Luận văn Phân lập chủng vi khuẩn lactic và khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC PHÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN LACTIC VÀ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN SVTH: LÊ THỊ HỒNG VÂN CBHD: THS. NGUYỄN VŨ TUÂN TP Hồ Chí Minh, 01/2008 TÓM TẮT LUẬN VĂN Trong công nghệ thực phẩm vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi từ rất lâu đời bởi ứng dụng phong phú của nó trong cuộc sống. Những nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh tổng hợp các bacteriocin, những peptide hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Để có những khảo sát sâu hơn trước hết cần phải có chủng vi khuẩn lactic sinh tổng hợp được bacteriocin cao. Vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm mục đích: - Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp được bacteriocin - Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng phân lập được. Chủng vi khuẩn sẽ được phân lập từ các nguồn tự nhiên như sữa tươi tự lên men, các loại rau quả muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá), kim chi và giá đỗ. Qua quá trình thí nghiệm, ta có được chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa tươi tự lên men thể hiện vùng ức chế Listeria monocytogenes chứng tỏ có khả năng sinh tổng hợp được bacteriocin. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên sự sinh trưởng và sự sinh tổng hợp bacteriocin của chủng nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Từ kết quả đạt được thì khi nuôi cấy chủng trong môi trường dịch thể MRS có pH ban đầu 6.0 ở nhiệt độ 30oC chủng sẽ sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin tốt nhất. Khi đó, độ đo quang O.D. 600 nm = 1.417 và hoạt tính bacteriocin đạt 2250 AU/ml. Tóm lại, nghiên cứu đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic yêu cầu từ sữa lên men tự nhiên và điều kiện nuôi cấy tối thích để chủng sinh trưởng, sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất là trong môi trường dịch thể MRS có pH ban đầu 6.0 ở 30oC. Với những ý nghĩa của nghiên cứu, em hy vọng sẽ làm được những khảo sát có ý nghĩa và góp phần tạo nền tảng cho những nghiên cứu sau này, mang lại những giá trị thật lớn trong việc bảo quản thực phẩm, đảm bảo an toàn thực phẩm và nâng cao giá trị sống của con người. MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i TÓM TẮT LUẬN VĂN ii MỤC LỤC iv DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC BẢNG vii MỞ ĐẦU 1 Chương 1: TỔNG QUAN VI KHUẨN LACTIC 3 1.1.1 Đặc điểm chung 3 1.1.2 Các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 8 BACTERIOCIN 12 1.2.1 Sơ lược về bacteriocin 12 1.2.2 Bacteriocin từ LAB 13 1.2.3 Bacteriocin từ vi khuẩn khác 22 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 23 1.2.5 Định vị và tinh sạch bacteriocin 26 1.2.6 Ứng dụng của bacteriocin 27 1.2.7 Tình hình nghiên cứu 30 1.3 PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC 33 Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU 37 2.1.1 Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy, giữ giống 37 2.1.2 Nguồn nguyên liệu phân lập 37 2.2 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM 39 2.3 PHƯƠNG PHÁP 40 2.3.1 Phương pháp dàn đều và cấy ria 40 2.3.2 Phương pháp định danh tế bào vi khuẩn 41 2.3.3 Khảo sát các điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng mới phân lập 43 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 PHÂN LẬP 45 3.2 KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA CHỦNG MỚI PHÂN LẬP THEO THỜI GIAN NUÔI CẤY 51 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 60 4.2 KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 68 MỞ ĐẦU Ngày nay, nhu cầu ăn uống của xã hội ngày càng được nâng cao. Cũng từ đó, việc an toàn vệ sinh thực phẩm đang được chú trọng và đẩy mạnh. Bảo quản thực phẩm nói chung và phụ gia thực phẩm hay bao bì thực phẩm nói riêng đang là những vấn đề nóng bỏng của xã hội. Nếu như những chất phụ gia thực phẩm có nguồn gốc hóa học tác dụng phổ rộng với nhiều loài sinh vật và gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người thì những hướng nghiên cứu trên những chất chống vi sinh vật mới có nguồn gốc tự nhiên, an toàn và đặc hiệu đối với từng loài vi sinh vật gây hại đang được quan tâm. [27] Và việc tìm ra bacteriocin là một bước ngoặt lớn trong bảo quản thực phẩm. Đây là những chất có nguồn gốc sinh học đã được cho phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm ở nhiều nước phát triển. Loài có khả năng sinh tổng hợp ra nó cũng không có gì xa lạ với chúng ta, đó là các vi khuẩn lactic, những vi khuẩn mà con người sử dụng trong thực phẩm hàng ngàn năm nay [16]. Bacteriocin từ Lactococcus lactis là các protein nhỏ, bền nhiệt, chống vi sinh vật. Nisin là một bacteriocin được sử dụng rộng rãi do có hoạt tính với phổ rộng kháng các vi khuẩn G+, bao gồm Listeria monocytogenes, ngăn chặn sự phát triển của bào tử nảy mầm Bacillus và Clostridium. [18] Các chủng vi khuẩn lactic là các vi sinh vật quan trọng nhất trong sản xuất các thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, phomai. Chúng sản xuất rất nhiều các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin. Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng. [7] Những chủng vi khuẩn lactic khác nhau sẽ có khả năng sinh tổng hợp những loại bacteriocin khác nhau, với số lượng khác nhau [27]. Vì vậy mà việc tìm ra các nguồn tự nhiên để có thể phân lập ra những chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp hàm lượng chất chống vi sinh vật cao là cần thiết. Từ những điều thực tiễn đó, việc tìm ra được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin và sản xuất được các loại bacteriocin sử dụng trong việc bảo quản thực phẩm an toàn là cần thiết và có ý nghĩa quan trọng. Trong bài nghiên cứu này, chúng ta sẽ xây dựng những bước khởi đầu cho việc khảo sát sâu rộng hơn và có giá trị ứng dụng hơn. Mục tiêu nghiên cứu của luận văn gồm: - Từ những nguồn tự nhiên như sữa, kim chi, các rau quả muối chua, giá đỗ phân lập chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. - Khảo sát sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin chủng phân lập được. - Khảo sát sự ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy như pH, nhiệt độ lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin để từ đó có thể rút ra được các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn. Chương 1: TỔNG QUAN 1.1 VI KHUẨN LACTIC 1.1.1 Đặc điểm chung 1.1.1.1 Hình thái và dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic (Lactic acid bacteria–LAB) là các vi khuẩn G+, chịu acid, không hình thành bào tử, hình que hoặc hình cầu [2]. Một số loài hiếu khí và có thể sử dụng oxygen thông qua enzyme flavoprotein oxidase, trong khi những giống khác kỵ khí nghiêm ngặt. Vi khuẩn lactic phát triển tối ưu ở pH 5.5–5.8 và và có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp đối với các amino acid, peptide, nucleotide base, vitamin, khoáng, acid béo và carbohydrate. [1, 45] Những vi khuẩn này sản xuất acid lactic như là sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate. Đặc điểm này đã gắn liền LAB với thực phẩm lên men để acid hoá ngăn chặn sự phát triển của tác nhân gây hư hỏng. Protein bacteriocin được sản xuất bởi nhiều chủng LAB, cung cấp một hàng rào ngăn cản vi sinh vật gây hư hỏng và gây bệnh. [11] LAB được sử dụng rộng rãi trong sản xuất sản phẩm lên men bởi vì hoạt tính trao đổi chất đặc biệt của nó. Sự acid hoá, sản phẩm của acid hữu cơ, và các chất kháng khuẩn khác như bacteriocin, góp phần to lớn trong bảo quản thực phẩm bằng cách ức chế mầm bệnh và chất gây ô nhiễm. Sự chuyển hoá lactose nhờ nuôi cấy vi khuẩn lactic đã làm cho thực phẩm lên men dễ tiêu hoá hơn. Nhiều hoạt tính biến dưỡng và enzyme của LAB dẫn đến sự sản xuất các chất dễ bay hơi hình thành mùi thơm và hương vị đặc trưng cho sản phẩm lên men. [45] Các giống của LAB chủ yếu là Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Oenococcus, Teragenococcus, Vagococcus, Weisella…[11, 45]. (a) (b) (c) Hình 1.1: Hình ảnh một số vi khuẩn lactic: (a) Lactococcus lactis, (b) Streptococcus thermophilus, (c) Lactobacillus helveticus [11] 1.1.1.2 Trao đổi chất của vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic được chia thành ba nhóm dựa trên mô hình lên men. - Lên men đồng hình: sản xuất hơn 85% acid lactic từ glucose - Lên men dị hình: sản xuất chỉ 50% acid lactic và một lượng ethanol, acid acetic và CO2 - Được biết đến như là giống lên men dị hình sản xuất DL–lactic acid, acid acetic và CO2. [45] Dưới điều kiện dư glucose và hạn chế oxygen, LAB biến đổi một phân tử glucose theo con đường Embden–Meyerhof–Parnas thành hai phân tử pyruvate. Cân bằng oxy hoá khử nội bào được duy trì trong suốt quá trình oxi hoá NADH, đồng thời với sự khử pyruvate thành acid lactic. Quá trình này sinh 2 phân tử ATP cho mỗi glucose được tiêu thụ. Đại diện cho kiểu lên men này là các giống Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus và Lactobacillus nhóm I. LAB lên men dị hình phân giải glucose theo con đường pentose phosphate. Một phân tử glucose-6-phosphate ban đầu bị khử hydro thành 6-phosphogluconate và sau đó khử nhóm carboxyl hình thành một phân tử CO2. Kết quả là pentose–5–phosphate bị chia ra thành một glyceraldehyde phosphate (GAP) và một phân tử acetyl phosphate. GAP sau đó được chuyển hoá thành lactate như trong lên men đồng hình, với acetyl phosphate bị biến đổi thành ethanol qua chất trung gian là acetyl–CoA và acetaldehyde. Về mặt lý thuyết, sản phẩm cuối (bao gồm ATP) được sản xuất có số lượng bằng với từ quá trình dị hoá một phân tử glucose. Các LAB lên men dị hình bắt buộc gồm Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, và Lactobacillus nhóm III [45, 47]. Phân giải protein [11] proteinase Protein bị cắt thành những hợp chất nhỏ hơn Protein + H2O polypeptide Hoạt tính này của Lactobacillus trong hệ thống đường ruột làm thuỷ phân protein bởi hệ vi sinh vật tiêu hoá dễ dàng, một đặc tính có giá trị cao cho trẻ em, người bệnh và người già. Phân giải lipid [11] lipase Phức hợp chất béo bị cắt thành các hợp chất nhỏ hơn Acid béo + glycerol Triglyceride (chất béo) Acid béo + glycerol Hoạt tính này được sử dụng trong việc thiết kế chế độ dinh dưỡng cho trẻ em, người bệnh và người già. Bằng chứng từ thử nghiệm y khoa và lâm sàng cho thấy Lactobacillus có thể phân hủy cholesterol. Biến dưỡng lactose [11] LAB có enzyme β–galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase (LDH) sản xuất acid lactic từ lactose. Acid lactic được xem là có một số chức năng sinh lý như: - Làm tăng sự tiêu hoá protein sữa bằng cách kết tủa chúng trong sữa đông - Cải thiện khả năng sử dụng calcium, phosphor và sắt - Kích thích sự bài tiết dịch từ dạ dày - Làm gia tăng nhu động ruột - Cung cấp nguồn năng lượng cho quá trình hô hấp Vị trí đồng phân quang học của acid lactic được sản xuất dựa vào bản chất của môi trường. Hình dạng cấu trúc của các isomer này như sau: D (-) levorotatory lactic acid         L (+) dextrorotatory lactic acid Ở người, cả hai isomer đều được hấp thụ lên thành ruột. Trong khi L (+) lactic acid được chuyển hoá hoàn toàn nhanh chóng trong tổng hợp glycogen, D (-) lactic acid được tổng hợp ít hơn, và acid không được chuyển hoá sẽ được thải ra trong nước tiểu. Khả năng chuyển lactose thành acid lactic được sử dụng điều trị thành công bệnh không dung hợp lactose. Những người mắc bệnh này không thể chuyển hoá lactose bởi vì thiếu hệ thống enzyme cần thiết hoặc chúng hoạt động không bình thường. Acid lactic làm thấp pH môi trường ruột xuống khoảng 4 đến 5 để ngăn cản sự phát triển của vi sinh vật gây thối rữa và E. coli, vi sinh vật đòi hỏi pH môi trường tối ưu là 6 đến 7. Một vài acid dễ bay hơi sản xuất trong quá trình lên men cũng có hoạt tính ức chế dưới điều kiện thế oxy hoá khử thấp [45]. 1.1.1.3 Sản xuất các chất đối kháng LAB cũng ức chế sự phát triển của vi sinh vật có hại gây thối rữa thông qua các sản phẩm chuyển hoá như hydrogen peroxide, carbon dioxide, diacetyl và đặc biệt là bacteriocin. Sản phẩm chuyển hoá của LAB sử dụng để chống lại các vi sinh vật gây thối rữa và chức năng sinh hóa có thể ức chế vi sinh vật của chúng được tóm tắt trong bảng dưới đây. Bảng 1.1: Một số sản phẩm chuyển hóa của LAB và phương thức hoạt động của chúng [44, 45] Sản phẩm chuyển hoá Phương thức hoạt động 1.Carbon dioxide Ngăn cản sự khử nhóm carboxyl, giảm tính thấm của màng 2. Diacetyl Phản ứng với protein gắn arginine 3. Hydrogen peroxide/ Lactoperoxidase Oxy hoá các protein cơ bản 4. Acid lactic Acid lactic bị phân ly đi xuyên qua màng, làm thấp pH nội bào. Nó gây trở ngại quá trình chuyển hoá như oxi hoá khử phosphor 5. Bacteriocin Ảnh hưởng đến màng, tổng hợp protein và DNA. Bacteriocin sản xuất bởi LAB là chủ đề của các nghiên cứu lớn bởi vì hoạt tính kháng khuẩn của chúng chống lại sự sản sinh vi khuẩn làm hư hỏng thực phẩm. Chủng sản xuất bacteriocin của LAB rất quan trọng trong việc cạnh tranh với các vi sinh vật khác trong đường ruột. Bacteriocin là protein có hoạt tính sinh học, có khả năng ngăn ngừa sự xâm nhiễm của vi sinh vật bằng cách ức chế chúng và liên kết với receptor đặc biệt của tế bào. Hiện nay, có những mối quan tâm về việc ứng dụng bacteriocin trong cả bảo quản thực phẩm và ức chế mầm bệnh vi khuẩn. Hầu hết các bacteriocin đều được chiết xuất từ vi khuẩn liên quan trong lên men thực phẩm. Sự sản xuất bacteriocin và tính kháng được xem là các đặc tính quan trọng của chủng, có thể được sử dụng trong thương mại như là chất loại bỏ hoặc làm giảm sự phát triển của chủng gây bệnh không mong muốn. [34] Hiện nay, các nghiên cứu đi sâu vào việc mở rộng hoạt tính kháng khuẩn của bacteriocin, đáng chú ý là nisin cùng với những nhân tố kháng khuẩn khác như hệ thống lactoperoxide hiện diện trong sữa, các tác nhân khác và các bacteriocin khác [16]. 1.1.2 Các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin 1.1.2.1 Chủng Lactococcus lactis (a) Giới thiệu [11] Chủng Lactococcus lactis (Lc. lactis) là các vi sinh vật quan trọng nhất trong sản xuất thực phẩm lên men hằng ngày như bơ, sữa chua, kem, fromage. Chúng sản xuất nhiều hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, bao gồm bacteriocin. Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng. Dựa vào đặc tính sinh hóa, Lc. lactis được phân thành: Lc. lactis subsp. lactis, Lc. lactis subsp. cremoris và Lc. lactis subsp. cremoris. Lc. lactis subsp. lactis có khả năng phát triển được ở nhiệt độ 40oC, sống được ở nồng độ muối ăn lên đến 4.0% và sản xuất được amonia từ arginine trong khi Lc. lactis subsp. cremoris không có tính chất này. Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis được phân biệt dựa vào khả năng chuyển hóa citrate. Một trong những đặc điểm quan trọng nhất trong công nghiệp của chủng Lc. lactis là plasmid được mã hoá, có nghĩa là plasmid mang gen có các đặc tính như biến dưỡng lactose và sản xuất proteinase cũng như tính kháng bacteriophage. Các plasmid biến dưỡng quan trọng khác và chức năng của chúng ở Lactococcus cũng đã được mô tả. Do đó, hiện nay chúng ta đã có những hiểu biết về gen plasmid kiểm soát biến dưỡng đường sucrose, galactose, mannose, xylose, glucose, sử dụng citrate, tính kháng phage, biến dưỡng và giới hạn DNA, sự tập hợp tế bào, sản xuất bacteriocin... Thêm vào đó, Lactococcus chứa nhiều plasmid, kích cỡ từ 1 đến >100 kbp. Plasmid mã hoá cho bacteriocin thường lớn và kích thước của chúng từ 81 đến 133 kbp. Chủng Lc. lactis thường có từ 2 đến 11 plasmid DNA, trong khi số lượng phổ biến thường là từ 4 đến 7. (b) Tính chất của chủng Lc. lactis [10, 11] Biến dưỡng protein Giống như tất cả các LAB khác, Lactococcus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp. Để phát triển, chúng đòi hỏi các protein, peptide, các amino acid đặc biệt, các nucleic acid và vitamine,... Trong sữa, nồng độ isoleucine, leucine, valine, histidine và methionine cần thiết cho Lactococcus là thấp hơn 1 mg/l. Nó bao gồm các amino acid tự do, có mặt ban đầu trong sữa, cung cấp nguồn nitơ cho khoảng 2% mật độ tế bào cuối cùng. Casein, có khoảng 80% protein hiện diện trong sữa, trở thành nguồn nitơ sơ cấp sau khi dùng hết nitơ từ các nguồn không phải protein. Biến dưỡng lactose Biến dưỡng lactose của chủng Lc. lactis khác với biến dưỡng lactose của các vi khuẩn lactic khác. Khác biệt là ở sự dị hoá cùng lúc glucose và galactose. Chức năng của con đường đó đối với Lactococcus là để sinh năng lượng và acid lactic là sản phẩm phụ. Biến dưỡng citrate Trong nhóm Lactococcus thì chỉ Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis là có khả năng biến dưỡng citrate hiện diện trong sữa. Sản phẩm cuối cùng của biến dưỡng citrate là diacetyl, acetoin, 2,3 butanediol, acid acetic và carbondioxide, chúng tạo nên hương vị cho các loại thực phẩm bơ sữa lên men. Citrate được vận chuyển vào tế bào mà không cần có sự biến đổi. Ở Lc. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis, phản ứng này được xúc tác bởi citrate permease. Sinh tổng hợp bacteriocin Các chủng thuộc loài Lc. lactis có khả năng sinh tổng hợp rất nhiều các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn bao gồm cả bacteriocin. Các hợp chất này xuất hiện như là sản phẩm cuối của quá trình biến dưỡng. Bacteriocin từ Lactococcus là các protein nhỏ, bền nhiệt, chống lại các vi khuẩn lân cận. Nisin là bacteriocin được biết đến nhiều nhất, có 34 amino acid, khối lượng phân tử 3354 kDa, thuộc nhóm lantibiotic, được ứng dụng nhiều trong bảo quản thực phẩm. Nisin gây cản trở việc cung cấp năng lượng của tế bào bằng cách tạo nên bào tử trên màng và làm mất điện thế màng. Nisin có hoạt tính với phổ rộng kháng các vi khuẩn G+, bao gồm cả L. monocytogenes, ngăn chặn sự phát triển của bào tử nảy mầm Bacillus và Clostridium và thông qua việc thêm calcium, nó sẽ có hoạt tính kháng lại một số vi khuẩn G+. Một hợp chất khác, lacticin 3147 được xác định là từ Lactococcus thu nhận từ chủng Irish Kefir sử dụng trong sản xuất bơ. Bacteriocin này ngăn cản các mầm bệnh từ vi khuẩn G+ như Staphylococcus, Clostridium, Listeria spp., Streptococcus. [10] Ngày nay, nisin là bacteriocin từ LAB duy nhất được cho phép làm chất phụ gia thực phẩm. Hai sản phẩm khác là ALTA 2431 và Microgard đã được phát triển làm chất kéo dài tuổi thọ thực phẩm dựa trên sản phẩm lên men thô của LAB. 1.1.2.2 Các chủng vi khuẩn lactic khác có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Một số chủng vi khuẩn lactic khác có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin được tổng hợp trong bảng 1.2. Bảng 1.2: Một số bacteriocin, chủng sản xuất và đặc tính tiêu biểu Bacteriocin Vi sinh vật MW (Da) Đặc tính Laticin 3714 Lc. lactis 2847 Bền nhiệt ở 1000C trong 10 phút ở pH 5 hay 900C ở pH bằng 7 trong 10 phút. Nhạy cảm với trypsin, α–chymotrypsin, proteinase K, và pronase E, kháng pepsin [37]. Plantaricin C Lactobacillus plantarum 3500-4000 Ổn định ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ thấp, bền nhiệt ở 1000C trong 60 phút hay 1210C trong 10 phút. Hầu hết ổn định ở pH acid hay trung tính. Nhạy cảm với pronase, trypsin, và α–chymotrypsin, kháng lại pepsin, proteinase K, α–amylase, và lipase [21]. Bavaricin A Lactobacilus bavaricus 3500-4000 Bền nhiệt ở 1000C trong 60 phút. Ổn định ở pH bằng 2.0 đến 9.7, nhạy cảm với pepsin, trypsin, pronase E, proteinase K và chymotrypsin A, kháng lại với catalase [30]. Piscicolin 126 Carnobacterium piscicola JG126 4416 Ổn định ở pH bằng 2 sau khi lưu trữ 2 tháng tại 40C. Bền nhiệt tại 1000C trong 120 phút tại pH 2–3, trở nên ít ổn định hơn khi pH tăng. Nhạy cảm với α–chymotrypsin, β–chymotrypsin, protease type I, XIV, XXIII, và trypsin, kháng catalase, lipase và lyzozyme [25]. Variacin Micrpcoccus varians 2658 Ổn định ở pH từ 2 đến 10, bền nhiệt 1150C trong 20 phút, nhạy cảm với pronase E, proteinase K, ficin, kháng catalase [14]. 1.2 BACTERIOCIN 1.2.1 Sơ lược về bacteriocin Bacteriocin là tên chung của các peptide do vi khuẩn tổng hợp có hoạt tính kìm hãm đặc hiệu hay ức chế mạnh mẽ sự sinh trưởng và phát triển của một số vi khuẩn khác. Điểm đặc biệt của các bacteriocin là chúng không có hoạt tính kháng sinh điển hình, nghĩa là chúng chỉ kìm hãm nhưng không trực tiếp làm chết vi sinh vật. Chính vì lý do này nên thời kỳ đầu người ta chỉ tập trung vào phát triển các chất kháng sinh, còn các chế phẩm bacteriocin bị xem nhẹ và không được quan tâm đúng mức. Theo thời gian sử dụng chất kháng sinh hiện tượng kháng thuốc xuất hiện và ngày càng trở nên trầm trọng đã gián tiếp xác nhận đặc tính quý giá của các bacteriocin là nguy cơ gây ra hiệu ứng trên của chúng rất thấp. Nhờ vậy mà việc nghiên cứu, sản xuất và sử dụng các bacteriocin đã được phục hồi và phát triển. Các chế phẩm bacteriocin điển hình là nisin, diplococin, subtilin, lactostrepcin, bacteriocin S50, monocin (từ Lactococcus), pediocin A, pediocin PA–1, pediocin AcH (từ Pediococcus), lactocidin, acidolin, acidolin, acidophilin, reuterin, lactocin F, lactocin 27, helveticin J (từ Lactobacillus), leuconocin S, carnocin UI49, micrograd (từ Leuconostoc), propionicin PLG–1, jensenin G (từ Propionicbacterium). [28] Bacteriocin được tìm thấy lần đầu tiên bởi Gratia vào năm 1925, được sản xuất bởi một chủng E. coli để chống lại các chủng khác trong dịch nuôi cấy. Thuật ngữ “colicine” được đặt tên bởi Gratia và Fredericq (1946), còn “bacteriocin” được sử dụng bởi Jacob et al. (1953) như là thuật ngữ chung cho các protein có đặc tính kháng khuẩn cao. Thuật ngữ colicine ngày nay là để chỉ các protein có tính kháng khuẩn được sản xuất bởi nhiều loài E. coli và các loài thuộc họ Enterobacteriaceae. [28] 1.2.2 Bacteriocin từ LAB Hầu hết các nghiên cứu về bacteriocin tập trung chủ yếu ở nhóm vi khuẩn lactic vì từ xa xưa người ta đã biết sử dụng vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm và ngăn ngừa sự nhiễm các vi khuẩn gây bệnh. Bởi vì LAB và chất chuyển hoá của chúng đã được tiêu thụ với số lượng cao qua nhiều thế hệ người tiêu thụ các thực phẩm truyền thống mà không có ảnh hưởng có hại nào, LAB tiếp tục như là nguồn sản xuất bacteriocin sử dụng trong thực phẩm, kể cả dạng hợp chất tinh khiết hay dịch chiết từ môi trường phát triển. Có thể thu được bacteriocin thô bằng cách nuôi chủng LAB sản xuất bacteriocin trên một phức hợp cơ chất. Dịch lên men thô có chứa các chất khác bên cạnh bacteriocin. LAB là vi khuẩn nuôi cấy được sử dụng đầu tiên trong ngành sản xuất thực phẩm lên men, chúng hiển nhiên được sử dụng nhiều nhất cho sự biến đổi gen để tạo các chủng công nghiệp bị thiếu gen điều hoà sinh tổng hợp nên bacteriocin mong muốn. [27] 1.2.2.1 Phân loại bacteriocin [18, 24, 27, 28] Hầu hết các bacteriocin từ LAB đều có tính cation, kỵ nước hay phân tử lưỡng cực hình thành từ khoảng 20 đến 60 gốc amino acid. Các bacteriocin thường được phân chia thành 3 hay 4 nhóm. Nhóm I: gồm các lantibiotic là các peptide nhỏ có chứa các amino acid không phổ biến như lanthionine (Lan), α–methyllanthionine (MeLAn), dehydrodlanine, và dehydrobutyrine. Nhóm I được chia thành 2 nhóm nhỏ tuỳ theo cấu trúc hoá học và hoạt tính kháng khuẩn. - Nhóm Ia: lantibiotic type A là các peptide được kéo dài ra với mạng lưới tích điện dương, hoạt động thông qua việc hình thành các lỗ trên màng tế bào vi khuẩn. Một số nhóm như pep-5 chứa 3 nối monosulfite, epidermin chứa 4 nối monosulfite, nisin A và Z, subtilin thì lại chứa 5 cầu nối monosulfite. Kích thước phân tử của lớp phụ Ia dao động từ 1959 kDa ở duramycin đến 4635 kDa ở carnocin U9. - Nhóm Ib: lantibiotic type B là các phân tử peptide hình cầu nhỏ hơn và có một điện tích âm hoặc không tích điện, hoạt tính kháng khuẩn liên quan đến sự ức chế các enzyme đặc biệt. Một số các bacteriocin lớp phụ Ib như mersacidin, actagardin, cinnamycin và mutacin A. Trong đó mutacin A tạo ra bởi Streptococcus mutan. Nhóm II: Các peptide nhỏ (< 10 kDa), bền nhiệt, không có các amino acid biến đổi sau dịch mã có chứa ít nhất một cầu nối disulfur cần thiết cho hoạt động của chúng. Là nhóm bacteriocin lớn nhất trong hệ thống phân lớp này, các peptide được chia thành 3 nhóm phụ. - Nhóm IIa bao gồm peptide giống pediocin, có trình tự liên ứng đầu N–Tyr Gly–Asn–Gly–Val–Xaa–Cys. Nhóm phụ này được quan tâm nhiều bởi vì hoạt tính kháng Listeria, chúng làm mất cân bằng điện tích và tạo lỗ thủng làm rò rĩ các chất phân hữu cơ và gây chết tế bào đích. - Nhóm IIb gồm các bacteriocin đòi hỏi phải có 2 peptide khác nhau để có hoạt tính như lactococcin Gα/ Gβ, lactococcin M/N, plantaricin EF, JK, enteriocin L50A và enteriocin L50B. - Nhóm IIc: bao gồm tất cả các bacteriocin nhóm 2 không phụ thuộc IIa và IIb, peptide có nhóm thiol có hoạt tính, đòi hỏi phải cắt giảm nhóm cysteine để có hoạt tính. Nhóm III: nhóm này hiện vẫn chưa được mô tả kỹ. Nhóm này có các protein lớn (>30 kDa), dễ biến đổi bởi nhiệt độ. Một số bacteriocin lớp này là helveticin J tạo bởi L. helveticus 481 và lactacins A và B tạo bởi L. acidophilus, helveticin V, acidophilicin A. Những loại này ít được các nhà khoa học trong lĩnh vực thực phẩm quan tâm. Klaenhammer (1999) đề nghị thêm nhóm 4, là nhóm chứa các bacteriocin phức tạp, đòi hỏi carbohydrate hay lipid để có hoạt tính. Tuy nhiên bacteriocin của nhóm này chưa được miêu tả nhiều ở mức độ sinh hoá để mở rộng định nghĩa. Nhóm này bao gồm cả glycoprotein như lactocin 27 hoặc lipoprotein như lacstrepcin. [27] Hình 1.2: Công thức của Nisin A [24] 1.2.3.2 Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin a. Gene và sinh tổng hợp Bacteriocin được tổng hợp với ribosome. Gen mã hoá cho sản xuất và miễn dịch của bacteriocin thường được tổ chức thành các operon cluster. Nhóm gene bacteriocin có thể được định vị trên nhiễm sắc thể (subtilin và mersacidin), cũng có thể được định vị trên plasmid (divergicin A và sakacin A), hay là trên transposon (nisin và lacticin 481). [18] Operon sinh tổng hợp lantibiotic thường chứa gen mã hoá trên tiền peptide, enzyme chịu trách nhiệm cho các phản ứng biến đổi, quá trình phân hủy protein chịu trách nhiệm tách rời peptide chỉ đạo, ABC (ATP–binding cassette), họ protein vận chuyển bao gồm protein vận chuyển peptide, protein điều hoà, và các protein tự bảo vệ tế bào sản xuất. Peptide chỉ đạo có một vai trò rất quan trọng. Nó giữ cho tiền peptide ở dạng bất hoạt trong tế bào, phát ra tín hiệu vận chuyển lantibiotic ra khỏi tế bào, chứa các trình tự đặc biệt chỉ đường cho enzyme sinh tổng hợp đi tới nơi thích hợp để thực hiện sự biến đổi các amino acid và ổn định hình dạng của domain propeptide. [18, 28] Gene mã hoá cho sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II như lactococccin A, B, và M, pediocin PA–1/AcH, và plantaricin A có nhiều điểm giống nhau trong tổ chức gen, bao gồm một gen cấu trúc mã hoá cho tiền peptide, theo sau bởi một gen miễn dịch, gen để vận chuyển và protein phụ thêm. Một số trường hợp đã tìm ra được gen điều hoà. Các protein phụ thêm là rất cần thiết để các bacteriocin nhóm II được xuất ra. Không có bản sao nào của các protein phụ thêm ở lantibiotic được tìm thấy. [16, 18] Sự tạo các bacteriocin vi khuẩn G+ thường cần nhiều gen ví dụ như cụm gen tạo nisin: Nis A: prepeptid Nis B, nis C: enzyme biến đổi amino cacid Nis P: cắt các peptide leader Nis L, nis FEG: miễn dịch Nis R, nis K: điều hoà và biểu hiện [18]. b. Cơ chế Hầu hết các bacteriocin được tổng hợp như là các tiền peptide ở dạng bất hoạt mang một peptide chỉ đạo có đầu N gắn với tiền peptide tại đầu C. Đối với lantibiotic, gốc serine, threonine, và cystein trong phần tiền peptide phải trải qua bước kéo dài biến đổi sau dịch mã để hình thành Lan/MeLan. Con đường sinh tổng hợp của lantibiotic đi theo một kế hoạch chung: hình thành tiền peptide, phản ứng biến đổi, phản ứng tách rời phân hủy peptide chỉ đạo và di chuyển tiền peptide đã được biến đổi hay tiền peptide trưởng thành xuyên qua màng tế bào chất. Sự tách rời peptide chỉ đạo có thể diễn ra trước, trong suốt quá trình hay sau khi xuất ra khỏi tế bào. Trong sản xuất lantibiotic nhóm I, như trong trường hợp của nisin, epidermin, subtilin, và Pep5, phản ứng dehydrate có lẽ được xúc tác bởi enzyme LanB. [18] Hình 1.3: Cơ chế sinh tổng hợp Nisin theo 5 bước [18] Bacteriocin nhóm II được sinh tổng hợp như là một tiền peptide có chứa một trình tự chỉ đạo đầu N bảo tồn và một điểm làm phân tách protein, với ngoại lệ là bacteriocin nhóm IIc, được sản xuất với một trình tự đơn đầu N điển hình dạng sec và được tiến hành thông qua một con đường còn chưa được biết rõ. Không giống như lantibiotic, bacteriocin nhóm II không trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã. Sau khi hình thành tiền peptide, tiền peptide được tách khỏi peptide chỉ đạo đồng thời với việc được xuất ra khỏi tế bào. [18] Peptide chỉ đạo có một vùng nhận biết điều khiển tiền peptide trong suốt quá trình trưởng thành, và protein vận chuyển, bảo vệ chủng hoang dại bằng cách giữ lantibiotic ở trạng thái không có hoạt tính khi nó ở bên trong sinh vật sản xuất, và tương tác với domain tiền peptide để chắc chắn rằng có một cấu hình phù hợp cần thiết cho tương tác enzyme–cơ chất. [16, 18] Hình 1.4: Cơ chế sinh tổng hợp bacteriocin nhóm II theo 4 bước [18] c. Cơ chế kháng khuẩn của bacteriocin [16, 18] Hầu hết các bacteriocin hoạt động bằng cách tạo kênh hay lỗ trên màng làm phá huỷ năng lượng hữu ích của tế bào sống. Các bacteriocin của vi khuẩn G+ thường không có receptor đặc hiệu để hút bám mặc dù vẫn có những ngoại lệ. Hoạt động khác với vi khuẩn G- ở hai điểm chính sau: - Việc tạo bacteriocin thì không cần thiết phải gây chết cho vi sinh vật sản xuất. Sự khác biệt này là do cơ chế vận chuyển để giải phóng bacteriocin. Ở một vài vi sinh vật thì phụ thuộc vào hệ thống tiết. Ngoài ra, ở vi khuẩn G+ có sự điều hoà đặc hiệu bacteriocin nên các bacteriocin chỉ dựa vào hệ thống điều hòa của tế bào chủ. - Hầu hết các bacteriocin kích thước nhỏ hoạt động trong phạm vi pH rộng từ 3 – 9, thậm chí acidocin B có thể hoạt động ở pH 11, ở điểm đẳng điện cao cho phép chúng tương tác với bề mặt điện tích âm của màng tế bào vi khuẩn. Đối với các bacteriocin phổ kháng khuẩn rộng các hợp chất cần thể nhận thì sẽ gắn phần kỵ nước vào màng vi khuẩn. Sau đó sự liên kết của các phân tử bacteriocin với nhau sẽ tạo thành những lỗ xuyên màng làm mất gradient và gây chết tế bào. Lớp lipid tích điện âm của màng tế bào chất là receptor đầu tiên cho bacteriocin trong việc hình thành lỗ. Ví dụ như nisin: xử lí tế bào bằng nisin cho thấy nó tạo ra khe hở cho tia UV chiếu được vào trong nội bào; nisin là một bacteriocin có các phần tích điện dương; liên kết với màng lipid tích điện âm, hình thành lỗ, bên cạnh đó làm trung hoà điện tích của màng, làm mất đi lực vận chuyển proton. Do có sự hình thành lỗ không đặc hiệu, các chất nhỏ như ion, ATP thoát ra ngoài, còn các chất lớn như protein không thoát ra tạo nên điện thế màng, làm tế bào chết từ từ. Một số bacteriocin từ vi khuẩn G+ có thể làm bất hoạt các tác nhân gây bệnh G- khi sử dụng tác nhân có tính kìm kẹp (chelating) như EDTA để phá hủy các đặc tính của lớp rào cản bên ngoài vi khuẩn G-. Ngoài ra, nisin cho thấy là có tác dụng gây ra sự tự phân của tế bào, gia tăng áp suất nội bào làm cản trở chuyển hóa năng lượng, ngăn cản sự phục hồi vách tế bào. Hình 1.5 : Cơ chế tạo lỗ hay kênh ion trên màng tế bào của bacteriocin nhóm II [18] Người ta cho rằng các bacteriocin nhóm IIa có thể tự tạo lỗ xuyên qua màng tế bào vì chúng là những bacteriocin cực nhỏ và lưỡng cực. Các cystibiotic thuộc lớp IIc như cerecin 7/8, enterocin B, carnobacteriocin A và devergicin A có đặc điểm là có cấu trúc bậc 2 có sự hiện diện các vùng lớn bao quanh gần như toàn bộ vùng kỵ nước. Trong tất cả các trường hợp phần cystein đầu tiên tìm thấy nằm sau lysin tích điện dương ở cuối phần ưa nước và phần thứ hai nằm ở 3 trình tự cuối. Liên kết disulfur cần cho hoạt tính kháng khuẩn cuộn trong phần C của protein tạo thành cấu trúc kỵ nước bền vững, ngoài ra trong phân tử có chứa glycerin nên phân tử rất linh động. Chính sự linh động này cho phép chuyển từ cấu trúc β thành α để thích hợp với tính kỵ nước. Chiều dài của vòng kỵ nước đủ dài xuyên qua màng tế bào chất và khi có sự gắn kết một số lượng lớn cấu trúc vòng sẽ gây chết [16, 18]. Các hiểu biết thông thường về phổ ức chế của bacteriocin từ vi khuẩn G+ là chúng chỉ giết giới hạn một số vi khuẩn G+ khác. Phổ giết chết đóng vai trò quan trọng từ những trường hợp phổ hẹp như Lactococcin A, B, M chỉ giết được Lactococcus đến trường hợp phổ rộng như nisin A, mutacin B có thể giết được nhiều vi sinh vật như Actinomyces, Bacillus, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Gardnerella, Lactococcus, Listeria, Micrococus, Mycrobacterium, Propiobacterium, Streptococcus và Staphylococcus. Ngược lại với những hiểu biết trên là các bacteriocin cũng có hoạt tính chống lại các vi khuẩn G- gây bệnh như : Campylobacter, Haemophilus, Helicobacter và Neisseria [18]. 1.2.3 Bacteriocin từ các loài vi khuẩn khác Bacteriocin vi khuẩn Gram âm [30, 34] Vi khuẩn G- sản xuất nhiều bacteriocin khác nhau, chúng được đặt tên theo tên giống (ví dụ như klebicin của Klebsiella pneumoniae) hay theo tên loài (ví dụ như colicin của E. coli, marcescin của Serratia marcescens, alveicin của Hafnia alvei và cloacin của Enterobacter cloacae) của vi khuẩn sản xuất. Bacteriocin do Pseudomonas sản xuất được gọi là pyocin. Klebicin, alveicin và marcescin cũng có phạm vi giết giới hạn ở các loài Klebsiella, Hafnia và Serratia. Bacteriocin sản xuất bởi Pseudomonas spp. (pyocin) cũng được nghiên cứu rộng rãi. Gen pyocin được mã hoá trên nhiễm sắc thể và thường gặp ở Pseudomonas. Có 3 dạng pyocin đã được mô tả: dạng F, dạng R, và dạng S. Pyocin dạng R và dạng F được sản xuất bởi 90% và dạng S được sản xuất bởi 70% các chủng P. aeruginosa được nghiên cứu. Pyocin dạng F và R là bacteriocin dạng đuôi phage, kháng nuclease và protease. Pyocin dạng S là bacteriocin nhạy cảm với protease tương tự như colicin. Nhóm gen colicin gồm 3 gen liên kết chặt chẽ với nhau, mã hoá cho các protein gây độc, protein miễn dịch và protein phân giải. Colicin giết tế bào đích bằng cách hình thành lỗ, bằng hoạt tính nuclease hay bằng cách làm gián đoạn vách tế bào. Sự định hướng của gen colicin với gen miễn dịch là khác nhau trong trường hợp nhóm gen colicin hình thành lỗ hay hoạt tính nuclease. Trong trường hợp hình thành lỗ, gen miễn dịch được định hướng đối diện với gen gây độc, có thể giết tế bào từ bên ngoài bằng cách khoang một lỗ lên màng tế bào. Bacteriocin từ Archaea: halocin và sulfolobicin [34] Cho đến nay, các archaeocin đã được mô tả đặc điểm chỉ từ hai nhóm: nhóm Archaea đặc biệt ưa mặn sản xuất halocin, nhóm Archaea đặc biệt ưa nhiệt sản xuất sulfolobicin. Hầu hết Archaea đều sản xuất kháng sinh, người ta cho rằng có hàng trăm halocin khác nhau, nhưng chỉ có 7 halocin và một sulfolobicin đã được thu nhận và mô tả đặc điểm đầy đủ. Halocin rất đa dạng về kích cỡ (thay đổi từ 3–35 kDa), bền nhiệt, và phụ thuộc muối. Phổ hoạt tính khá rộng với hoạt tính giết chết các haloarchaea khác. Hiện nay, chỉ có halocin H6/H7 là được biết rõ về cơ cấu hoạt động, nó ức chế kênh vận chuyển Na+/H+ ở cả tế bào haloarchaea và động vật có vú. Halocin có thể là peptide (≤10 kDa, gọi là microhalocin), hay là protein (>10 kDa), có hoạt tính kháng sinh, được sản xuất bởi các thành viên của họ Halobacteriaceae. 1.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp bacteriocin 1.2.4.1 Môi trường nuôi cấy Kelstrup và Gibbons (2002) đã thấy rằng gia tăng tính nhớt của dịch môi trường bằng cách thêm agar, dextran, glycerol, hay tinh bột sẽ gia tăng năng suất sản sinh bacteriocin của vi khuẩn Streptococcus cô lập từ khoang miệng của người và động vật gặm nhấm. Một nghiên cứu khác của M.A. Riley (2007) về staphylococcin 1580 cho thấy nuôi trong môi trường bán rắn sẽ cho năng suất lớn hơn 20 lần so với môi trường lỏng. Các chất riêng biệt hợp thành môi trường có thể quyết định sự sản xuất của bacteriocin. Sự sản xuất bacteriocin bởi các chủng khác nhau của S. mutans có thể làm gia tăng bằng cách thêm cao nấm men 2% vào môi trường cơ bản Trypticase. Tương tự, sự hình thành butyricin 7423 trong môi trường được thấy là phụ thuộc với lượng casein hydrolysate thêm vào cho đến tối đa 5%. Sự hình thành bacteriocin của các chủng Corynebacteria và bởi Staphylococcus được thấy rằng phụ thuộc hàm lượng amino acid trong môi trường nuôi cấy. Ion Mangan (2004) được thấy là cần thiết cho nhiều sản phẩm sản sinh trong môi trường hoá học xác định. Thêm 0.5% mannitol vào môi trường brain heart infusion broth làm gia tăng năng suất của staphylococcin 426 nhưng giảm lượng staphylococcin 414. Tương tự, glucose làm gia tăng sự sản xuất streptococcin A–FF22 nhưng làm giảm streptococcin B–74628. Những nghiên cứu khác cho thấy thêm vào cả glucose hay manitol sẽ làm gia tăng sự sản xuất chất ức chế bởi phage type 71 Staphylococcus trong dịch chiết đậu nành. [13] Điều kiện nuôi cấy Sự khác nhau của điều kiện môi trường như nhiệt độ, thời gian, oxy, pH có ảnh hưởng đến năng suất của bacteriocin có hoạt tính. Nhìn chung, sự sản xuất bacteriocin tốt hơn ở điều kiện nhiệt độ tối ưu của chủng sản xuất phát triển. Nuôi ở nhiệt độ quá cao có thể ngăn cản sự sản sinh bacteriocin và đôi khi dẫn đến sự thay đổi các đặc tính một cách không thuận nghịch. [40] Việc tạo ra các bacteriocin ở vi khuẩn G+ thường khi chuyển từ pha log đến pha ổn định. Sản lượng bacteriocin tối đa trong môi trường có thể thấy ở nhiều pha khác nhau trong chu kỳ tăng trưởng. Schlegel và Slade (2002) nhận thấy sự sản xuất streptocin STH1 nhiều nhất trong suốt pha log và giảm dần mức độ sản sinh bacteriocin trước khi bước vào pha ổn định. Trái lại, sản xuất streptococcin A – FF22 bắt đầu ở cuối pha log và hoạt tính giảm dần dần khi nuôi kéo dài. Tương tự, sản xuất staphylococcin C55 bắt đầu ở pha log, đạt đến tối đa giữa 24 và 48 giờ phát triển, và sau đó suy tàn dần. Butyricin 7423 thì được tiết ra trong suốt cuối pha log, tuy nhiên, perfringocin 11105 chỉ xuất hiện nhiều vào pha ổn định và sản phẩm của nó dường như lại tiêu hủy một phần tế bào sản xuất. Meitert (2005) đã báo cáo một vài chủng C. diphtheriae giải phóng bacteriocin liên tục nhưng một vài chủng khác lại sản xuất gián đoạn. Lachowicz (2002) nghiên cứu khả năng sản xuất staphylococcin A–1262a trên môi trường rắn. Hoạt tính được nhận thấy đầu tiên sau 8 giờ, đạt đến tối đa khi từ 18 đến 24 giờ, và sau đó giảm dần về 0. Những nghiên cứu khác cũng nhận thấy hoạt tính bacteriocin bị mất khi nuôi kéo dài. Sự ảnh hưởng này có thể liên quan đến sự xuất hiện của chất bất hoạt bacteriocin hay enzyme tiêu hủy hoặc thay đổi chúng [38, 40]. Một ảnh hưởng thú vị lên sự phục hồi một số bacteriocin là pH. Một nghiên cứu về điều kiện để tối ưu sản xuất colicin K cho thấy rằng điều chỉnh pH môi trường là một yếu tố then chốt. Một số nghiên cứu tìm thấy rằng sản xuất streptococcin A–FF22 trên agar Todd–Hewitt sẽ gia tăng khi điều chỉnh pH ban đầu của môi trường đến 6.5. [13] Sản xuất chất ức chế bacteriocin và chất làm bất hoạt Davie và Brock (2003) tìm thấy acid teichoic, thường có trong lớp vỏ tế bào S. faecalis subsp. zymogenes X14, góp phần vào tính miễn dịch của vi khuẩn này với bacteriocin của chính nó sản xuất ra (hemolysin). Việc thải ra các sản phẩm ức chế trong giai đoạn sau chu trình phát triển là kết quả của sự biến mất của bacteriocin trong môi trường nuôi cấy. Tương tự, hoạt tính bacteriocin trong dịch nổi môi trường chứa staphylococcin 1580 được gia tăng khi thẩm tách, từ đó đề nghị rằng các chế phẩm này có thể chứa một chất ức chế khối lượng phân tử nhỏ của bacteriocin. Tất cả bacteriocin được mô tả đặc điểm đều có chứa một hợp chất protein cần thiết cho hoạt tính sinh học. Sự bất hoạt không thuận nghịch của một số bacteriocin có thể là kết quả từ sự tiêu hủy bởi protease nếu những chất này cũng sản xuất bởi vi khuẩn Bacteriocinogenic. Tác động này lần đầu tiên được chứng minh bởi Serratia marcescens, nhưng nó cũng được tin là đóng vai trò trong việc làm bất hoạt bacteriocin của Clostridium botulinum và Streptococcus nhóm A. Đun chế phẩm bacteriocin mà ổn định nhiệt sẽ làm bất hoạt protease, do đó bảo vệ bacteriocin. [28] 1.2.5 Định vị và tinh sạch bacteriocin Nhiều bacteriocin của vi khuẩn G+ dường như tồn tại ở hai dạng là liên kết với tế bào và ở ngoài tế bào. Tỷ lệ của mỗi dạng phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của môi trường. Bacteriocin trong phân loại này bao gồm megecin C–216, lactocin LP27, staphylococcin 1580, butyricin 7423, staphylococcin C55 và streptococin A–FF22. Những nhận xét tương tự cũng được báo cáo nhiều với colicin. [21] Trong trường hợp bacteriocin có nhiều ở xung quanh tế bào, các tính chất hoá học, cơ học, enzyme có thể ảnh hưởng đến việc giải phóng chúng khỏi tế bào. Viridin A, B, và C (bacteriocin của Streptococcus viridans) có thể thu được ở trạng thái tế bào tự do (cell-free) sau khi đồng nhất dịch tế bào sản xuất bacteriocin. Staphylococcin 414 cũng được tìm thấy ở bề mặt tế bào của chủng sản xuất nhưng có thể tách ra bằng cách phá vỡ cơ học tế bào. Trái lại, staphylococcin 462 không thể bị hoà tan bằng cách phá vỡ tế bào sản xuất. Các nghiên cứu khác cũng chứng tỏ rằng staphylococcin 1580 có thể được trích từ vi khuẩn với 5% NaCl. Tương tự tinh chế colicin E2–W3110 và E3– W3110 và bacteriocin JF246 của S. marcescens được hỗ trợ bằng cách trích bacteriocin quanh tế bào với 1M sodium chloride. Streptococcin A–FF22 ở dạng liên kết với tế bào có thể được trích bằng cách đun trong axit loãng. Streptococcin, nisin và diplococcin cũng có thể được thu bằng cách trích với axit từ tế bào sản xuất. Trong một số nghiên cứu khác phương pháp xử lý nhiệt dịch nuôi cấy của Lactobacillus đã gia tăng khả năng giải phóng lactocin LP27 từ tế bào. Phương pháp trích với axit dường như có hiệu quả trong ví dụ này. Donoghue khi sử dụng một phương pháp khác đã nhận thấy rằng megacin C–216 và Cx–337 được giải phóng từ tế bào sinh megacinogenic bằng cách xử lý với lysozyme, kết hợp tiền xử lý với trypsin. Tác giả kết luận rằng megacin được định vị trên bề mặt ngoài tế bào. [17] Thường dịch thô đầu tiên được cô đặc bằng cách lắng tủa phân đoạn với acid, muối, ethanol, hoặc các hỗn hợp khác nhau. Sau đó việc tinh chế có thể dựa vào kích cỡ khác nhau (sắc ký lọc gel, lọc qua máy siêu lọc, ly tâm) hay thay đổi điện tích (sắc ký trao đổi ion, điện chuyển). [32] Một vấn đề chung là sự mất hoạt tính trong quá trình tinh chế. Do đó việc giám sát hoạt tính bacteriocin (đơn vị bacteriocin/miligram protein) tại mỗi bước tinh chế và điều chỉnh khi có thể để tránh việc mất nhiều hoạt tính là rất quan trọng [28]. 1.2.6 Ứng dụng bacteriocin 1.2.6.1 Ứng dụng trong bảo vệ sức khoẻ con người Khi có sự tăng nhanh các vi khuẩn gây bệnh cần phải có phương pháp loại bỏ sự nhiễm. Một trong những giới hạn trong việc sử dụng kháng sinh là chúng có phổ ức chế rộng. Điều này sẽ giết không đặc hiệu bất kỳ loại vi khuẩn nào không kháng thuốc. Do đó, kháng sinh tiêu diệt luôn các vi khuẩn có lợi cho sức khoẻ con người. Người ta sử dụng bacteriocin như là một giải pháp thay thế. Chúng có phổ ức chế hẹp nên có thể xem như “thuốc độc thiết kế”, nó có tác dụng đặc hiệu với các vi khuẩn gây bệnh [41]. 1.2.6.2 Ứng dụng trong bảo quản thực phẩm Hiện nay chỉ có bacteriocin của LAB được phép sử dụng trong thực phẩm lên men vì LAB đã được sử dụng hàng thế kỷ qua để lên men thực phẩm. Năm 1988, FDA tiến tới việc sử dụng nisin trong quá trình khử trùng Pasteur fromage, tạo thành một sự kiện chính thức hợp pháp ở Mỹ trong ứng dụng bacteriocin như là chất phụ gia thực phẩm. Khi ước lượng để sử dụng như là chất phụ gia thực phẩm phải đòi hỏi sự đánh giá về tính bền nhiệt khi chúng được sử dụng phổ biến trong quá trình chế biến thực phẩm. [41] Từ rất xa xưa, người ta sử dụng phổ biến nitrate để ngăn chặn sự phát triển của Clostridium trong thịt nhưng vì sự an toàn cho công nghiệp thực phẩm cần phải có một phương pháp bảo quản khác. Nisin có tác dụng ngăn chặn sự phát triển của bào tử C. botulinum trong fromage, được thương mại và sử dụng rộng rãi. Ưu điểm lớn của nisin là hầu như không tác dụng lên các loài vi khuẩn G- nên việc sử dụng chúng không làm ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột có lợi của người, chúng dễ dàng bị phân hủy trong đường tiêu hoá và hoàn toàn an toàn ở liều sử dụng. Ví dụ: liều bảo quản hiệu quả trong phomát là 100 – 400 UI/g, trong khi đó liều LD50 trên mèo và chuột non thậm chí tới 7 g/kg ngày. Chính nhờ đặc điểm trên nên nisin hiện nay đang được triển khai thử nghiệm ứng dụng làm chất bảo quản thực phẩm ở nhiều quốc gia trên thế giới. Trong công nghệ chế biến sữa, nisin có thể được sử dụng theo một trong hai cách là: bổ sung chế phẩm nisin trực tiếp vào sữa bột hay vào nguyên liệu sữa trước khi lên men chế biến fromage hoặc người ta phối hợp sử dụng các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp nisin vào trong quá trình lên men fromage, nhằm khắc phục hiện tượng lên men sinh hơi khó chịu và kiểm soát quá trình lên men butyric do vi khuẩn Clostridium gây ra (trong công nghệ sản xuất fromage, ở một số nước người ta sử dụng nitrite để khống chế hai quy trình lên men không mong muốn trên, song một số dẫn xuất của chúng rất độc và có hoạt tính gây ung thư nên người ta đang nỗ lực tìm kiếm giải pháp thay thế). Tuy nhiên vai trò công nghệ của nisin trong sản xuất fromage vẫn chưa thực sự tìm được vị trí vững chắc. [27, 32] Trong công nghệ chế biến đồ hộp, sau quá trình thanh trùng bào tử của một số loại vi khuẩn bền nhiệt vẫn còn, ví dụ: C. perfringens, C. thermocaccharolyticum hay Bacillus stearothermophilus. Trong rất ít trường hợp có thể vẫn có nguy cơ còn sót lại, việc sử dụng nisin cho các nhóm sản phẩm này nhằm 2 mục đích là giảm khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn (để cải thiện hiệu quả thanh trùng ngay ở chế độ thanh trùng ôn hoà hơn) và kìm hãm, ngăn ngừa quá trình thối rữa (trong trường hợp nếu còn bào tử sót). Nhóm sản phẩm thường áp dụng là: cà chua nghiền, cà rốt nghiền, các sản phẩm nấm mũ, đậu quả đóng hộp. [16] Trong công nghệ chế biến các sản phẩm thịt (thịt hun khói, dăm bông, xúc xích, thịt băm…) người ta đang nỗ lực tìm kiếm các giải pháp công nghệ để thay thế cho việc sử dụng nitrite và nisin hiện đang thu hút được sự quan tâm của các nhà sản xuất, trong đó hướng phối hợp nisin-nitrite cho hiẹâu quả rất tích cực và đang được thử nghiệm tiếp tục. [22] Một nhóm sản phẩm khác có thể sử dụng hiệu quả nisin là sữa chocolate. Sản phẩm này, do độ acid thấp nên nguy cơ nhiễm vi khuẩn cao hơn, trong khi đó nhiệt độ thanh trùng cao ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng mùi và vị sản phẩm. Việc kết hợp sử dụng nisin cho phép hạ thấp nhiệt độ và thời gian thanh trùng, đồng thời lại cải thiện được chất lượng sản phẩm (ở nồng độ nisin khoảng 80 UI/ml đã có khả năng ngăn ngừa hiện tượng lên men thối sản phẩm sữa chocolate ở nhiệt độ thường trong vòng 6 tháng). [16] 1.2.7 Tình hình nghiên cứu Từ những năm 1676, Antonie van Leuuwenhoek đã ghi nhận về tính kháng trong đó sản phẩm từ một loài vi sinh vật này ngăn cản sự phát triển của một loài vi sinh vật khác. Đã có rất nhiều bài báo và công trình nghiên cứu về colicin, bacteriocin, bacteriocin từ LAB, và các ứng dụng đặc biệt của nó. Kết hợp với các phương pháp hiện đại, những nghiên cứu ngày càng tinh vi và đa dạng về mọi khía cạnh của bacteriocin. Đã có rất nhiều bacteriocin được nghiên cứu và mô tả đặc điểm. Kevin G. Mossie et al. (1979) đã mô tả đặc điểm và phương thức hoạt động của bacteriocin sản xuất bởi chủng Bacteroides fragilis, Gerald W. Upton et al. (1977) đã mô tả đặc điểm của bacteriocin của Streptococcus phân lập được từ bệnh nhân viêm màng tim trong. Raf Callewaert et al. (1999) đã mô tả đặc điểm và sản xuất amylovorin L471, một bacteriocin tinh chế từ Lactobacillus amylovorus DCE 471. Bảng 1.3: Một số chủng sản sinh bacteriocin và điều kiện nuôi cấy [11] Chủng vi khuẩn Bacteriocin sản sinh Môi trường Điều kiện nuôi cấy P. acidilactici LB 42-923 Pediocin AcH TGE 37OC, 20 h L. lactis subsp. lactis ATCC 11454 Nisin TGE 30 OC, 24 h L. sake Lb 706 Sakacin A MRS 25 OC, 24 h L. carnosum Lml Leuconocin Lcml MRS 25 OC, 24 h L. plantarum NCDO 955 None TGE 30 OC, 18 h L. mesenteroides Ly None TGE 30 OC, 18 h E. faecalis MB1 None TGE 30 OC, 18 h Các nhà khoa học đã tích cực nghiên cứu để tìm ra các gen liên quan đến sinh tổng hợp, điều hoà của bacteriocin và miễn dịch của chủng sản xuất. Mặc dù một số bacteriocin đã xác định được gen mã hoá nhưng vẫn còn rất nhiều điều chưa rõ ràng, như là cơ chế biến đổi từ tiền peptide thành peptide trưởng thành, các enzyme tham gia, sự sinh tổng hợp được điều hòa như thế nào, đặc biệt là với các bacteriocin lantibiotic. Hiện nay, gen mã hoá cho nisin đã được tìm thấy và định vị. Một số bacteriocin khác cũng đã được xác định như lactococcin, variacin, lacticin, plantaricin… nhưng vẫn còn nhiều bacteriocin khác chưa được xác định. [16] Về phương thức hoạt động của bacteriocin, đã đạt được nhiều kết quả và khám phá quan trọng trong vấn đề này, ví dụ như lacticin 3147 hình thành lỗ đặc hiệu ion trên màng tế bào vi khuẩn G+. Nisin thì liên kết với một chất tẩy cation có hoạt tính bề mặt để thấm vào vách tế bào vi khuẩn. Lactocin 27 tác động lên sự tổng hợp DNA, RNA và protein… [37] Mặc dù có nhiều bacteriocin được tinh chế, nghiên cứu và mô tả đặc điểm nhưng chỉ có một số ít được cho là có tiềm năng thương mại. Cho đến nay, chỉ có nisin là bacteriocin tinh khiết duy nhất được sử dụng trong thực phẩm ở Mỹ. Nó đã được sử dụng như là chất bảo quản thực phẩm ở trên 50 quốc gia, chủ yếu là trong fromage, rau quả đóng hộp, các sản phẩm qua khử trùng Pasteur như sữa, ngoài ra còn bảo quản trứng và salad tươi. [41] Ứng dụng của các bacteriocin khác trong bảo quản thực phẩm cũng được nghiên cứu, ALTA 2341 được sản xuất từ lên men Pediococcus acidilactici và dựa trên hiệu quả ức chế của pediocin PA-i/AcH. Nó được thêm vào fromage mềm của Mexico rất mẫn cảm với sự nhiễm Listeria. Micrograd là kết quả của lên men Propionibacterium. Nó có hoạt tính chống lại vi khuẩn G- như là Pseudomonas, Salmonella, Yersinia cũng như là nấm men và nấm mốc. Hoạt tính bảo vệ của Microgard gần như là do có sự hiện diện của acid propionic [36]. ALTA 2341 được chấp nhận bởi FDA cho sử dụng trong fromage và yoghurt mùi trái cây. Một sản phẩm khác là Bioprofit là hợp chất của chủng Lactobacillus và Propionibacterium được dùng trong nuôi cấy thông thường để chống sự phát triển của nấm men, nấm mốc, Bacillus spp. Clostridium spp và Lactobacillus trong suốt quá trình lên men bơ sữa. [13] Đặc biệt có một số bacteriocin loại lantibiotic còn có một số ứng dụng trong y dược hiện đang được nghiên cứu. Epidermin và Gallidermin (2003) cho thấy hoạt tính kháng Propionibacterium acnes, tác nhân gây mụn trứng cá. Những chất bảo quản này đưa đến việc các lantibiotic có thể được sử dụng trong xử lý mụn trứng cá ngoài da như là một liệu pháp thay thế cho các kem erythromycin/vitamin A được sử dụng hiện nay. Tương tự, tính ổn định với acid của nisin (HURST, 1981) đã hướng đến nhiều nghiên cứu gần đây cho rằng nó có thể có ảnh hưởng trong chữa trị bệnh viêm loét dạ dày. Vì hoạt tính kháng khuẩn của nó là chống lại Helicoacter pylori. Độ nhạy của nisin với các enzyme tiêu hoá lại là trở ngại trong việc sử dụng các chất này trong trị liệu. [44] Nhưng có lẽ ý nghĩa nhất là nhóm cinnamycin thuộc lantibiotic loại B đã cho thấy ảnh hưởng của chúng đến chức năng miễn dịch của người, sự tăng nhanh leucocyte có thể đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ chống virus Herpes simplex. Do đó, ứng dụng tiềm năng của những hợp chất này trong việc chăm sóc sức khỏe con người là rõ ràng. [14] Mặc dù có nhiều nghiên cứu trong suốt những năm qua để đạt được hiểu biết sâu sắc về bacteriocin nhưng vẫn cần tiếp tục tìm hiểu để đạt được sự am hiểu đầy đủ về cơ cấu phân tử, mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng, cơ cấu hoạt động của bacteriocin. Trong sinh tổng hợp của lantibiotic, chức năng của enzyme chịu trách nhiệm cho các phản ứng biến đổi vẫn còn chưa hiểu rõ, cơ chế miễn dịch của chủng sản xuất vẫn còn chưa được trả lời thoả đáng. [19] Bacteriocin được sử dụng như là chất đặc hiệu chống lại các vấn đề vi khuẩn khó giải quyết. Tuy nhiên, tính hiệu quả của nó trong thực phẩm có thể bị giới hạn bởi nhiều lý do, và giá thành sản phẩm là một trở ngại to lớn khi sử dụng chúng làm chất bảo quản thực phẩm. Do đó, không chỉ tiếp tục nghiên cứu để tìm ra những bacteriocin mới và hiệu quả hơn mà còn phải quan tâm đến khía cạnh kinh tế của nó. [11, 39] 1.3 Phân lập vi khuẩn lactic Trên thế giới người ta đã tiến hành phân lập các chủng có khả năng sản sinh bacteriocin lớn nhất. Loài được nhắc đến nhiều nhất là Lc. lactis với khả năng sản xuất nisin. Vì vi khuẩn lactic là một vi khuẩn được sử dụng rộng rãi nên nó được phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau. Nguồn phân lập vi khuẩn lactic thường là sữa tự lên men, các sản phẩm từ sữa như fromage hoặc là các sản phẩm lên men lactic truyền thống của các nước, như kim chi của Hàn Quốc, bushera của Uganda, và đôi lúc nguồn phân lập là các nguyên liệu của các sản phẩm lên men như rau cải, giá đỗ,… hay nước hồ, nước giếng, nước bọt của người. [21, 23] Các phương pháp phân lập dựa trên các đặc tính hình thái và sinh trưởng của chủng cần phân lập. Tất cả gồm 3 bước: Tách loại các chủng từ nguồn phân lập ra thành từng chủng riêng rẽ Môi trường mà ta phân lập thường chứa rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau bởi nó là những môi trường giàu dinh dưỡng. Trong một tổ hợp nhiều chủng loài như vậy, nhiệm vụ đầu tiên của chúng ta là phải tách riêng biệt chúng ra thành các chủng thuần khiết. Ta có thể dễ dàng làm điều này với các điều kiện môi trường đặc hiệu khác nhau sẽ cho ra các nhóm loài khác nhau. Với nấm men, ta sử dụng môi trường malt hay môi trường RBCA (Rose Bengal Chloramphenicol agar) nuôi cấy ở 25oC trong vòng 1 – 2 ngày. Coliforms được phân lập trên bề mặt thạch của môi trường VRBA (Violet Red Bile agar) trong tủ ấm có nhiệt độ 37oC sau 24h. Còn với các chủng LAB được nuôi trên môi trường thạch MRS hay M17 ở nhiệt độ 30o trong vòng 48h. Dù đã nuôi cấy đúng môi trường và đúng thời gian đặc hiệu nhưng trên bề mặt môi trường vẫn có nhiều loại khuẩn lạc của nhiều loài khác nhau vì vậy ta phải tiến hành tách loại thêm vài lần nữa để có thể thu từng chủng thuần khiết. [7, 22] Nhận danh dựa vào đặc điểm hình thái của chủng Khi đã tách loại ra thành từng loài riêng rẽ, ta sẽ dựa vào các đặc tính hình thái, nhuộm Gram để phân loại, sàng lọc lại các chủng có đặc tính giống loài mà ta cần phân lập. Đặc tính hình thái ở đây là hình dáng tế bào, khả năng di chuyển, sự sinh bào tử… [20, 23] Nhận danh nhờ vào các hoạt động sinh hóa cơ bản Với các bước sàng lọc ở trên đã loại bớt các chủng không cần thiết, ta sẽ tiến hành nuôi cấy trong các điều kiện khác nhau, thành phần môi trường đặc biệt khác nhau để kiểm tra mức độ sinh trưởng, phát triển của từng loài. Tiếp theo ta sẽ khảo sát khả năng chuyển hóa các chất đặc trưng của loài hay sản xuất ra các hợp chất đặc biệt. [7, 23] Ví dụ như trong LAB, chủng Lc. lactis có khả năng sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối NaCl lên đến 4%, nhiệt độ của môi trường có thể lên tới 40oC, ngoài ra nó còn có khả năng sản xuất ra khí từ glucose, dextran từ sucrose và ammonia từ arginine. Đặc biệt hơn hết là chủng này có khả năng sản sinh ra bacteriocin mà cụ thể là nisin có thể ức chế được một số vi khuẩn G+. [22] Với các phòng thí nghiệm lớn và hiện đại, các chủng phân lập còn có các bước nhận danh phức tạp và yêu cầu kĩ thuật cao hơn như kiểm tra gen, kiểm tra vòng plasmid… [23] Sữa và các sản phẩm lên men từ sữa là nguồn thực phẩm dinh dưỡng được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Trong môi trường giàu dinh dưỡng như sữa thì có rất nhiều loài vi sinh vật phát triển, và nổi bật nhất là các loài LAB do trong sữa chứa nhiều lactose, nguồn carbon chính của loài. Từ lâu người ta đã tiến hành phân lập các chủng vi khuẩn lactic khác nhau trong sữa và sữa lên men để thu được các chủng thuần khiết, sử dụng trong các sản phẩm riêng biệt. Trong sữa tươi có rất nhiều loài vi sinh vật như: Brevibacterium linens, Lactobacillus helveticus, Lactococcus lactis subsp. lactis, subsp. cremoris, subsp. diacetylactis, Leuconostoc lactis, Propionibacterium spp., Steptococcus thermophilus, Candida kefir, Penicillium camemberti, Penicillium roqueforti, Bifidobacterium spp., Lactobacillus acidophilus… [11] Hình 1.6: Hệ thống các loài vi khuẩn phân loại theo nhuộm Gram quan trọng trong lên men sữa [11] Chương 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN LIỆU 2.1.1 Chủng vi sinh vật và môi trường nuôi cấy, giữ giống Chủng vi sinh vật chỉ thị (dùng trong phương pháp kiểm tra bacteriocin – phương pháp Agar Well Diffusion) là chủng của vi khuẩn Listeria monocytogenes được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, bộ môn Công nghệ sinh học, khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. Vi khuẩn được lưu trữ giống trong ống thạch nghiêng trên môi trường TSA–YE (xem phụ lục) ở nhiệt độ 4oC. Canh trường được chuẩn bị bằng cách lấy khuẩn lạc của chủng cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường dịch thể tryptic soy có bổ sung chất chiết nấm men (TSB – YE) (Xem phụ lục) nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC trong vòng 24h. Vi khuẩn lactic cần phân lập có môi trường phân lập và giữ giống là môi trường thạch MRS (Man, Rogosa, Sharpe) (Xem phụ lục) và được nuôi ở 30oC trong vòng 48h. Sau khi có được các khuẩn lạc thuần khiết, ta sẽ lấy khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường dịch thể MRS (Xem phụ lục) và nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC trong vòng 24h. 2.1.2 Nguồn nguyên liệu phân lập Nguồn 1: Sữa tươi lên men Chuẩn bị: sữa tươi sau khi mua từ trại bò sữa ở quận 9 về phòng thí nghiệm sẽ được ly tâm tách béo và cho tự lên men ở nhiệt độ 28oC trong vòng 17h. Trong khoảng thời gian tự lên men, sữa sẽ tiến hành đông tụ nhờ vào các enzyme và acid mà lactococci và các vi sinh vật khác sản sinh ra. Và hiện tượng đông tụ này bắt đầu xảy ra từ giờ thứ 10 của quá trình lên men. Canh trường này được sử dụng là nguồn phân lập vi khuẩn. [31] Nguồn 2: Các sản phẩm rau cải muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá) Ba loại sản phẩm này được mua ở chợ Hòa Hưng và lấy trực tiếp nước lên men làm canh trường để phân lập chủng vi khuẩn cần thiết mà không cần thêm thao tác lên men hay xử lý nào khác trong phòng thí nghiệm. [12, 23] Nguồn 3: Kim chi Nguồn nguyên liệu sử dụng được mua từ siêu thị Big C. Nước lên men của kim chi được pha loãng và phân lập ra các chủng vi khuẩn. Nguồn 4: Giá Giá được mua ở chợ Hòa Hưng, đem về xay nhuyễn và pha loãng vào nước vô khuẩn để làm canh trường chứa vi sinh vật phân lập. [35] Các chủng vi khuẩn trong các sản phẩm lên men là do trong bản thân những loại rau quả đã có sẵn. Chúng sử dụng các nguồn dinh dưỡng trong rau quả để phát triển lên. Vì vậy mà ta sẽ dụng chính những rau quả tự nhiên này để làm nguồn phân lập. 2.2 THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM Chọn nguồn phân lập Tách loại thành từng loài vi sinh vật thuần khiết Phân biệt bằng đặc tính hình thái chủng vi khuẩn Xác định bằng đặc tính sinh lý của chủng vi khuẩn Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Khảo sát khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Khảo sát các yếu tố điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp bacteriocin Thuyết minh tiến trình thí nghiệm Từ các nguồn đã chọn, ta tiến hành các thao tác chuẩn bị để có thể phân lập tốt nhất. Pha loãng các canh trường, tách loại các chủng vi sinh vật riêng rẽ ra khỏi nhau bằng phương pháp dàn đều và cấy ria. Từ các nhóm vi sinh vật thuần khiết, ta làm các bước phân loại bằng đặc tính hình thái nhờ vào hình thái khuẩn lạc, hình thái của vi sinh vật khi quan sát dưới kính hiển vi và qua khóa nhuộm Gram. Sau đó xác định chủng vi khuẩn lactic bằng khả năng sinh tổng hợp bacteriocin bằng phương pháp Agar Well Diffusion. Với chủng vi khuẩn phân lập được, tiến hành khảo sát sự sinh trưởng bằng phương pháp đo quang O.D.600 nm và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Từ kết quả đó xây dựng được đường cong sinh trưởng và mối liên hệ giữa sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng. Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy (pH, nhiệt độ) đến sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin nhằm cải thiện hàm lượng chất ức chế trong dịch nuôi cấy thu được. 2.3 PHƯƠNG PHÁP 2.3.1 Phương pháp dàn đều, cấy ria Từ canh trường chứa vi sinh vật đã chuẩn bị, tiến hành pha loãng bằng dung dịch nước peptone 0,1% theo các cấp 10, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109. Dùng pipet lấy 0,1ml canh trường đã pha loãng có chứa vi sinh vật trong các ống nghiệm theo từng cấp đổ vào từng hộp Petri chứa sẵn môi trường thạch MRS. Lấy que trang đã được vô khuẩn dàn đều trên khắp bề mặt thạch. Hộp Petri đã cấy vi sinh vật được cho vào tủ ấm ở nhiệt độ 30oC, nuôi cấy trong vòng 48 giờ để thu được các khuẩn lạc mọc trên bề mặt thạch. [6] Chọn những hộp có mật độ khuẩn lạc vừa phải, không dày đặc, không chồng lên nhau. Trên bề mặt thạch lúc này sẽ có nhiều loại khuẩn lạc do nhiều loài vi sinh vật khác nhau phát triển lên nên để biết rõ đâu là chủng cần phân lập, phải tiến hành cấy dàn đều thêm 2,3 lần nữa. Để phân loại sơ bộ, khuẩn lạc được phân loại dựa theo các hình thái bên ngoài tương tự nhau thành từng nhóm và tiến hành làm tiêu bản quan sát trên kính hiển vi, loại bỏ bớt nấm men và nấm mốc. Các khuẩn lạc còn lại là vi khuẩn, ta cũng sẽ phân loại theo hình thái bên ngoài như độ trong, độ nhám, màu sắc của khuẩn lạc để pha loãng từng loại một vào trong dịch peptone 0,1%, cũng tiến hành pha loãng theo các cấp rồi đổ hộp Petri theo phương pháp dàn đều như trên. Sau vài lần đổ hộp dàn đều tách loại các chủng vi khuẩn ra khỏi hỗn hợp, ta thu được các khuẩn lạc thuần khiết. [12] Song song với việc phân lập dàn đều ta còn có thể cấy ria để thu được các khuẩn lạc thuần khiết mà không tốn công quá nhiều vào việc pha loãng và dàn đều trên hộp Petri. Phân lập cấy ria với các loại khuẩn lạc ta đã tách loại sơ bộ. Sau khi phân lập cấy ria, vi khuẩn sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành một khuẩn lạc riêng lẻ, thuần khiết. [6] Sau khi đã phân lập thành các khuẩn lạc thuần khiết của từng loài một, chủng sẽ được giữ giống trong ống thạch nghiêng trước khi tiến hành các khảo sát khác. Các ống giống được bảo quản ở nhiệt độ 4oC cấy chuyền định kì 3 tuần/lần để đảm bảo các hoạt tính sinh học của chủng. [6, 23] 2.3.2 Phương pháp định danh tế bào vi khuẩn 2.3.2.1 Định danh bằng đặc điểm hình thái Vì chủng Lc. lactis là có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin được sử dụng rộng rãi nhất nên trong quá trình phân lập, ta dựa vào các đặc tính của loài này để nhận danh và kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Với khuẩn lạc hoàn toàn riêng rẽ từ cấy ria, làm tiêu bản để quan sát độ đồng nhất cũng như hình thái bên ngoài của loài. Trước tiên ta sẽ dựa vào các đặc tính hình thái của chủng vi khuẩn phân lập được với đặc tính của loài Lc. lactis. Với các đặc tính hình thái của chủng và của khuẩn lạc như sau: vi khuẩn có tế bào hình trứng có kích thước 0.5–1.0 µm, ở dạng riêng rẽ, xếp thành đôi hay chuỗi ngắn, là tế bào vi khuẩn G+, không sinh bào tử, không có khả năng chuyển động. Khuẩn lạc của chủng Lc. lactis có màu trắng sữa, hơi trong, kích thước nhỏ, hình tròn, có bề mặt mịn bóng. [20, 31] Sau khi loại các loài không phù hợp, tiến hành cấy thạch nghiêng để giữ giống, và sử dụng cho các bước tiếp theo. Nhuộm Gram Lấy canh trường vi khuẩn được nuôi cấy ở 30oC trong vòng 24h, đem quan sát khả năng sinh trưởng và tiến hành nhuộm Gram để nhận dạng loài vi khuẩn mà ta cần phân lập. [6] Vì loài Lactococci là G+ nên khi nhuộm Gram sẽ cho các tế bào giữ màu tím của dung dịch tím tinh thể. 2.3.2.2 Kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Đây cũng là bước xác định đặc tính hóa sinh của chủng phân lập. Khuẩn lạc riêng rẽ được cho vào môi trường dịch thể MRS nuôi cấy ở 30oC trong vòng 24h. Canh trường sau khi nuôi cấy được ly tâm lạnh để tách tế bào vi khuẩn tận thu dịch bacteriocin (ở 4oC, 4000 vòng/phút trong 20 phút). Dịch ly tâm thu được sẽ sử dụng để thử hoạt tính bacteriocin bằng phương pháp Agar Well Diffusion. [43]. Cụ thể như sau: Chuẩn bị hộp Petri vô khuẩn và môi trường thạch nuôi cấy đã tiệt trùng. Ta cho 20ml môi trường thạch MRS vào hộp Petri 90. Tiến hành cấy chủng chỉ thị đã được điều chỉnh về nồng độ 106 cfu/ml vào hộp với thể tích 1%. Để khô trong vòng 30 phút, ta sẽ đục lỗ thạch 6mm trên mỗi đĩa thạch. Cho 40 µl dịch ly tâm có chứa chất kháng sinh vào trong mỗi lỗ thạch. Ta sẽ nuôi cấy các hộp Petri ở nhiệt độ 30oC trong vòng 16 giờ. Và sau đó ta sẽ quan sát hoạt tính kháng khuẩn dựa trên các vòng ức chế đo được trên hộp. [19] Độ chuẩn hoạt độ của dịch kháng sinh AU.ml-1 được tính theo công thức AU.ml-1= (1000/40).D.10(R/r) Trong đó: AU.ml-1 là độ chuẩn. AU (Arbitrary Unit): đơn vị tự do. D: độ pha loãng của dịch chứa bacteriocin R: đường kính vòng ức chế (mm) r: đường kính ban đầu của lỗ thạch (mm) (ở đây r = 6) [19] 2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn mới phân lập 2.2.3.1 Khảo sát sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng theo thời gian nuôi cấy Ta tiến hành nuôi cấy chủng ở môi trường MRS ở điều kiện nhiệt độ 30oC và pH của môi trường là 6.0. Sau khi cấy chủng vi khuẩn lactic vào môi trường mẫu sẽ được lấy theo từng giờ một cho đến khi đủ 24h. Khi đã nuôi cấy vi khuẩn trong khoảng thời gian thích hợp, đem ly tâm lạnh môi trường nuôi cấy ở 4oC, 4000 vòng/phút trong vòng 20 phút để thu được sinh khối của vi khuẩn lactic. Tách dịch lỏng ra để kiểm tra khả năng sản sinh bacteriocin theo phương pháp Agar Well Diffusion còn phần sinh khối lắng xuống ta đem pha vào nước peptone rồi đem ly tâm lại. Tiến hành ly tâm như vậy 2 lần để kết quả đo quang không bị ảnh hưởng bởi màu của môi trường nuôi cấy cũ. Pha loãng lại phần lắng trong ống ly tâm để rót vào cuvet và đem đo mật độ quang OD ở bước sóng 600 nm. Mẫu trắng kiểm chứng là mẫu dung dịch peptone 0,1%. [6] Với số liệu thu được trong đo quang, ta dựng đường cong sinh trưởng cho chủng vi khuẩn. 2.2.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng Trước tiên chủng sẽ được nuôi cấy trong môi trường dịch thể MRS ở pH = 6.0 với các điều kiện nhiệt độ khác nhau: 25, 30, 37oC và ở nhiệt độ 30oC với các giá trị pH của môi trường nuôi cấy khác nhau: 5.0, 6.0, 7.0. Trong khi nuôi cấy, mẫu canh trường được lấy ra để kiểm tra theo các khoảng thời gian thích hợp. Các mẫu này được ly tâm lạnh, đo quang và kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Từ các kết quả thu được ta sẽ có được nhiệt độ và pH môi trường nuôi cấy thích hợp cho chủng vi khuẩn mà ta phân lập được. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 PHÂN LẬP 3.1.1 Hình thái khuẩn lạc Nguồn 1: Sữa tự lên men Trong lần dàn đều đầu tiên từ canh trường sữa tươi tự lên men, hộp Petri được ủ ở nhiệt độ 30oC, sau 48 giờ có bề mặt thạch MRS xuất hiện 3 loại khuẩn lạc khác nhau màu trắng sữa: (1a) Khuẩn lạc có màu trắng đục, lớn, bề mặt khuẩn lạc bóng mịn, mép xung quanh khuẩn lạc tròn đều không có răng cưa. (1b) Khuẩn lạc có màu trắng hơi trong, khá lớn, bề mặt khuẩn lạc khá bóng mịn, mép xung quanh khuẩn lạc tròn đều không có răng cưa. (1c) Khuẩn lạc màu trắng đục, nhỏ, bề mặt khuẩn lạc nhám, không bóng mịn, mép xung quanh khuẩn lạc không bo tròn mà có hình răng cưa. Từ 3 loại khuẩn lạc đó, ta pha loãng vào dung dịch peptone 0.1% để dàn đều, thu được các chủng thuần thiết hơn. Qua hai lần dàn đều, các chủng được phân biệt dựa trên đặc tính hình thái bên ngoài khi quan sát ở kính hiển vi có độ phóng đại 40x. Kết quả đạt được như sau: (1a) Tế bào có dạng hình tròn, riêng rẽ hay kết đôi, ở giữa tế bào có nhân, kích thước tế bào lớn, không chuyển động. (1b) Tế bào có dạng hình tròn kết thành chuỗi dài, kích thước tế bào nhỏ, không chuyển động. (1c) Tế bào có dạng hình tròn, không chuyển động, ở dạng riêng rẽ hay kết đôi, chuỗi ngắn, kích thước tế bào nhỏ. Các đặc tính hình thái bên ngoài của chủng Lc. lactis cần phân lập cho thấy rằng nhóm (1a) và (1b) không phù hợp. Nhóm (1a) có kích thước rất lớn, lại có nhân rõ ràng nên có thể đó là nấm men, không phải chủng vi khuẩn lactic. Nhóm (1b) và (1c) có kích thước gần nhau nhưng lại có kiểu sắp xếp tế bào khác nhau. Qua quan sát nhóm (1b) có thể thuộc loài Streptococcus. Nguồn 2: Các loại rau quả muối chua (cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá) và kim chi Trong lần dàn đều đầu tiên, sau 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, trên bề mặt thạch MRS cũng xuất hiện 3 loại khuẩn lạc đều có màu trắng sữa và bề mặt khuẩn lạc đều bóng mịn, mép xung quanh tròn đều, không có răng cưa: (2a) Khuẩn lạc có màu trắng đục, có kích thước nhỏ. (2b) Khuẩn lạc có màu trắng trong, có kích thước hơi lớn. (2c) Khuẩn lạc có màu trắng đục, có kích thước lớn. (2d) Riêng trong hộp Petri dàn đều từ canh trường của kim chi có khuẩn lạc màu trắng trong, bề mặt hơi mờ, kích thước rất nhỏ. Qua nhiều lần dàn đều tách loại sau đó, kết quả quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại 40x cho thấy: (2a) Tế bào có kích thước nhỏ, hình tròn, kết chuỗi ngắn, không chuyển động. (2b) Tế bào có kích thước nhỏ, hình que dài, không chuyển động. (2c) Tế bào có kích thước lớn, hình tròn riêng rẽ hoặc kết đôi, giữa tế bào có thể quan sát thấy rõ nhân, không chuyển động. (2d) Tế bào có kích thước nhỏ, hình tròn riêng rẽ hoặc kết chuỗi ngắn, không chuyển động. Loại bỏ bớt nhóm (2c) vì tế bào có kích thước lớn như vậy có thể kết luận là nấm men. Nhóm (2b) có hình dạng dài nên có thể là loài Bacillus. Nhóm (2a), (2b) và (2d) dù không có đặc điểm giống như loài Lc. lactis nhưng ta vẫn lấy khuẩn lạc của chúng cho vào môi trường dịch thể MRS để nuôi cấy và thử khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Nguồn 3: Giá Trong lần dàn đều đầu tiên, sau 48 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, trên bề mặt thạch MRS chỉ xuất hiện một loại khuẩn lạc duy nhất có màu trắng sữa, có kích thước nhỏ, bề mặt bóng mịn, mép không có răng cưa. Sau khi dàn đều thêm lần nữa, bề mặt hộp Petri vẫn chỉ có một loại khuẩn lạc (3a). Quan sát trên kính hiển vi cho thấy các tế bào hình tròn, xếp riêng rẽ hay thành từng đôi, có kích thước nhỏ, không chuyển động. Các chủng còn lại (1b, 1c, 2a, 2b, 2d, 3a) mặc dù có chủng không phù hợp với các đặc điểm hình thái cơ bản của chủng cần phân lập nhưng tất cả vẫn được đem đi nuôi cấy trong môi trường dịch thể MRS ở 30oC trong vòng 24 giờ để nhuộm Gram và kiểm tra khả năng sinh tổng hợp bacteriocin bằng phương pháp Agar Well Diffusion. Kết quả thu được trong bảng 3.1. Bảng 3.1: Kết quả phân loại bằng nhuộm Gram và kiểm tra hoạt tính bacteriocin của các chủng thu nhận được trong quá trình phân lập Phân biệt nhờ nhuộm Gram Kiểm tra hoạt tính bacteriocin Kết quả 1a G+ Không có vòng ức chế Loại 1c G+ Thể hiện vòng ức chế Nhận 2a G+ Không có vòng ức chế Loại 2b G+ Không có vòng ức chế Loại 2d G+ Không có vòng ức chế Loại 3a G+ Không có vòng ức chế Loại Chỉ có một chủng vi khuẩn có các hình thái bên ngoài phù hợp với các đặc tính của loài cần phân lập và thể hiện vùng ức chế đối với chủng chỉ thị trong phương pháp Agar Well Diffusion. Khuẩn lạc của chủng vi khuẩn lactic phân lập từ nguồn sữa lên men tự nhiên được thể hiện ở hình 3.1 và hình thái của chủng được quan sát dưới kính hiển vi độ phóng đại 40x trong hình 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của chủng phân lập được trên loài L. monocytogenes được thể hiện trên hình 3.3. Các hình ảnh các vòng ức chế chứng tỏ có sự hiện diện của bacteriocin. Hình 3.1: Khuẩn lạc của chủng phân lập từ sữa lên men được trên hộp Petri Hình 3.2: Hình thái của chủng dưới kính hiển vi có độ phóng đại 40x Hình 3.3: Vòng ức chế của dịch ly tâm đối với L. monocytogenes (1) Sữa: ta chọn nguồn phân lập này dựa trên kết quả nghiên cứu của L.G. Stoyanova et al. (2005). Nghiên cứu này phân lập được chủng vi khuẩn Lc. lactis từ sữa tươi tách béo tự lên men, do họ có những điều kiện tốt hơn nên họ định danh và xác định được chính xác loại bacteriocin mà chủng sinh tổng hợp. Trong khi đó, nghiên cứu trên kim chi của Sang Hee Park et al., 2003 hay nghiên cứu trên giá sống nảy mầm từ đậu xanh của M. Nomura et al., 2007 đều phân lập ra được chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin nhưng trong thí nghiệm chúng ta đã không làm được. Nguyên nhân ở đây có thể là do nguồn nguyên liệu ban đầu khác nhau giữa các quốc gia, nguồn rau củ sử dụng trong nước không có sẵn chủng cần phân lập. Các nghiên cứu phân lập khác cũng có kết quả tốt, rất nhiều chủng vi khuẩn phân lập được có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin như nghiên cứu phân lập Lc. lactis từ nguồn thức uống, rau quả lên men truyền thống Malaysia của Ahmad Faris Mohd Adnan và Irene K.P. Tan, 2006, hay nghiên cứu phân lập Lc. lactis từ thức uống lên men truyền thống của Uganda – bushera của C.M.B.K. Muyanja et al., 2003 nhưng do chúng ta không có điều kiện để khảo sát các nguồn nguyên liệu này. Đổi lại, các nghiên cứu được tiến hành trên nguồn nguyên liệu là các sản phẩm muối chua truyền thống của nước ta như cải muối chua, cà pháo muối chua, dưa giá nhưng không thu được kết quả khả quan. Từ các nguồn này ta không thu được chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, cũng chưa có kết quả nghiên cứu nào trên những nguồn phân lập này nên chưa thể có kết luận rõ ràng nào. Có rất nhiều nghiên cứu phân lập vi khuẩn lactic sinh bacteriocin từ fromage và các sản phẩm từ sữa khác mà thời gian thí nghiệm hạn hẹp đã không cho phép quá nhiều khảo sát. Như nghiên cứu phân lập Lactobacillus plantarum sinh tổng hợp plantaricin C của Gonzalez B et al., 2002 từ nguồn là các sản phẩm từ sữa hay nghiên cứu của L. Aquilanti et al., 2006 phân lập vi khuẩn lactic từ fromage Canestrato Pugliese. 3.2 KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA CHỦNG MỚI PHÂN LẬP THEO THỜI GIAN NUÔI CẤY Hình 3.4: Sự sinh trưởng ( )và sinh tổng hợp bacteriocin ( ) của chủng theo thời gian khi nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC và pH 6.0 Sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi khuẩn lactic trong điều kiện nuôi cấy tĩnh được thể hiện trên hình 3.4. Pha lag của chủng kéo dài từ giờ đầu tiên đến giờ thứ 6, O.D.600 nm tăng không nhiều từ 0.756 đến 0.79. Pha log bắt đầu từ giờ thứ 7 trở đi và kết thúc ở giờ thứ 19 để đến giờ thứ 20, O.D.600 nm đạt 1.437 và bước vào pha ổn định. Pha ổn định kéo dài hết thời gian khảo sát của thí nghiệm. Kết quả khảo sát khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng theo thời gian dựa trên phương pháp Agar Well Diffusion cũng được thể hiện trên hình 3.4. Từ đồ thị cho thấy khả năng sinh tổng hợp bacteriocin tỉ lệ thuận với sự sinh trưởng của chủng. Thời gian ban đầu chủng còn ở giai đoạn pha lag, canh trường không có sự hiện diện của chất chống vi sinh vật, hoạt tính bacteriocin bằng 0 AU/ml. Từ thứ 8 trở đi lượng bacteriocin trong canh trường mới đo được bằng 52.9 AU/ml. đến khi nuôi cấy được 20 giờ thì lượng bacteriocin mới sinh tổng hợp cao nhất (2250 AU/ml) trùng với thời điểm đường cong sinh trưởng của chủng đi vào pha ổn định. Cũng từ đó mà ta nhận thấy rằng hoạt tính chống vi sinh vật của bacteriocin không bị ảnh hưởng nhiều trong môi trường nuôi cấy lúc bấy giờ đã có pH thấp do acid lactic của quá trình lên men đã nhiều. Hoạt tính này vẫn ổn định ở mức cao cho hết thời gian khảo sát của thí nghiệm. Từ những kết quả thu nhận được, thời gian nuôi cấy để thu được dịch có chứa hàm lượng bacteriocin cao nhất là sau 20 giờ, đồng thời cũng là thời gian đường cong sinh trưởng chuyển từ pha log sang pha ổn định. Kết quả này hoàn toàn tương tự với kết quả nghiên cứu trên chủng vi khuẩn Lc. lactis subsp. lactis phân lập từ kim chi của H. J. Choi et al. (2000) và nghiên cứu của Svetoslav D. Todorov and Leon M. T. Dicks, 2004 trên chủng Lc. lactis subsp. lactis phân lập từ “bia barley”. Trong hai nghiên cứu đó, điều kiện nuôi cấy giống với thí nghiệm của luận văn, tức là cũng nuôi cấy trên môi trường dịch thể MRS có pH ban đầu 6.0 ở 30oC có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cao nhất và đường cong sinh trưởng có pha log kết thúc ở 20 giờ. Trong khi đó, nghiên cứu của Suranjita Mitra et al., 2005 khảo sát chủng Lc. lactis phân lập từ sữa lên men trên môi trường TGE (tryptone – glucose – yeast extract) có pH ban đầu 6.5 ở nhiệt độ 37oC cho kết quả là sự sinh trưởng cao nhất sau 6 giờ và khả năng sinh tổng hợp chất chống vi sinh vật cao nhất sau 7 giờ. Hay ít hơn là nghiên cứu của L.G. Stoyanova et al., 2005, thời gian tốt nhất thu nhận canh trường nuôi cấy chủng Lc. lactis phân lập từ sữa lên men trong môi trường MRS có pH ban đầu 7.0 ở 30oC là sau 12 giờ. Bên cạnh đó cũng có nghiên cứu của E. P. Knoshaug et al., 2000 trên chủng Lc. lactis subsp. lactis phân lập từ nguồn thức uống sữa lên men nhẹ của vùng Scandinavi cho kết quả thời gian nuôi cấy tối thích là 16 giờ. Môi trường nuôi cấy ở là môi trường M17 có bổ sung glucose (xem phụ lục) có pH ban đầu là 7.0. M17 là môi trường thích hợp hơn cho chủng Lc. lactis subsp. lactis vì vậy mà chủng phát triển và sinh tổng hợp bacteriocin nhanh hơn. Chính vì vậy mà thời gian tối ưu ở nghiên cứu này ngắn hơn thí nghiệm của chúng ta. 3.3 ẢNH HƯỞNG CỦA NHIỆT ĐỘ ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA CHỦNG Nhiệt độ nuôi cấy rất quan trọng đối với các chủng vi sinh vật, vì vậy khảo sát được nhiệt độ tối thích của chủng rất cần thiết. Đường cong sinh trưởng và đồ thị biểu diễn khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng trong môi trường MRS có pH ban đầu 6.0 và nuôi ở nhiệt độ 25oC được thể hiện trong hình 3.5. Hình 3.5: Khả năng sinh trưởng ( ) và sinh tổng hợp bacteriocin ( ) của chủng trong môi trường nuôi cấy có pH ban đầu 6.0 ở nhiệt độ 25oC Ở nhiệt độ này, chủng vi khuẩn phát triển không mạnh mẽ như ở nhiệt độ 30oC. Thời gian đầu chủng sinh trưởng rất kém O.D. 600 nm không tăng đáng kể từ 0.715 đến 0.765, pha lag kéo dài đến giờ thứ 10 của quá trình nuôi cấy. Từ giờ thứ 10 đến giờ thứ 19 là pha log độ O.D. 600 nm tăng lên mức cực đại ở giá trị 0.945 (so với 1.437 của điều kiện nuôi cấy 30oC). Sau 23 giờ nuôi cấy, đường cong sinh trưởng có chiều hướng đi xuống. Khả năng sinh tổng hợp của chủng ở nhiệt độ 25oC cũng giống như ở nhiệt độ 30oC ở chỗ tăng và giảm theo chiều hướng tăng giảm của sự sinh trưởng của chủng. Hàm lượng bacteriocin cũng đạt giá trị cao nhất 707.8 AU/ml sau giờ nuôi cấy thứ 19. Hình 3.6: Sự sinh trưởng ( ) và sinh tổng hợp bacteriocin ( ) của chủng trong môi trường nuôi cấy có pH ban đầu 6.0 ở nhiệt độ 37oC Điều kiện nuôi cấy ở 37oC cũng thu được kết quả là khả năng sinh tổng hợp bacteriocin có liên quan mật thiết đến sự sinh trưởng của chủng. Pha lag kéo dài 7 giờ đầu tiên, O.D. 600 nm tăng rất chậm từ 0.711 lên đến 0.727, hoạt tính bacteriocin cũng không có thể hiện. Pha lag thật sự bắt đầu từ giờ thứ 8 và đến giờ thứ 20 thì đạt giá trị O.D. 600 nm cực đại ở 1.234 và hoạt tính bacteriocin lớn nhất là 1453.2 AU/ml và giữ nguyên đến hết thời gian khảo sát. Những giá trị cực đại ở điều kiện này luôn nhỏ hơn ở 30oC O.D. 600 nm =1.234 so với 1.437 và 1453.2 AU/ml so với 2250 AU/ml. Với kết quả này thì nhiệt độ nuôi cấy 25oC và 37oC không tối thích bằng 30oC vì giá trị cực đại của O.D. 600 nm và hoạt tính bacteriocin khi nuôi cấy chủng ở nhiệt độ 25oC và 37oC không cao bằng khi nuôi cấy ở 30oC. (P < 0.05) Kết quả này giống với kết quả của thí nghiệm của Svetoslav D. Todorov and Leon M. T. Dicks (2004) và nghiên cứu của H. J. Choi et al. (2000). Các thí nghiệm cũng tiến hành khảo sát Lc. lactis nuôi cấy môi trường MRS có pH ban đầu 6.0 ở các nhiệt độ khác nhau và rút ra được nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp bacteriocin là 30oC. Song song đó, nghiên cứu của Suranjita Mitra et al., 2005 và nghiên cứu của L.G. Stoyanova et al., 2005 lại cho kết quả khác là nhiệt độ 37oC là tối thích nhất cho chủng Lc. lactis nuôi cấy trong môi trường TGE (tryptone – glucose – yeast extract) có pH ban đầu là 7.0. Điều khác biệt này được lý giải rằng chủng vi khuẩn mà các nghiên cứu này khảo sát có nhiệt độ tối ưu cao hơn và được nuôi trong môi trường khác do các chủng từ các nguồn phân lập khác nhau. Qua các thí nghiệm và các nghiên cứu bàn luận ta thấy được nhiệt độ là yếu tố quan trọng trong các điều kiện nuôi cấy của chủng, quyết định đến đường cong sinh trưởng của chủng cũng như khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Và có thể rút ra được nhiệt độ nuôi cấy thích hợp để chủng phát triển và sinh tổng hợp ra lượng bacteriocin nhiều nhất là ở 30oC. 3.4 ẢNH HƯỞNG CỦA pH ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG VÀ SINH TỔNG HỢP BACTERIOCIN CỦA CHỦNG Chủng mới phân lập được nuôi cấy ở 30oC trong môi trường MRS có pH ban đầu khác nhau để khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Hình 3.7 biểu diễn đường cong sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp chất chống vi sinh vật của chủng trong môi trường có pH ban đầu 5.0 và hình 3.8 là ở pH ban đầu 7.0. Hình 3.7: Sự sinh trưởng ( )và sinh tổng hợp bacteriocin ( ) của chủng ở pH 5.0, nhiệt độ 30oC Với pH ban đầu của môi trường là 5.0, chủng phát triển không mạnh mẽ. Pha lag và pha log không rõ ràng, độ tăng với tốc độ log của chủng cũng không thể hiện rõ. Chỉ số O.D. 600 nm cao nhất đạt được là 0.926 ở giờ nuôi cấy thứ 20 (so với ở pH 6.0 là 1.437). Lượng bacteriocin sinh tổng hợp ra cũng thấp. Chủng bắt đầu sinh chất ức chế từ giờ thứ 11 (52.9 AU/ml) và đạt độ cao nhất ở giờ thứ 20 (540.6 AU/ml), nhưng hàm lượng này thấp hơn khi nuôi cấy ở pH 6.0 rất nhiều (540.6 AU/ml so với 2250 AU/ml). Hình 3.8: Sự sinh trưởng ( ) và sinh tổng hợp bacteriocin ( ) của chủng ở pH 7.0, nhiệt độ 30oC Khi nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic trong môi trường MRS có pH ban đầu 7.0 ở nhiệt độ 30oC, đường cong sinh trưởng có pha lag kéo dài đến 7 giờ, O.D. 600 nm trong khoảng 0.702 đến 0.739. Sau giờ thứ 7, sự sinh trưởng tăng theo hàm mũ lên đến giá trị cực đại (.D. 600 nm =1.256) ở giờ nuôi cấy thứ 20 rồi sau đó ổn định đến hết thời gian khảo sát. Sự sinh tổng hợp bacteriocin diễn tiến chậm hơn một chút, dịch nuôi cấy thể hiện được vòng ức chế ở giờ thứ 12 (194.6 AU/ml) và tăng nhanh đến giá trị cực đại (1155.9 AU/ml) sau giờ thứ 20. Ở thí nghiệm này, chủng mất một thời gian khá dài để thích ứng với môi trường nuôi cấy mới phát triển và sinh tổng hợp bacteriocin nên hàm lượng sinh khối và chất ức chế tối đa không cao bằng ở pH ban đầu của môi trường MRS bằng 6.0 (O.D. 600 nm = 1.256 so với 1.437, và hoạt tính bacteriocin 1155.9 AU/ml so với 2250 AU/ml). Vì vậy mà pH 6.0 thích hợp cho nuôi cấy chủng vi khuẩn lactic được phân lập hơn. Kết quả đạt được hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu của Svetoslav D. Todorov and Leon M. T. Dicks, 2004 trên chủng Lc. lactis subsp. lactis phân lập từ “bia barley”. Nghiên cứu này khảo sát các giá trị pH của môi trường MRS nuôi cấy khác nhau (4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5). Và nghiên cứu của H.J. Choi et al., 2000 khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường M17 ban đầu lên sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của Lc. lactis subsp. lactis A164 phân lập từ kim chi, các giá trị pH thí nghiệm là: không điều chỉnh pH ban đầu, pH = 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0. Cả hai nghiên cứu đều kết luận rằng pH tối thích nhất là 6.0. Trong nghiên cứu của L.G. Stoyanova et al., 2005 trên Lc. lactis subsp. lactis phân lập từ sữa lên men thì nhiệt độ tối thích cho chủng phát triển và sinh tổng hợp bacteriocin trên môi trường TGE (tryptone – glucose – yeast extract), nhiệt độ nuôi cấy là 37oC lại ở pH = 7.0. Hay nghiên cứu của Suranjita Mitra et al., 2005 khảo sát các giá trị pH ban đầu của môi trường TGE là 6.5, 7.5, 8.5, 9.5, 10.5, 11 trên chủng Lc. lactis phân lập từ sữa lên men. Sau khi nuôi cấy chủng Lc. lactis ở 37oC trong 10 giờ, các mẫu được lấy ra và đo hoạt tính bacteriocin, kết luận của nghiên cứu là pH tối ưu = 11.0. pH có giá trị tối thích khác nhau với những chủng phân lập khác nhau vì vậy mà dù hai nghiên cứu này có nguồn phân lập tương tự nhau, môi trường nuôi cấy giống nhau nhưng kết quả thu được lại khác xa nhau. Vì vậy thí nghiệm của chúng ta dù có nguồn phân lập giống hai nghiên cứu này nhưng kết quả thu được khác chúng cũng là điều hoàn toàn có thể giải thích được. pH của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của chủng vi sinh mà như các kết quả ở trên cho thấy sự tăng sinh khối luôn đi đôi với sự tăng lượng bacteriocin sinh tổng hợp được. Do đó pH của môi trường thích hợp chủng nuôi cấy rất quan trọng để chủng sinh tổng hợp bacteriocin. Từ các thí nghiệm và nghiên cứu bàn luận ở trên ta rút ra được pH môi trường MRS ban đầu tối ưu cho chủng là 6.0. Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Qua quá trình thí nghiệm và khảo sát, ta thu được kết quả sơ bộ mà luận văn đặt ra. Em đã phân lập được chủng vi khuẩn có những đặc tính thỏa mãn chủng yêu cầu và đặc biệt là có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin, thể hiện vòng ức chế đối với các loài vi khuẩn G+ như loài L. monocytogenes trong phương pháp kiểm tra Agar Well Diffusion. Các bước khảo sát sơ bộ cho thấy được sự ảnh hưởng mạnh mẽ của các điều kiện nuôi cấy như thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH lên sự sinh trưởng của chủng cũng như khả năng sinh tổng hợp bacteriocin. Từ đó đặt những cơ sở cần thiết cho quá trình nghiên cứu cải thiện khả năng sinh tổng hợp bacteriocin của chủng. Qua những kết quả thu được trong quá trình khảo sát biểu diễn được đường cong sinh trưởng của chủng vi khuẩn lactic phân lập được và rút ra được điều kiện nuôi cấy đề nghị thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp bacteriocin của chủng sẽ là nuôi cấy 20 giờ ở nhiệt độ 30oC trong môi trường dịch thể MRS có pH ban đầu bằng 6.0. Dịch sau khi nuôi cấy trong điều kiện thích hợp đó sẽ cho kết quả đo quang O.D.600 nm = 1.437 và hoạt tính chống vi sinh vật là 2250 AU/ml. 4.2 KIẾN NGHỊ Bacteriocin là một bước phát triển mới đối với ngành bảo quản thực phẩm, và chúng ta có thể thấy được tiềm năng lớn của hướng đi mới này. Tuy nhiên, những nghiên cứu của luận văn chỉ là những sơ khởi ban đầu trong lĩnh vực này. Trong khuôn khổ của luận văn, thời gian không cho phép em tiến hành những nghiên cứu sâu hơn. Chủng vi khuẩn lactic phân lập được mới chỉ qua khảo sát sơ bộ điều kiện nuôi cấy về thời gian, nhiệt độ và pH của môi trường. Chủng phân lập được chưa được thuần hóa để có khả năng sinh tổng hợp bacteriocin cao. Em xin được kiến nghị những vấn đề cần được nghiên cứu nhiều hơn để có thể nhanh chóng ứng dụng vào trong ngành công nghệ thực phẩm trong nước. - Nhận danh chủng vi khuẩn phân lập được bằng các phương pháp gen, xác định rõ loài và loài phụ của chủng. - Tối ưu các điều kiện nuôi cấy khác, khảo sát thêm sự phát triển, sinh trưởng cũng như sự sinh tổng hợp bacteriocin của chủng vi khuẩn lactic khi thay đổi môi trường nuôi cấy. - Tối ưu hóa thành phần môi trường nhằm thu được hàm lượng bacteriocin cao nhất trong dịch canh trường nuôi cấy. - Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến dịch bacteriocin thu được, làm thế nào thu nhận và tinh sạch dịch canh trường mà không làm biến đổi hay đánh mất hoạt tính kháng khuẩn của hợp chất. - Tối ưu quá trình thu nhận và tinh sạch bacteriocin. - Định danh và xác định cấu trúc phân tử của loại bacteriocin mà chủng phân lập sinh tổng hợp. - Ứng dụng bacteriocin trong bảo quản thực phẩm, trong bao bì thực phẩm, nghiên cứu khả năng ức chế vi sinh vật trêân các sản phẩm cụ thể. Em hy vọng kết quả thu được sẽ góp những cơ sở có ý nghĩa trong những khảo sát sau này. Từ những kết quả đó, những khóa sau sẽ tiếp tục các nghiên cứu sâu hơn và hoàn thiện hơn để có những ứng dụng có giá trị trong ngành thực phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Tỵ, Vi sinh vật học, NXB Giáo Dục, 2002. [2]. Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật học công nghệ, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2004. [3]. Nguyễn Đức Lượng, Thực phẩm lên men truyền thống, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh [4]. Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa, Tập 1, NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2004. [5]. Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương; Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm; NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh, 2006. [6]. Trần Thủy Tiên , Luận văn tốt nghiệp Thu nhận bacteriocin từ vi khuẩn Lactococcus lactis và thử ứng dụng trong bảo quản thịt, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh, 2007. [7]. Ahmad Faris Mohd Adnan and Irene K.P. Tan; Isolation of lactic acid bacteria from Malaysian foods and assessment of the isolates for industrial potential; Bioresource Technology, Vol. 98, Issue 7, pp. 1380-1385, 2007 [8]. Allison, G.E. and Klaenhammer, T.R; Phage resistance mechanisms in lactic acid bacteria; International Dairy Journal, Vol. 8, pp. 207–226, 1998 [9]. Amechi Okereke and Thomas J. MonTville; Bacteriocin- media