Luận văn Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocacbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái nguyên - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- LÊ TIẾN MẠNH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY SINH HỌC HYDROCACBON THƠM CỦA MỘT VÀI CHỦNG VI KHUẨN ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NƯỚC Ô NHIỄM DẦU TẠI QUẢNG NINH Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGHIÊM NGỌC MINH Thái nguyên - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lêi c¶m ¬n! Trước hết tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành, sâu sắc tới TS. Nghiêm Ngọc Minh đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ Sinh học Môi trường, đặc biệt là KS. Đàm Thúy Hằng, Thạc Sỹ Nguyễn Bá Hữu những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình. Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để hoàn thành bản luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm khoa, các thầy cô và các bạn đồng nghiệp Khoa Sinh – KTNN đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Sư Phạm - Đại Học Thái Nguyên. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó! Hà nội, tháng 9 năm 2008 Học viên Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bố trong một công trình nào khác. Tác giả Lê Tiến Mạnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................1 DANH MỤC CÁC BẢNG.................................................................2 DANH MỤC CÁC HÌNH ..................................................................3 MỞ ĐẦU .......................................................................................... CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................8 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .............8 1.1.1. Tính chất hóa lý ..................................................................8 1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hƣởng của nó tới môi trƣờng sống .............................................................................................10 1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH ..........................................................13 1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam ...........13 1.2.2. Nguồn gốc phát sinh ............................................................14 1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH ................................................15 1.3.1 Phƣơng pháp hóa lý ..............................................................16 1.3.2. Phƣơng pháp phân hủy sinh học ...........................................16 1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật ..................................19 1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH ...................................................19 1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV ...........................................21 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân .................................................................25 1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật ........................................29 1.6.1. Phƣơng pháp phân loại truyền thống ...................................29 1.6.2. Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử .....................30 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................33 2.1. Nguyên liệu và hóa chất .............................................................. 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.1. Nguyên liệu.........................................................................33 2.1.2. Hóa chất .............................................................................33 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy....................................................................33 2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu ...................................................34 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................34 2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nƣớc nhiễm dầu ......................34 2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn .............................................................................35 2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn......................36 2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase............................................................................36 2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phƣơng pháp của Sambrook, Russell ........................................36 2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phƣơng pháp PCR ........................37 2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng ..................................38 2.4.4.4. Phƣơng pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động ........................................................................................40 2.4.4.5. Phƣơng pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại ...........41 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................42 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH .................................................................42 3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 .............44 3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31 .............................................................................................45 3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 .............................................................................................49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR .......................................................49 3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 ............50 3.4.3 Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp ......................................................................................52 3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 .............54 3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng BQN31 .............................................................................................57 IV. KẾT LUẬN ........................................................................................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................63 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 BẢNG CHỮ VIẾT TẮT bp Base pair (cặp bazơ) USEPA United State Environmental Protection Agency (Cục bảo vệ môi trường Hoa Kỳ) LB Luria-Bertani PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) POP Persistent Organic Pollutant DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid VSV Vi sinh vật X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside μl Microlit μm Micromet PAH Polycyclic aromatic hydrocacbon (hydrocarbon thơm đa nhân) ppm đơn vị một phần triệu (mg/l) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH ......................................... 9 Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH ................. 20 Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật ................................. 30 Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH .................................................................... 42 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn ............................... 44 Bảng 3.3: phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng BQN31..................................................................................................... 46 Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 .......... 46 Bảng 3.5: Độ tương đồng của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế .............................................. 56 Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế ................................................................... 60 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocacbon thơm đa nhân (PAH) ...................................................................................................... 8 Hình 1.2: Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật ............................... 21 Hình 1.3: Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm .................................................................................................... 22 Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33.......................................................................... 43 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31............................... 45 Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 .............................................. 45 Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 ............................................... 50 Hình 3.5: Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31........................................................................................... 50 Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 ................................................ 51 Hình 3.7: Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng được lựa chọn ........................................................................................... 52 Hình 3.8: Sản phẩm cắt DNA plasmid của dòng số 13 ............................... 53 Hình 3.9: Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng vi khuẩn BQN31....................................................................................... 53 Hình 3.10: Trình tự đầy đủ đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 ........... 54 Hình 3.11: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000 nucleotide so sánh..................................................................................... 55 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Hình 3.12: Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF và C23OR ................................................................................................ 58 Hình 3.13: Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas sp. BQN31 ........................................................................ 58 Hình 3.14: Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenaza của chủng Sphingomonas sp. BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. Thước đo thể hiện một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh ................................ 59 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 MỞ ĐẦU Trong thời đại ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về nguyên liệu và nhiên liệu của con người ngày càng tăng, đã kéo theo sự mở rộng các ngành công nghiệp khai thác, chế biến như : công nghiệp dầu mỏ, khai thác chế biến than, công nghiệp sản xuất sơn, sản xuất các hóa chất tẩy rửa... Quảng Ninh là một tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm Bắc Bộ, có tốc độ tăng trưởng kinh tế cao so với bình quân chung của cả nước. Trong những năm gần đây, các ngành công nghiệp và dịch vụ chiếm một tỷ trọng lớn, khoảng trên 80% GDP của tỉnh. Các ngành công nghiệp khai thác và chế biến than, xi măng, đóng tàu, nhiệt điện, sản xuất vật liệu xây dựng đang có tốc độ phát triển nhanh. Quảng Ninh là một trong những điểm trung chuyển xăng dầu lớn nhất cả nước. Hoạt động vận tải đường bộ, đường thủy; các hoạt động du lịch, vận tải khách du lịch….diễn ra hết sức sôi động. Các hoạt động trên đã tạo ra một bộ mặt kinh tế rất đa dạng của Quảng Ninh. Tuy nhiên, các hoạt động đó cũng đã gây ra những hậu quả không nhỏ về môi trường, đặc biệt là các hoạt động vận chuyển và khai thác than, chế biến và sử dụng vật liệu nổ, các hoạt động vận tải, trung chuyển xăng dầu… ở Quảng Ninh. PAH là một nhóm các hợp chất hữu cơ có hai hay nhiều vòng thơm. Chúng có mặt khắp nơi trong môi trường (đất, không khí, các nguồn nước và các lớp trầm tích) và là một trong các thành phần có trong các sản phẩm của dầu mỏ [16]. Một số PAH có khả năng gây ung thư tiềm tàng, gây đột biến và là chất gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Tổ chức bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào nhóm những chất ô nhiễm điển hình và tiến hành kiểm soát sự có mặt của PAH trong các hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16], [50]. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Trong nước thải tại nhiều cơ sở sản xuất công nghiệp ở Quảng Ninh, ngoài một số hợp chất hữu cơ, vô cơ (NH4NO3) thì sự có mặt của dầu và một số các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) đang là vấn đề lớn đặt ra đòi hỏi các cấp chính quyền địa phương cần phải quan tâm xử lý triệt để. Hiện nay để khắc phục hậu quả này có nhiều phương pháp có thể áp dụng như sử dụng hóa chất, hấp phụ, lắng đọng… Tuy nhiên các phương pháp này đòi hỏi chi phí lớn và vẫn có thể gây ra ô nhiễm thứ cấp. Qua thử nghiệm thực tế, phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học đã và đang khẳng định tính ưu việt của nó. Đó là giá thành rẻ, có thể tiến hành thuận lợi trong điều kiện tự nhiên, độ an toàn rất cao và thân thiện với môi trường. Do vậy, trên thế giới và ở Việt Nam đã có nhiều nhà khoa học tập trung nghiên cứu về điều tra về phân bố, cấu trúc các tập đoàn vi sinh vật, khả năng phân hủy PAH của các chủng đơn cũng như các tập đoàn vi sinh vật. Các gen tham gia quá trình phân hủy sinh học PAH cũng được quan trắc trong quá trình xử lý, của các tập đoàn VSV bản địa và trong các nghiên cứu phân hủy PAH ở điều kiện phòng thí nghiệm. Catechol là một trong các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy sinh học các hợp chất vòng thơm, do vậy các gen mã hóa các enzym chuyển hóa catechol được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Chính vì những yêu cầu thực tiễn trên, chúng tôi đã lựa chọn nghiên cứu và thực hiện đề tài “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học hydrocarbon thơm của một vài chủng vi khuẩn được phân lập từ nước ô nhiễm dầu tại Quảng Ninh”. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Mục tiêu nghiên cứu: Phân lập và tuyển chọn ra được một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ hợp chất hydrocacbon thơm. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập và tuyển chọn một số loại vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH. 2. Nghiên cứu, đánh giá khả năng phân hủy sinh học PAH của một số chủng vi khuẩn đã được phân lập. 3. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái tế bào của một đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH. 4. Phân loại định tên đại diện vi khuẩn có khả năng phân hủy PAH dựa trên việc xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm cơ bản của hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân 1.1.1 Tính chất hóa lý Các PAH có mặt khắp nơi trong môi trường, những hợp chất này có 2- 6 vòng benzen kết hợp với nhau. Trọng lượng phân tử vào khoảng 128 – 278 g/mol (Hình 1.1). PAH là những chất kỵ nước. Khả năng gây ô nhiễm môi trường tùy thuộc khả năng hòa tan của chúng trong môi trường nước [16], [48]. Đặc điểm về khả năng hòa tan và áp suất hơi của PAH là nhân tố chính ảnh hưởng đến khả năng phân tán của chúng trong khí quyển, thủy quyển và sinh quyển. Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của một số hydrocarbon thơm đa nhân (PAH) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Số lượng vòng benzen trong cấu trúc hóa học của các PAH quyết định khả năng hòa tan của các PAH trong nước. PAH giảm khả năng hòa tan trong nước hay tăng tính kỵ nước khi số lượng vòng benzen tăng [54]. Khả năng hòa tan của các PAH rất biến động, từ những chất khó hòa tan nhất là benzo(b)perylen có chỉ số hòa tan là 0,003 mg/l cho đến chất dễ hòa tan nhất là naphthalen có chỉ số hòa tan tới 31 mg/l. Nếu khả năng hòa tan trong nước của PAH thấp, hay hệ số hấp phụ cao sẽ dẫn đến các PAH có xu hướng bị hấp phụ trong cặn bùn, đất đá và trầm tích, do đó ảnh hưởng rất nhiều tới khả năng chúng bị phân hủy sinh học bởi vi sinh vật [10]. Ngược lại, khả năng hòa tan trong nước của PAH cao thì khả năng bị phân hủy bởi vi sinh vật cũng cao. Điều đó cho thấy khả năng hòa tan trong nước của các PAH có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học PAH. Bảng 1.1: Tính chất vật lý của một số loại PAH [31] * Kp d = [octanol]/ [nước] Trong các tính chất vật lý của PAH, hệ số Kp d phản ánh khả năng hấp phụ lên bề mặt vật liệu rắn. Nếu hệ số Kp d cao, các PAH có xu hướng tăng Loại PAH Số vòng thơm Nhiệt độ nóng chảy (oC) Nhiệt độ sôi (oC) Độ tan trong nước (mg/l) LogKpd Áp suất hơi ở 20oC (torr) Phenanthrene 3 101 340 1,29 4,45 6,8x10-4 Anthracene 3 216 340 0,07 4,46 2,0x10-4 Fluoranthene 4 111 250 0,26 5,33 6,0x10-6 Benzo[a]anthracene 4 158 400 0,24 5,61 5,0x10-9 Pyrene 4 149 360 0,14 5,32 6,8x10-7 Chrysene 4 255 488 0,02 5,61 6,3x10-7 Benzo[a]pyrene (BaP) 5 179 496 0,0038 6,04 5,0x10-7 Dibenzo[a]anthracene 5 262 524 0,0005 5,97 1,0x10-10 Benzo[g,h,i]perylen 6 222 -- 0,0003 7,23 1,0x10-10 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 khả năng hấp phụ lên bề mặt các vật liệu rắn, đồng nghĩa với sự giảm khả năng phân hủy sinh học. Áp suất hơi và nhiệt độ sôi của các PAH cũng có vai trò quan trọng trong quá trình xử lý loại bỏ PAH khỏi các vùng bị ô nhiễm do nó ảnh hưởng đến khả năng hóa hơi của mỗi PAH. Khi áp suất hơi tăng, khả năng bay hơi của các PAH cũng tăng, mà sự bay hơi cũng là một con đường để loại bỏ PAH khỏi nguồn ô nhiễm. Khả năng bay hơi của các PAH cũng phụ thuộc vào kích thước và khối lượng phân tử. Naphthalene có kích thước nhỏ nhất nên có khả năng bay hơi đến 89%, trong khi đó benzo[a]pyrene (BaP) là hợp chất có kích thước lớn, chỉ có khả năng bay hơi 1%. Phenanthrene là đồng phân của anthracene có độ bay hơi thấp hơn do cấu trúc phân tử chứa các vòng thơm không thẳng hàng như trong cấu trúc của anthracene (Hình 1.1 và Bảng 1.1). PAH còn bị phân hủy dưới ánh sáng tử ngoại từ bức xạ mặt trời. Trong khí quyển, PAH có thể phản ứng với những chất ô nhiễm như nitrogen oxid, sulfur oxid tạo thành các dạng dione, nitro và dinitro PAH và sulfonic acid. 1.1.2 Tính độc của PAH và ảnh hưởng của nó tới môi trường sống Tính độc của PAH đã được người ta biết đến từ những năm 30 của thế kỷ XX, khi Hieger và Cook cùng những cộng sự khác nghiên cứu và thấy tinh thể benzo(a)pyrene màu vàng gây khối u ở động vật thí nghiệm [17]. Với con người, PAH có thể là tác nhân gây đột biến và dẫn đến ung thư [16], [31], [11], [27]. Ở quy mô phòng thí nghiệm, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng, quá trình gây ung thư bởi PAH là một quá trình phức tạp, đa giai đoạn và phụ thuộc vào nhiều yếu tố : kích thước phân tử PAH, độ phân cực trong phân tử, hóa học lập thể và các phản ứng xảy ra trong quá trình trao đổi chất, các nguyên tố mang điện tích mà có ảnh hưởng đến sự gắn kết của các sản phẩm trao đổi chất với các đại phân tử là DNA, RNA. Một số nghiên cứu Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 khác đã đưa ra kết luận: các PAH có khối lượng phân tử nhỏ, cấu tạo phân tử chỉ có một, hai, ba vòng thơm là rất độc, trong khi các PAH có khối lượng phân tử lớn lại có thể gây độc ở mức độ gen, hoặc gây ra đột biến, bởi chúng có khả năng gắn vào các phân tử DNA, RNA, hoặc protein, gây nên những biến đổi ở mức phân tử [16], [42]. Naphthalene là một chất ô nhiễm thuộc nhóm PAH gây ảnh hưởng tới một loạt các cơ quan như phổi, thận và kìm hãm quá trình hô hấp. Nhiễm độc naphthalene ở người dẫn tới bệnh thiếu máu và viêm thận. Ngoài ra, sự thay đổi về da và mắt ở những người bị phơi nhiễm naphthalen cũng đã được công nhận. Phenanthrene được biết như chất cảm quang với da người, chất gây dị ứng với động vật, đột biến tới hệ thống vi khuẩn trong các điều kiện đặc biệt. Chất này gây yếu các nhiễm sắc thể tương đồng và kìm hãm sự nối liền các kẽ hở gian bào. Ngoài ra, các PAH khác như acenaphthalene, fluoranthene, fluorene đều gây độc cho động và thực vật. Độc tính của benzo(a)pyrene, benzo(a)anthracene, benzo(b)fluoranthrene, benzo(k)fluoranthrene, dibenzen (a,h)anthracene và indenol(1,2,3-c,d)pyrene đã được nghiên cứu chứng minh gây ung thư cho người. Trong tự nhiên hiếm khi bắt gặp các PAH đơn lẻ mà chỉ gặp chúng ở dạng hỗn hợp nhiều PAH, do đó độc tính của chúng càng được tăng cường [53]. PAH thâm nhập gián tiếp vào cơ thể con người thông qua chuỗi thức ăn, đường hô hấp hoặc qua sự tiếp xúc trực tiếp với nguồn ô nhiễm, gây ung thư, đột biến gen. Rất nhiều PAH có chứa “vùng bay” và vùng tương tự nó “vùng K”. Cả hai vùng này đều cho phép trao đổi chất, tạo ra dạng liên kết “epoxit-vùng bay” và “epoxit- vùng K” có khả năng hoạt động cao và một số chúng là nguyên nhân gây ra ung thư [53]. Khi xâm nhập vào cơ thể, PAH nhanh chóng xâm nhập vào các mô mỡ và tiếp tục di chuyển đến những cơ quan khác. Tùy từng loại PAH với liều Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 lượng và thời gian tác động mà mức độ ảnh hưởng đến cơ thể khác nhau. Chẳng hạn, với naphthalene, nếu tiếp xúc trong thời gian ngắn, nồng độ thấp, nó có thể gây dị ứng, viêm tấy da, mắt. Khi xâm nhập vào hệ tiêu hóa, naphthalene sẽ gây bệnh thiếu máu do chúng phá vỡ các tế bào hồng cầu. Nếu tiếp xúc với naphthalene trong thời gian dài với nồng độ lớn hơn 10 ppm sẽ dẫn tới các bệnh kinh niên, gây ung thư da phổi và có thể làm giảm khả năng thụ thai ở phụ nữ và có thể làm nguy hiểm tới sự phát triển của thai nhi [31]. Trong số các PAH, người ta đặc biệt chú ý đến benzo[a]pyrene vì tính độc hại của nó. Benzo[a]pyrene (BaP) là một thành phần có trong khói thuốc lá, và là một trong những nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi [16], [31]. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh BaP có thể chuyển hóa thành các loại oxid với sự xúc tác của phức hệ cytochrome P450, mà những oxid này có thể phản ứng với các DNA gây đột biến. BaP cũng được xác định là nguyên nhân gây ung thư cho con người và động vật [16], [31], [55]. Một vài nghiên cứu trên đối tượng động, thực vật cho thấy, động vật nếu tiếp xúc với naphthalene ở nồng độ cao, thì chỉ trong thời gian ngắn cũng có thể gây mờ mắt, gây độc ở mức độ vừa phải. Hiệu ứng mạnh hơn, naphthalene có thể gây chậm phát triển, thậm chí gây chết với động thực vật. Nghiên cứu ngưỡng độc của naphthalene đối với loài cá vược, người ta đã xác định LC50 là 240 g/l (LC50 là liều gây chết 50% mẫu sinh vật thí nghiệm). Bằng việc thử nghiệm với một nhóm chuột cho sử dụng anthracene với lượng 1,8 µg/l, người ta thấy rằng, sau 2 tuần gây nhiễm, tỷ lệ chuột xuất hiện khối u là 40% [31]. Sự tồn tại của các hợp chất PAH trong môi trường vùng bờ biển có thể đe dọa tới sức khỏe con người và môi trường biển thông qua các tác động trực tiếp hoặc qua các chuỗi thức ăn trong chu trình vật chất [61]. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Do tính độc hại như vậy, cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ (USEPA) đã xếp PAH vào danh sách một trong những chất ô nhiễm điển hình và đã tiến hành kiểm định sự có mặt của PAH trong hệ sinh thái dưới nước cũng như trên cạn [16], [53]. 1.2. Nguồn gốc phát sinh PAH 1.2.1. Hiện trạng ô nhiễm PAH trên thế giới và ở Việt Nam Các hydrocarbon thơm đa nhân đã được tìm thấy ở nhiều môi trường sinh thái khác nhau, kể cả môi trường không khí. Trong môi trường nước, PAH phân bố rộng rãi. Người ta ước tính, hàng năm có khoảng 2,3x10 5 tấn các hợp chất này đã xâm nhập vào các hệ sinh thái dưới nước. Đặc biệt, với hệ sinh thái bị ô nhiễm PAH vùng ven bờ biển thường có nguồn gốc từ phế thải và công nghiệp hóa dầu, công nghiệp khai thác và vận chuyển dầu mỏ, nước thải công nghiệp và sinh hoạt, cháy rừng và cháy đồng cỏ [61]. Người ta đã định lượng được nồng độ BaP trong nước uống là 0,0002 đến 0,024 g/l. Trong 90 mẫu nước kiểm tra ở Mỹ cho thấy nồng độ của 6 PAH từ 0,001 đến 0,01 g/l, 1% mẫu nước kiểm tra cho thấy nồng độ trung bình lớn hơn 0,1 g/l [31]. Nhiều công trình nghiên cứu còn cho thấy, sự có mặt của PAH trong các mẫu trầm tích với nồng độ đáng kể. Một số nơi có mức độ ô nhiễm PAH rất cao: nồng độ các hợp chất PAH ở vịnh Boston (Mỹ) có thể lên tới 100.000 ng/g. Nguyên nhân chủ yếu là do trong môi trường biển hầu hết các hợp chất PAH hòa tan kém trong nước đã dẫn đến việc chúng được tích lũy trong các lớp trầm tích [31]. Trong không khí cũng chứa một lượng đáng kể PAH. Đã có hơn 500 PAH và các hợp chất liên quan được phát hiện trong không khí, đặc biệt là BaP chiếm tỷ lệ cao nhất. Vào những năm 1970, ở Mỹ, nồng độ BaP trong không khí trung bình là 1- 5 ng/m 3 . Trong 30 năm trở lại đây, nồng độ BaP có Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 xu hướng giảm, tuy nhiên con số này hiện nay vẫn còn cao, khoảng 4 ng/m 3 ở Copenhagen (Đan Mạch). Ở Trung Quốc, việc đốt than trong các hộ gia đình tạo ra một lượng BaP khoảng 14,7 g/m 3 , ở Ấn Độ là 4 g/m 3 [31] Người ta cũng tìm thấy hydrocarbon thơm đa nhân nhiều trong đất bề mặt. Nồng độ của PAH trong đất rừng rất dao động (từ 5 - 100 g/kg), mà nguồn chủ yếu là từ xác thực vật do quá trình cháy, hay hấp phụ PAH từ không khí. Với đất nông nghiệp, mức độ ô nhiễm PAH từ 10 đến 100 g/kg, chủ yếu do mưa làm ngưng tụ các hợp chất PAH từ khí quyển và đi vào đất. Nếu tính cho cả đất rừng và đất nông nghiệp, lượng ô nhiễm trung bình là 1000 g/kg. Đối với đất bị nhiễm dầu, nồng độ ô nhiễm lớn hơn nhiều so với vùng đất rừng và đất nông nghiệp, bởi PAH là một thành phần chính có trong dầu mỏ [55]. Trong đất ở thành thị, nồng độ PAH khoảng 600 – 3000 g/kg, và có thể cao hơn nữa ở những vùng có các hoạt động vận tải và sản xuất công nghiệp [55]. 1.2.2. Nguồn gốc phát sinh Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự phát sinh của PAH, nhưng chúng đều có bản chất chung là do các quá trình đốt cháy không hoàn toàn các vật liệu hữu cơ trong tự nhiên hay cho hoạt động sản xuất của con người. Trong tự nhiên, PAH được phát sinh là từ các quá trình địa chất tự nhiên, hóa lỏng khí than, các vụ cháy đồng cỏ, cháy rừng thậm chí trong các trận mưa [16], [28], [31], [38]. Con người cũng có thể gián tiếp hay trực tiếp làm phát sinh PAH vào môi trường từ việc đốt nhiên liệu (than đá, dầu diesen, ...) trong sinh hoạt hay trong sản xuất (đốt nhiên liệu cho các phương tiện máy móc có động cơ, quá trình đốt rác tại các nhà lò đốt). Các vụ tràn dầu do sự cố hay trong quá trình vận chuyển cũng làm phát sinh một lượng đáng kể PAH vào môi trường [31]. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Tại các nước công nghiệp phát triển, các hoạt động có liên quan đến đốt cháy tạo ra một lượng lớn PAH. Các PAH này được tích tụ lại trong đất và làm tăng nồng độ PAH nhanh chóng trong vòng 100 -150 năm trở lại đây [31]. PAH là nhóm hợp chất độc, nhưng chúng lại khá quan trọng trong công nghiệp, đặc biệt trong các ngành công nghiệp dược, nhuộm, sản xuất đồ nhựa và sản xuất thuốc trừ sâu [31]: naphthalene, anthracene, phenanthrene thường được sử dụng trong công nghiệp sản xuất thuốc nhuộm. Naphthalene cũng được dùng như thuốc xông diệt bướm trong các gia đình. Đặc biệt, phenanthrene cũng được ứng dụng trong công nghiệp dược dùng để sản xuất thuốc ngủ. Ở New York (Mỹ), hỗn hợp phenanthrene và anthracene được sử dụng để chống rỉ cho những thiết bị trữ nước [31]. Benzo[a]pyrene được sử dụng để hạn chế muội và khói, trong công nghệ quét hắc ín, hay còn sử dụng để liên kết các phần tích điện lại với nhau. Người ta cũng có thể tìm thấy trong hợp chất Creosote, một chất hóa học được sử dụng làm chất bảo quản gỗ (PAH chiếm đến 85% khối lượng của creosote) [20], [31]. BaP cũng được sử dụng là tác nhân gây đột biến lên động vật thí nghiệm, để kiểm tra đặc tính gây ung thư của nó trong thời gian ngắn [31]. 1.3. Các biện pháp xử lý tẩy độc PAH Tính chất độc hại và cấu trúc khó bị phân hủy trong tự nhiên của PAH đã trở thành một vấn đề cấp bách đang được chú ý. Người ta đã và đang nghiên cứu nhiều biện pháp hóa học, lý học, sinh học v.v…nhằm phân hủy PAH. Việc làm thay đổi cấu trúc hóa học của chất độc nhằm tạo ra các sản phẩm ít độc hoặc không độc cho môi trường và con người đang là một thách thức đối với các nhà khoa học và công nghệ. Để giảm độc tính của các chất này, người ta hay phá vỡ cấu trúc phân tử của chúng bằng cách sử dụng enzyme cắt vòng. Đến nay, trên thế giới, người ta đã đưa ra một số phương Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 pháp tiêu độc như: cô lập, chôn lấp, xử lý hóa học, đốt ở nhiệt độ cao, lý học, sinh học v.v. 1.3.1 Phương pháp hóa lý Trong cấu tạo hóa học của PAH, do có cấu trúc vòng thơm, PAH tương đối khó phân hủy trong tự nhiên. Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng đối với nhiều chất thải, rác thải, kể cả các chất thải nguy hại trong đó có chất độc hóa học [22]. Ưu điểm của phương pháp này là không tốn kém nhưng nhược điểm là các chất độc vẫn nằm trong đất chứ không được phân hủy, các chất độc hóa học này sẽ là nguồn tiềm tàng gây ô nhiễm cho môi trường. Công nghệ thiêu đốt cũng đã được sử dụng trên thế giới, phương pháp xử lý này tương đối triệt để song giá thành lại cao và có khả năng gây ô nhiễm thứ cấp bởi các sản phẩm phụ tạo trong quá trình vận hành. Các phương pháp hóa học như declo hóa, oxy hóa, phương pháp vật lý như quang hóa, sử dụng tia bức xạ, tia cực tím, hay áp suất cao cũng mang lại hiệu quả nhất định. Theo Draper và cộng sự (1987), xử lý bằng phương pháp quang hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ 20 W/cm 3 ở nhiệt độ 20 o C trong thời gian 3 ngày [25]. Tuy nhiên, những phương pháp trên có nhược điểm là không có tác dụng với lớp đất có độ sâu dưới vài milimet, do đó chỉ xử lý được lớp đất rất mỏng trên bề mặt [49]. Mặc dù làm sạch PAH có thể được tiến hành bằng nhiều biện pháp lý hóa đã nêu ở trên, nhưng các phương pháp này có nhược điểm là gây ô nhiễm thứ cấp nên không an toàn và không xử lý triệt để. Mặt khác, giá thành của việc sử dụng các phương pháp đó l ại cao nên xu hướng sử dụng chúng ngày càng giảm. 1.3.2. Phương pháp phân hủy sinh học Hiện nay, phương pháp sinh học đang bắt đầu được quan tâm bởi tính an toàn và hiệu quả không những về mặt công nghệ mà còn về kinh tế. Chìa Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 khóa của công nghệ phân hủy sinh học là thúc đẩy tập đoàn vi sinh vật bản địa tham gia vào quá trình phân hủy ở mức cao nhất. Các nghiên cứu cơ bản đều nhằm mục đích thúc đẩy hiệu quả quá trình tẩy độc thông qua việc kích thích tập đoàn vi sinh vật trong các điều kiện phân hủy khác nhau tạo ra kết quả cuối cùng là các sản phẩm ít độc hoặc hoàn toàn không độc. Chính vì vậy, công nghệ phân hủy sinh học đã trở thành công nghệ thân thiện với môi trường. Phương pháp phân hủy sinh học đã được các nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu và áp dụng trong những năm gần đây và cũng đã đạt được khá nhiều thành tựu. Công nghệ sinh học đảm bảo an toàn cho môi trường hơn tất cả các công nghệ khác. Đặc biệt, trong điều kiện sinh thái đa hệ, việc áp dụng công nghệ phân hủy sinh học PAH nói riêng và các nguồn chất độc nói chung sẽ mang lại hiệu quả kinh tế xã hội cao nhất [59], [61]. Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác, sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ . Phương pháp phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp (nhiệt độ cao, áp suất lớn, quá trình xúc tác…) không gây ra ô nhiễm thứ cấp, thân thiện với môi trường, chi phí thấp, do đó rất phù hợp với điều kiện ở nước ta. Tuy nhiên, phương pháp sinh học thường diễn ra với tốc độ chậm, thời gian xử lý kéo dài. Đây chính là một nhược điểm cơ bản của nó, đòi hỏi có lời giải đáp từ phía các nhà khoa học. Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp sinh học có thể được tiến hành theo hai hướng chính: tăng cường sinh học và kích thích sinh học. Tăng cường sinh học là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các môi trường bị ô nhiễm. Tuy nhiên, vẫn còn có những khó khăn trong việc bổ sung vi sinh vật vào các nơi bị ô nhiễm do chi phí lớn; hiệu quả phân hủy nhiều khi không cao do nhiều nguyên nhân (sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường; sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần thiết cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật) [26]. Kích thích sinh học là quá trình thúc đẩy sự phát triển, hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông qua việc điều chỉnh các yếu tố môi trường như độ pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v. Kích thích sinh học hiện là khuynh hướng được sử dụng rộng rãi trong xử lý ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học [26]. Trong hoạt động sống, vi sinh vật cần nguyên tố N, P, một số chất dinh dưỡng khác và các điều kiện sống thích hợp. Từ nguồn ô nhiễm, người ta có thể phân lập những chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng PAH, nghiên cứu các đặc tính sinh lý, sinh hóa của chúng để từ đó tìm ra điều kiện sống tối ưu của chúng từ đó ứng dụng cho việc kích thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa trong việc phân hủy sinh học PAH tại vùng ô nhiễm. Để tăng cường quá trình phân hủy sinh học, việc bổ sung các nguồn dinh dưỡng như nguồn cacbon, nitơ, photpho theo phải theo tỷ lệ nhất định đã đề cập ở phần trên là C:N:P = 100:10:1. Ngoài ra, các yếu tố môi trường cũng cần điều chỉnh thích hợp, đảm bảo cho tốc độ phân hủy ở mức ổn định và đạt hiệu quả cao nhất. Đôi khi người ta cũng kết hợp cả hai biện pháp để có thể tăng cường sự phân hủy sinh học. Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật nuôi cấy có khả năng phân hủy chất ô nhiễm, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ưu cho tập đoàn vi sinh vật bản địa hoạt động. Như vậy, hoạt động của tập đoàn vi sinh Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 vật bản địa cùng với hoạt động của vi sinh vật ngoại lai sẽ tăng cường hiệu quả của quá trình xử lý [26]. Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện với các quy mô khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác. Sau khoảng thời gian nhất định (vài tháng hoặc vài năm), các chất ô nhiễm có thể được loại bỏ hoàn toàn [23], [32]. Để bảo vệ sự đa dạng vi sinh vật và an toàn đối với môi trường, cần có sự giám sát chặt chẽ khi đưa các vi sinh vật từ nơi này sang nơi khác để xử lý ô nhiễm, nhất là với các vi sinh vật đã được chuyển gen. Để quá trình bổ sung vi sinh vật đạt hiệu quả, cần phải bổ sung ở thời điểm mới bị ô nhiễm và với lượng lớn vi sinh vật ở trạng thái sinh trưởng tốt trước khi các vi sinh vật bản địa kịp thích nghi, tấn công và làm thay đổi cấu trúc cơ chất. Tuy nhiên, việc lên men vi sinh vật với khối lượng lớn là điều không dễ dàng và vô cùng tốn kém, mặt khác cũng không đảm bảo vi sinh vật giữ nguyên được các đặc tính phân hủy ô nhiễm [26], [27]. 1.4. Phân hủy sinh học các PAH bởi vi sinh vật 1.4.1. Vi sinh vật phân hủy PAH Hiện nay, có nhiều nghiên cứu về khả năng của vi sinh vật sử dụng các PAH có trọng lượng phân tử thấp như naphthalene, phenanthrene và anthracene. Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu về tiềm năng phân hủy các PAH có trọng lượng phân tử cao như chrysene và benzo[a]pyrene [16]. Vi sinh vật phân hủy PAH phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Số lượng các vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH tại các vùng ô nhiễm nhiều hơn so với các vùng không ô nhiễm. Các loài vi sinh vật trong vùng ô nhiễm có xu hướng thích nghi, bằng cách thay đổi cấu trúc di truyền để hướng đến việc phân hủy PAH. Vi khuẩn có vai trò quan trọng trong tham gia phân hủy sinh Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 học PAH trong nước và trầm tích, trong khi đó, nấm sợi và xạ khuẩn đóng vai trò quan trọng phân hủy PAH và các chất ô nhiễm trong môi trường đất [27]. Thống kê ở bảng 1.2 cho thấy, vi sinh vật phân hủy PAH thuộc nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau [3], [6], [11], [27], [33], [42], [51], [60], [58], [61], [62]. Các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa PAH phần lớn thuộc vi khuẩn, vi khuẩn lam và một số vi tảo [16], [38], [58], [39], [60]. Bảng 1.2: Một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy PAH Vi khuẩn Vi khuẩn lam Vi nấm Acinetobacter sp. Aeromonas sp. Alcaligenes denitrificans Arthobacter sp. Bacillus cereus Beijerinckia sp. Cycloclasticus Corinebacterium renale Flavobacterium sp. Micrococcus sp. Mycobacterium sp. Staphylococcus auriculans Pseudomonas stuzeri Rhodococcus sp. Sphingomonas. sp Staphylococcus auriculans Agmenellum quadruplicatum Anabena sp. CA Amphora sp. Aphanocapsa sp. Chlorella autotrophica Chlamydomonas angulosa Coccochloris elabens Cylindrotheca sp. Dunaliella tertiolecta Microcoleus chthonoplastes Navicula sp. Nostoc sp. Phorphyridium Scapricomutum Synedar sp. Ulva fasciata Aspergillus sp. FVX5 Basidiobolus ranarum Bjerkandera adusta Candida maltosa Chrysosporium pannorum Claviceps paspali Gliocladium sp. Helicostylum catenoides Linderina pennispora Mucor hiemalis Penicillium chrysogenum Phycomyces blakesleeanus Ramaria sp. Rhizopus stononife Sordaria fimicola Trchoderma viride Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Trong một thông báo tổng quan gần đây về các phân hủy sinh học PAH của Johnsen (2005) cho thấy Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas và Mycobacteria là các vi khuẩn chiếm ưu thế [36]. 1.4.2. Cơ chế phân hủy PAH bởi VSV Phân hủy sinh học các PAH có thể diễn ra theo hai cơ chế trao đổi chất và đồng trao đổi chất. Quá trình chuyển hóa PAH bởi vi sinh vật có thể phân hủy thành các dạng không độc hoặc chuyển hóa hoàn toàn thành CO2. Cerniglia cho rằng quá trình phân hủy PAH có thể theo ba chiều hướng : phân hủy hoàn toàn, đồng phân hủy và oxi hóa không đặc hiệu [16]. Cerniglia (1993) đã tóm lược phân hủy PAH bởi vi sinh vật theo 3 nhóm chính (hình 1.2). Theo Cerniglia, catechol là chất trung gian của phân hủy sinh học PAH bởi vi khuẩn và tảo, tiếp theo catechol lại được cắt vòng ở vị trí ortho và meta [16]. PAH Vi nấm, tảo Nấm tr¾ng Cyt P-450/Methan Monooxygenase Vi khuẩn, tảo Dioxygena se Dehydrogena se C¾t vßng C¾ t C¾ t Lignin peroxidase, laccase Hình 1.2. Các con đường phân hủy PAH ở vi sinh vật Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Suntherland (1995) cũng đưa ra sơ đồ tương tự về các con đường phân hủy PAH bởi vi khuẩn và nấm (Hình 1.3)[51]. Cụ thể, các PAH được phân hủy bởi vi sinh vật như: - Chuyển hóa PAH đến cis-dihydrodiol, phenol và các sản phẩm cắt vòng bởi vi khuẩn và vi khuẩn lam - Chuyển hóa PAH đến phenol bởi vi khuẩn nhóm methylotrophic - Chuyển hóa PAH đến trans-dihydrodiol bởi vi nấm, vi khuẩn, và vi khuẩn lam - Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm mục trắng (white-rot fungi) Hình 1.3. Ba con đường phân hủy hiếu khí PAH chính của vi khuẩn và nấm Chuyển hóa PAH đến trans-dihydrodiol bởi vi nấm, vi khuẩn và vi khuẩn lam. Hiện nay người ta đã biết đến các enzyme cytochrome P450 monooxygenase được sinh ra bởi một loài vi nấm, vi khuẩn và vi khuẩn lam. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Các enzyme này tham gia chuyển hóa PAH đến dạng aren oxit, sau đó dạng hợp chất trung gian này được hydrat hóa bởi enzyme epoxyt hydrolase đến dạng trans-dihydrodiols hoặc được tái sắp xếp không có sự tham gia của enzyme tạo thành dạng phenol. Trong trường hợp các vi sinh vật chỉ có thể thực hiện theo cách chuyển hóa này, thì chúng sẽ không sử dụng PAH như nguồn cacbon mà chỉ có thể loại bỏ tính độc của PAH [16], [51]. Chuyển hóa PAH đến quinon bởi nấm trắng (white- rot fungi): Một số nấm trắng phân hủy lignin và cellulo (có trong gỗ) sẽ chuyển hóa PAH đến quinon và các chất khác mà không qua cis-dihydrodiol hoặc trans- dihydrodiol, trong một số trường hợp quá trình chuyển hóa này có sự tham gia của lignin peroxydase [16], [51]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, trong vi khuẩn, các gen mã hóa các enzym tham gia vào quá trình chuyển hóa PAH có thể nằm trên plasmid hoặc chromosome [29]. Trong hai thập kỷ vừa qua, một nhóm các gen bảo thủ cao dị hóa PAH (các gen giống nah) từ các loài Pseudomonas đã được điều tra đầy đủ bao gồm cả quan hệ chức năng-cấu trúc và tiến hóa của các gen này [29]. Tuy nhiên, gần đây các gen dị hóa PAH mà có sự khác nhau về tiến hóa đối với gen giống nah đã được nghiên cứu ở các vi khuẩn Gram âm khác và cả vi khuẩn Gram dương [29]. Theo Wikstrom (1996), bước đầu tiên của phân hủy sinh học hiếu khí PAH phụ thuộc có sự tham gia của hệ enzyme đa thành phần xúc tác sự hydroxyl hóa các hợp chất PAH và tạo ra dạng cis-dihydrodiol [56]. Một số tác giả khác cho rằng, các con đường phân hủy hydrocarbon thơm trong điều kiện hiếu khí đều xảy ra qua các bước cắt vòng thơm, loại vòng theo con đường ở phần trên cùng (upper pathway) và tạo thành catechol [56], [46], [44]. Tiếp theo, quá trình cắt vòng của catechol bởi enzyme dioxygenase có thể xảy ra tại các vị trí meta và ortho. Cắt vòng catechol ở vị trí ortho được Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 thực hiện bởi enzym catechol 1,2-dioxygenase để tạo ra cis, cis-muconic acid, chất này sau đó được phân hủy theo con đường β-ketoadipate [34]. Cắt vòng tại vị trí meta của catechol được thực hiện bởi enzyme catechol 2,3- dioxygenase (C23O) tạo ra 2-hydroxymucomic semialdehyde [34], đây được coi là quá trình phổ biến nhất ở các giai đoạn tiếp sau ở con đường phía dưới (lower pathway) của quá trình phân hủy các PAH [56], [45], [44]. Enzyme catechol 2,3-dioxygenase là thành viên của liên họ enzyme Extradiol dioxygenase. Các enzyme extradiol dioxygenase được xem như là các enzyme chìa khóa trong rất nhiều con đường phân hủy các hợp chất thơm bởi vi khuẩn cũng như các phản ứng được xúc tác bởi các enzyme này [46]. Do vị trí quan trọng và trung tâm của catechol nên gen mã hóa cho enzyme catechol 2,3- dioxygenase được quan tâm đặc biệt trong các nghiên cứu đánh giá cũng như phát hiện ra khả năng phân hủy PAH của các chủng vi sinh vật, tập đoàn vi sinh vật tại các điểm ô nhiễm hydrocarbon dầu mỏ [45]. Đã có rất nhiều nghiên cứu khai thác các giá trị tiềm tàng ứng dụng và lý thuyết của C23O trong bảo vệ môi trường và trong các lĩnh vực khác. Các enzyme extradiol dioxygenase có hoạt tính tốt sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến sự gia tăng các hoạt động đồng hóa PAH. Tính đến năm 2004 đã có trên 30 enzym C23O và nhiều trình tự nucleotide của các gen mã hóa C23O đã được xác định [34]. Hiện nay, các nhà nghiên cứu vẫn đang khai thác các khía cạnh ứng dụng và học thuyết của C23O và gen mã hóa C23O trong các chủng đơn, tập đoàn và trong quá trình phân hủy các chất vòng thơm ở tự nhiên và trong xử lý làm sạch bằng phân hủy sinh học. PAH là các chât gây ô nhiễm quan trọng trong nước ngầm. Các PAH có 2 và 3 vòng được quan tâm đặc biệt do khả năng hòa tan cao hơn trong nước và dễ di chuyển vào nước ngầm [43]. Hiện nay, có rất ít công bố về chuyển hóa PAH bởi vi khuẩn kỵ khí. Mặc dù naphthalene và acenaphthalene Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 đã được loại bỏ (rất ít) bởi hỗn hợp vi khuẩn khử nitrat, tuy nhiên cơ chế trao đổi chất của quá trình chưa được sáng tỏ. Gần đây, Coates và cộng sự đã công bố về khả năng oxy hóa PAH đến CO2 dưới điều kiện khử sulphat của các mẫu tràm tích vịnh San Diego [18]. Tuy nhiên quá trình này đòi hỏi nhiều thời gian và tốc độ rất chậm [16]. Phân hủy kỵ khí PAH đã được nghiên cứu với NO 3- , ion Fe hoặc SO4 2- như là các chất nhận điện tử và dưới các điều kiện sinh methan. Các con đường phân hủy sinh hóa đã được nghiên cứu với các tập đoàn vi khuẩn hoặc chủng sạch phân hủy napthalene và cho thấy, 2-naphthoic acid là chất trao đổi chất trung gian. Naphthalene được họat hóa bởi bổ sung đơn vị C1 để tạo ra 2-naphthoic acid, trong khi đó methylnaphthalene được hoạt hóa bởi bổ sung fumarate đối với nhóm methyl và được phân hủy tiếp thành 2-naphthoic acid. Phân hủy 2-naphthoic acid được thực hiện qua khử và cắt vòng để tạo ra 5,6,7,8-tetrahydro-2-naphthoic acid. Sản phẩm trung gian cắt vòng như là 2- carboxyclohexylacetic acid cho thấy sự phân hủy diễn ra qua các dẫn xuất cyclohexan chứ không qua các hợp chất thơm. Phân hủy kỵ khí PAH cũng đã được chứng minh trong môi trường nước nhiễm bằng xác định các hợp chất trao đổi chất đặc hiệu và nghiên cứu đồng vị phóng xạ. Các sản phẩm trao đổi chất đặc hiệu phân hủy kỵ khí PAH như naphthyl-2-methylsuccinate đã được phát hiện chứng tỏ sự phân hủy kỵ khí của 2-methylnaphthalene, trong khi đó 2-naphthoic acid là dấu hiệu của phân hủy kỵ khí naphthalene và 2- methylnaphthalene [43]. 1.5. Các yếu tố ảnh hƣởng tới quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân Sự phân hủy sinh học PAH phụ thuộc rất nhiều yếu tố. Ngoài các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ, dinh dưỡng, độ ẩm của đất, nồng độ oxy, nó còn Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 phụ thuộc vào tính chất vật lý, hóa học của các PAH, sự có mặt đồng thời hay riêng rẽ của các PAH trong môi trường. Ngoài ra nó còn phụ thuộc vào bản thân các vi sinh vật, phương thức mà các vi sinh vật chuyển cơ chất qua màng tế bào. Thường những phân tử tan có thể được vận chuyển qua màng tế bào và có khả năng phân hủy sinh học tốt hơn [16], [51], [31], [42], [61]. Các yếu tố môi trường tại nơi mà vi sinh vật được phân lập ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của chúng. Do vậy, trong quá trình xử lý làm sạch môi trường, vấn đề này đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu quả của việc xử lý. Quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân bởi các vi sinh vật thường xảy ra với tốc độ chậm, do vậy việc tạo điều kiện thích hợp cho tập đoàn vi sinh vật phát triển tốt nhất, có hiệu quả phân hủy sinh học cao có thể coi là chìa khóa của công nghệ phân hủy sinh học. Theo Yuan và cộng sự (2000), điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các hydrocarbon thơm đa nhân của đối tượng mà tác giả nghiên cứu là 30 o C, pH 7. Hai chủng vi khuẩn Alcaligenes eutrophus JMP134 và Pseudomonas cepacia AC1100 phát triển tốt nhất ở 29 o C [30]. Một số nghiên cứu khác cho thấy chủng Streptomyces danangensis XKDN19 có khả năng phát triển tốt nhất ở 32 o C, pH 6, nồng độ NaCl 0 - 3% [9]; chủng Streptomyces danangensis XKDN11 ở 30 o C, pH 7, nồng độ NaCl 0,5% [1]; chủng nấm sợi FDN20 ở 28 o C, pH 6, nồng độ NaCl 3% [3]. Các yếu tố khác như nguồn nitơ, photpho, cacbon và các khoáng khác cũng ảnh hưởng đến sự phát triển và phân hủy chất độc của các vi sinh vật. Nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự (2002) về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến sự phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân của một số chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas, Sphingomonas phân lập từ đất nhiễm dầu cho thấy các chủng này có khả năng phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 o C, pH 7 - 7,8 và nồng độ muối NaCl từ 0% đến 3% [4]. Một số Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 tác giả khác cũng phát hiện điều kiện tối ưu cho phân hủy sinh học PAH ở 30 o C và pH 7 [31], [51], [61]. Trên đây là những kết quả quan trọng trong việc kích thích tập đoàn vi sinh vật bản địa trong đó có vi khuẩn để tiến tới xử lý vùng đất nhiễm độc hóa học. Trong tự nhiên, thường không tồn tại một loại hydrocarbon thơm đa nhân mà thường tồn tại dưới dạng hỗn hợp. Do đó việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp các PAH là điều cần thiết để xem ảnh hưởng qua lại của chúng trong hỗn hợp cũng như nồng độ của chúng. Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học, nồng độ của PAH cao sẽ làm giảm quá trình phân hủy sinh học và gây độc cho vi sinh vật. Các PAH có trọng lượng phân tử thấp, cấu trúc đơn giản dễ dàng phân hủy hơn so với các PAH có trọng lượng phân tử cao và có cấu trúc phức tạp. Theo Yuan, điều kiện tối ưu cho sự phân hủy các hydrocarbon thơm đa nhân đối với đối tượng tác giả nghiên cứu là tại nhiệt độ 30 o C, pH 7 [52]. Tác giả Zaidi cùng các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự phân hủy phenanthrene và nhận thấy tại pH từ 6 đến 7 thì không ảnh hưởng mạnh đến khả năng phân hủy, nhưng tại pH 10 thì gây ức chế khả năng phân hủy phenanthrene của vi sinh vật [14],[61]. Bên cạnh các yếu tố quan trọng kể trên phải kể đến các yếu tố dinh dưỡng. Đó là nguồn nitơ, phốt pho, các nguồn cacbon có thể bổ sung như cao men, glucoza, axetat, pyruvat.v.v. Đây cũng sẽ là những nghiên cứu rất cần thiết phục vụ cho quá trình tạo các yếu tố công nghệ thích hợp trong xử lý tẩy độc [37]. Sự phân hủy sinh học các hydrocarbon thơm đa nhân riêng rẽ trong mẫu thí nghiệm đã không ngừng được nghiên cứu và ngày càng thu được nhiều kết luận có giá trị [16], [42], [58]. Các PAH có cấu trúc phân tử đơn giản, trọng lượng phân tử thấp dễ dàng phân hủy sinh học hơn so với các Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 PAH có trọng lượng phân tử cao và cấu trúc phức tạp [11], [16], [58], [59]. Tuy nhiên, chúng ta còn ít hiểu biết về khả năng phân hủy sinh học các PAH khi chúng có mặt đồng thời trong các vùng ô nhiễm. Thường trong tự nhiên không chỉ tồn tại một loại PAH mà tồn tại hỗn hợp các PAH. Do đó, việc nghiên cứu khả năng phân hủy hỗn hợp PAH là điều cần thiết để có thể đánh giá được ảnh hưởng qua lại và tương quan nồng độ của chúng đến sự phân hủy hỗn hợp. Sự tồn tại của các PAH khác nhau có thể thúc đẩy hoặc ức chế quá trình phân hủy sinh học [58]. Yuan cùng cộng sự (2000) tiến hành nghiên cứu khả năng phân hủy đồng thời các PAH trong bùn sông có nhiễm PAH. Kết quả cho thấy, tốc độ phân hủy Phenanthrene giảm khi có mặt thêm bất kì một PAH nào trong mẫu. Khi 6 PAH có mặt đồng thời, tốc độ phân hủy phenanthrene, acenaphthalene giảm nhưng tốc độ phân hủy Anthracene, Fluorene và Pyrene lại tăng [58]. Ngoài ra, tốc độ phân hủy PAH cũng còn bị ảnh hưởng mạnh bởi các chất hoạt động bề mặt không phân cực như Bij 30, Bij 35, triton X100, triton N110. Các chất này gây độc và ức chế hoạt động của vi sinh vật vì chúng có khả năng tương tác với màng tế bào hay chính xác hơn là các phân tử chất hoạt động bề mặt tương tác với protein màng tế bào [40]. Các chất này cũng có thể trực tiếp gây ức chế hoạt động của các enzyme liên quan tới con đường chuyển hóa PAH. Có thể chúng còn liên kết với cả các enzyme hay với các cơ chất . Một lí do làm giảm khả năng phân hủy sinh học các hợp chất này là chúng hạn chế sự tiếp xúc của tế bào vi sinh vật với các chất hữu cơ hòa tan trên bề mặt [61]. Tóm lại, việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự phân hủy sinh học các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân là rất quan trọng. Có thể coi đây là cơ sở công nghệ cho quá trình xử lý ô nhiễm PAH bằng phương pháp phân Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 hủy sinh học (bioremediation), đảm bảo các điều kiện thuận lợi làm cho tốc độ phân hủy các hydrocarbon đa nhân có thể đạt tới mức tối đa. 1.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật Vi sinh vật rất đa dạng trong tự nhiên. Tuy nhiên, chỉ một phần nhỏ trong số chúng là có thể nuôi cấy được ở trong điều kiện phòng thí nghiệm. Do đó, việc phân loại chúng gặp nhiều khó khăn. Hiện nay có nhiều phương pháp để phân loại vi sinh vật. Các phương pháp cổ điển chỉ dựa vào các đặc điểm sinh lý, sinh hóa và hình thái cấu tạo bên ngoài để phân loại vi sinh vật, còn phương pháp hiện đại lại chú trọng nhiều đến việc nghiên cứu các phân tử axit nucleic như DNA, RNA để áp dụng trong phân loại. Từ đó có thể thành lập cây phát sinh chủng loại, phản ánh mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các loài với nhau. 1.6.1. Phương pháp phân loại truyền thống Phương pháp phân loại cổ điển sử dụng hình thái kết hợp những đặc điểm hình dạng bên ngoài và các đặc điểm sinh lý để phân loại. Các phương pháp cổ điển thường dùng các chỉ tiêu để phân loại là: màu sắc, kích thước của khuẩn lạc phát triển trên môi trường; các đặc điểm giống nhau về hình dạng, kích thước, có hay không có tiên mao của tế bào vi khuẩn; sự khác nhau về đặc điểm sinh hóa: phản ứng nhuộm Gram, sự kháng chất kháng sinh, sự trao đổi chất và dinh dưỡng, đối tượng vật chủ, phân tích phân tử axit teichoic. Ngoài ra, còn rất nhiều phương pháp phổ biến khác nữa như: kiểm tra các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật với các chất phản ứng khác nhau, các phản ứng miễn dịch của các kháng nguyên là thành phần cấu tạo của tế bào như kháng nguyên O của lipopolysaccharid hay của bao nhầy thường được sử dụng để phân biệt các chủng của một loài [15]. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 1.6.2. Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá mức phân tử axit nucleic. Trên cơ sở trình tự DNA, người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại. Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương pháp nghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử”. Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao. Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả mức độ sử dụng trong phân loại vi sinh vật (Bảng 1.3) [35] Bảng 1.3: Một số phương pháp phân loại vi sinh vật Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại DNA nhiễm sắc thể Thành phần bazơ (%G+C) Chi Biến tính DNA :DNA Loài Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxom RNA riboxom Trình tự nucleotide Loài, chi và trên chi Lai DNA : rRNA Protein Trình tự axit amin Chi và trên chi So sánh bằng phản ứng huyết thanh Loài và chi Các kiểu điện di Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Thành tế bào Cấu trúc peptidoglycan Loài và chi Polysacharid Axit teichoic Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Màng Axít béo Loài và chi Lipid phân cực Axit mycolic Isoprenoid quinonones Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác. Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic (DNA, RNA). Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật. Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài. Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác. Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật. Trong 3 loại gen rRNA của vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại. Gen mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotide, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiết giữa các chủng. Ngược lại, gen mã hóa 23S rRNA lại có kích thước lớn (3000) nucleotide do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánh trình tự. Chỉ có gen 16S rRNA với kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu. Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa cho cấu trúc 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ lưỡng và họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạn Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 chúng bằng kỹ thuật PCR. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [35]. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất 2.1.1. Nguyên liệu Nguyên liệu để sử dụng trong đề tài nghiên cứu này là mẫu nước nhiễm dầu thu thập tại bể thu gom của xí nghiệp khai thác mỏ Quảng Ninh. 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu này có độ tinh khiết cao của các hãng trên thế giới như New England Biolabs, Sigma, Merk v.v. Cặp mồi 27F và 1492R được tổng hợp tại hãng Invitrogen TM , vector PCR ® 2.1 (Invitrogen). Mồi xuôi (27F ): 5’ - AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG - 3’ Mồi ngược (1492R) : 5’ - GGY TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’ Cặp mồi catechol 2,3-dioxygenase được tổng hợp tại hãng Alpha DNA (Canada). Mồi xuôi (C23OF) : 5’ - ATG GAT DTD ATG GGD TTC AAG GT - 3’ Môi ngược (C23OR) : 3’ - ACD GTC ADG AAD CGD TCG TTG AG - 5’ 2.2. Môi trƣờng nuôi cấy + Môi trường muối khoáng dịch (g/l) NH4NO3 4 NaCl 1,2 KH2PO4 0,3 Nước máy vừa đủ 1 lít MgSO4 0,4 pH 6,5 NaH2PO4 0,7 + Môi trường muối khoáng thạch (g/l): Thành phần các loại hóa chất giống như môi trường khoáng dịch nhưng được bổ sung thêm 20g agar. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 + Môi trường muối khoáng được bổ sung thêm hỗn hợp vitamin, hỗn hợp vi lượng và cao men. Môi trường trước khi được sử dụng được khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 25 phút. + Môi trường LB dịch (g/l) NaCl 10 Nước cất vừa đủ 1 lít Trytone 10 pH 7 Cao men 5,0 + Môi trường LB thạch (g/l): Thành phần các hóa chất tương tự môi trường LB dịch nhưng có bổ sung thêm 20g agar. + Nước muối sinh lý (0,85%) NaCl 8,5g Nước cất 1 lít 2.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã được sử dụng có độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen - Viện Công nghệ sinh học bao gồm: kính hiển vi, cân kỹ thuật, máy đo pH Hanna, tủ cấy vô trùng Laminar của Pháp, tủ sấy, nồi khử trùng, máy nuôi lắc ở các nhiệt độ khác nhau, tủ nuôi ổn nhiệt, máy ly tâm Eppendorf, máy PCR, máy soi DNA, máy điện di Bio-Rad, máy chụp ảnh Gel-Doc, tủ lạnh các loại 4 o C, -20 o C, - 80 o C, máy xác định trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, lò vi sóng, pipet man của hãng Eppendorf, bình nón, đầu côn, ống ly tâm v.v. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phân lập vi sinh vật trên mẫu nước nhiễm dầu Làm giàu vi sinh vật lần một bằng cách hút 5 ml mẫu nước nhiễm dầu chuyển vào trong bình tam giác chứa 45 ml môi trường khoáng dịch có bổ Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 sung vitamin, vi lượng, cao men và PAH với nồng độ 50 ppm. Nuôi lắc bình 200 vòng/phút, ở 30 o C trong 5 ngày. Làm giàu vi sinh vật lần 2 và lần 3 tương tự như mẫu làm giàu lần 1. Tiến hành pha loãng mẫu làm giàu lần 3, rồi gạt mẫu pha loãng trên môi trường muối khoáng có bổ sung vitamin, vi lượng, cao men và 100 ppm PAH. Mẫu được đem nuôi tĩnh ở 30 o C. Chọn chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trường có PAH rồi tiến hành nuôi lắc và làm sạch. 2.4.2. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn * Phƣơng pháp nhuộm Gram Lam kính được rửa sạch bằng các dung dịch rửa, sau đó làm khô trên ngọn lửa đèn cồn. Lấy một giọt dịch sau 16 giờ nuôi nhỏ lên lam kính rồi dùng que cấy vô trùng dàn đều giọt dịch và cố định tế bào trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm tiêu bản bằng dung dịch tím kết tinh (Cystal violet) trong thời gian 1 phút. Rửa bằng nước cất rồi nhuộm tiêu bản với lugon trong thời gian 2 phút. Tiếp tục rửa tiêu bản bằng cồn 70 % khoảng 20 giây, sau đó rửa bằng nước sạch rồi để khô. Nhuộm tiếp với safarin trong 1 phút, rửa lại bằng nước cất 2 lần và để khô tự nhiên. Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 100 lần dưới vật kính dầu. Nếu vi khuẩn bắt màu xanh tím thuộc loại Gram (+) còn bắt màu hồng là Gram (-). Vi khuẩn sử dụng làm đối chứng cho nhóm Gram (-) là E. coli và Gram (+) là Bacillus. * Quan sát hình thái tế bào bằng kính hiển vi điện tử quét Vi khuẩn được nuôi cấy 5-7 ngày trên môi trường muối khoáng chứa PAH. Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc vô trùng để loại bỏ cặn, rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Rửa lại sinh khối vi khuẩn bằng nước cất vô trùng 2 lần để loại các chất cặn bẩn trong môi trường nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được hòa tan trong glutaraldehyt 2,5 % trong đệm Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 photphat natri 100 mM (pH 7,2) trong 30 phút. Lấy một giọt tế bào đã xử lý đưa lên lưới đồng khoảng 1 phút để cho mẫu bám được vào lưới. Rửa nhẹ bằng nước sạch sau đó làm khô mẫu qua cồn 25, 50, 75, 100 % T-butyl. Sau đó làm khô mẫu bằng máy đông khô và phủ mẫu bằng vàng. Mẫu được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV. Hình thái tế bào vi khuẩn được chụp ảnh và đo kích thước. Cố định mẫu và soi kính được thực hiện tại Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Hồ Chí Minh. 2.4.3. Đánh giá khả năng sử dụng PAH của vi khuẩn PAH được xác định bằng phương pháp đo quang phân tử, dựa trên sự dịch chuyển điện tử trên các orbital п của các nối đôi liên kết trong vòng thơm của PAH. Khả năng chuyển hóa PAH của vi khuẩn trong dịch nuôi cấy được xác định trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến UV-VIS: GBC - CINTRA 4. 20 ml dịch nuôi cấy vi sinh vật sử dụng PAH được chiết bằng 180 ml acetone, sau đó lọc toàn bộ, thu dịch lọc đưa đi phân tích. Nồng độ của mỗi PAH trước và sau xử lý được tính toán dựa vào chiều cao peak hấp thụ tại các bước sóng, các PAH hấp thụ tại các bước sóng như: pyrene 275 nm; fluorene: 257,7 nm, fluoranthrene: 286,7 nm, phenanthrene: 292,6 nm, anthracene: 252 nm, naphthalene: 296 nm. 2.4.4. Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3-dioxygenase 2.4.4.1. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn theo phương pháp của Sambrook, Russell [47]. Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách lấy dịch nuôi cấy chuyển vào ống li tâm rồi li tâm với vận tốc 6.000 vòng/phút ở 4 o C trong 10 phút. Bƣớc 2: Hòa tan mẫu trong 400 µl đệm lys is rồi lắc kỹ cho tan tủa. Bƣớc 3: Bổ sung 50 µl lysozym và ủ ở 37 o C trong 30 phút. Bƣớc 4: Bổ sung 20 µl protease K rồi ủ ở 56 o C trong 2 giờ. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Bƣớc 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), lắc đều và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới, bổ sung CI (24:1) với tỷ lệ 1:1 v/v, lắc nhẹ sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C. Bƣớc 7: Hút pha trên chuyển sang eppendorf mới và tủa DNA bằng cồn tuyệt đối, giữ ở -20 o C trong khoảng 2-3 giờ. Bƣớc 8: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 o C, thu tủa DNA. Bƣớc 9: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C Bƣớc 10: Làm khô tủa và hòa tan tủa trong nước khử ion vô trùng 2.4.4.2. Nhân đoạn gen bằng phương pháp PCR Phương pháp PCR do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Phương pháp này tạo ra bước nhảy vọt trong kỹ thuật sinh học phân tử và được sử dụng phổ biến đến nay. Phương pháp này cho phép nhân lên số lượng lớn đoạn gen cần thiết trong thời gian ngắn. Để thực hiện được phản ứng PCR cần có các nguyên liệu chính là đoạn DNA khuôn, cặp mồi đặc hiệu, enzyme DNA polymerase, các nucleotide tự do, máy PCR v.v. * Thành phần phản ứng: Buffer Taq 10X 2,5 µl MgCl2 25 mM 3,0 µl dNTPs 2,5 mM 2.5 µl Mồi xuôi 20 µM 1 µl Mồi ngược 20 µM 1 µl Taq DNA polymerase (5 U/µl) 0,2 µl H2O 13,3 µl DNA khuôn 1,5 µl Tổng thể tích 25 µl Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Đối với nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA sử dụng cặp mồi 27F và 1492R thì chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: Bƣớc 1 95 o C trong 5 phút Bƣớc 2 94 o C trong 1 phút Bƣớc 3 55 o C trong 1 phút Bƣớc 4 72 o C trong 2 phút Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4 Bƣớc 6 72 o C trong 7 phút Bƣớc 7 4 o C bảo quản mẫu Trong trường hợp nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase sử dụng cặp mồi C23OF và C23OR với chu trình nhiệt dưới đây: Bƣớc 1 94 o C trong 7 phút Bƣớc 2 94 o C trong 1 phút Bƣớc 3 55 o C trong 1 phút Bƣớc 4 72 o C trong 1 phút Bƣớc 5 Lặp lại 35 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4 Bƣớc 6 72 o C trong 10 phút Bƣớc 7 4 o C bảo quản mẫu 2.4.4.3. Quy trình biến nạp và chọn dòng Biến nạp: bộ Kit TA Cloning (R) của hãng Invitrogen TM (Mỹ) đã được sử dụng cho quá trình biến nạp. Nguyên tắc: Đoạn DNA cần thiết nhân lên trong phản ứng PCR được sử dụng để gắn vào vector PCR 2.1 tạo thành vector mang đoạn gen 16S rRNA. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 * Thành phần phản ứng: Dung dịch đệm 1,0 µl Vector pCR2.1 1,5 µl Sản phẩm PCR (đoạn DNA cần thiết) 1,2 µl Enzyme T4 ligase 1,0 µl Nước 5,3 µl Tổng thể tích 10 µl Phản ứng gắn đoạn DNA cần thiết vào vector được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ 14 o C, thời gian 18 giờ. Sau đó sản phẩm này được biến nạp vào tế bào khả biến (vi khuẩn E. coli INV F’). * Quy trình biến nạp: Bƣớc 1: Lấy 4 µl vector tái tổ hợp ở trên cho vào ống đựng tế bào khả biến E. coli INV F’ rồi ủ trên đá 30 phút. Bƣớc 2: Sốc nhiệt 42 o C trong thời gian 45 giây. Bƣớc 3: Đặt ống tế bào lên đá trong 2 phút. Bƣớc 4: Thêm 250 µl SOC vào ống đựng tế bào rồi đem nuôi ở tủ lắc 37 o C trong khoảng 1 giờ. Bƣớc 5: Hút dịch nuôi gạt trên đĩa môi trường LB có bổ sung 50 mg/l ampicilin, và 50 mg/ml X-Gal. Sau đó nuôi ở 37 o C trong khoảng 16-18 giờ. Chọn các dòng khuẩn lạc màu trắng và một dòng khuẩn lạc màu xanh nuôi trên môi trường LB dịch. Trên môi trường LB có X-gal những khuẩn lạc màu trắng là những cá thể có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại lai, những khuẩn lạc màu xanh là những cá thể không đính đoạn DNA plasmid và DNA ngoại lai. * Quy trình tách chiết DNA plasmid: Bƣớc 1: Thu sinh khối tế bào bằng cách ly tâm dịch nuôi 6.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C, đổ dịch và thu tủa. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Bƣớc 2: Bổ sung 100 µl Sol I rồi vontex kỹ cho tan hết tủa. Bƣớc 3: Thêm 200 µl Sol II và đảo nhẹ, ủ đá khoảng 5 phút. Bƣớc 4: Bổ sung 150 µl Sol III, đảo đều rồi ủ đá 10 phút. Bƣớc 5: Bổ sung C:I theo tỷ lệ 1:1 v/v, lắc đều rồi ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Bƣớc 6: Hút pha trên chuyển sang ống mới và thêm 500 µl isopropanol 100 % tủa DNA, để khoảng 2-3 giờ. Bƣớc 7: Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút.để thu tủa. Bƣớc 8: Rửa tủa bằng cồn 70 %, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Bƣớc 10: Làm khô tủa bằng cách ly tâm khô, sau đó tủa được hòa tan trong nước khử ion. * Phản ứng cắt vector tái tổ hợp bằng enzyme EcoRI: *Thành phần phản ứng: Đệm EcoRI 10X 2,0 µl Enzyme cắt EcoRI (5 U/µl) 0,2 µl RNase (1 mg/ml) 0,5 µl H2O 15,3 µl DNA plasmid 2,0 µl Tổng thể tích 20 µl Trộn đều các thành phần phản ứng với nhau rồi đặt ống phản ứng vào bể ổn nhiệt ở 37 o C trong 16 giờ. 2.4.4.4. Phương pháp xác định trình tự gen bằng máy tự động Xác định trình tự hai đoạn gen mã hóa 16S rRNA và catechol 2,3- dioxygenase của vi khuẩn BQN31 trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3.100 Avant Genetic Analyzer tự động theo phương pháp của Sanger. Trình Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 tự hai đoạn gen 16S rRNA và đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 được đăng ký trên GenBank. 2.4.4.5. Phương pháp xây dựng cây phát sinh chủng loại Sử dụng chương trình Blast so sánh mức độ tương đồng giữa trình tự các đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 với các trình tự gen liên quan trên ngân hàng gen. Tiếp theo, sử dụng phần mềm Clustal X, NJ để xây dựng cây phát sinh chủng loại đoạn gen mã hóa 16S rRNA, gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của vi khuẩn BQN31 và các đoạn gen đại diện. Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH Từ mẫu ban đầu, vi sinh vật sử dụng PAH được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường muối khoáng chứa các nguồn PAH như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. VSV sử dụng PAH trong mẫu nước nhiễm dầu không đa dạng, trên mỗi loại PAH chỉ có từ 1 đến 4 loại khuẩn lạc, trong đó loại vi khuẩn có mầu trắng, trơn, lồi bóng và nhỏ chiếm ưu thế (Bảng 3.1). Khả năng phát triển của vi khuẩn được đánh giá sơ bộ bằng sự thay đổi mầu môi trường. Bảng 3.1: Số lượng vi khuẩn phân lập được trên môi trường khoáng có bổ sung các hợp chất PAH Môi trường chứa PAH và hỗn hợp PAH Số lượng vi khuẩn phân lập Phenanthrene 5 Anthracene 4 Fluorene + Fluoranthene 1 Pyrene + Chrysene 3 Naphthalene 2 Các số liệu trong bảng 3.1 cho thấy, từ mẫu làm giàu vi sinh vật trên hai nguồn phenanthrene và anthracene có số lượng vi khuẩn phân lập được nhiều nhất. Tổng số 15 chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt trên môi trường chứa các nguồn PAH khác nhau đã được phân lập và được ký hiệu từ BQN20-BQN34. Trong số 15 chủng vi khuẩn này, 4 chủng vi khuẩn BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 có khả năng phát triển mạnh hơn cả trên nguồn phenanthrene (Hình 3.1). Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Môi trường trong các bình nuôi cấy vi khuẩn và các PAH có mầu vàng nâu. Trong số 15 chủng vi khuẩn, chủng BQN31 phân hủy phenanthrene mạnh nhất, môi trường đổi màu chỉ sau 32 giờ nuôi cấy. Các chủng vi khuẩn còn lại chuyển hóa ở mức độ yếu hơn, sinh khối vi sinh vật ít hơn, môi trường không đổi mầu hoặc đổi màu sau nhiều ngày. Hình thái khuẩn lạc của 4 chủng vi khuẩn sử dụng phenanthrene mạnh được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.2. BQN30 BQN31 BQN32 BQN33 K K K K Hình 3.1: Khả năng phân hủy phenanthrene của 4 chủng BQN30, BQN31, BQN32, BQN33 (Ghi chú: K: mẫu đối chứng) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường muối khoáng chứa phenanthrene BQN30 Tròn, trơn, trắng trong BQN31 Tròn, trơn, bóng, lồi, trắng đục, ánh xanh BQN32 Tròn, trơn, ánh vàng BQN33 Tròn, trơn, bóng, ánh xanh Trong số các chủng vi khuẩn kể trên, chủng vi khuẩn BQN31 có khuẩn lạc to, mọc dầy, dịch nuôi cấy chuyển màu nhanh hơn những chủng khác. Do đó, chủng BQN31 đã được chọn để nghiên cứu và xác định khả năng phân hủy PAH. Sự tồn tại của các vi khuẩn bản địa sử dụng các loại PAH khác nhau cho thấy tiềm năng lớn trong việc áp dụng thành công công nghệ phân hủy sinh học xử lý ô nhiễm dầu và PAH. 3.2. Đặc điểm hình thái và tế bào của chủng vi khuẩn BQN31 Chủng vi khuẩn BQN31 được nuôi cấy trên môi trường muối khoáng bổ sung phenanthrene, nuôi ở nhiệt độ 30 o C. Khuẩn lạc chủng BQN31 sau 3-5 ngày nuôi cấy có hình tròn, trắng, trơn, lồi, bóng, có ánh xanh, kích thước khoảng 1-2 mm (Hình 3.2). Chủng BQN31 thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm, tế bào hình que, bề mặt tương đối nhẵn và kích thước khoảng 0,29 - 0,5 m x 0,95 - 1,1 m (Hình 3.3). Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc chủng vi khuẩn BQN31 Hình 3.3: Hình thái tế bào vi khuẩn BQN31 (Quan sát trên kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV với độ phóng đại 15.000 lần) 3.3. Khả năng sử dụng các loại PAH của chủng vi khuẩn BQN31 Trong môi trường tự nhiên, các PAH thường tồn tại ở dạng hỗn hợp và rất độc. Do đó, việc đánh giá khả năng phân hủy PAH bởi các chủng vi sinh vật bản địa có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình làm sạch ô nhiễm dầu nói chung và PAH nói riêng. Sau 5 ngày nuôi lắc trên môi trường khoáng bổ sung các PAH khác nhau, mầu của môi trường chứa các vi sinh vật thay đổi rõ rệt, môi trường chuyển màu nâu vàng. Đặc biệt, trong các bình nuôi cấy chứa phenanthrene và naphthalene môi trường đục hơn và có nhiều sinh khối hơn (Bảng 3.3). 1 µm Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Bảng 3.3: Phổ UV đo khả năng phân hủy các PAH của chủng BQN31 Nguồn PAH Phổ UV Hình ảnh minh họa Phenanthrene Naphthalene Hiệu quả sử dụng một số loại PAH của chủng BQN31 được trình bày trong bảng 3.4. ĐC BQN31 ĐC BQN31 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Bảng 3.4: Khả năng sử dụng các PAH khác nhau của chủng BQN31 Các PAH Hiệu suất phân hủy (%) Màu môi trường nuôi cấy Ghi chú Phenanthrene 60,24 vàng nâu Fluorene 18,52 vàng nhạt Fluoranthene vàng chanh không phân tích Pyrene 18,75 nâu nhạt, ánh vàng Naphthalen 69,38 màu vàng Anthracene 25,9 màu nâu Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy, chủng BQN31 sử dụng tất cả các PAH thử nghiệm. Đối với mỗi loại PAH, màu môi trường nuôi cấy có sự thay đổi khác nhau. Dựa trên kết quả phân tích, sau 5 ngày nuôi lắc ở nhiệt độ 30 o C và 200 vòng/phút, chủng BQN31 có khả năng sử dụng 69,38% naphthalene, 60,24% phenanthrene, 18,52% fluorene, 25,9% anthracene và 18,75% pyrene với nồng độ ban đầu là 100 ppm mỗi loại PAH. Khả năng phân hủy của chủng BQN31 với naphthalen là cao nhất và fluorene là thấp nhất. Kết quả này chứng tỏ với các PAH ít vòng thì khả năng bị phân hủy sinh học càng mạnh. Trên thế giới, đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy các loại PAH của các chủng vi sinh vật. Weissenfels và cộng sự (1991) đã công bố chủng Alcaligenes denitrficans WW1 phân hủy fluoranthene với tốc độ 300 mg/l mỗi ngày, đồng thời chủng này sử dụng các loại PAH khác như pyrene, benzo(a)anthracene theo cơ chế đồng trao đổi chất [53]. Chủng Mycobacterium sp. PYR-1 phân hủy 74% hỗn hợp PAH gồm phenanthrene, anthracene, fluoranthene, pyrene, chrysene và benzo(a)pyrene sau 7 ngày nuôi cấy. Trong đó 95% fluoranthren bị loại bỏ sau 24h nuôi cấy, tuy nhiên nồng độ ban đầu chỉ có 17 mg/l [21]. Hai chủng Cycloclasticus N3 và W của Gelsenbrecht và cộng sự không sử dụng được PAH cao phân tử như fluoranthene, pyrene và chrysene như là nguồn carbon và năng lượng duy Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 nhất, tuy nhiên theo cơ chế đồng trao đổi chất chủng Cycloclasticus N3 có thể phân huỷ khoảng 50% các PAH cao phân tử trên với nồng độ ban đầu 1ppm khi bổ sung 10ppm phenanthrene sau 7 ngày [12]. Hiện nay, có nhiều công bố kết quả nghiên cứu về khả năng phân hủy fluoranthene và pyrene như là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất của các chủng xạ khuẩn thuộc các chi Gordonia, Mycrobacterium [36] . Theo nghiên cứu của Lors và cộng sự về xử lý sinh học mẫu đất nhiễm PAH từ một khu vực công nghiệp ở miền Bắc nước Pháp tại phòng thí nghiệm với 3 loại hỗn hợp cơ chất PAH gồm các PAH có 3 hoặc 4 vòng thơm cùng với 16 loại PAH (theo quy định của UEPA - Hoa Kỳ) cho kết quả loại bỏ lần lượt là 96%, 80% và 80%, sau 245 ngày [19]. Chủng Rhodococcus sp. được phân lập từ mẫu trầm tích có khả năng phân hủy 53% anthracene sau 24h ở nồng độ 3µg/ml [21]. Xue-Jing Zheng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng chuyển hoá sinh học của tập đoàn vi sinh vật hiếu khí có trong bùn cống, bổ sung chất hoạt động bề mặt tween 80 cho hiệu quả loại bỏ PAH trên 95% đối với PAH chứa 3 vòng thơm và tăng tốc độ loại bỏ PAH chứa 4 vòng thơm sau 21 ngày [57]. Cũng bổ sung tween 80 (0,5%), Dhenain và cộng sự đã cho thấy khả năng loại bỏ từ 35 – 50% benzo(a)anthracene, benzo(a)pyrene, benzo(b)fluoranthene, benzo(j)fluoranthene, benzo(k)fluoranthene, fluoranthene trong bùn đen của công nghiệp nhôm [13]. Ở Việt Nam, chủng vi khuẩn Sphingomonas yanoikuyae MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ có khả năng phân hủy 64,5% phenanthrene và 61,4% anthracene sau 7 ngày nuôi cấy với nồng độ ban đầu là 12mg/l [8]. Hoàng Thị Mỹ Hạnh và cộng sự (2003) đã phân lập và nghiên cứu khả năng sử dụng PAH của chủng nấm Aspergillus sp. FVX5 phân lập từ thí nghiệm xử lý làm sạch cặn dầu thô của tàu Chí Linh. Chủng nấm này có khả năng phân Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 hủy 266,69 mg/l phenanthrene, 33,34 mg/l anthracene, 19,16 mg/l fluoranthene sau 7 ngày nuôi cấy ở điều kiện 37 o C [2]. Sau 7 ngày nuôi lắc trên môi trường khoáng có bổ sung glucose, hai chủng xạ khuẩn XKDN12 và XKDN13 phân lập từ đất nhiễm chất độc hoá học có khả năng sử dụng PAH, 32,72% và 45,05% với phenanthrene, 39,01% và 52,22% với anthracene, 23,32% và 41,41% với fluoranthen [7]. Chủng vi khuẩn Chromobacterium sp. BPQ1 phân lập từ nước thải nhiễm dầu ở công ty xăng dầu B12, Quảng Ninh có thể sử dụng phenanthrene và fluorene [5]. Trong một nghiên cứu khác, chủng vi khuẩn KCP8 phân lập tại Khe Chè có khả năng phân hủy hỗn hợp PAH (phenanthrene, anthracene và fluoranthene). Sau 7 ngày nuôi lắc chủng KCP8 phân hủy 76,12% hỗn hợp PAH, trong đó khả năng phân hủy phenanthrene trong hỗn hợp là 79,96%, anthracene là 71,09% và fluoranthene là 41,01% [4]. So sánh với các kết quả đã công bố trên thế giới và Việt Nam, cho thấy rằng, chủng vi khuẩn BQN31 có khả năng phân hủy trung bình các PAH đã công bố. Tuy nhiên, khả năng sử dụng nhiều loại PAH khác nhau chứng tỏ vai trò nhất định của chủng vi khuẩn này trong nước thải nhiễm dầu ở khu vực Quảng Ninh. Chủng này có thể được sử dụng để xây dựng tập đoàn giống vi sinh vật sử dụng trong quá trình làm sạch ô nhiễm PAH ở các điều kiện có kiểm soát. 3.4. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 3.4.1. Tách chiết DNA tổng số và nhân đoạn gen mã hóa 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR Tách chiết và làm sạch DNA tổng số vi khuẩn là khâu quan trọng vì chất lượng của DNA sẽ ảnh hưởng đến hiệu quả của các thí nghiệm tiếp theo. DNA tổng số của vi khuẩn BQN31 có độ tinh sạch cao, hàm lượng đủ lớn, băng gọn không đứt gãy (Hình 3.4). Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Sử dụng DNA tổng số của vi khuẩn BQN31 làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (27F và 1492R) và chu trình nhiệt như đã trình bày ở phần 2.4, sản phẩm PCR thu được là một băng DNA duy nhất, sắc nét và có kích thước khoảng 1.500 bp đúng như lý thuyết (Hình 3.5). 3.4.2. Tách dòng gen mã hóa 16S rRNA từ chủng BQN31 Hiện nay, để xác định trình tự gen có thể sử dụng hai phương pháp như xác định trình tự nucleotide trực tiếp từ sản phẩm PCR hoặc gắn sản phẩm PCR vào một vector sau đó biến nạp vào tế bào khả biến như E. coli, nuôi cấy tế bào E. coli tái tổ hợp, tách và làm sạch DNA plasmid và xác định trình tự đoạn DNA đã được chèn vào vector sử dụng các mồi của vector. Hình 3.4: DNA tổng số của chủng BQN31 DNA tổng số Hình 3.5. Sản phẩm PCR nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31. M: thang DNA chuẩn 1 kb 1,5 kb M BQN31 1 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Ưu điểm của phương pháp xác định trình tự trực tiếp là tiết kiệm thời gian. Phương pháp xác định trình tự DNA thông qua bước biến nạp cho kết quả rõ ràng hơn. Ngoài ra, tách dòng gen giúp các nhà nghiên cứu chủ động hơn về gen hoặc đoạn gen đã nhân để sử dụng cho các mục đích nghiên cứu khác. Trong nghiên cứu này, sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA từ chủng BQN31 được xác định trình tự theo phương pháp gắn sản phẩm PCR vào một vector sau đó biến nạp vào tế bào khả biến E. coli. *Gắn sản phẩm PCR vào vector pCR 2.1 và biến nạp vào E. coli DH5α Sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA đã được gắn vào vector pCR 2.1 nhờ enzyme T4 DNA ligase và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Sau khi nuôi ở 37 o C trong 18 giờ trên môi trường LB đặc chứa ampicillin và X-Gal đã xuất hiện những khuẩn lạc trắng xen kẽ những khuẩn lạc xanh (Hình 3.6). Số lượng khuẩn lạc màu trắng nhiều hơn so với khuẩn lạc màu xanh, chứng tỏ hiệu suất biến nạp là tốt. Các khuẩn lạc trắng E. coli DH5α có thể mang plasmid đã được chèn sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA. Các khuẩn lạc trắng E. coli DH5α được chọn lựa, tách DNA plasmid. Sản phẩm DNA plasmid thu được từ các dòng tế bào chọn lựa được điện di kiểm tra trên gel agaros 1%. Hình 3.6: Kết quả biến nạp chủng BQN31 (Khuẩn lạc trắng: là những khuẩn lạc có thể mang DNA plasmid đã gắn đoạn DNA ngoại lai. Khuẩn lạc xanh: là những khuẩn lạc không đính đoạn DNA plasmid và DNA ngoại lai) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Các khuẩn lạc màu trắng có thể mang vector chứa đoạn DNA cần thiết được lựa chọn để tách DNA plasmid cùng với một vài khuẩn lạc xanh được sử dụng làm mẫu đối chứng. 3.4.3. Tách DNA plasmid và kiểm tra các dòng khuẩn lạc thích hợp Các khuẩn lạc lựa chọn được nuôi trên môi trường LB dịch để tách DNA plasmid. Sản phẩm DNA plasmid được điện di kiểm tra trên gel agarose để lựa chọn dòng tế bào mang vector tái tổ hợp (Hình 3.7 ). Hình 3.7. Sản phẩm điện di kiểm tra DNA plasmid của các dòng được lựa chọn C: DNA plasmid dòng khuẩn lạc màu xanh (đối chứng) 1: DNA plasmid của dòng khuẩn lạc số 13 màu trắng Kết quả ở hình 3.7 cho thấy, DNA plasmid của dòng số 13 nằm ở vị trí cao hơn mẫu đối chứng. Dòng vi khuẩn số 13 này có thể mang vector tái tổ hợp chứa đoạn gen 16S rRNA nhân lên từ DNA tổng số của vi khuẩn BQN31. Enzyme giới hạn EcoRI đã được sử dụng để kiểm tra liệu thực sự DNA plasmid của dòng số 13 có mang sản phẩm PCR hay không. Sản phẩm cắt của dòng 13 cho băng có kích thước phù hợp khoảng 1.500 bp (Hình 3.8). C 1 M 1 1,5 Kb 1 Kb Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Như vậy, sản phẩm PCR nhân đoạn gen 16S rRNA đã được chèn vào vector và được biến nạp vào E. coli DH5α. DNA plasmid dòng số 13 được làm sạch để phục vụ cho việc xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn BQN31 (Hình 3.9). Kết quả hình 3.9 cho thấy DNA plasmid dòng số 13 sau khi loại RNA có độ sạch cao, đủ điều kiện sử dụng để xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31. 3.4.4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn BQN31 C 1 Hình 3.9. Sản phẩm làm sạch DNA plasmid dòng số 13 của chủng vi khuẩn BQN31 Giếng C: Mẫu đối chứng (DNA plasmid dòng màu xanh) Giếng 1: DNA plasmid dòng số 13 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA chủng BQN31 được xác định hai chiều với sử dụng cặp mồi M13R và M13F. Sau khi phân tích và xử lý số liệu, trình tự đầy đủ của đoạn gen mã hóa 16S rRNA của vi khuẩn BQN31 được xác định (Hình 3.10) Trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 đã được xác định và đăng ký trên GenBank với mã số EU814953. Kết quả so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 với trình tự của các VSV prokaryote đã được công bố trên GenBank cho thấy, chủng BQN31 quan hệ gần gũi với các chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas (Hình 3.11). Chủng BQN31 có độ tương đồng cao với các chủng Sphingomonas sp. JQL4-5 (98%), Sphingomonas sp. A4 (98%), Sphingomonas sp. AMS7 (98%), Sphingomonas sp. VX-MXL9 (97%), 1 AGAGTTTGAT CATGGCTCAG AACGAACGCT GGCGGCATGC CTAATACATG CAAGTCGAAC 61 GAGATCTTCG GATCTAGTGG CGCACGGGTG CGTAACGCGT GGGAATCTGC CCTTGGGTTC 121 GGAATAACAT CGGGAAACTG ATGCTAATAC CGGATGATGA CGTAAGTCCA AAGATTTATC 181 GCCCAGGGAT GAGCCCGCGT AGGATTAGCT AGTTGGTGGG GTAAAGGCTC ACCAAGGCGA 241 CGATCCTTAG CTGGTCTGAG AGGATGATCA GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC 301 TCCTACGGGA GGCAGCAGTA GGGAATATTG GACAATGGGG GCAACCCTGA TCCAGCAATG 361 CCGCGTGAGT GATGAAGGCC TTAGGGTTGT AAAGCTCTTT TACCCGGGAT GATAATGACA 421 GTACCGGGAG AATAAGCTCC GGCTAACTCC GTGCCAGCAG CCGCGGTAAT ACGGAGGGAG 481 CTAGCGTTGT TCGGAATTAC TGGGCGTAAA GCGCACGTAG GCGGCGATCC AAGTCAGRGG 541 TGAAAGCCCG GGGCTCAACC CCGGAATAGC CCTTGAGACT GGATTGCTTG AATCCGGGAG 601 AGGTGAGTGG AATTCCGAGT GTAGAGGTGA AATTCGTAGA TATTCGGAAG AACACCAGTG 661 GCGAAGGCGG CTCACTGGAC CGGCATTGAC GCTGAGGTGC GAAAGCGTGG GGAGCAAACA 721 GGATTAGATA CCCTGGTAGT CCACGCCGTA AACGATGATA ACTAGCTGCT GGGGTGCATG 781 GCACTTCGGT GGCGCAGCTA ACGCATTAAG TTATCCGCCT GGGGAGTACG GTCGCAAGAT 841 TAAAACTCAA AGGAATTGAC GGGGGCCTGC ACAAGCGGTG GAGCATGTGG TTTAATTCGA 901 AGCAACGCGC AGAACCTTAC CAACGTTTGA CATCCCCAGT ATGGTTTCCA GAGATGGATT 961 CCTTCAGTTC GGCTGGCTGG GTGACAGGTG CTGCATGGCT GTCGTCAGCT CGTGTCGTGA 1021 GATGTTGGGT TAAGTCCCGC AACGAGCGCA ACCCTCGCCT TTAGTTGCCA TCATTCAGTT 1081 GGGTACTCTA AAGGAACCGC CGGTGATAAG CCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAGTCC 1141 TCATGGCCCT TACGCGTTGG GCTACACACG TGCTACAATG GCGACTACAG TGGGTAGCGA 1201 CCTCGCGAGG GGAAGCTAAT CTCCAAAAGT CGTCTCAGTT CGGATTGTTC TCTGCAACTC 1261 GAGAGCATGA AGGCGGAATC GCTAGTAATC GCGGATCAGC ATGCCGCGGT GAATACGTTC 1321 CCAGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATSGGAGTTG GATTCACTCG AAGGCGTTGA 1381 GCTAACCGCA AGGAGGCAGG CGACCACAGT GGGTTTAGCG ACTGGGGTGA AGTCGTAACA 1441 AGGTAACCGT AAA Hình 3.10: Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Sphingomonas paucimobilis EPA 505 (96%). Bốn chủng Sphingomonas sp. A4 , Sphingomonas sp. AMS7, Sphingomonas sp. VX-MXL9, Sphingomonas paucimobilis EPA 505 đều là các chủng vi khuẩn sử dụng PAH được phân lập từ các nguồn ô nhiễm khác nhau. Các vi khuẩn phân hủy PAH chiếm ưu thế trong đất thường thuộc các chi như Sphingomonas, Burkholderia, Pseudomonas và Mycobacterium [36]. Trong số các chủng vi khuẩn phân lập từ môi trường, số lượng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas chiếm tỷ lệ cao trong số các chủng có khả năng phân hủy nhiều loại chất độc hại trong đó có cả PAH, các hợp chất dioxin, các hợp chất phenol chứa clo. Các vi khuẩn Sphingomonas cũng phân bố rộng rãi trong các môi trường không ô nhiễm như các hệ thống phân phối nước và môi trường biển [36]. Sphingomonas sp. AMS7 Sphingomonas sp. JQL4-5 Sphingomonas sp. BQN31 Sphingomonas sp. A4 Sphingomonas sp. P2 S. yanoikuyae B1 Sphingomonas sp. CFO6 Sphingobium sp. 2F5-2 Sphingomonas sp. 3Y S. paucimobilis EPA 505 0.002 Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên so sánh trình tự các đoạn gien mã hóa 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện. (Thước đo thể hiện hai nucleotide khác nhau trên 1.000 nucleotide so sánh) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Bảng 3.5: Độ tương đồng các đoạn gen 16S rRNA của chủng BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện STT Chủng vi khuẩn Số nucleotide tương đồng Mức độ tương đồng (%) 1 Sphingomonas sp. AMS7 1353 * /1374 # 98,47 2 Sphingomonas sp. JQL4-5 1433 * /1456 # 98,42 3 Sphingomonas sp. A4 1392 * /1420 # 98,02 4 Sphingomonas sp. VX- MXL9 398 * /408 # 97,54 5 S. paucimobilis EPA 505 1385 * /1430 # 96,85 Chú thích: *- số nucleotide của đoạn gen 16S rRNA chủng BQN31 #- số nucleotide của đoạn gen 16S rRNA các chủng đại diện Theo một số công trình nghiên cứu đã được công bố ở trong và ngoài nước, các chủng vi khuẩn Sphingomonas sp. A4, Sphingomonas sp. VX- MXL9, S. paucimobilis EPA 505 đều có khả năng phân hủy các hợp chất PAHs khá tốt. Chủng vi khuẩn S. yanoikuyae MXL-9 phân lập từ cặn dầu thô mỏ Bạch Hổ phân hủy phenanthrence và anthracene [8]. Chủng Sphingomonas sp. A4 có khả năng sử dụng acenaphthene và acenaphthylene như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất. [41]. Chủng vi khuẩn S. paucimobilis EPA 505 có khả năng sử dụng fluoranthene như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất, ngoài ra chúng còn có thể chuyển hóa được nhiều loại PAH khác. Dingyi Ye và cộng sự đã chỉ ra rằng, sau 16h nuôi cấy với nồng độ 10 ppm mỗi PAH, chủng vi khuẩn S. paucimobilis EPA 505 đã phân hủy 80.0, 72.9, 31.5, 33.3, 12.5, và 7.8% của pyrene, benz[a]anthracene Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 (B[a]A), chrysene, benzo[a]pyrene (B[a]P), benzo[b]fluoranthene (B[b]F), and dibenz[a,h]anthracene (DB[a,h]A) [24]. Như vậy, dựa trên một số đặc điểm hình thái và so sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA, chủng vi khuẩn BQN31 được xếp vào chi Sphingomonas và được đặt tên là Sphingomonas sp. BQN31. Chủng vi khuẩn Sphingomonas sp. BQN31 cũng thuộc trong số các vi khuẩn sử dụng PAH thường gặp trên thế giới và ở Việt Nam. 3.5. Nhân đoạn gen mã hóa catechol 2,3 dioxygenase từ chủng BQN31 Phân hủy sinh học của hydrocarbon thơm ở điều kiện hiếu khí thường xảy ra qua các bước cắt vòng thơm và tạo thành catechol, đây là một sản phẩm trung gian phổ biến nhất của quá trình phân hủy các hợp chất hydrocarbon thơm. Quá trình cắt vòng của catechol bởi enzyme dioxygenase có thể xảy ra ở hai vị trí meta và ortho. Tuy nhiên, cắt vòng tại vị trí meta được thực hiện bởi enzyme C23O được coi là quá trình phổ biến nhất ở các giai đoạn tiếp theo của phân hủy sinh học PAH. Xuất phát từ vị trí quan trọng của gen mã hóa enzyme C23O trong việc phân hủy sinh học PAH, gen mã hóa C23O đã được nhiều tác giả nghiên cứu quan trắc. Việc nghiên cứu sự tồn tại của gen này trong tự nhiên cũng như trong các chủng vi khuẩn sử dụng PAH là rất cần thiết. Trong nghiên cứu này, trình tự đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase của chủng BQN31 đã được xác định nhằm mục đích tìm hiểu sự đa dạng gen chức năng cũng như bản chất quá trình làm sạch dầu và PAH ô nhiễm ở mức độ phân tử. Các kết quả thu được sẽ giúp chúng ta hiểu rõ hơn về quá trình làm sạch ô nhiễm dầu cũng như sự đa dạng các gen chức năng trong nước nhiễm dầu tại khu vực Quảng Ninh. Sản phẩm DNA đã được tách sạch như ở phần 3.3.1 được dùng làm khuôn để tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi C23OF và C23OR. Sản phẩm Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 PCR thu được có kích thước khoảng 750 bp phù hợp với tính toán lý thuyết (Hình 3.12). Hình 19 là cây phát sinh chủng vi khuẩn đại diện. Hình 3.12. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase từ DNA tổng số chủng BQN31 và cặp mồi C23OF và C23OR. M- thang DNA chuẩn 1kb. kb M 1 0,75 0,50 atggatgttatgggtttcaaggtcgccaaggacgcggacttggaccattttaccgagcgc M D V M G F K V A K D A D L D H F T E R ttgctcgatatcggtgtccatgtcgacgtgatcccggcgggggaagatcccggtgtaggc L L D I G V H V D V I P A G E D P G V G cgcaagattcggtttaacacgccgacacagcacgtcttcgaactttacgccgagatggcg R K I R F N T P T Q H V F E L Y A E M A ctgtcggccaccggtccggccgtcaagaaccccgatgtctgggtcgtggagccacgtggc L S A T G P A V K N P D V W V V E P R G atgcgtgccacccgctttgatcactgtgcgctcaacggcgtggatatagccagttcggcc M R A T R F D H C A L N G V D I A S S A aagatttttgtcgatgcgcttgatttctcagtcgccgaggaactggtcgatgaaaccagc K I F V D A L D F S V A E E L V D E T S ggcgcccggctcggcatctttcttagctgcagcaacaaagcacacgatgtcgccttctta G A R L G I F L S C S N K A H D V A F L ggctatcccgaagacggtaagatccaccatacctcgttcaacctggaatcctggcacgat G Y P E D G K I H H T S F N L E S W H D gttggccatgccgccgacatcatcagccgctacgatatttcgctggatatcgggccgacc V G H A A D I I S R Y D I S L D I G P T cgtcatgggatcacccgcgggcagacgatctacttcttcgatccctcgggcaaccgcaac R H G I T R G Q T I Y F F D P S G N R N gaaaccttcagcggcggttacatttattatccggacaatccgcagcgcctgtggcaggca E T F S G G Y I Y Y P D N P Q R L W Q A gagaacgccggcaaggccatcttctactacgaaaaggcgctcaacgaccgcttcctgaca E N A G K A I F Y Y E K A L N D R F L T gt Hình 3.13. Trình tự nucleotide và trình tự axít amin suy diễn đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase của chủng Sphingomonas sp. BQN31 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Sản phẩm PCR được gắn vào vector pCR ® 2.1 nhờ enzyme T4 ligase ở 14 o C, biến nạp vào tế bào E. coli INV F’, tách chiết và kiểm tra DNA plasmid theo Sambook và cộng sự. Xác định trình tự đoạn gen mã hóa C23O trên máy xác định trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, được xử lý trên phần mềm Bioedit 6.0.7 (5/17/04), và suy diễn ra trình tự axít amin, so sánh mức độ tương đồng bằng chương trình Blast (Hình 3.13). Trình tự nucleotide và axit amin suy diễn đoạn gen mã hóa C23O của chủng BQN31 đã được đăng ký trình tự các đoạn gen trên GenBank với mã số lần lượt là EU814954 và ACF24468.1 C23O-Sphi- C230 (DQ873681) C23O-Sphi. BQN31 C23O-Pseu- ZP2 (EU082778) phnE-Pseu- DJ77 (U83882) catE-Sphi. agrestis - HV3 (L10655) cmpE-Sphi- HV3 (Z84817) xylE-Sphi- B1 (U23375) xylE-Sphi- KMG425 (AF494100) C23O-Rhiz- ZJF08 (DQ534019) C23O-Sphi. B2-7 (EU596533) C23O-Sphi. A8AN3 (U73127) Hình 3.14. Cây phát sinh chủng loại các đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3-dioxygenase của chủng Sphingomonas sp. BQN31 và một số chủng vi khuẩn đại diện (Thước đo thể hiện một nucleotide khác nhau trên 100 nucleotide so sánh) Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 So sánh mức độ tương đồng giữa trình tự đoạn gen mã hóa enzyme catechol-2,3 dioxygenase của chủng BQN31 và của các chủng khác trên GenBank và EMBL cho thấy, đoạn gen này ở chủng BQN31 có độ tương đồng rất cao đối với các đoạn gen mã hóa enzyme catechol-2,3 dioxygenase tương tự ở các chủng vi khuẩn thuộc chi Sphingomonas, Pseudomonas (Hình 3.14, Bảng 3.6). Đoạn gen mã hóa catechol 2,3-dioxygenase của chủng BQN31 có mức tương đồng 99 % với các đoạn gen phnE ở chủng vi khuẩn Pseudomonas sp. DJ77, cmpE ở chủng Sphingomonas sp. HV3, catE ở chủng Sphingomonas agrestis HV3 và C23O ở chủng Pseudomonas sp. ZP2 (Bảng 3.6). Bảng 3.6: Độ tương đồng của đoạn gen mã hóa enzyme catechol 2,3 dioxygenase của chủng BQN31 so với một số đại diện đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế Chú thích: *- số nucleotide của đoạn gen 16S rRNA chủng BQN31 #- số nucleotide của đoạn gen 16S rRNA các chủng đại diện Các trình tự nucleotide đã công bố về gen mã hóa C23O của các đại diện thuộc chi Pseudomonas (P. aeruginosa JI104, P. putida CF600, P. putida P 35X, P. putida pDK1, P. putida H, P. putida pW0, P. putida NAH, và Pseudomonas sp. IC) cho thấy mức tương đồng từ 75% đến trên 95% [45]. Trong khi đó, mức tương đồng về trình tự nucleotide của gen này ở các vi STT Chủng vi khuẩn Số nucleotide tương đồng Mức độ tương đồng (%) 1 Sphingomonas sp. strain HV3 716 * /719 # 99,58 2 Pseudomonas sp. DJ77 716 * /719 # 99,58 3 Pseudomonas sp. ZP2 714 * /719 # 99,30 Luận văn tốt nghiệp Khoa Sinh - KTNN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 khuẩn thuộc nhóm Sphingomonas (Sphingomonas sp. HV3 và S. yanoikuyae B1) là 76,5%. Sự giống nhau về trình tự nucleotide gen mã hóa C23O ở các chủng vi khuẩn của hai chi này vào khoảng 50% [45]. Trình tự C23O của các chi khác như Ralstonia (R. pickettii U20258, R. eutropha JMP 52415, R. rhodochous X69504, R. rhodochous NCIB 13064 và Bacillus (B. stearothermophilus FDTP-3) không đồng nhất. Các trình tự này cũng không hoàn toàn giống nhau giữa các thành viên, với nhóm Sphingomonas và nhóm Pseudomon