Luận văn Nghiên cứu thu nhận enzyme từ phế liệu cá

NHAÄN XEÙT CUÛA GIAÙO VIEÂN HÖÔÙNG DAÃN Ngaøy thaùng naêm Giaùo vieân höôùng daãn NHAÄN XEÙT CUÛA GIAÙO VIEÂN PHAÛN BIEÄN Ngaøy thaùng naêm Giaùo vieân phaûn bieän ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HOAÙ HOÏC LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYME TÖØ PHEÁ LIEÄU CAÙ SVTH : PHAÏM THÒ HOÀNG NGA MSSV : 60301761 CBHD : TS. TRAÀN BÍCH LAM BOÄ MOÂN KYÕ THUAÄT THÖÏC PHAÅM TP Hoà Chí Minh, 01/2008 Lôøi caûm ôn Ñeå hoaøn thaønh luaän vaên, toâi ñaõ nhaän ñöôïc söï giuùp ñôõ töø raát nhieàu phía. Tröôùc heát, toâi xin caûm ôn Boä moân Kyõ thuaät Thöïc phaåm, Khoa Kyõ thuaät Hoaù hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch khoa Tp HCM ñaõ taïo moâi tröôøng cho toâi hoïc taäp vaø nghieân cöùu trong thôøi gian thöïc hieän luaän vaên. Em xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh ñeán quí thaày coâ ñaõ truyeàn ñaït nhöõng kieán thöùc vaø kinh nghieäm laøm vieäc quyù baùu trong gaàn naêm naêm ngoài gheá giaûng ñöôøng. Em cuõng xin göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh vaø saâu saéc ñeán coâ Traàn Bích Lam ñaõ taän tình höôùng daãn vaø chæ baûo cho em trong thôøi gian laøm luaän vaên vöøa qua. Con xin caûm ôn ba meï ñaõ heát loøng yeâu thöông, chaêm soùc vaø coå vuõ tinh thaàn cho con. Cuoái cuøng toâi xin göûi loøng bieát ôn ñeán taát caû caùc baïn trong khoa ñaõ giuùp ñôõ toâi trong suoát thôøi gian laøm luaän vaên naøy. Ngaøy 5 thaùng 1 naêm 2008 Phaïm Thò Hoàng Nga Toùm taét luaän vaên Ñeà taøi “Nghieân cöùu thu nhaän enzyme töø pheá lieäu caù” nhaèm khaûo saùt hoaït tính cuûa caùc enzyme trong noäi taïng caù tra (Pangasius hypophthalmus) vaø nghieân cöùu thu nhaän cheá phaåm enzyme thoâ. Caùc soá lieäu thöïc nghieäm veà vieäc so saùnh giöõa maãu noäi taïng coù maät vaø boû maät cho thaáy ôû maãu coù maät hoaït tính rieâng cuûa enzyme amylase thaáp hôn; hoaït tính rieâng enzyme protease cao hôn; vaø hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase thì cao hôn maãu boû maät. Ñaùng chuù yù laø hoaït tính rieâng lipase cao neân vieäc thu nhaän cheá phaåm taäp trung theo höôùng toái öu hoùa ñieàu kieän trích ly enzyme naøy. Quaù trình trích ly tieán haønh ôû nhieät ñoä 300C; thôøi gian trích ly laø 2,5 h; pH dung moâi trích ly (dung dòch Na2CO3) laø 9; tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly laø 1 : 2,5 (theo khoái löôïng) thu ñöôïc dòch trích ly coù hoaït tính rieâng cuûa lipase cao nhaát 1,4257 µmol/h.mg. Söû duïng dung moâi keát tuûa laø ethanol vôùi tyû leä dòch trích ly vaø ethanol (theo theå tích) laø 50 : 50 cho tuûa coù hoaït tính rieâng cuûa lipase cao nhaát laø 7,5187 µmol/h.mg. Trong quaù trình baûo quaûn laïnh ñoâng, hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase giaûm theo haøm soá muõ (vôùi y laø hoaït tính rieâng lipase, x laø ngaøy baûo quaûn). MUÏC LUÏC TRANG BÌA I NHIEÄM VUÏ LUAÄN VAÊN DANH SAÙCH HÌNH VEÕ Hình 2.1. Caù tra 5 Hình 2.2. Moät soá enzyme trong heä tieâu hoùa cuûa ñoäng vaät 12 Hình 2.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa enzyme amylase. 13 Hình 2.4. AÛnh höôûng cuûa ketene leân hoaït tính cuûa enzym amylase. 13 Hình 2.5. Hoaït tính amylase ôû caù da trôn raêng nhoïn. 20 Hình 2.6. Hoaït tính protease ôû caù da trôn raêng nhoïn. 20 Hình 2.7. Hoaït tính cuûa enzyme heä tieâu hoùa cuûa caù da trôn ôû Brazin. 21 Hình 2.8. Sô ñoà thu nhaän enzyme baèng phöông phaùp taùch chieát vôùi aceton. 26 Hình 2.9. Sô ñoà taùch chieát enzyme baèng phöông phaùp keát tuûa baèng muoái (NH4)2SO4 27 Hình 3.1. Caáu taïo caù 46 Hình 4.1. Ñöôøng chuaån protein. 58 Hình 4.2. Ñöôøng chuaån tyrosin. 59 Hình 4.3. Söï taùch lôùp cuûa maãu sau trích ly thöïc hieän quaù trình ly taâm (1-lôùp baõ, 2-lôùp dòch trích ly, 3-lôùp môõ, 4-lôùp daàu). 61 Hình 4.4. Noàng ñoä protein trong maãu M vaø maãu BM. 62 Hình 4.5. So saùnh hoaït tính enzyme amylase cuûa maãu M, vaø maãu BM. 63 Hình 4.6. So saùnh hoaït tính enzyme protease cuûa maãu M, vaø maãu BM. 64 Hình 4.7. So saùnh hoaït tính enzyme lipase cuûa maãu M, vaø maãu BM. 65 Hình 4.8. So saùnh hoaït tính rieâng enzyme cuûa maãu M, vaø maãu BM. 67 Hình 4.9. Söï thay ñoåi hoaït tính protease kieàm ôû moät soá loaøi caù 68 Hình 4.10. AÛnh höôûng cuûa thôøi gian trích ly ñeán hoaït tính rieâng enzyme lipase. 70 Hình 4.11. AÛnh höôûng cuûa tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly ñeán hoaït tính rieâng enzyme lipase. 74 Hình 4.12. AÛnh höôûng cuûa pH dung moâi trích ly ñeán hoaït tính rieâng enzyme lipase. 77 Hình 4.13. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä trích ly ñeán hoaït tính rieâng enzyme. 80 Hình 4.14. AÛnh höôûng cuûa thôøi gian trích ly , tyû leä dung moâi trích ly vaø noäi taïng leân hoaït tính enzyme lipase. 84 Hình 4.15. AÛnh höôûng cuûa tyû leä dòch trích ly vaø ethanol leân noàng ñoä protein tan. 85 Hình 4.16. AÛnh höôûng cuûa tyû leä dòch trích ly vaø ethanol leân hoaït tính cuûa enzyme lipase. 86 Hình 4.17. AÛnh höôûng cuûa tyû leä dòch trích ly vaø ethanol leân hoaït tính rieâng cuûa enzyme lipase. 87 DANH SAÙCH BAÛNG BIEÅU Bảng 2.1. Thaønh phaàn thöùc aên trong ruoät caù tra ngoaøi töï nhieân 7 Bảng 2.2. Khoái löôïng caùc phaàn khaùc nhau cuûa caù tra. 7 Bảng 2.3. Löôïng enzyme cuûa tuyeán tuïy. 31 Bảng 4.1. Xaây döïng ñöôøng chuaån protein. 58 Bảng 4.2. Xaây döïng ñöôøng chuaån tyrosin. 59 Bảng 4.3. Noàng ñoä protein trong dòch trích ly cuûa maãu coù maät (M) vaø maãu boû maät (BM). 61 Bảng 4.4. Hoaït tính enzyme amylase trong noäi taïng caù, so saùnh giöõa maãu M vaø maãu BM. 63 Bảng 4.5. Hoaït tính enzyme protease trong noäi taïng caù, so saùnh giöõa maãu M vaø maãu BM. 64 Bảng 4.6. Hoaït tính enzyme lipase trong noäi taïng caù, so saùnh giöõa maãu M vaø maãu BM. 65 Bảng 4.7. Hoaït tính rieâng cuûa caùc enzyme trong noäi taïng caù, so saùnh giöõa maãu M vaø maãu BM. 66 Bảng 4.8. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo thôøi gian trích ly (t). 69 Bảng 4.9. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase (HTL) theo thôøi gian trích ly. 69 Bảng 4.10. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase (HTRL) theo thôøi gian trích ly. 70 Bảng 4.11. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly. 71 Bảng 4.12. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase theo tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly. 72 Bảng 4.13. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase theo tyû leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly. 73 Bảng 4.14. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo pH dung moâi trích ly. 75 Bảng 4.15. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase theo pH dung moâi trích ly. 76 Bảng 4.16. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase theo pH dung moâi trích ly. 77 Bảng 4.17. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo nhieät ñoä trích ly (T). 78 Bảng 4.18. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase theo nhieät ñoä trích ly. 79 Bảng 4.19. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase theo nhieät ñoä trích ly. 79 Bảng 4.20. Boá trí quy hoaïch thöïc nghieäm. 81 Bảng 4.21. Noàng ñoä protein. 81 Bảng 4.22. Hoaït tính lipase. 82 Bảng 4.23. Hoaït tính rieâng lipase. 82 Bảng 4.24. Ma traän quy hoaïch thöïc nghieäm 82 Bảng 4.25. YÙ nghóa cuûa caùc heä soá ñöôïc kieåm ñònh theo tieâu chuaån t. 83 Bảng 4.26. Söï thay ñoåi noàng ñoä protein theo tyû leä dòch trích ly vaø ethanol. 85 Bảng 4.27. Söï thay ñoåi hoaït tính lipase theo tyû leä dòch trích ly vaø ethanol. 86 Bảng 4.28. Söï thay ñoåi hoaït tính rieâng lipase theo tyû leä dòch trích ly vaø ethanol. 87 Lôøi môû ñaàu Haøng naêm, saûn löôïng khai thaùc thuûy haûi saûn treân theá giôùi ñaït tôùi haøng traêm trieäu taán, 50% trong soá ñoù ñöôïc duøng ñeå cheá bieán laøm thöùc aên cho con ngöôøi. Nhöng chæ khoaûng 30% cuûa saûn löôïng naøy thaät söï ñöôïc con ngöôøi tieâu thuï, phaàn coøn laïi laø pheá phuï phaåm [23]. Trong nhöõng naêm gaàn ñaây dieän tích vaø saûn löôïng nuoâi troàng thuûy saûn ôû nöôùc ta taêng cao, ñaëc bieät laø nuoâi caù tra vaø caù basa ñaït moät doanh thu ñaùng keå, ñem laïi nhieàu lôïi nhuaän cho caùc doanh nghieäp. Trong naêm 2006, saûn löôïng caù tra caû nöôùc taêng, ñaït hôn 1,5 trieäu taán . Saûn löôïng taêng cao thì moái quan taâm veà nguoàn pheá lieäu cuõng taêng cao. Theo thoáng keâ, moãi ngaøy caùc nhaø maùy cheá bieán tung ra thò tröôøng hôn 2000 taán pheá phuï phaåm goàm xöông, ñaàu, môõ, da caù...; trong ñoù noäi taïng chieám 12,04% veà khoái löôïng, khoaûng 240 taán. Phuï phaåm töø ngaønh coâng nghieäp cheá bieán caù bao goàm ñaàu, noäi taïng, da, vaây vaø xöông caù. Chuùng ñöôïc taän duïng ñeå cheá bieán boät caù, daàu caù vaø moät soá döôõng chaát coù giaù trò khaùc. Boät caù laø thöôøng duøng laøm thöùc aên gia suùc, gia caàm, trong khi daàu caù vaø caùc döôõng chaát khaùc coù nhöõng öùng duïng to lôùn trong nhieàu lónh vöïc khaùc nhau nhö coâng nghieäp thöïc phaåm, döôïc phaåm vaø y hoïc. Vì vaäy, vieäc taän thu phuï phaåm caù laø moät vieäc laøm ñuùng ñaén vaø caàn thieát nhaèm naâng cao hieäu quaû söû duïng nguoàn nguyeân lieäu cuõng nhö goùp phaàn giaûm thieåu nguoàn chaát thaûi töø ngaønh coâng nghieäp cheá bieán caù. Moät saûn phaåm thöông phaåm coù giaù trò cao trong noäi taïng caù chöa ñöôïc quan taâm ñoù laø enzyme tieâu hoùa cuûa caù goàm coù enzyme protease nhö pepsin, trypsin …, enzyme amylase, vaø enzyme lipase … , Neáu taän thu ñöôïc nguoàn nguyeân lieäu doài daøo vaø reû tieàn naøy seõ mang laïi moät giaù trò kinh teá lôùn ñoàng thôøi giaûm thieåu oâ nhieãm moâi tröôøng voán laø vaán ñeà böùc xuùc taïi caùc khu vöïc cheá bieán caù. Xuaát phaùt töø thöïc teá naøy chuùng toâi ñaõ tieán haønh thöïc hieän ñeà taøi “Nghieân cöùu thu nhaän enzyme töø pheá lieäu caù”. Trong khuoân khoå luaän vaên, chuùng toâi ñaõ tieán haønh nghieân cöùu caùc noäi dung sau: Khaûo saùt hoaït tính cuûa caùc enzyme trong noäi taïng caù tra (Pangasius hypophthalmus). Khaûo saùt caùc thoâng soá cuûa quaù trình trích ly enzyme. Toái öu hoùa quaù trình trích ly. Thu nhaän cheá phaåm enzyme thoâ. Toång quan Nguyeân lieäu Caù da trôn Phaân loaïi khoa hoïc Giới (regnum) : Animalia Ngaønh (phylum) : Chordata Lớp (class) : Actinopterygii Sieâu boä (superordo) : Ostariophysi Bộ (ordo) : Siluriformes Boä Caù da trôn hay boä Caù nheo (danh phaùp khoa hoïc: Siluriformes) laø moät boä caù raát ña daïng trong nhoùm caù xöông. Caùc loaøi caù trong boä naøy ña daïng veà kích thöôùc vaø caùch thöùc sinh soáng, goàm loaøi naëng nhaát nhö caù tra daàu (Pangasius gigas) ôû Ñoâng Nam AÙ, loaøi daøi nhaát nhö caù nheo chaâu AÂu (Silurus glanis), nhöõng loaøi chæ aên xaùc caùc sinh vaät cheát ôû lôùp nöôùc ñaùy, hay caùc loaøi caù kyù sinh nhoû beù nhö Vandellia cirrhosa. Veà caáu taïo noùi chung, chuùng khoâng coù vaûy, coù hoaëc khoâng coù taám xöông baûo veä, vaø chæ coù moät soá loaøi caù da trôn coù raâu. Caùc ñaëc tröng ñeå xaùc ñònh boä caù da trôn treân thöïc teá laø caùc ñaëc ñieåm chung cuûa hoäp soï vaø bong boùng. [38] Boä caù naøy coù taàm quan troïng kinh teá ñaùng keå; nhieàu loaøi ñöôïc nuoâi ôû quy moâ lôùn ñeå cung caáp caù thöïc phaåm, moät vaøi loaøi ñöôïc nuoâi thaû nhö laø caù caâu theå thao. Nhieàu loaøi caù nhoû, cuï theå laø caùc loaøi trong chi Corydoras, ñöôïc nuoâi laøm caù caûnh trong caùc beå caù. [38] Caù da trôn thuoäc veà sieâu boä goïi laø Ostariophysi. Taïi thôøi ñieåm naêm 2007, ngöôøi ta coâng nhaän khoaûng 36 hoï caù da trôn coøn toàn taïi vôùi khoaûng 3.023 loaøi. Ñieàu naøy laøm cho boä caù da trôn trôû thaønh boä ñoäng vaät coù xöông soáng ñöùng haøng thöù hai, thöù ba veà söï ña daïng; treân thöïc teá, khoaûng 1 treân 20 loaøi ñoäng vaät coù xöông soáng laø caù da trôn. Caù tra Phaân loaïi khoa hoïc [41] Boä caù da trôn : Siluriformes Hoï caù tra : Pangasiidae Gioáng caù tra daàu : Pangasius Loaøi caù tra : Pangasius hypophthalmus (Sauvage 1878) Hình 2.1. Caù tra Caù tra laø một trong soá 11 loaøi thuoäc hoï caù tra (Pangasiidae) ñaõ ñöôïc xaùc ñònh ôû soâng Cöûu long. Taøi lieäu phaân loaïi gaàn ñaây nhaát cuûa taùc giaû W.Rainboth xeáp caù tra naèm trong gioáng caù tra daàu. Caù tra daàu raát ít gaëp ôû nöôùc ta vaø coøn soáng soùt raát ít ôû Thaùi lan vaø Campuchia, ñaõ ñöôïc xeáp vaøo danh saùch caù caàn ñöôïc baûo veä nghieâm ngaët (saùch ñoû). Caù tra cuûa ta cuõng khaùc hoaøn toaøn vôùi loaøi caù nheo Myõ (Ictalurus punctatus) thuoäc hoï Ictaluridae. Phaân boá Caù tra phaân boá ôû löu vöïc soâng Meâ koâng, coù maët ôû caû 4 nöôùc Laøo, Vieät Nam, Campuchia vaø Thaùi lan. ÔÛ Thaùi Lan coøn gaëp caù tra ôû löu vöïc soâng Meâ koâng vaø Chao Phraya. ÔÛ nöôùc ta nhöõng naêm tröôùc ñaây khi chöa coù caù sinh saûn nhaân taïo, caù boät vaø caù tra gioáng ñöôïc vôùt treân soâng Tieàn vaø soâng Haäu. Caù tröôûng thaønh chæ thaáy trong ao nuoâi, raát ít gaëp trong töï nhieân ñòa phaän Vieät Nam, do caù coù taäp tính di cö ngöôïc doøng soâng Meâ koâng ñeå sinh soáng vaø tìm nôi sinh saûn töï nhieân. Khaûo saùt chu kyø di cö cuûa caù tra ôû ñòa phaän Campuchia cho thaáy caù ngöôïc doøng töø thaùng 10 ñeán thaùng 5 vaø di cö veà haï löu töø thaùng 5 ñeán thaùng 9 haøng naêm. Hình thaùi, sinh lyù Caù tra laø caù da trôn (khoâng vaåy), thaân daøi, löng xaùm ñen, buïng hôi baïc, mieäng roäng, coù 2 ñoâi raâu daøi. Caù tra soáng chuû yeáu trong nöôùc ngoït, coù theå soáng ñöôïc ôû vuøng nöôùc hôi lôï (noàng ñoä muoái 7-10 ), coù theå chòu ñöïng ñöôïc nöôùc pheøn vôùi pH>5, deã cheát ôû nhieät ñoä thaáp döôùi 15oC, nhöng chòu noùng tôùi 39 oC. Caù tra coù soá löôïng hoàng caàu trong maùu nhieàu hôn caùc loaøi caù khaùc. Caù coù cô quan hoâ haáp phuï vaø coøn coù theå hoâ haáp baèng boùng khí vaø da neân chòu ñöïng ñöôïc moâi tröôøng nöôùc thieáu oxy hoøa tan. Tieâu hao oxy vaø ngöôõng oxy cuûa caù tra thaáp hôn 3 laàn so vôùi caù meø traéng.[2] Caù tra coù ngöôõng oxi thaáp hôn caù basa (do caù basa khoâng coù cô quan hoâ haáp phuï), neân chòu ñöïng toát hôn caù basa ôû moâi tröôøng nöôùc coù haøm löôïng oxy hoøa tan thaáp. Nhìn chung caù tra chòu ñöïng ñöôïc vôùi moâi tröôøng khaéc nghieät hôn caù basa. Caù tra ôû ÑBSCL, chuùng soáng ôû soâng raïch, möông, ao, hoà vuøng nöôùc ngoït, soáng ôû thuyû vöïc nöôùc tónh vaø nöôùc chaûy. Caù cuõng soáng ñöôïc ôû nöôùc lôï vôùi noàng ñoä muoái thaáp. pH thích hôïp cho caù tra töø 6,5 – 8, caù coù theå soáng ñöôïc pH 4,5. Caù tra soáng ñöôïc ôû moâi tröôøng chaät heïp, nöôùc giaøu caùc chaát höõu cô, caù soáng ñöôïc ôû nôi coù oxi hoaø tan raát thaáp (coù khi baèng 0), caù tra coù cô quan hoâ haáp laø boùng khí, thôû ñöôïc khí trôøi. Nhieät ñoä thích hôïp cho caù tra 26 – 300C. Cô quan tieâu hoaù cuûa caù tra goàm mieäng, raêng haøm, gai mang, daï daøy to hình chöõ U, cô raát phaùt trieån. Tuùi maät lôùn, ruoät ngaén. Caù tra laø loaøi caù aên taïp, song coù nhieàu ñaëc ñieåm cuûa loaøi caù aên thòt, nhöng caù tra laø loaøi caù hieàn, chuùng khoâng ñuoåi baét moài, moài aên chuû yeáu laø nhöõng loaøi ñoäng vaät yeáu vaän ñoäng. Ñaëc ñieåm dinh döôõng: Caù tra khi heát noaõn hoaøng thì thích aên moài töôi soáng, vì vaäy chuùng aên thòt laãn nhau ngay trong beå aáp vaø chuùng vaãn tieáp tuïc aên nhau neáu caù öông khoâng ñöôïc cho aên ñaày ñuû, thaäm chí caù vôùt treân soâng vaãn thaáy chuùng aên nhau trong ñaùy vôùt caù boät. Ngoaøi ra khi khaûo saùt caù boät vôùt treân soâng, coøn thaáy trong daï daøy cuûa chuùng coù raát nhieàu phaàn cô theå vaø maét caù loaøi caù khaùc. Daï daøy cuûa caù phình to hình chöõ U vaø co giaõn ñöôïc, ruoät caù tra ngaén, khoâng gaáp khuùc leân nhau maø dính vaøo maøng treo ruoät ngay döôùi boùng khí vaø tuyeán sinh duïc. Daï daøy to vaø ruoät ngaén laø ñaëc ñieåm cuûa caù thieân veà aên thòt. Ngay khi vöøa heát noaõn hoaøng caù theå hieän roõ tính aên thòt vaø aên laãn nhau. Trong quaù trình öông nuoâi thaønh caù gioáng trong ao, chuùng aên caùc loaïi phuø du ñoäng vaät coù kích thöôùc vöøa côõ mieäng cuûa chuùng vaø caùc thöùc aên nhaân taïo. Khi caù lôùn theå hieän tính aên roäng, aên ñaùy vaø aên taïp thieân veà ñoäng vaät nhöng deã chuyeån ñoåi loaïi thöùc aên. Trong ñieàu kieän thieáu thöùc aên, caù coù theå söû duïng caùc loaïi thöùc aên baét buoäc khaùc nhö muøn baõ höõu cô, thöùc aên coù nguoàn goác ñoäng vaät. Trong ao nuoâi caù tra coù khaû naêng thích nghi vôùi nhieàu loaïi thöùc aên khaùc nhau nhö caùm, rau, ñoäng vaät ñaùy. Khi phaân tích thöùc aên trong ruoät caù ñaùnh baét ngoaøi töï nhieân, cho thaáy thaønh phaàn thöùc aên khaù ña daïng, trong ñoù caù tra aên taïp thieân veà ñoäng vaät.  Bảng 2.1. Thaønh phaàn thöùc aên trong ruoät caù tra ngoaøi töï nhieân  Caù tra  (Theo D.Menon vaø P.I.Cheko (1955)) Nhuyeãn theå 35,4% Caù nhoû 31,8% Coân truøng 18,2% Thöïc vaät döông ñaúng 10,7% Thöïc vaät ña baøo 1,6% Giaùp xaùc 2,3% Bảng 2.2. Khoái löôïng caùc phaàn khaùc nhau cuûa caù tra. Troïng löôïng caù (g) Thaønh phaàn (%) Fillet khoâng da Da Thòt buïng Môõ laù Noäi taïng Ñaàu, xöông, vaây, ñuoâi 550-700 755-845 850-950 980-1060 1105-1310 1356-1647 1695-1925 1985-2450 2570-2980 3050-3650 39.5 39.3 39.0 38.9 38.7 38.6 37.1 38.0 38.0 38.1 4.4 4.8 4.9 4.9 4.9 5.0 5.1 5.1 5.2 5.5 9.8 9.9 10.1 10.1 10.2 10.4 10.5 10.5 10.9 11.0 1.2 1.3 1.5 2.0 3.1 4.1 4.4 4.9 5.1 5.2 5.1 5.2 5.4 6.0 6.1 6.2 6.2 6.6 6.7 6.7 39.3 38.8 38.3 37.4 36.8 35.3 35.1 34.6 33.6 32.5 Trung bình 38.52 4.98 10.34 3.28 6.02 36.17 Tình hình saûn xuaát taïi Vieät Nam Vôùi tieàm naêng to lôùn, ÑBSCL coù dieän tích nuoâi thuûy saûn chieám 71,4%, saûn löôïng thuûy saûn chieám 69,86% vaø kim ngaïch xuaát khaåu maët haøng naøy chieám ñeán 61,4% so vôùi caû nöôùc. Noåi baät nhaát laø con caù tra ñang phaùt trieån nhanh trong nhöõng naêm gaàn ñaây. [40] Tính töø naêm 2006, saûn löôïng caù tra nuoâi ôû ÑBSCL ñaït 800.000 taán, xuaát khaåu ñöôïc 292.800 taán, thu veà kim ngaïch xuaát khaåu 773,64 trieäu USD, chieám 23,4% so vôùi xuaát khaåu thuûy saûn cuûa caû nöôùc. Trong 6 thaùng ñaàu naêm 2007, dieän tích nuoâi caù tra toaøn vuøng ÑBSCL ñaõ leân ñeán 3.642 ha, taêng 1.256 ha so vôùi naêm tröôùc. Töø ñoù, saûn löôïng caù tra ñaït 380.489 taán, khoái löôïng caù tra xuaát khaåu ñöôïc 173.100 taán, ñaït kim ngaïch xuaát khaåu 462,4 trieäu USD, taêng 32% veà löôïng vaø 38,9% kim ngaïch so vôùi cuøng kyø naêm 2006. Caù tra, ba sa cuûa Vieät Nam ñaõ ñöôïc xuaát khaåu sang 76 quoác gia vaø vuøng laõnh thoå, taêng 6 thò tröôøng so cuøng kyø. Ñaõ coù 209 doanh nghieäp cuûa Vieät Nam coù hoaït ñoäng xuaát khaåu caù tra, ba sa. Rieâng ÑBSCL naêm 2006 coù 136 nhaø maùy cheá bieán thuûy saûn, thì trong ñoù coù 70 nhaø maùy cheá bieán caù tra xuaát khaåu, coâng suaát 1,5 trieäu taán/naêm. Chæ taïi TP Caàn Thô cuõng ñaõ coù 15 nhaø maùy cheá bieán caù tra xuaát khaåu, coâng suaát cheá bieán khoaûng 400.000 taán caù tra nguyeân lieäu. Löôïng pheá lieäu vaø taän duïng pheá lieäu Löôïng pheá lieäu [43] Hieän nay, ÑBSCL ñang coù 70 nhaø maùy cheá bieán maët haøng phi-leâ caù tra vôùi khaû naêng tieâu thuï khoaûng 4000 taán nguyeân lieäu/ngaøy. Vôùi saûn löôïng naøy, moãi ngaøy caùc nhaø maùy cheá bieán tung ra thò tröôøng hôn 2000 taán xöông, ñaàu, môõ, da caù... Naêm 2006, vôùi 800.000 taán caù nguyeân lieäu ñöôïc ñöa vaøo cheá bieán, caùc nhaø maùy chæ thu ñöôïc chöa ñaày 300.000 taán phi-leâ vaø loaïi ra hôn 500.000 taán pheá phaåm. Naêm 2007, neáu saûn löôïng caù nguyeân lieäu ñaït 1 trieäu taán nhö döï baùo cuûa VASEP thì caùc nhaø maùy cheá bieán phaûi thaûi ra thò tröôøng hôn 600.000 taán pheá phaåm caù tra. Theo giôùi chuyeân moân, hieän nay moät kg phi-leâ caù xuaát khaåu coù giaù hôn 3 USD thì giaù caù tra maát phi-leâ chæ dao ñoäng ôû möùc töø 2.000 - 4.000 ñoàng/kg. Ñaây seõ laø moät nguoàn nguyeân lieäu cho caùc ngaønh coâng nghieäp taän duïng. Taän duïng pheá lieäu [44, 37] Caù tra sau khi laáy phi leâ xuaát khaåu thì phaàn coøn laïi goàm coù da caù, môõ caù, ñaàu, xöông, noäi taïng … Hieän nay chuùng ñaõ vaø ñang ñöôïc nghieân cöùu taän duïng gaàn nhö toaøn boä. Da caù ñang ñöôïc nghieân cöùu cheá bieán gelatin ñeå söû duïng trong ngaønh coâng nghieäp döôïc (laøm voû thuoác con nhoäng thay theá nguyeân lieäu da heo) vaø myõ phaåm. Môõ caù - chieám töø 15 - 20% troïng löôïng – ban ñaàu ñöôïc caùc cô sôû cheá bieán naáu thaønh môõ nöôùc cung öùng cho thò tröôøng, sau ñoù ñöôïc caùc doanh nghieäp nghieân cöùu ñeå saûn xuaát 2 loaïi daàu: loaïi nheï coù theå trích ly DHA (omega 3) söû duïng trong coâng ngheä döôïc phaåm, thöïc phaåm; loaïi naëng saûn xuaát daàu biodiesel söû duïng cho ñoäng cô. Phaûi nhìn nhaän laø vieäc nghieân cöùu saûn xuaát daàu biodiesel töø môõ caù coù trieån voïng raát lôùn, phuø hôïp vôùi xu theá thôøi ñaïi bôûi caøng ngaøy nguoàn nhieân lieäu hoaù thaïch (daàu moû, than ñaù...) caøng caïn kieät, nhu caàu söû duïng nhieân lieäu taùi taïo, khoâng gaây oâ nhieãm nhö daàu biodiesel laø raát lôùn. Theâm nöõa, ngheà nuoâi caù tra, basa ôû ÑBSCL ñang phaùt trieån maïnh neân nguoàn nguyeân lieäu phuïc vuï cheá bieán daàu biodiesel raát doài daøo, caùc quoác gia laân caän khoâng theå coù ñöôïc öu theá naøy. Ñaàu, xöông soáng, ruoät … cheá bieán thaønh thöùc aên coâng nghieäp phuïc vuï chaên nuoâi sau khi ñaõ naáu laáy môõ. Theo oâng Traàn Höõu Thích, giaùm ñoác  Coâng ty STECG, vôùi saûn löôïng nguyeân lieäu caù öôùc tính khoaûng 700.000 taán/naêm, nhöõng phuï phaåm cuûa coâng ngheä cheá bieán caù (ñaàu, vi, buïng, xöông) seõ leân ñeán  khoaûng 450.000 - 480.000 taán/naêm. Töø 480.000 taán phuï phaåm thoâ, chuùng ta coù theå laøm ra khoaûng 96.000 taán boät caù. Bong boùng caù baùn cho nhöõng ñaïi lyù chuyeân thu mua saáy khoâ cung caáp cho caùc nhaø haøng naáu suùp. Bao töû caù laøm saïch baùn cho caùc quaùn aên ñaëc saûn. Ngoaøi ra, con caù tra coøn moät nguoàn protein raát quan troïng maø laâu nay ngöôøi ta boû phí laø maùu caù. Moät soá coâng ty nghieân cöùu taän duïng nguoàn pheá lieäu: Taïi An Giang, Agifish laø coâng ty nghieân cöùu saûn xuaát thaønh coâng daàu biodiesel töø môõ caù tra, basa. Trong quy trình saûn xuaát coøn thu ñöôïc glycerol vaø muoái kali duøng saûn xuaát phaân boùn vaø môõ boâi trôn ñoäng cô. ÔÛ Phöôùc Thôùi, OÂ Moân (TP Caàn Thô), oâng Trònh Minh Tuù - giaùm ñoác coâng ty TNHH Minh Tuù cho bieát töø cuoái naêm 2004, coâng ty oâng ñaõ nghieân cöùu quy trình saûn xuaát biodiesel töø môõ caù, coù theå saûn xuaát 300 lít daàu biodiesel moãi giôø. Töø phuï phaåm thoâ, Coâng ty CP öùng duïng coâng ngheä thích hôïp (STECG J.S.C) laøm ra boät caù ñaït > 45o ñaïm, saûn xuaát ra môõ saïch, vaø ñaõ tieáp tuïc nghieân cöùu laøm ra caùc saûn phaåm coù giaù trò cao hôn nhö daàu biodiesel (giaù thaønh khoaûng 6.500ñ/l) hoaëc caùc chaát neàn duøng trong myõ phaåm, vaø ñang xem xeùt nghieân cöùu chieát suaát DHA töø môõ caù ñeå söû duïng trong cheá bieán thöïc phaåm vaø chaên nuoâi … Phaàn coøn laïi caù tra sau khi laáy phi leâ ñöôïc söû duïng haàu nhö toaøn boä, nhöng phaàn noäi taïng caù (ngoaïi tröø daï daøy) thì vaãn chöa ñöôïc nghieân cöùu söû duïng. Ñaây laø boä phaän tieâu hoùa chính cuûa caù tra, chöùa nhieàu enzyme tieâu hoùa, neân caàn thieát nghieân cöùu vaø taän thu nguoàn enzyme naøy. Enzyme heä tieâu hoùa Ñaëc ñieåm chung cuûa enzyme heä tieâu hoùa Söï tieâu hoùa thöùc aên ôû ñoäng vaät goàm chuû yeáu laø moät chuoãi nhöõng quaù trình hoùa sinh hoïc xaûy ra ôû mieäng, daï daøy, ruoät laøm giaûm kích thöôùc phaân töû vaø laøm hoøa tan caùc thaønh phaàn thöùc aên baèng caùc enzyme tieâu hoùa. [36,28] Thöïc phaåm cuûa chuùng ta bao goàm thaønh phaàn chính laø protein, cacbonhydrat, chaát beùo, nöôùc, khoaùng, vaø moät löôïng nhoû nhöõng nguyeân toá khaùc. Cô cheá chính xaùc cuûa söï tieâu hoùa chuùng (söï tieâu hoùa, haáp thuï, vaø söû duïng) raát phöùc taïp, vaø enzyme tieâu hoùa goùp phaàn caàn thieát vaøo trong quaù trình naøy. Moät vaøi enzyme tieâu hoùa: [15] Enzyme pepsin ñöôïc tieát daïng pepsinogen khoâng hoaït ñoäng trong moâi tröôøng HCl, noù ñöôïc hoaït hoùa thaønh pepsin. Pepsin taùc ñoäng leân caùc protein trong thöùc aên taïo chuoãi peptit ngaén chöùa khoaûng 4-12 axit amin. Enzyme trypsin ñöôïc baøi tieát döôùi daïng tieàn enzyme trypsinogen, tieàn enzyme naøy gaëp enzyme enterokinase cuûa ruoät thì bieán thaønh trypsin hoaït ñoäng (trypsinogen bò caét maát 6 ñoaïn peptit sau cuøng bieán thaønh trypsin). Trypsin laïi coù taùc duïng töï xuùc taùc. Enzyme chymotrypsin cuûa tuïy cuõng ñöôïc baøi tieát döôùi daïng tieàn enzyme chymotrypsinogen. Tieàn enzyme naøy gaëp trypsin seõ bieán thaønh chymotrypsin. Caû hai enzyme trypsin vaø chymotrypsin ñeàu coù taùc duïng gioáng nhau, töùc laø ôû moâi tröôøng coù ñoä pH gaàn baèng 8 thì hai men naøy thuûy phaân protein thaønh caùc loaïi peptit. Rieâng chymotrypsin coøn coù taùc duïng gaây ñoâng söõa. Trong phaàn treân cuûa taù traøng ñoä pH gaàn baèng 5 töùc laø khoâng thuaän lôïi laém cho taùc duïng cuûa trypsin vaø chymotrypsin ñoái vôùi protein, nhöng ôû ñoù hai enzyme naøy beàn vöõng hôn laø moâi tröôøng kieàm (moâi tröôøng kieàm deã laøm phaân huûy trypsin vaø chymotrypsin). Enzyme cacboxypeptidase coù taùc duïng caét caùc axit amin sau cuøng coù mang - COOH cuûa caùc chaát peptit. Enzyme aminopeptidase caét caùc axitamin coù mang -NH2 töï do ôû cuoái maïch cuûa caùc polipeptit. Enzyme lipase cuûa tuïy laø moät enzyme tieâu hoùa môõ raát maïnh. Taùc duïng cuûa lipase laø thuûy phaân môõ thaønh moät hoãn hôïp glyxerit vaø axit beùo (glyxerit ñôn giaûn: monoglyxerit). Enzyme amylase cuûa tuïy taùc ñoäng leân tinh boät gioáng nhö enzyme ptyalin cuûa nöôùc boït, nhöng taùc duïng cuûa men amylase tuïy maïnh hôn, vaø enzyme naøy coù theå tieâu hoùa tinh boät soáng. Cuõng nhö ptyalin nöôùc boït, amylase tuïy caàn coù nhieàu ion Cl- ñeå phaùt huy taùc duïng. Ñoä pH toái thieåu cho enzyme naøy laø 6,5 ñeán 7. Moät phaàn nhoû amilase tuïy baøi tieát ra ñöôïc chuyeån sang maùu, laøm cho maùu cuõng coù moät taùc duïng laø tieâu hoùa tinh boät. Enzyme mantase cuûa tuïy bieán mantose thaønh glucose. Enzyme nuclease cuûa tuïy phaân huûy caùc axit nucleic, giaûi phoùng nhöõng ñoaïn nucleotit ñôn giaûn. Söï saûn sinh enzyme heä tieâu hoùa Enzyme tieâu hoùa ñöôïc saûn sinh ra bôûi nhöõng tuyeán khaùc nhau nhö: tuyeán nöôùc boït, tuyeán trong daï daøy, tuïy taïng, vaø nhöõng tuyeán trong ruoät non. [16,17,18] Tuyeán nöôùc boït ôû ñoäng vaät coù vuù tieát ra enzyme α-amylase, giuùp thuûy phaân tinh boät. Enzyme ñöôïc tieát ra töø daï daøy goàm coù: pepsin. Töø tuyeán tuïy coù enzyme trypsin, chymotrypsin, amylase. Trong ruoät non thì coù enzyme lipase, maltase, isomaltase, lactase … Daï daøy Dòch daï daøy HCl Pepsinogen + Teá baøo ñænh Teá baøo vaùch Pepsin Tuïy taïng Dòch tuïy taïng Lipase Amylase Trypsin Chymotrypsin Aminopeptidase Carboxypeptidase Hình 2.2. Moät soá enzyme trong heä tieâu hoùa cuûa ñoäng vaät Nhöõng enzyme chính trong heä tieâu hoùa laø lipase, amylase, protease. Ñaëc ñieåm vaø tính chaát cuûa moät soá enzyme heä tieâu hoùa Enzyme amylase Amylase ñöôïc saûn xuaát bôûi tuïy ngoaïi tieát vaø tuyeán nöôùc boït ñeå tieâu hoùa tinh boät. Noù cuõng ñöôïc saûn xuaát bôûi nieâm maïc ruoät non, gan. [ 29, 25, 34] Enzyme amylase ôû maät vaø tuïy taïng caù coù nhieät ñoä toái öu laø 350C, pH toái öu laø 7,2. Noàng ñoä NaCl laø caàn thieát ñeå hoaït hoùa hoaøn toaøn amylase, ñoái vôùi caù cao hôn so vôùi ñoäng vaät coù vuù, vôùi amylase cuûa caù laø 0,5 N. Toác ñoä thuûy phaân tinh boät tyû leä nghòch vôùi noàng ñoä enzyme khi löôïng enzyme quaù lôùn. [16, 19] Nhöõng yeáu toá aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa enzyme amylase: thôøi gian thuûy phaân caøng daøi thì hoaït tính enzyme caøng giaûm, tæ leä giöõa enzyme vaø cô chaát, nhieät ñoä phaûn öùng, pH, noàng ñoä ion.[16, 19] Hình 2.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân hoaït tính cuûa enzyme amylase. Truïc tung: 200-T (phuùt). Vôùi T laø thôøi gian phaûn öùng ñeán khi dung dòch khoâng coøn cho maøu xanh vôùi thuoác thöû iot. x : amylase trong tuyeán nöôùc boït cuûa con ngöôøi; ∆ : amylase trong tuyeán tuïy cuûa ruøa nöôùc ngoït; °: amylase trong tuyeán tuïy cuûa caù moøi daàu. Döôùi cuøng ñieàu kieän phaûn öùng thì nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme amylase ôû tuyeán nöôùc boït cuûa ngöôøi cao hôn trong tuyeán tuïy cuûa ruøa bieån vaø caù moøi daàu. Nhöõng yeáu toá aûnh höôûng ñeán nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme amylase trong heä tieâu hoùa cuûa ñoäng vaät: tæ leä enzyme vaø cô chaát caøng cao thì nhieät ñoä toái öu caøng cao, thôøi gian thuûy phaân caøng laâu thì nhieät ñoä toái öu caøng thaáp. Hình 2.4. AÛnh höôûng cuûa ketene leân hoaït tính cuûa enzym amylase. Chaát voâ hoaït: [21, 22] Enzyme amylase bò voâ hoaït khi acetyl hoùa vôùi keten. Amylase bò voâ hoaït khi xöû lyù vôùi formaldehyde. Formaldehyte taùc duïng vôùi enzyme trong 30 phuùt ôû pH 8,2; nhieät ñoä 250C, vôùi noàng ñoä 1%. Ñaëc ñieåm vaø tính chaát cuûa enzyme amylase töø giun saùn kyù sinh treân heo [35] α-amylase (EC 3.2.1.1) ñöôïc taùch ra töø giun saùn Ascaris suum kyù sinh treân heo. Duøng phöông phaùp ñaúng ñieän ñeå loaïi moät daïng α-amylase ra khoûi cô vôùi pI 5, vaø 2 daïng ra khoûi ruoät vôùi pI 4.7 vaø 4.5. Khoái löôïng phaân töû cuûa isoenzyme trong ruoät laàn löôït laø 83 vaø 73 kDa, vaø enzyme amylase töø cô laø 59kDa. α-amylase töø ruoät coù pH toái öu laø 7,4 vaø töø cô coù pH toái öu laø 8,2. Enzyme töø cô chòu nhieät ñöôïc hôn enzyme töø ruoät. Caû amylase töø cô vaø töø ruoät ñeàu giaûm nöûa hoaït tính sau 15 phuùt töông öùng ôû 700C vaø 500C. Giaù trò Km: Amylase töø cô laø: 0,22 g/ml glycogen, vaø 3,33 g/ml tinh boät. Amylase töø ruoät laø: 1,77 g/ml glycogen, vaø 0,48 g/ml tinh boät. Caû hai ñeàu ñöôïc hoaït hoùa bôûi Ca2+, vaø bò öùc cheá bôûi EDTA, axit ioñoaxetic, p-chloromercuribenzoate, vaø chaát öùc cheá α-amylase töø boät mì. Khoâng coù söï khaùc nhau ñaùng keå veà tính chaát cuûa α-amylase ôû ñoäng vaät kyù sinh vaø vaät chuû cuûa noù. Enzyme protease [3] Trypsin: Trypsin coù trong dòch tuïy cuûa ngöôøi vaø ñoäng vaät. Trypsin ñöôïc Kiihne khaùm phaù vaø chieát taùch vaøo naêm 1884. Naêm 1931 Northrop vaø Knuzt thu ñöôïc trypsin vaø trypsinogen ôû daïng tinh theå. Trong cô theå sinh vaät, trypsin hoaït ñoäng trong moâi tröôøng kieàm ôû ruoät neân ñöôïc goïi laø protease kieàm tính. Vai troø cuûa trypsin laø tieáp tuïc thuûy phaân caùc protein coøn laïi sau khi ñaõ bò thuûy phaân moät phaàn ôû daï daøy. ÔÛ trong maùu cuõng coù moät ít trypsin hoaït ñoäng. Trong tuyeán tuïy, ñaàu tieân trypsin ñöôïc tieát ra ôû daïng khoâng hoaït ñoäng laø trypsinogen, sau ñoù trypsinogen ñöôïc chuyeån hoùa thaønh trypsin hoaït ñoäng döôùi taùc duïng cuûa enzyme ñöôøng ruoät enterokinase vaø bôûi chính trysin do noù coù taùc duïng töï xuùc taùc. Trypsin laø moät chuoãi polypeptide coù 249 axit amin, troïng löôïng phaân töû 22680-23400. pH toái öu cho hoaït ñoäng cuûa trypsin laø 8 vaø pH thích hôïp cuûa trypsin laø 7,8 – 9,5. Tuy nhieân hoaït tính cuûa dung dòch trypsin vaãn coù theå oån ñònh ôû pH 3 – 5. Caùc kim loaïi coù taùc duïng hoaït hoùa trypsin laø Ca, Co, Mn. Caùc kim loaïi coù taùc duïng öùc cheá laø Cu, Ag, Hg. Chymotrysin: Chymotrypsin laø moät protease ñöôïc tieát ra töø tuyeán tuïy. Ñaây laø moät protease kieàm tính quan troïng sau trypsin. Chymotrypsin ñöôïc thu nhaän ôû daïng tinh theå vaøo naêm 1933 bôûi Kunitz vaø Northrop. Chymotrypsin ñöôïc tuïy tieát ra döôùi daïng khoâng hoaït ñoäng ñoù laø chymotrypsinogen, sau ñoù chymotrypsinogen ñöôïc chuyeån sang daïng hoaït ñoäng laø chymotrypsin nhôø taùc duïng cuûa trypsin. Chymotrypsin ñöôïc caáu taïo töø 3 sôïi polypeptide: sôïi A (axit amin töø 1 -13), sôïi B (caùc axit amin töø 16 -146), sôïi C (axit amin töø 149-245). Caùc sôïi naøy lieân keát vôùi nhau bôûi caàu noái disulfite. Chymotrypsin laø moät protease hoaït ñoäng trong ñieàu kieän moâi tröôøng coù pH kieàm neân ñöôïc xeáp vaøo nhoùm protease kieàm tính töông töï nhö trypsin. Chymotrypsin hoaït ñoäng trong ñieàu kieän pH 7- 9 vaø pH toái öu laø 8-9, ñieåm ñaúng ñieän pI=5,4. pH 5 khoâng thuaän tieän cho hoaït ñoäng cuûa chymotrypsin nhöng ôû pH naøy chymotrypsin laïi beàn vöõng hôn trong moâi tröôøng pH 8 (moâi tröôøng kieàm deã laøm phaân huûy trypsin vaø chymotrypsin). Chymotrypsin laø moät chuoãi polypeptide coù 245 axit amin, troïng löôïng phaân töû 22500. Enzyme lipase [12, 14, 27, 11] Ñònh nghóa: Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3): laø enzyme xuùc taùc cho phaûn öùng thuûy phaân triacylglycerol (daàu thöïc vaät, môõ ñoäng vaät) taïo thaønh glixerin vaø axit beùo töông öùng. Lipase xuùc taùc phaûn öùng thuyû phaân laàn löôït töøng lieân keát - ester trong phaân töû chöù khoâng phaûi caét ñöùt caû 3 lieân keát ester cuøng luùc. Coù hoaït tính maïnh ñoái vôùi cô chaát khoâng tan trong nöôùc, theå hieän hoaït tính beà maët. Hoaït ñoäng maïnh trong heä nhuõ hoùa, ñaëc bieät laø heä nhuõ ñaûo (nöôùc trong daàu). Caáu truùc cuûa lipase töø ñoäng vaät : Caáu taïo lipase tuyeán tuïy töø ngöôøi goàm hai tieåu phaàn, phaàn lôùn hơn chứa ñuoâi N, phaàn nhoû hôn chứa ñuoâi C. Nhaân cuûa tieåu phaàn ñuoâi N hình thaønh bôûi 9 sôïi xeáp song song treân maët phaúng gaáp neáp β. Tieåu phaàn C hình thaønh bôûi hai lôùp maët phaúng khoâng song song. Tieåu phaàn N chöùa trung taâm hoaït ñoäng, lieân keát vôùi nhoùm glycosyl, lieân keát vôùi Ca2+ vaø coù theå lieân keát vôùi heparin. Trung taâm hoaït ñoäng bò che döôùi caùc voøng xoaén α maïch ngaén goïi laø caùc naép hay nuùt ñaäy. Tính chaát cuûa enzyme lipase: Lipase coù hoaït tính beà maët ôû phaân pha nöôùc – lipit vaø chæ thuûy phaân chaát beùo ñaõ nhuõ hoùa. Lipase coù theå thuûy phaân caû 3 lieân keát ester trong TAG hoaëc chæ thuûy phaân moät soá lieân keát ester nhaát ñònh giöõa goác – OH vaø caùc goác acyl trong phaân töû acyl lipit. Lipase tuyeán tuïy ñoäng vaät ñaëc hieäu vôùi goác acyl ôû vò trí 1, 3. Kích thöôùc cuûa gioït daàu trong heä nhuõ töông caùng nhoû thì toång dieän tích beà maët phaân pha daàu – nöôùc caøng lôùn daãn ñeán hoaït tính lipase caøng cao. Lipase coù nhieàu trong heä thoáng tieâu hoùa cuûa ñoäng vaät. Lipase trong tuïy heo ñöôïc nghieân cöùu ñaày ñuû nhaát. Noù coù MW 48kDa, khaû naêng thuûy phaân giaûm daàn trong daõy cô chaát: TAG > DAG > MAG. Phaân töû lipase tuyeán tuïy coù ñaàu kò nöôùc lieân keát vôùi gioït daàu, coøn taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme thì gaén vôùi phaân töû cô chaát, taïi taâm hoaït ñoäng coù caùc axit amin Ser, His, vaø Asp coù vai troø tham gia vaøo vieäc caét caùc lieân keát ester. Taâm hoaït ñoäng cuûa lipase coøn chöùa nhoùm Leucine coù taùc duïng taïo ra lieân keát kò nöôùc vôùi cô chaát lipit vaø ñaët cô chaát ñuùng vaøo vò trí taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Hoaït tính cuûa lipase ñöôïc taêng cöôøng bôûi ion Ca2+, caùc axit beùo töï do taïo ra seõ keát hôïp vôùi Ca2+ ñeå taïo thaønh muoái khoâng tan. Cô cheá taùc duïng cuûa lipase: Thoâng thöôøng, trong phaûn öùng coù xuùc taùc enzyme, nhôø söï taïo thaønh phöùc hôïp trung gian enzyme – cô chaát maø cô chaát được hoaït hoaù, bôûi leõ khi cô chaát keát hôïp vaøo enzyme do keát quaû cuûa söï cöïc hoùa, söï chuyeån dòch cuûa caùc electron vaø söï bieán daïng cuûa caùc lieân keát tham gia tröïc tieáp vaøo phaûn öùng daãn tôùi laøm thay ñoåi ñoäng naêng cuõng nhö theá naêng, keát quaû laøm cho phaân töû cô chaát trởø neân hoaït ñoäng hôn, nhôø ñoù tham gia phaûn öùng deã daøng. Quaù trình taïo thaønh phöùc enzyme – cô chaát (ES) vaø bieán ñoåi phöùc naøy thaønh saûn phaåm, giaûi phoùng enzyme töï do thöôøng traûi qua 3 giai ñoaïn : E + S ES P + E - Giai ñoaïn 1: Enzyme keát hôïp vôùi cô chaát baèng lieân keát yeáu taïo thaønh phöùc ES khoâng beàn, phaûn öùng naøy xaûy ra raát nhanh vaø ñoøi hoûi naêng löôïng hoaït hoaù thaáp. - Giai ñoaïn 2: Khi cô chaát taïo phöùc vôùi E seõ bò thay ñoåi caû caáu hình khoâng gian, caû veà möùc ñoä beàn vöõng cuûa caùc lieân keát. Keát quaû laø caùc lieân keát bò phaù vôõ. - Giai ñoaïn 3: taïo thaønh saûn phaåm coøn enzyme ñöôïc giaûi phoùng döôùi daïng töï do. Cô cheá taùc duïng cuûa lipase : taâm aùi nhaân cuûa lipase seõ töông taùc vôùi 1 trong 2 nguyeân töû tích ñieän döông cuûa lieân keát bò thuyû phaân. Söï taïo thaønh phöùc hôïp tröïc tieáp nhö theá vôùi trung taâm phaûn öùng seõ laøm cho söï ñöùt caùc lieân keát vaø söï thuyû phaân dc deã daøng thuaän lôïi. Moät cô cheá khaùc lieân heä tính taùc duïng cuûa enzyme vôùi söï khuyeát electron cuûa lieân leát bò thuyû phaân laø : Enzyme laøm taêng söï khuyeát electron voán ñaõ toàn taïi tröôùc ñoù, baèng caùch taïo thaønh lieân keát töông öùng vôùi cô chaát ôû nhöõng vò trí ít nhieàu gaàn guõi vôùi lieân keát bò thuyû phaân. Nhôø vaäy maø laøm cho söï phaân boá electron trong phaân töû cô chaát bò thay ñoåi theo 1 chieàu höôùng caàn thieát, khieán cho vieäc ñöùt lieân keát ñöôïc deã daøng hoaëc khieán cho 1 trong 2 nguyeân töû cuûa lieân keát töông taùc ñöôïc vôùi caùc taùc nhaân aùi nhaân. AB + H2O AOH + BH Döôùi taùc duïng cuûa enzyme lipase, khi hôïp chaát AB keát hôïp vôùi enzyme thì lieân keát A-B bò keùo caêng , keøm theo söï chuyeån dòch electron daãn ñeán laøm ñöùt lieân keát A-B vaø gaén nhoùm HO- cuûa nöôùc vaøo phaàn B cuûa phaân töû. Sau khi hoaøn thaønh phaûn öùng enzyme döôïc giaûi phoùng döôùi daïng töï do. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán tính chaát cuûa enzyme lipase Cô chaát Baùo caùo cuûa Ting vaø caùc ñoàng söï thì tyû leä daàu nöôùc laø 10/5 laø toái öu vôùi hieäu suaát thuûy phaân daàu naønh laø 48% vôùi lipase coá ñònh treân haït chitosan baèng phöông phaùp Binary. pH, nhieät ñoä: pH toái öu cho lipase coá ñònh treân haït chitosan laø 7-8 thì cho hieäu suaát phaûn öùng huûy phaân daàu naønh laø cao nhaát (Ting vaø ñoàng söï) Romija chieát xuaát trong dòch gan vaø tuïy taïng cuûa möïc (Sepiaofficinalis), baïch tuoäc (Eledne cierbosa) ñöôïc enzyme lipase xuùc taùc phaûn öùng thuyû phaân thaáy pH thích hôïp nhaát cuûa lipase dòch gan laø 6.0, coøn cuûa dòch tuïy taïng laø 6.4. Hykeo ñaõ laáy dòch ruoät caù vöôïc ( perca fluviatelis ) ñem thuyû phaân tributirin thì thaáy taùc duïng cuûa chuùng maïnh nhaát ôû 25–37oC, pH = 12.3 – 12.8. Caùc nhaø khoa hoïc Nhaät ñaõ duøng dòch tuî taïng cuûa toâm caøng (Squil-laoratoria) thuyû phaân methylacetat thấy chuùng hoaït ñoäng maïnh ôû 38oC, pH = 7.2 vôùi thôøi gian laø 15h. Chaát hoaït hoùa vaø öùc cheá: Canxi hoaït hoùa lipase trong phaûn öùng thuûy phaân theo ba cô cheá : Keát hôïp vôùi enzyme laøm thay ñoåi caáu truùc. Giuùp lipase deã daøng haáp thuï leân beà maët cô chaát-nöôùc. Khöû caùc axit beùo saûn phaåm cuûa phaûn öùng thuûy phaân giaûm khaû naêng öùc cheá cuûa axit vôùi enzyme. Moät vaøi cô chaát öùc cheá nhö : Caùc hôïp chaát beà maët coù chöùa anion Protein Ion kim loaïi Caùc hôïp chaát coù chöùa phospho nhö cabarmate, β-lactone… Chaát nhuõ hoùa Muoái maät nhuõ hoùa lipase töø tuyeán tuïy cuûa ngöôøi Nöôùc Nöôùc khoâng nhöõng laø moâi tröôøng ñeå khuyếch taùn enzyme vaø cô chaát maø coøn laø taùc nhaân tham gia vaøo phaûn öùng. Nöôùc coù aûnh höôûng khoâng nhöõng tôùi vaän toác maø caû ñeán chieàu höôùng cuûa phaûn öùng thuûy phaân bôûi enzyme. Noù cuõng laø 1 yeáu toá ñieàu chænh caùc phaûn öùng thuyû phaân bôûi enzyme, coù theå duøng laøm nhaân toá taêng cöôøng hay kìm haõm caùc phaûn öùng thuyû phaân coù enzyme xuùc taùc. Enzyme trong heä tieâu hoùa cuûa caù vaø hoaït ñoäng cuûa chuùng Hieän nay ngöôøi ta nghieân cöùu veà heä tieâu hoùa trong caù chuû yeáu ñeå khaûo saùt thoùi quen veà aên uoáng cuûa chuùng laø chính chöù khoâng nhaèm muïc ñích veà thu nhaän enzyme tieâu hoùa. Trong heä tieâu hoùa cuûa caù, moät teá baøo trong daï daøy coù theå saûn sinh caû HCl vaø enzyme. Ñieàu naøy traùi ngöôïc vôùi loaøi ñoäng vaät coù vuù, chuùng coù 2 loaïi teá baøo, moät saûn sinh HCl, moät saûn sinh enzyme. Söï saûn sinh axit ôû caù gioáng vôùi ñoäng vaät coù vuù: NaCl vaø H2CO3, taïo thaønh NaHCO3 vaø HCl. [39] Hai heä saûn xuaát enzyme chính laø giöõa ruoät – tuïy taïng, vaø thaønh ruoät. Caù da trôn: [28] Quaù trình tieâu hoùa cuï theå cuûa caù da trôn chöa ñöôïc nghieân cöùu roäng raõi, nhöng hoï cho raèng noù gioáng vôùi nhöõng ñoäng vaät coù caáu taïo daï daøy ñôn giaûn. Boä phaän tieâu hoùa cuûa caù da trôn goàm coù mieäng, hoïng , thöïc quaûn, daï daøy ruoät vaø nhöõng boä phaän khaùc nhö tuïy taïng, gan, vaø tuùi maät. pH trong daï daøy cuûa caù da trôn thì thay ñoåi trong khoaûng töø 2-4, pH trong ruoät thì töø 7-9. Enzyme tieâu hoùa coù trong ruoät goàm trypsin, chymotrypsin, lipase vaø amylase. Lipit laø moät nguoàn naêng löôïng ñaëc bieät toát cho caù da trôn. Tinh boät khoâng ñöôïc tieâu hoùa toát baèng lipit ôû caù da trôn, nhöng söï tieâu hoùa tinh boät ôû loaøi caù soáng ôû vuøng nöôùc aám thì cao hôn loaøi caù soáng ôû vuøng nöôùc laïnh. Caù da trôn raêng nhoïn [32] Söï phaân boá cuûa enzyme ôû loaøi caù da trôn raêng nhoïn: Hình 2.5. Hoaït tính amylase ôû caù da trôn raêng nhoïn. Hình 2.6. Hoaït tính protease ôû caù da trôn raêng nhoïn. Caù bôn sao: [10] Daï daøy coù khaû naêng thuûy phaân protein nhôø enzyme pepsin, chaát beùo vaø cacbonhydrat thì khoâng bò taán coâng ôû daï daøy. Trong ruoät, protein bò thuûy phaân nhieàu hôn nhôø enzyme trypsin vaø eresin. Gan vaø thaønh tuùi maät chöùa 1 löôïng ñaùng keå trypsin hôn so vôùi ruoät. Chaát beùo vaø cacbonhydrat ñöôïc thuûy phaân ôû trong ruoät, vì maøng nhaày ôû ruoät vaø maøng cuûa tuùi maät vaø caû gan chöùa lipase vaø amylase. Gan thì chöùa moät löôïng ñaùng keå lipase hôn laø maät vaø ruoät, nhöng lipase cuûa noù hoaït ñoäng beân trong teá baøo. Enzyme tieâu hoùa cuûa caù da trôn ôû Brazin (Pseudoplatystoma Coruscans). [26] Hình 2.7. Hoaït tính cuûa enzyme heä tieâu hoùa cuûa caù da trôn ôû Brazin. Hoaït tính enzyme ôû moät soá loaøi caù [16]: Hoaït tính lipase (xaùc ñònh theo phöông phaùp chuaån ñoä) ÖÙng duïng cuûa cheá phaåm enzyme heä tieâu hoùa Lipase töø tuïy heo ñöôïc öùng duïng trong coâng ngheä cheá bieán söõa, nhaèm taïo muøi vò vaø caáu truùc cho saûn phaåm.[3] Protease töø ñoäng vaät töø laâu cuõng ñöôïc öùng duïng vaøo coâng ngheä cheá bieán söõa. [3] Enzyme töø caù: Moät ñaëc tröng cuûa enzyme töø caù ñoù laø chuùng coù theå hoaït ñoäng ôû nhieät ñoä thaáp vaø pH töø trung tính ñeán kieàm trong khi enzyme töø ñoäng vaät treân caïn giaûm veà hoaït tính trong cuøng ñieàu kieän. Enzyme töø caù ñöôïc duøng trong saûn suaát caù, ñeå giuùp cho quaù trình loaïi boû da, vaûy, vaø maøng maø khi duøng caùch khaùc raát khoù khaên trong vieäc loaïi boû, ví duï nhö laø da caù thu, caù ñuoái … Chuùng coøn ñöôïc duøng trong saûn xuaát tröùng caù, thuûy phaân caû bao taûi tröùng caù, cho pheùp loaïi boû hôn 50% so vôùi chæ söû duïng phöông phaùp truyeàn thoáng taùch baèng truï quay. [9] Nhöõng ñaëc ñieåm ñaëc bieät cuûa enzyme töø caù laø voâ giaù cho moät soá quaù trình saûn xuaát. Pepsin töø caù tuyeát ñöôïc duøng ñeå ngaên ngöøa nhöõng muøi vò khoâng mong muoán phaùt trieån trong thôøi haïn söû duïng cuûa phoâ mai cöùng. Trypsin ñöôïc söû duïng ñeå khoâi phuïc maøu caroten cho pheá lieäu cuûa ñoäng vaät giaùp xaùc ñeå duøng trong thöùc aên cho ñoäng vaät döôùi nöôùc maëc duø vaãn coøn moät vaøi vaán ñeà veà kyõ thuaät. Enzyme töø caù coøn ñöôïc duøng trong vieäc nöôùng, laøm meàm thòt, saûn xuaát da, tröùng caù muoái, soát caù, vaø saûn xuaát muøi vò caù. [9] Nhöõng öùng duïng khaùc cuûa enzyme töø caù bao goàm vieäc saûn xuaát FPC (fish protein concentrate) duøng laøm nguoàn dinh döôõng boå sung vaøo thöùc aên cho ñoäng vaät soáng döôùi nöôùc ñeå hoã trôï cho vieäc tieâu hoùa. [9] ÔÛ Phaùp, enzyme töø caù ñöôïc söû duïng trong thöông maïi ñeå phuïc hoài nhöõng gia vò töø caù vaø ñoäng vaät coù voû. Veà cô baûn, nguyeân lieäu ñöôïc naáu chaûy ñeå coù theå loaïi ra khoûi xöông vaø voû vaø nhöõng nguyeân lieäu caàn thieát khaùc ñeå laøm gia vò coâ ñaëc. [9] Enzyme töø caù laø moät saûn phaåm thöông phaåm coù giaù trò . Loï trypsin töø caù tuyeát, 5g, trò giaù khoaûng £60. [9] Enzyme tieâu hoùa laø thuoác trôï tieâu hoùa: [42] Trong y hoïc, enzyme tieâu hoùa ñöôïc öùng duïng roäng raõi ñeå caûi thieän söï tieâu hoùa: chöõa trò nhöõng vaán ñeà lieân quan ñeán tieâu hoùa nhö chöùng ôï noùng, vieâm, loeùt daï daøy, beänh tró, taùo boùn, ung thö ruoät … Amylase tuyeán tuïy: [ 29, 25, 34] : Ñeán nay nhöõng öùng duïng laâm saøng cuûa amylase laø duøng ñeå phaùt hieän beänh vieâm tuïy, nhö daïng amylase tuyeán tuïy (p-amylase) ñöôïc duøng laøm test thöû ñôn, höõu hieäu nhaát trong chaån ñoaùn vieâm tuïy caáp tính. Amylase huyeát thanh cuõng ñöôïc öùng duïng laâm saøng roäng raõi ñeå phaùt hieän ra beänh vieâm tuïy caáp tính. Söï öùng duïng cuûa enzyme naøy coù ñoä chính xaùc laø 95%. Tuy nhieân, nhöôïc ñieåm cuûa noù laø tính ñaëc hieäu chæ 70-80%. Amylase tuyeán tuïy thì höõu duïng hôn amylase toång trong vieäc öôùc löôïng beänh nhaân vieâm tuïy caáp tính. Caùc phöông phaùp thu nhaän cheá phaåm enzyme [3] Phöông phaùp trích ly vaø keát tuûa baèng muoái Nguyeân taéc: muoái coù noàng ñoä cao coù taùc duïng vôùi phaân töû nöôùc bao quanh protein enzyme vaø laøm chuyeån hoùa ñieän tích, laøm thay ñoåi tính hoøa tan cuûa enzyme. Trong coâng nghieäp enzyme, ngöôøi ta thöôøng söû duïng muoái ammonium sulfate. Nhöôïc ñieåm cuûa noù laø tính aên moøn raát cao. Sau naøy ngöôøi ta thay theá baèng sodium sulfate, muoái naøy khoâng gaây hö hoûng thieát bò nhöng tính hoøa tan cuûa noù khoâng toát. Nhieät ñoä tieán haønh keát tuûa enzyme coù theå laø 35 – 400C nhöng ñeå traùnh khaû naêng laøm maát hoaït tính enzyme, ngöôøi ta thöôøng phaûi laøm laïnh dung dòch muoái vaø dung dòch enzyme tröôùc khi troän hai loaïi dung dòch naøy laïi vôùi nhau. Noàng ñoä toái öu cuûa muoái duøng trong keát tuûa enzyme seõ ñöôïc xaùc ñònh trong nhöõng thí nghieäm cuï theå. Khoaûng toái öu cuûa noàng ñoä muoái duøng trong keát tuûa enzyme raát roäng, khoaûng 20-80%. Phöông phaùp trích ly vaø keát tuûa enzyme baèng dung moâi höõu cô Dung moâi höõu cô coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán khaû naêng hoøa tan cuûa enzyme, aûnh höôûng solvat hoùa cuûa phaân töû nöôùc xung quanh phaân töû enzyme bò thay ñoåi, töông taùc giöõa enzyme seõ taêng leân. Nguyeân taéc: khi cho dung moâi höõu cô vaøo dung dòch enzyme seõ laøm giaûm khaû naêng hoøa tan cuûa nöôùc bao quanh enzyme. Hieän töôïng naøy xaûy ra laø do söï giaûm haèng soá ñieän ly cuûa dung moâi, ñaåy moät löôïng lôùn nöôùc. Caùc phaân töû nöôùc saép xeáp raát traät töï xung quanh caùc ñoaïn kî nöôùc treân beà maët enzyme coù theå ñöôïc thay theá baèng phaân töû cuûa dung moâi höõu cô. Töø ñoù laøm gia taêng ñoä hoøa tan cuûa chuùng. Caùc enzyme coù tính kî nöôùc maïnh seõ coù khaû naêng hoøa tan hoaøn toaøn trong dung moâi höõu cô. Nguyeân nhaân cô baûn cuûa söï quaàn hôïp protein enzyme coù theå do caùc löïc tónh ñieän, löïc Van der Waals (gioáng nhö ôû muoái). Töông taùc kî nöôùc trong tröôøng hôïp naøy khoâng coù yù nghóa lôùn, taïi ñieåm ñaúng ñieän thì söï keát tuûa dieãn ra toát nhaát, khi ñoù löôïng dung moâi söû duïng cho quaù trình tuûa laø ít nhaát. Trong coâng nghieäp saûn xuaát enzyme, ngöôøi ta thöôøng söû duïng ethanol vaø aceton ñeå keát tuûa enzyme. Khi tieán haønh keát tuûa enzyme baèng nhöõng dung moâi höõu cô thì caàn heát söùc löu yù ñeán nhieät ñoä. Do enzyme raát nhaïy caûm vôùi nhieät ñoä khi coù maët cuûa caùc chaát nhö ethanol hoaëc aceton, neân baét buoäc khi tieán haønh keát tuûa enzyme phaûi laøm laïnh caû dung moâi höõu cô vaø dung dòch enzyme. Möùc ñoä nhaïy caûm nhieät ñoä cuûa enzyme khi coù maët caùc dung moâi höõu cô thöôøng maïnh hôn möùc ñoä nhaïy caûm cuûa enzyme vôùi nhieät ñoä khi coù maët cuûa muoái voâ cô. Ngöôøi ta thöôøng tieán haønh keát tuûa enzyme baèng dung moâi höõu cô ôû nhieät ñoä töø 3-100C. Tyû leä vaø noàng ñoä caùc dung moâi höõu cô duøng ñeå keát tuûa enzyme ñöôïc xaùc ñònh baèng thöïc nghieäm cho töøng loaïi enzyme vaø töøng noàng ñoä enzyme coù trong dung dòch. Nhöôïc ñieåm: coù theå xaûy ra hieän töôïng bieán tính khoâng thuaän nghòch khi keát tuûa baèng dung moâi höõu cô. Nguyeân nhaân laø do, khi haèng soá ñieän moâi giaûm phaân töû protein coù theå töï thaùo gôõ vaø taïo thaønh daïng khoâng hoaït ñoäng, trong khi caùc goác kî nöôùc laïi tieáp xuùc vôùi dung moâi. Hieän töôïng naøy xaûy ra khi tieán haønh tuûa ôû nhieät ñoä phoøng, neáu thöïc hieän ôû nhieät ñoä 4-10oC khoâng thaáy xuaát hieän keát tinh enzyme. Trong quaù trình keát tuûa baèng dung moâi höõu cô taïo ra 1 nhieät löôïng lôùn coù theå laøm maát hoaït tính cuûa enzyme. Do ñoù dung dòch sau loïc cuøng dung moâi ñöôïc laøm laïnh tröôùc khi söû duïng vaø dung moâi phaûi ñöôïc cho töø töø vaø khuaáy lieân tuïc ñeå traùnh söï taêng nhieät ñoä cuïc boä beân trong hoãn hôïp ( t = 5-10’, trong luùc ñoù nhieät ñoä khoâng quaù 5oC ) Phöông phaùp söû duïng pH Protein laø chaát löôõng cöïc, chuùng coù caû nhoùm axit vaø nhoùm bazô. Möùc ñoä hoøa tan cuûa enzyme phuï thuoäc vaøo pH, möùc ñoä naøy laø toái thieåu khi chuùng ôû ñieåm ñaúng ñieän, phaàn lôùn protein coù ñieåm ñaúng ñieän ôû khoaûng axit, vì theá quaù trình naøy ñöôïc goïi laø keát tuûa axit. Keát tuûa enzyme ôû ñieåm ñaúng ñieän thöôøng ñöôïc thöïc hieän ôû quy moâ nhoû, chöù khoâng thöïc hieän ôû quy moâ coâng nghieäp. Thôøi gian taïo ñieåm ñaúng ñieän vaø thôøi gian löu ñeå taïo keát tuûa beàn vöõng thöôøng laøm thay ñoåi hoaït tính enzyme. Nhö vaäy, thieát bò phaûn öùng caøng lôùn, khaû naêng laøm thay ñoåi hoaït tính enzyme caøng lôùn. Khi ñoù, thôøi gian khuaáy troän vaø thôøi gian laéng keát tuûa caøng keùo daøi, enzyme caøng deã bò bieán tính. Caùc quy trình thu nhaän cheá phaåm enzyme Phöông phaùp taùch chieát enzyme vôùi aceton vaø röûa tuûa (2 laàn) baèng aceton Quaù trình trích ly thöïc hieän ôû 200C vôùi thôøi gian laø 3h vaø tyû leä nguyeân lieäu vaø dung dòch Na2CO3 1.2 % theo khoái löôïng laø 1 : 2. Quaù trình keát tuûa söû duïng dung moâi höõu cô laø aceton vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi laø 1 : 4, khuaáy trong 10 phuùt ñeå laéng 15 phuùt ôû nhieät ñoä laïnh. Saáy tuûa ôû 30-350C. Xöû lyù nguyeân lieäu, xay nhoû Nguyeân lieäu ñöôïc baûo quaûn ôû nhieät ñoä ñoâng ñaù Trích ly Na2CO3 1,2 % Tuûa thu laáy enzyme Ly taâm laáy tuûa (laàn 1) Röûa tuûa baèng aceton Ly taâm laáy tuûa (laàn 2) Saáy tuûa Nghieàn nhoû Cheá phaåm enzyme Aceton laïnh Hình 2.8. Sô ñoà thu nhaän enzyme baèng phöông phaùp taùch chieát vôùi aceton. Phöông phaùp taùch chieát enzyme baèng coàn Caùc giai ñoaïn taùch chieát vôùi coàn tuyeät ñoái vôùi nhöõng tyû leä 1:4, 1:5, 1:7 vaø coàn 96o töông töï nhö vôùi aceton nhöng thay aceton baèng coàn. Phöông phaùp taùch chieát enzyme keát tuûa baèng (NH4)2SO4 Tuïy heo baûo quaûn töôi Xöû lyù, vaø xay nhoû Trích ly laàn 1 Loïc laáy dung dòch Trích ly laàn 2 Loïc laáy dung dòch Keát tuûa Ly taâm laáy tuûa Saáy tuûa Nghieàn Cheá phaåm enzyme Nöôùc caát H2SO4 0,25N (NH4)2SO4 0,25 N Hình 2.9. Sô ñoà taùch chieát enzyme baèng phöông phaùp keát tuûa baèng muoái (NH4)2SO4 Trích ly laàn 1 vôùi nöôùc caát vôùi tæ leä nguyeân lieäu vaø dung moâi laø 1 : 1, ñeå töï phaân 6-8 h ôû 200C. Trích ly laàn 2 vôùi dung dòch H2SO4 0,25 , tyû leä nguyeân lieäu vaø dung moâi laø 2 : 1, pH 3,5-4, trích ly trong 1 h. Quaù trình keát tuûa thöïc hieän vôùi (NH4)2SO4 60-70%, vôùi tyû leä nguyeân lieäu vaø dungmoâi laø 1 : 2. Phöông phaùp thu nhaän enzyme thoâ baèng phöông phaùp saáy Laáy tuïy töôi ñaõ ñöôïc baûo quaûn, caân troïng löôïng vaø troän vôùi tinh boät moät löôïng baèng 10% so vôùi troïng löôïng tuïy töôi, tieáp theo saáy ôû nhöõng nhieät ñoä 50oC, 60oC, 70oC. Sau 1 thôøi gian saáy ôû nhöõng nhieät ñoä treân thì ta ñem xay nhuyeãn vaø ñöôïc cheá phaåm enzyme thoâ. Trong quaù trình ly taâm laáy tuûa, troän vôùi taù döôïc nhö lactose, glucose, hay tinh boät laø caùc chaát phuï gia coù tính chaát oån ñònh enzyme ñoàng thôøi ruùt ngaén thôøi gian saáy, haïn cheá söï giaûm hoaït tính enzyme trong khi saáy . Thöôøng saáy ôû chaân khoâng nhieät ñoä to = 45oC. Saáy khoâ : sau khi ly taâm thu phaàn keát tuûa, ñem saáy khoâ coù thoåi khí ôû nhieät ñoä 30 – 40oC hoaëc saáy chaân khoâng hay thieát bò saáy ñoâng khoâ. Ñeå traùnh bò maát hoaït tính ngöôøi ta trộïn theâm vaøo cheá phaåm enzyme caùc chaát ñoän nhö tinh boät hoaø tan, maltose dextrin trong quaù trình saáy. Phöông phaùp taùch vaø laøm saïch enzyme Gaàn ñaây öùng duïng caùc phöông phaùp môùi (ñieän di, saéc kyù trao ñoåi ion, loïc gel…) phoái hôïp vôùi caùc bieän phaùp thöôøng đñöôïc duøng tröôùc ñaây (bieán tính choïn loïc, keát tuûa phaân ñoaïn, saéc kyù haáp phuï) cho pheùp thu ñöôïc phaåm vaät cuûa nhieàu enzyme vôùi ñoä thuaàn khieát cao. Maëc duø trong vieäc xaây döïng phương phaùp môùi ñaõ ñaït ñöôïc nhieàu keát quaû, tuy nhieân vaán ñeà taùch laøm thuaàn khieát enzyme hieän nay vaãn coøn laø moät coâng taùc phöùc taïp, khoù khaên. Nguyeân nhaân chuû yeáu do moät maët enzyme coù trong teá baøo vôùi löôïng raát ít, maëc khaùc noù luoân coù ñoàng thôøi vôùi caùc protein khaùc cuõng coù caùc tính chaát lyù hoaù raát gioáng nhau, hôn nöõa enzyme laïi raát khoâng beàn, deã bò maát khaû naêng xuùc taùc do taùc ñoäng cuûa caùc yeáu toá beân ngoaøi. Trong dòch chieát, ngoaøi enzyme coøn chöùa caùc protein taïp vaø nhieàu chaát khaùc, ñeå loaïi boû chuùng phaûi söû duïng phoái hôïp nhieàu bieän phaùp khaùc nhau. Ñeå loaïi boû muoái vaø caùc taïp chaát coù phaân töû löôïng thaáp thöôøng duøng caùc bieän phaùp thaåm tích ñoái vôùi nöôùc hay ñoái vôùi caùc dung dòch ñeäm loaõng hoaëc baèng caùch loïc qua gel sephadex. Ñeå loaïi boû caùc protein taïp vaø caùc taïp chaát coù phaân töû löôïng cao khaùc, thöôøng duøng keát hôïp nhieàu bieän phaùp khaùc nhau: phöông phaùp bieán tính choïn loïc nhôø taùc duïng cuûa nhieät ñoä hoaëc pH cuûa moâi tröôøng, phöông phaùp keát tuûa phaân ñoaïn baèng muoái trung tính hoaëc caùc dung moâi höõu cô, caùc phöông phaùp saéc kyù (saéc kyù haáp phuï, saéc kyù trao ñoåi ion), ñieän di, phöông phaùp loïc gel. Phöông phaùp bieán tính choïn loïc nhôø taùc duïng cuûa nhieät ñoä hoaëc pH cuûa moâi tröôøng chæ duøng ñoái vôùi tröôøng hôïp cuûa caùc enzyme beàn nhieät hoaëc beàn axit. Dòch enzyme ñöôc giöõ ôû 50-70oC hay ôû pH = 5 hoaëc nhoû hôn trong thôøi gian xaùc ñònh sau ñoù protein taïp ñaõ bò bieán tính ñöôïc loaïi boû baèng caùch loïc hoaëc ly taâm. Phöông phaùp keát tuûa phaân ñoaïn baèng (NH4)2SO4 döïa treân cô sôû söï khaùc nhau veà khaû naêng keát tuûa cuûa caùc protein (enzyme) ôû moät noàng ñoä muoái (tính theo % noàng ñoä baõo hoaø) xaùc ñònh ñöôïc duøng phoå bieán ñeå loaïi boû böôùc ñaàu protein taïp cuûa caùc dòch enzyme. Cuõng coù theå keát tuûa phaân ñoaïn baèng caùc dung moâi höõu cô. Phöông phaùp naøy chæ duøng vôùi nhöõng enzyme ít bò bieán tính bôûi caùc dung moâi höõu cô ñöôïc choïn duøng. Ñeå giöõ cho enzyme khoûi bò maát khaû naêng hoaït ñoäng, quaù trình phaûi ñöôc thöïc hieän ôû nhieät ñoä thaáp (-5oC). Phöông phaùp haáp phuï choïn loïc – haáp phuï “trong theå tích” (theâm chaát haáp phuï tröïc tieáp vaøo dòch enzyme) hoaëc treân coät (saéc kyù haáp phuï) ñöôïc duøng phoå bieán trong vieäc taùch vaø laøm saïch enzyme. Chaát haáp phuï chuû yeáu thöôøng ñöôïc duøng laø hydroxyapatit cho hieäu quaû phaân taùch ñaëc bieät cao. Haáp phuï choïn loïc enzyme coù theå thöïc hieän baèng moät trong hai caùch: chaát haáp phuï protein taïp hoaëc haáp phuï enzyme. Quaù trình haáp phuï thöôøng ñöôïc tieán haønh ôû 0oC. Enzyme sau ñoù ñöôc chieát baèng caùc dung moâi thích hôïp. Phöông phaùp saéc kyù trao ñoåi ion döïa teân cô sôû phản ứng trao ñoåi ion giöõa protein đñöôïc tan trong nöôùc hoaëc dung dòch ñeäm loaõng vaø caùc taùc nhaân trao ñoåi ion. Taùc nhaân trao ñoåi ion coù theå laø nhöïa trao ñoåi ion hoaëc caùc daãn xuaát ester cuûa xelulloza (cacboxymetylxelluloza, dietylaminoetylxelluloza, trietylaminoetylxelluloza…). Phöông phaùp saéc kyù treân dietylaminoetylxelluloza (DEAE-xelluloza) coù öu ñieåm laø vôùi dòch chieát thích hôïp ngoaøi taïp chaát protein coøn coù khaû naêng loaïi boû caùc taïp chaát axit nucleic. Ñieàu ñoù cho pheùp khoâng caàn duøng ñeán caùc bieän phaùp nhaèm loaïi boû axit nucleic khoù vaø phöùc taïp nhö keát tuûa protamin hoaëc streptomixin sunfat thöôøng ñöôïc duøng tröôùc ñaây. Sephadex laø daãn xuaát cuûa polysacarit dextran trong ñoù caùc phaân töû cuûa chuùng lieân keát vôùi nhau bôûi caùc lieân keát ngang xuaát hieän nhôø taùc duïng cuûa epiclohidrin taïo thaønh “saøng phaân töû”. Soá lieân keát ngang taïo thaønh caøng nhieàu, kích thöôùc cuûa loã saøng phaân töû caøng nhoû. Khi loïc vaø chieát baèng dung moâi thích hôïp moät hoãn hôïp goàm nhieàu chaát treân coät sephadex, caùc chaát phaân töû coù kích thöôùc nhoû seõ khuyeách taùn vaøo beân trong caùc sephadex ñaõ ñöôc ngaâm trong dung dòch ñeäm, coøn caùc phaân töû chaát coù kích thöôùc lôùn hôn khoâng coù khaû naêng ñi vaøo caùc haït seõ ñöôc chieát nhanh khoûi coät. Vaäy cô sôû cuûa phöông phaùp loïc gel sephadex döïa vaøo söï khaùc nhau veà kích thöôùc, hình daïng vaø phaân töû löôïng cuûa caùc enzyme (12700-1000000) cho pheùp taùch vaø laøm saïch enzyme baèng phöông phaùp loïc gel sephadex laø phöông phaùp coù nhieàu trieån voïng. Khoâng coù phöông phaùp taùch laøm saïch chung cho caùc enzyme. Ñeå xaây döïng phöông phaùp taùch vaø laøm saïch moät enzyme naøo ñoù caàn bieát löïa choïn vaø phoái hôïp moät caùch coù hieäu quaû nhaát caùc bieän phaùp taùch vaø laøm saïch khaùc nhau. Moät soá cheá phaåm enzyme töø ñoäng vaät [3] Pancreatin: coù trong tuïy cuûa ñoäng vaät maùu noùng vaø ngöôøi ta thöôøng trích pancreatin töø tuïy taïng cuûa heo. Pancreatin laø heä enzyme thuûy phaân xuùc taùc caùc phaûn öùng chuyeån hoùa ñaïm ñöôøng, chaát beùo vaø moät soá chaát khaùc ôû trong heä tieâu hoùa. Caùc enzyme naøy goàm coù trypsin, chymotrypsin, elastase, colagenase, cacboxyl-peptidase A vaø B, aminopeptidase, amylase, lactase, saccharase, lipase, ribonuclease, desoxyribonuclease … Tyû leä enzyme naøy trong dòch tuïy khoâng thay ñoåi ngoaïi tröø vaøi tröôøng hôïp thieáu huït coù choïn loïc cuûa lipase vaø trypsinogen. 1 mg pancreatin coù khoaûng ≥ 25 ñôn vò hoaït tính protease, ≥ 25 ñôn vò hoaït tính amylase vaø ≥ 2 ñôn vò hoaït tính lipase. Bảng 2.3. Löôïng enzyme cuûa tuyeán tuïy. Stt Enzyme Löôïng enzyme tính theo phaàn traêm chaát khoâ cuûa tuyeán tuïy (ñaõ loaïi môõ) 1 Trypsinogen 5,0 2 Chymotrypsinogen 5,0 3 Amylase 5,0 4 Lipase 2,5 5 Ribonuclease 0,2 6 Desoxyribonuclease 0,004 Pancreatin ñöôïc thu nhaän baèng caùch xay nhuyeãn tuïy taïng coøn töôi, trích heát caùc chaát trong tuïy taïng vôùi nöôùc, loïc boû baõ roài hoøa chaát trích vôùi coàn ñeå baûo quaûn. Dòch trích naøy coù hoaït tính cao hôn boät. Boät pancreatin laø daïng voâ ñònh hình coù maøu xaùm nhaït hay vaøng nhaït, coù muøi vaø vò ñaëc tröng, hoøa tan trong nöôùc, khoâng tan trong coàn vaø chloroform. Pancreatic amylase: pancreatic amylase coù nhoùm (–SH) vì theá enzyme naøy raát deã bò bieán tính bôûi ion kim loaïi naëng. Khi coù maët ion closide hoaït tính maïnh nhaát cuûa chuùng ôû pH 7. Amylase töø tuyeán tuïy ñoäng vaät coù khoaûng pH toái öu laø 5,5-8,5 (6,0-7,0), khoaûng nhieät ñoä toái öu laø 40 – 450C, maát hoaït tính ôû 750C. Pancreatic protease: Trong coâng nghieäp saûn xuaát enzyme ngöôøi ta thöôøng saûn xuaát cheá phaåm hoãn hôïp giöõa trypsin vaø chymotrypsin. Cheá phaåm thöông maïi naøy ñöôïc saûn xuaát töø tuyeán tuïy. Trong cheá phaåm thöông maïi naøy coøn chöùa caû peptidase khaùc, enzyme amylase, lipase. Cheá phaåm hoãn hôïp naøy hoaït ñoäng maïnh ôû pH 8,5 - 9,0; nhieät ñoä töø 30 – 400C. Tuy nhieân ngöôøi ta chuõng coù theå söû duïng pH laø 7,5 vaø nhieät ñoä 45 – 500C ñeå thöïc hieän caùc phaûn öùng. Cheá phaåm hoãn hôïp beàn vöõng trong dung dòch ôû pH 3 – 5 . Neáu ñöa nhieät doä leân 900C ôû pH 6-8, cheá phaåm enzyme hoãn hôïp seõ bò maát hoaït tính. Khi cho 1-2 g CaCl2/l cheá phaåm enzyme hoãn hôïp vaø haøm löôïng cô chaát cao seõ laøm oån ñònh enzyme. Pancreatic lipase: Enzyme naøy thu nhaän töø tuyeán tuïy cuûa heo. Cheá phaåm enzyme coù chöùa caû esterase, protease, amylase, vaø caùc zymogen. Enzyme naøy tham gia phaân huûy triglyceride töï nhieân, daàu, chaát beùo, axit beùo ñôn giaûn vaø acyl ester. Caùc saûn phaåm lipase thöông maïi thöôøng troän ion calcium. Caùc ion calcium aûnh höôûng raát toát ñeán hoaït tính enzyme vaø tính beàn vöõng cuûa enzyme. Ion calcium taùc duïng ñeán hoaït tính vaø söï oån ñònh cuûa lipase phuï thuoäc vaøo NaCl coù trong cheá phaåm. Haøm löôïng ion calcium toái öu laø 0,5 g/l. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzyme Moät soá ñieåm caàn löu yù khi xaùc ñònh hoaït tính enzyme [3] Noàng ñoä cô chaát trong phaûn öùng phaûi ôû trong moät giôùi haïn thích hôïp ñuû thöøa ñeå baõo hoaø enzyme nhöng khoâng quaù cao ñeå ñeán möùc kìm haõm enzyme. Vôùi nhöõng enzyme caàn coù chaát hoaït hoaù hoaëc chaát laøm beàn thì phaûi cho caùc chaát naøy vaøo enzyme tröôùc khi cho cô chaát vaøo hoãn hôïp phaûn öùng. Xaùc ñònh hoaït ñoä caàn tieán haønh ôû pH thích hôïp vaø coá ñònh. Nhöng caàn phaûi chuù yù laø pH thích hôïp coù theå thay ñoåi khaù nhieàu tuøy thuoäc vaøo cô chaát vaø thaønh phaàn dung dòch ñeäm, löïc ion cuûa dung dòch ñeäm. Nhieät ñoä duøng ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä phaûi thaáp hôn nhieät ñoä toái öu cuûa enzyme ñeå ñeà phoøng taùc duïng kìm haõm enzyme do nhieät ñoä cao. Thôøi gian xaùc ñònh hoaït ñoä thöôøng töø 5 ñeán 30 phuùt. Trong moät soá tröôøng hôïp coù theå keùo daøi 24 giôø neáu hoaït tính cuûa enzyme quaù thaáp. Trong tröôøng hôïp ñoù caàn phaûi cho theâm vaøo dung dòch caùc chaát dieät vi sinh vaät vaø traùnh duøng nhöõng dung dòch ñeäm thuaän lôïi cho söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Enzyme amylase α – amylase deã daøng thuûy phaân tinh boät thaønh caùc dextrin khoâng cho maøu vôùi iot, coøn glucoseamylase laïi thuûy phaân tinh boät tôùi glucose vaø laøm thay ñoåi maøu vôùi iot chaäm, vì leõ trong dung dòch luoân coù moät löôïng nhoû dextrin phaân töû lôùn. Ñeå xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme amylase coù theå duøng moät trong caùc phöông phaùp sau: Ño söï bieán thieân ñoä nhôùt cuûa dung dòch baèng nhôùt keá khi cho amylase taùc duïng leân hoà tinh boät, khi ñoù caùc maïch phaân töû cô chaát bò caét ngaén, ñoä nhôùt dung dòch giaûm daàn. Phöông phaùp ño ñoä nhôùt cuûa Davison [18]. Ñoä nhôùt cuûa dung dòch phuï thuoäc vaøo kích thöôùc phaân töû cuûa heä phaân taùn. Khi caét phaân töû tinh boät thaønh nhöõng dextrin, ñoä nhôùt giaûm. Trong phöông phaùp naøy hoaït tính amylase ñöôïc xaùc ñònh laø löôïng enzyme laøm giaûm 20% ñoä nhôùt trong 60 phuùt, hoaëc 10% trong 19,2 phuùt, hoaëc 5% trong 8,4 phuùt. Do ñoù neáu nhö 0,2 ml dung dòch enzyme laøm giaûm ñeán 80% ñoä nhôùt ban ñaàu trong 20 phuùt thì dung dòch seõ chöùa 15 ñôn vò amylase (60/(20x0,2)) trong 1 ml. Ño maät ñoä quang cuûa dung dòch sau khi thöïc hieän phaûn öùng maøu vôùi iot. Khi coù amylase taùc duïng thì caùc saûn phaåm phaân giaûi cuûa tinh boät seõ cho maøu khaùc nhau ñoái vôùi iot. Phöông phaùp Wohlgemuth [19, 18, 17, 20] Phöông phaùp naøy döïa vaøo cuûa maøu xanh cuûa tinh boät vaø iot khi tinh boät bò thuûy phaân. Moät löôïng taêng daàn dung dòch enzyme ñöôïc cho vaøo moãi oáng nghieäm, vaø cho 5 ml dung dòch tinh boät 1% ñöôïc laøm laïnh vaøo moãi oáng. Taát caû sau ñoù ñöôïc cho ñoàng thôøi vaøo tuû aám trong moät khoaûng thôøi gian tuøy yù, sau ñoù chuùng ñöôïc laáy ra, cho nöôùc caát ñeán gaàn ñaày vaø nhoû 1 gioït iot 0,1 N cho moãi ml dung dòch vaøo moãi oáng nghieäm. Ñôn vò hoaït tính laø soá ml tinh boät 1% maø 1 ml enzyme chuyeån hoùa thaønh dextrin trong ñieàu kieän thí nghieäm cuï theå (thôøi gian , nhieät ñoä … ) Ño löôïng ñöôøng maltose hoaëc glucose taïo thaønh sau khi cho enzyme taùc duïng leân cô chaát. Hoaït tính amylase ñöôïc xaùc ñònh theo phöông phaùp Bernfield (1955), döïa vaøo söï giaûm haøm löôïng tinh boät vaø taêng haøm löôïng dextrin ñöôïc ño baèng axit 3, 5 dinitrosalisilic ôû 540 nm. Hoaït tính amylase ñöôïc xaùc ñònh laø soá mg maltose ñöôïc giaûi phoùng ra töø tinh boät bôûi 1 g vaät lieäu trong 3 phuùt ôû 350C vaø pH 6.9. [32, 13] Söï giaûm bôùt haøm löôïng Cu [18]: sau moãi 30 phuùt, maãu ñöôïc laáy ra khoûi dung dòch thuûy phaân vaø cho phaûn öùng vôùi dung dòch Fehling. Hoãn hôp ñöôïc cho vaøo beå ñieàu nhieät 1120C vaø ñeå chính xaùc 6 phuùt. Sau ñoù noù ñöôïc laáy ra vaø loïc. Keát tuûa ñöôïc röûa vôùi nöôùc caát ôû 600C, sau ñoù hoøa tan vaøo hoãn hôïp muoái saét amon sulfat vaø axit sulfuric 0,5M; vaø chuaån ñoä ngay vôùi dung dòch kali manganat 0,5 N. Löôïng ñöôøng bieán ñoåi coù theå ñöôïc tính toaùn töø giaù trò chuaån ñoä, vaø xaùc ñònh ñöôïc hoaït tính enzyme. Enzyme protease Northrop giôùi thieäu nhöõng phöông phaùp sau ñaây duøng ñeå xaùc ñònh hoaït tính protease. Gelatin, casein, albumin … ñöôïc duøng laøm cô chaát. [10] Söï thay ñoåi ñoä nhôùt. Cô chaát laø dung dòch gelatin 3% ñöôïc chænh pH 2,5 ñoái vôùi pepsin vaø pH 7,4 duøng photphat 0,05 M ñoái vôùi trypsin. 10 ml cô chaát ñöôïc cho vaøo nhôùt keá ñaët trong beå ñieàu nhieät 350C; cho 0,2-0,4 ml dòch chöùa enzyme vaøo khi gelatin taêng leân ñeán nhieät ñoä cuûa beå. Enzyme voâ hoaït ñöôïc cho vaøo moät heä thoáng töông töï ñeå laøm maãu ñoái chöùng. Döïa vaøo khoaûng thôøi gian, ñoä nhôùt cuûa heä thoáng ñöôïc xaùc ñònh. Moät ñôn vò hoaït tính enzyme ñöôïc xaùc ñònh laø löôïng enzyme caàn thieát ñeå laøm giaûm 20% ñoä nhôùt trong 60 phuùt, 10% trong 19,2 phuùt vaø 5% trong 8,4 phuùt. [16,10] Söï giaûm haøm löôïng nitô protein. Phöông phaùp cuûa Northrop söû duïng casein 2% laøm cô chaát. Protein ñöôïc laøm keát tuûa vaøo luùc ñaàu ôû maãu, vaø sau moät khoaûng thôøi gian thích hôïp, maãu phaûn öùng ñöôïc keát tuûa protein tröôùc baèng TCA. Xaùc ñònh haøm löôïng keát tuûa ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzyme. Vaø söï giaûm lieân keát peptide (chuaån ñoä formol) Peptone ñöôïc duøng laøm cô chaát. Moät gioït dung dòch phenoltalein 0,1% ñöôïc cho vaøo moãi ml dòch thuûy phaân vaø toaøn boä ñöôïc chuaån ñeán khi xuaát hieän maøu hoàng baèng dung dòch NaOH N/50 chöùa 1 gioït dung dòch phenoltalein trong 1 ml. 0,1 ml cuûa formal 40% ñöôïc theâm vaøo moãi ml dung dòch vaø dung dòch ñöôïc chuaån ñoä ñeán maøu töông töï luùc ñaàu. Ñeå thuaän tieän, vôùi moãi maãu ngöôøi ta tieán haønh moät caëp, caû hai ñöôïc ñöa ñeán cuøng moät maøu. Formol ñöôïc cho vaøo maãu thöù nhaát vaø ñöôïc chuaån ñeán maøu cuûa maãu thöù 2, cho formal vaøo maãu thöù 2 vaø chuaån ñeán maøu cuûa maãu thöù nhaát. Hoaït tính cuûa enzyme thuûy phaân protein ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp Anson caûi tieán (Chöông 3). Enzyme lipase [11] Enzyme thuyû phaân chaát beùo coù nhieäm vuï phaù vôõ caáu truùc chaát beùo beân trong caùc teá baøo cuûa nhöõng cô quan khaùc nhau cuõng nhö taïo ñieàu kieän cho söï di chuyeån cuûa lipit töø cô quan naøy sang cô quan khaùc. Moät khía caïnh quan troïng cuûa heä enzyme thuyû phaân chaát beùo laø chuùng chæ xuùc taùc cho caùc phaûn öùng lyù hoaù taïi beà maët tieáp xuùc giöõa hai pha beùo-nöôùc, nhôø cô cheá haáp phuï beà maët. ÔÛ nhöõng nöôùc coâng nghieäp phaùt trieån, caùc chaát beùo aên ñöôïc ñaõ coù maët trong böõa aên cuûa con ngöôøi, maø thaønh phaàn chuû yeáu laø triacylglycerols (TAGs) töø 100-150g moãi ngaøy, chieám khoaûng 30% naêng löôïng maø cô theå ñöa vaøo haøng ngaøy. Nhöõng phaân töû TAG khoâng theå töï ñi qua maøng ruoät ñöôïc. Moät chuoãi caùc phaûn öùng thuyû phaân vaø haáp thuï caàn xaûy ra ñeå giaûi phoùng hoaù naêng coù maët trong caùc maïch hydrocacbon cuûa TAG sinh vaät coù theå söû duïng ñöôïc. Enzyme lipase beân trong boä maùy tieâu hoùa ñoùng vai troø ñaëc bieät quan troïng trong vieäc cung caáp dinh döôõng cho cô theå con ngöôøi vaø nhöõng ñoäng vaät baäc cao. Caùc phöông phaùp duøng ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzyme lipase goàm coù phöông phaùp chuaån ñoä, quang phoå, saéc kyù, phoùng xaï, söùc caêng beà maët, ñuïc keá, ño ñoä daãn ñieän, hoaù hoïc mieãn dòch, hieån vi… Phaûn öùng thuyû phaân triacylglycerol ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme lipase coù theå ñöôïc vieát nhö sau: TAG = triacylglycerols DAG = diacylglycerols MAG = monoglycerols FFA = free fatty acids. Moät soá phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzyme: Söï bieán maát cuûa cô chaát Phöông phaùp ño ñoä ñuïc Trong moâi tröôøng raén : Phöông phaùp naøy söû duïng caùc chaát chæ thò maøu treân ñóa thaïch vôùi caùc ester carboxylic ñöôïc duøng laøm cô chaát, baûn chaát laø xaùc ñònh ñöôøng kính cuûa vuøng khuyeách taùn saûn phaåm. Söï phaân giaûi chaát beùo seõ laøm lan roäng vuøng saùng maøu treân ñóa thaïch. Hieän töôïng quang hoïc naøy quan saùt ñöôïc khi caùc acid beùo ñöôïc giaûi phoùng ra hoaø tan moät phaàn vaøo nöôùc. Quaù trình saùng maøu naøy laø keát quaû cuûa söï giaûm kích thöôùc cuûa caùc haït nhuõ bò thuyû phaân coù taùc duïng laøm giaûm aùnh saùng khuyeách taùn. Kyõ thuaät naøy cuõng coù theå ñöôïc aùp duïng trong quaù trình theo doõi söï thuyû phaân cuûa Tweens do caùc enzyme lipase khaùc nhau xuùc taùc. Trong moâi tröôøng loûng: Phöông phaùp naøy theo doõi söï giaûm ñoä haáp thuï cuûa nhuõ TAG theo thôøi gian. Kyõ thuaät naøy raát nhaïy vôùi nhöõng heä nhuõ, nhöng ñoái vôùi caùc heä nhuõ töï nhieân ví duï nhö huyeát töông chaúng haïn, thì söï coù maët cuûa nhieàu yeáu toá khaùc coù theå aûnh höôûng ñeán quaù trình. Vì vaäy, enzyme lipase thuaàn khieát ñöôïc söû duïng ñeå xaây döïng moät ñöôøng chuaån. Phöông phaùp ñóa Wilhelmy: Cô chaát laø nhöõng maøng film ñôn phaân töû thuaàn khieát: Trong soá caùc phöông phaùp xaùc ñònh söùc caêng beà maët thì kó thuaät maøng film ñôn phaân töû taïi beà maët tieáp xuùc cuûa khoâng khí -nöôùc ñaõ ñöôïc phaùt trieån roäng vaø ñöôïc nhoùm nghieân cöùu cuûa Freùderic Beisson, Claude Rivìere cuõng nhö nhoùm cuûa Brockman söû duïng. Kyõ thuaät naøy veà cô baûn goàm moät lôùp Teflon (lôùp choáng dính) phuû treân maùng, treân ñoù laø moät dung dòch. Moät baûn moûng Pt nhuùng trong beà maët cuûa pha nöôùc ñöôïc gaén lieàn vôùi moät electromicrobalance ñeå ño aùp suaát beà maët, ñeå xaùc ñònh söùc caêng beà maët. Phöông phaùp maøng film ñôn phaân töû thích hôïp ñeå nghieân cöùu nhöõng phaûn öùng enzyme treân chaát beùo maø ñöôïc phaân boá taïi beà maët tieáp xuùc khoâng khí-nöôùc. Phöông phaùp naøy coù ñoä nhaïy cao, vaø löông chaát beùo thaáp ñaùp öùng yeâu caàu ñeå thöïc hieän nhöõng pheùp ño ñoäng hoïc ñaùng tin caäy. Maøng film ñôn phaân töû ñöôïc troän laãn vôùi cô chaát: Haàu heát nhöõng nghieân cöùu ñoäng hoïc veà hoaït ñoäng cuûa enzyme thuyû phaân chaát beùo ñaõ ñöôïc thöïc hieän in vitro, duøng nhöõng chaát beùo thuaàn khieát laøm cô chaát. Thöïc teá, taát caû caùc maët phaân caùch cuûa sinh vaät ñeàu laø söï pha troän phöùc taïp cuûa hoãn hôïp goàm lipit vaø protein. Kyõ thuaät ñôn lôùp lyù töôûng thích hôïp cho vieäc nghieân cöùu kieåu hoaït ñoäng cuûa heä enzyme thuyû phaân chaát beùo taïi maët phaân caùch, söû duïng hoãn hôïp chaát beùo ñaõ ñöôïc ñieàu chænh. Coù 2 phöông phaùp töø hoãn hôïp chaát beùo taïo maøng ñôn lôùp taïi beà maët phaân pha khí-nöôùc, hoaëc baèng caùch phaân boá hoãn hôïp chaát beùo khoâng tan trong nöôùc vaøo moät dung moâi höõu cô deã bay hôi, hoaëc tieâm moät dung dòch nhuõ töông cuûa chaát taåy röûa vaøo trong pha nöôùc, ñöôïc bao phuû bôûi lôùp ñôn chaát beùo khoâng tan. Moät öùng duïng môùi cuûa maùng “ Zero-order ” ñöôïc ñeà xöôùng bôûi Píeroni vaø Verger cho vieäc nghieân cöùu söï thuyû phaân cuûa lôùp ñôn phaân töû hoãn hôïp ôû maät ñoä beà maët khoâng thay ñoåi vaø thaønh phaàn chaát beùo coá ñònh nhö sô ñoà bieåu dieãn trong hình Fig 1A. Maøng chaén baèng teflon ñöôïc ñaët ngang qua keânh nhoû cuûa maùng “ Zero-order“ ñeå ngaên truyeàn thoâng beà maët giöõa maøng chöùa ( reservoir ) vaø boä phaän phaûn öùng (reaction compartment). AÙp suaát beà maët ñöôïc xaùc ñònh roõ ñaàu tieân baèng caùch ñaët baûn Pt vaøo trong boä phaän phaûn öùng , nôi maø hoãn hôïp film ñöôïc phaân boá ôû aùp suaát yeâu caàu. AÙp suaát beà maët ñöôïc ño sau khi chuyeån baûn Pt tôùi maøng chöùa, nôi maø film cô chaát thuaàn khieát ñöôïc phaân boá tieáp sau. AÙp suaát beà maët cuûa maøng chöùa baèng vôùi aùp suaát beà maët cuûa boä phaän phaûn öùng baèng vieäc di chuyeån lôùp maøng chaén di ñoäng. Maøng chaén giöõa 2 boä phaän ñöôïc chuyeån dòch cho pheùp nhöõng beà maët tieáp xuùc vôùi nhau vaø enzyme ñöôïc tieâm vaøo trong boä phaän phaûn öùng vaø keát quaû ñoäng hoïc ñöôïc ghi cheùp nhö moâ taû. Lieân keát beà maët vaø söï phuïc hoài lôùp: Baèng caùch söû duïng kyõ thuaät lôùp ñôn phaân töû, nhieàu nhaø nghieân cöùu ñaõ baùo caùo raèng giaù trò toái öu xaûy ra ôû moái töông quan giöõa vaän toác vaø aùp suaát beà maët. Giaù trò chính xaùc cuûa ñieåm toái öu bieán ñoåi tuyø theo söï keát hôïp giöõa enzyme vaø cô chaát ñöôïc söû duïng. Moät caùch giaûi thích hôïp lyù ñaõ ñöôïc ñöa ra ñeå giaûi thích hieän töôïng naøy laø: Giaû thuyeát ñaàu tieân, ñöôïc ñeà nghò bôûi Hughes vaø nhöõng ngöôøi laøm vieäc thuoäc theá heä sau oâng: Söï ñònh höôùng phuï thuoäc maøng bao cuûa cô chaát coù leõ laø moät trong nhöõng nhaân toá ñieàu hoøa maø quaù trình phaân giaûi chaát beùo phuï thuoäc. Söû duïng nhöõng enzyme ñaõ ñöôïc ñaùnh daáu phoùng xaï, Verger vaø Pattus ñaõ thieát laäp raèng giaù trò cöïc ñaïi ñöôïc quan saùt cuûa söï töông quan giöõa vaän toác vaø aùp suaát beà maët seõ bieán maát töông quan vôùi söï gia taêng tính hoaït ñoäng beà maët cuûa enzyme. Thaät vaäy, söï khaùc bieät chính giöõa lôùp ñôn vaø khoái lôùn (bulk system) naèm ôû khu vöïc beà maët giao tieáp vaø tyû leä theå tích, chuùng khaùc nhau bôûi nhieàu traät töï saép xeáp ôû heä thoáng ñôn lôùp, tyû leä naøy thöôøng laø 1 cm-1, phuï thuoäc vaøo ñoä saâu cuûa caùi maùng. Trong khi ñoù, ôû khoái lôùn tyû leä naøy coù theå cao khoaûng 10-5 cm-1, phuï thuoäc vaøo löôïng lipit söû duïng vaø traïng thaùi cuûa söï phaân giaûi lipit. Keát quaû laø ôû tröôøng hôïp cuûa khoái lôùn söï haáp phuï haàu heát caùc enzyme xuaát hieän taïi beà maët giao tieáp, trong khi ôû lôùp ñôn chæ coù 1 phaân töû enzyme trong haøng traêm caùc enzyme coù theå xuaát hieän taïi beà maët giao tieáp. Vì ôû tình traïng naøy, moät löôïng nhoû khoâng xaùc ñònh aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán toác ñoä thuyû phaân ñöôïc haáp phuï treân lôùp ñôn. Ñeå khaéc phuïc söï giôùi haïn naøy thì nhieàu phöông phaùp ñaõ ñöôïc ñeà ra ñeå phuïc hoài vaø ño löôïng enzyme ñaõ ñöôïc haáp phuï taïi beà maët giao tieáp. Sau khi ño toác ñoä, Momsen vaø Brockman ñaõ chuyeån lôùp ñôn ñeán 1 maåu giaáy kî nöôùc vaø nhöõng enzyme ñöôïc haáp phuï sau ñoù ñöôïc phaân tích baèng phöông phaùp chuaån ñoä. Sau khi so saùnh vôùi toác ñoä cuûa maãu traéng vaø pha mang, soá löôïng cuûa nhöõng enzyme ñöôïc haáp phuï seõ ñöôïc tính toaùn töø vaän toác cuûa maïng löôùi vaø hoaït ñoäng cuûa nhöõng enzyme ñaëc hieäu. Trong baûng phaân tích nhöõng enzyme hoaït ñoäng phoùng xaï, maøng film ñöôïc huùt ra baèng caùch loàng nhöõng ñaùy cuûa oáng mao quaûn thuyû tinh cong vaøo trong chaát loûng vaø noåi leân treân ñænh cuûa moät phaàn thaønh Teflon. Khi nhöõng phaân töû enzyme ñöôïc ñaùnh daáu phoùng xaï tan trong pha mang seõ bò huùt ra cuøng vôùi nhöõng thaønh phaàn ñi keøm vôùi maøng film. Keát quaû seõ ñöôïc kieåm tra döïa treân söï hoaït ñoäng phoùng xaï trong cuøng moät theå tích cuûa pha mang ñöôïc huùt ra. Söï khaùc bieät giöõa 2 giaù trò thöïc söï ñaõ phaûn aùnh ñöôïc hoaït ñoäng phoùng xaï vöôït möùc toàn taïi ôû beà maët tieáp xuùc, ñöôïc quy cho phaân töû enzyme coù lieân keát vôùi maøng film. Bôûi vì coù theå söû duïng kyõ thuaät lôùp ñôn ñeå ño toác ñoä phaûn öùng ñöôïc theå hieän baèng ñôn vò mol.cm-2.min-1 vaø söï vöôït möùc cuûa enzyme ôû beà maët baèng ñôn vò mg.cm-2. Ta deã daøng ñaït ñöôïc giaù trò hoaït ñoäng ñaëc hieäu cuûa enzyme thöôøng ñöôïc ño baèng ñôn vò laø mol.min-1.mg-1( IU.mg-1). Baèng caùch keát hôïp ñoàng thôøi 2 kó thuaät ELISA vaø kó thuaät lôùp ñôn phaân töû, ta coù theå ño ñöôïc hoaït tính cuûa enzyme lipase trong ñöôøng ruoät cuûa ngöôøi (HGL-Human gastric lipase). Treân lôùp maøng 1,2 didecanoyl-sn-glycerol (lôùp dicaprin) vaø cuõng coù theå xaùc ñònh ñöôïc söï vöôït möùc cuûa enzyme beà maët töông öùng. Moät löôïng HGL luaân chuyeån seõ gia taêng moät caùch oån ñònh vôùi maøng bao lipit. Nhöõng hoaït tính ñaëc hieäu ñöôïc xaùc ñònh treân lôùp dicaprin taïi 35mN.m-1 ñaõ ñöôïc tìm thaáy ôû cuøng moät möùc ñoä giaù trò khi ñöôïc ño döôùi ñieàu kieän phaân tích khoái lôùn toái öu, söû duïng cô chaát laø chaát nhuõ hoaù tributyrin (lieàu löôïng laø 1000IU cho 1mg enzyme). Taïi moät noàng ñoä lipase cho tröôùc trong pha mang nöôùc, söï lieân keát beà maët cuûa caùc HGL vôùi lôùp maøng phosphatidylcholine öa beùo cuûa loøng ñoû tröùng ñaõ ñöôïc nhaän ra raèng chaäm hôn 10 laàn so vôùi tröôøng hôïp cuûa lôùp maøng dicaprin. Tuy nhieân, chuùng ta phaûi löu yù raèng nhöõng phaân töû enzyme ñöôïc lieân keát beà maët khoâng chæ bao goàm nhöõng enzyme ñoù (laø nhöõng enzyme lieân quan tröïc tieáp ñeán söï xuùc taùc) maø coøn moät löôïng protein khoâng ñoaùn ñöôïc (ñöôïc haáp phuï leân lôùp ñôn). Nhöõng enzyme naøy khoâng lieân quan ñeán söï thuyû phaân enzyme cuûa lôùp. Phöông phaùp hieån vi löïc nguyeân töû (Atomic force microscopy): Ñeå theo doõi ñoäng hoïc cuûa söï thuyû phaân cuûa maøng phospholipids keùp baèng phospholipase A2, Nielsen ñaõ laøm moät thí nghieäm söû duïng phöông phaùp hieån vi löïc nguyeân töû (AFM) trong moâi tröôøng chaát loûng. Theo nhöõng nghieân cöùu naøy thì söï thuyû phaân enzyme cuûa maøng acylglycerols / phospholipids keùp baèng enzyme Humicola lanuginosa lipase (HLL) cuõng ñaõ ñöôïc nghieân cöùu baèng phöông phaùp AFM. Maøng lipit keùp cuûng coá bôûi Mica bò thuyû phaân bôûi HLL vaø vì saûn phaåm hoaø tan trong dung dòch ñeäm, caùc khu vöïc bò khoeùt saâu cuûa maøng keùp seõ bò phaùt hieän ra bôûi ñænh AFM. Chuùng ta seõ coù ñöôïc nhöõng hình aûnh thôøi gian thöïc cuûa söï thuyû phaân xuaát hieän ôû lôùp maøng keùp vaø seõ phaân tích chuùng baèng phaàn meàm ñaõ ñöôïc thieát laäp saün. Nhöõng hình aûnh naøy seõ chæ ra ñöôïc söï xuaát hieän cuûa veát loõm taïi beà maët ôû möùc xaáp xæ 10-9 moät caùch gia taêng daàn. Theâm vaøo ñoù, söï gia taêng dieän tích cuûa loã hoång ôû lôùp maøng keùp lipit maø ñöôïc ghi nhaän nhö laø chöùc naêng thôøi gian vaø hoaït tính ñaëc hieäu cuûa enzyme seõ ñöôïc ñaùnh giaù vôùi ñieàu kieän moät phaân töû lipase seõ hoaït ñoäng trong 1 loã. Keát quaû ñöôïc söû duïng ñeå laøm maãu cho ñoäng hoïc cuûa phaûn öùng enzyme taïi beà maët tieáp xuùc giöõa 2 pha beùo - nöôùc. Döõ lieäu naøy cung caáp hình aûnh ñaàu tieân ôû taàm Nano cuûa ñoäng hoïc quaù trình phaân giaûi lipit. Quang phoå hoïc hoàng ngoaïi: Moät phaân tích lieân tuïc ñeå ño söï thuûy phaân cuûa nhöõng TAG do lipase xuùc taùc micell ñaûo ngöôïc söû duïng Fourier thay ñoåi quang phoå hoïc hoàng ngoaïi (FTIR – Fourier transform infrared spectroscopy), ñöôïc phaùt trieån bôûi Walde vaø Luisi. Söï phaân huûy chaát beùo coù theå ñöôïc theo doõi baèng vieäc ghi laïi phoå FTIR cuûa toaøn boä hoãn hôïp phaûn öùng. Soá löôïng nhöõng ester axit beùo vaø FFAs (maø cöïc ñaïi ñænh töông öùng taïi 1751cm-1 vaø taïi 1715 cm-1) coù theå döïa treân cô sôû cuûa nhöõng heä soá taét vaø ñònh luaät cuûa Beer. Phöông phaùp naøy ñöôïc öùng duïng ñeå ño söï phaân huûy chaát beùo cuûa nhöõng cô chaát khaùc nhau (nhö trioctanoyglycerol, caùc loaïi daàu thöïc vaät). Söï xuaát hieän nhöõng saûn phaåm cuûa phaûn öùng thuûy phaân Söï giaûi phoùng proton nhö moät pheùp phaân tích giaùn tieáp: Nhöõng chaát chæ thò maøu: Trong moâi tröôøng raén: Khi dung dòch lipase ñöôïc ñaët treân moät ñóa agar chöùa ester carboxylic nhö moät cô chaát, coù theå theo doõi ñoä pH baèng vieäc quan saùt söï thay ñoåi maøu cuûa nhöõng chaát chæ thò (do nhöõng axit beùo ñöôïc giaûi phoùng trong phaûn öùng thuûy phaân gaây ra) maø tröôùc ñoù ñaõ ñöôïc keát hôïp cuøng vôùi nhöõng cô chaát trong gel agar. ÔÛ ñaây toàn taïi moät moái quan heä tuyeán tính giöõa ñöôøng kính cuûa ñoám (vò trí) khuyeách taùn axit beùo vaø logarit cuûa vuøng phaân boá enzyme. Kyõ thuaät naøy raát tieän lôïi trong vieäc saøng loïc nhanh choùng nhöõng vi sinh vaät phaân huûy lipid phaùt trieån treân nhöõng ñóa agar. Tuy nhieân moät vaøi sai soùt coù theå laø keát quaû töø quaù trình axit hoùa cuûa moâi tröôøng, vì söï phaùt sinh cuûa nhöõng chaát chuyeån hoùa axit khaùc vôùi FFAs maø ñöôïc giaûi phoùng bôûi nhöõng vi khuaån lipase. Trong moâi tröôøng chaát loûng: maëc duø ñaây laø moät phöông phaùp ñònh tính, kyõ thuaät naøy cung caáp moät phöông tieän ñôn giaûn ñeå phaùt hieän hoaït tính cuûa lipase trong nhöõng phaàn nhoû coät ghi saéc kí taïi nhöõng giai ñoaïn laøm saïch lipase khaùc nhau baèng vieäc quan saùt nhöõng thay ñoåi maøu saéc cuûa nhöõng chaát chæ thò maøu ñöôïc troän ñeàu vôùi nhöõng cô chaát ester. Moät phöông phaùp ñònh tính ñôn giaûn hôn maø döïa vaøo söï phaùt hieän nhöõng ñaëc tröng maïnh meõ veà muøi cuûa axit butyric vaø axit caproic, chuùng coù muøi cuûa nhöõng gioït söõa ñaõ bò thuûy phaân maø ñöôïc duøng nhö moät cô chaát lipase. Pheùp chuaån ñoä: Phöông phaùp pH-stat noåi tieáng (Fig 2) noùi chung ñaõ ñöôïc söû duïng nhö moät pheùp phaân tích enzyme lipase khaùc. Ñaây laø moät kyõ thuaät tieän lôïi ñeå moâ taû ñaëc ñieåm vaø söï ñaëc bieät cuûa lipase cuõng nhö hieän töôïng kích hoaït beà maët tieáp xuùc giöõa caùc pha. Vôùi phöông phaùp pH-stat, hoaït ñoäng cuûa lipase ñöôïc ño treân moät maùy khuaáy troän heä nhuõ töông cuûa nhöõng TAGs töï nhieân hay chaát toång hôïp baèng vieäc trung hoøa FFAs ñöôïc giaûi phoùng theo thôøi gian bôûi söï theâm vaøo chaát chuaån ñoä NaOH ñeå duy trì ñoä pH taïi moät giaù trò ñieåm cuoái khoâng ñoåi. Trong tröôøng hôïp ñaëc bieät cuûa lipase/colipase tuïy taïng phöùc taïp, söï phaân tích thöôøng chung nhaát laø ñöôïc thöïc hieän trong moät maùy ñieàu nhieät (ôû 37oC) bình phaûn öùng hieän chöùa ñöïng 0.5ml tributyrin trong 5ml dung dòch ñeäm coù chöùa nöôùc (coù pH = 8), trong ñoù khoâng coù maët cuûa baát kyø chaát hoaït ñoäng beà maët hay heä nhuõ töông naøo khaùc. Thoâng thöôøng, tributyrin ñôn giaûn ñöôïc nhuõ töông hoùa taïi choã bôûi söï kích thích khuaáy troän cô hoïc hieäu quaû trong bình pH-stat. Hieäu quaû cuûa dòch ñoàng nhaát tuaàn hoaøn cuûa daàu oliu ñöôïc nhuõ töông hoùa vôùi gum arabic ñaõ ñöôïc chæ ra ñeå caûi thieän ñoä nhaïy cuûa pheùp phaân tích. Phöông phaùp pH-stat ñöôïc duøng ñeå phaùt hieän ra hoaït tính cuûa lipase trong dòch moâ ñoàng theå thöïc vaät, coù maët cuûa deoxycholate,söû duïng triolein ñöôïc nhuõ hoùa vôùi gum arabic nhö cô chaát. Kyõ thuaät pH-stat ñaõ ñöôïc duøng ñeå xaùc ñònh nhöõng hoaït tính lipase trong huyeát thanh, plasma vaø dòch taù traøng. Phöông phaùp pH-stat laø moät phöông phaùp ñònh löôïng cho keát quaû khaù chính xaùc (nhaïy) trong giôùi haïn 1mol axit beùo ñöôïc giaûi phoùng trong 1 phuùt. Khi söû duïng NaOH 0.1 M laøm chaát chuaån ñoä thì phöông phaùp naøy khoâng ñaùng tin caäy trong vieäc nhaän bieát ñöôïc möùc ñoä hoaït ñoäng nhoû hôn 0.1 mol/phuùt. Ngoaøi tính nhaïy thaáp cuûa noù, nhöôïc dieåm cuûa phöông phaùp pH-stat laø vuøng phaân boá heïp cuûa nhöõng giaù trò pH maø coù theå ñöôïc nghieân cöùu tìm hieåu. Ñaëc bieät hôn, söï phaùt hieän nhöõng proton ñöôïc giaûi phoùng trong suoát thôøi gian phaûn öùng thuûy phaân maø ñöôïc xuùc taùc bôûi nhöõng enzyme lipase thì caàn coù quaù trình ion hoùa moät phaàn nhöõng axit beùo ñöôïc giaûi phoùng. Bôûi vaäy, nhöõng giaù trò pH cuûa ñieåm cuoái cuûa moâi tröôøng phaûn öùng phaûi gaàn baèng nhau, hoaëc cao hôn, thích hôïp hôn giaù trò pKa hieån thò cuûa axit beùo ñöôïc giaûi phoùng. Ñieàu naøy ñaõ ñöôïc töôøng trình bôûi Benzonana vaø Desnuelle maø giaù trò pKa hieån thò cuûa axit oleic coù theå cao ñuùng 7.5 trong nhöõng ñieàu kieän phaân tích cuûa lipase. Hôn nöõa, neân chuù yù raèng: khaû naêng ion hoùa cuõng nhö söï coù maët cuûa nhöõng ion Canxi seõ laøm giaûm ñaùng keå söï chính xaùc cuûa nhöõng giaù trò pKa hieån thò. Söï coù maët cuûa nhöõng ion Ca2+ coù aûnh höôûng tích cöïc ñeán hieäu quaû ion hoaù cuûa nhöõng axit beùo maïch daøi. Hieän töôïng keát tuûa vi moâ naøy ñieàu khieån caân baèng hoùa hoïc baèng ñònh luaät hoaït ñoäng khoái löôïng. Neáu taïi giaù trò pH ñöôïc choïn, FFAs khoâng hoaøn toaøn bò ion hoùa, söï chuaån ñoä lieân tuïc cuûa hoï cuõng khoâng chính xaùc hoaëc khoâng theå thöïc hieän ñöôïc, thaäm chí sau khi ñaõ coù moät heä soá hieäu chænh. Söï chuaån ñoä ngöôïc (a back-titration ) phaûi ñöôïc thöïc hieän, nhö trong tröôøng hôïp cuûa HGL, hoaït ñoäng trong nhöõng ñieàu kieän pH axit. Bôûi vaäy, hoaït ñoäng HGL ñöôïc ño baèng vieäc uû aám dung dòch enzyme vôùi heä nhuõ töông TAG trong vaøi phuùt ôû pH = 3. Söï giaûi phoùng FFAs khoâng ñöôïc ion hoùa thì ñöôïc chuaån ñoä ngöôïc ôû cuoái phaûn öùng baèng vieäc chuyeån dòch nhanh ñoä pH töø 3 ñeán 9. Phöông phaùp Fluorimatric ( ño söï phaùt huøynh quang ) döïa vaøo nhöõng ester Umbelliferyl: [30, 11] Nhieàu phöông phaùp ñaõ ñöôïc moâ taû ñeå ño hoaït tính cuûa lipase. Nhöõng phöông phaùp thöôøng söû duïng nhaát ñöôïc döïa vaøo söï chuaån ñoä nhöõng axit beùo töï do ñöôïc giaûi phoùng trong suoát thôøi gian thuyû phaân. Tuy nhieân, nhöõng phöông phaùp naøy yeâu caàu coù söï chuaån bò cuûa nhöõng heä nhuõ töông beàn cuûa nhöõng cô chaát vaø söï ñieàu khieån pH trong thôøi gian thuyû phaân. Phöông phaùp ñoàng vò phoùng xaï coù ñoä nhaïy lôùn hôn, nhöng yeâu caàu caùc cô chaát phaûi ñöôïc ñaùnh daáu. Phöông phaùp so maøu (colorimetric) döïa treân söï thuyû phaân nhöõng ester cuûa p-nitrophenol hoaëc thioesters coù saün. Caùc cô chaát huyønh quang ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå phaân tích protease, phosphatase, glycosidase, sulfatase vaø nhöõng hoaït tính cuûa enzyme lipase. Chaúng haïn nhö, rhodamine 6G thì höõu ích ñeå ño hoaït tính cuûa nhöõng enzyme lipase vaø nhöõng ester cuûa C6NBD{ [(7-nitro-2,1,3-benzoxandiazol-4-yl)amino]-caproyl } thì thích hôïp ñeå ño hoaït tính cuûa nhöõng enzyme phospholipase. Moät daãn xuaát coumarin (C9H8O2 : anhydrit cuûa axit o-cumarin,lacton keát tinh maøu traéng, ñoäc tìm thaáy ôû nhieàu loaïi caây vaø cheá taïo toång hôïp, ñöôïc duøng trong saûn xuaát nöôùc hoa vaø xaø phoøng, coøn goïi laø 1,2-benzopyrone) cuõng ñaõ ñöôïc söû duïng ñeå phaân tích hoaït tính lipase. Hoãn hôïp huyønh quang umbelliferone (UMB) ñöôïc ester hoùa vôùi nhöõng axit beùo no vaø khoâng no coù chieàu daøi maïch carbon khaùc nhau, vaø söû duïng cô chaát laø nhöõng ester khoâng huyønh quang ñeå ño hoaït tính cuûa 2 loaïi enzyme lipase ñöôïc tinh saïch töø 2 chuûng Rhizopus delemar vaø Candida cylindracea. Cöôøng ñoä huyønh quang cuûa UMB do caùc chaát ñöôïc giaûi phoùng bôûi söï thuûy phaân cô chaát ñaõ cho moät daáu hieäu veà hoaït ñoäng cuûa lipase vôùi nhöõng ester töông öùng. UMB ñöôïc tìm thaáy coù phaàn nhaïy vaø oån ñònh hôn so vôùi 4-methylumbelliferone (4-MU) ñaõ ñöôïc söû duïng tröôùc ñaây. Phöông phaùp coù ñoä nhaïy cao ( nmoles UMB/ml/hr) ñöôïc moâ taû ôû ñaây ñaõ ñöôïc kieåm tra treân 5 ester khaùc nhau. Phương phaùp coù öu ñieåm laø khoâng caàn söï trích ruùùt cuûa những saûn phaåm thuyû phaân chaát beùo, noù cuõng coù theå ñöôïc thöïc hieän nhanh choùng trong 2 ñeán 3 phuùt vaø nhö vaäy hình thaønh moät lôùp maøng chaén cho chính lipase ñöôïc sinh ra bôûi vi sinh vaät. Goodwin vaø Kavanagh quan saùt raèng söï phaùt huyønh quang UMB vaø 4-MU xuaát hieän ôû böôùc soùng töông öùng laø 380 vaø 634nm.Chuùng ta khoâng phaùt hieän ra baát kì söï khaùc nhau quan troïng naøo trong söï phaùt huyønh quang giöõa UMB vaø 4-MU ôû taïi thôøi ñieåm t = 0. Tuy nhieân, söï phaùt huyønh quang 4-MU ñöôïc chöùng minh laø khoâng oån ñònh vaø gia taêng theo thôøi gian, trong khi söï phaùt huyønh quang UMB coøn laïi khoâng thay ñoåi. Nhö vaäy UMB cho söï phaân tích nhöõng muïc ñích thì ñaùng tin caäy hôn 4-MU. Keát quaû ôû UMB coù veû ít phuï thuoäc vaøo pH, maëc duø giaù trò cöïc ñaïi (100%) xaûy ra taïi pH = 7.4, hoaït ñoäng coøn laïi laø 95% ôû taïi pH = 7.0 Söû duïng 4-MU butyrate, Roberts coù theå phaùt hieän ra hoaït ñoäng phaân huyû lipit thaáp nhaát maø chuùng ta coù theå phaùt hieän ra laø 0.3 nmoles/ml/hr. Ñoä nhaïy cao naøy seõ laø 1 ñieàu quan taâm ñaëc bieät khi caàn phaûi ño hoaït ñoäng phaân huyû lipit ôû nhöõng möùc raát thaáp. Phöông phaùp Fluorimetric coù ñoä nhaïy cao hôn khoaûng 4000 laàn so vôùi phöông phaùp Colorimetric döïa vaøo thioesters vaø cao hôn gaáp 10000 laàn so vôùi phöông phaùp chuaån ñoä döïa vaøo söï söû duïng kyõ thuaät pH-stat. Döôùi nhöõng ñieàu kieän toái öu cho cô chaát, toác ñoä thuyû phaân ôû vuøng phaân boá enzyme laø 0.3 mmol/min/mg enzymevôùi 4-MU oleate, vaø 2.5 mmol/min/mg enzyme vôùi UMB oleate. Söï coù maët cuûa nhoùm methyl coù theå laøm giaûm suùt toác ñoä thuyû phaân cuûa nhöõng enzyme lipase. Ngoaøi lôïi ích laø coù ñoä nhaïy cao, pheùp phaân tích Fluorimetric coù theå ñöôïc thöïc hieän chæ trong 2 ñeán 3 phuùt. Traùi ngöôïc vôùi phöông phaùp ñoàng vò phoùng xaï, caùc saûn phaåm cuûa söï phaân huyû lipit cuõng khoâng caàn phaûi ñöôïc trích ruùt vaø taùch rieâng ra. Hôn nöõa, nhöõng ester UMB raát oån ñònh vaø khoâng bò söï töï thuyû phaân nhö 4-MU palmitate maø ñaõ ñöôïc baùo caùo. Trong khi heä nhuõ töông 4-MU palmitate coù theå khoâng oån ñònh thì heä nhuõ töông UMB coøn laïi raát oån ñònh. Nhöõng ion canxi seõ laøm taêng theâm hoat tính cuûa enzyme lipase bôûi söï taùc ñoäng tröïc tieáp leân enzyme. Chuùng cuõng coù theå giaûm bôùt tính hoaø tan ñöôïc cuûa nhöõng axit beùo sinh ra trong thôøi gian thuyû phaân, maø ñaây coù theå laø moät vaán ñeà quan troïng khi söû duïng phöông phaùp chuaån ñoä. Phöông phaùp huyønh quang (Fluorimetric) thì traùnh ñöôïc vaán ñeà naøy. Trong nhöõng ñieàu kieän thöû nghieäm nhö ñaõ neâu, 30mM calcium chloride ñöôïc kích hoaït cho enzyme lipase töø chuûng Rhizopus delemar; 8mM cuûa Triton X-100 seõ kìm haõm hoaït tính lipase veà phía triglycerides, daãn tôùi söï kìm haõm 100% hoaït ñoäng veà phía nhöõng cô chaát fluorigenic. Moät soá ester 4-MU thöông phaåm thì thích hôïp cho vieäc söû duïng. Nhöng neáu hoaït tính lipase ñöôïc phaân tích laø yeáu thì nhöõng ester UMB coù theå laø moät söï thay theá toát hôn. Phöông phaùp nghieân cöùu Nguyeân lieäu Noäi taïng caù tra (khoâng coù daï daøy): laáy töø daây chuyeàn cheá bieán caù fillet do coâng ty coå phaàn xuaát nhaäp khaåu thuûy saûn An Giang (Agifish) cung caáp. Noäi taïng caù ñöôïc baûo quaûn laïnh vaø vaän chuyeån töø An Giang leân thaønh phoá. Sau ñoù noäi taïng caù tra ñöôïc xöû lyù theo muïc ñích nghieân cöùu vaø baûo quaûn laïnh ñoâng ôû -200C ñeå haïn cheá söï bieán tính cuûa enzyme. Hình 3.1. Caáu taïo caù Hoùa chaát NaOH, HCl, Na2CO3, I2, KI, NaCl, K2HPO4, KH2PO4 … Ethanol, albumin, ure, tinh boät hoøa tan, Tris, gum Arabic … Thuoác thöû phenolphthalein, thylmolphtalein, folin … Thieát bò söû duïng trong nghieân cöùu Maùy xay thòt. Beå ñieàu nhieät: Memmert WB14 – Memmert GmbH Co., Ñöùc. Caân kyõ thuaät: Sartorius BL 1500 – Sartorius AG Göttingen, Ñöùc. Caân phaân tích: Sartorius BS 210S – Sartorius AG Göttingen, Ñöùc. Maùy ño quang phoå UV – VIS: Genesys 6 – Thermo Electron Corporation, Myõ. Maùy khuaáy töø khoâng gia nhieät. Maùy khuaáy töø gia nhieât. Maùy ly taâm laïnh – Hettich – Mikko 22r Tuû aám. Maùy chuaån ñoä töï ñoäng. Maùy caát ñaïm Gerhardt, Ñöùc.… Phöông phaùp nghieân cöùu Sô ñoà nghieân cöùu Khaûo saùt ñieàu kieän trích ly (tæ leä noäi taïng vaø dung moâi trích ly, pH, nhieät ñoä, thôøi gian trích ly) Toái öu hoùa quaù trình trích ly Khaûo saùt phöông phaùp keát tuûa Choïn phöông phaùp phaân tích enzyme Tìm hieåu nguyeân lieäu Khaûo saùt hoaït tính caùc enzyme tieâu hoaù (amylase, protease, lipase) Choïn phöông phaùp xöû lyù Choïn enzyme tieâu hoùa ñieån hình Thu nhaän cheá phaåm enzyme Quy trình vaø thuyeát minh QUY TRÌNH THU NHAÄN ENZYME TÖØ NOÄI TAÏNG CAÙ TRA VAØ XAÙC ÑÒNH HOAÏT TÍNH ENZYME Xaùc ñònh hoaït tính enzyme 1 Xaùc ñònh hoaït tính enzyme 2 Noäi taïng caù töôi baûo quaûn ôû nhieät ñoä -200C Xöû lyù, xay nhoû ñem caân troïng löôïng Loïc Trích ly Keát tuûa Ly taâm laáy tuûa Cheá phaåm enzyme thoâ Xaùc ñònh hoaït tính enzyme 3 Töï phaân THUYEÁT MINH QUY TRÌNH: Noäi taïng caù tra: noäi taïng caù tra ñöôïc thu töø nhaø maùy cheá bieán thuûy saûn ñöôïc baûo quaûn laïnh ñoâng tröôùc khi ñem trích ly ñeå thu nhaän enzyme (-20oC). Thôøi gian baûo quaûn noäi taïng caøng ngaén caøng toát ñeå traùnh hieän töôïng enzyme bò bieán tính. Xöû lyù: loaïi boû maät ra khoûi noäi taïng caù tra. Xay maãu: cho noäi taïng vaøo xay ôû maùy xay thòt. Trong quaù trình xay caàn giöõ laïnh ñeå traùnh bieán tính enzyme. Trích ly enzyme: phoái troän nguyeân lieäu ñaõ xay vôùi dung moâi (nöôùc hoaëc dung dòch Na2CO3, HCl). Trong quaù trình naøy enzyme trong noäi taïng seõ hoøa tan vaø khuyeách taùn vaøo dung moâi. Töï phaân: ñeå thu nhaän enzyme noäi baøo. Loïc ñeå thu dòch chöùa enzyme: muïc ñích loaïi boû taïp chaát khoâng tan coù trong dòch enzyme. Keát tuûa: ñeå tinh saïch enzyme, chuùng ta boå sung caùc dung moâi höõu cô (ethanol) vôùi tyû leä thích hôïp vaøo dòch enzyme thoâ. Khi ñoù keát tuûa seõ xuaát hieän trong hoãn hôïp. Quaù trình keát tuûa caàn giöõ ôû nhieät ñoä 200C. Ly taâm thu nhaän protein ñaõ keát tuûa: hoãn hôïp ñöôïc ly taâm ôû 4oC vôùi vaän toác 3500 voøng/phuùt trong thôøi gian 10 phuùt nhaèm muïc ñích thu nhaän phaàn keát tuûa. Phöông phaùp xaùc ñònh haøm löôïng protein Ñònh löôïng protein hoøa tan theo phöông phaùp Lowry [5] Nguyeân taéc: Haàu heát protein ñeàu chöùa tyrosin vaø tryptophan. Tyû leä cuûa nhöõng axit amin naøy trong phaân töû tuøy thuoäc vaøo loaïi protein, vì vaäy nhöõng protein cuøng moät loaïi vôùi nhau thì tyû leä caùc axit amin naøy trong phaân töû cuûa chuùng nhö nhau. Khi cho protein taùc duïng vôùi thuoác thöû Folin seõ taïo thaønh moät phöùc chaát coù maøu. Cöôøng ñoä maøu saéc cuûa maãu thí nghieäm tyû leä vôùi haøm löôïng tyrosin vaø tryptophan (cuõng nhö haøm löôïng protein coù trong maãu. Treân nguyeân taéc naøy, ta coù theå duøng phöông phaùp so maøu ñeå xaùc ñònh haøm löôïng protein tan. Hoùa chaát: Dung dòch albumin 0,1%. Dung dòch A (ddA): 20 g Na2CO3 vaø 0,5 g Na-K Tartrat trong 1 lít NaOH 0,1N. Dung dòch B (ddB): 1 g CuSO4 .5H2O trong 1 lít nöôùc. Dung dòch C (ddC): 45 ml ddA + 5 ml dd B ñeå 24 h trong tuû maùt. Thuoác thöû Folin. Caùch tieán haønh: Dòch enzyme: 5 ml enzyme ñònh möùc leân 100 ml baèng nöôùc caát. OÁng M1: 0,2 ml maãu + 2 ml dd C, ñeå 10 phuùt roài theâm 2 ml Folin ñaõ pha loaõng 3 laàn. Ñeå 30 phuùt so maøu ôû 750 nm.. OÁng M2 : 0,2 ml nöôùc caát + 2 ml dung dòch C, ñeå 10 phuùt roài theâm 0,2 ml Folin ñaõ pha loaõng 3 laàn. Ñeå 30 phuùt so maøu ôû 750 nm. Xaây döïng ñöôøng chuaån Albumin: OÁng soá 0 1 2 3 4 5 Noàng ño protein (µg/ml) 0 100 200 300 400 500 Dd Albumin 0,1% (ml) 0 1 2 3 4 5 Nöôùc caát (ml) 10 9 8 7 6 5 Maät ñoä quang Tính toaùn keát quaû: Veõ ñoà thò vaø xaùc ñònh phöông trình ñöôøng chuaån albumin. Xaùc ñònh maät ñoä quang cuûa oáng maãu. Xaùc ñònh µmol protein tan cuûa oáng maãu töø phöông trình ñöôøng chuaån albumin. Xaùc ñònh noàng ñoä protein tan cuûa dòch chöùa enzyme. Noàng ñoä protein (CP) trong dòch enzyme ñöôïc tính theo coâng thöùc: Vôùi a : noàng ñoä protein trong dòch enzyme phaân tích (µg/ml). n : heä soá pha loaõng. C : noàng ñoä protein trong dòch enzyme phaân tích (mg/ml). Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính enzyme Hoaït tính enzyme amylase [2, 4] Nguyeân taéc: Phöông phaùp naøy döïa treân cô sôû enzyme amylase thuûy phaân tinh boät tôùi caùc dextrin coù phaân töû löôïng khaùc nhau tuøy möùc ñoä thuûy phaân. Saûn phaåm thuûy phaân seõ coù maøu khaùc nhau vôùi I2. Baèng caùch ño maät ñoä quang cuûa dung dòch thuûy phaân seõ tính ñöôïc hoaït tính enzyme. Hoaït tính enzyme amylase ñöôïc bieåu thò laø soá µg tinh boät ñöôïc thuûy phaân do 1 ml dòch enzyme, trong 1 phuùt ôû 35oC, pH 7.2. Hoùa chaát vaø dòch chieát enzyme: Dung dòch ñeäm photphat pH 7,2. Dung dòch HCl 0,1 N. Dung dòch iot goác: Hoøa tan 0,25 g iot vaø 2,5 g KI vôùi 1 löôïng nhoû nöôùc caát. Laéc nheï ñeå hoãn hôïp hoøa tan hoaøn toaøn, sau ñoù chuyeån dung dòch sang bình ñònh möùc 100 ml, boå sung nöôùc caát ñeán vaïch möùc. Baûo quaûn dung dòch trong bình maøu naâu ôû choå toái trong thôøi gian 1 thaùng. Dung dòch iot phaân tích: Pha loaõng 2 ml dung dòch iot goác vôùi dung dòch HCl 0,1 N trong bình ñònh möùc dung tích 100ml. Tröôùc khi söû duïng caàn kieåm tra maät ñoä quang cuûa noù treân maùy so maøu quang ñieän ôû böôùc soùng l = 453 nm vôùi chieàu daøy cuvet 1mm. Maät ñoä quang cuûa dung dòch phaûi coù giaù trò 0,160 (±0.001). Neáu coù sai leäch veà maät ñoä quang phaûi hieäu chænh baèng caùch theâm 1 vaøi gioït axit HCl hoaëc dung dòch iot goác. Dung dòch tinh boät 1%: Hoøa tan 1 gam tinh boät (theo chaát khoâ tuyeät ñoái) vôùi 50 ml nöôùc caát trong bình ñònh möùc 100ml, laéc ñeàu. Ñaët vaøo beáp caùch thuûy ñang soâi, laéc lieân tuïc cho ñeán khi tinh boät tan hoaøn toaøn. Sau ñoù laøm nguoäi bình vaø boå sung 10ml dung dòch ñeäm phophat 7,2. Boå sung nöôùc caát ñeán vaïch möùc, laéc ñeàu. Dung dòch ñöôïc chuaån bò trong ngaøy söû duïng. Dòch enzyme pha loaõng: laáy 10 ml dòch chöùa enzyme, boå sung 2,5 ml ñeäm phophat 7,2 ; 12,5 ml dung dòch NaCl 0,1N. Giöõ hoãn hôïp ôû nhieät ñoä 35oC trong thôøi gian moät giôø. Caùch tieán haønh: Cho vaøo oáng nghieäm 5 ml dung dòch tinh boät 1%, ñaët vaøo beå ñieàu nhieät coù nhieät ñoä 35 oC trong 10 phuùt ñeå oån ñònh. Boå sung vaøo 10 ml dòch enzyme pha loaõng. Laéc ñeàu. Laáy töø oáng nghieäm 0,1 ml hoãn hôïp phaûn öùng cho vaøo oáng nghieäm khaùc chöùa 10ml dung dòch iot phaân tích, laéc ñeàu. Ñeå 15 phuùt, ño cöôøng ñoä maøu cuûa dung dòch ôû böôùc soùng l = 656nm so vôùi nöôùc caát, ta ñöôïc giaù trò D1. Sau 4 tieáng phaûn öùng, tieán haønh ño maät ñoä quang töông töï nhö treân ta coù ñöôïc giaù trò D2. Tính toaùn keát quaû: HTA : soá ñôn vò hoaït tính trong 1 ml dòch enzyme t : thôøi gian phaûn öùng (giôø); D1 : maät ñoä quang ban ñaàu; D2 : maät ñoä quang sau 4 giôø phaûn öùng; C : löôïng tinh boät ban ñaàu tham gia phaûn öùng (mg). V : theå tích dòch enzyme. Hoaït tính enzyme protease [1] Xaùc ñònh baèng phöông phaùp Anson caûi tieán. Nguyeân taéc: Hoaït tính enzyme protease ñöôïc bieåu thò laø soá µg tyrosin, sinh ra do söï thuûy phaân albumin cuûa enzyme coù trong 1 ml dòch, trong 1 phuùt ôû 45oC, pH 7.2. Hoùa chaát vaø dòch chieát enzyme: Dung dòch cô chaát protein 2%: 2g albumin + 36 g ure + 8ml dung dòch NaOH 1N + 40ml nöôùc caát, hoaø tan. Boå sung 10 ml dung dòch ñeäm photphat pH 7.2; chænh veà pH 7.2 baèng HCl 2 N. Ñònh möùc thaønh 100ml. Baûo quaûn trong tuû laïnh. Dòch enzyme pha loaõng: 5 ml maãu, 2.5 ml dung dòch ñeäm photphat pH 7.2 sau ñoù ñònh möùc thaønh 25 ml. (Heä soá pha loaõng n = 5). Caùch tieán haønh: Laáy 2 oáng nghieäm vaø tieán haønh nhö sau:( Moãi thí nghieäm laëp laïi 2 laàn) OÁng maãu (ml) OÁng khoâng (ml) Dung dòch albumin 2% trong ñeäm phophat 2 2 Ñeå ôû 45oC trong 5 phuùt Dung dòch axit tricloacetic 10% 0 4 Dòch enzyme pha loaõng 0,4 0 Laéc ñeàu, ñeå ôû 45oC trong 10 phuùt Dung dòch axit tricloacetic 10% 4 0 Dòch enzyme pha loaõng 0 0,4 Laéc ñeàu moãi oáng vaø ñeå laéng trong khoaûng 10 phuùt ôû nhieät ñoä phoøng, ñem loïc. Huùt vaøo caùc oáng nghieäm khaùc moãi oáng 2 ml dòch loïc, 4 ml dung dòch NaOH 0,5 N vaø 1 ml thuoác thöû Folin pha loaõng 6 laàn. Laéc kyõ. Ñeå 15 phuùt phaûn öùng. Sau ñoù ño maät ñoä quang cuûa dung dòch ôù böôùc soùng 620 nm. Xaây döïng ñöôøng chuaån tyrosin. Pha dung dòch tyrosin 100 µg/ml: Laáy 0,1 g tyrosin ñònh möùc leân 1000 ml Pha caùc dung dòch tyrosin chuaån coù noàng ñoä 0, 5, 10, 15, 20 µg/ml Dung dòch tyrosin chuaån (µg/ml) 0 5 10 15 20 Dung dòch tyrosin 100 µg/ml (ml) 0 5 10 15 20 Nöôùc caát (ml) 100 95 90 85 80 Tính toaùn keát quaû: Veõ ñoà thò vaø xaùc ñònh phöông trình ñöôøng chuaån tyrosin. Xaùc ñònh cheânh leäch maät ñoä quang giöõa dung dòch trong oáng maãu vaø oáng khoâng. Xaùc ñònh noàng ñoä tyrosin cuûa oáng maãu töø phöông trình ñöôøng chuaån tyrosin. Xaùc ñònh hoaït tính cuûa enzyme protease. Coâng thöùc tính: HTP : hoaït tính enzyme protease trong dòch chöùa enzyme. C : noàng ñoä tyrosin cuûa dung dòch trong oáng maãu. Vt : toång theå tích cuûa dung dòch trong oáng maãu. VE : theå tích cuûa dòch enzyme pha loaõng. t : thôøi gian phaûn öùng.(phuùt) n : heä soá pha loaõng. Hoaït tính enzyme