Luận văn Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme invertase (-Fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------- LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------- LƢU THỊ CƢ PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE (-FRUCTOFURANOSIDASE) NHẰM TĂNG TRỮ LƢỢNG SUCROSE Ở CÂY MÍA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUỲNH LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Lưu Thị Cư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, KS. Đỗ Tiến Phát Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, là những ngƣời đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành luận văn. Trong thời gian thực tập nghiên cứu tôi cũng đã nhận đƣợc sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị, các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo trong khoa Sinh- KTNN và khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên đã hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những ngƣời thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn dành cho tôi, động viên và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. Thái Nguyên, ngày 25 tháng 09 năm 2009 Học viên Lưu Thị Cư Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................... 3 1.1. VAI TRÒ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA ................................ 3 1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía ............................................................................................. 3 1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam ................................................................ 4 1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE ........................................................................... 5 1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO .............................................. 8 1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) .................................................................................... 10 1.5.1. Nguồn gốc RNAi .............................................................................................. 10 1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen .................................................................................. 10 1.6. KỸ THUẬT GATEWAY ® ............................................................................... 12 1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA ........... 14 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........... 16 2.1. NGUYÊN LIỆU................................................................................................... 16 2.1.1. Nguyên liệu thực vật ........................................................................................ 16 2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme ....................................................................... 16 2.1.3. Hóa chất khác .................................................................................................... 16 2.1.3. Các thiết bị máy móc ....................................................................................... 17 2.2. PHƢƠNG PHÁP ................................................................................................. 17 2.2.1. Thiết kế mồi....................................................................................................... 17 2.2.2. Tách RNA tổng số ............................................................................................ 18 2.2.3. RT-PCR .............................................................................................................. 18 2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen ............................................................... 19 2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi ........................................................... 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo ...................................................................... 21 2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía ....................................... 22 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: ...................................................................................... 2 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................... 24 3.1. THIẾT KẾ MỒI ................................................................................................... 24 3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ ...................................................................................... 25 3.3. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE ............ 27 3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN ............................. 28 3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR ............................................................ 28 3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 ............................................................................................ 28 3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR ............................. 29 3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit ................................................................ 31 3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi ........................................... 31 3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway ....................... 31 3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli ........................... 32 3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. .......................................... 34 3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA ................... 35 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo ..................................................... 35 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen ............................................... 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT AS Acetosyringone A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) bp Cặp base cDNA Complementary DNA = DNA bổ sung đƣợc tổng hợp bằng khuôn mRNA cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonat DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr đEtBrEthiium bromide E.coli Escherichia coli gus β-glucuronidase IBA Indole-3-Butyric Acid kb kilo base LB Luria and Bertani MS Môi trƣờng nuôi cấy theo Murashige và Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Giá trị mật độ quang (optical density) PCR Polymerase Chaine Reaction = Phản ứng chuỗi Polymerase RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus DNA (polymerase) 2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm ................................................. 16 Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc................................... 18 Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR ............................................................ 19 Bảng 2.4. Các môi trƣờng tái sinh cây mía ............................................................. 21 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3’INV và 5’INV .......................................................................................................... 25 Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI ................................................................................................... 25 Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4. .......................................... 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính ............................................................................................... 6 Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi................................................................ 11 Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway ................................................................ 13 Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2 giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% ............................... 26 Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% ................ 27 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13 (For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong vector pENTR/D ....................................................................................... 30 Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số AY302083 .................................................................................................. 31 Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi ........................................... 32 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII và XbaI ......................................................................................... 34 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV ....................... 35 Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo ................................ 37 Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông qua trung gian A.tumefaciens ................................................................. 39 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Đƣờng là một nhu cầu cần thiết trong đời sống con ngƣời. Theo thống kê, nhu cầu tiêu thụ đƣờng trên thế giới trung bình tính theo đầu ngƣời là 35 kg/1 ngƣời/1 năm. Tại Việt Nam, năm 1994 là 8 kg/1 ngƣời/1 năm, hiện nay là 15 kg/1 ngƣời/1 năm và dự kiến nhu cầu về đƣờng còn tiếp tục tăng nữa. Tại các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, 75% sản lƣợng đƣờng đƣợc sản xuất từ cây mía. Mía là một trong số ít loài thực vật tích trữ chủ yếu đƣờng sucrose (α-D-glucopyranosyl-1, 2-D-fructofuranose), nguồn nguyên liệu ban đầu để sản xuất đƣờng. Do đó, ở Việt Nam mía trở thành một cây công nghiệp trọng yếu và là cây xóa đói giảm nghèo của chính phủ. Tuy nhiên, các giống mía của Việt Nam có năng suất đƣờng chỉ đạt mức trung bình của thế giới. Việc nhập các giống mía cao sản của thế giới kết hợp với phƣơng pháp lai tạo truyền thống chƣa thực sự có hiệu quả trong việc tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao lại phù hợp với điều kiện thổ nhƣỡng khí hậu của nƣớc ta. Chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao bằng công nghệ sinh học có tiềm năng giảm giá thành đƣờng mà không cần tăng diện tích trồng mía và thúc đẩy sự phát triển nền công nghiệp mía đƣờng tại Việt Nam. Sinh tổng hợp sucrose là một quá trình phức hợp, trong đó enzyme Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khóa điều chỉnh sự tích lũy lƣợng sucrose trong cây mía. Nó có vai trò phân hủy sucrose trong tế bào. Vì vậy, muốn tăng trữ lƣợng sucrose trong cây mía thì phải ức chế đƣợc sự biểu hiện của gen mã hóa Invertase. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA-interference) hiện nay đã trở thành một biện pháp công nghệ hữu hiệu có thể ức chế hoàn toàn biểu hiện của gen ở động vật, thực vật và cả vi sinh vật [31]. Ở thực vật, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 RNAi có thể đƣợc thực hiện bằng cách chuyển gen có cấu trúc biểu hiện sự phiên mã cao RNA sense, anti-sense hoặc RNA kẹp tóc bổ sung chính nó mà chứa trình tự tƣơng đồng với gen đích. Với mục tiêu nghiên cứu chọn tạo giống mía có hàm lƣợng đƣờng cao, chúng tôi chọn đề tài “Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hóa enzyme Invertase (β-fructofuranosidase) nhằm tăng trữ lượng sucrose ở cây mía”. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU: Ức chế biểu hiện của Invertase dạng hòa tan nhằm tăng trữ lƣợng sucrose ở cây mía. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU: 1. Phân lập đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía in vitro ROC1 2. Thiết kế đƣợc vector ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase (β- fructofuranosidase) ở cây mía. 3. Nghiên cứu hệ thống tái sinh ở cây mía phục vụ cho mục đích chuyển gen tiếp theo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY MÍA 1.1.1. Sơ lƣợc về cây mía Mía (Saccharum L.) thuộc chi mía (Saccharum), họ hòa thảo (Poaceae), bộ lúa (Poales), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae). Chúng là những cây có thân to, mập, chia đốt cao từ 2 - 6 m. Các loại thực vật trong chi này đa số là các loại cỏ sống lâu năm bao gồm khoảng 6 - 37 loài tùy theo hệ thống phân loại, sống chủ yếu ở khu vực nhiệt đới và ôn đới trên thế giới [2]. Cây mía chứa hàm lƣợng đƣờng rất cao chiếm khoảng 46% khối lƣợng khô, trong đó sucrose chiếm tới 80%. Chính vì thế, mía trở thành một trong những cây công nghiệp quan trọng của ngành công nghiệp sản xuất đƣờng. Ngoài ra, cây mía còn chứa các chất đạm (protein), chất bột (carbohydrate), chất béo (lipid), các chất khoáng và các vitamin… vì thế mía còn có tác dụng thanh nhiệt, giải khát, trợ giúp tiêu hóa, cung cấp năng lƣợng và các chất dinh dƣỡng cần thiết cho cơ thể. Theo Đông y, mía là "vị thuốc" dùng để chữa một số bệnh nhƣ ho khan, đại tiện táo, tiểu tiện bất lợi, đau dạ dày, an thai… Mía còn là loại cây có tác dụng bảo vệ đất rất tốt, đặc biệt là chống xói mòn đất cho các vùng đồi trung du. Hơn nữa, mía là cây rễ chùm và phát triển mạnh trong tầng đất từ 0 - 60 cm (1 ha mía tốt có thể cho 13 - 15 tấn rễ sau thu hoạch), đây là nguồn chất hữu cơ quý làm tăng độ phì của đất. Phần bã mía chứa nhiều cellulose có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, bìa các tông, ép thành ván dùng trong kiến trúc... Sản phẩm cặn bã còn lại sau khi chế biến đƣờng (bùn lọc) có thể sử dụng để sản xuất nhựa, xêrin, làm sơn, xi đánh giầy... phế phẩm còn lại dùng làm phân bón rất tốt. Trong tƣơng lai bã mía còn có thể nguồn nguyên liệu làm bột giấy, làm sợi thay thế Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 các loại cây rừng bị giảm đi. Khi mà nguồn nhiên liệu lỏng ngày càng cạn kiệt nhƣ hiện nay, một số nƣớc phát triển trên thế giới nhƣ Mỹ, Brazil, Ấn Độ… đã bắt đầu sử dụng nhiên liệu sinh học từ cây mía để bổ sung và thay thế. Nhƣ vậy, cây mía có vai trò rất quan trọng trong đời sống kinh tế của con ngƣời. 1.1.2. Tình hình sản xuất mía ở Việt Nam Hiện nay có khoảng 200 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới trồng và sản xuất mía đƣờng, sản lƣợng trung bình đạt khoảng 13.246 triệu tấn (gấp 6 lần so với củ cải đƣờng). Ở Việt Nam, mía là cây trồng chủ đạo trong ngành công nghiệp đƣờng của cả nƣớc. Dự kiến niên vụ 2009-2010 diện tích mía nguyên liệu cả nƣớc sẽ vào khoảng 290.000 ha, tăng 19.400 ha so với vụ trƣớc, trong đó diện tích vùng mía nguyên liệu tập trung của các nhà máy là 221.816 ha với năng suất mía bình quân đạt 55 tấn/ha và sản lƣợng đạt 16 triệu tấn. Cây mía góp phần xóa đói giảm nghèo ở vùng trung du, miền núi ở nhiều tỉnh nƣớc ta nhƣ: Hòa Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Phú Yên, Bình Định, Quảng Ngãi [3]... Nhà nƣớc đã hỗ trợ một phần đầu tƣ phát triển cơ sở hạ tầng giao thông, thủy lợi cho vùng trồng mía tập trung, nghiên cứu chuyển giao khoa học kỹ thuật và công nghệ nhằm nâng cao năng suất, chất lƣợng, hiệu quả sản xuất mía đƣờng [1]. Quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa ngày một gia tăng cùng với sự biến đổi môi trƣờng khí hậu nên diện tích đất trồng trọt có xu hƣớng ngày một thu hẹp. Hơn nữa, ở nƣớc ta hiện nay có tới trên 60% các giống mía là những giống cũ nhƣ: ROC1, ROC10, F156, F127… hoặc các dạng lai ghép nội chi phức tạp. Các giống này có đặc điểm dễ canh tác, thích nghi rộng với nhiều vùng sinh thái của Việt Nam, nhƣng trữ lƣợng đƣờng rất thấp. Còn lại các giống mía nhập nội tuy có trữ lƣợng đƣờng cao song không phù hợp với khí hậu Việt Nam nên năng suất thấp. Chính vì thế, Quyết định số 26/2007/QĐ- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 TTg của Phó thủ tƣớng Nguyễn Sinh Hùng “Quy hoạch phát triển mía đƣờng đến năm 2010 và định hƣớng đến năm 2020” đƣợc phê duyệt đã đƣa quan điểm rõ ràng là: đồng thời với việc nhập khẩu giống mía có năng suất, trữ đƣờng cao đƣợc đánh giá tốt phù hợp với Việt Nam thì phải xây dựng hệ thống viện nghiên cứu và các trung tâm giống mía đủ điều kiện trang thiết bị và năng lực cán bộ để chủ động sản xuất giống tốt, có năng suất, trữ lƣợng đƣờng cao của Việt Nam, đáp ứng yêu cầu sản xuất [1]. 1.2. SINH TỔNG HỢP SUCROSE Trong lục lạp của mía có enzyme photphoenolpyruvat-cacboxilase hoạt động rất mạnh. Sản phẩm đầu tiên của quang hợp ở mía là các axit oxaloaxetic, malic, aspartic đều gồm có bốn nguyên tử cacbon trong phân tử, do đó mía đƣợc gọi là thực vật C4 [5]. Chu trình C4 (hay cơ chế Hatch-Slack) là cơ chế có sự chuyên hoá trong việc thực hiện chức năng quang hợp của cây C4: một loại lục lạp chuyên trách cố định CO2, còn một loại lục lạp chuyên khử CO2 thành các chất hữu cơ cho cây. Vì vậy mà hoạt động quang hợp của cây C4 có hiệu quả hơn các nhóm thực vật khác và thƣờng cho năng suất sinh học rất cao. Sucrose là một disaccharide của glucose (α-D-glucopyranoside) và fructose (β-D-fructofuranosyl), có công thức phân tử C12H22O11. Đây là sản phẩm chính của quá trình quang hợp, có vai trò bổ sung năng lƣợng cho quá trình sinh trƣởng phát triển của thực vật cũng nhƣ các sinh vật sống khác. Trong cơ thể động vật, sucrose là nguyên liệu tổng hợp glucogen, khi thừa sẽ chuyển sang dạng mỡ dự trữ. Sucrose tích lũy phần lớn ở các mô của thực vật, giúp cho thực vật có khả năng thích nghi tốt hơn với các điều kiện bất lợi của môi trƣờng nhƣ: hạn, lạnh, mặn và cƣờng độ ánh sáng mạnh... [7, 12, 17, 23, 26, 30]. Nó đƣợc tích trữ chủ yếu ở cây mía, củ cải đƣờng và có ở Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 trong nhiều loại cây khác nhƣ dứa, chuối, mơ, mận, dƣa hấu, táo, cà rốt… đây là nguồn nguyên liệu tự nhiên, rất dễ trồng với số lƣợng lớn và giá rẻ. Sucrose rất dễ hòa tan trong nƣớc, khi bị thủy phân tạo thành glucose và fructose. Sinh tổng hợp sucrose là một chu trình phức tạp diễn ra ở cytosol (tế bào chất) trong lá của cây trồng với sự tham gia của nhiều enzyme khác nhau, trong đó một số enzyme chính (key enzyme) có ảnh hƣởng lớn tới lƣợng sucrose đƣợc tổng hợp. Các enzyme này xúc tác cho các dạng phản ứng: (1) Tổng hợp sucrose nhƣ sucrose 6-phosphatephosphatase (SPS) hoặc sucrosesynthase (SS) (2) Thủy phân sucrose nhƣ β-fructofuranosidase (Invertase) (3) Vận chuyển các hexose tới tế bào chất và chuyển hóa lại thành sucrose nhƣ pyrophosphate fructose 6-phosphat 1 phosphostransferase (PFP) [6]. Hình 1.1: Chu trình sinh tổng hợp sucrose với sự tham gia của các enzyme chính SUCROSE 6’-P FRUCTOSE GLUCOSE 6-P ATP FRUCTOSE 1.6-P2 GLUCOSE 1-P UDP-GLUCOSE UTP SUCROSE FRUCTOSE 6-P GLUCOSE ADP UDP UDP ADP ATP PPi Pi Pi Invertase SPS SS Pi PFP Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Thay đổi hoạt tính các enzyme này thƣờng dẫn tới những biến đổi lớn trong lƣợng sucrose tích lũy trong tế bào thực vật [6, 10, 11, 15, 31, 35]. Các enzyme liên quan tới chu trình sinh tổng hợp sucrose ở thực vật đã đƣợc nghiên cứu trên nhiều đối tƣợng gồm cả thực vật hai lá mầm và một lá mầm [10, 15, 31]. Trong đó, SPS (sucrose 6-phosphatephosphatase) đƣợc coi là enzyme chính của chu trình sinh tổng hợp sucrose ở thực vật, nó xúc tác quá trình hình thành sucrose 6-phosphate, cơ chất cho phản ứng tổng hợp các phân tử sucrose [7, 16]. SPS là enzyme có hoạt tính tỉ lệ thuận với sucrose trong các mô dự trữ của khoai tây, ngô, cải bó xôi [30]. Ở ngô, hoạt tính SPS tỉ lệ thuận với tốc độ tổng hợp và vận chuyển sucrose [16]. Cây cà chua chuyển gen tăng cƣờng biểu hiện SPS thì lƣợng sucrose tăng còn lƣợng tinh bột giảm trong quá trình quang hợp [33]. Tƣơng tự, cây bông mang gen SPS của rau bi-na (spinacia oleracea) cũng có tốc độ tổng hợp sucrose cao hơn so với đối chứng [13]. Ngƣợc lại, khi làm bất hoạt SPS, các dòng cây khoai tây chuyển gen sẽ giảm trữ lƣợng sucrose [10]. Gen mã hóa cho SPS đã đƣợc phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau và cho tới nay ngân hàng gen NCBI đã có thông tin về vài trăm trình tự SPS của các loài thực vật hai lá mầm nhƣ khoai tây, thuốc lá, rau bi-na, củ cải đƣờng; cây một lá mầm nhƣ lúa, ngô, mía và cả tảo lam [9, 10, 13, 14, 21, 27, 31, 33]. Liên quan chặt chẽ với SPS trong chu trình sinh tổng hợp sucrose là enzyme thủy phân sucrose - Invertase (β- fructofuranosidase). Khi hoạt tính của Invertase cao thì lƣợng đƣờng tích lũy trong các mô tế bào giảm và ngƣợc lại. Hoạt tính của enzyme pyrophosphate fructose 6-phosphotransferase (PFP) cũng tỉ lệ nghịch với lƣợng sucrose trong tế bào thực vật [11]. PFP xúc tác chuyển hóa fructose 6-phosphate thành fructose 1,6-biphosphate. Do vậy, nếu hoạt tính của PFP giảm, lƣợng cơ chất cho phản ứng tổng hợp sucrose sẽ tăng, dẫn tới lƣợng sucrose cũng tăng tƣơng ứng. Ảnh hƣởng này đã đƣợc chứng minh trên các dòng mía có mang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 cấu trúc antisense làm bất hoạt PFP. Lƣợng sucrose trên các cây mía chuyển gen còn non tăng khoảng 50%. Tuy nhiên, khi phân tích trên các cây trƣởng thành, tổng lƣợng sucrose tăng, nhƣng chƣa đáng kể so với đối chứng [11]. Những nghiên cứu trên đã chứng tỏ đƣợc vai trò quan trọng của các enzyme SPS, PFP, Invetase trong việc tổng hợp và tích lũy sucrose ở thực vật. 1.3. VẬN CHUYỂN SUCROSE TRONG TẾ BÀO Theo thuyết vận chuyển đƣờng (hay thuyết Turgeon), đƣờng sucrose đƣợc tổng hợp ở tế bào chất của các tế bào thịt lá trong quang hợp sẽ đƣợc vận chuyển ra không bào, sau đó nhờ hệ thống cấu trúc liên kết giữa các tế bào (sợi liên bào và cầu sinh chất hay plasmodesmata) nó sẽ đƣợc chuyển từ tế bào này sang tế bào khác và nhờ ống dẫn phloem mà sucrose đi tới khắp các cơ quan của thực vật bằng con đƣờng khuyếch tán. Các phân tử nhỏ sucrose trong ống dẫn phloem sẽ đƣợc polyme hóa thành những phân tử đƣờng lớn và phức tạp hơn, lúc này các phân tử đƣờng đƣợc đẩy ra xa khỏi lá đến những phần khác của cây, nơi mà nó đƣợc sử dụng hay tích trữ lại, và do kích thƣớc của nó quá lớn nên nó không thể chuyển ngƣợc trở về lá. Chính cơ chế khuếch tán này đã tạo nên sự vận chuyển liên tục sucrose từ các cơ quan quang hợp (source tissue) tới các cơ quan dự trữ (sink tissue). Bên cạnh đó, sucrose còn đƣợc vận chuyển và tích trữ tại không bào làm nguyên liệu cho chu trình sinh tổng hợp tinh bột. Ngoài lƣợng sucrose đƣợc vận chuyển liên tục, một phần sucrose sẽ đƣợc phân hủy nhằm cung cấp năng lƣợng cho quá trình sinh trƣởng và phát triển, đồng thời tái tạo các cơ chất khác. 1.4. ENZYME INVERTASE (β-FRUCTOFURANOSIDASE) Invertase (β-fructofuranosidase) đƣợc mã hóa bởi 5 - 10 đồng phân tùy thuộc từng loài thực vật khác nhau. Cây mô hình Arabidopsis thaliana có 5 đồng phân Invertase, trong khi ở cà chua hiện nay đã phân lập đƣợc 8 đồng phân. Hiện nay, trên ngân hàng gen đã có trình tự EST (Expressed Sequenced Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Tags) của enzyme Invertase phân lập từ một số giống mía [35]. Invertase trung tính (có trong tế bào chất) đã đƣợc tinh sạch từ thân mía trƣởng thành. Tuy nhiên trình tự gen mã hóa cho dạng enzyme này vẫn chƣa đƣợc công bố trên GenBank. Invertase có mặt ở hầu hết các mô thực vật tích trữ đƣờng và tồn tại ở nhiều dạng khác nhau: dạng hoà tan (soluble acid Invertase) có nhiều trong không bào (dịch tế bào); dạng liên kết với màng (cell wall Invertase) có trong thành tế bào; dạng độc lập (neutral Invertase) có chủ yếu trong hạt. Nó là một enzyme xúc tác quá trình thủy phân sucrose trong không bào thành hai đƣờng đơn là glucose (Aldohexose) và fructose (Ketohexose) [6]. Vì thế, mức độ biểu hiện của nó có nhiều ảnh hƣởng lên sự sinh trƣởng phát triển của thực vật [6]. Cụ thể, khi Invertase có hoạt tính cao nó sẽ làm giảm một lƣợng sucrose đáng kể trong thân cây mía. Nghiên cứu cho thấy những dòng mía có sản lƣợng đƣờng cao thƣờng là các dòng có hoạt tính Invertase thấp và ngƣợc lại [35]. Tƣơng tự, một số dòng cà chua ngọt có tích lũy nhiều đƣờng là do hoạt tính của Invertase thấp. Invertase có hoạt tính cao trong không bào của tế bào thuốc lá và đậu tƣơng cũng đã làm giảm lƣợng sucrose trong các cơ quan này [6]. Bất hoạt Invertase làm tăng tỉ lệ tích trữ sucrose trong cây cà chua chuyển gen ở lá và quả, đồng thời cũng làm thay đổi tỉ lệ đƣờng đơn (hexose) trong các dòng cây này [18, 24]. Lá của các dòng khoai tây biểu hiện gen mã hóa Invertase phân lập từ nấm men tích trữ chủ yếu glucose và fructose hơn là sucrose. Hơn nữa, những dòng này hình thành ít củ và nhỏ hơn các dòng đối chứng, nhƣng chứa nhiều đƣờng hơn là tinh bột. Điều này chứng tỏ rằng Invertase có liên quan chặt chẽ tới hàm lƣợng và vận chuyển của sucrose ở thực vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Nhƣ vậy, Invertase đƣợc xem nhƣ là một chiếc chìa khoá điều chỉnh sự tích lũy sucrose dự trữ trong thực vật. Do đó, ức chế biểu hiện của Invertase có thể tăng tích lũy sucrose trong cây mía. 1.5. ỨC CHẾ BIỂU HIỆN GEN BẰNG PHƢƠNG PHÁP RNAi (RNA INTERFERENCE) 1.5.1. Nguồn gốc RNAi RNAi là một cơ chế căn bản để kiểm soát chuỗi thông tin di truyền hay cách vô hiệu hoá hoạt động của các gen xác định do hai nhà khoa học Andrew Z. Fire và Craig C. Mello khám phá ra và công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/12/1998 [4]. Andrew Fire và Craig Mello đã nghiên cứu cơ chế điều khiển biểu hiện gen ở giun tròn (Caenorhabditis elegans) và cho rằng khi mRNA “chiều dịch mã” và “chiều đối mã” gặp nhau thì chúng sẽ kết hợp lại thành những mRNA sợi kép. Hai ông đã kiểm chứng lại giả thuyết của mình bằng cách tiêm các phân tử mRNA sợi kép chứa các mật mã di truyền quy định nhiều protein khác của giun tròn. Kết quả đều thu đƣợc protein đƣợc mã hóa bởi các gen đó không đƣợc tổng hợp. Qua đó Fire và Mello đã rút ra đƣợc kết luận rằng có thể RNA dạng chuỗi kép đã làm các gen bị bất hoạt. Công trình đƣợc công bố và đƣợc trao giải Nobel Y học năm 2006. 1.5.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi (RNA interference) đƣợc coi nhƣ một phƣơng thức miễn dịch tự nhiên giúp sinh vật chống lại sự xâm nhập của virus RNA bằng cách phân huỷ các trình tự nucleotide tƣơng đồng của chúng [8]. Nó làm trung gian kháng lại cả acid nucleic ngoại bào và nội bào, cũng nhƣ điều khiển sự biểu hiện gen mã hóa protein. Nó đƣợc thực hiện khi có sự xuất hiện của phân tử RNA mạch kép trong cơ thể sinh vật gây nên ức chế sự biểu hiện gen của một loại trình tự đặc hiệu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Hình 1.2. Cơ chế gây bất hoạt gen RNAi Hình 1.2 cho thấy, Cơ chế RNAi đƣợc bắt đầu bằng việc phân cắt phân tử RNA chuỗi kép (dsRNA) bởi enzyme Dicer - một trong những enzyme thuộc họ RNase III, tạo thành các phân tử RNA ức chế nhỏ (siRNA) có kích thƣớc khoảng 21 - 26 nucleotide [4]. Các siRNA này đƣợc giải xoắn và một mạch gắn kết với một phức hợp protein một cách chọn lọc gọi là phức hợp cảm ứng sự bất hoạt RNA (RISC – RNA Induced Silencing Complex). Argonaute (protein Argonaute) trong RISC có chứa RNase-H hoạt động nhƣ một endonuclease sẽ tách siRNA thành những chuỗi RNA đơn, trong đó chỉ có một chuỗi đơn RNA có đầu 5’ có lực bắt cặp base (base pairing) nhỏ nhất đƣợc chọn để tiếp tục đi vào phức hệ RISC. Sau đó, RISC sẽ thu nhận các phân tử phiên mã mRNA nội sinh của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của chuỗi siRNA đang có mặt trong phức hệ bằng cách bắt cặp với các base theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 nguyên tắc bổ sung. Khi đã đƣợc nhận diện các mRNA nhanh chóng bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi xoắn kép siRNA-mRNA và bị tiêu hủy bởi các RNA nuclease (Helicase) có trong RISC. Sợi RNA bị phân cắt, tiếp tục hình thành các siRNA. Quá trình tiếp diễn liên tục nhƣ vậy sẽ phân hủy các bản mã sao hình thành, kết quả là ức chế biểu hiện của gen mong muốn [4]. Cơ chế can thiệp RNAi đem lại những ứng dụng vô cùng to lớn và đang là công cụ nghiên cứu hữu ích trong nhiều ngành sinh học, nông nghiệp và y dƣợc học. Nó đƣợc biết đến nhƣ một kỹ thuật sinh học hiện đại có hiệu quả trong việc chuyển gen phòng chống bệnh do virus, vi khuẩn, hay làm tăng cƣờng, ức chế một tính trạng mong muốn nào đó ở sinh vật. Phƣơng pháp này đã đƣợc ứng dụng thành công để thay đổi thành phần chất béo trong dầu, loại caffein trong cà phê, tăng hàm lƣợng lysine trong ngô hoặc loại các chất gây dị ứng ở táo và cà chua [19, 20, 25]. RNAi là một hƣớng mới cho phép các nhà khoa học nghiên cứu những ứng dụng trong các liệu pháp trị bệnh cho con ngƣời trong tƣơng lai cũng nhƣ phân tích chức năng hệ gen cây trồng v.v... 1.6. KỸ THUẬT GATEWAY Kỹ thuật Gateway (Invitrogen) là một kỹ thuật dòng hóa phổ biến, nó mang lại hiệu quả cao và nhanh chóng khi phân tích chức năng, biểu hiện protein và dòng hóa đoạn DNA. Kỹ thuật này cho phép chuyển đoạn DNA giữa các vector tách dòng khác nhau mà vẫn duy trì định hƣớng chính và cấu trúc đọc, thay thế việc sử dụng các enzyme giới hạn và các enzyme nối hiệu quả trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này có hiệu quả cao (90%) đối với việc tách dòng có định hƣớng của các sản phẩm PCR. Hơn nữa các phản ứng đơn giản, dễ thực hiện, nhanh, mạnh và tự động. Đây là kỹ thuật hữu ích cho những đặc tính tái tổ hợp đặc hiệu vị trí của vi khuẩn lambda, giúp cho phản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra một cách hiệu quả và gắn các đoạn trình tự DNA vào nhiều hệ thống vector. Hình 1.3. Sơ đồ mô tả kỹ thuật Gateway - Kỹ thuật Gateway đƣợc thực hiện bởi hai bƣớc chính: + Tạo dòng tiếp nhận “entry clone” bằng cách chèn gen biểu hiện (expression gene) vào vector tiếp nhận (pENTR/D). + Tạo dòng biểu hiện (expression clone) bằng cách tái tổ hợp giữa “entry clone” với một vector đích (destination vector) mà có chứa các trình tự attR1 và attR2 và marker có khả năng kháng chọn lọc ccdB. Trên hình 1.3 cho thấy dòng vector nhận có các điểm tái tổ hợp attL1 và attL2 sẽ phản ứng với các điểm tái tổ hợp trên vector đích attR1 và attR2 để tạo ra một cấu trúc mới attB1 và attB2. Mặt khác, đoạn gen quan tâm đƣợc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 gắn vào trên vector nhận sẽ trao đổi chéo với đoạn ccdB trên vector đích vì thế thu đƣợc trên dòng biểu hiện có cấu trúc của đoạn gen mong muốn. 1.7. NGHIÊN CỨU VỀ TÁI SINH VÀ CHUYỂN GEN Ở CÂY MÍA Tái sinh cây đƣợc xem là mấu chốt quan trọng, quyết định sự thành công của các thí nghiệm chuyển gen. Hiện nay, hệ thống chuyển gen ở thực vật thông qua A.tumefaciens đã mang lại những thành tựu lớn trong thời gian ngắn có thể tạo ra các giống cây trồng có những đặc tính tốt mong muốn. Ở mía đã chuyển gen thành công với hai phƣơng pháp là súng bắn gen và thông qua vi khuẩn A.tumefaciens, trong đó chuyển gen thông qua A.tumefaciens là hiệu quả hơn hẳn. Snyman và cs (2006) đã tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía bằng phƣơng pháp súng bắn gen từ mô sẹo [29]. Mô sẹo tạo ra bằng cách đặt những lát cắt nhỏ dày 1 - 2 mm ở phần đỉnh ngọn của cây mía lên môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo là (MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l casein + 0,6 mg/l 2,4D +5 g/l agar), pH = 5,8 trong điều kiện tối, ở 28oC. Trƣớc 4 giờ chuyển gen bằng kỹ thuật súng bắn gen, các mô sẹo đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ sung thêm 0,2 M Sorbitol; 0,2 M manitol. Sau chuyển gen các mô sẹo đƣợc đồng nuôi cấy ở trong tối, 3 ngày. Tiếp theo mô sẹo đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc và thu đƣợc cây chuyển gen hoàn chỉnh với các môi trƣờng có bổ sung 45 mg/l geneticin. Manickavasagam và cs (2004) tái sinh và chuyển gen thành công ở mía thông qua A.tumefaciens từ các mô phân sinh của chồi bằng con đƣờng tạo đa chồi với hiệu quả thu đƣợc là 49,6% cây chuyển gen [22]. Lây nhiễm A.tumefaciens vào các mô non đã bị làm thƣơng của mía trong 10 phút. Sau đó thấm khô trên giấy thấm và đặt lên môi trƣờng MS trong 3 ngày. Các mô đƣợc diệt khuẩn bằng nƣớc cất khử trùng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Ông tạo đƣợc các cây chuyển gen trên các môi trƣờng chọn lọc tái sinh có bổ sung 5 mg/l ppt. Santosa và cs (2004) chuyển gen thành công vào mô sẹo của mía thông qua A.tumefaciens GV2260. Kết quả kiểm tra các cây sau chọn lọc thấy rằng có khoảng 85 - 100% cây sống sót có mang gen chuyển [34]. Mô sẹo đƣợc tạo từ đoạn thân non trên môi trƣờng [4,3 g/l MS + 30 g/l sucrose + 0,5 g/l NZ- amine + 0,3 ml vitamin (0,1 g / 75 ml hydrochloride thiamine; 0,05 g / 75 ml biotin; 1 g / 75 ml pyrodoxine hydrochlorid; 0,25 g / 75 ml myo-inositol) + 3 mg/l 2,4D + 100 ml nƣớc dừa + 8 g/l agar, pH = 5,8] trong điều kiện tối, 1 tháng. Trƣớc 7 giờ biến nạp với A.tumefaciens bổ sung thêm 75 μl chất chống ôxyhóa vào dịch khuẩn. A.tumefaciens đƣợc hòa tan với môi trƣờng cảm ứng tạo chồi có bổ sung 5 ml chất chống ôxyhóa với OD578 = 0,2 và đƣợc lây nhiễm với các mảnh mô sẹo nhỏ (2 - 3 mm) trong 5 - 10 phút. Diệt khuẩn và chuyển mô sẹo lên môi trƣờng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime ở 28oC, lắc 60 vòng/2 ngày. Cây chuyển gen đƣợc tạo thành với các môi trƣờng chọn lọc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 100 mg/l kanamycin. Zhangsun và cs (2007) tái sinh và chuyển gen ở mía từ mô sẹo thông qua A.tumefaciens (OD600=0,2; 0,4; 0,6) trong thời gian 10 - 20 phút với kháng sinh chọn lọc 500 mg/l carbenicillin và 1 mg/l ppt [28]. Nhƣ vậy, các tác giả đã tái sinh và chuyển gen thành công chủ yếu từ mô sẹo và thông qua vi khuẩn A.tumefaciens. Để thành công việc chuyển gen vào thực vật nói chung cũng nhƣ ở mía thì nhất thiết phải có một hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và một quy trình chuyển gen hoạt động hiệu quả. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã thử nghiệm và cải biến hệ thống tái sinh và quy trình chuyển gen của các nghiên cứu thành công về mía ở trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Nguyên liệu thực vật Chúng tôi sử dụng giống mía ROC1 và ROC10 in vitro đang đƣợc giữ tại Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 2.1.2. Các chủng plasmid và enzyme Bảng 2.1. Các plasmid sử dụng trong thí nghiệm Plasmid Kích thƣớc (bp) Kháng sinh chọn lọc Nguồn cung cấp pENTR TM /D- TOPO 2580 Kanamycin Invitrogen (Mỹ) pK7GWIWG2(II) 12904 Spectinomycine, streptomycine Trƣờng Đại học Ghent (Bỉ) - Các chủng vi khuẩn: E.coli One Shot TOP 10 và A.tumefaciens chủng CV58C1 mang plasmid pGV2260 - Các enzyme giới hạn: HindIII , XbaI của hãng New England Biolabs - Các enzyme T4 ligase, T4 kinase do hãng Fermentas cung cấp 2.1.3. Hóa chất khác - Cặp mồi 3’INV/5’INV nhân đoạn gen mã hóa enzyme Invertase và cặp mồi M13for/rev kiểm tra sự có mặt của gen Invertase trong vector tách Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 dòng pENTR TM /D-TOPO do chúng tôi thiết kế và đặt tổng hợp tại hãng Bioneer (Hàn Quốc). - Gateway LR Clonase TMII Enzyme Mix Kit (Invitrogen, Mỹ) - Bộ kit kit Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) - Bộ kit Qiagen (QIAquick Gel Extraction) - Bộ kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). - Các hóa chất thông dụng trong sinh học phân tử (thang marker chuẩn, agarose, phenol, chloroform, isoamylalcholhol... ) và các hóa chất cho nuôi cấy mô đều thuộc phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học mua từ các hãng nổi tiếng nhƣ Invitrogen, Merk, Amersham Parmacia Biotech, Fermentas, New England Biolabs... 2.1.3. Các thiết bị máy móc Pipetman, máy soi gel (Bio-Rad), máy chụp ảnh (Amersham Pharmacia Biotech), máy li tâm (Ependorf), máy đo pH (Mettler), bộ điện di (Bio-Rad), máy hút chân không (Savant), máy PCR (MJ Research), bể ổn nhiệt, nồi khử trùng, máy biến nạp bằng xung điện, máy đo OD, máy vortex, máy xác định trình tự nucleotid tự động... của Phòng thí nghiệm Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. 2.2. PHƢƠNG PHÁP 2.2.1. Thiết kế mồi Khai thác dữ liệu trong GenBank để tìm ra tất cả các trình tự gen mã hoá Invertase của cây mía (Bảng 3.2). Sử dụng phần mềm chuyên dụng DNAstar so sánh độ tƣơng đồng giữa các trình tự Invertase thu đƣợc và thiết kế cặp mồi đặc hiệu tại các vùng có độ bảo thủ cao nhất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 2.2.2. Tách RNA tổng số Sử dụng hóa chất Trizol Regents (Invitrogen, Mỹ) để tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá và bẹ thân non của 2 giống mía in vitro ROC1 và ROC10 theo hƣớng dẫn kèm theo. 2.2.3. RT-PCR Phân lập gen mã hóa enzyme Invertase ở mía bằng kỹ thuật RT-PCR một bƣớc (RT-PCR one step) theo chu kỳ sau: Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bƣớc Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ 1 Tổng hợp cDNA 50 30 phút 1 2 Biến tính 95 5 phút 1 3 Biến tính 94 20 giây 35 4 Gắn mồi 52 1 phút 35 5 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 35 6 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 7 Kết thúc phản ứng 8 24 giờ 1 Thành phần của phản ứng với tổng thể tích 25 l đƣợc bổ sung vào ống effendorf 0,5 ml đã đƣợc xử lý DEPC theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (Bioneer) gồm có: 2X dung dịch đệm RT-PCR; 1 µg RNA tổng số; 0,4 - 0,6 mM 3’INV; 0,4 - 0,6 mM 5’INV; 0,5 g enzyme RT. Mix mẫu nhẹ nhàng và thực hiện phản ứng RT-PCR theo chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 2.2. Sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8 - 1,5% trong dung dịch đệm TAE 1X và nhuộm bản gel trong ethidium Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 bromide (EtBr). Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction Kit. 2.2.4. Tách dòng và xác định trình tự gen Sản phẩm PCR tinh sạch sẽ đƣợc gắn vào vector tách dòng pENTR/D của hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo vector tổ hợp có mang đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn (INV_pENTR). Phản ứng đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Sau đó, vector tái tổ hợp INV_pENTR đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli Top 10 và nhân nuôi lƣợng lớn trong môi trƣờng LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 50 mg/l kanamycin. Plasmid tái tổ hợp đƣợc tách chiết theo phƣơng pháp Sambroock và đƣợc cất giữ ở -20oC. INV_pENTR đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev với tổng thể tích 25 μl bao gồm: 1X dung dịch đệm PCR, 50 ng plasmid, 50 mM MgCl2, 2 mM dNTPs, 10 ng M13for, 10 ng M13rev, 0,5 g Taq polymerase. Chu kỳ của phản ứng nhƣ sau: Bảng 2.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 95 5 phút 1 2 Biến tính 94 20 giây 35 3 Gắn mồi 52 1 phút 35 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 35 5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Mẫu plasmid tái tổ hợp INV_pENTR sau khi kiểm tra sẽ đƣợc loại RNA và thực hiện xác định trình tự nucleotide trên máy ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer tại Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ gen. 2.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp INV-RNAi INV_pENTR sẽ đƣợc gắn vào vector pK7GWIWG2(II) theo kỹ thuật Gateway để tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen mã hóa Invertase (INV_RNAi). Trong kỹ thuật này, vector pENTR/D mang vị trí tái tổ hợp attL trong khi ở vector nhận là attR. Các vị trí này giúp phản ứng tái tổ hợp lambda (Lambda reconstruction: LR) xảy ra khi có mặt đồng thời plasmid INV_pENTR với vector nhận pK7GWIWG(II) gắn đoạn gen Invertase theo cả 2 chiều xuôi-ngƣợc vào vector nhận, tạo nên cấu trúc INV_RNAi mong muốn. Các dòng plasmid tái tổ hợp sau đó đƣợc nhân lên trong tế bào E.coli trên đĩa môi trƣờng thạch LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin và 50 mg/l chloramphenicol ở 37 oC qua đêm. Sau đó tiến hành tách plasmid theo kit QIAprep Spin Miniprep (QIAGEN). Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi thu đƣợc sẽ đƣợc phân lập và kiểm tra sự có mặt của đoạn gen Invertase bằng phƣơng pháp cắt giới hạn với hai enzyme HindIII và XbaI sau đó đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Dòng tế bào mang vector INV_RNAi sẽ đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens CV58C1 bằng xung điện ở 400 Ω / 2,5 KV / 25 μF. Plasmid tái tổ hợp đƣợc nhân nuôi trong môi trƣờng có bổ sung 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin ở 28oC qua đêm. Tách plasmid theo Sambroock và kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 2.2.6. Tái sinh mía thông qua mô sẹo Chúng tôi tiến hành tái sinh mía theo phƣơng pháp của hai nhóm nghiên cứu Santosa và cs (2004); Zhangsun và cs (2007) có cải biến nhƣ sau: cắt những đoạn thân mía non có chứa đỉnh sinh trƣởng của cây mía in vitro dài khoảng 0,5 cm sau đó đặt lên môi trƣờng môi trƣờng tạo mô sẹo (M1 - M4). Các mẫu cấy sẽ đƣợc nhân nuôi trong buồng tối ở 25oC trong vòng 15 - 20 ngày thì thu đƣợc các mô sẹo lên tốt. Các mô sẹo nhân lên trong môi trƣờng tạo mô sẹo (M1) lỏng có bổ sung 3 mg/l 2,4D trong tối, ở 27oC, lắc 90 vòng/phút, 1 tuần để đạt kích thƣớc lớn phục vụ cho việc biến nạp. Sau đó, các mô sẹo đƣợc loại bỏ phần thân xanh và đặt lên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc. Khi chồi có kích thƣớc khoảng 1- 3 cm (25 - 30 ngày) thì chuyển sang môi trƣờng tạo rễ Mr. Bảng 2.4. Các môi trƣờng tái sinh cây mía Môi trƣờng Thành phần pH Nhân mía M0: MS + 0,8 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar 5,8 Tạo mô sẹo M1: MS + 3 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M2: MS + 4 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M3: MS + 5 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar M4: MS + 6 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose + 9 g/l agar 5,8 Nhân mô bằng nuôi lỏng lắc M1 lỏng: MS + 3 mg/l 2,4D + 30 g/l sucrose 5,8 Tạo chồi Mc: MS +1,5 mg/l kinetin + 2 mg/l BAP + 30 g/l sucrose +9 g/l agar Tạo rễ Mr: MS + 1 mg/l NAA + 30 g/l sucrose +9 g/l agar 5,8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 2.2.7. Thử nghiệm chuyển gen gus-intron vào cây mía 2.2.7.1. Tạo huyền phù vi khuẩn Lấy một khuẩn lạc từ đĩa nuôi đặc nuôi trong môi trƣờng LB có bổ sung 100 mg/l spectinomycin + 50 mg/l chloramphenicol + 50 mg/l kanamycine (hoặc 100 mg/l spectinomycin + 50 mg/l rifamycin) ở 28oC, lắc 200 vòng/phút qua đêm. Lấy ra 5 ml khuẩn nuôi phục hồi trong 30 ml môi trƣờng LB lỏng mới, lắc tiếp trong khoảng 2 - 3 giờ trong cùng điều kiện. Sau đó ly tâm khuẩn ở 5000 vòng/phút trong 10 phút thu sinh khối tế bào rồi hòa tan khuẩn vào ½ MS không đƣờng, (pH = 5,8) có bổ sung AS 100 mM. 2.2.7.2. Đồng nuôi cấy với huyền phù A.tumefaciens và tái sinh Mô sẹo sau khi đƣợc nhân sinh khối từ môi trƣờng lỏng sẽ đƣợc lấy ra tách thành từng mảnh nhỏ. Quá trình lây nhiễm khuẩn đƣợc tiến hành theo hai hƣớng là thổi khô mô sẹo và chuyển lên môi trƣờng cảm ứng tạo chồi với các ngƣỡng thời gian khác nhau. Sau đó mô sẹo đƣợc lấy ra và ngâm trong huyền phù vi khuẩn thời gian từ 10 - 30 phút. Sau đó thấm khô và cấy lên môi trƣờng đồng nuôi cấy M1 (thổi khô) hoặc Mc (cảm ứng tạo chồi). Sau 3 ngày, mô sẹo đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng diệt khuẩn M1 có bổ sung 500 mg/l cefotaxim trong 1 tuần. Các mô sẹo sống sót sẽ đƣợc chuyển lên môi trƣờng tái sinh Mc + 500 mg/l cefotaxim và Mc + 500 mg/l cefotaxim + 1 mg/l ppt. Các chồi tái sinh đƣợc chuyển sang môi trƣờng chọn lọc Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxim và 1 mg/l ppt để tạo cây hoàn chỉnh. Chúng tôi kiểm tra biểu hiện gen gus bằng cách nhuộm mô sẹo sau đồng nuôi cấy với dung dịch X-gluc, ủ ở 37oC trong tối trong khoảng từ 12 - 16 giờ, sau đó rửa với cồn 70% và soi trên kính hiển vi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 KHÁI QUÁT SƠ ĐỒ THÍ NGHIỆM Cắt đoạn thân sát gốc (5 cm) Mô sẹo Chọn lọc mô sẹo Tái sinh cây Đồng nuôi cấy Diệt khuẩn Tách RNA tổng số RT_PCR Tách dòng và xác định trình tự gen Thiết kế vector tái tổ hợp INV_RNAi Thiết kế mồi Cây mía in vitro Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. THIẾT KẾ MỒI Để nhân đƣợc đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase bằng kỹ thuật RT-PCR điều quan trọng nhất là phải có đƣợc cặp mồi đặc hiệu cho trình tự của đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase. Chúng tôi đã sử dụng từ khóa “Invertase Sugarcane” để tìm kiếm trong ngân hàng dữ liệu gen NCBI các trình tự gen Invertase đã đƣợc công bố (www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết quả đã thu đƣợc sáu trình tự của gen mã hóa cho enzyme Invertase ở cây mía, trong đó có 5 trình tự mã hóa cho enzyme Invertase hòa tan (soluble acid Invertase) với mã số AF062734, AF 062735, AF083855, AF083856, AY302083; và một trình tự mã hóa cho enzyme Invertase liên kết màng (cell wall Invertase) có mã số AY302084 (Bảng 3.2). Sử dụng chƣơng trình MegAlign (DNAstar) so sánh độ tƣơng đồng của các trình tự trên với nhau cho thấy năm trình tự của Invertase hoà tan tƣơng đồng cao mặc dù đƣợc phân lập từ các giống mía khác nhau và có độ tƣơng đồng 46% với đoạn trình tự mã hoá cho Invertase liên kết màng. Trình tự đầy đủ của gen này với mã số AY302083 có độ dài 1923 bp. Trong nghiên cứu của chúng tôi đoạn gen dài 435 nucleotide (từ nucleotide vị trí 384 tới vị trí 818 bp - vùng có trình tự bảo thủ cao nhất) nằm trên gen mã hoá enzyme Invertase hòa tan (AY302083) đƣợc lựa chọn để tách dòng. Sau đó với mục đích giúp sản phẩm PCR gắn đƣợc vào vector tách dòng pENTR/D chúng tôi đã gắn thêm đồng thời vào mồi đầu 3’ một đoạn trình tự CACC để tạo vị trí bám cho enzyme TOPO-Isomerasse (GTGG) gắn trên vector nhân dòng PENTR/D-TOPO. Cặp mồi đƣợc đặt tổng hợp bởi hãng BIONEER, Hàn Quốc. Trình tự cặp mồi đặc hiệu thu đƣợc ở bảng 3.1 nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Bảng 3.1. Trình tự và các thông số cần thiết của cặp mồi 3 ’ INV và 5 ’ INV Mồi Trình tự mồi Tm(oC) %GC (5 ’ INV) 5 ’ -CATCTGGGGCAACAAGATC-3 ’ 52,3 52,6 (3 ’ INV) 5 ’ -CACCAAGTGCACGAAGTCCTTG-3 ’ 59,1 54,5 Bảng 3.2. Mã số các trình tự đoạn gen Invertase ở mía trên ngân hàng gen NCBI STT Mã số Chiều dài Dạng Tên Tác giả 1 AY302083 2274 bp mRNA Invertase hòa tan Peters,K.F., Grof,C.P.L. and Botella,J.R. 2 AF062734 1808 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 3 AF083856 1402 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 4 AF083855 494 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 5 AF062735 1808 bp mRNA Invertase hòa tan Albert,H.H., Zhu,Y.J. and Moore,P.H. 6 AY302084 1889 bp mRNA Invertase liên kết màng Peters,K.F., Grof,C.P.L., Albertson,P.L. and Botella,J.R. 3.2. TÁCH RNA TỔNG SỐ Do đặc tính của RNA là một loại phân tử không bền, dễ bị phân hủy bởi các enzyme ribonuclease (RNase). RNase có mặt ở khắp nơi trong tế bào và có hoạt tính rất mạnh và vẫn có hoạt tính mạnh ở nhiệt độ cao (100oC trong khoảng 1 giờ). Do đó, việc tách chiết RNA đòi hỏi phải hết sức cẩn thận để tránh các tạp nhiễm chứa RNase từ môi trƣờng và tất cả các dụng cụ thí nghiệm để tách RNA đều phải đƣợc xử lý trong dung dịch DEPC 0,1% để loại trừ RNase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Để tách RNA tổng số từ lá và thân non của mía chúng tôi tiến hành thu mẫu lá và bẹ non của hai giống ROC1 và ROC10. Các mẫu đƣợc nghiền nhanh trong N2 lỏng thành bột mịn với cối chày sứ đã đƣợc khử trùng để phá vỡ tế bào. Sau đó phải bổ sung ngay dung dịch Trizol vào vì nếu không các RNase nội bào sẽ đƣợc giải phóng và phân cắt RNA. Các thành phần trong dung dịch Trizol nhƣ: phenol, guanidine isothiocyanate sẽ nhanh chóng làm kết tủa protein và bất hoạt các RNase nội bào. Bổ sung chloroform:isoamyl (24:1) để làm sạch các protein còn sót lại. Tiếp theo việc bổ sung isopropanol vào làm kết tủa RNA. Cuối cùng sản phẩm RNA tổng số đƣợc hòa tan trong 20 μl nƣớc cất có DEPC 0,01%. RNA tổng số sẽ đƣợc kiểm tra chất lƣợng bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 1%. Hình 3.1 cho thấy các mẫu RNA từ thân và lá có hàm lƣợng lớn và có 2 băng RNA riboxom rõ nét nên khẳng định rằng RNA tổng số chƣa bị phân hủy và tối ƣu để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Nhƣ vậy, chúng tôi đã tách chiết thành công RNA tổng số từ lá và thân non của mía ROC1 và ROC10 in vitro. Hình 3.1. Kết quả điện di RNA tổng số tách từ lá và bẹ thân non của 2 giống mía ROC1 và ROC10 trên gel agarose 1% RNA tổng số sẽ đƣợc loại DNA bằng DNase sử dụng cho phản ứng RT-PCR. ROC 1 10 1 10 Lá Thân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 3.3. NHÂN DÕNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA ENZYME INVERTASE RNA tổng số sau khi đƣợc tinh sạch sẽ sử dụng làm khuôn cho phản ứng RT-PCR để nhân đoạn gen mã hóa cho enzyme Invertase với cặp mồi 5’INV và 3’INV đã thiết kế. Nếu phản ứng này xảy ra đặc hiệu theo lý thuyết thì sẽ có một băng duy nhất có kích thƣớc dài tƣơng ứng với tính toán lí thuyết là 435 bp của đoạn Invertase cần phân lập đƣợc nhân lên. Hình 3.2. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR trên gel agarose 0,8% (M): Marker 1kb; (INV): sản phẩm thôi gel Phản ứng RT-PCR có thể bị giảm hiệu quả do một số nguyên nhân nhƣ chất lƣợng và hàm lƣợng RNA tổng số của gen mã hóa enzyme Invertase, nhiệt độ bắt cặp với mồi chƣa phù hợp... Vì vậy khi tiến hành phản ứng chúng tôi đã điều chỉnh lƣợng mẫu, nồng độ mồi, Mg2+, nhiệt độ bắt cặp với mồi... để đảm bảo cho phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu nhất. Thành phần hỗn hợp của phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng đã đƣợc tối ƣu hóa trình bày ở mục 2.2.1.3. Sản phẩm của phản ứng RT-PCR một bƣớc với khuôn là RNA tổng số thu đƣợc từ bẹ mía non (giống ROC1) đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên trên gel agarose 0,8% (Hình 3.2). Kết quả cho thấy chúng tôi INV M 450 bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 đã nhân đƣợc 1 đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 450 bp (khi so sánh với thang DNA chuẩn 1 kb), kích thƣớc này phù hợp với kích thƣớc đoạn DNA dự đoán khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu. 3.4. TÁCH DÒNG GEN VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN 3.4.1. Tạo plasmid tái tổ hợp INV-pENTR Để khẳng định chắc chắn rằng đoạn DNA thu đƣợc từ phản ứng RT-PCR chính xác là đoạn gen mã hóa enzyme Invertase, chúng tôi tiến hành việc tiếp theo là tách dòng và xác định trình tự gen. Để việc tách dòng đạt đƣợc hiệu quả nhất chúng tôi tiến hành tinh sạch sản phẩm RT-PCR theo bộ kit Qiagen của hãng QIAquick Gel Extraction. Quá trình tách dòng đƣợc thực hiện bằng cách gắn sản phẩm RT-PCR vào vector tách dòng pENTR/D của hãng Invitrogen (Mỹ) để tạo “entry clone” INV_pENTR. Vector pENTR/D có kích thƣớc 2580 bp, trên vector này có hai vị trí gắn attL1 và attL2, đoạn gen cần chuyển Invertase sẽ đƣợc gắn vào giữa hai vị trí này. Vector này còn có gen kháng kháng sinh kanamycin và có vị trí gắn mồi M13 phục vụ cho việc chọn dòng các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp INV_pENTR. Ngoài ra, enzyme Topoisomerase sẽ giúp cho việc gắn gen vào vector diễn ra trong một khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 5 phút) và có thể đạt hiệu quả cao tới 90%. Thành phần và chu trình của phản ứng đƣợc trình bày ở mục 2.2.4.1. Kết quả của phản ứng sẽ thu đƣợc vector tái tổ hợp INV_pENTR. 3.4.2. Biến nạp plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 Vector tái tổ hợp INV_pENTR thu đƣợc sau phản ứng lai sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt nhằm tách dòng và nhân nhanh plasmid tái tổ hợp với số lƣợng lớn. Hiệu quả của phản ứng này phụ thuộc vào chất lƣợng sản phẩm vector tái tổ hợp và tế bào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 khả biến. Ở đây, toàn bộ vector tái tổ hợp INV_pENTR sẽ đƣợc biến nạp với tế bào khả biến và đƣợc cấy trải khuẩn trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc kanamycine 50 mg/l và ủ ở 37oC, qua đêm. Kết quả thu đƣợc các khuẩn lạc màu trắng trên đĩa môi trƣờng. Song không phải tất cả các khuẩn lạc đều mang plasmid tái tổ hợp INV_pENTR vì bản thân plasmid này có gen kháng kháng sinh còn tế bào khả biến E.coli lại không kháng bất kỳ kháng sinh nào. Vì vậy, có thể có một lƣợng nhỏ nào đó các tế bào chứa plasmid pENTR/D nhƣng lại không gắn gen Invertase, do enzyme TOPO ở hai đầu vector bị mất và plasmid tự đóng vòng. Vậy trong số những khuẩn lạc thu đƣợc, khuẩn lạc nào mang vector chứa đoạn gen mã hóa Invertase và khuẩn lạc nào không có? Để xác định rõ các plasmid tái tổ hợp chính là dòng INV_pENTR mong muốn, chúng tôi tiến hành tách chiết plasmid theo Sambrock từ những khuẩn lạc sống sót trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc và thực hiện phản ứng PCR plasmid thu đƣợc với cặp mồi đặc hiệu M13for/rev. 3.4.3. Chọn lọc plasmide tái tổ hợp INV_pENTR bằng PCR với cặp mồi M13 (F/R) Quá trình biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli bằng sốc nhiệt có hiệu quả có thể tới 95%. Song rất có thể còn có những gen không đƣợc gắn vào và chúng sẽ tồn tại bên trong hoặc xung quanh những khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng chọn lọc. Do đó, PCR plasmid với cặp gen đặc hiệu 3 ’ INV, 5 ’ INV vẫn có thể thu đƣợc những băng có kích thƣớc khoảng 435 bp nhƣng không có đoạn gen Invertase đƣợc gắn vào vector. Vì vậy, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi M13for/rev đặc hiệu của vector pENTR/D với các plasmid của các dòng khuẩn số 1, 2, 3 để có kiểm tra chính xác xem đoạn gen Invertase đã gắn đƣợc vào vector tách dòng hay chƣa. Theo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 lý thuyết thì vị trí gắn mồi M13for/rev trên vector pENTR/D đƣợc thiết kế đặc hiệu và cho phép nhân một đoạn DNA từ nucleotide vị trí 537 tới vị trí 861 trên vector pENTR/D. Nhƣ vậy, PCR với cặp mồi này sẽ thu đƣợc các sản phẩm có chiều dài khoảng 750 bp hoặc 324 bp từ các dòng plasmid INV_pENTR dƣơng hoặc âm tính tƣơng ứng khi kiểm tra bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose 0,8%. Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid với cặp mồi M13(For/Rev) nhằm kiểm tra sự có mặt của đoạn Invertase trong vector pENTR/D (M): Marker 1kb; (1), (2),( 3): sản phẩm PCR từ plasmid INV_ pENTR/D; (-): đối chứng âm Với kết quả thu đƣợc ở hình 3.3 cho thấy rằng 2 dòng plasmid tái tổ hợp tách từ dòng khuẩn số 1 và 2 cho các băng có kích thƣớc khoảng 750 bp đúng với kích thƣớc của tính toán lý thuyết của các dòng plasmid INV_pENTR dƣơng tính. Nhƣ vậy, có thể kết luận rằng đoạn gen Invertase đã đƣợc gắn và tạo “entry clone” INV_pENTR ở dòng khuẩn số 1 và 2. Dòng plasmid INV_pENTR tái tổ hợp đã đƣợc gửi đi để xác định trình tự đoạn gen Invertase. 750 bp 3 2 1 - M Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 3.4.4. Kết quả xác định trình tự nucleotit Đoạn gen mã hóa Invertase đƣợc gửi đi xác định trình tự nuclotide trên máy xác định trình tự tự động ABI PRIMS 3100 Avant Genetic Analyzer. Sau đó, chúng tôi sử dụng phần mềm DNAstar và BioEdit để tiến hành so sánh trình tự nucleotide của đoạn gen mã hóa enzyme Invertase này với trình tự Invertase có mã số AY302083 đã đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi. Kết quả nhƣ sau: Hình 3.4. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen Invertase phân lập đƣợc với trình tự Invertase trong ngân hàng gen có mã số AY302083 Trên hình 3.4 cho thấy, trình tự gen Invertase phân lập đƣợc ở cây mía ROC1 in vitro có độ tƣơng đồng khá cao với trình tự gen AY302083 đã đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi đặc hiệu (90,1%). Điều này chứng tỏ chúng tôi đã phân lập chính xác đoạn gen mã hóa Invertase mong muốn ở cây mía ROC1 in vitro. 3.5. THIẾT KẾ VECTOR TÁI TỔ HỢP INV-RNAi 3.5.1. Tạo vector tái tổ hợp INV_RNAi bằng kỹ thuật Gateway Kỹ thuật Gateway Cloning là một kỹ thuật nhân dòng phổ biến và hiệu quả cho việc gắn trình tự DNA vào hệ thống một hoặc nhiều vector. Trong thí 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 AGGAACTGGATGAACGACCCCAATGGCCCGGTGTACTACAAGGGCTGGTACCACCTGTTCTACCAATACAACCCGGACGGCGCCATCTGGGGCAACAAGA amplified -----------------------------------------------------------------------------------CATCTGGGGCAACAAGA 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGCTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTCTGGAC amplified TCGCGTGGGGCCACGCCGTCTCCCGCGACCTCATCCACTGGCGCCACCTCCCGCTGGCCATGGTGCCCGACCAGTGGTACGACACCAACGGCGTGTGGAC 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACCGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC amplified GGGCTCCGCCACCACGCTCCCCGACGGCCGCCTCGCCATGCTCTACACGGGCTCCACCAACGCCTCCGTGCAGGTGCAGTGCCTCGCCGTGCCCGCCGAC 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGCATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA amplified GACGCCGACCCGCTGCTCACCAACTGGACCAAGTACGAGGGCAACCCGGTGCTGTACCCGCCGCCGGGGATCGGGCCCAAGGACTTCCGCGACCCCACCA 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| AY302083 CGGCGTGGTTCGACCCGTCGGACAACACCTGGCGCATCGTCATCGGCTCCAAGGACGACGCCGAGGGCGACCACGCCGGCATCGCCGTGGTGTACCGCAC amplified CGGCGTGGTTCGACCA------------------------------------------------------------------------------------ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 nghiệm này chúng tôi thực hiện phản ứng LR với các thành phần đã trình bày ở mục 2.2.2.1. để gắn vector INV_pENTR với vector pK7GWIWG2(II) nhằm thu đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi của gen mã hóa Invertase. Phản ứng này đƣợc tiến hành với sự xúc tác của enzyme LR-clonase và Proteinase K ở nhiệt độ phòng. pK7GWIWG2(II) là một vector chuyển gen đƣợc cấu trúc bởi hai vùng gắn đặc biệt là: attR1-ccdB-attR2 có chiều ngƣợc nhau và đƣợc nối với nhau nhờ một đoạn intron. Do đó, khi thực hiện phản ứng lai LR thì sẽ tạo ra sản phẩm là một plasmid INV_RNAi có hai vị trí gắn mang đoạn gen Invertase có chiều ngƣợc nhau: sense-intron-antisense (Invertase-intron-antiInvertase). Đoạn intron của vector pK7 có vai trò rất quan trọng trong việc tạo đoạn thắt nút (vòng) để RNA sợi đôi dễ đƣợc hình thành (Invertase-intron- antiInvertase) và hoạt động một cách ổn định trong genome của vật chủ khi nó đƣợc chuyển vào. Đây chính là cấu trúc RNAi cần thiết kế để chuyển gen vào cây mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng của mía cao hơn một cách ổn định. Hình 3.5. Mô hình cấu trúc chuyển gen INV_RNAi 3.5.2. Biến nạp vector INV_RNAi vào tế bào khả biến E.coli Vector tái tổ hợp INV_RNAi đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli TOP 10 bằng phƣơng pháp sốc nhiệt ở 42oC với khoảng thời gian là 1 phút 30 giây. Sau đó, khuẩn sẽ đƣợc nuôi phục hồi với 250 μl LB lỏng ở 37oC ở tủ lắc khoảng 60 phút. Tiếp theo khuẩn sẽ đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chọn lọc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 có kháng sinh 100 mg/l spectinomycin, 40 mg/l streptomycin và 50 mg/l chloramphenicol. Kết quả thu đƣợc một lƣợng lớn các khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trƣờng chọn lọc. Vector pK7GWIWG2(II) là vector có cấu trúc mang gen kháng các kháng sinh spectinomycin, streptomycin, chloramphenicol và gen ccdB mã hóa cho plasmid F gây ức chế sinh trƣởng của tế bào E.coli, còn vector INV_RNAi không có gen ccdB do gen Invertase chèn vào thay thế. Vì vậy, các khuẩn lạc mọc trên đĩa môi trƣờng chọn lọc chỉ có thể là những khuẩn lạc có mang plasmid pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột biến và các khuẩn lạc có mang plasmid INV_RNAi. Chọn ngẫu nhiên 3 khuẩn lạc đƣợc đánh số từ 1 đến 3 nuôi trong môi trƣờng lỏng có các kháng sinh chọn lọc tƣơng tự và tiến hành tách plasmid từ các dòng khuẩn đó. Để kiểm tra các plasmid thu đƣợc có chính xác là INV_RNAi hay là pK7GWIWG2(II) nhƣng vị trí chứa đoạn gen ccdB đã bị đột biến. Chúng tôi thực hiện phản ứng cắt enzyme giới hạn đặc hiệu XbaI và HindIII đối với 3 plasmid từ khuẩn lạc số 1, 2 và 3. Theo tính toán trên lý thuyết thì sản phẩm của phản ứng cắt enzyme sẽ cho 3 đoạn có kích thƣớc là: Đoạn 1 dài 978 bp mang đoạn Invertase chiều xuôi, đoạn 2 dài 2825 bp mang đoạn Invertase chiều ngƣợc và cuối cùng là phần còn lại của vector nhận pK7GWIWG(II) dài 8114 bp. Hình 3.6 cho thấy sản phẩm của phản ứng cắt enzyme thu đƣợc các phân đoạn có các kích thƣớc tƣơng ứng với dự tính ở cả 3 plasmid 1, 2 và 3 và có sự khác biệt rõ rệt so với đối chứng là vector không biến nạp pK7GWIWG(II), chứng tỏ cấu trúc INV_RNAi đã đƣợc thiết kế. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid INV_RNAi tổ hợp với HindIII và XbaI (M): Marker 1kb; (1), (2), (3): các dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng vector pK7GWIWG(II) 3.6. BIẾN NẠP VECTOR CHUYỂN GEN INV_RNAi VÀO CHỦNG VI KHUẨN A.TUMEFACIENS CV58C1. Để kiểm tra hoạt động của cấu trúc INV_RNAi trên vector tái tổ hợp trong cây trồng cũng nhƣ tạo nguyên liệu cho quá trình chuyển gen ức chế biểu hiện gen mã hóa Invertase ở cây mía, thì cấu trúc INV_RNAi phải đƣợc biến nạp vào vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1 bằng phƣơng pháp xung điện. Đây là một phƣơng pháp biến nạp có hiệu quả cao trong thời gian ngắn. Plasmid tái tổ hợp INV_RNAi số 2 đƣợc biến nạp vào A.tumefaciens bằng xung điện với thành phần và các bƣớc tiến hành biến nạp đƣợc trình bày ở mục 2.2.2.3. Kết quả cho thấy trên đĩa môi trƣờng có bổ sung kháng sinh chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin thu đƣợc những khuẩn lạc màu trắng. Sau đó chọn ngẫu nhiên 2 dòng khuẩn lạc nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng có bổ sung các kháng sinh chọn lọc 100 mg/l streptomycin, 100 mg/l spectinomycin và 50 mg/l rifamycin để tách plasmid. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR plasmid INV-RNAi trong A.tumefaciens với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV (M): Marker 1kb; (1), (2): các dòng plasmid tái tổ hợp; (-): đối chứng âm Tách plasmid theo Sambroock và kiểm tra sự có mặt của INV_RNAi trong A.tumefaciens CV58C1 bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’INV và 3’INV. Kết quả kiểm tra hình 3.7 cho thấy các dòng khuẩn lạc đều cho kết quả dƣơng tính kích thƣớc khoảng 450 bp mong muốn. Nhƣ vậy, chứng tỏ chúng tôi đã tạo đƣợc vector chuyển gen INV_RNAi trong chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1. Đây là nguồn nguyên liệu phục vụ cho thí nghiệm chuyển gen tiếp theo nhằm tạo dòng mía bất hoạt gen mã hoá Invertase, tăng lƣợng sucrose tích trữ. 3.7. TÁI SINH VÀ BƢỚC ĐẦU BIỂU HIỆN GEN GUS Ở MÍA 3.7.1. Quy trình tái sinh mía thông qua mô sẹo Từ các nghiên cứu tái sinh và chuyển gen thành công ở cây mía cho thấy rằng tỉ lệ tái sinh thu đƣợc cao và hiệu quả thông qua nguyên liệu ban đầu là mô sẹo. Trong thí nghiệm này, chúng tôi tiến hành thử nghiệm tạo mô sẹo với giống mía ROC10 in vitro trên môi trƣờng MS đối chứng không có 2,4D và các môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo M1-M4 (Bảng 2.4). Kết quả thu đƣợc cho thấy ở môi trƣờng đối chứng MS (không có 2,4D) hoàn toàn không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 tạo đƣợc mô sẹo. Còn các mẫu trên môi trƣờng cảm ứng có bổ sung hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng 2,4D đều tạo đƣợc mô sẹo và cho hiệu quả tái sinh mía đƣợc thể hiện thông qua bảng sau: Bảng 3.3. Khả năng tạo mô sẹo và tái sinh ở giống mía ROC10 in vitro trên các môi trƣờng thử nghiệm M1 - M4. Môi trƣờng 2,4-D (mg/l) Tổng mẫu cấy Tỉ lệ tạo mô sẹo (%) Tỉ lệ mẫu tạo chồi (%) Số chồi / 1 khối mô sẹo M1 3 3x130 83,07 ± 0,44 67,95 ± 1,36 42,66 ± 1,45 M2 4 3x130 86,15 ± 3,11 46,41 ± 3,33 20,66 ± 2,96 M3 5 3x130 71,79 ± 0,68 63,08 ± 1,33 32,33 ± 1,45 M4 6 3x130 83,33 ± 2,89 37,95 ± 1,12 17,66 ± 4,33 Bảng 3.3 cho thấy, các mẫu ở môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D cho tỉ lệ tạo mô sẹo và hiệu suất tái sinh cao hơn hẳn so với các môi trƣờng M2 - M4 có bổ sung 4, 5, 6 mg/l 2,4D; trong đó tỉ lệ tạo chồi đạt 67,95% và số chồi trên một khối mô sẹo đạt khoảng 42,66. Nhƣ vậy, môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D cho kết quả tạo mô sẹo và tái sinh cây ở mía ROC10 in vitro tốt nhất trong thí nghiệm này. Do đó, chúng tôi chọn môi trƣờng M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D làm môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo cho việc tái sinh và chuyển gen ở mía trong các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình tái sinh cây từ mô sẹo đến cây hoàn chỉnh đƣợc minh họa trong hình 3.8. Mặt khác, chúng tôi tiếp tục nhân nuôi mô sẹo trong môi trƣờng lỏng lắc M1 có bổ sung 3 mg/l 2,4D trong vòng 1 tuần, ở 27oC, lắc 90 vòng/phút, trong điều kiện tối để phục vụ cho việc biến nạp thử nghiệm gen gus-intron. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Cây mía ROC10 in vitro Đoạn thân sát gốc dài 0,5 cm trên môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo Mô sẹo Tạo cây hoàn chỉnh Mô sẹo lên mầm xanh Mô sẹo đang nhú mầm Hình 3.8. Quy trình tái sinh mía ROC10 in vitro từ mô sẹo 3.7.3. Chọn lọc mô sẹo và tái sinh cây chuyển gen Quy trình chuyển gen có hiệu quả là yếu tố rất quan trọng trong việc chuyển gen vào thực vật. Sau khi thử nghiệm đƣợc môi trƣờng tái sinh cây mía thông qua mô sẹo, chúng tôi tiến hành thử nghiệm việc chuyển gen vào cây mía thông qua việc sử dụng gen chỉ thị gus-intron. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thử nghiệm hai chủng vi khuẩn A.tumefaciens khác nhau là EHA1300 và CV58C1 cùng mang vector chuyển gen pPTN289, ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 10 và 30 phút. Chúng tôi đã thử nghiệm lây nhiễm khuẩn với mô sẹo theo phƣơng pháp thổi khô sau nhân nuôi trong môi trƣờng lỏng lắc M1. Song chúng tôi đã không thu đƣợc kết quả chuyển gen mong muốn khi kiểm tra biểu hiện gen chỉ thị gus-intron với dung dịch X-gluc. Do đó, chúng tôi tiến hành hƣớng nghiên cứu thứ hai là chuyển mô sẹo sau nhân nuôi sang môi trƣờng cảm ứng tạo chồi Mc sau đó mới tiến hành lây nhiễm khuẩn. Ở thời gian biến nạp 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 phút các mô sẹo ở cả hai chủng vi khuẩn đều không thu đƣợc mẫu có biểu hiện gen gus. Trong khi đó ở thời gian nhiễm khuẩn 30 phút, mẫu có biểu hiện gen gus xuất hiện ở cả hai công thức với hai chủng khuẩn nghiên cứu. Tỉ lệ biểu hiện gen gus trên mô sẹo đạt 31,67% với chủng CV58C1 và 11,67% khi sử dụng chủng EHA1300. Khi sử dụng hai chủng vi khuẩn này với ngƣỡng thời gian nhiễm khuẩn là 30 phút, chúng tôi đều thu đƣợc các chồi mía sống sót trên môi trƣờng chọn lọc (với CV58C1 là 18,57% và EHA1300 là 7,14%). Bảng 3.4. Kết quả biến nạp gen gus-intron vào cây mía Chủng vi khuẩn A.tumefaciens Thời gian biến nạp (phút) Tỉ lệ biểu hiện gen gus (%) Tỉ lệ mẫu tái sinh (%) Tỉ lệ mẫu sống sót trên môi trƣờng có bổ sung 2 mg/l ppt (%) CV58C1 30 31,67 ± 0,65 81,43 ± 1,56 18,57 ± 1,28 EHA1300 30 11,67 ± 0,89 92,85 ± 0,31 7,14 ± 0,69 Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi đã thu đƣợc kết quả khi tiến hành chuyển gen gus vào cây mía thông qua mô sẹo theo phƣơng pháp cảm ứng tạo chồi. Tuy nhiên do thời gian có hạn, các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả chuyển gen vẫn chƣa hoàn toàn đƣợc tối ƣu. Mặc dù vậy, việc thu đƣợc các mô sẹo tái sinh có biểu hiện của gen chỉ thị gus đã cho thấy việc sử dụng công nghệ RNAi để tạo cây mía chuyển gen làm tăng khả năng tích trữ đƣờng trong cây mía là một hƣớng đi triển vọng trong tƣơng lai. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Hình 3.9. Biến nạp gen gus-intron vào cây mía ROC10 in vitro thông qua trung gian A.tumefaciens Mô sẹo biến nạp trên môi trƣờng đồng nuôi cấy Mc Mô sẹo biểu hiện gus khi nhuộm với dung dịch X-gluc Mô sẹo tạo chồi trên Mc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime Chồi cây trên môi trƣờng chọn lọc Mr có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 2 mg/l ppt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: 1. Phân lập đƣợc đoạn gen mã hoá Invertase có kích thƣớc khoảng 435 bp từ giống mía ROC1 in vitro xúc tác quá trình phân huỷ sucrose. 2. Thiết kế đƣợc vector chuyển gen INV-RNAi ức chế sự biểu hiện của Invertase và biến nạp thành công chủng vi khuẩn A.tumefaciens CV58C1. 3. Chọn lọc một số môi trƣờng thích hợp tái sinh cây mía thông qua mô sẹo (môi trƣờng tạo mô sẹo M1, môi trƣờng tạo chồi Mc, môi trƣờng tạo rễ Mr) và bƣớc đầu chuyển gen chỉ thị gus-intron vào cây mía. ĐỀ NGHỊ: Tiến hành chuyển vector ức chế biểu hiện mã hóa Invertase (INV- RNAi) ở cây mía nhằm tăng trữ lƣợng đƣờng của các giống mía ở Việt Nam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên BÀI BÁO CỦA TÁC GIẢ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN ĐÃ ĐƢỢC CÔNG BỐ Lƣu Thị Cƣ, Đỗ Tiến Phát, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Lê Quỳnh Liên (2009) Phân lập và thiết kế vector ức chế biểu hiện gen mã hoá Invertase (-fructofuranosidase) ở cây mía. Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc_Thái Nguyên, tháng 11 năm 2009. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Quyết định số 26/2007/QĐ-TTg, về việc phê duyệt “Quy hoạch phát triển mía đường đến năm 2010 và định hướng đến năm 2020”. 2. Hoàng Thị Sản (2003) Phân loại học thực vật. Nxb Giáo dục 3. Trần Văn Sỏi (2003) Cây mía. Nhà xuất bản Nghệ An. 4. Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNA (RNAi) gây bất hoạt gen và tiềm năng ứng dụng to lớn. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 265-275. 5. Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật ứng dụng. Nxb Giáo dục. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 6. Avigad G and Dey PM (1997) Carbohydrate metabolism: storage carbohydrates. Plant biochemistry Acedemic Press Ltd, pp: 143-204. 7. Balibrea ME, Rus-Alvarez AM, Bolarin MC, Perez-Alfocea F (1997) Fast changes in soluble carbohydrates and proline content in tomato seedlings in response to ionic and nonionic iso-osmostic stress, J. Plant physiol. (151): 222-226. 8. Baulcomble D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431 (7006): 356-63. 9. Chen S, Hajirezaei M, Bornke F (2008) Differential expression of sucrose phosphate synthase isoenzymes in tobaco reflects their functional specialization during dark governed starch mobilization in source leaves. Plant Cell Environ. 31(1): 165-76 elegans. Nature. 391: 806-811. 10. Geigenberger P, Reimholz R, Deiting U, Sonnewald U and Stitt M (1999) Decreased expression of sucrose phosphate Synthase Strongly inhibits the water stress-induced synthesis of sucrose in growing potato tubers. The plant Journal. 19: 119-129. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11. Groenewald J, Botha FC (2007) Down-regulation of pyrophosphate: fructose 6-phosphate 1-phosphotransferase (PFP) activity in Sugarcane enhances sucrose accumulation in immature internoods. Transgenic Res. 12. Guy CL (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism. Annu. Rev. Plant physiol. Plant Mol. Biol. 41: 187- 223. 13. Haigler CH, Singh B, Zhang D, Hwang S, Wu C, Cai WX, Hozain M, Kang W, Kiedaisch B, Strauss RE, Hequet EF, Wyatt BG, Jwiden GM, Holaday AS (2007) Transgenic cotton over-producing spinach sucrose phosphate synthase showed enhanced leaf sucrose synthesis and improved fiber quality under controlled environmental conditions. Plant Mol Biol. 63 (6): 815-32. 14. Hesse H, Sonnewald U, Willmitzer L (1995) Cloning and expression analysis of sucrose phosphate synthase from sugar beet (Beta vulgaris L.). Mol Gen Genet. 247 (4): 515-20. 15. Huber SC. and Huber JL. (1992) Role of sucrose-phosphate Synthase in Sucrose Metabolism in leaves. Plant physiol. 99: 1275-1278. 16. Huber SC, and Huber JL(1996) Role and regulation of Sucrose phosphate synthase in higher plants. Annu. Rew. Plant physiol. Plant Mol.Biol. 47: 431-444. 17. Ingram J, Chadler JW, Gallagher L, Salamini F, Bartels D (1997) Analysis of cDNA clones encoding sucrose-phosphate synthase in relation to sugar interconversions associated with dehydration in the resurrection plant, Craterostigma plantagineum Hochst. Plant Physiol. 115:113-121. 18. Klann EM, Hall B, Bennett AB (1996) Antisense acid invertase (TIV1) gene alters soluble sugar composition and size in transgenic tomato fruit. Plant Physiol. 112 (3): 1321-30. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19. Le QL, Mahler V, Lorenz Y, Scheurer S, Biemelt S, Vieths S, Sonnewald U (2006b) Reduced allergenicity of tomato fruits harvested from Lyc e 1 silenced transgenic tomato plants. J. Aller. Clin. Immunol. 118(5):1176-83. 20. Liu Q, Singh SP, Green AG (2002) High-stearic and High-oleic cottonseed oils produced by hairpin RNA-mediated post-transcriptional gene silencing. Plant Physiol. 129(4): 1732-43. 21. Lunn JE, Gillespie VJ, Furbank RT (2003) Expression of a cyanobacterial sucrose-phosphate synthase from Synechocystis sp. PCC 6803 in transgenic plants. J Exp Bot. 54 (381): 223-37 22. Manickavasagam M, Ganapathi A, Anbazhagan VR, Sudhakar B, Selvaraj N, Vasudevan A, Kasthurirengan S (2004) Agrobacterium-mediated genetic transformation and development of herbicide-resistant sugarcane (Saccharum species bybrids) using axillary buds. Plant Cell Rep 23: 134-143. 23. Morgan JM (1984) Osmoregulation and water stress in higher plant, Ann Rev. Plant physiol. 35: 299-319 24. Nguyen-Quoc B, Foyer CH (2001) A role for ‘futile cycles’ involving invertase and sucrose synthase in sucrose metabolism of tomato fruit. J Exp Bot. 52 (358): 881-9. 25. Ogita S, Uefuji H, Yamaguchi Y, Koizumi N, Sano H (2003) Producing decaffeinated coffee plants. Nature 423(6942): 823. 26. Quick P, Siegl G, Neuhaus E, Feil R, Stitt M (1989) Sort term water stress leads to stimulation of sucrose synthesis by activating sucrose-phosphate synthase. Planta. 177: 535–546. 27. Salerno GL, Pagnussat GC, Pontis HG (1998) Studies on sucrose phosphate synthase from rice leaves. Cell Mol Biol 44(3): 407-16 28. Santosa DA, Hendroko R, Farouk A và Greiner R (2004) A rapid and highly efficient method for transformation of sugarcane callus. Molecular Biotechnology 28: 113-119. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29. Snyman SJ, Meyer GM., Richards JM, Haricharan N, Ramgareeb S, Huckett BI (2006) Refining the application of direct embryogenesis in sugarcane: effect of the developmental phase of leaf disc explants and the timing of DNA transfer on transformation efficiency. Plant Cell Rep. 25: 1016–1023. 30. Stitt M (1989) Product inhibition of potato tuber pyrophosphate, Fructose 6-phosphate phosphotransferase by phosphate and pyrophosphate. Plant physiol. 89: 628-633. 31. Sugihartor B, Sakakibara H, Sumadi and Sugiyama T (1997) Differential Expression of Two Genes for Sucrose-phosphate-Synthase in Sugarcane: Molecular Cloning of the cDNAs and Comparative Analysis of Gene Expression. Plant cell physiol. 38: 961-965. 32. Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, eddective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27(6): 581-90. 33. Worrell AC, Bruneau JM, Summerfelt K, Boersig M, Voelker TA (1991) Expression of a maize sucrose phosphate synthase in tomato alters leaf carbohydrate partitioning. Plant Cell. 3(10): 1121-30. 34. Zhangsun D, Luo S, Chen R, Tang K (2007) Improved Agrobacterium- mediated genetic transformation of GNA transgenic sugarcane. Section Cellular and Molecular Biology 62 (4): 386-393. 35. Zhu YJ, Komor E, and Moore PH. (1997) Sucrose Accumulation in the Sugarcane Stem 1s Regulated by the Difference between the Activities of Soluble Acid Invertase and Sucrose Phosphate Synthase. Plant Physiol. 115(2): 609-616. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên PHỤ LỤC Môi trƣờng MS cơ bản: - MS I: KNO3:1900 mg/l; NH4NO3:1650 mg/l; MgSO4.7H2O:370 mg/l; KH2PO4:170 mg/l - MS II: CaCl2.2H2O mg/l - MS III: H3BO3:6,2 mg/l; MnSO4: 22,3 mg/l; ZnSO4: 8,6 mg/l; KI: 0,83 mg/l; Na2MoO4: 0,25 mg/l; CuSO4: 0,025 mg/l; CoCl2: 0,025 mg/l - MS IV:Na2EDTA: 37,3 mg/l; FeSO4.7H2O: 27,8 mg/l - MS V: Glycin: 2 mg/l; Nicotinic: 0,5 mg/l; B1: 0,5 mg/l; B6: 0,5 mg/l Môi trƣờng LB: - LB lỏng: Môi trƣờng LB lỏng: 0,5% (5 g/l) dịch chiết nấm men (Yeast extract), 1% (10 g/l) bacto-Tryptone, 1% (10 g/l) NaCl. Hoặc dùng 25g LB bột LB pha sẵn cho 1l LB lỏng. - LB đặc: LB lỏng bổ sung 1,5% (15g/l) Bactor-aga. Dung dịch đệm tách plasmid: - Sol I: 50 mM glucose, 25 mM Tris HCl pH 8, 10 mM ETDA pH8 - Sol II: 0.2 NaOH, SDS 1% - Sol III: 60 ml CH3COOK 5M; 11,5 ml CH3COOH; 28,5 ml H20 Các môi trƣờng đƣợc khử ở áp suất 4 atmotphe và 117oC trong 15 phút. Đệm điện di gel agarose: - TAE 50 X (100 ml) : Tris -base 24.2 g, axit axetic 5.71g , EDTA 0.1M pH8 50ml thêm nƣớc đến 100 ml. - Đệm tra mẫu (loading buffer): 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glycerol 100%, thêm nƣớc cất cho đủ 1 ml