Luận văn Nghiên cứu và nhân giống các dòng bạch đàn lai ue35 và ue56 giữa eucalyptus urophylla và e. exserta bằng phương pháp nuôi cấy mô

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ ----------------------- ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH THÁI NGUYÊN – NĂM 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------------ ----------------------- ĐẶNG NGỌC HÙNG NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ CHUYÊN NGÀNH: LÂM HỌC MÃ SỐ: 60.62.60 LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS. LÊ ĐÌNH KHẢ THS. ĐOÀN THỊ MAI THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời nói đầu Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục hình ảnh Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3 1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp ........................................... 3 1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp ......................... 3 1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ................................ 4 1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật ............................................................ 4 1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào................................................. 4 1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 6 1.4.1. Môi trường nuôi cấy ................................................................................... 6 1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng.................................................................... 8 1.4.3. Môi trường vật lý ........................................................................................ 10 1.4.4. Vật liệu nuôi cấy ......................................................................................... 11 1.4.5. Điều kiện vô trùng ...................................................................................... 11 1.4.6. Buồng nuôi cấy ........................................................................................... 12 1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống ........................................ 12 1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị ..................................................................................... 12 1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động ............................................................................. 13 1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh ................................................................................ 13 1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) ........................................................................ 14 1.5.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên ................................................................. 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.6. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn liễu (E. exserta) ........... 16 1.6.1. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla)......................................................... 16 1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) ............................................................ 17 1.6.3. Bạch đàn lai ................................................................................................ 17 1.6.4. Nhân giống Bạch đàn bằng nuôi cấy mô ................................................... 20 1.7. Một số kết quả nổi bật về nuôi cấy mô cây thân gỗ và Bạch đàn ............... 21 1.7.1. Trên thế giới................................................................................................ 21 1.7.2. Nhân giống cây gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam ............... 25 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................................................................................... 28 2.1. Mục tiêu nghiên cứu ..................................................................................... 28 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu ................................................................................... 28 2.2.1. Một số đặc điểm chính của dòng UE35 và dòng UE56 .............................. 28 2.2.2. Cây mẹ lấy vật liệu ...................................................................................... 28 2.2.3. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) ........................................................................ 29 2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 29 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................. 30 2.4.1. Chọn loại môi trường phù hợp ................................................................... 31 2.4.2. Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu..................... 31 2.4.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu .... 32 2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC) và chất lượng chồi (TLCHH) ............................................................................... 32 2.4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH ................................. 32 2.4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP+IAA đến HSNC và TLCHH ........................ 33 2.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ..................... 34 2.4.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................. 34 2.4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC và TLCHH ..... 35 2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ ............................................................................................. 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ .............................................................................. 36 2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm ........................................................................................................... 36 2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm ................................................................................. 37 2.4.5. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 38 2.4.6. Thu thập và xử lý số liệu ............................................................................. 38 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................ 41 3.1. Khử trùng mẫu cấy ....................................................................................... 41 3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu ...................... 43 3.3. Nghiên cứu loại môi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi ..................... 44 3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung vitamine B2 vào môi trƣờng MS* đến HSNC và TLCHH ........................................................................................................... 46 3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng trong môi trƣờng MS* đến HSNC và TLCHH ............................................................................................... 50 3.5.1. Ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH ............................................. 50 3.5.2. Ảnh hưởng phối hợp của BAP + IAA đến HSNC và TLCHH ................... 52 3.5.3. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trường MS* đến HSNC và TLCHH .......................................................................................... 55 3.5.4. Ảnh hưởng của sự phối hợp BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH ......... 58 3.5.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và TLCHH ................................................................................................................. 60 3.5.6. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ IBA trong môi trường 1/2 MS* tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ............................................. 63 3.5.7. Ảnh hưởng của tổ hợp IAA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài của rễ ................................................................................. 66 3.5.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở vườn ươm.................................................................................................... 68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Chƣơng 4: KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KIẾN NGHỊ ........................................ 72 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 72 4.2. Tồn tại ........................................................................................................... 72 4.3. Kiến nghị ....................................................................................................... 73 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 75 Tài liệu tiếng việt ................................................................................................ 75 Tài liệu tiếng Anh ................................................................................................ 77 Phụ Lục Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI NÓI ĐẦU Nâng cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là mục tiêu quan trọng trong việc đào tạo cao học của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp khoá học 2006-2009, được sự đồng ý của Khoa sau đại học - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp “Nghiên cứu nhân giống các dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophylla và E. exsertar bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào”. Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã nhận được sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo trực tiếp giảng dạy, cũng như lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Hà Nội, bộ môn công nghệ tế bào thuộc Viện khoa học sự sống - trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô giáo, đặc biệt là GS.TS. Lê Đình Khả, Th.s. Đoàn Thị Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và người thân đã giúp đỡ tôi có được bản luận văn này. Nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một vấn đề khó trong nghiên cứu ứng dụng sản xuất giống cây lâm nghiệp. Việc nghiên cứu nhân giống một số dòng Bạch đàn lai nói trên trong đề tài nhằm góp phần xây dựng cơ sở hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất cây với số lượng lớn, đồng đều, có chất lượng cao do vậy không thể tránh khỏi những khiếm khuyết, rất mong được sự chỉ bảo bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu này được hoàn thiện. Tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 4 năm 2009 Tác giả Đặng Ngọc Hùng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 3.1a Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE35 (180 mẫu) …... 41 3.1b Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE56 (180 mẫu) ….... 42 3.2 Bảng ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi…………….... 43 3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trường) …….…. 44 3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamine B2 đến HSNC và TLCHH của UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức) …………………………….. 47 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức) …………………….……... 51 3.6 Ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/ công thức) ……………………… 53 3.7 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức)…………………………………………………………………… 56 3.8 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH của 2 dòng UE35 và UE56 (180 chồi cấy/công thức) ……… 59 3.9 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/công thức) …………………………. 61 3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài của rễ (180 chồi cây/ công thức) ………………………………….. 64 3.11 Ảnh hưởng của IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều dài rễ của dòng UE35 và UE56 ………………………………… 66 3.12 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại vườn ươm sau 1 tháng (90 cây mạ /công thức)……………………….. 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ TT Tên biểu đồ Trang 3.1a: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC của dòng UE35 và UE.......... 48 3.1b: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến TLCHH của dòng UE35 và UE ....... 48 3.2a: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến HSNC của dòng UE35 và UE ................... 51 3.2b: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến TLCHH của dòng UE35 và UE................. 52 3.3a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54 3.3b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến TLCHH của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54 3.4a: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 56 3.4b: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến TLCHH của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 58 3.5a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 59 3.5b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến TLCHH của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 60 3.6a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................ 62 3.6b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến TLCHH của dòng UE35 và UE ............................................................................. 62 3.7a: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE ......... 65 3.7b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tới số rễ trung bình của dòng UE35 và UE .................................................................................................................... 65 3.8a: Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1tới tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE .......................................................................................................... 67 3.8b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA + ABT1 tới số rễ trung bình của dòng UE35 và UE ................................................................................................. 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TT Tên bảng Trang 3.1. Ảnh khử trùng mẫu cấy và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày ……………... 43 3.2. Ảnh dòng UE35 cấy trong 5 loại môi trường ………………………. 46 3.3 Ảnh mẫu được cấy sang môi trường có bổ sung vitamin B2 sau 10 ngày nuôi cấy ……………………………………………………….. 47 3.4a. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 48 3.4b. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 49 3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH ……………………………………………………………... 55 3.6. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA …………………………………………………………... 58 3.7. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1 mg/l N AA + 0,5 mg/l Kinetin …………………………………………… 62 3.8. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung ABT1 vào môi trường ra rễ sau 15 ngày nuôi cấy ……………………………………………………….. 68 3.9. Ảnh cây con tại vườn ươm của 2 dòng ……………………………... 71 3.10. Ảnh sơ đồ cho quy trình nuôi cấy mô 2 dòng UE35 v à UE56 …….. 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABT1 : Chất kích thích ra rễ của Trung Quốc BAP : 6- Benzyl amino purine B2 : Riboflavil Bộ NN&PTNT : Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Ca (0Cl)2 : Hypoclorit canxi GA3 : Gibberellin acid 3 HgCl2 : Clorua thuỷ ngân HSNC : Hệ số nhân chồi IAA : Indol acetic acid IBA : 3-Indol butyric acid Kinetine : 6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05 NAA : Nathyl acetic acid Na0Cl : Hypoclorit natri TTG1 : Thuốc kích thích ra rễ có gốc IBA của Trung tâm giống - Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam TLCHH : Tỷ lệ chồi hữu hiệu 1 MỞ ĐẦU Trong những năm gần đây, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và thu được những thành tựu đáng kể. Kỹ thuật này ra đời nhanh chóng có vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất giống cây trồng. Ưu điểm nổi bật của phương pháp này là có thể nhân nhanh, giữ được đặc điểm di truyền ổn định, có thể sản xuất với số lượng cá thể lớn trong thời gian ngắn. Cây nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể làm đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis). Vì thế nuôi cấy mô tế bào còn là một biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dù nuôi cấy mô đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp (Lê Đình Khả, Đoàn Thị Mai, 2002, tr. 166-182). Bạch đàn là cây mọc nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn, có khả năng sinh trưởng trên nhiều dạng lập địa khác nhau, thích hợp cho rừng trồng sản xuất nguyên liệu như: gỗ, ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng, gỗ củi. Bạch đàn được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới. Nhiều giống Bạch đàn được cải thiện cùng với kỹ thuật trồng rừng thâm canh cho năng suất cao. Ở Việt Nam, Bạch đàn chiếm vị trí quan trọng trong cơ cấu cây trồng rừng. Tuy nhiên năng suất và chất lượng rừng Bạch đàn trồng rừng ở nước ta còn thấp và rất khác nhau. Từ năm 1996 Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng - Viện khoa học Lâm Nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu lai tạo và chọn được một số tổ hợp lai có nhiều triển vọng về khả năng sinh trưởng. Các tổ hợp lai trong loài và khác loài của các loài Bạch đàn urophyla (Eucalyptus urophyla) với Bạch đàn liễu (E. exserta) trong đó Eucaluptus urophyla được dùng làm mẹ, E. exserta được dùng làm bố. Những dòng cây lai được chọn là các dòng vô tính thuộc các tổ hợp lai U29E2 (dòng 35) và U29E4 (dòng 56). Hai dòng cây lai này đều có mẹ là Bạch đàn uro (U29), bố là Bạch 2 đàn liễu (E2), song lại thuộc hai cây khác nhau là E2 và E4 vì vậy có đặc điểm sinh trưởng khác nhau. Các dòng vô tính này thuộc các tổ hợp lai đã được Bộ NN&PTNT công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật thích hợp với điều kiện lập địa ở vùng đất đồi nghèo dinh dưỡng có thể cho năng suất gấp 2-4 lần so với loài bố mẹ (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001). Việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô những giống lai mới được chọn tạo này có ý nghĩa rất lớn để sớm đưa vào sản xuất trên diện rộng mà vẫn giữ được các đặc tính ưu việt của chúng. Để hạn chế lây lan của dịch bệnh có thể xảy ra thì một trong những biện pháp kỹ thuật là trồng hỗn loài các dòng vô tính khác nhau. Ở Nước ta hiện nay có khoảng 12 dòng Bạch đàn đã được Bộ NN&PTNT công nhận và cho phép trồng rừng sản xuất, trong khi đó mới có U6, GU8, PN2, PN14, PN32 là những dòng đã được nhân giống bằng nuôi cấy mô đã qua khảo nghiệm, nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô để cung cấp cho rừng trồng. Hiện nay, nhu cầu cây giống Bạch đàn có năng suất cao và đã qua khảo nghiệm, cũng như của hai dòng này nhằm phục vụ trồng rừng khá lớn. Thời gian qua Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp đã thử nghiệm áp dụng quy trình nhân giống nuôi cấy mô hai dòng UE35 và UE56 và đã có kết quả bước đầu. Việc nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô để hoàn thiện công nghệ và phục vụ sản xuất giống là rất cần thiết. Từ những đặc điểm, nhu cầu thực tiễn và nhu cầu khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus urophyla và E. exserta bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô”. Đây cũng là một phần kết quả của đề tài “Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch đàn urophyla, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế bào” - chủ nhiệm đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp Giống lai là giống được tạo ra do lai tự nhiên hoặc lai nhân tạo giữa các cá thể có kiểu gen (genotype) khác nhau. Giống lai thường có năng suất cao và có tính chống chịu với các điều kiện bất lợi tốt hơn bố mẹ. Vì thế, tạo và sử dụng giống lai đang là mối quan tâm hàng đầu của các nhà chọn giống nông lâm nghiệp trên thế giới (Lê Đình Khả, 2006). 1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tissue culture). Vi nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ được tách khỏi cây (George, 1930) đang được dùng phổ biến để nhân giống thực vật, trong đó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận được dùng để nuôi cấy có thể là chồi bất định, chồi bên, chồi đỉnh, bao phấn, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) vv. (Isikawa và cs, 1996, Preece, 1997, Tripepi, 1997, Merkle, 1997, Nguyễn Đức Thành, 2000). Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất định (Preece, 1997, Tripepi, 1997) là những phương pháp chính được dùng trong nhân giống cây rừng mà không đề cập các nội dung khác. Nuôi cấy mô thường được trẻ hoá cao độ và có rễ giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt đáng kể so với cây mọc từ hạt. Trong lúc cây hom lại thường không có rễ cọc, rễ cây không thể đâm sâu xuống đất như cây mọc từ hạt và thường có hiện tượng bảo lưu cục bộ (topophisis) như đã đề cập ở trên. Ví dụ: cây mô keo lai ở giai đoạn 1-2 tháng tuổi (cũng như các loài cây bố mẹ là Keo tai tượng và Keo lá tràm) cũng có đủ các loại lá kép một lần, kép hai lần và lá giả, lại có rễ theo kiểu rễ cọc như những cây mọc từ hạt điển hình, thì cây hom cũng của giống này lại chỉ có lá giả của cây trưởng thành và không có rễ cọc (nghĩa là tính trẻ hoá bị hạn chế, còn tính bảo lưu cục bộ thì biểu hiện rõ rệt). Vì thế nuôi cấy mô còn là biện pháp trẻ hoá giống trong sản xuất lâm nghiệp. Mặc dầu nuôi cấy mô đòi hỏi 4 kỹ thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn được nhiều nơi áp dụng, đặc biệt là phối hợp với giâm hom, tạo thành công nghệ mô - hom đang được sử dụng khá phổ biến trong sản xuất lâm nghiệp. Tuy vậy, tính trẻ hoá của cây nuôi cấy mô vẫn kém hơn cây mọc từ hạt, Brand và Lineberger (1992) nghiên cứu so sánh mức độ trẻ hoá của cây mô, cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành và cây ghép của cây Bulô (Betula sp.) đã thấy rằng sau 1 tháng cây nuôi cấy mô có các băng protein giống như cây mọc từ hạt, sau 4-8 tháng lại giống với cây trưởng thành, còn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành sau 4-8 tháng đã có một số cây có hoa, trong lúc cây mọc từ hạt nhanh nhất cũng phải sau 8 năm mới có hoa (Grosdova, 1985). Điều đó chứng tỏ cây nuôi cấy mô tuy có mức độ trẻ hoá cao hơn cây ghép và cây hom lấy từ cành của cây trưởng thành (chứ không phải lấy từ chồi của cây đã trẻ hoá) song không thể trẻ như cây mọc từ hạt. 1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào 1.3.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật Nguyên lý cơ bản của nhân giống nuôi cấy mô tế bào là tính toàn năng của tế bào thực vật. Mỗi tế bào bất kỳ của cơ thể thực vật đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cả thực vật đó còn gọi là bộ gen (genom). Đặc tính của thực vật được thể hiện ra kiểu hình cụ thể trong từng thời kỳ của quá trình phát triển phụ thuộc vào sự giải mã các thông tin di truyền tương ứng trong hệ gen của tế bào. Do đó, khi gặp điều kiện thích hợp, trong mối tương tác qua lại với điều kiện môi trường, cơ quan, mô hoặc tế bào đều có thể phát triển thành một cá thể mới hoàn chỉnh mang những đặc tính di truyền giống như cây mẹ. 1.3.2. Sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô là kết quả phân hoá và phản phân hoá tế bào. Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau, trong đó có nhiều loại tế bào khác nhau, thực hiện chức năng cụ thể khác nhau. Các mô có được cấu trúc chuyên môn hoá nhất định nhờ vào sự phân hoá. 5 Phân hoá tế bào là sự chuyển hoá các tế bào phôi sinh thành các tế bào của mô chuyên hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể. Quá trình phân hoá có thể diễn như sau: Tế bào phôi sinh Tế bào dẫn Tế bào phân hoá chức năng Khi tế bào đã phân hoá thành mô chức năng, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình. Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng giống như tế bào phôi sinh và tiếp tục thực hiện quá trình phân hoá, quá trình này gọi là sự phản phân hoá của tế bào. Về bản chất thì sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá phân hoá gen. Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số gen được hoạt hoá để cho ra tính trạng mới, một số gen khác lại bị ức chế hoạt động. Quá trình này xảy ra theo một chương trình đã được mã hóa trong cấu trúc của phân tử DNA của mỗi tế bào. Khi tế bào nằm trong cơ thể thực vật, chúng bị ức chế bởi các tế bào xung quanh. Khi tách tế bào riêng rẽ, gặp điều kiện bất lợi thì các gen được hoạt hoá, quá trình phân chia sẽ được xảy ra theo một chương trình đã định sẵn trong DNA của tế bào (Vũ Văn Vụ, 1994). Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô, tế bào thực vật thực chất là kết quả của quá trình phân hoá và phản phân hoá tế bào. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào xét cho đến cùng là kỹ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) một cách định hướng dựa vào sự phân hoá và phản phân hoá của tế bào trên cơ sở tính toàn năng Phân hoá Tế bào dãn Phản phân hoá Tế bào phôi sinh Tế bào chuyển hoá 6 của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở sơ đồ bên. Theo sơ đồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo (callus). 1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá trình này có thể chia thành các nhân tố sau: 1.4.1. Môi trường nuôi cấy Trong nuôi cấy in vitro, môi trưởng nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Cho đến nay, đã có nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy. Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nôi cấy mô là rất quan trọng. Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể. Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau: 7 + Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994). + Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là HN4 + và NO3 - (nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3 - của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với NH4 +. Nhưng đôi khi NO3 - gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất. + Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg, Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường được thuận lợi. Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể lựa chọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn. Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l). Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng. + Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng 8 vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin, nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994). + Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men, cà rốt, chối, khoai tây... được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro. Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA. Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy. 1.4.2. Các chất điều hoà sinh trưởng Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy. 9 + Auxin: Nhóm này gồm có các chất chính là: IBA (3-Indol butyric acid), IAA (Indol acetic acid), NAA (Nathyl acetic acid),… trong nuôi cấy mô thực vật Auxin thường được sử dụng để kích thích sự phân chia tế bào, biệt hoá rễ, hình thành mô sẹo, kìm hãm sự phát triển chồi và tạo ra các rễ phụ (Nguyễn Văn Uyển, 1993). + Cytokinin: Được bổ sung vào môi trường chủ yếu để kích thích sự phân chia tế bào và quyết định sự phân hoá chồi bất định từ mô sẹo và cơ quan. Các hợp chất thường sử dụng là: Kinetine (6- Furfuryl aminopurine - C10H9N05), BAP (6- Benzyl amino purine), Zip (Izopentenyl adenin), Zeatin… Trong các chất này thì Kenitin và BAP được sử dụng phổ biến nhất vì chúng có hoạt tính cao và giá thành rẻ. Tuỳ vào từng hệ mô và mục đích nuôi cấy mà Cytokinin được sử dụng ở các nồng độ khác nhau. Ở nồng độ thấp (10-7- 10-6M) chúng có tác dụng kích thích sự phân bào, ở nồng độ 10-6- 10-5M chúng kích thích sự phân hoá chồi. Trong nuôi cấy mô để kích thích sự nhân nhanh người ta thường xử dụng Cytokinin với nồng độ 10- 6 - 10 -4 (Lê Văn Chi, 1992). + Gibberellin: Nhóm này có khoảng 20 loại hormone khác nhau nhưng quan trọng nhất là GA3 (Gibberellin acid 3). GA3 có tác dụng kích thích nảy mầm của các loại hạt khác nhau, kéo dài các lóng đốt thân cành. Bên cạnh đó GA3 còn có tác dụng phá ngủ của các phôi, ức chế tạo rễ phụ (Picrick, 1987) cũng như tạo chồi phụ (Street, 1973). Ngoài ra, có còn có tác dụng ảnh hưởng đến sự ra hoa của một số thực vật và có tác dụng rút ngắn thời gian sinh trưởng dinh dưỡng của cây. + Abscisic acid (ABA): là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên nhưng vẫn được dùng trong nuôi cấy tế bào in vitro. ABA có ảnh hưởng âm tính đến mô nuôi cấy, khi ABA tương tác với BAP cho hệ số nhân chồi cao hơn khi dùng BAP riêng rẽ (lê Văn Chi, 1992). + Ethylen: có biểu hiện tác động hai chiều, nó kìm hãm sự hình thành chồi ở giai đoạn sớm nhưng lại kích thích sự phát triển chồi ở giai đoạn muộn. Trong một số trường hợp, Ethylen có tác dụng kích thích hình thành rễ nhưng một số trường hợp nó lại kìm hãm quá trình này (Nguyễn Văn Uyên, 1993). 10 Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ nét tới khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trường. Sự ổn định của môi trường, khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây. Nếu pH thấp (7,0) đều gây ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro. Nên việc xác định được độ pH ban đầu của môi trường cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mô cấy là cần thiết. Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6. 1.4.3. Môi trường vật lý Trong nuôi cấy mô tế bào các yếu tố của môi trường vật lý được quan tâm đó là ánh sáng, độ ẩm, nhiệt độ. + Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy. Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng. Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy. Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày. Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy. Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986). Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974). Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy. Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo. Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux. + Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của Auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô. Theo kết quả nghiên cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 200C/150C hoặc 200C/180C 11 tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn. Ở nhiệt độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn. Còn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không có tổ chức. Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ 25 - 30 0C và ban đêm từ 17 - 200C. + Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô. 1.4.4. Vật liệu nuôi cấy Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân giống in vitro. Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công. Thực tế cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau. Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao. Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tượng tầng… sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995). 1.4.5. Điều kiện vô trùng Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy in vitro. Nếu điều kiện này không được đảm bảo thì mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại. Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối. Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy vô trùng. Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt tốc độ sinh trưởng nhanh. Phương tiện khử trùng  Nồi hấp tiệt trùng: sử dụng cho việc khử trùng môi trường nuôi cấy, dụng cụ nuôi cấy bằng hơi nước có áp suất và nhiệt độ cao (1,2 - 1,5 atm, 120 -1300C). 12  Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy  Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường sử dụng các dung dịch như HgCl2 (clorua thuỷ ngân), Na0Cl (Hypoclorit natri), Ca (0Cl)2 (Hypoclorit canxi), H202 (ôxi già) (Street, 1974)…cồn dùng để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.  Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng được ở nhiệt độ cao như dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trưởng. Hiện nay, người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền phù tế bào.  Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp chiếu đèn tử ngoại.  Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không khí vô trùng về phía người ngồi thao tác. 1.4.6. Buồng nuôi cấy Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải đảm bảo các điều kiện: - Nhiệt độ: 25 - 300C - Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux. Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài. 1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống 1.5.1. Giai đoạn chuẩn bị Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các bước tiếp theo. Giai đoạn này coi như là một bước thuần hoá vật liệu để nuôi cấy. Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ 13 động trong công tác nhân giống. Trong trường hợp cần thiết có thể làm trẻ hoá vật liệu giống. 1.5.2. Giai đoạn cấy khởi động Mục đích của giai đoạn này là tạo ra các chồi mới từ các mô nuôi cấy. Khi đã có nguồn nguyên liệu nuôi cấy, cần tiến hành lấy mẫu và xử lý trong những điều kiện vô trùng. Người ta thường dùng một hoá chất như HgCl2, Ca(0Cl)2, Na0Cl, H202, để khử trùng mẫu cấy. Tuỳ thuộc vào từng loại vật liệu mà chọn hoá chất, nồng độ và thời gian khử trùng thích hợp. Về nguyên tắc, mô nuôi cấy có thể là bất kỳ bộ phận nào của cây (thân, rễ, lá, hoa, quả…) nhưng theo Blatt thì mô lấy từ các phần non của cây có khả năng nuôi cấy thành công cao hơn mô lấy từ các bộ phận trưởng thành khác (Blat K. M. and Hwanok Ma, 2004). Vì vậy, người ta thường lấy chồi đỉnh hay chồi nách để nuôi cấy in vitro. Ngoài ra, khi lựa chọn mô nuôi cấy cần chú ý tuổi sinh lý của mô càng thấp thì độ trẻ hoá cao, nuôi cấy dễ thành công. Các mô lấy ở thời kỳ sinh trưởng mạnh của cây trong mùa sinh trưởng cho khả năng tái sinh tốt hơn (Anoleson, 1980). Đối với mẫu dễ bị hoá nâu khi nuôi cấy có thể bổ sung than hoạt tính hoặc polyvinin pyrroline (PVP) vào môi trường (Lê Đình Khả, 1999). Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ mô nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt. Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào việc chọn bộ phận nuôi cấy, cho nên khi lấy mẫu cần đảm bảo các nguyên tắc nêu trên. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 - 6 tuần. 1.5.3. Giai đoạn nhân nhanh Một trong những ưu điểm của phương pháp nhân giống in vitro so với các phương pháp nhân giống khác có hệ số nhân cao. Vì vậy, có thể coi đây là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhân giống. Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp. Trong giai đoạn này vai trò của các chất điều hoà sinh trưởng (Auxin, Cytokinin) là cực kỳ quan trọng để sản sinh ra lượng cây con tối đa mà vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây. Theo nguyên tắc chung thì môi trường có nhiều Kitocinin sẽ kích thích tạo chồi. Chế độ nuôi thường là 25-270C và 10-16h/ngày, cường độ chiếu sáng 14 1000 lux. Yêu cầu của giai đoạn này là tạo ra số lượng cây con tối đa trong thời gian ngắn nhưng vẫn đảm bảo sức sống và bản chất di truyền của cây. 1.5.4. Tạo cây hoàn chỉnh (ra rễ) Đây là giai đoạn chuẩn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ thống vô trùng khi đã đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường sau 2-3 tuần ở các chồi này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Môi trường tạo rễ thường giảm lượng Cytokinin và tăng lượng Auxine để tạo điều kiện cho sự ra rễ của chồi cây. Người ta thường dùng các chất NAA (Acid α- naphty axetic), IBA (Acid β - indol butyric), IAA (Acid β - indol acetic) ở nồng độ 1mg/l - 5mg/l để tạo rễ cho hầu hết các loại cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô. Giai đoạn này thường kéo dài từ 2-4 tuần lễ, sau đó được chuyển sang môi trường Auxin để rễ phát triển. Ở giai đoạn này cây con rất nhạy cảm với ẩm độ và bệnh tật do hoạt động của rễ và lá mới phát sinh rất yếu, cây chưa chuyển sang giai đoạn tự dưỡng. 1.5.5. Đưa cây ra môi trường tự nhiên Đây là giai đoạn chuyển dần cây con trong ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời. Cây mô được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng, nên phải tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột làm cây có thể bị sốc hoặc chết. Khi cây con đã cứng cáp và đạt những tiêu chuẩn nhất định về chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngoài giá thể. Giá thể tiếp nhận cây in vitro phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước và sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây mới đưa từ bình nuôi ra, cần duy trì độ ẩm >50% để cây con không mất nước và làm giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh. Sau 2-3 ngày đưa ra ngoài cây mô sẽ sinh trưởng ổn định, chăm sóc cây mô tương tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt. Đối với nuôi cấy mô, nhóm nghiên cứu thuộc Trung tâm nghiên cứu của viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam là Đoàn Thị Mai và cs đã sử dụng chất kích thích ra rễ IBA, IAA và NAA ở các nông độ khác nhau (để bổ sung cho môi trường MS) và đã thấy rằng khi dùng IBA ở nồng độ 2 mg/l đối với ra rễ chồi trong ống nghiệm, còn ra rễ trực tiếp bằng cách ngâm và chấm dung dịch ra rễ sử sụng nồng độ 3 ppm 15 đã cho tỷ lệ ra rễ cao (80-92%) ở các dòng Keo lai BV10, BV29, BV32 và BV33. Nồng độ cho tỷ lệ ra rễ cao ở dòng BV16 (65%) và BV5 (50%) là 1ppm của IBA. Đồng thời đưa cây nuôi cấy mô ra rễ trực tiếp (bằng cách chấm thuốc bột TTG1) với giá thể cát sông thực hiện thành công cho cây Lát hoa, Keo lai (Đoàn Thị Mai và cs, 2000, 2006,2008). Tuy vậy, kết quả xử lý ra rễ cho cây mô bằng thuốc bột TTG1 1,0% trên môi trường cát sông do Lê Đình Khả cùng kỹ sư lâm nghiệp Malaysia thực hiện tại tập đoàn sản xuất gỗ dán Ta Ann ở Sarawak (Malaysia) vào ngày 1 tháng 12 năm 1999 và kiểm tra vào ngày 6 tháng 1 năm 2000 đã thấy các dòng BV5, BV10, BV16, BV32 và BV33 đều có tỷ lệ ra rễ 100%, dòng BV29 có tỷ lệ ra rễ thấp nhất cũng đạt 86,7% đến ngày 24 tháng 1 (gần 2 tháng sau khi cấy giâm) vẫn giữ được tỷ lệ sống là 81- 100% (với tỷ lệ chung là 91,51%) (Anken, 2000). Điều đó cho thấy khi giâm trên môi trường cát sông. IBA được sử dụng ở dạng thuốc bột TTG1 1% là chất kích thích có hiệu quả ra rễ cao nhất đối với các dòng keo lai đã được đánh giá và lựa chọn (Lê Đình Khả và các cộng tác viên, 2003). Đây là giai đoạn chuyển dần cây con từ ống nghiệm ra nhà kính rồi ra ngoài trời. Cây mô được chuyển từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng nên phải tập cho cây quen dần với môi trường tự nhiên, tránh sự thay đổi đột ngột làm cho cây có thể bị sốc hoặc bị chết. Khi cây con đã cứng cáp và đạt được tiêu chuẩn về chiều cao, số lá và số rễ thì đưa ra ngoài giá thể. Giá thể tiếp nhận cây nuôi cấy mô phải đảm bảo tơi, xốp, thoáng nước và sạch bệnh. Phải giữ ẩm cho cây khi mới đưa cây từ bình nuôi ra, cần duy trì độ ẩm trên 50% để cây con không mất nước và làm giàn che để tránh ánh sáng quá mạnh. Sau 2-3 tuần đưa ra ngoài cây mô sẽ sinh trưởng ổn định, chăm sóc cây mô tương tự chế độ chăm sóc cây hom hoặc cây từ hạt. Tóm lại, quá trình nhân giống in vitro có thể được chia thành các giai đoạn như trên nhưng kết quả của mỗi giai đoạn không tách biệt nhau mà có sự kế thừa của giai đoạn trước. Trong các giai đoạn trên thì giai đoạn chuẩn bị môi trường là 16 đặc biệt quan trọng, giai đoạn này ảnh hưởng xuyên suốt và quyết định sự thành công hay thất bại của quá trình nhân giống. 1.6. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) và Bạch đàn liễu (E. exserta) 1.6.1. Bạch đàn urô (Eucalyptus urophylla) Eucalyptus urophylla loài có phân bố tự nhiên ở một số đảo của phần cực Nam của quần đảo Santo - Indonesia, bao gồm các đảo: Adonara, Alor, Flores, Lomblen, Pantar Timor và Wetar. Tại đây E. urophylla xuất hiện theo dải 7030’ - 10 0 vĩ độ Nam. Giới hạn phía Đông và phía Tây của vùng phân bố chưa xác định rõ ràng. Hiện nay người ta chấp nhận vùng phân bố của loài Bạch đàn này là từ 122 - 127 0 kinh Đông. Trong khu vực phân bố, Bạch đàn E. urophylla sống từ vùng bán sơn địa tới vùng núi, nhưng cũng thấy có hiện tượng xuất hiện loài này ở vĩ độ thấp. Đây là loài có phân bố khá đặc biệt và đáng nhớ nhất về độ cao và nhiệt độ. E. urophylla có phân bố theo độ cao lớn nhất trong số các loài Bạch đàn (79 - 2960 m trên mặt biển). Do thay đổi về độ cao nên biến động về nhiệt độ cũng vì thế mà khá lớn. Trên cùng một đảo với khoảng cách không thấy xa nhau mà các quần thụ phải thích nghi với các điều kiện nhiệt độ rất khác nhau, từ 27 - 300C trên độ cao 400m xuống 17 - 210C trên độ cao 1900m. Trên đảo Timor từ độ cao 1000m trở lên, ngoài lượng mưa cao (1300 - 2200 mm) còn thấy cả sương mù thường xuyên. Mặc dù phạm vi phân bố hẹp song loài bạch đàn này vẫn có lượng biến dị di truyền lớn theo độ cao được thể hiện qua các xuất xứ của loài ở nhiều nước (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2000). Bạch đàn là nhóm cây được trồng rộng rãi ở nước ta (đặc biệt là các tỉnh miền Trung và miền Nam) để cung cấp nguyên liệu giấy và ván dăm, gỗ trụ mỏ, gỗ xây dựng và củi đun. Đây cũng là cây trồng chủ yếu trên các đường nông thôn, các bờ vùng, bờ thửa ở đồng bằng Bắc Bộ và đồng bằng Sông Cửu Long. Kết quả nghiên cứu và gây trồng nhiều năm qua cho thấy nhiều loài Bạch đàn được nhập vào nước ta chỉ một số loài sinh trưởng nhanh và có khả năng thích ứng lớn. Trong đó, đáng chú ý là các loài Bạch đàn uro (E. urophylla), Bạch đàn tere (E. tereticornis) và Bạch đàn caman (E. camaldulensis), Bạch đàn liễu (E. exserta). Ở những nơi thấp 17 Bạch đàn E. urophylla có thể mọc lẫn với Bạch đàn E. alba (Martin and Cossalater, 1975 - 1976). Bạch đàn urô là cây thích hợp với các lập địa có đất sâu ẩm ở các tỉnh miền Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Các xuất xứ có triển vọng nhất cho vùng trung tâm miền Bắc là Lewotobi và Egor Flores (Nguyễn Dương Tài, 1994; Lê Đình Khả, 1996). Egor Flores cũng là một trong những suất xứ có triển vọng nhất ở Mang Linh và Lang Hanh của vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 1996, Phạm Văn Tuấn và cs, 2001). 1.6.2. Bạch đàn liễu (Eucalyptus exserta) Bạch đàn liễu (E. exserta) là loài cây gỗ nhỡ đến gỗ lớn khi mọc trên những nơi đất tốt và lượng mưa cao có thể cao đến 25m, đường kính 60 cm - 1m ở những nơi khô cạn thì cao đến 10-15m và chiều dài đoạn thân dưới cành ngắn, dưới 1/2 chiều cao của đoạn thân (Bolandetal, 2006) trong khoảng 1500m dọc bờ biển Bạch đàn liễu có phân bố tự nhiên ở phía Đông bang Queenland đến phía Bắc của Newsouth Wale trong khoảng 1500km từ 140-260 vĩ độ Nam và 1400- 1550 kinh độ Đông dọc theo bờ biển. Đây là loài có khả năng thích ứng rộng với các điều kiện khí hậu và đất đai khác nhau, từ vùng đất thấp ven biển, đất xấu, đất dốc ngèo dinh dưỡng, vùng đất đồi, có thể sống trên đất cát nghèo dinh dưỡng, trên đất đồi trơ sỏi đá và trên đất thịt nặng. Song sinh trưởng tốt nhất trên đất bồi tụ, giàu dinh dưỡng. Bạch đàn liễu sinh trưởng ở độ cao gần mặt biển đến 900m trên mặt biển, từ nhiệt độ 2-160C của tháng lạnh nhất nhiệt độ tối cao trung bình của tháng nóng nhất 26-360C. Bạch đàn liễu có gỗ lõi màu đỏ nâu, có vân đẹp và có độ bền lớn có khối lượng riêng 905-1000kg/m3 (Boland et al, 2006). 1.6.3. Bạch đàn lai Giống lai tự nhiên giữa Bạch đàn caman (Eucalyptus camaldulensis) với Bạch đàn đỏ (E. robusta) đã được Lê Đình Khả phát hiện 1970 tại các rừng trồng Bạch đàn caman (E. camaldulensis) tại các tỉnh Nghệ An, Quảng Ninh, Phú Thọ, Thái Nguyên, với tỷ lệ 2-3%. Giống lai có hình thái thân cây, vỏ cây, lá, hoa, quả và giải phẫu như chiều dày lá, số lượng và kích thước tế bào khí khổng, chiều dày vỏ 18 hạt, chiều dày lá mầm, khối lượng 1000 hạt, v.v… Thể hiện tính trung gian giữa hai loài bố mẹ, đồng thời có sinh trưởng nhanh hơn rõ rệt so với các loài cây bố mẹ. Ở giai đoạn 7 tuổi Bạch đàn lai có đường kính 9,9 - 14,4 cm, chiều cao 5,1 - 11,4 m, thì Bạch đàn đỏ có đường kính là 4,3 - 9,7 cm, chiều cao 3,4 - 6,9 m; còn Bạch đàn caman có các chỉ tiêu này tương ứng là 1,8 - 6,3 cm và 3,1 - 7,4 m (Lê Đình Khả, 1970), nghĩa là giống Bạch đàn lai tự nhiên này có thể tích thân cây gấp 4 - 5 lần các loài cây bố mẹ. Điều thú vị là ngay từ khi phát hiện ra đời F2 của Bạch đàn lai tự nhiên có hiện tượng phân ly theo kiểu nhị hạng thức bậc n dạng (a + b) n, theo 5 dạng khác nhau với tỷ lệ phân ly theo phần trăm là 1,7: 14,0: 58,4: 8,3: 1,0 mà cây lai F2 thiên về hệ mẹ là Bạch đàn caman (Lê Đình Khả, 1970). Đáng tiếc trong thời kỳ này do chưa có kỹ thuật giâm hom thích hợp nên Bạch đàn lai đã không được phát triển vào sản xuất ở Việt Nam. Một số nơi đã thử xây dựng vườn giống bằng cây ghép song cũng không thành công. Lai nhân tạo cho các loài Bạch đàn E. urophylla, E. exserta và E. camaldulensis ở Việt Nam đã được trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thực hiện từ năm 1997. Đến năm 2000 hơn 60 tổ hợp lai giữa 3 loài nói trên đã được tạo ra, trong đó một số dòng hoặc tổ hợp lai sinh trưởng gấp 1,5 - 2 lần bố mẹ. Một bộ giống gồm nhiều tổ hợp lai khác loài UC, UE, EU, UC, và UU đã được khảo nghiệm so sánh với các xuất xứ tốt nhất của các loài bố mẹ như UEgon, U27, U28, U29, E1, E2, E4. Khảo nghiệm được tiến hành tại Thụy Phương (Hà Nội), Cẩm Quỳ (Hà Tây) và một số vùng khác trong nước. Khảo nghiệm đã cho thấy lai thuận nghịch ở những điều kiện lập địa khác nhau, sinh trưởng của các tổ hợp lai cũng thay đổi theo từng điều kiện lập địa. Ví dụ, ở Thụy Phương tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất là giống Bạch đàn urô với Bạch đàn caman. Trong khi ở Ba Vì các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất lại là giữa Bạch đàn urô và Bạch đàn liễu (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2002). Sau khi đã tạo được tổ hợp lai và khảo nghiệm giống lai đã chọn lọc được một số cây trội trong các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất, vượt xuất xứ Egon 19 Flores của E. urophylla (xuất xứ tốt nhất) về thể tích lá 51,3 - 247,4% (có thể tích thân cây gấp 1,5 - 3,5 lần giống sản xuất tốt nhất). Năm 2001 Bộ NN&PTNT đã có quyết định số 4356 (ngày 19/9) công nhận 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai U29E1, U29E2, U29C3, U29C4, U29U4, U29U26, U15C4, U30E5 (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001). Các giống lai này đã được Nguyễn Việt Cường và cs (2007, 2008) tiếp tục khảo nghiệm ở một số nơi từ đó đã chọn được các dòng vô tính sinh trưởng nhanh đã được Bộ NN&PTNT công nhận là giống quốc gia hoặc giống tiến bộ kỹ thuật. Khảo nghiệm tại lâm trường Vạn Xuân cho thấy các dòng Bạch đàn lai được chọn có một số dòng sinh trưởng vượt trội rõ rệt so với các dòng đối chứng như: U6, GU8, PN2, PN14 cả về đường kính, chiều cao và chỉ số thể tích thân cây, đặc biệt là các dòng U29E1.24, U29E2.5, U15E4.83. Những dòng này có chỉ số thể tích (Iv = D 2H) bằng 70,4 - 73,9, trong khi dòng Bạch đàn GU8 có chỉ số thể tích 50,3, còn các dòng khác như PN2, PN14 và U6 có chỉ số thể tích thân cây là 23,5 - 31,7 (Lê Đình Khả et al, 2003). Một số tổ hợp lai khác loài mới giữa các loài E. tereticornis (T), E. pellita (P), E. camandulensis (C) và E. urophylla (U) được tạo ra sau này và khảo nghiệm tại Minh Đức (tỉnh Bình Dương) cũng thấy rằng sau 2 năm các tổ hợp lai T1P17, C1P17, P18U29C3, v.v… có thể đạt thể tích thân cây 21,8 - 26,1 dm3/cây, trong lúc giống U29 có thể tích thân cây 9,7 dm3/cây, một số giống sinh trưởng kém nhất trong khảo nghiệm chỉ đạt 6,8 - 8,5 dm3/cây (Nguyễn Việt Cường, 2006). Theo quy trình trồng Bạch đàn urophylla của ta (04-TCN-26-2001) quy định mật độ trồng rừng là 1100 - 1660 cây/ha. Song kết quả nghiên cứu của Stape C.R., C.R. Silva (2007) cho nhiều công thức mật độ trồng Bạch đàn khác nhau tại Brazin đã thấy là mật độ 500-900 cây/ha chưa cho năng suất cao, mật độ 1500 cây/ha bắt đầu có năng suất cao, những mật độ khác năng suất tăng lên không đáng kể. Vì thế với Bạch đàn chúng tôi chỉ dùng một mật độ trồng 1660 cây/ha với các công thức bón phân khác nhau. 20 Bạch đàn cao sản đang được sử dụng rộng rãi trong trồng rừng nguyên liệu, tuy vậy số giống thực sự được đưa vào sản xuất chưa nhiều, một số ít giống có biểu hiện bị bệnh, một số khác năng suất chưa cao, kỹ thuật nhân giống hàng loạt còn gặp khó khăn. Vì thế việc chọn tạo thêm, nhân giống và khảo nghiệm giống và kỹ thuật trồng thâm canh vẫn còn rất cần thiết. Ngoài ra tái tổ hợp trong biến dị di truyền đã được các nhà di truyền học phát hiện từ những năm đầu thế kỷ 20 (Williams, 1964; Lobasev, 1969; Muntring, 1967), song đến nay việc áp dụng lý thuyết tái tổ hợp mới chỉ dừng lại ở một số loài cây nông nghiệp còn trong lâm nghiệp là hoàn toàn mới. 1.6.4. Nhân giống Bạch đàn bằng nuôi cấy mô Nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho giống lai giữa Bạch đàn trắng đã được Nguyễn Ngọc Tân và cs (1997) thực hiện thành công từ năm 1993 thấy rằng dùng BAP thêm vào môi trường MS có thể tạo được 20-30 chồi trên hom. Môi trường MS + IBA có thể đạt tỉ lệ ra rễ 80%. Giống lai được sử dụng để nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô là U29C3. Nghiên cứu do nhóm Đoàn Thị Mai (2000) thực hiện bằng cách lấy chồi non của cây hơn 3 tháng tuổi. Kết quả nghiên cứu cho thấy khử trùng mẫu vật trong HgCl2 nồng độ 0,1% cho chồi đoạn 2 trong thời gian 8 phút có hiệu quả cao nhất, còn Ca(OCl)2 có hiệu quả rất thấp. Tỷ lệ bật chồi hữu hiệu (bằng tích của tỷ lệ mẫu không nhiễm với tỷ lệ mẫu nẩy chồi) ở đoạn 2 là 48,0% (thời gian 8 phút), còn chồi đoạn một là 14,8-22,2% (thời gian 8-10 phút). Còn xử lý bằng Ca(OCl)2 10% đối với đoạn chồi 1 và chồi 2 có tỷ lệ bật chồi hữu hiệu cao nhất là 10,8% và 7,3%. Nghiên cứu cho thấy từ tháng 5-8 là thời kỳ khử trùng có hiệu quả nhất (mẫu ít bị nhiễm, có tỷ lệ bật chồi cao nhất), thời gian bật chồi khoảng 20 ngày, các tháng khác cho hiệu quả thấp hơn, thời gian bật chồi lâu hơn (khoảng 30 ngày). Chồi Bạch đàn lai sau khi khử trùng và rửa sạch cấy chuyển vào môi trường nhân chồi MS có bổ sung BAP và Kn phối hợp hai chất này ở các nồng độ khác nhau, công thức bổ sung cho thấy tăng hệ số nhân chồi rõ rệt. Với BAP 0,5 mg/l MS đạt số chồi trong cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm), cá biệt có cụm lên đến 20-30 21 chồi/cụm. Bổ sung BAP ở các nồng độ khác nhau đều cho số chồi ít hơn, còn Kn hoặc BAP + Kn đều cho hệ quả thấp. Ví dụ: BAP + 0,1mg/l Kn thì công thức cao nhất chỉ đạt 8,3 chồi/cụm. Nhân chồi Bạch đàn cao 2,5 - 3cm trong môi trường ra rễ là MS có bổ sung 1mg/l IBA có thể đạt tỷ lệ ra rễ 83,8% bổ sung IBA ở các nồng độ thấp hơn đều có tỷ lệ ra rễ thấp. Khi bổ sung NAA thì tỷ lệ ra rễ cao nhất cũng chỉ đạt 51% (nồng độ 1mg/l MS). Cây mô đã ra rễ được cấy vào bầu gồm 94% đất đồi + 5% phân chuồng hoai mục + 1% NPK sau 3 tháng có tỷ lệ sống 76-83%. 1.7. Một số kết quả nổi bật về nuôi cấy mô cây thân gỗ và Bạch đàn 1.7.1. Trên thế giới Bạch đàn lai tự nhiên đã được phát hiện những năm 1950 giữa Eucalyptus pausiflora với E. dives (Fryor, 1950), trong những năm sau này các giống lai tự nhiên đã được phát hiện giữa E. camandulensis và E. tereticornis với tên gọi là E. hybrid ở Ấn Độ (cuối những năm 1970) và giống lai giữa E. grandis với E. urophylla ở Brazil vào đầu những năm 1980. Giống lai tự nhiên cũng được phát hiện giữa E. obliqua với E. pulchella ở Tasmania (Potts, Reid, 1983). Nhờ chọn lọc và khảo nghiệm giống mà nhiều giống lai có năng suất cao đã được đưa vào sản xuất trên quy mô lớn. Lai giống Bạch đàn đã được nhiều nước quan tâm từ cuối những năm 1960. Phương pháp lai giống Bạch đàn cũng được giới thiệu áp dụng trong các nước (Moncur, 1995). Nhiều tổ hợp lai khác loài mà E. grandis và E. urophylla được dùng làm cây mẹ đã được tạo ra. Theo Martin (1989) thì đến năm 1989 đã có hơn 20 tổ hợp lai khác loài được tạo ra ở chi Bạch đàn, trong đó chủ yếu là nhóm E. grandis và E. urophylla được dùng làm cây mẹ. Còn theo Shuxiong (1989) thì từ năm 1975 Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã tạo được một số tổ hợp lai E. saligna x E. exserta, trong đó một số cá thể của cây lai có thể tích thân cây vượt E. exserta đến 82%. Từ năm 1989 Viện lâm nghiệp nhiệt đới của Trung Quốc cũng tạo ra 204 cây lai (không phải tổ hợp lai) giữa E. urophylla với E. tereticornis, E. camaldulensis. 22 E. exserta, E. grandis, E. saligna và E. pellita, trong đó một số cá thể cây lai E. urophylla x E. tereticornis và E. urophylla x E. camaldulensis đã có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với bố mẹ của chúng, cây lai có thể tích vượt bố mẹ tương ứng là 120,7% và 89,4% (Xing & Wang, 1996; Shen Xihuan, 2000). Các tổ hợp lai thuận nghịch giữa E. urophylla và E. grandis đã được tạo ra ở Trung Quốc (Wang & Yang, 1996, Rezede Gabriel & Rezende Marcos, 2000). Ở Brazin và Indonesia (Hardlyanto & Tridasa, 2000). Một loạt tổ hợp lai giữa các loài E. alba, E. camaldulensis, E. microtheca, E. terericornis, E. polycarpa và E.torelliana cũng được tạo ở Ấn Độ trong các năm 1991 - 1999 (Paramathma, Surendran, 2000). Sau này nhiều giống lai khác loài giữa E. grandis và E. urophylla, giữa E. urophylla và E. tereticornis, E. camaldulensis, E. exserta, E. grandis, E. saligna và E. pellita đã được khảo nghiệm, từ đó đã chọn được những giống lai có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với bố mẹ và có tính chống chịu gió, được sử dụng cho các chương trình trồng rừng ở Trung Quốc (Bai Jiayu et al, 2003). Các giống lai trong loài Bạch đàn caman cũng đang được trồng có kết quả ở ThaiLand. Nghiên cứu của Glori (1993) ở Philippin cho thấy trong các giống giữa các loài Bạch đàn E. pellita, E. deglupta và E. urophylla sau 4 năm trồng các tổ hợp lai E. deglupta x E. pellita và E. pellita x E. urophylla đều có thể tích thân cây cao hơn các loài cây bố mẹ. Lai thuận nghịch và tế bào chất có ảnh hưởng rất lớn đến ưu thế lai, vì thế có vai trò quan trọng trong chọn giống cây rừng. Tuy vậy trong một số trưởng hợp cây lai F1 E. grandis x E. dunii sau 4 năm chỉ có thể tích thân cây 52 dm3/cây, còn thể tích thân cây của mẹ và bố tương ứng là 261 dm 3 /cây và 132 dm 3 /cây (de Asiss, 2000). Chương trình cải thiện giống cho E. pellita dựa trên lai thuận nghịch cũng được thực hiện tại Pointe Noire ở Công Gô. Sinh trưởng của những cá thể tốt nhất của các tổ hợp lai xa khác loài đã vượt trội (superior) các xuất xứ của loài thuần (loài bố mẹ) (Harwood, 1998). Nhờ sử dụng giống lai được đánh giá qua khảo nghiệm giống và áp dụng các biện pháp kỹ thuật thâm canh (trong đó có bón phân Kali và vi lượng) mà ở Brazin 23 và Nam Phi đã tạo được các rừng trồng có năng suất 30-50 m3/ha/năm (Stape, da Silva, 2007). Điều đó cho thấy lai giống, khảo nghiệm giống và nhân giống là những khâu không thể thiếu khi phát triển các giống lai cho Keo lai và Bạch đàn lai. Đây là một hướng đi đang được các nhà lâm nghiệp ở nhiều nước trên thế giới áp dụng có kết quả để tạo ra các giống lai có năng suất cao (Lê Đình Khả, 2008). Số lượng các loài Bạch đàn đã được nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô ngày càng tăng, đến năm 1987 đã có trên 20 loài Bạch đàn khác nhau được nuôi cấy thành công. Các nhà khoa học Ấn Độ thành công trong việc tạo cấy mô từ các cây chội Bạch đàn Eucalyptus camandulensis, E. tereticornis, E. globulus, E. torelliana. Cây mô có nguồn gốc từ cây ưu việt sinh trưởng nhanh gấp 3 lần và đồng đều hơn là cây mọc từ hạt của cùng cây mẹ. Tại Australia, nhân giống nuôi cấy mô đã được áp dụng để nhân nhanh cho các cây được chọn cho tính chịu mặn trong đất và đang được sản xuất với quy mô lớn cho loài E. camandulensis. Trung Quốc là một nước thành công trong việc tạo cây nuôi cấy mô cho các loài cây thân gỗ. Đến nay đã có hơn 100 loài cây thân gỗ được nuôi cấy như Dương, Bạch đàn, Tếch, Bao đồng (cây Hông). Là một trong những nước ứng dụng sớm và thành công nuôi cấy mô vào trồng rừng trên diện rộng. đến năm 1991 ở vùng Nam Trung Quốc, người ta đã tạo ra trên 1 triệu cây mô của các cây và các dòng lai được chọn lọc. Những cây mô này được dùng như là những cây đầu dòng để tạo cây hom tại các vườn ươm địa phương và dùng thẳng vào trồng rừng (Nguyễn Quang Thạch, 2000). Hiện nay, nuôi cấy mô tế bào cũng là một biện pháp nhân giống được áp dụng nhiều ở các loài cây lá kim nhằm phục vụ cho các chương trình trồng rừng dòng vô tính. Một số loài Thông đã được nuôi cấy thành công đó là: Pinus nigra, P. caribaea, P. pinaster… Có tới 30 loài trong số loài cây lá kim được nghiên cứu nuôi cấy mô đã đạt được những thành công bước đầu, trong đó phải kể đến các loài Bách tán (Araucaria), Liễu sam (Cryptomeria japonica), Bách xanh (Nguyễn Quang Thạch, 2000)… Trong số 30 loài cây lá kim đã được nuôi cấy mô, có 4 loài được đưa vào sản xuất trên diện rộng đó là Cù tùng (Sequoia sempvirens) ở Pháp, Thông 24 P. radiate ở viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P. taera và Pseudotsuga menziesii ở Mỹ. Darus H. Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô tế bào cây keo tai tượng (Accasia mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3% Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều cao >0,5cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (O. L. Gamborg, G. C. Phillips, 1997). Người ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cây mô và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang được áp dụng để tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng rừng (Nguyên Quang Thạch, 2000). Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã được áp dụng cho cây Tếch (Tectona grandis). Gupta và các cộng sự (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt của cây non và từ mầm cây 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo được 500 cây nuôi cấy mô từ một chồi ở cây trưởng thành và 3000 cây từ 1 cây non trong một năm. Kaosaard (1990) cho biết Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm 1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm (Ikemori, Y.K., 1987). Perhutani (Indonesia, 1991) đã thử nghiệm và nuôi cấy mô thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã được đem trồng thử. Nhân giống nuôi cấy mô tế bào đối với cây rừng đã thu được những thành công đáng kể, đây là một khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên thế giới trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các loài Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea), Thông Radiata (Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus caribaea) và Thông lai (P. caribaea x P. elliottii) ở Austraylia… (Dr. Phundan sigh, 2001). W.Nitiwattanachai (Trindate, H. Ferreina, J. G. Pais, M. S. Aloni, R., 1990) đã nuôi cấy thành công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trường nhân 25 nhanh chồi là MS (1962) + 10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho tạo rễ là White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA. Cũng với cây Keo tai tượng, V.J. Hartney và cs thuộc (Division of Forest Research) đã sản xuất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trường nuôi cấy được sử dụng là WPM + 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM BAP + 1 μM NAA. Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 40C), giai đoạn khử trùng mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng trong thời gian 20 phút (sharma, J.K., 1994). 1.7.2. Nhân giống cây gỗ bằng phương pháp nuôi cấy mô ở Việt Nam Bạch đàn là một trong các loài cây trồng rừng chính của Việt Nam, không chỉ đối với trồng rừng tập trung mà còn cả đối với trồng cây phân tán, trồng cây trong các hộ gia đình. Cho tới trước những năm 1970 đã có trên 50 loài Bạch đàn được khảo nghiệm ở Việt Nam và từ đó đến nay đã có hàng chục loài được khảo nghiệm trên diện rộng với khá nhiều xuất xứ làm cơ sở cho chọn loài và xuất xứ sinh trưởng nhanh phục vụ trồng rừng đại trà (Lê Đình Khả, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Hoàng Trương, 1993). Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn trong lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh Phú Thọ, Công ty giống lâm nghiệp trung ương, trung tâm khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng Ninh, xí nghiệp giống Thành Phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp… Hiện nay một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho công tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu. Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn lai và keo lai có năng suất cao. Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cây mô tế bào cho Keo lai, Bạch đàn và một số cây rừng khác (Lê Đình khả và cs, 2003). 26 Ngoài những nghiên cứu nuôi cấy mô Keo lai đã được giới thiệu khi tổng kết đề tài KH03.03 năm 1996 (Lê Đình Khả, 1996) trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu của Nguyễn Ngọc Tân Và cs (1996), nhóm nghiên cứu nuôi cấy mô (Đoàn Thị Mai, Ngô Thị Minh Duyên, 2000) đã thực hiện một số nghiên cứu bổ sung cho một số dòng Keo lai đã được đánh giá và thu được một số kết quả như sau: khử trùng mẫu vật bằng HgCl2 0,1% với thời gian 2,4,6,8,10,12 phút trong tháng 2, 5, 8, 10 và 12 cho thấy trong 8 - 10 phút cho kết quả tốt. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng nẩy chồi là BAP (2ppm) và BAP (2ppm) + Kn (0,05 ppm) và môi trường MS là công thức cho mẫu vật đẻ chồi nhiều nhất. Ảnh hưởng của chất kích thích ra rễ đến khả năng ra rễ của các dòng Keo lai riêng biệt là: IBA (3ppm) cho tỷ lệ ra rễ cao (80-92) đối với BV10, BV29, BV32, BV33. Nồng độ IBA 1ppm ra rễ tốt cho dòng BV16 (65%), BV5 (50%). Dương Mộng Hùng (1993) nghiên cứu bằng nuôi cấy mô cho 2 loài Bạch đàn E. camaldulensis và E. urophylla từ cây chội của 2 loài đã tạo được một số cây mô Bạch đàn với hệ số nhân chồi là 1-2 lần. Đoàn Thị Mai và cs (2000) đã nghiên cứu nuôi cấy mô thành công cho giống Bạch đàn lai U29C3. Kết quả cho thấy thời kỳ mẫu bị nhiễm ít nhất và có tỷ lệ bật chồi cao nhất là từ tháng 5-8. Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l BAP cho số chồi trung bình trong mỗi cụm cao nhất (16,6 chồi/cụm). Môi trường ra rễ thích hợp là môi trường MS bổ sung 1,0 mg/l IBA cho tỷ lệ ra rễ tới 83,8 % (Đoàn Thị Mai và cs, 2000). Mai Đình Hồng, 1995 đã đưa ra môi trường nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn dòng U6 là: môi trường nhân chồi (MS + 3% đường + 4,5 g/l agar + 0,5 mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA), môi trường tạo rễ (1/4 MS + 1,5 % đường + 5g/l agar + 1mg/l IBA). Đoàn Thị Nga, thuộc viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh - Phú Thọ nghiên cứu nuôi cấy mô cây Bạch đàn dòng PN2. Tác giả cho rằng, môi trường thích hợp nhân nhanh là MS + 0,5mg/l BAP + 0,25 mg/l NAA. Môi trường ra rễ tối ưu là 1/4 MS + 1mg/l IBA. 27 Đoàn Thị Mai (2008) đã đưa ra môi trường nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn dòng UE35 hoá chất khử trùng thích hợp là chất kháng sinh với nồng độ 4,5mg/l trong thời gian 25 phút, tỷ lệ bật chồi đạt 17,5% và PN3D là mẫu bật chồi đạt 17,5% HgCl2 nồng độ 0,5% trong khoảng thời gian là 12 phút. Môi trường là MS* + BAP 0,5mg/l + NAA 0,3mg/l + các phụ gia khác. 28 CHƢƠNG 2 MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu  Xác định môi trường (hoá học và vật lý) phù hợp để nhân giống 2 dòng UE35 và UE56 của bạch đàn lai giữa (E. urophylla x E. exserta) bằng phương pháp nuôi cấy mô.  Tạo ra cây con hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho các dòng UE35 và dòng UE56.  Huấn luyện và cấy cây con ra vườn ươm. 2.2. Đối tƣợng nghiên cứu Tiến hành nghiên cứu nhân giống cho 2 dòng UE35 và dòng UE56. Hai dòng này đã được tuyển chọn và trồng khảo nghiệm dòng vô tính tại trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam. 2.2.1. Một số đặc điểm chính của dòng UE35 và dòng UE56 Dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 đã được tuyển chọn thông qua khảo nghiệm dòng vô tính và được cho là nhóm có sinh trưởng tương đối nhanh. 2.2.2. Cây mẹ lấy vật liệu Hai dòng Bạch đàn UE35 và UE56 là cây trội được chọn từ các tổ hợp lai U29E2 và U29E4, đây là những tổ hợp lai thuộc nhóm có sinh trưởng nhanh thích hợp cho trồng rừng trên đất nghèo dinh dưỡng đồi núi miền Bắc. Dòng UE35 được tạo ra từ đề tài lai giống Bạch đàn (Lê Đình Khả, 2001), đã qua khảo nghiệm giống. Cây lấy mẫu là cây 1,5 tuổi trồng tại Trung tâm giống cây rừng thuộc viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam và chồi gốc của cây 3 năm trồng thí nghiệm tại Cẩm Quỳ (Hà Nội) (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001) và (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, Ngô Minh Chí, 2007). 29 2.2.3. Vật liệu nuôi cấy (mẫu cấy) Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng. Mẫu được lấy ở chồi 15 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Chồi được cắt bỏ phần ngọn non, một phần cuống lá mà toàn bộ phiến lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 1,5 - 3cm, đường kính từ 2 - 3mm mang từ 2-3 nách lá, trong đoạn từ lá thứ 3 - 6. Đề tài tiến hành nghiên cứu ở phòng thí nghiệm và vườn ươm tại Trung tâm nghiên cứu giống cây lâm nghiệp thuộc Viện khoa học Việt Nam và khu nuôi cấy mô tế bào - Viện khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 2.3. Nội dung nghiên cứu Để đạt được mục đích nghiên cứu, đề tài thực hiện các nội dung sau đây: 1. Khử trùng mẫu vật nuôi ở các nồng độ khác nhau của HgCl2 và Ca (0Cl)2 trong các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra chất khử trùng mẫu thích hợp. 2. Nuôi cấy mẫu trong 5 loại môi trường và xác định môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh chồi. 3. Thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin B2 tới hệ số nhân chồi (HSNC) và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH) của quá trình nuôi cấy. 4. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng phối hợp của chúng đến HSNC và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH). 5. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng của chúng đến hiệu quả của giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (giai đoạn tạo rễ). 6. Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm. 30 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu giống nuôi cấy mô hai dòng Bạch đàn UE35 và UE56 Dòng tuyển chọn  Tạo cây hom  Khử trùng mẫu (Bằng dung dịch HgCl2 hoặc Ca (ClO)2 hay các hoá chất có tính diệt khuẩn khác ở các nồng độ khác nhau)  Tạo chồi ban đầu (Xác định môi trường tái sinh chồi thích hợp)  Nhân chồi (Xác định môi trường nhân chồi thích hợp được bổ sung các chất kích thích sinh trưởng như BAP và Kinetin ở các nồng độ khác nhau)  Tạo rễ (Tạo rễ in-vitro: Xác định môi trường và phương pháp ra rễ hiệu quả)  Vƣờn ƣơm * Cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt. Khử trùng mẫu bằng chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn được tiến hành qua các bước:  Rửa xà phòng loãng  Rửa dưới vòi nước chảy  Tráng nước cất  Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5 - 15 phút  Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất từ 3-5 lần  Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được thực hiện trong buồng cấy vô trùng 31 * Tạo và nhân nhanh chồi Là giai đoạn kích thích mô cấy phát sinh hình thành nhiều chồi. Vấn đề là phải xác định được môi trường nuôi cấy và điều kiện nuôi cấy thích hợp để có hiệu quả cao nhất. + Tái sinh chồi ban đầu từ mẫu nuôi cấy: Tiến hành cấy trên các môi trường khác nhau như WPM, MS, MS* (môi trường MS cải tiến), WV3, Litvay có bổ sung agar 7 g/l, đường 30 g/l và độ pH của các môi trường được điều chỉnh đến 6. + Nhân chồi: trên cơ sở thí nghiệm tái sinh chồi ban đầu, tiếp tục thử nghiệm môi trường tối ưu cho quá trình nhân nhanh chồi bằng cách thay đổi thành phần chất khoáng và sự có mặt của Cytokynin (BAP, Kinetin) riêng rẽ hay phối hợp. + Tạo rễ và huấn luyện: là giai đoạn chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ để có thể hoàn chỉnh hoặc có thể ra rễ trực tiếp trên cát trong nhà kính. Chọn các chồi đủ tiêu chuẩn về chiều cao, chất lượng nuôi cấy trên các môi trường tạo rễ hoặc cho ra rễ trực tiếp, mục đích là để tìm ra môi trường thích hợp để tạo cây con hoàn chỉnh. Sau đó cây con được huấn luyện để thích nghi với điều kiện bên ngoài. + Đưa cây in vitro ra điều kiện bên ngoài: Để tìm giá thể thích hợp cho cây con có tỷ lệ sống cao khi đưa ra ngoài điều kiện tự nhiên tiến hành các thí nghiệm về thành phần ruột bầu. 2.4.1. Chọn loại môi trường phù hợp Tiến hành cấy mẫu đã được khử trùng vào ống nghiệm chứa 5 môi trường có bổ sung Sucroser 30g/l, agar 5g/l (không bổ sung chất điều hoà sinh trưởng) là: 1. Môi trường Litvay (Litvay, 1985) phụ biểu 1 [34] 2. Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) phụ biểu 2 [31] 3. Môi trường MS cải tiến (có bổ sung thêm vitamin và khoáng chất) (Murashige & Skoog medium including Nitsch vitamin, 1969) phụ biểu 3 [32] 4. Môi trường WPM (Mccown Woody Plant medium, 1980) phụ biểu 4 [20] 5. Môi trường WV3 (Westvaco WV3 medium) phụ biểu 5 [29] 2.4.2. Ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu Kết quả tổng hợp các mùa thí nghiệm khử trùng mẫu cho 2 dòng UE35 và UE56. Kết quả được tổng hợp dựa trên số liệu thu thập được kế thừa từ công trình “Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch đàn urophyla, 32 Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế bào - chủ nhiệm đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện. 2.4.3. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến hệ số nhân chồi và tỷ lệ chồi hữu hiệu Để xác định vai trò của vitamin B2 đối với sự sinh trưởng và phát triển của chồi, môi trường nhân chồi có sự bổ sung thêm là MS* + 30g/l đường + 5,5g/l agar, pH = 6,5 với 5 mức nồng độ như sau: Bảng 2.1: Công thức ảnh hƣởng của vitamin B2 đến khả năng nhân chồi Công thức Thành phần môi trường ĐC MS* + 1.0 mg/l B2 CT2 MS* + 2.0 mg/l B2 CT3 MS* + 3.0 mg/l B2 CT4 MS* + 4.0 mg/l B2 CT5 MS* + 5.0 mg/l B2 2.4.4. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến hệ số nhân chồi (HSNC) và chất lượng chồi (TLCHH) Các thí nghiệm được sử dụng riêng lẻ một chất điều hoà sinh trưởng hoặc phối hợp 2 hoặc 3 chất ở các nồng độ khác nhau. Những thí nghiệm được sử dụng phối hợp thì có những chất được cố định nồng độ, chỉ một chất có nồng độ thay đổi. Khi đó việc xử lý số liệu được đưa về dạng ảnh hưởng của một nhân tố đến HSNC và TLCHH. 2.4.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH Từ môi trường tốt nhất cho nhân chồi ở các thí nghiệm về ảnh hưởng của vitamin B2 (MS* + 30g/l đường + 5,5 g/l agar + mg/l B2) đề tài tiến hành bổ sung BAP ở các mức nồng độ thay đổi như sau: Bảng 2.2: Công thức thí nghiệm nhân chồi Công thức Thành phần môi trường ĐC MS* 33 CT7 MS* + 1.0 mg/l BAP CT8 MS* + 2.0 mg/l BAP CT9 MS* + 3.0 mg/l BAP CT10 MS* + 4.0 mg/l BAP 2.4.4.2. Ảnh hưởng của nồng độ BAP+IAA đến HSNC và TLCHH Đề tài tìm hiểu ảnh hưởng của auxin đến quá trình phát sinh chồi có sự tương tác với BAP. Tìm ra môi trường thích hợp cho nhân chồi của 2 dòng này, đề tài tiến hành bổ sung IAA với các nồng độ khác nhau vào môi trường là: MS* + 30g/l đường + 5,5 g/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP (môi trường này xác định là môi trường có HSNC và TLCHH cao nhất ở thí nghiệm trên), nồng độ IAA thay đổi là: Bảng 2.3: Công thức thí nghiệm nhân chồi Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng CT IAA CT 11 ĐC 0 CT 12 MS* + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l CT 13 1,0 mg/l CT 14 1,5 mg/l CT 15 2,0 mg/l CT 16 MS* + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l CT 17 1,0 mg/l CT 16 1,5 mg/l CT 19 2,0 mg/l CT 20 MS* + 3 mg/l BAP + 0,5 mg/l CT 21 1,0 mg/l CT 22 1,5 mg/l CT 23 2,0 mg/l CT 24 MS* + 4 mg/l BAP + 0,5 mg/l CT 25 1,0 mg/l CT 26 1,5 mg/l CT 27 2,0 mg/l 2.4.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + NAA đến HSNC và TLCHH Song song với việc nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và IAA, đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của BAP và NAA đến HSNC và TLCHH 34 của 2 dòng nghiên cứu. Môi trường MS* + 30g/l đường + 5,5 g/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + bổ sung NAA ở các nồng độ khác nhau. Bảng 2.4: Công thức thí nghiệm nhân chồi Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng NAA ĐC ĐC 0 CT 29 MS* + mg/l BAP+ 0,5 mg/l CT 30 1,0 mg/l CT 31 1,5 mg/l CT 32 2,0 mg/l 2.4.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và TLCHH Bên cạnh các thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp nồng độ BAP với auxin, đề tài tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp BAP + Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi của 2 dòng. Môi trường là: MS* + 30g/l đường + 5,5 g/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP và bổ sung Kinetin ở các nồng độ mg/l thay đổi là: Bảng 2.5: Công thức thí nghiệm nhân chồi Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng Kinetin ĐC ĐC 0 CT 34 MS* + mg/l BAP + 1,0 mg/l CT 35 2,0 mg/l CT 36 3,0 mg/l CT 37 4,0 mg/l 2.4.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ BAP + Kinetin + NAA đến HSNC và TLCHH 35 Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi đã thu được môi trường MS* + 30mg/l đường + 5,5 mg/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA là tốt nhất cho HSNC và TLCHH của 2 dòng. Tuy nhiên, để tìm ra môi trường thích hợp hơn cho nhân nhanh chồi. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Kinetin với tổ hợp BAP và NAA. Kinetin được bổ sung vào môi trường MS* + 30mg/l đường + 5,5 mg/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA với hàm lượng thay đổi là: Bảng 2.6: Công thức thí nghiệm nhân chồi Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng Kinetin ĐC ĐC 0 CT 39 MS* + mg/l BAP + mg/l NAA + 0,5 mg/l CT 40 1,0 mg/l CT 41 1,5 mg/l CT 42 2,0 mg/l 2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ IBA được bổ sung vào môi trường 1/2 MS* + 15 mg/l đường + 5 g/l agar, pH = 6,5. IBA ở nồng độ thay đổi là: Bảng 2.7: Công thức thí nghiệm ra rễ Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng IBA ĐC ĐC 0 CT 44 1/2 MS* + 1,0 mg/l CT 45 2,0 mg/l CT 46 3,0 mg/l CT 47 4,0 mg/l 36 2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều dài trung bình của rễ Để xác định ảnh hưởng của nồng độ IBA và ABT1 đến quá trình hình thành rễ của hai dòng UE35 và UE56, đề tài bổ sung ABT1 vào môi trường 1/2MS*+ 30g/l đường + 5,0g/l agar + mg/l IBA + nồng độ ABT thay đổi như sau: Bảng 2. 8: Công thức thí nghiệm ra rễ Công thức Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng ABT1 ĐC ĐC 0 CT 44 1/2 MS* + mg/l IBA + 1,0 mg/l CT 45 2,0 mg/l CT 46 3,0 mg/l CT 47 4,0 mg/l 2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở vườn ươm Trước khi đưa cây con trong ống nghiệm ra trồng ở vườn ươm, đề tài chuyển các bình cây (cây hoàn chỉnh ở trong bình) ra môi trường bên ngoài, mục đích để cây con làm quen dần với điều kiện ngoài vườn ươm (gọi là giai đoạn huấn luyện). Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cường độ ánh sáng từ 5.000 - 10.000 lux, không cho ánh nắng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây. Nhằm xác định thời gian huấn luyện cây con để có thể rút ngắn hoặc kéo dài so với sản xuất. Chúng tôi thử nghiệm 5 khoảng thời gian huấn luyện cây con. Huấn luyện cây để ở ánh sáng và nhiệt độ trong điều kiện tự nhiên: - Không huấn luyện (0 ngày) - 4 ngày - 12 ngày - 16 ngày 37 Sau khi huấn luyện, cây con được trồng ra bầu khoảng 4 tuần thì tiến hành đo đếm tỷ lệ sống, chiều cao và sinh trưởng của cây để đánh giá ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây trong giai đoạn vườn ươm. Quá trình lấy cây con ra khỏi bình, trồng cây vào bầu đất và chăm sóc cây ngoài vườn ươm được tiến hành theo các bước kỹ thuật được thực hiện tại Trung tâm giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam và khu công nghệ tế bào Viện khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. 1. Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nhựa PE có đường kình 5,5 cm, cao 11 cm, có đục lỗ dưới đáy. Thành ruột bầu là đất tầng B 100% đập nhỏ, sàng bỏ rễ cây và các tạp chất khác. 2. Xử lý bầu: Trước khi cấy 1-2 ngày, bầu đất được xử lý khử trùng mầm bệnh bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hoà thuốc tìm vào nước và dùng ô doa tưới lên bề mặt bầu cho thấm sâu 2-3cm). 3. Lấy cây ra khỏi bình và cấy vào bầu - Tạo hỗn hợp hồ rễ: Trộn đất tầng B với dung dịch thuốc tím 0,1% với tỷ lệ thể tích đất/dung dịch thuốc tím = 1/1 trước khi ra cây 12-24 giờ. - Lấy cây ra khỏi bình: cây mầm lấy từ trong lọ đổ ra lòng bàn tay, nhặt từng cây ra khỏi môi trường nuôi cấy và rửa sạch. Nhúng rễ cây vào hỗn hợp hồ rễ - Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất đã được xử lý và để bay hơi sau 1 ngày. 4. Chăm sóc cây sau khi cấy: Cây sau khi cấy được che bằng lưới đen (độ tàn che 50-60%) 10-15 ngày sau khi cấy. Sau 2 tuần tưới phân NPK tỷ lệ (5:10:3) nồng độ 0,3%, sau khi tưới rửa lại bằng nước sạch. Phun phòng nấm bệnh bằng dung dịch Bellate nồng độ 5g/10 lít nước, 1 tuần một lần. Thu thập tỷ lệ sống và đo chiều cao của cây sau khi cấy 4 tuần. 2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện nhân tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau: 38 - Ánh sáng: Mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng từ 1500 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ngày. - Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì từ 23-250C (±2) - Độ ẩm thường xuyên xấp xỉ 60% 2.4.5. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên theo khối với 3 lần lặp (Andrew. I, 1991, số 71, 39 trang). Với thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng, thí nghiệm chọn loại môi trường, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu (ống nghiệm, đánh giá kết quả sau 4 tuần nuôi cấy qua HSNC). Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 6 mẫu. Môi trường chứa trong bình tam giác, đánh giá kết quả HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy. Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường tạo rễ, mỗi công thức theo dõi 10 bình, mỗi bình 30 chồi. Môi trường được chứa trong bình trụ đường kính 6cm hoặc 10cm, chiều cao 15 - 20 cm, với nắp nilong quấn nịt cao su kép. Thu thập tỷ lệ ra rễ, số rễ tạo thành và chiều dài của rễ sau 2 tuần nuôi cấy. Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao của cây con ở vườn ươm, mỗi công thức theo dõi 30 bình và đo đếm 30 cây tại vườn ươm. 2.4.6. Thu thập và xử lý số liệu * Thu thập số liệu + Các chỉ tiêu đo đếm trong phòng thí nghiệm: 1. Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = Tổng số mẫu nhiễm x 100 Tổng số mẫu ban đầu 2. Tỷ lệ mẫu sống (%) = Tổng số mẫu sống x 100 Tổng số mẫu ban đầu 3. Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = Tổng số mẫu nảy chồi x 100 Tổng số mẫu thí nghiệm 39 4. Chiều cao trung bình của chồi (cm) = Tổng chiều cao chồi Tổng số chồi đo đếm 5. Hệ số nhân chồi = Tổng số chồi mới hình thành Tổng số chồi ban đầu 6. Tỷ lệ ra rễ (%) = Tổng số chồi ra rễ x 100 Tổng số chồi nuôi cấy 7. Chiều dài rễ trung bình (cm) = Tổng chiều dài rễ Tổng số rễ đo đếm 8. Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng số cây sống x 100 Tổng số cây ban đầu Số liệu thu được nghi chép trong bảng biểu và xử lý trên máy tính bằng phần mềm thống kê Excel (theo Nguyễn Hải Tuất và Ngô Kim Khôi, 1996). Một số công thức tính toán: - Số trung bình mẫu: X = Error! Objects cannot be created from editing field codes.Error! Objects cannot be created from editing field codes. - Phương sai: Sd2 = Error! Objects cannot be created from editing field codes.Error! Objects cannot be created from editing field codes.) 2 - Hệ số biến động: V% = Sd x 100 Xtb * Xử lý số liệu - Vẽ biểu đồ và tính các giá trị trung bình được thực hiện trên phần mềm Excel - Để kiểm tra ảnh hưởng của các nhân tố thí nghiệm bằng phương pháp phân tích phương sai một nhân tố theo phần mềm SPSS 11.5. Tiêu chuẩn Duncan được dùng để phân nhóm và tìm công thức thí nghiệm tốt nhất là: Giả thiết H0: nhân tố A có tác động một cách đồng đều (ngẫu nhiên) đến kết quả thí nghiệm khi đó: α1= α2=...= αa = 0 hoặc μ1= μ2 = …..= μa = μ Giả thiết H1: Tác động của nhân tố A là không đồng đều ở tất cả các cấp khi đó có ít nhất là có một αi ≠ 0. 40 Nếu giá trị Sig của F 0,05 thì chấp nhận H1 với: n A Va Van F )1( )(    . Trong đó: - VA: là biến động giữa các trị số trung bình mẫu: cxnVVV a i iiNTA   1 2 - VT là biến động toàn bộ của n trị số quan sát: cXV a ji n Þ ijT i   1 2 - VN là biến động giữa các trị số quan sát cùng một mẫu.       1 2 1 2 i ii a li ni Þ ijN cXnaXV Với những thí nghiệm có phương sai tổng thể không bằng nhau thì không dùng so sánh phương sai mà chúng tôi sử dụng tiêu chuẩn Tamhane,s T2 để xác định sự sai khác. Với tiêu chuẩn này nếu 2 công thức có sự sai khác sẽ được được đánh dấu * ở kết quả phân tích số liệu. 41 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khử trùng mẫu cấy Hiện nay, HgCl2 đang được sử dụng để khử trùng mẫu trong nhân giống in vitro cây Bạch đàn ở nhiều phòng thí nghiệm. Hầu hết, khi khử trùng bằng HgCl2 đều cho tỷ lệ mẫu sống cao, tuy nhiên đây là chất được xếp vào nhóm chất độc hại số 1 đối với cơ thể con người. Trong khi đó Ca(OCl)2 cũng được một số tác giả sử dụng để khử trùng mẫu và ít độc hại cho con người (Coke J. E, 1996). Đề tài sử dụng 2 loại hoá chất là HgCl2 và Ca(OCl)2. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả được trình bày ở bảng và đồ thị sau: Bảng 3.1a. Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE35 (180 mẫu) Hoá chất Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) % mẫu chết % mẫu nhiễm % mẫu sống HgCl2 0,1 8 10,0 61,7 28,3 10 13,0 40,6 46,4 12 38,9 31,3 30,0 Ca(OCl)2 3.0 20 7,8 67,8 24,4 30 13,3 58,9 27,8 40 18,9 48,9 32,2 Qua bảng 3.1a cho thấy việc tạo vật liệu khởi đầu có khử trùng từ chồi nách của dòng UE35 là tương đối khó, mẫu có tỷ lệ nhiễm cao. - Khử trùng bằng Ca(OCl)2 khi tăng thời gian khử trùng thì mẫu nhiễm giảm, số mẫu chết tăng do quá thời gian khử trùng. tỷ lệ mẫu cao nhất là 40 phút (mẫu sống 32,2%), mẫu nhiễm cao nhất là thời gian 20 phút (67,8%), bên cạnh đó thì thời gian khử trùng ảnh hưởng yếu đến tỷ lệ mẫu sống. Từ kết 42 quả đó thấy Ca(OCl)2 là chất khử trùng bề mặt yếu đối với dòng UE35 (tỷ lệ mẫu chết thấp, tỷ lệ mẫu nhiễm cao dẫn đến tỷ lệ mẫu sống rất thấp). - Khử trùng bằng HgCl2: với thời gian khử trùng tăng (8, 10, 12 phút) tỷ lệ mẫu nhiễm đối với dòng UE35 giảm từ 61,7 xuống 31,1% và bên cạnh đó thì mẫu chết lại tăng từ 10,0% đến 38,9%. Tỷ lệ mẫu sống và tái sinh tăng khi thời gian từ 10-12 phút. Bảng 3.1b: Tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE56 (180 mẫu) Hoá chất Nồng độ (%) Thời gian khử trùng (phút) % mẫu chết % mẫu nhiễm % mẫu sống HgCl2 0,1 8 13,3 54,4 32,3 10 18,9 35,0 46,1 12 43,3 29,4 27,3 Ca(OCl)2 3.0 20 11,1 61,7 27,2 30 16,1 55,6 28,3 40 21,1 44,4 34,5 Từ bảng 3.1b ta thấy tỷ lệ mẫu nhiễm chiếm 35% của HgCl2 và 44,4% Ca(OCl)2, qua đó thấy việc khử trùng đối với dòng UE56 là tương đối khó. Với HgCl2 tỷ lệ mẫu nhiễm giảm từ 54,4% xuống 35,0% và 29,4% số mẫu chết tăng từ 13,3% đến 19,8% và 43,3%. Tỷ lệ tái sinh của mẫu và mẫu sống tăng trong khi thời gian khử trùng lên 10 phút và giảm ở thời gian khử trùng là 12 phút. Qua hai bảng của hai dòng UE35 và UE56 thấy HgCl2 có tính khử trùng mạnh hơn Ca(OCl)2 do đó dung dịch khử trùng này cũng gây tổn thương mạnh đến mô nuôi cấy, đồng thời tỷ lệ chết cao hơn và tỷ lệ chồi sống sót cũng cao hơn rất nhiều. Với HgCl2 nồng độ 0,1%, ở thời gian 10 phút có kết quả tốt nhất ở cả hai dòng. Nên đề tài chọn khử trùng bằng HgCl2 0,1%. 43 Ảnh 3.1. Khử trùng mẫu và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày 3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu Bảng 3.2: Bảng ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi Tháng Dòng UE35 Dòng UE56 Thời gian bật chồi Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) 1 - 3 53,84 3,24 45,22 2,15 32 ngày 4 - 6 52,56 12,53 41,35 13,10 28 ngày 7 - 9 42,91 15,76 46,22 16,05 27 ngày 10 - 12 65,24 4,25 50,05 5,63 36 ngày Kết quả thí nghiệm cho thấy, dòng UE35 tháng 4-6 kết quả khử trùng với chỉ số tỷ lệ mẫu nhiễm là 52,56%, tỷ lệ mẫu bật chồi là 12,53% trong 28 ngày và tháng 7-9 mẫu nhiễm là 42,9%, mẫu bật chồi là 15,76% ở thời gian này trong năm với thời gian là 27 ngày mẫu đạt tỷ lệ tốt nhất; dòng UE56 ở tháng 4-6 kết quả khử trùng với chỉ số tỷ lệ mẫu nhiễm là 41,35, tỷ lệ mẫu bật chồi là 13,10 trong 28 ngày và tháng 7-9 mẫu nhiễm là 46,22, mẫu bật chồi là 16,05 ở thời gian này trong năm với thời gian là 27 ngày mẫu đạt tỷ lệ tốt nhất. Cũng như một số giống cây rừng nói chung, thời gian khử trùng mẫu thích hợp nhất là từ tháng 4 đến tháng 10 hàng năm. Trong khoảng thời gian này, kết quả khử trùng đạt được là cao nhất (tỷ lệ nhiễm 44 thấp, tỷ lệ bật chồi cao và thời gian bật chồi cũng ngắn nhất) do đây là thời điểm sinh trưởng thích hợp của các đối tượng nghiên cứu. Tuy nhiên, để xác định chính xác thời gian thích hợp nhất cho các thí nghiệm khử trùng, đề tài tiếp tục các thí nghiệm lặp lại trong thời gian tới. Nhằm tối ưu hoá từng khâu trong quá trình nhân giống để xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nhân giống cho các đối tượng nghiên cứu. 3.3. Nghiên cứu loại môi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi Để có sự thành công đối với nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thì giai đoạn quan trọng đó là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho đối tượng cần nhân giống. Với các công bố về môi trường nhân giống cây Bạch đàn còn hạn chế, thêm vào đó chưa có môi trường cụ thể nào và có độ tin cậy cao cho dòng Bạch đàn lai. Do vậy, đề tài thử nghiệm một số môi trường, sử dụng để nhân giống các loài cây thân gỗ. Từ đó chọn ra môi trường thích hợp cho nghiên cứu hai dòng Bạch đàn trên. Trong điều kiện nuôi cấy mô tế bào HSNC và TLCHH phụ thuộc vào thành phần môi trường, nồng độ chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy. Các nghiên cứu giai đoạn này nhằm tìm ra được môi trường thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh chồi, giai đoạn có vai trò quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân giống. Kết quả được trình bày bảng dưới đây. Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của 5 loại môi trƣờng đến HSNC và TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trƣờng) Loại môi trường Dòng UE35 Dòng UE56 Số chồi thu được HSNC (lần) Số chồi thu được HSNC (lần) Litvay 200 1,11 192 1,07 WPM 184 1,02 170 0,94 MS * 213 1,18 211 1,17 MS 173 0,96 165 0,92 WV3 195 1.08 186 1,03 (MS *: là môi trường MS cải tiến có bổ sung thêm một số vitamin và khoáng chất) 45 Từ bảng 3.3 đề tài nhận thấy rằng: HSNC cao nhất ở môi trường MS*, với dòng UE35 là 1,18 lần và 1,17 lần ở dòng UE56, thấp nhất ở môi trường MS (dòng UE35=0,96 và dòng UE56= 0,92). Môi trường MS* là môi trường nuôi cấy cây thân gỗ nói chung, môi trường này đã được nhiều tác giả trong và ngoài nước sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhóm tác giả Đoàn Thị Mai và cs của Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam đã nghiên cứu môi trường này thành công cho cây Keo lai, một số dòng Bạch đàn lai (Đoàn Thị Mai và cs, 1998); (Đoàn Thị Mai, cs, 2000), Viện sinh học nhiệt đới (Trần Văn Minh, 1994) đã sử dụng môi trường này đề nhân giống cây Trầm qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng sau khi đã so sánh với môi trường MS. Một số tác giả New Dilan cũng đã sử dụng để nuôi cấy chồi đối với một số loài Thông (Coke J. E, 1996). Để kiểm tra sự sai khác, chúng tôi so sánh phương sai về ảnh hưởng của loại môi trường nuôi cấy đến HSNC của cả hai dòng UE35 và UE56 được kết quả như sau (phụ lục 07). - Phương sai tổng thể của HSNC ở hai dòng đều > 0,05 (dòng UE35 có Sig = 0,139; dòng UE56 = 0,378) điều này cho thấy phương sai của các biến ngẫu nhiên ở dòng UE35 là bằng nhau và dòng UE56 cũng bằng nhau. - Phân tích phương sai với cả hai dòng thu được giá trị Sig của F đều bằng 0,00 < 0,05. Như vậy, HSNC ở các công thức môi trường có sự khác nhau rõ rệt. - Bảng phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan cho thấy môi trường MS* nằm trong nhóm tốt nhất, trong 5 công thức thí nghiệm với cả hai dòng UE35 và UE56 với α = 0,05 (độ tin cậy 95%). - Như vậy môi trường MS* thích hợp nhất cho tạo chồi và nhân nhanh chồi cho 2 dòng bạch đàn này. Môi trường này được đề tài sử sụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 46 Ảnh 3.2. Dòng 35 cấy trong 5 loại môi trƣờng (Từ trái qua phải: Môi trường Litvay, MS, MS*, WPM, WV3) 3.4. Ảnh hƣởng của việc bổ sung vitamin B2 vào môi trƣờng MS* đến HSNC và TLCHH Vitamin đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhân giống nuôi cấy mô, tế bào các loài cây trồng nói chung. Chúng chiếm hàm lượng rất nhỏ trong cá thể thực vật nhưng là chất không thể thiếu trong sinh trưởng và phát triển. Trong môi trường MS * đã có các vitamin cần thiết như B1, B6, nhưng không có vitamin B2, một vitamin quan trọng cho sinh trưởng và sự phát triển của thực vật (đặc biệt là Bạch đàn). Hiện nay, một số nơi sản xuất giống cây Bạch đàn bằng phương pháp nuôi cấy mô, đang sử dụng vitamin B2 để bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Đề tài bổ sung B2 vào môi trường MS* + 30 g/l đường + 4,5 g/l agar, pH=6,5. Sau 4 tuần nuôi cấy, kết quả thu được trình bày ở bảng sau: Kết quả bảng 3.3 và đồ thị 3a và 3b cho thấy: ở công thức đối chứng (hàm lượng vitamin B2 = 0 mg/l) thì HSNC và TLCHH thấp, dòng UE35 có HSNC và TLCHH lần lượt là 1,19 lần và 12,6%, dòng UE56 là 1,15 lần và 12,1%. HSNC và TLCHH tăng khi bổ sung B2 với nồng độ 1,0 mg/l (dòng 35 có HSNC = 1,42 lần, TLCHH = 14,9%); dòng UE56 có HSNC = 1,38 lần, TLCHH = 16,1%. Khi bổ sung nồng độ 2,0 mg/l HSNC tăng thấp so với nồng độ 1,0 mg/l, dòng UE35 là 1,44; dòng UE56 là 1,39. Nhưng TLCHH tăng đó là: (18,1% và 17,9% ở hai dòng). Khi bổ sung B2 tăng hơn nữa ở các nồng độ 3,0 và 4,0 mg/l thì HSNC và TLCHH khôn