Luận văn Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây sắn thuyền (syzygium resinosum (gagnep) merr. et perry)

Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Tr­êng ®¹i häc vinh =====&===== Phan ThÞ Thu Ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc mét sè hîp chÊt tõ rÔ c©y s¾n thuyÒn (Syzygium resinosum (gagnep) Merr. Et Perry) LuËn v¨n th¹c sü hãa häc Vinh, 2011 Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Tr­êng ®¹i häc vinh =====&===== Phan ThÞ Thu Ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh cÊu tróc mét sè hîp chÊt tõ rÔ c©y s¾n thuyÒn (Syzygium resinosum (gagnep) Merr. Et Perry) Chuyªn ngµnh: Hãa h÷u c¬ M· sè: 60. 44. 27 LuËn v¨n th¹c sü hãa häc Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS.TS. Hoµng V¨n Lùu Vinh, 2011 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn tới: PGS.TS. Hoàng Văn Lựu - Khoa Hoá học - Trường Đại học Vinh, người đã giao đề tài và tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này. PGS.TS. Chu Đình Kính - Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình ghi phổ và xác định cấu trúc các hợp chất. TS. Trần Đình Thắng và PGS.TS.NGƯT. Lê Văn Hạc đã có những ý kiến đóng góp quý báu cho luận văn này. Ths - NCS Nguyễn Văn Thanh đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực nghiệm. Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới các thầy giáo, cô giáo Khoa Hoá học, Khoa Sau đại học - Trường Đại học Vinh; các thầy giáo, cô giáo Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam; các anh chị đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành được luận văn này. Vinh, ngày 01 tháng 01 năm 2011 Phan Thị Thu MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU 1 1. Lý do chọn đề tài 1 2. Nhiệm vụ nghiên cứu 2 3. Đối tượng nghiên cứu 2 Chương 1: TỔNG QUAN 3 ĐẠI CƯƠNG VỀ THỰC VẬT HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI SYZYGIUM 1.1. Đại cương về thực vật học 3 1.2. Những nghiên cứu về thành phần hoá học của thực vật chi Syzygium. 6 1.2.1. Các hợp chất triterpenoit 6 1.2.1.1. Triterpen khung oleanan 6 1.2.1.2. Triterpen khung ursan 8 1.2.1.3. Triterpen khung lupan 9 1.2.2. Các hợp chất steroit 10 1.2.3. Các hợp chất acetophenon 12 1.2.4. Các flavonoit 14 1.2.4.1. Hợp chất flavanon 14 1.2.4.2. Các hợp chất flavon 16 1.2.4.3. Các hợp chất flavonol 17 1.2.4.4. Các hợp chất chalcon 22 1.2.5. Các hợp chất khác 24 1.3. Đại cương về thực vật học và hóa học cây sắn thuyền 27 1.3.1. Tên gọi 27 1.3.2. Phân bố 27 1.3.3. Mô tả thực vật 27 1.3.4. Thành phần hóa học cây sắn thuyền 28 1.3.5. Tác dụng dược lý 31 Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. Phương pháp lấy mẫu 33 2.2. Phương pháp phân tích, tách và phân lập các chất 33 2.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 33 Chương 3: THỰC NGHIỆM 34 3.1. Thiết bị và hóa chất 34 3.1.1. Thiết bị 34 3.1.2. Hoá chất 34 3.2. Tách và xác định cấu trúc hợp chất 34 3.2.1. Tách các hợp chất. 34 3.2.1.1. Thu hái mẫu 34 3.2.1.2. Chiết và tách các hợp chất rễ cây sắn thuyền 35 3.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất 38 Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 4.1. Xác định cấu trúc hợp chất TDR 133 từ rễ cây sắn thuyền 39 4.1.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR 39 4.1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 133 43 4.2. Xác định cấu trúc hợp chất TDR 168 từ rễ cây sắn thuyền 50 4.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR của TDR 168 50 4.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 168 54 KẾT LUẬN 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ TỪ VIẾT TẮT NMR : Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân) 1H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton) 13C-NMR : Carbon – 13, Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer d (ppm) : Độ chuyển dịch hoá học s : Singlet d : Doublet t : Triplet DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Một số hợp chất acetophenon phân lập được từ chi Syzygium 13 Bảng 1.2: Một số hợp chất phân lập được từ chi Syzygium 24 Bảng 3.1: Số liệu của quá trình chạy cột cao rễ sắn thuyền 35 Bảng 4.1: Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR của hợp chất TDR 133 42 Bảng 4.2: Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 133 và chất đã công bố 49 Bảng 4.3: Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR của hợp chất TDR 168 53 Bảng 4.4: Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 168 và chất đã công bố 58 ẢNH, SƠ ĐỒ Trang Ảnh 1.1: Ảnh chụp cây sắn thuyền 28 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ tách các chất từ rễ cây sắn thuyền 37 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1: Phổ 1H - NMR của hợp chất TDR 133 39 Hình 4.2: Phổ giãn 1H - NMR của hợp chất TDR 133 40 Hình 4.3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 133 43 Hình 4.4: Phổ giãn 13C - NMR của hợp chất TDR 133 44 Hình 4.5: Phổ DEPT của hợp chất TDR 133 45 Hình 4.6: Phổ giãn DEPT của hợp chất TDR 133 46 Hình 4.7: Phổ 1H - NMR của hợp chất TDR 168 50 Hình 4.8: Phổ giãn 1H - NMR của hợp chất TDR 168 51 Hình 4.9: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 168 53 Hình 4.10: Phổ giãn 13C - NMR của hợp chất TDR 168 54 Hình 4.11: Phổ DEPT của hợp chất TDR 168 55 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ nhiều thế kỷ nay, những chế phẩm y học cổ truyền được coi như một kho tàng dược liệu quý báu. Đối với Việt Nam, là nước có thu nhâp thấp, đời sống của người dân ở vùng nông thôn, miền núi còn rất nhiều khó khăn thì việc tạo ra nguồn thuốc có giá thành rẻ hơn luôn là mong muốn của người dân và cũng là mục tiêu của Chính phủ và của Ngành Y tế. Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên được thừa hưởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loài dược liệu quý. Theo số liệu thông kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên 10.000 loài trong đó có khoảng 3.200 loài cây được sử dụng trong Y học dân tộc. [1]. Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là một trong những định hướng để con người có thể chiết, tách, tổng hợp tìm ra các loại thuốc mới chống lại bệnh tật, chất bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm cũng như các chế phẩm phục vụ nông nghiệp, chăn nuôi có hoạt tính sinh học cao mà không ảnh hưởng đến môi sinh. Cùng với sự phát triển vượt bậc của ngành sinh học phân tử, hoá học các hợp chất thiên nhiên đã và đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu. Tìm kiếm và phát hiện các chất có hoạt tính sinh học trong thảm thực vật Việt Nam, qua đó đưa ra các giải pháp bảo tồn sự đa dạng sinh học của môi trường xung quanh là một nhiệm vụ luôn đòi hỏi sự cố gắng của tất cả mọi người trong xã hội đặc biệt là các nhà khoa học. Vì vậy, việc nghiên cứu thành phần hoá học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Ví dụ điển hình là gần đây đã chiết xuất thành công axit shikimic từ cây hồi ở Lạng Sơn (Illicium verum), đó là nguyên liệu chính để sản xuất tamiflu (oseltamivir phot phat) làm thuốc trị dịch cúm gia cầm H5N1… Cây sắn thuyền (Syzygium resinosum) thuộc họ Sim (Myrtaceae) được dùng để chữa một số bệnh trong dân gian như chữa vết thương, chống nhiễm khuẩn, lên da non nhanh, chữa bệnh tiêu chảy [11]. Nhằm góp phần hiểu biết thêm về thành phần hoá học của cây sắn thuyền, chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất từ rễ cây sắn thuyền” (Syzygium resinosum (gagnep) Merr. et Perry), là nội dung nghiên cứu chính của luận văn. 2. Nhiệm vụ nghiên cứu - Lấy mẫu rễ cây sắn thuyền. - Ngâm với dung môi metanol và chiết với các dung môi khác nhau. - Phân lập các hợp chất bằng phương pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. - Làm sạch các chất bằng phương pháp rửa và kết tinh phân đoạn. - Xác định cấu trúc của các hợp chất bằng các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H - NMR, 13C - NMR, DEPT). 3. Đối tượng nghiên cứu Rễ cây sắn thuyền, mẫu lấy tại huyện Triệu Sơn, tỉnh Thanh Hóa vào tháng 10 năm 2009. Chương 1 TỔNG QUAN ĐẶC ĐIỂM VỀ THỰC VẬT HỌC VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHI SYZYGIUM 1.1. Đặc điểm về thực vật học Syzygium là một chi thực vật có hoa, thuộc họ Sim (Myrtaceae), Chi này có khoảng 500 loài [41], phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, ít gặp ở các vùng ôn đới và hiếm thấy ở các vùng hàn đới, gặp phổ biến ở các nước Châu Á, Châu Phi. Chi này có quan hệ gần với chi Eugenia, một số nhà thực vật học còn đưa chi Syzygium vào trong chi Eugenia. Ở Việt Nam, tác giả Phạm Hoàng Hộ [8] đã thống kê được 57 loài, trong đó có hơn 30 loài đặc hữu trong hệ thực vật nước ta. Phần lớn các loài là cây thân gỗ và cây bụi thường xanh. Một vài loài được trồng làm cây cảnh vì chúng có tán lá đẹp, một số loài được trồng để lấy quả ăn ở dạng quả tươi hay làm mứt hoặc thạch [41]. Có nhiều loài cây thuộc chi Syzygium được sử dụng trong y học dân gian. Cây vối (Syzygium nervosum DC) có tính vị, vị đắng, chát, có tác dụng thanh nhiệt, giải biểu, sát trùng, chỉ dương, tiêu trệ... Lá và nụ vối nấu nước vừa thơm vừa tiêu cơm. Lá vối tươi hay sắc khô có tính chất sát trùng để rửa những mụn nhọt, lở loét, ghẻ. Người ta thường dùng phối hợp lá vối với lá hoắc hương làm nước hãm, uống lợi tiêu hóa. Thường dùng lá, vỏ, thân, hoa làm thuốc chữa đầy bụng, khó tiêu, ỉa chảy, mụn nhọt, viêm đại tràng mãn tính, lị trực trùng [11]. Năm 1968, Nguyễn Đức Minh, phòng Đông y thực nghiệm - Viện nghiên cứu Đông y đã tiến hành nghiên cứu và đi tới kết luận là ở tất cả các giai đoạn phát triển, lá và nụ đều có tác dụng kháng sinh, vào mùa đông kháng sinh tập trung nhiều nhất ở lá. Hoạt chất kháng sinh tan trong nước, các dung môi hữu cơ, bền vững với nhiệt độ và ở các môi trường có pH từ 2 đến 8, tác dụng mạnh nhất với Streptococcus, sau đến vi trùng bạch cầu, Staphylococcus và Pneumcoccus [11] [15]. Ở Ấn Độ, rễ sắc đặc dạng xirô được dùng để đắp vào vết thương sưng đỏ, quả dùng để ăn trị phong thấp. Ở Trung Quốc, các bộ phận của cây dùng để chữa trị cảm mạo, đau đầu phát sốt, lỵ trực khuẩn, viêm gan, bệnh mẩn ngứa, viêm tuyến sữa, ngứa ngáy ngoài da, bệnh nấm ở chân, vết thương do dao súng...[20]. Các nhà hóa học Trung Quốc đã xác định được trong lá vối có 0,08% tinh dầu, còn trong nụ hoa vối có 0,18% tinh dầu Cây đinh hương (Syzygium aromaticum) có nguồn gốc ở Indonesia và được sử dụng như một loại gia vị gần như trong mọi nền văn hóa ẩm thực. Nó có tên gọi là đinh hương có lẽ là do hình dáng của chồi hoa trông khá giống với những cái đinh nhỏ. Đinh hương khô có thể dùng trong nấu ăn hoặc là ở dạng nguyên vẹn hay ở dạng nghiền thành bột, nhưng do nó tạo mùi rất mạnh cho nên chỉ cần dùng rất ít. Gia vị làm từ đinh hương được dùng khắp cả ở Châu Âu và Châu Á cũng như được thêm vào trong một số loại thuốc lá (gọi là kretek) ở Indonesia và thỉnh thoảng ở các quán cà phê tại phương Tây. Đinh hương đôi khi còn được trộn lẫn với cần sa. Đinh hương còn là một nguyên liệu quan trong trong sản xuất các loại hương dùng ở Trung Quốc hay Nhật Bản. Tinh dầu đinh hương có các tính chất gây tê và kháng vi trùng, đôi khi được dùng để khử mùi hôi của hơi thở hay để cải thiện tình trạng đau răng. Thành phần chính của tinh dầu đinh hương, eugenol, được các nha sĩ sử dụng để làm dịu cơn đau sau khi nhổ răng sâu và nó là mùi đặc trưng trong các phòng mạch nha khoa. Tinh dầu đinh hương cũng được dùng để lau chùi các lưỡi kiếm của người Nhật để ngăn cản sự mờ xỉn của mặt được đánh bóng [41], và được sử dụng trong điều trị bằng xoa bóp dầu thơm [11]. Trong y học cổ truyền người ta còn dùng nụ hoa đinh hương phơi khô như một vị thuốc với tác dụng làm ấm tỳ, vị, thận và bổ dương. Cây đơn tướng quân (Syzygium formosum Wall) còn có tên khác ở theo địa phương là cây trâm chụm ba, cây rau chiếc [18], có nhiều tác dụng trong việc điều trị bệnh. Lá sắc lấy nước uống để trị mẫn ngứa, mề đay, dị ứng, dùng ngoài để tắm ghẻ. Ngoài ra có thể dùng để chữa viêm họng đỏ, viêm phế quản cấp và mãn tính [11], chữa viêm bàng quang. Trong những năm gần đây, nhiều tác giả đã nghiên cứu cây thuốc này và tìm thấy trong lá đơn tướng quân có chất kháng sinh mạnh, có tác dụng diệt nhiều loại vi khuẩn, trong đó có các cầu khuẩn staphylo, strepto, phế cầu... Kháng sinh đơn tướng quân mạnh và bền vững không bị huỷ bởi các men pepsine, trypsine... của ống tiêu hoá, chịu được nhiệt độ 1000C trong 30 phút và có khả năng hấp thụ qua thành ruột phân bố đều vào các phủ tạng trong cơ thể. Điều đáng chú ý là kháng sinh đơn tướng quân có tác dụng với cả các chủng staphylo đã kháng lại nhiều loại thuốc kháng sinh thường dùng và chống dị ứng rất rõ [41]. Tại Trung Hoa: Mận bồ đào (Syzygium jambos) hay Pu-tao, Shui pu-tao được xem là có tính 'ấm', quả có tính thanh huyết và thu liễm để điều trị nấc nấc cục không ngừng, đau bao tử và tiêu chảy do sưng ruột…Tại Indonesia : Lá Syzygium jambos được dùng để trị tiêu chảy, kiết lỵ , nóng sốt [41]. Tại Việt Nam : Lá được dùng sắc để chữa những bệnh đường hô hấp [18]. Tại Ấn Độ : Mận Syzygium được gọi là Gulabjam. Lá nấu lấy nước trị đau mắt, quả dùng chữa đau gan, vỏ làm thuốc thu liễm [41]. Trâm mốc (Syzygium cumini): Quả chín có vị ngọt chát giàu vitamin C, ăn giúp tiêu hóa tốt, hạ thấp đường huyết, trị tiêu chảy, giảm kích thích thần kinh dạ dày và thần kinh trung ương, hạn chế tiết dịch vị, chữa ợ chua, viêm dạ dày.[41] Lá trâm mốc chứa nhiều tanin dễ tiêu và được dùng nấu nước uống như trà có lợi cho bệnh nhân tiểu đường [18]. Cây sắn thuyền (Syzyrum resinosum) được dùng để chữa vết thương, chống nhiễm khuẩn, lên da non nhanh và chữa bệnh tiêu chảy [11]. 1.2. Những nghiên cứu về thành phần hoá học của thực vật chi Syzygium. Cho đến nay đã có khoảng 12 loài thực vật chi Syzygium được nghiên cứu hoá thực vật [23], đã phân lập được các chất thuộc các nhóm chất khác nhau, chủ yếu là triterpenoit, flavonoit và steroit. 1.2.1. Các hợp chất triterpenoit 1.2.1.1. Triterpen khung oleanan Từ chồi non của Syzygium aromaticum [23] và loài Syzygium claviflorum [29] đã phân lập được axit oleanolic (3-hydroxy-12-oleanen-20-oic acid). (1.1) 3-hydroxy-12-oleanen-20-oic acid. Từ lá và từ nụ cây Syzygium nervosum DC, lá của cây Syzygium resinosum và vỏ cây Syzygium jambos cũng đã phân lập được axit này [6] [28] [17]. Cũng từ lá của loài Syzygium claviflorum [29] và loài Syzygium resinosum [6] đã phân lập được axit arjunoric (2α,3b,23-trihydroxy-12-oleanen-28-oic axit). (1.2) 2α,3b,23-trihydroxy-12-oleanen-28-oic axit Một số công trình nghiên cứu đã phát hiện ra tritecpen khung oleane có hoạt tính kháng khuẩn phổ biến trên chủng Staphylcoccus aureus. Một số hợp chất khác như axit leanoic có hoạt tính kháng HIV [29]. Gần đây người ta đã nghiên cứu và phát hiện ra một số tritecpen khung ursan cũng như tritecpen khung oleane có hoạt tính kháng khuẩn rất tốt trên chủng Staphylcoccus aureus [36]. Từ Syzygium formosanum Wall [16] và vỏ cây Syzygium jambos [31] đã phân lập được friedelin. (1.3) Friedelin b-amyrin acetate cũng được tách từ dịch chiết etyl axetat của vỏ Syzygium jambos [31]. (1.4) b-amyrin acetate 1.2.1.2. Triterpen khung ursan Axit ursolic đã được phân lập từ cây Syzygium claviflorum [29], lá của cây Syzygium formosum Wall [16], lá và nụ Syzygium nervosum DC [29]. (1.5) Axit ursolic Axit ursolic là một trong những tritecpen thuộc khung ursan đã được nghiên cứu sâu sắc về các hoạt tính khác nhau. Như hoạt tính kháng khuẩn Staphylococus aurcus, Pseudomonas aerugunosa và Bacillus subtilis [21]. Axit này còn được chứng minh có hoạt tính gây độc đối với dòng tế bào bạch huyết (leuk p388), dòng tế bào L-1210, dòng tế bào ung thư phổi ở người A-549 [32], dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2) và đặc biệt có hoạt tính kháng HIV [21]. Từ lá cây Syzygium claviflorum và lá cây Syzygium formosum Wall cũng như từ rễ cây Syzygium resinosum đã tách được Axit asiatic [29] [10]. (1.6) Axit asiatic 2α-hydroxy-ursolic axit đã được tách từ lá cây Syzygium formosum Wall [16] (1.7) 2α-hydroxy-ursolic axit 1.2.1.3. Triterpen khung lupan Ngoài kiểu khung oleanan và ursan, từ loài Syzygium claviflorum cũng phân lập được hợp chất triterpen thuộc kiểu khung lupan như axit betulinic [29] và 3-hydroxy-30-nor-20-oxo-28-lupanonic acid [17]. (1.8) 3-hydroxy-30-nor-20-oxo-28-lupanonic acid, (1.9) Axit betulinic Những nghiên cứu gần đây cho thấy axit betulinic cũng đã được tách ra từ rễ của cây Syzygium resinosum [17], lá cây Syzygium formosum Wall [16], và vỏ cây Syzygium jambos. Từ cây Syygium formosum Wall [16] và vỏ Syzygium jambos [39] đã tách được 3α-lupeol (1.10) 3α-lupeol Một số tritepenoit khung lupan có hoạt tính kháng HIV như axit betulinic [14]. Lupeol cũng được người ta phát hiện có tác dụng với một số dòng tế bào ung thư gan (Hep-G2), A-431, H-4IIE [26] [37]. Ngoài ra lupeol còn là chất chống oxy hoá và kháng viêm [27] 1.2.2. Các hợp chất steroit Hợp chất phytosterol đã được phân lập từ nụ cây Syzygium nervosum DC [5], rễ của cây Syzygium resinosum [17], vỏ cây Syzygium jambos [31] và lá của cây Syzygium formosum Wall [16] là b - Sitosterol. Cũng từ rễ cây Syzygium resinosum đã phân lập được Stigmasterol [17]. Studies with laboratory animals fed stigmasterol found that both cholesterol and sitosterol absorption decreased 23% and 30%, respectively, over a 6-week period. (1.11) b - Sitosterol (1.12) Stigmasterol Từ lá của cây Syygium formosum Wall đã tách được b - Sitosterol-glucosid [16]. (1.13) b - Sitosterol-glucosid Tại châu Âu, β-sitosterol đóng một vai trò quan trọng trong liệu pháp thảo dược đặc biệt là trong điều trị phì đại tuyến tiền liệt lành tính (BPH). It is also used in Europe for the treatment of prostatic carcinoma [ 6 ] and breast cancer, [ 7 ] although the benefits are still being evaluated in the US. Nó cũng được sử dụng ở Châu Âu để điều trị ung thư tuyến tiền liệt và ung thư vú, mặc dù những lợi ích vẫn đang được đánh giá ở Mỹ. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng stigmasterol có thể hữu ích trong công tác phòng chống một số bệnh ung thư, bao gồm buồng trứng, tuyến tiền liệt, vú, và ung thư ruột kết [41].Studies have also indicated that a diet high in phytoesterols may inhibit the absorption of cholesterol and lower serum cholesterol levels by competing for intestinal absorption. Studies with laboratory animals fed stigmasterol found that both cholesterol and sitosterol absorption decreased 23% and 30%, respectively, over a 6-week period. 1.2.3. Các hợp chất acetophenon Trong số các chất đã phân lập từ 12 loài thuộc chi Syzygium thì kiểu cấu trúc các hợp chất acetophenon được tìm thấy nhiều nhất trong số các chất này. Chủ yếu là cấu trúc acetophenon chứa gốc đường gắn với nhóm thể trihydroxybenzoyl ở các vị trí khác nhau của gốc này. Từ loài Syzygium aromaticum đã phân lập được các acetophenon sau [23]: Bảng 1.1. Một số hợp chất acetophenon phân lập được từ chi Syzygium Tên chất Vị trí nhóm thể R1 R2 R3 R4 (1.14) 3’-Glucosyl-2’,4’,6’-trihydroxyacetophenone H H H H (1.15) 2”-O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl) H H H (1.16) 6”-O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl) H H H (1.17) 2”,3”-O-(3,4,5 trihydroxybenzoyl) H H (1.18) 2”,6”-O-(3,4,5 trihydroxybenzoyl) H H (1.19) 2”,3”,6”-Tris-O-(3,4,5 trihydroxybenzoyl) H (1.20) 2”,3”,4”,6”-Tetrakis-O-(3,4,5 trihydroxybenzoyl) Từ Syzygium aromaticum cũng phân lập được hợp chất 2”,3”-bis-O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl)4”,6”-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl [23]. (1.21) 2”,3”-bis-O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl) 4”,6”-O-(S)-hexahydroxydiphenoyl 1.2.4. Các flavonoit 1.2.4.1. Hợp chất flavanon Từ loài Syzygium samarangense đã phân lập được hợp chất 5,7-dihydroxy-6,8-dimethylflavanone; [23]. (1.22) 5,7-Dihydroxy-6,8-dimethyl flavanone; Cũng như ở nụ và lá của cây Syzygium nervosum DC đã phân lập được hợp chất 7-hydroxy-5-metoxy-6,8-dimethyl flavanone [6]. (1.23) 7-hydroxy-5-metoxy-6,8-dimethyl flavanone Từ loài Syzygium jambos đã phân lập được 5 flavanone sau: [14] (1.24) 8-dihydroxy-6-metoxy-flavanon (1.25) 5,7-dimetoxy flavanon (1.26) 5,7-dihydroxy flavanon (1.27) 6,8-dihydroxy-5-methyl-flavanon Từ nụ Syzygium nervosum DC đã phân lập được 2 flavonoid mới là (2S)-8-formyl-6-methylnaringenin và (2S)-8-formyl-6-methylnaringenin-7-O- β-D-glucopyranoside [22] (1.28) R = H: (2S)-8-formyl-6-methylnaringenin (1.29)R = β-D-glucopyranosyl: (2S)-8-formyl-6-methylnaringenin-7-O- β-D-glucopyranoside 1.2.4.2. Các hợp chất flavon Từ loài Syzygium altrernifolium phân lập được 4’,5,7-trihydroxy-6,8-dimethylflavone [23]. (1.30) 4’,5,7-trihydroxy-6,8-dimethylflavone Từ loài Syzygium aromaticum phân lập được hợp chất 3,4’,5-trihydroxy-7-methylflavone [23]. (1.31) 4’,5-dihydroxy-7-methylflavone 5,7-dihidroxi-6-metoxi flavone đã được tách từ vỏ cây Syzygium nervosum DC [5]. (1.32) 5,7-dihidroxi-6-metoxi flavone Từ dịch chiết ethanol của hạt Syzygim aromaticum đã tách được hai apigenin triglycoside mới: apigenin 6-C-[β-D-xylopyranosyl-(1’”→ 2”)-β-D-galactopyranoside]-7-O-β-D-glucopyranoside và apigenin 6-C-[β-D-xylopyranosyl-(1’”→2”)-β-D-galactopyranoside]-7-O-β-D-(6”’-O-P-coumarylglucopyranoside [33] (1.33) 1.2.4.3. Các hợp chất flavonol Từ nụ cây Syzygium aromaticum đã tách được quercetin [34] (1.34) Quercetin Trong rễ Syzygium resinosum đã tách được kaempferol [11] (1.35) Kaempferol Từ lá cây Syzygium nervosum DC đã tách được 3,5,7,4’-tetrahydroxy flavon [6]. (1.36) 3,5,7,4’-tetrahydroxy flavon Từ vỏ Syzygium nervosum DC đã tách được rhamnocitrin [25]. (1.37) Rhamnocitrin Cũng từ lá Syzygium jambos đã tách được 2 flavonoid là quercetin và myricetin [31]. (1. 38) Myricetin. Ngoài ra còn một vài flavonoit có chứa gốc đường ở các vị trí nhóm thế khác nhau. 3,3’,4’,5,5’,7-hexahydroxyflavone được tách từ Syzygium cumini và 3,3’,4’,5,5’,7-hexahydroxy-2’-methyflavone được tách từ Syzygium aromaticum [23]. (1.39) 3,3’,4’,5,5’,7-hexahydroxyflavone. (1.40) 3,3’,4’,5,5’,7-hexahydroxy-2’-methyflavone Từ dịch chiết diclometan của nụ Syzygium aromaticum đã tách được tamarixetin-3-O-β-D-glucopyranoside và từ dịch chiết ethanol tách được ombuin-3-O-β-D-glucopyranoside [34]. (1.41) R = H Tamarixetin-3-O- β-D-glucopyranoside (1.42) R = CH3 Ombuin-3-O- β-D-glucopyranoside Từ lá của Syzygium jambos đã tách và xác định cấu trúc của 2 flavonoid glycosides axyl hoá 3-O-(4”-O-acetyl)-α-L-rhamnopyrenoside của meamsetin (myricetin-4’-methyl ether) và myricetin-3-O-(4”-O-acetyl-2”-O-galloyl)- α-L-rhamnopyrenoside [28]. (1.43) R1 = Me; R2 = H; R3 = -COCH3 (1.44) R1 = H; R3 = -COCH3 Trong quả một số loại cây thuộc chi Syzygium như Syzygium cumini, Syzygium curranii, Syzygium jambos, Syzygium javanicum, Syzygium malaccens, Syzygium samaravgense đều chứa các hợp chất phenolic cyaniclin-3-glucoside và delphiniclin-3-glucoside; myricitrin; quercitrin; rutin [33]. (1.45) R = H Cyaniclin-3-glucoside (1.46) R = OH Delphiniclin-3-glucoside (1.47) R1 = OH, R2 = OH: Myricitrin (1.48) R1 = OH, R2 = H Quercitrin: (1.49) Rutin 1.2.4.4. Các hợp chất chalcon Từ loài Syzygium samarangense [23] đã phân lập được 3 hợp chất chalcon sau: (1.50) 2',4'-dihydroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethychalcon (1.51) 4',6'-dihydroxy-2'-methoxy-5'-methychalcon (1.52) 2',4'-dimethoxy-6'-hydroxy-5'-methychalcon Từ nụ và lá cây Syzygium nervosum DC đã phân lập được 2',4' - dihidroxy - 6' - methoxy - 3', 5' - dimethyl chalcon [6], [40]. (1.53) 2',4'-dihidroxy-6'-methoxy-3',5'-dimethyl chalcon Một số hợp chất chalcon và dẫn xuất có hoạt tính rất thú vị như 2,6-dihydroxy-4-methoxydihydrochacon được chứng minh có tác dụng với dòng tế bào ung thư biểu mô (KB) và hoạt tính kháng khuẩn chủng Bacillus subtilus và Micrococus luteus [32]. Một nghiên cứu gần đây đã tách được 2 flavonoid mới từ nụ Syzygium nervosum DC là 3’-formyl-4’,6’,4-trihydroxy-2’-methoxy-5’-methylchalcon và 3’- formyl - 6’, 4 - dihydroxy - 2’ - methoxy - 5’ - methylchalcon - 4’ - O - β - D - glucopyranoside [22] (1.54) R = H (1.55) R = β-D-glucopyranosyl Cũng từ cao methanol của nụ Syzygium nervosum DC đã phân lập được 4 flavonoid mới có hoạt tính chống cúm H1N1 và H5N2 [25]. (1.56) (1.57) (1.58) (1.59) 1.2.5. Các hợp chất khác Bảng 1.2. Một số hợp chất phân lập được từ chi Syzygium. Tên chất Công thức cấu tạo Nguồn thực vật Tài liệu dẫn (1.60) 2,4-dihydroxy-6-methybenzoic axit, 2-β-D-Glucopyranoside Syzygium aromatica [23] (1.61) Ellagic acid Syzygium aromaticum [33] (1.62) 3-Galloylglucose Syzygium cumini [23] (1.63) Limonin Syzygium aromaticum [23] (1.64) 2-methoxy-4-(2-propenyl) phenol,O-[3,4,5-trihydroxybenzoyl-(→6-β-D-glucopyranoside] Syzygium aromaticum [23] (1.65) 2-methoxy-4-(2-propenyl) phenol Syzygium aromaticum [23] (1.66) 3-phenyl-1-(2,4,6-trihydroxy)-1-propanone; 2’-Me ether Syzygium samaragense [23] (1.67) 3-phenyl-1-(2,4,6-trihydroxy-3-methylphenyl)-1-propanone; 6’-Me ether Syzygium samaragense [23] (1.68) Ferulic aldehyde Syzygium aromaticum [34] (1.69) 2,6,9-Humulatriene. Syzygium aromaticum [23] (1.70) Samarangenin A Syzygium samaragense Syzygium aqueum [23] (1.71) Samarangenin A; 3-O-(3,4,5- trihydroxybenzoyl) Syzygium samaragense Syzygium aqueum [23] (1.72) Syzyginin A Syzygium aromaticum [23] (1.73) Syzyginin B Syzygium aromaticum [23] (1.74) Syzygiol Syzygium polycephaloides [23] 1.3. Đặc điểm về thực vật học và hóa học cây sắn thuyền 1.3.1. Tên gọi Cây sắn thuyền còn có tên khác là sắn xàm thuyền [41]. Tên khoa học là Syzygium Resinosum (Gagnep) Merr. et Perry. 1.3.2. Phân bố Sắn thuyền là cây mọc hoang và được trồng hầu hết khắp các tỉnh Miền Bắc nước ta. Hà Nội cũng có, các tỉnh Hoà Bình, Hà Tây, Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình…Ngoài ra còn có ở Thanh Hóa, Nghệ An [11]. 1.3.3. Mô tả thực vật Sắn thuyền có thân thẳng đứng, hình trụ, cao tới 15 m. Cành nhỏ gầy, dài, lúc đầu dẹt sau hình trụ, màu nâu nhạt, nhăn nheo. Lá mọc đối, hai đôi lá gần nhau mọc theo hai hướng thẳng góc với nhau. Lá mọc sum suê, phiến lá hình mác thuôn nhọn ở gốc, nhọn tù ở đỉnh, dài 6 - 9 cm, rộng 20 - 45 mm, đen nhạt ở trên khi khô. Cụm hoa mọc ở kẽ lá rụng hay chưa rụng, dài 2 - 3 cm, thưa hợp thành nhóm dài 20 cm, trục gầy nhỏ, tận cùng bởi 3 hoa không có cuống. Nụ hoa hình lê, gần hình cầu dài 3 - 4 mm, rộng 2 - 3 mm [9] [10] [11]. Hoa có màu trắng, mọc thành từng chùm và cho làm 2 vụ. Vào tháng 2 (gọi là vụ chiêm, có ít hoa và khi quả chín rất chát) và vào tháng 5 (gọi là vụ mùa, cho năng suất rất cao và quả khi chín có vị ngọt hơi chát). Rễ có hình chân kiềng có 3 rễ to bò trên mặt đất và được phủ bằng một lớp bột màu trắng. Ảnh 1.1. Ảnh chụp cây sắn thuyền 1.3.4. Thành phần hóa học cây sắn thuyền Đã có một số công trình trong nước nghiên cứu về thành phần hóa học của cây sắn thuyền. Lá chứa tinh dầu, chất nhựa, chất nhầy, tannin. Ngoài ra còn có axit oleanoic, betulinic, asiatic [9]. Quả có các hợp chất phenol, các glicosid petunidin và malvidin. Hai hợp chất này khi thuỷ phân cho petunidin và malvidin. Trong hoa có kaempferol và các hợp chất tritecpen [11]. (1.9) Axit betulinic (1.6) Axit asiatic (1.1) Axit oleanolic (1.35) Kaempferol (1.75) Petunidin (1.76) Malvidin Những nghiên cứu gần đây cho thấy từ rễ cây sắn thuyền cũng đã phân lập được axit oleanoic, betulinic, asiatic và kaempferol. Ngoài ra còn tách được 7 hợp chất sau [17]: (1.11) b - Sitosterol (1.2) 2a,3b,23-trihydroxy-olean -12-en-28-oic-axit (1.77) Stigmasta-5,28 (29)-dien-3b-n-ankanoat (1.12) Stigmasterol (1.78) 9-hexadecenoic-acid (1.79) Docosene (1.80) Bergenin 1.2.5. Tác dụng dược lý Trong dân gian, người ta thường lấy lá non và quả để ăn, lấy vỏ để xám thuyền và phối hợp với củ nâu để nhuộm lưới. Bộ phận dùng làm thuốc là lá và vỏ cây. Lá sắn thuyền tươi giã nhỏ đắp lên vết thương có tác dụng làm se vết thương, chống nhiễm trùng, làm cho vết thương chóng lên da non. Đối với quá trình viêm, lá sắn thuyền có tác dụng thúc đẩy nhanh quá trình tiêu viêm, tăng cường hiện tượng thực bào. Trên tiêu bản tai thỏ cô lập, lá sắn thuyền có tác dụng làm dãn mạch rõ rệt [11], ngoài ra lá sắn thuyền còn có khả năng chống HIV và chống ung thư [9]. Vỏ cây sấy khô, tán bột dùng để chữa bệnh tiêu chảy cho trẻ em. Axit asiatic phân lập từ cây sắn thuyền có tác dụng lên vi khuẩn streptoccus mutans [41]. Một số bài thuốc trong dân gian [41]: - Đầy bụng, sôi bụng, tiêu lỏng: lá sắn thuyền non một nắm, giã nhỏ, chiêu nước cho uống. - Vết thương đang chảy máu: lá non giã nhuyễn đắp và buộc lại. - Vết mổ không liền miệng, chảy nước: lá sắn thuyền giã nát, uống nước, bã đắp vào vết mổ. Làm liên tục một tuần. - Loét dạ dày: lá sắn thuyền rửa sạch, nhai ăn. Làm liên tục một tuần. - Đỉa chui vào âm hộ phụ nữ: lá sắn thuyền một nắm to, thái nhỏ, nước 600ml. Đun sôi kỹ, lấy ra 100ml cho uống, còn lại ngồi xổm xông âm hộ. - Họng viêm, ho rát: lá sắn thuyền một nắm, lá nhọ nồi một nắm, tất cả rửa sạch, giã nhỏ, ép lấy nước cốt rồi pha thêm 20 ml mật ong, quấy đều. Súc miệng trước khi đi ngủ. Theo Nam dược thần hiệu của Tuệ Tĩnh [18]: - Chữa ỉa chảy ra máu không ngớt: Vỏ sắn thuyền, vỏ củ nâu, vỏ cây vải, vỏ cây sung, vỏ cây ruối, vỏ dụt, củ gấu, các vị bằng nhau, 12-20g, sắc uống. - Chữa trẻ em ỉa xối hoặc đi lỵ ngày đêm không dứt: Dùng vỏ sắn thuyền sấy khô tán bột, cho uống mỗi lần 2g với nước cơm Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Phương pháp lấy mẫu Mẫu sau khi lấy về được rửa sạch, chặt nhỏ sau đó được sử lý qua etanol 960 và phơi trong bóng râm cho đến khô. Xử lý mẫu khô bằng cách ngâm với dung môi thích hợp thu được dịch chiết, chưng cất thu hồi dung môi ở áp suất thấp được các cao tương ứng dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm. 2.2. Phương pháp tách và phân lập các hợp chất Để phân lập các hợp chất, chúng tôi tiến hành lần lượt các phương pháp: - Sắc ký cột thường sử dụng silicagen cỡ hạt 0.040 - 0.063 mm (254 - Merck). - Sắc ký lớp mỏng (TLC). - Các phương pháp kết tinh phân đoạn. 2.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp giữa các phương pháp phổ: - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR được đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3. - Phổ 13C - NMR, DEPT được đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môi CDCl3. Chương 3 THỰC NGHIỆM 3.1. Thiết bị và hóa chất 3.1.1. Thiết bị - Cột sắc ký thường (chiều dài 1,4 m; đường kính 4,5 cm). - Cột sắc ký thường (chiều dài 0.5 m; đường kính 2 cm). - Bộ chưng cất thường. - Các thiết bị đo phổ - Các vật dụng cần thiết khác 3.1.2. Hoá chất - Axit sunfuric. - Axeton. - Butanol. - Clorofom. - Các dung môi đo phổ - Etylaxetat. - Metanol. - Hexan. - Nước cất. - Iốt. - Silicagel. 3.2. Tách và xác định cấu trúc hợp chất 3.2.1. Tách các hợp chất 3.2.1.1. Thu hái mẫu Rễ cây sắn thuyền được lấy vào tháng 10 năm 2009 tại huyện Triệu Sơn tỉnh Thanh Hoá, mẫu rễ cây sắn thuyền đã được bác sĩ, thầy thuốc ưu tú Vũ Quang Chính - Chủ tịch Hội Đông y tỉnh Thanh Hoá định danh. 3.2.1.2. Chiết và tách các hợp chất rễ cây sắn thuyền Rễ cây sắn thuyền sau khi làm khô ngâm trong metanol trong thời gian 45 ngày. Lọc dịch chiết và chưng cất thu hồi dung môi ở áp suất thấp được cao metanol. Phần bã còn lại tiếp tục được ngâm với metanol trong thời gian 7 ngày rồi chiết nóng 3 lần thu thêm được một lượng cao nữa. Gom tất cả lượng cao này lại rồi phân tán vào nước cất sau đó chiết lần lượt với hexan, clorofom, etylaxetat, butanol. Chưng cất loại dung môi thu được các cao hexan, clorofom, etylaxetat, butanol tương ứng, phần dịch chiết butanol và phần cặn. Cao etylaxetat trộn đều với silicagel theo tỉ lệ 1:1 rồi lấy một phần cao cho vào cột sắc ký đã được nhồi bằng pha tĩnh là silicagel có cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (254 - Merck). Tiến hành sắc ký với hệ dung môi rửa giải là etylaxetat - metanol và tăng dần tỉ lệ độ phân cực. Lấy lần lượt các thể tích xác định chảy ra khỏi cột (mỗi lần lấy 80ml). Cất thu hồi dung môi một phần rồi cho bay hơi tự nhiên thu được các phân đoạn tương ứng được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Số liệu của quá trình chạy cột cao rễ sắn thuyền TT Hệ dung môi EtOAc/CH3OH Tỉ lệ Phân đoạn 1 EtOAc /CH3OH 100 : 0 1 : 10 2 EtOAc /CH3OH 95 : 5 11 : 20 3 EtOAc /CH3OH 90 : 10 21 : 40 4 EtOAc /CH3OH 85 :15 41 : 50 5 EtOAc /CH3OH 82 :20 51 : 70 6 EtOAc /CH3OH 75 : 25 71 : 80 7 EtOAc /CH3OH 70 : 30 81 : 90 8 EtOAc /CH3OH 60 : 40 91 : 110 9 EtOAc /CH3OH 50 : 50 111 : 115 10 EtOAc /CH3OH 0 : 100 116 : 120 Sau khi cho dung môi vào rửa giải thấy trên cột xuất hiện năm khoảng màu. Dưới cùng có màu trắng sữa, tiếp đến có màu vàng đậm, ở giữa có màu xanh đen, tiếp đến có màu vàng nhạt, trên cùng có màu đen. Tại phân đoạn 13 tương ứng với hệ dung môi 95 : 5 xuất hiện một chất rắn dạng tinh thể màu trắng đục. Dùng axeton hoà tan để rửa chất bẩn, sau đó đun nóng rồi lọc qua giấy lọc thu được phần dung dịch cần kết tinh. Để lạnh và bay hơi từ từ thấy có tinh thể màu trắng xuất hiện. Quy trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần thu được một chất sạch dạng tinh thể màu trắng được ký hiệu là TDR 133. Tại phân đoạn 38, phân đoạn 39 và phân đoạn 40 tương ứng với hệ dung môi 90 : 10 xuất hiện một chất rắn màu vàng xanh. Thử với sắc ký lớp mỏng thấy 3 phân đoạn này cho các vệt gần tương tự nhau, dự đoàn là một chất nên gộp chúng lại. Dùng hexan và axeton rửa nhiều lần để loại bỏ chất bẩn. Hoà tan chất này trong axeton nóng và lọc nóng. Để lạnh và bay hơi từ từ thu được một tinh thể màu vàng. Quá trình này được lặp đi lặp lại nhiều lần, thử sắc ký lớp mỏng cho một vệt với hệ số Rf = 0,6/1 = 0,6 thu được một chất sạch ký hiệu là TDR 168 MẪU KHÔ Bã mẫu CAO METANOL Hệ dung môi 95 : 5 Cao hexan Cao Clorofom CAO ETYLAXETAT Dịch chiết butanol Hệ dung môi 90 : 10 TDR 133 TDR 168 Ngâm trong metanol 45 ngày Lọc dịch chiết và cất thu hồi dung môi Chiết nóng 3 lần Ngâm trong metanol 7 ngày Phân tán vào nước Chiết với các dung môi và cất thu hồi dung môi hexan clorofom etylaxetat butanol Nhồi cột Rửa giải bằng dung môi EtOAc - MeOH Sơ đồ 3.1: Sơ đồ tách các chất từ rễ cây sắn thuyền 3.2.2. Xác định cấu trúc các hợp chất Để xác định cấu trúc các hợp chất, chúng tôi sử dụng kết hợp các phương pháp phổ: - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H - NMR được đo trên máy Bruker 500 MHz, dung môi CDCl3. - Phổ 13C - NMR, DEPT được đo trên máy BRUKER 125 MHz, dung môi CDCl3. (Các phổ trên đều được đo tại Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc các hợp chất TDR 133 từ rễ cây sắn thuyền Hợp chất TDR 133 có dạng tinh thể màu trắng. 4.1.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR Hình 4.1: Phổ 1H - NMR của hợp chất TDR 133 Hình 4.2: Phổ giãn 1H - NMR của hợp chất TDR 133 Phổ 1H - NMR của hợp chất TDR 133 có những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng sau: Phổ 1H - NMR của hợp chất TDR 133 cho 10 tín hiệu. Tín hiệu cộng hưởng của nhóm –CH2 - CH2 – được thể hiện ở hình 13 là 2 triplet có độ chuyển dịch hoá học tương ứng d = 3,42 ppm và d = 3,02 ppm. J = 8Hz. Tín hiệu cộng hưởng của 6 proton hai nhóm methoxy là 2 singlet có độ chuyển dịch hoá học d = 3,83 ppm và d = 3,89 ppm Proton thơm H3 của vòng A có độ chuyển dịch hoá học 6,07 ppm (singlet). 5 proton của vòng B từ H2 đến H6 có độ chuyển dịch hoá học trong khoảng 7,21 7,31 ppm. Tín hiệu cộng hưởng của proton H4 có độ chuyển dịch d = 7,21 ppm, J = 1,5Hz (tt) Tín hiệu cộng hưởng của proton nhóm OH ở vị trí 2’, và ở vị trí 6’là 2 singlet có dộ dịch chuyển hoá học tương ứng d = 13,41 ppm và d = 6.77 ppm. Bảng 4.1. Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR của hợp chất TDR 133 Số cacbon Nhóm cacbon 1H – NMR (d : ppm), J (Hz) 2 CH 7,26 – 7,31 4 CH 7,21 (tt); J1 = 8,5; J2 = 1,5 5 CH 7,26 – 7,31 3’ CH 6,07 (s) Cα CH2 3,42 (t), J = 8 Cβ CH2 3,03 (t), J = 8 4’ OCH3 3,83 (s) 5’ OCH3 3,89 (s) 6’ OH 6,77 (s) 2’ OH 13,41 (s) 4.1.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 133 Hình 4.3: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 133 Hình 4.4: Phổ giãn 13C - NMR của hợp chất TDR 133 Hình 4.5: Phổ DEPT của hợp chất TDR 133 Hình 4.6: Phổ giãn DEPT của hợp chất TDR 133 Phổ 13C - NMR của hợp chất TDR 133 có những tín hiệu cộng hưởng đặc trưng sau: Phân tử dihidropashanon có 17 nguyên tử cacbon nhưng trên phổ 13C – NMR chỉ cho 14 tín hiệu là do các nguyên tử cacbon ở các vị trí C2 và C6; C3 và C5 đối xứng nhau và có độ chuyển dịch hoá học gần bằng nhau (128,4 và 128,5) nên bị chập 4 tín hiệu thành 1 tín hiệu. Các nguyên tử cacbon của nhóm –CH2 - CH2 – có giá trị d = 45,2 ppm và 30,5 ppm. Cα ở gần nhóm cacbonyl hơn nên có giá trị chuyển dịch hoá học lớn hơn Cβ. Các nguyên tử cacbon của hai nhóm methoxi (OCH3) ở vị trí 4’ và 5’ của vòng A có các giá trị tương ứng với d = 61,4 ppm và d = 56,0 ppm. Nguyên tử cacbon của nhóm cacbonyl có độ chuyển dịch hoá học d = 204,4 ppm. Các nguyên tử cacbon của vòng thơm A ở vị trí C2’ và C5’ liên kết với các nhóm –OH, -OCH3 có độ chuyển dịch hoá học tương ứng d = 151,2 ppm và d = 127,8 ppm. Phổ DEPT của hợp chất TDR 133 Hợp chất TDR 133 có 6 nhóm CH trong đó các nhóm CH của vòng B ở vị trí 2, 6 đối xứng và ở vị trí 3, 5 đối xứng. Phổ DEPT 90 chỉ cho 3 tín hiệu là do chập 2 tín hiệu của 2 nhóm (C2, C6) và (C3, C5) thành một tín hiệu. Còn trên phổ DEPT 135 có 5 tín hiệu của 2 nhóm CH và CH3 chứng tỏ hợp chất TDR 133 có 2 nhóm CH3.Cũng trên phổ DEPT 135 có 2 tín hiệu của nhóm CH2 cho thấy có 2 nhóm CH2. Tác giả Kazuhiko Ichino, Hitoshi Tanaka, Kazuo Ito, Toshihiro Tanaka, Mizuo Mizuno (1988) trong bài “Two new dihydrochalcones from Lindera erythrocarp” công bố trên Journal of Natural Products 51(5) pp 915-917 đã đưa ra bảng số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 13C – NMR (CDCl3) của Dihydropashanone ỏ bảng 4.2 Bảng 4.2. Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 133 và chất đã công bố Số cacbon Nhóm cacbon 13C–NMR(d:ppm) (dung môi CDCl3) TDR 133 Chất đã công bố 1 C 141,6 141,4 2 CH 128,4 128,5 3 CH 128,5 128,5 4 CH 126,0 126,0 5 CH 128,5 128,5 6 CH 128,4 128,5 1’ C 103,8 103,8 2’ C 151,2 151,2 3’ CH 127,8 141,6 4’ C 162,0 162,0 5’ C 92,6 92,7 6’ C 158,0 158,1 C = O 204,4 204,5 Cα CH2 45,2 45,3 Cβ CH2 30,5 30,5 4’ OCH3 61.4 61,4 5’ OCH3 56,0 56,0 Từ các số liệu phổ 1H – NMR và 13C – NMR của hợp chất TDR 133 so với phổ đã được công bố xác định cấu tạo của hợp chất A là: (4.1) 2’, 6’ - dihydroxy - 4’, 5’- dimethoxy - dihydrochalcone (dihydropashanone) 4.2. Xác định cấu trúc TDR 168 từ rễ cây sắn thuyền Hợp chất TDR 168 có dạng tinh thể màu vàng. 4.2.1. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR của TDR 168 Hình 4.7: Phổ 1H - NMR của hợp chất TDR 168 Hình 4.8: Phổ giãn 1H - NMR của hợp chất TDR 168 Phổ 1H – NMR của hợp chất TDR 168 có những tín hiệu đặc trưng sau: Phổ 1H – NMR của hợp chất TDR 168 có 5 tín hiệu. - Hai tín hiệu doublet tương ứng với độ chuyển dịch hoá học d = 6,19 ppm, J = 2 Hz và d = 6,39 ppm, J = 2 Hz là của các proton thơm vòng A (H6 và H8). - Proton thơm H2’ của vòng C có tín hiệu doublet ứng với độ chuyển dịch hoá học d = 7,74 ppm, J = 2 Hz. - Hai proton thơm của vòng C là H5’ và H6’ ở vị trí octo với nhau có độ chuyển dịch hoá học d = 6,89 ppm, J = 8,5 Hz và d = 7,64 ppm, J = 8,5 Hz trên phổ có hai tín hiệu doublet. Bảng 4.3: Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 1H – NMR của hợp chất TDR 168 Số cacbon Nhóm cacbon 1H – NMR (d : ppm), J (Hz) 6 CH 6.19 (d), J = 2 8 CH 6.39 (d), J = 2 2’ CH 7.74 (d), J = 2 5’ CH 6.89 (d), J = 8,5 6’ CH 7.64 (dd), J1 = 8,5, J2 = 2 4.2.2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 168 Hình 4.9: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 168 Hình 4.10: Phổ giãn 13C - NMR của hợp chất TDR 168 Hình 4.11: Phổ DEPT của hợp chất TDR 168 Phổ 13C – NMR của hợp chất TDR 168 có những tín hiệu đặc trưng sau: Phổ 13C – NMR của hợp chất TDR 168 có 15 tín hiệu cho thấy chất này có 15 nguyên tử cacbon. - Nguyên tử cacbon của nhóm cacbonyl ở vị trí C4 có độ chuyển dịch hoá học d = 176,2 ppm. - Hai tín hiệu cộng hưởng của nguyên tử cacbon của liên kết đôi ở vị trí C2 và C3 có giá trị tương ứng d = 147,4 ppm và d = 136,4 ppm. - Các nguyên tử cacbon của vòng thơm liên kết với nhóm –OH có độ chuyển dịch hoá học d = 158,3 ppm (C5), d = 165,6 ppm (C7), d = 146,5 ppm (C3’) và d = 148,4 ppm (C4’). - Nguyên tử cacbon C6 và C8 của vòng A ứng với độ dịch chuyển hoá học d = 99,7 ppm, d = 94,6 ppm - Các nguyên tử cacbon của vòng C là C5’ và C6’ có độ dịch chuyển hoá học d = 116,9 ppm, d = 120,8 ppm Phổ DEPT của hợp chất TDR 168 Phổ DEPT của hợp chất TDR 168 có 5 tín hiệu nhóm CH, không có tín hiệu nhóm CH2 chứng tỏ có 5 nhóm CH, không có nhóm CH3, và không có nhóm CH2. Tác giả Jae Hyeok Lee, Chung Hwan Ku, Sung Hoon Kim, Hee Wook Park và Dae Keun Kim (2003) trong bài “Phytocchemical constituents from Diodia teres” công bố trên Arch Pham Res 27(1) pp 40-43 đã đưa ra bảng số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 13C – NMR (100 MHz, DMSO-d6) của Quercetin (C15H10O7) ở bảng 4.4: Bảng 4.4: Số liệu cộng hưởng từ hạt nhân 13C - NMR của hợp chất TDR 168 và chất đã công bố. Số cacbon Nhóm cacbon 13C–NMR(d:ppm) TDR 168 (dung môi CDCl3) Chất đã công bố (dung môi DMSO-d6) 2 C 147,4 146,8 3 C 136,2 135.7 4 C=O 176,2 175,6 5 C 161,3 160.6 6 CH 99,7 98,2 7 C 165,6 165,8 8 CH 94,6 93,5 9 C 158,3 156,2 10 C 103,6 103,0 1’ C 122,8 122,0 2’ CH 116,4 115.2 3’ C 146,5 145,0 4’ C 148,4 147,5 5’ CH 116,9 115,5 6’ CH 120,9 120.1 Từ các số liệu phổ 1H – NMR và 13C – NMR của hợp chất TDR 168 so với phổ đã được công bô xác định cấu tạo của hợp chất B là: Quercetin (C15H10O7) có công thức cấu tạo là: (4.2) Quercetin (C15H10O7) KẾT LUẬN Bằng phương pháp chiết với dung môi metanol, sau đó lần lượt chiết với các dung môi hexan, clorofom, etylaxetat, butanol và chưng cất thu hồi dung môi ở áp suất thấp, lần lượt thu được các cao tương ứng. Cao etylaxetat sử dụng sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel, hệ dung môi rửa giải là etylaxetat - metanol với độ phân cực tăng dần lần lượt thu được các phân đoạn khác nhau. Tiến hành rửa, kết tinh nhiều lần và kiểm tra độ sạch bằng sắc ký lớp mỏng thu được một số hợp chất tương đối sạch trong đó có 2 hợp chất kí hiệu là TDR 133, TDR 168 từ rễ cây sắn thuyền. Sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H - NMR, 13C - NMR, DEPT), kết hợp với chất chuẩn đã xác định được cấu trúc của hợp chất TDR 133 là: 2’, 6’ – dihydroxy – 4’, 5’- dimethoxy – dihydrochalcone (dihydropashanone); hợp chất TDR 168 là: Quercetin. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TIẾNG VIỆT Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, TP HCM. Nguyễn Xuân Dũng, Đào Hữu Vinh và các cộng sự (1985), Các phương pháp sắc ký, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. Trần Đình Đại (1998), Khái quát về thực vật Việt Nam, Hội thảo Việt - Đức về hóa học và các hợp chất thiên nhiên, Hà Nội, tr.17-27. Nguyễn Văn Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học. Lê Thị Anh Đào, Nguyễn Xuân Dũng, Hoàng Văn Lựu (1997), Nghiên cứu thành phần hóa học cây vối ở Nghệ An, Tạp chí hóa học, T 35, số 3, tr.47-51. Nguyễn Văn Đậu, Nguyễn Thị Thuận, Đỗ Thị Thanh (2007), Phân lập một số hợp chất từ lá cây vối, Tuyển tập công trình hội nghị khoa học và công nghệ hóa học hữu cơ toàn quốc lần thứ IV, Hà Nội, tr.311-315. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc, Nhà xuất bản Giáo dục. Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, Nhà xuất bản Trẻ, TP HCM, tr.783-796. Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Ngô Văn Quang, Phan Văn Kiên (2007), Axit asiatic phân lập từ cây sắn thuyền (Syzygium resinosum) và có tác dụng lên vi khuẩn Streptoccus mutans, Tạp chí Dược học số 7, tr.19-22. Văn Ngọc Hướng, Nguyễn Xuân Sinh (2003), Isolation and Identification of two triterpenoids from leaves of Syzygium resinosum Gagnep, 8th Eurasia Conference on chemical Science, Hanoi, tr.355-359. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr.395. Hoàng Văn Lựu (1996), Nghiên cứu thành phần hóa học một số cây thuộc họ Sim (Myrtaceae) ở Nghệ An, Luận án Tiến sĩ khoa hóa học, Trường đại học Sư phạm Hà Nội. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng, Lê Thị Anh Đào (1994), Đặc trưng hóa học tinh dầu hoa vối (Cleistocalyx operculatus Roxb. Merr et Perry) của Việt Nam, Thông báo khoa học, Đại học sư phạm Hà Nội, tr.32-34. Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Quang Tuệ (2004), Thành phần hóa học của cây Gioi, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học, Tập 9, số 1, tr.20-23. Nguyễn Đức Minh (1975), Tính kháng khuẩn của cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học. Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Quyết Tiến, Nông Thị Liễu (2009), Tuyển tập các báo cáo khoa học, Hội nghị khoa học và công nghệ sinh học toàn quốc tại Thái Nguyên, tr.253-257. Nguyễn Văn Thanh, Hoàng Văn Lựu, Chu Đình Kính, Phạm Thị Thanh Mỹ (2008), Xác định cấu trúc một số hợp chất tách từ rễ cây sắn thuyền (Syzygium resinosum (Gagnep.., Merr. Et Perry), Tạp chí Hóa học, 46 (5A), tr.260-264. Y học cổ truyền Tuệ Tĩnh B. TIẾNG ANH Jaki BU, Franzblau SG, Chadwick LR, Lankin DC, Zhang F, Wang Y, Pauli GF (2008), Purity-activity relationships of natural products: the case of anti-TB active ursolic acid, J Nat Prod, 71(10), pp.1742-1748. Byung Sun Min, Cao Van Thu, Nguyen Tien Dat, Nguyen Hai Dang, Han-Su Jang and Tran Manh Hung (2008), Antioxidative Flavonoids from Cleistocalyx operculatus Buds, Chemical & Pharmaceutical Bulletia, 56 (12), pp.1725-1728. Chapman & Hall/CRC, DNP on CD-ROM, Version 15:1. Churng - Werng Chang, Tian-Shung Wu, Yih-Shoa Hsieh, Sheng-Chu KuO, and Pei-Dawn Lee Chao, (1999), Terpenoids of Syzygium formosanum, J. Nat. Prod., 62 (2), pp.327-328. Dao Trong Tuan, Bui Thanh Tung, Nguyen Phi Hung, Thuong Phuong Thien, Sung Sik Yoo, Eun Hee Kim, Sang Kyum Kim and Won Keun Oh (2010), C-methylated flavonoids from Cleistocalyx operculatus and their Inhibitory effects on novel influenza A (H1N1) neuraminidase, J. Nat. Prod, 73 (10), pp.1636-1642. Kadliya S.El Deeb, Rwaida A.Al-Haidari, Jaber S.Mossa, Abdel-Monem Ateya, (2003), Phytochemical and pharmacological studies of Maytenus forsskaoliana, Saudi Pharmaceutical Journal, 11 (4) pp. 184-191. Fernandez M.A., De las Heras B., Garcia M.D., Saenz M.T. (2001), New insights into the mechanism of action of the anti - inflammatory triterpen lupeol, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 53 (11), pp.1533-1539. Ibrahim I. Mahmoud, Mohamed S.A. Marzuok, Fatma A.Moharram, Mohamed R.Gindi and Amel M.K Hassan (2001), Acylated flavonol glycosides from Eugenia jambolana (Syzygium jambos) leaves, Phytochemistry volume 58 (8), pp.1239-1244. Yoshiki Kashiwada, Hui-Kang Wang, Tsuneatsu Nagao, Susumu Kitanaka, Ichiro Yasuda, Toshihiro Fujioka, Takashi Yamagishi, L. Mark Cosentino, Mutsuo Kozuka, Hikaru Okabe, Yasumasa Ikeshiro, Chang-Qi Hu, Eric Yeh, and Kuo-Hsiung Lee (1998), Anti-AIDS agents. 30. Anti-HIV activity of Oleanolic acid, Pomolic acid, and structurally related triterpenoids, J. Nat. Prod 61 (9), pp.1090-1095. Kenji Shiojima, Yoko Arai, Kazuo Masuda, Yoichi Takase and Hiroyuki Ageta (1992), Mass Spectra of Pentacyclic Triterpenoids, 40, pp.1683-1690. Kuiate JR, Mouokeu S, Wabo HK, Tane P. (2007), Antidermatophytic triterpenoids from Syzygium jambos (L.) alston (Myrtaceae), Phytother Res, 21(2), pp.149 - 152. Kuo-Hsiung Lee, Yuh-Meei Lin, Tian-Shung Wu, De-Cheng Zhang, Takashi Yamagishi, et al (1988), The cytotoxic Principles of Prunella vulgaris, Psychotria serpens, and Hyptis capitata: Ursolic Acid and Related Derivatives, Planta Med, 54 (4), pp.308-311. Mahmoud L. Nassar (2006), Flavonoid triglycosides from the seed of Syzygium aromaticum, Carbohydrate Research, 341 (1), pp.160-163. Mahmoud L. Nassar, Ahmed H.Gaara, Ahmed H.EL-Ghorab, Abdel Razic H. Farrag Hui Shen, Enamul Hua and Tom J.Marby (2007), Chemical constituents of clove (Syzygium aromaticum, Fam. Myrtaceae) and their antioxidant activity, Rev. Latinoamer. Quim 35/3. Matsutake Higa, Kazuhito Ogihara, and Seiichi Yogi (1998), Bioactive naphthoquinone derivatives from Diospyros maritima BLUME, Chemical & Pharmaceutical Bulletia, 46, pp1189-1193. Min BS, Jung HJ, Lee JS, Kim YH, Bok SH, Ma CM, Nakamura N, Hattori M, and Bae K (1999), Inhibitory effect of triterpenes from Crataegus pinatifida on HIV-I protease, Planta Med, 65(4), pp 374-375. Moriarity DM, Huang J, Yancey CA, Zhang P, Setzer WN, Lawton RO, Bates RB, Caldera S (1998), Lupeol is the cytotoxic principle in the leaf extract of dendropanax of querceti, Planta Med, 64 , pp 370-372. Myint Myint Khine (2006), Isolation and Characterization of phytoconstituents from Myanmar Medicinal Plants, Dissertation, pp29-33. Slowing K., Sollhunber M., Carretero E., Villar A (1994), Flavanoids glycosides from Eugenia jambos, phytochemistry, 37 (1), pp255-258. Zhang Fengxian, Liu Meifang and Lu Renrong (1990), Chemical constituents from the bud of Cleistocalyx operculatus, Acta Botanica Sinica 32 (6), pp.469