Luận văn Nghiên cứu thu nhận lipase trên môi trường bã đậu nành bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt

Chöông 1 GIÔÙI THIEÄU Lipase laø moät trong nhöõng loaïi enzyme coù giaù trò thöông maïi raát cao bôûi vì noù coù khaû naêng xuùc taùc cho nhieàu loaïi phaûn öùng ñaëc hieäu khaùc nhau. Cho ñeán ngaøy nay, loaïi enzyme naøy vaãn ñöôïc xem laø chaát xuùc taùc linh ñoäng nhaát. Tuy nhieân, phöông phaùp nuoâi caáy ñeå thu nhaän lipase chuû yeáu laø phöông phaùp truyeàn thoáng – phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu. ÔÛ Vieät Nam, coâng ngheä enzyme chöa thaät söï phaùt trieån maïnh, nhöng nhu caàu veà enzyme laø raát lôùn. Do ñoù, vieäc nghieân cöùu vaø phaùt trieån saûn xuaát enzyme taïi Vieät Nam laø ñieàu raát caàn thieát. Hieän nay, phöông phaùp nuoâi caáy beà maët treân moâi tröôøng raén ñang daàn theå hieän nhöõng öu ñieåm so vôùi phöông phaùp truyeàn thoáng khi thu nhaän moät soá saûn phaåm sinh hoïc vaø trong ñoù coù cheá phaåm lipase töø vi sinh vaät. Nhöõng öu ñieåm nhö naêng suaát sinh toång hôïp enzyme cao, coâng ngheä ñôn giaûn vaø chi phí ñaàu tö thaáp ñaõ laøm cho phöông phaùp naøy raát thích hôïp ñeå phaùt trieån taïi Vieät Nam. Vì vaäy, vieäc nghieân cöùu thu nhaän lipase treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà maët laø muïc tieâu caáp thieát cuûa ñeà taøi khoa hoïc naøy. Chuùng toâi muoán taän duïng nguoàn pheá lieäu baõ ñaäu naønh ñeå saûn xuaát ra moät nguoàn lôïi lôùn – cheá phaåm lipase hoaït tính cao vaø öùng duïng phöông phaùp naøy vaøo quy moâ saûn xuaát coâng nghieäp. Chöông 2 Toång quan Lipase vaø Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët 2.1. ENZYME LIPASE 2.1.1. Giôùi thieäu Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) laø enzyme tham gia quaù trình xuùc taùc cho phaûn öùng thuûy phaân thuaän nghòch triacylglycerol ôû ñieàu kieän bình thöôøng. Lipase khaùc vôùi enzyme esterase ôû ñieåm chæ thuûy phaân cô chaát khoâng tan trong nöôùc vaø hoaït tính ñöôïc taêng cöôøng khi ôû beà maët phaân chia pha cô chaát – nöôùc (interfacial activation). Vì vaäy hoaït tính toái öu cuûa lipase chæ ñöôïc theå hieän trong heä nhuõ töông, khi ñoù thì dieän tích beà maët tieáp xuùc giöõa cô chaát vaø enzyme seõ taêng leân raát nhieàu. Ngoaøi ra, khoâng nhöõng xuùc taùc cho heä nhuõ töông bình thöôøng (daàu trong nöôùc) lipase coøn hoaït ñoäng maïnh ôû nhöõng heä nhuõ laø nöôùc trong daàu vaø daàu hoøa tan trong dung moâi höõu cô. Hôn theá nöõa, lipase raát linh hoaït vì coù theå xuùc taùc cho phaûn öùng chuyeån hoùa ester vaø toång hôïp ester ñaëc hieäu veà caáu hình khoâng gian vôùi söï ña daïng veà cô chaát phaûn öùng. Nhöõng tieán boä quan troïng gaàn ñaây ñaõ nghieân cöùu veà caáu truùc cuûa tinh theå lipase ñeå giuùp chuùng ta tìm hieåu saâu hôn veà cô cheá xuùc taùc, hoaït tính beà maët, tính ñaëc hieäu vaø baûn chaát cuûa trung taâm hoaït ñoäng. Do ñoù vieäc öùng duïng lipase ngaøy caøng trôû neân ña daïng vaø ñaày tieàm naêng. 2.1.2. Nguoàn thu nhaän lipase 2.1.2.1. Lipase töø ñoäng vaät [4-8] Lipase thu nhaän töø nhöõng cô quan, moâ cuûa moät soá loaøi ñoäng vaät höõu nhuõ ñaõ ñöôïc nghieân cöùu raát nhieàu, nhöng toaøn dieän hôn caû laø lipase coù nguoàn goác töø con ngöôøi vaø moät soá lipase töø tuyeán tuïy. Nhöõng enzyme tuyeán tuïy naøy ñöôïc tieát ra ôû taù traøng xuùc taùc cho söï thuûy phaân triacylglycerol. Lipase tuyeán tuïy coù theå thuûy phaân hoaøn toaøn triacylglycerol thaønh acid beùo vaø glycerol. Baûn chaát cuûa chuùng laø nhöõng glycoprotein, phaân töû löôïng 50kDa, khoâng coù hoaëc ít hoaït tính ñoái vôùi phospholipid vaø ñöôïc hoaït hoùa ôû beà maët phaân chia pha daàu nöôùc, nhöng laïi bò öùc cheá bôûi muoái maät. Lipase cuûa ñoäng vaät höõu nhuõ beàn ôû pH thaáp, ñöôïc hoaït hoùa bôûi muoái maät vaø ñaëc hieäu taïi vò trí sn-3 cuûa cô chaát. Lipoprotein lipase ngöôøi coù chöùc naêng thuûy phaân triacylglycerol trong chylomicron. Ñeå coù hoaït tính thì enzyme naøy keát hôïp vôùi apolipoprotein C-II ñeå taïo thaønh dimer vaø ñöôïc hoaït hoùa bôûi heparin. Tuy nhieân, lipase trong gan thöïc hieän chöùc naêng chuyeån hoùa lipoprotein nhöng khoâng lieân keát vôùi apoC-II. Lipase coù trong söõa meï ñöôïc hoaït hoùa bôûi muoái maät ñeå giuùp treû sô sinh tieâu hoùa chaát beùo coù trong söõa. 2.1.2.2. Lipase töø thöïc vaät [9] Lipase töø thöïc vaät khoâng ñöôïc chuù yù nhieàu so vôùi nhöõng nguoàn thu nhaän khaùc. Tuy nhieân, gaàn ñaây loaïi enzyme naøy ñaõ baét ñaàu ñöôïc quan taâm vaø nghieân cöùu khaù phoå bieán. Trong ñoù, lipase töø nhöõng haït coù daàu laø ñöôïc quan taâm nhaát. Nhöõng enzyme naøy neáu khaùc nhau töø nguoàn nguyeân lieäu thu nhaän thì tính ñaëc hieäu veà cô chaát, pH toái öu, khaû naêng phaûn öùng vôùi sulfuhydryl, tính kî nöôùc cuõng khaùc nhau. Nhöõng enzym naøy coù quan heä maät thieát vôùi triacylglycerol coù trong baûn thaân haït daàu ñoù vaø chæ ñöôïc toång hôïp trong quaù trình naûy maàm cuûa haït. 2.1.2.3. Lipase töø vi sinh vaät [10] Ñaây laø nguoàn enzyme ñöôïc quan taâm vaø saûn xuaát nhieàu nhaát theo qui moâ coâng nghieäp. Khaùc vôùi thöïc vaät vaø ñoäng vaät, vi sinh vaät ñöôïc caáu taïo töø moät teá baøo, chính vì vaäy maø noù coù nhöõng öu ñieåm hôn haún ñoäng vaät vaø thöïc vaät. Vi sinh vaät coù khaû naêng toång hôïp moät löôïng enzyme raát lôùn trong moät khoaûng thôøi gian ngaén; hoaït tính cuûa enzyme cao hôn hoaït tính cuûa enzyme ñöôïc toång hôïp töø ñoäng vaät vaø thöïc vaät; vaø ta hoaøn toaøn coù theå ñieàu khieån toác ñoä sinh toång hôïp enzyme trong khi saûn xuaát. Lipase ñöôïc thu nhaän töø vi sinh vaät bao goàm vi khuaån, naám men vaø naám moác laø nhöõng enzyme ngoaïi baøo coù tính chaát gaàn gioáng lipase tuyeán tuïy. Caùc loaøi naám moác coù khaû naêng sinh toång hôïp lipase nhö: Aspergillus spp., Mucor spp., Rhizopus spp., Penicillium spp., Geotrichum spp. Ñoái vôùi naám men goàm nhöõng loaøi: Torulopsis spp., Candida spp. Vaø vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp lipase bao goàm: Pseudomonas spp., Achromobacter spp., Staphylococcus spp. Baûng 2.1 – Caùc loaøi vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp lipase [10] 2.1.3. Cô cheá sinh toång hôïp lipase töø vi sinh vaät [11-16] Gioáng nhö söï toång hôïp protein, lipase seõ ñöôïc hình thaønh khi traûi qua caùc quaù trình phieân maõ, dòch maõ vaø sau dòch maõ. Taát caû caùc quaù trình ñöôïc thöïc hieän beân trong teá baøo chaát cuûa vi sinh vaät. Ñaàu tieân laø söï phieân maõ. Quaù trình chæ xaûy ra khi ñoaïn gen toång hôïp neân lipase phaûi ñöôïc hoaït hoùa tröôùc baèng chaát caûm öùng. Chaát naøy seõ giuùp giaûi phoùng enzyme RNA polymerase thoaùt khoûi söï kìm haõm cuûa chaát öùc cheá baèng caùch keát hôïp vôùi chính chaát öùc cheá ñoù. Baûn chaát cuûa chaát caûm öùng chính laø cô chaát chòu söï xuùc taùc cuûa lipase. Keát thuùc quaù trình phieân maõ dieãn ra trong nhaân teá baøo saûn phaåm seõ laø phaân töû mRNA, nhöng phaân töû naøy raát deã bò thuûy phaân trong moâi tröôøng teá baøo chaát. Beân caïnh ñoù, nhöõng keát quaû nghieân cöùu gaàn ñaây cho thaáy phaân töû siRNA (short interference RNA) ñöôïc hình thaønh trong quaù trình phieân maõ coù taùc ñoäng kìm haõm söï dòch maõ hoaëc thuùc ñaåy söï phaân huûy nhöõng phaân töû mRNA. Vì vaäy soá löôïng enzyme ñöôïc toång hôïp seõ giaûm ñi ñaùng keå. Tieáp theo, quaù trình dòch maõ seõ söû duïng taøi lieäu maõ chöùa trong phaân töû mRNA ñeå taïo thaønh maïch protein coù thöù töï acid amin chính xaùc. Tuy nhieân, chuoãi polypeptide naøy raát deã bò thuûy phaân bôûi enzyme peptidase. Quaù trình naøy caàn moät loaïi protein “chuyeån giao” ñeå taùi söû duïng caùc acid amin cuûa protein coù caáu truùc gaáp khuùc (folded protein) maø khoâng coøn söû duïng ñöôïc nöõa. Khi nhöõng chuoãi polypeptide enzyme ñaõ ñöôïc toång hôïp khaù nhieàu thì nhöõng polypeptide ôû gaàn nhau seõ töông taùc vôùi nhau taïo thaønh caáu truùc gaáp khuùc laøm cho khoái enzyme trôû neân khoâng tan. Ñieàu naøy ñaõ laøm cho enzyme maát ñi hoaït tính sinh hoïc. Quaù trình naøy ñöôïc ñieàu khieån bôûi chaperone, laø moät ñoaïn polypeptide coù chöùc naêng laøm gaáp khuùc caùc enzyme trong noäi baøo tröôùc khi nhöõng enzyme naøy ñöôïc vaän chuyeån qua maøng membrane. Ñoái vôùi pre-pro-enzyme ngoaïi baøo, laø enzyme toång hôïp trong teá baøo chaát nhöng chöa coù caáu truùc hoaøn thieän, caáu truùc phaân töû khoâng ñöôïc gaáp khuùc trong suoát quaù trình vaän chuyeån qua maøng membrane. Do ñoù, moät soá protein khaùc ñaõ hoã trôï enzyme ngoaïi baøo naøy choáng laïi söï gaáp khuùc trong teá baøo chaát ñeå khoâng hình thaønh khoái protein khoâng tan vaø choáng laïi söï thuûy phaân noäi baøo. Hoaït tính cuûa enzyme coøn phuï thuoäc vaøo cofactor laø nhöõng ion kim loaïi. Söï cung caáp khoâng ñuû nhöõng ion naøy trong teá baøo chaát seõ laøm giaûm ñi hoaït tính cuûa enzyme. Vì vaäy phaûi ñaûm baûo noàng ñoä baõo hoøa caùc ion ñoái vôùi enzyme phaûi thaáp hôn noàng ñoä caùc ion ñoù trong teá baøo chaát. Ñoái vôùi pre-pro-enzyme, khi khoâng ñuû cofactor ñeå ñaûm baûo hoaït tính cuõng nhö söï vaän chuyeån qua maøng membrane thì moät löôïng enzyme naøy bò giöõ laïi trong teá baøo chaát laøm aûnh höôûng hieäu suaát sinh toång hôïp enzyme. Sau khi ñöôïc vaän chuyeån qua maøng membrane, enzyme ngoaïi baøo vaãn coù theå bò phaân huûy bôûi enzyme peptidase trong khoâng gian chu chaát. Trong giai ñoaïn naøy pro-enzyme, laø enzyme ngoaïi baøo trong khoâng gian chu chaát chöa coù caáu truùc hoaøn thieän, vaãn tieáp tuïc hoaøn thieän caáu truùc cuûa noù nhôø nhöõng phaûn öùng thuûy phaân. 2.1.4. Ñaëc ñieåm cuûa lipase vi sinh vaät [17,18] 2.1.4.1. Caáu truùc phaân töû Lipase thu nhaän töø vi sinh vaät laø nguoàn enzyme ñaày tieàm naêng vaø ñöôïc nghieân cöùu moät caùch saâu roäng. Nhìn chung, lipase coù caáu truùc a/b vôùi vò trí trung taâm laø löôùi hoãn hôïp b chöùa boä ba xuùc taùc vaø coù caáu truùc xoaén ngaên caûn cô chaát tieáp xuùc trung taâm hoaït ñoäng. Rhizomucor miehei (Mucor miehei) saûn xuaát lipase ngoaïi baøo coù khaû naêng thuûy phaân raát nhieàu cô chaát lipid khaùc nhau. Trong quaù trình sinh toång hôïp, caáu truùc phaân töû cuûa enzyme ñöôïc gaén theâm moät ñoaïn peptide tín hieäu (signal peptide) vaø moät ñoaïn propeptide beân caïnh maïch enzyme chính bao goàm 269 amino acid coù phaân töû löôïng laø 29.472 Dalton. Coù hai daïng ñoàng phaân cuûa enzyme laø daïng A (pI=3,9) vaø daïng B (pI=4,3) phuï thuoäc möùc ñoä deglycosylation trong quaù trình sau dòch maõ. Caáu truùc cuûa lipase Rhizomucor miehei laø caáu truùc daïng a/b goàm vuøng löôùi b trung taâm coù taùm daûi b lieân keát song song cuoän leân treân vuøng xoaén löôõng cöïc (N-terminal). Taát caû caùc caáu truùc xoaén ñeàu naèm moät beân löôùi b. Ba lieân keát disulfide trong phaân töû lipase, Cys29-Cys268; Cys40-Cys43 vaø Cys235-Cys244 coù taùc duïng laøm cho toaøn boä caáu truùc cuûa enzyme ñöôïc oån ñònh. Vuøng trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme coù chöùa boä ba xuùc taùc Ser144, His257 vaø Asp203 nhöng laïi bò che phuû bôûi phaàn khoâng phaân cöïc cuûa caáu truùc xoaén löôõng cöïc “lid”. “Lid” laø moät ñoaïn oligopeptide kî nöôùc maø enzyme esterase khoâng coù. Chính vì ñieàu naøy ñaõ giuùp lipase haáp phuï ñöôïc treân beà maët phaân chia pha daàu-nöôùc vaø sau ñoù dieãn ra söï taùi saép xeáp caáu truùc enzyme, ñoaïn phaân töû “lid” seõ cuoän vaøo trong ñeå loä vuøng trung taâm hoaït ñoäng xuùc taùc thuûy phaân cô chaát. Vì theá, ta coù theå nhaän thaáy raèng hoaït tính beà maët cuûa lipase chính laø vieäc taïo thaønh caáu truùc beàn vöõng treân beà maët phaân chia giöõa hai pha daàu vaø nöôùc. Lipase töø Geotrichum candidum cuõng toàn taïi döôùi hai daïng ñoàng phaân: daïng I (pI=4,56) vaø daïng II (pI= 4,46) coù cuøng chieàu daøi maïch laø 544 amino acid, phaân töû löôïng 59.085 Dalton vaø coù töø hai ñeán ba vò trí N-glycosylation töông öùng vôùi töøng daïng ñoàng phaân. Tuy nhieân, lipase I vaø II ñöôïc maõ hoùa bôûi hai ñoaïn gen khaùc nhau. Caáu truùc cuûa enzyme cuõng coù daïng a/b vôùi löôùi hoãn hôïp b hình thaønh bôûi 11 daûi trong ñoù coù 7 daûi song song vôùi nhau. Nhöõng caáu truùc cuoän xoaén lieân keát vôùi caùc daûi ñeàu naèm ôû hai beân vuøng löôùi b. Hai lieân keát disulfide ñöôïc tìm thaáy laø Cys61-Cys105 vaø Cys276-Cys288. Boä ba xuùc taùc laø Ser217, His463 vaø Glu354 naèm trong vuøng trung taâm hoaït ñoäng bò che khuaát bôûi hai caáu truùc xoaén a gaàn nhö song song vôùi nhau. Moät soá caáu truùc phaân töû cuûa lipase thu nhaän töø Candida rugosa, C. antarctica, Rhizopus delmar, Pseudomonas glumae vaø Ps. aeruginosa cuõng ñöôïc nghieân cöùu. Song, söï khaùc bieät quan troïng veà caáu truùc giöõa lipase tuyeán tuïy vaø vi sinh vaät chính laø phaàn enzyme chöùa ñaàu Carbon (C-terminal domain) ñöôïc duøng ñeå lieân keát vôùi colipase khoâng coù trong caáu truùc enzyme cuûa vi sinh vaät. Moät ñieàu caàn phaûi löu yù laø khoâng phaûi taát caû lipase ñeàu coù hoaït tính beà maët. Ví duï nhö lipase töø Pseudomonas aeruginosa thieáu caáu truùc xoaén “lid” bao phuû trung taâm hoaït ñoäng, do ñoù enzyme naøy khoâng coù hoaït tính beà maët. Hình 2.1 – Caáu truùc tinh theå lipase Thermomyces lanuginose; löôùi b, caáu truùc xoaén a, trung taâm hoaït ñoäng vaø ñoaïn phaân töû “lid” ñöôïc theå hieän töông öùng trong maøu xanh, vaøng, ñoû (sticks) vaø ñoû.  2.1.4.2. Hoaït tính beà maët Nhôø vaøo kyõ thuaät X quang maø caáu truùc tinh theå cuûa moät soá lipase ñaõ ñöôïc xaùc ñònh. Chuùng ta bieát raèng trong caáu truùc ñoù coù moät phaân ñoaïn xoaén a, ñöôïc goïi laø “lid”, ñaõ che laép trung taâm hoaït ñoäng laøm cho enzyme khoâng theå coù hoaït tính xuùc taùc trong dung dòch nöôùc hoaëc trong dung moâi höõu cô. Nhöng neáu trong dung dòch xuaát hieän beà maët phaân chia pha giöõa daàu vaø nöôùc thì söï haáp phuï enzyme naøy leân beà maët ñoù seõ laøm thay ñoåi hình daïng enzyme daãn ñeán vieäc môû roäng cöûa raøo “lid” taïo ñieàu kieän cho söï tieáp xuùc cô chaát vôùi trung taâm hoaït ñoäng. Hình 2.2 – Hoaït tính beà maët cuûa lipase: E, enzyme trong pha nöôùc; Ea, enzyme haáp phuï treân beà maët; Ea*, enzyme ñöôïc hoaït hoùa; S, cô chaát; Ea*S, phöùc enzyme cô chaát; Ea*Ac, acylenzyme; P1,P2 saûn phaåm thuûy phaân. 2.1.4.3. Trung taâm hoaït ñoäng vaø cô cheá phaûn öùng thuûy phaân Trung taâm hoaït ñoäng cuûa lipase laø nhöõng phaân töû acid amin coù vò trí xaùc ñònh treân toaøn boä caáu truùc phaân töû enzyme, bao goàm boä ba xuùc taùc Asp (coù theå thay theá baèng Glu), His vaø Ser. Hình 2.3 – Trung taâm hoaït ñoäng lipase Thermomyces lanuginose, nguyeân töû C maøu xanh laù, O maøu ñoû, N maøu xanh döông, H maøu traéng Phaûn öùng thuûy phaân ñöôïc thöïc hieän nhôø boä ba xuùc taùc Ser, His, Asp traûi qua naêm giai ñoaïn sau: Hình 2.4 – Cô cheá phaûn öùng thuûy phaân cuûa lipase Enzyme keát hôïp vôùi cô chaát hình thaønh phöùc chaát hoaït ñoäng. Nhoùm chöùc hoaït ñoäng –OH cuûa Serine taán coâng vaøo goác acyl cuûa cô chaát taïo lieân keát ñoàng hoùa trò hình thaønh hôïp chaát trung gian. Giai ñoaïn naøy ñöôïc hoã trôï bôûi hoaït tính xuùc taùc base cuûa His trong boä ba xuùc taùc. Taïo thaønh acyl enzyme vaø taùch khoûi phaûn öùng oxy cuûa lieân keát ester (R1OH). Taùch goác acyl coøn laïi ra khoûi trung taâm hoaït ñoäng bôûi nhoùm chöùc hoaït ñoäng cuûa His, coù söï tham gia cuûa phaân töû nöôùc vaø hình thaønh hôïp chaát trung gian coù caáu truùc töù dieän. Giaûi phoùng acid carboxylic (R2COOH). 2.1.4.4. Tính chaát ñaëc hieäu Döïa vaøo tính ñaëc hieäu, lipase vi sinh vaät coù theå ñöôïc phaân thaønh ba nhoùm. Nhoùm ñaàu tieân bao goàm nhöõng enzyme khoâng ñaëc hieäu vôùi vò trí hoaëc caáu truùc goác acyl treân maïch triglyceride, ví duï nhö lipase töø Candida cylindracea vaø Staphylococcus aureus. Nhoùm thöù hai ñöôïc xem laø quan troïng nhaát bao goàm nhöõng enzyme xuùc taùc ñaëc hieäu vò trí 1, 3 treân phaân töû triacylglycerol, trong ñoù thoâng duïng laø lipase töø Aspergillus niger, Rhizopus delemar, Mucor miehei vaø Pseudomonas fragi. Cuoái cuøng laø nhoùm thöù ba goàm nhöõng enzyme chæ xuùc taùc ñaëc hieäu moät soá acid beùo nhaát ñònh, ví duï lipase töø Geotrichum candidum chæ thuûy phaân acid beùo maïch daøi hoaëc acid beùo khoâng no daïng cis-9. 2.1.4.5. Khaû naêng chòu nhieät Khaû naêng chòu nhieät cuûa lipase coù lieân quan ñeán caáu truùc phaân töû enzyme. Nhöõng yeáu toá cuûa moâi tröôøng nhö pH vaø ion kim loaïi seõ aûnh höôûng vaø laøm thay ñoåi caáu truùc cuûa phaân töû. Ngoaøi ra, söï ñoät bieán gen trong quaù trình hình thaønh ñoaïn “lid” cuõng aûnh höôûng ñaùng keå ñeán khaû naêng chòu nhieät cuûa lipase. 2.1.4.6. Söï hoaït hoùa enzyme Nguyeân toá Ca coù theå taêng cöôøng hoaït tính thuûy phaân cuûa lipase baèng caùch hoã trôï cho söï thay ñoåi hình daïng caáu truùc phaân töû, taïo ñieàu kieän deã daøng cho söï haáp phuï enzyme vaø giaûm löôïng acid beùo taïo thaønh treân beà maët phaân chia pha maø coù theå gaây öùc cheá phaûn öùng thuûy phaân. Söï hoaït hoùa lipase ôû tuyeán tuïy cuûa ngöôøi phuï thuoäc raát nhieàu vaøo cô chaát vaø söï coù maët cuûa muoái maät. Beân caïnh ñoù, söï aûnh höôûng Ca ñeán hoaït tính lipase vi sinh vaät phuï thuoäc loaïi enzyme vaø ñieàu kieän thí nghieäm. Ví duï, ñeå taêng cöôøng hoaït tính lipase C. rugosa ta coù theå boå sung muoái Ca cuûa acid beùo taïo thaønh vaøo dung dòch ñaõ ñöôïc nhuõ hoùa nhöng chæ ñoái vôùi cô chaát laø daàu olive khoâng phaûi tributyrin. Tuy nhieân, Ca khoâng coù taùc duïng ñoái vôùi heä nhuõ töông nöôùc trong daàu vaø neáu khoâng söû duïng chaát nhuõ hoùa thì Ca cuõng khoâng aûnh höôûng ñeán hoaït tính lipase C. rugosa nhöng laïi taêng söï öùc cheá cuûa acid maät. 2.1.4.7. Khaû naêng chòu löïc caét Phaûn öùng xuùc taùc bôûi lipase ñöôïc thöïc hieän treân beà maët phaân chia pha, do ñoù dieän tích vaø “chaát löôïng” cuûa vuøng phaûn öùng coù aûnh höôûng quan troïng ñeán toác ñoä phaûn öùng. Keát hôïp ñieàu kieän khuaáy troän vaø söû duïng chaát nhuõ hoùa seõ laøm taêng dieän tích beà maët tieáp xuùc giöõa enzyme vaø cô chaát. Tuy nhieân, enzyme seõ bò maát hoaït tính do caáu truùc khoâng theå gaáp khuùc treân beà maët phaân chia pha khí-loûng vaø loûng-loûng neáu söï cheânh leâch löïc lieân keát giöõa hai pha laø raát lôùn. Söï bieán tính naøy taêng daàn theo nhieät ñoä vaø söï chuyeån ñoäng hoãn loaïn cuûa doøng löu chaát. Neáu toác ñoä khuaáy troän taêng thì seõ taïo ra nhieàu boït khí trong hoãn hôïp phaûn öùng, daãn ñeán toác ñoä bieán tính cuûa enzyme taêng leân. Vieäc boå sung phuï gia polypropylene glycol vaøo trong hoãn hôïp phaûn öùng seõ laøm giaûm ñaùng keå söï bieán tính enzyme. 2.1.5. ÖÙng duïng enzyme lipase [10] Lipase ñöôïc söû duïng roäng raõi trong caùc ngaønh coâng nghieäp cheá bieán daàu beùo, thöïc phaåm, chaát taåy röûa, toång hôïp hoùa chaát vaø döôïc phaåm, saûn xuaát giaáy vaø caùc loaïi myõ phaåm. Ngoaøi ra, lipase coøn ñöôïc söû duïng ñeå thuùc ñaåy phaûn öùng phaân huûy chaát thaûi daïng beùo (fatty waste) vaø polyurethane. Moät soá nhöõng öùng duïng quan troïng cuûa lipase ñöôïc toång hôïp trong baûng 2.2. Phaàn lôùn cheá phaåm lipase ñöôïc thu nhaän töø vi khuaån, naám men vaø naám moác. Baûng 2.2– ÖÙng duïng cuûa lipase trong coâng nghieäp [10] Ngaønh coâng nghieäp Phaûn öùng Saûn phaåm hoaëc öùng duïng Chaát taåy röûa Söõa vaø thöïc phaåm töø söõa Baùnh keïo Thöùc uoáng Nöôùc soát (Food Dressings) Thöïc phaåm dinh döôõng Thòt caù Daàu beùo Hoùa chaát Döôïc phaåm Myõ phaåm Thuoäc da Giaáy Thuûy phaân chaát beùo Thuûy phaân chaát beùo söõa, laøm chín phoâ mai, thay ñoåi thaønh phaàn bô söõa Caûi thieän muøi vò Taêng cöôøng höông vò Caûi thieän chaát löôïng Chuyeån hoùa ester Caûi thieän muøi vò Chuyeån hoùa ester, thuûy phaân Phaûn öùng toång hôïp ñaëc hieäu Chuyeån hoùa ester, thuûy phaân Toång hôïp Thuûy phaân Thuûy phaân Loaïi veát daàu môõ treân vaûi Taêng cöôøng hôïp chaát taïo höông vò cho söõa, phoâ mai vaø bô Keùo daøi thôøi gian baûo quan Thöùc uoáng Mayonnaise, dressings, whippings Thöïc phaåm dinh döôõng Saûn phaåm thòt caù loaïi môõ Bô ca cao, margarine, acid beùo, glycerol, mono vaø diglyceride Hôïp chaát voøng chiral, hoùa chaát Chaát hoã trôï tieâu hoùa, trao ñoåi chaát Chaát nhuõ hoùa, chaát laøm aåm Saûn phaåm thuoäc da Giaáy chaát löôïng cao 2.1.5.1. Coâng nghieäp chaát taåy röûa Nhôø vaøo khaû naêng thuûy phaân chaát beùo, lipase ñöôïc söû duïng nhö moät loaïi phuï gia trong coâng nghieäp chaát taåy röûa. Tuy nhieân, lipase phaûi thoûa maõn nhöõng yeâu caàu sau: (1) khoâng ñaëc hieäu cô chaát, coù khaû naêng thuûy phaân daàu môõ vôùi thaønh phaàn khaùc nhau; (2) chòu ñöïng ñieàu kieän khaéc nghieät (pH 10 – 11, 30 – 60oC); (3) khoâng bò taùc ñoäng bôûi caùc chaát hoaït ñoäng beà maët vaø caùc enzyme khaùc coù trong hoãn hôïp chaát taåy röûa. Ñeå ñaït nhöõng tính chaát nhö treân, kyõ thuaät taùi toå hôïp di truyeàn vaø phaân tích protein ñaõ ñöôïc aùp duïng trong nghieân cöùu nuoâi caáy vaø thu nhaän lipase töø vi sinh vaät. Naêm 1994, haõng Novo Nordisk ñaõ giôùi thieäu saûn phaåm lipase thöông maïi ñaàu tieân “Lipolase” coù nguoàn goác töø Thermomyces lanuginosus vaø Aspergillus oryzae. Naêm 1995, hai cheá phaåm lipase “Lumafast” töø Pseudomonas mendocina vaø “Lipomax” töø P. alcaligenes ñaõ ñöôïc coâng boá bôûi haõng Genencor International. Hai loaïi cheá phaåm naøy ñöôïc xem laø coù khaû naêng thích nghi cao trong ñieàu kieän taåy röûa. 2.1.5.2. Coâng nghieäp thöïc phaåm Chaát beùo laø moät trong nhöõng thaønh phaàn quan troïng cuûa thöïc phaåm. Khoâng nhöõng mang laïi giaù trò dinh döôõng cao, chaát beùo coøn ñem ñeán giaù trò caûm quan raát toát ñoái vôùi thöïc phaåm. Tính chaát cuûa chaát beùo phuï thuoäc vaøo vò trí acid beùo treân maïch glycerol, ñoä daøi maïch vaø möùc ñoä khoâng baõo hoøa cuûa caùc acid beùo. Vì theá lipase coù khaû naêng thay ñoåi tính chaát cuûa chaát beùo baèng caùch thay ñoåi vò trí acid beùo vaø coù theå thay theá moät hoaëc nhieàu hôn caùc acid beùo treân maïch glycerol. Vôùi caùch laøm nhö vaäy, caùc loaïi chaát beùo coù giaù trò khoâng cao seõ ñöôïc caûi thieän vaø taêng giaù trò söû duïng. Bô ca cao chöùa thaønh phaàn acid beùo palmitic vaø stearic, coù ñieåm noùng chaûy taïi 37oC, laø thaønh phaàn quan troïng trong saûn phaåm chocolate. Vôùi coâng ngheä söû duïng lipase thöïc hieän phaûn öùng thuûy phaân vaø toång hôïp lieân keát ester, chaát beùo thay theá bô ca cao ñaõ ñöôïc saûn xuaát töø nhöõng chaát beùo coù giaù trò khoâng cao. Moät öùng duïng khaùc laø söû duïng lipase coá ñònh Rhizomucor miehei thöïc hieän phaûn öùng trao ñoåi ester ñeå thay theá acid palmitic cuûa daàu coï baèng acid stearic, hoaëc coù theå laøm giaûm haøm löôïng acid beùo maïch daøi taïi vò trí sn-2 baèng caùch trao ñoåi vôùi nhöõng phaân töû C18:0 vaø C18:1. Vôùi nhöõng hieäu quaû trong quaù trình trao ñoåi chaát, PUFA (polyunsaturated fatty acid) ñöôïc söû duïng trong döôïc phaåm vaø thöïc phaåm chöùc naêng. PUFA raát caàn thieát cho quaù trình toång hôïp maøng membrane vaø prostaglandin. Nhöõng PUFA töï do hay daïng mono hoaëc diglyceride cuûa noù ñöôïc ñieàu cheá thaønh döôïc phaåm coù taùc duïng haïn cheá haøm löôïng cholesterol trong maùu, khaùng vieâm vaø choáng taéc ngheõn maïch. Lipase vi sinh vaät ñöôïc öùng duïng ñeå taùch vaø thu nhaän PUFA töø môõ ñoäng vaät vaø daàu thöïc vaät. Trong coâng nghieäp saûn xuaát phoâ mai, lipase ñöôïc öùng duïng trong quaù trình laøm chín ñeå taêng theâm höông vò cho saûn phaåm. Ñoái vôùi coâng nghieäp thòt caù, lipase giuùp loaïi boû nhöõng chaát beùo khoâng mong muoán aûnh höôûng ñeán muøi vò saûn phaåm trong quaù trình baûo quaûn. 2.1.5.3. Coâng nghieäp saûn xuaát giaáy Thaønh phaàn khoâng öu nöôùc trong goã, chuû yeáu laø triglyceride vaø saùp, seõ gaây caûn trôû trong quaù trình saûn xuaát giaáy. Lipase ñöôïc söû duïng ñeå loaïi boû nhöõng thaønh phaàn naøy ra khoûi boät giaáy trong quaù trình laøm giaáy. Ngaønh coâng nghieäp Nippon Paper Industries cuûa Nhaät Baûn ñaõ öùng duïng thaønh coâng lipase Candida rugosa coù theå thuûy phaân ñeán 90% haøm löôïng triglyceride coù trong goã. 2.1.5.4. Toång hôïp höõu cô Vieäc söû duïng lipase trong toång hôïp hoùa hoïc höõu cô ngaøy caøng trôû neân ña daïng do tính chaát ñaëc hieäu veà cô chaát, vò trí vaø caáu hình khoâng gian cuûa enzyme. Phaàn lôùn lipase ñöôïc söû duïng coù nguoàn goác töø vi sinh vaät. Nhöõng enzyme naøy hoaït ñoäng treân beà maët phaân chia hai pha kî vaø öa nöôùc vaø coù khaû naêng hoaït ñoäng toát trong dung moâi höõu cô. ÖÙng duïng quan troïng cuûa lipase laø toång hôïp lieân keát ester, taïo thaønh caùc hôïp chaát taïo höông vaø nguoàn nhieân lieäu diesel quan troïng. Tuøy thuoäc vaøo ñieàu kieän phaûn öùng maø enzyme naøy coù theå thöïc hieän phaûn öùng thuûy phaân hoaëc toång hôïp lieân keát ester. 2.1.5.5. Chuyeån hoùa sinh hoïc Söï chuyeån hoùa sinh hoïc ñöôïc thöïc hieän döïa treân cheá phaåm enzyme vaø vi sinh vaät coù khaû naêng sinh toång hôïp lipase ñaëc hieäu. Ñoái vôùi cheá phaåm enzyme, phaûn öùng thuûy phaân lieân keát ester ñöôïc tieán haønh treân beà maët phaân chia pha vaø enzyme ñöôïc goùi trong khuoân gel thöïc hieän nhieàu söï chuyeån hoùa khaùc nhau. Ñoái vôùi vi sinh vaät, quaù trình gaây ñoät bieán ñöôïc aùp duïng ñeå toång hôïp nhieàu loaïi enzyme ñaëc hieäu thöïc hieän söï chuyeån hoùa cô chaát thoâng qua moät hoaëc vaøi phaûn öùng. Moät soá nghieân cöùu cho thaáy ñoái vôùi phöông phaùp nuoâi caáy vi sinh vaät ñaëc hieäu thì hieäu suaát chuyeån hoùa cao gaáp nhieàu laàn so vôùi vieäc söû duïng cheá phaåm enzyme. 2.2. PHÖÔNG PHAÙP NUOÂI CAÁY BEÀ MAËT [19,20] 2.2.1. Giôùi thieäu Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët treân moâi tröôøng raén (solid-state fermentation) laø phöông phaùp nuoâi caáy lieân quan ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät treân haït cô chaát raén aåm. Pha khí laø pha lieân tuïc trong vuøng khoâng gian giöõa nhöõng haït cô chaát. Phaàn lôùn haøm löôïng nöôùc haáp thuï vaøo beân trong haït cô chaát, tuy nhieân vaãn coù theå xuaát hieän nhöõng gioït nöôùc trong vuøng khoâng gian töï do hoaëc seõ hình thaønh moät lôùp nöôùc moûng treân beà maët haït cô chaát raén. Hình 2.5 – Haït cô chaát vaø pha khí phaân boá trong heä nuoâi caáy beà maët: nuoâi caáy naám sôïi (traùi) vaø vi sinh vaät ñôn baøo (phaûi) [19] Ñoái vôùi kyõ thuaät leân men, neáu ta phaân loaïi quaù trình leân men theo traïng thaùi vaät lyù cuûa moâi tröôøng thì phöông phaùp nuoâi caáy beà maët laø moät caùch thöùc thöïc hieän quaù trình leân men cô chaát raén khoâng coù söï hieän dieän cuûa pha loûng. Trong ñoù, cô chaát khoâng nhöõng ñoùng vai troø laø nguoàn dinh döôõng maø coøn laø chaát mang cho vi sinh vaät. Trong baøi nghieân cöùu naøy, chuùng toâi chæ taäp trung vaøo phöông phaùp nuoâi caáy beà maët theo ñònh nghóa nhö treân. 2.2.2. Öu vaø nhöôïc ñieåm Moâi tröôøng maø vi sinh vaät phaùt trieån trong phöông phaùp nuoâi caáy beà maët raát khaùc bieät so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu. Nhìn chung, neáu ta söû duïng phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu thì seõ töông ñoái deã daøng ñeå kieåm soaùt caùc ñieàu kieän xaûy ra beân trong quaù trình nhö: Vi sinh vaät ngaäp trong canh tröôøng loûng vaø khoâng gaëp phaûi nguy cô khoâ canh tröôøng nhö ôû phöông phaùp nuoâi caáy beà maët. Nhieät ñoä ñöôïc kieåm soaùt trong suoát caùc giai ñoaïn sinh tröôûng cuûa vi sinh vaät. Löôïng O2 hoøa tan caàn thieát ñoái vôùi söï phaùt trieån sinh khoái ñöôïc kieåm soaùt lieân tuïc. Nguoàn dinh döôõng trong canh tröôøng luoân ñöôïc kieåm tra vaø boå sung vôùi haøm löôïng thích hôïp. Giaù trò pH ñöôïc theo doõi vaø kieåm soaùt deã daøng. Ngöôïc laïi, moâi tröôøng nuoâi caáy trong phöông phaùp beà maët hôi khaéc nghieät ñoái vôùi vi sinh vaät: Vi sinh vaät tieáp xuùc tröïc tieáp pha khí trong canh tröôøng neân deã bò öùc cheá do beà maët haït cô chaát coù theå bò khoâ. Nhieät ñoä coù theå taêng cuïc boä vaø vöôït quaù giaù trò toái thích vì trong quaù trình trao ñoåi chaát, nhieät seõ ñöôïc thaûi ra ngoaøi moâi tröôøng. Do ñoù, trong caùc giai ñoaïn sinh tröôûng cuûa vi sinh vaät nhieät ñoä khoâng ñöôïc oån ñònh. O2 phaân boá töï do trong vuøng khoâng gian giöõa nhöõng haït cô chaát, tuy nhieân haøm löôïng O2 ban ñaàu coù theå seõ khoâng ñuû cho moät löôïng ñaùng keå sinh khoái phaùt trieån. Nguoàn dinh döôõng cung caáp cho vi sinh vaät khoâng ñuû thaäm chí khi noàng ñoä chaát dinh döôõng trung bình trong haït cô chaát cao. Hay noùi caùch khaùc, trong canh tröôøng beà maët ñaõ xaûy ra söï dòch chuyeån gradient noàng ñoä chaát dinh döôõng vaøo beân trong haït cô chaát. Vieäc xaùo troän nhöõng haït cô chaát trong quaù trình nuoâi caáy seõ gaây toån thöông cho vi sinh vaät nhö naám sôïi. Khoâng kieåm soaùt ñöôïc giaù trò pH. Vôùi nhöõng söï khaùc bieät keå treân thì quaù trình nuoâi caáy baèng phöông phaùp beà saâu seõ deã daøng tieán haønh hôn. Vaø khi xem xeùt veà khía caïnh cô chaát söû duïng thì phöông phaùp naøy vaãn phaùt huy öu ñieåm cuûa mình. Ví duï, seõ raát ñôn giaûn vaø khoâng toán nhieàu chi phí khi vaän chuyeån moâi tröôøng loûng hôn laø moâi tröôøng raén, cuõng nhö vieäc phaûi tieät truøng moâi tröôøng tröôùc khi nuoâi caáy. Tuy nhieân, trong moät soá tröôøng hôïp, phöông phaùp nuoâi caáy beà maët laïi thích hôïp hôn khi: Saûn phaåm sau quaù trình leân men phaûi ôû daïng raén. Saûn phaåm chæ coù theå thu ñöôïc töø quaù trình nuoâi caáy beà maët hoaëc neáu söû duïng phöông phaùp beà maët hieäu suaát leân men cao hôn beà saâu. Ví duï, moät soá loaïi enzyme caûm öùng chæ thu nhaän töø canh tröôøng raén vaø moät soá loaøi naám sôïi chæ hình thaønh baøo töû khi ñöôïc nuoâi caáy beà maët. Chaát maøu Monascus thu nhaän ñöôïc baèng hai phöông phaùp nhöng phöông phaùp beà maët cho hieäu suaát thu nhaän cao hôn. Saûn phaåm töø phöông phaùp beà maët coù tính chaát mong muoán hôn phöông phaùp beà saâu. Ví duï, saûn phaåm thu nhaän töø vieäc nuoâi caáy naám sôïi treân moâi tröôøng raén laø hôïp chaát coù taùc duïng öùc cheá coân truøng. Saûn phaåm naøy coù theå hoaït ñoäng trong ñieàu kieän baát lôïi vaø hieäu quaû cao hôn so vôùi thu nhaän töø phöông phaùp beà saâu. Taän duïng nguoàn pheá lieäu raén maø coù theå gaây haïi ñeán moâi tröôøng. 2.2.3. ÖÙng duïng vaø tieàm naêng [20] Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët ñaõ ñöôïc söû duïng töø raát laâu ñoái vôùi nhöõng saûn phaåm truyeàn thoáng nhö: Tempe, saûn phaåm thu ñöôïc khi leân men ñaäu naønh naáu chín baèng naám moác Rhizopus oligosporus. Caùc sôïi naám seõ noái keát caùc haït ñaäu thaønh moät khoái baùnh. Saûn phaåm leân men naøy raát thoâng duïng ôû Indonesia. Koji, saûn phaåm leân men ñaäu naønh chín töø Aspergillus oryzae. Trong 2 ñeán 3 ngaøy ñaàu quaù trình leân men, sôïi naám khoâng nhöõng phuû treân beà maët maø coøn tieát ra heä enzyme vaøo beân trong ñaäu naønh. Sau ñoù, khoái ñaäu leân men ñöôïc nghieàn nhuyeãn vaø thöïc hieän quaù trình uû trong vaøi thaùng. Ang-kak, tieáng Vieät goïi laø “gaïo ñoû”, laø saûn phaåm leân men haït gaïo töø Monascus purpureus. Trong quaù trình leân men, maøu ñoû ñöôïc tieát ra ngoaøi moâi tröôøng. Sau ñoù, haït gaïo ñöôïc saáy vaø nghieàn thaønh boät. Ñaây laø loaïi boät maøu söû duïng trong cheá bieán thöïc phaåm. Vaø cho ñeán ngaøy nay, haøng nghìn saûn phaåm khaùc nhau ñöôïc saûn xuaát töø coâng ngheä nuoâi caáy beà maët ñaõ chöùng toû tieàm naêng to lôùn cuûa phöông phaùp naøy: Caùc loaïi enzyme nhö: amylase, protease, lipase, pectinase, tannase, cellulase, vaø rennet. Caùc hôïp chaát maøu, muøi. Caùc hôïp chaát höõu cô: ethanol, acid oxalic, acid citric, acid lactic. Hormone thöïc vaät: acid gibberellic. Thöùc aên gia suùc giaøu protein; giaûm haøm löôïng ñoäc toá hoaëc taêng khaû naêng tieâu hoùa. Chaát khaùng sinh: penicillin, oxytetracycline. Thuoác tröø saâu vaø dieät loaøi thöïc vaät gaây haïi toång hôïp baèng phöông phaùp sinh hoïc. Beân caïnh ñoù, phöông phaùp nuoâi caáy beà maët coøn öùng duïng trong xöû lyù moät soá quaù trình nhö: taåy maøu thuoác nhuoäm, taåy traéng sinh hoïc (biobleaching)… Moät tieàm naêng to lôùn khaùc laø phöông phaùp nuoâi caáy beà maët coù theå söû duïng pheá lieäu hoaëc saûn phaåm phuï trong ngaønh noâng nghieäp vaø cheá bieán thöïc phaåm laøm moâi tröôøng thích hôïp cho söï phaùt trieån vi sinh vaät vaø thu nhaän hôïp chaát caàn thieát. Nguoàn nguyeân lieäu bao goàm: caùm mì, caùm gaïo, baùnh daàu, baõ taùo eùp, baõ nho, voû chuoái, voû quaû hoï citrus, rôm raï, xaùc caø pheâ, xaùc quaû hoï citrus, phaàn thòt cuû caûi ñöôøng, traáu quaû caø pheâ… Tuy nhieân, moät soá nguyeân lieäu coù giaù trò trong noâng nghieäp cuõng ñöôïc söû duïng nhö: khoái söõa ñoâng, gaïo vaø khoai mì. Ngoaøi ra, moät soá hôïp chaát xô coù boå sung thaønh phaàn dinh döôõng ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå nuoâi caáy beà maët, ví duï nhö chaát xô töï nhieân laø baõ mía hoaëc nhaân taïo nhö polyurethane. 2.2.4. Quy trình nuoâi caáy beà maët Caùc giai ñoaïn cô baûn trong quy trình nuoâi caáy baèng phöông phaùp beà maët khoâng khaùc gì so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu, bao goàm: Giai ñoaïn chuaån bò: löôïng gioáng caáy, cô chaát vaø thieát bò leân men sinh hoïc. Giai ñoaïn leân men: nhaäp lieäu, vaän haønh thieát bò vaø thaùo lieäu. Giai ñoaïn sau leân men: caùc quaù trình xöû lyù ñeå ñaït ñöôïc thaønh phaåm. Hình 2.6 – Quy trình nuoâi caáy beà maët theo töøng meû leân men [19] 2.2.4.1. Chuaån bò cô chaát Cô chaát coù theå ñöôïc caét nhoû, nghieàn thaønh haït ñeå ñaït ñöôïc kích thöôùc mong muoán. Neáu kích thöôùc haït caøng nhoû thì dieän tích beà maët cuûa toaøn boä cô chaát caøng taêng, taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho vi sinh vaät baùm vaøo cô chaát ñeå phaùt trieån. Tuy nhieân, neáu kích thöôùc quaù nhoû seõ daãn ñeán hieän töôïng keát tuï caùc haït cô chaát, gaây khoù khaên ñoái vôùi söï phaùt trieån vi sinh vaät. Nöôùc vaø chaát dinh döôõng coù theå ñöôïc boå sung hoaëc tieàn xöû lyù cô chaát ñeå taêng theâm chaát dinh döôõng nhö naáu chín. Ngoaøi ra, cô chaát neân ñöôïc tieät truøng hoaëc thanh truøng tröôùc khi vaän haønh thieát bò leân men. 2.2.4.2. Chuaån bò löôïng gioáng caáy Caùch thöùc chuaån bò löôïng gioáng caáy phuï thuoäc vaøo loaïi vi sinh vaät maø ta söû duïng. Ña soá phöông phaùp nuoâi caáy beà maët ñeàu söû duïng heä sôïi. Do ñoù, löôïng gioáng caáy caàn chuaån bò laø soá löôïng baøo töû trong nhieàu hình thöùc khaùc nhau. Ví duï, löôïng gioáng caáy coù theå hoãn hôïp baøo töû trong canh tröôøng loûng nuoâi caáy beà saâu, hoaëc baøo töû phaùt trieån treân cô chaát raén roài ñöôïc nghieàn mòn. Tuy nhieân, muïc ñích cuûa quaù trình naøy laø taêng soá löôïng gioáng vaø khaû thích öùng moâi tröôøng leân men. 2.2.4.3. Chuaån bò thieát bò leân men sinh hoïc Thieát bò phaûi ñöôïc laøm saïch sau moãi meû leân men baèng phöông phaùp tieät truøng hoaëc coù theå keát hôïp tieät truøng moâi tröôøng beân trong thieát bò. 2.2.4.4. Nhaäp lieäu Löôïng gioáng caáy coù theå cho vaøo thieát bò tröôùc hoaëc sau khi nhaäp lieäu moâi tröôøng. Neáu cô chaát khoâng theå ñaûo troän beân trong thieát bò thì vieäc caáy gioáng neân thöïc hieän beân ngoaøi. Neáu cô chaát coù theå ñaûo troän, caùch toát nhaát laø phun löôïng gioáng caáy ñeàu treân khaép beà maët cô chaát. Quaù trình nhaäp lieäu phaûi caån thaän ñeå traùnh laây nhieãm neáu vieäc tieät truøng moâi tröôøng thöïc hieän beân ngoaøi thieát bò. 2.2.4.5. Vaän haønh thieát bò Quaù trình naøy caàn söï chuù yù vaø theo doõi ñeå kieåm soaùt caùc thoâng soá nhö löu löôïng khoâng khí, nhieät ñoä moâi tröôøng, toác ñoä ñaûo troän, nhieät ñoä nöôùc laøm maùt vaø hoaït ñoä nöôùc. Söï vaän haønh khaùc nhau tuøy thuoäc vaøo loaïi thieát bò. 2.2.4.6. Thaùo lieäu Quaù trình naøy coù theå ñöôïc keát hôïp vôùi quaù trình loïc vaø saáy tröôùc khi thaùo canh tröôøng ra khoûi thieát bò. 2.2.4.7. Xöû lyù sau leân men Quaù trình naøy phuï thuoäc vaøo saûn phaûm muoán thu nhaän. Saûn phaåm coù theå laø toaøn boä canh tröôøng leân men hoaëc saûn phaåm thu nhaän töø canh tröôøng leân men. Trong tröôøng hôïp thöù hai, quaù trình trích ly saûn phaåm töø canh tröôøng raén laø quaù trình maø phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu khoâng coù. Nhöõng quaù trình sau cuûa giai ñoaïn xöû lyù sau leân men töông töï nhö trong phöông phaùp beà saâu. 2.2.5. Caáu truùc vaät lyù heä thoáng thieát bò leân men beà maët Ñeå hieåu ñöôïc caùc hieän töôïng xaûy ra beân trong thieát bò leân men sinh hoïc, heä thoáng ñöôïc phaân chia thaønh hai caáp ñoä khaùc nhau veà caáu truùc vaät lyù caùc pha beân trong thieát bò. ÔÛ caáp ñoä vó moâ, thieát bò bao goàm ba pha: voû thieát bò, phaàn khoâng gian phía treân beân trong thieát bò vaø toaøn boä canh tröôøng (Hình 2.7a). Trong phaàn naøy, caáp ñoä vi moâ canh tröôøng trong thieát bò seõ ñöôïc baøn luaän nhieàu hôn. Hình 2.7 – Caùc pha beân trong thieát bò leân men sinh hoïc: (a) Caáp ñoä vó moâ, (b) Caáp ñoä vi moâ, töø traùi sang phaûi nuoâi caáy naám sôïi vaø naám men hoaëc vi khuaån, (c) Caáu taïo chi tieát haït cô chaát [19] Caáp ñoä vi moâ cuûa canh tröôøng beân trong thieát bò bao goàm ba pha (Hình 2.7b): Caùc haït cô chaát; Vuøng khoâng gian giöõa caùc haït; Sinh khoái vi sinh vaät. Kích thöôùc vaø hình daïng cuûa haït cô chaát quyeát ñònh theå tích vuøng khoâng gian giöõa caùc haït vaø möùc ñoä lieân tuïc giöõa chuùng. Caùc haït cô chaát ñöôïc laøm aåm vaø coù moät lôùp moûng maøng nöôùc treân beà maët cuûa haït. Sinh khoái vi sinh vaät ñôn baøo taïo thaønh moät lôùp maøng bao quanh beà maët haït cô chaát, hoaëc taïo thaønh moät maïng löôùi sôïi naám trong tröôøng hôïp ñoái vôùi naám sôïi. Vuøng khoâng gian xung quanh laø pha khí, thaäm chí neáu sôïi naám phaùt trieån trong vuøng naøy thì chæ chieám ñöôïc 34% theå tích toaøn boä khoâng khí. Beà maët phaân chia giöõa pha khí vaø haït cô chaát laø lôùp maøng loûng chöùa sôïi naám bao quanh haït (Hình 2.7c). Beân trong vuøng khoâng gian naøy khoâng hoaëc coù raát ít nöôùc maëc duø nhöõng gioït nöôùc nhoû coù theå bò giöõ laïi trong maïng löôùi sôïi naám. Xem xeùt vôùi möùc ñoä chi tieát hôn, caùc haït cô chaát coù ñaëc ñieåm: Caùc hôïp chaát polymer trong cô chaát coù theå bò chuyeån hoùa, phaân huûy thaønh nguoàn thöùc aên cho vi sinh vaät. Luùc ñoù, caáu truùc vaø tính chaát cuûa haït cuoái giai ñoaïn leân men seõ khaùc so vôùi luùc ñaàu. Tuy nhieân nhöõng ñaëc ñieåm cuûa haït cô chaát tröôùc khi leân men ñöôïc quyeát ñònh bôûi giai ñoaïn chuaån bò vaø ñaây laø yeáu toá aûnh höôûng ñeán khaû naêng vi sinh vaät coù söû duïng ñöôïc cô chaát hay khoâng. Sinh khoái vi sinh vaät phaân boá trong khoâng gian giöõa nhöõng haït cô chaát. Trong tröôøng hôïp vi sinh vaät ñôn baøo, lôùp sinh khoái seõ bò ngaên caûn vôùi beà maët haït cô chaát bôûi lôùp maøng moûng nöôùc. Do ñoù hình thaønh treân beà maët haït cô chaát moät lôùp sinh khoái daïng paste chaéc chaén. Trong tröôøng hôïp naám sôïi, söï phaùt trieån sinh khoái treân beà maët cô chaát seõ hình thaønh ba lôùp roõ raøng: phaàn sôïi naám trong khoâng khí, phaàn sôïi naám trong lôùp maøng loûng treân beà maët haït vaø phaàn sôïi naám xuyeân vaøo beân trong haït cô chaát. Khaùi nieäm beà maët haït cô chaát seõ trôû neân khoâng roõ raøng ñoái vôùi naám sôïi vì maät ñoä sôïi naám seõ phaùt trieån daøy ñaëc nhaát ôû beân ngoaøi vaø caû beân trong haït cô chaát trong suoát quaù trình sinh tröôûng. Ñaây laø nôi maø löôïng O2 vaø chaát dinh döôõng cung caáp cho naám sôïi cuøng moät luùc. Haït cô chaát ñöôïc laøm aåm, nhöng ñaây laø löôïng aåm töï do toàn taïi treân beà maët haït. Beà daøy cuûa lôùp nöôùc naøy phuï thuoäc tính chaát cuûa sinh khoái vaø ñoä aåm cuûa cô chaát. 2.2.6. Ñoäng hoïc quaù trình Ñoäng hoïc cuûa quaù trình nuoâi caáy beà maët ñöôïc phaân tích theo möùc ñoä khaùc nhau. Möùc ñoä thöù nhaát lieân quan ñeán caùc quaù trình sinh hoùa vaø vaän chuyeån trong khoâng gian haït cô chaát neân ñöôïc goïi laø ñoäng hoïc vi moâ. Möùc ñoä thöù hai lieân quan ñeán söï thay ñoåi toaøn boä cuûa heä thoáng trong suoát quaù trình leân men neân ñöôïc goïi laø ñoäng hoïc vó moâ. 2.2.6.1. Ñoäng hoïc vi moâ Ñoäng hoïc vi moâ ñöôïc aùp duïng cho hai loaïi caáu truùc vaät lyù cuûa heä thoáng leân men beà maët nhö ñöôïc ñònh nghóa ôû treân. Ñoái vôùi loaïi caáu truùc vó moâ thì toaøn boä canh tröôøng ñöôïc xem nhö moät pha duy nhaát bao boàm cô chaát vaø khí beân trong noù. Hình 2.8(a) bieåu dieãn caùc quaù trình truyeàn nhieät vaø truyeàn khoái xaûy ra beân trong vaø giöõa caùc pha trong thieát bò ôû caáp ñoä vó moâ. Tuy nhieân, ñoäng hoïc ñoái vôùi caáu truùc vi moâ seõ ñöôïc quan taâm vaø trình baøy nhieàu hôn trong phaàn naøy. Ñoái vôùi ñoäng hoïc caáu truùc vi moâ, haït cô chaát vaø khoâng khí xung quanh laø hai pha khaùc nhau. Hình 2.8(b) theå hieän caùc quaù trình vaän chuyeån, trao ñoåi chaát cuûa naám sôïi sinh tröôûng hieáu khí vaø söû duïng nguoàn dinh döôõng laø carbon ôû caáp ñoä vi moâ. Caùc quaù trình vaän chuyeån naøy khoâng bò aûnh höôûng nhieàu bôûi thieát bò vaø caùch vaän haønh. Quaù trình chuaån bò cô chaát raát caàn thieát ñeå laøm toån thöông vaùch teá baøo, giuùp cho chuùng deã daøng tieáp xuùc vôùi heä enzyme vi sinh vaät. Beân caïnh ñoù, kích thöôùc haït nhoû seõ laøm taêng dieän tích beå maët söû duïng cuûa vi sinh vaät vaø taêng söï khueách taùn caùc chaát trao ñoåi. Caùc quaù trình vaän chuyeån, trao ñoåi vaø sinh tröôûng, bao goàm: Söï khueách taùn O2, CO2 vaø hôi nöôùc beân trong vuøng khoâng khí tónh, hoaëc laø söï ñoái löu cuûa chuùng neáu canh tröôøng ñöôïc suïc khí. Moät ñieàu caàn löu yù laø neáu canh tröôøng coù ñöôïc suïc khí hay khoâng thì vaãn coù moät lôùp khoâng khí tónh bao xung quanh beà maët haït cô chaát. Söï trao ñoåi O2, CO2 vaø hôi nöôùc giöõa caùc pha khaùc nhau trong caáu truùc vi moâ canh tröôøng. Hình 2.8 – Caùc hieän töôïng xaûy ra beân trong thieát bò leân men trong thôøi gian sinh tröôûng cuûa naám sôïi. (a) Hieän töôïng vó moâ. (b) Hieän töôïng vi moâ: [1] khueách taùn O2, CO2 vaøo vuøng khí tónh, [2] tieâu thuï O2 vaø giaûi phoùng CO2, [3] vaän chuyeån O2, CO2 trong lôùp maøng moûng bao quanh cô chaát, [4] khueách taùn O2, CO2 vaøo trong haït cô chaát, [5] nhaän O2 vaø thaûi CO2 cuûa sôïi naám trong cô chaát, [6] sinh toång hôïp enzyme thuûy phaân, [7] khueách taùn enzyme, [8] phaûn öùng enzyme vaø cô chaát, [9] khueách taùn saûn phaåm thuûy phaân, [10] haáp thuï saûn phaåm, [11] vaän chuyeån chaát dinh döôõng nuoâi cô theå, [12] thaûi nöôùc trong quaù trình trao ñoåi chaát, [13] nhaän nöôùc cho sinh khoái môùi, [14] khueách taùn nöôùc trong haït, [15] boác hôi nöôùc taïi beà maët cô chaát, [16] khueách taùn hôi nöôùc, [17] haáp thu chaát dinh döôõng nuoâi sinh khoái, [18] giaûi phoùng vaø khueách taùn saûn phaåm trao ñoåi chaát, [19] söï phaùt trieån ñan xen cuûa sôïi naám. Söï khueách taùn O2, CO2, nöôùc, chaát dinh döôõng, proton, saûn phaåm vaø enzyme beân trong lôùp maøng moûng vaø cô chaát. Lôùp maøng naøy bao goàm sinh khoái vaø aåm töï do bao quanh treân beà maët haït cô chaát. Quaù trình sinh hoùa dieãn ra beân trong haït cô chaát vì enzyme vi sinh vaät seõ xuùc taùc cho phaûn öùng phaân huûy caùc chaát beân trong haït. Söï vaän chuyeån chaát dinh döôõng trong sôïi naám. Söï phaùt trieån cuûa sôïi naám vaø lôùp sinh khoái treân beà maët haït cô chaát. Caùc phaûn öùng sinh lyù cuûa vi sinh vaät ñoái vôùi moâi tröôøng khaéc nghieät nhö hoaït ñoä nöôùc thaáp, haøm löôïng O2 thaáp vaø nhieät ñoä cao. Caùc quaù trình caûm öùng vaø öùc cheá ñoái vôùi vi sinh vaät. Quaù trình cheát cuûa teá baøo 2.2.6.2. Ñoäng hoïc vó moâ Ñoäng hoïc vó moâ moâ taû vaø phaân tích söï thay ñoåi cuûa toaøn boä heä thoáng leân men. Quaù trình naøy ñöôïc chia laøm ba giai ñoaïn: giai ñoaïn ñaàu, giöõa vaø cuoái. Giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình. Baét ñaàu quaù trình leân men laø giai ñoaïn caáy gioáng vaøo moâi tröôøng. Ñoái vôùi naám sôïi, löôïng gioáng caáy laø baøo töû seõ baùm vaøo beà maët haït cô chaát vaø böôùc vaøo giai ñoaïn hoaït hoùa. Giai ñoaïn naøy thöôøng keùo daøi 10 giôø. Canh tröôøng raén caàn giöõ nhieät ñoä oån ñònh vaø toái öu cho söï hoaït hoùa. Moãi baøo töû seõ “naûy maàm” ôû nhöõng thôøi ñieåm khaùc nhau. Khi “naûy maàm” sôïi naám ñöôïc hình thaønh vaø duoãi thaúng vöôn ra xa baøo töû vaø baét ñaàu phaân nhaùnh taïo thaønh nhöõng khuaån laïc treân canh tröôøng. Ban ñaàu sôïi naám seõ ñöôïc “nuoâi döôõng” baèng chaát dinh döôõng döï tröõ trong baøo töû. Söï phaùt trieån sau ñoù cuûa sôïi naám phuï thuoäc vaøo nguoàn dinh döôõng trong haït cô chaát. Neáu nguoàn carbon laø hôïp chaát polymer thì naám sôïi phaûi toång hôïp heä enzyme caàn thieát vaø ñöa vaøo beân trong haït cô chaát. Cô cheá vaän chuyeån laø khueách taùn ñôn giaûn phuï thuoäc vaøo phaân töû enzyme vaø caáu truùc cuûa haït. Enzyme thuûy phaân cô chaát taïo thaønh saûn phaåm khueách taùn beân trong haït. Löôïng O2 bò tieâu thuï taïo thaønh doøng khueách taùn O2 töø pha khí tónh ñeán sinh khoái vaø töø trong haït ra ngoaøi lôùp maøng moûng saùt beà maët. Caùc sôïi naám khi phaùt trieån seõ ñan xen laãn nhau taïo thaønh moät maïng löôùi daøy ñaëc. Ñieàu naøy seõ gaây caûn trôû cho söï phaùt trieån tieáp tuïc cuûa sôïi naám. Trong suoát giai ñoaïn naøy, sôïi naám phaân nhaùnh vaø bao phuû khaép beà maët cô chaát ñoàng thôøi xuyeân vaøo beân trong haït (Hình 2.9). Haøm löôïng O2 trong haït phaûi vöøa ñuû ñeå cung caáp cho sôïi naám phaùt trieån beân trong haït nhöng cuõng vöøa ñuû ñeå löôïng sinh khoái khoâng taêng nhieàu. Vì neáu sinh khoái taêng maïnh thì nhieät cuûa quaù trình trao ñoåi chaát seõ giaûi phoùng ra ngoaøi moâi tröôøng, laøm thay ñoåi nhieät ñoä toái öu cho söï sinh tröôûng cuûa naám sôïi. Söï sinh tröôûng seõ ñaït ñeán toác ñoä sinh tröôûng rieâng cöïc ñaïi khi taát caû caùc ñieàu kieän ñeàu ñöôïc toái öu nhö nhieät ñoä, pH vaø hoaït ñoä nöôùc. Phuï thuoäc vaøo quaù trình maø giai ñoaïn sinh tröôûng cöïc ñaïi naøy coù theå ñaït ñöôïc trong khoaûng töø 2 ñeán 10 giôø nuoâi caáy trong thieát bò. Giai ñoaïn giöõa cuûa quaù trình. Caùc ñieàu kieän seõ thay ñoåi khi maät ñoä sinh khoái taêng leân. Bôûi vì khi sinh khoái taêng thì toác ñoä sinh tröôûng taêng, daãn ñeán söï tieâu thuï O2 chaát dinh döôõng vaø söï thaûi nhieät ra ngoaøi moâi tröôøng cuõng taêng leân. Ñieàu naøy laøm cho O2 vaø chaát dinh döôõng seõ khueách taùn ra ngoaøi beà maët cô chaát, nôi maø sinh khoái phaùt trieån maïnh meõ. Tuy nhieân, noàng ñoä O2 vaø chaát dinh döôõng ôû lôùp beà maët cô chaát seõ giaûm töø töø cho ñeán khi toác ñoä sinh tröôûng khoâng taêng nöõa. Luùc naøy, quaù trình chuyeån khoái cuõng bò haïn cheá (Hình 2.10). Trong giai ñoaïn giöõa naøy, löôïng sinh khoái treân moät ñôn vò dieän tích beà maët cô chaát taêng. Naám sôïi tieáp tuïc xuyeân vaøo beân trong haït cô chaát maëc duø löôïng O2 coù theå coøn raát ít. Beân caïnh ñoù, söï phaùt trieån cuûa phaàn sôïi naám tieáp xuùc pha khí beân ngoaøi cuõng ñoùng goùp cho söï taêng maät ñoä sinh khoái. Trong canh tröôøng khoâng coù ñaûo troän, maïng löôùi sôïi naám ñöôïc hình thaønh. Phuï thuoäc vaøo ñoä daøy ñaëc vaø ñoä dai cuûa maïng löôùi, caùc haït cô chaát ñöôïc keát laïi thaønh khoái. Ngöôïc laïi, neáu canh tröôøng ñöôïc khuaáy ñaûo, caùc sôïi naám seõ bò eùp vaø ñeø neùn treân beà maët haït daãn ñeán öùc cheá söï sinh tröôûng, thaäm chí khoâng taïo thaønh baøo töû. Tröôøng hôïp luùc naøy gioáng nhö tröôøng hôïp trong hình 2.11 khi lôùp sinh khoái daøy ñaëc bao quanh haït cô chaát. Hình 2.9 – Söï thay ñoåi sinh khoái trong quaù trình nuoâi caáy beà maët. (a) Söï phaùt trieån treân beà maët cô chaát. (b) Söï phaùt trieån treân maët caét cô chaát [19] Hình 2.10 – Caùc bieán ñoåi trong quaù trình nuoâi caáy beà maët ñoái vôùi heä sôïi, töø taâm haït cô chaát ñeán pha khí beân ngoaøi haït [19] Hình 2.11 – Caùc bieán ñoåi trong quaù trình nuoâi caáy beà maët ñoái vôùi vi sinh vaät ñôn baøo, töø taâm haït cô chaát ñeán pha khí beân ngoaøi haït [19] Trong giai ñoaïn giöõa, nhieät cuûa quaù trình trao ñoåi chaát laøm taêng nhieät ñoä khoái canh tröôøng. Nhieät ñoä vaãn cöù tieáp tuïc taêng khi toác ñoä giaûi nhieät luoân thaáp hôn toác ñoä sinh nhieät. Maëc duø khoâng khí lieân tuïc ñöôïc bôm vaøo trong canh tröôøng nhöng nhieät ñoä bao giôø cuõng cao hôn nhieät ñoä toái öu töø 10 ñeán 20oC, ít nhaát laø ôû moät vaøi nôi trong thieát bò xaûy ra hieän töôïng sinh nhieät cuïc boä. Vì vaäy trong giai ñoaïn giöõa, söï sinh tröôûng luoân bò haïn cheá bôûi nhieät ñoä, noàng ñoä chaát dinh döôõng, saûn phaåm thuûy phaân vaø haøm löôïng O2. Caùc yeáu toá naøy phuï thuoäc toác ñoä sinh tröôûng, tính chaát cô chaát vaø loaïi thieát bò vaø caùch vaän haønh cuûa noù. Neáu hôïp chaát polymer trong cô chaát bò thuûy phaân laø hôïp chaát taïo neân caáu truùc cuûa cô chaát thì tính chaát cô chaát seõ bò thay ñoåi. Kích thöôùc khoái haït giaûm daãn ñeán theå tích canh tröôøng giaûm. Ñieàu naøy aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán caùc quaù trình vaän chuyeån maø ñaõ ñöôïc ñeà caäp ôû treân. Giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình. Vi sinh vaät tieáp tuïc chòu ñöïng ñieàu kieän khoâng thuaän lôïi ñeå phaùt trieån: nhieät ñoä cao, löôïng O2 thaáp, thieáu chaát dinh döôõng. Haäu quaû laø naám sôïi seõ bò öùc cheá khoâng theå hình thaønh baøo töû, teá baøo seõ thoaùi hoùa daãn ñeán töû vong. Nhieät löôïng seõ giaûm vaø nhieät ñoä toaøn boä khoái canh tröôøng giaûm. Giai ñoaïn naøy khaù quan troïng neáu saûn phaåm muoán thu nhaän laø baøo töû hoaëc saûn phaåm trao ñoåi chaát baäc hai. Nhöng ñoái vôùi nhöõng saûn phaåm khaùc, phaûi thu nhaän taïi thôøi ñieåm tröôùc giai ñoaïn cuoái. Phuï thuoäc vaøo töøng quaù trình cuï theå, giai ñoaïn naøy coù theå ngaén chæ vaøi giôø, hoaëc keùo daøi vaøi ngaøy ñeán vaøi tuaàn nhö trong thu nhaän saûn phaåm trao ñoåi baäc hai. 2.2.7. Phaân loaïi thieát bò leân men sinh hoïc Thieát bò leân men sinh hoïc söû duïng trong phöông phaùp nuoâi caáy beà maët raát ña daïng vaø phong phuù. Döïa vaøo caùch thöùc ñaûo troän vaø suïc khí, caùc thieát bò leân men ñöôïc chia thaønh boán nhoùm chính (Hình 2.12): Nhoùm 1. Loaïi thieát bò khoâng ñaûo troän vaø khoâng suïc khí tröïc tieáp vaøo trong canh tröôøng. Loaïi thieát bò naøy thöôøng söû duïng nhöõng khay leân men (tray) ñöôïc ñaët beân trong buoàng nuoâi caáy (chamber), xeáp thaønh töøng taàng vaø coù khoaûng troáng giöõa caùc taàng. Khoâng khí coù nhieät ñoä vaø ñoä aåm thích hôïp ñöôïc thoåi vaøo trong buoàng vaø tuaàn hoaøn treân beà maët caùc khay. Caùc khay ñöôïc laøm baèng goã, tre, kim loaïi hoaëc nhöïa. Beà maët cuûa khay ñeå hôû vaø ñaùy coù ñuïc loã ñeå gia taêng söï khueách taùn oxi vaøo trong canh tröôøng. Nhoùm 2. Loaïi thieát bò leân men khoâng ñaûo troän nhöng suïc khí cöôõng böùc vaøo canh tröôøng. Thieát bò söû duïng coät ñeäm (packed bed) daïng hình truï hoaëc hình hoäp chöõ nhaät ñaët theo höôùng thaúng ñöùng. Ñaùy coät ñöôïc ñuïc loã ñeå khoâng khí suïc tröïc tieáp vaøo beân trong canh tröôøng. Nhoùm 3. Loaïi thieát bò thöïc hieän söï ñaûo troän giaùn ñoaïn hoaëc lieân tuïc. Thieát bò ñöôïc caáu taïo bôûi 1 troáng hình truï, ñaët naèm ngang. Canh tröôøng chieám ½ theå tích cuûa troáng. Khoâng khí chæ ñöôïc thoåi treân beà maët canh tröôøng. Nhoùm 4. Loaïi thieát bò thöïc hieän keát hôïp caû hai yeáu toá ñaûo troän vaø suïc khí cöôõng böùc vaøo canh tröôøng. Loaïi thieát bò naøy ñöôïc phaân thaønh hai nhoùm nhoû: ñaûo troän giaùn tieáp vaø lieân tuïc. Caùc thieát bò thuoäc nhoùm naøy bao goàm thieát bò daïng taàng soâi (air-solid fluidized bed), troáng (rocking drum) vaø boàn khuaáy troän (stirred bed). Hình 2.12 – Phaân loaïi thieát bò leân men sinh hoïc baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà maët 2.2.8. Caùc nghieân cöùu öùng duïng phöông phaùp beà maët ñeå thu nhaän lipase Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët ñöôïc öùng duïng khaù phoå bieán trong vieäc thu nhaän moät soá loaïi enzyme. Trong ñoù, lipase laø loaïi enzyme ñöôïc xem laø coù tieàm naêng khi aùp duïng phöông phaùp nuoâi caáy naøy treân moâi tröôøng baõ raén noâng nghieäp. Moät soá nghieân cöùu treân moâi tröôøng raén ñöôïc toång hôïp trong baûng 2.3. Baûng 2.3 – Caùc öùng duïng phöông phaùp nuoâi caáy beà maët ñeå thu nhaän lipase Taùc giaû Gioáng VSV Moâi tröôøng raén Ñieàu kieän nuoâi caáy Hoaït tính lipase Ikram ul-Haq et al., 2001 [21] Rhizopus oligosporous Boät quaû haïnh xay 30oC 48 giôø 48 U/g J. Cordova et al., 1997 [22] Rhizopus rhizopodiformis Hoãn hôïp baõ olive : cuû caûi ñöôøng (1:1) 24 giôø 79,6 U/g Rhizomucor pusillus 20,24 U/g Alessandro D’ Annibale et al., 2006 [23] Penicillium citrinum NRRL 1841 Baõ khoâ daàu olive 188 giôø 1230 U/dm3 J.A. Rodriguez et al., 2006 [24] Rhizopus homothallicus (IRDI 3a) Baõ mía 12 giôø 826 U/g Luciana A.I. de Azeredo et al., 2007 [25] Penicillium restrictum Baõ caây coï cao ôû Brazil (babassu cake) 30oC 63 giôø 17,4 U/g Andreas K. Gombert et al., 1999 [26] Penicillium restrictum Baõ caây coï cao ôû Brazil (babassu cake) 24 giôø 30,3 U/g Nutan D. Mahadik et al., 2002 [27] Aspergillus niger Boät caùm mì 30oC 120 giôø 630 U/g Taùc giaû Gioáng VSV Moâi tröôøng raén Ñieàu kieän nuoâi caáy Hoaït tính lipase Nilkamal Mahanta et al., 2007 [28] Pseudomonas aeruginosa Baõ haït Jatropha curcas (Jatropha curcas seed cake) 120 giôø 1084 U/g N.R. Kamini et al., 1997 [29] Aspergillus niger Baùnh daàu gingelly 72 giôø 363 U/g Chöông 3 Phöông phaùp nghieân cöùu 3.1. NGUYEÂN LIEÄU 3.1.1. Nguoàn gioáng vi sinh vaät Chuûng naám moác Rhizopus sp. ñöôïc phaân laäp töø Phoøng thí nghieäm Vi sinh, khoa Kyõ thuaät Hoùa hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa vaø ñöôïc xaùc ñònh coù khaû naêng sinh toång hôïp lipase [3], ñöôïc nuoâi caáy treân oáng thaïch nghieâng taïi 30oC trong 7 ngaøy vaø giöõ gioáng taïi 4oC. Moâi tröôøng nuoâi caáy laø moâi tröôøng thaïch dòch nha vaø moâi tröôøng giöõ gioáng laø moâi tröôøng khoai taây – caø roát agar (Baûng 3.1). Baûng 3.1 – Thaønh phaàn moâi tröôøng khoai taây – caø roát agar Thaønh phaàn Haøm löôïng Khoai taây 20 g Caø roát 20 g Agar 20 g Nöôùc caát 1000 mL 3.1.2. Chuaån bò löôïng gioáng caáy Baøo töû sau 7 ngaøy nuoâi caáy treân oáng thaïch nghieâng ñöôïc tieán haønh ñöa vaøo nghieân cöùu. Laáy 10 mL nöôùc caát voâ khuaån cho vaøo oáng gioáng, laéc ñeàu treân maùy laéc oáng nghieäm ñeå taùch lôùp baøo töû treân maët thaïch, sau ñoù chuyeån dòch baøo töû sang oáng nghieäm ñöïng nöôùc caát ban ñaàu. Tröôùc khi laáy gioáng ñeå caáy vaøo moâi tröôøng khaûo saùt, caàn laéc kyõ oáng dòch baøo töû ñeå baøo töû ñöôïc phaân boá ñeàu trong oáng nghieäm. 3.1.3. Thaønh phaàn moâi tröôøng 3.1.3.1. Baõ ñaäu naønh Baõ ñaäu naønh söû duïng trong nghieân cöùu laø nguoàn pheá lieäu trong coâng nghieäp saûn xuaát söõa ñaäu naønh ñaõ qua quaù trình nghieàn vaø saáy ñeán ñoä aåm 6%. 3.1.3.2. Baõ mía Mía sau khi eùp kieät nöôùc ñöôïc ñöa vaøo quy trình xöû lyù: röûa saïch baõ mía ba laàn baèng nöôùc caát, saáy taïi nhieät ñoä 80oC trong hai ngaøy, sau ñoù ñem nghieàn vaø caét nhoû baõ mía. Phaàn mía ñöôïc söû duïng trong nghieân cöùu coù kích thöôùc töø 1 – 2 mm [24]. Hình 3.1 - Quy trình xöû lyù baõ mía 3.1.3.3. Thaønh phaàn boå sung Nguoàn chaát caûm öùng khaûo saùt: daàu ñaäu naønh vaø daàu döøa. Nguoàn nitô: (NH4)2SO4 Nguoàn khoaùng: KH2PO4, FeSO4, CuSO4, MgSO4, MnSO4 Töø nguoàn nitô vaø khoaùng, pha thaønh dung dòch boå sung caùc thaønh phaàn khaûo saùt vaøo moâi tröôøng nghieân cöùu vôùi haøm löôïng nhö trong baûng 3.2. Baûng 3.2 – Thaønh phaàn dung dòch boå sung Thaønh phaàn Haøm löôïng (NH4)2SO4 4 g KH2PO4 2 g MgSO4.7H2O 0,6 g MnSO4.7H2O 0,2 g FeSO4.7H2O 0,1 g CuSO4.5H2O 0,1 g Nöôùc caát 100 mL 3.1.4. Thieát bò vaø Hoùa chaát Baûng 3.3 – Thieát bò söû duïng trong nghieân cöùu Thieát bò Muïc ñích söû duïng Thoâng soá kyõ thuaät Caân 4 soá leû Caân chính xaùc hoùa chaát, moâi tröôøng Caân 2 soá leû Caân hoùa chaát, moâi tröôøng Maùy ño pH Ño pH Noài haáp tieät truøng Tieät truøng moâi tröôøng, duïng cuï 121oC, 20 phuùt Maùy laéc ngang Trích ly enzyme Trích ly: 300 voøng/phuùt Phaûn öùng: 250 voøng/phuùt Beå ñieàu nhieät Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Nhieät ñoä: 40,45,50,55oC Tuû caáy Caáy gioáng vaøo moâi tröôøng Maùy chuaån ñoä Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Maùy khuaáy töø Troän dung dòch chuaån ñoä Maùy ñoàng hoùa cô Ñoàng hoùa tributyrin - gum Maùy laéc oáng nghieäm Phaân phoái ñeàu baøo töû Maùy xaùc ñònh ñoä aåm Xaùc ñònh ñoä aåm moâi tröôøng Nhieät ñoä saáy: 110oC Baûng 3.4 – Hoùa chaát söû duïng trong nghieân cöùu Teân hoùa chaát Muïc ñích söû duïng Nguoàn goác Tributyrin Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Merck - Ñöùc Gum arabic Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Merck - Ñöùc NaOH Xaùc ñònh hoaït tính enzyme Pha dung dòch ñeäm Vieät Nam n-Hexan Taùch chaát beùo trong dòch chieát enzyme Trung Quoác Acetone Voâ hoaït enzyme Vieät Nam Coàn tuyeät ñoái Voâ hoaït enzyme Vieät Nam KH2PO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Pha dung dòch ñeäm Vieät Nam FeSO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam CuSO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam MgSO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam MnSO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam (NH4)2SO4 Thaønh phaàn moâi tröôøng Vieät Nam Peptone Thaønh phaàn moâi tröôøng Trung Quoác Chaát chieát naám men Thaønh phaàn moâi tröôøng Trung Quoác 3.2. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Chuûng naám moác Rhizopus sp. ñaõ ñöôïc xaùc ñònh laø thích hôïp cho vieäc nuoâi caáy sinh toång hôïp lipase treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh [3]. Trong voøng 42 giôø, lipase thu nhaän coù hoaït tính 53,843 IU/g khoái löôïng moâi tröôøng. Keát quaû naøy cho thaáy moâi tröôøng baõ ñaäu naønh raát coù trieån voïng trong öùng duïng saûn xuaát lipase theo quy moâ coâng nghieäp. Vì vaäy, trong baøi nghieân cöùu naøy, chuùng toâi ñaõ chuyeån ñoåi moâ hình nuoâi caáy töø bình Erlen 250 mL sang söû duïng bao tieät truøng PP vôùi muïc ñích naâng cao hoaït tính lipase thu nhaän ñöôïc. Noäi dung nghieân cöùu bao goàm: Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa thôøi gian ñeán hoaït tính lipase thu nhaän treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh trong hai moâ hình nghieân cöùu: Erlen vaø bao PP. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung baõ mía ñeán hoaït tính lipase. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính lipase. Khaûo saùt aûnh höôûng loaïi chaát caûm öùng vaø haøm löôïng ñeán hoaït tính lipase. Xaùc ñònh thôøi gian nuoâi caáy thích hôïp ñeå thu nhaän lipase. Xaùc ñònh ñieàu kieän phaûn öùng toái öu cho lipase thu nhaän ñöôïc. 3.2.1. Moâ hình nuoâi caáy trong bao tieät truøng PP Trong moâ hình naøy, chuùng toâi söû duïng loaïi bao PP coù kích thöôùc 16,5 x 27,5 cm ñeå tieán haønh nuoâi caáy naám moác treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh. Bao PP coù khaû naêng chòu ñöôïc nhieät ñoä tieät truøng laø 121oC vaø khoâng bò bieán daïng sau khi haáp. Caùc thaønh phaàn vaø ñieàu kieän nuoâi caáy hoaøn toaøn töông töï nhö trong moâ hình söû duïng erlen (Baûng 3.5). Chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu song song hai loaïi moâ hình treân theo thôøi gian. Baét ñaàu laáy maãu ñem phaân tích taïi thôøi ñieåm 30 giôø, sau ñoù khoaûng 12 giôø chuùng toâi laáy maãu moät laàn. Moãi maãu bao goàm bình erlen vaø bao PP nuoâi caáy theo thôøi gian töông öùng. Baûng 3.5 – Thaønh phaàn nuoâi caáy trong erlen vaø bao PP Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 10 g Dung dòch boå sung 10 mL Dòch baøo töû 1 mL Chuaån bò thí nghieäm nhö sau: Löôïng gioáng caáy: ñöôïc chuaån bò nhö trong phaàn 3.1.2. Tieán haønh kieåm tra laïi soá löôïng baøo töû trong 1mL dòch baøo töû baèng caùch pha loaõng vôùi nöôùc caát voâ khuaån vaø ñeám tröïc tieáp döôùi kính hieån vi. Sau khi coù keát quaû, tính toaùn löôïng nöôùc caát voâ khuaån cho vaøo sao cho 1mL dòch baøo töû chöùa khoaûng 107 baøo töû. Caân chính xaùc khoái löôïng baõ ñaäu naønh laø 10g, cho vaøo erlen 250mL vaø bao PP cuøng vôùi 10mL dung dòch boå sung, troän ñeàu hoãn hôïp. Laøm nuùt boâng ñaäy kín mieäng bình erlen vaø bao PP. Haáp tieät truøng 121oC trong 20 phuùt. Laøm nguoäi moâi tröôøng ñeán nhieät ñoä phoøng. Tieán haønh caáy gioáng vaøo moâi tröôøng vaø thöïc hieän trong tuû caáy (söû duïng pipet voâ khuaån caáy 1mL dòch baøo töû ñöôïc chuaån bò nhö treân vaøo moâi tröôøng), sau ñoù troän ñeàu. Nuoâi ôû nhieät ñoä thöôøng 30oC trong tuû aám. Töø keát quaû phaân tích hoaït tính lipase, chuùng toâi seõ so saùnh khaû naêng söû duïng cuûa hai loaïi moâ hình naøy vaø choïn ra moâ hình vaø thôøi gian thích hôïp cho vieäc khaûo saùt yeáu toá tieáp theo. 3.2.2. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung baõ mía ñeán hoaït tính lipase Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi thay ñoåi thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy baèng caùch boå sung baõ mía theo phaàn traêm khoái löôïng baõ ñaäu naønh (30, 40, 50%). Tieán haønh song song maãu ñoái chöùng, khoâng boå sung baõ mía, khoái löôïng baõ ñaäu naønh laø 10g. Böôùc chuaån bò thí nghieäm thöïc hieän nhö treân. Thôøi gian nuoâi caáy laø thôøi gian toái öu trong phaàn khaûo saùt 3.2.1. Baûng 3.6 – Thaønh phaàn nuoâi caáy trong bao PP khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa baõ mía Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 7 g Baõ mía 2,1 ; 2,8 ; 3,5 g Dung dòch boå sung 10 mL Dòch baøo töû 1 mL Nöôùc caát (*) 3,3 ; 5,4 ; 7,5 mL (*): löôïng nöôùc caát boå sung tính toaùn döïa treân ñoä aåm ban ñaàu cuûa baõ ñaäu naønh vaø baõ mía sao cho ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy laø nhö nhau. Töø keát quaû phaân tích, chuùng toâi seõ ñaùnh giaù aûnh höôûng vieäc boå sung baõ mía vaø haøm löôïng toái öu ñoái vôùi hoaït tính lipase ñeå tieáp tuïc khaûo saùt yeáu toá tieáp theo. 3.2.3. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính lipase Keát hôïp caùc yeáu toá khaûo saùt ôû phaàn treân, chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu söï aûnh höôûng cuûa ñoä aåm ñeán hoaït tính lipase sinh toång hôïp treân moâi tröôøng naønh mía. Coá ñònh theå tích dung dòch boå sung (10mL), ñoä aåm moâi tröôøng thay ñoåi phuï thuoäc vaøo löôïng nöôùc caát theâm vaøo. Caùc giaù trò ñoä aåm khaûo saùt laø ñoä aåm sau khi tieät truøng. Xaùc ñònh ñoä aåm moâi tröôøng baèng phöông phaùp saáy ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi ôû nhieät ñoä 110oC. 3.2.4. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát caûm öùng ñeán hoaït tính lipase Caùc loaïi chaát caûm öùng boå sung vaøo moâi tröôøng goàm coù daàu naønh vaø daàu meø. Haøm löôïng caùc loaïi daàu chieám 1,5% khoái löôïng moâi tröôøng. Tieán haønh maãu khoâng boå sung daàu ñeå ñoái chöùng. Caùc böôùc chuaån bò thöïc hieän nhö treân. Sau khi choïn ñöôïc loaïi chaát caûm öùng boå sung phuø hôïp, tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng chaát caûm öùng ñoái vôùi hoaït tính lipase thu nhaän. Caùc giaù trò khaûo saùt: 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0%. 3.2.5. Xaùc ñònh thôøi gian nuoâi caáy thích hôïp ñeå thu nhaän lipase Sau khi ñaõ xaùc ñònh caùc thaønh phaàn toái öu cuûa moâi tröôøng, chuùng toâi tieán haønh kieåm tra thôøi gian nuoâi caáy ñeå thu nhaän lipase coù hoaït tính cao nhaát. Baét ñaàu laáy maãu taïi thôøi ñeåm 30 giôø, khoaûng caùch moãi laàn laø 12 giôø. 3.2.6. Xaùc ñònh ñieàu kieän phaûn öùng toái öu cho lipase Khaûo saùt hoaït tính cuûa dòch enzyme thoâ trong ñieàu kieän phaûn öùng nhieät ñoä vaø pH khaùc nhau. Caùc giaù trò khaûo saùt: pH: 7,0 ; 7,5 ; 8,0 ; 8,5 ; 9,0. Nhieät ñoä: 35, 40, 45, 50, 55oC. Maãu ñoái chöùng coù giaù trò pH 7 vaø nhieät ñoä 35oC. 3.3. PHÖÔNG PHAÙP PHAÂN TÍCH 3.3.1. Xaùc ñònh hoaït tính lipase baèng phöông phaùp chuaån ñoä acid – base [30] Phöông phaùp naøy caên cöù vaøo löôïng acid töï do taïo thaønh trong dòch thuûy phaân triglyceride. Dung dòch cô chaát phaûn öùng laø heä nhuõ töông 10% tributyrin, boå sung 10% gum arabic, ñoàng hoùa baèng thieát bò ñoàng hoùa cô trong 10 phuùt. Chuaån bò dòch enzyme thoâ: sau khoaûng thôøi gian nuoâi caáy, cho vaøo erlen hoaëc bao PP chöùa canh tröôøng vi sinh vaät chính xaùc 100mL nöôùc caát, neáu thaønh phaàn moâi tröôøng coù baõ mía thì duøng chính xaùc 200mL nöôùc caát. Ñaùnh tôi canh tröôøng, ñoå toaøn boä hoãn hôïp vaøo erlen vaø ñöa leân maùy laéc 300 voøng/phuùt trong 2 giôø. Sau ñoù ly taâm vôùi toác ñoä 3000 voøng/phuùt trong 15 phuùt, thu laáy dòch trong enzyme thoâ. Chuaån bò dung dòch phaûn öùng: söû duïng erlen 100mL, laàn löôït cho vaøo bình caùc theå tích nhö sau: 5mL dung dòch ñeäm phosphate pH = 7; 5mL dung dòch enzyme thoâ; 5mL dung dòch cô chaát. Tieán haønh phaûn öùng: laéc ñeàu hoãn hôïp, phaûn öùng trong 1 giôø ôû nhieät ñoä phoøng (35oC). Sau ñoù, theâm vaøo 10mL dung dòch acetone : coàn tuyeät ñoái (1:1) ñeå döøng phaûn öùng. Ñoå toaøn boä dung dòch sau phaûn öùng vaøo becher 100mL, cho theâm 25mL nöôùc caát roài tieán haønh chuaån ñoä baèng maùy chuaån ñoä töï ñoäng. Caøi ñaët giaù trò pH töông ñöông (End point) 9,25 ñeå döøng quaù trình chuaån ñoä. Thöïc hieän song song maãu ñoái chöùng: töông töï nhö treân nhöng cho vaøo 10mL dung dòch acetone – coàn tuyeät ñoái (1:1) ñeå voâ hoaït enzyme tröôùc khi cho dung dòch cô chaát ñeå phaûn öùng. Trong ñieàu kieän naøy, phaûn öùng thuûy phaân do enzyme phaûn öùng seõ khoâng xaûy ra. 3.3.2. Coâng thöùc tính hoaït tính lipase [21] Ñoái vôùi lipase, moät ñôn vò hoaït ñoä IU laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå xuùc taùc taïo thaønh 1 micromole acid beùo trong 1 phuùt ôû caùc ñieàu kieän xaùc ñònh. Hoaït tính xuùc taùc cuûa lipase laø soá ñôn vò hoaït ñoä coù trong 1g chaát khoâ moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät ñeå thu nhaän enzyme. Moâi tröôøng söû duïng laø baõ ñaäu naønh ñaõ saáy khoâ, neân coâng thöùc hoaït tính lipase ñöôïc bieåu dieãn nhö sau: Hoaït tính lipase (IU/g) = ( DV x N x 1000 x v1) / ( v2 x t x m) Trong ñoù: DV : hieäu soá mL dung dòch NaOH chuaån ñoä maãu so vôùi maãu traéng. N : noàng ñoä ñöông löôïng dung dòch NaOH 0,1N trong chuaån ñoä. 1000 : heä soá quy ñoåi ñôn vò. v1 : soá mL nöôùc caát duøng ñeå trích ly maãu canh tröôøng raén. v2 : soá mL dòch enzyme thoâ ñem phaûn öùng. t : thôøi gian phaûn öùng tính baèng phuùt. m : soá g moâi tröôøng baõ ñaäu naønh ñem nuoâi caáy. 3.3.3. Phöông phaùp xöû lyù thoáng keâ Ñoä laëp laïi caùc maãu thí nghieäm laø ba laàn. Xöû lyù baèng phaàn meàm STATGRAPHICS Plus 3.0. Theå hieän caùc kyù töï (a, b, c, …) beân caïnh keát quaû xöû lyù. Caùc giaù trò coù kyù töï gioáng nhau nghóa laø caùc giaù trò ñoù khoâng coù söï khaùc bieät veà yù nghóa. Ngöôïc laïi, caùc giaù trò coù kyù töï khaùc nhau laø caùc giaù trò coù söï khaùc bieät veà yù nghóa vôùi ñoä tin caäy 95%. Chöông 4 Keát quaû vaø Baøn luaän 4.1. Khaûo saùt khaû naêng sinh toång hôïp lipase treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh Döïa vaøo keát quaû nghieân cöùu tröôùc ñaây [3], chuùng toâi ñaõ choïn ñöôïc chuûng naám moác Rhizopus sp. coù khaû naêng sinh toång hôïp lipase hoaït tính cao treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh. Thaønh phaàn boå sung vaøo moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy ñaõ ñöôïc xaùc ñònh laø toái öu cho moâ hình erlen (Baûng 4.1). Tuy nhieân, nhö chuùng toâi ñaùnh giaù, hoaït tính cuûa lipase thu nhaän töø baõ ñaäu naønh vaãn coù theå taêng leân. Vì theá, chuùng toâi ñaõ tieán haønh nghieân cöùu moät loaïi moâ hình môùi: thay theá bình erlen baèng nhöõng bao PP ñeå nuoâi caáy. Muïc ñích cuûa loaïi moâ hình naøy laø taêng khaû naêng söû duïng cô chaát (baõ ñaäu naønh) vaø taïo ñieàu kieän nuoâi caáy toát hôn ñoái vôùi naám sôïi. Hôn theá nöõa, moâ hình bao PP chuùng toâi söû duïng laø böôùc ñaàu tieân trong vieäc nghieân cöùu phaùt trieån moâ hình nuoâi caáy thaønh quy moâ coâng nghieäp [31]. Baûng 4.1 – Thaønh phaàn moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu trong moâ hình erlen ñaõ khaûo saùt [3] Thaønh phaàn moâi tröôøng Haøm löôïng Ñieàu kieän nuoâi caáy Thoâng soá Baõ ñaäu naønh 10g Ñoä aåm ban ñaàu 53% Daàu ñaäu naønh 0,15g Nhieät ñoä nuoâi caáy 30oC Dung dòch boå sung 10mL Thôøi gian 42 giôø Dòch baøo töû 1mL Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy cuøng moät luùc hai loaïi moâ hình bao PP vaø bình erlen vaø theo doõi hoaït tính lipase thay ñoåi theo thôøi gian. Thaønh phaàn moâi tröôøng nhö trong baûng 3.5. Baét ñaàu laáy maãu phaân tích taïi thôøi ñieåm 30 giôø. Keát quaû khaûo saùt theå hieän trong baûng 4.2. Baûng 4.2 – Hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh trong bao tieät truøng PP vaø erlen Bao tieät truøng PP Erlen(*) Thôøi gian, giôø IU/g Thôøi gian, giôø IU/g 30 27,264 ± 0,921 30 21,246 ± 0,344 38 31,751 ± 1,317 42 29,220 ± 0,173 47 25,661 ± 0,908 48 22,025 ± 0,528 60 21,928 ± 0,401 66 23,094 ± 0,017 72 27,254 ± 1,143 72 21,584 ± 0,388 87 37,023 ± 1,234 84 18,324 ± 0,199 96 25,282 ± 0,550 Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. (*) Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 2 maãu ñoäc laäp. Hình 4.1 – Hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh trong bao tieät truøng PP vaø Erlen Döïa vaøo ñoà thò, ta nhaän thaáy quy luaät bieán ñoåi hoaït tính lipase theo thôøi gian trong hai loaïi moâ hình laø gioáng nhau. Trong khoaûng töø 38 ñeán 42 giôø, lipase thu nhaän coù hoaït tính cao nhaát. Sau khoaûng thôøi gian naøy, hoaït tính enzyme baét ñaàu giaûm daàn. Tuy nhieân, neáu keùo daøi thôøi gian nuoâi caáy ñeán 60 giôø thì hoaït tính enzyme taêng trôû laïi nhöng sau ñoù tieáp tuïc giaûm maïnh. Ñöôøng cong hoaït tính lipase moâ hình bao PP naèm treân so vôùi ñöôøng cong moâ hình erlen. Ñieàu naøy cho thaáy khaû naêng öùng duïng bao PP ñeå nuoâi caáy laø coù trieån voïng. Nhìn vaøo ñoà thò, chuùng toâi taïm thôøi chia thôøi gian nuoâi caáy thaønh ba giai ñoaïn: giai ñoaïn I laø giai ñoaïn ñaït giaù trò hoaït tính lipase cöïc ñaïi (töø 0 ñeán 38 – 42 giôø nuoâi caáy), giai ñoaïn II laø giai ñoaïn hoaït tính baét ñaàu giaûm daàn (Erlen: töø 42 ñeán 50 giôø, bao PP: töø 38 ñeán 60 giôø), vaø giai ñoaïn III laø giai ñoaïn hoaït tính taêng trôû laïi vaø cho ñeán khi keát thuùc thôøi gian khaûo saùt. Trong giai ñoaïn I, hai loaïi moâ hình ñeàu ñaït hoaït tính lipase cao taïi thôøi ñieåm 38 – 42 giôø. Tuy nhieân, lipase thu nhaän töø moâ hình bao PP (31,751 IU/g) cho hoaït tính cao hôn moâ hình bình erlen (29,220 IU/g). Nguyeân nhaân laø do khaû naêng söû duïng beà maët cô chaát trong bao toát hôn trong erlen vì beà daøy canh tröôøng nuoâi caáy nhoû hôn 1cm vaø dieän tích canh tröôøng chieám 2/3 dieän tích cuûa bao. Trong khi ñoù, canh tröôøng nuoâi caáy trong bình erlen coù beà daøy töø 2 ñeán 3cm neân naám sôïi khoâng theå taän duïng phaàn cô chaát naèm ôû ñaùy bình. Moâ hình nuoâi caáy trong erlen vaø bao PP ñeàu thuoäc nhoùm 1 theo khoùa phaân loaïi caùc thieát bò leân men beà maët (2.2.7). Canh tröôøng hoaøn toaøn khoâng ñöôïc ñaûo troän vaø suïc khí. Söï khueách taùn khoâng khí xuyeân qua nuùt boâng laø khoâng ñaùng keå. Vì vaäy, chuùng toâi xem moâ hình nuoâi caáy laø moät heä kín. Neáu xeùt theo khía caïnh vó moâ, heä nuoâi caáy beà maët ñöôïc chia laøm 3 pha nhö sau: canh tröôøng, phaàn khoâng gian treân beà maët canh tröôøng vaø thaønh bình erlen hay bao PP. Chuùng toâi giaû thieát raèng phaàn khoâng gian treân beà maët canh tröôøng cuûa hai loaïi moâ hình laø nhö nhau. Do ñoù, chuùng toâi xeùt ñeán hai yeáu toá coøn laïi. Ñoái vôùi bao PP, söï truyeàn nhieät vaø chuyeån khoái qua lôùp voû bao laø hieäu quaû hôn so vôùi thaønh thuûy tinh bình erlen [31]. Ñoái vôùi canh tröôøng, khi phaân tích vi moâ, canh tröôøng ñöôïc chia thaønh 3 pha: haït cô chaát, lôùp sinh khoái bao quanh beà maët vaø khoâng gian xung quanh haït [19]. Chính yeáu toá dieän tích beà maët cô chaát ñöôïc söû duïng nhieàu trong moâ hình bao PP ñaõ laøm cho hoaït tính lipase taêng. Tuy nhieân, söï khueách taùn O2 vaøo beân trong haït raát haïn cheá do moâi tröôøng nuoâi caáy khoâng tôi xoáp. Ñieàu naøy laøm yeáu ñi söï sinh tröôûng phaàn khuaån ti dinh döôõng cuûa naám sôïi. Ñaây chính laø boä phaän tröïc tieáp sinh toång hôïp enzyme chuyeån hoùa cô chaát beân trong haït. Keát quaû laø hoaït tính lipase thu nhaän töø bao PP cao hôn töø erlen nhöng khoâng ñaùng keå. Lipase thu nhaän trong giai ñoaïn I coù hoaït tính cao nhaát bôûi vì ñaây laø giai ñoaïn xaûy ra quaù trình thích nghi vaø sinh tröôûng cuûa naám moác. Khi ñöôïc caáy vaøo moâi tröôøng baõ ñaäu naønh, baøo töû naám moác seõ baùm treân beà maët haït vaø phaùt trieån taïo thaønh hai boä phaän: khuaån ti khí sinh vaø khuaån ti dinh döôõng. Ñoä aåm thích hôïp vaø chaát dinh döôõng saün coù treân beà maët haït taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho khuaån ti khí sinh phaùt trieån maïnh. Khoâng nhöõng taïo thaønh lôùp sinh khoái bao xung quanh haït, khuaån ti khí sinh coøn phaùt trieån vöôn ra vuøng khoâng gian xung quanh. Ngöôïc laïi, phaàn khuaån ti dinh döôõng thì phaùt trieån vaø caém saâu vaøo beân trong haït. Löôïng O2 khueách taùn vaøo trong haït seõ giuùp cho söï phaùt trieån cuûa phaàn khuaån ti naøy, sinh toång hôïp löôïng enzyme caàn thieát ñeå thuûy phaân cô chaát, taïo thaønh chaát dinh döôõng cung caáp cho söï phaùt trieån cuûa heä sôïi. Trong 24 giôø ñaàu laø giai ñoaïn thích nghi, toång hôïp heä enzyme vaø chöa hình thaønh heä sôïi treân beà maët canh tröôøng. Töø 24 ñeán 36 giôø, heä sôïi baét ñaàu phaùt trieån vaø lan roäng treân khaép beà maët canh tröôøng. Taïi thôøi ñieåm 42 giôø, heä sôïi daøy ñaëc lieân keát caùc haït cô chaát taïo thaønh moät khoái canh tröôøng raén. Giai ñoaïn II laø giai ñoaïn hoaït tính lipase baét ñaàu giaûm. Giai ñoaïn naøy töông öùng vôùi pha oån ñònh cuûa naám moác. Hoaït tính lipase giaûm coù theå do löôïng O2 beân trong haït giaûm maïnh vaø söï khueách taùn O2 töø ngoaøi vaøo trong khoâng ñuû cho söï phaùt trieån tieáp tuïc cuûa khuaån ti dinh döôõng do bò ngaên caûn bôûi lôùp sinh khoái daøy ñaëc. Moät nguyeân nhaân khaùc coù theå gaây neân hieän töôïng naøy laø do trong quaù trình sinh tröôûng, nhieät cuûa quaù trình trao ñoåi chaát taêng maïnh daãn ñeán öùc cheá sinh toång hôïp enzyme. Döïa vaøo ñoà thò, ta nhaän thaáy ñoä doác cuûa ñöôøng cong thuoäc moâ hình erlen trong giai ñoaïn giaûm hoaït tính naøy doác hôn so vôùi moâ hình bao PP. Ñieàu naøy chöùng toû lipase bò öùc cheá vaø giaûm hoaït tính maïnh do nhieät cuïc boä khoâng ñöôïc giaûi toûa trong moâ hình erlen. Moät laàn nöõa chính yeáu toá beà daøy canh tröôøng vaø hieäu quaû cuûa söï truyeàn nhieät ñaõ gaây caûn trôû cho moâ hình erlen. Ngöôïc laïi, öu ñieåm hôn moâ hình erlen, dieän tích canh tröôøng trong bao PP ñöôïc traûi roäng treân 2/3 dieän tích cuûa bao taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho söï khueách taùn O2 vaøo beân trong haït vaø taêng hieäu quaû truyeàn nhieät. Vì vaäy, söï giaûm hoaït tính lipase trong bao keùo daøi ñeán 60 giôø. Cuoái giai ñoaïn II, baøo töû ñaõ baét ñaàu hình thaønh trong bao PP, nhöng moâ hình erlen thì khoâng thaáy xuaát hieän baøo töû. Ñaàu giai ñoaïn III laø quaù trình hình thaønh baøo töû cuûa naám moác. Quaù trình naøy phuï thuoäc vaøo ñieàu kieän hieän taïi cuûa moâ hình. Haøm löôïng O2, nguoàn dinh döôõng, ñoä aåm vaø nhieät ñoä laø yeáu toá quyeát ñònh. Ñoái vôùi moâ hình bao PP, trong quaù trình hình thaønh heä sôïi, caùc sôïi naám ñöôïc phaân boá roäng khaép beà maët canh tröôøng. Hieäu quaû söû duïng nguoàn cô chaát cao hôn so vôùi moâ hình erlen. Do ñoù, naám moác vaãn coù khaû naêngï sinh toång hôïp enzyme khi lan roäng tôùi nhöõng vò trí coù ñieàu kieän thuaän lôïi. Ñieàu naøy laøm cho ñöôøng cong hoaït tính moâ hình bao PP taêng leân trong giai ñoaïn naøy. Tuy nhieân, ñoái vôùi moâ hình erlen, hieän töôïng naøy khoâng xaûy ra. Cuoái giai ñoaïn III laø giai ñoaïn thoaùi hoùa daãn ñeán töû vong. Ñieàu kieän phaùt trieån raát khaéc nghieät. Löôïng O2 gaàn nhö khoâng ñuû trong lôùp sinh khoái bao quanh beà maët haït cô chaát, chaát dinh döôõng caïn kieät, nhieät ñoä taêng cao laøm khoâ beà maët cô chaát. Do ñoù, heä sôïi ngöøng phaùt trieån vaø suy vong daàn daàn. Quan saùt moâ hình erlen, ta nhaän thaáy thaäm chí baøo töû khoâng theå hình thaønh trong giai ñoaïn naøy. Sau khi phaân tích nhöõng keát quaû khaûo saùt, chuùng toâi quyeát ñònh choïn moâ hình bao tieät truøng PP thay theá cho moâ hình erlen. Coâng vieäc tieáp theo cuûa chuùng toâi laø phaùt huy nhöõng öu ñieåm vaø haïn cheá nhöõng khuyeát ñieåm cuûa loaïi moâ hình môùi naøy. Khoaûng thôøi gian 42 giôø ñöôïc choïn laø thôøi gian thích hôïp cho vieäc thu nhaän lipase treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh vaø ñöôïc aùp duïng ñeå khaûo saùt caùc yeáu toá tieáp theo. 4.2. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung baõ mía ñeán hoaït tính lipase Trong pha thích nghi cuûa naám moác, khuaån ti dinh döôõng seõ phaùt trieån vaø caém saâu vaøo beân trong haït cô chaát. Phaàn khuaån ti naøy seõ sinh toång hôïp lipase ñeå thuûy phaân nguoàn cô chaát laø löôïng daàu soùt trong haït baõ ñaäu naønh. Neáu löôïng O2 khueách taùn vaøo trong haït ñuû cung caáp cho söï phaùt trieån cuûa khuaån ti thì löôïng enzyme toång hôïp ñöôïc seõ nhieàu hôn. Vì vaäy ñeå taêng khaû naêng söû duïng cô chaát cuõng nhö taêng söï khueách taùn O2, ñoä tôi xoáp cuûa moâi tröôøng, chuùng toâi khaûo saùt vieäc boå sung baõ mía vaøo moâi tröôøng vôùi haøm löôïng khaùc nhau. Thaønh phaàn moâi tröôøng vaø haøm löôïng baõ mía boå sung nhö trong baûng 3.6, nuoâi caáy canh tröôøng trong bao PP, sau 42 giôø, laáy maãu ñeå phaân tích hoaït tính lipase. Keát quaû khaûo saùt ñöôïc theå hieän trong baûng 4.3. Baûng 4.3 – Aûnh höôûng haøm löôïng baõ mía ñeán hoaït tính lipase Baõ mía,% IU/g 0 31,751 ± 1,317d 30 43,310 ± 0,113c 40 52,470 ± 0,316b 50 63,654 ± 2,778a Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. Caùc kyù töï khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù yù nghóa (P<0,05). Hình 4.2 – Khaûo saùt söï aûnh höôûng haøm löôïng baõ mía ñeán hoaït tính lipase Khi taêng haøm löôïng mía boå sung vaøo moâi tröôøng, hoaït tính lipase taêng tuyeán tính vaø ñaït giaù trò 63,654 IU/g vôùi löôïng mía boå sung laø 50% khoái löôïng baõ ñaäu naønh. Haøm löôïng mía boå sung khaùc nhau ñeàu coù yù nghóa thoáng keâ. Ñieàu naøy chöùng minh raèng ñoä tôi xoáp cuûa moâi tröôøng coù aûnh höôûng quan troïng ñoái vôùi phöông phaùp nuoâi caáy beà maët. Moâ hình chuùng toâi nuoâi caáy khoâng ñaûo troän vaø suïc khí vaøo beân trong canh tröôøng. Vì theá boå sung löôïng mía seõ laøm taêng vuøng khoâng gian xung quanh beà maët cô chaát haït ñaäu naønh, daãn ñeán taêng söï khueách taùn haøm löôïng O2 vaøo beân trong haït cô chaát. Ngoaøi ra, löôïng mía boå sung coøn giuùp phaân boá ñeàu baõ ñaäu naønh beân trong canh tröôøng, taêng khaû naêng söû duïng cô chaát cuûa naám sôïi. Beân caïnh vieäc söû duïng baõ mía, chuùng toâi coøn söû duïng nhöõng nguoàn nguyeân lieäu phoái troän khaùc ñeå so saùnh khaû naêng aûnh höôûng cuûa chuùng ñoái vôùi hoaït tính lipase. Chuùng toâi ñaõ söû duïng traáu [3] vaø moät soá moâi tröôøng khaùc nhö baép, caùm mì, caùm gaïo, baõ döøa, baõ ñaäu phoäng ñeå troän vaøo moâi tröôøng baõ ñaäu naønh nhöng keát quaû khoâng khaû quan (keát quaû khaûo saùt nhöõng loaïi moâi tröôøng treân chuùng toâi khoâng ñöa vaøo baøi nghieân cöùu naøy). Vì vaäy, vieäc söû duïng baõ mía ñaõ ñöa ñeán cho chuùng toâi moät keát quaû raát toát. Vaø chuùng toâi xem ñaây laø thaønh phaàn thích hôïp ñeå phoái troän chung vôùi moâi tröôøng baõ ñaäu naønh. Moät ñieàu chuùng toâi löu yù laø khi boå sung baõ mía vôùi haøm löôïng 50% baõ ñaäu naønh thì theå tích canh tröôøng trong bao PP taêng leân gaáp 4 laàn so vôùi canh tröôøng chæ coù baõ ñaäu naønh. Neáu chuùng toâi taêng tæ leä baõ mía nghieân cöùu leân 60, 70% thì theå tích bao PP khoâng ñuû ñeå phaàn khoâng gian treân beà maët canh tröôøng laø nhö nhau trong caùc ñieàu kieän khaûo saùt ôû phaàn treân. Vì vaäy, ñeå ñôn giaûn hoùa vieäc nghieân cöùu, chuùng toâi döøng haøm löôïng baõ mía ôû möùc 50%, laáy keát quaû naøy ñeå khaûo saùt caùc yeáu toá tieáp theo. Sau khi coù thaønh phaàn vaø ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu, chuùng toâi seõ naâng caáp moâ hình nghieân cöùu (scale-up) ñeå ñöa vaøo quy moâ lôùn hôn. 4.3. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính lipase Ñoä aåm laø moät yeáu toá quan troïng aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp enzyme cuûa naám moác treân moâi tröôøng nuoâi caáy beà maët. Löôïng aåm boå sung vaøo moâi tröôøng seõ taäp trung chuû yeáu treân beà maët haït cô chaát. Nhôø vaøo löôïng aåm naøy maø baøo töû cuûa naám moác coù theå phaùt trieån taïo thaønh heä sôïi treân beà maët canh tröôøng. Ngoaøi ra, löôïng aåm töï do naøy coøn coù theå khueách taùn vaøo beân trong haït cô chaát, hoøa tan chaát dinh döôõng ñeå deã daøng vaän chuyeån vaøo trong teá baøo khuaån ti; xuùc taùc cho phaûn öùng thuûy phaân cuûa enzyme vaø laøm giaûm löôïng nhieät sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát cuûa heä sôïi. Trong phaàn naøy, chuùng toâi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm moâi tröôøng ñeán hoaït tính lipase. Thaønh phaàn moâi tröôøng bao goàm baõ mía vaø baõ ñaäu naønh (tæ leä 1:2). Coá ñònh theå tích dung dòch boå sung vaø dòch baøo töû caáy vaøo moâi tröôøng, chuùng toâi boå sung nöôùc caát ñeå laøm thay ñoåi ñoä aåm moâi tröôøng (Baûng 4.4). Ñoä aåm cuûa moâi tröôøng ñöôïc xaùc ñònh ngay sau khi haáp tieät truøng moâi tröôøng. Thôøi gian nuoâi caáy laø 42 giôø, sau ñoù tieán haønh laáy maãu phaân tích. Baûng 4.4 – Thaønh phaàn nuoâi caáy trong bao PP khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa ñoä aåm Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 7 g Baõ mía 3,5 g Dung dòch boå sung 10 mL Dòch baøo töû 1 mL Nöôùc caát 5 ; 10 mL Keát quaû khaûo saùt ñöôïc theå hieän trong baûng 4.5. Baûng 4.5 – Aûnh höôûng ñoä aåm ñeán hoaït tính lipase Ñoä aåm,% IU/g 38,90* 39,206 ± 0,372c 51,84** 63,146 ± 0,621a 60,09 55,114 ± 0,693b 65,73 55,460 ± 1,021b (*): khoâng theâm nöôùc caát; dung dòch boå sung 5mL, haøm löôïng khoaùng vaø nitô khoâng thay ñoåi. (**): khoâng theâm nöôùc caát;dung dòch boå sung 10mL,haøm löôïng khoaùng vaø nitô khoâng thay ñoåi. Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. Caùc kyù töï khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù yù nghóa (P<0,05). Hình 4.3 – Aûnh höôûng ñoä aåm ñeán hoaït tính lipase thu nhaän treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh boå sung baõ mía Khi boå sung nöôùc caát vaøo moâi tröôøng vôùi haøm löôïng 5, 10mL thì ñoä aåm cuûa moâi tröôøng töông öùng laø 60 vaø 66%. Ñoái vôùi hai maãu coøn laïi, chuùng toâi phaûi thay ñoåi theå tích dung dòch boå sung ñeå laøm thay ñoåi ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nhöng caùc yeáu toá coøn laïi phaûi coá ñònh. Trong ñoù coù moät maãu chuùng toâi khoâng theâm nöôùc caát ñeå laøm maãu ñoái chöùng. Ñoä aåm cuûa maãu naøy laø 52%. Ñoái vôùi 5mL dòch boå sung, ñoä aåm moâi tröôøng laø 39%. Döïa vaøo keát quaû naøy, ta nhaän thaáy hoaït tính lipase cao nhaát khi thu nhaän treân moâi tröôøng coù ñoä aåm 52%. Ñaây laø ñoä aåm toái öu cho söï phaùt trieån cuûa naám moác treân canh tröôøng naønh mía. Neáu ñoä aåm moâi tröôøng taêng cao thì seõ laøm keát dính caùc haït cô chaát trong canh tröôøng, daãn ñeán giaûm söï khueách taùn khoâng khí treân beà maët canh tröôøng vaøo trong vuøng khoâng gian giöõa nhöõng haït cô chaát. Löôïng O2 seõ khoâng ñöôïc cung caáp ñaày ñuû, toác ñoä sinh tröôûng giaûm vaø hoaït tính enzyme seõ giaûm. Neáu ñoä aåm moâi tröôøng quaù thaáp, baøo töû khoâng theå phaùt trieån treân beà maët haït cô chaát daãn ñeán hoaït tính enzyme giaûm ñi ñaùng keå. Vì ñoä aåm aûnh höôûng quan troïng ñeán söï phaùt trieån cuûa naám moác trong giai ñoaïn ñaàu cuûa quaù trình nuoâi caáy beà maët neân chuùng toâi phaûi xaùc ñònh tröôùc khi khaûo saùt caùc yeáu toá khaùc. Neáu khoâng, vieäc khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc yeáu toá sau seõ khoâng coøn khaùch quan. Keát thuùc giai ñoaïn naøy, chuùng toâi ñaõ xaùc ñònh ñöôïc thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy nhö sau: baõ ñaäu naønh 7g; baõ mía 3,5g; dung dòch boå sung 10mL; löôïng gioáng caáy vaøo moâi tröôøng 1mL vaø ñieàu kieän nuoâi caáy laø 30oC, 42 giôø, ñoä aåm ban ñaàu laø 52%. Hoaït tính lipase ñaït ñöôïc 63,146 IU/g. 4.4. Khaûo saùt aûnh höôûng vieäc boå sung chaát caûm öùng ñeán hoaït tính lipase Lipase laø moät loaïi enzyme caûm öùng. Loaïi enzyme naøy chæ toàn taïi vôùi moät löôïng cô baûn töông ñoái ít. Vieäc toång hôïp enzyme chæ ñöôïc thöïc hieän khi coù nhu caàu söû duïng. Khi ñoù, löôïng enzyme seõ taêng moät caùch ñoät ngoät. Tuy nhieân, ñeå toång hôïp ñöôïc lipase, ñoøi hoûi trong moâi tröôøng phaûi coù chaát caûm öùng töông öùng. ÔÛ ñaây, chaát caûm öùng chính laø cô chaát daàu triglyceride chòu söï thuûy phaân cuûa loaïi enzyme naøy. Ngoaøi ra, ñoái vôùi phöông phaùp leân men beà maët, quaù trình sinh toång hôïp lipase coøn lieân quan ñeán söï tieáp xuùc giöõa phaàn khuaån ti dinh döôõng vôùi cô chaát daàu beân trong haït. Neáu söï tieáp xuùc naøy khoâng hieäu quaû thì löôïng enzyme toång hôïp ñöôïc khoâng ñaùng keå. Vì vaäy chuùng toâi tieán haønh khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung chaát caûm öùng vaøo moâi tröôøng naønh mía. Chuùng toâi khaûo saùt hai loaïi chaát caûm öùng laø daàu naønh vaø daàu döøa. Ñaây laø hai loaïi daàu khaù phoå bieán vaø deã tìm. Söï khaùc bieät giöõa hai loaïi daàu naøy laø ñoä daøi maïch carbon cuûa phaân töû acid beùo vaø möùc ñoä khoâng no cuûa chuùng. Daàu naønh chuû yeáu laø haøm löôïng acid linoleic (C18:2), trong khi ñoù daàu döøa chuû yeáu laø haøm löôïng acid lauric (C12:0). Söï khaùc nhau nhö vaäy coù theå döï ñoaùn tính ñaëc hieäu veà cô chaát cuûa lipase thu nhaän ñöôïc. Thaønh phaàn moâi tröôøng nhö trong baûng 4.6, haøm löôïng daàu khaûo saùt laø 1,5% khoái löôïng moâi tröôøng, nuoâi caáy trong 42 giôø, sau ñoù ñem maãu ñi phaân tích. Baûng 4.6 – Thaønh phaàn nuoâi caáy trong bao PP khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa chaát caûm öùng Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 7 g Baõ mía 3,5 g Dung dòch boå sung 10 mL Haøm löôïng daàu 0,15 g Dòch baøo töû 1 mL Keát quaû khaûo saùt ñöôïc theå hieän trong baûng 4.7. Baûng 4.7 – Aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung chaát caûm öùng ñeán hoaït tính lipase thu nhaän töø moâi tröôøng baõ ñaäu naønh keát hôïp baõ mía Loaïi daàu IU/g Ñoái chöùng 63,146 ± 0,621c Daàu naønh 70,635 ± 1,793b Daàu döøa 81,076 ± 2,332a Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. Caùc kyù töï khaùc nhau bieåu thò söï khaùc nhau coù yù nghóa (P<0,05). Hình 4.4 – Aûnh höôûng cuûa vieäc boå sung chaát caûm öùng ñeán hoaït tính lipase thu nhaän töø moâi tröôøng baõ ñaäu naønh keát hôïp baõ mía Keát quaû phaân tích hoaït tính lipase cho thaáy 3 maãu khaùc nhau coù yù nghóa vaø daàu döøa laøm taêng hoaït tính cuûa enzyme nhieàu nhaát (81,076 IU/g). Khi boå sung daàu vaøo canh tröôøng nuoâi caáy, caùc phaân töû daàu beùo seõ phaân boá treân beà maët haït cô chaát vaø moät phaàn khueách taùn vaøo beân trong haït, laøm taêng khaû naêng tieáp xuùc vôùi khuaån ti dinh döôõng. Do ñoù, khaû naêng sinh toång hôïp lipase taêng maïnh. Vieäc söû duïng daàu döøa hieäu quaû hôn daàu naønh cho thaáy lipase coù tính ñaëc hieäu vôùi cô chaát. Beân caïnh ñoù, khi so saùnh vôùi maãu ñoái chöùng, chuùng toâi nhaän thaáy naám moác söû duïng haøm löôïng daàu trong baõ ñaäu naønh raát coøn haïn cheá. Nguyeân nhaân laø do khuaån ti dinh döôõng chæ coù theå söû duïng löôïng daàu ôû gaàn saùt beà maët haït. 4.5. Khaûo saùt thôøi gian nuoâi caáy ñeå thu nhaän lipase coù hoaït tính cao Vieäc boå sung baõ mía vaø daàu döøa coù theå aûnh höôûng ñeán toác ñoä sinh tröôûng cuûa naám moác. Vì vaäy, chuùng toâi khaûo saùt laïi thôøi gian nuoâi caáy ñeå choïn ra thôøi ñieåm thích hôïp ñeå thu nhaän lipase coù hoaït tính cao. Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vaø keát quaû phaân tích hoaït tính lipase ñöôïc theå hieän trong baûng 4.8 vaø 4.9. Baûng 4.8 – Thaønh phaàn moâi tröôøng trong bao PP khi khaûo saùt thôøi gian nuoâi caáy Thaønh phaàn Haøm löôïng Baõ ñaäu naønh 7 g Baõ mía 3,5 g Dung dòch boå sung 10 mL Haøm löôïng daàu döøa 0,15 g Dòch baøo töû 1 mL Baûng 4.9– Hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh vaø baõ mía coù boå sung daàu döøa Thôøi gian, giôø IU/g 30 46,180 ± 1,157 42 81,076 ± 2,332 60 61,200 ± 3,564 72 66,365 ± 0,899 84 55,035 ± 3,742 96 55,105 ± 0,348 Caùc giaù trò trong baûng theå hieän giaù trò trung bình ± ñoä leäch chuaån cuûa 3 maãu ñoäc laäp. Hình 4.5 – Hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi treân moâi tröôøng baõ ñaäu naønh vaø baõ mía coù boå sung daàu döøa Keát quaû phaân tích cho thaáy quy luaät bieán ñoåi hoaït tính lipase hoaøn toaøn töông ñoàng vôùi quy luaät chung maø chuùng toâi ñaõ ñeà caäp trong phaàn 4.1. Hoaït tính lipase taêng hôn gaáp ñoâi khi boå sung baõ mía vaø daàu döøa vaøo canh tröôøng taïi thôøi ñieåm 42 giôø. Ñaây laø thôøi gian toái öu ñeå nuoâi caáy chuûng naám moác Rhizopus treân moâi tröôøng naønh mía coù boå sung daàu döøa ñeå thu nhaän lipase (81,076 IU/g). Hình 4.6 – So saùnh hoaït tính lipase theo thôøi gian khi nuoâi trong ñieàu kieän khaûo saùt 4.6. Khaûo saùt haøm löôïng daàu döøa boå sung vaøo moâi tröôøng Sau khi ñaõ xaùc ñònh ñöôïc thôøi gian nuoâi caáy toái öu treân moâi tröôøng naønh mía, chuùng toâi tieáp tuïc khaûo saùt haøm löôïng daàu döøa toái öu cho hoaït tính lipase. Caùc giaù trò khaûo saùt bao goàm 0,5 ; 1,0 ; 1,5 ; 2,0 ; 2,5 ; 3,0% khoái löôïng moâi tröôøng. Tieán haønh song song moät maãu khoâng boå sung daàu ñeå ñoái chöùng. Thôøi gian nuoâi caáy laø 42 giôø. Keát quaû phaân tích theå hieän trong baûng 4.10. Baûng 4.10 – AÛnh höôûng haøm löôïng daàu döøa ñeán hoaït tính lipase Daàu döøa, % IU/g 0 63,146 0,5 116,762 1,0 101,571 1,5 81,076 2,0 106.095 2,5 105.857 3,0 116.762 Hình 4.7 – Aûnh höôûng haøm löôïng daàu döøa ñeán hoaït tính lipase Vieäc boå sung daàu döøa seõ laøm taêng khaû naêng sinh toång hôïp lipase. Nhöng haøm löôïng daàu quaù nhieàu treân beà maët haït cô chaát seõ gaây caûn trôû cho söï khueách taùn O2 vaøo beân trong haït, daãn ñeán vieäc laøm giaûm löôïng enzyme toång hôïp ñöôïc. Tuy nhieân, ñoái vôùi moâi tröôøng naønh mía chuùng toâi ñang khaûo saùt thì haøm löôïng mía chieám ñeán 50% khoái löôïng baõ ñaäu naønh neân theå tích moâi tröôøng taêng ñaùng keå. Do ñoù, aûnh höôûng cuûa haøm löôïng daàu döøa boå sung khaùc nhau laø khoâng roõ reät. Döïa vaøo ñoà thò, ta thaáy raèng hoaït tính lipase cao nhaát töông öùng vôùi haøm löôïng daàu döøa laø 0,5 vaø 3%. Vì vaäy chuùng toâi löïa choïn haøm löôïng daàu döøa ñeå boå sung vaøo moâi tröôøng naønh mía laø 0,5%. 4.7. Xaùc ñònh nhieät ñoä vaø pH toái öu cho phaûn öùng cuûa lipase Dòch enzyme thoâ cuûa maãu daàu döøa (baûng 4.7) coù hoaït tính luùc khaûo saùt laø 81,076 IU/g. Chuùng toâi tieán haønh xaùc ñònh pH vaø nhieät ñoä toái öu cho phaûn öùng cuûa enzyme trong maãu naøy. Ñeå xaùc ñònh pH toái öu, chuùng toâi thay ñoåi giaù trò pH cuûa dung dòch ñeäm boå sung vaøo hoãn hôïp phaûn öùng (3.3.1). Maãu ñoái chöùng coù pH = 7, nhieät ñoä phaûn öùng laø 35oC. Keát quaû khaûo saùt cho thaáy enzyme lipase coù pH toái öu laø 8,5. Hình 4.8 – Xaùc ñònh pH vaø nhieät ñoä toái öu cho phaûn öùng cuûa enzyme Ñeå xaùc ñònh nhieät ñoä phaûn öùng toái öu, chuùng toâi söû duïng giaù trò pH cuûa dung dòch ñeäm boå sung vaøo hoãn hôïp phaûn öùng laø 8,5. Söû duïng beå ñieàu nhieät, caùc maãu ñöôïc tieán haønh phaûn öùng taïi caùc nhieät ñoä khaùc nhau. Maãu ñoái chöùng coù nhieät ñoä phaûn öùng laø 35oC. Döïa vaøo ñoà thò, enzyme lipase coù nhieät ñoä toái öu laø 45oC. Chöông 5 Keát luaän vaø Ñeà nghò 5.1. KEÁT LUAÄN Vieäc thay ñoåi moâ hình nuoâi caáy baèng erlen sang moâ hình nuoâi caáy baèng bao PP ñaõ laøm taêng hoaït tính lipase thu nhaän ñöôïc töø chuûng naám moác Rhizopus sp. Beân caïnh ñoù, vieäc boå sung baõ mía vaø daàu döøa coøn laøm cho lipase ñaït hoaït tính cöïc ñaïi 116,762 IU/g chaát khoâ baõ ñaäu naønh chæ sau 42 giôø nuoâi caáy. Caùc keát quaû khaûo saùt ñöôïc nhö sau: Chuûng naám moác thích hôïp cho vieäc nuoâi caáy sinh toång hôïp lipase: Rhizopus sp. Thaønh phaàn moâi tröôøng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu trong moâ hình bao PP: Thaønh phaàn moâi tröôøng Haøm löôïng Ñieàu kieän nuoâi caáy Thoâng soá Baõ ñaäu naønh 7g Ñoä aåm ban ñaàu 52% Baõ mía 3,5g Nhieät ñoä nuoâi caáy 30oC Daàu döøa 0,05g Thôøi gian 42 giôø Dung dòch boå sung 10mL Dòch baøo töû 1mL Thaønh phaàn dung dòch boå sung (trong 100mL nöôùc caát): Thaønh phaàn Haøm löôïng (NH4)2SO4 4 g KH2PO4 2 g MgSO4.7H2O 0,6 g MnSO4.7H2O 0,2 g FeSO4.7H2O 0,1 g CuSO4.5H2O 0,1 g pH phaûn öùng toái öu: 8,5. Nhieät ñoä phaûn öùng toái öu: 45oC. 5.2. ÑEÀ NGHÒ Do nhöõng haïn cheá veà maët thôøi gian vaø kinh phí, chuùng toâi vaãn chöa theå khaûo saùt ñöôïc moät soá caùc yeáu toá nhö sau: AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán khaû naêng sinh toång hôïp lipase. AÛnh höôûng cuûa thaønh phaàn vaø haøm löôïng dung dòch khoaùng boå sung ñeán khaû naêng sinh toång hôïp lipase. Nghieân cöùu naâng caáp quy moâ moâ hình: taêng khoái löôïng canh tröôøng. Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän toái öu trong quy trình thu nhaän cheá phaåm lipase. Nghieân cöùu tinh saïch vaø baûo quaûn cheá phaåm. Nghieân cöùu öùng duïng cheá phaåm. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO [1] Nguyeãn Laân Duõng (chuû bieân), Vi sinh vaät hoïc, NXB Giaùo Duïc, 2003, 520. [2] Leâ Vaên Vieät Maãn, Laïi Mai Höông, Thí nghieäm vi sinh vaät hoïc thöïc phaåm, NXB Ñaïi hoïc Quoác gia TpHCM, 2006, 152. [3] Traàn Thò Thieäp, Nghieân cöùu thu nhaän enzyme lipase töø naám moác, Luaän vaên Toát nghieäp Ñaïi hoïc, Ñaïi hoïc Baùch Khoa Tp.HCM, 2007. [4] Hjorth A., Carriere E., Cudrey C., A structural domain (the lid) found in pancreatic lipases is absent in the guinea pig (phospholipase) lipase, Biochemistry, 32, 1993. [5] Weete J.D., Microbial Lipases, Food Lipids: Chemistry, Nutrition and Biotechnology, Marcel Dekker, Inc, USA, 2002. [6] Dugi K.A., Dechek H.L., Tally G.D., Brewer H.B., Santamaria-Fojo S., Human lipoprotein lipase: The loop covering the catalytic site is essential for interaction with substrates, J. Biol. Chem., 267:25086, 1992. [7] Clark S.B., Laboda H.L., Triolein-phosphatidylcholine cholesterol emulsions as substrates for lipoprotein and hepatic lipases, Lipids, 26:28, 1991. [8] Baba T., Downs D., Jackson K.W., Tang J., Wang C.S., Structure of human milk activated lipase, Biochemistry, 30:500, 1991. [9] Mukherjee K.D., Mills M.J., Lipases from plants, Lipases, Cambridge University Press, Cambridge, 1994, 49. [10] Sharma R., Chisti Y., Chand Banerjee U., Production, purification, characterization, and applications of lipases, Biotechnology Advances, 19, 2001, 627 – 662. [11] Scherer, L.J., Rossi, J.J., Approaches for the sequence-specific knockdown of mRNA, Nature Biotechnol., 21, 2003, 1457 – 1465. [12] Enfors, S.O., Control of proteolysis in fermentation of recombinant proteins, Trends Biotechnol., 10, 1992, 310 – 315. [13] Wickner, S., Maurizi, M.R., Gottesman, S., Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins, Science, 286, 1999, 1888 – 1893. [14] Henge, R., Bukau, B., Proteolysis in prokaryotes: protein quality control and regulatory principles, Mol. Microbiol., 49, 2003, 1541 – 1462. [15] Mitraki, A., Fane, B., Haase-Petigell, C., Sturtevant, J., King, J., Global suppression of protein folding defects and inclusion body formation, Science, 290, 1991, 54 – 58. [16] Jones, H.E., Holland, I.B., Campbell, A.K., Direct measurement of free Ca2+ shows different regulation of Ca2+ between the periplasm and the cytosol of Escherichia coli, Cell Calcium, 32, 2002, 183 – 192. [17] Wong D.W.S., Food Enzymes: Structure and Mechanism, Chapman & Hall, New York, 1995, 37 – 84. [18] Maruyama T., M. Nakajima, S. Ichikawa, H. Nabetani, S. Furusaki, M. Seki, Oil – Water Interfacial Activation of Lipase for Interesterification of Triglyceride and Fatty Acid, J. American Oil Chemist’s Society, Vol. 77, no. 11, 2000, 1121 – 1126. [19] David A. Mitchell, Nadia Krieger, Marin Berovic, Solid-State Fermentation Bioreactors: Fundamentals of Design and Operation, Springer Berlin Heidelberg, New York, 2006. [20] Susana R. Couto, M Aùngeles Sanromaùn, Application of solid-state fermentation to food industry – A review, Journal of Food Engineering, 76, 2006, 291 – 302. [21] Ikram ul-Haq, Shumaila Idrees, M. Ibrahim Rajoka, Production of lipases by Rhizopus oligosporous by solid-state fermentation, Process Biochemistry, 37, 2002, 637 – 641. [22] J. Cordova, M. Nemmaoui, M. Ismaili-Alaoui, A. Morin, S. Roussos, M. Raimbault, B. Benjilali, Lipase production by solid state fermentation of olive cake and sugar cane bagasse, Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 5, 1998, 75 – 78. [23] Alessandro D’Annibale, V. Brozzoli, S. Crognale, A.M. Gallo, F. Federici, M. Petruccioli, Optimisation by response surface methodology of fungal lipase production on olive mill wastewater, Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 81, 2006, 1586 – 1593. [24] J.A. Rodriguez, J.C. Mateos, J. Nungaray, V. G., T.B., S. Roussos, J. Cordova, J.Bratti, Improving lipase production by nutrient source modification using Rhizopus homothallicus cultured in solid state fermentation, Process Biochemistry, 41, 2006, 2264 – 2269. [25] Luciana A.I., Patrícia M.G., Geraldo S.A., Leda R.C., Denise M.G., Production and Regulation of Lipase Activity from Penicillium restrictum in Submerged and Solid-State Fermentation, Current Microbiology, 54, 2007, 361 – 365. [26] Andreas K.G., Annette L.P., Leda R.C., Denise M.G., Lipase production by Penicillium restrictum in solid-state fermentation using babassu oil cake as substrate, Process Biochemistry, 35, 1999, 85 – 90. [27] Nutan D.M., Ulka S.P., K.B., Jayant M.K., Digambar V.G., Production of acidic lipase by Aspergillus niger in solid-state fermentation, Process Biochemistry, 38, 2002, 715 – 721. [28] Nilkamal M., Anshu G., S.K. Khare, Production of protease and lipase by solvent tolerant Pseudomonas aeruginosa PseA in solid-state fermentation using Jatropha curcas seed cake as substrate, Bioresource Technology, 2007. [29] N.R. Kamini, J.G.S. Mala, R. Puvanakrishnan, Lipase production from Aspergillus niger by solid-state fermentation using gingelly oil cake, Process Biochemistry, 33, 1997, 505 – 511. [30] Freùdeùric Beisson, Ali Tiss, Claude Rivieøre, Robert Verger, Methods for lipase detection and assay: a critical review, Eur. J. Lipid Sci. Technol., 2000, 133 – 153. [31] Rajagopalan S., Modak JM, Modeling of heat and mass transfer for solid state fermentation process in tray bioreactor, Bioprocess Eng., 13, 1995, 161.