Luận văn Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------   ------ BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------   ------ BÙI THỊ HÀ NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN THUỘC CHI STREPTOMYCES SINH CHẤT KHÁNG SINH CHỐNG NẤM GÂY BỆNH TRÊN CÂY CHÈ Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. VI THỊ ĐOAN CHÍNH THÁI NGUYÊN - 2008 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô giáo TS. Vi Thị Đoan Chính đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn ThS. Nguyễn Phú Hùng và các cán bộ của bộ môn Sinh học thuộc Khoa KHTN & XH - ĐHTN đã nhiệt tình giúp đỡ tôi. Xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Ngô Đình Quang Bính và các cán bộ phòng Di truyền vi sinh học - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. Xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Y - Dƣợc Thái Nguyên, Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau Đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm - ĐHTN đã tạo nhiều điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này. Xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa KHCB, Bộ môn Hóa - sinh đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc học tập và hoàn thành luận văn này. Tôi xin cảm ơn các thầy cô, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn. Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những ngƣời thân yêu của tôi. LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái nguyên, ngày 15 tháng 9 năm 2008 Tác giả Bùi Thị Hà MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình vẽ, đồ thị MỞ ĐẦU..........................................................................................................1 Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN..................................................................3 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên............................................3 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn..................................................4 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn...............................................5 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn....................................................................6 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI... ...........8 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy.....................................8 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy)..................................9 1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................10 1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy)............................................10 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces..........................................11 1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN.................................................12 1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh...........................................12 1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn..................................15 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh........16 1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT..................................................18 1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm......................................................18 1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật.................................21 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu và hóa chất.........................................................................24 2.1.1. Nguyên liệu................................................................................24 2.1.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị.................. ...................................24 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu..........................................................................27 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè...........................27 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn..........................................................28 2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski........................................28 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh ................................................28 2.2.2.3.Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh............29 2.2.3. Bảo quản giống......................................................................................29 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn....................30 2.2.4.1. Đặc điểm hình thái...................................................................30 2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy....................................................................31 2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa......................................................31 2.2.5. Lên men tạo kháng sinh.........................................................................32 2.2.5.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp .................................32 2.2.5.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon..................................................33 2.2.5.3. Ảnh hƣởng của nguồn Nitơ......................................................33 2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA....33 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB.....................33 2.2.62. Khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR...................34 2.2.6.3. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose......................................35 2.2.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu.....................................................................36 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè......................37 3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn.............................................................38 3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn............................38 3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao..........................41 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2....42 3.3.1. Đặc điểm hình thái......................................................................42 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy........................................................................43 3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa.........................................................45 * Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon...............................................45 * Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp .........................................................46 * Khả năng chịu muối...........................................................................46 * Khả năng sinh enzym ngoại bào........................................................47 3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1..............................48 3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1....................50 3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn...........52 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp.....................................52 3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon.....................................................54 3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ..........................................................56 3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử........57 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn..........57 3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR..................58 Chƣơng 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận.........................................................................................60 4. 2. Kiến nghị về những nghiên cứu tiếp theo.....................................61 CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN....................62 TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................63 NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN XK : Xạ khuẩn VSV : Vi sinh vật CKS : Chất kháng sinh HSCC : Hệ sợi cơ chất HSKS : Hệ sợi khí sinh KTKS : Khuẩn ty khí sinh HTKS : Hoạt tính kháng sinh HTKN : Hoạt tính kháng nấm MT : Môi trƣờng KHVQH : Kính hiển vi quang học KHVĐT : Kính hiển vi điện tử DNA : Deoxyribonucleic Acid RNA : Ribonucleic Acid ISP : International Streptomyces Project TE : Tris - Ethylendiamin tetracetic acid SDS : Sodiumdodecyl sulfat TAE : Tris - Acetate - Ethylendiamin tetracetic acid PCR : Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi polymerase) DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm.....37 Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu................................39 Bảng 3. 3.Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè.......40 Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn..................................41 Bảng 3.5. Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1.........................................44 Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2....45 Bảng 3.7. Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng R2 và Đ1...................46 Bảng 3.8. Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1...................................47 Bảng 3.9. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm định.........................................................................................................48 Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis....50 Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A. brunneofungu.52 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng lên men khác nhau...........................................................................................53 Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1.....................................................................................55 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1...............................................................................................56 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh.............................38 Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu.................39 Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm.........................40 Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn.....................42 Hình 3.5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2................................42 Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1...............................43 Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng...........................44 Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn.......................................47 Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2....49 Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS ............54 Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS.........55 Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS.............57 Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn.........................58 Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu.....59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -1- MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Việt Nam là nước nông nghiệp nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm. Mưa là điều kiện rất thuận lợi cho VSV phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật. Vì vậy việc sử dụng hoá chất trong bảo vệ thực vật từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam. Song việc sử dụng hoá chất bảo vệ thực vật thường là độc hại và khi tồn dư trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ con người, gây ô nhiễm môi trường và mất cân bằng sinh thái. Chính vì vậy, Hội nghị tư vấn khu vực châu Á Thái bình dương của FAO năm 1992 đã khẳng định đấu tranh sinh học là nền tảng của chương trình IPM (Quản lý dịch hại tổng hợp) với chiến lược là sử dụng tác nhân sinh học để hạn chế sự phát triển của các quần thể ký sinh. Một trong những hướng nghiên cứu theo xu hướng này là sử dụng các tác nhân sinh học để hạn chế các quần thể VSV gây bệnh. Trong số các tác nhân sinh học thường được sử dụng để ức chế VSV gây bệnh, xạ khuẩn là nhóm có nhiều tiềm năng nhất vì tỷ lệ loài có khả năng sinh CKS cao, trong đó có nhiều CKS có khả năng chống nấm mạnh. Thái nguyên là tỉnh giàu tiềm năng về nông, lâm nghiệp. Trong đó cây chè là cây loại cây chủ đạo và hàng năm các bệnh do nấm cũng đã gây ra những thiệt hại nặng nề, làm giảm năng suất và chất lượng sản phẩm. Vì vậy việc tìm kiếm các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật có tầm quan trọng đặc biệt góp phần vào công tác bảo vệ thực vật và xây dựng nền nông nghiệp an toàn và bền vững. Xuất phát từ những lý do trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay cũng như để góp phần khai thác nguồn vi sinh vật vô cùng phong phú của Thái Nguyên. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -2- 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên cây chè. - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh, có nhiều triển vọng ứng dụng. 3. Đối tƣợng và nội dung nghiên cứu của đề tài * Đối tượng nghiên cứu - Các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Thái Nguyên. - Các chủng vi nấm gây bệnh trên cây chè ở Thái Nguyên. * Nội dung nghiên cứu 1. Phân lập các chủng nấm gây bệnh trên cây chè để sử dụng làm VSV kiểm định. 2. Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm từ các mẫu đất khác nhau. 3. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính chống nấm mạnh đã được lựa chọn. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo thành CKS của các chủng đã lựa chọn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -3- Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ XẠ KHUẨN 1.1.1. Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên Xạ khuẩn (Actinobacteria) thuộc nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên. Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được. Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật. Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [43]. Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5. Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian trong năm. Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh, 60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh. Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [6]. Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi. Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước. Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -4- amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ. Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [7]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn * Khuẩn lạc Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử). Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 1 m đến 2 3 m, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [10],[22]. Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy. Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 50 m, dễ quan sát bằng mắt thường. Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo. Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh. Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn. Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong. Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau. Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -5- * Khuẩn ty Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng. Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản. Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh. Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng. Độ dài của khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 m/giờ [43] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi. Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gene cần thiết từ genom và tiến hành tổng hợp protein, cứ như vậy sợi được hình thành và phát triển. Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên trong chứa các bào tử nang [7]. 1.1.3. Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử. Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn. Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn. Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA). Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [9]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -6- Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 400 A 0 chia 3 lớp. Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [13]. Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh. Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm. Trong nhiều trường hợp khi kích thích sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi. 1.1.4. Cấu tạo của xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập. Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào. Thành tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 120A 0 , khi già có thể đạt tới 150 200A 0 , lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A 0 , lớp trong dày khoảng 50A 0 . Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N - axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit. Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom và các dung môi hoà tan lipit khác. Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lipit hơn so với HSCC) khác với nấm. Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -7- trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [25],[30], [32], [35] [36]. Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [6], [8]. Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP) và glyxin. Chi Streptomyces thuộc nhóm này. Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic (m - ADP) và glyxin. Nhóm III: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic. Nhóm IV: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic, arabinose và galactose. Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein. Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn. Nguyên sinh chất và nhân tế bào xạ khuẩn không có khác biệt lớn so với tế bào vi khuẩn. Trong nguyên sinh chất của xạ khuẩn cũng chứa mezoxom và các thể ẩn nhập (các hạt polyphosphate: hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm sudan III và các hạt polysaccharide bắt màu với dung dịch lugol). Tuy nhiên, điểm khác biệt của xạ khuẩn so với các sinh vật prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 45% [11]. Xạ khuẩn thuộc loại vi khuẩn Gram dương nên ngoài yếu tố di truyền trong nhiễm sắc thể còn có các yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể, chúng có thể tự nhân lên mà được Lederberg gọi là plasmid. Các plasmid đem lại cho tế bào nhiều đặc tính chọn lọc quý giá như có thêm khả năng phân giải một số hợp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -8- chất, chống chịu với nhiệt độ bất lợi, chống chịu với các kháng sinh, chuyển gene, sản xuất các chất kháng sinh trong đất và môi trường tuyển chọn [3]. Xạ khuẩn thuộc loại cơ thể dị dưỡng, nguồn cacbon chúng thường dùng là đường, tinh bột, rượu và nhiều chất hữu cơ khác. Nguồn nitơ hữu cơ là protein, pepton, cao ngô, cao nấm men. Nguồn nitơ vô cơ là nitrat, muối amôn…Khả năng đồng hoá các chất ở các loài hay chủng xạ khuẩn khác nhau là khác nhau. 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN HIỆN ĐẠI Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học...nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp mới như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh...Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử. 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định. Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử. Theo Pridham và cộng sự [38], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng. RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn. S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn. Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn. Tuy nhiên như ta đã biết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -9- xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA. Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái. Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử [45]. 1.2.2. Đặc điểm hóa phân loại (Chemotaxonomy) Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trở lại đây. Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV. Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau: - Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào. - Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG. - Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter. Đây là đặc điểm phân loại cơ bản cho các chi đó. - Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10. Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit (axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [11]. - Photpholipit có 5 typ photpholipit (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -10- Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất. Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào. 1.2.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym. Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn. Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý - sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại. Do tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi [29]. 1.2.4. Phân loại số (Numerical taxonomy) Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số. Phương pháp này dựa trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa. Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng. - Công thức của Sokal và Michener (SSM) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -11- 100 NNN NN S dSS SS SM(AB) Trong đó: (AB)SM S : Mức độ giống nhau giữa hai cá thể A, B (%) NS+: Số các tính trạng giống nhau Nd: Số các tính trạng khác nhau NS- : Số các tính trạng đối lập nhau. - Công thức của Jacard (SJ) 100 NN N S dS S J(AB) Trong đó: (AB)J S : mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%) NS: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh. Nd: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia). Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu "rễ cây") của các thông số. Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một nhóm. Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất định [44]. 1.2.5. Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt tên năm 1943 [43]. Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất. Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh. Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm. Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất. Bề Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -12- mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước. Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử. Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử. Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng ... Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc. Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm. Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn...tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy. Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ. Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau. Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này. Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ. Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 30 0 C, pH tối ưu 6,5 - 8,0. Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh). Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật. Cho đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [48],[49]. 1.3. CHẤT KHÁNG SINH TỪ XẠ KHUẨN 1.3.1. Lƣợc sử nghiên cứu chất kháng sinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -13- Theo định nghĩa của Outchinnikov [48]. Chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp. Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penixillin vào tháng 10 năm 1928. Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và trở thành "một loại thuốc thần kỳ". Năm 1945, A.Fleming, E. Chain và H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học - kỷ nguyên kháng sinh. Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin, tiroxidin do Rene ' Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin do Waksman phát hiện năm 1941, erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952... Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện [31]. Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng. CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới. Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -14- Năm 1999 một kháng sinh mới khác được phát hiện có tác dụng ngăn chặn hiện tượng cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh. Đó là kháng sinh loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312. Năm 2003, nhiều nước trên thế giới vẫn tiếp tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới. Tại Nhật Bản, chất kháng sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp. TP - A0356 bằng phương pháp sắc kí cột. CKS này có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus fumigalus và Candida albicans. Ngoài ra chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml [15]. Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp. C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [47]. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ. Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [7],[41]. Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN, kỹ thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những đem lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -15- 1.3.2. Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS. Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [6]. Một trong những tính chất của các CKS có nguồn gốc từ VSV nói chung và từ xạ khuẩn nói riêng là có tác dụng chọn lọc. Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định. Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng. Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn. Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS. Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường tự nhiên. Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng. Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng [5]. Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định. - CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzym. - CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau. - CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác. Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau. Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -16- 1.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.3.3.1. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy * Nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn. Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 - 30 0 C, nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 28 0 C [20]. * pH môi trường Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường. pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzym và tác động gián tiếp qua môi trường. pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [24],[46]. * Độ thông khí Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy)[21]. Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat... làm tăng khả năng hòa tan oxy. Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 - 8ml O2/ 100ml môi trường lên men [8]. * Tuổi giống Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng. Tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thường là 24 giờ tuổi. Lượng giống cấy truyền khoảng từ 2 - 10% [14]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -17- 1.3.3.2. Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng. Trước hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng...[5],[26],[29]. * Nguồn cacbon Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành CKS. Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột. Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucoza, mannoza, fructoza...có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như sacaroza, maltoza...Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS. * Nguồn nitơ Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô. Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao sẽ ức chế sinh tổng hợp CKS[27]. Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon. Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn. * Nguồn photphat vô cơ Photphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS. Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá 10 mg/ml. Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS. * Các yếu tố vi lượng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -18- Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men. Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn. Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn. * Hình thức lên men Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định. Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan sát thấy và CKS được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng. Quá trình sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy đảo và sục khí. 1.4. MỘT SỐ BỆNH HẠI CHÈ DO NẤM GÂY RA VÀ ỨNG DỤNG CỦA CKS TRONG BẢO VỆ THỰC VẬT 1.4.1. Một số bệnh hại chè do nấm 1.4.1.1. Bệnh phồng lá chè Bệnh được phát hiện năm 1868 ở Ấn Độ, nhưng đến năm 1895 Masse mới nghiên cứu phát hiện nguyên nhân gây bệnh. Bệnh do nấm Esobasidium vexans Mase gây ra [1],[4]. Bệnh phát sinh ở lá non, cành non, vết bệnh phần lớn ở mép lá. Đầu tiên trên lá xuất hiện những chấm nhỏ hình giọt dầu màu vàng nhạt. Sau đó vết bệnh lớn dần, màu nhạt dần. Phía dưới vệt bệnh (mặt dưới lá) phồng lên và mặt trên lõm xuống, phía lồi có hạt phấn màu trắng, có giới hạn rõ rệt với phần lá khoẻ. Cành bị nấm hại sẽ bị chết [50]. Đám bào tử (Basidiospore) của nấm bệnh có hình gậy, phía đỉnh phân nhánh, mỗi nhánh đính một bào tử có hình bầu dục hoặc hình thận không màu. Lúc đầu bào tử là đơn bào, về sau ở giữa có vách ngăn tạo thành hai bào tử. Bào tử rất dễ rụng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -19- Dưới điều kiện độ ẩm cao, nhiệt độ thấp bệnh phát sinh mạnh. Các thời điểm bệnh thường phát sinh mạnh là tháng 3 đến tháng 5 và tháng 9 đến tháng 10. Nhiệt độ thích hợp là 15 20 0 C. 1.4.1.2. Bệnh đốm nâu Bệnh đốm nâu (còn gọi là khô lá chè hình bánh xe) là bệnh hại lá thường thấy ở các nương chè Việt Nam. Bệnh phát sinh vào tháng 5, 6 mưa nhiều và bệnh phát sinh mạnh nhất vào tháng 8, 9. Bệnh nặng có thể làm khô lá và rụng sớm. Tác nhân gây bệnh là do nấm Colletotrichum camelliae Masse [1],[4]. Bệnh đốm nâu chủ yếu hại lá già, cành và quả. Trên lá vết bệnh bắt đầu từ mép lá, màu nâu, không có hình dáng nhất định hoặc hình bán nguyệt. Trên vết bệnh có các đường tròn đồng tâm, ở giữa vết bệnh lá bị khô, màu xám tro đen lan dần theo hình gợn sóng bánh xe. Trên cành cũng có triệu trứng như vậy, bộ phận bị bệnh có thể bị rách (vỡ) ra [50]. Bào tử nấm tồn tại trên vết bệnh và lá bệnh, thậm chí cả khi lá rơi xuống đất. Năm sau, khi nhiệt độ tăng lên, bào tử phát tán nhờ gió mưa truyền đến các lá chè và sau lây nhiễm 5 18 ngày thì xuất hiện vết bệnh. Bệnh ưa nóng ẩm nên thường phát sinh vào tháng 7, 8. Sau mưa liên tục 10 15 ngày bệnh phát triển rất nặng. Ở vùng đất thấp có mực nước ngầm cao, thoát nước không tốt, phân bón không đủ đều tạo điều kiện cho bệnh phát sinh. Trong quá trình chăm sóc chè bị xây xát nhiều, ánh sáng quá mạnh hoặc khi gặp mưa, bệnh phát sinh càng nặng, giống chè lá to bệnh dễ phát sinh mạnh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -20- 1.4.1.3. Bệnh đốm trắng Ở Việt Nam, bệnh đốm trắng có ở mọi vùng chè, phát sinh trên vườn chè mới trồng, gây hại ở lá non và cành non. Mùa mưa bệnh phát sinh mạnh nhất. Tác nhân gây bệnh là do nấm Phyllosticta theafolia Hara [4]. Lúc đầu vết bệnh còn nhỏ, hình tròn, màu nâu phần giữa lõm xuống có màu trắng sáng, xung quanh có màu lông sẫm. Đường kính vết bệnh 0,5 1,5 mm. Thời kỳ sau, nhiều vết nhỏ liên kết với nhau tạo thành vết lớn không có hình dạng nhất định, cuống lá bị bệnh dễ làm cho lá rụng. Bệnh có thể phát sinh ở tất cả cành non. Mặt trên vết bệnh có những vết nhỏ màu đen. Bệnh đốm trắng có những nốt mốc và có những vết nhỏ hình mũi kim. Sợi nấm hoặc bào tử tồn tại trong lá bị rụng hoặc ở cành cây để qua đông. Mùa xuân bào tử phát tán và xâm nhập vào các cành non và lá bánh tẻ. Nhiệt độ từ 18 25 0 C rất thích hợp cho sự phát sinh của bệnh. Mùa xuân và mùa thu, mưa nhiều là điều kiện cho sự phát sinh mạnh. Trên các giống chè lá nhỏ (như Đại bạch trà, Gruzia) bệnh cũng phát sinh mạnh. 1.4.1.4. Bệnh đốm xám Bệnh đốm xám là bệnh phổ biến ở các vùng trồng chè. Bệnh phát sinh vào mùa mưa, nhiệt độ 27 30 0 C. Bệnh nặng làm lá chè khô rụng, cây chè còi cọc. Tác nhân gây bệnh là do nấm Pestalossia theae Sawada [1],[4]. Vết bệnh trên lá có màu nâu sẫm, lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen sau đó lan ra khắp lá. Bệnh thường bắt đầu từ mép lá và làm cho lá rụng. Vết bệnh có hình gợn sóng, trên vết bệnh có các hình vân đen. Lá thường bị rụng khi bệnh lan khắp lá hoặc 1/2 lá. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -21- Những điểm nhỏ trên lá là bào tử phân sinh đính trên cuống ngắn và đính bào tử. Bào tử có 3 ngăn, đầu nhỏ có cuống, đầu lớn có 3 lông, bào tử màu nâu xẫm. 1.4.1.5. Bệnh thối búp chè Bệnh thối búp chè thường thấy ở các nước trồng chè của vùng Châu Á. Bệnh này được phát hiện ở Phú Hộ từ năm 1961 - 1962 trên những nương chè tăng sản và lấy hom giống. Tác nhân gây bệnh là do nấm Colletotrichum theae Petch [4]. Bệnh thường xuất hiện ở lá non, cuống lá và cành non. Vết bệnh lúc đầu bằng đầu kim có màu đen, sau đó lan dần ra hết cả búp và cành chè. Sau 8 10 ngày vết bệnh có thể dài tới 15 20 mm. Khi thời tiết nóng ẩm lá dễ bị rụng. Trong vườn ươm thường hay bị nặng hơn ở nương chè hái búp. Từ tháng 7 đến tháng 9 thường có mưa kéo dài, bệnh dễ gây hại nặng. Nhiệt độ 27 0 C và độ ẩm > 90% là điều kiện thuận lợi cho bệnh phát sinh. Bào tử nấm lan truyền nhờ mưa gió. Chè để cành và vườn ươm bón nhiều phân đạm và trên nền thâm canh cao, thường bị bệnh nặng hơn. 1.4.2. Các chất kháng sinh trong bảo vệ thực vật * Xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã điều tra nghiên cứu tình hình sử dụng CKS trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật. Tuy còn ở mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông nghiệp hiện đại. Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây. Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -22- rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh của cây. Thông thường, một loại xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất. Không phải tất cả các xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể hiện trong đất (khoảng 4 - 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây. Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên. Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh. Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ VSV thông qua các enzym phân giải. Ngoài ra, nhiều XK còn tiết ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ [14]. * Các chất kháng sinh có nguồn gốc xạ khuẩn trong phòng trừ nấm gây bệnh thực vật Để tránh dịch bệnh trong nông nghiệp, người ta có thể sử dụng một số biện pháp kỹ thuật, như thay đổi cơ cấu cây trồng, mùa vụ. Tuy nhiên biện pháp này gây xáo trộn hệ sinh thái đồng ruộng, tạo điều kiện để phát sinh một số bệnh mà trước đây ít gặp. Việc tuyển chọn các dòng cây kháng bệnh cũng chỉ được vài năm, sau đó các tác nhân gây bệnh lại kháng lại. Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ dại... kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất. So với thuốc hóa học, dùng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học. CKS và dịch lên men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất [15]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -23- Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ...Ở Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng xạ khuẩn từ đất và nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn. Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp. 201 có khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F. solani...[15]. Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F. oxysporum gây bệnh thối rễ ở thực vật [2]. Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định. Ngoài ra, giá thành của các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất của người nông dân. Do đó cần có sự phối hợp thống nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả to lớn trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người [14]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -24- Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 2.1.1. Nguyên liệu 2.1.1.1 Mẫu cây Mẫu nghiên cứu là các lá chè, búp chè bị bệnh thu thập từ các địa điểm khác nhau của Thái Nguyên, được bảo quản trong tủ lạnh không quá 24 giờ. 2.1.1.2. Mẫu đất Các mẫu đất được lấy ở các độ sâu 5 - 10 cm tại các địa điểm khác nhau của tỉnh Thái Nguyên. 2.1.1.3. Vi sinh vật kiểm định Ngoài các chủng nấm phân lập được từ các lá chè bị bệnh, 3 chủng nấm gây bệnh thực vật được sử dụng làm VSV kiểm định là: - Rhizoctonia solani VCM 3047 - Fusarium oxysporum VCM 3028 - Fusarium moniliforme VCM 3027 Các chủng nấm này nhận được từ phòng Di truyền VSV - Viện Công nghệ Sinh học thuộc Viện khoa học và công nghệ Việt Nam. 2.1.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.1.2.1. Hóa chất - Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, fructose, mantose... của hãng Merck (Đức), Trung Quốc sản xuất - Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4. 7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4. 7H2O, (NH4)2SO4, CaCO3, MnCl2, Na2CO3, ZnCl2, ZnSO4.... nhập từ Trung Quốc, Anh sản xuất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -25- - Các loại cao: Cao thịt, cao nấm men, cao malt, peptone... của hãng Merck (Đức). - Các loại hóa chất khác: thạch, tinh bột tan, casein, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose)... của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất. - Các dung môi: etanol, iso-propanol, metanol, aceton.. của Trung Quốc. 2.1.2.2. Dụng cụ và thiết bị - KHVQH Olympus (Nhật) - Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) - KHVĐT Joel (Nhật) - Cân phân tích, cân kỹ thuật - Máy lắc (Hàn Quốc) - Nồi khử trùng (Đài Loan) - Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini - Máy ly tâm Hettich (Đức) - Máy cất nước Hamilton. - Các dụng cụ thủy tinh của Trung Quốc, Đức, Việt Nam... 2.1.2.3. Các công thức môi trường Môi trường phân lập và giữ giống nấm *Môi trường CZ (Czapek - Dox - Agar) (g/l) NaNO3 - 2; KH2PO4 - 1; MgSO4. 7H2O - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Thạch - 20; H2O - 1lít. *Môi trường khoai tây (PDA - Potato Dextrose Agar) (g/l) Khoai tây miếng - 200; Thạch - 18; đường - 20, H2O 1lít; pH 7 - 1,4. Môi trường phân lập, giữ giống và nghiên cứu xạ khuẩn * Môi trường Gause - I (g/l) Tinh bột tan - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4. 7H2O - 0,5; NaCl - 0,5; (NH4)2SO4 - 2; KNO3 - 0,5; FeSO4 - 0,01; Thạch - 18 g; H2O - 1lit; pH 7 - 7,4. * Môi trường Gause - II (g/l) Nước chiết thịt - 30ml; pepton - 5; NaCl - 5; glucoza - 10; Thạch - 18g; H2O - 1lít; pH 7 - 7,4. * Môi trường ISP - 1 (g/l) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -26- Trypton - 5, cao nấm men - 3; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2. * Môi trường ISP -2 (g/l) Cao nấm men - 3; Cao malt - 10; Dextrose - 4; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH 7 - 7,2. * Môi trường ISP - 3 (g/l) Bột kiều mạch - 20; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH - 7,2. * Môi trường ISP - 4 (g/l) Tinh bột tan - 10; K2HPO4 - 1,0; MgSO4. 7H2O - 1,0; NaCl - 1,0; (NH4)2SO4 - 2; CaCO3 - 2; dung dịch khoáng - 1ml; thạch - 18g; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2. * Môi trường ISP - 5 (g/l) Asparagin - 1; Glixerin - 10; K2HPO4 - 1; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH 7,0 - 7,4. * Môi trường ISP - 6 (g/l) Peptone - 10; cao nấm men - 1; xitrat sắt - 0,5; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,2. * Môi trường ISP - 7 (g/l) Glycerol - 15; L - tyrosine - 0,5; L - asparagine - 1; FeSO4.7H2O - 0,01; K2HPO4 - 0,5; MgSO4. 7H2O - 0,5; Nacl - 0,5; Muối A - 1ml; Thạch - 20; Nước cất - 1lit; pH 7,2 - 7,4. * Môi trường ISP - 9 (g/l) (NH4)2SO4 - 2,64; KH2PO4 - 2,38; K2HPO4 - 5,65; MgSO4 - 1; dung dịch muối B - 1ml; nguồn cacbon - 10; thạch - 20; H2O - 1lít; pH 6,8 - 7. - Dung dịch muối A (%): FeSO4 - 0,1; ZnSO4 - 0,15; MnCl2 - 0,1; Nước cất - 100ml. - Dung dịch muối B (%): CuSO4 - 0,64; FeSO4 - 0,11; MgCl2 - 0,79; nước cất - 100ml. * Môi trường 79 (g/l) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -27- Glucoza -10; peptone -10; cazein thủy phân - 2; cao nấm men - 2; NaCl - 6, K2HPO4 - 0,2; thạch - 18; H2O - 1lít; pH 7 - 7,4. * Môi trường A4 - H (g/l) Glucoza - 15; bột đậu tương - 15; NaCl - 5; CaCO3 - 1; H2O - 1lít; pH 7. * Môi trường A - 4 (g/l) Glucoza - 10; bột đậu tương - 10; NaCl - 5; CaCO3 - 1; H2O - 1lít; pH 7. * Môi trường Tinh bột (g/l) Tinh bột - 20; K2HPO4 - 0,5; MgSO4 - 0,5; KNO3 - 1; NaCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Agar - 30,0; Nước - 1 lít; pH 7,2 - 7,4. * Môi trường Czapek Glycerin (g/l) Glycerin - 30,0; NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1.0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Agar - 20,0; Nước - 1 lít. * Môi trường Czapek Gluco (g/l) Gluco - 30,0; NaNO3 - 2,0; K2HPO4 - 1.0; MgSO4 - 0,5; KCl - 0,5; FeSO4 - 0,01; Agar - 20,0; Nước - 1 lít. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp phân lập nấm gây bệnh từ các mẫu chè Chọn các mẫu chè có triệu chứng điển hình, mới. Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vòi nước,cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp. Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên bằng cồn (etanol 70%) trong vòng 3 phút. Rửa lại bằng nước cất vô trùng, thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng. Dùng dao mổ vô trùng cắt các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1 - 3mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khỏe). Dùng panh vô trùng đặt các mảnh mô nhỏ trên vào môi trường Czapek trên đĩa petri. Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: ngày, cây, bệnh.. Để đĩa môi trường đã đặt mẫu trong tủ ấm 30 0 C. Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh. Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp: PDA hoặc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -28- CZ. Thu nhận giống thuần khiết trong ống thạch nghiêng và bảo quản trong tủ lạnh ở 4 0 C [14]. 2.2.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 2.2.2.1. Phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski Cân 1g đất cho vào bình nón 50 ml chứa 9ml nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút. Dùng pipet vô trùng hút 0,5 ml d ịch đất sang ống nghiệm có chứa 4,5 ml nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10 -2 , 10 -3 ...10 -6 . Từ mỗi nồng độ pha loãng ở các nồng độ 10 -3 đến 10 -6 , nhỏ 0,1ml sang đĩa Petri chứa môi trường Gause - I. Dùng que gạt vô trùng chang đều, sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng từ 4 - 7 ngày. Trên mỗi mẫu đất, khuẩn lạc của xạ khuẩn được cấy 3 pha sang đĩa Petri chứa môi trường Gause - I để làm sạch. Sau đó nuôi ở nhiệt độ phòng 4 - 7 ngày, từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng Gause - I, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10 - 14 ngày [12]. Theo ISP màu sắc khuẩn ty khí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh, Blue (B) nhóm xanh da trời, Violet (V) nhóm tím, và nhóm màu không xác định (X) [16],[19], [42]. 2.2.2.2. Xác định hoạt tính kháng sinh Phương pháp thỏi thạch (dùng để sơ tuyển Xạ khuẩn) Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 4 hoặc Gause - I trong đĩa petri sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định. Sau đó để vào tủ lạnh 4 - 5h cho CKS khuếch tán vào môi trường thạch sau đó để vào tủ ấm. VSV kiểm định nuôi ở 28 - 30 0 C, đọc kết quả sau vài ngày [7]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -29- HTKS được xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D - d, mm), D là kích thước vòng vô khuẩn và d là đường kính thỏi thạch. Phương pháp đục lỗ (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể) Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định trong đĩa petri. Nhỏ vào các lỗ khoan dung d ịch cần thử (các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch). Phương pháp khoanh giấy lọc (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dung môi) Khoanh giấy lọc F8 có đường kính 6mm được tẩm một lượng dịch CKS (1ml/10 khoanh giấy lọc). Sau đó sấy khô ở 40 0 C, đặt khoanh giấy lọc đã tẩm CKS vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định (các bước tiếp theo giống phương pháp thỏi thạch). 2.2.2.3. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh chất kháng sinh Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hóa được cấy truyền sang các bình nón dung tích 250 ml chứa 100 ml môi trường Gause - I và nuôi lắc 220 vòng/ phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng. Giống phát triển được cấy truyền với tỷ lệ 10% sang bình nón dung tích 250 ml chứa 80 ml môi trường Gause - I dịch thể. Quá trình lên men kéo dài 96 giờ ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 220 vòng /phút. Sau đó thử HTKS trong dịch lọc [7]. 2.2.3. Bảo quản giống Các chủng xạ khuẩn đã lựa chọn được cấy trên môi trường thạch nghiêng Gause - I ở nhiệt độ phòng. Sau 10 - 14 ngày khi xạ khuẩn mọc tốt, các ống giống được bảo quản trong tủ lạnh ở 4 - 6 0 C. Sau 2 - 3 tháng cấy truyền lại một lần. Để bảo quản lâu giống được giữ trong ống cát, trong parafin lỏng vô trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được 6 tháng đến 2 năm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -30- 2.2.4. Nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại xạ khuẩn 2.2.4.1. Đặc điểm hình thái Quan sát màu sắc của hệ sợi khí sinh Dựa theo tài liệu của ISP, Gause và cộng sự (1983), xác định màu sắc của HSKS dựa vào bảng màu của Tresner và Bakus. Căn cứ vào màu sắc HSKS của các chủng mới phân lập để phân thành các nhóm màu theo Gause và cộng sự: White (W) nhóm trắng, Gray (Gy) nhóm xám, Red (R) nhóm đỏ, Yellow (Y) nhóm vàng, Green (Gn) nhóm xanh... Quan sát màu sắc của hệ sợi cơ chất Màu sắc của HSCC được xác định qua quan sát trực tiếp trên môi trường thạch đĩa hoặc thạch nghiêng và mô tả theo thang màu chuẩn của Bondarsev (1953), Tresner và cộng sự (1961). Quan sát cuống sinh bào tử Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause - I có găm lamen nghiêng 45 0 trên bề mặt môi trường. Sau 7 - 9 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy ra quan sát hình dạng chuỗi sinh bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học. Chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay hơi lượn sóng ký hiệu là RF (Rectiflexibiles), hình móc câu hay hình xoắn không hoàn toàn ký hiệu là RA (Retinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spirales) [33], [35], [41]. Quan sát bề mặt bào tử Dùng màng cacbon đặt trực tiếp lên bề mặt khuẩn ty khí sinh có bào tử, sau đó quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét. Bào tử có các hình dạng: tròn, ovan, elíp, hình que [33]. Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: Nhẵn ký hiệu là Sm (Smooth), dạng mụn cóc ký hiệu là Wa (Warty), dạng gai ký hiệu là Sp (Spiny) và dạng tóc ký hiệu là Ha (Hairy). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -31- 2.2.4.2. Đặc điểm nuôi cấy Màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường: Gause - I, Gause - II, ISP - 1, ISP - 2, ISP - 3, ISP - 4, ISP - 5, ISP - 6, ISP - 7 ở nhiệt độ phòng. Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường [33], [37]. Sự hình thành sắc tố melanin Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 6 ở nhiệt độ phòng. Bắt đầu quan sát màu của môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14. Nếu sinh melanin, màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến màu đen [33]. 2.2.4.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa Khả năng sinh enzym ngoại bào - Chiết dịch enzym Thu enzym từ môi trường lỏng: xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi trường Gause II dịch thể sẽ được lọc bỏ sinh khối hoặc ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 15 phút, chiết dịch trong thì thu được enzym thô. - Xác định hoạt tính các enzym ngoại bào bằng phương pháp khuếch tán trên thạch với một trong các nguồn cơ chất sau: - Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylaza) - Cazein (xác định hoạt tính proteaza) - CMC (xác định hoạt tính endoglucanaza). Chuẩn bị môi trường cơ chất - thạch gồm: 20g thạch + 2 - 10g cơ chất, pha môi trường trong 1000 ml nước. Thanh trùng ở 1 atm trong 30 phút. Đổ môi trường vào các đĩa Petri sao cho bề dày lớp thạch khoảng 3 mm. Dùng khoan nút chai đục lỗ (d = 10 mm) trên lớp thạch cách nhau 40 mm. Nhỏ 0,2 ml dung dịch enzym cần thử và 0,2 ml nước làm đối chứng, để ở tủ lạnh 4 0 C khoảng 4 giờ, sau đó đặt vào tủ ấm 30 0 C trong 24 giờ [23]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -32- Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D - d (mm). Sau khi nhuộm màu đỏ Công gô (cơ chất CMC), axit tricloaxetic (cơ chất casein) và thuốc thử Lugol (cơ chất tinh bột). Vùng cơ chất bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch. Khả năng chịu muối Cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch nghiêng ISP - 1 có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ 0,5; 3; 7; 9; 11; 12 (%). Sau 7 - 10 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng. Khả năng sử dụng các nguồn cacbon Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP - 9 có bổ sung 1% các nguồn đường: Glucoza, maltoza, fructoza, lactoza, sacaroza.... Cách làm: Cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung vào 100ml môi trường ISP - 9 còn nóng. Lắc cho tan đường rồi đổ vào đĩa Petri và nuôi cấy xạ khuẩn ở nhiệt độ 28 -30 0 C, sau 14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đối chứng [33]. Trong đó môi trường có glucoza được coi là đối chứng dương (+) và môi trường không có đường được coi là đối chứng âm (-). - Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh bằng hoặc kém hơn đối chứng dương một ít: có khả năng sử dụng loại đường đó. ký hiệu là (+). - Nếu xạ khuẩn sinh trưởng mạnh hơn đối chứng dương, ký hiệu là (++). - Nếu xạ khuẩn sinh trưởng bằng đối chứng âm hoặc không mọc: không có khả năng sử dụng loại đường đó, ký hiệu là (-). - Nếu xạ khuẩn sinh trưởng tốt hơn đối chứng âm một ít nhưng kém hơn đối chứng dương nhiều, ký hiệu là (±). 2.2.5. Lên men tạo kháng sinh 2.2.5.1. Lựa chọn môi trường lên men thích hợp Xạ khuẩn được lên men trên các môi trường cơ bản (theo Porter) là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -33- A - 4, A - 4H, A - 9, ISP - 4, Gause - I và Gause - II. Sau 96 giờ nuôi cấy trên máy lắc 220 vòng/ phút ở nhiệt độ phòng. Xác định HTKS trong dịch lên men (phương pháp đục lỗ) và sinh khối (phương pháp khoanh giấy lọc) để chọn ra môi trường cơ bản phù hợp cho những nghiên cứu tiếp theo [34]. 2.2.5.2. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Bổ sung nguồn cacbon (%): Tinh bột tan 1 và 2; glucoza - 1,5; lactoza - 1,5; sacaroza - 1,5; rỉ đường - 1,5; vào hỗn hợp dung dịch muối (dung d ịch muối A) đã bổ sung 0,2 % (NH4)2SO4. Bổ sung giống và lên men trên máy lắc tròn với tốc độ 220 vòng/ phút. Sau 96 giờ lên men xác định HTKS trong dịch lên men bằng phương pháp đục lỗ thạch. 2.2.5.3. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ Bổ sung nguồn Nitơ (%): Cao nấm men, bột đậu tương, (NH4)2SO4 và KNO3 vào hỗn hợp dung dịch muối đã bổ sung thêm 1,5% glucoza. Sau đó bổ sung giống rồi lên men và thử HTKS bằng phương pháp đục lỗ. 2.2.6. Các phƣơng pháp sinh học phân tử trong phân lập gen 16S - rRNA 2.2.6.1. Tách chiết DNA của xạ khuẩn bằng đệm CTAB Nguyên tắc: Phá vỡ thành tế bào của xạ khuẩn nhờ lyzozym. Loại bỏ protein khỏi DNA nhờ các enzym protease K. Phân tách các thành phần của tế bào sau khi phá vỡ thành hai pha nhờ dung dịch đệm chlorofom: isoamyl alcohol (24:1): pha trên chứa cặn tế bào, pha dưới chứa axit nucleic. Sau cùng, DNA được tủa bằng ethanol tuyệt đối (đã được làm lạnh - 22), được làm khô và hòa tan trong đệm TE [39]. Tiến hành: Lấy 1,5ml dịch nuôi cấy tế bào đem ly tâm tốc độ 3000 vòng/ phút trong 30 phút để thu cặn tế bào. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -34- Hòa tan cặn tế bào trong 0,8 ml TE 25S, lắc đều bằng vontex. Bổ sung 40 µl lysozym, ủ ở 37 0 C trong 90 phút (nồng độ cuối cùng của lysozym là 2mg/ ml). Bổ sung 10 µl protease K, mix đều, thêm 60 µl 10% SDS, đảo nhẹ, ủ 1giờ ở nhiệt độ 55 0 C (nồng độ cuối cùng của protease K là 0,18mg/ml, SDS là 0,5%). Bổ sung 150 µl NaCl 5M, mix đều. Sau đó bổ sung 130 µl CTAB, mix đều, ủ 10 phút ở 55 0 C. Đặt ở nhiệt độ phòng 5 phút, chia đều ra 2 ống eppendorf mới. Sau đó bổ sung vào mỗi ống 700 µl chlorofom/ isoamyl alcohol, mix đều 15 phút. Ly tâm 9000 vòng/phút trong 20 phút để tách pha. Chuyển dịch pha trên sang các eppendorf mới và bổ sung 0,6V isopropanol, đảo nhẹ. Đặt trong tủ - 20 0 C trong 30 - 40 phút. Ly tâm 9000 vòng/phút, rửa tủa bằng etanol 70%. Hòa tan DNA trong 100 µl TE. 2.2.6.2. Khuếch đại gen rRNA - 16S bằng phản ứng PCR Nguyên tắc: PCR là phản ứng trùng hợp, cho phép khuếch đại một đoạn DNA cụ thể lên hàng triệu lần nhờ sự xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt. Enzym này có khả năng hoạt động ở nhiệt độ cao. Sự hoạt động của enzym được kiểm soát của một chu kỳ nhiệt xác định. Đoạn DNA được tổng hợp được giới hạn về mặt kích thước bởi một cặp mồi đặc hiệu. Cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu có trình tự là: Trình tự mồi: Mồi xuôi 27 5 ' - agagtttgatcctggctcag - 3 ' 27- 47 Mồi ngược 1525 5 ' - aaaggaggtgatccagcc - 3 ' 1525 -1507 Tiến hành: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -35- Thành phần phản ứng Chu kỳ nhiệt H2O 17,1µl Buffer (10X) 2,5µl dNTP (2,5mM) 2µl Primer 1 (10pml) 1µl Primer 2 (10pml) 1µl ADN khuôn 1µl Enzyme Taq 0,4µl 94 0 C 3 phút 94 0 C 1 phút 64 0 C 1 phút 72 0 C 1 phút 30 giây 4 0 C ∞ Tổng 25µl 2.2.5.3. Phương pháp điện di trên gel agarose Phương pháp điện di trên gel agrose được sử dụng để kiểm tra DNA plasmid, kiểm tra các phân đoạn DNA được nhân bằng kỹ thuật PCR và kiểm tra kết quả cắt giới hạn. Phương pháp này được chia làm một số bước như sau: - Chuẩn bị gel agarose: cân một lượng agarose tương ứng (tùy theo nồng độ gel yêu cầu) vào trong dung dịch 100ml TAE 1X. Đun sôi bằng lò vi sóng, để nguội xuống khoảng 50 0 C rồi đổ dung dịch vào bản gel đã cài sẵn lược. Sau khoảng 30 phút, đặt bản gel vào bể điện di và đổ dung dịch điện di TAE ngập bản gel. - Tra mẫu: lấy 1 - 2 g DNA pha loãng trong 16 l đệm TE, sau đó bổ sung 4 l dye mầu. Một lượng DNA maker tương ứng cũng được tra vào bản gel trước khi điện di. - Điện di: Điện di tại hiệu điện thế không đổi 100V trong khoảng 20 - 30 phút. Quan sát sự di động của DNA từ cực âm sang cực dương thông qua dye mầu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -36- - Nhuộm bản gel: Bản gel sau điện di được ngâm vào dung dịch thuốc nhuộm EtBr nồng độ 2 g/ml trong khoảng 10 phút, lắc nhẹ trên máy lắc, sau đó soi gel trên đèn UV và chụp ảnh bằng máy chụp gel của hãng Bio - Rad. 2.2.7. Phương pháp xử lý số liệu Kết quả nghiên cứu được chúng tôi xử lý theo phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excel. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -37- Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và thuần khiết các chủng nấm gây bệnh trên chè Từ các mẫu chè bị bệnh thu thập ở các khu vực khác nhau của tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 3 chủng nấm được ký hiệu là CT - 1A, CT - 2E và CT - 5X. Các chủng nấm phân lập được đều có đặc điểm chung là: các sợi nấm đều không có màu sắc, sợi nấm có vách ngăn (hình 3.1). Mỗi chủng nấm được phân lập từ một mẫu chè có biểu hiện bệnh khác nhau. Kết quả được trình bày trên bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm một số mẫu chè làm nguồn phân lập các chủng nấm Ký hiệu chủng nấm Nguồn phân lập Biểu hiện bệnh CT - 1A Lá chè non Trên bề mặt lá và mép lá có nhiều đốm nâu CT - 2E Lá chè non Vết bệnh có màu nâu sẫm, lúc đầu chỉ có chấm nhỏ màu đen, sau đó lan ra khắp lá. CT - 5X Lá chè non Các lá bị xoăn, trên mặt lá có thể bị nhăn. Sau khi được tinh sạch, 3 chủng nấm trên được giữ trong ống thạch nghiêng trên môi trường Czapek và được sử dụng làm VSV kiểm định để tuyển chọn xạ khuẩn sau này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -38- Chủng CT - 1A Chủng CT - 2E Chủng CT - 5X Hình 3.1. Ba chủng nấm phân lập từ các mẫu chè bị bệnh 3.2. Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn 3.2.1. Hoạt tính kháng nấm của các chủng xạ khuẩn Từ các mẫu đất lấy ở độ sâu 5 - 10 cm tại các địa điểm khác nhau thuộc tỉnh Thái Nguyên, chúng tôi đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces. Sau khi thử HTKS theo phương pháp khuếch tán trên thạch với 3 chủng nấm CT - 1A, CT - 2E, CT - 5X, chúng tôi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng trong tổng số 80 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. So sánh với tỷ lệ chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công bố trước đây cùa Lê Gia Hy và cộng sự [18], tỷ lệ chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè của chúng tôi có phần cao hơn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -39- Bảng 3.2. Xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu Nhóm màu xạ khuẩn Các chủng có HTKN Tỷ lệ chủng có HTKN so với tổng số (%) Số lượng Tỷ lệ(%) Trắng (Allbus) 11 36,7 13,7 Xám (Griseus) 8 26,7 10,0 Xanh (Azeureus) 7 23,3 8,6 Hồng (Roseus) 2 6,7 2,6 Nâu (Chromogenes) 1 3,3 1,3 Lục (Viridis) 1 3,3 1,3 Tổng cộng 30 100 37,5 Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm phân chia theo nhóm màu của Shirling và Gottlieb [37]. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.2 và hình 3.2. Hình 3. 2. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm theo nhóm màu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -40- Kết quả trên bảng 3.2 cho thấy: số lượng chủng có hoạt tính nhiều nhất là nhóm trắng chiếm 36,7%, sau đó là nhóm xám - 26,7%, nhóm xanh - 25,3%, nhóm hồng - 6,7% và ít nhất là các nhóm nâu và lục đều chiếm 3,3%. Kết quả này của chúng tôi cũng phù hợp với những nghiên cứu của một số tác giả trước đây [14],[18]. Đồng thời chúng tôi cũng nhận thấy khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè có sự khác nhau (bảng 3.3). Bảng 3. 3. Tính đối kháng của xạ khuẩn với 3 chủng nấm gây bệnh trên chè Chủng XK có HTKN 3 chủng nấm gây bệnh chè CT - 1A CT - 2E CT - 5X Kháng cả 3 chủng Số lượng 9 16 13 4 Tỷ lệ (%) 30 53 43 13,3 Trong tổng số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, số chủng kháng nấm CT - 2E là cao nhất, có 16 chủng (chiếm 53% ), tiếp theo là số chủng kháng nấm CT - 5X, có 13 chủng (chiếm 43%) và ít nhất là chủng kháng nấm CT - 1A có 9 chủng (chiếm 30%). Hình 3.3. Tỷ lệ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng nấm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -41- Đáng chú ý trong số đó, có 4 chủng có khả năng kháng được cả 3 chủng nấm, chiếm tỷ lệ 13,3%, các chủng còn lại phần lớn chỉ kháng được 1 đến 2 chủng nấm. Tỷ lệ các chủng kháng nấm được thể hiện trên hình 3.3. 3.2.2. Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có HTKN cao Sau khi đã tuyển chọn sơ bộ được 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng có hoạt tính kháng nấm mạnh nhất được ký hiệu là: Đ1 và R2. Ở bước này, các chủng được nuôi lắc trong môi trường dịch thể ISP - 4 để thu dịch nuôi cấy. Kết quả kiểm tra hoạt tính của dịch nuôi cấy theo phương pháp đục lỗ với các chủng nấm như trên được thể hiện trên bảng 3.4 và hình 3.4. Bảng 3. 4. Hoạt tính kháng nấm của 3 chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn Hoạt tính kháng nấm (D- d, mm) CT - 1A CT - 2E CT - 5X Đ1 12 14 15 R2 12 16 17 Kết quả trên bảng 3.4 cho thấy: mặc dù cả 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn đều vẫn giữ được hoạt tính kháng nấm, song mức độ kháng đối với các chủng nấm có sự khác nhau. Khả năng kháng nấm CT - 1A của cả 2 chủng xạ khuẩn đều yếu nhất và khả năng kháng chủng CT - 5X của 2 chủng xạ khuẩn là cao nhất. Chúng tôi tiếp tục tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và phân loại của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2. Hai chủng xạ khuẩn này thuộc hai nhóm màu khác nhau. Chủng Đ1 thuộc nhóm màu trắng và chủng R2 thuộc nhóm màu nâu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -42- VSV kiểm định: CT - 5X VSV kiểm định: CT - 2E Hình 3.4. Hoạt tính kháng nấm của 2 chủng xạ khuẩn lựa chọn 3.3. Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại của 2 chủng XK Đ1 và R2 3.3.1. Đặc điểm hình thái Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có dạng gai. Chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì. Hình 3. 5. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng R2 R2 D1 ĐC ĐC R2 D1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -43- Hình 3.6. Cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử chủng Đ1 3.3.2.Đặc điểm nuôi cấy Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường khác nhau để quan sát khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn và màu sắc của hệ khuẩn ty. Kết quả cho thấy xạ khuẩn rất đa dạng về màu sắc khi nuôi cấy trên các môi trường khác nhau. Tùy theo thành phần của môi trường nuôi cấy mà màu sắc khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh hay sắc tố hòa tan tiết ra khác nhau. Các đặc điểm nuôi cấy của 2 chủng R2 và Đ1 được trình bày trên bảng 3.5 cho thấy: Đối với chủng Đ1: khi nuôi cấy trên các môi trường ISP - 1, ISP - 2, ISP - 3, ISP - 5, ISP - 7 màu sắc của KTKS và KTCC đều có màu trắng. Trên môi trường ISP - 4 màu sắc HSCC có màu xám và HSKS có màu trắng. Ở môi trường ISP - 6 màu sắc của HSKS có màu vàng và HSCC có màu trắng. Đối với chủng R2: màu sắc của HSCC và HSKS có đa dạng hơn khi nuôi cấy trên các môi trường ISP khác nhau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -44- Bảng 3. 5: Đặc điểm nuôi cấy của chủng R2 và Đ1 Môi trƣờng Chủng Đ1 Chủng R2 HSCC HSKS Sắc tố HSCC HSKS Sắc tố ISP - 1 Trắng Trắng Không màu Nâu Trắng Không màu ISP - 2 Trắng Trắng Không màu Nâu Xám ghi Không màu ISP - 3 Trắng Trắng Không màu Trắng ngà Xám ghi Không màu ISP - 4 Xám Trắng Không màu Trắng Xám Không màu ISP - 5 Trắng Trắng Không màu Trắng ghi nâu Trắng ghi xanh Không màu ISP - 6 Trắng Vàng Không màu Nâu Xám ghi (yếu) Melanin ISP - 7 Trắng Trắng Không màu Nâu Xám ghi Nâu * Khả năng hình thành sắc tố melanin Chủng R2 và Đ1 được nuôi cấy trên môi trường ISP - 6 ở nhiệt độ 30 0 C. Sau 14 ngày quan sát chúng tôi nhận thấy: Hình 3.7. Khả năng hình thành sắc tố melanin của 2 chủng Chủng R2 Chủng Đ1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -45- Đối với chủng Đ1 màu sắc của môi trường không có sự biến đổi, tức là không có khả năng hình thành sắc tố melanin. Đối với chủng R2 màu sắc của môi trường biến đổi từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm, điều đó có nghĩa là chủng R2 có khả năng hình thành sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt. 3.3.3. Đặc điểm sinh lý - sinh hóa * Khả năng đồng hóa các nguồn cacbon Để đánh giá khả năng đồng hóa các nguồn cacbon khác nhau, chúng tôi tiến hành nuôi 2 chủng R2 và Đ1 trên môi trường ISP - 9 có bổ sung các nguồn cacbon khác nhau với nồng độ 1%. Sau 7 - 14 ngày nuôi cấy, kết quả được thể hiện trên bảng 3. 6. Bảng 3.6. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 Nguồn cacbon Mức độ sinh trƣởng Chủng Đ1 Chủng R2 Glucose ++++ ++++ Saccharose ++++ ++ Fructose ++++ ++ Lactose - ++++ Manitol ++++ ++++ Dextrin ++ ++++ Cellulose + + Arabinose - +++ Ghi chú: ++++: Sinh trưởng rất tốt; +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng yếu; +: Sinh trưởng rất yếu; - :Không sinh trưởng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -46- Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy: Cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều có khả năng đồng hóa tốt các nguồn cacbon khác nhau. Song chủng R2 đồng hóa tốt nhất nguồn cacbon là: Glucose, Lactose, Manitol, Dextrin và sinh trưởng yếu nhất trong môi trường có chứa nguồn cacbon Cellulose. Đối với chủng Đ1 có khả năng đồng hóa tốt nguồn cacbon Glucose, Saccharose, Fructose, Manitol và không có khả năng đồng hóa 2 nguồn cacbon là Lactose, Arabinose. * Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp Chủng R2 và Đ1 được nuôi ở các thang nhiệt độ khác nhau. Khả năng sinh trưởng của 2 chủng được thể hiện trên bảng 3.7. Bảng 3. 7: Nhiệt độ sinh trƣởng thích hợp của 2 chủng XK Nhiệt độ Chủng 25 0 28 0 30 0 32 0 35 0 40 0 R2 + +++ +++ ++ + + Đ1 ++ +++ +++ + + - Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng. Kết quả trên bảng 3.6 cho thấy, hai chủng R2 và Đ1 có khả năng sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ từ 25 0 - 32 0 C, chủng R2 sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 28 0 - 30 0 C và sinh trưởng yếu ở nhiệt độ 35 0 - 40 0 C. Chủng Đ1 cũng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 28 0 - 30 0 C và không sinh trưởng ở nhiệt độ 40 0 C. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho cả 2 chủng phát triển tốt là 28 - 30 0 C. * Khả năng chịu muối Hai chủng R2 và Đ1 được nuôi cấy trong môi trường ISP - 1 có bổ sung NaCl ở các nồng độ 0,5; 3; 7; 9; 11; 12 và 0% đối chứng. Kết quả thu được ở bảng 3.8. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -47- Bảng 3.8: Khả năng chịu muối của 2 chủng R2 và Đ1 Nồng độ NaCl (%) Chủng 0,5 3 5 7 9 12 0 R2 +++ + ++ + + - - Đ1 +++ ++ + + + - - Ghi chú: +++: Sinh trưởng tốt; ++: Sinh trưởng bình thường; +: Sinh trưởng yếu; -: Không sinh trưởng. Nồng độ muối có ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn. Kết quả trình bày trên bảng 3.8 cho thấy: cả 2 chủng đều có khả năng sử dụng nồng độ muối tới 9% , ở nồng độ muối cao hơn thi cả 2 chủng đều không phát triển được. Như vậy ở nồng độ muối 0,5% chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 đều có tác dụng kích thích sự sinh trưởng. * Khả năng sinh enzym ngoại bào Tinh bột CMC Casein Hình 3.8. Hoạt tính enzym của các chủng xạ khuẩn R2 D1 D1 D1 R2 R2 ĐC ĐC ĐC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -48- Trong quá trình sống, để phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp thành các hợp chất đơn giản có thể hấp thu được. Xạ khuẩn có khả năng tiết vào môi trường các enzym ngoại bào. Chúng tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng này của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu, kết quả được thể hiện trên hình 3.8 cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn đều có khả năng thủy phân mạnh casein, tinh bột và CMC. 3.3.4. Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 Hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn cũng là một trong các chỉ tiêu phân loại. Cùng với việc nghiên cứu khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè. Chúng tôi cũng kiểm tra khả năng kháng một số chủng nấm kiểm định gây bệnh thực vật như đã nêu trong mục 2.1.1.3. Kết quả được thể hiện trên bảng 3.9 và hình 3.9. Bảng 3.9: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng R2 và Đ1 với 3 chủng nấm kiểm định Chủng xạ khuẩn Hoạt tính kháng sinh (D - d, mm) F. oxysporum F. moniliforme R. solani R2 22 15 17 Đ1 18 19 0 Kết quả trên bảng 3.9 cho thấy: chủng R2 có phổ ức chế các VSV kiểm định khá rộng, có khả năng kháng cả 3 loại nấm. Tuy nhiên chủng R2 có khả năng kháng nấm F. oxysporum là mạnh nhất với vòng ức chế là 22 mm, còn với nấm R. solani là 17 mm và nấm F. moniliforme là 15 mm (hình 3.9). Chủng Đ1 chỉ có hoạt tính chống nấm F. oxysporum và F. moniliforme mà không có khả năng kháng nấm R. solani. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -49- Khả năng đối kháng các chủng VSV cùng với các đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóa được dùng để tham khảo trong phân loại các chủng xạ khuẩn này. Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 không chỉ có khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè mà cũng có khả năng kháng cả các nấm gây bệnh thực vật như F. oxysporum, F. moniliforme, R. solani. VSV kiểm định: F. oxysporum VSV kiểm định: F. monilforme F. oxysporum F. moniliforme VSV kiểm định: R. solani R. solani. Hình 3.9. Hoạt tính kháng 3 chủng nấm kiểm định của 2 chủng Đ1 và R2 F.oxysporum m D1 D1 D1 R2 R2 R2 ĐC ĐC ĐC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -50- 3.3.5. Vị trí phân loại của hai chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 * Phân loại chủng R2 Bảng 3.10. So sánh đặc điểm phân loại của chủng R2 với S. misawaensis Đặc điểm phân loại Chủng R2 Loài chuẩn S. misawaensis Hình thái Hình dạng cuống sinh bào tử Xoắn (S) Xoắn (S) Bề mặt bào tử Có gai ngắn Có gai ngắn Môi trường ISP - 6 Khả năng sinh melanin Có Có Môi trường tinh bột Màu KTCC Vàng nâu Vàng hoặc vàng nâu Màu KTKS Xám Xám hoặc xám trắng Sắc tố tan Vàng nhạt Vàng đến vàng nâu Môi trường Czapek Glycerin KTCC Nâu ghi Nâu ghi KTKS Trắng hồng Trắng hồng Sắc tố tan Melanin Melanin Sinh kháng sinh Có Acwaimycin Đối chiếu với khóa phân loại xạ khuẩn của Gause, 1983 [49]. Chúng tôi nhận thấy chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài S. misawaensis. Kết quả so sánh các đặc điểm của chủng R2 với loài S. misawaensis được trình bày trên bảng 3. 10. Chủng R2 có cuống sinh bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử có gai ngắn. Khi nuôi cấy trên các môi trường tinh bột màu sắc KTCC từ màu trắng đến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -51- vàng nâu, còn màu sắc KTKS biến đổi thành màu xám hoặc xám trắng. Trên môi trường Czapek Glycerin màu sắc của KTKS từ màu trắng biến đổi thành màu trắng hồng, còn KTCC biến đổi thành màu nâu ghi. Chủng R2 có khả năng sinh sắc tố melanin trên môi trường có chứa sắt. Khi so sánh các đặc điểm phân loại của chủng R2 với loài chuẩn S. misawaensis trong khóa phân loại của Gauze, 1983. Chúng tôi nhận thấy chủng R2 có nhiều đặc điểm giống với loài này về hình thái, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử, đặc điểm nuôi cấy, khả năng hình thành sắc tố melanin và CKS. Như vậy, chủng R2 rất có thể thuộc loài S. misawaensis, nhóm Cinereus, seri: chromogenes. Chủng này được Hamada et Okami, mô tả vào năm 1968c [28]. * Phân loại chủng Đ1 Đặc điểm phân loại của chủng Đ1 được thể hiện trên bảng 3.11 cho thấy: chủng Đ1 có cuống sinh bào tử dạng thẳng, bề mặt bào tử xù xì. Khi nuôi cấy trên môi trường Gause - I, màu sắc của KTCC từ màu vàng nhạt biến đổi thành màu vàng nâu, màu sắc KTKS có màu trắng. Trên môi trường Gause - II, màu sắc của KTKS từ màu vàng biến đổi thành màu nâu, KTCC không có màu. Trên môi trường Czapek Glucoza, màu sắc của KTCC từ màu trắng biến đổi thành màu nâu vàng, màu của KTKS có màu trắng ánh kem. Chủng Đ1 không có khả năng hình thành sắc tố melanin. Đối chiếu với khóa phân loại của Gauze, 1983, chúng tôi nhận thấy chủng Đ1 có nhiều đặc điểm giống với loài Actinomyces brunneofungus về các đặc điểm hình thái, cuống sinh bào tử, khả năng hình thành sắc tố melanin và đặc điểm nuôi cấy, khả năng hình thành CKS chống nấm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -52- Như vậy, có thể chủng Đ1 thuộc loài A. brunneofungus, nhóm Albus, seri: albocolorabus. Chủng này được Krasilnikov et al, mô tả vào năm 1971[48]. Bảng 3.11. So sánh đặc điểm phân loại của chủng Đ1 với A.brunneofungus Đặc điểm phân loại Chủng Đ1 Loài chuẩn A.brunneofungus Hình thái Hình dạng cuống sinh bào tử Thẳng (RF) Thẳng và lượn sóng Bề mặt bào tử Xù xì Xù xì Môi trường ISP - 6 Khả năng sinh melanin Không Không Gauze - I Màu KTCC Vàng nâu Vàng nâu Màu KTKS Trắng Trắng Sắc tố tan Không Không có Gauze - II Màu KTCC Không màu Không màu Màu KTKS Nâu Nâu Sắc tố tan Không Không Czapek gluco Màu KTCC Nâu vàng Nâu hoặc nâu vàng Màu KTKS Trắng ánh kem Trắng ánh kem Sắc tố tan Yếu Yếu Sinh kháng sinh Có Flavofungina 3.4. Khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn đã lựa chọn 3.4.1. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp Trong công nghệ lên men, môi trường lên men đóng vai trò quan trọng. Một môi trường lên men tốt phải là môi trường vừa thuận lợi cho chủng sinh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -53- trưởng tốt vừa cho hiệu suất kháng sinh cao. Để lựa chọn môi trường lên men đáp ứng được cả hai điều kiện trên, chúng tôi sử dụng 5 loại môi trường lên men cơ sở là: A - 4H, A - 4, Gause - I, Gause - II và ISP - 4. Quá trình lên men được tiến hành trong bình nón dung tích 250 ml có chứa 25ml môi trường. Sau 120 giờ nuôi lắc ở nhiệt độ 28 0 C - 30 0 C, thu d ịch lên men, xác định HTKS bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.12 và hình 3. 12 Bảng 3.12: Hoạt tính kháng sinh của 2 chủng xạ khuẩn trên các môi trƣờng lên men khác nhau Chủng XK Môi trƣờng Sinh khối (mg/ml) HTKS (D-d,mm) R2 A - 4H 8,34 ± 0,12 22,33 ± 1,42 A - 4 4,6 ± 0,15 19,52 ± 0,48 Gauze - I 5,51 ± 0,23 17,65 ± 0,58 Gauze - II 7,52 ± 0,21 13,93 ± 0,13 ISP - 4 3,19 ± 0,15 12,18 ± 0,15 Đ1 A - 4H 9,24 ± 0,23 21,34 ± 0,21 A - 4 4,43 ± 0,18 18,72 ± 0,17 Gauze - I 6,48 ± 0,33 16,23 ± 0,44 Gauze - II 7,25 ± 0,22 9,14 ± 0,34 ISP - 4 2,78 ± 0,26 7,25 ± 0,14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -54- Hình 3.10: Ảnh hƣởng của môi trƣờng đến khả năng tổng hợp CKS Kết quả trên bảng 3.12 và hình 3.10 cho thấy: Trong 5 môi trường lên men cả 2 chủng nghiên cứu đều cho sinh khối lớn nhất trong môi trường A - 4H. Với chủng R2 là 8,0 mg/ml, chủng Đ1 là 9,0 mg/ml. Đồng thời dịch lên men của môi trường A - 4H cũng có hoạt tính kháng sinh mạnh nhất (21mm). Từ kết quả này đã chứng tỏ các thành phần trong môi trường lên men có ảnh hưởng nhiều đến khả năng hình thành CKS của xạ khuẩn như nhiều nghiên cứu trước đã khẳng định [14],[17]. Với mục đích là lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp CKS, căn cứ vào kết quả này chúng tôi nhận thấy môi trường A - 4H là thích hợp nhất và được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.4.2. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon Các hợp chất cacbon vừa là nguồn dinh dưỡng lại vừa là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể. VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng có khả năng sử dụng được nhiều nguồn cacbon khác nhau. Để nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh trưởng và hình thành CKS, đồng thời xác định được nguồn cacbon thích hợp nhất cho 2 chủng R2 và Đ1, chúng tôi tiến hành khảo sát một số nguồn cacbon thông thường được sử dụng để lên men CKS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -55- Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn cacbon lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 Các chỉ tiêu Ký hiệu chủng Nguồn cacbon Glucose Tinh bột Lactose Sacarose Sinh khối R2 17,44 ± 0,22 16,23 ± 0,42 13,58 ± 0,56 18,93 ± 0,57 Đ1 18,53 ± 0,45 15,75 ± 0,33 11,55 ± 0,15 17,26 ± 0,34 HTKS R2 15,24 ± 0,36 18,21 ± 0,32 20,23 ± 0,61 21,22 ± 0,78 Đ1 17,53 ± 0,16 16,82 ± 0,58 16,34 ± 0,74 18,29 ± 0,65 Kết quả trình bày trên bảng 3.13 cho thấy: cả 2 chủng xạ khuẩn R2 và Đ1 đều có khả năng sử dụng được cả 4 nguồn đường nghiên cứu. Tuy nhiên ảnh hưởng của các nguồn cacbon này lên sự sinh trưởng và khả năng tạo kháng sinh của các chủng có sự khác nhau. Đối với chủng R2 nguồn cacbon sacarose cho sinh khối lớn nhất và HTKS mạnh nhất. Chủng Đ1 nguồn cacbon Glucose cho sinh khối lớn nhưng sacarose có HTKS mạnh nhất. Hình 3.11: Ảnh hƣởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp CKS Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -56- 3.4.3. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ Nitơ là nguồn dinh dưỡng không thể thiếu đối với VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng. Trong môi trường lên men, nguồn nitơ có ảnh hưởng nhiều đến sự tổng hợp CKS của xạ khuẩn [3]. Nguồn nitơ được sử dụng trong môi trường lên men xạ khuẩn có thể ở dạng vô cơ hoặc hữu cơ. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của cả 2 nguồn nitơ này đến khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu. Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh tổng hợp CKS của 2 chủng R2 và Đ1 Nguồn nitơ Nồng độ (%) Sinh khối (mg/ml) Hoạt tính kháng sinh (D-d,mm) R2 Đ1 R2 Đ1 Bột đậu tương 1 12,6 ± 0,25 11,2 ± 0,32 21,63 ± 0,58 20,32 ±0,15 Cao nấm men 1 13,52 ± 0,23 13,28 ±0,17 19,78 ± 0,26 19,73 ±0,52 (NH4)2SO4 1 9,73 ± 0,18 8,01 ± 0,22 17,65 ± 0,44 16,82 ±0,38 KNO3 1 7,82 ± 0,52 8,56 ± 0,24 16,92 ±0,32 14,34±0,17 Nguồn nitơ hữu cơ được chúng tôi sử dụng là cao nấm men và bột đậu tương, nguồn nitơ vô cơ là nitrat kali (KNO3) và muối sunfat amon ((NH4)2SO4.). Các nguồn nitơ này được bổ sung vào môi trường A - 4H. Quá trình lên men được tiến hành trong bình nón 250 ml có chứa 25 ml môi trường. Sau 120 giờ nuôi lắc, thu dịch lên men và xác định HTKS. Kết quả được trình bày trên bảng 3.14 và hình 3.12. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -57- Từ kết quả trên cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu đều sinh trưởng tốt ở trong 2 môi trường có nguồn nitơ hữu cơ là bột đậu tương và cao nấm men. Song chưa rõ có sự khác nhau rõ rệt giữa 2 nguồn nitơ này. Hình 3.12 : Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp CKS Cũng như sự sinh trưởng, HTKS của 2 chủng nghiên cứu cũng cao hơn ở trong 2 môi trường có bột đậu tương và cao nấm men. Các kết quả này đã khẳng định ưu thế của nguồn nitơ hữu cơ lên khả năng sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp CKS của xạ khuẩn nói chung. Điều này có thể giải thích trong các nguồn nitơ hữu cơ, ngoài thành phần protein còn chứa các chất cần thiết cho quá trình tổng hợp CKS. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả đã công bố trước đây [14]. 3.5. Phân loại các chủng xạ khuẩn theo phƣơng pháp sinh học phân tử 3.5.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số của các chủng xạ khuẩn Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA từ 2 chủng xạ khuẩn là Đ1 và R2. Trước khi tiến hành tách chiết DNA, các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường tăng sinh để thu sinh khối tế bào. DNA được tách chiết theo phương pháp của Ausubel và cs có cải tiến [39] đã Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -58- được trình bày ở trên. Kết quả tách chiết được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 0,8% và được trình bày trong hình 3.13. Đ1 R2 Hình 3.13. Ảnh điện di DNA tổng số của 2 chủng xạ khuẩn Trên cơ sở kết quả thu được trong hình 3.13 cho thấy DNA đã được tách ra từ cả 2 chủng xạ khuẩn nêu trên. Tương ứng với mỗi chủng, sản phẩm điện di chỉ có một băng duy nhất đã chứng tỏ DNA không bị đứt gãy trong quá trình tách chiết. Hàm lượng DNA thu được là tương đối lớn và có độ sạch cao. Như vậy, có thể nói rằng DNA thu được trong quá trình tách chiết đã đạt được các yêu cầu đề ra. Sản phẩm DNA đáp ứng tốt cho các nghiên cứu khuếch đại gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR. 3.5.2. Kết quả nhân gen 16S - rRNA bằng phản ứng PCR Để tạo tiền đề cho việc định loại 2 chủng xạ khuẩn đã được phân lập nêu trên, trong nghiên cứu này chúng tôi đã tiến hành khuếch đại gen 16S - rRNA. Đây là một gen chỉ thị được dùng phổ biến trong định loại VSV. Cặp mồi được thiết kế để khuếch đại cho phản ứng PCR cho phép khuếch đại trình tự trọn vẹn của gen 16S - rRNA, đảm bảo tốt cho các nghiên cứu tách dòng và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -59- xác định trình tự đầy đủ của gen này. Kết quả khuếch đại gen được trình bày trong hình 3.14. Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu M. Maker ΦX174 cắt bằng Hind III 3,4. chủng Đ1. 5,6. Chủng R2 Dựa trên kết quả điện di hình 3.14 cho thấy cả 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2 đều có sự nhân lên của gen 16S - rRNA. Sản phẩm PCR có độ đặc hiệu cao, không có các sản phẩm phụ. Mặt khác, dựa trên DNA maker chuẩn cho thấy sản phẩm PCR có kích thước khoảng 1,5 kb tương ứng với kích thước theo tính toán lý thuyết trong quá trình lựa chọn mồi. Như vậy có thể kết luận là đoạn DNA được nhân lên chính là gen 16S - rRNA. Kết quả này là cơ sở quan trọng để chúng tôi có thể tiếp tục tách dòng và xác định trình tự đầy đủ của gen 16S ở 2 chủng nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -60- Chƣơng 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN 1. Từ các mẫu đất khác nhau, đã phân lập và thuần khiết được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt tính kháng nấm gây bệnh trên chè ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5%. Trong số các chủng có hoạt tính kháng nấm, nhóm trắng chiếm 36,7%, xám - 26,7%, xanh - 23,3%, hồng - 6,7%, nâu - 3,3%, lục - 3,3%. 2. Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn là Đ1 và R2 có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có hoạt tính kháng nấm, kháng được cả 2 chủng nấm gây bệnh trên chè là CT - 2E và CT - 5X, đồng thời cũng có khả năng kháng các nấm kiểm định. 3. Đã tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khuếch đại gen 16S - rRNA để nhận định: - Chủng R2 có thể là loài Streptomyces misawaensis. - Chủng Đ1 có thể là loài Actinomyces brunneofungus. 4. Đã xác định được một số điều kiện lên men thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của 2 chủng xạ khuẩn. - Môi trường A - 4H thích hợp cho lên men tạo chất kháng sinh cho cả 2 chủng xạ khuẩn Đ1 và R2. - Nguồn cacbon thích hợp nhất để tổng hợp CKS của chủng R2 là Sacarose và chủng Đ1 là glucose. - Bột đậu tương và cao nấm men đều là những nguồn nitơ hữu cơ thích hợp cho lên men CKS của cả 2 chủng xạ khuẩn này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -61- 4. 2. KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 1. Tiếp tục nghiên cứu để giải trình tự gene 16S của hai chủng xạ khuẩn Đ1 và R2. 2. Tiếp tục nghiên cứu khả năng tổng hợp CKS của hai chủng Đ1 và R2. 3. Tách chiết và xác định bản chất hóa học của các CKS. 4. Tìm hiểu khả năng ứng dụng của các CKS thô và cần được khảo nghiệm trên diện rộng để đánh giá hiệu quả sử dụng trong công tác bảo vệ thực vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -62- CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Bùi Thị Hà, Vi Thị Đoan Chính (2008), "Khả năng kháng nấm gây bệnh trên chè của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Thái Nguyên", Tạp chí khoa học và công nghệ, số 2 (46), tr. 92 - 96. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -63- TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (2006), Kỹ thuật trồng,chăm sóc và chế biến chè, NXB Nông nghiệp, tr. 72 - 77. 2. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia, Hà Nội, tr.53 - 71. 3. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 4. Chi cục bảo vệ thực vật Phú Thọ, Sử dụng an toàn, hiệu quả thuốc bảo vệ thực vật trên cây chè, 07/2003, tr. 24 - 30. 5. Nguyễn Hoàng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận văn thạc sĩ sinh học, Hà Nội. 6. Vi Thị Đoan Chính (2000), Nghiên cứu khả năng nâng cao hoạt tính kháng sinh của chủng Streptomyces rimosus R77 và Streptomyces hygroscopicus 5820 bằng kỹ thuật dung hợp tế bào trần, Luận án TS sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà Nội. 7. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học - Tập III. NXB khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 8. Nguyễn Lân Dũng, Đoàn Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Tập I, NXBKHKT Hà Nội, 328 - 345. 9. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1977), Vi sinh vật học - tập II, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -64- 10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2002), Vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, Hà Nội, tr. 39 - 41. 11. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Nữ Kim Thảo, Các nhóm vi khuẩn chủ yếu, Vietsciences, 15/02/2006 12. Nguyễn Thành Đạt (2000), Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục 13. Nguyễn Thành Đạt, K.A. Vinogradva V.A.Poltorac (1974), Tính biến dị bề mặt bào tử Xạ khuẩn sinh choromomycin, Act.A. buraviensis, microbiologia, TXL III, N5, NXB Academia cccp. 14. Bùi Thị Việt Hà (2006), "Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam", Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. 15. Đỗ Thu Hà (2004) Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. 16. Lê Gia Hy (1994), "Nghiên cứu Xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam", Luận án Tiến sĩ, Hà Nội. 17. Lê Gia Hy, Nguyễn Quỳnh Châu, Phạm Kim Duy, "Ảnh hưởng của canxi và coban lên khả năng sinh tổng hợp clotetraxyclin và vitamin B12 bằng phương pháp lên men bề mặt", Tạp chí sinh học, số 4, 1992. 18. Lê Gia Hy và cộng sự (1992), "Tính đối kháng của xạ khuẩn phân lập từ đất Việt Nam đối với bệnh đạo ôn", Tạp chí Sinh học, tập 14, số 4, 11 - 12. 19. Lê Mai Hương (1993), Nghiên cứu Xạ khuẩn sinh chất kháng sinh phân lập ở Hà Nội và vùng phụ cận, luận án tiến sĩ, Hà Nội. 20. Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên -65- 21. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, NXB Xây dựng, Hà Nội, tr.47-49. 22. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật học công nghiệp, Nhà xuất bản xây dựng, Hà Nội, tr.47 - 49. TIẾNG ANH 23. Berdy