Luận văn Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi khuẩn bacillusphân lập từ đất vườn sinh protease kiềm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Nguyễn Thị Trần Thụy NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN CHỦNG VI KHUẨN BACILLUS PHÂN LẬP TỪ ĐẤT VƯỜN SINH PROTEASE KIỀM Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS. LƯƠNG ĐỨC PHẨM Thành phố Hồ Chí Minh - 2009 LỜI CẢM ƠN Luận văn được hoàn thành bởi sự nỗ lực của bản thân, sự giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp và những người thân trong gia đình. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Lương Đức Phẩm, người đã tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn. Cô Trần Thanh Thủy đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn Ban lãnh đạo, cùng các thầy cô giáo Khoa Sinh, trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã tổ chức và thực hiện thành công khóa đào tạo thạc sĩ chuyên ngành Vi Sinh Vật (2006 – 2009) , tạo cơ hội học tập nâng cao trình độ về lĩnh vực mà tôi tâm huyết. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường trung học phổ thông Ngô Quyền, phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Xin gửi lời cảm ơn Phòng khoa học công nghệ - sau đại học, trường Đại học sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành đúng tiến độ. MỞ ĐẦU Ngày nay với các hiểu biết của mình về vi sinh vật con người đã sử dụng chúng vào trong các lĩnh vực sản xuất khác nhau như công nghiệp, nông nghiệp, y học... để phục vụ cho đời sống của con người. Ta biết rằng trong quá trình sống của thế giới sinh vật luôn xảy ra các phản ứng hóa sinh để chuyển hóa vật chất. Các phản ứng này luôn gắn chặt với sự có mặt của enzim với hiệu suất xúc tác cực kì lớn so với các chất vô cơ và hữu cơ khác và có tính đặc hiệu cao. Do đó các chế phẩm enzim thường được sử dụng rộng rãi trong y học, trong công nghiệp, sản xuất thực phẩm và trong chăn nuôi... Trong đó protease là nhóm enzim được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực công nghiệp. Người ta có thể thu enzim protease từ nhiều nguồn khác nhau như từ động vật, thực vật và vi sinh vật. Song trong cơ thể động vật và thực vật quá trình tổng hợp enzim thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể vì vậy muốn thu được enzim cần phải phá bỏ các tổ chức đó. Nguyên liệu động vật để sản xuất enzim thường phải tươi lấy ngay sao khi động vật vừa bị giết chết và bảo quản ở -200C, thời gian thu hoạch dài làm cho việc sử dụng động vật và thực vật để sản xuất enzim là không kinh tế và không thể đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzim. Trong khi đó các vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn có chứa rất nhiều loại enzim có hoạt tính cao. Chúng lại có khã năng chuyển hóa các chất và sinh sản nhanh, nguồn nguyên liệu nuôi cấy vi khuẩn lại thường rẻ tiền, người ta có thể dể dàng điều khiển sự tổng hợp enzim từ các nguồn nguyên liệu khác nhau. Trong các nguồn protease từ vi sinh vật có nhiều triển vọng nhất là việc thu protease từ vi khuẩn Bacillus vì thường có hoạt tính cao và có nhiều ưu thế hơn hẳn. Xuất phát từ thực tế đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu, phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus sinh enzim protease từ đất vườn”. Với các nội dung sau:  Phân lập và tuyển chọn các chủng Bacillus từ đất vườn.  Nghiên cứu hình thái tế bào và khuẩn lạc, một số đặc tính sinh học cơ bản.  Nghiên cứu nuôi cấy trên môi trường tiêu chuẩn và môi trường thay thế để thu được sinh khối lớn và hoạt tính enzim protease cao.  Nghiên cứu phương pháp tách chiết và thu nhận chế phẩm protease có hoạt lực cao.  Ý nghĩa của đề tài  Ý nghĩa khoa học Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái của tế bào và khuẩn lạc của một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, các điều kiện, các yếu tố môi trường và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến việc thu sinh khối và thu enzym protease của vi khuẩn.  Ý nghĩa thực tiễn Dựa trên những gì thu được trong quá trình nghiên cứu góp phần giúp xác định được một số môi trường dinh dưỡng phù hợp có thể ứng dụng vào qui mô sản xuất lớn hơn để thu sinh khối hoặc thu chế phẩm enzym protease có hoạt tính cao. CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Vi khuẩn Bacillus 1.1.1. Đặc điểm chung Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, không khí do chúng có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Phần lớn các chủng thuộc các loài của giống này đều có khả năng sinh ra nhiều - amylase và protease kiềm, có một số chủng sinh ra xenlulase, giống này không sinh ra lipase.  Bacillus là vi khuẩn Gram dương  Hình dạng: hình que có kích thước khác nhau (0,5-2,5)x(1,2-10)m.  Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng di động.  Dinh dưỡng : Là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ  Chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện.  Bacillus có khả năng sinh bào tử. Thông thường bào tử được tạo ra khi tế bào đã trãi qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc tố, vì chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm. Bào tử của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những điều kiện sống bất lợi.  Đa số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số phù hợp với pH = 9 – 10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như Bacillus acidocaldrius.[7]  Về nhiệt độ có nhiều chủng ưa nhiệt độ cao (450C – 750C), hay ưa lạnh (50C – 250C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 340C – 370C. Hầu hết Bacillus không gây độc cho người và động vật. Một số loại gây độc cho côn trùng . Chùng có khả năng sinh enzim ngoại bào do đó được ứng dụng nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường, nông nghiệp.... Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên: 1.1.1.1. Bacillus subtilis [4], [14], [17], [18] Bacillus subtilis được nhà khoa học cùng thời với Rober Knoch tên là Ferdinand Cohn phát hiện và đặt tên năm 1872 Bacillus subtilis phân bố nhiều trong đất đặc biệt là cỏ khô nên còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô. Hình dạng: có dạng hình que, ngắn và nhỏ, kích thước 0,6 x (3-5) m. Bacillus subtilis là vi khuẩn gram dương, đôi khi các tế bào nối lại với nhau tạo thành chuổi dài, ngắn khác nhau hoặc các tế bào đứng riêng rẽ. Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám trắng, hoặc tạo ra lớp màng mịn, lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn hoặc mép lồi lõm nhiều hay ít, bám chặt vào môi trường thạch. Bacillus subtilis có lớp màng nhày (giáp mạc), được cấu tạo chủ yếu từ polypeptit chủ yếu là axit polyglutamic. Việc hình thành màng nhày giúp vi khuẩn có khả năng chịu được điều kiện khắc nghiệt nhờ màng nhày có khả năng dự trữ thức ăn và bảo vệ vi khuẩn tránh bị tổn thương khi khô hạn. Màng nhày có thể quan sát được khi nhuộm tiêu bản: qua kính hiển vi ta có thể nhìn thấy màng nhày của vi khuẩn Bacillus subtilis là không màu, trong suốt, tế bào của vi khuẩn bắt màu đỏ trên nền tiêu bản xanh hoặc đen. Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Bacillus subtilis là 360C – 500C, tối đa khoảng 600C, là loại ưa nhiệt cao. Bào tử của Bacillus subtilis cũng chịu được nhiệt khá cao. Bào tử có hình bầu dục, kích thước 0,6m – 0,9m. Phân bố không theo nguyên tắc chặt chẽ nào, lệch tâm, gần tâm nhưng không chính tâm. Chúng phát tán rộng rãi, được tạo ra vào cuối thời kì sinh sản của vi khuẩn. Do mỗi tế bào chỉ tạo ra một bào tử nên đây không phải là một hình thức sinh sản mà chỉ là một hình thức thích nghi giúp vi khuẩn vượt qua các điều kiện sống bất lợi. Bào tử có thể sống từ vài năm đến vài chục năm. Đã có những chứng cứ về việc duy trì sức sống trong 200-300 năm của bào tử Bacillus subtilis [6]. Khi gặp điều kiện thuận lợi những bào tử này sẽ phục hồi và tiếp tục chu kì sống của mình. Các vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng phân hủy pectin và polysaccarit ở mô thực vật và góp phần tạo ra các nốt trên củ khoai tây bi u. Chúng sinh trưởng trên môi trường nguyên thủy xác định mà không cần bổ sung thêm yếu tố kích thích sinh trưởng. Sự sinh trưởng phát triển của chúng góp phần làm hỏng các nguyên liệu có nguồn gốc động thực vật. Chúng không sinh trưởng trên thực phẩm có tính axit ở điều kiện tối ưu. Chúng là nguyên nhân gây hỏng bánh mì và nhiều thực phẩm khác [16]. Bacillus subtilis sinh ra rất nhiều loại enzim, đặc biệt là  amylase và protease kiềm có giá trị cao, ngoài ra Bacillus subtilis có khả năng sinh ra riboflavin ( tiền vitamin B2 )[3]. Vì vậy chúng được ứng dụng nhiều trong công nghiệp cũng như một số ngành khác. 1.1.1.2. Bacillus megaterium Megaterium có nghĩa là “ con thú lớn”. Tế bào của nó khá lớn, gấp 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, chiều ngang (1,2-1,5)m có thể đến 2m, dài từ 3m -12m, ở các giống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dinh dưỡng dự trữ (hạt mỡ, glycogen) [4]. Bào tử lớn hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 x (0,7 – 1)m, bào tử lớn nhất có đường kính từ 1,2 – 1,5 m. Chúng nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc xiên của tế bào.[4] Khuẩn lạc tròn đều, không thùy, không nếp, mép tròn đều hoặc hơi lượn sóng, lồi nhẵn, nhưng thường có vòng viền quanh đồng tâm trên bề mặt, màu trắng sữa hay đục. Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kì một yếu tố sinh trưởng nào. Bacillus megaterium cũng sản sinh ra các enzim tương tự như Bacillus subtilis nên cũng được ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp. 1.1.1.3. Bacillus mensentericus Bacillus mensentericus rất giống Bacillus subtilis. Thường có trong đất, hạt mì và ngũ cốc và đặc biệt là trên khoai tây và cỏ khô. Hình dạng tế bào hình que mảnh, dài ngắn khác nhau (3-10)x(0,5- 0,6)m. Đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuổi dài. Khuẩn lạc ăn sâu và bám chặt vào môi trường thạch, nhăn nhúm, khô không mọc lan ra môi trường thường có màu màu xám nhạt hoặc trắng hơi vàng kem, vàng nâu, hồng hoặc đen.[4] Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của Bacillus mensentericus là 36 - 450C tối đa là 50 – 550C, ở pH từ 4,5 – 5 thì nó ngừng phát triển. Bào tử của Bacillus mensentericus thường có hình bầu dục và dài khoảng 0,5 – 0,9 m, nắm ở vị trí bất kì trong tế bào, tế bào thường không phình to khi mang bào tử. Bacillus mensentericus có hoạt tính enzim amylase và protease cao hơn hẳn Bacillus subtilis nhưng lên men đường lại kém hơn. Hai loại trực khuẩn này rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây nhiễm và làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các thực phẩm có chứa nitơ và các sản phẩm giàu đường, đây cũng là loại được ứng dụng vào ngành công nghệ sản xuất enzim protease và amylase... Ngoài ra nó còn sinh ra một hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn( như Vibrio) gọi là Bacterioxin. 1.1.1.4. Bacillus cereus Tế bào của Bacillus cereus dày, kích thước (1 – 1,5) x (3 -5)m, có khi dày hơn, chúng thường đứng riêng rẽ hay xếp thành chuổi. Bào tử có hình bầu dục kích thước 0,9 x ( 1,2 – 1,5 )m nắm lệch tâm, tế bào chất của nó có chứa các hạt và không bào.[4] Khuẩn lạc của Bacillus cereus là khuẩn lạc phẳng, khá khuyếch tán, hơi lõm, trắng đục, mép lồi lõm [4]. Bào tử của nó phát tán khắp nơi, trong đất, không khí... Thường sinh sôi và nảy nở trên thực phẩm và có thể sinh ra độc tố gây ngộ độc thực phẩm. Nó còn được áp dụng để sản xuất thuốc kháng sinh. [16] 1.1.1.5. Bacillus pumilus Bào tử phát tán rộng khắp mọi nơi, thường Baccillus pumilus có mặt trong đất nhiều hơn Bacillus subtilis.[7] Khuẩn lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan không ranh giới. Tế bào của nó gần giống với tế bào của Bacillus subtilis.[7] 1.1.1.6. Bacillus polymyxa Tế bào của Bacillus polymyxa có kích thước (0,6 – 1 ) x (2 -7)m, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi hoặc chuổi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào đó sẽ phồng lên hình quả chanh. [4] Khuẩn lạc của Bacillus polymyxa không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, nhày, lan dần ra xung quanh, mép đôi khi có thùy.[18] Bào tử hình bầu dục kéo dài, trên bề mặt cắt ngang như hình sao. Chúng phát tán rộng, kích thước dài khoảng ( 1,7 – 2,6) m, nằm giữa tế bào. Loại vi khuẩn này làm giảm pectin và polysaccarit trong cây. Chúng còn có khả năng cố định đạm. Chúng thường sinh trưởng và phát triển trên thực vật đang bị hỏng. Vì vậy, người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm. Môi trường kem và những môi trường có tính axit yếu phù hợp với loại vi khuẩn này. Chúng là nguồn để sản xuất thuốc kháng sinh polimixin. Đây là một loại vi khuẩn rất phổ biến và có ích, chủ yếu là cho công nghiệp dược. 1.1.1.7. Bacillus brevis Người ta thường tìm thấy và phân lập chúng từ đất và thực phẩm. Bacillus brevis là trực khuẩn kích thước ( 0,7 -1) x (3 -5 )m. Chúng thường đứng riêng rẽ. Bào tử hình bầu dục, có kích cỡ (0,8 – 1)m, nằm cuối tế bào làm cho đầu tế bào hơi bị phồng to lên.[4] Khuẩn lạc thường màu trắng, đôi khi có sắc vàng, lồi hoặc phẳng lấp lánh, mép răng cưa giống dạng mỡ đặc. Về nhu cầu dinh dưỡng, Bacillus brevis yêu cầu hỗn hợp axit amin cho sinh trưởng và phát triển, không cần bổ sung vitamin. 1.1.1.8. Bacillus simplex Tế bào của Bacillus simplex thường nhỏ bé , có kích thước ( 2-5)x 0,6m, thường đứng riêng rẽ không kết thành chuỗi. Khuẩn lạc giống khuẩn lạc của Bacillus cereus, phẳng khá khuyếch tán, với bề mặt hơi xù xì. hơi lõm, màu đục, mép lồi lõm. Đặc biệt khuẩn lạc của Bacillus simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi trường.[4] Bào tử có hình bầu dục, có kích thước từ 0,6 – 0,9 m, nằm lệch tâm. 1.1.1.9. Bacillus linchenniformis Bào tử của chúng chủ yếu phát tán trong đất. Chúng sinh trưởng và phát triển trên các loại thực phẩm. Đặc biệt chúng có khả năng sản xuất ra Bacitracin, một loại kháng sinh có ích trong y học, nên chúng được ứng dụng phổ biến trong công nghiệp dược và sản xuất kháng sinh dùng trong chăn nuôi làm chất kích thích sinh trưởng. 1.1.2. Một số nghiên cứu và ứng dụng của giống Bacillus ở VN và trên thế giới Hiện nay chủng Bacillus đang được ứng dụng vào rất nhiều các lĩnh vực sản xuất khác nhau để phục vụ cho đời sống của con người như : 1.1.2.1. Sinh tổng hợp enzim Ở Việt Nam công nghệ enzym gần như chưa phát triển nhiều. Tuy đã có rất nhiều các nghiên cứu đề cập đến việc sản xuất các enzym của động vật, thực vật và vi sinh vật nhưng hầu như chưa có enzym nào được sản xuất với qui mô công nghiệp. Việt Nam vẫn hoàn toàn lệ thuộc vào nguồn enzym của nước ngoài.[9] Hiện nay chủng Bacillus đang được ứng dụng để sản xuất một số enzym sau: Tên Enzym Mã số EC Nguồn Nội bào(I) / Ngoại bào (E) Sản lượng Ngành ứng dụng -Amylase 3.2.1.1 Bacillus E +++ Starch -Amylase 3.2.1.2 Bacillus E + Starch Glucose isomeraseh 5.3.1.5 Bacillus I ++ Fructose syrup Penicillin amidase 3.5.1.11 Bacillus I - Pharmaceutical Proteasei 3.4.21.14 Bacillus E +++ Detergent (Nguồn Các enzym này có vai trò trong nhiều ngành sản xuất khác nhau. 1.1.2.2. Công nghệ thực phẩm [16] Việc ứng dụng vi sinh vật vào việc chế biến thực phẩm là những công trình đầu tiên của con người trong lĩnh vực này. Ngày nay người ta ứng dụng vi khuẩn Bacillus để sản xuất ra các enzym có vai trò quan trọng trong công nghệ thực phẩm như amylase dùng để đường hóa tinh bột v.v... 1.1.2.3. Dược phẩm và y tế [16] Trong lĩnh vực bảo vệ sức khỏe con người và vật nuôi, công nghệ vi sinh vật cũng tạo ra được nhiều loại thuốc trị bệnh hữu hiệu, nhất là những bệnh nhiểm khuẩn như : kháng sinh...như penixilinase sản xuất từ Bacillus subtilis. 1.1.2.4. Nông nghiệp và đời sống [35] Trong trồng trọt các chất hoạt động do vi sinh vật sinh ra có thể dùng làm thuốc trừ sâu và bảo vệ thực vật như Bacillus thuringiensis gây bệnh cho côn trùng và các chất trao đổi có tính độc của nó được dùng như những chất diệt côn trùng đặc hiệu. 1.1.2.5. Bảo vệ môi trường [23] Vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ môi trường vì chúng tham gia vào quá trình phân hủy các chất trong vòng tuần hoàn vật chất. Nhờ có các loại vi sinh vật trong đó có vi khuần Bacillus mà các rác thải được thải ra do hoạt động sống của con người sẽ được phân hủy. 1.1.3. Hệ enzim của vi khuẩn Bacillus Bacillus có khả năng sản sinh ra nhiều loại enzim có hoạt tính cao như protease, amylase, xenlulase. 1.1.3.1. Protease Protease là enzim xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid[-CO-NH-] giữa các loại axit amin trong phân tử protein (hay các nhóm polypeptid) thành axit amin. Protease là một nhóm enzim phân giải protein (gồm proteinaza, peptidaza, desaminaza....) mà phần lớn được tế bào tiết ra ngoài và hoạt động ở bên ngoài tế bào. Protease có chức năng sinh học rất đa dạng, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa quá trình trao đổi chất ở sinh vật sống. 1.1.3.2. Amylase Amylase là các enzim xúc tác cho quá trình thủy phân tinh bột và các polyoza tương tự như dextrin, glucogen. Có hai loại amylase là: -amylase, - amylase và glucoamylase tuy nhiên các chủng Bacillus thường chỉ có khả năng tổng hợp -amylase còn không tổng hợp được - amylase và glucoamylase [9] -amylase xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết -1,4 glucozit nội mạch ở bất kì vị trí nào trong phân tử tinh bột với cơ chất là amyloza. - amylase cho sản phẩm thủy phân chủ yếu là maltoza (khoảng 87%) và một ít glucose (13%) với cơ chất là amylopectin, -amylase chỉ thủy phân liên kết 1,4 không thủy phân liên kết 1,6. Trong họ Bacillus thường gặp rất nhiều chủng phát triển ở nhiệt độ không cao nhưng lại sinh ra -amylase chịu nhiệt cao. 1.1.3.3. Xenlulase Xenlulase là một phức hệ enzim phức tạp xúc tác cho sự thủy phân xenlulose thành xenlobiose và cuối cùng thành glucose. Một phức hệ enzim xenlulase gồm 3 enzim chủ yếu đó là:  Endogluconaza hay CMC-ase: là enzim tấn công chuổi xenlulose một cách tùy tiện và phân hủy liên kết -1,4 glucozit.  Enxogluconase hay xenlobiohydrolase: giải phòng xenlobiose hoặc glucose từ đầu không khử của xenlulose, tác dụng yếu lên CMC, nhưng tác dụng mạnh lên xenlulose vô định hình hoặc xenlulose đã được phân hủy một phần.  - glucozidase hay xenlobiose : thủy phân xenlobiose và các xenlodextrin khác hòa tan trong nước. 1.2. Enzim protease 1.2.1. Sơ lược lịch sử nghiên cứu enzim [9], [34], [35] Từ trước thế kỉ 17 con người đã biết sử dụng rộng rãi các qui trình enzim trong hoạt động thực tế như làm bánh mì, bia, rượu...tuy nhiên, việc ứng dụng enzim trong giai đoạn này hoàn toàn có tính chất kinh nghiệm thuần túy. Từ thế kỉ 17 đến thế kỉ 19, người ta đã đề ra được khái niệm lên men. Vanhelmont, người Hà Lan, lần đầu tiên đã quan sát được sự tạo thành các chất khí khác với không khí trong quá trình lên men. Năm 1659, Silvius lần đầu tiên đã chỉ ra rằng tất cả các quá trình sống đều là những quá trình hóa học. Năm 1787, Pabroni cho rằng bản chất quá trình lên men và sự phân giải một chất này bởi một chất khác là “ferment”. Năm 1876, Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzim. Trong số tất cả các enzim của hệ tiêu hóa thì protease là enzim được nghiên cứu sớm hơn tất cả. Các protease ở động vật được nghiên cứu sớm nhất.  Từ thế kỉ 18, nhà tự nhiên học Pháp là Reomur đã làm thí nghiệm và đã phát hiện được rằng dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt.  Năm 1836, Schwann đã quan sát được hoạt động phân giải protein của dịch vị. Tuy nhiên, 30 năm sau mới tách được enzim này.  Năm 1857, Corvisar đã tách được tripsin từ dịch tụy, đây là protease đầu tiên nhận được dưới dạng chế phẩm, những chế phẩm này vẫn còn lẩn nhiều enzim và protein khác.  Năm 1861, Brucke đã tách được pepsin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết.  Năm 1862, Danilevxki dùng phương pháp hấp phụ trên colodion đã tách được tripsin với amylase tụy tạng.  Năm 1872, Hommarsten đã tách được chế phẩm Chymozin (renin). Ngoài ra cũng có một số nghiên cứu về protease trong máu. Schmidt (1869- 1872) đã nêu giả thuyết rằng trong máu có enzim fibrin tham gia vào quá trình làm đông máu. Tác giả cũng đã tách enzim này và kết tủa bằng cồn, chế phẩm thu được có tác dụng làm fibrinogen đông lại nhanh chóng. Các protease ở thực vật được phát hiện muộn hơn  Năm 1874, Group Besanez công bố đã thu nhận được protease từ hạt của một số loại hạt đậu đều có hoạt tính phân giải protein.  Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được protease ở thực vật. Ông thấy rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có protease, khi dùng cồn kết tủa sẽ nhận được chế phẩm không tinh khiết (100g/cây) gọi là papain.  Đến nữa đầu thế kỉ 20, người ta mới phát hiện thêm các peptid hydrolase khác như:  Bromelin protease có trong các phần khác nhau của cây dứa (Willstatter, Grassmanm, Ambros 1926).  Fixin protease có trong các cây thuộc giống Ficus (Walti, 1938) Trong khi đó các protease của vi sinh vật chỉ được chú ý nghiên cứu từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918-1919, Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn. Trong vài chục năm sau đó, số công trình nghiên cứu protease của vi sinh vật đã phát triển nhanh chóng. Một số công trình thu protease từ vi sinh vật như: Enzim, nguồn nguyên liệu Tác giả Năm Subtilizin A (Bacillus subtilis) Peptidase A (Streptococus) Protease kiềm (Aspergillus oryzae) Aspergilopeptidase A ( Aspergillus satoi) Guntelberg và Ottensen Elliot Crewther và Lennox Yoshida 1950 1950 1950 1956 Protease kiềm (Pseudomonas aeruginosa) Subtilopeptidase C ( Bacillus amyloliquefaciens ) Keratinase (Streptomyces fradiae) Elastase (Pseudomonas aeruginosa) Protease (Arthrobacter) Protease trung tính II (Bacillus amylosacchariticus) Protease kiềm ( Apergillus sydowi) Morihara Hagihara và cộng sự Nickerson, Durand Morihara Tsuzuki Hofsten và cộng sự Tsuru và cộng sự Danno, Yoshimura 1957 1958 1963 1965 1965 1966 1967 Nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease với số lượng lớn. Các enzim này có thể ở trong tế bào (nội bào) hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy (ngoại bào). Vi sinh vật là nguồn sản xuất protease tương đối l y tưởng vì nó có khá nhiều ưu điểm so với các nguồn khác như động vật và thực vật. 1.2.2. Phân loại và các đặc điểm của protease [9], [12], [17] Protease là enzim thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptid CO-NH của phân tử protein và peptid thành các axitamin tự do và một ít peptid khối lượng phân tử nhỏ. Theo kết quả nghiên cứu trên các protease từ 1950 đến nay cho thấy các protease của mỗi loài sinh vật cũng có thể khác nhau về tính chất. Hiện nay có nhiều cách gọi tên và phân loại nhóm của protease, và được thay đổi qua nhiều thời kì. 1.2.2.1. Theo phân loại quốc tế các enzim thuộc nhóm này được chia thành 4 phân nhóm phụ  Aminopeptidase: xúc tác cho việc thủy phân liên kết peptid ở đầu Nitơ của mạch polypeptid.  Cacboxypeptidase: xúc tác cho sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacbon của mạch polypeptid.  Dipeptihydrolase: xúc tác cho việc thuỷ phân các liên kết dipeptid.  Proteinase: xúc tác cho sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch. 1.2.2.2. Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzim (Barrett-1984) Theo Barrett, protease được chia thành 4 nhóm nhỏ, tên của các nhóm này gồm tên của các axit amin quan trọng nhấtcó vai trò xúc tác trong trung tâm hoạt động của enzim.  Protease serine (EC 3.4.21.): là những protease có nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động. Các protein serine này thường hoạt động ở vùng pH kiềm và có tính đặc hiệu tương đối rộng.  Protease cystein ( EC 3.4.22.): là các protein có nhóm thiol (-SH) của axit amin cystein ở trung tâm hoạt động. Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm hoạt động của enzim, vì nó có khả năng tham gia phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hoá học  Protease aspartic (EC 3.4.23.) : là những protease chứa nhóm (- COOH) trong trung tâm hoạt động. Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng pH là axit, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và có tính đặc hiệu đối với các axit amin có vòng thơm hoặc axit amin kị nước ở cả hai phía của liên kết peptit bị thủy phân.  Protease kim loại (EC 3.4.24.): Là những protease mà trong trung tâm hoạt động của chúng có những ion kim loại. Nhóm này thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính. 1.2.2.3. Phân loại theo pH tác dụng tối ưu của protease Dựa vào pH hoạt động của các protease người ta chia nó ra thành 3 loại:  Protease acid: hoạt động trong khoảng 3-3,8.  Protease base: hoạt động trong khoảng 8,5-8,9.  Protease trung tính. Tuy nhiên, tác động tối ưu của protease còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất vì cùng một loại protease của một chủng vi khuẩn, khi thủy phân casein, hemiglobin, gelatin sẽ thể hiện hoạt độ cực đại ở những giá trị pH khác nhau. 1.2.3. Tính ưu việt và các ứng dụng của protease vi sinh vật [1], [9], [14], [15] Khác với protease của thực vật và động vật, protease của vi sinh vật là những enzim ngoại bào. Hệ protease của vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzim rất giống nhau về hình dạng cấu trúc và khối lượng phân tử nên rất khó tách ra dười dạng tinh thể đồng nhất. Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzim khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để và đa dạng. Protease do vi khuẩn tổng hợp có khả năng chịu được nhiệt độ cao hơn các nguồn khác. Protease là loại enzim được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như: công nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp v.v...Ở nước ta các nghiên cứu về protease được bắt đầu từ những năm 60. 1.2.3.1. Trong công nghiệp thực phẩm Protease của vi khuẩn được sử dụng trong quá trình chế biến cá. Ở mang cá, đặc biệt là ở ruột cá nguồn vi sinh vật rất phong phú. Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá ...protease có trong ruột cá thủy phân một phần protein của cá...Trong một số trường hợp khi thêm protease sẽ làm tăng hương vị của sản phẩm. Ngoài ra protease còn được sử dụng để làm mểm thịt và tăng hương vị thịt sau khi chế biến. Nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến sẽ làm tăng hương vị thịt. Việc thủy phân protein bằng protease không phá hủy các vitamin có trong nguyên liệu, không làm sẩm màu dịch thủy phân và không tạo thành các sản phẩm phụ khác. Người ta cũng sử dụng protease để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệu giàu protein như thịt vụn, đầu cá, da...và để sản xuất thức ăn kiêng. Một số protease có khả năng làm đông sữa trong sản xuất phomat. Protease làm phomat chóng chín, nâng cao chất lượng và có thể tạo ra nhiều loại phomat khác nhau. Protease của vi khuẩn có thể thay thế một phần renin. Vì thế, ta có thể giảm giá thành trong sản xuất phomat. Protease này có thể thu từ Bacillus mesentericus. Dùng protease của vi khuẩn để thu casein kỹ thuật dùng trong các ngành khác nhau như: vecni, chất màu, hương liệu... Nó cũng được sử dụng trong sản xuất chao và các dịch thủy phân. 1.2.3.2. Trong công nghiệp nước giải khát Protease được sử dụng để làm trong bia và nước quả. Được sử dụng trong quá trình sản xuất rượu giúp phân giải các protein có tác dụng kìm hãm amylase do đó làm tăng quá trình đường hóa tinh bột. 1.2.3.3. Trong công nghiệp thuộc da Protease còn được sử dụng để làm mềm da, tăng cường khả naăng tách lông ra khỏi da mà không là ảnh hưởng đến chất lượng da, vì vậy, da thu được sẽ mềm và sạch lông hơn. 1.2.3.4. Trong mỹ phẩm Protease được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xà phòng tắm, kem bôi mặt...Do nó có tác dụng loại bỏ lớp biểu bì da đã chết làm cho da mịn. các loại xà phòng có chứa protease có tác dụng tẩy mồ hôi và các vết bẩn protein như: vết máu..khá tốt. 1.2.3.5. Trong nông nghiệp Protease được sử dụng để xử l ý các phế liệu giàu protein làm thức ăn cho vật nuôi, nhằm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và hệ số sử dụng thức ăn, có thể tiến hành bằng cách thêm trực tiếp protease vào thức ăn trước khi dùng hoặc dùng protease để xử l ý sơ bộ thức ăn. 1.2.3.6. Trong nghiên cứu khoa học Được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc protein 1.2.3.7. Trong công nghiệp dược phẩm và y học Sản xuất các chất hoạt hóa và kiềm hãm protease để điều trị các bệnh đặc trưng. Protease được sử dụng để tăng khả năng tiêu hóa protein ở những người bị tiêu hóa kém do dạ dày, tụy tạng hoạt động không bình thường do thiếu enzim. Protease còn được sử dụng để phân hủy các cục máu đông trong cơ thể để chữa bệnh nghẽn tỉnh mạch. Protease được sử dụng để làm tiêu mủ ở các vết thương, các ổ viêm, làm thông đường hô hấp... 1.2.3.8. Trong xử lý rác Hiện nay đất nước đang ngày càng phát triển, dân số tăng nhanh, khối lượng chất thải đặc biệt là rác hữu cơ trong công nghiệp, nông nghiệp và sinh hoạt tăng rất nhanh. Theo tính toán của công ty công trình đô thị I, mổi ngày người Hà Nội thải ra khoảng 1500m3 rác. Mỗi năm, một người dân ở thành phố Hồ Chí Minh trung bình thải ra 160 kg rác. Như vậy, khối lượng rác mà thành phố thãi ra mỗi năm là 360000 tấn. Phần lớn rác được đưa đến các bãi rác để đem chôn, đem đốt hoặc đổ vào các dòng nước đây là nguồn gốc lây lan của các ở bệnh tật, phát sinh ra các độc chất gây ô nhiểm không khí ảnh hưởng đến con người, vật dụng gia súc và hoa màu. Trong rác vi khuẩn thương hàn có thể tồn tại 115 ngày, vi khuẩn phó thương hàn tồn tại 136 ngày, vi khuẩn kiết lỵ 40 ngày, trứng giun đũa 300 ngày. Rác không được dọn kịp thời sẽ gây tắc nghẽn cống rãnh hoặc án ngữ đường phố, tạo môi trường tốt cho ruồi muổi và các loài trung gian truyền bệnh khác phát triển. Hiện nay, người ta xử lý rác bằng cách đốt ở các nhà máy thu hơi nhiệt cho nhà mát phát điện hoặc nhà mày hơi công nghiệp. Khi đốt như thế các chất thải là các chất tổng hợp, cao su sẽ gây ra nhiều khì độc như SO2, SO3, P2O5, NO, NO2, CO... gây hại cho sức khỏe. Nhờ tiến bộ của công nghệ sinh học, người ta đã đề ra con đường xử lý rác bằng con đường sinh học. Tức là phân hủy rác hữu cơ dưới tác dụng của vi sinh vật. Nguồn vi sinh vật có hoạt tính protease hiện hữu khá phong phú trong tự nhiên.. Người ta có thể sử dụng các vi sinh vật này để phân hủy các nguồn protein động vật và thực vật có trong rác hữu cơ. Để giải quyết vấn đề bảo vệ môi trường sống, đồng thời tận dụng phế liệu sản xuất ra những vật liệu quan trọng cho các ngành. Một trong những biện pháp tốt nhất là tái xuất phế thải làm phân bón hữu cơ, giá thể trồng nấm, nuôi giun... Trong rác có chứa một số chất hữu cơ, cũng như các yếu tố dinh dưỡng dùng để bổ sung độ phì nhiêu cho đất và làm tăng thu hoạch cây trồng. trung bình trong 10 tấn rác có 900-1900kg chất hữu cơ theo hướng này rác có thể ủ thành đống, tại đây sẽ xảy ra các quá trình phân giải các chất hữu cơ của vi sinh vật. Nhiệt độ của các đống ủ khoảng 50 0C. Muốn cho quá trình ủ rác diễn ra nhanh hơn người ta cho thêm vào đó các loại vi khuẩn như Streptomyces, Azotobacter, một số nấm mốc như Rhizobium. Ở nước ta hiện nay đã có những nhà máy ủ phân rác để bổ sung chất hữu cơ cho nông nghiệp như nhà máy DANO (hóc môn) công suất 5 tấn/ ngày. Tại đây ủ phân rác dựa trên các tác động phân hủy chất hữu cơ của vi sinh vật. Các điều kiện bên ngoài có ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi sinh vật trong quá trình ủ rác. Do đó phải tạo điều kiện cần thiết nhằm thúc đẩy mạnh hoặc khống chế hoạt động của vi sinh vật làm cho rác hoại kĩ hơn, đỡ mất chất dinh dưỡng. 1.2.3.9. Trong kỹ nghệ phim ảnh Protease từ vi khuẩn được sử dụng để tái sinh các nguyên liệu cảm quan khác nhau như phim điện ảnh, phim rơnghen, phim chụp. Nó sẽ phân giải và hòa tan lớp nhủ tương gelatin trên phim và giấy ảnh, do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quí. 1.3. Thu nhận enzim từ vi sinh vật 1.3.1. Ưu điểm của việc sản xuất enzim từ vi sinh vật [9], [16] Việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất enzim có những ưu điểm sau:  Có thể chủ động quá trình sản xuất enzim từ vi sinh vật vì quá trình sinh trưởng, phát triển và tổng hợp enzim của vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào điều kiện bên ngoài.  Chu kì sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật ngắn do đó việc sản xuất enzim từ vi sinh vật trong thời gian ngắn từ 36 – 60 giờ.  Có thể dễ dàng định hướng việc tổng hợp enzim từ vi sinh vật theo hướng sản xuất chọn lọc enzim với số lượng lớn.  Giá thành của enzim sản xuất từ vi sinh vật thấp. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường đơn giản và rẻ tiền.  Các enzim thu được từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao.  Vi sinh vật có thể cùng lúc sinh tổng hợp nhiều loại enzim khác nhau 1.3.2. Lý thuyết về sinh tổng hợp enzim cảm ứng Hiện nay người ta có thể điều khiển được tốc độ sinh tổng hợp enzim trong khi sản xuất. Các enzim tham gia thủy phân được vi sinh vật tổng hợp là những enzim cảm ứng. Hiện tượng cảm ứng trong tổng hợp enzim được Monod-Jacob tìm ra vào năm 1961, cơ chế điều khiển này thể hiện rất rõ ở vi sinh vật. Tác động của các yếu tố bên ngoài lên tế bào vi sinh vật thường là tác động trực tiếp, tế bào vi sinh vật phản ứng lại các tác động này thường cũng rất nhanh. Chính vì thế ta có thể sử dụng các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH và đặc biệt là cơ chất để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzim của vi sinh vật. Các enzim thủy phân một chất nào đó và khi có mặt chất đó trong môi trường nuôi cấy thì lượng enzim này được tổng hợp ra gấp nhiều lần so với bình thường khi không có cơ chất, được gọi là enzim cảm ứng. Các chất được đưa vào môi trường nuôi cấy để kích thích tổng hợp ra enzim cảm ứng được gọi là cơ chất cảm ứng. Cơ chất cảm ứng thường được coi là yếu tố quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzim. Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzim cảm ứng của vi sinh vật cũng sẽ tăng dần. Nhưng nếu ta vẫn cứ tiếp tực tăng nồng độ cơ chất lên đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chựng lại hoặc giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất gây nên. Như vậy, để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzim bằng cơ chất cảm ứng cần chú ý:  Có gen tương ứng trong nhiểm sắc thể của tế bào.  Có đầy đủ các nguyên liệu để xây dựng các phần tử enzim đó  Năng lượng cần thiết dùng cho tổng hợp enzim.  Muốn thu nhận enzim cảm ứng nào thì phài cho cơ chất cảm ứng của enzim đó vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật.  Tác động cảm ứng chỉ đạt hiệu quả cao ở một liều lượng nhất định. Nếu vượt quá liều lượng này sẽ làm cho quá trình tổng hợp enzim giảm. Do đó, không phải cho càng nhiều cơ chất thỉ khả năng sinh tổng hợp enzim sẽ càng cao. Bình thường khi không có cơ chất cảm ứng, chất kìm hãm có trong tế bào sẽ tương tác với gen điều khiển làm cho quá trình tổng hợp enzim bị ức chế. Khi ta cho cơ chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy, cơ chất sẽ tương tác với chất kìm hãm và các gen tương ứng. Enzim được tổng hợp sẽ phân hủy cơ chất . Khi đó chất kìm hãm sẽ không bi phong tỏa nên tương tác với gen điều khiển ức chế quá trình tổng hợp. Như vậy, muốn enzim được tổng hợp ta phải luôn cho cơ chất cảm ứng vào môi trường. Trong công nghiệp sản xuất enzim cần phải lựa chọn những cơ chất cảm ứng thích hợp và xác định nồng độ tối ưu của nó trong mội trường để có hiệu quả sinh tổng hợp cao nhất. 1.3.3. Chọn giống vi sinh vật có khả năng sinh enzim cao Không phải tất cả các loại vi sinh vật đều có khả năng sinh enzim như nhau và ngay cả những chủng của cùng một giống cũng không cùng hoạt tính sinh tổng hợp enzim. Vì vậy người ta cần phải lựa chọn trong số rất nhiều loại vi sinh vật để có được những chủng có hoạt lực cao trong việc tạo ra các enzim thuần khiết. Trong số đó Bacillus subtilis đã trở thành nguồn chủ yếu trong việc sản xuất ra nhiều loại enzim khác nhau được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực kĩ thuật. Ngoài ra để nâng cao hoạt tính của enzim người ta còn tiến hành các biện pháp gây đột biến để tác động lên bộ máy di truyền hoặc làm thay đổi đặc tính di truyền của vi sinh vật tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzim cao hơn hẳn chủng ban đầu 1.3.4. Ảnh hưởng của yếu tố môi trường lên khả năng sinh enzim Quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau. Để thu nhận được với hiệu suất cao nhất khi phân giải protein bởi sinh khối của vi sinh vật, ta cần tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy. Muốn vậy ta phải nghiên cứu kĩ các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải protein của vi sinh vật. 1.3.4.1. Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi sinh vật, khả năng sinh tổng hợp enzim của vi sinh vật, tính chất của enzim được tổng hợp. Tùy từng loài vi sinh vật nhiệt độ thích hợp có khác nhau. Các loại mốc phát triển thích hợp ở 220C – 32 0C còn các loại vi khuẩn phát triển thích hợp ở 35 0C – 55 0C. Nói chung, đa số vi sinh vật tổng hợp protease không bền nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp. 1.3.4.2. Độ pH Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp enzim ở vi sinh vật và hầu như không thay đổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật. Đối với nấm mốc pHop từ 6-6,5 và đối với vi khuẩn pHop trung tính từ 6,6-7,4. Khi dùng phương pháp bề sâu, pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai trò quyết định đối với sự phát triển và sự tích lũy protease của môi trường của vi sinh vật. Điều này thể hiện khá rõ ở các loài thuộc giống Bacillus, pH môi trường thường có thể thay đổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật, pH ban đầu thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật là đối với nấm mốc pH từ 3,8-5,6, đối với vi khuẩn là 6,2-7,4. Trong quá trình nuôi cấy tùy theo thành phần môi trường và các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất ở vi sinh vật, pH của môi trường sẽ chuyển dần về phía axit hoặc kiềm. Đối với các loài thuộc giống Bacillus, pH thường chuyển về phía kiềm. Nhiều khi có thể căn cứ vào pH của môi trường sau khi nuôi cấy để dự đoán lượng protease được tích lũy trong môi trường. Theo tác giả Lê Ngọc Tú- La văn Trứ pH môi trường ảnh hưởng đến tỷ lệ giữa các protease được tổng hợp. Do đó, nếu giữ cho pH luôn có giá trị xác định trong suốt quá trình nuôi cấy, vi sinh vật sẽ tạo thành mạnh mẽ một dạng protease xác định, chiếm ưu thế trong môi trường. 1.3.4.3. Ảnh hưởng của độ thông khí Độ thông khí trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình tổng hợp protease. Tuy nhiên, ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo từng loài vi sinh vật. Trong một số trường hợp thiếu oxi tuy kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại tăng quá trình tổng hợp protease.Sự thiếu khí mạnh sẽ kìm hãm sự tổng hợp protease. Lượng oxi thích hợp cho quá trình tổng hợp protease ở vi sinh vật có khác nhau. Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khí cũng ảnh hưởng khác nhau đến quá trình tổng hợp các protease khác nhau. 1.3.4.4. Độ ẩm Độ ẩm của môi trường lên men cũng là một yếu tố cần thiết cho sự sinh trưởng của vi khuẩn khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt. Thông thường thì các loại vi khuẩn đòi hỏi độ ẩm cao hơn nấm mốc, độ ẩm thích hợp nhất là khoảng 60-70%. 1.3.4.5. Thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy đối với vi khuẩn để sinh tổng hợp enzim cực đại là trong khoảng 36-48 giờ. Tuy nhiên để phân giải protein đạt hiệu suất cao nhất, đòi hỏi thời gian lâu hơn, để enzim phân giải đối với cơ chất tự nhiên. 1.3.5. Ảnh hưởng của thành phần môi trường Ngoài các yếu tố của môi trường thì thành phần và tỷ lệ của các chất dinh dưỡng có mặt trong môi trường nuôi cấy có ý nghĩa quyết định đến khả năng sinh tổng hợp protease của vi khuẩn. Để tăng lượng protease cho môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng... thích hợp và đặc biệt cần sử dụng chất cảm ứng. 1.3.5.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon Nguồn C thường dùng để nuôi cấy vi sinh vật là các gluxit như: mono,di, polysaccarit (tinh bột), Đặc tính và tác dụng của nguồn Cacbon phụ thuộc vào bản chất hóa học của chúng và đặc tính sinh lý của vi sinh vật. Nguồn Cacbon tự nhiên thường được dùng trong môi trường nuôi cấy là bột mì, bột đậu tương, cám và nước chiết của chúng. Nồng độ gluxit thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease cũng thay đổi tùy loài vi sinh vật. 1.3.5.2. Ảnh hưởng của nguồn Nitơ Các chất có thể dùng làm nguồn cung cấp nitơ cho vi sinh vật có thể là các chất hữu cơ hoặc các muối hữu cơ (amon, nitrat). Nhiều vi sinh vật có thể sử dụng cả nitơ của HNO3, HNO2. Giá trị dinh dưỡng của các nguồn nitơ khác nhau tùy thuộc vào lượng nitơ của nó có thể được tách ra dễ dàng dưới dạng NH3. Nguồn Nitơ hữu cơ thường có ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp protease. Vì chúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này. Các nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là các loại bột khác nhau (có chứa gluten), nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải, pepton, protein. Trong các nguyên liệu này đều có axit amin tự do tương đối thấp. Các axit amin có thể làm tăng hoặc giãm quá trình sinh tổng hợp protease như Cystein sẽ kìm hãm khả năng sinh protease axit của Aspergillus. Tác dụng kìm hãm của axit amin có thể là do khi có axit amin cần thiết tế bào có thể sử dụng được thì không cần phải tổng hợp protease nữa. Khi sử dụng phối hợp nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ sẽ làm tăng đáng kể quá trình tổng hợp protease. Nguồn nitơ vô cơ tốt nhất cho vi khuẩn thường là (NH4)2 PO4. Các muối clorua, sulphate, nitrat amon thường có ảnh hưởng không tốt đấn quá trình tổng hợp protease. Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là: Pepton, casein, albumin, bột đậu tương... Trong các nguồn này thì pepton ở nồng độ thấp thường là chất cảm ứng tốt cho quá trình tổng hợp protease. 1.3.5.3. Ảnh hưởng của khoáng chất Các hợp chất khoáng có ý nghĩa rất lớn trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật vì chúng làm thay đổi trạng thái hóa keo của tế bào chất. Photpho và lưu huỳnh cũng có ảnh hưởng đáng kể lên quá trình sinh tổng hợp protease. Các phophate vô cơ có ảnh hưởng xấu lên quá trình tổng hợp protease axit. Tuy nhiên, KH2PO4 thường có ảnh hưởng tốt lên quá trình tổng hợp các enzim thủy phân nhờ tác dụng đệm của nó. Lưu huỳnh có ảnh hưởng khác nhau lên quá trình tổng hợp protease, nó có vai trò điều hòa quá trình sinh tổng hợp protease ở vi sinh vật. Trong tế bào vi sinh vật người ta còn thấy sự có mặt của nhiều yếu tố khoáng khác như Magiê, natri, sắt,… Các vi sinh vật có thể lấy các chất khoáng này từ môi trường hay do chúng ta bổ sung vào môi trường nuôi cấy một số dạng muối khoáng hoặc có khi chúng có sẵn trong nguyên liệu pha môi trường. 1.3.5.4. Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng, NaCl, vitamin, môt số nguyên tố khác... Các chất này cũng có ảnh hưởng đến lượng protease được sinh ra trong môi trường nuôi cấy. bởi vì dưới tác dụng NaCl có thể làm thay đổi khả năng thẩm thấu của tế bào. Một số kim loại (kẽm, sắt, mangan, magiê…) là các chất hoạt hóa enzim. Chúng tham gia cấu tạo enzim và các enzim này được gọi là metaloenzim. 1.3.6. Những phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để sản xuất enzim [15] Công nghệ sản xuất enzim hiện nay trên thế giới áp dụng hai phương pháp: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm. 1.3.6.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường dinh dưỡng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng. Các chất dinh dưỡng này thường là các nguyên liệu tự nhiên như cám, các phế liệu của ngành công nghiệp thực phẩm hoặc hỗn hợp của nhiều chất. Trong môi trường dinh dưỡng ta thường cho thêm các chất cảm ứng cần thiết cho sự tổng hợp enzim nào đó hoặc một số chất dinh dưỡng bổ sung nguồn nitơ, photpho như nước chiết ngô, khoai tây, dịch nấm men…Để đảm bảo độ xốp môi trường cần có các chất làm xốp như trấu với tỷ lệ 10-20%. Trước khi gieo cấy, môi trường cần được thanh trùng để đảm bảo không bị nhiểm vi sinh vật lạ. Để nuôi bề mặt người ta thường dùng khay để trong phòng kín có hút gió. Quá trình nuôi bề mặt thường kéo dài từ 33-48giờ và trãi qua 3 giai đoạn:  Giai đoạn 1: bắt đầu từ khi cấy giống đến giờ thứ 10-12. Trong giai đoạn này xãy ra sự trương nở của bào tử và xuất hiện cuống nấm, chưa hình thành enzim. Không đòi hỏi phải thông khí nhiều.  Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 10-18 giờ. Vi sinh vật phát triển nhanh, hô hấp mạnh. Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để phúc vụ cho quá trình trao đổi chất trong tế bào làm cho nhiệt độ môi trường tăng.  Giai đoạn 3: kéo dài từ 10-20 giờ, quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần, nhiệt lượng tạo ra giảm, quá trình tạo thành enzim vẫn tiếp tục. Tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của từng giống mà thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzim tối đa. Phương pháp này có ưu điễm là nồng độ enzim thu được cao hơn so với phương pháp nuôi cấy chìm, Khả năng nhiểm trùng thấp, tốn ít điện năng, có thể sấy khô nhanh chóng đưa vào sản xuất mà không cần phải qua bước tách chiết enzim. Tuy nhiên, nó cũng có nhược điễm là tốn nhiều diện tích, khó cơ giới hóa, tự động hóa, cần nhiều lao động thủ công. 1.3.6.2. Phương pháp nuôi cấy chìm Trong phương pháp này vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng có sục khí và khuấy đảo liên tục, nguồn C thường dùng trong phương pháp này là tinh bột, rỉ đường... còn nguồn N thường là cao ngô, dịch men bia thủy phân... ngoài ra trong thành phần của môi trường cũng cần bổ sung thêm các chất khóang. Người ta cần thanh trùng môi trường nuôi cấy trước khi cấy giống bằng cách sục hơi trực tiếp ở nhiệt độ cao và trong thời gian phù hợp và phải được dịch hóa sơ bộ để tránh trường hợp tinh bột hồ hóa làm môi trường sệt lại. Sau khi làm nguội môi trường đến nhiệt độ thích hợp thì có thể tiến hành cấy giống. giống được cấy vào thường ở hệ sợi chứ không phải dạng bào tử. Quá trình nuôi cấy cần khuấy đảo và sục khí liên tục. Thời gian nuôi cấy kéo dài từ 1-4 ngày tùy loại giống. Trong nuôi cấy chìm việc khống chế pH, chế độ hiếu khí, bảo đảm điều kiện vô trùng là những điều kiện quan trọng. Phương pháp này có ưu điểm là tiết kiệm diện tích sản suất, dễ cơ giới hóa tự động hóa, enzim thu được tinh khiết hơn. Tuy nhiên, phương pháp này lại có hạn chế là lượng enzim thu được có hoạt tính không cao, tốn điện năng do cần sục khí liên tục và nếu bị nhiễm trùng thì phải bỏ tòan bộ khối môi trường. 1.3.7. Thu nhận và tinh sạch enzim protease từ môi trường nuôi cấy [15] Các chế phẩm enzim được sử dụng trong thực tế ở nhiều dạng khác nhau. Trong một số trường hợp, enzim có thể được sử dụng ở dạng thô mà không cần phải tách chiết tinh khiết như đưa vào bột giặt, thuộc da v.v... Một số khác, người ta lại cần sử dụng các enzim tinh khiết ở nhiều mức độ khác nhau nên phải tách chiết, tinh chế. Enzim rất dễ bị mất hoạt tính, vì vậy khi tinh chế enzim cần tránh gây biến tính protein làm ảnh hưởng đến họat tính của enzim nên cần tiến hành nhanh trong điều kiện nhiệt độ thấp, độ pH phù hợp... Việc thu chế phẩm enzim cần phải qua các bước sau: 1.3.7.1. Thu dịch enzim Đối với trường hợp enzim nằm trong tế bào ( phương pháp bề mặt) thì cần phải phá vở tế bào bằng cách: nghiền trong máy đồng hóa, nghiến với thủy tinh, cát v.v... Sau đó chiết xuất enzim bằng các dung môi khác nhau như nước, dung dịch đệm, muối trung tính ... để thu dịch enzim và loại bỏ bã sinh khối. Đối với trường hợp enzim tiết ra môi trường ( phương pháp chìm) thí tách sinh khối và các chất cặn bã ra môi trường bằng cách ly tấm hoặc ép lọc với các chất trợ lọc... 1.3.7.2. Thu chế phẩm kỹ thuật Chế phẩm enzim kỹ thuật là chế phẩm enzim chưa tinh chế có thể chứa 1 hoặc 1 vài enzim chủ yếu ngoài ra trong đó còn có các protein không hoạt động, các chất ổn định..... Thường được dùng trong công nghiệp và nông nghiệp. Để thu được chế phẩm kỹ thuật người ta tiến hành cô đặc các dịch enzim trong thiết bị có độ chân không cao. Sau đó:  Hoặc tiếp tục cô đặc ở nhiệt độ cao 40-450C bổ sung thêm các chất bảo quản NaCl, glixerol... và thu chế phẩm.  Hoặc bổ sung thêm các chất ổn định rồi đem sấy ở nhiệt độ cao và thu chế phẩm.  Hoặc cho kết tủa enzim bằng muối trung tính hoặc cồn, ly tâm lấy cặn, rồi cho thêm chất ổn định, đem sấy khô, nghiền mịn và thu chế phẩm. 1.3.7.3. Thu chế phẩm enzim tinh khiết Việc tinh chế enzim có thể tiến hành qua nhiếu phương pháp. Đầu tiên loại các protein không hoạt động khỏi dịch enzim bằng phương pháp làm biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của pH và nhiệt và tách chúng ra bằng cách ly tâm hoặc lọc bỏ kết tủa. Có thể phương pháp tách phân đoạn khác nhau nhờ kết tủa bằng dung môi hữu cơ, muối, hấp phụ chọn lọc, trao đổi ion để thu những phần có hoạt lực enzim cao nhất. Sau đó cần làm sạch và sấy khô ( chân không ở nhiệt độ thấp hoặc sấy thăng hoa) các chế phẩm enzim để có thể sử dụng lâu dài. Việc thu chể phẩm enzim tinh khiết và nhất là ở dạng tinh thể thường rất khó khăn và tốn kém nên chỉ dùng trong y học hoặc trong nghiên cứu. CHƯƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ VẬT LIỆU 2.1.1. Đối tượng Các chủng vi khuẩn Bacillus phân lập được từ đất vườn. 2.1.2. Vật liệu 2.1.2.1. Thiết bị Tủ cấy và vô trùng Cân điện tử Máy ly tâm Kính hiển vi quang học Tủ khử trùng khô Nồi hấp thanh trùng Tủ ấm Bếp điện Máy lắc Máy đo so màu Ống nghiệm Đĩa petri Bình định mức Pipet 2.1.2.2. Hóa chất (NH4)2SO4 Aceton CaCO3 Cao nấm men Cao thịt Cazein CuSO4.5H2O Dung dịch Albumin HCl TCA Ethanol 960 FeSO4 Gelatin Glucose K2HPO4 KH2PO4 MnSO4 Na2CO3 Na2HPO4 NaCl NaOH Pepton Thạch Thuốc nhuộm fucsin Thuốc nhuộm tím Gentian Thuốc thử folin Tyrosin 2.2. Môi trường 2.2.1. Môi trường phân lập, giữ giống và nuôi cấy (Môi trường MPA) [15] Cao thịt 3g/l Pepton 5g/l NaCl 5g/l Thạch 20g/l Nước cất 1000ml Khử trùng 1atm/30 phút 2.2.2. Môi trường định tính khả năng sinh tổng hợp protease [12],[17] Pepton 0.2 g Casein 4g Glucoza 0.05g MnSO4.4H2O 0,1g/l NaCl 3g K2HPO4 1.5g KH2PO4 1,5g Agar 15g Nước cất 1000ml Khử trùng 1atm/15 phút 2.2.3. Môi trường thử hoạt tính của enzym protease [15] Môi trường cơ sở Pepton 5g/l Cao nấm men 2,5g/l Glucose 10g/l Nước 1000ml 32 pH 5,5 – 7,8 2.3. Các dung dịch 2.3.1 Dung dich xanh metylen Loeffler Rượu etylic 300ml Xanh metylen 20g Hòa tan hổn hợp trên rồi lọc trong (1) Dịch lọc (1) 30ml KOH 1% 1ml Nước cất 1000ml 2.3.2 Đỏ trung tính 0.5% Đỏ trung tính 0.5g Nước cất 100ml Lọc trong trước khi dùng 2.4. Các phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp phân lập Trước khi lấy mẫu các dụng cụ lấy mẫu được thanh trùnh bằng cồn. Mẫu được lấy từ năm địa điểm khác nhau và trộn đều trước khi xác định (lấy khoảng 10g đất và 90 ml nước đã vô trùng cho vào bình tam giác 250 ml). Đun dung dịch đất cách thủy 10 -15 phút ở 800C để các vi khuẩn không sinh bào tử sẽ chết, số có bào tử còn lại sẽ sống. Do vậy Bacillus sẽ có chủ yếu trong dịch đun nóng. Đổ một lượng dung dịch đất vào hai đĩa petri : Một đĩa để một vài lát khoai tây, một đĩa để cỏ khô đã được cắt ngắn thành đoạn. Sau đó đưa đi nuôi cấy ở 370 C trong 24 đến 48g thấy xuất hiện trên bề mặt khoai tây váng màu xám nhạt và ở cỏ khô xuất hiện váng màu trắng đục. 33 2.4.2. Phương pháp giữ giống cấy chuyền Các chủng vi khuẩn đã được phân lập nhiều lần sẽ được cấy trên môi trường thạch nghiêng trong ống nghiệm là môi trường giữ giống. Cách tiến hành: Đổ môi trường giữ giống vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm chờ thạch đông. Tiếp theo, dùng que cấy vô trùng và cấy zich zắc trên bề mặt thạch nghiêng. Nút ống nghiệm lại để ở tủ ấm 370C, sau 24h thấy xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh 40C giữ giống. Giống được cấy chuyển hàng tháng và được hoạt hóa trước khi nhân giống. 2.4.3. Một số phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của vi khuẩn Chủng được quan sát trong môi trường rắn MPA bằng mắt thường và kính hiển vi quang học. Các đặc điểm nuôi cấy, hình thái được đánh giá dựa trên các chỉ số: khả năng phát triển, hình thái, màu sắc, bề mặt và mép khuẩn lạc. 2.4.3.1. Phương pháp quan sát đặc điểm khuẩn lạc Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng trên môi trường rắn MPA  Khả năng phát triển của khuẩn lạc.  Bề mặt khuẩn lạc.  Màu sắc khuẩn lạc. 2.4.3.2. Phương pháp làm tiêu bản tế bào sống Được sử dụng để xác định hình dáng, sự sắp xếp của các tế bào cũng như khả năng di động của chúng Cách tiến hành: Lấy một phiến kính khô và sạch đặt lên giá đở, nhỏ một giọt nước sạch vô trùng lên phiến kính, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật trên môi trường đặc, đặt vào chổ phiến kính, hòa nhẹ để tạo dịch huyền phù. Đậy nhẹ lá kính lên giọt dịch để tránh tạo bọt khí. Dùng khăn giấy lau nhẹ bề mặt lá kính cho khô. Mọi thao tác cần tiến hành bằng các dụng cụ sạch, vô trùng và phải cạnh ngọn lữa đèn cồn. Đặt tiêu bản lên bàn kính quan sát với vật kính x40. 34 2.4.3.3. Phương pháp nhuộm gram [10] Đây là phương pháp làm tiêu bản nhuộm màu được sử dụng rất phổ biến để theo dõi các đặc điểm hình thái, đếm số lượng vi khuẩn. Nguyên tắc: Sự bắt màu thuốc nhuộm của tế bào vi sinh vật là một quá trình hấp phụ, khả năng bắt màu của tế bào vi sinh vật có liên quan đến muối magiê của axit riboleic. Khi nhuộm phức tạp, muối này có phản ứng với thuốc nhuộm loại tryphenylmetan (gelatinviolet, oryatanviolet, metylviolet) chịu được dưới tác dụng của cồn (không bị mất màu dưới tác dụng của cồn). Những vi khuẩn không bị mất màu là những vi khuẩn gram(+), ngược lại những vi khuẩn không giữ được màu là vi khuẩn Gram (-) Cách tiến hành: cho một giọt nước cất lên phiến kính, dùng que cấy vô trùng lấy một ít tế bào vi khuẩn mọc trên môi trường đặc hoà vào giọt nước. Hơ phiến kính lên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần, chú ý không để phiến kính nóng quá vì như thế tế bào vi khuẩn sẽ bị biến dạng. Khi giọt nước bay hơi dần vi khuẩn sẽ gắn chặt vào phiến kính. Nhuộm màu nhờ tím Gentian bằng cách nhỏ thuốc nhuộm này lên vết bôi, giữ 1-2 phút rồi rửa bằng nước cất. Tiếp theo nhỏ dung dịch Lugol lên tiêu bản để trong 1 phút, sau đó đổ thuốc đi và tráng bằng nước cất. Sau đó rửa bằng cồn 96o trong thời gian khoảng 30-40 giây. Rửa lại tiêu bản bằng nước cất rồi để khô vết bôi. Sau đó nhuộm bổ sung bằng Fucshin loãng khoảng 1-2 phút. Rửa lại bằng nước cất cho đến khi hết màu rồi đợi khô. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, nếu vi khuẩn nhuộm màu tím thì đó là vi khuẩn Gram dương, ngược lại vi khuẩn nhuộm màu hồng là vi khuẩn Gram âm. Chọn các chủng có khả năng nhuộm màu Gram (+) để tiếp tục nghiên cứu. 35 2.4.3.4. Phương pháp xác định sự hình thành bào tử [10] Để xác định sự hình thành bào tử ta sử dụng phương pháp sốc nhiệt: Vi khuẩn được nuôi trên môi trường thạch trong 72h, sau đó sinh khối tế bào được hòa vào nước muối sinh lý. Sốc nhiệt ở 80-850C trong 15 phút. Sau khi sốc nhiệt gạt dịch vi khuẩn lên môi trường thạch đĩa, gói đĩa để vào tủ ấm 370C khoảng 24g. Nếu thấy xuất hiện khuẩn lạc chứng tỏ vi khuẩn có khả năng hình thành bào tử. Ta cũng có thể tiến hành nhuộm bào tử theo phương pháp sau: Cố định mẩu trên phiến kính sau đó nhỏ lên mẩu thuốc nhuộm xanh metylen hơ nóng trong 3 phút ( chú ý không để mẩu bị khô nếu khô phải nhỏ thêm). Rữa kỹ bằng nước, nhỏ tiếp thuốc nhuộm đỏ trung tính trong 1 phút rồi rữa kỹ. Hong khô phiến kính. Quan sát trên kính hiển vi với độ phóng đại x 1000 lần. Tế bào chất có màu hồng, bào tử bắt màu xanh. 2.4.4. Phương pháp xác định sự sinh trưởng của vi khuẩn theo mật độ quang Phương pháp xác định nồng độ tế bào bằng máy so màu quang học được sử dụng rộng rãi. Cơ sở của phương pháp này là tính chất hấp phụ hoặc làm lệch một phần ánh sáng của các dung dịch có vật chất lơ lững. Để đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn ta có thể đo sự tăng sinh khối qua giá trị OD (Optical density). Tất cả các thí nghiệm được tiến hành đo ở bước sóng 620 nm (OD620) Cách tiến hành: chủng giống được nuôi ở 370C rồi cấy vào môi trường MPA lỏng. Đặt các bình trụ này vào máy lắc với nhiệt độ như trên với tốc độ 200 vòng /phút trong 24h. Sau đó lấy dịch vi khuẩn nuôi trong bình này để đo OD bằng máy so màu ở bước sóng 620 nm với kính lọc màu đỏ. Chú ý các thao tác lấy dịch để đo OD phải được tiến hành trong tủ cấy vô trùng. 2.4.5. Phương pháp xác định hoạt tính catalase Nguyên tắc: catalase xúc tác phản ứng thuỷ phân hydrogen peroxide (H2O2) thành H2O và phóng thích phân tử ôxy (có hiện tượng sủi bọt). Hầu hết các 36 VSV hiếu khí đều có enzym catalase giúp loại trừ sự tích tụ chất độc đối với tế bào là H2O2 được tạo ra trong chuỗi hô hấp. Cách tiến hành: nhỏ một giọt dung dịch H2O2 3% lên trên khuẩn lạc, hoặc chuyển một lượng VSV lên lam rồi thử bằng dung dịch H2O2 3%. Dựa vào hiện tượng có sủi bọt (+) hay không (-) kết luận về hoạt tính catalase của mỗi chủng, từ đó cho biết mỗi chủng có phải là vi khuẩn hiếu khí hay không. Chọn các chủng có hoạt tính catalase (+) hiếu khí để tiếp tục nghiên cứu. 2.4.6. Xác định nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng Chuẩn bị môi trường MPA có nồng độ muối khác nhau 5g, 10g, 15g... cấy vi sinh vật vào nuôi các bình này trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 24h. Đo OD thường xuyên để đánh giá sự phát triển của chủng. 2.4.7. Xác định khả năng thủy phân protein [10] Phương pháp này dùng để xác định khả năng thủy phân protein của các chủng vi khuẩn thu được. Cách tiến hành: Nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng có chứa cơ chất cảm ứng là casein ở 370C trong khoảng 24 đến 48h trên máy lắc 200 vòng/phút. Sau 24 giờ lấy dịch nuôi đem li tâm 5000 vòng/phút lấy dịch loại bỏ cặn. Đổ môi trường đặc có chứa casein với nồng độ tương tự vào đĩa petri. Chờ môi trường nguội đông lại dùng khuyên đục lổ để đục lổ trên môi trường tạo thành giếng. Dùng pipetMan hút dịch li tâm cho vào giếng. Để đĩa trong tủ lạnh 3 - 4 tiếng để dịch khuyếch tán 370C. Sau 24giờ dùng thuốc thử HgCl2 đổ lên bề mặt thạch. Nếu có enzim nó sẽ tạo thành vùng phân giải xung quanh giếng, do các protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các vùng chưa bị phân giải sẽ có màu trắng đục. 37 Đánh giá khả năng tạo thành enzym để tuyển chọn những giống có hoạt tính enzym cao: Lật sấp đĩa petri dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D), và đo đường kính của giếng (d). Đánh giá khả năng hình thành enzym: Tỷ lệ D-d càng lớn thì khả năng sinh enzym càng nhiều. 2.4.8. Chạy PCR để xác định danh chủng vi khuẩn được chọn Trong 3 chủng chọn 1 chủng có khả năng sinh enzym và có tốc độ sinh trưởng tốt nhất cho chạy PCR để định danh. Phương pháp thực hiện: giải trình tự gen 16S rARN và tra cứu trên Blast search. Thành phần của phản ứng PCR: 10X PCR buffer (Invitrogen) : 12μl 20 mM dNTPs : 2μl Primer 1 (20mM) (mồi xuôi) : 1.25 μl Primer 2 (20mM) (mồi ngược) : 1.25 μl 50 mM MgCl2 (invitrogen) : 4μl Taq : 0.5 μl ADN khuôn mẩu : 0.5μl H2O đến 100μl :80.5 μl Nguyên tắc: khuếch đại một trình tự lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt. Gen 16 rARN gồm khoảng 1542bp với nhiều trình tự bảo tồn. Trong đó có một đoạn trình tự #550bps đặc hiệu cho giống và loài của vi khuẩn. Giải trình tự đoạn đặc hiệu này giúp định danh chính xác vi khuẩn. Cách thực hiện: Bước 1: lấy một ít khuẩn lạc được nuôi cấy trên bề mặt thạch làm thành dịch huyền phù tiến hành tách chiết AND bằng cách: đun sôi 5phút, để lạnh 5phút, ly tâm 5phút lấy dịch nổi. 38 Bước 2: cho dịch nổi thu được, primer, tad,dNTP, Mg2+ vào PCR mix để khuyếch đại gen 16s rARN. Phản ứng PCR gồm 3 bước:  Biến tính: trong một dung dịch đầy đủ thành phần cho sự sao chép, DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tmax của phân tử, thường là 94-950C trong vòng 30s-1phút.  Lai: nhiệt độ được hạ thấp để các mồi bắt cặp với khuôn, nhiệt độ này dao động trong khoảng 40-700C và kéo dài 30s-1phút.  Tổng hợp: nhiệt độ được nâng lên đến 720C để DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài ngắn của trình tự DNA, thường kéo dài từ 30s đến vài phút. Bước 3: Điện di kiểm tra trên gel 1% agarose để xác định sản phẩm PCR. Bước 4: Sản phẩm PCR được tinh chế bằng kit QIAEX II của Qiagen. Bước 5: Giải trình tự đoạn rARN 16S. Các phương pháp nhằm xác định trình tự axit nucleic đều dựa vào 2 nguyên tắc:  Nguyên tắc hoá học (phương pháp Maxam và Gilbert): dựa vào các phản ứng thuỷ giải hoá học đặc hiệu phân tử DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kích thước chênh nhau 1 nucleoide.  Nguyên tắc enzym học (phương pháp Sanger và các phương pháp cải biên): dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định nhờ DNA polymerase. Với việc tổng hợp thêm các dideoxynucleotide cùng với các deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều đoạn DNA có kích thước chênh nhau 1 nucleotide. Ở cả 2 phương pháp trên, các phân đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamid. Nếu sử dụng đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ thì kết quả trình tự cần xác định sẽ được đọc trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di. 39 Bước 6: tủa và tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự, điện di mao quản trên CEQ8000. Xuất kết quả giải trình tự để phân tích. Đăng nhập vào NCBI BLAST SEARCH xác định tên vi khuẩn cần định danh. 2.4.9. Phương pháp thu chế phẩm enzym thô [16] Sau 40h nuôi cấy tiến hành chiết tách protease ngoại bào ở vi khuẩn bằng cách: Ly tâm dịch môi trường ở 5000vòng/ phút trong 20 phút để thu dịch chiết protease ngoại bào (loại bỏ cặn ở dưới). 2.4.10. Xác định hoạt độ của enzym protease theo phương pháp Anson[8] Nguyên tắc: Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hòa tan trong tricloroacetic (TCA) và một số các axit amin. Các peptid và sản phẩm tạo thành có chứa Tyrosin, triptophan khi cho tác dụng với thuốc thử Folin tạo dung dịch có màu. Cường độ màu tăng cùng với nồng độ chất đem phản ứng, cường độ màu được ghi nhận bằng giá trị mật độ quang OD ở λ = 660nm. xác định lượng tyrosin và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin. Hóa chất : Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 5,96g Na2HPO4.12H2O trong nước thành 250ml. Dung dịch KH2PO4 1/15M : hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml. Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7,6 : trộn 177ml dung dịch Na2HPO4 1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 đo và chỉnh lại pH cho đúng Dung dịch Casein 1% : đun sôi cách thủy 1g Casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100ml. Dung dịch TCA 10% : hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0,5N : Hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỷ lệ 1 :2) 40 Dung dịch HCl 0,2N : trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml. Dung dịch tyrosin 20 mM/l : khuấy nghiền 0,118g tyrosin trong dung dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml. Dung dịch tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0,2 N : pha loãng 5ml dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0,2N thành 100ml. Cách tiến hành : Dựng đường chuẩn Tyrosin Ống nghiệm Dung dịch hóa chất 1 2 3 4 5 6 Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 Lượng Tyrosin tương ứng (M) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0 Dung dịch HCl 0,2N (ml) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1 Dung dịch NaOH 0,5 N (ml) 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN). Vẽ đường chuẩn tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và ΔOD ( ΔOD = ODTN-OD KC).  Xác định hoạt tính enzym : Ống nghiệm thật là ống thí nghiệm, ống nghiệm không là ống kiểm chứng Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Thật Không Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 0 5 Dung dịch enzym mẫu (ml) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,5 0C trong 30 phút 41 Dung dịch TCA 5% (ml) 5 0 Dung dịch enzym mẫu (ml) 0 1 Để yên lọc lấy dịch bên dưới Dung dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N 2 2 Thuốc thử Folin 0.6 0.6 Lắc đều, để yên sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm. Tính ΔOD = ODTN-ODKC. dựa vào đồ thị chuẩn suy ra M tyrosine  Cách tính Hoạt tính protease: HT (UI) = vt KVX . .. (UI/ml) hoặc HT (UI) = mvt KVX .. .. (UI/g) X: là số M Tyrosine suy ra từ đường chuẩn V: Tổng thể tích hổn hợp phản ứng enzym (11ml) v: thể tích dịch lọc đem phân tích (1ml) K: độ pha loãng của mẫu. t: thời gian thủy phân (phút) m: Khối lượng mẫu enzim đem xác định hoạt tính (g) 1UI = 1 micromol Tyrosine/ml/phút hoặc UI/g 2.4.11. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tổng hợp protease của vi khuẩn. Chuẩn bị môi trường có các nguồn nguyên liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau:  Bổ sung Casein vào môi trường cơ sở 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%. 42  Bổ sung bột đậu nành vào môi trường cơ sở 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Bổ sung bột cá vào môi trường cơ sở 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Trong 3 loại môi trường trên chọn loại cơ chất có nồng độ thích hợp cho hoạt tính enzim cao nhất. Sau đó bổ sung thêm CaCO3 ở các nồng độ khác nhau 0.3, 0.5, 1, 1.5% Cho 50ml môi trường vào bình tam giác khữ trùng ở 1atm/30 phút, để nguội sau đó cấy vi khuẩn vào với tỷ lệ 1-2%. Sau đó lắc ở 200 vòng/phút trong 40h ở 370C. Đo pH, đo độ sinh trưởng và hoạt độ protein chọn môi trường tốt nhất. 2.4.12. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn 2.4.12.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn Tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường thích hợp. Ly trích enzym thô có trong canh trường. Xác định hoạt tính của protease của môi trường bằng phương pháp Anson theo các khoảng thời gian nuôi cấy 28, 32, 36, 40, 44, 48. Dựa vào kết quả thu được xác định thời gian thích hợp cho quá trình lên men. 2.4.12.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn Các chủng giống được nuôi ở 370C, sau đó cấy vào môi trường thích hợp trong bình trụ miệng nhỏ có chứa 50ml dịch với tỷ lệ 1-2%. Nuôi các bình này trong máy lắc ở các nhiệt độ 270C, 320C, 370C, 420C, 470C... với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian thích hợp. Đo OD, đo pH, hoạt độ protein để chọn nhiệt độ thích hợp. 43 2.4.12.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn Tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp. Tiến hành ly trích dịch enzym thô. Xác định hoạt tính của protease có trong canh trường ở mỗi pH môi trường khác nhau: 6,5; 7; 7,5; 8; 8.5 ... dựa vào kết quả thu được ta chọn pH môi trường thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp protease 2.4.12.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của độ hiếu khí lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của các chủng vi khuẩn Đổ vào các bình tam giác có thể tích 250ml, 500ml dung địch lên men có thể tích khác nhau 50, 75, 100ml.. để ở nhiệt độ thích hợp trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian thích hợp. Đo OD thường xuyên để đánh giá sự phát triển của chủng. Đo pH, hoạt độ protein để chọn độ hiếu khí thích hợp 2.4.13. Phương pháp tách và thu nhận enzym protease bằng dung môi hữu cơ Tiến hành tủa với các tác nhân tủa: ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa, ở nồng độ thích hợp, thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45phút, đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh.  Đối với tác nhân tủa là aceton và ethanol 960 Cơ chế: Khi cho dung môi vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly của dung dịch, kết quả là làm giảm khả năng tan của nước bao quanh protein. Nguyên nhân cơ bản của sự tạo quần thể protein có thể do các lực tỉnh điện , lực VanderWaals. Người ta thấy rằng, ở gần điểm đẳng điện của protein, sự lắng diễn ra ở nồng độ dung môi hữu cơ thấp hơn. Khi cho dung môi hữu cơ vào để kết tủa có thể xãy ra hiện tượng biến tướng không thuận nghịch protein. Các phân tử protein chỉ thể hiện hoạt độ enzim khi nó tồn tại trong cấu trúc không 44 gian nhất định, sao cho các gốc phân cực phân bố trên bề mặt của phân tử protein , còn các gốc kỵ nước không phân cực thì nằm trong phân tử . Khi hằng số điện ly của môi trường giảm, phân tử protein có thể tự tháo gở và tạo thành dạng không hoạt động, trong đó các gốc kị nước lại tiếp xúc với dung môi. Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình này. Do đó, thực hiện quá trình này phải ở trong điều kiện nhiệt độ thấp, thường ở 4 – 10 0C. Tiến hành: Bước 1: Thu dịch enzim từ canh trường ( mục ) giữ lạnh dịch enzim và dung môi hữu cơ ( aceton, ethanol 960) sao cho nhiệt độ đạt từ 0 – 40C. Khảo sát với tỷ lệ Ethanol: tỉ lệ 1:3 ( dung dịch enzim: cồn) Aceton: tỉ lệ 1:2 ( dung dịch enzim : aceton) Bước 2: Tiến hành tủa: Cho từ từ dung môi hữu cơ vào dung dịch enzim và khuất đều, giữ ở nhiệt độ lạnh 30 – 45 phút, ly tâm 4500 vòng / phút trong 15 phút thu tủa, sấy khô ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh.  Đối với tác nhân tủa là muối sulfate amon (NH4)2SO4 Cơ chế: Khi ta muối trung hòa ở nồng độ cao vào dung dịch có chứa protein thì protein sẽ tạo ra kết tủa. Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị nước. Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và tạo tủa. Các muối sunfat, trong đó (NH4)2SO4 được dùng nhiều nhất vì chúng rất dễ tan trong nước ngay ở nhiệt độ thường, giá thành lại rất rẻ, nhưng gặp khó khăn khi thu hồi, vì chúng có khả năng lẩn trong tủa protein. Tiến hành: Bước 1: Thu dung dịch enzim từ dịch nuôi cấy ( mục) 45 Bước 2: Tiền hành tủa: Cho g muối vào dung dịch enzim rồi khuấy đều, giữ ở nhiệt độ phòng 45 – 60 phút, ly tâm 4500vòng/ phút trong 15 phút, thu tủa. Bước 3: Chế phẩm enzim thô thu được còn lẫn nhiều muối. Thẩm tích qua màng thẩm tích là phương pháp dùng để tách các phân tử muối ra khỏi protein. Màng này chỉ cho các chất có phân tử lượng nhỏ ( muối, đường...) khuyếch tán qua màng và giữ lại các chất có phân tử lượng lớn ( protein, enzim). Màng thẩm tích thường làm bằng collodion hay celophan. Bước 4: Sấy khô chế phẩm enzim ở nhiệt độ < 500C, bảo quản lạnh. Hiệu suất thu nhận H = m/v Trong đó: m là khối lượng enzim thu được sau khi tủa V là thể tích dung dịch có chứa enzim trước tủa tính bằng ml. 2.4.14. Phương pháp xác định protease kiềm Lấy chế phẩm protease thu được cho tác động với cơ chất casein được pha trong các dung dịch đệm có độ pH khác nhau 6, 6.5, 7, 7,5 , 8....Xác định hoạt tính protease của chế phẩm theo phương pháp Anson.  pH 6,5 – 8: sử dụng đệm sorensen. pH 8.5 – 9.5: sử dụng đệm glyxin - NaOH [13] 2.4.15. Phương pháp xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Xác định hoạt độ protease của chế phẩm theo phương pháp Anson ở những nhiệt độ khác nhau trong dãy nhiệt độ 350C, ...., 800C. Chon nhiệt độ tối ưu cho enzim phân giải cơ chất. 2.4.16. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ protease Xác định hoạt độ protease của chế phẩm theo phương pháp Anson ở nhiệt độ và pH thích hợp nhưng thay đổi thời gian protease tác động lên cơ chất casein: 30- 100 phút. Chọn thời gian thủy phân thích hợp cho enzim. 46 2.4.17. Phương pháp nghiên cứu động học Từ các điều kiện tối ưu sẽ tiến hành nuôi cấy chủng đã chọn có khả năng sinh trưởng tốt nhất và sinh enzym protease có hoạt tính cao nhất trong bình tam giác lên men 1l. Tiến hành nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, sinh trưởng và hoạt lực của enzym. 2.4.18. Phương pháp xử lý số liệu thực nghiệm Sử dụng toán xác suất thống kê để xử lý các số liệu thu được cho ra kết quả.  Xác định giá trị trung bình Giá trị trung bình của các số liệu là tổng giá trị thực của mỗi lần đo chia cho số lần đo: n x x n i  Trong đó: : giá trị của một lần đo ix x : giá trị trung bình n : số lần đo Nếu thực hiện sự đo đạc lặp lại nhiều lần trên một mẫu thí nghiệm thì chúng ta có thể tiệm cận đến một giá trị trung bình thật. Để giá trị trung bình của các lần đo như là một giá trị gần đúng với giá trị trung bình thật, ta phải dùng phương pháp thống kê để đánh giá mức độ chính xác của các lần đo.  Tính toán độ lệch mẫu và độ lệch chuẩn  Độ lệch mẫu (Sample deviation): Là sự khác biệt giữa giá trị của một lần đo với giá trị trung bình. Độ lệch mẫu = xi - x Trong đó: 47 xi : giá trị của một lần đo. x : giá trị trung bình.  Độ lệch chuẩn (Standard deviation): Là sai số có thể có trong một lần đo. S  2i 1n xx    Với S : độ lệch chuẩn : giá trị của một lần đo ix x : giá trị trung bình n : số lần đo Vậy giá trị trung bình có thể diễn đạt như sau: Sx  Độ lệch chuẩn có thể chuyển đổi thành độ lệch chuẩn của giá trị trung bình hay còn gọi là sai số chuẩn được ký hiệu là Sm. Sm n S S: độ lệch chuẩn n: số lần đo. Công thức trên cho thấy, số lần đo càng lớn (n càng lớn) thì độ lệch chuẩn của giá trị trung bình (Sm) càng nhỏ, hay mức độ chính xác của lần đo đạc càng cao. Độ lệch chuẩn có thể được biểu diễn qua đường cong phân bố Gaussian. Kết quả cho thấy: 68,3% các giá trị quan sát sẽ nằm trong khoảng x  S. 95,5% các giá trị quan sát sẽ nằm trong khoảng x  2S. 99,7% các giá trị quan sát sẽ nằm trong khoảng x  3S. 48 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn 3.1.1. Phân lập Từ các mẫu đất vườn, khoai tây và cỏ khô đã phân lập được 10 khuẩn lạc. Các khuẩn lạc lần lượt được kí hiệu là KT 1, KT 2, KT 3, KT 4, KT 5, KT 6, KT 7, KT 8, KT 9, KT 10. Các khuẩn lạc sau khi được làm sạch thuần khiết bằng cách phân lập và cấy lại nhiều lần, được tiến hành so sánh vòng phân giải enzim protease để chọn ra 3 chủng có vòng phân giải cao nhất. 3.1.2. Khảo sát vòng phân giải Tiến hành nuôi các chủng trên trong môi trường 2.2.3 lỏng trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút sau 40 giờ kể từ lúc bắt đầu cấy vi khuẩn, ủ ở nhiệt độ phòng. Ly tâm dịch môi trường ở 5000vòng/ phút trong 20 phút để thu dịch chiết protease ngoại bào (loại bỏ cặn ở dưới). Nhỏ 0.2ml dịch ly tâm lên bề mặt thạch (môi trường 2.2.2 đặc) khoang lổ. Ta thu được kết quả đo bán kính vòng phân giải của 10 chủng vi khuẩn như sau: Bảng 3.1: Bán kính vòng phân giải casein của 10 chủng vi khuẩn phân lập Chủng vi khuẩn Vòng phân giải (mm) KT1 13 KT2 11 KT3 8 KT4 19 KT5 14 KT6 20 KT7 14 KT8 20 KT9 15 KT10 22 49 Qua bảng 3.1 ta nhận thấy: Các chủng vi khuẩn đều có khả năng tổng hợp enzim protease. Trong đó các chủng KT6, KT8, KT10 có bán kính vòng phân giải lớn hơn so với các chủng còn lại. Qua đó, có thể sơ bộ đánh giá khả năng sinh tổng hợp protease của 10 chủng vi khuẩn. Từ đó chọn 3 chủng KT6, KT8, KT10 để tiếp tục nghiên cứu đặc điểm hình thái khuẩn lạc. KT10 KT6 KT8 Hình 3.1: Vòng phân giải casein của chủng KT6, KT8, KT10. 50 3.1.3. Xác định các đặc điểm sinh học 3.1.3.1. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Tiến hành pha loảng chủng KT 10, 6, 8 với nồng độ thích hợp với nước cất, tiến hành cấy dàn trên đĩa petri và quan sát khuẩn lạc của chúng dưới kính hiển vi với độ phóng đại 40 lần . KT 6 KT8 Hình 3.2: Khuẩn lạc của chủng KT6, KT8, KT10. Qua quan sát hình 3.2 ta nhận thấy: Khuẩn lạc của KT 6: màu trắng đục, bề mặt khuẩn lạc mịn, mép hơi nhăn. KT 10 51 Khuẩn lạc của KT 8: tròn đều, không thùy, mép tròn đều, hơi lượng sóng có màu kem. Khuẩn lạc của KT 10: bám chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn nheo, màu kem, mép nhẳn, hơi lượn sóng. 3.1.3.2. Đặc điểm hình thái tế bào Sau 20 giờ nuôi cấy ta tiến hành nhuộm gram tế bào vi khuẩn KT 10, KT6, KT 8. Quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần. Hình 3.3: Tế bào vi khuẩn KT6, KT8, KT10 nhuộm Gram. KT 6 KT8 KT 10 52 Qua quan sát hình 3.3 ta thấy tế bào của cả ba chủng đều bắt màu tím có dạng hình que chứng tỏ cả ba đều là vi khuẩn gram dương. Tế bào của cả ba chủng đều đứng riêng rẻ là chủ yếu. 3.1.3.3. Nghiên cứu sự hình thành bào tử Tiến hành sốc nhiệt với dịch sinh khối tế bào của từng chủng sau khi nuôi 72h, ở nhiệt độ 850C, trong 15 phút. Sau đó gạt dịch này lên bề mặt môi trường thạch đĩa, để ở 370C trong 24 giờ theo dõi thấy cả 3 chủng đều có xuất hiện khuẩn lạc, chứng tỏ cả ba chủng đều sinh bào tử. Chúng tôi tiến hành quan sát các mẩu nhuộm đơn dưới kính hiển vi có độ phóng đại 1000 lần ta thấy bào tử của cả 3 chủng phân bố chính tâm là chủ yếu. Hình 3.4: Bào tử vi khuẩn KT6, KT8, KT10. KT 8 KT6 KT 10 53 3.1.3.4. Nghiên cứu khả năng sinh enzim catalaza Tiến hành cấy từng chủng vi khuẩn ra đĩa petri và nuôi trong tủ ấm ở 370C. Sau khi xuất hiện khuẩn lạc thì giỏ lên khuẩn lạc 1 giọt H2O2 10%. Kết quả cho thấy khuẩn lạc bị giỏ H2O2 có xuất hiện bọt khí. Chứng tỏ cả ba chủng đều có khả năng sinh enzim catalaza để phân hủy H2O2 thành H2O và O2. Chính khí O2 bay lên làm xuất hiện bọt khí. H2O2 Catalase H2O + O2 Qua đó chứng tỏ cả ba chủng đều là vi sinh vật hiếu khí. Chính vì vậy trong quá trình nghiên cứu tiếp theo cần sử dụng máy lắc: bình tam giác 250ml chứa 50ml dịch môi trường được bổ sung 1-2% chủng giống được lắc ở 200vòng/ phút. 3.1.3.5. Xác định nồng độ NaCl ức chế sinh trưởng của vi khuẩn Hầu hết các chủng Bacillus đều ưa mặn, nên mục đích của thí nghiệm nhắm xác định độ mặn tối đa mà vi khuẩn có thể chịu được. Việc nghiên cứu khả năng chịu mặn của các chủng vi khuẩn có ý nghĩa rất lớn tới phạm vi ứng dụng của vi khuẩn như sản suất chế phẩm probiotic để nuôi tôm. Chuẩn bị môi trường MPA có nồng độ muối dao động từ 1% - 10% cấy vi sinh vật với tỷ lệ 1-2% vào các bình để trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút. sau 24h tiến hành đo OD sinh trưởng của vi khuẩn. Bảng 3.2: Sự sinh trưởng của vi khuẩn ở các nồng độ muối khác nhau Nồng độ NaCl % OD(620nm) KT6 OD(620nm) KT8 OD(620nm) KT10 1 0.680 ± 0.004 0.715 ± 0.001 0.725 ± 0.001 2 0.698 ± 0.005 0.722±0.001 0.754 ± 0.001 3 0.684 ± 0.0003 0.705 ± 0.001 0.737 ± 0.004 4 0.646 ± 0.002 0.693 ± 0.002 0.693 ± 0.003 5 0.557 ± 0.001 0.523 ± 0.001 0.613 ± 0.002 54 6 0.316 ± 0.002 0.257 ± 0.022 0.538 ± 0.001 7 0.113 ± 0.001 0.108 ± 0.003 0.207 ± 0.002 8 0.086 ± 0.002 0.069 ± 0.002 0.072 ± 0.002 9 0.060 ± 0.001 0.005 ± 0.001 0.063 ± 0.001 10 0.0040 ± 0003 0.005 ± 0.001 0.035 ± 0.003 Hình 3.5: Khả năng chịu măn của 3 chủng vi khuẩn Từ số liệu đo OD(620nm) của 3 chủng ta thấy ở độ mặn từ 1%- 5% cả 3 chủng KT6, KT8, KT10 đều sinh trưởng khá tốt: giá trị đo OD của cả 3 chủng đều dao động trong khoảng 0.7 – 0.5. Khi độ mặn tăng thêm thì sự sinh trưởng của cả 3 chủng đều yếu dần. Riêng chủng KT 8 ngừng phát triển ở độ mặn 9%. Hai chủng KT6, KT10 ngừng ở 10%. Theo như Kusher (Kusher et al.,1983) có thể xếp 3 chủng này vào nhóm ưa mặn. 55 3.1.4. Tuyển chọn chủng vi khuẩn Để có thể đánh giá chính xác chúng tôi tiến hành lên men 3 chủng vi khuẩn trên trong môi trường 2.2.3 lỏng và tiến hành đo hoạt độ của 3 chủng trên theo phương pháp Anson. Tiến hành nuôi các chủng trên trong môi trường có casein 1% trong điều kiện 370C trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 48 tiếng. Sau đó ly tâm lấy dịch tiến hành đo hoạt độ protease theo phương pháp Anson thu được kết quả sau: Đường chuẩn Tyrosine Bảng 3.3: Đường chuẩn Tyrosine Lượng tyrosine (µM) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 ∆OD 0 0.324 0.543 0.868 1.099 1.293 Hình 3.6: Đồ thị đường chuẩn Tyrosine 56 Bảng 3.4: Kết quả đo tốc độ sinh trưởng và hoạt độ protease của 3 chủng Chủng OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) KT 6 0.513 ± 0.011 1.764 ± 0.007 KT 8 0.460 ± 0.026 1.496 ± 0.017 KT 10 0.556 ± 0.006 1.907 ± 0.017 Theo bảng 3.4 ta thấy chủng số 10 có hoạt tính protease và tốc độ sinh trưởng cao nhất. Nên ta chọn chủng KT 10 để tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh trưởng và phát triển tiếp theo 3.2. Phân loại và xác định tên của chủng tuyển chọn Từ những đặc điểm sinh học của chủng KT 10 mà ta thu nhận được trong các nghiên cứu ở trên ta tiến hành đối chiếu với bảng định loại của Harry Seeley và cộng sự (1994), ta có thể kết luận: Chủng KT 10 là một loài thuộc chi Bacillus. Để có thể xác định chính xác đó là loài nào ta dực vào kết quả phân tích trình tự 16s-rARN do phòng xét nghiệm NK-BIOTECH của công ty Nam Khoa xác định. Kết quả được trình bày ở hình sau: Hình 3.7: Trình tự 16S rARN của chủng KT 10 57 Trình tự này được đem đối chiếu với trình tự 16S rARN của các chủng vi khuẩn đã được định loại trong ngân hàng gen BLAST. Kết quả đối chiếu cho thấy chủng KT 10 là Bacillus subtilis với độ chính xác là 100%. Vì vậy ta gọi chủng này là Bacillus subtilis KT 10 3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và tổng hợp protease của vi khuẩn. Chuẩn bị môi trường có các nguồn nguyên liệu khác nhau ở các nồng độ khác nhau:  Bổ sung Casein vào môi trường 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Bổ sung bột đậu nành vào môi trường 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Bổ sung bột cá vào môi trường cơ sở 2.2.3 thay glucose ở nồng độ 1, 2, 3, 4, 5%.  Dùng môi trường cơ sở 2.2.3 làm thí nghiệm đối chứng. Cho 50ml môi trường vào bình tam giác khữ trùng ở 1atm/30 phút, để nguội sau đó cấy vi khuẩn vào với tỷ lệ 1-2%. Các môi trường đều được chuẩn độ ở pH 7. Sau đó lắc ở 200 vòng/phút trong 40h ở 370C. Đo độ sinh trưởng và hoạt độ protein ta thu được kết quả ở bảng 3.5 Bảng 3.5: Sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT10 trong các cơ chất khác nhau Cơ chất Nồng độ % OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 1 0.437 ± 0.005 0.944 ± 0.019 2 0.631 ± 0.004 1.270 ± 0.077 3 0.497 ± 0.003 1.078± 0.057 4 0.432 ± 0.004 1.066 ± 0.047 G lu co se 5 0.387 ± 0.009 0.777 ± 0.050 58 1 0.503 ± 0.005 1.904 ± 0.032 2 0.537 ± 0.003 1.931 ± 0.046 3 0.603 ± 0.003 1.977 ± 0.037 4 0.599 ± 0.002 1.811 ± 0.035 C as ei n 5 0.437 ± 0.003 1.680 ± 0.016 1 0.963 ± 0.002 1.400 ± 0.005 2 1.486 ± 0.002 1.758 ± 0.163 3 1.664 ± 0.002 1.811 ± 0.032 4 1.522 ± 0.003 1.716 ± 0.063 B ột cá 5 1.215 ± 0.002 1.412 ± 0.027 1 1.232 ± 0.014 1.902 ± 0.016 2 1.56 ± 0.008 1.945 ± 0.023 3 1.898 ± 0.003 2.018 ± 0.014 4 1.968 ± 0.006 2.094 ± 0.009 B ột đậ u nà nh 5 1.609 ± 0.002 1.791 ± 0.015 Bảng 3.6: Hoạt độ enzim protease ở mức cao nhất với các cơ chất khác nhau Cơ chất Nồng độ % OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) Glucose 2 0.631 ± 0.004 1.270 ± 0.077 Casein 3 0.603 ± 0.003 1.977 ± 0.037 Bột cá 3 1.664 ± 0.002 1.811 ± 0.032 Bột đậu nành 4 1.968 ± 0.006 2.094 ± 0.009 59 Hình 3.8 Hoạt độ enzim protease trong các môi trường với cơ chất khác nhau Qua kết quả thu được ta thấy Glucose không phải là cơ chất cảm ứng sinh enzim protease nên vi khuẩn sinh enzim có hoạt độ thấp hơn hẳn khi ta thay glucose bằng các cơ chất cảm ứng sinh enzim như đậu nành, bột cá và casein với các nồng độ khác nhau. Trong đó môi trường đậu nành 4% và casein 3% vi khuẩn phát triển tốt nhất và cho hoạt độ enzim cao nhất. Tuy nhiên, do giá thành của bột đậu nành rẻ hơn, lại dể tìm nên ta chọn đậu nành là cơ chất cảm ứng sinh enzim sau này. Đồng thời trong quá trình phát triển, vi khuẩn sinh enzim làm thay đổi độ pH của môi trường nên ta có thể bổ sung thêm CaCO3 ở các nồng độ 0.3, 0.5, 1, 1.5%, để trung hòa lượng axit tạo thành.Tiến hành tiếp giống vào 50ml môi trường với tỷ lệ 1- 2% rồi nuôi lắc ở 370C trong 40h với chế độ lắc là 200 vòng/ phút. Đo OD sinh trưởng và hoạt tính protease của vi khuẩn ta thu được kết quả theo bảng sau. 60 Bảng 3.7: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 lên sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT10 Nồng độ CaCO3 % pH OD sinh trưởng HĐP(UI/ml) 0 8.63 1.906 ± 0.014 2.011 ± 0.007 0.3 8.68 1.927 ± 0.008 2.106 ± 0.008 0.5 8.85 1.935 ± 0.003 2.144 ± 0.010 1 8.64 1.914 ± 0.006 2.060 ± 0.028 1.5 8.60 1.902 ± 0.002 1.957 ± 0.007 Hình 3.9: Ảnh hưởng của nồng độ CaCO3 lên sinh trưởng và hoạt độ enzim protease của KT10 Qua đồ thị ta thấy nồng độ CaCO3 thích hợp nhất cho sự sinh trưởng và sinh enzim protease của vi khuẩn là 0.5%. Nên trong các thí nghiệm sau ta chọn môi trường có nồng độ cơ chất đậu nành là 4% và bổ sung CaCO3 với nồng độ là 0.5%. 61 3.4. Nghiên cứu các điều kiện môi trường ảnh hưởng đến sinh tổng hợp enzym prorease của vi khuẩn. 3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym protease của chủng vi khuẩn KT10 Nhằm xác định thời gian thích hợp để dừng nuôi cấy thu sinh lượng enzim tối đa, ta tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường cảm ứng sinh enzim có cơ chất đậu nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5 %. Nuôi các bình này trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút. Sau từng khoảng thời gian xác định 20, 30, 36, 40, 44, 48, 52... Xác định hoạt tính của protease của môi trường bằng phương pháp Anson và đo OD sinh trưởng ở bước sóng 620nm. Số liệu thu được thể hiện ở bảng sau: Bảng 3.8: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của vi khuẩn KT 10 Thời gian nuôi cấy OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 20h 0.584 ± 0.001 0.836 ± 0.007 30h 1.367 ± 0.002 1.774 ± 0.008 36h 1.988 ± 0.003 2.026 ± 0.007 40h 1.968 ± 0.002 2.126 ± 0.016 44h 1.955 ± 0.003 1.893 ± 0.012 48h 1.505 ± 0.002 1.712 ± 0.006 52h 1.241 ± 0.002 1.369 ± 0.005 62 Hình 3.10: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của vi khuẩn KT 10 Sau khi tiến hành ly tâm thu dịch enzim thô và tiến hành khảo sát theo phương pháp Anson. Ta thấy sự sinh trưởng của vi khuẩn và hoạt độ enzim sinh ra tăng dần từ 20h – 40h sau đó giảm dần. Sự sinh trưởng đạt mức cao nhất ở 36h và hoạt độ enzim đạt cao nhất ở khoảng thời gian 40h. Vì vậy, trong các thí nghiệm sau ta chọn thời gian thích hợp để thu enzim là 40 giờ. 3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym protease của chủng vi khuẩn KT 10 Nhiều nghiên cứu cho thấy nhờ khả năng sinh bào tử mà các vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh trưởng trong giới hạn nhiệt độ khá rộng, nhưng hầu hết các vi khuẩn nhóm này đều là loài ưa ấm với nhiệt độ dao động từ 20 – 450C [21,22]. Nhằm tìm được nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh enzim của vi khuẩn KT10. Chủng giống được nuôi ở 370C, sau đó cấy 1 - 2% vào môi trường cảm ứng sinh 63 enzim có cơ chất đậu nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5 % trong bình trụ miệng nhỏ. Nuôi các bình này trong máy lắc ở các nhiệt độ 27, 32, 37, 42, 47... với tốc độ 200 vòng/ phút trong thời gian 40h. Ta thu được kết quả như bảng sau: Bảng 3.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KT 10 Nhiệt độ OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 270C 1.180 ± 0.003 1.643 ± 0.018 320C 1.894 ± 0.002 2.039 ± 0.003 370C 1.985 ± 0.003 2.206 ± 0.009 420C 1.826 ± 0.002 2.183 ± 0.036 470C 1.508 ± 0.002 1.797 ± 0.014 Hình 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp protease của vi khuẩn KT 10 64 Theo số liệu ở bảng 3.9 ta thấy sự sinh trưởng và hoạt độ protease của vi khuẩn KT 10 đạt tối đa ở điều kiện nhiệt độ là 370C. Kết quả này là phù hợp vì các chủng Bacillus thường là các chủng ưa ấm.Vì vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo ta chọn điều kiện nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 370C. 3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của chủng vi khuẩn KT 10 pH là chỉ tiêu để đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn nên đây là một yếu tố quan trọng cần được nghiên cứu. Để đánh giá được sự phát triển cũng như khả năng sinh enzim của KT 10 ở các pH khác nhau, ta tiến hành nuôi các chủng giống, sau đó cấy 1 - 2% vào môi trường cảm ứng sinh enzim có cơ chất đậu nành 4%, bổ sung CaCO3 với nồng độ 0.5 %, ở mỗi pH môi trường khác nhau: 6,5; 7; 7,5; 8; 8.5 ... trong 40h và ở nhiệt độ 370C, ly tâm dịch enzym thô. Đo OD sinh trưởng và hoạt tính của protease ta được kết quả như sau: Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợpenzim protease của KT10 pH OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 6.5 1.780 ± 0.003 1.931 ± 0.011 7 2.035 ± 0.002 2.225 ± 0.017 7.5 2.022 ± 0.002 2.099 ± 0.013 8 1.926 ± 0.002 2.014 ± 0.008 8.5 1.908 ± 0.002 1.933 ± 0.008 65 Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của KT10 Qua bảng 3.10 ta thấy ở pH 6.5 vi khuẩn phát triển yếu. Khi pH tăng từ 7-8.5 vi khuẩn sinh trưởng và phát triển tốt hơn. Ở pH 7- 7,5 là khoảng mà vi khuẩn sinh trưởng tốt và cho hoạt tính enzim cao nhất. Do vậy, trong các thí nghiệm tiếp theo ta chọn độ pH thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzim của vi khuẩn là 7-7.5. 3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự hiếu khí lên khả năng sinh trưởng và tạo enzym của chủng vi khuẩn KT 10 Nồng độ oxi hòa tan trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng phát triển của vi sinh vật hiếu khí. Tuy nhiên ảnh hưởng này có khác nhau tùy theo từng loài vi khuẩn, hầu hết là làm tăng tốc độ sinh trưởng, rút ngắn pha tiềm phát, nâng cao lượng sinh khối nhưng trong một vài trường hợp thì thiếu oxi tuy có kiềm hãm sinh trưởng nhưng lại gia tăng quá trình sinh tổng hợp enzim. Để tìm hiểu ảnh hưởng của độ thông khí lên khả năng sinh enzim và sinh trưởng của vi khuẩn ta cho vào các bình tam giác có thể tích 250ml dung địch lên men có thể tích khác nhau từ 25ml – 125ml. Độ thông khí được tính bằng tỷ lệ thể tích môi trường so với thể 66 tích bình chứa để ở nhiệt độ 370C trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút trong 40 giờ. Tiến đo OD sinh trưởng và hoạt độ protease ta thu được kết quả như bảng sau: Bảng 3.11: Ảnh hưởng của sự hiếu khí lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của KT10 Độ thông khí % OD sinh trưởng HĐP (UI/ml) 10 1.874 ± 0.003 2.038 ± 0.012 20 1.890 ± 0.002 2.296 ± 0.008 30 1.764 ± 0.002 1.981 ± 0.008 40 1.590 ± 0.002 1.816 ± 0.025 50 1.542 ± 0.002 1.808 ± 0.005 Hình 3.13: Ảnh hưởng của sự hiếu khí lên sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim protease của KT10 67 Dựa vào bảng 4.11 ta nhận thấy độ thông khí phù hợp cho sự sinh trưởng và sinh enzim của KT 10 là 20% tương đương với tỷ lệ giữa môi trường và bình chứa là 50/250 ml. Do vậy, độ thông khí thích hợp để nuôi vi khuẩn KT 10 là 20%. 3.5. Nghiên cứu tách enzym protease từ dịch môi trường. Dùng môi trường bột đậu nành 4% trong bình tam giác 250ml, cấy vi khuẩn với nồng độ 1 – 2 %, nuôi ở nhiệt độ 370C, trong 40 giờ đem ly tâm 5000 vòng/phút trong 20 phút loại bỏ cặn giữ lạnh ở 40C. Rồi tiến hành tủa enzim với các tác nhân tủa như trình bày ở phần trên. Ta thu được kết quả sau: Bảng 3.12: Thu nhận enzim bằng các tác nhân tủa Tác nhân tủa Ethanol 960 Acetone (NH4)2SO4 VddE/Vdm Hiệu suất thu nhận VddE/Vdm Hiệu suất thu nhận Nồng độ Hiệu suất thu nhận 1:3 3.8g/100ml 1:2 3.2g/100ml 70% 2.9g/100ml Tiến hành thí nghiệm khảo sát với 0,1g chế phẩm enzim protease thu được theo từng tác nhân tủa hòa tan trong 150ml nước cất. Đo hoạt độ enzim protease bằng phương pháp Ason ta thu được kết quả như bảng sau: Bảng 3.13: Kết quả đo hoạt độ enzim theo tác nhân tủa Tác nhân tủa HĐ P (UI/g) Ethanol 960 2485.1 ± 9.587 Acetone 1925.2 ± 25.688 (NH4)2SO4 1470.8 ± 9.148 Dựa vào bảng 3.13 ta nhận thấy sử dụng tác nhân tủa là ethanol 960 cho hiệu suất tủa cao nhất và đồng thời hoạt độ của enzim cũng được giữ lại cao nhất. Vì vậy trong các thí nghiệm sau ta sử dụng cồn ethanol 960 làm tác nhân tủa. 68 3.6. Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzim Sử dụng chế phẩm enzim protease được tinh sạch sơ bộ ở trên với độ pha loãng 1500 lần. Chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ protease của chế phẩm 3.6.1. Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzim protease Casein được pha trong các dung dịch đệm có độ pH khác nhau 6, 6.5, 7, 7.5 , 8....Sau đó cho enzim protease tác dụng trong điều kiện nhiệt độ tối thích. Ta được kết quả như sau: Bảng 3.14 Hoạt độ enzim protease theo pH của dung dịch đệm pH HĐP (UI/g) 6 1036.7 ± 4.223 6.5 1687.9 ± 4.057 7 1967.8 ± 6.198 7.5 2257.9 ± 9.148 8 2272.1 ± 2.343 8.5 2363.4 ± 3.514 9 2241.7 ± 5.367 Hình 3.14: Hoạt độ enzim protease theo pH của dung dịch đệm 69 Dựa vào bảng 3.14 ta thấy pH có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của chế phẩm. Chế phẩm protease thu được có hoạt tính tương đối cao ở pH từ 7.5 – 9 . Đạt cao nhất ở độ pH là 8.5. Nên ta có thể kết luận chế phẩm protease thu được từ vi khuẩn KT 10 thuộc nhóm protease kiềm. 3.6.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease Sau khi nuôi cấy và tủa enzim protease ta tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ protease của chế phẩm thu được kết quả sau: Bảng 3.15: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt độ enzim protease của chế phẩm Nhiệt độ (0C) HĐP (UI/g) 35 2253.9 ± 3.514 40 2296.5 ± 7.028 45 2312.7 ± 8.446 50 2410.1 ± 9.370 55 2109.8 ± 2.343 60 1795.4 ± 3.514 65 1024.5 ± 5.367 70 557.9 ± 9.587 Hình 3.15: Đồ thị kết quả đo hoạt độ enzim theo nhiệt độ phản ứng 70 Theo kết quả thu được ta thấy hoạt độ enzim của chế phẩm tương đối ổn định từ 350C – 550C. Đạt mức tối đa ở 500C (2410.1). Sau đó nếu nhiệt độ vẫn tiếp tục tăng thì hoạt tính của enzim giảm mạnh từ 1024.5 đến 557.9. 3.6.3. Ảnh hưởng của thời gian phản ứng đến hoạt độ protease Nhằm xác định được thời gian enzim tác dụng với cơ chất cho hiệu quả cao nhất, ta dùng chế phẩm enzim tủa được cho tác động với cơ chất casein1% trong thời gian: 10- 100 phút, ở nhiệt độ 500C và pH của dung đệm là 8.5. Tiến hành đo hoạt độ enzim ta thu được kết quả sau: Bảng 3.16: Hoạt độ enzim theo thời gian phản ứng Thời gian (phút) HĐ P (UI/g) 10 2318.8 ± 3.514 20 2373.5 ± 7.028 30 2408.0 ± 3.099 40 2467.9 ± 1.757 50 2593.9 ± 2.108 60 2605.8 ± 4.099 70 2247.5 ± 4.518 80 1748.2 ± 3.514 90 1466.7 ± 2.438 100 1164.3 ± 5.176 71 Hình 3.16: Hoạt độ enzim theo thời gian phản ứng Qua kết quả thu được ta thấy hoạt tính của chế phẩm tương đối ổn định trong khoảng từ 10-60 phút. Từ phút thứ 70, hoạt tính của chế phẩm giảm một cách nhanh chóng, và đến phút 100 chế phẩm có hoạt tính thấp nhất. Vì vậy khi tiến hành cho enzim phân hủy cơ chất ta có thể lựa chọn khoảng thời gian phù hợp cho phản ứng là từ 10 – 60 phút. 3.7. Nuôi cấy trong bình tam giác và nghiên cứu động học của quá trình này Từ các điều kiện tối ưu đã tìm được ở trên ta tiến hành cấy 1-2% chủng vi khuẩn KT 10 vào 250ml dịch lên men/ 1000ml bình chứa có cơ chất là bột đậu nành 4% có bổ sung 0.05% CaCO3, ở nhiệt độ 370C, pH 7. Sau từng khoảng thời gian xác định 20, 30, 36, 40, 44, 48, 52...tiến hành nghiên cứu động học quá trình sinh tổng hợp enzym với 3 thông số pH, sinh trưởng và hoạt độ enzim. Sau đó tủa enzim bằng cồn 960 rồi sấy khô ở 400C tiến hành pha loãng đo hoạt lực của enzym theo phương pháp Anson. Ta thu được kết quả theo bảng bảng 4.17 72 Bảng 3.17: Sinh trưởng, pH và hoạt độ của vi khuẩn KT 10 theo thời gian Thời gian pH OD sinh trưởng Hoạt độ enzim (UI/g) 20h 7.35 0.587 ± 0.002 0.837 ± 0.008 30h 7.86 1.374 ± 0.001 1.791 ± 0.003 36h 8.17 1.998 ± 0.002 2.115 ± 0.003 40h 8.37 1.978 ± 0.003 2.318 ± 0.006 44h 8.39 1.965 ± 0.002 2.200 ± 0.004 48h 7.85 1.513 ± 0.001 1.812 ± 0.003 52h 7.73 1.247 ± 0.002 1.549 ± 0.004 Hình 3.17 Động học sự sinh trưởng và sinh enzim của chủng KT 10 Như vậy sau một thời gian tiến hành phân lập, thử nghiệm các điều kiện nuôi cấy vi khuẩn KT 10 ta thấy khi được tiến hành nuôi với số lượng lớn hơn vi khuẩn vẩn có thể đảm bảo cho enzim protease kiềm có hoạt tính và tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn không thay đổi nhiều so với khi nuôi ở qui mô nhỏ ( bình 250ml). 73 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ  KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được ở trên, chúng tôi rút ra những kết luận sau đây: Từ đất vườn chúng tôi đã phân lập được10 khuẩn lạc khác nhau có hoạt tính protease. Trong đó có 3 chủng vi khuẩn cho hoạt tính protease tương đối mạnh là KT6, KT8, KT10. Sau đó tiến hành nghiên cứu hình thái tế bào, khuẩn lạc và một vài đặc điểm sinh học, ta thấy 3 chủng này là:  Trực khuẩn, gram (+), có khả năng hình thành bào tử.  Có hoạt tính catalase nên đây là vi sinh vật hiếu khí.  Nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là từ 300C-370C nên đây là những vi sinh vật ưa ấm .  Sinh trưởng tốt ở nồng độ muối 1% - 5%. Trong 3 chủng này thì chủng KT10 cho enzim với hoạt độ cao hơn hẳn 2 chủng còn lại nên KT10 được chọn làm chủng giống để nghiên cứu tiếp . Sau khi tiến hành định danh bằng phương pháp phân tử (PCR) đã xác định chủng KT10 là Bacillus subtilis với độ chính xác là 100%. Nghiên cứu nuôi cấy chủng KT10 trong các môi trường có cơ chất cảm ứng sinh enzim protease khác nhau như: casein, bột đậu nành, bột cá. Thì trong môi trường casein và bột đậu nành vi khuẩn KT 10 sinh tổng hợp enzim có hoạt độ cao hơn. Tuy nhiên, do bột đậu nành rẻ và dễ tìm nên bột đậu nành ở nồng độ 4% là cơ chất cảm ứng thích hợp để sinh enzim. Trong môi trường có 0.5% CaCO3 (đóng vai trò điều khiển pH) ta thấy vi khuẩn có thể sinh enzim có hoạt độ cao hơn. Các điều kiện tối ưu để nuôi cấy KT 10 là :  Nhiệt độ phù hợp là 370C.  Độ pH thích hợp cho môi trường ban đầu là 7. 74  Thời gian tối thích để chủng KT10 sinh tổng hợp enzim protease trên môi trường thích hợp trên là 40h.  Độ hiếu khí là 1/5 (50ml môi trường /250ml bình chứa) Chế phẩm enzim protease sau khi tinh sạch tiến hành tủa sơ bộ bằng nhiều tác nhân khác nhau. Trong đó cồn 960 là tác nhân tủa được nhiều và cho enzim protease có hoạt tính cao nhất với hiệu suất thu nhận enzim là 3.8g/100ml có hoạt độ là 2485.1UI/g. Enzim protease tủa được này cho hoạt độ cao nhất ở các điều kiện sau (Ở nồng độ cơ chất là 1% thời gian phản ứng 30phút pH của dung dịch đệm là 7.6, nhiệt độ 35.5):  Nhiệt độ phản ứng là 500C.  Độ pH của dung dịch đệm là 8.5 nên ta có thể kết luận đây là protease kiềm.  Thời gian enzim phản ứng với cơ chất là từ 10 – 60 phút . Tiến hành nuôi cấy nghiên cứu động học sự sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp enzim ở qui mô bình 1l ta thấy sự sinh trưởng và hoạt độ enzim của vi khuẩn gần như không thay đổi so với khi nuôi ở bình 250ml. Với các kết quả thu được từ các thí nghiệm hoàn toàn có thể làm cơ sở cho việc nghiên cứu sâu hơn về khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp enzim của chủng vi khuẩn này để có thể áp dụng vào sản xuất enzim protease kiềm trên qui mô lớn hơn.  ĐỀ NGHỊ Do điều kiện khách quan nên tôi không thể nghiên cứu sâu hơn. Nếu có điều kiện, chúng tôi sẽ tiếp tục đề tài với các nghiên cứu:  Khảo sát sâu các điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzim protease ở qui mô lớn hơn.  Nghiên cứu các ứng dụng của enzim protease kiề