Luận văn Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo và nhân giống lợn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------ NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM ------------------ NGUYỄN THỊ HẬU NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ĐÔNG LẠNH TINH DỊCH LỢN DẠNG CỌNG RẠ PHỤC VỤ TẠO VÀ NHÂN GIỐNG LỢN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Chăn nuôi Mã số: 606240 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : 1. TS. Nguyễn Mạnh Hà 2. TS. Đào Đức Thà THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Lời cảm ơn Để hoàn thành báo cáo tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực phấn đấu của bản thân, tôi còn nhận đƣợc sự giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình của nhiều cá nhân, đơn vị và tập thể khác. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo TS. Nguyễn Mạnh Hà Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên và TS. Đào Đức Thà Phó Bộ môn Sinh lý sinh hóa và tập tính vật nuôi Viện Chăn nuôi Quốc gia, những ngƣời đã dành nhiều thời gian, tâm huyết chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập. Tôi xin gửi tới các thầy giáo, cô giáo trong trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên nói chung, khoa Chăn nuôi nói riêng những ngƣời đã giúp đỡ, giảng dạy tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Chăn nuôi và toàn thể cán bộ công nhân viên của Viện, đặc biệt các anh, các chị là cán bộ trong Bộ môn Sinh lý sinh hóa và tập tính vật nuôi Viên chăn nuôi, Trung tâm thực nghiệm và bảo tồn vật nuôi Viện chăn nuôi và Phòng thí nghiệm công nghệ tế bào động vật Viện Chăn nuôi, những ngƣời luôn hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành tốt đề tài này. Xin bày tỏ lòng biết ơn tới ngƣời thân, bạn bè và đồng nghiệp luôn ở bên tôi, luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên và thực tập tại Viện Chăn nuôi! Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2009 Sinh viên Nguyễn Thị Hậu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 LỜI CAM ĐOAN T«i xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña riªng t«i. C¸c sè liÖu, kÕt qu¶ nªu trong luËn v¨n lµ trung thùc vµ ch•a tõng ®•îc ai c«ng bè trong bÊt k× c«ng tr×nh nµo kh¸c. T«i xin cam ®oan r»ng c¸c th«ng tin trÝch dÉn trong luËn v¨n ®Òu ®· ®•îc chØ râ nguån gèc. Tác giả Nguyễn Thị Hậu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT A ( Progressive. Motility ) ASTT C cs ctv DAP DCL DSL I ( Immotile) Motility NST L ( Local motility ) TTNT TTON V VAC VCL VAP VSL : Hoạt lực của tinh trùng : Áp suất thẩm thấu : Nồng độ tinh trùng : Cộng sự : Cộng tác viên : Độ dài đƣờng trung bình : Độ dài đƣờng ziczăc : Độ dài đƣờng thẳng : Tinh trùng không hoạt động : Hoạt động của tinh trùng : Nhiễm sắc thể : Tinh trùng hoạt động tại chỗ : Thụ tinh nhân tạo : Thụ tinh ống nghiệm : Lƣợng tinh dịch trong một lần lấy tinh : Tổng số timh trùng tiến thẳng : Tốc độ chuyển động theo đƣờng ziczăc : Tốc độ chuyển động theo đƣờng trung bình : Tốc độ chuyển động theo đƣờng thẳng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Một số chỉ tiêu chất lƣợng tinh nguyên trƣớc đông lạnh ............... 52 Bảng 3.2. Khoảng cách và vận tốc của tinh trùng ở các giống lợn ................ 58 Bảng 3.3. Đặc điểm của môi trƣờng ly tâm (n=60) ....................................... 59 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của hai môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng ..... 60 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Landrace. ...................................................................................... 62 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Yorkshire...................................................................................... 62 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của ... 63 giống lợn Duroc ........................................................................................... 63 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến sức sống của tinh trùng……….65 Bảng 3.9. Sức sống tinh trùng sau ly tâm của các giống lợn ......................... 67 Bảng 3.10. Đặc điểm môi trƣờng cân bằng (n= 60) ...................................... 68 Bảng 3.11. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Landrace .............. 69 Bảng 3.12. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Yorkshire ............. 70 Bảng 3.13. Chất lƣợng tinh dịch sau cân bằng của giống Duroc ................... 70 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của thời gian đông lạnh đến sức sống của tinh trùng 71 (n= 70) ......................................................................................................... 71 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của thời gian giải đông đến sức sống tinh trùng ..... 73 (n=70) .......................................................................................................... 73 Bảng 3.16. Chất lƣợng tinh dịch đông lạnh sau giải đông của các giống lợn 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ Biểu đồ 3.1: Biểu đồ so sánh thể tích tinh dịch của các giống lợn................ 53 Biểu đồ 3.2: Biểu đồ so sánh hoạt lực tinh trùng của các giống .................. 54 Biểu đồ 3.3: Biểu đồ so sánh nồng độ C (tr/ml) của các giống..................... 55 Biểu đồ 3.4: Biểu đồ so sánh VAC (tỷ) trong một lần lấy tinh ...................... 56 Biêủ đồ 3.5: Biêủ đồ so sánh Motility (%), A (Progressive.Motility %) tinh trùng trong 2 môi trƣờng ly tâm ................................................................... 61 Biêủ đồ 3.6: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng ở tinh nguyên và tinh pha trong môi trƣờng ly tâm (VCN). ............................................................ 64 Biêủ đồ 3.7: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A ) tinh trùng ở các chế độ ly tâm .... 66 Biêủ đồ 3.8: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng trƣớc, và sau đông lạnh ở thời gian đông lạnh 10 phút và 20 phút......................................................... 72 Biêủ đồ 3.5: Biểu đồ so sánh hoạt lƣc (A) tinh trùng ở thời gian giải đông 30 giây và 45 giây ............................................................................................. 74 Biêủ đồ 3.10: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng sau giải đông ở các giống lợn ...................................................................................................... 76 Biêủ đồ 3.11: Biểu đồ so sánh độ dài các chuyển động của tinh trùng ........ 77 Biêủ đồ 3.12: Biểu đồ so sánh vận tốc chuyển động của tinh trùng ở các dạng vận động ....................................................................................................... 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ..................................................................................................... 10 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI ............................................................ 10 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ..................................................................... 11 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI ........................ 11 CHƢƠNG 1 ................................................................................................. 12 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 12 1.1. Vai trò của lợn đực giống và thụ tinh nhân tạo trong chăn nuôi lợn ở nƣớc ta ....................................................................................................................... 12 1.2. Cơ sở của những nghiên cứu về tinh dịch và tinh trùng lợn ....................... 13 1.2.3. Một số đặc tính sinh lý của tinh trùng lợn ............................................... 18 1.2.4. Một số chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn ................................................. 24 1.2.5. Các yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh dịch ...................................... 27 1.3. Cơ sở khoa học của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn ................................ 31 1.3.1. Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch .................................... 32 1.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng tới sức sống tinh trùng trong đông lạnh ............... 35 1.3.3. Cơ sở khoa học của môi trƣờng đông lạnh tinh dịch lợn ........................ 37 1.3.4. Cơ sở khoa học về quy trình đông lạnh tinh dịch lợn .............................. 41 1.4. Tình hình nghiên cứu đông lạnh tinh dịch lợn trong nƣớc và ngoài nƣớc . 42 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nƣớc ........................................................... 42 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc ............................................................ 44 CHƢƠNG 2 ................................................................................................. 45 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG ...................................................... 45 VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 45 2.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu................................................................... 45 2.1.1. Tinh dịch lợn đực .................................................................................... 45 2.1.2. Hoá chất và các dụng cụ thí nghiệm. ...................................................... 45 2.2. Yêu cầu ...................................................................................................... 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.............................................................. 45 2.4. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................... 46 2.4.1. Nghiên cứu một số chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng của tinh dịch lợn trƣớc khi đông lạnh .................................................................................................... 47 2.4.3. Nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh .......................................... 51 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu ......................................................................... 51 CHƢƠNG 3 ................................................................................................. 52 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................................. 52 3.1. Kết quả nghiên cứu về một số chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn trƣớc khi đông lạnh. ......................................................................................................... 52 3.2. Kết quả nghiên cứu về kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn ............................ 59 3.2.1.Kết quả nghiên cứu kỹ thuật ly tâm ......................................................... 59 3.2.2. Kết quả nghiên cứu kỹ thuật cân bằng tinh dịch .................................... 68 3.2.3. Kết quả nghiên cứu đông lạnh tinh dịch trong hơi nitơ. .......................... 71 3.2.4. Kết quả nghiên cứu nhiệt độ và thời gian giải đông tinh dịch đông lạnh .......................................................................................................................... 73 Nhƣ vậy kết quả sử dụng tinh đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất cần phải nghiên cứu sâu hơn nhằm nâng cao hiệu quả. Tuy nhiên với kết quả bƣớc đầu nhƣ trên cũng đã khẳng định đƣợc thành công của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn.......................................................................................... 80 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 81 1. KẾT LUẬN .............................................................................................. 81 2. ĐỀ NGHỊ ................................................................................................. 82 I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ........................................................................... 83 II. TÀI LIỆU TIẾNG ANH .......................................................................... 84 III. TÀI LIỆU TIẾNG PHÁP ....................................................................... 87 IV. TÀI LIỆU TIẾNG ĐỨC......................................................................... 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 MỞ ĐẦU 1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI Hiện nay, kỹ thuật thụ tinh nhân tạo gia súc nói chung và kỹ thuật thụ tinh nhân tạo lợn nói riêng đã đƣợc nghiên cứu và áp dụng rộng rãi trên toàn thế giới. Để có vật liệu cung cấp cho thụ tinh nhân tạo, trƣớc hết phải có một quy trình bảo quản nhằm giữ cho tinh trùng vẫn đảm bảo chất lƣợng khi ở ngoài cơ thể. Quy trình đó bao gồm các kỹ thuật nhƣ: kỹ thuật pha loãng, kỹ thuật bảo tồn và kỹ thuật đông lạnh tinh dịch. Trên thế giới, kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất, thành công kỳ diệu về đông lạnh tinh dịch lợn đã đƣa kỹ thuật thụ tinh nhân tạo (TTNT) lên một vị trí mới, đã có những ngân hàng tinh dịch đông lạnh năng suất cao. Sự hiện diện của các ngân hàng tinh dịch đông lạnh đã giúp cho việc vận chuyển, trao đổi, mua bán giống trên thế giới trở nên thuận tiện và giảm nguy cơ lan truyền mầm bệnh. Đồng thời kỹ thuật đông lạnh tinh dịch sẽ góp phần bảo tồn lâu dài tinh dịch của một số giống địa phƣơng quý hiếm. Ở nƣớc ta kỹ thuật đông lạnh tinh dịch bò đã đƣợc nghiên cứu, sản xuất, áp dụng rộng rãi trong sản xuất, tuy nhiên kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn mới bƣớc đầu đƣợc nghiên cứu. Một số nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn theo công nghệ Nhật Bản và Mỹ đã đƣợc tiến hành, bƣớc đầu có kết quả nhƣng chƣa áp dụng trong sản xuất. Để góp phần làm phong phú thêm các kỹ thuật và công nghệ mới trong sinh sản và thụ tinh nhân tạo lợn, đồng thời áp dụng những kết quả nghiên cứu vào sản xuất, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ phục vụ tạo và nhân giống lợn”. Thuộc đề tài công nghệ sinh học cấp nhà nước: “Nghiên cứu ứng dụng tổ hợp công nghệ sinh sản phục vụ công tác tạo và nhân giống lợn”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU - Xác định đƣợc kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ. - Sử dụng tinh dịch đông lạnh dạng cọng rạ trong sản xuất và thụ tinh trong ống nghiệm. 3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI - Đề tài sẽ đề xuất đƣợc một kỹ thuật mới trong kỹ thuật thụ tinh nhân tạo - công nghệ đông lạnh tinh dịch lợn dạng cọng rạ. - Phục vụ chƣơng trình tạo và nhân giống lợn, làm cơ sở và góp phần trong bảo tồn quỹ gen (bảo tồn tinh dịch những giống lợn quý hiếm). - Bổ sung vào tài liệu và nghiên cứu khoa học. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vai trò của lợn đực giống và thụ tinh nhân tạo trong chăn nuôi lợn ở nƣớc ta Lợn đực giống có vai trò quan trọng trong việc đƣa nhanh tiến bộ di truyền. Một con đực giống sử dụng trong thụ tinh nhân tạo cho số con đời sau gấp trên 355 lần so với một con nái, và sử dụng phối giống trực tiếp chỉ cho số con đời sau gấp 40,5 lần so với lợn nái. Ảnh hƣởng của đực giống đến đời sau không chỉ ở phạm vi số lƣợng mà cả ở chất lƣợng, nhiều tính trạng trội của đực giống thƣờng đƣợc biểu hiện ở đời con nhƣ: màu sắc lông, da, thể chất khoẻ mạnh, tính cao sản, sức miễn kháng với bệnh tật. Một số tác giả đã chứng minh sức sống của đời sau cũng phụ thuộc vào sức sống của tinh trùng. Do đó chăn nuôi tốt lợn đực giống là một trong những nhân tố quan trọng trong việc phát triển nâng cao năng suất, chất lƣợng sản phẩm của ngành chăn nuôi lợn. Hiện nay, với sự kế thừa thành tựu của các lĩnh vực sinh lý học, di truyền học, dinh dƣỡng gia súc…… và kết hợp với thực tế chăn nuôi lợn nói chung, chăn nuôi lợn đực giống nói riêng đã không ngừng đƣợc cải thiện và hoàn thiện. Kỹ thuật thụ tinh nhân tạo có những ƣu điểm vƣợt trội sau: - An toàn dịch bệnh: ngăn ngừa bệnh từ con đực truyền sang con cái và ngƣợc lại. - Giảm số lƣợng đực giống phải nuôi - Nâng cao nhanh tiến bộ di truyền cho đời sau, cho phép sử dụng rộng rãi và phát huy tiềm năng di truyền của những đực giống tốt (sử dụng tinh dịch bảo tồn nhiều ngày hoặc tinh dịch đông lạnh) - Theo dõi quản lý giống chính xác và rõ ràng - Rất cần thiết khi áp dụng phƣơng pháp gây động dục hàng loạt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 1.2. Cơ sở của những nghiên cứu về tinh dịch và tinh trùng lợn 1.2.1. Sinh lý sinh dục gia súc đực 1.2.1.1. Sự thành thục tính dục Sự thành thục về tính dục thƣờng biểu hiện sớm hơn sự thành thục về thể vóc. Lợn đực thành thục tính dục vào khoảng 8 tháng tuổi trở lên khi đó khối lƣợng cơ thể đạt 90- 100kg (đối với lợn đực ngoại), từ 6 tháng tuổi trở lên và khối lƣợng cơ thể đạt từ 70- 80kg (đối với lợn lai), từ 5 tháng tuổi trở lên và khối lƣợng cơ thể đạt 45- 50kg (đối với lợn nội). 1.2.1.2. Cấu tạo bộ máy sinh dục lợn đực Hệ sinh dục lợn đực gồm các bộ phận chủ yếu sau: - Bao dịch hoàn: mỗi dịch hoàn đƣợc bao bọc bởi một bao sợi (màng trắng), bên ngoài đƣợc phủ bằng một tinh mạc, bên trong đƣợc phủ bởi một màng mạch máu. - Dịch hoàn (testis) hay còn gọi tinh hoàn: vừa là tuyến nội tiết vừa là tuyến ngoại tiết. Dịch hoàn sản sinh tinh trùng và tiết hormon sinh dục testosteron có tác dụng phát triển đặc điểm giới tính. Cấu tạo của dịch hoàn gồm: + Giáp mạc riêng (tunica vaginalis propria): cấu tạo bởi 1 lớp sợi bền, là phần kéo dài của phúc mạc. + Màng trắng (tunica ablugine a): từ đây phát ra nhiều bức ngăn hình tia, chia dịch hoàn thành nhiều múi. Mỗi múi đều chứa những ống sinh tinh uốn khúc (tubuli abluginea) trong đó tinh trùng đƣợc hình thành. Tất cả các ống sinh tinh đều hƣớng về vách giữa của dịch hoàn. + Mạng tinh (rate testis) và thể Haimo (Highmor): khi đi vào vách giữa của dịch hoàn, những ống sinh tinh uốn khúc biến thành những ống sinh tinh thẳng và đan chéo vào nhau tạo thành mạng tinh. Mạng tinh cùng với vách giữa của dịch hoàn tạo thành thể Haimo. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 - Dịch hoàn phụ (Epididymis): ở lợn đực dịch hoàn phụ rất phát triển, có thể đạt tới 150 – 200 gam ở lợn trƣởng thành, dịch hoàn phụ là cái kho để chứa tinh trùng, có cấu tạo đơn giản: ngoài cùng là một lớp màu trắng, bên trong là một hệ thống ống uốn lƣợn ngoằn ngoèo, tất cả các ống đó tập trung lại đổ vào một cái ống đi ra khỏi đầu dƣới của dịch hoàn phụ gọi là ống dẫn tinh. Tinh trùng không ngừng đƣợc sinh ra ở ống sinh tinh sau đó đi vào dịch hoàn phụ và lƣu lại đó một thời gian. Khi vào dịch hoàn phụ tinh trùng không vận động, không có khả năng thụ tinh. Trong đầu dịch hoàn phụ đuôi tinh trùng có sự rung động nhẹ, tại thân dịch hoàn phụ tinh trùng có tiềm năng chuyển động tiến thẳng nhƣng bị ức chế (môi trƣờng trong dịch hoàn phụ có tính axit yếu, áp suất thẩm thấu cao), trong đuôi dịch hoàn phụ sự trao đổi chất của tinh trùng tăng lên, tinh trùng xuất hiện khả năng hoạt động. Tinh trùng lợn di chuyển qua dịch hoàn phụ quãng 9 - 14 ngày, chia ra đầu dịch hoàn phụ: 3 ngày; thân dịch hoàn phụ: 2 ngày; đuôi dịch hoàn phụ: 4 - 9 ngày. Biến đổi của tinh trùng trong dịch hoàn phụ nhƣ sau: giọt bào tƣơng trƣợt từ vị trí gần tâm xuống vị trí xa tâm trên đoạn giữa của tinh trùng. Hiện tƣợng này xảy ra khi tinh trùng di chuyển từ đầu xuống thân dịch hoàn phụ. Trong đuôi dịch hoàn các giọt bào tƣơng đều ở xa tâm và không còn bám theo tinh trùng khi tinh dịch đƣợc xuất ra ngoài. Khi vào đến dịch hoàn phụ, một số tinh trùng có thể bị kỳ hình, số này giảm xuống khi đi qua vùng gần tâm đến vùng xa tâm của đầu dịch hoàn phụ. Đuôi dịch hoàn phụ làm nhiệm vụ lọc đặc biệt góp phần cải thiện chất lƣợng tinh dịch khi tinh dịch đƣợc xuất ra ngoài. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Nếu có nhiều tinh trùng kỳ hình trong tinh dịch xuất ra, thể hiện chức năng của dịch hoàn phụ kém. Tinh trùng tại đuôi dịch hoàn phụ mới có khả năng gắn chặt vào vùng trong suốt của tế bào trứng để thực hiện quá trình thụ tinh. - Thừng dịch hoàn: thừng dịch hoàn gồm các động mạch và thần kinh đi vào dịch hoàn, chúng cấu tạo bởi các mô liên kết, các hệ cơ vòng và cơ dọc liên kết với nhau. - Dƣơng vật: dƣơng vật nằm ở dƣới vách bụng, đƣợc bắt đầu bằng một trụ, hai đầu bám vào hai mẩu xƣơng ngồi, hƣớng ra phía trƣớc. Dƣơng vật lợn đực có một đoạn cong hình chữ S, nằm kín trong da, khi giao phối mới thò ra ngoài. Đầu dƣơng vật có hình xoắn nhƣ mũi khoan, cách đầu mút 0,5 - 0,7cm có lỗ để phóng tinh ra ngoài. Khi giao phối hay lấy tinh, dƣơng vật thò ra ngoài 20 - 40 cm. 1.2.1.3. Các tuyến sinh dục phụ - Tuyến tinh nang (Tiểu nang, vesicular semen gland): tuyến tinh nang là một cái túi rỗng để chứa tinh trùng, gồm hai tuyến hình trứng, màu vàng nhạt, nằm trong xoang chậu, trên bàng quang và ống dẫn tinh. Tuyến tinh nang tiết ra một chất keo màu trắng hoặc vàng. Chất keo này gặp dịch tiết của tuyến tiền liệt thì kết lại tạo thành một cái nút đóng cổ tử cung sau giao phối, mục đích không cho tinh trùng chảy ngƣợc ra ngoài. Chất keo này còn có thành phần glucoza, axit béo tăng cƣờng dinh dƣỡng, hoạt lực cho tinh trùng. Tuyến này ở lợn có kích thƣớc lớn nhƣng kém đặc chắc. Ở lợn tuyến tiểu nang dài tới 15 - 20 cm, nặng xấp xỉ 850 gam. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 - Tuyến tiền liệt (Prostate gland): động vật nói chung và gia súc đực nói riêng đều có chung tuyến tiền liêt. Tuyến tiền liệt nằm ở phần cuối của ống dẫn tinh và phần đầu của niệu đạo. Tuyến tiền liệt có nhiều lỗ đổ vào niệu đạo, dịch tiết của tuyến không trong suốt, có tính kiềm nhằm tác dụng trung hòa độ axit trong lòng niệu đạo và H2CO3 (axit cacbonic) do tinh trùng sản sinh ra trong quá trình hoạt động. Tuyến tiền liệt phát triển theo lứa tuổi của gia súc. Gia súc non thì tuyến tiên liệt bé, gia súc trƣởng thành thì tuyến tiền liệt phát triển to đồng thời cũng teo đi khi gia súc đã già. Tuyến cầu liệu đạo (Cowper, Glandula bulborethrales): còn có tên gọi là tuyến củ hành, là một tuyến lớn, thon dài 18 cm, nặng khoảng 400 gam, nằm dọc theo đƣờng niệu sinh dục phần xoang chậu. Mặt trên của tuyến Cowper đƣợc bao bọc bởi phần cơ dày, chất bài tiết của tuyến này chính là keo phèn, chất này đặc, keo dính, có tác dụng nút cổ tử cung sau khi lợn đực phóng tinh xong. Tuy nhiên, keo phèn là chất không có lợi cho tinh trùng, vì khi tinh trùng ra ngoài cơ thể, nếu trong tinh dịch có lẫn keo phèn, tinh trùng thƣờng tụ lại nên rất chóng chết. Do đó, khi làm TTNT ngƣời ta lọc bỏ keo phèn ngay sau khi lấy tinh, hoặc lọc bỏ ngay trên phễu khi đang lấy tinh. 1.2.2. Sự tiết tinh dịch ở lợn đực Khi đã thành thục về tính dục (8 - 9 tháng tuổi và khối lƣợng cơ thể đạt 90 - 100 kg), ở lợn đực ngoại ngƣời ta có thể cho phối giống trực tiếp hay lấy tinh bằng tay qua phƣơng pháp nhảy giá. Theo Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993) [12] có thể quan sát thấy lợn đực có 3 giai đoạn xuất tinh rõ rệt nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 - Giai đoạn đầu tiết ra 10 - 20 ml dịch trong suốt không có tinh trùng, chất này có tác dụng rửa đƣờng niệu sinh dục. - Giai đoạn thứ 2 kéo dài 1 - 2 phút, tiết ra khoảng 100 - 120 ml, chất này gồm tinh trùng và các chất phân tiết của các tuyến sinh dục nhƣ tiền liệt, cowper, tinh nang. - Giai đoạn thứ 3: là giai đoạn bài tiết chủ yếu của các tuyến sinh dục phụ (150 - 200 ml). Số lƣợng tinh trùng ở giai đoạn này ít, giai đoạn này kéo dài 4 - 5 phút. Tinh dịch của lợn đực là một hỗn hợp bao gồm tinh trùng đƣợc sản sinh ra từ dịch hoàn và các chất tiết của các tuyến sinh dục phụ nhƣ tuyến tinh nang, tuyến cowper, tuyến tiền liệt và tuyến urethra của vùng bụng. Trong tinh dịch, phần quan trọng nhất là tinh trùng, đây là yếu tố chính làm cho lợn cái có thể thụ thai. Phần quan trọng thứ hai là tinh thanh, tinh thanh là một hỗn hợp chất lỏng do các tuyến sinh dục phụ bài tiết ra. Ở các loài gia súc khác nhau tuyến này phát triển không giống nhau. Ở lợn tuyến tinh nang và tuyến cowper bài tiết nhiều, cho nên tinh dịch lợn thƣờng nghèo tinh trùng và fructose. Ở lợn tinh thanh gồm 56 - 70% do tuyến tinh nang tiết ra, 15 - 18% do tuyến cowper tiết ra, 2 - 3% do dịch hoàn phụ tiết ra. Tinh trùng trong tinh dịch chỉ chiếm 2 - 7%. Theo Ogiƣn f.v (1977) và Levin K.L (1980)( dẫn theo Nguyễn Tấn Anh (1984) [1]. Thành phần hoá học của tinh dịch lợn: tinh dịch lợn là một hỗn hợp các chất lỏng phức tạp, cho nên một số chất chỉ đƣợc xác định ở mức định tính. Các loài khác nhau thì thành phần hoá học của tinh dịch cũng khác nhau. Tác dụng chủ yếu của tinh dịch là rửa đƣờng niệu sinh dục, là môi trƣờng để nuôi sống tinh trùng ngoài cơ thể, kích thích tinh trùng hoạt động trong đƣờng sinh dục của con cái. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 1.2.3. Một số đặc tính sinh lý của tinh trùng lợn 1.2.3.1. Sự hình thành và cấu tạo của tinh trùng lợn Tinh trùng lợn chỉ chiếm 2 - 7% trong tổng số tinh dịch tiết ra. Tinh trùng là tế bào sinh dục đã hoàn chỉnh về hình thái, cấu tạo và đặc điểm sinh lý sinh hóa có khả năng thụ thai. Quá trình hình thành tinh trùng đƣợc chia làm nhiều giai đoạn:  Giai đoạn sinh sản: từ một tế bào tinh nguyên nó sinh sản bằng cách nhân đôi mục đích là tăng số lƣợng tế bào, nhƣng số lƣợng nhiễm sắc thể không thay đổi.  Giai đoạn sinh trƣởng: tế bào tinh nguyên tăng cƣờng quá trình đồng hóa, làm cho kích thƣớc tế bào to ra. Đến cuối giai đoạn sinh trƣởng tế bào phôi đƣợc gọi là tinh bào cấp I (cyt 1).  Giai đoạn thành thục: đây là lần phân chia giảm nhiễm, từ một tế bào lƣỡng bội ( 2n NST) tạo thành hai tế bào đơn bội ( n NST) ( Cyt I) với hai loại mang nhiễm sắc thể giới tính khác nhau: NST X và NST Y.  Giai đoạn hoàn chỉnh cấu tạo: tinh trùng phát triển đuôi, phía ngoài tinh trùng đƣợc bao bọc bởi lớp màng lipoprotein có chức năng bảo vệ và dinh dƣỡng cho tinh trùng. + Nhân tế bào thu nhỏ lại và biến thành đầu tinh trùng, phần lớn tế bào chất dồn về một phía tạo thành cổ, thân. Một số thể Golgi tập trung ở đầu mút phía trƣớc của tiền tinh trùng tạo thành acrosome. + Các ty thể chuyển tới vùng cổ thân, phần lớn các tế bào chất biến đi chỉ còn lại một lớp mỏng bao quanh miền ty thể và đuôi. + Qúa trình biến thái xảy ra trên tế bào dinh dƣỡng Sectoli trong lòng ống sinh tinh, trong khoảng thời gian 14-15 ngày. Sau đó chúng trở thành tinh trùng non và rơi vào ống sinh tinh, đƣợc đẩy về phía phụ dịch hoàn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19  Giai đoạn phát dục: ở phụ dịch hoàn, tinh trùng non tiếp tục phát dục và thành thục. Trong quá trình di chuyển từ đây đến cuối dịch hoàn phụ, tinh trùng phải di chuyển với đoạn đƣờng khá dài khoảng trên 100m nằm uốn khúc quanh co. Trong quá trình này nhiều tinh trùng non bị phân hủy. Về hình thái, tinh trùng có ba phần chính: - Đầu tinh trùng là phần chứa các vật chất di truyền. - Cổ thân. - Đuôi tinh trùng là phần có liên quan đến chức năng vận động. Đầu có hai phần cơ bản: nhân và acrosome Nhân chiếm 87% thể tích của đầu và đƣợc nén chặt lại gần nhƣ tinh thể. Trong nhân có chứa Chromatin đậm đặc cao độ gồm AND liên kết với một protein đặc biệt. Số lƣợng nhiễm sắc thể trong nhân tinh trùng là đơn bội. Nhân của tinh trùng không có ARN. Phần trƣớc nhân đƣợc bao bọc bằng một acrosome, giống cái túi có hai lớp màng và bọc sát vào nhân. Acrosome là một lyzosome đặc biệt. Trong acrosome của tinh trùng có chứa enzym thuỷ phân Hyaluronidaza có tác dụng phân giải axit Hyaluronic là chất keo gắn các tế bào màng phóng xạ, làm cho chúng rời ra để lộ trứng ra ngoài cho tinh trùng có thể dễ dàng tiếp cận với noãn hoàng trong quá trình thụ thai. Cổ thân: là phần rất ngắn, hơi eo lại, cắm vào hốc ở đáy phía sau của nhân. Phần cổ thân có hai loại cặp hạt là: cặp hạt trung tâm và chín cặp hạt bên. Từ cặp hạt trung tâm xuất phát hai sợi trục chính đi về phía đuôi. Từ chín cặp hạt bên xuất phát ra chín cặp sợi bên đi theo hình xoắn ốc về phía đuôi. Phần cổ thân chứa nhiều loại enzym oxy hoá khử giúp cho các phản ứng trao đổi chất của tinh trùng. Đuôi đƣợc chia ra các phần: đoạn giữa, đoạn chính, đoạn thân: Đoạn giữa có 9 cặp vi ống ngoài, 2 vi ống trung tâm và đƣợc bọc quanh bằng 9 sợi ƣa osmi, tất cả tạo thành bó trục. Bó trục đƣợc phủ bên ngoài bằng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 một bọc ty thể xếp theo đƣờng xoắn ốc (lò xo ty thể) và kết thúc ở vòng nhẫn gensen. Ty thể có chứa các enzym oxy hoá và photphoryl hoá, ty thể đƣợc coi là nguồn phát sinh năng lƣợng cần thiết cho sự hoạt động của tinh trùng. Đoạn chính không đƣợc bao bọc bằng ty thể mà chỉ có bó trục ở giữa và những sợi ƣa osmi vây bên ngoài. Hệ thống này đƣợc bao phủ bởi một vỏ bọc bằng những sợi chắc, vỏ bọc này duy trì khả năng ổn định cho các yếu tố co rút của đuôi. Bó trục của đuôi chịu trách nhiệm cho sự chuyển động của tinh trùng. Bọc ty thể cung cấp năng lƣợng dƣới dạng ATP cho các tay dynein của các cặp vi ống (các tay dynein có khả năng phân huỷ ATP, giải phóng năng lƣợng để chuyển động đuôi tinh trùng). Mỗi cặp vi ống ngoài có hai dãy dynein (ngoài và trong) chĩa về phía cặp vi ống kề bên. Khi đƣợc kích thích bởi ATP, các tay này hoạt động nhƣ một cá líp, đi dọc theo cặp kề bên, làm cho các cặp này trƣợt lên cặp khác. Sự hình thành cầu nối hình tia giữa các cặp vi ống ngoài với vi ống trung tâm chống lại hiện tƣợng trƣợt vừa nêu, làm cho đuôi tinh trùng uốn lƣợn. Do các cặp vi ống ngoài trƣợt liên tục nên sự uốn lƣợn đƣợc hình thành liên tục, đƣợc lan truyền tạo nên sự chuyển động đặc trƣng của đuôi tinh trùng (chuyển động làn sóng). Đây là hiện tƣợng trƣợt theo vi ống. - Theo I.I xôcôlôpskaya (1962) (dẫn theo Nguyễn Tấn Anh) [1] thì thân tinh trùng lợn có 25% vật chất khô, 75% là nƣớc. Trong vật chất khô: protein 82%, lipit 13%. Trong đuôi tinh trùng có: 76% protein, 23% lipit, 1% muối. 1.2.3.2. Hoạt động của tinh trùng Khi còn trong dịch hoàn phụ, tinh trùng hoạt động rất yếu hoặc không hoạt động. Khi đƣợc giải phóng ra ngoài, tinh trùng trở nên hoạt động mạnh do tác động của dịch tiết do các tuyến sinh dục phụ tiết ra. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Trạng thái hoạt động của tinh trùng thể hiện chất lƣợng tinh dịch. Nếu tinh trùng hoạt động càng mạnh thì chất lƣợng càng tốt. Tinh trùng có 3 hình thức vận động cơ bản (Nguyễn Tấn Anh, 1985) [2]: + Vận động tiến thẳng: đây là những tinh trùng có khả năng thụ thai. + Vận động xoay tròn: những tinh trùng có dạng vận động này thƣờng là không có khả năng thụ thai. + Vận động tại chỗ: thƣờng là những tinh trùng non hoặc bị dị tật, những tinh trùng này không có khả năng thụ thai. Với công nghệ kỹ thuật số (Phân tích theo phần mềm Sperm vision 3.0) ngƣời ta có thể xác định đƣợc các dạng chuyển động, tốc độ chuyển động của tinh trùng và xác định đƣợc khoảng cách tinh trùng chuyển động trong khoảng thời gian nhất định đó là khoảng cách, vận tốc chuyển động theo đƣờng ziczăc, theo đƣờng trung bình và theo đƣờng thẳng. + DCL (Distance Curve Line): độ dài đƣờng ziczăc (µm). + DAP (Distance Average Path): độ dài đƣờng trung bình (µm). + DSL (Distance Straight Line): độ dài đƣờng thẳng (µm). Tƣơng ứng với mỗi dạng chuyển động trên, ngƣời ta cũng đã xác định đƣợc tốc độ chuyển động của tinh trùng ở 3 dạng đƣờng đi là: + VCL (Velocity Curve Line): tốc độ chuyển động theo đƣờng ziczăc (µm/giây). + VAP (Velocity Average Path): tốc độ chuyển động theo đƣờng trung bình (µm/giây). + VSL (Velocity Straight Line): tốc độ chuyển động theo đƣờng thẳng (µm/giây). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 1.2.3.3. Trao đổi chất và năng lƣợng của tinh trùng lợn Quá trình trao đổi chất và năng lƣợng ở tinh trùng gồm có: năng lƣợng tiêu hao do sự co rút của phần đuôi tinh trùng trong quá trình vận động và năng lƣợng tạo ra do sự phân giải các hợp chất dự trữ trong tinh trùng. Sự phân giải các hợp chất cao năng ADP và ATP để cung cấp năng lƣợng cho các hoạt động của tinh trùng nhƣ sau: ATP + H2O => ADP + Axit Photphoric + 8 Kcalo ADP + H2O => AMP + Axit Photphoric + 8 Kcalo Ngoài ra năng lƣợng của tinh trùng đƣợc tạo ra do quá trình đƣờng phân và hô hấp. Quá trình đƣờng phân giúp cho tinh trùng có thể sống và hoạt động trong điều kiện không có oxy nhƣng có đƣờng glucose. Quá trình đƣờng phân xảy ra theo phản ứng: C6H12O6 => 2C3H6O3 + 27,7 Kcalo Quá trình này chỉ xảy ra khi có đƣờng. Khi còn ở trong dịch hoàn phụ hầu nhƣ không có đƣờng nên tinh trùng ở trạng thái bất động. Khi xuất tinh ra ngoài tinh trùng nhận đƣợc đƣờng từ chất phân tiết của tuyến tinh nang thì chất đƣờng nhanh chóng thấm qua màng của tinh trùng. Quá trình hô hấp xảy ra nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 C6H12O6 + 6 O2 => 6CO2 + 6H2O + 679 Kcalo Quá trình hô hấp xảy ra trong điều kiện có oxy và giải phóng nhiều năng lƣợng hơn. Trong môi trƣờng có oxy, quá trình hô hấp của tinh trùng diễn ra mạnh mẽ hơn. Tuy nhiên lƣợng các chất dự trữ có trong tinh trùng không nhiều vì vậy làm cho thời gian sống của tinh trùng ngắn. Do đó, muốn kéo dài thời gian sống của tinh trùng ngoài cơ thể thì cần bảo quản tinh dịch trong môi trƣờng yếm khí. Tinh dịch ở trâu, bò, dê rất đậm đặc, lƣợng oxy rất ít nên quá trình hô hấp đƣợc thay bằng quá trình đƣờng phân. Còn ở lợn, tinh dịch loãng, lƣợng oxy đủ nên hô hấp là quá trình giải phóng năng lƣợng chủ yếu. Khi hô hấp, không những chất đƣờng đƣợc oxy hoá mà cả chất béo, các axit amin cũng đƣợc oxy hoá. Quá trình hô hấp đƣợc tăng lên bởi nhiệt độ. Cứ tăng lên 10oC thì quá trình hô hấp tăng lên 2 – 2,5 lần. Điều này có liên quan đến việc bảo quản tinh dịch ở nhiệt độ phù hợp. Nếu nhiệt độ tăng quá cao, sự hô hấp của tinh trùng tăng lên và làm chúng nhanh bị chết do đó không bảo quản đƣợc lâu. Trao đổi chất của tinh trùng luôn luôn biến động theo sự biến thiên của môi trƣờng ngoại cảnh, theo thời gian lƣợng Fructo giảm dần, axit lăctic tích tụ lại rồi CO2 làm giảm pH. Từ đó tác động xấu đến quá trình trao đổi chất của tinh trùng, làm tinh trùng già cỗi, sự tiêu thụ O2 chỉ đạt tối đa khi tinh trùng còn tƣơi. Sự già cỗi của tinh trùng dần tạo lên nguy cơ về hình thái tinh trùng, acrosome biến dạng và biến mất. Tinh trùng có thể mất khả năng vận động và chết sau khi acrosome nổi lên những mụn nƣớc, làm vỡ màng sinh chất và chất liệu acrosome trào ra ngoài. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 1.2.4. Một số chỉ tiêu chất lượng tinh dịch lợn 1.2.4.1. Thể tích tinh dịch (V ml) Thể tích tinh dịch là số ml tinh dịch sau khi lọc bỏ keo phèn trong một lần thực hiện thành công phản xạ xuất tinh. Thể tích tinh dịch phụ thuộc vào yếu tố: giống, loài, độ tuổi, cá thể, kỹ thuật khai thác tinh, tần xuất lấy tinh và mùa vụ lấy tinh... Trong tinh dịch lợn có chứa một lƣợng khá lớn hạt thể selatin, chiếm tỷ lệ 20 - 30% lƣợng tinh dịch, chúng là sản phẩm của tuyến Cowper. Khi xuất tinh, những hạt thể selatin gặp enzim vegikinaza của tuyến tinh nang rồi đọng lại thành những tinh thể lớn hơn. Sau đó các thể này hấp phụ nƣớc và tăng lên về thể tích, ngƣời ta gọi đó là keo phèn (Trần Tiến Dũng và cs, 2002) [7]. Trong giao phối tự nhiên, keo phèn có tác dụng bịt lỗ tử cung không cho tinh dịch chảy ra ngoài. Trong TTNT cần phải nhanh chóng loại bỏ keo phèn, nếu không nó sẽ hấp phụ một phần nƣớc trong tinh dịch và một số lƣợng lớn tinh trùng. Vào mùa giao phối trong tinh dịch lợn có lƣợng selatin lớn hơn mùa không giao phối. Do đó khi xác định thể tích tinh dịch cần phải loại bỏ keo phèn bằng cách lọc qua nhiều lớp vải gạc. 1.2.4.2. Hoạt động của tinh trùng Hoạt động của tinh trùng: M (Motility %) là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng có hoạt động, bao gồm: hoạt động tiến thẳng và hoạt động tại chỗ. - Hoạt động tiến thẳng của tinh trùng: hoạt lực A ( Progessive motility %) Là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng có hoạt động tiến thẳng. Hoạt lực tinh trùng càng cao chất lƣợng tinh trùng càng tốt và khả năng thụ thai càng lớn, sức sống của tinh trùng có ảnh hƣởng đến sức sống của đời sau. Hoạt lực tinh trùng càng cao thì khả năng thụ thai càng cao, Theo Eliasson (trích theo Nguyễn Tấn Anh, 1996) [3], hoạt lực và sức sống của tinh trùng phụ thuộc vào tỷ lệ thích hợp giữa các dịch tiết của tuyến tiền liệt và tiểu nang. Thành Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 phần hóa sinh của tinh thanh rất ổn định cho mỗi lần xuất tinh và không phụ thuộc vào tần số xuất tinh. Chất tiết của tiểu nang có chứa một vài nhân tố không có lợi cho hoạt lực và sức sống của tinh trùng. Nhƣng chất tiết của tuyến tiền liệt lại kích thích sức hoạt động tinh trùng. Khi tiếp xúc với chất tiết tuyến tiền liệt, tinh trùng đƣợc bảo vệ để tránh ảnh hƣởng không có lợi của chất tiết tuyến tiểu nang. - Hoạt động tại chỗ: L (Local motility %) là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng có hoạt động vòng tròn, lắc lƣ tại chỗ. 1.2.4.3. Tinh trùng không hoạt động I (Immotile %): là tỷ lệ phần trăm số tinh trùng không hoạt động (đã chết). 1.2.4.4. Nồng độ tinh trùng: C (triệu/ml) Nồng độ tinh trùng là số tinh trùng có trong 1 ml tinh nguyên. Nồng độ tinh trùng là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng tinh dịch, là cơ sở để tính toán liều tinh sản xuất. 1.2.4.5. Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong tinh dịch: VAC ( tỷ/lần) Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tấn Anh (1984) [1] ở lợn Yorkshire có chỉ số VAC là 45,1 ± 1,73 tỷ/lần, ở lợn Landrace có chỉ số VAC là 36,05 ± 1,24 tỷ/lần. 1.2.4.6. Độ pH của tinh dịch pH đƣợc xác định bởi nồng độ ion H+ trong tinh dịch. pH của tinh dịch liên quan đến khả năng sống và thụ tinh của tinh trùng. pH của tinh dịch toan tính thì tinh trùng hoạt động yếu, thời gian sống kéo dài. Ngƣợc lại, pH của tinh dịch kiềm tính thì tinh trùng hoạt động mạnh, thời gian sống bị rút ngắn. pH của tinh dịch giữa các loài gia súc khác nhau thì khác nhau. pH của dịch tiết từ dịch hoàn phụ ở các loài gia súc luôn có tính chất toan tính, có tác Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 dụng ức chế tới mức thấp nhất sự trao đổi chất của tinh trùng và kéo dài thời gian sống của tinh trùng. pH của dịch tiết từ các tuyến sinh dục phụ trung tính hoặc kiềm tính. Vì vậy, pH tinh dịch của những động vật có lƣợng tinh nhiều, trong đó có dịch tiết của tuyến tinh nang chiếm tỷ lệ cao thì thƣờng có giá trị kiềm tính. Theo Nguyễn Tấn Anh (1996) [3], pH tinh dịch lợn có tính kiềm yếu (7,2 - 7,5). 1.2.4.7. Áp suất thẩm thấu: (Posm, mosmol) ASTT của một chất lỏng phụ thuộc vào nồng độ hòa tan các phân tử, các ion trong đó và đƣợc tính trên một đơn vị thể tích. ASTT có ảnh hƣởng đến quá trình hô hấp của tinh trùng trong các môi trƣờng khác nhau. Trong môi trƣờng có Cl - với ASTT là 7 atm, tinh trùng đạt mức tiêu thụ oxy cao nhất (13 µl O2/100 triệu tinh trùng) khi ASTT là 13 atm, sự tiêu hao oxy giảm xuống (7,8 µl O2/100 triệu tinh trùng). ASTT là chỉ tiêu cần thiết làm cơ sở cho việc nghiên cứu xây dựng môi trƣờng bảo tồn đông lạnh tinh dịch. Theo Joaquín Gadea (2003) [29] thì tinh dịch lợn có ASTT là 290 - 300 mosm, tinh trùng có thể chịu đƣợc giới hạn ASTT từ 240 - 380 mosm. Theo Fraser và cs (2001) [22] thì ASTT của tinh dịch là 250 - 290 mosm. Nếu ASTT thấp hơn 200 mosm thì khả năng hoạt động và sức sống của tinh trùng bị suy giảm (Gilmore và cs, (1996) [23]; Fraser và cộng sự,(2001) [22]). 1.2.4.8. Acrosome tinh trùng Acrosome nằm trong phần đầu của tinh trùng. Acrosome có vai trò rất quan trọng đối với quá trình thụ tinh, là một chỉ tiêu để đánh giá chất lƣợng tinh dịch. Chỉ có các tinh trùng có acrosome nguyên vẹn mới có thể tham gia thụ tinh. Cũng giống nhƣ các phần cấu tạo khác của tinh trùng, acrosome rất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 dễ bị phá huỷ bởi các yếu tố vật lí, hoá học của môi trƣờng. Ngoài ra, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình ở acrosome còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền. 1.2.4.9. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: K (%) Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình là số tinh trùng có hình dạng bất thƣờng so với tổng số tinh trùng đếm đƣợc trong quá trình kiểm tra. Theo Milovanov (1962) [32], nhận thấy có hai thời kỳ có thể gây nên tình trạng kỳ hình ở tinh trùng: - Kỳ hình ngay trong quá trình sinh tinh - tinh trùng kỳ hình sơ cấp, bắt nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến bệnh lý ở cơ quan sinh tinh. - Sau khi tinh trùng đƣợc bài tiết ra - tinh trùng kỳ hình thứ cấp, bắt nguồn từ nguyên nhân có liên quan đến ngoại cảnh hoặc kỹ thuật không đúng trong khâu xử lý tinh dịch. 1.2.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng tinh dịch 1.2.5.1. Giống và độ tuổi Đến một độ tuổi nhất định thì lợn đực thành thục về tính, tuỳ theo từng giống khác nhau, tầm vóc to hay nhỏ, cƣờng độ trao đổi chất mạnh hay yếu, khả năng thích nghi với điều kiện thời tiết, khí hậu mà có số lƣợng cũng nhƣ chất lƣợng tinh dịch khác nhau. Các giống lợn nguyên thuỷ chƣa đƣợc cải tiến thì số lƣợng và chất lƣợng tinh dịch đều kém hơn các giống lợn đã đƣợc cải tiến chọn lọc. Các giống lợn nội nhƣ: Móng Cái, Mƣờng Khƣơng chỉ đạt 1- 6 tỷ tinh trùng tiến thẳng (VAC) trong một lần xuất tinh, trong khi đó các giống lợn ngoại nuôi tại Việt Nam nhƣ : Yorkshire, Landrace, Duroc trắng thì tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC) đạt từ 16 đến 90 tỷ trong một lần xuất tinh. Trong các nhân tố cấu thành chỉ tiêu tổng số tinh trùng tiến thẳng (VAC) thì sự khác nhau cơ bản giữa các giống lợn nhập ngoại là nồng độ tinh trùng và khối lƣợng tinh dịch. Các giống lợn nội có nồng độ tinh trùng từ 20 - 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 triệu/ml tinh dịch, còn các giống lợn ngoại đạt 170 - 500 triệu /ml (Nguyễn Tấn Anh, (1985) [2] và Lƣu Kỷ (1995) [8]; Lê Xuân Cƣơng (1987) [6]). Tuổi thành thục của lợn đực tuỳ thuộc vào giống, các điều kiện khí hậu, dinh dƣỡng….. Một số giống lợn nội nhƣ: Ỉ, Móng Cái….thƣờng thành thục về tính sớm từ tháng tuổi thứ 3. Các giống lợn ngoại, lợn lai có tuổi thành thục về tính muộn hơn thƣờng từ 4 - 6 tháng tuổi. Tuy nhiên đến 6 - 8 tháng tuổi lợn đực mới hoàn thiện về phản xạ sinh dục, nhƣng lúc này lƣợng tinh dịch sản xuất ra còn rất thấp so với lúc cơ thể trƣởng thành. Lợn đực ngoại hậu bị một lần xuất tinh đạt 80- 100ml, lợn đực ngoại trƣởng thành đạt 250- 400ml. Theo tác giả Feredeen (1971), trích Lê Xuân Cƣơng (1987) [6] thì lƣợng xuất tinh lợn đực lúc 8 tháng tuổi đạt 70- 80ml với nồng độ tinh trùng đạt 180-200 triệu tinh trùng/ml các tinh trùng kỳ hình chiếm 5-10%. Từ 8 tháng tuổi trở lên thể tích xuất tinh và nồng độ tinh trùng tăng lên. Theo kết quả nghiên cứu của Hafez (1960), trích theo Lê Xuân Cƣơng (1986) [6] thể tích xuất tinh của một lợn đực trƣởng thành là từ 150- 300ml, tổng số tinh trùng tiến thẳng là 30 - 60 tỷ tinh trùng, nồng độ tinh trùng đạt từ 200-300 triệu/ml. Trong công tác giống lợn của Việt Nam hiện nay quy định : tuổi bắt đầu huấn luyện sử dụng đối với lợn đực nội là 5 - 6 tháng tuổi, lợn đực ngoại là 7 - 8 tháng tuổi. Thời gian sử dụng trong vòng 3 - 4 năm. Nói chung những giống lợn màu trắng (Yorkshire, Landrace, Duroc trắng) hăng về tính dục và lúc còn non tỏ ra thành thục hơn về phản xạ sinh dục so với một số giống lợn sẫm mầu nhƣ Hampshire, Pietrain và Duroc đỏ Zimmerman và cs (1986) [47]. Ngoài các yếu tố trên thì kiểu gen Halothan cũng ảnh hƣởng đến chỉ tiêu phẩm chất tinh dịch. Nhiều nghiên cứu cho thấy số và chất lƣợng tinh dịch ở lợn đực có kiểu gen Halothan NN là tốt nhất, sau đó đến Nn và cuối cùng là nn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 1.2.5.2.Yếu tố ngoại cảnh - Dinh dưỡng Một lợn đực giống tốt là nó có phẩm chất tinh dịch tốt, khả năng giao phối cao, năng suất chất lƣợng sinh sản tốt. Muốn đƣợc nhƣ vậy chắc chắn lợn đực giống phải có thân hình khoẻ mạnh, rắn chắc, không béo quá, không gầy quá, đặc biệt cơ năng về tính dục phải bình thƣờng. Do đó lợn đực giống cần đƣợc nuôi dƣỡng đúng đắn, cho vận động đầy đủ và có chế độ sử dụng hợp lý. Dinh dƣỡng là yếu tố quan trọng thứ hai sau phẩm giống. Thức ăn đầy đủ sẽ phát huy đƣợc tiềm năng di truyền của giống. Nếu lợn ăn thức ăn không đủ tiêu chuẩn dinh dƣỡng thì sẽ giảm tính hăng rõ rệt, nồng độ tinh trùng thấp, tỷ lệ kỳ hình cao, phẩm chất tinh dịch kém. Nếu bổ sung thức ăn đạm vào khẩu phần để đạt đƣợc 120-130g protein/đơn vị thức ăn (protein thực vật) thì mật độ tinh trùng tăng 37,9%. Tỷ lệ protein dƣới 100 g/đơn vị thức ăn thì thể tích tinh dịch chỉ đạt 50 - 60 ml, mật độ tinh trùng đạt 20 - 25 triệu (Lê Xuân Cƣơng, 1985[5]). Khoáng: Chủ yếu là: Ca, P có ảnh hƣởng rõ rệt đến phẩm chất tinh dịch. Nếu trong khẩu phần thức ăn thiếu Ca thì tinh trùng phát dục không hoàn toàn, sức hoạt động yếu và tuyến sinh dục dễ bị bệnh. Khẩu phần của đực giống cần phải đảm bảo 14 - 18g Ca, 8 - 10g P cho 100kg thể trọng trong thời kỳ sử dụng cũng nhƣ chuẩn bị phối giống. Vitamin: Quan trọng nhất là vitamin A, D, E. Vitamin A giúp cơ quan sinh dục phát triển bình thƣờng, nếu thiếu thì tinh hoàn có thể bị teo, ống dẫn tinh bị thoái hóa gây cản trở cho sự sản sinh tinh trùng, nhu cầu vitamin A: 200UI/kg thức ăn. Nếu thiếu vitamin D thì ảnh hƣởng xấu đến sự hấp thụ Ca, P ảnh hƣởng gián tiếp đến chất lƣợng tinh dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 Vitamin E chống oxy hoá mỡ, kích thích tuyến yên tiết ra kích dục tố. Thiếu vitamin E ở mức độ nhất định thì quá trình sinh tinh trùng bị ngừng trệ và khả năng thụ thai rất kém. Nếu thiếu trong thời gian dài sẽ làm dịch hoàn bị teo và không có khả năng phục hồi trở lại nếu bổ sung vitamin E. Vitamin E có nhiều trong thức ăn non và thức ăn mầm, vì vậy đối với đực giống trong khẩu phần ăn phải có thóc mầm, ngô mầm, giá đỗ…(là những loại thức ăn có chứa nhiều vitamin E) hoặc bổ sung vitamin E công nghiệp. - Chăm sóc Ngoài việc đảm bảo chuồng trại khô ráo sạch sẽ, thoáng mát về mùa hè, ấm về mùa đông, đầy đủ ánh sáng, ngƣời ta rất quan tâm đến chế độ vận động, tắm trải cho lợn đực giống. Các cơ sở chăn nuôi đánh giá cao tác dụng của chế độ vận động hợp lý đối với việc rèn luyện thể chất, nâng cao phẩm chất tinh tinh dịch. Nếu cho lợn đực giống vận động không đầy đủ nó sẽ ngủ nhiều hơn, mau béo, bụng to, sệ, giảm tính hăng, làm chân sau yếu ảnh hƣởng đến việc giao phối. Hàng ngày cho đực giống vận động tự do trong sân chơi từ 1 - 2 giờ, hoặc cho lợn vận động cƣỡng bức, cho lợn vận động vào thời điểm thích hợp: mùa hè vào lúc sáng sớm, mùa đông vào lúc chiều và cho vận động dƣới ánh nắng mặt trời giúp lợn dễ dàng tổng hợp vitamin D. Thƣờng xuyên tắm trải sạch sẽ cho lợn đực giống có ảnh hƣởng tích cực đến quá trình bài tiết, tránh đƣợc một số bệnh ngoài da, tăng cƣờng hoạt động tính dục, tăng tính thèm ăn, thông qua việc tắm trải tạo điều kiện làm quen giữa ngƣời chăn nuôi với đực giống, hỗ trợ cho công tác phối giống và khai thác tinh. -Thời tiết khí hậu, nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, lứa tuổi Các yếu tố trên có ảnh hƣởng đến phẩm chất tinh dịch. Theo Nguyễn Tấn Anh vào mùa Đông Xuân (tháng 10, 11, 12, 1, 2, 3, 4) tổng số tinh trùng trong một lần xuất tinh của lợn Landrace (nuôi tại Hà Nội) cao hơn các tháng Hè Thu (tháng 5, 6, 7, 8, 9). Nhiệt độ không khí từ 17 - 180C thuận lợi cho quá trình sinh tinh của lợn đực giống. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Lứa tuổi cũng ảnh hƣởng đến khả năng sản xuất tinh của lợn. Lợn đực ngoại từ 2 - 3 năm tuổi là thời kỳ có khả năng khai thác tinh tốt nhất. Theo Torahiko II D.A (1994) [43] cho biết ảnh hƣởng của từng mùa vụ trong năm đến chất lƣợng tinh dịch nhƣ sau: Bảng 1.1. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến sự tiết tinh dịch lợn Chỉ tiêu Mùa vụ Mùa Xuân Mùa Hè Mùa Thu Mùa Đông Thể tích tinh dịch (ml) 173±63,6 151±46,7 211±76,6 199±76,0 Số lƣợng tinh trùng/ml 4,50.10 8 ±1,58 4,96.10 8 ±1,30 4,40.10 8 ±1,3 4,86.10 8 ±1,90 Tổng số tinh trùng 727.10 8 ±287,5 723,9.10 8 ±240,8 850,3.10 8 ±249,4 896,7.10 8 ±349 Fructose mg/100ml 8,3±8,76 8,5±5,32 21,0±14,33 14,4±10,1 - Tần số khai thác tinh dịch ảnh hưởng đến lượng xuất tinh Tần số này ảnh hƣởng tới lƣợng tinh xuất, nồng độ và tổng số tinh trùng hoạt động. Phần lớn đực giống đƣợc khai thác tinh với khoảng cách từ 3 - 5 ngày/lần (Nguyễn Văn Thƣởng ,1998) [16]. - Tác động cơ học Do đặc điểm cấu tạo Acrosome của tinh trùng liên kết rất lỏng lẻo với đầu, đầu tinh trùng liên kết lỏng lẻo với phần cổ - thân. Vì vậy, các phần của tinh trùng rất dễ bị bong ra. Từ đặc điểm này cần chú ý trong quá trình sản xuất và vận chuyển tinh dịch lợn cần tránh những tác động cơ học nhằm hạn chế ảnh hƣởng của tác động cơ học lên tinh trùng. 1.3. Cơ sở khoa học của kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Tinh dịch lợn sau khi ra ngoài cơ thể thì rất dễ bị sốc hoặc choáng do tiếp xúc với điều kiện ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ, ánh sáng, độ ẩm, môi trƣờng, xóc lắc... Theo I.I.Ivanov (1908) trích theo Nguyễn Thiện và ctv [13], bảo tồn tinh dịch gia súc ở điều kiện bình thƣờng, nhiệt độ tốt nhất ở khoảng 5 - 150C. Khả năng hoạt động của tinh trùng tỷ lệ thuận với nhiệt độ. Nhiệt độ ở 50C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 tinh trùng hầu nhƣ không hoạt động và chúng hoạt động tích cực đạt ở mức tối đa 38 - 410C. Ở 00C và 460C tinh trùng sẽ chết (ở 00C nƣớc nội bào và nƣớc ngoại bào đóng băng, ở 460C protein của tinh trùng bị biến tính và không có khả năng hồi phục đƣợc). Nếu đƣợc bảo tồn bằng các kỹ thuật đặc biệt nhƣ kỹ thuật đông lạnh, tinh trùng có thể sống trong khoảng thời gian rất dài. Theo MaJur (1989) [31] dùng phƣơng pháp bức xạ dự đoán, tinh trùng bảo tồn ở nhiệt độ -196o C có thể bảo tồn đƣợc khoảng 400 năm (trạng thái tiềm sinh). 1.3.1. Một số nguyên lý cơ bản về đông lạnh tinh dịch 1.3.1.1. Hiện tƣợng đóng băng chất lỏng Khi chất lỏng bị làm lạnh xuống nhiệt độ quá thấp sẽ xảy ra hiện tƣợng đóng băng. Quá trình này xảy ra qua các giai đoạn sau: - Tiền đóng băng - Tạo nhân tinh thể - Giãn nở của tinh thể băng - Kết tinh hoàn thiện tại một nhiệt độ nhất định (EP/Entectic point) EP EP Pha lỏng Pha lỏng Pha tinh Pha tinh thể và pha tinh thể thể và pha lỏng Sơ đồ : Quá trình làm lạnh và đóng băng của một dung dịch (Ditto, 1992) [21] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 * Tiền đóng băng Là quá trình khi làm lạnh một chất lỏng, nếu tốc độ làm lạnh chậm, nhiệt độ của chất lỏng hạ xuống điểm đóng băng mà chất lỏng vẫn giữ nguyên trạng thái và chƣa có tinh thể đóng băng. Trạng thái của chất lỏng lúc này không ổn định, chỉ cần một tác động nhẹ là xảy ra hiện tƣợng tạo nhân hoặc phá vỡ hiện tƣợng tạo nhân tinh thể thay vào đó là hiện tƣợng kết hạt (Ditto, 1992) [21] ; (Weize, 1991) [46]. * Hiện tƣợng tạo tinh thể Một chất lỏng đóng băng phải có một hạt nhỏ làm nhân cho các phân tử nƣớc lần lƣợt bám vào để hình thành tinh thể. Hiện tƣợng tạo nhân tinh thể có hai hình thái: + Nƣớc nguyên chất: việc tạo nhân từ hạt tinh thể nƣớc + Dung dịch: các hạt chất tan làm nhân cho các phân tử nƣớc bao quanh tạo tinh thể. Việc tạo tinh thể ở trƣờng hợp này xảy ra ở nhiệt độ cao hơn trƣờng hợp nƣớc nguyên chất. * Sự giãn nở của tinh thể băng Khi đóng băng các tinh thể hình thành, thể tích của chúng sẽ tăng, sự giãn nở thể tích này giải phóng năng lƣợng tiềm ẩn trong các phân tử nƣớc làm cho nhiệt độ của dung dịch tăng đến điểm đóng băng mặc dù quá trình làm lạnh vẫn tiếp tục (Iritani, 1989) [27]. Tại thời điểm đóng băng nhiệt độ của dung dịch không đổi trong một giai đoạn nhất định và giai đoạn này dài hay ngắn phụ thuộc vào tốc độ đóng băng. Nếu tốc độ đóng băng nhanh thì giai đoạn trên sẽ ngắn lại và sự giãn nở của tinh thể sẽ bị loại trừ và thay vào đó là hiện tƣợng tinh thể hoá. * Điểm đóng băng hoàn chỉnh và sự kết tinh tinh thể của dung dịch Khi hiện tƣợng làm lạnh tiếp tục, lƣợng tinh thể nƣớc tăng lên và pha lỏng giảm dần, nồng độ dung dịch tăng và dung dịch sẽ tách ra làm 2 phần: pha tinh thể và pha lỏng. Nếu hiện tƣợng làm lạnh tiếp tục thì pha lỏng sẽ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 biến mất ở một nhiệt độ nhất định. Điểm đó gọi là điểm đóng băng hoàn chỉnh của một dung dịch (Weize, 1991) [46]. 1.3.1.2. Ảnh hƣởng của đóng băng lên tế bào tinh trùng Tinh trùng là một loại tế bào đặc biệt rất mẫn cảm với các yếu tố ngoại cảnh. Khi đông lạnh tinh trùng chịu ảnh hƣởng bởi các hiện tƣợng sau: - Hiện tượng đóng băng nội bào Tinh trùng bị chết hoặc mất năng lƣợng hoạt động khi cấu tạo nội bào bị phá vỡ do việc hình thành tinh thể nƣớc nội bào. Nếu tinh trùng nằm trong dung dịch nƣớc muối sinh lý có thể loại trừ hiện tƣợng này vì đƣợc các phân tử nƣớc ở dạng lỏng bao quanh mặc dù dung dịch ngoại bào bắt đầu đóng băng ở nhiệt độ -20C đến -50C. Khi đông lạnh tinh dịch, sự tạo thành nhân tinh thể và giãn nở của tinh thể băng chỉ xảy ra trong điều kiện đông lạnh chậm, còn khi đông lạnh cực nhanh thì hai hiện tƣợng trên không xảy ra mà xảy ra hiện tƣợng tinh thể hoá (vitrification) tạo ra các hạt băng nhỏ li ti, loại trừ đƣợc hiện tƣợng giãn nở tinh thể (Iritani, 1989) [27]. Do vậy, quá trình đóng băng không ảnh hƣởng tới tinh trùng. -Sự mất nước của tế bào tinh trùng Trong quá trình làm lạnh tinh dịch, nƣớc ngoại bào đóng băng làm ASTT chênh lệch, nƣớc nội bào thoát khỏi tinh trùng và tiếp tục đóng băng ở phần ngoại bào. Ở nhiệt độ 00C đến 50C, nƣớc nội bào và ngoại bào vẫn chƣa đóng băng mà ở trạng thái không bị đông lại, ổn định nên không làm ảnh hƣởng đến cấu trúc tế bào tinh trùng. Ở khoảng nhiệt độ -20C đến -50C, tinh thể đã đƣợc hình thành trong môi trƣờng ngoại bào, trong khi nƣớc nội bào không bị đông lại kéo theo sự chênh lệch cân bằng hoá học gây hiện tƣợng mất nƣớc tế bào, tế bào bị teo lại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Ở khoảng nhiệt độ -150C, tế bào tinh trùng có tới 80% nƣớc nội bào thoát ra ngoài dẫn đến hiện tƣợng đóng băng nội bào bị ngăn cản. Ở khoảng nhiệt độ -300C, phần lớn nƣớc nội bào thoát ra khỏi tinh trùng. Vậy tinh trùng có thể chịu lạnh -300C và có thể tồn tại ở -1960C. Vấn đề đặt ra là tốc độ làm lạnh phải đủ chậm cho sự mất nƣớc tế bào, tránh đóng băng nƣớc nội bào, nhƣng quá trình này cũng phải đủ nhanh để tránh gây ra hiện tƣợng chênh lệch ASTT giữa môi trƣờng ngoại bào và nội bào, dễ dẫn đến hiện tƣợng mất nƣớc nghiêm trọng. Tuy nhiên, cũng có tinh trùng không có khả năng chịu lạnh do các thay đổi lý hoá sinh xảy ra ở nhiệt độ thấp, nhƣ biến đổi cấu trúc nội bào, sự thay đổi các nguyên tử hydro trong các hợp chất hữu cơ và sự kết tủa protein (Iritani, 1989) [27]. -Hiện tượng đóng băng ngoại bào Trong quá trình đông lạnh, hiện tƣợng đóng băng nƣớc ngoại bào sẽ xảy ra làm nồng độ dung dịch tăng lên và ASTT ngoại bào cao hơn ASTT nội bào, pH cũng thay đổi (Iritani, 1989) [27]. - Chuyển động của nước và sự giãn nở tinh thể nước gây ra huỷ hoại cơ học đối với tinh trùng Quá trình giải đông cũng nhƣ đông lạnh đều có tác dụng cơ học huỷ hoại tinh trùng do sự chênh lệch áp suất tinh thể, sự di chuyển của nƣớc qua màng tế bào tinh trùng và sự giãn nở của các tinh thể nƣớc đá hay các bọt khí giữa các phân tử nƣớc đá gây ra hiện tƣợng bất thƣờng: méo mó, vỡ màng... Các tổn thƣơng cơ học này có thể loại trừ bằng cách hạn chế việc hình thành các tinh thể với kích thƣớc nhỏ nhờ kỹ thuật đóng băng hoặc tan băng với tốc độ nhanh. 1.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng tới sức sống tinh trùng trong đông lạnh Khi đông lạnh và giải đông, do các hiện tƣợng trên sẽ đe dọa đến sự sống của tinh trùng. Các nhân tố giúp tinh trùng tồn tại sau khi đông lạnh và giải đông: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 -Khả năng chịu lạnh của tinh trùng Khả năng chịu lạnh của tinh trùng là tỷ lệ sống sót của tinh trùng sau khi giải đông. Điều này phụ thuộc vào: giống, độ tuổi lấy tinh, mùa vụ lấy tinh... -Thành phần môi trường pha loãng Môi trƣờng pha loãng bao gồm: chất có năng lƣợng, chất đệm, chất chống đông, chất điện giải... Tỷ lệ tinh trùng sau đông lạnh và giải đông phụ thuộc vào các thành phần trên, nếu việc pha chế môi trƣờng không hợp lý sẽ làm giảm hoạt lực, tăng tỷ lệ chết của tinh trùng. - Thời gian cân bằng Tinh trùng sau khi ra ngoài cơ thể rất dễ bị sốc nhiệt do sự chênh lệch giữa nhiệt độ trong cơ thể và nhiệt độ môi trƣờng ngoài cơ thể. Chính vì vậy cần thiết phải hạ nhiệt độ từ từ để tinh trùng làm quen với nhiệt độ thấp. Theo Ditto (1992) [21] cho biết: thời gian cân bằng khoảng 3 - 5h ở nhiệt độ 50C để tinh trùng làm quen với nhiệt độ thấp. -Tốc độ đông lạnh Khi đông lạnh sâu để tinh trùng đóng băng, tốc độ đông lạnh nhanh hay chậm quyết định đến hoạt lực tinh trùng sau giải đông. Ở nhiệt độ -20C, nƣớc nội bào và ngoại bào vẫn giữ nguyên pha lỏng, chƣa đóng băng thành dạng tinh thể, tế bào tinh trùng chƣa bị ảnh hƣởng. Ở nhiệt độ -50C, nƣớc ngoại bào bắt đầu đóng băng, nồng độ chất tan ngoại bào tăng lên, áp suất tinh thể chênh lệch, một phần nƣớc nội bào thoát ra ngoài và tiếp tục biến thành tinh thể băng. Ở nhiệt độ -100C xảy ra 3 trƣờng hợp phụ thuộc tốc độ đông lạnh (Iritani, 1989) [27]: + Đông lạnh chậm: nƣớc ngoại bào đóng băng, nƣớc nội bào thoát ra ngoài, tế bào tinh trùng mất nhiều nƣớc và teo lại. + Đông lạnh nhanh: khi không đủ thời gian để nƣớc nội bào thoát ra khỏi tinh trùng, nên nƣớc ngoại bào và nƣớc nội bào cùng đóng băng ở dạng tinh thể, các tinh thể nƣớc giãn nở sẽ làm méo hoặc vỡ màng tế bào tinh trùng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 + Đông lạnh rất nhanh: khi nƣớc nội bào không kịp thoát ra ngoài và do tốc độ đóng băng rất nhanh, nƣớc nội bào và nƣớc ngoại bào không kịp kết tinh dạng tinh thể mà xảy ra hiện tƣợng thuỷ tinh hoá. Kích thƣớc của tất cả các tinh thể nƣớc nội bào và ngoại bào đều rất nhỏ ở dạng li ti nên không có sự giãn nở về thể tích, giữ đƣợc áp suất thể tích đẳng trƣơng. Do đó, tinh trùng vẫn giữ nguyên hình thái và cấu trúc. -Giải đông Tinh cọng rạ đƣợc giải đông trong nƣớc ấm. Nhiệt độ và thời gian giải đông phải đồng thời đáp ứng đƣợc hai yêu cầu là “đánh thức” tinh trùng đang ở trạng thái tiềm sinh chuyển sang trạng thái hoạt động và không làm ảnh hƣởng đến hoạt lực của tinh trùng. Do đó, cần phải giải đông nhanh, nhiệt độ giải đông phải đảm bảo để tinh trùng không phải chịu đựng pha kết tinh hoá đồng thời không phá vỡ cấu trúc của tinh trùng. - Bảo quản Tinh trùng sau đông lạnh luôn phải đƣợc bảo quản trong nitơ lỏng (-196 0 C). Nếu bảo quản tốt, tinh trùng sau bảo quản hàng chục năm khi giải đông vẫn có khả năng thụ thai. Ở Thụy Sĩ: tinh trùng bò bảo quản 20 năm vẫn có khả năng thụ thai. Ở Nhật Bản: tinh cọng rạ gia súc bảo quản sau 4 - 13 năm, sức hoạt động 45 - 55%, tỷ lệ thụ thai 54% (Hiroshi Masuda, 1994) [26]. Bằng phƣơng pháp bức xạ thì tinh trùng có thể tồn tại đến 400 năm (Majur, 1989) [31]. 1.3.3. Cơ sở khoa học của môi trường đông lạnh tinh dịch lợn Kỹ thuật đông lạnh đƣợc tiến hành trong thời gian dài, điều kiện nhiệt độ rất thấp. Vì vậy, các môi trƣờng sử dụng trong đông lạnh cần phải đáp ứng đƣợc các yêu cầu nhƣ: cung cấp năng lƣợng cho tinh trùng; độ pH, ASTT phải cân bằng tƣơng đối với pH và ASTT của tinh trùng; tăng cƣờng các chất đệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 để duy trì pH; có các chất có tác dụng bảo vệ tinh trùng trong điều kiện nhiệt độ thấp và tránh cho tinh trùng không bị tấn công bởi các vi sinh vật gây hại. Tinh thanh là môi trƣờng sống của tinh trùng nhƣng lại là một trở ngại lớn trong công nghệ đông lạnh tinh dịch. Vì trong tinh thanh không chứa thành phần chống lạnh và có một lƣợng nƣớc rất lớn (tinh dịch ngựa và lợn là nhiều hơn cả trong các loài gia súc) sẽ gây ra hiện tƣợng kết tinh. Do đó phải rút nƣớc và loại bỏ nƣớc thay vào đó là một môi trƣờng đông lạnh tổng hợp có những tính chất hóa lý tƣơng đồng ít kiềm tính hơn, bao gồm có các chất điện giải, chất không điện giải và chất chống lạnh. Từ đó giúp cho tinh trùng sau bảo tồn đƣợc nguyên vẹn để có khả năng thụ thai và sinh ra đời sau một cách bình thƣờng. Một số nguyên tắc cơ bản của môi trƣờng đông lạnh tinh dịch lợn: - Áp suất thẩm thấu Để tinh trùng tồn tại đƣợc trong môi trƣờng pha loãng tinh dịch thì ASTT của dung dịch môi trƣờng đông lạnh (ASTT ngoại bào) phải tƣơng đồng với ASTT bên trong của tinh trùng (ASTT nội bào), tức là dung dịch môi trƣờng phải đẳng trƣơng. Nhƣ vậy tinh trùng mới giữ vững đƣợc hình thái học và có khả năng tiến hành trao đổi chất bình thƣờng. Trƣờng hợp môi trƣờng dung dịch ƣu trƣơng (ASTT ngoại bào lớn hơn ASTT nội bào) hoặc nhƣợc trƣơng (ASTT ngoại bào nhỏ hơn ASTT nội bào) sẽ gây ra hiện tƣợng teo hoặc trƣơng phồng, có thể làm vỡ cấu trúc tinh trùng. Trong thực tiễn sản xuất, ASTT của tinh dịch vật nuôi có biến động ngay cùng một cá thể giữa các lần lấy tinh khác nhau. Vì vậy, không phải lúc nào môi trƣờng cũng đều đẳng trƣơng so với tinh dịch và tinh trùng. Đây cũng là một nguyên nhân gây lên khó khăn trong bảo tồn tinh dịch. Tuy nhiên tinh trùng vẫn có thể chịu đƣợc khoảng cách chênh lệch nhất định ấy nhờ vào sự thích ứng tạm thời của màng lọc tinh trùng với độ bền thẩm thấu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 - Đường trong môi trường đông lạnh tinh dịch Trong môi trƣờng đông lạnh thƣờng sử dụng các loại đƣờng nhƣ: Glucose, fructose, lactose. - Chất phòng vệ lạnh (chất ''chống lạnh'' cho tinh trùng) Khả năng chịu lạnh của tinh trùng rất kém. Mặt khác, kỹ thuật đông lạnh đòi hỏi phải tiến hành trong điều kiện nhiệt độ rất thấp. Vì vậy, cần thiết phải bổ sung vào môi trƣờng đông lạnh chất có tác dụng bảo vệ (protecter) cho tinh trùng, hạn chế tối đa hiện tƣợng sốc nhiệt. Các chất đó là: lòng đỏ trứng gà, các dạng chế phẩm của phospholipid, glyxeryl… (Nguyễn Thiện và ctv, 2006) [14]. + Glyxeryl : Công thức C3H5(OH)3; Khối lƣợng phân tử: 92,09 Glyxeryl có tác dụng nhƣ một chất chống lạnh, có độc tính nhẹ, khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, tan mạnh trong nƣớc và cồn. Glyxeryl là dung môi tốt cho các chất điện giải và hợp chất hữu cơ, làm giảm tinh thể nƣớc. Trong môi trƣờng đông lạnh, glyxeryl ngấm vào tinh trùng thay thế nƣớc bị mất và làm tinh trùng không bị teo. Glyxeryl làm cho nƣớc đóng băng ở dạng hạt nhỏ, loại trừ đƣợc sự giãn nở của tinh thể nƣớc nội bào, chống đƣợc sự phá vỡ tế bào. Glyxeryl giữ đƣợc sự ổn định về nồng độ của các chất hòa tan, không làm thay đổi ASTT và hạn chế việc phá hủy các protein của tinh trùng. + Lòng đỏ trứng: lòng đỏ trứng có tác dụng ''bảo vệ'' cho tinh trùng chống đƣợc hiện tƣợng choáng lạnh, chức năng này đƣợc thực hiện nhờ một dạng lipit của lòng đỏ trứng. Trong lòng đỏ trứng gà lipit chiếm 32,6%. Lipit lòng đỏ trứng gà có cấu tạo phức tạp, thành phần của chúng gồm: glyxeryl 62,3%, photpholipit 32,8%, steron 4,9% (Nguyễn Tấn Anh, 1996) [3]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Độ pH của lỏng đỏ trứng hơi toan (pH 6 - 6,7), nên khi pha lòng đỏ trứng vào môi trƣờng có thể làm giảm pH của môi trƣờng xuống hơi toan. pH này có lợi cho tinh trùng. - Chất kháng khuẩn trong môi trường Để hạn chế tác hại của vi khuẩn với tinh trùng ngƣời ta bổ sung vào môi trƣờng các chất kháng khuẩn với nồng độ thích hợp. Các chất kháng khuẩn gồm: penicillin, streptomycin, amykacin. - Chất ''rửa sạch'' môi trường Trong tinh thanh của tinh dịch gia súc có những kim loại đa hóa trị nhƣ Ca, Mg… Theo Mann (1956) (trích dẫn theo Telesforo Bonadonna, 1967) [49] và Hefez (1960) trích dẫn theo Lê Xuân Cƣơng(1985) [5] thì trong tinh dịch lợn có chứa: Ca 5mg/100ml; Mg 11mg/100ml. Chính những nguyên tố này làm tăng cƣờng quá trình chuyển hóa của tinh trùng thông qua hoạt hóa các enzym trong tinh trùng. Trong bảo tồn tinh dịch cần vô hiệu hóa tác hại của các nguyên tố trên. Do đó, trong một số môi trƣờng đông lạnh đều có Trilon B (EDTA). Công thức của EDTA: Na2C10H14N2O8.2H2O EDTA trong môi trƣờng có một số công dụng nhƣ: liên kết các cation kim loại có trong tinh dịch (Ca+ +, Mg+ +...) tạo lên phức vô hại đối với tinh trùng. Nó còn có khả năng kìm hãm hoạt động của một số vi khuẩn và nhiều loại enzym có hại cho tinh trùng, hạn chế quá trình trao đổi chất trong tinh dịch (nhất là quá trình phân huỷ), giúp cho tinh trùng duy trì hàm lƣợng ATP, ADP ở mức độ cao, duy trì đƣợc trạng thái tiềm sinh của tinh trùng. Do đó bảo vệ đƣợc acrosomee của tinh trùng không bị phá huỷ (Plitsơcô N.T, 1965; Xerơđiuc X. I, 1971). Trích dẫn theo Nguyễn Tấn Anh [4]. - Chất bảo vệ màng của tinh trùng Trong đông lạnh tinh dịch, màng tinh trùng là cấu trúc dễ bị tổn thƣơng nhất. Để hạn chế sự phá vỡ của màng tinh trùng trong đông lạnh tinh dịch cần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 thiết phải bổ sung chất có tác dụng tăng cƣờng khả năng chịu đựng của màng. Một số tác giả đã nghiên cứu vai trò và sử dụng chất OEP (Orvus Es Paste hay Equex) trong đông lạnh tinh dịch. Thành phần cơ bản của OEP là: Sodium và Triethanollamin lauryl sulphate. Tsutsui và cộng sự (2000) [44] khi nghiên cứu ảnh hƣởng của OEP đến acrosomee trong khi đông lạnh tinh dịch chó đã chỉ ra rằng: trong môi trƣờng pha loãng có bổ sung OEP thì tỷ lệ acrosomee nguyên vẹn cao hơn hẳn so với đối chứng không sử dụng OEP. V. G. Pursel, L. L. Schulman và L. A. Johnson (1978) [37] đã chỉ ra rằng nồng độ OEP trong dung dịch đông lạnh tinh dịch từ 1 - 1,5% cho tỷ lệ acrosomee nguyên vẹn cao nhất, tinh trùng hoạt động mạnh và có khả năng thụ tinh cao hơn so với sử dụng OEP với nồng độ 0,5% và 2%. 1.3.4. Cơ sở khoa học về quy trình đông lạnh tinh dịch lợn Nhiều công trình nghiên cứu về quy trình đông lạnh tinh dịch lợn đã đƣợc các nƣớc nhƣ Nhật Bản, Hàn Quốc, Đức... đề xuất. Pursel và Johnson (1978) [37] đã đề xuất quy trình đông lạnh và giải đông tinh dịch lợn với những bƣớc nhƣ sau: Tinh dịch đƣợc thu thập theo phƣơng pháp khai thác bằng tay. Loại bỏ keo phèn ngay trong khi thu tinh dịch. Sau đó tinh dịch đƣợc pha loãng theo tỷ lệ 1:3 với môi trƣờng Androhep Plus và hạ nhiệt độ xuống 23oC sau đó là 15oC trong vòng 1 giờ 30 phút. Các mẫu tinh dịch sau đó đƣợc đƣa vào ly tâm ở điều kiện 800 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 15oC. Tinh trùng thu đƣợc sau ly tâm đƣợc pha loãng để đạt đƣợc nồng độ tinh trùng là 200.106/ml theo hai bƣớc: - Bƣớc 1: pha loãng với môi trƣờng BF5 (CE) để đạt đƣợc thể tích bằng 2/3 thể tích cuối cùng sau đó làm lạnh tinh dịch tới nhiệt độ 5oC trong vòng 2 - 2,5 giờ. - Bƣớc 2: pha loãng tinh dịch thu đƣợc với môi trƣờng FE theo tỷ lệ 1/3 thể tích cuối cùng. Sau đó để tinh dịch ở nhiệt độ 5oC khoảng 5 phút. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Tinh dịch thu đƣợc sau bƣớc 2 đƣợc đóng vào cọng rạ 5 ml và đƣa vào đông lạnh. Đông lạnh đƣợc tiến hành tuần tự theo các bƣớc: - Bƣớc 1: hạ nhiệt độ từ 5oC xuống -8oC (Tốc độ hạ nhiệt độ: 20oC/phút) - Bƣớc 2: hạ nhiệt độ từ -8oC xuống -120oC (Tốc độ hạ nhiệt độ: 69oC/phút) - Bƣớc 3: hạ nhiệt độ từ -120oC xuống -140oC (Tốc độ hạ nhiệt độ: 20oC/phút) - Bƣớc 4: đƣa mẫu tinh dịch vào bảo quản trong nitơ lỏng ở -196oC Các mẫu tinh sau khi đông lạnh đƣợc giải đông trong nƣớc nóng 50oC với thời gian là 20 giây. 1.4. Tình hình nghiên cứu đông lạnh tinh dịch lợn trong nƣớc và ngoài nƣớc 1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Theo nhà bác học nổi tiếng ngƣời Nga I.I. Ivanôp (1900) (Trích dẫn theo Nguyễn Tấn Anh [12]) “ Tinh thanh chỉ giúp cho tinh trùng hoạt động, nó không cần thiết cho quá trình thụ thai và có thể dùng tinh trùng đã đƣợc pha loãng trong các dung dịch nhân tạo để dẫn cho súc vật cái mà vẫn sinh ra đời con một cách bình thƣờng ”. Quan điểm nổi tiếng này đã đặt nền móng cho hàng loạt công trình nghiên cứu về môi trƣờng pha loãng và bảo tồn tinh dịch của vật nuôi sau này. Các tác giả ngƣời Anh là Polge và Rowson là những ngƣời đầu tiên nghiên cứu về vấn đề này. Sau đó các tác giả khác đã phát triển nó mạnh mẽ và phổ biến, trong suốt những năm 1950 và 1960, những nghiên cứu bảo tồn đông lạnh sâu tinh trùng lợn là cải tiến quy trình đông lạnh tinh dịch của bò. Kết quả là tinh trùng có khả năng hoạt động sau giải đông nhƣng không có khả năng sinh sản. Dù một vài báo cáo tuyên bố thành công trong bảo quản đông lạnh có khả năng thụ thai của tinh trùng trong một số tài liệu trƣớc năm 1970, nhƣng những kết quả nghiên cứu đó đã không thể lặp lại đƣợc. Năm 1970, nghiên cứu đầu tiên thành công trong sử dụng tinh đông lạnh cho sinh sản bằng phƣơng pháp đông lạnh và giải đông tinh dịch lợn đã đƣợc báo cáo bởi Polge Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 và cs (1979) [34]. Tuy nhiên, sự thụ tinh chỉ thành công trong vòi trứng, nghĩa là phải phẫu thuật để thụ tinh. Khả năng sinh sản sử dụng tinh đông lạnh, thụ tinh qua cổ tử cung, đã đƣợc báo cáo bởi 3 nhóm khác nhau năm 1971 (Crabo và Einarsson, 1971 [20]; Graham và cs, 1971 [25]; Pursel và Johnson, 1971 [35]). Những công bố này đánh dấu sự kết thúc một thời gian dài tình trạng không chắc chắn trong đông lạnh tinh dịch lợn, theo đó có thể đông lạnh sâu tinh trùng mà vẫn giữ đƣợc khả năng sinh sản. Sau những nghiên cứu ban đầu, nhiều cố gắng bắt đầu nhắm đến phát triển và chỉnh sửa cho hoàn chỉnh hơn quy trình đông lạnh tinh dịch lợn. Tới tận ngày nay, đông lạnh trong cọng rạ (Westendorf và cộng sự, 1975) [50] và đông viên (Pursel và Johnson, 1975) [36], là những phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng nhất. Kết quả dẫn tinh cho lợn bằng tinh đông lạnh cho thấy, lợn nái mang thai và sinh sản thành công khi sử dụng tinh đông lạnh. Tuy nhiên, kết quả thụ thai và số con sinh ra trong một ổ không cao bằng sử dụng tinh dịch lỏng. Bởi vậy, nhiều cố gắng trong thời gian dài nhằm làm sáng tỏ các vấn đề liên quan đến đông lạnh và giải đông tinh dịch, nhƣ: nguyên nhân thực tế, hạ giá thành sản phẩm, sự đồng đều trong sức sống của tinh trùng... đã đƣợc tiếp tục nghiên cứu. Việc sử dụng tinh đông lạnh hiện nay chiếm tỷ lệ nhỏ hơn 1% so với thụ tinh nhân tạo trên thế giới (Wagner và Thibier 2000) [45]. Tỷ lệ lợn đẻ do sử dụng tinh đông lạnh đạt 40 - 70% (thấp hơn 20 - 30% so với sử dụng tinh dịch lỏng) và mỗi lứa đẻ là 7 - 10 lợn con đƣợc sinh ra trong một ổ (thấp hơn khoảng 2 - 3 con so với sử dụng tinh dịch lỏng)(Almlid và Hofmo, 1996 [19]). Hiện nay, nghiên cứu đông lạnh tinh dịch trên thế giới đƣợc tiến hành rất phổ biến. Nhật Bản từ năm 1990 đã nghiên cứu thành công kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn. Trạm thực nghiệm Ibaragi thuộc Trung tâm giống quốc gia Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Nhật Bản đã thành công trong việc đông lạnh tinh dịch các giống lợn địa phƣơng có hoạt lực tinh trùng sau giải đông đạt 33% - 40%. Theo Kim.I.C (Viện nghiên cứu chăn nuôi Hàn Quốc) (2007) [30], sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh của các giống Landrace, Yorkshire, Duroc, tỷ lệ thụ thai 61,8-74,6% , số con trên ổ 8,1-8,7. Nguyên tắc cơ bản về kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn là giảm đến mức tối thiểu quá trình trao đổi chất của tế bào tinh trùng nhƣng vẫn giữ đƣợc sự cân bằng ASTT nội và ngoại bào. Việc phát minh ra cơ chế tác dụng của Glyxeryl, Ethylenglycol và lòng đỏ trứng gà trƣớc đây đã thúc đẩy sự phát triển của công nghệ này thì ngày nay với kỹ thuật tiên tiến ngƣời ta đã có thêm những hoá chất mới nhƣ Tris, BSA, Hepes là những dung dịch pha sẵn không cần đến lòng đỏ trứng gà. 1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước Về đông lạnh tinh dịch gia súc đã thành công và áp dụng mạnh mẽ trong sản xuất nhƣ tinh đông lạnh bò sữa, bò thịt tại Trung tâm đông lạnh Moncada thuộc Công ty truyền giống gia súc trung ƣơng. Đối với gia súc khác đã có một số nghiên cứu đông lạnh tinh dịch đã đƣợc công bố nhƣng chƣa hoàn chỉnh và chƣa có sản phẩm hàng hoá. Đào Đức Thà và cs (1996) [18] thuộc Viện Chăn Nuôi đã tiến hành đông lạnh tinh dịch dê Bách Thảo dạng viên. Đỗ văn Thu (2005) [15] thuộc Viện công nghệ sinh học cũng đã tiến hành đông lạnh tinh dịch cừu dạng cọng rạ. Đối với lợn, những nghiên cứu về đông lạnh tinh dịch dạng viên đã đƣợc tiến hành rất sớm tại Viện công nghệ sinh học nhƣng cũng chƣa hoàn chỉnh để có thể trở thành công nghệ phục vụ sản xuất. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng, vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Tinh dịch lợn đực Tinh dịch của một số giống lợn hiện đang đƣợc nuôi tại Viện chăn nuôi : Landrace, Yorkshire, Duroc. 2.1.2. Hoá chất và các dụng cụ thí nghiệm. - Các loại hoá chất : glucose, lactose, natri citrate, natri bicacbonate, Trilon B (EDTA), OEP (Orvus-Es-Paste), KCl, penicillin, streptomycin, amykacin, NaCl 0,9%, Cafein, nƣớc cất, nitơ lỏng, ... - Dụng cụ thí nghiệm : hệ thống kiểm tra đánh giá chất lƣợng tinh dịch (Computerized Digital Semen Analysis), bao gồm: máy vi tính có cài phần mềm Sperm Vision 3.0, kính hiển vi phản pha có camera tốc độ cao. Tủ bảo ôn, máy ly tâm lạnh, máy đo áp lực thẩm thấu osmometer, máy đếm tinh trùng SDM-5, máy đo pH (pH meter), bình nitơ, dụng cụ đông lạnh, micropipet, cọng rạ 5ml dùng cho đông lạnh tinh dịch lợn của hãng Minitab. 2.2. Yêu cầu - Tinh dịch lợn đông lạnh dạng cọng rạ có hoạt lực (A) ≥40% - Tinh dịch lợn đông lạnh dạng cọng rạ đạt tiêu chuẩn trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, trong sản xuất tỷ lệ thụ thai >50 %. 2.3. Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian: đề tài đƣợc tiến hành từ tháng 1/2008 đến tháng 12/2008. - Địa điểm: nghiên cứu đƣợc tiến hành tại Phòng thí nghiệm bộ môn Sinh lý sinh hoá và tập tính vật nuôi, Phòng nghiên cứu tế bào động vật, Trung tâm thực nghiệm và bảo tồn vật nuôi- Viện chăn nuôi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 2.4. Nội dung và phƣơng pháp nghiên cứu Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm đƣợc bố trí theo sơ đồ sau Thụ tinh trong ống nghiệm Dẫn tinh cho lợn nái Tinh dịch lợn Lựa chọn mẫu tinh đạt chất lƣợng Ly tâm Xử lý đông lạnh Cân bằng Đông lạnh Giải đông Sử dụng tinh đông lạnh Các nghiên cứu về đánh giá chất lƣợng tinh dich Các nghiên cứu về Môi trƣờng ly tâm Các nghiên cứu so sánh về phƣơng pháp ly tâm Các nghiên cứu về môi trƣờng đông lạnh Các nghiên cứu về phƣơng pháp cân bằng Các nghiên cứu về kỹ thuật đông lạnh Các nghiên cứu về phƣơng pháp giải đông Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 2.4.1. Nghiên cứu một số chỉ tiêu đánh giá chất lượng của tinh dịch lợn trước khi đông lạnh 2.4.1.1. Màu sắc tinh dịch Màu sắc của tinh dịch đƣợc đánh giá bằng mắt thƣờng ngay sau khi thu thập tinh. 2.4.1.2. Lƣợng tinh dịch trong một lần lấy tinh (V, ml) Sau khi lấy tinh, lọc bỏ ngay chất keo phèn (dùng 4-6 lớp vải màn sạch đã vô trùng, hoặc dùng giấy lọc). Tinh dịch đã lọc hứng vào lọ có khắc độ. Khi kiểm tra cần đặt ngang tầm mắt, đọc kết quả ở đáy mặt cong của tinh dịch. 2.4.1.3. Hoạt động của tinh trùng Là tỷ lệ (% ) tinh trùng hoạt động (M motility % ) gồm: + Tỷ lệ tinh trùng tiến thẳng: hoạt lực A ( progressive motility % ) + Tinh trùng hoạt động tại chỗ: L ( Local motility %) 2.4.1.4. Tinh trùng không hoạt động ( I: Immotile %) Chỉ tiêu hoạt động của tinh trùng và tinh trùng không hoạt động đều đƣợc đánh giá bằng hệ thống Sperm Vision 3.0 (Phƣơng pháp tiến hành trình bày trong phần phụ lục) 2.4.1.5.Nồng độ tinh trùng (C, triệu/ml) Nồng độ tinh trùng đƣợc đánh giá bằng máy so màu SDM-5 của hãng Minitub (Đức). ( Phƣơng pháp tiến hành trình bày trong phần phụ lục) 2.4.1.6. Tổng số tinh trùng tiến thẳng trong tinh dịch VAC ( tỷ/lần lấy tinh) VAC =V (ml)x A x C ( tr/ml) Dựa vào chỉ tiêu tổng số tinh trùng tiến thẳng để quyết định số liều tinh sản xuất. 2.4.1.7. pH của tinh dịch Sử dụng máy đo pH 2.4.1.8. Áp suất thẩm thấu Đo ASTT của tinh dịch lợn trên máy đo tự động Osmometer Type 5 của hãng Minitub (Đức). ( Phƣơng pháp tiến hành trình bày trong phần phụ lục). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 2.4.1.9. Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình - Phƣơng pháp: làm tiêu bản cố định và quan sát trực tiếp trên màn hình vi tính của phần mềm Sperm Vision. ( Phƣơng pháp tiến hành trình bày trong phần phụ lục) 2.4.1.10. Phƣơng pháp nghiên cứu acrosome của tinh trùng - Phƣơng pháp: nhỏ một giọt tinh nguyên hoặc tinh pha lên trên phiến kính. Sau đó nhỏ một giọt dung dịch Acro - stain của hãng IMV (Pháp) bên cạnh giọt tinh. Dùng đũa thuỷ tinh trộn đều, dàn mỏng tiêu bản trên phiến kính rồi để khô. Xem trên kính hiển vi phản pha với độ phóng đại 400 lần(10 x 40). Đếm số tinh trùng không còn acrosome nguyên vẹn trên tổng số tinh trùng quan sát đƣợc trên một vi trƣờng. Chúng ta nhận thấy acrosome của tinh trùng phát ra quầng sáng ở phía đầu, đó là tinh trùng còn nguyên acrosome, những tinh trùng mà acrosome bị tổn thƣơng sẽ không có quầng sáng này. Kiểm tra trên 5 vi trƣờng, tính số trung bình trong 5 vi trƣờng quan sát. Số tinh trùng còn Acrosome = tổng số tinh trùng đếm đƣợc - Số tinh trùng không còn Acrosome nguyên vẹn. Công thức tính: Acrosome (% ) = Số tinh trùng còn Acrosome × 100 Tổng số tinh trùng đếm đƣợc 2.4.2. Nghiên cứu kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn Các mẫu tinh sau khi đã đƣợc lựa chọn theo đúng tiêu chuẩn và đƣợc nghiên cứu theo phƣơng pháp phân lô so sánh để xác định kỹ thuật tối ƣu. Phƣơng pháp đông lạnh : theo phƣơng pháp của Kim In Cheul (Viện nghiên cứu chăn nuôi Hàn quốc) (2007) [30]. 2.4.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của kỹ thuật ly tâm đến sức sống của tinh trùng Phƣơng pháp tiến hành nhƣ sau: a. Chuẩn bị tinh dịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 - Tinh dịch đƣợc kiểm tra đánh giá các chỉ tiêu chất lƣợng - Lựa chọn mẫu tinh có chất lƣợng đạt tiêu chuẩn của kỹ thuật TTNT b. Ly tâm tinh dịch Chúng tôi sử dụng môi trƣờng ly tâm BTS ( Militab) và môi trƣờng ly tâm VCN (Viện chăn nuôi) - Thành phần của môi trƣờng ly tâm: + Môi trƣờng BTS: Gluco: 37g; Citrate Na: 6g; EDTA (trilon B): 1,25g; Bicacbonate Na: 1,25g; KCl: 0,74g. Tất cả pha trong 1000ml nƣớc cất. + Môi trƣờng VCN: Gluco 37g; Citrate Na : 5g; EDTA (trilon B): 1,25 g; Bicacbonate Na: 1,25g; KCl : 0,75g. Pha trong 1000ml nƣớc cất - Pha tinh dịch trong môi trƣờng ly tâm BTS và VCN tỷ lệ 1:1; nhiệt độ ly tâm: 22 0 C - Chế độ ly tâm: + Chế độ 1: tốc độ ly tâm 1500 v/p, thời gian 15 phút + Chế độ 2 : tốc độ ly tâm 2000v/p, thời gian 15 phút c. Thu thập tinh trùng sau ly tâm + Hút bỏ dung dịch phía trên trong các ống ly tâm + Lấy phần tinh trùng lắng phía đáy ống ly tâm d. Đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau ly tâm để có sự so sánh về chất lƣợng tinh trùng giữa chế độ ly tâm 1 và 2 cũng nhƣ chất lƣợng tinh trùng sau ly tâm ở hai chế độ so với trƣớc khi ly tâm. 2.4.2.2. Nghiên cứu kỹ thuật cân bằng tinh dịch Phần tinh dịch lắng ở phía đáy ống nghiệm đƣợc thu thập, pha loãng với các loại môi trƣờng đông lạnh và đƣợc cân bằng ở các bƣớc : a. Pha loãng và cân bằng bƣớc 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 - Thành phần môi trƣờng đông lạnh: + Môi trƣờng đông lạnh 1 (L.Y.E .1) gồm: nƣớc cất : 100ml; lactose: 11g; lòng đỏ trứng gà : 25ml; penicilin: 0,029g; streptomycin: 0,076gr. + Môi trƣờng đông lạnh 2 (L.Y.E. 2) gồm: Dung dịch L.Y.E.1: 91,2%; Glyxerol: 7,5%; OEP:1,3% Căn cứ vào nồng độ tinh trùng trong 1ml hỗn hợp để quyết định tỷ lệ pha loãng, nồng độ tinh trùng cần đạt đƣợc là 1.109/ml. Tinh dịch thu thập đƣợc sau ly tâm đƣợc pha loãng với môi trƣờng L.Y.E.1, mức pha loãng bằng 2/3 thể tích cuối cùng. - Cân bằng : hỗn hợp tinh dịch và L.Y.E 1 đƣợc hạ nhiệt độ từ 25oC xuống 5 oC (bằng tủ bảo ôn có trƣơng trình hạ nhiệt độ) trong vòng 2 giờ. b. Pha loãng và cân bằng bƣớc 2: Hỗn hợp sau khi pha loãng và cân bằng ở bƣớc 1 đƣợc pha loãng với môi trƣờng L.Y.E.2, mức pha loãng bằng 1/3 thể tích cuối cùng, dung dịch L.Y.E.2 đƣợc chia làm 4 lần pha với hỗn hợp trên, mỗi lần cách nhau 15 phút. Hỗn hợp đƣợc cân bằng ở nhiệt độ 50C trong 1- 2 giờ. c. Đánh giá sức sống tinh trùng ở các lần cân bằng để so sánh sự sai khác về chất lƣợng tinh giữa các lần cân bằng và ở các giống lợn d. Đóng gói tinh dịch Tinh dịch sau cân bằng bƣớc 2 đƣợc đóng thành các cọng rạ maxi - straw có thể tích 5 ml/cọng rạ với tổng số tinh trùng có trong 1 cọng rạ là 5x 109 tinh trùng (nồng độ 1x 109 tinh trùng/1ml), bằng cách dùng seringe hút tinh dịch sau đó bơm vào các cọng rạ. 2.4.2.3. Nghiên cứu đông lạnh tinh dịch trong nitơ lỏng Cọng rạ chứa tinh dịch đã cân bằng đƣợc để trong hơi nitơ lỏng, cách mặt nitơ lỏng 15cm (nhiệt độ đạt khoảng -79oC) trong thời gian 10 phút và 20 phút, sau đó đƣợc đƣa xuống nitơ lỏng ở nhiệt độ - 196oC. Sau đó đƣợc bảo Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 quản lâu dài trong nitơ lỏng. Sau khi bảo quản đánh giá sức sống của tinh trùng ở các thời gian đông lạnh khác nhau để tìm ra thời gian đông lạnh thích hợp. 2.4.2.4. Nghiên cứu kỹ thuật giải đông tinh dịch Kỹ thuật giải đông : theo phƣơng pháp của Kim In Cheul + Kỹ thuật 1 : nhiệt độ 520C, thời gian 45giây + Kỹ thuật 2 : nhiệt độ 520C, thời gian 30 giây Đánh giá sức sống của tinh trùng ở hai thời gian giải đông 45 giây và 30 giây để tìm ra thời gian giải đông tối ƣu nhất. 2.4.3. Nghiên cứu sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh 2.4.3.1. Nghiên cứu sử dụng tinh đông lạnh thụ tinh ống nghiệm Tinh dịch đông lạnh sau khi giải đông đƣợc dùng trong kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm để tạo phôi. 2.4.3.2. Sử dụng tinh dịch lợn đông lạnh phối giống cho lợn nái trong sản xuất - Giải đông tinh dịch đông lạnh - Pha loãng tinh dịch đã giải đông trƣớc khi sử dụng : Sử dụng 80 ml môi trƣờng VCN để pha loãng 5 ml tinh đông lạnh đã giải đông để phối giống cho lợn nái. 2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng chƣơng trình Excel và phần mềm Minitab 14.0. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu về một số chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch lợn trƣớc khi đông lạnh. Bảng 3.1: Một số chỉ tiêu chất lƣợng tinh nguyên trƣớc đông lạnh Chỉ tiêu Giống Landrace (n=84) (Mean ±SE mean) Yorkshire (n=60) (Mean ±SE mean) Duroc (n=68) (Mean ±SE mean) Màu tinh dịch Trắng sữa Trắng sữa Trắng sữa Mùi tinh dịch Mùi tanh tinh dịch Mùi tanh tinh dịch Mùi tanh tinh dịch V(ml) 215 ± 13,34** 275 ± 14,24** 285 ± 16,35** Motility (%) 96,04 ± 0,37a 95,24 ± 0,44b 94,88 ± 0,41c A (Progressive Motility %) 85,83 ± 0,64 a 86,07 ± 0,75 b 84,13 ± 0,71 c Nồng độ C (triệu/ml) 259,15 ± 15,24*** 274,15 ± 16,28*** 214,24±12,45*** VAC (Tỷ) 47,35 ± 12,23*** 64,78 ± 14,54*** 51,21 ± 13,24*** pH 7,34 ± 0,42d 7,35 ± 0,76d 7,41 ± 0,13d Kỳ hình (%) 6,87 ± 0,17e 6,40 ± 0,11f 7,17 ± 0,32g Acrosome % 93,1 ± 4,12h 94,5 ± 3,65i 92,45 ± 3,21k Áp suất thẩm thấu (mosm) 312,05 ± 5,96 m 308,80 ± 6,88 n 320,65 ± 6,12 o Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái giống nhau là không có ý nghĩa thống kê (p ≥ 0,05); có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) ** là có ý nghĩa thống kê (p < 0,01); *** là có ý nghĩa thống kê (p < 0,001). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Chất lƣợng tinh dịch (tinh nguyên) trƣớc khi đông lạnh là một trong những nhân tố quyết định đến chất lƣợng tinh dịch đông lạnh. Nghiên cứu chất lƣợng tinh nguyên nhằm chọn nguyên liệu tốt cho đầu vào của kỹ thuật đông lạnh. Đề tài tiến hành đánh giá chất lƣợng tinh dịch của một số giống lợn Landrace, Yorkshire, Duroc. Qua bảng 3.1 cho thấy chỉ tiêu màu sắc, mùi tinh dịch của các mẫu tinh khảo sát bình thƣờng, đạt tiêu chuẩn của tinh dịch lợn ngoại. 215 275 285 0 50 100 150 200 250 300 Thể tích (ml) Landrace Yorksire Duroc Giống Biểu đồ 3.1: Biểu đồ so sánh thể tích tinh dịch của các giống lợn Kết quả bảng 3.1 và biểu đồ hình 3.1 cho thấy: Thể tích tinh dịch (V,ml) ở các giống Landrace là 215±13,34; Yorkshire: 275±14,24; Duroc: 285±16,35. Sự sai khác giữa các giống ở mức (p<0,01). Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả: V(ml) của lợn Landrace 183,8±6,39; Yorkshire: 246,8±8,71 (Nguyễn Tấn Anh 1984) [1]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Sanada và Saito (1978) [40] cho biết lợn Landrace nuôi tại Nhật Bản có V(ml) trung bình là 212±6,39. Theo Nguyễn Thiện, Nguyễn Tấn Anh (1993) [12] thì thể tích tinh dịch lợn ngoại một lần xuất tinh biến động từ 250- 400 ml. Nhƣ vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi là phù hợp với các tác giả trên. 85.83 86.07 84.13 83 83.5 84 84.5 85 85.5 86 86.5 Hoạt lực A (%) Landrace Yorksire Duroc Giống Biểu đồ 3.2: Biểu đồ so sánh hoạt lực tinh trùng của các giống Kết quả bảng 3.1 và biểu đồ hình 3.2 cho thấy. Chỉ tiêu hoạt lực A (Progressive. Motility %) ở các giống tƣơng ứng là 85,83 ± 0,64; 86,07 ± 0,75; 84,13 ± 0,71. Sự sai khác của chỉ tiêu này giữa các giống có ý nghĩa thống kê (p< 0,05). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cao hơn kết quả nghiên cứu của Lƣơng Tất Nhợ (1980) [10], Nguyễn Tấn Anh 1984 [1]: trong thụ tinh nhân tạo lợn, một số giống lợn ngoại nuôi ở nƣớc ta có hoạt lực tinh trùng trung bình 70%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 259.15 274.15 214.24 0 50 100 150 200 250 300 Landrace Yorksire Duroc Giống Nồng độ C (triệu/ml) Biểu đồ 3.3: Biểu đồ so sánh nồng độ C (tr/ml) của các giống Kết quả bảng 3.1 và biểu đồ hình 3.3 cho thấy: chỉ tiêu nồng độ tinh trùng C (tr/ml) ở các giống Landrace là 259,15±15,24; Yorkshire: 274,15±16,28; Duroc: 214,24±12,45; nồng độ C giữa các giống có sự sai khác rõ rệt (p< 0,001). Theo kết quả nghiên cứu của Gottasdi L.L(1980) [24]; Ito Niwa (1984) [28] nồng độ tinh trùng của lợn Landrace là 245±39,14; Large White là 227±18,24; Nguyễn Thiện và cs (1976) [11] chỉ tiêu này của Landrace từ 200-260 tr/ml; Lê Quang Long (1976) [9]. Nồng độ tinh trùng ở lợn Landrace 196 tr/ml; Yorkshire 112 tr/ml, thì kết quả nghiên cứu của chúng tôi bằng và cao hơn kết quả nghiên cứu của các tác giả trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 47.35 64.78 51.21 0 10 20 30 40 50 60 70 Landrace Yorkshire Duroc Giống VAC(Tỷ) Biểu đồ 3.4: Biểu đồ so sánh VAC (tỷ) trong một lần lấy tinh Kết quả bảng 3.1 và biểu đồ hình 3.4 cho thấy: VAC của các giống Landrace, Yorkshire, Duroc tƣơng ứng là 47,35±12,23; 64,78±14,54; 51,21±13,24. Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Tấn Anh (1984) [1] chỉ tiêu VAC ở giống lợn Landrace là 36,05±1,24; Yorkshire là 45,1±1,73 tỷ. Kết quả nghiên cứu các chỉ tiêu pH, tỷ lệ kỳ hình, acrosome tinh trùng, áp suất thẩm thấu tinh dịch cuả các giống lợn trong thí nghiệm ở bảng 3.1 cho thấy: pH tinh dịch ở lợn Landrace là 7,34±0,42; Yorkshire: 7,35±0,76; Duroc: 7,41±0,13. Theo Lƣơng Tất Nhợ và cs (1980) [10] pH tinh dịch lợn nuôi tại Việt Nam biến động từ 7,1-7,3; V.K. Milovanov và Socolopscaia (1962) [32]: 7,1-8,0; Rigau và cs (1996) [39] chỉ tiêu này là 7,4±0,2. Không có sự sai khác giữa các giống ( p ≥ 0,05). Tỷ lệ kỳ hình ở lợn Landrace là: 6,37±0,17; Yorkshire: 6,40±0,11; Duroc: 6,87±0,32. Theo Nguyễn Thiện và ctv (1976) [11] tỷ lệ kỳ hình của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 lợn ngoại là 4,6%. Halfer (1976) trích dẫn theo Nguyễn Tấn Anh [4] tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng dao động từ 10-30%, nhƣ vậy kết quả nghiên cứu của chúng tôi nằm trong phạm vi nghiên cứu của các tác giả trên. Theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 1959-76) [17] thì tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong tinh dịch sử dụng để TTNT phải nhỏ hơn 10%. Tỷ lệ acrosome còn nguyên vẹn ở lợn Landrace, Yorkshire, Duroc tƣơng ứng là: 93,1±4,12; 93,5±3,65; 92,45±3,21. Theo kết quả trên, tinh dịch của 3 giống lợn trên có tỷ lệ acrosome nguyên vẹn tƣơng đối cao đáp ứng đƣợc yêu cầu phẩm chất tinh dịch đƣa vào thí nghiệm. Theo Pursel và cs (1971) [35] nghiên cứu trên lợn Landrace, Yorkshire chỉ tiêu này là trên 90%. Theo một số nghiên cứu và quy trình thụ tinh nhân tạo mới đây cho thấy chỉ tiêu acrosome có ảnh hƣởng quyết định đến số lƣợng tinh trùng trong 1 liều tinh. Công ty Kubus (Tây Ban Nha) đƣa ra tiêu chuẩn liều tinh dịch nhƣ sau: nếu tỷ lệ acrosome 92-100% thì cần 2,5 tỷ tinh trùng/1 liều tinh; tƣơng ứng khi acrosome 82-92% thì cần 3,0 tỷ; 72-81% thì cần 3,5 tỷ; 62-71% cần 4 tỷ; 52- 61% cần 5 tỷ và khi tỷ lệ này từ 0-51% thì tinh dịch bị loại bỏ. Kết quả nghiên cứu áp suất thẩm thấu (mosm) của các giống lợn Landrace là: 322,05±5,96; Yorkshire: 318,80±6,88; Duroc: 320,65±6,12.Có sự sai khác giữa các giống ở chỉ tiêu này (p<0,05); theo các tác giả: Nguyễn Tấn Anh (1984) [1] là từ 290-334 mosm; 344,8±1, Joaquín, Gadea (2003) [29]: 290-300 mosm, Fraser L (2001) [22]: 250-300 mosm. Các chỉ tiêu tỷ lệ kỳ hình, tỷ lệ acrosome còn nguyên vẹn, áp suất thẩm thấu có sự sai khác giữa các giống có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Ngoài những chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng tinh dịch ở trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hoạt động của tinh trùng thông qua các chỉ tiêu: khoảng cách của các dạng chuyển động của tinh trùng: DCL (µm); DAP (µm); DSL (µm). Tƣơng ứng với mỗi dạng chuyển động là vận tốc chuyển động của tinh trùng là: VCL (µm/giây); VAP (µm/giây); VSL (µm/giây). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Bảng 3.2. Khoảng cách và vận tốc của tinh trùng ở các giống lợn Chỉ tiêu Giống lợn Landrace (Mean ±SEmean) Yorkshire (Mean ±SEmean) Duroc (Mean ±SEmean) n= 84 n= 60 n= 68 DCL (µm) 73,09±1,13a 56,89±1,33b 56,33±1,15b DAP (µm) 40,54±0,63c 33,74±0,74d 32,18±0,69d DSL (µm) 23,84±0,41e 22,89±0,49f 20,62±0,46f VCL(µm/giây) 171,23±2,61g 131,29±3,07h 130,47±2,89h VAP(µm/giây) 95,25±1,48j 78,01±1,74k 75,88±1,63k VSL(µm/giây) 56,47±0,94i 53,16±1,11m 49,33±1,04m Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái giống nhau là không có ý nghĩa thống kê( p≥0,05); có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Qua bảng 3.2 hầu hết các chỉ tiêu trên của lợn Landrace cao nhất, sự sai khác giữa các giá trị trung bình của các chỉ tiêu so với các giống còn lại có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Các chỉ tiêu trên ở hai giống lợn Yorkshire, Duroc không có sự sai khác (p≥0,05). Theo P. Thilmant (2001) [48] thì VCL của tinh trùng lợn nằm trong khoảng 128-133 (µm/giây); VAP từ 70,9 -74,7 (µm/giây), VSL từ 50,6-53,8 (µm/giây). Kết quả của chúng tôi không có sự sai khác với các kết qủa của P. Thilmant. Nhƣ vậy, kết quả thu đƣợc từ các chỉ tiêu chất lƣợng tinh dịch, những giống lợn sử dụng trong nghiên cứu này có chất lƣợng tinh dịch tốt, đạt tiêu chuẩn trong kỹ thuật thụ tinh nhân tạo theo tiêu chuẩn TCVN, 1959-76 [17] và đây là nguyên liệu đầu vào đạt tiêu chuẩn tốt trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 3.2. Kết quả nghiên cứu về kỹ thuật đông lạnh tinh dịch lợn 3.2.1.Kết quả nghiên cứu kỹ thuật ly tâm Những mẫu tinh dịch đạt tiêu chuẩn, đƣợc pha với môi trƣờng ly tâm (môi trƣờng rửa) và ly tâm nhằm loại bỏ tinh thanh và các thành phần không có lợi, sử dụng phần tinh trùng thu đƣợc phục vụ cho các bƣớc tiếp theo. 3.2.1.1. Kết quả nghiên cứu môi trƣờng ly tâm Môi trƣờng ly tâm là môi trƣờng pha với tinh dịch để ly tâm (môi trƣờng rửa) Bảng 3.3. Đặc điểm của môi trƣờng ly tâm (n=60) Chỉ tiêu Môi trƣờng BTS (Mean ±SEmean) VCN (Mean ±SEmean) pH 7,2±0,23 7,3±0,12 Áp lực thẩm thấu (mosm) 302±12,10 304±13,21 Kết quả bảng 3.3 cho thấy: pH của môi trƣờng BTS là 7,2±0,23; VCN: 7,3±0,12; Áp lực thẩm thấu của 2 môi trƣờng tƣơng ứng là: 302±12,10 và 304±13,21. Theo Joaquín Gadea (2003) [29] tinh trùng có thể chịu đƣợc giới hạn ASTT từ 240 – 380 mosm. Nếu ASTT thấp hơn 200 mosm thì khả năng hoạt động và sức sống của tinh trùng bị suy giảm (Gilmore và cs, 1996 [23]; Fraser và cs, 2001 [22]). pH và áp lực thẩm thấu của 2 môi trƣờng có giá trị tƣơng đƣơng ở tinh dịch lợn ngoại, nhƣ vậy khi pha với tinh dịch không làm ảnh hƣởng đến sức sống tinh trùng 3.2.1.2. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng. Mẫu tinh thí nghiệm đƣợc phân thành 2 phần và pha trong 2 môi trƣờng ly tâm : VCN, BTS. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của hai môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng n Chỉ tiêu Trạng thái tinh dịch Tinh nguyên (Mean ±SEmean) Tinh pha với môi trƣờng VCN (Mean ±SE mean) Tinh pha với môi trƣờng BTS (Mean ±SE mean) 70 Motility (%) 95,39±0,23 a 95,20±0,32 b 95,28±0,22 b 70 Hoạt lực A (Progressive Motility %) 85,34±0,40 c 85,16±0,34 d 85,14±0,64 d Ghi chú: Trong cùng một dòng, sự sai khác giữa các giá trị trung bình có một chữ cái giống nhau là không có ý nghĩa thống kê( p≥0,05), có một chữ cái khác nhau là có ý nghĩa thống kê (p <0,05) Kết quả bảng 3.4 cho thấy, tỷ lệ tinh trùng hoạt động (Motility %) ở tinh nguyên là 95,39±0,23; ở môi trƣờng VCN: 95,20±0,32; ở môi trƣờng BTS: 95,28±0,22. Hoạt lực A (Progressive.Motility %) của tinh nguyên, tinh pha trong môi trƣờng VCN và BTS tƣơng ứng là: 85,34±0,40; 85,16±0,34; 85,14±0,64. Sự sai khác về các chỉ tiêu sức sống của tinh trùng ở tinh nguyên và tinh pha có ý nghĩa thống kê (p<0,05). Nhƣng không có sự sai khác giữa hai môi trƣờng (p≥ 0,05). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 95.39 95.2 95.28 85.34 85.16 85.14 80 82 84 86 88 90 92 94 96 % Motility (%) Hoạt lực A (%) Tinh nguyên VCN BTS Biêủ đồ 3.5: Biêủ đồ so sánh Motility (%), A (Progressive.Motility %) tinh trùng trong 2 môi trƣờng ly tâm Qua biểu đồ ở hình 3.5 chúng tôi thấy không có sự sai khác về chỉ tiêu Motility (%) và A (Progressive.Motility %) của tinh trùng ở các môi trƣờng. Nhƣ vậy, có thể dùng hai môi VCN và BTS làm môi trƣờng ly tâm. Tuy nhiên, căn cứ vào kết quả nghiên cứu trên, trong thí nghiệm này chúng tôi chỉ sử dụng môi trƣờng VCN để làm môi trƣờng ly tâm nhằm đánh giá ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của các giống lợn. 3.2.1.3. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm VCN đến sức sống tinh trùng của các giống lợn. Kết quả bảng 3.5 cho thấy, ở lợn Landrace các giá trị trung bình của các chỉ tiêu sức sống tinh trùng Motility (%), A ((Progressive.Motility %) ở tinh pha là 96,03± 0,38; 85,23± 0,64 và tinh nguyên là 96,04±0,38; 85,83±0,64 có sự sai khác (p<0,05), nhƣng ở các chỉ tiêu còn lại có sự sai khác (p<0,01). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Landrace. Chỉ tiêu n Tinh nguyên (Mean ±SEmean) Tinh pha (Mean ±SEmean) Motility (%) 84 96,04±0,38 96,03±0,38 A (Progressive Motility %) 84 85,83±0,64 85,23±0,64 DCL (µm) 84 73,09±1,13 67,36±1,13 DAP (µm) 84 40,54±0,63 37,51±0,63 DSL (µm) 84 23,84±0,41 22,11±0,42 VCL(µm/giây) 84 171,23±2,61 159,48±2,6 VAP(µm/giây) 84 95,25±1,48 89,11±1,47 VSL(µm/giây) 84 56,47±0,94 52,88±0,94 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Yorkshire Chỉ tiêu n Tinh nguyên (Mean±SE mean) Tinh pha (Mean±SE mean) Motility (%) 60 95,25±0,45 94,81±0,45 A (ProgressiveMotility %) 60 86,07±0,76 85,80±0,76 DCL (µm) 60 56,90±1,33 51,19±1,33 DAP (µm) 60 33,74±0,74 28,69±0,74 DSL (µm) 60 22,89±0,49 20,46±0,49 VCL(µm/giây) 60 131,29±3,08 115,32±3,08 VAP(µm/giây) 60 78,01±1,74 64,88±1,74 VSL(µm/giây) 60 53,17±1,11 46,45±1,11 Kết quả bảng 3.6 cho thấy, ở lợn Yorkshire các giá trị trung bình của tinh nguyên ở các chỉ tiêu đánh giá sức sống tinh trùng Motility (%) là Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 95,25±0,45; A (Progressive.Motility %): 86,07±0,76. Ở tinh pha các giá trị tƣơng ứng là 94,81±0,45 và 85,80±0,76. Các giá trị trung bình của các chỉ tiêu trên ở tinh nguyên và tinh pha có sự sai khác (p<0,05), nhƣng ở các chỉ tiêu còn lại có sự sai khác (p<0,01). Bảng 3. 7. Ảnh hƣởng của môi trƣờng ly tâm đến sức sống tinh trùng của giống lợn Duroc Chỉ tiêu n Tinh nguyên (Mean±SE mean) Tinh pha (Mean±SE mean) Motility (%) 68 94,88±0,42 94,13±0,42 A (Progressive.Motility %) 68 84,14±0,71 84,0±0,71 DCL (µm) 68 56,33±1,15 55,12±1,25 DAP (µm) 68 32,18±0,70 31,98±0,70 DSL (µm) 68 20,63±0,46 20,05±0,46 VCL(µm/giây) 68 130,47±2,89 128,22±2,89 VAP(µm/giây) 68 75,88±1,64 73,44±1,64 VSL(µm/giây) 68 49,34±1,04 48,74±1,04 Kết quả nghiên cứu ở lợn Duroc cũng cho nhận xét tƣơng tự: các giá trị trung bình của các chỉ tiêu đánh giá sức sống tinh trùng Motility (%), A (Progressive Motility %) ở tinh pha và tinh nguyên có sự sai khác (p<0,05), nhƣng ở các chỉ tiêu còn lại có sự sai khác (p<0,01). Kết quả bảng 3.5; 3.6; 3.7 cho thấy sức sống tinh trùng ở tinh nguyên của lợn Yorkshire cao nhất, sau đó là Landrace và cuối cùng là Duroc. Và ở tinh pha cũng cho kết quả tƣơng tự. Các giá trị trung bình của các chỉ tiêu đánh giá sức sống tinh trùng có sự sai khác (p<0,05). Điều đó chứng tỏ chất lƣợng tinh pha có phụ thuộc vào chất lƣợng tinh nguyên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 85.83 86.07 84.14 85.23 86.8 84 82.5 83 83.5 84 84.5 85 85.5 86 86.5 87 Hoạt lƣc A (%) Tinh nguyên Tinh pha Landrace Yorkshire Duroc Biêủ đồ 3.6: Biểu đồ so sánh hoạt lực (A) tinh trùng ở tinh nguyên và tinh pha trong môi trƣờng ly tâm (VCN). 3.2.1.4. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của chế độ ly tâm đến sức sống tinh trùng của các giống lợn. Kỹ thuật ly tâm là một khâu rất quan trọng trong kỹ thuật đông lạnh tinh dịch. Nếu chế độ ly tâm phù hợp sẽ giúp loại bỏ đƣợc nhiều tinh thanh, thu đƣợc lƣợng tinh trùng tối đa trong tinh dịch, không gây những tổn thƣơng đến cấu trúc của tinh trùng. Sau khi pha tinh dịch với môi trƣờng ly tâm, chúng tôi tiến hành ly tâm tinh pha ở nhiệt độ 220C trong thời gian 15 phút với tốc độ ly tâm 1500 v/phút và 2000 v/phút nhằm tìm ra chế độ ly tâm thích hợp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của tốc độ ly tâm đến sức sống tinh trùng (n=70) Chỉ tiêu Tinh dịch trƣớc khi ly tâm (Mean ±SEmean) Chế độ ly tâm 1500 v/p (Mean ±SEmean) 2000v/p (Mean ±SEmean) Motility (%) 95,28±0,37*** 94,95±0,48** 92,28± 0,48** A (Progressive.Motility %) 85,12±0,63 *** 82,58± 0,9