Luận văn Phân lập và định danh một số loài aspergillus trên hạt đậu phộng ở chợ Xuân Khánh

Luận văn tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng i TRƯỜNG ðẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NƠNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MƠN CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM NGUYỄN THU MAI PHÂN LẬP VÀ ðỊNH DANH MỘT SỐ LỒI ASPERGILLUS TRÊN HẠT ðẬU PHỘNG Ở CHỢ XUÂN KHÁNH LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn LÂM THỊ VIỆT HÀ NGUYỄN BẢO LỘC Năm 2007 Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng ii Luận văn tốt nghiệp đính kèm tên đề tài “Phân lập và định danh một số lồi Aspergillus trên hạt đậu phộng ở chợ Xuân Khánh” do NGUYỄN THU MAI thực hiện đã được thơng qua hội đồng báo cáo luận văn. Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện LÂM THỊ VIỆT HÀ NGUYỄN CƠNG HÀ NGUYỄN BẢO LỘC Cần Thơ, 28 tháng 6 năm 2007 CHỦ TỊCH HỘI ðỒNG LÝ NGUYỄN BÌNH Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng iii LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ: Quý thầy cơ Trường ðại Học Cần Thơ và đặc biệt là Quý thầy cơ Bộ Mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm nĩi riêng đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt những năm học qua. ðặc biệt em xin thành cảm ơn cơ Lâm Thị Việt Hà và thầy Nguyễn Bảo Lộc - người đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm cũng như kiến thức để giúp em hồn thành tốt luận văn tốt nghiệp ngành Cơng Nghệ Thực Phẩm. Tập thể cán bộ phịng thí nghiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm, tập thể lớp Cơng Nghệ Thực Phẩm K28 đã giúp đỡ và cùng trao đổi những kiến thức trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Cần Thơ, ngày 14 tháng 06 năm 2007 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thu Mai Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng iv MỤC LỤC Trang LỜI NĨI ðẦU..................................................................................................................i MỤC LỤC ................................................................................................................ ..ii DANH MỤC BẢNG................................................................................................. .iv DANH MỤC HÌNH........................................................................................................v TĨM TẮT................................................................................................................. vii CHƯƠNG I: ðẶT VẤN ðỀ ........................................................................................ i 1.1. ðẶT VẤN ðỀ .................................................................................................. 1 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU.............................................................................. 1 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ......................................................................2 2.1. HẠT ðẬU PHỘNG.......................................................................................... 2 2.1.1. Cấu tạo hạt đậu phộng ................................................................................ 2 2.1.2. Thành phần hĩa học và giá trị dinh dưỡng hạt đậu phộng ........................... 2 2.2. NẤM MỐC ASPERGILLUS HIỆN DIỆN TRÊN ðẬU PHỘNG...................... 6 2.2.1. ðặc tính chung của nấm mốc Aspergillus ................................................... 6 2.2.2. Cấu tạo sợi nấm và hệ sợi nấm ................................................................... 7 2.2.3. Hình thái nấm mốc ..................................................................................... 7 2.2.4. Một số lồi Aspergillus............................................................................... 8 2.2.5. Aflatoxin và tác động của nĩ đối với sức khỏe con người........................... 9 2.2.6. Sự nhiễm độc aflatoxin trên đậu phộng và biện pháp phịng tránh ............ 10 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ......................16 3.1. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU .................................................................... 16 3.1.1. ðịa điểm................................................................................................... 16 3.1.2. Thời gian nghiên cứu................................................................................ 16 3.1.3. Nguyên liệu.............................................................................................. 16 3.1.4. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................... 16 3.1.5. Hĩa chất ................................................................................................... 16 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 17 Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng v 3.3. NỘI DUNG VÀ TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM ............................................... 17 3.3.1. Phân lập nấm mốc Aspergillus.................................................................. 17 3.3.2. Tiến hành thí nghiệm................................................................................ 17 a. Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy..................................................................... 17 b. Chuẩn bị mẫu ............................................................................................. 17 c. Phân lập nấm mốc....................................................................................... 17 d. ðịnh danh................................................................................................... 18 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN………………………………… 21 4.1. Aspergillus flavus..................................................................................... 23 4.2. Aspergillus niger…………………………………………………......................25 4.3. Aspergillus oryzae………………………………………………………………..27 4.4. Aspergillus ficuum…………………………………………………………29 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ………………………………………30 5.1. KẾT LUẬN………………………………………………………………………30 5.2. ðỀ NGHỊ………………………………………………………………………...30 TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................31 PHỤ LỤC…………………………………………………………………….............32 Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng vi DANH MỤC BẢNG Trang Error! No table of contents entries found.Bảng 7: Qui trình định loại một chủng nấm mốc (đối với nhiều chi nấm mốc)............12 Luận văn tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng v DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1. Hình thái học nấm mốc..................................................................................... 10 Hình 2. Mẫu hạt đậu phộng cĩ nấm mốc phát triển trên mơi trường nuơi cấy PGA sau 3 - 5 ngày, nhiệt độ 27 - 320C........................................................................................ 21 Hình 3. Aspergillus flavus với những giọt tiết cĩ màu trắng đục xung quanh rìa khuẩn lạc sau 4 –5 ngày nuơi cấy trên mơi trường Czapek....................................................... 23 Hình 4. Aspergillus flavus cĩ bơng hình cột với những chuỗi bào tử rất dài................... 23 Hình 5. Cấu tạo hiển vi một bơng với thể bình hai tầng ................................................. 23 Hình 6. Cấu tạo một bọng cĩ hình gần cầu. ................................................................... 23 Hình 7. Các bào tử kết lại thành chuỗi rất dài ................................................................ 23 Hình 8. Bào tử của A. flavus ......................................................................................... 24 Hình 9. Cấu tạo một thể bình hai tầng với cuống đính thể bình cĩ hình trụ và thể bình cĩ hình chai................................................................................................................... 24 Hình 10. Aspergillus niger sau 3 ngày và sau 5 ngày nuơi cấy trên mơi trường Czapek, nhiệt độ 27 - 320C. ........................................................................................................ 26 Hình 11. Cấu tạo sợi nấm A. niger mang chức năng sinh sản cĩ bơng hình cầu toả tia... 26 Hình 12. Bơng với thể bình hai tầng và bọng hình cầu. ................................................. 26 Hình 13. Cấu tạo hiển vi một thể bình hai tầng với lớp thể bình thứ nhất dài gấp đơi thể bình thứ hai. Lớp thứ nhất cĩ hình trụ, lớp thứ hai cĩ hình chai ............................... 26 Hình 14. Aspergillus oryzae cĩ màu vàng lục khi non và chuyển sang màu vàng lục nâu khi già .................................................................................................................... 28 Hình 15. Aspergillus oryzae cĩ bơng hình cầu khi non và xé rách tạo hình trụ hay những chuỗi tua rua khi già. .......................................................................................... 28 Hình 16. Cấu tạo bơng lớn với thể bình hai tầng và bọng cĩ hình cầu ........................... 28 Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng vi Hình 17. Cấu tạo bơng nhỏ với thể bình một tầng.......................................................... 28 Hình 18. Aspergillus ficuum cĩ màu nâu trên mơi trường Czapek sau 7 ngày tuổi…..... .28 Hình 19. Aspergillus ficuum cĩ bơng hình cầu tỏa tia rất đều và đặc biệt cuống khá dài..... ............................................................................................................................ 30 Hình 20. Khi già, bơng xé rách tạo dạng cột. ................................................................. 30 Hình 21. Cấu tạo hiển vi một bơng cĩ bọng hình cầu và quan sát thấy rõ thể bình một lớp................................................................................................................................. 30 Hình 22. Bơng được đính trên cuống rất dài .................................................................. 30 Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng vii TĨM TẮT ðậu phộng là một trong những loại hạt cĩ giá trị dinh dưỡng cao và nĩ là mặt hàng xuất khẩu quan trọng ở nước ta, đem lại nguồn thu ngoại tệ khá lớn. Tuy nhiên do nước ta cĩ điều kiện khí hậu nhiệt đới nĩng ẩm nên rất thuận lợi cho các lồi nấm mốc phát triển và gây hại. ðặc biệt trên đậu phộng thường cĩ lồi Aspergillus xâm nhập và gây hư hỏng, chẳng những thế chúng cịn tiết ra độc tố gây ung thư cho người khi ăn phải. Sự cĩ mặt của các lồi này phụ thuộc vào vùng địa lý cũng như loại thực phẩm thích hợp cho sự sinh trưởng của chúng. Phần luận văn này được tiến hành với mục đích “Phân lập và định danh một số Aspergillus trên hạt đậu phộng ở chợ Xuân Khánh - thành phố Cần Thơ”. Kết quả sau khi phân lập và tiến hành định danh được bốn lồi Aspergillus sau: Aspergillus flavus, Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus ficuum. ðiều này cho thấy các lồi trên phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và xuất hiện trên đậu phộng với tần số rất cao. Luận văn tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 1 CHƯƠNG I: ðẶT VẤN ðỀ 1.1. ðẶT VẤN ðỀ ðậu phộng là loại cây cơng nghiệp phổ biến trên thế giới và ở nước ta, nĩ được xem là một trong những cây mũi nhọn về chiến lược kinh tế trong việc sản xuất và khai thác lợi thế của vùng khí hậu nhiệt đới. Hạt đậu phộng cĩ giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều protein và lipid với hàm lượng khá cao, nĩ cũng là nguồn cung cấp vitamin E, K, B rất quan trọng và cả nguồn thiamine và niacine là những vitamin cĩ rất ít trong các loại ngũ cốc khác. Từ đậu phộng, người ta cĩ thể chế biến thành các sản phẩm thực phẩm như bánh, mứt, kẹo,...(chiếm khoảng 12% sản lượng đậu phộng), ngồi ra cịn cĩ khoảng 6% sử dụng cho chăn nuơi, 1% cho xuất khẩu và khoảng 80% số đậu phộng sản xuất ra được dùng để sản xuất dầu ăn. Ở nước ta, sản lượng đậu phộng sản xuất ra hàng năm chủ yếu dùng cho xuất khẩu (70 - 80%) cho nên nĩ là cây đem lại nguồn thu ngoại tệ rất quan trọng. Tuy nhiên, ở nước ta do điều kiện khí hậu nhiệt đới nĩng ẩm cộng với điều kiện bảo quản khơng đảm bảo nên hạt đậu phộng rất dễ bị nấm mốc tấn cơng, gây hư hỏng và khơng thể sử dụng được nữa. Phần lớn nấm mốc trên đậu phộng thuộc giống Aspergillus, Penicillium, Fusarium và trong số chúng lại sản sinh ra độc tố. Theo nghiên cứu, người ta kết luận cĩ 4 độc tố hiện diện trên hạt đậu phộng là: Aflatoxin, Citrinin, Ochratoxin A và Zearalenone trong đĩ Aflatoxin được đặc biệt chú ý vì tính độc của nĩ. Sự hiện diện của nấm mốc nhất là Aspergillus sản sinh độc tố gây ra những vụ ngộ độc, gây chết người và gia súc,... ðặc biệt, chúng cịn dẫn đến gây ung thư gan. Việc biết được sự cĩ mặt của các lồi Aspergillus trong đậu phộng cĩ ý nghĩa rất quan trọng, để từ đĩ cĩ hướng ứng dụng thực tế (vài lồi được sử dụng để sản xuất enzyme, sản phẩm lên men,...), biết được sự phân bố của giống đa dạng, đồng thời phịng chống sự xâm nhập của chúng vào hạt đậu phộng nĩi riêng và các loại thực phẩm khơ nĩi chung. Bám sát mục tiêu trên, tơi tiến hành thực hiện đề tài “Phân lập và định danh một số lồi Aspergillus trên hạt đậu phộng ở chợ Xuân Khánh - thành phố Cần Thơ”. 1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Phân lập và làm thuần chủng các lồi Aspergillus hiện diện trên đậu phộng trong quá trình tồn trữ và sự xâm nhiễm trong quá trình vận chuyển hạt. - Xác định tên gọi từng lồi dựa trên các đặc điểm về hình thái và các đặc điểm lồi của chúng. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 2 CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. HẠT ðẬU PHỘNG 2.1.1. Cấu tạo hạt đậu phộng - Về hình dạng: hạt cĩ nhiều hình dạng khác nhau: trịn, bầu dục, ... - Về màu sắc: hạt cĩ màu trắng, hồng, đỏ sậm,... - Cấu tạo: hạt cĩ 3 bộ phận chính là vỏ lụa, nội nhũ và phơi. + Vỏ lụa: rất mỏng, ở ngồi bao bọc lấy nội nhũ và phơi. Màu sắc của lớp vỏ lụa thay đổi tùy thuộc vào giống. + Nội nhũ (tử diệp): gồm hai phiến cĩ màu trắng sữa hoặc trắng ngà, hình phẳng lồi, hai mặt phẳng úp vào nhau. + Phơi gồm cĩ ba lá phơi: mầm, phơi lá, phơi rễ. 2.1.2. Thành phần hĩa học và giá trị dinh dưỡng hạt đậu phộng Hạt đậu phộng cĩ chứa một hàm lượng lớn lipid, protein, ngồi ra trong đậu phộng cịn cĩ các vitamin, chất khống, nước,...Thành phần hĩa học hạt đậu phộng thay đổi tùy thuộc vào giống và điều kiện sinh trưởng. Trong protein đậu phộng cĩ rất nhiều các acid amin, đặc biệt là các acid amin cần thiết hiện diện trong đậu phộng với một tỷ lệ rất cao. Hạt đậu phộng là nguồn chứa hàm lượng lipid rất cao bao gồm cả các acid béo no và chưa no Bảng 1: Thành phần hĩa học hạt đậu phộng. Thành phần gr/100grams Nước 6,50 Protein 25,80 Lipid 49,24 Tro 2,33 Carbohydrate 16,13 ðường 3,97 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 3 *Lipid Trong dầu đậu phộng cĩ khoảng 80% các acid béo chưa no và 20% các acid béo no.Thành phần chính xác các acid béo thay đổi tùy theo giống và điều kiện canh tác.Trong đĩ acid oleic và acid linoleic chiếm trên 80% hàm lượng acid béo và trong các acid béo no, acid palmitic chiếm 10%; 10% cịn lại là các acid béo tương đối quan trọng đã được phát hiện gần đây. Bảng 2: Thành phần các acid béo trong dầu đậu phộng. Thành phần gr/100grams Tổng lượng acid béo bão hịa 6,834 Acid myristic, 14:0 0.025 Acid palmitic, 16:0 5.154 Acid steric, 18:0 1.100 Tổng lượng acid béo chưa bão hịa 24.429 Acid palmitoleic, 16:1 0.009 Acid oleic, 18:1 23.756 Acid linoleic, 18:3 0.003 Acid α-linoleic, 18:2 15.555 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Dầu đậu phộng chứa ít phospholipid, trung bình 0,3% (Chu Thị Thơm và cộng sự, 2006 ). Các phospholipid của dầu đậu phộng là một trong những trụ cột của ngành cơng nghiệp dầu do khả năng tạo nhũ tương và đặc tính chống oxy hĩa của chúng. Dầu đậu phộng tương đối ổn định so với nhiều dầu thực vật khác do trong dầu đậu phộng cĩ tocopherol là chất chống oxy hĩa chủ yếu. *Protein ðậu phộng cĩ chứa khoảng 26% protein trong đĩ globulin là cao nhất, khoảng 97% hàm lượng protein. Ngồi ra cịn cĩ hàm lượng khơng đáng kể các albumin, prolamin, glutein. Hệ số tiêu hĩa của protein đậu phộng khoảng 89%. Trong protein đậu phộng cĩ chứa các acid amin cần thiết cho dinh dưỡng người. Tuy nhiên, dựa trên kết quả phân tích và trên nhiều thí nghiệm người ta nhận thấy rằng cac protein của đậu phộng bị hạn chế trước hết bởi methionin rồi tới lysine và threonin. Ngồi ra cịn cĩ ít nhất 16 acid amin được tìm thấy ở dạng tự do, những acid amin này cĩ liên quan đến phản ứng hĩa nâu trong quá trình chế biến. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 4 Bảng 3: Thành phần các acid amin trong protein đậu phộng. Amino acids gr/100grams Tryptophan 0,250 Threonin 0,883 Isoleucine 0,907 Leucine 1,672 Lysine 0,926 Methionine 0,317 Cystine 0,331 Phenylalanine 1,337 Tyrosine 1,049 Valine 1,082 Arginine 3,085 Histidine 0,652 Alanine 1,025 Aspartic acid 3,146 Glutamic acid 5,390 Glycine 1,554 Proline 1,138 Serine 1,271 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. * Vitamin - Vitamin tan trong dầu: ðậu phộng cĩ lượng rất ít các vitamin A, D và caroten. Trong khi đĩ các vitamin E chiếm số lượng đáng kể tồn tại ở dạng tocopherol và là tác nhân chống oxy hĩa chủ yếu trong dầu đậu phộng. - Vitamin tan trong nước: ðậu phộng là nguồn khá dồi dào về các vitamin tan trong nước. + ðậu phộng khơng chứa vitamin C. + Vitamin B1 (thiamine) được thấy trong đậu phộng ít nhất ở ba dạng thiamine, thiamine monophosphate và thiamine pyrophosphate với tỷ lệ 33:10:1 (Chu Thị Thơm và cộng sự, 2006). Ngồi ra, cịn cĩ riboflavin, niacine,... Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 5 Bảng 4: Thành phần các vitamin trong hạt đậu phộng. Vitamin mg/100grams Vitamin C 0,000 Thiamine 0,640 Riboflavin 0,135 Niacine 12,006 B6 0,348 E (tocopherol) 8,330 Folate, tổng số (mcg/100gr) 240 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. * Chất khống Hạt đậu phộng là nguồn cung cấp các chất khống như Ca, P, Mg, Na, Fe,... Trong hạt các cây lấy dầu trong đĩ cĩ đậu phộng, hàm lượng các nguyên tố khống thường lớn hơn 1,8 - 2,2 lần so với hạt các loại cây khác. Bánh dầu đậu phộng (hạt đậu phộng sau khi lấy dầu) chứa rất nhiều các khống vi lượng và protein. Bảng 5: Thành phần các chất khống trong hạt đậu phộng. Chất khống mg/100grams Ca 92 Fe 4,58 Mg 168 P 376 K 705 Na 18 Zn 3,27 Cu 1,144 Mn 1,934 Nguồn: USDA National Database for Standard Reference Release 19, 2006. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 6 Ta thấy rằng, đậu phộng là một loại hạt cĩ nhiều lipid và protein. Sau thu hoạch nhất là trong điều kiệu khí hậu nhiệt đới nĩng ẩm như ở nước ta hạt đậu phộng cĩ nhiều diễn biến hĩa sinh làm thay đổi thành phần hạt đậu phộng. Do đĩ, trong quá trình bảo quản hạt nếu khơng đảm bảo các yếu tố về tình trạng hạt, điều kiện phương tiện bảo quản (nhiệt độ và độ ẩm kho bảo quản) sẽ dẫn đến hư hỏng hạt mà quan trọng hơn cả là sự tấn cơng của nấm vào khối hạt. Về các lồi nấm hại quả đậu phộng, người ta chia làm hai nhĩm. - Nhĩm nấm ngồi đồng: + Hệ vi sinh vật ở đất trồng đậu phộng trong suốt mùa sinh trưởng. Chủ yếu là Fusarium spp., Aspergillus spp., Rhizopus spp., Rhizoctonia spp., Macrophoma phascoli. + Hệ vi sinh vật ở quả và hạt trước khi chín và thu hoạch: chiếm ưu thế là Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp. và Rhizopus spp. + Hệ vi sinh vật ở quả và hạt khi phơi (hoặc sấy khơ) chiếm ưu thế là Fusarium spp., Aspergillus spp., Penicillium spp. - Nấm trong khi cất giữ: Người ta phát hiện đến 150 lồi nấm ở quả và hạt đậu phộng cất giữ trong kho. Phổ biến là các lồi nấm Aspergillus (nhĩm Aspergillus flavus, Aspergillus glaucus, Aspergillus niger), Penicillium spp. (P. rubram, P. funicularum, P. citrum), Fusarium spp., Rhizopus spp.,...ðĩng vai trị quan trọng là các giống Aspergillus mà trong số chúng tạo ra độc tố aflatoxin gây nguy hại đến sức khỏe con người (Chu Thị Thơm và et al., 2006) 2.2. NẤM MỐC ASPERGILLUS HIỆN DIỆN TRÊN ðẬU PHỘNG 2.2.1. ðặc tính chung của nấm mốc Aspergillus Họ nấm Aspergillus cĩ thể lên đến 200 lồi, trong đĩ cĩ khoảng 20 lồi gây hại cho con người. Aspergillus thuộc nhĩm vi nấm, khơng cĩ chất diệp lục do vậy chúng khơng thể tổng hợp được các chất dinh dưỡng cho bản thân mà phải lấy từ các chất hữu cơ cĩ sẵn trong mơi trường để sinh trưởng và phát triển. Khuẩn ty cĩ vách ngăn, phân nhánh, khơng màu, màu nhạt hoặc trở nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất định của khuẩn lạc. Aspergillus hồn tồn hiếu khí, chúng phát triển mạnh trong điều kiện khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Tương tự như các lồi nấm mốc nĩi chung, Aspergillus chịu được điều kiện nhiệt độ, độ acid và aw thấp hơn các lồi vi sinh vật khác. Về sinh sản, Aspergillus sinh sản bằng hình thức vơ tính đĩ là cách sinh sản bằng mẩu sợi - một đoạn sợi nấm rơi vào cơ chất gặp điều kiện thuận lợi Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 7 sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới. Ngồi sinh sản bằng mẩu sợi, nấm mốc cịn sinh sản bằng bào tử đính (conidia), đây là hình thức sinh sản phổ biến ở nấm mốc; khi đĩ các sợi khuẩn ty khí sinh hình thành một dạng tế bào đặc biệt hình chai và đầu các tế bào này sinh ra các bào tử cịn gọi là bào tử đính hay bào tử trần, màu sắc của bào tử đặc trưng cho nấm mốc ở tuổi trưởng thành. Các giống Aspergillus phân bố rất rộng rãi. Chúng cĩ thể được phân lập từ đất, đậu phộng, thĩc, gạo, ngơ, giày da, sơn, giấy, phim ảnh, dược liệu,... Một số giống Aspergillus được sử dụng trong cơng nghệ lên men, sản xuất enzyme (amylase, protease, pectinase,...), các acid hữu cơ (acid citric, acid glucomic,...). Một số lồi lại tạo thành mycotoxin cĩ khả năng gây ung thư (Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus versicolor,...). 2.2.2. Cấu tạo sợi nấm và hệ sợi nấm Sợi nấm là một ống hình trụ dài, cĩ vách ngăn ngang. Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài vừa phân nhánh và vừa tạo thành các vánh ngăn. Các nhánh lại tiếp tục phân nhánh liên tiếp. Tồn bộ sợi nấm và các nhánh phát triển từ một tế bào nấm mốc trên mơi trường nuơi cấy hoặc trong một số cơ chất tự nhiên gọi là hệ sợi nấm, hệ sợi nấm phát triển thành khối cĩ hình dạng nhất định thường là trịn hoặc gần trịn gọi là khuẩn lạc (Bùi Xuân ðồng, 2004). Về nguyên tắc cấu tạo tế bào nấm mốc khơng khác tế bào vi khuẩn và nấm men, trong tế bào chất thường tạo thành một số khơng bào chứa đầy dịch bào. Các chuỗi tế bào được ngăn cách và nối tiếp nhau tạo thành khuẩn ty. Hệ sợi nấm mốc cĩ một số sợi ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra ngồi bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh. Từ khuẩn ty khí sinh sẽ cĩ một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử và màu sắc của bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc của nấm mốc khi già. 2.2.3. Hình thái nấm mốc Giống Aspergillus sinh sản bằng bào tử đính (conidia), đây là hình thức sinh sản vơ tính và bào tử nấm mốc là cơ quan sinh sản chứ khơng phải là dạng tồn tại bảo vệ như ở các vi khuẩn. Bào tử đính phát triển từ thành tế bào rất dày bên trong hệ sợi nấm gọi là tế bào chân đế. Nĩ tạo thành sợi cuống dài và kết thúc khi tạo ra một cấu trúc phồng hình củ hành gọi là bọng (túi). Xung quanh bọng là một hoặc hai bộ cuống để đính bào tử gọi là cuống đính bào tử hay thể bình. Từ bộ cuống đính bào tử ngồi cùng, bào tử được sinh ra gọi là bào tử đính. Khơng cĩ một giống nấm sợi nào khác ngồi giống nấm này cĩ hệ bào tử đính tương tự ( Nguyễn ðức Lượng et al., 2003). Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 8 Nguồn: 2.2.4. Một số lồi Aspergillus thường gặp • Aspergillus flavus Khi phát triển trên mơi trường thạch Czapek, thạch malt và PDA bề mặt khuẩn lạc cĩ màu vàng lục, do bào tử đính màu này được tạo ra rất nhiều. Hệ bào tử đính thường cĩ sợi cuống với vỏ cuống xù xì, cĩ hai bộ cuống đính bào tử và tạo bào tử đính cĩ gai. Lồi này cĩ thể tạo aflatoxin và cĩ khả năng gây bệnh. Foot cell Tế bào chân đế Conidiophore stipe Cuống conidi Vesiele Bọng Metulac Phialides Thể bình (cuống thể bình) Thể bình Conidia Bào tử Columnar Hình cột Radiate Hình tia Hulle cells Tế bào Hulle (tế bào vỏ dầy) Hình 1: Hình thái học nấm mốc Chú thích hình: Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 9 • Aspergillus parasiticus Lồi này tương tự như lồi Aspergillus flavus, chỉ cĩ hai điểm khác là chúng chỉ cĩ một bộ cuống đính bào tử và bề mặt cuống nhẵn hoặc xù xì. Chúng cũng cĩ thể tạo aflatoxin và gây bệnh. • Aspergillus niger Nhĩm này gồm cĩ trên dưới 10 lồi. Chúng cĩ màu đen khi quan sát bằng mắt thường do chúng tạo bào tử đính màu đen, nhưng lại cĩ màu nâu khi quan sát dưới kính hiển vi cĩ độ phĩng đại thấp. Chúng cĩ hai bộ cuống đính bào tử và tạo bào tử đính màu nâu hơi đen và cĩ gai. Bọng và sợi cuống thường cĩ màu nâu bĩng. Một số lồi của nhĩm này cĩ khả năng gây bệnh. • Aspergillus fumigatus Lồi này cĩ hệ bào tử đính chỉ cĩ một bộ cuống đính bào tử. Cuống đính bào tử, túi và sợi cuống cĩ màu lục hơi xanh. Bào tử đính cĩ gai. Khuẩn lạc cĩ màu nâu hơi xanh. ðây là lồi cĩ khả năng gây bệnh cho người và động vật, thường lây nhiễm qua con đường hơ hấp. Chúng phát triển mạnh ở vùng cĩ khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới (Nguyễn ðức Lượng et al., 2003). 2.2.5. Aflatoxin và tác động của nĩ đối với sức khỏe con người Hiện nay cĩ khoảng 300 aflatoxin với trên 100 lồi nấm mốc tương ứng đã được phát hiện, trong đĩ chiếm số đơng là Penicillium sau đĩ đến Aspergillus. Bảng 6: Các lồi thuộc chi Aspergillus và các mycotoxin tạo thành. Lồi nấm Mycotoxin Aspergillus flavus Aflatoxin, acid koji, acid nitro-propionic, acid Aspergillic, aspertoxin,... Asp. parasiticus Aflatoxin Asp. niger Aflatoxin Asp. fumigatus Aflatoxin, fumigacillin, gliotoxin Asp. oryzae Oryzacilli, acid koji Asp. versicolor Versicolorin A, B, C; aversin, sterogmatocystin Nguồn: Bùi Xuân ðồng, 2004. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 10 Trong thực tế hiện nay chỉ cĩ những mycotoxin gây ung thư gan mới được con người thực sự quan tâm. Trong số đĩ được chú ý đặc biệt là các aflatoxin B1, B2, G1, G2 do: - ðộc tính và được tạo thành với lượng nhiều. ðộc tố rất bền nhiệt. - Khả năng phân bố phổ biến Aspergillus flavus. - Tỷ lệ cao các chủng tạo ra aflatoxin ở các lồi nấm này. Ở Việt Nam, Aspergillus flavus và aflatoxin được phát hiện trên nhiều loại lương thực và thực phẩm với tần suất khác nhau trên các sản phẩm và vùng địa lý khác nhau. * ðộc tính aflatoxin Với lượng nhỏ ăn nhiều ngày aflatoxin cĩ khả năng ung thư gan cho người, nếu hấp thu tổng lượng 2,5mg trong 89 ngày cĩ thể dẫn đến ung thư gan hơn một năm sau. Với số lượng aflatoxin lớn, gây bệnh cấp tính với các triệu chứng chủ yếu ở gan (gan bị hoại tử, chảy máu gan,...). Liều lượng độc tố gây chết người khoảng 10mg (www.vnn.vn). Theo WHO, qui định trong thức ăn, thức uống cho người khơng được cĩ quá 30µg trên 1kg sản phẩm ăn uống và khơng được cĩ quá 0,3ppm aflatoxin trong thức ăn bổ sung cho trẻ em ở các vùng dân cư thiếu dinh dưỡng protein. 2.2.6. Sự nhiễm độc aflatoxin trên đậu phộng và biện pháp phịng tránh ðậu phộng cĩ thể bị nhiễm độc khi cĩ một số nấm phát triển trên nĩ, sự sinh sản và sinh nhiễn độc tố này cĩ thể xảy ra trong 3 thời kỳ: - Aspergillus flavus xâm nhập và sản sinh độc tố trước khi thu hoạch: Do gặp điều kiện thời tiết xấu, vỏ hạt bị tổn thương nứt vỡ tạo điều kiện thuận lợi cho nấm xâm nhập vào trong quả. - Aspergillus flavus xâm nhập và sản sinh độc tố sau khi thu hoạch: Aspergillus flavus phát triển mạnh khi hạt đậu đã chín quá mức mới thu hoạch. ðậu phộng sau khi thu hoạch nếu khơng được phơi khơ mà đem đi bảo quản ngay cũng tạo điều kiện tốt cho việc sản sinh độc tố. - Aspergillus flavus xâm nhập và sản sinh độc tố trong kho bảo quản: ðộ ẩm tương đối trong khơng khí ở kho và nền kho là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến sự sản sinh độc tố. Nếu trong kho quá ẩm, nguy cơ đậu phộng nhiễm độc rất cao mặc dù được thu họach đúng kỹ thuật và phơi đúng cách. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 11 * Các nhân tố tạo điều kiện xuất hiện chất độc trên đậu phộng Aspergillus flavus xâm nhập và sản sinh độc tố phần lớn ảnh hưởng bởi ba yếu tố: - Nhiệt độ: • Aspergillus flavus tồn tại và phát triển được ở khoảng nhiệt độ 6 - 450C. • Tốc độ tăng trưởng tối ưu ở khoảng 30 - 350C. • Sinh độc tố ở khoảng 13 - 400C, đặc biệt nhiều ở 250C. - ðộ ẩm: • Aflatoxin sinh ra nhiều khi độ ẩm khơng khí là 85% ở 300 C trong 21 ngày. - Tình trạng vỏ hạt: • Vỏ hạt bị thương tổn là điều kiện để xúc tiến nhiễm độc cao, tạo điều kiện nấm xâm nhập và gây hư hỏng. * Những biện pháp sau đây cho phép thu hoạch đậu phộng khơng cĩ hoặc cĩ rất ít aflatoxin: - Chọn những giống lạc cĩ vỏ dai, cứng, khơng bị nứt vỏ, quả ít bị tổn thương trong quá trình canh tác và thu hoạch. - Thu hoạch kịp thời ngay khi chín, khơng để lâu. - Phơi giữ cho đậu phộng thật khơ. - Cần phải bảo quản đậu phộng tránh tiếp xúc với khơng khí bên ngồi. - Dùng phương pháp lý hĩa để ức chế hoặc giải độc aflatoxin. 2.3. Sơ lược về hệ thống phân loại nấm mốc và phương pháp định danh. 2.3.1. Sơ lược về hệ thống phân loại nấm mốc. ðơn vị nhỏ nhất là lồi. Mỗi lồi được gọi bằng một tên khoa học gồm hai phần: tên giống và tên lồi (danh pháp kép). Tên giống viết hoa, tên lồi viết thường và được in nghiêng. Giống là một nhĩm cĩ chứa một hoặc nhiều lồi, trong khi bậc kế tiếp là họ cĩ thể cĩ một hoặc nhiều giống. Do vậy, hệ thống phân loại theo bậc được xếp từ trên xuống gồm cĩ 7 bậc như sau: Giới (Kingdom). Ngành ( Phylum). Lớp (Class). Bộ (Order). Họ (Family). Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 12 Giống (Genus). Lồi (Species). 2.3.2. Phân loại nấm. Giới nấm (Mycetalia) Ngành Nấm nhày (Myxomycetes). Lớp Acrasiomycetes. Lớp Hydromyxomycetes Lớp Myxomycetes. Lớp Plasmodiophoromycetes. Ngành Nấm (Mycota). Giai đoạn dinh dưỡng là sợi nấm hoặc đơn bào, cĩ vách. Chia thành 5 lớp. Lớp Nấm Roi (Mastigomycetes) gồm nấm cĩ bào tử động, sợi nấm khơng vách ngăn. Lớp Nấm Tiếp Hợp (Zygomycetes). Sợi nấm khơng vách ngăn, sinh sản hữu tính theo lối đẳng giao cho ra một bào tử tiếp hợp. Lớp Nấm Nang (Ascomycetes). Sợi nấm cĩ vách ngăn, sinh sản hữu tính cho ra nang chứa bào tử nang. Lớp Nấm ðảm (Basidiomycetes). Sợi nấm cĩ vách ngăn, sinh sản hữu tính cho ra đảm mang bào tử đảm. Lớp Nấm Bất Tồn (Deuteromycetes). Sợi nấm cĩ vách ngăn, sinh sản vơ tính bằng bào tử hay hạch nấm, chưa biết sinh sản hữu tính (kể cả những nấm đã biết sinh sản hữu tính nhưng trong giai đoạn vơ tính vẫn xếp vào lớp này). 2.3.3. Phân loại đến giống Aspergillus Giới Nấm: Mycetalia Ngành Nấm: Mycota Lớp Nấm Bất Tồn: Deuteromycetes Bộ Nấm Bơng: Moniliales. Họ Nấm Bơng: Moniliaceae. Giống: Aspergillus. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 13 * Phương pháp định loại lồi. Qui tắc chính. - Chủng nấm mốc tuyệt đối thuần chủng (khơng lẫn nấm mốc hoặc các lồi vi sinh vật khác). - Sử dụng các mơi trường nuơi cấy, nhiệt độ và thời gian nuơi cấy đúng với qui định của các chuyên luận phân loại. - Quan sát và ghi chép đầy đủ các đặc điểm phân loại của chủng nấm mốc cần định loại (đặc điểm khuẩn lạc trên mơi trường trong đĩa petri và các đặc điểm vi học). - Dùng các chuyên luận phân loại bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ) để định loại đến giống, sau đĩ dùng các chuyên luận phân loại của giống đã xác định để định loại đến lồi (và thứ nếu cĩ). - Kiểm tra mẫu nấm mốc đã định loại với chủng mẫu của lồi cĩ trong bộ sưu tập mẫu (nếu cĩ). - Viết tên các nhĩm phân loại đúng danh pháp quốc tế. Bảng 7. Qui trình định loại một chủng nấm mốc (đối với nhiều chi nấm mốc). Tuổi khuẩn lạc (ngày) Quan sát khuẩn lạc Quan sát các đặc điểm vi học Ngày 1 Cấy nấm ở một hoặc 3 điểm ở giữa mặt thạch trong đĩa petri. Thực hiện tiêu bản thạch hoặc tiêu bản phịng ẩm. Ngày 2 - 5 (tùy từng lồi) Khảo sát các đặc điểm của khuẩn lạc non. Ghi chép. Khảo sát, ghi chép, vẽ các đặc điểm phát sinh, cách sắp xếp của bộ máy mang bào tử và của bào tử. Ngày 5 - 12 (tùy từng lồi) Khảo sát các đặc điểm của khuẩn lạc trưởng thành. Ghi chép. Khảo sát, ghi chép, vẽ các đặc điểm hình thái của bộ máy mang bào tử và của bào tử (ở tiêu bản vi học). Các đặc điểm của khuẩn lạc cần quan sát: - Hình dạng (thường là trịn, gần trịn). - Kích thước (đường kính, chiều dày). - Dạng mặt (mượt, mịn, len, xốp, dạng hạt, lồi lõm,...) - Màu sắc mặt trên. - Màu sắc mặt dưới. - Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo,..) Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 14 - Giọt tiết (nhiều, ít, màu sắc,...) - Sắc tố hịa tan ra mơi trường (màu của mơi trường xung quanh khuẩn lạc), nếu cĩ. Các đặc điểm vi học cần khảo sát: - Bào tử: typ phát sinh bào tử, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề mặt,... - Bộ máy mang bào tử trần, gồm: Giá bào tử trần (conidiophore): kích thước (đường kính, chiều dài), bề mặt (nhẵn, cĩ gai,...), màu sắc, cĩ vách ngăn hay khơng, và các đặc điển khác. Tế bào sinh bào tử trần (conidiogenous cell): typ tế bào sinh bào tử trần (thể bình, dạng sinh bào tử trần đồng thời hay khơng đồng thời, dạng sinh bào tử trần qua lỗ để lại sẹo,...), hình dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp, vị trí (ở đỉnh giá, nhánh, dỉnh nhánh,...)... - Sợi nấm: Cĩ hay khơng cĩ vách ngăn ngang, đường kính, màu sắc, bề mặt, cĩ hoặc khơng cĩ các hình thái đặc biệt như bĩ sợi, bĩ giá, hạch nấm,... Tiến hành định loại. Căn cứ vào kết quả khảo sát đầy đủ, chính xác các đặc điểm của khuẩn lạc và các đặc điểm vi học, tiến hành xác định tên lồi của chủng nấm mốc. ðể định loại tiến hành hai bước: • Bước 1: Tìm nhĩm phân loại cĩ trong các chuyên luận phân loại bằng một số đặc điểm qui định trong các chuyên luận phân loại đĩ. Thường chúng ta dùng chuyên luận phân loại bậc cao để xác định chủng nấm mốc lần lượt, cuối cùng thuộc giống nấm mốc nào. Tiếp theo dùng chuyên luận phân loại trong các chuyên luận phân loại của giống đĩ để xác định lồi. Khi đã xác định tạm thời lồi của chủng nấm mốc, tiến hành so sánh tất cả các đặc điểm đã khảo sát của chủng nấm mốc với các đặc điểm tương ứng của lồi đĩ trong chuyên luận. Trường hợp các đặc điểm phù hợp với chuyên luận, ta xác định chủng nấm mốc này thuộc lồi vừa tiến hành so sánh, nếu khơng phù hợp ta phải tiến hành làm lại từ đầu. • Bước 2: Nếu cĩ chủng nấm mốc mẫu của lồi hoặc thứ vừa xác định trong bộ sưu tập các chủng nấm thì ta tiến hành so sánh chủng này với chủng nấm mốc mẫu. Muốn vậy ta xác định các đặc điểm chính của khuẩn lạc, các đặc điểm vi học chính của chủng nấm mẫu, và tiến hành so sánh với chủng nấm cần định loại. Nếu các đặc điểm này trùng nhau ta khẳng định chắc chắn lồi của chủng nấm mốc cần định loại. Thơng thường trong trường hợp khi định loại nấm mốc bằng chuyên luận phân loại cho kết quả khơng chắc chắn ta mới tiến hành thêm với các chủng nấm mẫu. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 15 Cĩ nhiều chuyên luận phân loại các chủng nấm mốc khác nhau được sử dụng rộng rãi trong các phịng thí nghiệm. Trong phạm vi luận văn này chúng tơi sử dụng chuyên luận phân loại trong “The genus Aspergillus” của K. B. Raper et Ch. Thom, 1965. Baltimore; đồng thời cĩ tham khảo thêm một số tài liệu phân loại cĩ liên quan. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 16 CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 3.1.1. ðịa điểm Quá trình tiến hành thí nghiệm, thu thập các dữ liệu sẽ được thực hiện tại phịng thí nghiệm Bộ Mơn Cơng Nghệ Thực Phẩm - Khoa Nơng Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng - Trường ðại Học Cần Thơ. 3.1.2. Thời gian nghiên cứu Thí nghiệm sẽ được thực hiện trong thời gian là 12 tuần bắt đầu từ ngày 26/02/07 đến ngày 18/05/07. 3.1.3. Nguyên liệu Hạt đậu phộng được thu mua tại các sạp hàng khác nhau ở chợ Xuân Khánh - Tp Cần Thơ. 3.1.4. Dụng cụ và thiết bị ðĩa petri. Tủ ủ. Nồi thanh trùng. Lame, lamellae. Becher. Tủ sấy. Que cấy mĩc. Kính hiển vi cĩ thước trắc vi. ðèn cồn. Nút bơng. 3.1.5. Hĩa chất Glucose Agar-Agar Cồn 700 và 960 Nước cất NaOH 1N HCl 1N 3.1.6. Các loại mơi trường Mơi trường Czapek. Mơi trường PGA. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 17 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Nuơi cấy mẫu trên mơi trường PGA. - Quan sát khuẩn lạc nấm mốc phát triển trên mơi trường nuơi cấy, tách rịng lồi nấm mốc nghi ngờ là Aspergillus bằng phương pháp cấy chuyền liên tục. - Tiến hành phân lập trên mơi trường Czapek. - Thực hiện tiêu bản nấm mốc quan sát dưới kính hiển vi. 3.3. NỘI DUNG VÀ TIẾN TRÌNH THÍ NGHIỆM 3.3.1. Phân lập nấm mốc Aspergillus Nhằm xác định các lồi Aspergillus hiện diện trên đậu phộng, tách riêng các lồi nấm mốc từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần chủng, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình quan sát hình thái sợi nấm, nhờ đĩ việc định tên chúng sẽ chính xác hơn. 3.3.2. Tiến hành thí nghiệm a. Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy Mơi trường PGA và Czapek được chuẩn bị, thanh trùng đổ vào các đĩa petri để đặc tự nhiên trên mặt phẳng ngang. b. Chuẩn bị mẫu Thí nghiệm được thực hiện với hai mẫu hạt khác nhau: - Mẫu 1: Hạt đậu phộng được rửa sạch bằng nước cất vơ trùng để xác định những lồi nấm mốc cĩ trong bản thân hạt. - Mẫu 2: Hạt đậu phộng khơng được rửa, dùng xác định những lồi nấm mốc bám lên hạt trong quá trình vận chuyển. c. Phân lập nấm mốc - Cho một vài hạt đậu phộng cịn nguyên vào đĩa petri chứa sẵn mơi trường PGA. - Cho đĩa vào tủ ủ ở nhiệt độ phịng. - Tiến hành quan sát sự phát triển của nấm mốc hàng ngày. Sau khoảng thời gian nuơi cấy từ 5-7 ngày, dùng que cấy vít lấy một ít bào tử nấm mốc nghi ngờ là Aspergillus (dựa trên hình thái và màu sắc bào tử nấm mốc) cấy lên mơi trường PGA trong đĩa petri. - Tiến hành ủ ở nhiệt độ phịng, và quan sát sự phát triển của nấm mốc hàng ngày. - Thao tác cấy truyền được thực hiện nhiều lần cho đến khi mẫu hồn tồn thuần chủng, khơng cĩ lẫn sợi nấm lạ. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 18 d. ðịnh danh Tiến hành nhận xét đại thể và vi thể nấm mốc - ðại thể: quan sát đặc điểm hình thái sợi nấm bằng mắt thường. - Vi thể: thực hiện tiêu bản nấm mốc, quan sát ở vật kính 40X cấu tạo khuẩn ty và bào tử của nĩ. Dựa trên kết quả thu nhận được tra khĩa phân loại, xác định tên lồi nấm mốc tương ứng. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 19 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Sau quá trình tiến hành thí nghiệm, chúng tơi quan sát thấy trên hạt đậu phộng xuất hiện thường xuyên một số lồi nấm mốc (được phân biệt chủ yếu dựa trên màu sắc) như sau: - Nấm cĩ hệ sợi bao phủ như mạng lưới, phát triển nhanh, bao trùm lên khắp đĩa với đầu là những chấm màu đen. - Nấm cĩ màu trắng, bề mặt li ti như bụi, khơng cĩ hệ sợi khí sinh. - Nấm cĩ màu vàng nâu. - Nấm cĩ màu đen. - Nấm cĩ màu nâu. - Nấm cĩ màu xanh xám, bề mặt li ti như bụi, khơng cĩ hệ sợi khí sinh. - Nấm cĩ màu vàng tươi, bề mặt li ti như bụi, khơng cĩ hệ sợi khí sinh. - Nấm cĩ màu xanh lục. - Các lồi men dại. Sau quá trình phân lập và định danh, chúng tơi xác định được bốn lồi Aspergillus sau: - Aspergillus flavus - Aspergillus oryzae - Aspergillus niger - Aspergillus ficuum Hình 2. Mẫu hạt đậu phộng cĩ nấm mốc phát triển trên mơi trường nuơi cấy PGA sau 3 - 5 ngày, nhiệt độ 27 - 320C . a) b) b) Mẫu hạt cĩ rửa a) Mẫu hạt khơng rửa Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 20 4.1. Aspergillus flavus TÊN: Aspergillus flavus Xuất xứ: Hạt đậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt độ: 27- 320C Ánh sáng: thường Mơi trường : Czapek Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày Khuẩn lạc: Tốc độ mọc: Trung bình Kích thước: 5 - 5.5 cm Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời. Giọt tiết: Xung quanh rìa khuẩn lạc cĩ giọt tiết màu trắng đục và màu đen, trong. Chúng được tiết ra sau 4 - 5 ngày nuơi cấy, bề trái các giọt tiết cĩ màu đen. Màu sắc: Mặt phải: Ban đầu khuẩn lạc cĩ màu vàng nhạt sau chuyển sang màu xanh lục Mặt trái: Khơng màu Sắc tố ra mơi trường: Khơng Giai đoạn vơ tính: ðầu: Cách sắp xếp: Mọc từ mơi trường. Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và tạo thành các cột với những chuỗi bào tử rất dài khi già. Kích thước: (50 - 200) µm. Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống ráp, cĩ nhiều gai mịn, đều. Kích thước: (380 - 800) x (12 - 18) µm. Màu sắc: Khơng màu. Bọng: Hình dạng: Hình cầu đến gần cầu. Kích thước: (35 - 50) µm. Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng. Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình hai tầng và một tầng. Cĩ cả hai loại thể bình trên cùng một bơng. Lớp 1: Hình dạng: Kích thước: Hình trụ. (10 - 20) x (3,75 - 5) µm. Lớp 2: Hình dạng: Kích thước: Hình chai. (5 - 7,5) x (3,75 - 5) µm. Hình dạng: Bào tử: Kích thước Hình cầu, bề mặt cĩ vẻ trơn nhẵn. (3 - 5) µm Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 21 Hình 3. Aspergillus flavus với những giọt tiết cĩ màu trắng đục xung quanh rìa khuẩn lạc sau 4 –5 ngày nuơi cấy trên mơi trường Czapek. Hình 7. Các bào tử kết lại thành chuỗi rất dài Hình 6. Cấu tạo một bọng cĩ hình gần cầu. Hình 4. Aspergillus flavus cĩ bơng hình cột với những chuỗi bào tử rất dài. Hình 5. Cấu tạo hiển vi một bơng với thể bình hai tầng Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 22 Nguồn: Hình ảnh được chụp ở điều kiện bình thường và ở vật kính 40X và 10X tại phịng thí nghiệm bộ mơn CNTP và bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật Hình 8. Bào tử của A. flavus Hình 9. Cấu tạo một thể bình hai tầng với cuống đính thể bình cĩ hình trụ và thể bình cĩ hình chai Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 23 4.2. Aspergillus niger TÊN: Aspergillus niger Xuất xứ: Hạt đậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt độ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Mơi trường : Czapek Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày Khuẩn lạc: Tốc độ mọc: Trung bình Kích thước: 4,4 - 5,8 cm Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, tâm khuẩn lạc lồi, rìa là lớp tơ trắng. Giọt tiết: Khơng Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc cĩ màu đen như than. Mặt trái: Khơng màu Sắc tố ra mơi trường: Khơng Giai đoạn vơ tính: ðầu: Cách sắp xếp: Mọc từ mơi trường. Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và xé rách tạo dạng cột khi già. Kích thước: (100 - 200) µm Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống nhẵn, khơng màu, cĩ màu nâu gần bọng. Kích thước: (400 - 800) x (15 - 18) µm Màu sắc: Khơng màu Bọng: Hình dạng: Hình cầu Kích thước: (45 - 72) µm Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình hai tầng với đặc trưng là lớp thứ nhất dài gấp đơi lớp thứ hai. Lớp 1: Hình dạng: Kích thước: Hình trụ dài. (17,5 - 25) x (5 - 7,5) µm Lớp 2: Hình dạng: Kích thước: Hình chai. (5 - 8) x (3 - 3,75) µm Hình dạng: Bào tử: Kích thước Hình cầu, bề mặt cĩ gai xù xì. (3,75 - 5) µm Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 24 Nguồn: Hình ảnh được chụp ở điều kiện bình thường và ở vật kính 40X và 10X tại phịng thí nghiệm bộ mơn CNTP và bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật Hình 10. Aspergillus niger sau 3 ngày và sau 5 ngày nuơi cấy trên mơi trường Czapek, nhiệt độ 27 - 320C. Hình 11. Cấu tạo sợi nấm A. niger mang chức năng sinh sản cĩ bơng hình cầu toả tia. Hình 12. Bơng với thể bình hai tầng và bọng hình cầu. và bọng cĩ hình cầu. Hình 13. Cấu tạo hiển vi một thể bình hai tầng với lớp thể bình thứ nhất dài gấp đơi thể bình thứ hai. Lớp thứ nhất cĩ hình trụ, lớp thứ hai cĩ hình chai. a) b) a) sau 3 ngày b) sau 5 ngày Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 25 4.3. Aspergillus oryzae TÊN: Aspergillus oryzae Xuất xứ: Hạt đậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt độ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Mơi trường : Czapek Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày Khuẩn lạc: Tốc độ mọc: Trung bình Kích thước: 5 - 6 cm Dạng khuẩn lạc: Dạng bột rời lấm tấm, khuẩn lạc tâm lồi, rìa thấp dần, ngồi là lớp tơ trắng. Giọt tiết: Khơng Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc ban đầu cĩ màu vàng lục sau chuyển thành màu vàng lục nâu. Mặt trái: Khơng màu Sắc tố ra mơi trường: Khơng Giai đoạn vơ tính: ðầu: Cách sắp xếp: Mọc từ mơi trường. Hình dạng: Hình cầu, toả tia khi non và xé rách thành những dãy tua rua với những chuỗi bào tử rất dài khi già. Kích thước: (140 - 170) µm. Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống cĩ gai mịn. Kích thước: (400 - 550) x (6,5 - 10) µm. Màu sắc: Khơng màu. Bọng: Hình dạng: Hình cầu đến gần cầu. Kích thước: (16,25 - 25) µm. Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng. Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình một tầng là chủ yếu. ðặc biệt bơng lớn hai thể bình, bơng nhỏ một thể bình. ðơi khi cĩ cả hai thể bình trên cùng một bơng. Thể bình một tầng Hình dạng: Kích thước: Hình chai. (7 - 8.75) x (3,75 - 5) µm Hình trụ dài. (7,5 - 11) x (3,75 - 7,5) µm Thể bình hai tầng: Lớp 1: Hình dạng: Kích thước: Lớp 2: Hình dạng: Kích thước: Hình chai. 12,5 x (7 - 7,5) µm Hình dạng: Bào tử: Kích thước: Hình cầu, bề mặt cĩ gai mịn, cĩ kích thước lớn, màu vàng nâu. Khi già gai trở nên xù xì, vách dày. (5 - 7) µm. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 26 Nguồn: Hình ảnh được chụp ở điều kiện bình thường và ở vật kính 40X và 10X tại phịng thí nghiệm bộ mơn CNTP và bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật Hình 14. Aspergillus oryzae cĩ màu vàng lục khi non và chuyển sang màu vàng lục nâu khi già Hình 15. Aspergillus oryzae cĩ bơng hình cầu khi non và xé rách tạo hình trụ hay những chuỗi tua rua khi già. Hình 16. Cấu tạo bơng lớn với thể bình hai tầng và bọng cĩ hình cầu Hình 17. Cấu tạo bơng nhỏ với thể bình một tầng Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 27 4.4. Aspergillus ficuum TÊN: Aspergillus ficuum. Xuất xứ: Hạt đậu phộng chợ Xuân Khánh Nhiệt độ: 27 - 320C Ánh sáng: thường Mơi trường : Czapek Tuổi nấm khi phân loại: 7 ngày Khuẩn lạc: Tốc độ mọc: Nhanh. Kích thước: 7 cm. Dạng khuẩn lạc: Dạng mặt răng cưa, khuẩn lạc là những vịng trịn đồng tâm thấp dần từ trong ra ngồi, rìa là lớp tơ trắng. Giọt tiết: Khơng Màu sắc: Mặt phải: Khuẩn lạc cĩ màu nâu nhạt đến nâu. Mặt trái: Khơng màu Sắc tố ra mơi trường: Khơng Giai đoạn vơ tính: ðầu: Cách sắp xếp: Mọc từ mơi trường. Hình dạng: Hình cầu, toả tia rất đều khi non và xé rách tạo dạng cột khi già. Kích thước: (150 - 200) µm Cuống: Hình dạng: Bề mặt cuống nhẵn, khơng màu, cĩ màu nâu gần sát bọng. Cuống cĩ đặc trưng dài vượt trội so với những lồi trên. Kích thước: (1200 - 1950) x (11 - 12,5) µm Màu sắc: Khơng màu, cĩ màu nâu gần sát bọng. Bọng: Hình dạng: Hình cầu đến gần cầu, cĩ kích thước lớn. Kích thước: (52 - 62) µm Vùng sinh sản: Khắp mặt bọng Thể bình: Cách sắp xếp: Thể bình một tầng với đặc trưng là kích thước rất ngắn. Lớp 1: Hình dạng: Kích thước: Hình trụ ngắn. (8,75 - 10) x (3,75 - 5) µm Lớp 2: Hình dạng: Kích thước: Hình dạng: Bào tử: Kích thước: Hình cầu đến gần cầu, bề mặt cĩ gai mịn. Màu nâu (3,75 - 4,5) µm Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 28 Nguồn: Hình ảnh được chụp ở điều kiện bình thường và ở vật kính 40X và 10X tại phịng thí nghiệm bộ mơn CNTP và bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật Hình 20. Khi già, bơng xé rách tạo dạng cột. Hình 18. Aspergillus ficuum cĩ màu nâu trên mơi trường Czapek sau 7 ngày tuổi. Hình 19. Aspergillus ficuum cĩ bơng hình cầu tỏa tia rất đều và đặc biệt cuống khá dài. Hình 21. Cấu tạo hiển vi một bơng cĩ bọng hình cầu và quan sát thấy rõ thể bình một lớp. Hình 22. Bơng được đính trên cuống rất dài Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 29 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN Qua kết quả nghiên cứu và theo dõi quá trình phát triển của nấm mốc được phân lập trên hạt đậu phộng, chúng tơi xin rút ra những kết luận sau: 1. Các lồi nấm mốc cĩ mặt trên hạt đậu phộng ở các sạp hàng khác nhau tương đối giống nhau. ðiều này cho thấy hệ nấm mốc tồn tại trên hạt đậu phộng tương đối ổn định trong khu vực chợ Xuân Khánh, Tp Cần Thơ. Bước đầu định danh được những lồi sau: 1. Aspergillus flavus. Lồi này tiết ra độc tố aflatoxin gây ung thư cho người và gây ra những bệnh cấp tính khi ăn phải với số lượng lớn. 2. Aspergillus oryzae. Lồi này được sử dụng để chế biến thực phẩm lên men truyền thống mà đặc trưng là tương. ðặc biệt, nĩ cịn được sử dụng trong chế biến sản phẩm koji của Nhật Bản. 3. Aspergillus niger. Lồi này cũng tạo ra độc tố mycotoxin, ngồi ra nĩ cịn cĩ mặt trong bánh men thuốc bắc dùng trong sản xuất rượu nếp than 4. Aspergillus ficuum. Bốn lồi này xuất hiện trên hạt đậu phộng với tần số rất cao, trong quá trình phân lập bao giờ cũng bắt gặp sự hiện diện của chúng. 2. Hệ nấm mốc trên hạt đậu phộng trong quá trình phân lập khơng thay đổi nhiều dù cĩ qua quá trình làm sạch bề mặt hay khơng làm sạch, chứng tỏ hệ nấm mốc xâm nhập vào bên trong hạt trong quá trình canh tác và vận chuyển đến nơi tiêu thụ là như nhau. 3. Hệ vi sinh vật trên hạt đậu phộng chủ yếu là nấm mốc và nấm men. 5.2. ðỀ NGHỊ 1. Thực hiện thí nghiệm với việc sát khuẩn hồn tồn bề mặt mẫu hạt bằng natri hypochloride 3% hoặc với H2O2 4%, rửa lại nhiều lần bằng nước cất vơ trùng để loại hĩa chất khử trùng. Sau đĩ nuơi cấy song song với mẫu hạt khơng được sát khuẩn để phát hiện những lồi nấm mốc nhiễm vào bên trong hạt trong quá trình canh tác và bám trên bề mặt hạt trong quá trình vận chuyển. 2. Tiếp tục tiến hành phân loại sâu hơn để định danh chính xác các lồi nằm trong giống Aspergillus. 3. Mở rộng khu vực thí nghiệm ra các chợ khác để khảo sát sự cĩ mặt của các lồi Aspergillus khác trên hạt đậu phộng từ đĩ biết được sự phân bố đa dạng của các lồi Aspergillus trên Tp Cần Thơ. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bùi Xuân ðồng (2004), Nguyên lý phịng chống nấm mốc và mycotoxin, NXB Khoa Học và Kỹ Thuật 2. Bộ mơn Bảo Vệ Thực Vật (2003), Thực hành Vi Sinh Học đại cương, trường ðại Học Cần Thơ. 3. Chu Thị Thơm et al. (2006), Kỹ thuật trồng và chăm sĩc cây lạc, NXB Lao ðộng. 4. Lâm Văn Mềnh (2004), Phân lập nấm mốc hiện diện trên cam - biện pháp hạn chế sự phát triển của chúng trong quá trình bảo quản, Trường ðHCT. 5. Nguyễn Bảo Vệ và Trần Thị Kim Ba (2005), Cây đậu phộng kỹ thuật canh tác ở ðồng Bằng Sơng Cửu Long, NXB Nơng Nghiệp. 6. Nguyễn ðức Lượng (2004), Cơng nghệ vi sinh học- tập 1- Cơ sở vi sinh vật cơng nghiệp, NXB ðHQG Tp HCM. 7. Nguyễn ðức Lượng et al. (2003), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học- tập 2- Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB ðHQG Tp HCM. 8. Nguyễn Thị Hồng Anh (1997), Nghiên cứu chế biến sữa đậu phộng, Trường ðHCT. 9. Phạm Văn Kim (2000), Vi sinh học đại cương, Trường ðHCT. 10. www.vnn.vn 11. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 31 PHỤ LỤC Phụ lục A: ðiều chế mơi trường trong nuơi cấy và phân lập nấm mốc. Phụ lục A.1. Mơi trường PGA Thành phần: Khoai tây. 200 gr Glucose 20 gr Agar - Agar 15 gr Nước cất 1000 ml pH = 6,5 - 6,8 ðiều chế: Khoai tây làm sạch vỏ, cắt thành từng sợi mỏng, cho vào beaker cĩ chứa nước cất. ðun cách thủy từ 2 - 4h. Lọc lấy nước trích, cho thêm nước cất cho đủ một lít, cho glucose vào khuấy tan, đo pH mơi trường, tiến hành điều chỉnh pH mơi trường bằng dung dịch NaOH 1N hoặc HCl 1N cho đến khi đạt pH yêu cầu. Cuối cùng cho agar vào và nấu tan. Mơi trường sau khi điều chế xong phân phối vào các bình tam giác cĩ dung tích 500ml và tiến hành thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Phụ lục A.2. Mơi trường Czapek Thành phần: - NaNO3 3 gr - K2PO4 1 gr - MgSO4 0,5 gr - KCl 0,5 gr - FeSO4.7H2O 0,01 gr - Succrose 30 gr - Agar 15 gr - Nước cất 1000 ml pH = 6,5 - 6,8 ðiều chế: Dùng beaker cĩ chứa 1000ml nước cất, đun cách thủy. Cho lần lượt các hĩa chất theo thứ tự từ trên xuống và khuấy tan. Sau khi các hĩa chất đã tan hết, đo pH mơi trường và tiến hành điều chỉnh cho đến khi pH đạt yêu cầu, cho agar vào và nấu tan. Chuyển mơi trường vào các bình tam giác 500ml và thanh trùng ở nhiệt độ 1210C trong khoảng thời gian 15 phút. Luận văn Tốt nghiệp khĩa 28 - 2007 Trường ðại Học Cần Thơ Ngành Cơng nghệ thực phẩm - Khoa Nơng nghiệp và Sinh học ứng dụng 32 Phụ lục B: Thực hiện tiêu bản quan sát nấm mốc dưới kính hiển vi. Phụ lục B.1. Tiêu bản nhuộm sống. Cho một giọt cotton blue lên một lame sạch. Sử dụng kim mũi giáo hoặc que cấy mĩc lấy một ít tơ hoặc một mảnh nhỏ thạch cĩ khuẩn ty nấm mốc. Rửa bớt bào tử nấm mốc bằng cách đặt tơ nấm trong dung dịch nước xà phịng lỗng, khuấy nhẹ. ðặt sinh khối khuẩn ty đã rửa vào giọt cotton blue trên lame, dùng hai que cấy mĩc hoặc một que cấy mĩc với một kim mũi giáo tách rời các sợi khuẩn ty trong dung dịch nhuộm. ðậy lại bằng một lamellae. ðặt tiêu bản lên bàn mang vật của kính hiển vi và tiến hành quan sát ở vật kính 10X và 40X. Phụ lục B.2. Tiêu bản thạch. Cắt một mảnh thạch hình chữ nhật cĩ kích thước bằng ¼ kích thước của lame, đặt lên một lame sạch. Dùng que cấy nhọn chạm nhẹ lên phần đầu sợi nấm để lấy bào tử, sau đĩ cấy nấm ở các cạnh của hình chữ nhật, đậy phần thạch lại bằng một lamellae sạch, đặt cả lame vào đĩa petri và ủ ở nhiệt độ phịng. Sau khoảng thời gian 3-5 ngày, lấy lame ra và tiến hành quan sát các đặc điểm vi học sợi nấm ở vật kính 10X.