Luận văn Nghiên cứu, xác định một s ố đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy và sự nhiễm khuẩn e.coli ở trâu nuôi tại Bảo Yên - Lào Cai và biện pháp phòng trị bệnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ HOÀNG LÂN NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY VÀ SỰ NHIỄM KHUẨN E.COLI Ở TRÂU NUÔI TẠI BẢO YÊN - LÀO CAI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ BỆNH LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM VŨ HOÀNG LÂN NGHIÊN CỨU, XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ CỦA HỘI CHỨNG TIÊU CHẢY VÀ SỰ NHIỄM KHUẨN E.COLI Ở TRÂU NUÔI TẠI BẢO YÊN - LÀO CAI VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ BỆNH LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Thú Y Mã số: 60.62.50 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN VĂN QUANG TS. TÔ LONG THÀNH THÁI NGUYÊN - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất cứ các công trình nào khác. Các tài liệu tham khảo, trích dẫn đều có nguồn gốc rõ ràng. Tác giả luận văn Vũ Hoàng Lân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành bản luận văn Thạc sỹ khoa học nông nghiệp tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ nhiệt tình của các cơ quan, các cấp lãnh đạo và cá nhân. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc và kính trọng tới tất cả các tập thể, cá nhân đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Quang – Trƣởng Khoa Chăn nuôi thú y, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên, TS. Tô Long Thành – Trung tâm chẩn đoán Quốc gia, TS. Đặng Xuân Bình – Phó giám đốc Trung tâm liên kết đào tạo và hợp tác Quốc tế, PGS. TS. Trần Thanh Vân – Trƣởng ban sau Đại học, Đại học Thái Nguyên, T.S Nguyễn Thuý Mỵ - Giảng viên khoa Chăn nuôi thú y, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên. Các thầy đã trực tiếp hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban giám hiệu, Khoa Sau Đại học, Khoa Chăn nuôi thú y cùng tập thể các thầy cô giáo Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên; Chi cục Thú y tỉnh Lào Cai, Trạm Thú y huyện Bảo Yên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn tới mọi ngƣời thân trong gia đình và toàn thể bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, chia sẻ giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi yên tâm hoàn thành nhiệm vụ. Tôi xin trân trọng gửi tới các Thầy, Cô giáo, các vị Hội đồng chấm luận văn lời cảm ơn chân thành và lời chúc tốt đẹp nhất. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2008 Tác giả Vũ Hoàng Lân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 MỤC LỤC Lời cam đoan Lời cảm ơn Mục lục Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục biểu đồ, đồ thị MỞ ĐẦU Trang 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu nghiên cứu 3 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Đại cƣơng về hội chứng tiêu chảy ở trâu 4 1.1.1. Một số nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy 4 1.1.2. Các biểu hiện bệnh lý lâm sàng của hội chứng tiêu chảy 9 1.1.3. Biện pháp phòng và trị bệnh tiêu chảy cho trâu 11 1.2. Những hiểu biết về vi khuẩn E.coli 14 1.2.1. Đặc trƣng về hình thái nhuộm màu 16 1.2.2. Đặc tính nuôi cấy 16 1.2.3. Đặc tính sinh hoá 17 1.2.4. Sức đề kháng 18 1.2.5. Cấu trúc kháng nguyên 19 1.2.6. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli 22 1.2.7. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E.coli 31 1.3. Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra ở trâu 32 1.3.1. Triệu chứng 32 1.3.2. Bệnh tích 32 1.3.3. Chẩn đoán 33 1.3.4. Phòng bệnh 33 1.3.5. Điều trị 34 1.4. Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nƣớc 35 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc 35 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nƣớc ngoài 36 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1. Đối tƣợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 38 2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 38 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 38 2.1.3. Thời gian nghiên cứu 38 2.2. Vật liệu dùng trong nghiên cứu 38 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm 38 2.2.2. Động vật thí nghiệm 38 2.2.3. Hóa chất, môi trƣờng thí nghiệm 38 2.2.4. Các loại kháng huyết thanh chuẩn để định type vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc 38 2.2.5. Máy móc, thiết bị 38 2.3. Nội dung nghiên cứu 38 2.3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai 38 2.3.2. Nuôi cấy, phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai 39 2.3.3. Xác định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn E.coli đã phân lập đƣợc 39 2.3.4. Xác định số lƣợng vi khuẩn E.coli trong phân trâu 39 2.3.5. Xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc 39 2.3.6. Kiểm tra độc lực vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai 39 2.3.7. Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập đƣợc với một số loại kháng sinh 39 2.3.8. Xác định một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở trâu 39 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 39 2.4.1. Phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ 39 2.4.2. Phƣơng pháp lấy mẫu 39 2.4.3. Phƣơng pháp phân lập và giám định vi khuẩn 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 2.4.4. Phƣơng pháp xác định số lƣợng vi khuẩn 40 2.4.5. Phƣơng pháp xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn E.coli 41 2.4.6. Xác định serotype kháng nguyên O vi khuẩn E.coli bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính 41 2.4.7. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn E.coli đƣợc phân lập trên chuột bạch 42 2.4.8. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc 42 2.4.9. Phƣơng pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng E.coli phân lập đƣợc 43 2.4.10. Phƣơng pháp xử lý số liệu 44 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45 3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai 45 3.1.1. Điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo đàn và theo cá thể 45 3.1.2. Điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo quy mô đàn 47 3.1.3. Điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo tuổi 49 3.1.4. Điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo mùa 52 3.2. Phân lập vi khuẩn E.coli trong phân trâu tiêu chảy và bình thƣờng 54 3.3. Giám định một số đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc 55 3.4. Kết quả xác định số lƣợng vi khuẩn E.coli trong phân trâu 58 3.4.1. Số lƣợng vi khuẩn khuẩn E.coli trong phân trâu ở trạng thái bình thƣờng 58 3.4.2. Số lƣợng vi khuẩn E.coli trong phân trâu ở trạng thái tiêu chảy 59 3.4.3. Kết quả đánh giá sự biến động số lƣợng vi khuẩn E.coli trong phân trâu ở trạng thái bình thƣờng và tiêu chảy 61 3.5. Kết quả xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc 63 3.5.1. Khả năng gây dung huyết của vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 ột số 64 3.6. ột số chủ .coli phân 65 3.7. 67 3.8. Kết quả của một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở trâu 69 Chƣơng 4 Ề NGHỊ 72 4.1. Kết luận 72 4.2. Đề nghị 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN AEEC BHI CPU ED EDP EHEC EMB EPEC ETEC HEM KN LT NXB P PCR RR SLT SLT1 SLT2 SS ST (a,b) ST1 Stx2e TSI UV VK VP VT2e VTEC : Adhenicia Enterropathogenic Escherichia coli : Brain-heart infusion : Colinial Forming Unit : Edema disease : Edema disease pathogenic : Entero heamorrhagic : Eosin Methylene Blue Agar : Enteropathogenic Escherichia coli : Enterotoxigenic Escherichia coli : Heamolysin : Kháng nguyên : Heat-Labile enterotoxin : Nhà xuất bản : Page : Polymerase Chain Reaction : Relative Risk : Shiga-like toxin : Shiga-like toxin 1 : Shiga-like toxin 2 : Samonella Shigella : Heat-Stabe Enterotoxin (a,b) : Heat-Stabe 1 : Shiga-toxin 2e : Triple Sugar Iron : Ultraviolet : Vi khuẩn : Voges Pros Kaver : Veterotoxin 2e : Verotoxigenic Escherichia coli Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Bảng DANH MỤC CÁC BẢNG SỐ LIỆU Trang 3.1. điều tra tình hình trâu mắc bệnh tiêu chảy theo đàn và theo cá thể 45 3.2. Kết quả điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo quy mô đàn 48 3.3. Kết quả điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo tuổi 50 3.4. Kết quả điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo mùa 53 3.5. Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli từ mẫu phân trâu khỏe và tiêu chảy 54 3.6. ợc 57 3.7. Kết quả xác định số lƣợng vi khuẩn E.coli trong phân trâu ở trạng thái bình thƣờng 58 3.8. Kết quả xác định số lƣợng vi khuẩn E.coli trong phân trâu ở trạng thái tiêu chảy 60 3.9. Sự biến động về số lƣợng vi khuẩn E.coli trong đƣờng tiêu hóa giữa trâu bình thƣờng và tiêu chảy 62 3.10. Kết quả xác định khả năng gây dung huyết của vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc 63 3.11. ột số 64 3.12. 66 3.13. 68 3.14. Kết quả của một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở trâu 70 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Biểu đồ DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang 3.1. Tỷ lệ trâu bị mắc bệnh tiêu chảy theo địa phƣơng 47 3.2. Tỷ lệ trâu mắc bệnh tiêu chảy theo quy mô đàn 49 3.3. Tỷ lệ trâu mắc bệnh tiêu chảy theo lứa tuổi 51 3.4. Tỷ lệ trâu mắc bệnh tiêu chảy theo mùa vụ 54 3.5. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn E.coli trong phân trâu ở trạng thái bình thƣờng và tiêu 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Trâu bò nói chung và đặc biệt là con trâu, đã từng gắn bó với nền văn minh lúa nƣớc và là một thành tố không thể thiếu trong đời sống tâm linh của ngƣời Việt Nam. Nhiều vùng nông thôn con trâu còn đƣợc coi nhƣ là một tài sản cố định hay một ngân hàng sống để đảm bảo an ninh kinh tế hộ gia đình. Uy tín và vị thế của một số ngƣời trong thôn bản nhiều khi phụ thuộc vào số lƣợng trâu mà họ có. Chăn nuôi trâu bò là kế sinh nhai, là một phƣơng tiện xoá đói giảm nghèo nhằm góp phần xây dựng nông thôn bền vững. Ngày nay, mặc dù có cơ khí hoá nông nghiệp nhƣng công việc làm đất nặng nhọc vẫn thu hút 70% trâu và 40% bò trong toàn quốc, đáp ứng khoảng trên 70% sức kéo trong nông nghiệp. Bên cạnh việc cung cấp sức kéo, nó còn cung cấp một lƣợng lớn nguồn phân bón hữu cơ cho trồng trọt, các sản phẩm phụ của con trâu nhƣ lông, da, sừng đƣợc sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến và thủ công mỹ nghệ. Đồng thời đây còn là nguồn cung cấp thực phẩm có giá trị kinh tế cao. Với những vai trò và ý nghĩa của ngành chăn nuôi trâu, những năm gần đây cùng với chủ trƣơng chính sách của Đảng và Nhà nƣớc trong chiến lƣợc kinh tế, phong trào chăn nuôi trâu đã và đang phát triển mạnh, đặc biệt là các tỉnh miền núi phía Bắc nƣớc ta. Vùng núi và trung du (gồm 13 tỉnh Đông Bắc và 3 tỉnh Tây Bắc) là những địa bàn phát triển chăn nuôi trâu, đàn trâu hiện có 1,7 triệu con, chiếm 50% tổng đàn trâu cả nƣớc (Trần Kim Anh, 2003 [2]). Các mô hình sind hóa đàn trâu bò theo quy mô từng hộ và trang trại phát triển khắp cả nƣớc, công tác quản lý giống, nuôi dƣỡng, chăm sóc đều đƣợc quan tâm cải tiến. Nhƣng công tác thú y, phòng và điều trị bệnh chƣa đƣợc chú ý đúng mức nên đã ảnh hƣởng không nhỏ về kinh tế cho ngƣời chăn nuôi. Bảo Yên là huyện vùng thấp của tỉnh Lào Cai, nằm cách trung tâm của tỉnh 75km về phía Đông Nam, có diện tích 82.090ha. Trong chiến lƣợc kinh tế xã hội tỉnh Lào Cai đến 2010, Bảo Yên là một huyện có vị thế quan trọng gắn Lào Cai với các tỉnh trung du Bắc Bộ cũng nhƣ các tỉnh vùng Tây Bắc. Trong các đề án về phát triển nông nghiệp của tỉnh, chăn nuôi đƣợc chọn là ngành phát triển chính và là khâu đột phá cho chuyển dịch cơ cấu phát triển nông Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 nghiệp của tỉnh. Trong đó ngành chăn nuôi trâu đƣợc quan tâm và đầu tƣ rất lớn. Sản phẩm chăn nuôi trâu thịt, trâu sinh sản tăng liên tục trong nhiều năm không những đã đáp ứng đủ cho nhu cầu thực phẩm trong tỉnh mà còn xuất ra tỉnh ngoài và tham gia xuất khẩu. Tuy nhiên chăn nuôi trâu ở Lào Cai cũng chịu ảnh hƣởng rất lớn của tình hình bệnh tật đặc biệt là hội chứng tiêu chảy. Hội chứng tiêu chảy gây thiệt hại lớn cho chăn nuôi các gia súc nói chung và chăn nuôi trâu nói riêng. Bệnh xảy ra ở mọi lứa tuổi: Trâu sinh sản, trâu thịt, trâu sau cai sữa, trâu theo mẹ. Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến hội chứng tiêu chảy của trâu nhƣ: Thức ăn, nƣớc uống không đảm bảo vệ sinh, chuồng trại ẩm thấp, thời tiết thay đổi …hoặc do các loại vi khuẩn: Escherichia, Salmonella sp, hay vi khuẩn yếm khí Chlostridium perfingens tuyp A, C cùng với các vi khuẩn khác nhƣ Lawsonia, interellulavis, Serpullina pilosicoli…Những vi rút gây tiêu chảy nhƣ vi rút viêm dạ dày truyền nhiễm, Rota virut và loại ký sinh trùng cũng gây bệnh tiêu chảy: Cầu trùng Coccidia, giun, sán,… Hội chứng tiêu chảy xảy ra quanh năm nhƣng nhiều nhất vào cuối Đông sang Xuân, cuối Xuân sang Hè, sau những đợt mƣa bão, khí hậu thay đổi đột ngột cho nên chăn nuôi trâu ở Lào Cai, dù là chăn nuôi tập trung trang trại hay chăn nuôi trong nông hộ, hội chứng tiêu chảy ở trâu các lứa tuổi vẫn đang là vấn đề nan giải. Hội chứng tiêu chảy có thể gây ra tình trạng thiếu sữa, bào thai phát triển chậm và khả năng nuôi con kém ở trâu, bò sinh sản. Bê, nghé giảm khả năng sinh trƣởng, còi cọc, tỷ lệ tử vong cao (Lê Minh Chí, 1995 [7]). Nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy, nhiều tác giả cho thấy, dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy thì hậu quả của nó bao giờ cũng gây ra viêm nhiễm, tổn thƣơng thực thể đƣờng tiêu hóa và cuối cùng là một “quá trình nhiễm trùng” (Roeder B.L, 1987 [93]; Hồ Văn Nam, 1985 [28]) Trong các nguyên nhân gây tiêu chảy cho trâu, vi khuẩn E.coli có một vai trò đặc biệt quan trọng, bởi vì ngoài tiêu chảy, vi khuẩn này còn gây chết cho trâu theo thể nhiễm trùng huyết, bại huyết, nhất là đối với nghé. Hiện nay đã có vắc xin để phòng bệnh do vi khuẩn E.coli gây ra cho trâu, nhƣng vấn đề này chƣa đƣợc nghiên cứu nhiều ở nƣớc ta, trong đó có địa bàn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. Vì vậy, để góp phần hạn chế bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra ở trâu và giải quyết yêu cầu cấp thiết cho ngành chăn nuôi trâu ở địa phƣơng, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu, xác định một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy và sự nhiễm khuẩn E.coli ở trâu nuôi tại Bảo Yên - Lào Cai và biện pháp phòng trị bệnh”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở trâu. - Xác định vai trò gây bệnh của vi khuẩn E.coli trong hội chứng tiêu chảy của trâu. - Xây dựng các phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở trâu do vi khuẩn E.coli gây ra đạt hiệu quả cao. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn - Đây là công trình nghiên cứu về sự liên quan giữa các yếu tố dịch tễ và vai trò của E.coli trong hội chứng tiêu chảy ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. - Công trình đã xác định đƣợc các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli. Từ đó, làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm hoàn thiện các nghiên cứu về vi khuẩn E.coli trong bệnh tiêu chảy ở trâu. - Xây dựng một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở trâu do vi khuẩn E.coli gây ra để góp phần khống chế bệnh trong thực tế sản xuất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đại cƣơng về hội chứng tiêu chảy ở trâu Hội chứng tiêu chảy ở gia súc nói chung và ở trâu nói riêng là một hiện tƣợng bệnh lý đặc thù của đƣờng tiêu hóa. Hiện tƣợng bệnh lý này rất phức tạp và đƣợc gây ra bởi sự tác động tổng hợp của nhiều yếu tố. Đã có rất nhiều các công trình nghiên cứu đƣợc đánh giá cao, làm cơ sở cho việc phòng và trị, đồng thời còn là cơ sở, nền tảng cho việc tiến hành các nghiên cứu tiếp theo về hội chứng tiêu chảy. Trâu là một loài gia súc nhai lại, đặc điểm về cấu tạo giải phẫu và về việc sử dụng thức ăn là có sự khác nhau cơ bản đối với những vật nuôi khác. Ngoài ra, với đặc thù của ngành chăn nuôi trâu bò nƣớc ta là thả rông và không có công tác kiểm tra thƣờng xuyên, nên trâu bò thƣờng xuất hiện nhiều hiện tƣợng bệnh lý, trong đó hội chứng tiêu chảy chiếm tỷ lệ cao. 1.1.1. Một số nguyên nhân gây hội chứng tiêu chảy 1.1.1.1. Do môi trường ngoại cảnh Môi trƣờng ngoại cảnh chính là môi trƣờng sống của các loài sinh vật, chúng bao gồm các yếu tố: khí hậu, thời tiết, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm, các điều kiện về chăm sóc nuôi dƣỡng, thức ăn, nƣớc uống… Nƣớc ta nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, thời tiết trong năm đƣợc chia thành 4 mùa rõ rệt: Xuân, Hè, Thu, Đông. Trong mỗi mùa đều có sự biến đổi về các yếu tố trên, và với sự biến đổi đó sẽ kéo theo sự biến đổi và phát triển của các loài vi sinh vật gây bệnh. Vụ Đông – Xuân, do điều kiện thời tiết, khí hậu thuận lợi nên các bệnh truyền nhiễm xảy ra mạnh, gây chết nhiều gia súc, trong đó bệnh phổ biến thƣờng gặp là bệnh ở đƣờng tiêu hóa. (Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1978 [40]; Đào Trọng Đạt, 1996 [9]). Trong các yếu tố khí hậu thì nhiệt độ lạnh và độ ẩm cao là hai yếu tố gây ảnh hƣởng nhiều nhất đến sức khỏe của trâu. Lạnh và ẩm gây rối loạn hệ thống điều hòa trao đổi nhiệt của cơ thể dẫn đến rối loạn quá trình trao đổi chất, làm giảm sức đề kháng của cơ thể, khi đó hệ vi sinh vật trong đƣờng tiêu hóa có thời cơ tăng cƣờng độc lực và gây bệnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 Theo Trịnh Văn Thịnh (1985) [53]; Hồ Văn Nam (1997) [29] cho thấy: Khẩu phần ăn cho vật nuôi không thích hợp, trạng thái thức ăn không tốt, thức ăn kém chất lƣợng nhƣ mốc, thối và nhiễm các tạp chất, các vi sinh vật có hại dễ dẫn đến rối loạn tiêu hóa kèm theo viêm ruột ỉa chảy ở gia súc. Thay đổi thức ăn đột ngột, đặc biệt là tăng lƣợng đạm và chất béo thƣờng làm cho bê, nghé rối loạn tiêu hóa, dẫn đến viêm ruột (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2002 [25]). Trong chăn nuôi trâu, việc thực hiện đúng quy trình chăm sóc, nuôi dƣỡng sẽ đem lại sức khỏe và khả năng sản xuất cho trâu. Khi thực hiện kỹ thuật chăm sóc không phù hợp đều có thể gây tiêu chảy cho trâu. 1.1.1.2. Do vi sinh vật * Tiêu chảy do virus Virus là những vi sinh vật cực kỳ nhỏ, ký sinh bắt buộc và chỉ phát triển trên tế bào sống của thực vật, động vật và vi khuẩn. Các virus gây bệnh đƣờng tiêu hóa thƣờng gây các triệu chứng nôn mửa kèm theo tiêu chảy có nhiều nƣớc, phân màu vàng hoặc hơi xanh, mùi hôi thối (Radostits O.M và cộng sự, 1994 [91]). Khooteng Huat (1995) [81] đã thống kê có hơn 10 loại virus có tác động làm tổn thƣơng đƣờng tiêu hóa, gây viêm ruột ỉa chảy nhƣ: Enterovirus, Rotavirus, Coronavirus,… Rotavirus và Coronavirus là những virus gây tiêu chảy quan trọng ở gia súc non mới sinh nhƣ nghé, cừu non, lợn con, ngựa con và đặc biệt là bê, do những virus này có khả năng phá hủy màng ruột và gây tiêu chảy nặng (Archie. H, 2000 [3]). Theo Phạm Sỹ Lăng (2002) [24], Pestivirut thuộc họ Togaviridae khi xâm nhập vào cơ thể trâu bò sẽ gây ra các triệu chứng chảy nƣớc dãi, nƣớc mũi, ỉa chảy liên tục, phân có máu, sợi huyết và màng niêm mạc ruột, gầy sút nhanh, ngừng nhai lại. * Tiêu chảy do vi khuẩn Vi khuẩn có khả năng gây bệnh là do chúng có độc lực, một mầm bệnh có độc lực là do nó có khả năng xâm nhập và phát triển trong cơ thể động vật, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 trong quá trình đó nó tiết ra những chất độc, những chất ngăn cản cơ năng bảo vệ của cơ thể. Vi khuẩn gây bệnh có khả năng xâm nhập vào tổ chức để sinh sôi, nảy nở và gây bệnh tích ở đó, ngoài ra còn có khả năng bài tiết huyết độc tố khuếch tán khắp trong cơ thể (ngoại độc tố) hoặc bài tiết ra sau khi chết (nội độc tố) bằng cách tự dung giải. Trong đƣờng tiêu hóa của động vật, các loại vi khuẩn có lợi tác dụng lên men, phân giải các chất trong đƣờng tiêu hóa, giúp cho sinh lý tiêu hóa diễn ra bình thƣờng, bên cạnh đó một số loài nhƣ: E.coli, Salmonella, Cl.perfringens,…là những vi khuẩn quan trọng gây rối loạn tiêu hóa, viêm ruột và tiêu chảy ở ngƣời cùng nhiều loài động vật khi có điều kiện thuận lợi. (Vũ Văn Ngũ 1979 [35]). Đào Trọng Đạt và cộng sự (1996) [10] cho biết: chiếm tỷ lệ cao nhất rong số các vi khuẩn đƣờng ruột gây tiêu chảy là E.coli (45,6%). Theo Tô Minh Châu (2000) [6] đã tiến hành giám định vi khuẩn E.coli của tổng số 90 mẫu lấy từ 6 trại chăn nuôi lợn quốc doanh khu vực thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả cho thấy serotuyp K88 chiếm tỷ lệ cao nhất, điều này phù hợp với nhận định cho rằng phần lớn lợn cai sữa bị tiêu chảy là do các chủng E.coli có K88 gây nên, chiếm tỷ lệ 58,3%. Radostits O.M và cộng sự (1994) [91] cho biết Salmonella là vi khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình gây ra hội chứng tiêu chảy. Theo nghiên cứu của Thái Thị Bích Vân và cộng sự (2007) [56] cho thấy: Trâu bị tiêu chảy có tỷ lệ nhiễm Salmonella cao hơn so với trâu bình thƣờng tƣơng ứng với tỷ lệ là 27,50% và 18,87%. Thành phần vi khuẩn trong phân bê, nghé tiêu chảy thấy tập trung có 4 loài: E.coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella, trong đó chủ yếu là E.coli và Salmonella có tỷ lệ nhiễm cao (72,48%, 51,32%) (Nguyễn Ngã và cộng sự, 2000 [32]). Vũ Đạt, Đoàn Thị Băng Tâm (1995) [8] đã chứng minh vai trò của Salmonella trong hội chứng tiêu chảy của trâu, bò, bê, nghé và thông báo: Trâu, nghé khỏe mạnh có tỷ lệ nhiễm Salmonella từ 23,30% - 31,07%. Trong trƣờng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 hợp tiêu chảy, tỷ lệ này tăng lên 37,50% (ở trâu) và 71,43% (ở nghé), đồng thời có hiện tƣợng bội nhiễm rõ. Theo Phan Thanh Phƣợng và cộng sự (1996) [41] cho biết: vi khuẩn Cl.perfrigens là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng trong hội chứng tiêu chảy ở lợn lứa tuổi 1 – 60 ngày và 60 – 120 ngày. Lƣợng vi khuẩn yếm khí có trong 1g phân lợn bình thƣờng là 4,2 triệu/g, ở lợn bị bệnh lên tới 7,6 triệu/g phân. Các tác giả Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, Đỗ Ngọc Thúy (1999) [39] cho biết: 70 mẫu bệnh phẩm của lợn mắc bệnh tiêu chảy ở các lứa tuổi khác nhau, đã phân lập đƣợc 60 chủng E.coli, chiếm 85,75% và Salmonella chiếm 80%. Từ kết quả này tác giả đã khẳng định hai loại vi khuẩn E.coli và Salmonella đóng vai trò chính gây chứng tiêu chảy. Xoắn khuẩn Spirochaetaceae serpulina, Treponema hyodysenteriae là nguyên nhân chính gây bệnh hồng lỵ ở lợn. Bệnh có triệu chứng đặc trƣng là sốt cao, ỉa chảy, phân có lẫn máu và vàng niêm mạc với dịch lầy nhầy, tỷ lệ chết 30% - 50%. Bệnh càng trầm trọng hơn nếu kế phát các vi khuẩn nhƣ E.coli, Salmonella (Nguyễn Hữu Vũ và cộng sự, 2000 [57]). * Tiêu chảy do nấm mốc Nấm mốc là vi sinh vật có cấu tạo gần giống với giới thực vật, sống ký sinh hay hoại sinh trên nhiều chất khác nhau, đặc biệt là các chất hữu cơ. Ngƣời ta tìm thấy nấm mốc ở khắp mọi nơi, từ phân, đất, cây cối mục nát, quần áo, giày dép, ngay cả trên cơ thể sống của động vật. Trong tự nhiên, các nhà khoa học đã tìm ra khoảng 240 loài nấm mốc có khả năng sản sinh ra độc tố, trong đó có trên 20 loài có khả năng gây bệnh có tính chất nghiêm trọng cho ngƣời và vật nuôi (Dakashinamuthy A, 1991 [63]). Độc tố Aflatoxin gồm có B1, B2, G1, G2 làm ức chế quá trình tổng hợp protein, men tiêu hóa, men gan, gây thiếu protein, men, gây nhiễm mỡ, thoái hóa gan, giảm chức năng hoạt động của các cơ quan và dẫn đến hiện tƣợng tiêu chảy. Nguyễn Hữu Nam (1999) [30] cho biết: sự có mặt của nấm mốc sẽ phá hủy các thành phần các chất dinh dƣỡng, gây giảm chất lƣợng thức ăn và dễ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 gây ra chứng ngộ độc. Những biểu hiện thƣờng gặp nhƣ: ngứa ngáy, lở loét, biến loạn thần kinh và những rối loạn về tiêu hóa. Theo Đậu Trọng Hào (2003) [17] cho biết: T – 2 Toxin và DAS gây kích ứng trên da, làm cho con vật khó chịu. Ở lƣợng độc tố cao có thể dẫn đến sự hủy hoại da, DAS và T – 2 Toxin cũng gây giảm bạch cầu, viêm dạ dày và ruột, yếu cơ tim, làm sảy thai và giảm khả năng tái tạo máu. Gia súc ăn phải thức ăn có chứa DAS hoặc T – 2 Toxin có thể dẫn tới giảm trọng lƣợng, ỉa chảy, bỏ ăn, gây nôn mửa. Nhiễm độc Aflatoxin ở đại gia súc ít gặp hơn ở gia cầm và lợn tuy nhiên khi trâu, bò ăn phải thức ăn có chứa sẵn hàm lƣợng Aflatoxin nhƣ: bã lạc, bã khô dầu bông,… thì sẽ tác động đến hệ vi sinh vật dạ cỏ, gây hiện tƣợng rối loạn hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa và có thể dẫn đến ỉa chảy. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về các phƣơng pháp phân hủy Aflatoxin và có những kết luận sau: - Việc loại bỏ hoặc làm giảm lƣợng Aflatoxin bằng phƣơng pháp cơ học và vật lý nhƣ: phân hủy Aflatoxin bằng không khí nóng, phân hủy Aflatoxin bằng hấp ƣớt ở áp xuất cao, làm giảm Aflatoxin bằng phƣơng pháp hấp phụ, phân hủy Aflatoxin bằng nhiệt, tách Aflatoxin bằng dung môi hữu cơ, phân hủy Afltoxin bằng các tia xạ,…có thể mang lại những kết quả khả quan. - Phƣơng pháp hóa học sử dụng nhằm vô hoạt hay giảm lƣợng Aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi đã đƣợc nhiều tác giả nghiên cứu và đƣợc ứng dụng ở nhiều nơi: oxy hóa khử, sử dụng các chất kiềm, sử dụng khí NH3, sử dụng Formaldehyd, bisunfit và axit. - Ngoài ra ta còn có thể sử dụng phƣơng pháp vi sinh vật để làm giảm lƣợng Aflatoxin trong thức ăn. Nấm Candida albicans là một trong những nguyên nhân gây ỉa chảy ở bê, nghé. (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2002 [24]). 1.1.1.2. Do ký sinh trùng Ký sinh trùng là những sinh vật sống nhờ vào sinh vật khác đang sống, chiếm đoạt chất dinh dƣỡng của sinh vật đó để sống và phát triển. Bệnh ký sinh trùng đƣờng tiêu hóa gây ra cho trâu không thành ổ dịch nguy hiểm, không làm cho trâu chết nhiều nhƣng chúng gây ra các hậu quả nghiêm trọng: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 làm giảm sinh trƣởng và phát triển, cơ thể gầy yếu nên dễ kế phát các bệnh truyền nhiễm khác, làm số lƣợng và chất lƣợng thịt giảm,…. Nguyễn Thị Kim Lan và cộng sự (2006) [22] cho biết: Các loài ký sinh trùng gây tiêu chảy cho trâu thƣờng gặp là: Nematode, Strongyloides, Ascaris suum, Fasciola herpatica. Qua việc nghiên cứu tình hình nhiễm giun sán đƣờng tiêu hóa của trâu bò, Nguyễn Thị Lan Anh và cộng sự, 2000 [1] cho biết: Trâu bò bị nhiễm giun sán đƣờng tiêu hóa rất sớm và nhiễm ở mọi lứa tuổi, đặc biệt lứa tuổi từ 1 đến 4 tháng tuổi, tỷ lệ nhiễm giun tròn là 82,1%. Kết quả điều tra đã xác định 16 loài giun đã ký sinh trên đƣờng tiêu hóa của trâu bò tại Daklak, trong đó có 1 loài ký sinh ở gan, 11 loài ở dạ cỏ, 1 loài ở dạ múi khế, 2 loài ở ruột non và 1 loài ở ruột già. Loài gây tác hại nặng nhất cho trâu bò là Fasciola spp, ký sinh ở ống dẫn mật, làm rối loạn chức năng sinh lý bình thƣờng của gan, dẫn đến gia súc gầy yếu và rối loạn tiêu hóa (Nguyễn Văn Diên, Phan Lục, Phạm Sỹ Lăng, 2006 [11]). Giun đũa Toxocara vitulorum thƣờng gây ỉa chảy phân trắng cho bê, nghé non 1 – 3 tháng tuổi. Sán lá gan Fasciola gigantica trong quá trình ký sinh cũng tiết độc tố gây ỉa chảy cho bê non. Những ký sinh trùng thƣờng là nguyên nhân tiền phát cho nhiễm khuẩn và ỉa chảy nặng ở bê nghé. (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2002 [24]). Lê Văn Năm (2004) [31] cho biết: ở lợn con, bê, nghé nhiễm cầu trùng, do các kỹ thuật viên thƣờng sai sót trong chẩn đoán, dẫn tới 30 – 50% gia súc non bị bệnh chết, số còn lại còi cọc và chậm lớn. Phạm Sỹ Lăng và cộng sự (2002) [25] cho biết: giun đũa A.suum trƣởng thành cƣ tú ở ruột non gây viêm niêm mạc ruột, gây loét niêm mạc, làm gia súc đau bụng và ỉa chảy. 1.1.2. Các biểu hiện bệnh lý lâm sàng của hội chứng tiêu chảy 1.1.2.1. Bệnh lý Nghiên cứu bệnh lý viêm ruột ỉa chảy ở gia súc, các tƣ liệu công bố tập chung chủ yếu về biến đổi tổ chức, tình trạng mất nƣớc và mất chất điện giải, trạng thái trúng độc của cơ thể bệnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Về giải phẫu bệnh, nhiều tài liệu cho thấy, viêm ruột ở gia súc thƣờng là thể cata - viêm chủ yếu trên niêm mạc ruột. Những trƣờng hợp viêm dạ dày - ruột, viêm ở tầng sâu là rất ít. Kết quả khảo sát của Mowwen J.M.V.M (1972) [86] cho thấy: viêm ruột niêm mạc ruột non chủ yếu là ở không tràng, hồi tràng, các lông nhung bị teo ngắn, biến dạng, tuyến Lieberkun tăng sinh sâu, các biểu mô phủ lông nhung biến dạng. Những biến đổi về tổ chức niêm mạc ruột của gia súc: niêm mạc ruột non xung huyết nhẹ, lớp hạ niêm mạc phù nhẹ, có nhiều tế bào ái toan thâm nhiễm, nhung mao ruột biến dạng, bề mặt biểu bì thoái hoá. Hệ thống nhung mao bị tổn thƣơng, hàng loạt men tiêu hoá bị ức chế. Về các chỉ tiêu huyết học, Macfaslance W.V và cộng sự (2003) [84] nhận xét: Khi gia súc bị viêm ruột mãn thì cơ quan tạo máu bị ảnh hƣởng và số lƣợng hồng cầu trong máu thấp. Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng gây tác hại trong hệ thống tiêu hóa của súc vật. Chúng xâm nhập qua những chỗ tổn thƣơng của niêm mạc dạ dày, nhung mao ruột rồi phát triển rất nhanh và tiết ra độc tố hoặc các men phá hoại tổ chức nhung mao, làm tróc ra từng mảng và chảy dịch ruột, đồng thời làm mất khả năng hấp thu chất dinh dƣỡng. Ngoài ra, vi khuẩn còn làm vỡ các mao mạch trong lớp cơ tiếp giáp với nhung mao của ruột và gây xuất huyết ruột. Rối loạn tiêu hóa dẫn đến tiêu chảy sẽ gây cho gia súc có những biểu hiện nhƣ mất nƣớc và chất điện giải, biến đổi về các tổ chức trong cơ thể, giảm trọng lƣợng,… Theo David F Sennior (1990) [64]; Lê Minh Chí (1995) [7] cho rằng: Khi cơ thể bị mất nƣớc sẽ gây ra hiện tƣợng giảm thể tích máu trong hệ thống huyết quản, làm thành phần hữu hình của máu cô đặc lại, tăng độ đặc của huyết thanh gây trở ngại tuần hoàn, quá trình này kéo dài dẫn đến nhiễm độc toan cho cơ thể. Ở gia súc ỉa chảy, nếu lƣợng dịch mất đi trong đƣờng ruột vƣợt quá lƣợng dịch đƣa vào khi ăn hoặc uống, thận sẽ cố gắng bù lại bằng cách cô đặc nƣớc tiểu để giảm lƣợng nƣớc thải ra. Nếu thận không bù đƣợc, mức dịch thể trong tổ chức bị giảm và máu bị đặc lại, hiện tƣợng này gọi là mất nƣớc và triệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 chứng lâm sàng là yếu, bỏ ăn, thân nhiệt thấp và có thể trụy tim, mắt bị hõm sâu, nhìn lờ đờ, da khô và khi véo lên thì nếp da chậm trở lại vị trí cũ. (Archie. H, 2000 [3]). Bệnh lý của sự mất nƣớc đƣợc biểu hiện qua giảm khối lƣợng của cơ thể cũng nhƣ trạng thái lâm sàng. Mất nƣớc độ I biểu hiện bằng giảm từ 1% đến 5% khối lƣợng cơ thể, mất nƣớc độ II khối lƣợng cơ thể giảm từ 6% đến 8%, mất nƣớc độ III khối lƣợng cơ thể giảm từ 9% đến 11%, và mất nƣớc độ IV khối lƣợng cơ thể giảm từ 12% đến 14%. (Phạm Ngọc Thạch, 1998 [50]). Nhƣ vậy khi bị viêm ruột, cơ thể không những không hấp thu đƣợc nƣớc do thức ăn đem vào mà còn có thể mất cả nƣớc do tiết dịch ra nữa. Mặt khác khi viêm ruột tính mẫn cảm tăng, nhu động ruột tăng lên nhiều lần. Hơn nữa do tổ chức bị tổn thƣơng, niêm mạc tăng tiết làm cho dịch rỉ viêm và dịch tiết có thể tăng gấp 80 lần bình thƣờng. 1.1.2.2. Triệu chứng lâm sàng Súc vật có thời gian ủ bệnh 2 – 3 ngày, sau đó biểu hiện các triệu chứng lâm sàng đặc trƣng: Con vật uống nhiều nƣớc, ăn ít hoặc bỏ ăn, không nhai lại, thức ăn bị đầy ứ trong dạ dày, lá sách bị cứng. Sau đó con vật ỉa chảy, đầu tiên phân sệt, vài ngày sau ỉa chảy nặng, phân chỉ là dịch màu xám xanh, xám vàng và có mùi tanh. Trƣờng hợp nặng, gia súc còn bị xuất huyết ruột, phân lẫn máu và niêm mạc ruột lầy nhầy. Bê, nghé ỉa chảy nặng có thể 10 – 15 lần/ngày, mất nƣớc nhanh làm cho con vật trũng mắt, da nhăn nheo, rối loạn các chất điện giải và chết trong tình trạng mất nƣớc. Súc vật thƣờng bị chết sau 3 – 4 ngày với tỷ lệ cao 30 – 40% nếu nhƣ không điều trị kịp thời. (Phạm Sỹ Lăng và cộng sự, 2002 [25]). 1.1.3. Biện pháp phòng và trị bệnh tiêu chảy cho trâu 1.1.3.1. Điều trị Theo nghiên cứu của tác giả Phạm Sỹ Lăng và cộng sự (2002) [25] có thể điều trị hội chứng ỉa chảy theo một trong các phác đồ sau: Phác đồ 1: Điều trị ỉa chảy do nhiễm khuẩn - Điều trị nguyên nhân: phối hợp kháng sinh và Sulfamid Kanamycin: 20 - 30mg/kg thể trọng/ngày Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Tetracylin: 20 - 30mg/kg thể trọng/ngày Bisepton hoặc Sulfaguanidin: 30-50mg/kg thể trọng/ngày. Thuốc kháng sinh có thể cho uống hoặc tiêm, Sulfamid cho uống. Ba loại thuốc phối hợp dùng liên tục 3 - 5 ngày. Mỗi liều thuốc chia làm hai liều nhỏ cho súc vật uống, ngày 2 lần. - Điều trị triệu chứng: + Chống mất nƣớc: truyền huyết thanh mặn ngọt vào tĩnh mạch, cứ 1000ml/100kg thể trọng/ngày. Nếu không có huyết thanh mặn ngọt, cho súc vật uống dung dịch Oresol. Cách sử dụng: Oresol 1 gói 20g (đóng sẵn) Nƣớc đun sôi để nguội : 1 lít. Pha xong cho súc vật uống dần. Gói đã pha chỉ dùng trong một ngày. + Chống chảy máu ruột: tiêm vitamin K, C. - Thuốc trợ tim mạch: Tiêm vitamin B1, long não nƣớc hoặc cafein. - Hộ lý: cho súc vật ăn nhẹ, giảm lƣợng rơm cỏ để tránh cọ xát vào niêm mạc ruột, cho ăn thêm cháo gạo. Cách ly súc vật ốm khi điều trị. Giữ gìn vệ sinh chuồng trại khi có bệnh sảy ra. Phác đồ 2: Điều trị ỉa chảy do nhiễm khuẩn - Điều trị nguyên nhân: phối hợp kháng sinh va sulfamid. Kanamycin: 20 - 30mg/kg thể trọng/ngày. Oxytetracylin: 20-30mg/kg thể trọng/ngày. Bisepton hoặc Sulfaguanidin: 30-50mg/kg thể trọng/ngày. Thuốc kháng sinh có thể uống hoặc tiêm. Sulfamid cho uống, dùng phối hợp liên tục 3-4 ngày. - Điều trị triệu chứng: + Chống mất nƣớc: truyền huyết thanh mặn ngọt vào tĩnh mạch, cứ 1000ml/100kg thể trọng/ngày. Nếu không có huyết thanh mặn ngọt, cho súc vật uống dung dịch Oresol. Cách sử dụng: Oresol 1 gói 20g (đóng sẵn) Nƣớc đun sôi để nguội : 1 lít. Pha xong cho súc vật uống dần. Gói đã pha chỉ dùng trong một ngày. + Chống chảy máu ruột: tiêm vitamin K, C. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 - Thuốc trợ tim mạch: Tiêm vitamin B1, long não nƣớc hoặc cafein. - Hộ lý: cho súc vật ăn nhẹ, giảm lƣợng rơm cỏ để tránh cọ xát vào niêm mạc ruột, cho ăn thêm cháo gạo. Cách ly súc vật ốm khi điều trị. Giữ gìn vệ sinh chuồng trại khi có bệnh sảy ra. Phác đồ 3: Điều trị do nhiễm nấm và nhiễm khuẩn - Thuốc điều trị: phối hợp kháng sinh chống nhiễm khuẩn, chống nấm và Sulfamid. Kanamycin: 20-30mg/kg thể trọng/ngày. Nystatin: 20mg/kg thể trọng/ngày. Bisepton hoặc Sulfaguanidin: 40mg/kg thể trọng/ngày. Cho súc vật uống phối hợp 3 loại thuốc trong 3 - 4 ngày. Liều thuốc trên chia 2 lần cho uống trong ngày. - Điều trị triệu chứng: + Chống mất nƣớc: truyền huyết thanh mặn ngọt vào tĩnh mạch, cứ 1000ml/100kg thể trọng/ngày. Nếu không có huyết thanh mặn ngọt, cho súc vật uống dung dịch Oresol. Cách sử dụng: Oresol 1 gói 20g (đóng sẵn) Nƣớc đun sôi để nguội : 1 lít. Pha xong cho súc vật uống dần. Gói đã pha chỉ dùng trong một ngày. + Chống chảy máu ruột: tiêm vitamin K, C. - Thuốc trợ tim mạch: Tiêm vitamin B1, long não nƣớc hoặc cafein. Thuốc trợ sức: nhƣ phác đồ 1 - Hộ lý: cho súc vật ăn nhẹ, giảm lƣợng rơm cỏ để tránh cọ xát vào niêm mạc ruột, cho ăn thêm cháo gạo. Cách ly súc vật ốm khi điều trị. Giữ gìn vệ sinh chuồng trại khi có bệnh sảy ra. Phác đồ 4: Điều trị ỉa chảy do giun tròn và nhiễm khuẩn (giun đũa, giun xoắn dạ dày, giun tóc…) - Thuốc điều trị: phối hợp thuốc tẩy giun và kháng sinh. + Tẩy giun: dùng 1 trong 2 loại thuốc sau: Mebedazol: 10-15mg/kg thể trọng/ngày. Tetramisol: 7-10mg/kg thể trọng/ngày. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Thuốc tẩy chỉ dùng một lần. Chỉ dùng thuốc tẩy khi phát hiện trong phân súc vật có các loại trứng giun và có dấu hiệu lâm sàng nhiễm giun. + Chống nhiễm khuẩn: phối hợp kháng sinh và Sulfamid: Oxytetracylin: 20-30mg/kg thể trọng/ngày. Bisepton : 40-50mg/kg thể trọng/ngày. Phối hợp 2 loại thuốc dùng liền trong 3-4 ngày. - Điều trị triệu chứng: + Chống mất nƣớc: truyền huyết thanh mặn ngọt vào tĩnh mạch, cứ 1000ml/100kg thể trọng/ngày. Nếu không có huyết thanh mặn ngọt, cho súc vật uống dung dịch Oresol. Cách sử dụng: Oresol 1 gói 20g (đóng sẵn) Nƣớc đun sôi để nguội : 1 lít. Pha xong cho súc vật uống dần. Gói đã pha chỉ dùng trong một ngày. + Chống chảy máu ruột: tiêm vitamin K, C. - Thuốc trợ tim mạch: Tiêm vitamin B1, long não nƣớc hoặc cafein.Thuốc trợ sức: nhƣ phác đồ 1 - Hộ lý: cho súc vật ăn nhẹ, giảm lƣợng rơm cỏ để tránh cọ xát vào niêm mạc ruột, cho ăn thêm cháo gạo. Cách ly súc vật ốm khi điều trị. Giữ gìn vệ sinh chuồng trại khi có bệnh sảy ra. 1.1.3.2. Phòng bệnh Phát hiện sớm súc vật bị bệnh, cách ly điều trị kịp thời. Thực hiện vệ sinh thú y: cho bò ăn sạch, uống sạch, ở sạch. Phân phải ủ để diệt mầm bệnh. Định kỳ tẩy uế chuồng trại và bãi chăn thả, giữ vệ sinh môi trƣờng. Chăm sóc tốt đàn trâu, bò, nhất là bê, nghé non và cho ăn đúng khẩu phần đảm bảo đủ dinh dƣỡng, không thay đổi thức ăn quá đột ngột. 1.2. Những hiểu biết về vi khuẩn E.coli Trực khuẩn ruột già Escherichia coli thuộc giới Bacteria, ngành Proteobacteria, lớp Gamma proteobacteria, bộ Enterobacteriales, họ Enterobacteriaceae, chi Escherichae, loài Escherichia. Trong số các loài vi khuẩn hiếu khí trong đƣờng tiêu hoá của động vật thì E.coli là loài vi khuẩn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 chiếm nhiều nhất (Bộ môn vi sinh vật trƣờng Đại học Y Khoa Hà Nội, 1993 [5]). Trực khuẩn ruột già Escherichia còn có tên khoa học là Bacterium coli commune, hay Bacilus Colicommunis do bác sỹ nhi khoa Đức Escherich phân lập từ phân của trẻ em bị tiêu chảy, năm 1885 (Nguyễn Vĩnh Phƣớc, 1978 [40]; Nguyễn Lân Dũng, 1976 [13]). Vi khuẩn do Escherich phát hiện từ trong tã lót của trẻ em đƣợc công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune. Chỉ 4 năm sau, năm 1889, vi khuẩn kia đƣợc giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân ngƣời có công khám phá. Năm 1895, nó lại đƣợc gọi bằng tên Bacillus coli. Năm 1896, gọi thành Bacterium coli. Sau nhiều kiểu gọi, đến năm 1991, vi khuẩn kia đƣợc định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli. Nơi cƣ trú chính của Escherichia coli thƣờng ở phần sau của ruột, ít khi ở dạ dày hay ở phần trƣớc ruột của các loài động vật nhƣ: ngựa, bò, dê, cừu, lợn, chó, mèo, gia cầm và ngƣời. Chúng theo phân của ngƣời hay gia súc đào thải ra ngoài, loài vật ăn thịt bài tiết nhiều E.coli hơn loài ăn cỏ. E.coli xuất hiện và sinh sống rất sớm ở đƣờng ruột ngƣời và động vật chỉ vài giờ sau khi sinh (sau khi đẻ 2 giờ) và tồn tại đến khi con vật chết. Theo Nguyễn Nhƣ Thanh và cộng sự (2001) [52]: Các chủng E.coli không gây bệnh mà chỉ khi các điều kiện nuôi dƣỡng, chăm sóc, vệ sinh thú y kém và trên cơ sở mắc kế phát sau các bệnh ký sinh trùng, bệnh virus, bệnh CRD dẫn đến sức chống đỡ của con vật suy giảm thì vi khuẩn E.coli trở nên cƣờng độc và có khả năng gây bệnh. E.coli đƣợc chia làm các Serotype khác nhau dựa trên cấu trúc kháng nguyên O, K, H và F. Hiện nay ngƣời ta đã xác định đƣợc 170 yếu tố quyết định kháng nguyên O, 70 yếu tố quyết định kháng nguyên K, 56 yếu tố quyết định kháng nguyên H và một số yếu tố quyết định kháng nguyên F (Fairbrother J. M, 1992 [69]; Carter G. R. Chengappa M. M; Roberts A. W, 1995 [61]). Những chủng E.coli phổ thông về mặt huyết thanh học đƣợc chia thành một số type. Một số của những type này đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh cho gia súc, gia cầm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 1.2.1. Đặc trưng về hình thái nhuộm màu E.coli là một trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thƣớc 2 - 3 x 0,6  . Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. Trong canh trùng già đôi khi thấy những trực khuẩn dài 4 - 8  . Phần lớn E.coli di động do có lông ở xung quanh thân, nhƣng 1 số không thấy di động. Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô. Vi khuẩn E.coli bắt màu Gram (-), có thể bắt màu đều hoặc sẫm hai đầu, khoảng giữa nhạt hơn. Nếu lấy vi khuẩn từ khuẩn lạc nhầy nhuộm có thể thấy giáp mô, còn khi soi tƣơi thì không thể thấy đƣợc (Nguyễn Nhƣ Thanh và cộng sự, 1997 [51]). Nếu cố đinh bằng axit osmic rồi quan sát dƣời kính hiển vi điện tử thấy tế bào E.coli có nhân, đó là một khối tối nằm trong nguyên sinh chất màu sáng. 1.2.2. Đặc tính nuôi cấy E.coli phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, một số chủng còn có thể nuôi cấy đƣợc ở môi trƣờng tổng hợp đơn giản nên ngƣời ta đã chọn chúng để nghiên cứu về sinh vật học. E.coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tuỳ tiện, có thể sinh trƣởng ở nhiệt độ: 5- 40°C, nhiệt độ thích hợp là 37°C. Phát triển đƣợc ở pH từ 5,5 – 8, pH thích hợp là: 7,2 – 7,4.(Nguyễn Nhƣ Thanh và cộng sự, 1997 [51]). Môi trƣờng thạch thƣờng: sau 24 giờ nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc tròn, ƣớt, bóng láng, không trong suốt màu tro nhạt, hơi lồi, đƣờng kính 2 – 3 mm. Nuôi lâu khuẩn lạc chuyển màu gần nhƣ nâu nhạt và mọc rộng ra. Có thể quan sát cả những khuẩn lạc dạng M và R. Môi trƣờng thạch thịt Pepton: sau 18 – 24 giờ bồi dƣỡng trong tủ ấm 37°C, chúng mọc thành những khuẩn lạc ẩm ƣớt, ánh màu xám, kích thƣớc trung bình, dạng tròn, mặt khuẩn lạc hơi lồi lên, có nếp nhăn và bề mặt láng. Môi trƣờng nƣớc thịt: vi khuẩn phát triển tốt, môi trƣờng rất đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng mỏng trên mặt môi trƣờng, môi trƣờng có mùi phân thối. Môi trƣờng Mule Kopman (Mulle Kauffman), môi trƣờng lục Malasit (Malachit) E.coli không mọc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Môi trƣờng thạch máu: Sau 24 giờ ở 37°C hình thành khuẩn lạc màu sáng, kích thƣớc 1 – 2 mm tuỳ thuộc vào chủng và Serotype. Môi trƣờng Endo: vi khuẩn hình thành khuẩn lạc màu mận chín, có ánh kim hoặc không có ánh kim. Môi trƣờng EMB có khuẩn lạc tím đen. Môi trƣờng thạch SS: E.coli có khuẩn lạc màu đỏ. E.coli bị ức chế ở môi trƣờng Vison – Blai. 1.2.3. Đặc tính sinh hoá * Chuyển hoá đƣờng E.coli lên men sinh hơi các loại đƣờng: Fructoz, Glucoz, Galactoz, Lactoz, Maniton, Mannit, Levulo, Ramnoz, Mannit, Xyloz, trừ Andonit và Inozit E.coli không lên men, trong khi đó Klebsiella lại lên men hai loại đƣờng này. Lên men không chắc chắn các loại đƣờng Dulcitol, Sacharoz và Salixin. E.coli lên men và sinh hơi nhanh đƣờng Lactoz. Đây là đặc điểm quan trọng để phân biệt E.coli và Salmonella. Tuy nhiên có một số chủng E.coli không lên men Lactoz (Theo Nguyễn Nhƣ Thanh và cộng sự, 1997 [51]) * Các phản ứng khác: Sữa: Đông sau 24 đến 72 giờ ở 37 0 C. Gelatin, huyết thanh đông, lòng trắng đông: không tan chảy H2S - VP - MR + Indol + Khử Nitrat thành Nitric, khử Cacboxyl trong môi trƣờng Lysin, Decacboxylase. Có các men Cacboxylaza với Lyzin, Dinitin, Acginin và Glutanic. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Đặc tính sinh hoá của Escherichia coli Glucoz + H Maniton + Adoniton - Dunxiton ± Inoxiton - Lactoz + Salixin ± Saccaroz ± Indol + Gelatin Tan chảy - Amon xitrat Sử dụng - VP Voges proskauer - Ure Phân giải - Nitrat Khử + Môi trƣờng Mule Kopman Không sinh trƣởng Lyzin Khử cacboxyl Arginin Khử cacboxyl Axit Glutamic Khử cacboxyl Chú thích: + : lên men - : không lên men +H : lên men, sinh hơi ± : nghi ngờ 1.2.4. Sức đề kháng Cũng nhƣ các vi khuẩn không sinh nha bào khác, E.coli không chịu đƣợc nhiệt độ, đun 55°C trong 1 giờ, ở 60°C trong 30 phút diệt vi khuẩn, ở 100°C chết ngay. Các chất sát trùng thông thƣờng nhƣ axit phenic 3%, Hydroperoxit 1%, Focmon 1%…có thể diệt vi khuẩn trong 5 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Ở môi trƣờng bên ngoài, vi khuẩn tồn tại 4 tháng. Vi khuẩn E.coli có khả năng đề kháng với sự sống khô và hun khói. 1.2.5. Cấu trúc kháng nguyên Cấu trúc kháng nguyên của E.coli rất phức tạp, Theo Bertschinger.H.U (1992) [60]; Quinn.P.J (1994) [90], cấu trúc này bao gồm: Kháng nguyên O (Somatic) hay thành tế bào, có bản chất lipopolysaccharid; Kháng nguyên K (Capsular hay Microcasular), bản chất là polysaccharid; Kháng nguyên lông H(Flagellar) và yếu tố bám dính F (Fimbriae), là protein. Cho đến nay, đã xác định đƣợc có ít nhất 170 serotype kháng nguyên O, 70 serotype kháng nguyên K, 56 serotype kháng nguyên H và sự phát triển một cách nhanh chóng số lƣợng các kháng nguyên F đã chính thức đƣợc ghi nhận (Bertschinger.H.U, 1992 [60]). * Kháng nguyên O (kháng nguyên thân): Đây là thành phần chính của thân vi khuẩn và cũng đƣợc coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. Theo Zinner và Petter (1983) [102]: kháng nguyên O đƣợc coi nhƣ một nội độc tố có thể tìm thấy ở màng ngoài vỏ bọc vi khuẩn và thƣờng xuyên đƣợc giải phóng vào môi trƣờng nuôi cấy. Trong trạng thái chiết suất tinh khiết, nó có bản chất là Lypopolysaccharide bao gồm 2 nhóm sau: - Polysaccharide có nhóm Hydro thành phần chủ yếu là Lipit nằm ở phần ngoài vi khuẩn mang đặc trƣng cho kháng nguyên từng giống. Phần Lipit của màng quyết định độc lực của vi khuẩn, nếu tỷ lệ Lipit của màng càng cao thì độc lực của vi khuẩn càng mạnh. - Polysaccharide không có nhóm Hydro nằm ở phía trong, không mang tính đặc trƣng mà chỉ tạo sự khác biệt về khuẩn lạc (từ dạng S sang dạng R). Kháng nguyên O có những đặc tính sau: chịu đƣợc nhiệt (ở 100°C trong 2 giờ không bị phá huỷ). Các chất nhƣ: cồn, axit HCl 1M chịu đƣợc trong 20 giờ, phá huỷ bởi Focmon 0,5%. Kháng nguyên O đƣợc cấu tạo bởi các phân tử lớn với thành phần các phân tử gồm có: Protein: làm phức hợp có tính kháng nguyên. Polyosit: tạo ra tính dặc hiệu của kháng nguyên. Lipit: kết hợp với Polyosit là cơ sở của độc tính. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Theo Mendearis (1986) [85]: khi làm mất dần từng phân tử đƣờng của chuỗi Polysaccharide hoặc thay đổi vị trí của các phân tử này sẽ dẫn đến thay đổi độc lực của vi khuẩn. Vi khuẩn E.coli có khoảng gần 170 Serotype kháng nguyên O đƣợc xếp từ 01 đến 0170. Hiện nay dựa vào cấu trúc kháng nguyên O để thử khả năng miễn dịch và làm các phản ứng kết hợp kháng nguyên, kháng thể gọi là (hiện tƣợng ngƣng kết O) để định Type chủng E.coli (Bertschinger H.U và cộng sự, 1992 [60]). * Kháng nguyên H (kháng nguyên lông): Kháng nguyên H đƣợc cấu tạo bởi thành phần lông của vi khuẩn có bản chất là Protein nhƣ chất Myosin của cơ. Nó kém bền vững hơn kháng nguyên O, kháng nguyên H không giữ vai trò độc lực và không có ý nghĩa trong việc đáp ứng miễn dịch. Kháng nguyên H mang những đặc tính sau: + Bị phá huỷ ở 60 0 C trong một giờ. + Bị cồn và các enzym phân giải Protein phá huỷ. + Kháng nguyên H vẫn tồn tại khi sử dụng Formol 0,5% xử lý. + Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra hiện tƣợng ngƣng kết H, trong đó các vi khuẩn đƣợc ngƣng kết lại với nhau nhờ lông dính. Các kháng thể kháng H cố định trên lông và là cầu nối với các lông bên cạnh. Kết quả tạo nên những hạt ngƣng kết giống nhƣ những cục bông nhỏ, các hạt ngƣng kết rất dễ tan khi lắc vì lông rất nhỏ và dài dễ đứt, các vi khuẩn di động khi tiếp xúc với kháng nguyên H sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên H của vi khuẩn E.coli không có vai trò bám dính, không có tính độc và cũng không có ý nghĩa trong đáp ứng miễn dịch phòng vệ nên ít đƣợc quan tâm nghiên cứu, nhƣng có ý nghĩa rất lớn trong xác định giống, loài của vi khuẩn (Orskov, 1980 [89]). Weinstein và cộng sự (1984) [99] chứng minh bằng cách sử dụng những giống E.coli có lông và không lông có cùng bản chất là kháng nguyên O gây cảm nhiễm cho chuột bằng đƣờng miệng với lƣợng vi khuẩn bằng nhau. Kết quả cho thấy khả năng gây bệnh cho chuột là hoàn toàn giống nhau. * Kháng nguyên K (Kapsular – kháng nguyên bề mặt): Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Kháng nguyên K còn gọi là kháng nguyên bề mặt, chúng bao quanh tế bào vi khuẩn và có bản chất là Polysaccharide. Vai trò của chúng chƣa đƣợc thống nhất lắm, có ngƣời cho rằng nó không có ý nghĩa về độc lực. Vì vậy chủng E.coli có kháng nguyên K cũng giống nhƣ chủng E.coli không có kháng nguyên K (Orskov, 1980 [89]). Cũng có ý nghĩa khác cho rằng: kháng nguyên K cũng có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trƣớc các yếu tố của cơ thể (Evan, 1973 [70]). Kháng nguyên K có 2 nhiệm vụ chính là: - Hỗ trợ phản ứng ngƣng kết với kháng nguyên 0. - Tạo ra hàng rào bảo vệ giúp vi khuẩn chống lại các tác động ngoại lai và hiện tƣợng thực bào. Kháng nguyên K với bản chất là Polysacharide dù ít hay nhiều đều có nhiệm vụ nhất định trong khả năng gây bệnh, không chỉ với vi khuẩn E.coli mà cả các vi khuẩn dƣờng ruột khác khi xâm nhập vào hệ thống tiêu hoá. * Kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ bọc) Một số vi khuẩn trong quá trình phát triển tiết ra một chất nhầy có khả năng tan vào nƣớc ở một vai trò nhất định, những chất này bao xung quanh bên ngoài vách vi khuẩn chống lại tác động của môi trƣờng ngoại cảnh, có thể quan sát đƣợc ở trạng thái ƣớt, dễ bị mất đi khi bị thay đổi điều kiện phát triển gọi là giáp mô (Capsule). Chất nhầy giáp mô phần lớn không có tính định hình vì khuếch tán, thƣờng đƣợc cấu trúc bởi hợp chất Polysaccharide nhƣng cấu trúc của Polysaccharide này lại phụ thuộc vào từng họ vi khuẩn khác nhau thì cấu trúc khác nhau. Do đó mà tình kháng nguyên của từng loại vi khuẩn khác nhau. Tuy nhiên, ở vi khuẩn E.coli nói riêng kháng nguyên giáp mô không đóng vai trò quan trọng. * Kháng nguyên Fimbriae (kháng nguyên Pili) Ngoài lông ra ở nhiều vi khuẩn gram âm nói chung và vi khuẩn E.coli nói riêng còn có những bộ phận khác hình sợi gọi là Pili. Pili vi khuẩn có bản chất là Protein bao phủ trên toàn bộ bề mặt tế bào vi khuẩn. Dƣới kính hiển vi điện tử, chúng có hình ảnh giống một chiếc áo lông bao bọc xung quanh vi khuẩn. Pili vi khuẩn đƣờng ruột khác lông ở chỗ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 nó cứng hơn, không lƣợn sóng và không liên quan đến chuyển động. Trƣớc đây ký hiệu là K (K88, K99), nay đổi là F nhƣ: F4 = K88, F5 = K99, F41,… - Kháng nguyên F4 (K88): Kháng nguyên F4 có khả năng gây dung huyết hồng cầu, đây là một yếu tố độc lực đối với lợn mà không có khả năng gây bệnh đối với các gia súc khác. Kháng nguyên F4 đƣợc sản sinh ở nhiệt độ 37 0 C, trong khi ở nhiệt độ phòng (20 o C) thì vi khuẩn không có khả năng tạo kháng nguyên này. Thông tin di truyền mã hóa cho tổng hợp kháng nguyên nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid (Gyles. G.L, 1992 [73]). - Kháng nguyên F5 (K99): F5 là kháng nguyên bám dính của E.coli và gây bệnh ở bê, nghé và cừu. sự sản sinh của F5 phụ thuộc vào nhiều yếu tố của vi khuẩn nhƣ: tốc độ sinh trƣởng, pha sinh trƣởng, nhiệt độ và alanine trong môi trƣờng, các gen mã hóa cho sự tổng hợp F5 nằm trên AND của plasmid (Isaacson. R.E, 1983 [74]). - Kháng nguyên F6 (987P): Giống nhƣ F4, F5, kháng nguyên F6 thƣờng có mặt ở các nhóm có kháng nguyên O9, O20, O101, O149. Vật liệu di truyền mã hóa quá trình tổng hợp kháng nguyên pili F6 cũng nằm ngoài nhiễm sắc thể, trên plasmid của tế bào vi khuẩn (Orskov và cộng sự 1980 [89]). - Kháng nguyên F41: Cox và cộng sự (1993) [62] đã nghiên cứu trong phòng thí nghiệm về khả năng mẫn cảm và sức đề kháng của lợn đối với vi khuẩn E.coli có F41. Kết quả cho thấy các chủng có F41 bám vào lông nhung của 23 lợn trong số 30 lợn đƣợc kiểm tra. Tác giả cho rằng, những lợn lớn tuổi hơn có sức đề kháng với sự bám dính của các chủng E.coli có F41 do các receptor tƣơng ứng với F41 bị giảm đi. 1.2.6. Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli Theo Kazunori (1987) [79]; Berstchinger H.U (1992) [60]: Bệnh viêm ruột tiêu chảy do E.coli gây ra chịu tác động bởi nhiều yếu tố khác nhau, chúng có vai trò tạo ra những điều kiện và môi trƣờng thích hợp cho vi khuẩn có thể Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 thay đổi từ dạng cộng sinh thƣờng trực trở thành cƣờng độc và gây bệnh. Tức là giúp E.coli tiếp thu đƣợc nhiều yếu tố gây bệnh khác nhau, trong đó có yếu tố là độc tố và cũng có cả các yếu tố không phải độc tố. Nhờ có đƣợc các yếu tố này mà chủng vi khuẩn E.coli có khả năng gây bệnh và trở thành tác nhân gây tiêu chảy, một bệnh nhiễm trùng đƣờng tiêu hóa của gia súc và gia cầm, cho nên ngƣời ta đã căn cứ vào các yếu tố gây bệnh để chia chúng vào các nhóm:Enterotoxigenic(ETEC),Enteropathogenic(EPEC),Enteroinvasive(EIEC) ,Enterohemorrhagic(EHEC) và Attaching and Effacing E.coli(AEEC). 1.2.6.1. Các yếu tố không phải là độc tố * Khả năng bám dính của vi khuẩn E.coli(adhesion) Khả năng bám dính của vi khuẩn E.coli là yếu tố gây bệnh vô cùng quan trọng để thực bƣớc đầu tiên của quá trình gây bệnh do vi khuẩn đƣờng ruột. Đó là một quá trình liên kết vững chắc, thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn với tế bào vật chủ (Jones và cộng sự, 1977 [78]). Hiện tƣợng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào, vừa mang tính lý, hoá học lại vừa mang tính sinh vật học và đƣợc thực hiện theo 3 bƣớc sau: - Bƣớc 1: vi khuẩn liên kết từng phần lên bề mặt tế bào, thực hiện quá trình này đòi hỏi vi khuẩn phải có khả năng di động (Jones và cộng sự, 1983 [77]). - Bƣớc 2: là quá trình hấp thụ, nó phụ thuộc vào đặc tính bề mặt của vi khuẩn và tế bào mà vi khuẩn bám dính và thực hiện theo hƣớng thuận nghịch dƣới sự tác động của những lực tƣơng hỗ khác nhau (Freter và cộng sự, 1981 [70]). Việc chuyển động thẳng tiến của vi khuẩn cũng có thể giúp vi khuẩn cố định và bám chắc trên bề mặt tế bào tham gia vào sự hấp thụ của quá trình bám dính (Uhllman J.I, 1982 [99]). - Bƣớc 3: Là quá trình tác động tƣơng tác giữa yếu tố bám dính của vi khuẩn với các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào. Khởi đầu của quá trình gây bệnh là tác động bám dính (cố định) E.coli lên điểm tiếp nhận tƣơng ứng của tế bào lông nhung niêm mạc ruột, sau đó xâm nhập, phát triển và gây bệnh bằng Enterotoxin. Về mặt bệnh tích vi thể, E.coli gây bệnh không phá hủy cấu trúc của lông nhung ruột non (Fairbrother.J.M, 1992 [69]). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Về mặt hình thái, các pili mang yếu tố bám dính thƣờng thẳng, dạng ống hay xoắn gần nhƣ là những lông phụ, có bản chất là protein. Nghiên cứu siêu sâu cấu trúc phan tử thấy chúng đƣợc cố định ở bên ngoài màng tế bào vi khuẩn và hầu hết đƣợc di truyền qua plasmid (Smith.H.W, 1989 [97]; Nagy.B, Fekete.Pzs, 1999 [87]). Các yếu tố bám dính có trọng lƣợng phân tử khác nhau, dao động từ 15- 25 kDa, với vị trí bám dính đƣợc cố định tại một điểm trong cấu trúc của chúng. Khả năng ngƣng kết với hồng cầu một số loài vật của các yếu tố bám dính khác nhau đã đƣợc khẳng định rất dễ dàng và thƣờng đƣợc phân loại bởi sự có mặt của đƣờng D-Mannose 0,5%, là MSHA: Yếu tố bám dính mẫn cảm với đƣờng Mannose hoặc MRHA: Yếu tố bám dính kháng đƣờng Mannose, không tham gia gây ngƣng kết hồng cầu. Nhờ có yếu tố bám dính, E.coli cố định đƣợc vào các tế bào biểu mô của niêm mạc ruột mà không bị rửa trôi bởi nhu động và đẩy ra ngoài theo phân. * Khả năng xâm nhập của vi khuẩn E.coli (invasion) Khả năng xâm nhập của vi khuẩn đƣờng ruột nói chung và của vi khuẩn E.coli nói riêng là một khái niệm để chỉ quá trình chƣa đƣợc xác định rõ mà nhờ đó vi khuẩn qua đƣợc hàng rào bảo vệ của lớp Mucosa trên bề mặt niêm mạc để xâm nhập vào tế bào Ephitel, đồng thời sản sinh và phát triển trong lớp tế bào này. Trong khi đó, những vi khuẩn khác không có khả năng xâm nhập, không thể qua lại đƣợc hàng rào bảo vệ của lớp Mucosa hoặc khi qua đƣợc lớp hàng rào này sẽ bị tế bào đại thực bào tiêu diệt (Guerrant, 1975 [72]). Theo Fairbrother.J.M (1992) [69]: Xâm nhập là khái niệm dùng để chỉ quá trình vi khuẩn E.coli vƣợt qua hàng rào bảo vệ trên bề mặt niêm mạc ruột non vào tế bào biểu mô, để sinh sản và phát triển trong lớp tế bào này, tránh đƣợc các yếu tố phòng vệ không đặc hiệu của niêm mạc ruột. Quá trình này thực sự chƣa đƣợc xác định rõ ràng. Khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử, vi khuẩn thƣờng khu trú hầu nhƣ một nửa chiều rộng ở phía ngoài của lông nhung, có thể thấy đƣợc Fimbriae giữa vi khuẩn và lông nhung, đồng thời cũng phát hiện thấy xuất huyết trong ruột, số lƣợng các bạch cầu trung tính và đại thực bào tăng, một số đầu lông nhung bị teo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Giống nhƣ Shigella spp về cơ chế xâm nhập, chủng E.coli gây bệnh có thể xuyên qua lớp màng tế bào biểu mô niêm mạc ruột, dung giải thể thực bào. Sự xâm nhập của các chủng EIEC tập chung chủ yếu ở đoạn kết tràng nhƣng thƣờng không sâu (Smith.H.W, và cộng sự, 1976 [96]). Trong tế bào bị xâm nhập vi khuẩn phát triển, nhân lên, di chuyển rải rác trong tế bào chất, sản sinh ra một hay vài loại Enterotoxin làm phân rã cấu trúc tế bào gây phản ứng viêm sốc nhiễm khuẩn và sau cùng là tiêu chảy nặng Song song với cơ chế xâm nhập của các chủng E.coli gây bệnh ở gia súc và ngƣời thì các chủng E.coli gây bệnh ở gia cầm còn phải phụ thuộc vào các yếu tố ngoại cảnh khác để xâm nhập và gây bệnh. Đặc biệt là nó xâm nhập vào các tổ chức cơ quan của cơ thể khi các cơ quan tổ chức này bị viêm và hoại tử dẫn đến lớp niêm mạc bảo vệ cơ quan tổ chức của gia cầm bị viêm không còn khả năng bảo vệ, từ đó E.coli xâm nhập dễ dàng vào tổ chức gây bệnh ở đó. * Khả năng dung huyết Vi khuẩn đƣờng ruột phát triển ở trong tổ chức, cơ quan. Hàm lƣợng sắt đảm bảo cho sự phát triển của vi khuẩn phụ thuộc vào chất Ciderofordo vi khuẩn sản sinh ra. Chất này có khả năng phân huỷ sắt liên kết trong tổ chức của vật chủ, mà chủ yếu dung giải hồng cầu giải phóng sắt trong nhân HEM để cung cấp cho quá trình trao đổi chất của vi khuẩn. Smith.H.W (1963) [94]: đã phát hiện ra Hly plasmid di truyền khả năng sản sinh Haemolysin gây dung huyết. Vì vậy việc sản sinh ra men Haemolysin của vi khuẩn có thể coi là một yếu tố độc lực của vi khuẩn. Ketyl.I và cộng sự (1975) [80] cho rằng: khả năng dung huyết là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn E.coli gây bệnh đƣờng tiết niệu và các chủng E.coli phân lập từ các cơ quan ngoài ruột thƣờng có độc lực cao hơn E.coli phân lập từ ruột (49% so với 8 – 18%). Có 4 kiểu dung huyết của E.coli nhƣng quan trọng nhất là kiểu -haemolysin và -haemolysin trong đó kiểu  gắn với tế bào vi khuẩn do vậy mà không có tác dụng độc. Smith H.W và cộng sự (1967) [95]: Kiểu  là kiểu 1 Protein thẩm thấu qua lọc, không đƣợc gắn với tế bào vi khuẩn, đƣợc giải phóng vào môi trƣờng nuôi cấy ở pha Logarit của chu trình phát triển của vi khuẩn và đƣợc coi là yếu tố độc lực của vi khuẩn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Theo Smith H.W và cộng sự (1963) [94]: các Serotype E.coli gây bệnh thƣờng có khả năng sản sinh ra men Heamolysin. Vì vậy, khả năng tạo ra men Heamolysin cũng là yếu tố độc lực của vi khuẩn. * ColicinV(colV) - Yếu tố kháng khuẩn của E.coli Trong quá trình phát triển, E.coli thƣờng sản sinh ra yếu tố cạnh tranh đƣợc gọi là ColicinV, một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các vi khuẩn khác. Khi tồn tại cộng sinh với nhiều loại vi khuẩn khác nhau, E.coli nhờ ColicinV kháng lại các vi khuẩn có lợi làm cho mình trở thành vi khuẩn chiếm ƣu thế trong đƣờng ruột để gây nên loạn khuẩn. Khả năng sản sinh CilicinV của E.coli đƣợc di truyền bởi ColV plasmid (Smith H.W, Huggis M.B, 1976 [96]). ColicinV có thể đƣợc coi nhƣ là một Bacteriocin, song tất chất này chỉ có tác dụng độc đối với các vi khuẩn trong họ Enterobacteriaceae. Khoảng 40% số chủng E.coli ở ngƣời và động vật có đặc tính sản sinh ColicinV, chúng đƣợc gọi là các chủng E.coli có tính Colicingenic hay các E.coli ColV + . Khi Colicin đƣợc sản sinh ra từ các chủng E.coli cƣờng độc ký sinh trong cơ thể vật chủ, trong trƣờng hợp này ColicinV có thể đƣợc coi là một yếu tố gây bệnh (Đào Trọng Đạt và cộng sự, 1996 [10]). Theo Griffiths. E (1985) [71]: ColV có bản chất là protein, phân tử lƣợng dao động trong khoảng 12.000 - 90.000 Dalton, có thể chịu đƣợc 120 0 C trong 30 phút, cấu trúc phân tử khá phức tạp với hai loại polypeptide. Loại có phân tử lƣợng lớn, tác dụng gây độc cho tế bào mẫn cảm. Loại còn lại, phân tử lƣợng nhỏ, giữ vai trò bảo vệ tế bào chủ. Ngoài hai đặc tính nhƣ đã phân loại theo trọng lƣợng phân tử, ColicinV do plasmid ColV của E.coli sản sinh còn có thể chia tiếp thành hai loại với các đặc tính khác nhau. Một loại giúp tế bào vi khuẩn sản xuất Hydroxamat, một chất thâu tóm sắt (Fe ++ ) từ tế bào và mô của vật chủ cung cấp cho hoạt động sống của chúng. Loại kia tham gia bảo vệ tế bào vi khuẩn, chống lại hoạt động của hệ thống hiệu ứng huyết tƣơng bổ thể ở cơ thể vật chủ. Trong cơ thể động vật không có sắt tự do tồn tại trong máu, mô hay trong dịch thể. Chúng chỉ tồn tại dƣới dạng phức chất Transferin, Ferrichrome hay bám vào các protein khác nhƣ hemoglobin. Muốn sử dụng sắt (Fe ++ ) vi khuẩn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 cần có sự tác động của Hydroxamat để cắt rời sắt (Fe ++ ) ra khỏi các hợp chất đó và đi vào hệ thống hấp thu sắt của tế bào vi khuẩn. Ở vi khuẩn E.coli, hệ thống này do plasmid ColV quyết định (Smith.H.W, Huggins.M.B, 1976 [96]). Các Bacteriocin tác động đến tế bào mẫn cảm theo cơ chế gây độc ở một vài dạng. Chúng phong tỏa tế bào không cho tiếp xúc hoặc thu nhận chất dinh dƣỡng, do đó vi khuẩn mẫn cảm bị rơi vào trạng thái mất cân bằng trao đổi chất, thoái hóa dần và phân rã. Cũng có một cách tác động khác do Bacteriocin tự "ngấm" vào tế bào vi khuẩn "thù địch" và tác động nhƣ những enzym cắt các axit nucleic nội bào(DNA-ase, RNA-ase), dẫn tới phá hủy hoàn toàn hệ gen của vi khuẩn. Một vài loại Bacteriocin lại tác động bằng cách tạo các "kênh" chuyển tải ion qua màng tế bào vi khuẩn mẫn cảm gây sự quá tải ion về nồng độ, chủng loại, dẫn tới làm mất cân bằng hiệu điện thế qua màng, kết cục là rối loạn trao đổi chất và bị tiêu diệt. * Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli Từ khi A.fleming, 1928 đã tìm ra Penicillin từ nấm mốc, thì cho tới nay đã có hàng ngàn chất kháng sinh đƣợc tìm ra. Nhƣng rất tiếc là cho đến nay chúng ta cũng chỉ sử dụng đƣợc một phần nhỏ kháng sinh, vì phần lớn các chất kháng sinh đƣợc tìm ra thƣờng gây các triệu chứng độc, gây tác dụng phụ có hại cho động vật hoặc do hoạt phổ kháng khuẩn hẹp, giá thành không phù hợp…đặc biệt là trong thú y, ta cũng chỉ dùng đƣợc một phần nhỏ các loại kháng sinh đã tìm ra nhƣ: Penicillin, Chlophenicol, Tetracyclin, Gentamycin, Kanamycin, Streptomyxin… Trong thực tế sản xuất để điều trị các bệnh đƣờng ruột nói chung và bệnh do E.coli nói riêng thì ta có rất nhiều kháng sinh nhƣ: Tetracyclin, Ampicilin, Nofroxacin, Enrofroxacin… Việc sử dụng các loại kháng sinh để chữa bệnh có giá trị rất quan trọng sản xuất. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh điều trị chỉ trong một thời gian nhất định thì lại phải đổi kháng sinh mới. Đó có lẽ là một hiệu quả tất yếu của hiện tƣợng kháng thuốc của vi khuẩn do ta đã quá lạm dụng kháng sinh điều trị. Theo Johnson M.C (1994) [76] cho biết: 27% E.coli và Klebsiella Pneumoniac kháng lại với Gentamycin gây bệnh ở ngƣời là do gia súc truyền sang, vì vậy bệnh có thể truyền từ gia súc sang ngƣời và ngƣợc lại. Có 2 loại kháng thuốc thƣờng gặp đó là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 - Kháng thuốc tự nhiên: Thƣờng gặp ở các loài vi khuẩn mà tế bào của nó tăng cƣờng sự tổng hợp các men cảm ứng có khả năng phân huỷ chất kháng sinh trƣớc khi chất này gây tác hại. Quá trình trao đổi chất của tế bào không mẫn cảm với chất kháng sinh, quá trình này có liên quan đến sự biến đổi về trao đổi axit Nucleic và Protein trong tế bào và có sự giảm thấp quá trình sinh hoá của tế bào, kết quả là chất kháng sinh không gây nên sự tổn thƣơng sâu sắc đến quá trình trao đổi chất của tế bào. E.coli có men Penicillinaza trong tế bào nên nó có khả năng kháng tự nhiên với Penicillin. - Kháng thuốc gây nên bởi nhân tố kháng sinh: Kháng thuốc thu đƣợc là hiện tƣợng phát sinh do tiếp xúc nhiều với kháng sinh đó dẫn đến vi khuẩn đã thu đƣợc các yếu tố kháng thuốc (Plasmid, Factoc, Episome) hoặc nó đƣợc truyền ngang từ vi khuẩn đề kháng xong vi khuẩn mẫn cảm theo ba phƣơng thức biến nạp, tải nạp và tiếp hợp. Trong loại này lại đƣợc chia ra làm 2 loại: + Ở những vi khuẩn đã có sẵn những yếu tố gây bệnh khác lại có khả năng kháng kháng sinh thì sẽ tăng tính gây bệnh lên gấp bội. Những loại vi khuẩn kháng nhiều loại kháng sinh không chỉ lây truyền trong hệ sinh thái của cơ sở chăn nuôi mà còn xuất hiện ở các nguồn nƣớc trong tự nhiên, trong nƣớc thải. Tính chất này đã đƣợc nghiên cứu rất nhiều đối với hệ vi khuẩn đƣờng ruột và có ý nghĩa rất lớn trong việc bảo vệ sức khoẻ con ngƣời và quần thể động vật. + Cũng có thể kể thêm một số tác hại khác của việc sử dụng kháng sinh không đúng cách nhƣ: nó phá hoại sự cân bằng sinh học của tập đoàn vi sinh vật đƣờng tiêu hoá, do tiêu diệt nhanh chóng vi trùng gây bệnh nên đồng thời nó cũng làm đảo lộn khả năng phòng vệ của cơ thể và làm rối loạn khả năng sản sinh miễn dịch của cơ thể, làm tăng khả năng quá mẫn của cơ thể sau khi dùng kháng sinh. Do những mặt có lợi và có hại của kháng sinh nên tìm ra các biện pháp đối phó tính kháng thuốc của vi khuẩn là điều rất cần thiết. Bên cạnh việc ta phải tìm ra các loại kháng sinh mới và nghiên cứu sử dụng phối hợp nhiều loại kháng sinh để điều trị làm tăng hiệu quả và tránh tính kháng. Đồng thời ta phải làm thay đổi các bản chất của các Plasmid hoặc ngăn ngừa sự tái sinh và truyền Plasmid giữa các tế bào vi khuẩn. Song song với hai điều đó thì trƣớc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 khi điều trị bệnh thì ta phải xác định độ mẫn cảm của nó đối với từng loại kháng sinh khác nhau bằng kỹ thuật kháng sinh đồ. Kết quả của kỹ thuật này dựa vào rất nhiều yếu tố nhƣ: thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng, lƣợng vi khuẩn ria trên mặt thạch, tiêu chuẩn của giấy tẩm kháng sinh, số lƣợng kháng sinh chứa trong giấy, tốc độ khuếch tán của kháng sinh trên thạch .... do đó ta cần phải tiêu chuẩn hoá các điều kiện tiến hành kỹ thuật kháng sinh đồ. Nghiên cứu về khả năng kháng thuốc của vi khuẩn E.coli, Phạm Khắc Hiếu và cộng sự (1999) [20], đã tìm thấy chủng E.coli kháng lại 11 loại kháng sinh, đồng thời chứng minh khả năng di truyền tính kháng thuốc của vi khuẩn E.coli và Salmonella qua plasmid. Hiện tƣợng kháng thuốc đã tránh cho vi khuẩn tránh đƣợc tác dụng của kháng sinh. Vì vậy tính kháng kháng sinh đƣợc coi là một yếu tố gây bệnh của vi khuẩn. 1.2.6.2. Độc tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli Vi khuẩn E.coli tạo ra hai loại độc tố đó là: nội độc tố và ngoại độc tố. - Ngoại độc tố: là một chất không chịu đƣợc nhiệt, dễ bị phá huỷ ở 56 0 C trong 10 – 30 phút dƣới tác dụng của Focmon và nhiệt, ngoại độc tố chuyển thành giải độc tố. Ngoại độc tố có tính hƣớng thần kinh và gây hoại tử. Hiện nay, việc chiết xuất ngoại độc tố chƣa thành công mà chỉ có thể phát hiện trong canh trùng của những chủng mới phân lập đƣợc (Đào Trọng Đạt và cộng sự, 1996 [9]). - Nội độc tố: là yếu tố gây độc lực chủ yếu của trực khuẩn đƣờng ruột. Chúng có trong tế bào vi khuẩn và gắn với tế bào vi khuẩn rất chặt chẽ. Nội độc tố có thể chiết xuất bằng nhiều phƣơng pháp nhƣ: phá vỡ vỏ tế bào bằng cơ học, chiết xuất bằng axit Trichoaxetic, Phenol, dƣới tác dụng của enzim. Nội độc tố đƣợc coi là một kháng nguyên hoàn toàn và có tính đặc hiệu cao đối với các chủng của mỗi Serotype. Hiện nay, khi nghiên cứu về độc tố do E.coli sinh ra thì ngƣời ta thƣờng chú ý đến hai lớp độc tố đƣờng ruột đó là: - Độc tố chịu nhiệt (ST = Heat – Stable – Toxin): Độc tố này chịu đƣợc nhiệt độ 100 0 C trong 15 phút sử lý. Độc tố ST đƣợc chia thành hai nhóm STa và STb dựa trên tính hoà tan trong Methanol và hoạt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 tính sinh học (Robichaud và cộng sự, 1987 [92]). Cả STa và STb đều có vai trò gây ỉa chảy cho các chủng E.coli gây bệnh ở gia súc, gia cầm và trẻ sơ sinh. STa kích thích hệ thống men Guanylate cyclase có mặt trên các tế bào biểu mô ruột vật chủ chuyển GTP thành cGMP. cGMP hoạt hóa 86 – Kpa protein kinase dẫn đến Phosphoryl hóa Phosphatiglycilinositol, hình thành Diaxyglyxerol, inositol 1,4,5 triphosphate, từ đó kích hoạt men C – kinase. Ba sản phẩm trên gây tăng hàm lƣợng Ca ++ bên trong tế bào, Ca ++ ngăn cản quá trình hấp thu Na + , Cl - nƣớc từ trong xoang ruột vào tế bào, đồng thời kích thích thải Na + , Cl - từ tế bào vào xoang ruột, hiện tƣợng này gây nên tiêu chảy. STb là một protein có tính kháng nguyên yếu, có phân tử lƣợng gần 5000Dalton, STb kích thích vòng nucleotit phân tiết dịch độc lập ở ruột. STb hoạt động ở ruột non lợn, nhƣng không hoạt động ở ruột non chuột, bê và bị vô hoạt bởi Trypsin (Fairbrotherb J.M, 1992 [69]). - Độc tố không chịu nhiệt (LT = Heat – Labile – Toxin): Độc tố này bị vô hoạt ở nhiệt độ 60 o C trong 15 phút (Guerrant, 1975 [72]). Độc tố LT có trọng lƣợng phân tử cao, nó gồm 5 nhóm B có khả năng bám dính lên bề mặt biểu bì của bề mặt ruột và một nhóm A có hoạt tính sinh học cao. Chỉ có các chủng E.coli gây bệnh cho ngƣời và lợn là có khả năng sản sinh LT, còn ở gia cầm và các loài khác không có khả năng. Độc tố kích thích tế bào niêm mạc ruột làm sản sinh Prostaglandin làm tăng cƣờng sản xuất 3,5 Adenozin – Monophotphat, làm thay đổi quá trình trao đổi nƣớc và chất điện giải. Kết quả là niêm mạc ruột bị xung huyết, tăng tính thấm của thành mạnh, từ đó nƣớc và chất điện giải thấm qua thành mạch vào trong ruột gây ỉa chảy. Độc tố không chịu nhiệt thực hiện quá trình gây bệnh chậm nhƣng kéo dài từ 18 – 24 giờ, đôi khi kéo dài từ 36 – 48 giờ. Theo Đặng Xuân Bình và cộng sự (2004) [4] khi xác định khả năng sản sinh độc tố của 96 chủng E.coli phân lập đƣợc từ phân và bệnh phẩm của lợn con từ sơ sinh đến 35 ngày tuổi cho thấy số chủng sản sinh ST chiếm tỷ lệ 87,5%, LT chiếm 50,0%, LT + ST chiếm tỷ lệ là 31,25%. Cả hai loại độc tố ST và LT đều bền vững ở nhiệt độ âm, thậm chí cả ở (- 20 o C). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Độc tố tế bào Verotoxin: Konowalchuck và cộng sự (1977) [82], đã phát hiện một loại độc tố hoạt động trong môi trƣờng nuôi cấy tế bào Vero, đƣợc sản sinh ra bởi vi khuẩn E.coli gây bệnh tiêu chảy ở ngƣời và gây bệnh phù đầu ở lợn con. Ảnh hƣởng gây bệnh ở tế bào của độc tố Vero rất khác so với ảnh hƣởng của độc tố đƣờng ruột không chịu nhiệt cổ điển của nhóm vi khuẩn E.coli gây bệnh đƣờng ruột. Độc tố Vero (VTs) hay Shiga (SLTS) là thuật ngữ đƣợc sử dụng trƣớc đây. Gần đây các nhà khoa học đã đề nghị sử dụng tên độc tố Shiga (Stx) cho tất cả những độc tố tế bào này. Stx sản sinh bởi E.coli bao gồm 2 nhóm: Stx1 và Stx2. 1.2.7. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn E.coli Khả năng gây bệnh của vi khuẩn đƣờng ruột tạo ra hội chứng tiêu chảy, viêm ruột đã trở thành mối lo ngại cho sức khoẻ ở ngƣời nói riêng và ở động vật nói chung trên toàn thế giới. Trong đó, vai trò gây bệnh của E.coli là rất lớn, nó có khả năng gây ra bệnh cho tất cả các động vật máu nóng. E.coli luôn luôn tồn tại trong đƣờng tiêu hoá của gia súc, gia cầm. Nhƣng dƣới ảnh hƣởng của một số yếu tố nhất định, các chủng E.coli gây bệnh trỗi dậy gây bệnh, gây ra hội chứng ỉa chảy và nhiễm trùng huyết ở gia súc non hoặc bệnh đƣờng hô hấp của gia cầm và các chủng khác không gây bệnh có thể trở thành căn bệnh cơ hội khi điều kiện cho phép. Vi khuẩn E.coli sau khi đƣợc sản sinh ra nhiều trong cơ thể động vật, chúng nhờ kháng nguyên bám dính để bám dính đƣợc vào lớp tế bào biểu mô nhung mao ruột. Sau đó vi khuẩn xâm nhập vào trong lớp tế bào biểu mô và phá hủy lớp tế bào này gây ra viêm ruột. Tại đây vi khuẩn sản sinh độc tố đƣờng ruột, tác động vào quá trình trao đổi muối, nƣớc ở ruột, làm cho nƣớc và chất điện giải không đƣợc hấp thu từ ruột vào cơ thể, ngƣợc lại thẩm xuất từ cơ thể vào ruột. Nƣớc tập trung vào ruột làm cho ruột căng lên, sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích vào hệ thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột đẩy mạnh nƣớc và phân ra ngoài, gây nên tiêu chảy. Sau đó vi khuẩn E.coli tiếp tục xâm nhập vào hệ thống mạch quản gây hiện tƣợng dung huyết, phá vỡ hồng cầu gây thiếu máu, làm tăng tính thấm thành mạch, nƣớc từ trong mạch quản thẩm xuất ra và tích tụ trong các mô bào gây phù. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 1.3. Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra ở trâu Bệnh tiêu chảy do vi khuẩn E.coli gây ra ở trâu là một thể bệnh rất hay gặp, E.coli thƣờng là nguyên nhân gây bệnh nguyên phát ở trâu, và từ đó tạo ra những phản ứng stress hoặc nhiễm trùng kế phát các bệnh khác. Thời gian nung bệnh thƣờng từ 12 – 18 giờ sau khi nhiễm bi khuẩn từ nền chuồng, vú mẹ, nƣớc uống. Bệnh thƣờng xảy ra ở các đàn có mật độ chăn nuôi cao hoặc ở các đàn lớn, nơi mầm bệnh lan truyền trong chuồng trại, nơi sinh sống. Ngƣời ta gọi Colibacillosis là một bệnh đƣờng ruột của ngựa, trâu, bò, cừu, lợn và gia cầm do vi khuẩn E.coli gây ra (Radostits O.M và cộng sự 1994 [91]) 1.3.1. Triệu chứng Nghé bị xù lông, ỉa chảy, phân trắng, vàng, có mùi hôi thối, gầy yếu nhanh chóng, các đầu xƣơng hông nhô ra, mắt trũng sâu, run rẩy, đi đứng siêu vẹo. Do bị mất nƣớc nên trọng lƣợng cơ thể giảm, cơ vùng bụng run rẩy, nhão, không còn trƣơng lực. Triệu chứng chủ yếu của bệnh tiêu chảy ở trâu do E.coli cũng nhƣ triệu chứng tiêu chảy do các nguyên nhân khác đó là hiện tƣợng tiêu chảy. Phân thƣờng từ nhão cho đến toàn nƣớc, màu của phân chuyển từ vàng sang trắng, trong phân có lẫn những vết máu, phân có mùi hôi thối. Thân nhiệt thƣờng bình thƣờng hoặc cao hơn một chút nhƣng vào giai đoạn cuối hay hạ xuống dƣới mức bình thƣờng, bê nghé có thể bỏ bú, không uống nƣớc, đôi khi có chƣớng bụng. Ở những trâu bị thể nhẹ có thể qua khỏi sau một vài ngày không cần điều trị, nhƣng khoảng 15 – 20% nghé bị bệnh ngày một nặng hơn, suy sụp hoàn toàn, nhiễm độc huyết dẫn đến chết nếu không điều trị tích cực (Phạm Sỹ Lăng, 1999 [23]). 1.3.2. Bệnh tích Do đặc điểm gây bệnh của E.coli là vi khuẩn chỉ tác động chủ yếu ở đƣờng tiêu hoá cho nên khi bê nghé chết thƣờng xác gầy, bẩn, lông xù, bê bết phân, hông lõm, niêm mạc nhợt nhạt. Bệnh tích chủ yếu là viêm ruột cata, dung huyết màng treo ruột. Dạ dày chứa sữa đông vón, không tiêu, màu trắng hoặc xám trắng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Ruột non căng phồng, chứa đầy hơi với những đám xuất huyết ở trên thành ruột. Có thể có biến chứng viêm phổi, viêm màng phổi và viêm phúc mạc. 1.3.3. Chẩn đoán Việc chuẩn đoán bệnh tiêu chảy trâu do E.coli gây ra rất phức tạp bởi vì những triệu chứng, bệnh tích xuất hiện tƣơng tự nhƣ bệnh tiêu chảy do các nguyên nhân vi khuẩn khác, các loại đơn bào và virus, hơn nữa vi khuẩn E.coli thƣờng gây bệnh kết hợp với các mầm bệnh khác. Việc nuôi cấy phân lập vi khuẩn từ phân trâu bị bệnh cũng rất dễ dàng nhƣng phải tiến hành xác định xem đó có phải là E.coli gây bệnh hay là E.coli cộng sinh. Vì vậy sau khi phân lập vi khuẩn E.coli phải xác định các yếu tố gây bệnh nhƣ K99, Enterotoxin đồng thời xác định thêm các loại mầm bệnh khác nhƣ Rotavirut, Coronavirut, Salmonella, nhƣng có thể phân biệt qua PH của phân vì nếu tiêu chảy do E.coli gây ra thƣờng PH của phân nghiêng về bazơ, còn nếu tiêu chảy do Rotavirut, Coronavirut phân thƣờng nghiêng về axit. Chẩn đoán lâm sàng dựa vào triệu chứng ỉa chảy, phân màu trắng hoặc vàng nhạt, gầy yếu. Dựa vào bệnh tích ở ruột nhƣ ruột căng phồng chứa đầy hơi, thành ruột mỏng. Chẩn đoán vi khuẩn học nuôi cấy mầm bệnh trên các môi trƣờng thạch để quan sát sự phát triển của vi khuẩn E.coli. Giám định bằng phản ứng ngƣng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm. Theo Nguyễn Nhƣ Thanh và cộng sự (1997) [51] cho biết: trong môi trƣờng có xitrat natri, E.coli không sử dụng đƣợc nguồn cacbon này nên không mọc, Aerogenes sử dụng đƣợc nguồn cacbon này nên mọc tốt, môi trƣờng trở nên xanh lơ. 1.3.4. Phòng bệnh Chƣơng trình phòng bệnh E.coli cho vật nuôi nói chung thì ta cần phải chú trọng đến sự giảm tỷ lệ ô nhiễm E.coli độc ở môi trƣờng xung quanh bằng chế độ vệ sinh, tiêu độc tốt. Luôn luôn kiểm soát hàm lƣợng vi khuẩn E.coli trong nƣớc, thức ăn theo đúng tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm, nƣớc uống. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Duy trì điều kiện chăn nuôi thích hợp, đồng thời đảm bảo mức độ miễn dịch cao. Vì hầu hết các vi khuẩn E.coli gây bệnh chỉ có một số Serotype nhất định, do đó có thể thanh toán mầm bệnh này trong từng cơ sở. Chuồng trại phải luôn thông thoáng để các khí độc nhƣ: NH4, H2S…không gây độc cho cơ thể gia súc. Hạn chế tối đa các tác nhân gây stress, sự thiếu hụt vitamin mà đặc biệt là vitamin A, B. Định kỳ kiểm tra vi khuẩn bằng bằng phƣơng pháp kháng sinh đồ để xác định hiện tƣợng kháng thuốc. Phòng bệnh bằng vắc xin: Do vi khuẩn E.coli có rất nhiều tuýp kháng nguyên nên việc chế vắc xin và kháng nguyên là rất phức tạp. Ngƣời ta thƣờng chế vắc xin đa giá, cũng có thể chế vắc xin tại chỗ. Đối với bê, nghé do sự tiến triển sớm và nhanh của bệnh nên việc áp dụng vắc xin ít có ý nghĩa (Nguyễn Nhƣ Thanh và cộng sự, 1997 [51]) 1.3.5. Điều trị Nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Nhiên và cộng sự (2000) [37] cho thấy hầu hết các chủng của vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc từ gia súc tiêu chảy đều có khả năng kháng lại nhiều loại kháng sinh nhƣ: Chloramphenicol, Sulfadimethoxine,…Trong đó có nhiều chủng lại mẫn cảm mạnh với Amikacin hoặc một số kháng sinh mới. Qua theo dõi tính kháng thuốc của E.coli trong một số năm gần đây ta thấy một số loại kháng sinh nhƣ Neomycin, Tetracyclin có tính mẫn cảm cao với E.coli. Ngoài ra ta cũng có thể sử dụng một số loại kháng sinh mới nhƣ: Cephalosporin, Gentamycin, Belcomycin, Septotrim, Colistin, Trimethoprim,… Ngoài việc sử dụng kháng sinh thì ta cần dùng các chất bổ sung thêm nƣớc và điện giải cho con vật. Nguyên lý điều trị bệnh tiêu chảy bê nghé do E.coli gây ra giống nhƣ điều trị các bệnh tiêu chảy do các nguyên nhân khác. Các kháng sinh thƣờng dùng để điều trị, tiêu diệt vi khuẩn E.coli gồm: Tetracylin, Neomycin, Colistin, Sulphamid, Trimethoprim, Nitrofetral dazan và Ampicillin có thể cho uống, trộn thức ăn hoặc tiêm. Nhƣng tốt nhất trƣớc khi dùng kháng sinh điều trị nên làm kháng sinh đồ để loại trừ khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn, một Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 loại kháng sinh không nên dùng diều trị quá 3 ngày. Để điều trị triệu chứng ngoài các dung dịch đã nêu trên có thể dùng: 113,6g Sodium chloride (NaCl) +50,3g Potassium chlorite (KCl) +108,9 Sodium bicarbonate (NaHCO3) + 535g Glucose + 232g Glycerin thành hỗn hợp, rồi lấy 38,2g hỗn hợp này hoà tan vào 1 lít nƣớc đun sôi để nguội cho bê nghé uống hoặc bú nếu bê nghé không tự uống và bú đƣợc thì dùng ống thông đƣa vào dạ dày (Phạm Sỹ Lăng, Lê Văn Tạo, 2002 [24]). 1.4. Tình hình nghiên cứu ở trong và ngoài nƣớc 1.4.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Qua kết quả nghiên cứu vai trò gây bệnh của vi khuẩn E.coli trong bệnh tiêu chảy của bê nghé, Trƣơng Quang và cộng sự (2006) [44], cho biết: so sánh các yếu tố gây bệnh của E.coli phân lập từ phân bê nghé bị tiêu chảy với phân bê nghé không bị tiêu chảy cũng thấy thay đổi đáng kể: tỷ lệ các chủng mang kháng nguyên bám dính tăng gấp 3,4 và 2,9 lần. Khả năng dung huyết gấp 2,1 và 2,77 lần. Khả năng sản sinh độc tố đƣờng ruột gấp 6,93 và 3,69 lần. Độc lực giết chuột cũng tăng gấp 2 – 3 lần. Vũ Khắc Hùng và cộng sự (2007) [21], đã phân lập 237 mẫu phân trâu và 126 mẫu phân bò khỏe mạnh tại các tỉnh miền trung để kiểm tra tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli sản sinh độc tố Shiga (STEC – Shiga toxin – producing E.coli), kết quả cho thấy: 27% trâu và 23% bò đƣợc kiểm tra mang STEC. Trong số 93 chủng STEC phân lập từ trâu và bò, 17 chủng mang gen stx1, 55 chủng mang đồng thời 2 gen stx1 và stx2. Tuy nhiên có 2 chủng mang gen stx1 nhƣng không gây độc cho tế bào Vero. Cũng trong 93 chủng trên có 68 chủng (73%) mang gen ehxA, 65 chủng (70%) mang gen saa. Những chủng E.coli đƣợc phân lập từ bê nghé có khả năng làm chết chuột khi gây nhiễm cho thỏ bằng cách đƣa trực tiếp canh trùng vào ruột non đã làm thỏ tiêu chảy trong thời gian từ 24 – 30 giờ, và giết thỏ trong vòng 36 giờ sau gây nhiễm (Nguyễn Văn Quang và cộng sự, 2002 [42]). Tác giả Phạm Thị Hồng Ngân (1999) [34], khi nghiên cứu khả năng sản sinh độc tố của các chủng E.coli phân lập đƣợc từ bê nghé khỏe mạnh và bị tiêu chảy thấy: Ở bê, nghé khỏe mạnh có một tỷ lệ nhất định các chủng E.coli Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 có khả năng sản sinh độc tố ruột (bê khỏe: 6,1%, nghé khỏe: 10,3%). Còn ở bê, nghé tiêu chảy thì tỷ lệ tăng lên (bê tiêu chảy: 27,8%, nghé tiêu chảy: 23,6%). Phạm Khắc Hiếu (1997) [19], cho thấy có 5% số chủng vi khuẩn E.coli phân lập đƣợc kháng lại 7 loại kháng sinh, 25% số chủng kháng lại 4 loại kháng sinh thƣờng dùng. Vi khuẩn E.coli là tác nhân quan trọng trong các bệnh nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hoá. Nó là một vi khuẩn chiếm nhiều nhất trong các loại vi khuẩn hiếu khí trong đƣờng tiêu hoá của động vật (Bộ môn vi sinh vật trƣờng Đại Học Y Khoa Hà Nội, 1993 [5]). Chúng xuất hiện rất sớm trong đƣờng tiêu hoá của ngƣời và động vật sơ sinh. Khi mới sinh động vật không có E.coli trong ruột, nhƣng chỉ sau đẻ vài giờ đã có bình thƣờng . Để hạn chế nguyên nhân gây bệnh do vi khuẩn E.coli cho gia súc và gia cầm thì nhiều nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu vắc xin E.coli để phòng bệnh. Nguyễn Thị Nội (1985) [38], đã dùng các chủng EC3, EC25, EC36, EC236 của Hungari mang kháng nguyên K88 để sản xuất vắc xin theo phƣơng pháp cải tiến đã có hiệu quả cao trong phòng bệnh lợn con ỉa phân trắng. Lê Văn Tạo và các cộng sự, 1990, đã nghiên cứu yếu tố gây bệnh K88, Enterotoxin Hemolyse của các chủng E.coli gây bệnh ở lợn để chọn giống vi khuẩn chế vắc xin cho uống. Ở lợn và gia cầm, hiện đã có rất nhiều nhà khoa học nghiên cứu về bệnh E.coli để định chủng và chế vắc xin phòng bệnh. Còn ở trâu, bò cũng đã có một số nhà khoa học quan tâm nghiên cứu về bệnh, nhƣng để định Type huyết thanh, tìm các chủng gây bệnh chế vắc xin phòng bệnh thì chƣa thực sự đƣợc quan tâm nhiều lắm. Đó có lẽ là một tổn thất rất lớn đối với ngành chăn nuôi trâu bò ở nƣớc ta - khi mà ngành chăn nuôi trâu bò đang phát triển mạnh mẽ không ngừng thì kéo theo nó là tình hình bệnh E.coli cũng phát triển theo, điều đó đòi hỏi các nhà khoa học trong nƣớc cần phải quan tâm nhiều hơn nữa. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu ở nước ngoài Trên thế giới từ lâu đã có rất nhiều nhà khoa học đi sâu nghiên cứu về vi khuẩn E.coli đặc biệt là trong những thập kỷ 60, 70 và những năm gần đây. Năm 1976 – Smith H.W và cộng sự [96] đã đề nghị: Khi lựa chọn giống vi khuẩn E.coli để sản xuất vắc xin phòng bệnh thì cần quan tâm đến các yếu tố gây bệnh mà vi khuẩn tiếp nhận đƣợc trong quá trình phát triển Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 cá thể, từ đó đi đến khẳng định vai trò gây bệnh của E.coli và đi sâu nghiên cứu những yếu tố gây bệnh của nó. Theo Sokol (1991) [98], sở dĩ vi khuẩn E.coli từ vai trò cộng sinh thƣờng trực trong đƣờng ruột đã trở thành vi khuẩn gây bệnh, vì trong quá trình sống của cá thể, vi khuẩn tiếp nhận đƣợc các yếu tố gây bệnh mà theo ông đó là yếu tố dung huyết (Hly), yếu tố cạnh tranh (Colv), yếu tố bám dính (K88, K99), yếu tố độc tố đƣờng ruột (Enterotoxin), yếu tố kháng kháng sinh. Các yếu tố gây bệnh này không đƣợc di truyền qua ADN của Chromosome mà di truyền bằng ADN nằm ngoài Romosome gọi là Plasmid, qua hiện tƣợng trao đổi bằng di truyền, bằng tiết hợp, chính những yếu tố di truyền này đã giúp cho vi khuẩn bám dính vào tế bào nhung mao ruột, xâm nhập vào thành ruột. Từ đây vi khuẩn thực hiện quá trình gây bệnh là sản sinh độc tố phá huỷ tế bào niêm mạc ruột gây bại huyết, dung huyết. Linggood (1982) [83] đã nghiên cứu về khả năng dung huyết của vi khuẩn E.coli và cho rằng đây là yếu tố độc lực quan trọng của vi khuẩn. Jones và cộng sự (1983) [77], đã nghiên cứu các loại khoáng nguyên bám dính mà E.coli có khả năng sản sinh gồm: F7, 987P, K88ab, K99. . . đồng thời tìm ra khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện cho từng loài. Dejonge (1984) [65], đã nghiên cứu về độc tố của vi khuẩn E.coli và cho rằng: E.coli sản sinh một số độc tố khác nhau nhƣ độc tố chịu nhiệt có bản chất là Peptit là nguyên nhân gây tiêu chảy, ngoài ra còn có Cytoxin, LTs, LTII2, LTIIb. Những độc tố này không bị trung hoà bởi kháng thể kháng độc tố Type. Faibrother (1992) [69], đã nghiên cứu và đặt tên các chủng E.coli theo những yếu tố gây bệnh mà chúng có khả năng sản sinh ra. Wilson J.M và cộng sự (1994) [101], khi phân lập trên bê, nghé bị tiêu chảy tai một số trang trại ở Canada cho thấy tỷ lệ nhiễm của bê dƣới 2 tuần tuổi với chủng Verotoxigenic E.coli là 17,80%, trên 2 tuần tuổi tới 3 tháng tuổi là 37,20%. Janke B.H và cộng sự (1989) [75], cho thấy vai trò của Adherence enteropathogenic E.coli là những nguyên nhân cơ bản và gây chết với tỷ lệ cao ở bê, nghé. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, địa điểm, thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Trâu nuôi tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. 2.1.2. Địa điểm nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu: Các trang trại và hộ gia đình chăn nuôi trâu tại một số xã của huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. Địa điểm xét nghiệm: Phòng thí nghiệm Khoa Chăn nuôi thú y, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên. 2.1.3. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 09/2007 – 09/2008. 2.2. Vật liệu dùng trong nghiên cứu 2.2.1. Mẫu bệnh phẩm Phân trâu tiêu chảy và phân trâu bình thƣờng tại các trang trại và hộ gia đình chăn nuôi trâu tại một số xã của huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. 2.2.2. Động vật thí nghiệm Chuột bạch: 18 – 20 gam/con, khỏe mạnh. 2.2.3. Hóa chất, môi trường thí nghiệm Các loại môi trƣờng dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn E.coli: thạch thƣờng, thạch MacConkey, thạch XLD, thạch máu, thạch Kligler, Nutrient broth, môi trƣờng BHI, dung dịch Kovac, thuốc nhuộm Gram, các loại giấy tẩm kháng sinh, các loại môi trƣờng đƣờng: Glucoze, Lactoze, Mannitol, Sorbitol,…. Kháng huyết thanh chuẩn định type kháng nguyên O đa giá và đơn giá, kháng huyết thanh K88 và K99 chuẩn. 2.2.4. Máy móc, thiết bị Buồng cấy vô trùng, nồi hấp ƣớt, tủ ấm, máy li tâm,… 2.3. Nội dung nghiên cứu 2.3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 2.3.2. Nuôi cấy, phân lập và xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E.coli ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. 2.3.3. Xác định đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng vi khuẩn E.coli đã phân lập được. 2.3.4. Xác định số lượng vi khuẩn E.coli trong phân trâu. 2.3.5. Xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli phân lập được. 2.3.6. Kiểm tra độc lực vi khuẩn E.coli phân lập được ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. 2.3.7. Kiểm tra khả năng mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập được với một số loại kháng sinh. 2.3.8. Xác định một số phác đồ điều trị bệnh tiêu chảy ở trâu. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp nghiên cứu dịch tễ Sử dụng phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ mô tả, dịch tễ học thống kê, dịch tễ học phân tích, cụ thể nhƣ sau: - Lập biểu mẫu điều tra. - Điều tra theo phƣơng pháp thống kê ngẫu nhiên, điều tra 6 xã trong huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai. - Trực tiếp điều tra qua chẩn đoán lâm sàng. - Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết. - Phƣơng pháp điều tra trâu bị tiêu chảy theo đàn và theo cá thể. - Phƣơng pháp điều tra trâu bị tiêu chảy theo quy mô đàn nuôi: từ 1 – 3 trâu, từ 3 – 5 trâu và trên 5 trâu. - Điều tra trâu bị tiêu chảy theo các mùa Xuân, Hè, Thu, Đông. 2.4.2. Phương pháp lấy mẫu Mẫu phân: Dùng tăm bông vô trùng lấy phân trực tiếp từ trực tràng hoặc lấy 3 – 5g phân ngay sau khi trâu thải ra rồi đựng trong túi nilon vô trùng, giữ trong thùng bảo ôn và mang nhanh về phòng thí nghiệm. Trên mỗi mẫu đều ghi đầy đủ các thông tin liên quan đến trâu đƣợc lấy mẫu (địa điểm, mùa vụ, tuổi, trạng thái phân, quy mô đàn). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 2.4.3. Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn Sơ đồ phân lập vi khuẩn E.coli (Theo Carter G. R, 1995 [61]) 2.4.4. Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn Sử dụng phƣơng pháp Kock, mẫu phân đƣợc pha loãng ở nồng độ b, cấy 0,2ml vào thạch đặc rồi đếm số khuẩn lạc (CFU) bằng máy đếm (trích theo Nguyễn Bá Hiên, 2001 [18]). Số lƣợng vi khuẩn (X) trong 1gr phân đƣợc tính theo công thức: X = 5.a.b Trong đó: a: là số lƣợng CFU trung bình trên một đĩa petri b: là nồng độ pha loãng mẫu hệ số 5 vì cấy 0,2ml Môi trƣờng thạch MacConkey, thạch XLD Giám định vi khuẩn E.coli Đếm số khuẩn lạc Thạch máu Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính Phát hiện các yếu tố gây bệnh Xác định serotype kháng nguyên O Thử kháng sinh đồ Mẫu phân, bệnh phẩm từ trâu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 2.4.5. Phương pháp xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn E.coli , xác định số lƣợng và giám định đặc tính sinh vật hoá học củ E.coli theo Quinn.P.J và cộng sự (1994) [90]: Các phản ứng sinh vật hóa học dùng để xác định phân biệt vi khuẩn E.coli nhƣ: - Phản ứng sinh Indol - Phản ứng lên men sinh hơi đƣờng - Phản ứng sinh H2S - Khả năng di động 2.4.6. Xác định serotype kháng nguyên O vi khuẩn E.coli bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính Sau khi kiểm tra các đặc tính sinh vật hóa học của các chủng E.coli phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành xác định serotype bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. ẩn E.coli poly O, H bằ . Vì kháng nguyên O của vi khuẩn E.coli có rất nhiều serotype bởi vậy ngƣời ta thƣờng sản xuất các nhóm kháng huyết thanh O, mỗi nhóm gồm một số serotype, đồng thời cùng đƣợc sản xuất các kháng huyết thanh đơn giá. Muốn xác định serotype vi khuẩn E.coli phải tiến hành xác định nhóm với kháng huyết thanh nhóm, sau đó mới xác định serotype với kháng huyết thanh đơn giá thuộc nhóm kháng huyết thanh đa giá đã ngƣng kết. * Cách tiến hành Trên một phiến kính sạch, nhỏ hai giọt nƣớc muối sinh lý ở 2 đầu. Dùng que cấy vô trùng lấy một khuẩn lạc E.coli cần xác định serotype mọc trên thạch máu, rồi hòa tan vào hai giọt nƣớc muối sinh lý ở hai đầu của phiến kính. Dùng que cấy vô trùng lấy kháng huyết thanh đa giá nhóm, rồi trộn đều vào một bên huyễn dịch vi khuẩn. Còn huyễn dịch vi khuẩn bên kia không trộn huyết thanh đa giá nhóm (đối chứng âm). Để yên từ 1 – 2 phút ở nhiệt độ phòng rồi đọc kết quả phản ứng: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 - Phản ứng dƣơng tính: khi trong giọt huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn có những hạt ngƣng kết, mức độ ngƣng kết đƣợc đánh giá từ + đến ++++. - Phản ứng âm tính: phần huyễn dịch kháng huyết thanh và vi khuẩn vẫn đục đều, không có những hạt ngƣng kết xuất hiện và giống nhƣ bên đối chứng âm. Chọn những khuẩn lạc có ngƣng kết với kháng huyết thanh đa giá nhóm, tiến hành làm ngƣng kết với từng kháng huyết thanh đơn giá thuộc hóm nhƣ đã tiến hành với nhóm đa giá. Nếu một vi khuẩn ngƣng kết chéo với nhiều nhóm, hoặc nhiều kháng thể đơn giá thì phải pha loãng kháng huyết thanh thành các độ pha loãng khác nhau theo cấp số 2 (1/2,1/4, 1/8,…..1/64), rồi làm phản ứng với từng độ pha loãng. Serotype nào ngƣng kết ở hiệu giá pha loãng kháng huyết thanh cao nhất đó là serotype của vi khuẩn. 2.4.7. Kiểm tra độc lực của vi khuẩn E.coli được phân lập trên chuột bạch Để xác định độc lực của vi khuẩn E.coli gây bệnh trên trâu, có thể thực hiện bằng phƣơng pháp tiêm truyền qua động vật thí nghiệm là chuột bạch khỏe mạnh và vô trùng. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: Bƣớc 1: Vi khuẩn E.coli thuần từ môi trƣờng giữ giống đƣợc cấy chuyển vào môi trƣờng Nutrient broth trong bình tam giác 100ml. Canh trùng đƣợc bồi dƣỡng ở 37 o C trong 24 giờ. Bƣớc 2: Lấy 1ml canh trùng đã đƣợc bồi dƣỡng tiêm vào xoang phúc mạc của chuột bạch. Bƣớc 3: Kiểm tra và theo dõi thời gian chết và số lƣợng chuột chết trong vòng 7 ngày. Căn cứ vào số lƣợng chuột chết, giờ chuột chết để đánh giá độc lực của vi khuẩn. Bƣớc 4: Mổ khám và phân lập vi khuẩn từ gan của chuột bị chết. 2.4.8. Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được ễn Thanh Hà (1991) [15]. Các bƣớc tiến hành: Bƣớc 1: Vi khuẩn E.coli thuần từ môi trƣờng giữ giống đƣợc cấy chuyển vào môi trƣờng Nutrient broth trong các ống nghiệm. Canh trùng đƣợc bồi dƣỡng ở 37 o C trong 24 giờ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Bƣớc 2: Lấy ống nghiệm ra rồi pha loãng ở nồng độ 10 4 . Hút 0,5ml canh trùng đổ vào đĩa thạch máu và chang đều. Bƣớc 3: Đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt đĩa thạch. Bƣớc 4: Bồi dƣỡng đĩa thạch ở 37 o C trong 24 giờ. Đọc kết quả bằng cách đo đƣờng kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá mức độ mẫn cảm hay kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E.coli kiểm tra. Kháng sinh Vòng vô khuẩn (đƣờng kính mm) Kháng Mẫn cảm trung bình Mẫn cảm Trimethoprim ≤ 10 11 – 15 ≥16 Streptomycin ≤ 11 12 – 14 ≥15 Gentamycin ≤ 12 13 – 17 ≥18 Neomycin ≤ 12 13 – 14 ≥15 Cephalothin ≤ 14 15 – 17 ≥18 Amikacin ≤ 14 15 – 16 ≥17 Apramycin ≤ 10 11 – 14 ≥15 Ceftiofur ≤ 17 18 – 20 ≥21 Lincospectiomycin ≤ 10 11 – 13 ≥14 Erofloxacin ≤ 16 17 – 19 ≥20 Ampicilin ≤ 11 12 – 14 ≥15 Tetracyclin ≤ 14 15 – 18 ≥19 2.4.9. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng E.coli phân lập được 2.4.9.1. Xác định khả năng dung huyết Cách tiến hành: Cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch máu, đốt que cấy sau mỗi lần đổi góc cấy để mật độ vi khuẩn giảm dần. Để tủ ấm ở nhiệt độ 37 o C trong 24 giờ, sau đó đọc kết quả: Mẫu dƣơng tính :Xung quanh khuẩn lạc có vòng dung huyết sáng. Mẫu âm tính: Xung quanh khuẩn lạc không có vòng dung huyết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 2.4.9.2. Xác định khả năng sản sinh độc tố ruột của vi khuẩn E.coli Xác định khả năng sản sinh độc tố ruột của vi khuẩn E.coli bằng phƣơng pháp “Phản ứng khuyếch tán trong da thỏ” (Peterson, 1976, trích theo Nguyễn Khả Ngự, 2000 [36]). Cách tiến hành: Chuẩn bị độc tố: Chủng vi khuẩn E.coli thuần khiết trên môi trƣờng giữ giống đƣợc cấy chuyển sang 30ml môi trƣờng BHI lỏng đựng trong bình tam giác loại 100ml, bồi dƣỡng có lắc ở điều kiện 37 o C/24h. Huyễn dịch độc tố thu đƣợc bằng cách li tâm canh trùng 10.000 - 12.000v/p ở điều kiện lạnh, trong 10 phút. Bỏ cặn bã lấy nƣớc trong và chia làm 2 phần: + Một phần bảo quản ở 4 o C để thử độc tố không chịu nhiệt. + Phần còn lại đun cách thuỷ ở 80 o C trong 10 phút sau đó bảo quản ở điều kiện 4 o C, để thử độc tố chịu nhiệt. Chuẩn bị động vật thí nghiệm: Chọn thỏ khoẻ có khối lƣợng 2,5 - 3 kg, cắt trụi lông ở phần lƣng, xoa thêm kem rụng lông để làm sạch hết phần chân lông còn lại, dùng bút dạ chia mảng da này thành những ô vuông nhỏ cạnh 2 x 2cm. Chính giữa mỗi ô vuông, tiêm nội bì 0,1ml dịch độc tố đã đƣợc chuẩn bị ở trên, mỗi mẫu tiêm 2 ô ở 2 vị trí xa nhau, đối chứng âm là môi trƣờng BHI lỏng vô trùng. Sau khi tiêm 18h với độc tố không chịu nhiệt và sau 2h với độc tố chịu nhiệt, thỏ thí nghiệm đƣợc tiêm tĩnh mạch tai dung d ịch Evan Blue, liều 40mg/kg thể trọng. Nuôi tiếp 2h, giết thỏ, lột da đọc kết quả phản ứng. Đọc kết quả phản ứng: + Phản ứng đƣợc đánh giá là dƣơng tính khi ở trên ô thi nghiệm vùng thẩm xuất Evan Blue có diện tích ≥ 16mm 2 (4x4mm). + Phản ứng cho kết quả âm tính khi ô da lƣng thỏ không có vùng thẩm xuất Evan Blue. + Phản ứng đƣợc coi là nghi ngờ khi trên ô da thỏ có vùng thẩm xuất Evan Blue nhƣng diện tích < 16mm 2 . 2.4.10. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu thu đƣợc trong các thí nghiệm đƣợc xử lý theo các phƣơng pháp toán học thông thƣờng. Xử lý số liệu theo Chu Văn Mẫn (2001) [28]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Một số đặc điểm dịch tễ của hội chứng tiêu chảy ở trâu tại huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai 3.1.1. Điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo đàn và theo cá thể Trâu ở vùng núi nói chung, trâu ở huyện Bảo Yên, tỉnh Lào Cai nói riêng thuộc loại hình trâu ngố, có khối lƣợng trung bình trâu đực ≥ 450kg, trâu cái ≥ 400kg, trâu đực thiến ≥ 500kg (Nguyễn Đức Thạc, 1985 [49]), nhƣng do quản lý chăm sóc nuôi dƣỡng chƣa đƣợc quan tâm đúng mức nên có xu thế giảm về khối lƣợng và sức sản xuất. Hội chứng viêm ruột ỉa chảy của trâu xảy ra do nhiều nguyên nhân khác nhau. Các yếu tố vi khuẩn, virus, ký sinh trùng, stress có thể là nguyên nhân nguyên phát hoặc thứ phát gây bệnh nhƣng đều gây tổn thƣơng đƣờng tiêu hóa kèm theo là nhiễm khuẩn bội nhiễm. Bệnh gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi do gây chết hoặc làm vật gầy yếu, giảm tăng trọng (Nguyễn Ngã và cs, 2000 [32]). Tiến hành điều tra trâu mắc bệnh tiêu chảy theo đàn và theo cá thể trên địa bàn các xã Vĩnh Yên (VY), Nghĩa Đô (NĐ), Xuân Hòa (XH), Lƣơng Sơn (LS), Tân Tiến (TT) và xã Minh Tân (MT) của huyện Bản Yên - Lào Cai. Qua điều tra 933 đàn trâu vớ 3.1: 3. điều tra tình hình trâu mắc bệnh tiêu chảy theo đàn và theo cá thể Địa điểm điều tra (xã) Mắc bệnh theo đàn Mắc bệnh theo cá thể Số đàn theo dõi (đàn) Số đàn mắc bệnh (đàn) Tỷ lệ (%) Số trâu theo dõi (con) Số trâu mắc bệnh (con) Tỷ lệ (%) Vĩnh Yên 216 85 39,3 498 99 19,8 Nghĩa Đô 178 81 45,5 534 117 21,9 Xuân Hoà 150 55 36,6 466 74 15,8 Lƣơng Sơn 146 70 47,9 451 109 24,1 Tân Tiến 125 33 26,4 256 33 12,8 Minh Tân 118 36 30,5 285 38 13,3 Tính chung 933 360 38,5 2490 470 18,8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 3. : Tỷ lệ trâu mắc bệnh tiêu chảy ở các xã trên là khá cao. Trâu mắc bệnh tiêu chảy theo đàn chiếm tỷ lệ từ 26,4% đến 47,9%; mắc bệnh theo cá thể, chiếm từ 12,8% đến 24,1%. Kết quả này tƣơng tự kết quả điều tra của Antonio.F và cộng sự (2004) [59]. Trong 6 xã chúng tôi tiến hành theo dõi tình hình tiêu chảy của đàn trâu thấy tỷ lệ trâu tiêu chảy có sự khác nhau giữa các xã. Tỷ lệ tiêu chảy của trâu theo đàn và theo cá thể cao nhất tại xã Lƣơng Sơn chiếm tỷ lệ 47,9% và 24,1%, và thấp nhất tại xã Tân Tiến chiếm tỷ lệ 26,4% và 12,8%. Tại xã Nghĩa Đô có tỷ lệ nhiễm theo đàn và theo cá thể là 45,5% và 21,9%, xã Vĩnh Yên là 19,8% và 39,3%, xã Xuân Hòa là 36,6% và 15,8%, xã Minh Tân là 30,5% và 13,3%. Tỷ lệ trâu bị tiêu chảy có sự khác nhau giữa các xã theo chúng tôi có thể là do đặc điểm về vị trí địa lý, mật độ dân cƣ, mật độ chăn nuôi gia súc. Các xã Lƣơng Sơn và Ngh