Luận văn Nuôi cấy quang tự dưỡng cây hoa cúc cắt cành (chrysanthemum sp. ) bằng hệ thống túi nylon

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC    TRẦN PHƢỚC LINH NUÔI CẤY QUANG TỰ DƢỠNG CÂY HOA CÚC CẮT CÀNH (Chrysanthemum sp. ) BẰNG HỆ THỐNG TÚI NYLON Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh 2006 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NUÔI CẤY QUANG TỰ DƢỠNG CÂY HOA CÚC CẮT CÀNH (Chrysanthemum sp. ) BẰNG HỆ THỐNG TÚI NYLON Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN TIẾN THỊNH TRẦN PHƢỚC LINH Niên khóa: 2002 – 2006 Thành phố Hồ Chí Minh 8/2006 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** PHOTOAUTOTROPHIC CULTURE OF CUT MUM (Chrysanthemum sp. ) USING NYLON – BAG SYSTEM GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. NGUYEN TIEN THINH TRAN PHUOC LINH Term: 2002 - 2006 HCMC 9/2006 4 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay, cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng tăng nhanh hơn bao giờ hết. Hoa tươi trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệt trong thị trường sản phẩm hàng hóa nông nghiệp thế giới.Trong đó, hoa Cúc là một trong những loại hoa được nhiều người ưa chuộng và phổ biến nhất. Trong xu thế hội nhập, cùng với chính sách mở cửa của nhà nước, nhiều nhà đầu tư nước ngoài như Công ty Hasfarm ở Đà Lạt không ngừng đưa vào Việt Nam những giống hoa Cúc đẹp và có giá trị kinh tế cao. Chính vì vậy, hiện nay sản phẩm hoa Cúc rất đa dạng về chủng loại, phong phú về màu sắc. Việc xuất hiện liên tục của những giống hoa Cúc ngoại nhập, bên cạnh các giống hoa nội địa, đã giúp mở rộng sản xuất và qua đó đáp ứng được nhu cầu thị hiếu của người tiêu dùng. Khi sản xuất được mở rộng, nhu cầu về giống cũng tăng theo, và phương pháp nhân giống cũng không ngừng cải tiến. Cây hoa Cúc được nhân giống chủ yếu bằng phương pháp vô tính qua phương pháp giâm cành truyền thống. Nhiều năm qua, thực tế cho thấy phương pháp này không đáp ứng kịp nhu cầu giống, mặt khác còn mang nguy cơ làm lây lan bệnh hại và làm thoái hóa giống.Vì vậy trong sản xuất số lượng lớn cây giống sạch bệnh với tốc độ nhanh, chất lượng đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cây hoa Cúc rất hiệu quả. Các nghiên cứu nuôi cấy mô truyền thống thường không quan tâm nhiều đến các yếu tố môi trường, và thường dựa quá nhiều vào những ứng dụng các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ngoại sinh. Bên cạnh đó, việc bổ sung đường, agar và vitamin vào môi trường nuôi cấy, cùng với việc sử dụng hệ thống nuôi cấy kín dẫn đến nhu cầu đòi hỏi sự vô trùng tuyệt đối. Điều này làm tăng chi phí sản xuất; gây ra sự mất mát một số lượng lớn cây con do nhiễm nấm khuẩn trong quá trình nuôi cấy; cảm ứng sự biến dị về hình thái, sinh lý cây nuôi cấy; đặc biệt là hiện tượng thủy tinh thể (vitrification) 5 thường xuất hiện. Chính vì vậy mà tỷ lệ sống của cây in vitro trong giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm thấp. Nhiều nghiên cứu ở những loài thực vật khác nhau đã cho thấy phương pháp có thể giúp khắc phục những nhược điểm trên, nâng cao rõ rệt chất lượng cây giống là phương pháp: Vi nhân giống bằng công nghệ quang tự dƣỡng. Theo phương pháp này khả năng tự quang hợp của cây được tạo điều kiện phát triển, sử dụng môi trường nhân giống chỉ bao gồm các loại muối khoáng, mà không có sự bổ sung đường hay các loại vitamin. Song song với những nghiên cứu về quang tự dưỡng, hệ thống nuôi cấy cũng không ngừng được cải tiến. Trong đó hệ thống nghiên cứu trong túi nylon rẻ tiền tỏ ra có nhiều triển vọng trong hạ giá thành sản phẩm cây con. Với những lý do đã nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “nuôi cấy quang tự dƣỡng cây hoa Cúc cắt cành (chrysanthemum sp. ) bằng hệ thống túi Nylon”. 1.2. Mục đích – yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng thích hợp, sử dụng các bịch nylon dân dụng, nhằm nâng cao chất lượng và hạ giá thành cây giống Cúc in vitro. 1.2.2. Yêu cầu Theo dõi các chỉ tiêu tăng trưởng của cây hoa Cúc trong phòng thí nghiệm và ngoài vườn ươm ở các điều kiện thí nghiệm quang tự dưỡng khác nhau. Tính toán sơ bộ chi phí giữa các hệ thống và phương pháp nuôi cấy. Từ đó xác định được giá thành của chúng. 6 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây hoa Cúc 2.1.1. Nguồn gốc cây hoa Cúc Hoa Cúc có tên khoa học là Chrysanthemum sp. (hiện nay chi Chrysanthemum còn có tên là Dendrathema). Hoa Cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc và Nhật Bản. Các nhà khảo cổ học Trung Quốc đã chứng minh rằng từ đời Khổng Tử người ta đã làm lễ thắng lợi hoa vàng (hoa Cúc) và cây hoa Cúc cũng đã đi vào các tác phẩm hội họa từ thời gian này. Ở Nhật Bản, Cúc là một loài hoa quí (Quốc hoa) thường được dùng trong các buổi lễ quan trọng. 2.1.2. Tình hình sản xuất và thƣơng mại cây hoa Cúc trên thế giới và Việt Nam Tuy cây Cúc có nguồn gốc từ lâu đời nhưng đến năm 1688 Jacob Layn người Hà Lan mới trồng phát triển mang tính thương mại ở đất nước này. Đến đầu thế kỷ 18, cây hoa Cúc là cây hoa quan trọng nhất đối với Trung Quốc, Nhật Bản. Ở Hà Lan, Cúc là cây quan trọng thứ hai sau hoa hồng. Hàng năm kim ngạch giao lưu buôn bán hoa cúc trên thị trường thế giới ước đạt tới 1,5 tỷ USD (Đặng Văn Đông, 2003). Bảng 2.1. Những nƣớc xuất khẩu và nhập khẩu hoa Cúc hàng năm Tên nƣớc Xuất khẩu (triệu USD) Nhập khẩu (triệu USD) Trung Quốc 300 200 Nhật Bản 150 200 Hà Lan 250 100 Pháp 70 110 Đức 80 50 Nga 120 Mỹ 50 70 Singapo 15 Israel 12 (Theo Đặng văn Đông, 2003). 7 Ở Việt Nam, hoa Cúc được du nhập vào từ thế kỷ 15. Đến đầu thế kỷ 19 đã hình thành các vùng chuyên canh cung cấp cho người tiêu dùng, một phần để chơi thưởng thức, một phần phục vụ việc cúng lễ và một phần dùng làm dược liệu. Hiện nay hoa Cúc có mặt ở khắp mọi nơi từ vùng núi cao đến đồng bằng, từ nông thôn đến thành thị. Các vùng trồng nhiều mang tính tập trung là Hà Nội, Thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt, và Hải Phòng. Riêng ở Đà Lạt là nơi lý tưởng cho việc trồng hoa Cúc quanh năm. Ngoài ra điều kiện khí hậu rất thích hợp cho việc sinh trưởng, phát triển của hầu hết các giống Cúc được nhập từ nước ngoài vào. Hiện nay ở Đà Lạt có trên 70 giống Cúc được trồng với mục đích cắt cành. Giống hoa Cúc hiện nay chủ yếu xuất phát từ Hà Lan và được du nhập vào Đà Lạt với nhiều hình thức khác nhau. Trong đó các công ty nước ngoài như Harfarm, Bonifarm góp một phần không nhỏ trong việc tạo sự đa dạng cho thị trường giống Cúc Việt Nam. Theo số liệu thống kê về tình hình sản xuất hoa tại thành phố Đà Lạt, cho thấy diện tích và sản lượng hoa Cúc là lớn nhất so với những loại hoa khác. Bảng 2.2. Tình hình sản xuất hoa tại thành phố Đà Lạt Chủng loại Diện tích (ha) Sản lƣợng (triệu cành) Hoa Cúc 300 120 Hoa Hồng 122 56 Hoa Cẩm Chƣớng 13,5 12 Hoa Lys Lys 12 4 (Nguồn: thông tin kinh tế-xã hội tỉnh Lâm Đồng, 2005) 2.1.3. Vị trí phân loại - Ngành : Angiospermatophyta - Lớp : Dicotyledoneae - Bộ : Asterales - Họ : Asteraceae - Chi :Chrysanthemum (Dendrathema). - Loài: Có nhiều loài, nhưng phổ biến như hoa cắt cành có thể kể là: morifolium. 8 2.1.4. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây hoa Cúc 2.1.4.1. Đặc điểm thực vật học  Rễ Rễ của Cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang, phân bố ở tầng đất mặt từ 5 – 20cm. Số lượng rễ rất lớn nên khả năng hút nước và các chất dinh dưỡng rất mạnh.  Thân Cây thuộc loại thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy. Kích thước thân cao hay thấp, to hay nhỏ, cứng hay mềm phụ thuộc từng giống và thời vụ trồng.  Lá Thường là lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻ thùy lông chim, phiến lá mềm mỏng có thể to hay nhỏ, màu sắc xanh đậm hay nhạt phụ thuộc vào từng giống. Mặt dưới phiến lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng. Trong một chu kỳ sinh trưởng tùy từng giống mà trên một thân cây Cúc có từ 30 – 50 lá.  Hoa Hoa Cúc chủ yếu ở hai dạng: - Dạng lưỡng tính: trong hoa có cả nhị đực và nhụy cái. - Dạng đơn tính: chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi có loại vô tính (không có cả nhụy, nhị). Màu sắc hoa Cúc rất khác nhau, hầu như có tất cả các màu của tự nhiên: trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, xanh. Trong đó trên mỗi bông hoa có thể có một màu duy nhất, hoặc có vài màu riêng biệt hoặc có thể có rất nhiều màu pha trộn, tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng. Tùy theo cách sắp xếp của cánh hoa mà người ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên bông) và nhóm hoa đơn (chỉ có một vòng hoa trên bông). Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắc đậm hơn. Cánh hoa có nhiều hình dáng khác nhau: có dạng cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn hoặc cánh dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong. Đường kính của bông hoa phụ thuộc vào giống. Giống hoa to có đường kính 10 – 12cm, loại trung bình 5 – 7cm và loại nhỏ từ 1 – 2cm. 9 2.1.4.2. Sinh thái cây hoa Cúc  Nhiệt độ Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng của hoa Cúc. Đa số các giống Cúc được trồng hiện nay đều ưa khí hậu mát mẻ, nhiệt độ dao động từ 15 – 200C. Bên cạnh đó có một số giống chịu nhiệt độ cao (30 – 350C). Trong thời kỳ ra hoa cần đảm bảo nhiệt độ thích hợp (cho từng loại giống Cúc) thì hoa sẽ to và đẹp.  Ánh sáng Ánh sáng có hai tác dụng chính đối với Cúc: + Ánh sáng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng phát triển của cây. Nó cung cấp năng lượng cho quá trình quang hợp tạo ra chất hữu cơ cho cây. + Ánh sáng có ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và nở hoa của Cúc. Cúc được xếp vào loại cây ngày ngắn. Thời gian chiếu sáng thời kỳ phân hóa mầm hoa tốt nhất là 10 giờ chiếu sáng/ngày. Thời gian chiếu sáng kéo dài thì sự sinh trưởng của cây hoa Cúc dài hơn, thân cây cao, lá to, hoa ra muộn, chất lượng hoa tăng. Thời gian chiếu sáng 11 giờ/ngày cho chất lượng hoa Cúc tốt nhất.  Ẩm độ Cúc là cây trồng cạn, không chịu được úng. Đồng thời là cây có sinh khối lớn, bộ lá to, tiêu hao nước nhiều nên cũng kém chịu hạn. Độ ẩm đất từ 60 – 70%, độ ẩm không khí 55 – 65% thuận lợi cho cây Cúc sinh trưởng tốt.  Đất và dinh dƣỡng - Đất: có vai trò cung cấp nước, dinh dưỡng cho sự sống của cây. Cây hoa Cúc có bộ rễ ăn nông do vậy yêu cầu đất cao ráo, thoát nước, tơi xốp. - Các chất dinh dưỡng: các loại phân hữu cơ (phân chuồng, phân vi sinh, than bùn), phân vô cơ (đạm, lân, kali) và các loại phân trung, vi lượng (Ca, Mg, Zn, Cu, Fe, Mn, Bo…) có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với sự sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng của hoa Cúc. 10 2.1.5. Phân loại 2.1.5.1. Nhóm giống cũ (1) Cúc đại đóa vàng: Cây cao 60-80cm, thân yếu, mềm, lá to, không đứng thẳng được tự nhiên mà phải có cọc đỡ. Hoa kép to đường kính 8-10cm, cánh dài hơi cong vào trong, cánh không sít vào nhau. Khả năng chịu rét kém nhưng chịu hạn tốt. Thời gian sinh trưởng rất dài 150-180 ngày, hiện nay ít trồng. (2) Cúc vàng hè Đà Lạt: Cây cao 40-50cm, thân nhỏ mảnh và cong. hoa to trung bình 4-5cm, cánh ngắn, mềm, màu vàng tươi. Nhiều lá to màu xanh vàng, chịu nóng tốt. thời gian sinh trưởng 90-120 ngày. Nhược điểm là cánh hoa mềm, tuổi thọ hoa ngắn nên giống này hiện nay ít trồng. (3) Cúc chi Đà Lạt: Cây cao 40-50cm, cây bụi, thân nhỏ cong, phiến lá to mỏng, màu xanh nhạt. Hoa đơn nhỏ, đường kính 2,0-2,5cm cánh màu trắng ở viền ngoài và hơi vàng ở giữa. Cây chịu lạnh, thời gian sinh trưởng 120-150 ngày. (4) Cúc chi trắng Đà Lạt: Cây nhỏ, dạng thân bò, phân cành nhiều, lá nhỏ màu xanh đậm. Hoa nhỏ đường kính 1-1,5cm có màu trắng, mùi thơm nhẹ. Trồng đẻ ướp chè, phơi khô làm thuốc nam. (5) Cúc chi vàng Đà Lạt: Cây giống như chi trắng, hoa màu vàng mùi thơm hắc. Trước kia người ta trồng để tạo thành cây hình cầu, trồng vào chậu chơi tết, hoặc để trồng trong các bồn hoa công viên. (6) Cúc gấm: Dạng cây bụi cao khoảng 30-40cm, khả năng phân cành rất mạnh do đó cũng dùng để tạo tán hình cầu trông giống mâm xôi. Hoa màu vàng nhạt đường kính 1,5-2,5cm. Thời gian sinh trưởng dài 120-150 ngày, khả năng chịu rét kém. (7) Cúc họa mi: Cây cao 45-50cm khả năng phân cành mạnh. Hoa đơn nhỏ, đường kính hoa 3-4cm, cánh dài, chiều rộng cánh nhỏ, màu trắng nhạt. Thời gian sinh trưởng dài 5-6 tháng. Khả năng chịu rét kém (8) Cúc kim tử nhung: Cây cao 55-60cm, thân cứng lá to, dài, răng cưa sâu, có màu xanh đậm. Hoa màu vàng nghệ pha đỏ nâu, đường kính hoa to 8-10cm. Thời gian sinh trưởng dài, chịu rét tốt. (9) Cúc tím hoa cà: Cây cao 50-60cm, thân cứng. Hoa to 8-10cm, cánh xếp chồng lên nhau cuốn cong vào phần giữa, hoa màu hoa cà, chịu rét tốt. Thời gian sinh trưởng dài 110-130 ngày. 11 (10) Cúc đỏ tiết dê: Cây cao 50-60cm, thân cứng. Hoa to đường kính 8-12cm, màu đỏ tiết dê cánh hẹp dài uốn cong vào phía giữa hoa. 2.1.5.2. Nhóm giống mới nhập nội (11) Cúc vàng Đài Loan: Được chọn lọc từ tập đoàn Cúc nhập nội của Đài Loan năm 1994. Cây cao 70-80cm, lá xanh đậm, phiến lá dày, thân mập thẳng, cứng. Hoa kép to có nhiều tầng xếp rất chặt, đường kính hoa 10-12cm, hoa màu vàng nghệ, rất bền (10-12 ngày ). Thời gian sinh trưởng 120-150 ngày, thích hợp với vụ mùa thu đông. (12) Cúc CN 93: Được nhập nội từ Nhật Bản về Việt Nam năm 1993, nhiều năm liền được thị trường ưa chuộng. Cây cao trung bình 60-70cm, cứng, mập thẳng, lá xanh to. Hoa kép, màu vàng, đường kính 10-12cm, cánh dày xếp sít chặt nhau, hoa bền, thời gian cắm lọ 10-15 ngày. Thời gian sinh trưởng ngắn 90-110 ngày, chịu nhiệt tốt có thể trồng nhiều thời vụ trong năm, nhưng thích hợp nhất là vụ xuân hè và hè thu (tháng 4-tháng 11). (13) Cúc CN 97: Được nhập nội từ Nhật Bản. Cây cao từ 55-65cm, cây to mập, lá xanh dày. Hoa kép màu trắng sữa, cánh dày đều xếp chặt vào nhau, đường kính hoa 10-12cm, Thời gian sinh trưởng 90-110 ngày, chịu rét. (14) Cúc CN 98: Được nhập nội từ Nhật Bản.Cây cao thẳng từ 60-70cm, lá xanh đậm. Hoa to, đường kính trung bình 8-10cm, màu vàng chanh. Thời gian sinh trưởng 80-90 ngày, chịu nóng, là một trong những giống chủ lực của mùa hè hiện nay. (15) Cúc CN 42: Được Viện Di Truyền Nông Nghiệp nhập từ Hà Lan về năm 2001. Giống có đặc điểm cây cứng, lá xanh bóng, chiều cao trung bình 70-80cm. Hoa màu trắng trong. Thời gian sinh trưởng 90-95 ngày, phù hợp với thời vụ đông. (16) Cúc CN 45: Được nhập cùng giống CN 42, cây cao trung bình 70-80cm. Cánh hoa bên ngoài màu trắng, cánh bên trong hơi vàng, đường kính hoa 7-10cm. Thời gian sinh trưởng 90-100 ngày, thích hợp với vụ đông. (17) Cúc CN 44: được nhập cùng giống CN 42, CN 45, cây cao 85-90cm, lá hình lông chim hẹp, hoa màu vàng đậm, đường kính 9-11cm. thời gian sinh trưởng 90-95 ngày, thích hợp trồng trong vụ đông. Ngoài các giống chính trên còn có rất nhiều giống khác đang được trồng ở Hà Nội và các tỉnh phía Bắc. Tên gọi của chúng được mô tả theo đặc điểm hoa, màu sắc, 12 nguồn gốc hoặc do các tác giả đặt tên. Ví dụ như: cánh sen, vàng nhị nâu, đỏ cờ, da hồng, tím Huế, tím lồi to, tím lồi con, trắng xanh, lồi xanh, vàng Tầu, chi trắng Hà Lan, chi vàng Hà Lan, tím sen, tím xoáy, tím hè, ánh vàng, ánh bạc, đầu đỏ, đầu vàng, CN40, Cn41, HL1…Bộ giống phong phú này luôn đáp ứng thị hiếu của người chơi hoa và những người muốn sưu tập về hoa Cúc. Hình 2.1. một số loài hoa Cúc 2.1.6. Các phƣơng pháp nhân giống cây hoa Cúc 2.1.6.1. Phƣơng pháp nhân giống cổ điển a) Mầm giá Mầm giá là những mầm non mọc lên từ rễ, phát sinh chung quanh gốc cây mẹ. mầm giá phát sinh nhiều hay ít tùy giống, đất đai và điều kiện chăm sóc. Mầm giá thường đảm bảo tính chất của cây mẹ, cho hoa to nhưng không đều. 13 Mầm giá thường to khỏe nên khả năng sinh trưởng, phát triển mạnh, cho hoa tốt nhưng thời gian cho hoa lâu hơn so với giâm cành. Trong thực tế sản xuất quy mô nhỏ, ta có thể tăng số lượng bằng cách tách mầm từ những cây Cúc có nhiều mầm chồi phát sinh quanh gốc. b) Giâm cành Đây là biện pháp kỹ thuật đơn giản đang được sử dụng phổ biến. Muốn có cành giâm tốt phải chuẩn bị vườn cây nguyên liệu (cây mẹ). Hệ số nhân Cúc theo phương pháp này đạt từ 15 – 20 lần tức là để trồng từ 15 – 20 ha cần phải có 1 ha vườn cây mẹ. 2.1.6.2. Nhân giống Cúc bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô Đây là phương pháp khoa học và hiện đại, phục vụ cho sản xuất với quy mô công nghiệp lớn. Ưu điểm của phương pháp này là hệ số nhân giống rất cao, từ một bộ phận của cây hoa Cúc sau 1 năm có thể cho ra đời từ 40 – 60 tỷ cây (Đặng Văn Đông, 2003). Các cây này đều sạch bệnh, chất lượng tương đối đồng đều và đồng nhất về mặt di truyền. Nuôi cấy mô hoa Cúc đã được thực hiện từ cuối những năm 1960 với mục đích làm tăng nhanh tốc độ nhân giống hơn với cách giâm cành cổ điển, tạo được dòng sạch bệnh vi rút, gây giống đột biến và dự trữ giống. 2.2. Phƣơng pháp nhân giống vô tính in vitro 2.2.1. Khái niệm Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. 14 2.2.2. Lịch sử phát triển Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thảo (cây một lá mầm) một loại cây khó thực hiện và ông bị thất bại. Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn, mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum). Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất kích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin. Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện. Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về tỷ lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá. Từ năm 1954, đến năm1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm 1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá. 15 2.2.3. Sự phát triển và thành tựu của nuôi cấy mô ở Việt Nam Sau ngày đất nước hoàn toàn giải phóng, chính phủ ta đã đầu tư về tài chính và con người nhằm phát triển các ngành khoa học nói chung và ngành sinh học nói riêng, trong đó có nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật được xây dựng tại Viện Công Nghệ Sinh Học (Viện Khoa Học Việt Nam), Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh, Phân Viện Sinh Học tại Đà Lạt, Viện Khoa Học Nông Ngiệp, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, Đại Học Nông Nghiệp I, Viện Lâm Nghiệp, Ở một số tỉnh, thành phố cũng bắt đầu xây dựng phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiệm vụ của các phòng thí nghiệm này là xây dựng và phát triển các phương pháp nghiên cứu, đồng thời tổ chức những hướng nghiên cứu ứng dụng phù hợp với điều kiện trang thiết bị ở Việt Nam và đã thu được những kết quả quan trọng như: vi nhân giống dứa, khoai tây, hoa hồng, cúc, cẩm chướng (Viện Công Nghệ Sinh Học), nhân giống chuối, hoa lan (Phân Viện Sinh Học tại Đà Lạt, Đại Học Nông Nghiệp I), nhân giống bạch đàn (Viện lâm Nghiệp) …. Đặc biệt là các kết quả nuôi cấy bao phấn lúa và thuốc lá, nuôi cấy tế bào trần của thuốc lá và khoai tây ở Viện Sinh Học và Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh. Bằng Việc ứng dụng kỹ thuật lai hữu tính và nuôi cấy túi phấn trên cây lúa, các tác giả Đoàn Thị Ái Thuyên, Phan Xuân Thanh, Lê Đình Hùng đã tạo được 15 dòng lúa đơn bội kép. Trong đó có một số dòng kết hợp được nhiều tính trạng mong muốn như: chín sớm, năng suất cao, kháng rầy nâu, chịu phèn, chịu mặn,…Các dòng lúa này đều được trồng ở xã Thanh Lộc (ngoại thành phố Hồ Chí Minh) và được theo dõi nhân lên ở một số địa phương khác phục vụ cho công tác nhân giống trên diện rộng. 2.2.4. Ứng dụng của lĩnh vực nuôi cấy mô Trước kia, người ta dùng phương pháp nuôi cấy mô tế bào để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự phân chia, sự di truyền, và tác dụng của các hóa chất đối với tế bào và mô trong quá trình nuôi cấy. Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô thực vật đã hướng về những ứng dụng thực tiễn. Các nhà thực vật học đã áp dụng phương pháp này với mục đích sau:  Tạo một quần thể cây trồng lớn và đồng nhất trong một thời gian ngắn, với diện tích thí nghiệm nhỏ, có điều kiện hóa lý kiểm soát. 16  Tạo được nhiều cây con từ mô và cơ quan của cây (lóng, thân, phiến lá, hoa, hạt phấn…) mà ngoài thiên nhiên không thực hiện được.  Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh.  Cải tiến các giống cây trồng bằng công nghệ sinh học.  Bảo quản nguồn gen quý. 2.3. Phƣơng pháp nuôi cấy mô truyền thống 2.3.1. Các nhân tố môi trƣờng in vitro 2.3.1.1. Nhân tố môi trƣờng trên không Nhân tố môi trường trên không gồm những nhân tố sau: - Nhiệt độ: cao, thấp, trung bình, khác nhau giữa giai đoạn tối và giai đoạn sáng và thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy. - Ánh sáng: quang phổ, thời gian chiếu sáng/tối, PPF và hướng chiếu sáng. - Không khí: CO2, O2, ethylene, hơi nước và các khí khác. 2.3.1.2. Nhân tố môi trƣờng vùng rễ  Nhân tố vật lý Nhân tố vật lý bao gồm những nhân tố sau: nhiệt độ, nước, thế thẩm thấu, khả năng khuyết tán của chất khí và chất lỏng, độ rắn, dày hay tính chắc của môi trường, chất liệu làm giá thể và thể tích vùng rễ.  Nhân tố hóa học Nhân tố hóa học gồm những nhân tố sau: - Chất khoáng: nồng độ, tỷ lệ hiện diện và mất đi, tỷ lệ tương đối và tính tan của các ion. - Các thành phần hữu cơ: đường, chất điều hòa tăng trưởng, chất tạo gel, vitamin và những chất khác. - pH. - Oxi hòa tan và các khí khác. - Tính khuyết tán và tiêu hao ion.  Nhân tố sinh học Nhân tố sinh học gồm: sinh vật cạnh tranh và xâm nhiễm, vi sinh vật cộng sinh và chất thải từ đối tượng nuôi cấy (thành phần tế bào và enzyme). 17 Những nhân tố môi trường trên khoảng không và môi trường vùng rễ là môi trường in vitro trên và dưới mặt thạch. Cơ chế của sự thay đổi môi trường in vitro giống như sự thay đổi môi trường trong vườn ươm cây. Nên môi trường in vitro là môi trường của vườn ươm cây thu nhỏ (Read, 1990). 2.3.2. Đặc tính môi trƣờng in vitro Bảng 2.3. Những đặc tính của môi trƣờng in vitro Nhân tố môi trƣờng in vitro Trạng thái thay đổi Mức độ thay đổi Môi trƣờng không khí - Độ ẩm cao. - Nhiệt độ không khí ổn định - Nồng độ CO2 thấp khi có ánh sáng và cao trong tối. - Nồng độ C2H4 cao. - Mức độ hô hấp thấp. - Mức độ quang hợp thấp. - Mức độ hô hấp trong tối cao. - Điện tử trong quang hợp thấp. - Năng lượng chiếu sáng thấp. - Không có sự cân bằng CO2. Môi trƣờng vùng rễ - Nồng độ đường cao. - Nồng độ muối cao. - Hàm lượng O2 hòa tan thấp. - Hàm lượng phenol, độc tố cao. - Mật độ vi sinh vật thấp. - Hàm lượng chất sinh trưởng cao. - Mức độ hấp thu nước thấp. - Mức độ hấp thu ion thấp. - Mức độ hấp thu đường thấp. - Mức độ vận chuyển các chất thành phần môi trường thấp. (Theo Trần Văn Minh, 2003) Điều được ghi nhận ở đặc tính môi trường in vitro là: hàm lượng dinh dưỡng và năng lượng thấp hơn môi trường bán kính, có nhiệt độ và ẩm độ ổn định, có sự thay đổi về hàm lượng CO2, nồng độ đường cao và không có vi sinh vật gây hại. Những đặc tính này ít thấy trong tự nhiên, nông nghiệp và lâm nghiệp. 2.3.3. Những vấn đề trong kiểm soát môi trƣờng in vitro Cây sống ở môi trường in vitro có sự khác biệt rất lớn so với cây sống ngoài môi trường tự nhiên. Môi trường in vitro truyền thống đã được Kozai và cộng sự (1992) mô tả như sau: độ ẩm tương đối cao, nhiệt độ ổn định, sự chênh lệch lớn của nồng độ CO2 giữa thời gian tối và thời gian sáng, sự hiện diện của đường, muối và chất điều hòa tăng trưởng trong môi trường ở nồng độ cao, sự tích lũy khí ethylene và 18 những chất độc khác, không có sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy. Những điều kiện trên thường ngăn sự thoát hơi nước, sự quang hợp, sự hấp thu nước, chất khoáng, CO2 và thúc đẩy sự hô hấp trong tối. Kết quả dẫn đến sự sinh trưởng nghèo nàn của mẫu cấy. Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng nuôi cấy mô theo phương pháp truyền thống (bình nuôi cấy được đậy nắp kín cùng với việc sử dụng đường, vitamin, và các chất điều hòa sinh trưởng) có ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cấy mô trong giai đoạn in vitro cũng như ngoài vườn ươm. Điển hình như cây con in vitro sinh trưởng chậm, xuất hiện biến dị hình thái và chất lượng, mẫn cảm với stress ở giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm. Trong nuôi cấy mô truyền thống thì đường được xem như nguồn carbon duy nhất cho sự phát triển của cây con in vitro. Đường hiện diện trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng không tốt đến tốc độ quang hợp của cây. Các nghiên cứu sinh hóa đã chứng minh rằng đường kìm hãm hoạt động của enzyme rubisco. Sự kém hoạt động của rubisco cũng có nghĩa là cường độ quang hợp của cây in vitro thấp (Hdider và Desjarding, 1994). Ngoài ra việc sử dụng đường trong môi trường của cây invtro rất hạn chế. Theo kết quả nghiên cứu của Kozai và Iwanami (1988) thì lượng đường được cây hấp thụ chỉ ở vào khoảng 2 – 8% lượng đường có trong môi trường, điều này gây sự lãng phí trong sản xuất. Sự có mặt của đường ở nồng độ cao là nguyên nhân của sự gia tăng áp suất thẩm thấu của môi trường, làm trở ngại quá trình hấp thu nước và muối khoáng của rễ. Đường và vitamin còn là chất hữu cơ thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật. Các nghiên cứu và trong thực tế đã chứng minh rằng sự hiện diện của đường và vitamin trong môi trường nuôi cấy làm tỷ lệ nhiễm nấm và khuẩn cao, dẫn đến chi phí sản xuất và giá thành sản phẩm tăng. Ngoài ra việc sử dụng các loại hộp kín, các bình tam giác đậy bằng nút cao su hay giấy bạc đã làm cho độ ẩm trong bình nuôi cấy thường cao hơn 95% (Fujiwara và Kozai, 1995). Độ ẩm cao làm cho tốc độ thoát hơi nước của các khí khổng kém. Độ ẩm cao làm giảm tích lũy chất khô và gây nên mất trật tự về sinh lý và cấu trúc hình thái (hiện tượng thủy tinh thể). Các cây này sẽ bị mất nước nhanh chóng khi đưa ra khỏi ống nghiệm, kết quả là tỷ lệ cây chết cao trong giai đoạn thuần hóa sau ống nghiệm. 19 Trong khi đó cây nuôi cấy in vitro trong điều kiện ẩm độ thấp giảm được sự mất nước quá độ từ lá và chống lại stress do mất nước khi chuyển trực tiếp từ ống nghiệm ra vườn ươm hay đồng ruộng (Tanaka và các cộng sự, 1992). Sự kém thông thoáng của hộp nuôi cấy còn ảnh hưởng đến thành phần không khí trong hộp. Ngay sau khi bật đèn, nồng độ CO2 trong ống nghiệm giảm xuống rất nhanh do hoạt động quang hợp của cây cấy mô. Vì vậy trong suốt thời gian chiếu sáng, cây trong ống nghiệm ở trạng thái đói CO2 trầm trọng, nên chúng phải sử dụng đường của môi trường (Nguyễn Văn Uyển, 1996). Cùng với sự giảm nồng độ CO2 là sự gia tăng tích tụ khí ethylen (C2H4). Ethylen được biết đến như là một chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Tuy nhiên ở nồng độ cao ethylen là một chất độc đối với cây. Nồng độ ethylen trong hộp nuôi cấy tăng dần theo thời gian đến nồng độ 2 μmol mol-1 từ 21 đến 60 ngày sau khi cấy (Nguyễn và Kozai, 1998). Nồng độ ethylen thường tăng cao trong các hộp nuôi cấy kém thông thoáng (De Proft và các cộng sự, 1985). Thông thường ánh sáng được sử dụng trong phòng nuôi cấy mô chỉ ở vào khoảng 30 – 50 μmol m-2 s-1. Cường độ ánh sáng này thấp hơn nhiều so với điều kiện tự nhiên. Việc sử dụng cường độ ánh sáng thấp đã làm giảm khả năng quang hợp, dẫn đến việc cây không sử dụng có hiệu quả nguồn carbon từ CO2 mà phải tăng cường dị dưỡng bằng cách hấp thu carbon từ đường trong môi trường nuôi cấy. Trong nuôi cấy mô truyền thống, agar được sử dụng rất phổ biến như là một giá thể để cố định mẫu cấy. Hệ rễ có thể phát triển được trong môi trường agar, tuy nhiên chúng rất mỏng manh, dễ gãy và hư hại khi chuyển ra bầu đất (Roberts và Smith, 1990; Robert và các cộng sự, 1994). Sự phát triển kém của hệ rễ một phần bởi sự kém thông thoáng và sự kém oxygen hòa tan trong môi trường thạch (Fujiwara và Kozai, 1995). Các nghiên cứu đã chứng minh việc thay thế agar trong môi trường nuôi cấy bằng các giá thể xốp như vermiculite, perlite, Florialite đã tạo điều kiện thông thoáng hơn cho sự phát triển hệ rễ (Kozai và các cộng sự, 1996; Nguyễn và Kozai, 1998; Nguyễn và các cộng sự, 1999). Vì vậy mặc dù ứng dụng của vi nhân giống trong các lĩnh vực làm vườn, nông nghiệp, lâm nghiệp đang rộng khắp thế giới, nhưng tính chất thương mại hóa của nó vẫn còn hạn chế bởi chi phí sản xuất cao và lợi nhuận thấp (Niu và Kozai, 1998). 20 2.4. Giới thiệu về các hệ thống nuôi cấy trên thế giới Hệ thống nuôi cấy được cải tiến không ngừng để thuận tiện cho việc sử dụng và nâng cao chất lượng của cây cấy mô. Năm 1897, lần đầu tiên Loed đã sử dụng hệ thống nuôi cấy bằng ống nghiệm. Tuy nhiên hệ thống nuôi cấy này có rất nhiều nhược điểm. Kỹ thuật nuôi cấy trong bình tam giác đã được Carrel phát triển vào năm 1923. Sau thành công này, nhiều hệ thống nuôi cấy đã được thử nghiệm như: bình ống, Erlenmeyer, bình Roux hay đĩa petri (Willmer, 1966). Hiện nay những loại bình này vẫn còn được sử dụng trong vi nhân giống. Ngoài các cải tiến về kiểu dáng, vật liệu dùng thiết kế hệ thống cũng không ngừng thay đổi: thủy tinh, polypropylene, polyvinylglycine và polycarbonate (Zobayed và cộng sự, 2000). Hiện nay những cải tiến của bình Magenta, được thiết kế đặc biệt để tăng cường sự thoáng khí của không gian trong bình. Song song với sự phát triển các loại bình nuôi cấy, khoa học kỹ thuật ngày càng tiến bộ đã tạo ra được nhiều vật liệu khác nhau phục vụ cho việc cải tiến các hệ thống nuôi cấy như màng thoáng khí Milliseal. Hệ thống film thoáng khí chứng tỏ có nhiều ưu điểm vượt trội so với các hệ thống cũ. tuy nhiên, giá thành của hệ thống này còn quá cao do sử dụng vật liệu đắt tiền (Tetrafluoroethylene perfluoroalkyl vinyl ether copolymer hoặc Tetrafluoroethylene hexafluoropropylene copolymer ). Do đó, khó có thể ứng dụng thương mại trong điều kiện ở Việt Nam. Hầu hết các phòng nuôi cấy mô ở Việt Nam thường sử dụng bình thủy tinh trong nuôi cấy in vitro. Gần đây, những nghiên cứu trong việc sử dụng túi nylon đã chứng tỏ được tính ưu Việt trong việc tiết kiệm chi phí trong nhân giống cây in vitro. Hệ thống túi nylon đang ngày càng được sử dụng rộng rãi, và dần thay thế bình thủy tinh trong các phòng nuôi cấy mô ở nước ta. 2.5. Phƣơng pháp vi nhân giống quang tự dƣỡng Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đẩy mạnh nghiên cứu trong thập niên 90. Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu thành công trong việc ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất giống cây trồng. 21 Phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp truyền thống. Nó thúc đẩy sự tăng trưởng của cây in vitro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và làm hạ giá thành cây in vitro. Phương pháp mới này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (ion, sự khuyết tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây con trong bình nuôi cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, ẩm độ, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy…) thay vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy như nồng độ đường, muối khoáng, vitamin hay các chất điều hòa sinh trưởng thực vật mà các nhà nuôi cấy mô vẫn thường quan tâm. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, đường không được sử dụng trong môi trường nuôi cấy. Nói đúng hơn là không sử dụng các cơ chất hữu cơ bao gồm cả các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, aminoacid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi trường (Nguyễn và Kozai, 1998). Điều này dựa trên cơ sở trong tự nhiên tất cả các cây xanh chứa diệp lục tố điều có khả năng tự quang hợp để tồn tại và phát triển. Tất cả các cơ quan dùng trong nuôi cấy mô có diệp lục tố đều có khả năng quang hợp. Chúng có thể nhận CO2 trong không khí làm nguồn carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường và vitamin trong quá trình nuôi cấy (Kozai, 1991). Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO2 có sẵn trong không khí làm nguồn carbon chính cho quá trình tăng trưởng và phát triển của cây. Sự loại bỏ đường trong môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm. Điều này đem lại ý nghĩa rất lớn trong sản xuất vì chi phí công lao động sẽ giảm đáng kể song song với việc giảm nguyên vật liệu. Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứa cây cấy mô được xem như một nhà kính thu nhỏ. Với phương pháp này sự tăng trưởng và phát triển của cây in vitro phần lớn chịu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ, nồng độ CO2, sự trao đổi khí. Nồng độ CO2 và ánh sáng là hai yếu tố quan trong nhất trong nuôi cấy mô quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tố (Kozai, 1996). Sự gia tăng khác biệt 22 giữa nồng độ CO2 bên trong và bên ngoài hộp nuôi cấy cùng với sự gia tăng cường độ ánh sáng làm cho hiệu suất quang hợp tăng (Kozai, 1996). 2.6. Các ứng dụng trong và ngoài nƣớc về nuôi cấy quang tự dƣỡng 2.6.1. Ở trong nƣớc Từ năm 1996 đến nay, Viện sinh học nhiệt đới đã tập trung nghiên cứu nuôi cấy mô quang tự dưỡng trên các đối tượng như: cà phê (C. arabusta), hông (Paulownia fortunei), neem (Azadirachta indica), lõi thọ (Gmelina arborea Roxb.), tre tầm vông (Thyrsostachys siamensis), bạch đàn (Eucalyptus tereticornis), xoan Ấn Độ (Azadirachta indica A. Juss), nho (Vitis vinifera L.), lan Dendrobium... Các thí nghiệm đã chứng minh các cây in vitro phát triển tốt trên môi trường nuôi cấy không có đường, vitamin và độ thoáng khí của bình nuôi cấy cao. Tỷ lệ nhiễm nấm, khuẩn giảm đáng kể (2 – 0%), ngược với phương pháp nuôi cấy truyền thống trên môi trường có đường và vitamin (tỷ lệ nhiễm lên tới 10 % trên tổng số cây nuôi cấy ban đầu). Cây có diện tích lá lớn hơn và sự đóng mở của khí khổng ở mặt dưới lá theo quy luật của tự nhiên ngay khi gặp điều kiện thay đổi của môi trường. Trong khi đó cây nuôi theo điều kiện truyền thống (có đường và vitamin) có diện tích lá nhỏ, khí khổng luôn ở trạng thái mở trong nhiều giờ khi chuyển từ điều kiện in vitro ra vườn ươm. Tỷ lệ cây sống 95-100 % sau 1 tháng ở vườn ươm đối với cây nuôi cấy trên môi trường không đường, trái lại chỉ từ 70-80 % theo phương pháp truyền thống. Kết quả đạt được của những nghiên cứu trên là tạo ra các cây cấy mô có chất lượng cao, tăng trưởng nhanh do rút ngắn thời gian nuôi cấy in vitro. Đồng thời tỷ lệ cây chết trong giai đoạn vườn ươm thấp dẫn đến việc giảm chi phí chăm sóc khi đưa cây ra vườn ươm (Nguyễn Thị Quỳnh, 2005). 2.6.2. Ở nƣớc ngoài Đã tiến hành nghiên cứu trên cây dâu tây (Fujiwara và các cộng sự, 1988), lan Cymbidium (Heo và các cộng sự, 1996), cẩm chướng (Jeong và các cộng sự, 1996), khoai tây, khoai lang (Heo và Kozai, 1999), cà phê (Afreen và các cộng sự, 2002). 23 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công Nghệ Sinh Học thuộc Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt từ ngày 20/03/2006 – 14 /08/2006. 3.2. Vật liệu thí nghiệm 3.2.1. Thiết bị và dụng cụ 3.2.1.1. Thiết bị - Cân điện tử, máy đo pH, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh, máy cất nước, tủ cấy vô trùng. 3.2.1.2. Dụng cụ Pince, dao cấy, kéo, túi nylon, đèn cồn, vỉ xốp nuôi cấy. 3.2.1.3. Mẫu cấy Mẫu cấy là giống Cúc D3 do phòng Công Nghệ Sinh Học – Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà Lạt cung cấp. 3.2.2. Điều kiện nuôi cấy 3.2.2.1. Đối với thí nghiệm dùng ánh sáng đèn - Nhiệt độ phòng sáng :25 ± 2 oC. - Quang kỳ: 16 giờ/ngày. - Cường độ chiếu sáng: 2500 lux. - Độ ẩm trung bình: 75 – 80 %. 3.2.2.2. Đối với thí nghiệm dùng ánh sáng tự nhiên - Nhiệt độ: 18 – 19 oC. - Độ ẩm 80 – 85 %. - Ánh sáng: sử dụng ánh sáng tán xạ. - Lượng mưa trung bình 1800 – 2000mm/năm. - Thắp bổ sung một bóng đèn có công suất 18W trong 4 giờ, khoảng cách từ đèn đến mẫu cấy là 1,8m. 24 3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy Các thí nghiệm được thực hiện sử dụng môi trường muối khoáng tổng hợp theo Murashige và Skoog (1962), viết tắt là (MS), có bổ sung hoặc không bổ sung đường và vitamin. 3.3. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.3.1. Bố trí thí nghiệm Các mẫu Cúc được dòng hóa vô tính trên môi trường MS cơ bản. Sau 21 ngày nuôi cấy, sử dụng các chồi ngọn cao khoảng 2cm dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm. Các kết quả thí nghiệm được ghi nhận sau 21 ngày. Các thí nghiệm đều được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Nếu giữa các nghiệm thức của các thí nghiệm có sự khác biệt ở mức 0,05 hoặc 0,01 thì dùng trắc nghiệm LSD hoặc Ducan để phân hạng. 3.3.1.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của sự thông khí đối với sự sinh trƣởng phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng Thí nghiệm gồm 25 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bịch, cấy 4 mẫu/bịch. - Tổng số bịch thí nghiệm: 225 - Tổng số mẫu: 900.  Vật liệu thí nghiệm: túi nylon (12cm  18cm); giá thể đất sạch (bán sẵn trên thị trường), môi trường MS không bổ sung đường và vitamin, ánh sáng đèn (viết tắt là MS khoáng). 25 Bảng 3.1. Mô tả thí nghiệm 1 Nghiệm thức Ký hiệu Loại giấy Số lỗ Số lớp Kích thƣớc lỗ (cm) 1 ĐC 0 0 0 0 2 A111 A4 1 1 1 3 3 A112 A4 1 1 2 3 4 A121 A4 1 2 1 3 5 A122 A4 1 2 2 3 6 A131 A4 1 3 1 3 7 A132 A4 1 3 2 3 8 A211 A4 2 1 1 3 9 A212 A4 2 1 2 3 10 A221 A4 2 2 1 3 11 A222 A4 2 2 2 3 12 A231 A4 2 3 1 3 13 A232 A4 2 3 2 3 14 B111 Báo 1 1 1 3 15 B112 Báo 1 1 2 3 16 B121 Báo 1 2 1 3 17 B122 Báo 1 2 2 3 18 B131 Báo 1 3 1 3 19 B132 Báo 1 3 2 3 20 B211 Báo 2 1 1 3 21 B212 Báo 2 1 2 3 22 B221 Báo 2 2 1 3 23 B222 Báo 2 2 2 3 24 B231 Báo 2 3 1 3 25 B232 Báo 2 3 2 3 26 3.3.1.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy và tác dụng của ánh sáng lên sự phát triển của cây Cúc in vitro Thí nghiệm gồm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. - Yếu tố 1: Phương pháp nuôi cấy: dị dưỡng, quang tự dưỡng - Yếu tố 2: Ánh sáng: đèn, tự nhiên. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bịch, cấy 4 mẫu/bịch. - Tổng số bịch thí nghiệm: 36 - Tổng số mẫu: 144.  Vật liệu thí nghiệm - Túi nylon (12cm  18cm). - Ở phương pháp nuôi cấy dị dưỡng: dùng môi trường MS có bổ sung đường, vitamin (MS cơ bản); Giá thể agar; Bịch không có lỗ thông khí. - Ở phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng: dùng môi trường MS không bổ sung đường, vitamin (MS khoáng); Giá thể đất sạch; Bịch có 1 lỗ thông khí (kích thước 1  3cm, dán 2 lớp giấy báo). Bảng 3.2. Mô tả thí nghiệm 2 Nghiệm thức Ký hiệu Phương pháp nuôi cấy Ánh sáng 1 DĐ dị dưỡng đèn 2 DT dị dưỡng tự nhiên 3 QĐ quang tự dưỡng đèn 4 QT quang tự dưỡng tự nhiên 3.3.1.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hƣởng của giá thể đối với sự phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng - Giá thể: Agar, cát, dớn, xơ dừa, đất sạch, giấy báo, giấy vệ sinh. - Thí nghiệm gồm 8 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bịch, cấy 4 mẫu/bịch. - Tổng số bịch thí nghiệm - Tổng số mẫu: 60 27  Vật liệu thí nghiệm - Túi nylon (12cm  18cm, dán 2 lớp giấy báo, 1 lỗ, kích thước lỗ 1cm  3cm), môi trường MS. Bảng 3.3. Mô tả thí nghiệm 3 Nghiệm thức Ký hiệu Giá thể Nồng độ đường (g/l) 1 ĐC Agar 30 2 A Agar 0 3 C Cát 0 4 D Dớn 0 5 X Xơ dừa 0 6 Đ Đất sạch 0 7 B Giấy báo 0 8 V Giấy vệ sinh 0 3.3.1.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của kích cở bịch nuôi cấy đối với sự phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng - Kích cở bịch: 11cm  18cm, 14cm  18cm, 20cm  30cm. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bịch, cấy 4 mẫu/bịch. - Tổng số bịch thí nghiệm: 27 - Tổng số mẫu: 108  Vật liệu thí nghiệm - Túi nylon (có 1 lỗ thông khí, kích thước 1cm  3cm, dán 2 lớp giấy báo) - Môi trường MS khoáng; Giá thể đất sạch; Ánh sáng tự nhiên. Bảng 3.4. Mô tả thí nghiệm 4 Nghiệm thức Ký hiệu Kích cở bịch 1 S11 11cm  18cm 2 S14 14cm  18cm 3 S20 20cm  30cm 28 3.3.1.5. Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp quang tự dƣỡng trong sản xuất giống Cúc đại trà Thí nghiệm gồm 2 yếu tố được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. - Yếu tố 1: kích thước lỗ: 0cm, 10cm  3cm, 15cm  3cm, - Yếu tố 2: số lượng lỗ: 0 lỗ, 1 lỗ, 2 lỗ. Thí nghiệm gồm 7 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 mẫu. Tổng số mẫu: 210  Vật liệu thí nghiệm - Túi nylon. - Môi trường MS khoáng cơ bản; giá thể đất sạch; ánh sáng tự nhiên. Bảng 3.5. Mô tả thí nghiệm 5 Nghiệm thức Ký hiệu Số lỗ Kích thƣớc lỗ Kích cở bịch Phƣơng pháp nuôi cấy 1 ĐC 1 0 0 12cm  18cm dị dưỡng 2 ĐC 2 1 1cm  3cm 12cm  18cm quang tự dưỡng 3 P0-0 0 0 60cm  100cm quang tự dưỡng 4 P1-10 1 10cm  3cm 60cm  100cm quang tự dưỡng 5 P1-15 1 15cm  3cm 60cm  100cm quang tự dưỡng 6 P2-10 2 10cm  3cm 60cm  100cm quang tự dưỡng 7 P2-15 2 15cm  3cm 60cm  100cm quang tự dưỡng 3.3.1.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy đối với sự phát triển của cây hoa Cúc ở giai đoạn vƣờn ƣơm Phương pháp nuôi cấy: dị dưỡng, quang tự dưỡng. Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức được lặp lại 4 lần, mỗi lần 10 cây. Tổng số cây thí nghiệm: 80 cây. 29 Bảng 3.6. Mô tả thí nghiệm 6 Nghiệm thức Nguồn gốc phƣơng pháp nuôi cấy Kích cở bịch 1 dị dưỡng 12cm  18cm 2 quang tự dưỡng 60cm  100cm 3.3.1. Các chỉ tiêu theo dõi 3.3.2.1. Các thí nghiệm 1, 2, 3, 4, 5: Sau 18 – 21 ngày nuôi cấy, quan sát và ghi nhận sự sinh trưởng, phát triển của cây in vitro qua các chỉ tiêu: gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô, chiều cao cây, kích thước lá, số rễ.  Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) Gia tăng trọng lượng tươi = trọng lượng tươi cuối cùng – trọng lượng tươi ban đầu. - Trọng lượng tươi ban đầu: cắt các chồi ngọn có kích thước đồng đều ở trong tủ cấy vô trùng. Rồi đưa các chồi ngọn này vào túi nylon vô trùng, cân bằng cân phân tích. Sau khi cấy các chồi ngọn này vào các bịch thí nghiệm, tiếp tục cân lại bịch vô trùng. Từ đó có thể tính được trọng lượng của tổng các mẫu cấy và trọng lượng tươi trung bình ban đầu của từng mẫu. - Trọng lượng tươi cuối cùng: dùng pince gắp các cây ở mỗi lần lặp lại ra khỏi bịch. Sau đó rửa bộ rễ vào trong nước sạch để hạn chế đến mức thấp nhất sự bám dính của giá thể vào bộ rễ. Dùng giấy thấm để thấm khô lượng nước còn bám vào bộ rễ rồi cân bằng cân phân tích. Từ đó tính được trọng lượng tươi trung bình cuối cùng của mỗi cây ở từng lần lặp lại. Gia tăng trọng lượng tươi cho ta biết sự gia tăng sinh khối tươi của cây.  Gia tăng trọng lượng khô (mg/cây) Gia tăng trọng lượng khô = trọng lượng khô cuối cùng - trọng lượng khô ban đầu. - Trọng lượng khô ban đầu: lấy 12 chồi ngọn (3 lần lặp lại, mỗi lần 4 mẫu) có kích thước tương đương nhau, cho vào tủ sấy ở nhiệt độ 70 oC trong 72 giờ. Sau đó lấy ra cân nhanh bằng cân phân tích. Từ đó tính được trọng lượng khô trung bình ban đầu của từng mẫu. 30 - Trọng lượng khô cuối cùng: lấy các cây ở từng lần lặp lại, sấy khô tương tự như trên và cân bằng cân phân tích. Từ đó tính được trọng lượng khô trung bình cuối cùng của mỗi cây ở từng lần lặp lại. Gia tăng trọng lượng khô cho biết khả năng tích lũy sinh khối hữu cơ của cây.  Chiều cao cây (mm/cây) Dùng thước đo chiều cao cây từ gốc đến ngọn. Chỉ tiêu chiều cao cây đánh giá sức phát triển của cây.  Kích thước lá (mm/lá) Dùng thước đo bề ngang mép lá, của lá thành thục thứ hai (tính từ ngọn). Kích thước lá đánh giá khả năng quang hợp của cây.  Số rễ Đếm số rễ chính của cây. Số lượng rễ đánh giá khả năng hấp thu chất dinh dưỡng của cây 3.3.3.2. Thí nghiệm 6 Sau 21 ngày nuôi cấy, cây hoa Cúc có nguồn gốc dị dưỡng và quang tự dưỡng được chuyển ra vườn ươm. Kết quả về sự sinh trưởng, phát triển được quan sát và ghi nhận sau 20 ngày tiếp theo, qua các chỉ tiêu: - Tỷ lệ sống = (số cây cuối cùng/tổng số cây) x 100 - Gia tăng trọng lượng tươi. - Gia tăng chiều cao cây = chiều cao cây cuối cùng – chiều cao cây ban đầu. - Kích thước lá. - Số rễ. 3.3.4. Xử lý số liệu Số liệu được xử lý dựa trên phần mềm MSTATC và Excel. 31 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của sự thông khí đối với sự sinh trƣởng phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng Sau 21 ngày nuôi cấy, sự tăng trưởng của cây in vitro ở các mức độ thông thoáng khí khác nhau được thể hiện qua các chỉ tiêu sau: Bảng 4.1. Ảnh hƣởng của sự thông khí đến các chỉ tiêu tăng trƣởng của cây in vitro Nghiệm thức Ký hiệu GTTLT (mg/cây) GTTLK (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/lá) SR 1 ĐC 106,2 MNO 9,23 I 31,33 JKLM 11,83 BCDE 3,5 FGH 2 A111 112,9 LMN 13,17 DEFGHI 37,0 GHIJKL 9,83 EFG 4,33 EFGH 3 A112 214,7 CD 17,7 BCD 53,9 ABC 13,17 AB 9,5 ABC 4 A121 202,8 CDE 15,67 CDEFGH 51,67 ABCD 13,17 AB 6,83 BCDE 5 A122 248,6 B 20,6 AB 55,0 AB 12,83 ABC 9,67 AB 6 A131 224,6 BC 16,9 BCDE 45,67 BCDEFG 12,67 ABC 8,6 BC 7 A132 114,2 LMN 15,2 CDEFGH 37,67 GHIJK 11,17 BCDEF 8,4 BC 8 A211 82,43 O 13,4 DEFGHI 34,67 HIJKLM 9,67 FG 5,83 CDEF 9 A212 34,9 P 11,17 GHI 31,67 JKLM 8,17 G 5,67 CDEFG 10 A221 142,3 IJK 14,2 CDEFGH 40,0 EFGHIJ 11,17 BCDEF 8,17 BC 11 A222 164,4 FGHI 16,8 BCDEF 41,4 EFGHIJ 12,17 BC 9,33 ABC 12 A231 156,0 HIJ 17,93 BCD 38,5 FGHIJK 11,17 BCDEF 7,83 BCD 13 A232 80,73 O 12,77 EFGHI 27,33 LM 9,83 EFG 5,83 CDEF 14 B111 129,5 KLM 13,43 DEFGHI 43,33 DEFGHI 10,0 DEFG 5,87 CDEF 15 B112 157,5 GHIJ 14,23 CDEFGH 49,0 ABCDE 10,83 CDEF 7,5 BCD 16 B121 316,9 A 24,93 A 56,67 A 14,67 A 11,93 A 17 B122 180,0 EFGH 13,9 CDEFGHI 44,0 CDEFGH 12,0 BCD 9,17 ABC 18 B131 192,3 DE 17,43 BCDE 55,0 AB 12,17 BC 9,0 BC 19 B132 137,0 JKL 11,83 GHI 40,17 EFGHIJ 11,33 BCDEF 8,83 BC 20 B211 38,2 P 11,7 GHI 29,17 KLM 8,67 G 2,83 IJ 21 B212 30,6 P 10,83 HI 24,67 M 8,0 G 2,0 J 22 B221 190,1 DEF 17,33 BCDE 48,33 ABCDEF 12,67 ABC 7,83 BCDEF 23 B222 84,35 O 12,0 FGHI 34,67 HIJKLM 9,67 FG 5,03 FGHI 24 B231 182,3 EFG 16,0 BCDEFG 44,0 CDEFGH 12,0 BCD 9,0 BC 25 B232 99,77 NO 18,5 BC 33,17 IJKLM 11,17 BCDEF 5,7 EFGH CV (%) 8,2 % 14,8 % 11,35 % 8,56 % 18,14 % Ghi chú: Ở Bảng 4.1 dưới đây, các giá trị theo sau bởi chữ cái trong cùng một cột không cùng ký tự biểu hiện sự khác biệt rất có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ 0.01. 32 Kết quả Bảng 4.1 cho thấy có sự khác biệt rất có ý nghĩa giữa các nghiệm thức ở các chỉ tiêu tăng trưởng của cây in vitro. Trong đó nghiệm thức giấy báo – 1 lỗ, 2 lớp – kích thước lỗ 1cm x 3cm (B121 ) cho kết quả tốt nhất ở tất cả các chỉ tiêu: gia tăng trọng lượng tươi (316,9mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (24,93 mg/cây), chiều cao cây (56,7mm/cây), kích thước lá (14,7mm/lá), số rễ (11,9 rễ/cây). Nghiệm thức giấy A4 – 1 lỗ - 2 lớp – kích thước lỗ 2cm x 3cm (A122) cho kết quả thấp hơn nghiệm thức B121 ở các chỉ tiêu: gia tăng trọng lượng tươi (248,6 mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (20,6 mg/cây), chiều cao cây (55mm/cây), kích thước lá (12,8mm/lá), số rễ (9,7 rễ/cây). Giữa hai nghiệm thức B121 và nghiệm thức A122, ngoại trừ chỉ tiêu gia tăng trọng lượng tươi có sự khác biệt có ý nghĩa. Các chỉ tiêu còn lại không có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở tất cả các chỉ tiêu tăng trưởng, nghiệm thức B121 và nghiệm thức A 122 có sự khác biệt so với nghiệm thức 0 lỗ thông khí (ĐC) và nghiệm thức giấy báo – 2 lỗ – 1lớp – kích thước lỗ 2cm x 3cm (B212). Giữa nghiệm thức ĐC và nghiệm thức B212, chỉ tiêu gia tăng trọng lượng khô ở nghiệm thức B212 cao hơn nghiệm thức ĐC (10,8 mg/cây so với 9,23 mg/cây). Ngược lại, ở chỉ tiêu chiều cao cây, nghiệm thức B212 thấp hơn nghiệm thức ĐC (24,7mm/cây so với 31,3mm/cây). Tuy nhiên chỉ tiêu gia tăng trọng lượng khô và chiều cao cây giữa hai nghiệm thức ĐC và B212 không có sự khác biệt về mặt thống kê. Các chỉ tiêu còn lại ở nghiệm thức ĐC cao hơn và có sự khác biệt so với nghiệm thức B212. Cụ thể như sau: gia tăng trọng lượng tươi (106,2 mg/cây so với 30,6 mg/cây), kích thước lá (11,8mm/lá so với 8mm/lá), số rễ (3,5 rễ/cây so với 2 rễ/cây). Qua quá trình theo dõi thí nghiệm và phân tích số liệu, chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau: - Ở các nghiệm thức có sự thông thoáng khí quá lớn (cụ thể là nghiệm thức B212), các chỉ tiêu tăng trưởng cho kết quả thấp nhất. Điều chúng tôi quan sát được ở các nghiệm thức này đó là: + Giá thể ở trong tình trạng thiếu ẩm độ. + Gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô và chiều cao cây thấp. + Kích thước lá nhỏ. Các lá ở các nghiệm thức này có màu xanh sẫm chứng tỏ chúng có sự quang hợp mạnh. Tuy nhiên phần lớn các lá này ở trong tình trạng héo khô do bị thiếu nước. 33 + Số rễ ít, đầu chóp rễ bị khô. Những kết quả trên chứng tỏ cây được nuôi cấy ở mức độ thông khí quá lớn, sự trao đổi khí và thoát hơi nước trong bịch nuôi cấy diễn ra mạnh. Độ ẩm trong bịch nuôi cấy không được duy trì. Điều đó dẫn đến tình trạng cây không đủ nước để duy trì các hoạt động sống một cách bình thường. - Ở nghiệm thức không có sự thông thoáng (ĐC), các chỉ tiêu tăng trưởng cũng cho kết quả rất thấp. Đặc biệt là chỉ tiêu gia tăng trọng lượng khô cho kết quả thấp nhất. - Ở tất cả các nghiệm thức của thí nghiệm 1, cây sinh trưởng trong môi trường MS khoáng cơ bản (không có đường và vitamin). Vì vậy hoạt động sống của cây chủ yếu dựa vào nguồn CO2. Ở nghiệm thức đối chứng, cây không có sự trao đổi khí với môi trường bên ngoài. Nên hoạt động sống của cây chủ yếu dựa vào lượng CO2 dự trữ trong bịch. Lượng CO2 dự trữ này không đủ cho cây hoạt động quang hợp bình thường. Bên cạnh đó, độ ẩm trong bịch nuôi cấy quá cao (thể hiện qua lượng nước tích tụ trên thành bịch). Độ ẩm cao đã làm cho tốc độ thoát hơi nước của các khí khổng kém. Điều này làm cản trở sự hấp thu nước và muối khoáng từ trong môi trường nuôi cấy, đồng thời gây trở ngại cho sự vận chuyển nước và các chất khoáng trong bó mạch (Fujiwara và Kozai, 1995). Do đó lượng sinh khối do cây tạo ra ở nghiệm thức này rất thấp. - Ở nghiệm thức có sự thông thoáng khí ở mức vừa phải (cụ thể là nghiệm thức B121), các chỉ tiêu tăng trưởng cho kết quả cao nhất. Sự thông thoáng khí ở mức độ vừa phải này không những đảm bảo sự duy trì ẩm độ trong bịch nuôi cấy mà còn giúp cho cây sử dụng có hiệu quả nguồn CO2 từ môi trường bên ngoài để tham gia vào quá trình quang hợp. Kết luận sơ bộ: Qua kết quả ở thí nghiệm trên, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau: sử dụng túi nylon có một lỗ thông khí. Lỗ thông khí được dán giấy báo 2 lớp có kích thước 1cm x 3cm, và giấy A4 2 lớp có kích thước lỗ 2cm x 3cm cho kết quả tốt nhất. Qua kết quả thu được ở Bảng 4.1 và những số liệu phân tích trên các biểu đồ ở thí nghiệm 1, cho thấy: giấy báo và giấy A4 đều có thể sử dụng để dán lỗ thông khí. Ảnh hưởng của số lỗ, số lớp giấy và kích thước lỗ không có ý nghĩa quyết định đến kết quả thí nghiệm, mà chỉ góp phần phục vụ mục đích tìm độ thông thoáng khí thích hợp, giúp cho hoạt động sinh lý của cây quang tự dưỡng diễn ra một cách bình thường. 34 Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) 214.7 248.6 224.6 82.43 164.4 137 190.1 182.3 106.2 80.73 156 142.3 34.9 112.9 202.8 114.2 316.9 99.77 84.35 30.6 38.2 129.5 157.5 180 192.3 0 50 100 150 200 250 300 350 ĐC 111 112 121 122 131 132 211 212 221 222 231 232 ĐC Giấy A4 Giấy báo Biểu đồ 4.1. Ảnh hƣởng của sự thông khí đến sự gia tăng trọng lƣợng tƣơi của cây in vitro Gia tăng trọng lượng khô (mg/cây) 20.6 15.2 13.4 16.8 17.93 24.93 17.33 18.5 9.23 11.17 15.67 14.2 12.7713.17 17.7 16.9 13.43 14.23 13.9 17.43 11.83 11.7 10.83 12 16 0 5 10 15 20 25 30 ĐC 111 112 121 122 131 132 211 212 221 222 231 232 ĐC Giấy A4 Giấy báo Biểu đồ 4.2. Ảnh hƣởng của sự thông khí đến sự gia tăng trọng lƣợng khô của cây in vitro 35 Chiều cao cây (mm/cây) 53.9 41.4 43.33 55 48.33 44 31.33 34.67 27.33 38.5 40 31.67 37.67 45.67 55 51.67 37 33.1734.67 24.67 29.17 40.1744 56.67 49 0 10 20 30 40 50 60 ĐC 111 112 121 122 131 132 211 212 221 222 231 232 ĐC Giấy A4 Giấy báo Biểu đồ 4.3. Ảnh hƣởng của sự thông khí đến chỉ tiêu chiều cao thân của cây in vitro Kích thước lá (mm/lá) 11.83 9.83 13.17 13.17 8.17 9.67 11.17 12.67 11.17 12.17 11.17 9.83 12.83 10 10.83 14.67 12 11.33 8 8.67 12.17 12.67 9.67 12 11.17 0 2 4 6 8 10 12 14 16 ĐC 111 112 121 122 131 132 211 212 221 222 231 232 ĐC Giấy A4 Giấy báo Biểu đồ 4.4. Ảnh hƣởng của sự thông khí đến chỉ tiêu kích thƣớc lá của cây in vitro 36 Số rễ 3.5 9.5 5.83 5.67 9.33 5.87 11.93 9 4.33 6.83 9.67 8.6 8.4 8.17 7.83 5.83 7.5 9.17 9 8.83 2.83 2 7.83 5.03 5.7 0 2 4 6 8 10 12 14 ĐC 111 112 121 122 131 132 211 212 221 222 231 232 ĐC Giấy A4 Giấy báo Biểu đồ 4.5. Ảnh hƣởng của sự thông khí đến chỉ tiêu số rễ của cây in vitro Hình 4.1. Cây in vitro tăng trƣởng ở các lớp giấy khác nhau 37 Hình 4.2. Cây in vitro tăng trƣởng ở các kích thƣớc lỗ khác nhau Hình 4.3. Cây in vitro tăng trƣởng ở các số lỗ khác nhau 4.2. Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy và tác dụng của ánh sáng lên sự phát triển của cây Cúc in vitro Qua quá trình theo dõi và phân tích số liệu chúng tôi thu được một số kết quả được trình bày trong Bảng 4.2. 38 Bảng 4.2. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy và tác dụng của ánh sáng lên sự phát triển của cây Cúc in vitro Nghiệm thức GTTLT (mg/cây) GTTLK (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/lá) SR DĐ DT QĐ QT 427,1 A 423,6 A 282,8 C 361,0 B 20,77 29,01 24,33 31,33 89,67 A 50,75 BC 61,75 B 47,00 C 9,00 C 12,67 B 13,75 AB 14,58 A 8,92 C 17,43 A 10,00 C 13,67 B Khác biệt * NS * * * Phƣơng pháp nuôi cấy Dị dưỡng Quang tự dưỡng 425,3 A 321,9 B 24,92 B 27,83 A 70,208 A 54,375 B 10,83 B 14,17 A 13,12 11,83 Khác biệt * * * * * * * * NS Ánh sáng Đèn Tự nhiên + đèn 355,0 B 392,3 A 22,55 B 30,20 A 75,708 A 48,875 B 11,38 B 13,63 A 9,46 B 15,54 A Khác biệt * * * * * * * * * CV (%) 6,23 % 3,20 % 11,40 % 6,38 % 10,25 %  Ghi chú NS : Không có sự khác biệt về mặt thống kê. * : Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,01 p ≤ 0,05. * * : Sự khác biệt rất có ý nghĩa ở mức p ≤ 0,01. CV (%): Độ lệch tiêu chuẩn. 4.2.1. Gia tăng trọng lƣợng tƣơi Dựa vào Bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt về chỉ tiêu gia tăng trọng lượng tươi giữa các nghiệm thức là có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 0,05. Trong đó nghiệm thức dị dưỡng – ánh sáng đèn (DĐ) có sự gia tăng trọng lượng tươi cao nhất (427,1 mg/cây), và nghiệm thức quang tự dưỡng – ánh sáng đèn (QĐ) có sự gia tăng trọng lượng tươi thấp nhất (282,8 mg/cây). Điều đó cho thấy ở điều kiện ánh sáng đèn, cường độ ánh sáng yếu, khả năng sử dụng nguồn CO2 của cây quang tự dưỡng bị hạn chế, dẫn đến sự 39 hạn chế khả năng quang hợp của cây. Sự tăng trưởng của cây quang tự dưỡng chủ yếu phụ thuộc vào hoạt động quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ. Nên cây quang tự dưỡng cho gia tăng trọng lượng tươi thấp nhất. Đối với cây dị dưỡng, cây sử dụng đường trong môi trường làm nguồn carbon cho quá trình phát triển. Thêm vào đó, cây dị dưỡng được nuôi cấy trong điều kiện không thoáng khí (độ ẩm cao, nồng độ ethylene cao, nồng độ CO2 thấp), dẫn đến sự rối loạn biến dưỡng và hình thái. Kết quả đưa đến sự tích tụ nước quá mức hay còn gọi là hiện tượng thủy tinh thể (vitrification hay hyperhydricity) (Woodward S., 1991; Leshem B. và Sachs F. ,1985), sự trong mờ hay sự mọng nước. Kết quả là sự gia tăng trọng lượng tươi của cây đạt ở mức cao nhất. Xét về phương pháp nuôi cấy, sự khác biệt gia tăng trọng lượng tươi giữa các nghiệm thức là rất có ý nghĩa ở mức 0,01. Trong đó nuôi cấy dị dưỡng cho sự gia tăng trọng lượng tươi cao nhất (425,3mg/cây). Xét về ánh sáng, sự khác biệt gia tăng trọng lượng tươi giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa. Trong đó, các nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên có bổ sung ánh sáng đèn đạt trọng lượng tươi cao nhất (392,3mg/cây). Điều đó chứng tỏ sự gia tăng cường độ ánh sáng ở mức thích hợp, làm gia tăng hiệu suất quang hợp. Qua đó làm gia tăng sinh khối của cây (Kozai, 2005; Bùi Trang Việt, 2000). Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) 427.1 423.6 282.8 361 0 200 400 600 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.6: Sự khác biệt về gia tăng trọng lƣợng tƣơi giữa các nghiệm thức  Ghi chú: AS đèn : Ánh sáng đèn. AS tự nhiên : Ánh sáng tự nhiên. 40 4.2.2. Gia tăng trọng lƣợng khô Kết quả nhận được cho thấy ở nghiệm thức quang tự dưỡng – ánh sáng tự nhiên (QT) cho gia tăng trọng lượng khô cao nhất (31,33mg/cây) và nghiệm thức dị dưỡng - ánh sáng đèn (DĐ) cho kết quả thấp nhất (20,77mg/cây). Nhưng sự khác biệt giữa tất cả các nghiệm thức là không có ý nghĩa về mặt thống kê. Tuy nhiên khi xét riêng giữa từng cặp tác nhân: dị dưỡng và quang tự dưỡng; ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên. Sự khác biệt rất có ý nghĩa. Các nghiệm thức dùng phương pháp quang tự dưỡng và nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên có kết quả gia tăng trọng lượng khô cao nhất. Từ kết quả trên chúng tôi rút ra một số nhận xét: Cây được nuôi cấy trong điều kiện quang tự dưỡng, nguồn carbon cung cấp cho cây chủ yếu là CO2 của không khí. Qua các lỗ thông khí, cây vừa lấy nguồn CO2 từ môi trường bên ngoài để quang hợp, vừa thải khí ethylene, và có thể là các khí ức chế sinh trưởng nào đó, đồng thời giảm độ ẩm trong bịch nuôi cấy. Sự trao đổi khí làm gia tăng khả năng hấp thụ và thoát hơi nước của lá, giúp cho sự vận chuyển chất khoáng trong cây dễ dàng (Bùi Trang Việt, 2000). Kết quả làm giảm sự tích lũy nước quá mức và gia tăng khối lượng vật chất khô. Trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, cường độ ánh sáng cao, nồng độ khí CO2 cao, giúp cho bộ máy quang hợp của cây hoạt động hiệu quả. Trong đó lá là cơ quan chủ yếu để quang hợp tạo ra sản lượng vật chất khô. Vì vậy sản lượng vật chất khô phụ thuộc chủ yếu vào diện tích lá. Qua các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy ở các nghiệm thức sử dụng ánh sáng tự nhiên: kích thước lá và số rễ có sự gia tăng đáng kể. nó cũng đóng vai trò quan trọng tạo nên sự khác biệt trong gia tăng trọng lượng khô giữa nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên. Gia tăng trọng lượng khô (mg /cây) 20.77 29.01 31.33 24.33 0 10 20 30 40 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.7 Sự khác biệt về gia tăng trọng lƣợng khô giữa các nghiệm thức 41 4.2.3. Chiều cao cây Sự khác biệt chiều cao cây giữa các nghiệm thức có ý nghĩa ở mức 0,05. Trong đó chiều cao cây của nghiệm thức dị dưỡng ánh sáng đèn là cao nhất (89,67mm/cây) và nghiệm thức quang tự dưỡng ánh sáng tự nhiên là thấp nhất (47,00mm/cây). Giữa các nghiệm thức trong từng tác nhân: dị dưỡng và quang tự dưỡng; ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên, sự khác biệt rất có ý nghĩa. Các nghiệm thức nuôi cấy trong môi trường dị dưỡng và các nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn có chiều cao vượt trội so với các nghiệm thức còn lại. Sự khác biệt về chiều cao cây thể hiện rõ nhất ở yếu tố ánh sáng. Theo quan sát của chúng tôi thì số đốt thân giữa các nghiệm thức không có sự khác biệt. Tuy nhiên ở các nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn, đốt thân dài ra, thân cây tương đối mảnh và mềm yếu. Việc sử dụng ánh sáng đèn có cường độ ánh sáng yếu làm cho cây vươn dài theo hướng ánh sáng (Bùi Trang Việt, 2000). chiều cao cây (mm/cây) 89.67 50.75 47 61.75 0 50 100 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.8. Sự khác biệt về chiều cao cây giữa các nghiệm thức 4.2.4. Kích thƣớc lá Qua Bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt về kích thước lá giữa các nghiệm thức ở mức 0,05. Ở nghiệm thức quang tự dưỡng ánh sáng tự nhiên, kích thước lá lớn nhất (14,58mm/cây) còn ở nghiệm thức dị dưỡng ánh sáng đèn, kích thước lá nhỏ nhất (9mm/cây). Sự khác biệt về kích thước lá giữa các nghiệm thức trong cùng tác nhân: dị dưỡng và quang tự dưỡng, giữa ánh sáng đèn và ánh sáng tự nhiên là rất có ý nghĩa. Trong đó các nghiệm thức về quang tự dưỡng và ánh sáng tự nhiên tạo ra lá có kích thước lớn nhất. 42 Lá là nơi xảy ra quá trình quang hợp chủ yếu của cây. Dưới tác dụng của ánh sáng lục lạp trong lá biến đổi các chất vô cơ thành các chất hữu cơ, cung cấp cho các hoạt động sống của cây, giúp cây sinh trưởng và phát triển. Vì vậy, kích thước lá hay số lượng lục lạp cũng thể hiện mức độ quang hợp của cây. Ở nghiệm thức nuôi cấy dị dưỡng sử dụng ánh sáng đèn, cây được nuôi cấy trong hệ thống nuôi cấy kín (độ ẩm cao, khí ethylene cao, nồng độ CO2 thấp). Điều đó dẫn đến những bất thường về sinh lý của cây như: lá bị cong, già yếu và rụng (Ried, 1987). Theo Desjardin (1995) khả năng quang hợp của cây in vitro sẽ giảm khi nồng độ đường trong môi trường nuôi cấy cao. Vì vậy cây nuôi cấy trong điều kiện dị dưỡng thường có kích thước lá nhỏ. Ở điều kiện ánh sáng tự nhiên, cường độ ánh sáng cao, nồng độ khí CO2 cao mức độ quang hợp của cây được gia tăng. Kết quả là kích thước lá của cây cũng tăng theo. Cùng với sự gia tăng kích thước lá, là sự hoạt động bình thường của khí khổng và sự dày lên của lớp cutin trên bề mặt lá. Kích thước lá (mm/lá) 9 12.6713.75 14.58 0 5 10 15 20 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.9. Sự khác biệt về kích thƣớc lá giữa các nghiệm thức 4.2.5. Số rễ Số liệu phân tích cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 0,05 ở tất cả các nghiệm thức: ở nghiệm thức dị dưỡng ánh sáng tự nhiên, cây có số rễ trung bình nhiều nhất (17,43 rễ/cây) và nghiệm thức dị dưỡng ánh sáng đèn, cây có số rễ trung bình ít nhất (8,92 rễ/cây). Giữa các nghiệm thức về tác nhân hình thức nuôi cấy: dị dưỡng và quang tự dưỡng, sự khác biệt không có ý nghĩa. Giữa các nghiệm thức về tác nhân ánh sáng: ánh sáng tự nhiên có số rễ nhiều nhất và có sự khác biệt rất có ý nghĩa so với nghiệm thức sử dụng ánh sáng đèn. 43 Rễ đóng vai trò hấp thu nước và chất dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy đưa lên lá, để lá tiến hành quang hợp, tổng hợp nên các chất hữu cơ. Do đó, việc sử dụng ánh sáng tự nhiên cho số rễ nhiều nhất là do hiệu suất quang hợp của cây được gia tăng (do cường độ ánh sáng và khí CO2 cao), dẫn đến việc gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng từ rễ. Vì vậy số lượng rễ nhiều. Số rễ ở nghiệm thức nuôi cấy dị dưỡng sử dụng ánh sáng tự nhiên cho kết quả nhiều nhất. Theo chúng tôi, ở điều kiện ánh sáng tự nhiên: cường độ ánh sáng cao, nồng độ CO2 cao, sự dao động lớn về nhiệt độ, độ ẩm, cường độ ánh sáng... trong ngày. Mặc dầu cây được nuôi cấy trong bịch nuôi cấy kín, nhưng sự chênh lệch áp suất giữa bên trong và bên ngoài bịch nuôi cấy có thể giúp cho cây lấy một lượng CO2 nhất định từ môi trường bên ngoài. Vì vậy, cây vừa sử dụng đường từ môi trường để tổng hợp chất hữu cơ, vừa sử dụng nguồn CO2 để quang hợp, vừa hoạt động chủ động để thích nghi với yếu tố bên ngoài. Nên số lượng rễ nhiều và kích thước lá tương đối lớn. Ở nghiệm thức nuôi cấy dị dưỡng ánh sáng đèn và nghiệm thức nuôi cấy quang tự dưỡng ánh sáng đèn cho số rễ ít nhất. Ở điều kiện ánh sáng đèn có cường độ ánh sáng thấp, khả năng quang hợp của cây dị dưỡng kém. Sự tăng trưởng của cây phần lớn chỉ dựa vào lượng đường hiện diện trong môi trường nuôi cấy. Cây dị dưỡng phát triển trong môi trường giàu dinh dưỡng, sử dụng ánh sáng nhân tạo, các điều kiện vật lý bên ngoài tương đối ổn định và dễ dàng được kiểm soát trong phòng nuôi cây. Vì vậy hoạt động sống của cây ít tiêu tốn năng lượng, nên cây chỉ cần một lượng dinh dưỡng vừa đủ để tồn tại và phát triển. Điều đó phần nào giải thích nguyên nhân kém phát triển của bộ rễ ở cây dị dưỡng ánh sáng đèn. Trái lại ở cây quang tự dưỡng, cây chỉ sử dụng nguồn carbon chủ yếu từ nguồn CO2 ở môi trường bên ngoài (thông qua lỗ thông khí). Tuy nhiên do cường độ ánh sáng và lượng CO2 thấp nên không đủ cung cấp cho nhu cầu quang hợp của cây. Kết luận sơ bộ: Qua kết quả thí nghiệm, cho thấy sự tăng trưởng vượt trội của cây quang tự dưỡng trong điều kiện ánh sáng tự nhiên. Điều này có ý nghĩa rất lớn đối với việc áp dụng mô hình quang tự dưỡng trong thực tế. Ngoài chất lượng cây cấy mô được gia tăng như đã nêu trên, hình thức nuôi cấy này còn giúp giảm rất nhiều chi phí trong nuôi cấy mô. Qua đó, làm giảm giá thành cây cây mô so với phương pháp dị dưỡng truyền thống. 44 Số rễ 8.92 17.43 10 13.67 0 5 10 15 20 AS đèn AS tự nhiên dị dưỡng quang tự dưỡng Biểu đồ 4.10. Sự khác biệt về số rễ giữa các nghiệm thức Hình 4.4. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy và tác dụng của ánh sáng lên sự tăng trƣởng của cây in vitro 45 4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hƣởng của giá thể đối với sự phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng Sau 21 ngày nuôi cấy, sự sinh trưởng của cây Cúc trên các giá thể khác nhau, được ghi nhận ở các kết quả sau: Bảng 4.3. Ảnh hƣởng của giá thể đối với sự phát triển của cây Cúc trong điều kiện quang tự dƣỡng Nghiệm thức GTTLT (mg/cây) GTTLK (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/cây) SR ĐC A C D X Đ B V 427.1 A 312.4 C 282.5 D 207.4 E 370.7 B 310.3 CD 114.8 F 182.1 E 26.77 BC 25.67 C 26.08 C 20.50 D 30.50 A 29.67 AB 16.17 E 20.25 D 89.67 A 38.33 DE 39.00 CD 39.35 CD 48.50 BC 50.25 B 28.83 E 37.92 DE 9.00 DE 13.67 AB 13.00 AB 10.83 CD 14.42 A 14.25 A 8.75 E 11.67 BC 8.92 D 8.17 D 11.25 BC 11.00 C 13.75 A 13.29 AB 4.33 E 8.92 D Khác biệt * * * * * * * * * * CV (%) 4.38 % 5.02 % 8.69 % 7.26 % 8.65 % Sự gia tăng trọng lượng tươi và chiều cao cây của nghiệm thức đối chứng (ĐC) tỏ ra vượt trội so với các nghiệm thức còn lại. Đó cũng chính là sự khác biệt giữa hai hệ thống: dị dưỡng ánh sáng đèn và quang tự dưỡng ánh sáng tự nhiên như đã được trình bày ở thí nghiệm 2. Dẫu vậy sự gia tăng trọng lượng khô của nghiệm thức lại rất thấp. Điều đó cho thấy trọng lượng tươi này chủ yếu đến từ khả năng hấp thu nước của cây đối chứng, mà không là sự hấp thụ dinh dưỡng để tổng hợp vật chất hữu cơ. Sự gia tăng trọng lượng khô ở nghiệm thức xơ dừa và đất sạch cao hơn các nghiệm thức khác. Trong đó giá thể xơ dừa có gia tăng trọng lượng khô cao nhất (30,5 mg/cây). Qua Bảng số liệu ở thí nghiệm 2 và 3, chúng tôi nhận thấy có sự tương đồng giữa gia tăng trọng lượng khô với kích thước lá và số rễ. Sự gia tăng về kích thước lá và số rễ giúp cây tổng hợp được nhiều sinh khối hữu cơ. Kết quả ở Bảng 4.3 cũng cho thấy giá thể là dớn, giấy vệ sinh và giấy báo cho kết quả thấp nhất. 46 Ở giá thể dớn, trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy độ pH của môi trường nuôi cấy sau 21 ngày thấp hơn rất nhiều so với độ pH được điều chỉnh ban đầu. Ngoài ra cây có biểu hiện thiếu sắt. Qua đó, chúng tôi có nhận xét: giá thể dớn làm acid hóa môi trường, độ pH quá thấp là nguyên nhân hạn chế sự hấp thu nước và muối khoáng của cây. Ngoài ra trong giá thể dớn có chứa nhiều tanin gây kết tủa sắt. Do đó việc dùng biện pháp xử lý để loại bỏ tanin là rất cần thiết. Ở giá thể giấy vệ sinh và giấy báo, cây phát triển kém. Điều này có thể do cây bị ảnh hưởng của phẩm nhuộm và mực in, có sẵn trên hai loại giá thể rẻ tiền này. Ở giá thể agar và cát, cây phát triển ở mức tương đối. Đối với giá thể cát, sau một thời gian nuôi cấy, độ ẩm trong môi trường nuôi cấy giảm rõ rệt (do cát không có khả năng ngậm nước và giữ nước). Agar là một loại giá thể phổ biến nhất được dùng trong nuôi cấy mô. Những nghiên cứu trong lĩnh vực nuôi cấy mô trên thế giới gần đây đã chứng minh vai trò kìm hãm của thạch đối với sự phát triển của cây nuôi cấy mô. Bên cạnh đó chi phí cho việc sử dụng agar là khá lớn (giá hiện nay là 180.000 đồng/kg). Agar còn có độ thông thoáng kém, cản trở sự khuyếch tán các khí hòa tan cũng như sự hấp thu nước và các chất khoáng của cây (Nguyễn Thị Quỳnh, 2002). Kết luận sơ bộ: Qua kết quả phân tích, chúng tôi rút ra kết luận: vật liệu tốt nhất dùng làm giá thể trong nuôi cấy quang tự dưỡng là xơ dừa và đất sạch. Đây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền. Tuy xơ dừa cho kết quả tốt nhất, nhưng trước khi sử dụng phải trải qua giai đoạn xử lý để loại bỏ muối và tanin. Ngoài ra, ở những vùng không có ưu thế phát triển dừa, thì việc tìm kiếm nguồn mạt dừa là rất khó khăn. Vì vậy ở hầu hết các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng đất sạch làm giá thể. Thực chất đây cũng là xơ dừa đã qua xử lý ủ hoai và được Công ty dừa Mekong bán rộng rãi trên thị trường hiện nay. 47 Gia tăng trọng lượng tươi 427.1 312.4 282.5 207.4 370.7 310.3 114.8 152.1 0 100 200 300 400 500 ĐC Agar Cát Dớn Xơ dừa Đất sạch Giấy báo Giấy vệ sinh Biểu đồ 4.11. Ảnh hƣởng của giá thể đến sự gia tăng trọng lƣợng tƣơi của cây in vitro Gia tăng trọng lượng khô (mg/cây) 26.77 20.5 30.5 29.67 20.25 16.17 26.0825.67 0 10 20 30 40 ĐC A C D X Đ B V Biểu đồ 4.12. Ảnh hƣởng của giá thể đến sự gia tăng trọng khô của cây in vitro Chiều cao cây (mm/cây) 38.33 39 39.35 50.25 37.92 89.67 48.5 28.83 0 20 40 60 80 100 ĐC A C D X Đ B V 48 Biểu đồ 4.13. Ảnh hƣởng của giá thể đến chiều cao thân của cây in vitro Kích thước lá (mm/lá) 9 13.67 10.83 14.42 14.25 8.75 13 11.67 0 5 10 15 20 ĐC A C D X Đ B V Biểu đồ 4.14. Ảnh hƣởng của giá thể đến kích thƣớc lá của cây in vitro Số rễ 8.92 8.17 11.25 11 13.75 13.29 4.33 8.92 0 5 10 15 ĐC A C D X Đ B V Biểu đồ 4.15. Ảnh hƣởng của giá thể đến số rễ của cây in vitro Số rễ 49 Hình 4.5. Sự tăng trƣởng của cây in vitro ở các giá thể khác nhau 4.4. Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của kích cở bịch nuôi cấy đối với sự phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng Sau 21 ngày nuôi cấy, các chỉ tiêu tăng trưởng của cây Cúc được thể hiện qua những kết quả dưới đây: 50 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của kích cở bịch nuôi cấy đối với sự phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng Nghiệm thức GTTLT (mg/cây) GTTLK (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/cây) SR S11 269.3 C 22.43 B 40.00 13.17 B 11.83 B S14 325.3 B 26.03 B 41.75 14.42 AB 15.67 B S20 481.9 A 33.77 A 43.83 15.83 A 20.00 A Khác biệt * * * * NS * * * * CV (%) 1.9 % 9.19 % 5.88 % 3.45 % 8.54 % Qua kết quả thu được ở Bảng 4.4, các chỉ tiêu về gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô, kích thước lá, số rễ có sự khác biệt rất có ý nghĩa. Trong đó nghiệm thức S20 cho kết quả cao nhất, kế đến là S14 và thấp nhất là S11. Ở chỉ tiêu chiều cao cây, cũng cho kết quả tương tự.Tuy nhiên không có sự khác biệt về mặt thống kê giữa các nghiệm thức chiếu theo chỉ tiêu này. Có thể biện luận như sau: Khi tăng kích cở bịch nuôi cấy, thể tích khí CO2 trong bịch nuôi cấy cũng tăng theo. Do cây được nuôi trong điều kiện ánh sáng tự nhiên, có cường độ ánh sáng tương đối cao, sự gia tăng thể tích khí CO2 này, cùng với sự hấp thu lượng CO2 từ môi trường bên ngoài, giúp đảm bảo lượng CO2 dồi dào ngay cả trong suốt thời gian chiếu sáng. Do đó, cây phát huy được tối đa khả năng quang hợp. Chính vì vậy, các chỉ tiêu tăng trưởng của cây ở nghiệm thức S20 tỏ ra vượt trội so với các nghiệm thức khác. Kết luận sơ bộ: Kết quả của thí nghiệm này cho thấy có thể sử dụng bịch có kích cở lớn trong nuôi cấy quang tự dưỡng để nâng cao hơn nữa chất lượng cây giống. Ngoài ra, có thể thấy rằng kích cở bịch lớn còn giúp tăng số lượng mẫu nuôi cấy/ bịch, qua đó giảm được công lao động và một số chi phí nguyên vật liệu khác. 51 Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) 269.3 325.3 481.9 0 100 200 300 400 500 600 S11 S14 S20 S11 S14 S20 Biểu đồ 4.16. Ảnh hƣởng của kích cở bịch lên sự gia tăng trọng lƣợng tƣơi của cây Cúc in vitro 2022.43 40 11.83 13.17 26.03 41.75 15.6714.42 33.77 43.83 15.83 0 10 20 30 4 50 GTTLK (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/lá) SR S11 S14 S20 Biểu đồ 4.17. Ảnh hƣởng của kích cở bịch lên sự gia tăng trọng lƣợng khô, chiều cao cây, kích thƣớc lá và số rễ của cây Cúc in vitro 52 Hình 4.6. Ảnh hƣởng của kích cở bịch lên sự tăng trƣởng của cây in vitro 4.5. Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp quang tự dƣỡng trong sản xuất giống Cúc đại trà Kết quả Thí nghiệm 4 đã chứng minh tốc độ sinh trưởng của cây quang tự dưỡng tỷ lệ thuận với kích cở bịch nuôi cấy. Trong quá trình thí nghiệm chúng tôi nhận thấy mô hình nuôi cấy quang tự dưỡng chỉ thật sự có hiệu quả tối ưu ở giai đoạn đưa cây ra vườn ươm hoặc ngoài đồng ruộng. Bên cạnh đó, sự vô trùng chỉ có ý nghĩa tương đối. Với mục đích sản xuất một số lượng lớn cây giống với tốc độ nhanh, có giá thành rẻ mà vẫn đảm bảo được chất lượng cây giống. Chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm này, kết quả được trình bày trong Bảng 4.5. 53 Bảng 4.5. Các chỉ tiêu tăng trƣởng của cây in vitro trong thí nghiệm nhân giống đại trà Nghiệm thức GTTLT (mg/cây) CCC (mm/cây) KTL (mm/lá) SR ĐC 1 ĐC 2 P0-0 P1-10 P1-15 P2-10 P2-15 224,7 C 147,8 C 172,2 C 354,2 B 333,9 B 453,5 A 454,2 A 69,07 A 34,6 C 35,43 BC 40,07 BC 38,17 BC 40,93 B 40,47 B 8,4 D 13,7 BC 12,57 C 14.27 ABC 14,77 AB 15,73 A 15,97 A 9,87 C 7,13 D 7,23 D 11,0 C 11,47 BC 13,27 AB 14,37 A Khác biệt * * * * * * * * CV (%) 10,77 % 5,5 % 5,19 % 7,22 % Kết quả nhận được cho thấy, ở nghiệm thức cây dị dưỡng trong túi nylon 12cm x 18cm (ĐC 1) cho kết quả chiều cao cây cao nhất (69,07mm/cây) và kích thước lá nhỏ nhất (8,4mm/lá). Kết quả này đã được lý giải ở thí nghiệm 2. Ở nghiệm thức cây vỉ xốp có 2 lỗ thông khí – kích thước lỗ 15cm x 3cm (P2-15) cho gia tăng trọng lượng tươi (454,2 mg/cây), kích thước lá (15,97mm/lá) và số rễ (14,37 rễ/cây) cao nhất. Các chỉ tiêu này có sự khác biệt có ý nghĩa so với các nghiệm thức ĐC 1, ĐC 2, và cây vỉ xốp 0 lỗ thông khí (P0-0). Điều đó chứng tỏ kích cở bịch và kích thước lỗ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của cây. Việc sử dụng kích cở bịch lớn giúp cây sinh trưởng, phát triển tốt. Điều này đã được ghi nhận ở thí nghiệm 4. Trong thí nghiệm 1 chúng tôi đã chứng minh về sự ảnh hưởng của sự thông khí đối với sự sinh trưởng của cây quang tự dưỡng. Cây quang tự dưỡng sống trong tình trạng không có sự trao đổi khí với môi trường bên ngoài, hoặc có sự trao đổi khí quá mức sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sinh lý bình thường của cây. Trong thí nghiệm này cây vỉ xốp được nuôi cấy trong điều kiện bán vô trùng và được tưới nước bổ sung 10 ngày/lần. Vì vậy nghiệm thức P2-15 có kích thước lỗ lớn nhất nhưng sự tăng trưởng của cây vẫn cho kết quả tốt nhất. 54 Ở nghiệm thức cây quang tự dưỡng trong túi nylon, kích cở 12cm x 18cm (ĐC 2) cho gia tăng trọng lượng tươi (147,8 mg/cây), chiều cao cây (34,6mm/cây) và số rễ (7,13 rễ/cây) thấp nhất. Điều này được lý giải như sau: ở nghiệm thức ĐC 2 cây chủ yếu sử dụng nguồn CO2 từ môi trường bên ngoài để quang hợp. Do kích cở bịch nhỏ (lượng CO2 dự trữ trong bịch thấp), cây được cấy với mật độ dày (10 cây/bịch), không gian nuôi cấy bị hạn chế nên có sự cạnh tranh dinh dưỡng và lượng CO2. Qua đó phần nào ức chế sự sinh trưởng của cây. Ngoài ra, cây được nuôi cấy ở điều kiện ánh sáng tự nhiên, nên sự sinh trưởng của cây phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện ngoại cảnh bên ngoài. Thí nghiệm này được thực hiện vào thời điểm diễn ra mưa nhiều. Do vậy, cường độ ánh sáng tương đối thấp hơn so với các thí nghiệm trước. Nên phần nào hạn chế sự quang hợp và sinh trưởng của cây. Kết quả là cây có sự gia tăng trọng lượng tươi và số rễ thấp nhất. Kết luận sơ bộ: Trong thí nghiệm sử dụng vỉ xốp đậy lồng nylon để sản xuất giống Cúc đại trà. Lồng nylon có 2 lỗ, mỗi lỗ dán 2 lớp giấy báo, kích thước mỗi lỗ 15cm x 3cm là thích hợp nhất. Việc sử dụng lồng nylon trong nhân giống Cúc góp phần giảm bớt các chi phí trong phòng thí nghiệm. Cây nuôi quang tự dưỡng ở thí nghiệm này vẫn duy trì được tình trạng non trẻ hơn so với cây đưa thẳng ra đất. Do đó hệ số nhân của cây nuôi cấy ở hệ thống trên sẽ cao hơn rất nhiều lần so với cây đưa ra ngoài vườn ươm. Ngoài ra cây được nuôi cấy ở từng lỗ riêng biệt nên không có sự cạnh tranh dinh dưỡng. Các cây này khi đưa ra vườn ươm, bộ rễ không bị tổn hại do vẫn còn được giữ nguyên bộ rễ. Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) 224.7 147.8 172.2 354.2 333.9 453.5 454.2 0 100 200 300 400 500 ĐC 1 ĐC 2 P (0-0) P (1-10) P (1-15) P (2-10) P (2-15) Biểu đồ 4.18. Chỉ tiêu gia tăng trọng lƣợng tƣơi trong mô hình nhân giống Cúc đại trà 55 Chiều cao cây (mm/cây) 69.07 34.6 35.43 40.07 38.17 40.93 40.47 0 10 20 30 40 50 60 70 80 ĐC 1 ĐC 2 P (0-0) P (1-10) P (1-15) P (2-10) P (2-15) Biểu đồ 4.19. Chỉ tiêu chiều cao cây trong mô hình nhân giống Cúc đại trà Kích thước lá (mm/lá) 8.4 13.7 12.57 14.27 14.77 15.73 15.97 0 5 10 15 20 ĐC 1 ĐC 2 P (0-0) P (1-10) P (1-15) P (2-10) P (2-15) Biểu đồ 4.20. Chỉ tiêu kích thƣớc lá trong mô hình nhân giống Cúc đại trà Số rễ 9.87 7.53 7.23 11 11.47 13. 7 14.37 0 5 10 15 20 ĐC 1 ĐC 2 P (0-0) P (1-10) P (1-15) P (2-10) P (2-15) Biểu đồ 4.21. Chỉ tiêu số rễ trong mô hình nhân giống Cúc đại trà 56 Hình 4.7. mô hình nuôi cấy quang tự dƣỡng trong sản xuất giống Cúc đại trà Hình 4.8. Cây quang tự dƣỡng vỉ xốp đƣợc bao bằng lồng nylon, có 2 lỗ thông khí, mỗi lỗ có kích thƣớc 15cm x 3cm, đƣợc dán bởi 2 lớp giấy báo Hình 4.9. Cây quang tự dƣỡng vỉ xốp đƣợc bao bằng lồng nylon 0 có lỗ thông khí 57 Hình 4.10. Cây dị dƣỡng và quang tự dƣỡng nuôi cấy trong túi nylon Hình 4.11. Cây ở các nghiệm thức khác nhau trong thí nghiệm Hình 4.12. cây quang tự dƣỡng từ vỉ xốp còn giữ nguyên bộ rễ khi đƣa ra vƣờn ƣơm 58 4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy đối với sự phát triển của cây hoa Cúc ở giai đoạn vƣờn ƣơm Sau 20 ngày tại vườn ươm, kết quả về sự sinh trưởng của cây ở hai hệ thống dị dưỡng và quang tự dưỡng được thể hiện như sau: Bảng 4.6. ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy đối với sự phát triển của cây hoa Cúc ở giai đoạn vƣờn ƣơm Nghiệm thức TLS (%) GTTLT (mg/cây) GTCCC (mm/cây) KTL (mm/lá) DD QTD 92,5 100 784,01 B 1629,95 A 20,84 B 37,18 A 21,06 B 35,13 A Khác biệt NS * * * * * * CV (%) 7,03 % 15,49 % 14,9 % 10,16 % Qua kết quả Bảng 4.6 cho thấy: Tỷ lệ sống của cây có nguồn gốc quang tự dưỡng (QTD) đạt 100 %, trong khi tỷ lệ sống ở cây có nguồn gốc dị dưỡng (DD) chỉ đạt 92,5 %. Tỷ lệ sống của cây dị dưỡng kém là do ở giai đoạn in vitro, cây dị dưỡng có những bất thường về sinh lý như hiện tượng thủy tinh thể, cây thụ động trong quá trình quang hợp, kích thước lá nhỏ, lớp cutin trên bề mặt lá bị giới hạn, khí khổng hoạt động bất bình thường. Sự ghi nhận này cũng đã được trình bày ở thí nghiệm 2. Kết quả là cây bị mất nước nhanh chóng khi chuyển ra giai đoạn ex vitro. Tỷ lệ sống của cây dị dưỡng kém hơn cây quang tự dưỡng đã được chứng minh trên cây cà phê, hông, neem… (Nguyễn Thị Quỳnh, 2005), dâu tây (Fujiwara và cộng sự, 1988), khoai tây, khoai lang (Heo và Kozai, 1999). Cây có nguồn gốc quang tự dưỡng cho các chỉ tiêu tăng trưởng tốt hơn cây có nguồn gốc dị dưỡng. Sự gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng chiều cao cây và kích thước lá của cây có nguồn gốc quang tự dưỡng đều lớn hơn cây có nguồn gốc dị dưỡng. Ở giai đoạn in vitro, chiều cao cây ở cây dị dưỡng tỏ ra vượt trội so với cây quang tự dưỡng. Trái lại, ở giai đoạn ex vitro, cây quang tự dưỡng có sự gia tăng chiều cao cây lớn hơn rất nhiều so với cây dị dưỡng. Sự gia tăng chiều cao cây, trọng lượng tươi và số rễ nói lên mức độ sinh trưởng, phát triển của cây, khả năng hấp thu, tích lũy vật chất, vận chuyển dinh dưỡng cũng như khả năng hấp thụ ánh sáng để quang hợp. Kết 59 quả trên chứng tỏ cây dị dưỡng phải trải qua quá trình thích nghi kéo dài hơn so với cây quang tự dưỡng  Kết luận sơ bộ: ở cây có nguồn gốc quang tự dưỡng, hoạt động quang hợp của cây đã hình thành trong quá trình nuôi cấy. Cây có kích thước lá lớn, lớp cutin trên bề mặt lá tương đối dày, hoạt động khí khổng diễn ra bình thường, số rễ nhiều, Do đó, khi đưa cây ra vườn ươm, cây dễ dàng thích nghi với điều kiện tự nhiên. Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) 784.01 1629.95 0 500 1000 1500 2000 DD QTD Biểu đồ 4.22. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy lên sự gia tăng trọng lƣợng tƣơi của cây Cúc ngoài vƣờn ƣơm 92.5 100 37.18 35.13 21.0620.84 0 20 40 60 80 100 120 TLS (%) GTCCC (mg/cây) KTL (mm/lá) DD QTD Biểu đồ 4.23. Ảnh hƣởng của phƣơng pháp nuôi cấy đến tỷ lệ sống, sự gia tăng chiều cao cây và kích thƣớc lá của cây Cúc ngoài vƣờn ƣơm 60 Hình 4.13. Cây quang tự dƣỡng ngày thứ nhất ở vƣờn ƣơm Hình 4.14. Cây dị dƣỡng ngày thứ nhất ở vƣờn ƣơm 61 Hình 4.15. Cây quang tự dƣỡng ngày thứ 20 ở vƣờn ƣơm Hình 4.16. Cây dị dƣỡng ngày thứ 20 ở vƣờn ƣơm Hình 4.17. Cây dị dƣỡng và quang tự dƣỡng ngày thứ 20 ở vƣờn ƣơm 62 4.7. Tính toán sơ bộ chi phí cây Cúc in vitro của các loại hình nuôi cấy - Giá trị giao dịch của cây Cúc in vitro nuôi cấy theo phương pháp dị dưỡng trong bình thủy tinh (dung tích 300 ml) được dùng làm tiêu chuẩn. - Giá trị giao dịch của một cây Cúc cấy mô tiêu chuẩn tại Đà Lạt là: 500đ/cây. - Các chi phí ở các loại hình nuôi cấy được tính toán trên 1000 cây. - Tổng giá trị giao dịch của 1000 cây là: 500.000đ. - Các chi phí được liệt kê dưới đây là những chi phí có thể tính toán được một cách tương đối giữa các hệ thống. Những vật liệu được sử dụng cố định hoặc có thể tái sử dụng như: bình thủy tinh, vỉ xốp, giá nuôi cây... hoặc các yếu tố khác như: mặt bằng, trang thiết bị, vốn đầu tư... không được tính đến. 4.7.1. Chi phí trong việc sử dụng bình thủy tinh Bảng 4.7. Chi phí trong việc sử dụng bình thủy tinh Mục chi Đơn giá Lượng sử dụng Thành tiền (VNĐ) Công pha môi trường, quấn nút bông, rửa chai 40.000 đ/ngày 1 ngày 40.000 Agar 180.000 đ/kg 40 g 7.200 Đường 12.000 đ/kg 150 g 1.800 Điện thanh trùng 2.000 đ/KWh 6 KWh 12.000 Cồn 12.000 đ/l 0,5 l 6.000 Công cấy 40.000 đ/ngày 1,67 ngày 66.800 Điện thắp sáng trong 21 ngày 2.000 đ/KWh 67,2 KWh 134.400 Tổng chi phí 268.200  Ghi chú: - Mỗi bình thủy tinh được cấy với mật độ 10 mẫu/bình. Nên tổng số chai được sử dụng là 100 chai. - Mỗi lít môi trường được dùng cho 20 chai. - Lượng agar sử dụng cho 1 lít môi trường: 8 g/l. - Lượng đường sử dụng cho 1 lít môi trường là: 30 g/l. - Công cấy: 60 chai/ngày. - Điện thắp sáng: sử dụng 4 bóng đèn, mỗi bóng có công suất 40W, thắp 16 giờ/ngày, trong 21 ngày. 63 4.7.2. Chi phí trong việc sử dụng túi nylon kích cở nhỏ, nuôi cấy theo phƣơng pháp dị dƣỡng. Bảng 4.8. Chi phí trong việc sử dụng túi nylon kích cở nhỏ, nuôi cấy theo phƣơng pháp dị dƣỡng. Mục chi Đơn giá Lượng sử dụng Thành tiền (VNĐ) Túi nylon 50 đ/túi 100 5.000 Agar 180.000 đ/kg 40 g 7.200 Đường 12.000 đ/kg 150 g 1.800 Điện thanh trùng 2.000 đ/KWh 6 KWh 12.000 Công rót môi trường 40.000 đ/ngày ½ ngày 20.000 Công cấy 40.000 đ/ngày 1,25 ngày 50.000 Cồn 12.000 đ/l 0,25 l 3.000 Điện thắp sáng trong 21 ngày 2.000 đ/KWh 33,6 KWh 67,200 Tổng chi phí 166.200  Ghi chú: - Mỗi túi nylon được cấy với mật độ 10 mẫu/bịch. Nên tổng số bịch được sử dụng là 100 bịch. - Mỗi lít môi trường được dùng cho 20 bịch. - Lượng agar sử dụng cho 1 lít môi trường: 8 g/l. - Lượng đường sử dụng cho 1 lít môi trường là: 30 g/l. - Công cấy: 80 bịch/ngày - Điện thắp sáng: sử dụng 2 bóng đèn, mỗi bóng có công suất 40W, thắp 16 giờ/ngày, trong 21 ngày. 64 4.7.2. Chi phí trong việc sử dụng túi nylon kích cở nhỏ, nuôi cấy theo phƣơng pháp quang tự dƣỡng Bảng 4.9. Chi phí trong việc sử dụng túi nylon kích cở nhỏ, nuôi cấy theo phƣơng pháp quang tự dƣỡng Mục chi Đơn giá Lượng sử dụng Thành tiền (VNĐ) Túi nylon 50 đ/túi 100 5.000 Công dán lỗ thông khí 50 đ/túi 100 5.000 Điện thanh trùng 2.000 đ/KWh 6 KWh 12.000 Đất sạch 700 đ/kg 3 kg 2.100 Công đưa môi trường vào bịch 40.000 đ/ngày ½ ngày 20.000 Công cấy 40.000 đ/ngày 2 ngày 80.000 Cồn 12.000 đ/l 0,5 l 3.000 Điện thắp sáng trong 21 ngày 2.000 đ/KWh 1680 KWh 3.360 Tổng chi phí 130.460  Ghi chú: - Mỗi túi nylon được cấy với mật độ 10 mẫu/bịch. Nên tổng số bịch được sử dụng là 100 bịch. - Đất sạch và môi trường được trộn với tỷ lệ: 1:1,5 - Mỗi kg đất sạch được sử dụng cho 35 bịch. - Công cấy: 50 bịch/ngày - Điện thắp sáng: sử dụng 1 bóng đèn có công suất 18W, thắp bổ sung 4giờ/ngày, trong 21 ngày. 65 4.7.3. Chi phí trong việc sử dụng túi nylon kích cở lớn, áp dụng phƣơng pháp quang tự dƣỡng trong sản xuất giống Cúc đại trà Bảng 4.10: Chi phí trong việc sử dụng túi nylon kích cở lớn, áp dụng phƣơng pháp quang tự dƣỡng trong sản xuất giống Cúc đại trà Mục chi Đơn giá Lượng sử dụng Thành tiền (VNĐ) Túi nylon 1.000 đ/bịch 12 12.000 Công dán lỗ thông khí, làm lồng nylon, đưa môi trường vào vỉ, cấy các mẫu cấy 40.000 đ/ngày 1 ngày 40.000 Đất sạch 700 đ/kg 7,2 kg 5040 Điện thắp sáng trong 21 ngày 2.000 đ/KWh 1680 KWh 3.360 Tổng chi phí 60.400  Ghi chú: - Sử dụng vỉ xốp 84 lỗ. Nên tổng số vỉ xốp được sử dụng là 12 vỉ. - Đất sạch và môi trường được trộn với tỷ lệ: 1:1,5 - Mỗi kg đất sạch được dùng cho 140 lỗ. - Điện thắp sáng: sử dụng 1 bóng đèn có công suất 18W, thắp bổ sung 4giờ/ngày, trong 21 ngày. Kết luận sơ bộ: Từ Bảng tính toán chi phí trên, chúng tôi tính được giá trị giao dịch của một cây Cúc cấy mô ở từng loại hình nuôi cấy như sau: - Cây dị dưỡng nuôi cấy trong bình thủy tinh: 500 đ/cây (tiêu chuẩn). - Cây dị dưỡng nuôi cấy trong túi nylon: (500.000 đ – 268.200 đ + 166.200 đ)/1000 cây = 398 đ. Giá thành thấp hơn tiêu chuẩn là: 100 – (398 x 100)/500 = 20,4%. - Cây quang tự dưỡng nuôi cấy trong túi nylon: (500.000 đ – 268.200 đ + 130.460 đ)/1000 cây = 362 đ. Giá thành thấp hơn tiêu chuẩn là: 100 – (362 x 100)/500 = 27,6 %. - Cây quang tự dưỡng nuôi cấy trong các lồng nylon có kích cở lớn: (500.000 đ – 268.200 đ + 60.400 đ)/1000 = 292 đ. Giá thành thấp hơn tiêu chuẩn là: 100 – (292 x 100)/500 = 41,6 %. 66 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Căn cứ vào kết quả của các thí nghiệm tiến hành trong đề tài nghiên cứu nhỏ này, chúng tôi rút ra được một số nhận xét và kết luận kỹ thuật như sau:  Về nhận xét - Cây giống Cúc sản xuất qua phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng luôn có chất lượng, khả năng sinh trưởng và tỷ lệ sống sót vườn ươm cao hơn hẳn cây có nguồn gốc dị dưỡng. - Giá thành sản xuất cây quang tự dưỡng là thấp hơn cây dị dưỡng khoảng từ 27,6 % – 41,6 %.  Về kết luận kỹ thuật - Sự thông thoáng khí thích hợp cho các túi nylon là: sử dụng túi nylon có 1 lỗ thông khí. Lỗ thông khí được dán bởi 2 lớp giấy báo, có kích thước lỗ là 1cm x 3cm. Ở mức độ thông thoáng khí này, đảm bảo cho cây sử dụng có hiệu quả nguồn CO2 lấy từ môi trường bên ngoài và vẫn duy trì được ẩm độ trong môi trường nuôi cấy. - Sử dụng ánh sáng tự nhiên có thắp bổ sung ánh sáng đèn giúp cây sinh trưởng tốt hơn, cây có khả năng quang hợp mạnh. Đồng thời vẫn duy trì được sự sinh trưởng sinh dưỡng của cây. - Giá thể tốt nhất được dùng trong nuôi cấy quang tự dưỡng là xơ dừa và đất sạch. Đây là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền.Tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu ở từng địa phương mà chúng ta có thể lựa chọn một trong hai loại nguyên liệu trên. - Kích cở bịch càng lớn, cây vừa có thể sử dụng nguồn CO2 dự trữ trong bịch, vừa sử dụng nguồn CO2 lấy từ môi trường bên ngoài. Vì vậy sự sinh trưởng của cây tỷ lệ thuận với kích cở bịch. - Cây được nuôi cấy đại trà với số lượng lớn trên các vỉ xốp phủ bằng lồng nylon có kích cở lớn, ở điều kiện bán vô trùng, sinh trưởng tốt và vẫn duy trì được tính trẻ của cây. Điều đó có ý nghĩa rất lớn trong việc sản xuất cây cấy mô có chất lượng tốt và giá thành rẻ. Mức độ thông khí thích hợp cho các lồng nylon có kích cở lớn là: 2 lỗ thông khí, mỗi lỗ được dán 2 lớp giấy báo, có kích thước lỗ là 15cm x 3cm. 67 - Tại vườn ươm, cây quang tự dưỡng lấy từ các vỉ xốp bao phủ bằng lồng nylon (có lỗ thông khí) sinh trưởng và phát triển tốt hơn cây dị dưỡng lấy từ các túi nylon có kích cở nhỏ. Tỷ lệ sống của cây quang tự dưỡng cũng cao hơn so với cây dị dưỡng (100 % so với 92,5 %). 5.1. Đề nghị - Tiếp tục áp dụng mô hình nhân giống quang tự dưỡng cho các giống Cúc và các loại cây trồng có giá trị kinh tế khác. - Tiếp tục cấy chuyền cây quang tự dưỡng trong các lồng vỉ xốp và theo dõi sự sinh trưởng của chúng qua các thế hệ. - Tiếp tục nghiên cứu cường độ ánh sáng thích hợp cho sự sinh trưởng của cây quang tự dưỡng. 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003. Công nghệ mới trồng hoa cho thu nhập cao – cây hoa Cúc. Nhà xuất bản Lao Động – Xã Hội. 2. Hội nghị tổng kết NCCB trong KHTN khu vực phía nam năm 2005. Tuyển tập các báo cáo NCCB trong KHTN. 42 – 46. 3. Nguyễn Xuân Linh, 1998. Hoa và kỹ thuật trồng Hoa. Viện Khoa Học Kỹ thuật Việt Nam. Nhà xuất bản nông nghiệp. 4. Nguyễn Quang Thạch và Đặng Văn Đông, 2002. Cây hoa Cúc và kĩ thuật trồng. Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội. 5. Trần Văn Minh, 2003. Công nghệ sinh học thực vật. Giáo trình cao học – nghiên cứu sinh. Viện sinh học nhiệt đới. Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia. 6. Nguyễn Văn Uyển, 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật - tập II. Nhà xuất bản nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang 82 – 85. 7. Trần Thị Dung, 2005. Bài giảng nuôi cấy mô tế bào thực vật. Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM. 8. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lí thực vật đại cương. NXB Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. Tài liệu nƣớc ngoài 9. Reid MS.,1987. Ethylene in plant growth and development. In: plant Hormones and Their Role in Plant Growth and Development, Martinus Nijhoff Publ. Dordrecht, Boston, Lancaster 257-279. 10. Desjardins Y., 1995. Carbon nutrition in vitro regulation and manipulation of carbon assimilation in micropropagated systems. In: automation and environmental control in plant tissue culture. Aitken-Christie J, Kozai T, Smith ML (eds.), Kluwer Academic Publishers, the Netherland 441-471. 69 11. Kozai T., Afreen F., Zobayed S.M.A.., 2005. Photoautotrophic mircopropagation as a new propa-gation system and closer transplant production sys- tems. Sprenger, Dordrecht, The Netherlands, 354 pp. 12. Hdider C, Desjardins Y., 1994. Effects of sugar on photosynthesis and phsphoenolpyruvate carbocilase activity on in vitro cultured strawberry plantlets. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 36: 27-33. 13. Kozai T, Iwanami Y., 1988. Effects of CO2 enrichment and sucrose concentration under high photon on fluxes on plantlet growth of carnation (Dianthus caryophyllus L.) in tissue culture during the propagation stage. J. Jpn. Soc. Hortic. Sci. 57:279-288. 14. Fujiwara K, Kozai T., 1995. Control of environmetal factors plantlet production with some mathematical simolation. In: Proc. Intl. Symp. Ecophysiology and photosynthetic in vitro cultures. 15. Tanaka M, Fujiwara K and Kozai T.,1992. Effects of relative in the cultuer vevvel on the growth and shoot a longation of Potato (Solanum tuberrosum) plantlets in vitro. J. Japan Soc. Hort. Sci., 62(2): 413-417. 16. Nguyen Q.T and Kozai T., 1998. Environmental control and its effects on the growth of plantlets in micropropation. Environ. Control in Biol., 36(2): 59-57. 17. Robets, Smit E.F, Horan I, Walker S, Matthews D and Mottley J.,1994. Stage III techniques for improving water relations and autotrophy in micropropagated plant. In: Lumsdem, P.J.,JR. Nicolas and W.T. Davies. (eds). Physiology, grewth and development of Publishers, Dordrecht, the Nerthends. 18. Fujiwara K, and Kozai T., 1995. Control of environmental factors for plantlet production with some mathematical simulation. In Care, f. and P. Chagvardieff. (eds.) Pro. Intl. Symp. Ecophysiology and photosynthetic in vitro cultures. CEA cadarache, Cedex, France. 19. Quynh NT, Kozai T, Nguyen KL, Nguyen UV, 1999. Photoautotrophic Micropropagation of tropical plants. In: Plant Biotechnology and In vitro Biology in the 21 st Century. Proc. 9 th Intl. Congr. Of IAPTC, 14-19 June, 1998 Jerusalem. Israel. Kluwer Academic Publishers, Dordecht, The Netrerlands 659 – 662. 70 20. Nguyen Q.T, and Kozai T and U.V. Nguyen U.V., 1999. Effects of sucrose concentration, supporting material and number of air exchanges of the vessel on the growth of in vitro coffee plantlets. Plant Cell. Tissue and Organ Culture 58: 51-57. 21. Niu G and Kozai T., 1998. Simulation of CO2 conccentration the culture vessel and growth of plantlets in micropropation. Crop Models in Protected Cultivation, Ed. L.F.M. Marcelis. Acta. Hort. 22. Willmer EN, 1966. Cell and tissue in culture, Methods, Biology and Physiology 3: 1-825. 23. Zobayed SMA, Aftenn F, Kozai T., 2000. Quality biomass Production via photoautotrophic micropropagation. Acta Hort. 24. Kozai T., 1991. Photoautotrophic micropropagation. In vitro Cell Bio. Dev. 27: 47-51. 25. . Kozai T., 1996. Environmental control and effects in transplant production under artificial light. J. Kor. Soc. Hort. Cont. Sci., 114(2): 12-16. 26. Fujiwara K, Kozai T, Watanabe I., 1998. Development of a photoautotrophic tissue culture system for shoots and/or plantlets as rooting and acclimatization stages. Acta Hort. 230: 153-158. 27. Heo J. and Kozai T., 1999. Forced ventilation micropropagation system for enhancing photosynthesis, growth, and development of Sweetpotato plantlets. Environ. Control in Biol., 37(1): 83-92. 28. Woodward S., Thomson R.J. and Neale W., 1991. Observasions on the propafation of carnivorous plant by in vitro culture. Newsletter Int. Plant Pro. Soc. Spring. 29. Leshem B and Sachs F.,1985. Vitrified Dicurthus. Ann. Bot. S6, 613-617. Tài liệu từ internet 30. ry_of_physiology_of_photosynthesis/images/Posp%C3%AD%C5%A1ilov%C3 %A1%25201999%2520Acclimatization%2520of%2520micropropagated%252 0plants.pdf+photoautotrophic+chrysanthemum+filetype:pdf&hl=vi&gl=vn&ct= clnk&cd=5&lr=lang_en 71 31. 32. guidelines/flowers/Chrysanthemum/propagation.htm 33. fo/Archives/culture.htm+greenhouse+propagation+of+chrysanthemum&hl=vi& gl=vn&ct=clnk&cd=4 34. 35. 72 PHỤ LỤC Các thành phần của môi trường MS cơ bản Nguyên tố Nồng độ (mg/l) Nguyên tố đa lƣợng CaCl2 440 KNO3 1900 KH2PO4 170 NH4NO3 1650 MgSO4.7H2O 370 Nguyên tố vi lƣợng CoCl2.6H2O 0,025 CuSO4.5H2O 0,025 H3BO3 6,2 KI 0,83 MnSO4.H2O 22.3 Na2MoO4.H2O 0,25 ZnSO4.H2O 8,6 Fe – EDTA FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA.2H2O 37,3 Vitamine & aminoacid Glycine 2 Myo-Inositol 100 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine HCl 0,5 Thiamine-HCl 0,1 Các thành phần khác Đường 30 g/l Agar 8 g/l pH môi trường 5,7 – 5,8 73 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của sự thông khí đối với sự sinh trƣởng phát triển của cây Cúc in vitro trong điều kiện quang tự dƣỡng  Bảng phân tích biến lƣợng về gia tăng trọng lƣợng tƣơi BẢNG KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ANOVA A N A L Y S I S O F V A R I A N C E T A B L E Degrees of Sum of Mean Freedom Squares Square F-value Prob. --------------------------------------------------------------------------- Between 24 349666.402 14569.433 103.114 0.0000 Within 50 7064.735 141.295 --------------------------------------------------------------------------- Total 74 356731.136 Coefficient of Variation = 8.20% BẢNG KẾT QUẢ TRUNG BÌNH CÁC NGHIỆM THỨC 1 Number Sum Average SD SE ------------------------------------------------------------------ 1 3.00 318.500 106.167 18.41 6.86 2 3.00 338.800 112.933 11.70 6.86 3 3.00 644.200 214.733 7.03 6.86 4 3.00 608.500 202.833 27.42 6.86 5 3.00 745.800 248.600 8.05 6.86 6 3.00 673.700 224.567 10.30 6.86 7 3.00 342.600 114.200 5.66 6.86 8 3.00 247.300 82.433 17.66 6.86 9 3.00 104.700 34.900 2.82 6.86 10 3.00 426.800 142.267 3.46 6.86 11 3.00 493.300 164.433 7.88 6.86 12 3.00 468.100 156.033 7.10 6.86 13 3.00 242.200 80.733 11.08 6.86 14 3.00 388.400 129.467 5.63 6.86 15 3.00 472.500 157.500 3.61 6.86 16 3.00 950.700 316.900 29.38 6.86 17 3.00 540.100 180.033 4.97 6.86 18 3.00 577.000 192.333 7.21 6.86 19 3.00 410.900 136.967 8.39 6.86 20 3.00 91.800 30.600 2.03 6.86 21 3.00 114.600 38.200 0.60 6.86 22 3.00 570.300 190.100 15.50 6.86 23 3.00