Luận văn Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

BỘ G IA ÙO DỤC VÀ Đ ÀO TA ÏO TR ƯỜNG Đ ẠI HỌC SƯ PH ẠM TP. H Ồ CHÍ MINH Nguyễn Thị Thanh Bình NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM AMYLASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 4 0 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN TH ANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 8 - 2010 LỜI CẢM ƠN Tơi xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến TS. Trần Thanh Thủy đã dìu dắt giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập và tận tình hướng dẫn trong suốt quá trình nghiên cứu, hồn thành luận văn này. Tơi xin ghi nhớ cơng ơn tất cả Quý Thầy Cơ trong Khoa Sinh, và trong phịng thí nghiệm Vi sinh – Sinh hĩa, Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành cơng việc nghiên cứu thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn các bạn học viên Cao học khĩa 17 và 18 ngành Vi sinh vật học, Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm. Cuối cùng tơi xin gởi lời biết ơn đến Ba Má, hai em và bạn bè đã luơn yêu thương và ủng hộ tơi vượt qua những khĩ khăn trong quá trình học tập và thực hiện luận văn. Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2010 NGUYỄN THỊ THANH BÌNH LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Những số liệu, kết quả trong luận văn này là hồn tồn trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kì cơng trình nào khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thanh Bình DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC Carboxymethy cellulose dd Dung dịch DNS 3, 5 – dinitrosalicylic acid Hđamylase Hoạt độ amylase HST Hệ sinh thái KL Khuẩn lạc KS Kháng sinh MT Mơi trường NS Nấm sợi NXB Nhà xuất bản OD Optical density (mật độ quang) PTN Phịng thí nghiệm RNM Rừng ngập mặn SV Sinh vật VK Vi khuẩn VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU Amylase là một loại enzym thủy phân tinh bột quan trọng nhất trong cơng nghệ sinh học. Nĩ cĩ khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside, α-1,6 glucoside của amylose và amilopectin, làm tăng tốc độ đường hĩa tinh bột của nguyên liệu giúp các phản ứng xảy ra nhanh chĩng, rút ngắn thời gian hình thành sản phẩm. Amylase thu nhận từ VSV nĩi chung, từ NS nĩi riêng cĩ nhiều ưu điểm nổi bật hơn các loại amylase từ thực vật và động vật như: hoạt tính enzym cao hơn, khả năng chịu nhiệt cao, thời gian thu enzym nhanh, giá thành rẻ, cĩ thể sản xuất ở quy mơ cơng nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn giản và rẻ tiền. Với những ưu thế nổi trội, NS trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho ngành cơng nghiệp sản xuất enzym. Do đĩ, trong vịng 50 năm trở lại đây, các chế phẩm enzym từ NS đã dần thay thế enzym từ động vật. Các chủng NS sinh amylase cao như: Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Rhizopus,... Với phạm vi ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: cơng nghệ thực phẩm, dược phẩm, cơng nghệ lên men, cơng nghiệp dệt nên khối lượng chế phẩm amylase được sản xuất hàng năm trên thế giới lên tới hàng chục vạn tấn và ngày một gia tăng. Chính vì vậy, việc tìm kiếm các chủng NS sinh amylase cao luơn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trong và ngồi nước. Trong quá trình tìm kiếm ấy, con người luơn quan tâm đến NS sống trong các hệ sinh thái đặc biệt. Nằm giữa đất liền và biển cả, RNM Cần Giờ cĩ mơi trường sống vốn khắc nghiệt, mang tính cạnh tranh cao, làm tăng khả năng sinh các chất cĩ hoạt tính sinh học giúp SV thích nghi tốt với điều kiện sống. Nơi đây lưu trữ, bảo tồn nguồn tài nguyên thiên nhiên vơ cùng quý giá của vùng ven biển nhiệt đới từ thực vật, động vật và cả VSV. Hơn nữa, Việt Nam là nước cĩ nguồn tinh bột và phụ phẩm nơng nghiệp khá dồi dào là điều kiện thuận lợi để ứng dụng amylase thu nhiều sản phẩm. Cĩ thể nĩi cho đến nay, sự hiểu biết về khu hệ NS ở RNM và vai trị của chúng trong hệ sinh thái này cịn quá ít và chưa đầy đủ. Trước thực tế này, nhằm đa dạng hĩa nguồn enzym từ các NS, cũng như mong muốn thu nhận được các chủng NS mang đặc tính quý, chúng tơi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thu nhận enzym amylase của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”.  Mục tiêu đề tài Tuyển chọn và khảo sát được một số chủng NS sinh α-amylase và glucoamylase cao từ RNM Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh  Nhiệm vụ của đề tài - Phân lập các chủng NS thu nhận từ RNM Cần Giờ. - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase các chủng NS phân lập được - Tuyển chọn 2 chủng sinh amylase cao tiếp tục khảo sát - Phân loại đến chi các chủng NS đã tuyển chọn - Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn - Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình thu nhận amylase - Thu nhận chế phẩm amylase thơ và so sánh với enzym thương mại trên thị trường. - Khảo sát các đặc tính sinh học khác  Đối tượng và phạm vi nghiên cứu - Đối tượng là các chủng NS phân lập từ các mẫu đất, thân, lá cây, …ở RNM Cần Giờ - Phạm vi nghiên cứu gồm 5 xã: Bình Khánh, Tam Thơn Hiệp, An Thới Đơng, Long Hịa, Lý Nhơn thuộc RNM huyện Cần Giờ.  Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài - Thời gian: Từ tháng 8/2009 – 7/ 2010 - Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh - Sinh hĩa, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Tp. Hồ Chí Minh Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. KHÁI QUÁT VỀ RNM CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH 1.1.1. Đặc điểm các nhân tố sinh thái cơ bản RNM Cần Giờ là một hệ sinh thái ngập mặn cĩ vai trị và vị trí đặc biệt quan trọng đối với MT và cộng đồng dân cư địa phương trong vùng. Là rừng mới tái sinh nhưng RNM Cần Giờ là Khu Dự trữ Sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam với hệ thực vật và động vật rất phong phú mang tính đa dạng sinh học cao [34], [39]. Hình 1.1. Rừng ngập mặn Cần Giờ Về vị trí địa lý khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu hệ thống sơng Đồng Nai – Sài Gịn nằm ở cửa ngõ Đơng Nam Tp. Hồ Chí Minh. Tọa độ: 10°22’ – 10°40’ độ vĩ Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đơng. Cách trung tâm Tp. Hồ Chí Minh khoảng 70km, phía Bắc Cần Giờ giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Chiều dài khu vực từ Bắc xuống Nam là 35 km, từ Đơng sang Tây là 30 km [39]. Ở RNM Cần Giờ, nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ dao động nhiệt trong ngày từ 5 – 70C. Khí hậu nĩng ẩm và chịu sự chi phối của quy luật giĩ mùa xích đạo. Nhiệt độ khơng khí cĩ ảnh hưởng khá lớn đến sinh trưởng, phát triển của sinh vật RNM. Chapman (1977) cho rằng RNM chỉ phát triển khi biên độ nhiệt ở tháng lạnh nhất cao hơn 200C, và biên độ dao động theo mùa khơng quá 100C [36], [34], [39]. Trong các nhân tố khí hậu ở RNM thì lượng mưa là nhân tố quan trọng. Ở đây, mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khơ từ tháng 1 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1300 đến 1400 mm hàng năm. Độ ẩm cao hơn các nơi khác trong khu vực Tp.Hồ Chí Minh: mùa mưa là 70 – 83%, mùa khơ là 74 – 77%; ẩm nhất vào tháng 9, khơ nhất vào tháng 4. Lượng nước bốc hơi bình quân 4mm/ ngày và 1204mm/tháng [34]. Ngồi ra, giĩ cũng là nhân tố tác động tới sự phân bố của thực vật RNM qua sự ảnh hưởng tới độ thốt hơi nước và tác động tới sự phát tán bào tử VSV [36]. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hố, quá trình nhiễm mặn đồng thời nĩ được phát triển trên một đầm mặn mới do phù sa sơng Sài Gịn và sơng Đồng Nai mang đến lắng đọng tạo thành nền bùn ngập mặn. Độ mặn của nước ở Cần Giờ phụ thuộc rất nhiều yếu tố như giĩ mùa, thuỷ triều, mưa, nước dâng và đặc biệt chịu ảnh hưởng rõ rệt từ nguồn nước ngọt ở thượng nguồn chảy xuống (do hoạt động của hồ Trị An, Dầu Tiếng…) đã làm thay đổi qui luật hoạt động nhiễm mặn ở Cần Giờ. Độ mặn nơi đây dao động 1,8 – 3%. Độ mặn là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, tỉ lệ sống của các lồi cây ngập mặn và phân bố của RNM. Hầu hết cây ngập mặn sinh trưởng tốt ở nước cĩ độ mặn từ 25% đến 50% độ mặn nước biển. Nhiều ý kiến cho rằng, muối là nhân tố quan trọng, tác động thơng qua quá trình chọn lọc tự nhiên thích nghi, tạo điều kiện để cây ngập mặn tồn tại, phát triển [36]. RNM Cần Giờ chịu tác động của chế độ bán nhật triều khơng đều của biển Đơng. Mỗi tháng cĩ khoảng 2 ngày nhật triều khơng đều xuất hiện 2-3 ngày trước, giữa và cuối tháng âm lịch. Mực nước trung bình cao nhất thường xuất hiện vào tháng 10, 11 và thấp nhất vào tháng 6, 7 [39]. Chế độ bán nhật triều với biên độ triều cao là một trong những nhân tố thuận lợi cho RNM sinh trưởng so với vùng cĩ nhật triều. Các dịng hải lưu ở đây là nhân tố chính giúp phát tán quả, hạt, trụ mầm và SV dọc theo các vùng ven biển. 1.1.2. Đặc điểm của các khu hệ SV tại RNM Cần Giờ RNM Cần Giờ cĩ hệ SV vơ cùng đa dạng và phong phú, trong đĩ cĩ nhiều lồi đem lại những giá trị kinh tế cao. Về thực vật: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ cĩ trên 150 lồi thực vật, các lồi chủ yếu như Bần trắng, Mấm trắng, các quần hợp Đước đơi - Bần trắng cùng Xu, Ổi, Trang, Đưng… Các loại cây nước lợ như Bần chua, các quần hợp Mái dầm – ơrơ, dừa lá, ráng… Thảm cỏ biển với các lồi ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp [66]. Động vật: bao gồm động vật thủy sinh khơng xương sống với trên 700 lồi, khu hệ cá trên 130 lồi, 9 lồi lưỡng thê, 31 lồi bị sát, 4 lồi cĩ vú. Trong đĩ cĩ 11 lồi bị sát cĩ tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (Gekko gekko), kỳ đà nước (Varanus salvator), trăn đất (Python molurus), trăn gấm (Python reticulatus) … Khu hệ chim cĩ khoảng 130 lồi thuộc 47 họ, 17 bộ [66]. Thảm động thực vật nơi này trở thành nguồn cung cấp thức ăn và nơi trú ngụ cho rất nhiều lồi thủy sinh, các động vật cĩ xương sống và hệ VSV. Vi sinh vật rất đa dạng gồm cĩ: vi khuẩn, nấm, tảo  Vi khuẩn VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV phân huỷ, chúng đĩng vai trị trung tâm về mặt chức năng trong hệ sinh thái này. Số lượng VK trong rừng ngập mặn chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát. Nhiều lồi sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đĩ, VK cĩ thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các lồi tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển [36].  Nấm Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng, phần lớn là vi nấm, chỉ cĩ một số lồi cĩ kích thước lớn. Nấm đĩng vai trị quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng gĩp phần phân huỷ nhanh xác lá thực vật (Fell và cộng sự, 1975). Người ta cĩ thể phân loại nấm dựa trên mơi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hơ hấp và trong đất, nhưng cũng cĩ một số lồi cĩ thể sống được từ hai MT trở lên [36]. Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn cĩ các lồi nấm ký sinh và hoại sinh như: Ascomycetes, Bacidomycetes và Deuteromycetes. Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm cĩ mặt trên lá cây Đước đỏ (R. mangle) khi cịn trên cây: Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và Aureobacidium [36]. Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium và Cercospora. Hầu hết các lồi nấm trên đất liền đều cĩ trên lá cây ngập mặn, cịn các lồi nấm biển thì cĩ trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn. Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển. Các mẫu gỗ để ngâm trong nước biển cĩ tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao [36] Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là sinh vật phân huỷ đầu tiên nhờ khả năng phân giải cellulose, lignin. Fell và Masters (1973) đã nghiên cứu tồn bộ quá trình phân hủy của lá cây ngập mặn đồng thời phân lập được 66 chi nấm, đại diện là các chi Phycomycetes, Thraustochytrium, Aspergillus, Penicillium, Tricoderma, Fusarium… Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và cây con thường là nấm hoại sinh gĩp phần phân huỷ xác thực vật. Chúng cịn gĩp phần phân huỷ cỏ biển, bùn và đầm lầy mặn. Những lồi này chịu được điều kiện mặn của RNM [36].  Tảo Tảo mọc ở RNM thường làm thành lớp phủ màu hồng, nâu hoặc lục nhạt phát triển trên các MT: bề mặt bùn, bề mặt thân cây, rễ, những cành và tán phía trên. Trong đĩ trên bề mặt bùn gồm cả tảo đơn bào, tảo đa bào mà chủ yếu là tảo xanh lục. Người ta liệt kê cĩ khoảng 41 lồi tảo silic trên mặt bùn quần xã RNM; Chúng khơng hình thành trên các vùng rõ ràng mà tùy thuộc vào độ ngập triều [36]. Tảo bùn cĩ tầm quan trọng trong kinh tế đất vì nĩ làm tăng hàm lượng hữu cơ trong đất nhờ quá trình quang hợp. Tảo cịn tạo ra độ thống khí giữa các hạt đất, tiết ra các chất nhầy hình thành phức hệ keo, tảo xanh lục dị dưỡng làm tăng hàm lượng đạm cho đất nhờ khả năng cố định đạm [36]. Các SV trong RNM làm nên sự đa dạng sinh học của các quần xã RNM, chúng là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố khơng thể thiếu trong chu trình chuyển hĩa vật chất ở RNM Cần Giờ. 1.1.3. Vai trị của RNM đối với hệ sinh thái RNM cĩ liên quan mật thiết với các đầm lầy mặn, các bãi bùn, bãi cỏ ven biển hoặc các quần xã cửa sơng khác. Dịng nước ngọt đổ từ thượng nguồn ra biển, dịng nước triều từ biển lên xuống các vùng cửa sơng đều đi qua RNM. Các dịng nước này vận chuyển vật chất, SV từ quần xã này tới quần xã khác và như vậy hệ sinh thái RNM chính là nơi giao lưu của các quần xã, tạo nên sự phong phú về thành phần SV cho nơi này [36]. Hệ thực vật RNM bao gồm các lồi thực vật (Sú, Vẹt, Mắm, Đước, Bần,…) sống trong vùng nước mặn, hệ rễ của cây gĩp phần vào việc làm giảm tốc độ dịng chảy của thủy triều, tạo điều kiện lắng đọng bùn, các vật chất lơ lửng, chúng gĩp phần bảo vệ vùng ven bờ; cung cấp các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc,…Bên cạnh đĩ, hệ thực vật cịn đĩng vai trị quan trọng trong việc điều hịa khí hậu, cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển [34]. RNM cịn là nơi kiếm ăn, sinh sản và cư trú của nhiều lồi hải sản cĩ giá trị kinh tế cao như tơm, cua, cá,... Mới đây, Bell và cộng sự (1984) khẳng định RNM là vườn ươm quan trọng cho các lồi cá sống ở cửa sơng. Khi so sánh thành phần các lồi cá và tơm trong một vùng cĩ RNM vào các mùa vụ trong năm đều thấy lượng con non của các lồi này đều cao hơn hẳn các vùng đất, cát ở ngồi đầm. Từ đây cho thấy RNM là nơi nuơi dưỡng chính cho con non của nhiều lồi hải sản [36] Các lồi động thực vật, VSV sống trong MT tự nhiên của RNM Cần Giờ liên kết với nhau thơng qua các quá trình trao đổi chất và đồng hĩa năng lượng nhằm khép kín chu trình dinh dưỡng của hệ sinh thái này. Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng đều chịu sự ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngồi như: thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa. RNM phát triển tốt nhất ở nước cĩ nồng độ muối 15 - 25‰ [36] Tuy nhiên, hiện nay RNM đang cĩ những thay đổi đáng kể trước áp lực của việc đánh bắt cá, tơm,… khai thác gỗ, củi, nhiên liệu, nuơi trồng thủy sản, du lịch… Sự tác động này nếu quản lý khơng tốt thì các vùng đất RNM sẽ bị suy thối và khơng thể tồn tại lâu bền. 1.2. TỔNG QUAN VỀ NẤM SỢI 1.2.1. Đặc điểm sinh học của NS NS là VSV cĩ nhân chuẩn. Hệ nấm cĩ cấu tạo khuẩn ty dạng sợi, sợi nấm (hypha) là những ống dài phân nhánh hay khơng phân nhánh, cĩ hay khơng cĩ vách ngăn ngang (septum), đường kính sợi từ 3-3,5 µm. Các sợi nấm phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay cịn gọi là khuẩn ty thể [58]. Cấu trúc sợi nấm gồm cĩ thành tế bào, màng, tế bào chất và nhân. Thành tế bào NS chứa kitin-cellulose hoặc kitin-glucan [58]. Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm. Khuẩn lạc NS thường cĩ dạng hình trịn hoặc gần trịn. Bề mặt KL cĩ thể mượt, nhẵn bĩng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, cĩ những vết khứa xuyên tâm hoặc lồ lõm khơng đều. Mép KL trơn, răng cưa [60] Một số sợi nấm cĩ thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm. Các đặc điểm hình thái khác cĩ tính đặc trưng cho lồi như bĩ sợi, bĩ giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hịa tan [58],... Phương thức dinh dưỡng của NS là hấp phụ qua màng, khơng cĩ cơ quan tiêu hĩa, khơng cĩ khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật. Hình1.2. Cấu trúc sợi nấm NS sinh sản chủ yếu bằng bào từ, bào tử cĩ thể hình thành theo kiểu vơ tính hoặc hữu tính. Bào tử vơ tính gồm các dạng bào tử trần hay bào tử kín, trong đĩ bào tử trần là phổ biến nhất. Trong sinh sản hữu tính, NS cĩ các hình thức đẳng giao, dị giao và tiếp hợp [59]. NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất cĩ hoạt tính sinh học như: enzym, các chất KS, các axit hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và đem lại lợi ích kinh tế cao. Bên cạnh đĩ, từ NS cịn cĩ các chất cĩ khả năng phân giải nguồn cacbonhydro ứng dụng trong xử lý ơ nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lịng đất [1], [57], [59].  Khả năng sinh các enzym ngoại bào NS đã trở thành nguồn VSV chủ yếu dùng trong việc sản xuất enzym. Hiện nay, từ NS người ta đã sản xuất được trên 80 loại enzym khác nhau, trong đĩ cĩ 10 enzym được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật. Một số enzym ngoại bào từ NS được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như cellulase, protease, amylase, pectinase và chitinase [21], [26], [29].  Cellulase là enzym xúc tác phân giải các hợp chất lingo –cellulose thành glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi- cellulose và lignin (15-30%). Các chủng NS Trichoderma, Penicillium, Aspergillus…cĩ khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bĩn, xử lý chất thải hữu cơ, các xác bã thực vật chứa cellulose ở RNM [21].  Protease là enzym thủy phân các phân tử protein tạo thành các chuỗi polypeptide ngắn. NS cĩ khả năng phân giải mạnh protein chứa trong các xác bã động vật ở RNM thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,…Protease cịn được sử dụng nhiều trong cơng nghiệp bột Hình1.3: Hình thái khuẩn ty NS Hình1.4 Hình thái khuẩn lạc NS Hình1.5: Hình thái một số dạng bào tử của NS giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác nhau như cơng nghiệp dược, cơng nghiệp thuộc da, cơng nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải...[29].  Amylase là enzym xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4-glucoside và α-1,6-glucpside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. NS cĩ khả năng phân giải tinh bột nhanh chĩng là những tác nhân khơng thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor… Amylase được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất sirơ, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong cơng nghiệp dệt....[21].  Chitinase là các biopolymer chứa các gốc N-acetyl-glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tơm, cua, ốc rất nhiều. Nhiều lồi NS thuộc chi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… cĩ khả năng sinh chitinase, giúp tăng cường khả năng tiêu diệt các lồi nấm gây bệnh và chống các lồi cơn trùng cĩ vỏ kitin. [21]. Các chủng NS thuộc chi Acremonium, Aspergillus, Penicillium cịn cĩ khả năng sinh các enzym phân giải dầu gĩp phần xử lý ơ nhiễm dầu giúp bảo vệ MT tự nhiên và SV sống ở RNM Cần Giờ [35].  Khả năng sinh KS của NS KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện trượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình cĩ tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. Các chất KS cĩ nguồn gốc từ NS chiếm tỷ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất tồn. Chất KS được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu thuật, chúng được dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương [11]. Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức cĩ nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất KS được sinh ra từ VSV đang là mối quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [11]. Ngồi ra, trước nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều trong cơng nghệ thực phẩm, cơng nghệ chế biến mủ cao su, trong cơng nghiệp nhẹ và cả trong y học. Axit hữu cơ sản xuất từ NS được nghiên cứu nhiều hơn: Năm 2004, Võ Thị Hạnh nghiên cứu sản xuất axit citric bằng NS Aspergillus niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì; các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum [29]. Bên cạnh những lợi ích trên, nhiều lồi NS là nguyên nhân gây hư hỏng hoặc giảm chất lượng của thực phẩm, dụng cụ quang học,... Một số NS tiết độc tố gây ngộ độc hoặc cĩ thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số NS gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm chân tay…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bơng ở lúa…[6], [7]. 1.2.2. Vị trí phân loại Cho đến nay, người ta ước tính trong tự nhiên cĩ khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu lồi nấm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 lồi. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 lồi. Riêng các lồi nấm thuộc lớp Nấm bất tồn ở nước ta hiện chỉ mới phát hiện được 338 lồi thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Việc phân loại NS chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, nuơi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hĩa và phương thức sinh sản [6]. Về phân loại nấm, hiện nay cĩ hai hệ thống phân loại nấm được sử dụng phổ biến hơn cả là: Hệ thống phân loại hình thái học và hệ thống phân loại phát sinh, với nhiều khĩa phân loại được sử dụng như: Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Barnett và cộng sự (1972), Ainsworth G.C và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Kendrich (1992), Ainsworth & Bisby (1995). Trong luận văn này, chúng tơi phân loại nấm dựa vào các đặc điểm mơ tả theo hệ thống phân loại của Ainsworth và cộng sự (1973), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984, 2004), Nguyễn Lân Dũng (2006) [57]. Trong những năm gần đây, với sự tiến bộ của sinh học phân tử đã đem lại phương pháp mới cho việc nghiên cứu phân loại học. Người ta sử dụng phương pháp nhân gen và giải trình tự gen (PCR-Plymerase Chain Reaction) để thu được kết quả phân loại nhanh và chính xác [40]. 1.2.3. Tình hình nghiên cứu khu hệ NS ở RNM nĩi chung và NS sinh amylase ở RNM nĩi riêng. Hiện nay cĩ khoảng 800 – 1000 lồi nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995 ; Jones, 1995), trong khi đĩ một số lượng lớn các lồi nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu biết về nấm RNM và vai trị của chúng đối với khu hệ sinh thái này cịn quá ít và chưa đầy đủ. Cĩ thể nĩi đây là một mảng rỗng của ngành VSV học (Agate A.D., Subraramnian, C. V and Anuci, V, 1998) [43]. Sự nghiên cứu về nấm RNM chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950. Những năm đầu, việc nghiên cứu xác định tính đa dạng của nấm trong RNM cịn rất lẻ tẻ, nhưng sau này các nhà khoa học đã thành lập hội nghiên cứu nấm tồn thế giới trong đĩ cĩ nấm biển ở RNM. Nhiều nước trên thế giới đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hĩa các lồi nấm biển cĩ mặt ở vùng RNM của họ. Ví dụ : Ấn Độ đã phân loại được 170 lồi, Hồng Kơng 170 lồi, Đài Loan 7 lồi, Singapore 156 lồi, Nhật 26 lồi, Úc 67 lồi, Mexico 94 lồi, Đức 4 lồi, Thái Lan 83 lồi,…[49] Năm 1979, Kohlmeyer phân lập 42 lồi vi nấm RNM thuộc các ngành phụ Ascomycotina, Deuteromycotina và Basidiomycotina Năm 1987, Hype và cộng sự cơng bố phát hiện được 89 lồi nấm từ cây Rhizophora mucronata lanak ở RNM Ấn Độ [48]. Năm 1988, Agate A. D., Subramania C. V và Vanuci M., đã nêu ra 8 lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV ở RNM cần các nhà khoa học giải quyết, trong đĩ cĩ sự phân loại, hệ thống hĩa cơ bản các lồi VSV của RNM trên thế giới [43]. Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 lồi nấm RNM trên tồn thế giới. Trong đĩ bao gồm 87 lồi thuộc Ascomycetes, 31 lồi thuộc Deuteromycetes và 2 lồi thuộc Basidiomycetes. Năm 1994, Newell S.Y phân lập được các lồi nấm nhày (Oomycetes) ưa mặn từ lá cây mục ở RNM, cĩ khả năng phân hủy xác động vật, thực vật ở đĩ. Năm 1995, Hyde và Lee ; Kohlmeyer et al., đưa ra nhận định các nấm RNM đĩng vai trị quan trọng đối với các chu trình tuần hồn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ cĩ một thơng báo của Mai Thị Hằng và cộng sự về nấm sợi RNM Giao Thủy, Nam Định. Năm 2001, tác giả này tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh enzym ngoại bào của 144 chủng phân lập từ RNM Giao Thủy. Năm 2002, Mai Thị Hằng nghiên cứu khả năng diệt cơn trùng và khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình [52]. Với rừng RNM, những phát hiện khoa học đầy thú vị chưa dừng lại ở đĩ. Các nghiên cứu VSV trong RNM ven biển đồng bằng sơng Hồng và Cần Giờ (2001-2003) đã chứng minh được: ở các hệ sinh thái RNM này cĩ tới 83/199 chủng nấm cĩ khả năng phân giải dầu mỏ ở các mức độ khác nhau. Đĩ là các lồi NS thuộc một số chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paecilomyces, Canninghamela cĩ khả năng phân giải dầu DO rất mạnh [69]. Theo nhĩm nghiên cứu của Phan Nguyên Hồng và Nguyễn Hồng Trí, những chất thải rắn trong sinh hoạt, y tế, cơng nghiệp, nơng nghiệp cùng với các hĩa chất dư thừa từ nội địa theo sơng ra RNM được giữ lại và nhờ VSV phân hủy, biến chúng thành thức ăn cho hệ sinh vật ở đây, làm trong sạch nước biển. Chính vì thế “người ta đã ví RNM là quả thận khổng lồ lọc các chất thải cho MT vùng ven biển” [69]. Năm 2004, Phan Thị Phương Hoa nghiên cứu phân loại 67 chủng NS thuộc chi Aspergillus phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình. Đây là một nghiên cứu được đánh giá cao trong số các nghiên cứu về NS ở RNM Việt Nam [8]. Đến năm 2007 mới cĩ tác giả Khưu Phương Yến Anh“Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ” [1] Năm 2009, cĩ tác giả Nguyễn Thị Bích Viên “Khảo sát một số đặc tính sinh học của một số chủng NS thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân lập được từ RNM Cần Giờ” [41]. Bên cạnh việc tìm kiếm những chủng NS mới ở RNM, người ta cịn nghiên cứu các đặc tính sinh học của chủng này. Ví dụ, để thu nhận amylase thì dùng các chủng Aspergillus, Rhizopus. Một số lồi của Neurospora, Mucor tổng hợp rất mạnh cả hai loại α-amylase và glucoamylse (Rodzevits, Butova 1965, Fennkxova. Rư-zakova 1966 ; Phillips, Caldwell 1951. Corman Lanalu-ke, 1948) [17]. Một số cơng trình nghiên cứu của Azarova (1981) ; Jerebtxov, Pankratove (1977) cho thấy glucoamylase cĩ khả năng thủy phân hồn tồn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối tới glucose [17]. Năm 2001, nhà khoa học Nhật Bản B.N. Okolo đã tiến hành tinh sạch và xác định một số tính chất của amylase phân giải tinh bột sống mới từ A. cacbonarius Năm 2008, tạp chí khoa học United States Patent Application cĩ đăng cơng trình “Nghiên cứu về α-amylase ngoại bào của chi Aspergillus” của Baldwin, Toby M, …cho thấy sự liên quan giữa việc sinh α- amylase và glucoamylase của chi nấm này [15]. Tại Việt Nam, năm 1974, tác giả D. V Hợp nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase từ A. niger. Năm 1977, tác giả L. V. Chứ, Đ. T. T Thu nghiên cứu sản xuất chế phẩm glucoamylase với đối tượng A. awamorii . Đến năm 1984, N. B Ngà và N. L Dũng nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các lồi A. oryzae, A. niger, A. awamorii cĩ hoạt tính α-amylase và glucoamylase cao để thủy phân tinh bột sắn. Năm 1993, cĩ cơng trình : “Nghiên cứu chọn lọc chủng Asp. niger TH3 – 19K của Nhật Bản cĩ hoạt tính glucoamylase cao dùng để thủy phân tinh bột sống” của tác giả D. V Hợp và cộng sự. Năm 1998, Hồng Kim Anh, Ngơ Kế Sương, Nguyễn Thị Phương Thủy cĩ cơng trình “Thu nhận amlyse từ nấm mốc Aspergillus sp” [2]. Ở Việt Nam, viện Sinh học Nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII, BioIII… cĩ dạng bột, chứa các enzym protease, cellulase, amylase và các VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho cá, heo, bị. Chế phẩm cĩ tác dụng phịng chống chứng rối loại tiêu hĩa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[57]. Năm 2002, Mai Thị Hằng và cộng sự cũng cĩ những khảo sát về khả năng sinh enzym amylase của NS phân lập từ RNM Nam Định và Thái Bình [10] Năm 2009 tác giả Nguyễn Thị Lan Hương “Nghiên cứu về khả năng sinh enzym amylase của một số chủng NS ở RNM Cần Giờ” [15]. Cĩ thể nĩi những nghiên cứu về NS sinh amylase trên đất liền khá phong phú và đa dạng, cịn những nghiên cứu về amylase của NS từ RNM Cần Giờ vẫn cịn khá ít ỏi, chưa tương xứng với tiềm năng. 1.3. TINH BỘT VÀ HỆ ENZYM AMYLASE 1.3.1. Tinh bột Tinh bột khơng phải một hợp chất đồng thể mà gồm hai polysaccarit khác nhau: amilose và amilopectin [5].  Thành phần cấu trúc của amylose. Amilose là loại mạch thẳng, chuỗi dài từ 500-2000 đơn vị glucozơ, liên kết nhau bởi liên kết α−1,4 glicozit. Hình1.6 – Phân tử Amilose  Thành phần cấu trúc của amilopectin Amilopectin là polyme cĩ mạch nhánh, ngồi mạch chính cĩ liên kết α-1,4 glucozit cịn cĩ nhánh liên kết với mạch chính bằng liên kết α-1,6 glucozit. Cấu tạo của amilopectin cịn lớn và dị thể hơn amilose nhiều. Trong tinh bột tỉ lệ amiloza/amilopectin khoảng ¼. Tỉ lệ này cĩ thể thay đổi phụ thuộc thời tiết, mùa vụ và cách chăm sĩc. Hình1.7 – Phân tử amilopectin Ở nước ta, nguồn nguyên liệu chứa tinh bột thì vơ cùng đa dạng và phong phú. Nhưng để phù hợp cho sản xuất enzym amylase ở qui mơ cơng nghiệp thì cần phải tính đến chi phí cho giá thành sản phẩm [5], [23], [28]. 1.3.2. Hệ enzym amylase Amylase là tên gọi của một nhĩm enzym cĩ tác dụng xúc tác thủy phân liên kết glucoside trong polysaccharide (tinh bột) và các dextrin cuối. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân là glucose, maltose và dextrin [15], [31], [44]. Các amylase chủ yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: 1.3.2.1. α – amylase hay α-1,4-glucohydrolase Là enzym phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amilose và amilopectin một cách ngẫu nhiên khơng theo trật tự nào cả. Việc tác dụng α – amylase lên hồ tinh bột làm giảm nhanh khả năng bắt màu của tinh bột với iod và độ nhớt của dịch hồ, amilose tạo thành maltose và maltotriose. Nếu trong thời gian dài thì sản phẩm thủy phân của amilose chứa 13% glucose và 87% maltose. Cịn amilopectin sẽ tạo thành maltose, maltotriose và dextrin phân tử thấp cùng 5-10% glucose [5], [21]. α – amylase thủy phân tinh bột chủ yếu tạo thành maltose và dextrin phân tử thấp khơng tạo màu với iod. Chúng cĩ ở thực vật, động vật và đặc biệt là ở rất nhiều VSV. α – amylase dễ tan trong nước, dung dịch muối, rượu lỗng. Tất cả các α – amylase đều chứa từ 1-30 nguyên tử gam canxi (Ca)/mol. Nếu tách hồn tồn Ca khỏi phân tử enzym thì α – amylase mất khả năng thủy phân cơ chất vì Ca tham gia hình thành và ổn định enzym. Ca cịn tác dụng đảm bảo α – amylase cĩ độ bền cực lớn với các tác động gây biến tính và phân hủy bởi các enzym phân giải protein [21] α – amylase từ các nguồn thu nhận khác nhau thường khơng giống nhau. + pH thích hợp cho hoạt động của đa số α – amylase từ NS là 4,5 – 5,5; của đại mạch nảy mầm và thĩc mầm là 4,7 – 5,4; và của VK là 5,5 – 6. pH tối thích của α – amylase từ A. oryzae là 4,8 – 5,8 [26]. + Độ bền của α – amylase với tác dụng của axit từ NS được sắp xếp theo thứ tự sau: A. batatae > A. usamii> A. oryzae> A. awamori> B. subtilis> thĩc mầm [21]. + α – amylase của NS rất nhạy cảm với hoạt động của nhiệt độ tối thích khoảng 40 - 500C, thĩc mầm và malt là 58 – 600C và VK là 70 – 750C [21]. α – amylase hầu như khơng tác dụng trên tinh bột nguyên thủy nhưng thủy phân hồ tinh bột rất nhanh. Thủy phân tinh bột bằng α – amylase thường xảy ra hai giai đoạn: * Giai đoạn đầu: (Giai đoạn dextrin hĩa) chỉ một số liên kết trong phân tử bị đứt và độ nhớt từ hồ tinh bột giảm Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp * Giai đoạn 2: (Giai đoạn đường hĩa) thủy phân các dextrin phân tử lớn vừa hình thành [17] Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose 1.3.2.2. β – amylase hay β (1 - 4) glucomaltohydrolase α-amylase Là ngoại enzym chỉ phân cắt các liên kết α – 1,4 glucoside ở đầu mạch. Chỉ phổ biến ở thực vật, nhiều ở hạt nảy mầm. Vi khuẩn khơng cĩ enzym này, cịn NS chưa được chứng minh hồn tồn về sự hiện diện của enzym này [5], [21]. β – amylase kém bền ở nhiệt độ cao, vơ hoạt hồn tồn ở 700C nhưng trong dịch nấu thì nhiệt độ tối thích là 60 – 650C. Enzym này khá bền trong MT axit ở pH 3-4. Đa số β – amylase hoạt động mạnh hơn ở MT pH 4,5-5 và vẫn giữ được hoạt tính khi khơng cĩ canxi. Điểm khác biệt của enzym này so với α-amylase là hầu như khơng tác dụng lên tinh bột sống mà chỉ phân giải hồ tinh bột. Chúng phân giải 100% amilose và 54-58% amilopectin thành maltose [26]. 1.3.2.3. Glucoamylase hay amyloglucozidaza, cịn gọi là γ-amylae Đây là enzym đường hĩa quan trọng nhất trong hệ amylase. Glucoamylase xúc tác thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu khơng khử trên mạch amilose và amilopectin tạo sản phẩm cuối cùng là glucose. Glucoamylase cĩ khả năng thủy phân hồn tồn tinh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose [21], [26], [44]. Trong số các VSV cĩ khả năng sinh glucoamylase đã được biết cho đến nay, chi Aspergillus là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh glucoamylase rất cao, đặc biệt là lồi Aspergillus niger. Đa số chế phẩm glucoammylase của VSV đều hoạt động tốt ở vùng axit, pH tối thích 4,5 – 5,0. Tuy hoạt động tốt trong vùng axit nhưng glucoamylase của một số chủng VSV cũng bền ở pH kiềm. Ví dụ glucoamylase của lồi Coniphora cerebella và Corticum rolfsii tương đối bền ở pH=9, glucoamylase của Mucor rouxianus bền ở pH=8 [21], [44]. Nhiệt độ tối thích của glucoamylase 50 – 600C. Tuy nhiên, cũng cĩ trường hợp glucoamylase hoạt động tốt nhất ở 65 – 700C, ví dụ như glucoamylase của lồi C. thermosaccharolytium. Glucoamylase bị ức chế mạnh bởi Hg+ nhưng các ion Mn2+ và Fe2+ lại cĩ tác dụng kích thích sự hoạt động của enzym này [5], [21], [29]. 1.3.3. Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp amylase của NS a. Giống nấm sợi Trong các yếu tố thì chủng giống NS là điều kiện đầu tiên và cơ bản nhất quyết định sự hình thành và hàm lượng amylase. Khơng phải tất cả các chủng nấm đều cĩ khả năng tổng hợp amylase như nhau. Ngày cả những chủng cùng chi, thậm chí cùng lồi cũng rất khác nhau về lượng enzym do chúng sản sinh ra. Chính vì thế mà việc tuyển chọn chủng NS cĩ khả năng tạo nhiều amylase là điều vơ cùng quan trọng [26], [31]. Bên cạnh việc tuyển chọn được chủng NS cĩ khả năng sinh amylase cao, cần phải đồng thời tiến hành nuơi cấy trong các điều kiện tối ưu nhằm đảm bảo khả năng tổng hợp enzym cao nhất và ổn định nhất. Sau đĩ, cần phải tiến hành bảo quản giống một cách cẩn thận để giữ được hoạt tính ban đầu. b. Nguồn dinh dưỡng Các yếu tố trong thành phần MT ảnh hưởng lớn tới hoạt động sống và sự tạo thành enzym của NS. Vì vậy, trong MT nuơi cấy cần bảo đảm đầy đủ các thành phần dinh dưỡng và tỉ lệ các chất dinh dưỡng hợp lý, phù hợp với từng loại NS [26]  Nguồn dinh dưỡng cacbon Trong MT nuơi cấy NS sinh amylase nhất thiết phải cĩ nguồn tinh bột làm chất cảm ứng và nguồn cacbon. NS cĩ khả năng đồng hĩa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat dễ hấp thu nhất với NS là glucose - là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào chu trình chuyển hĩa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [26]. Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác nhau cũng cĩ ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các enzym riêng biệt của hệ amylase. Ví dụ như để đảm bảo hoạt lực α-amylase cao cần 6% tinh bột, cịn với glucoamylase là 2% [26]. Nguyên liệu sử dụng cho nuơi cấy NS thu amylase thường là những nguyên liệu cĩ nguồn gốc tự nhiên như cám mì, cám gạo, ngơ mảnh, đậu nành và các loại hạt ngũ cốc khác. Trong đĩ cám gạo, cám mì được sử dụng nhiều hơn cả. Hai loại này cĩ đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho VSV phát triển. Mặt khác, khi chế tạo MT, các nguyên liệu này chúng thường cĩ tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng khơng khí lưu chuyển trong khối nguyên liệu [26].  Nguồn dinh dưỡng nitơ Nguồn dinh dưỡng nitơ để nuơi NS tạo amylase thường được dùng dưới các dạng muối vơ cơ chủ yếu là NaNO3 hoặc NH4NO3 với hàm lượng 0,91% cĩ hiệu quả cao hơn các loại muối khác. Các hợp chất N hữu cơ thường dưới dạng nguyên liệu giàu đạm như: cao ngơ, bột đậu tương, khơ lạc, khơ dầu,…[21], [26]. Khi sử dụng nguồn nitơ nhất định cho vào MT cĩ thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu thụ muối, MT bị acid hĩa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp tích cực glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase. Tỉ lệ giữa cacbon và nitơ trong MT cĩ ý nghĩa rất lớn đối với sự tạo thành amylase. Chỉ khi nào trong MT cĩ đủ lượng cacbon và nitơ cần thiết mới tích lũy được enzym cực lớn. Trong MT Czapeck tỉ lệ giữa tinh bột và NaNO3 là 18:1 [21].  Nguồn dinh dưỡng khống Các chất khống như Fe, Mn, Zn, Cu…cĩ vai trị quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hĩa vật chất qua màng và thành tế bào NS, tham gia vào thành phần cấu tạo protein, enzym, điều hịa các chất trong tế bào…[26] Một số chất khống cĩ vai trị rất quan trọng trong quá trình tổng hợp enzym amylse như: Canxi là thành phần khơng thể thiếu được trong cấu tạo amylase vì nĩ cần cho quá trình tổng hợp và ổn định α-amylase, bảo vệ enzym này khỏi tác động của protease; Magie (Mg) ảnh hưởng đến độ bền nhiệt của enzym. Thiếu MgSO4 sẽ ảnh hưởng đến tổng hợp mọi amylase của NS (Fenikxova, Muxaeva, 1967). Nồng độ tối ưu của muối này cần cho sự tổng hợp α-amylase và glucoamylase là 0,05%. Phospho ảnh hưởng đến sự sinh sản của NS, khi bổ sung phospho hữu cơ vào MT sẽ làm tăng giá trị dinh dưỡng MT và làm tăng tổng hợp amylase 2-3 lần; Tuy nhiên, nếu trong MT cĩ nhiều Mn, Cu, Hg thì sẽ kìm hãm sự tổng hợp amylase [21]. c. Điều kiện nuơi cấy Ngồi các yếu tố dinh dưỡng, trong MT nuơi cấy VSV các yếu tố như nhiệt độ, độ ẩm, pH, thời gian nuơi cấy cũng ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp amylase của VSV. - Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng đa số NS trên MT rắn là 28-320C. Chu kỳ sinh trưởng của NS cĩ thể chia làm 3 thời kì: Thời kì trương và nảy mầm của đính bào tử (10-11 giờ đầu tiên), nhiệt độ cần ở 23-300C. Thời kì sinh trưởng nhanh hệ sợi (4-18 giờ), nấm hơ hấp mạnh nên giữ nhiệt độ phĩng ở 28-290C. Và ở thời kì sinh amylse mạnh (10-12 giờ) ở nhiệt độ 28-290C [26]. - Ảnh hưởng của độ ẩm Trong điều kiện sản xuất, độ ẩm ban đầu của MT thích hợp với NS là 60-65%, VK là khoảng 70%, độ ẩm MT cần phải được duy trì trong quá trình sản xuất. Độ ẩm cao sẽ làm giảm độ thống khí của MT, cịn khi độ ẩm thấp lại kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của VSV. - Ảnh hưởng của pH Đa số NS phát triển và tạo amylase ở MT axit yếu trong khi vi khuẩn lại phát triển và sinh enzym cao ở MT trung tính. pH mơi trường khơng chỉ ảnh hưởng đến lượng enzym tổng hợp mà cịn ảnh hưởng đến chủng loại enzym được tổng hợp. Ví dụ, A. oryzae khi MT cĩ pH=6,5 thì ưu thế tổng hợp thuộc về α – amylase, trong khi đĩ ưu thế thuộc về glucoamylase khi pH của MT là 4,5. - Ảnh hưởng của độ mặn Muối ăn NaCl ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng phát triển của VSV, ngồi tác dụng cung cấp nguồn ion Cl- cịn cĩ tác dụng làm thay đổi sức thẩm thấu của màng tế bào, tạo điều kiện cho việc tiết các chất ra MT [26]. Hầu hết các chủng nấm sợi RNM đều cĩ khả năng phát triển tốt ở nồng độ muối từ 3-5% (Mai Thị Hằng, 2001). Một số chủng cĩ nguồn gốc tại RNM là cĩ khả năng chịu mặn thì sinh trưởng tốt ở nồng độ muối 10%. Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng từ 20 - 30% thì một số NS cĩ thể sống được nhưng mọc rất yếu [12] - Ảnh hưởng của thời gian Thời gian nuơi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzym. Trong quá trình nuơi cấy NS, sự hình thành amylase cực đại thường kết thúc khi NS bắt đầu sinh bào tử. Thời gian kết thúc sự tạo thành amylase thường từ 30 đến 42 giờ. Cịn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất là trong khoảng từ 40 đến 50 giờ [21] 1.3.4. Các phương pháp nuơi cấy NS thu nhận amylase  Phương pháp nuơi cấy chìm – MT nuơi dạng lỏng. NS được nuơi trong dung dịch đường hay dịch thủy phân cellulose, tinh bột cĩ bổ sung nguồn nitơ vơ cơ (NaNO3). Để tạo điều kiện cho NS sinh trưởng và phát triển tốt, tổng hợp nhiều amylase, người ta thường bổ sung thêm vào MT một số chất thích hợp như: nước chiết mầm mạch, nước chiết ngơ,… Phương pháp này địi hỏi phải cĩ cánh khuấy hay máy lắc để đảo trộn MT cung cấp ơxy cho NS phát triển. Để thu nhận enzym, dịch enzym được cơ đặc ở nhiệt độ thấp [26], [28]. Phương pháp này cĩ ưu điểm: -NS được gieo cấy và phân tán khắp mọi điểm trong MT, nên bề mặt xung quanh NS dễ tiếp xúc với dịch dinh dưỡng. - Các thiết bị lên men dễ cơ khí hĩa và tự động hĩa. Song phương pháp nuơi cấy chìm cũng cĩ một số nhược điểm sau: - Địi hỏi trang thiết bị hiện đại, điều kiện vơ trùng tuyệt đối - Trong quá trình nuơi cấy phải thổi khí và khuấy liên tục - Dễ bị nhiễm trùng tồn bộ - Cần chọn thành phần MT với tỉ lệ dinh dưỡng thích hợp và chú ý tới chất cảm ứng để NS sinh enzym ở mức tối đa.  Phương pháp nuơi cấy bề mặt – MT bán rắn Là phương pháp tạo điều kiện cho NS phát triển trên bề mặt MT. Nguyên liệu chính thường là cám mì, cám gạo, cám nếp, bắp xay nhỏ, tấm gạo,…được bổ sung lượng nhỏ (10-20%) trấu, hạt ngũ cốc, mạt cưa,… để làm tăng độ thống khí. MT được bổ sung thêm một số chất dinh dưỡng khác, rồi tiến hành trộn đều với nước sao cho độ ẩm khoảng 55 – 60%. Hấp thanh trùng ở 1-1,5 atm/45-60 phút, để nguội rồi cho bào tử nấm hay NS vào. MT đã cấy giống được tãi lên các khay sạch với chiều dày từ 2 – 5cm và nuơi ở các điều kiện thích hợp. Sau khoảng thời gian nuơi cấy, người ta thu nhận MT đem sấy nhẹ ở 400C để đạt độ ẩm 8-12%, nghiền nhỏ. Đây chính là chế phẩm enzym dạng thơ [26]. Phương pháp này cĩ nhược điểm là: - Tốn diện tích mặt bằng - Khĩ cơ khí hĩa và đặc biệt là khĩ tự động hĩa được tồn bộ quá trình - Chi phí nhân cơng, điện nước...cho một đơn vị sản phẩm cao Trong hai phương pháp trên, thì nuơi cấy NS trên MT bán rắn đem lại hiệu quả cao hơn, vì NS là VSV hiếu khí bắt buộc do đĩ nuơi trên MT này thì độ thống khí cao. Nồng độ enzym tạo thành cao hơn nhiều so với nuơi cấy chìm. MT khơng cần điều kiện vơ trùng tuyệt đối, nếu bị nhiễm VSV lạ cũng dễ dàng xử lý. Chế phẩm dễ sấy khơ, bảo quản, dễ vận chuyển và ít tổn hao hoạt tính enzym. Là phương pháp sử dụng trong điều kiện khơng cần thu enzym tinh khiết, rất dễ thực hiện, quy trình cơng nghệ đơn giản khơng địi hỏi quá cao về trang thiết bị [28].  Phương pháp thu nhận amylase - Từ phương pháp nuơi cấy chìm: Sau khi lọc bỏ sinh khối VSV và các tạp chất rắn khơng tan cịn khoảng 1-3% chất khơ hịa tan, trong đĩ cĩ enzym. Thu dịch lọc, sau đĩ cơ đặc cho giảm thể tích từ 4-10 lần trong điều kiện chân khơng ở 25 – 300C, rồi tiến hành tách enzym. - Từ mơi trường nuơi cấy bề mặt: Chế phẩm enzym thơ được bổ sung lượng nước gấp 4 – 5 lần khối lượng canh trường để hịa tan enzym. Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 10-120C. Dịch chiết thu được cĩ màu nâu sẫm, khá trong. Dịch chiết được cơ đặc chân khơng tới 50-55% chất khơ hịa tan, dịch đậm đặc này cĩ thể bảo quản lâu dài mà khơng mất hoạt lực và rất dễ hịa tan. - Tinh sạch amylase: Sử dụng cồn lạnh (40C) lượng gấp 2 – 2,5 lần lượng dịch enzym đổ từ từ vào dịch lọc, khuấy nhẹ để cồn hịa đều với dịch lọc enzym. Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh. Sau 15 – 24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa. Sấy khơ nhẹ ở nhiệt độ < 400C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết [26] 1.3.4. Ứng dụng của enzym amylase Amylase là hệ enzym thủy phân quan trọng nhất trong ngành cơng nghệ sinh học. Hiện nay, việc sản xuất chế phẩm amylase đã được khai thác theo tiêu chuẩn cơng nghiệp và ứng dụng trong nhiều lãnh vực khác nhau [29]. a. Trong cơng nghệ rượu, cồn, bia Trong vài chục năm gần đây, các nhà sản xuất đã sử dụng chế phẩm amylse từ NS A. oryzae hay A. awamori, B. subtilis để thay thế malt trong việc đường hĩa tinh bột sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu cĩ chứa tinh bột. Việc thay thế này giúp tiết kiệm được hàng vạn tấn tinh bột loại tốt, giảm giá thành sản phẩm và rút ngắn quá trình sản xuất. Người Nhật đã biết sử dụng enzym của nấm mốc trong quá trình đường hĩa để sản xuất rượu Sake từ cách đây hơn 1700 năm. Người Trung Quốc thì đã sử dụng nhiều loại nấm mốc để đường hĩa rượu trong sản xuất rượu từ cách đây 4000 năm. Cịn người Việt Nam đã biết sản xuất rượu từ gạo cách đây hàng ngàn năm [29], [31]. Riêng ở Mỹ, mãi đến thế kỷ XIX khi Takamine người Nhật đưa nấm mốc Aspergillus sang mới biết sử dụng enzym của nấm này thay amylase của malt để sản xuất cồn [29]. b. Sản xuất bánh mì Để rút ngắn thời gian ủ bột, khi thêm 0,002 – 0,003% chế phẩm amylase vào bột nhào sẽ nâng cao chất lượng bánh mì về hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp. Nhiệt độ vơ hoạt α- amylase của NS tương đối cao (700C) nên cĩ thể dùng enzym này với liều lượng lớn mà khơng cĩ hiện tượng dextrin hĩa khi nướng. Hơn nữa, hoạt độ α-amylase lại cao nên cĩ thể đạt đến độ đường hĩa cần thiết rất nhanh chĩng, sau đĩ bị vơ hoạt ngay. Tuy nhiên, chế phẩm enzym nấm mốc thường là một phức hệ enzym, trong đĩ protease cĩ thể làm cho chất lượng bánh mì xấu đi [29]. c. Cơng nghiệp dệt Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước khi tẩy trắng và nhuộm. Trong vải thơ thường chứa khỏang 5% tinh bột và các tạp chất khác. Để làm vải mềm, cĩ khả năng nhúng nước, tẩy trắng và bắt màu tốt người ta thường sử dụng 1 lượng chế phẩm amylase (từ VK hay nấm mốc) khỏang 0,3-0,6 g/l dung dịch và thời gian xử lý 5-15 phút ở nhiệt độ 900C. Phương pháp này khơng làm hại vải, độ mao dẫn tốt, đồng thời đảm bảo vệ sinh. Ngồi ra, amylase cũng được nghiên cứu ứng dụng rộng rãi trong sản xuất đường bột, sản xuất dextrin, maltodextrin, nha glucose, siro, glucose – fructose, sản xuất tương và nước chấm …ở quy mơ cơng nghiệp [29]. d. Trong sản xuất thức ăn gia súc Trong chế biến thức ăn gia súc, thành phần ngũ cốc chiếm một khối lượng rất lớn với thành phần tinh bột rất cao. Để tăng hiệu suất sử dụng năng lượng từ nguồn tinh bột, người ta thường sử dụng chế phẩm amylase của A. oryzae, A. owamorii thêm enzym amylase vào khẩu phần ăn của động vật, nhất là động vật non làm tăng khả năng đồng hĩa dẫn đến tăng trọng nhanh [31]. e. Nghiên cứu sinh học, y học Cĩ rất nhiều nghiên cứu trong y học và lâm sàng học liên quan đến ứng dụng của amylase. Chế phẩm amylase cho phép phát hiện các oligosaccharide phân tử lượng lớn với độ nhạy cao Amylase cùng các enzym khác, được dùng trong chữa bệnh do thiếu enzym, kém khả năng chuyển hĩa chất, bệnh về tiêu hĩa, tim, thần kinh,… Ngồi ra, chế phẩm enzym được dùng để điều chế MT nuơi VSV phục vụ cho cơng tác nghiên cứu khoa học, chuẩn trị bệnh [29], [31].  Một số chế phẩm enzym amylase trên thế giới và Việt Nam Bảng 1.1 : Một số chế phẩm enzym amylase thương mại [21] STT Chế phẩm enzym Tên thương mại Hãng sản xuất 1 α-amylase vi khuẩn Tenase Optiamyl BAN Miles lab Miles Kali-chemie Novo-nordisk 2 α-amylase vi khuẩn chịu nhiệt Termamyl Opti-therm Maxamyl Novo-nordisk Miles Kali-chemie Gist-brocades 3 Amyloglucosidase Diazym AMG Spezym Miles lab Novo-nordisk Fiun Biochemical 4 β-amylase Dextrozym (chứaAMG) Promozym Novo-nordisk Novo-nordisk 5 Biozym MKC. Fugal amylase Fungamyl clarase Amano Novo-nordisk Miles lab Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên vật liệu - Các chủng NS phân lập từ mẫu đất, thân, lá cây tại 5 xã của RNM Cần Giờ - Các VSV kiểm định: E. coli, B. subtilis từ viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh - Chế phẩm amylase từ viện Sinh học nhiệt đới Tp. Hồ Chí Minh - Nguồn nguyên liệu thu nhận enzym: Cám mì, trấu, bột ngơ, đậu tương mua từ chợ Tân Bình.  Các mơi trường sử dụng trong thí nghiệm * MT1 - MT Czapek – Dox cải tiến: dùng để phân lập NS [9], [22], [43] NaNO3 3.5g; KH2PO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.01g (vết); glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút; Cloramphenicol 1% MT. *MT2 - MT cao nấm men (YEA) (Yeast Extraxt Agar) Dùng để nuơi cấy và giữ giống NS [15] , [54] Cao nấm men 4g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5.5 – 6.0; khử trùng 1atm/ 30 phút. *MT3 - MT Malt Extract Agar (MEA): Dùng để bảo quản NS [22], [54] Pepton 1g; Malt Extract 20g; glucose 20g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 5 – 6; khử trùng 1amt/30 phút. *MT4 - MT cảm ứng tổng hợp amylase: Dùng để phân lập nhanh các chủng NS sinh amylase[11], [13], [21] NaNO3 3.5g; K2HPO4 1.5g; MgSO4.7H2O 0.5g; KCl 0.5g; FeSO4.7H2O 0.1g (vết); tinh bột tan 10g; agar 20g; nước biển 1000ml; pH = 6.5; khử trùng 1atm/ 30 phút *MT5 - MT cảm ứng tổng hợp cellulose [1]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g tinh bột tan bằng 10g CMC. *MT6 - MT cảm ứng tổng hợp protease [26]: Tương tự MT4 nhưng khơng sử dụng NaNO3 và thay 10g tinh bột tan bằng 10g casein. *MT7 - MT cảm ứng tổng hợp chitinase[26]: Tương tự MT4 nhưng thay 10g tinh bột tan bằng 10g chitin. *MT8 - MT cảm ứng tổng hợp pectinase[26]: 200g cà rốt gọt vỏ, xay nhỏ, đun với 1000ml nước biển trong 60 phút, thêm 1 ít CaCO3 để trung hịa MT. Sau đĩ lọc lấy nước trong, bổ sung 20g agar; pH = 6,5; khử trùng 1atm/30 phút. *MT9 - MT Meat Peptone Agar (MPA): MT nuơi cấy và giữ giống vi khuẩn kiểm định [11] Pepton 5g; NaCl 5g; cao thịt 5g; agar 20g; nước cất 1000ml; pH = 7.5; khử trùng 1atm/ 30 phút. *MT10 – MT thử khả năng phân giải dầu [1],[11], [35]: KH2PO4 0,3g; MgSO4 0,4g; KNO3 3g; Na2HPO4 0,7g; Dầu DO 50ml; nước biển 950ml; khử trùng 1atm/ 30 phút  Một số MT bán rắn khảo sát khả năng sinh amylase *MT11 [1], [11], [26]: Cám mì 65g; trấu 25g; bột bắp 7,5g; NaNO3 2g; MgSO4 0,05g; KH2PO4 0,2g; KCl 0,05g; urê 0,2g; độ ẩm 50 - 60%, pH = 5 – 6, khử trùng 1atm/ 30 phút. *MT12 [21], [26]: Trấu 55g; cám 30g; bột bắp 5g; bã khoai mì 5g; đường 4g; (NH4)2HPO4 0,1g; ure 0,2g; CaCl20,1g; KCl 0,05g; HCl 0,05g; độ ẩm 50 – 60%; khử trùng 1atm/45 phút. *MT13 [21], [26]: 90% bã khoai mì; 10% trấu, bổ sung dung dịch khống (KH2PO4 0,1%; NH4Cl 0,1%; KNO3 0,3%; MgSO4 0,05%) cho đủ độ ẩm 60%; khử trùng 1atm/30 phút. *MT14 [15]: 50% cám gạo; 33% bã khoai mì; 17% trấu; độ ẩm 60%; pH 5-5,5; khử trùng 1atm/30 phút. *MT15 [15]: Cám 60%; bột đậu nành 30%; bột ngơ 10%; trấu 25%; độ ẩm 60%; pH 5,0-5,5; khử trùng 1atm/60 phút. 2.2. Hĩa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1. Hĩa chất - Cồn, NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, NaCl, HCl,... - Glucose, cao nấm men, nước chiết khoai tây, tinh bột tan, agar, peptone, cao thịt, casein, thuốc thử lugol, HgCl2, Dinitrosalysilic, lactophenol… - Chất KS: Cloramphenycol (Ấn Độ) 2.2.2. Dụng cụ Bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, pipet, que cấy, que gạt, bơng mỡ, đèn cồn, cốc thủy tinh, 2.2.3. Thiết bị Tủ cấy vơ trùng (Việt Nam), tủ lạnh (National - Nhật), tủ giữ mẫu (Sanyo - Nhật), máy giập mẫu (Đức), máy lắc Gerhardt (Đức), cân điện Sartorius (Đức), tủ sấy Memmert (Đức), nồi hấp áp lực Autoclave (Đài Loan), máy đo quang phổ UV – Visible spectrophometer (Nhật), máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật), máy đo pH (Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc), máy ly tâm Rotina (Đức), cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ), máy đo độ ẩm Startorius (Đức),... 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ (Theo A. D. Agate, 1988) [42] Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: Xã Bình Khánh, xã Tam Thơn Hiệp, xã An Thới Đơng, xã Long Hịa…Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2km, các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ cĩ độ mặn 3%, nhiệt độ khoảng 290C; pH 7,02 Lấy các mẫu đất mặt, đất sâu 5-10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thần cành chết khơ cịn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất. Cách lấy: Dùng dao, kéo vơ trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi ni lơng vơ trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu được phân lập ngay khơng giữ quá 24 giờ [43]. 2.3.2. Phương pháp vi sinh 2.3.2.1. Phân lập mẫu theo phương pháp pha lỗng mẫu (F. Uyenco, 1988) * Lấy mẫu và pha lỗng Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vơ trùng. Sau đĩ dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vịng 2 phút, tốc độ 230 vịng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngồi. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha lỗng 10-1. Lắc đều, hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vơ trùng ta được dung dịch pha lỗng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha lỗng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4… * Cấy mẫu Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nơng độ lên đĩa petri chứa MT czapek- dox cải tiến. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đĩ sử dụng que trang đĩ trang tiếp hai đĩa tiếp theo. Hình 2.1. Bản đồ tổng quan về RNM Cần Giờ và các vị trí lấy mẫu * Ủ mẫu Lật ngược đĩa petri, gĩi vào giấy báo, ủ ở nhiệt độ phịng từ 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy chuyền vào ống thạch nghiêng. * Làm thuần Lấy một khuẩn lạc riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hịa vào nước cất, trải đều trên mặt đĩa lần 2. Nếu các dạng khuẩn lạc đồng đều, cĩ màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều cĩ 1 dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết. Sau đĩ chọn khuẩn lạc riêng rẽ cấy truyền vào 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hĩa. 2.3.2.2. Giữ giống trên MT thạch dưới lớp dầu khống (Lumiere và Chevrotier – 1914) Chuẩn bị ống giống đã nuơi ở nhiệt độ phịng và thời gian thích hợp. Dầu khống chứa trong ống eppendorf hấp vơ trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khơ ở 1700C trong 1-2 giờ, để nguội. Dùng que cấy lấy bào tử NS cho vào eppendorf chứa dầu khống vơ trùng. Hàn kín eppendorf bằng paraffin, bảo quản ở nhiệt độ 40C. Phương pháp này cĩ thể bảo quản trong 1-3 năm. 2.3.2.3. Quan sát đại thể NS [6], [7] NS sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ như sau - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vơ trùng. - Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chĩng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2-3 hộp. - Ủ ấm trong một tuần để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát - Dùng kính lúp ba chiều soi mơ tả các đặc điểm: + Hình thái, kích thước KL + Màu sắc mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc của KL + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT, đặc điểm của mép KL + Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt Kl…… 2.3.2.4. Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch [8] - Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. - Dùng khoan nút chai vơ trùng cĩ d = 8mm, khoan các khối thạch. - Chuẩn bị đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bơng thấm nước, nước cất vơ trùng. - Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vơ trùng lên trên bề mặt các khối thạch. - Các phiến kính cĩ khối thạch cấy NS nghiên cứu được đặt trong các hộp petri cĩ sẵn một ít bơng thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vơ trùng. Các hộp petri này được bao và giữ trong tủ ấm 3 - 4 ngày. - Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch cĩ một giọt dung dịch lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất. - Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactyophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản thứ hai. - Dùng kính hiển vi quan sát và vẽ mơ tả các đặc điểm + Hình dạng cuống sinh bào tử. + Hình dạng thể bình. + Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn. + Đặc điểm bào từ đính, màu sắc, kích thước bào tử… 2.3.2.5. Định danh NS bằng kĩ thuật di truyền phân tử (PCR).[40]  Nguyên tắc: Dùng phương pháp PCR để khuếch đại một trình tự gen lên nhiều lần bằng một cặp mồi chuyên biệt là NK28s-F và NK28s-R đặc hiệu một đoạn ADN dài 260 bps cĩ chứa các trình tự đặc hiệu giống. Các phân đoạn ADN sẽ được phân tách qua điện di trên gel agarose 2%. Giải trình tự sản phẩm này và đối chiếu với ngân hàng dữ liệu gen NCBI để định danh NS [40].  Các bước tiến hành: - Nuơi cấy chủng NS trong ống nghiệm từ 2-3 ngày rồi lấy một lượng mẫu NS khoảng ½ hạt gạo cho vào một tube eppendorf - Cho thêm 180µl TE1X và 20µl Prokprep rồi đem ủ ở 560C qua đêm - Thêm 500µl Phenol Buffer và 500µl L2 vào vortex khoảng 15 giây rồi đun sơi ở 1000C trong 15 phút. - Sấy nhẹ rồi thêm vào 250µl Chloroform/Isoamyl Alcohol vào vortex, lắc đều rồi ly tâm 14,000 vịng/phút trong 10 phút - Hút 450µl dịch nổi sang một tube eppendorf mới. Sau đĩ thêm vào 500µl Isopropanol. Giữ tube ở nhiệt độ -200C trong 1 – 2 giờ - Ly tâm 14,000 vịng/phút trong 15 phút ở 40C. Đổ bỏ dịch nổi - Rửa cặn DNA 2 lần, mỗi lần cho 500µl Ethanol 70% vào, úp ngừa tube 3-4 lần. - Ly tâm 14,000 vịng/phút trong 15 phút. Đổ bỏ dịch nổi - Làm khơ cặn DNA ở 560C trong 10 – 15 phút - Hịa tan cặn DNA trong 50µl TE1X. Lấy 5µl dịch ly trích DNA này để thực hiện kỹ thuật PCR nấm - Lấy 5µl DNA của NS sau khi ly trích của vào PCR mix. -Tiến hành điện di nhúng chìm trên gel agarose 2% điện di trên DNA chip trên hệ thống Bio Analyzer. Sản phẩm PCR cĩ độ dài 260 bps. - Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch thì tiến hành giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định chi và lồi của chủng nghiên cứu [40] 2.3.2.6. Xác định hoạt tính enzym ngoại bào: bằng khuyếch tán trên MT thạch (William, 1983).  Nguyên tắc: Dùng thuốc thử với cơ chất màu đặc trưng, phần cơ chất bị NS phân hủy sẽ khơng tạo màu mà tạo vịng phân giải trong suốt quanh khuẩn lạc  Cách tiến hành: Dùng MT định tính đo khả năng phân giải các hệ enzym. + Phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và MT thử hoạt tính enzyme tương ứng (MT4, MT5, MT6, MT7, MT8) cấy chấm điểm (3 điểm/đĩa), giữ các đĩa trong 28-30oC, 3-4 ngày. +Phương pháp đục lỗ trên thạch: - Thu dịch nuơi cấy NS: dùng que cấy vơ trùng lấy 1 vịng que cấy NS vào bình tam giác chứa 50ml MT lỏng vơ trùng. Nuơi cấy trên máy lắc (160 vịng/phút), 4 ngày, 25-28oC - Ly tâm dịch nuơi cấy 3000 tốc độ vịng/phút trong 20 phút. - Lọai bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vơ trùng là dịch enzym thơ, bổ sung 0,04% NaNO3 để khử trùng; cĩ thể giữ dịch ly tâm 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -20oC. - Dùng khoan nút chai vơ trùng (d = 8mm) khoan các lỗ thạch trên MT nghiên cứu tương ứng trong các đĩa. - Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym thơ vào các lỗ khoan trên các MT thử hoạt tính tương ứng. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 4 - 6 giờ. Sau đĩ chuyển sang tủ ấm 28-300C trong 24giờ. - Thuốc thử lugol (hỗn hợp 0,05% I2 với 2,65%KI) cho amylase, cellulose, kitinase; dung dịch 10% HgCl2 cho protease, nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vịng phân giải bằng thước đo KL.  Kiểm tra kết quả - Kiểm tra hoạt tính amylase, cellulase, kitinase: + Nếu NS cĩ hoạt tính amylase sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym. Vùng tinh bột chưa bị phân giải cĩ màu xanh tím đậm. + Nếu NS cĩ hoạt tính cellulase sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym. Vùng cellulose chưa bị phân giải cĩ màu tím hồng nhạt. + Nếu NS cĩ hoạt tính kitinase sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym. Vùng kitin chưa bị phân giải cĩ màu nâu đỏ nhạt. - Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu NS cĩ hoạt tính protease sẽ tạo vịng trong suốt quanh Kl hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym. Vùng chứa protein chưa bị phân giải cĩ màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa.  Đánh giá kết quả - Đặt sấp hộp petri. Dùng thước đo đường kính vịng phân giải (D) và đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d = 8mm) - Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng NS Quy ước: D-d ≥ 25 mm: hoạt tính enzym mạnh; D-d ≥ 20 mm: hoạt tính enzym khá mạnh; D-d ≥ 15 mm: hoạt tính enzym trung bình; D-d ≤ 10 mm: hoạt tính enzym yếu. 2.3.2.7. Xác định hoạt tính KS (Egorov và cộng sự, 1969)  Nguyên tắc: Chất KS do NS sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV khơng phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch KS hay khối thạch chứa nấm tạo vịng vơ khuẩn trong suốt.  Cách tiến hành (Phương pháp khối thạch) : + Cấy các chủng NS nghiên cứu vào MT2 (thay nước biển bằng nước cất) ủ trong tủ ấm từ 3 – 4 ngày. + Lấy một vịng que cấy VSV kiểm định cho vào 3ml nước cất lắc đều tạo dung dịch huyền phù. + MT9 sau khi hấp khử trùng để nguội 40oC, cho dung dịch huyền phù chứa VSV kiểm định vào lắc đều và đổ một lớp mỏng lên đĩa petri, để nguội. + Dùng khoan nút chai vơ trùng khoan các khối thạch cĩ NS cần thử hoạt tính KS. Đặt các khối thạch vào đĩa petri cĩ MT9 đã cấy VSV kiểm định  Kết quả kiểm tra -Khả năng sinh KS được đánh giá bằng hiệu số (D - d, mm). Trong đĩ D: đường kính vịng phân giải, d: đường kính KL (lỗ thạch) - Quy ước: D-d ≥ 25 mm: hoạt tính KS rất mạnh; D-d ≥ 20 mm: hoạt tính KS mạnh; D-d ≥ 15 mm : hoạt tính KS trung bình; D-d ≤ 10 mm: hoạt tính KS yếu 2.3.2.8. Khảo sát khả năng phân giải dầu  Cách tiến hành: Cấy NS trong bình tam giác 250ml chứa 50ml dầu khống (MT10). Sau 15 ngày nuơi cấy tĩnh ở nhiệt độ phịng, đo sinh khối của NS, kiểm tra sự phân bố các giọt dầu và mùi để đánh giá khả năng phân giải dầu của NS [35]  Cách đo sinh khối NS: - Cấy bào tử NS vào bình tam giác. - Sau 15 ngày nuơi cấy, lọc lấy sinh khối NS và đem sấy khơ ở 1050C - Cân trọng lượng của tờ giấy thấm, sau đĩ cân sinh khối NS trên tờ giấy. Lấy kết quả sau trừ kết quả trước ta thu được kết quả sinh khối NS [32]. 2.3.2.9. Phương pháp nuơi cấy NS trên MT lên men bán rắn (MT11)  Mục đích: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp amylase của các chủng NS nghiên cứu  Cách tiến hành: - Cho vào mỗi bình tam giác (250ml) 15g MT xốp, hấp khử trùng 1atm/ 30 phút. - Cho 10ml nước cất vơ trùng vào mỗi ống nghiệm nuơi NS. Dùng que cấy cà nhẹ lên bề mặt thạch để lấy hết bào tử, lắc đều cho bào tử ở dạng huyền phù. - Lấy 3ml dịch bào tử (khoảng 105 – 106 bào tử/1g MT) cho vào MT xốp đã chuẩn bị. Nuơi cấy ở điều kiện thích hợp. 2.3.3. Phương pháp hĩa sinh 2.3.3.1. Phương pháp tách chiết dịch amylase thơ từ canh trường nuơi cấy  Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hịa tan trong nước của amylase, dùng nước cất vơ trùng hịa tan tạo dịch enzym amylase thơ.  Cách tiến hành: Cho 100ml nước cất vào mỗi bình tam giác chứa MT xốp đang nuơi NS. Lắc đều, giữ ở nhiệt độ 3 – 40C trong 30 - 45 phút để enzym khuếch tán. Sau đĩ, đem hỗn hợp lọc qua vải và ly tâm dịch lọc 5000vịng/ 15phút. Thu dịch ly tâm, định mức 100ml. Ta thu được enzym thơ và đem xác định hoạt độ amylase 2.3.3.2. Phương pháp thu enzym bán tinh khiết Chế phẩm enzym thơ được nuơi cấy theo phương pháp bề mặt được giã bằng cối, chày sứ với sự trợ giúp của cát thạch anh hay bột thủy tinh. Sau đĩ, bổ sung lượng nước gấp 4 – 5 lần khối lượng canh trường để hịa tan enzym. Lọc và thu dịch lọc, bảo quản lạnh 40C. Dùng cồn lạnh (40C) lượng gấp 2 – 2,5 lần lượng dịch enzym đổ từ từ vào dịch lọc, khuấy nhẹ để cồn hịa đều với dịch lọc enzym. Đưa hỗn hợp vào tủ lạnh. Sau 15 – 24 giờ, hỗn hợp phân thành 2 lớp. Đem ly tâm hay lọc để thu enzym dạng tủa. Sấy khơ nhẹ ở nhiệt độ < 400C để thu chế phẩm enzym bán tinh khiết. 2.3.3.3. Phương pháp xác định hoạt độ α - amylase (Phương pháp Henkeil, 1956)  Nguyên tắc: Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iod. Đơn vị hoạt độ của enzym là lượng enzym cĩ khả năng thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút ở 30oC, pH = 6,0.  Hĩa chất: + Dung dịch NaCl 0,1%: hịa tan 0,1g NaCl vào nước thành 100ml + Dung dịch iod: hịa tan 1g iod vào 5ml dung dịch chứa 2g KI thêm nước cất đến 100ml. Khi dùng pha lỗng dung dịch này 500 lần. + Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6,0 + Dung dịch HCl 0,1N + Dung dịch tinh bột 1,0%: hịa tan 10g tinh bột trong 500ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6,0 đem đun sơi trong 3 phút để tinh bột hịa tan rồi định mức 1000ml, bảo quản trong tủ lạnh. + Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1%  Cách tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch tinh bột 1,0%, 1ml dung dịch NaCl 0,1% và 2ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH = 6,0. Lắc đều để ở 300C trong 15-20 phút để dung dịch đạt đến 300C, thêm vào hỗn hợp 1ml dung dịch enzym đã đạt đến 300C, lắc đều và giữ ở 300C trong 30 phút. Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm cho ngay vào 5ml dung dịch HCl 0,1N làm ngừng phản ứng. Song song mẫu thật, làm mẫu khơng cũng tương tự như trên nhưng cho dung dịch HCl 0,1N vào trước rồi cho enzym vào sau. Lấy 1ml mẫu thử thật và mẫu khơng cho vào ống nghiệm, thêm 9ml dung dịch iod đã pha lỗng 500 lần. Lắc đều rồi so màu ở bước sĩng 560nm. Lấy hiệu số đọc được trên máy giữa mẫu khơng và mẫu thật, đối chiếu đường cong tiêu chuẩn tính số mg tinh bột bị phân giải.  Đường chuẩn tinh bột: Từ dung dịch tinh bột 1,0%, xây dựng đường chuẩn với dung dịch tinh bột cĩ nồng độ 0 – 10mg/ml. Xây dựng đường chuẩn tinh bột (mg/l) Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ tinh bột (mg/l) 0 2 4 6 8 10 Dung dịch tinh bột (ml) 0 1 2 3 4 5 Nước cất (ml) 5 4 3 2 1 0 - Vẽ đồ thị sự biến thiên mật độ quang (ΔOD) theo nồng độ tinh bột (mg/ml) ở bước sĩng 560nm. - Tính kết quả: Hoạt độ (UI/g) = Trong đĩ X: số mg tinh bột bị thủy phân (mg/ml) n: độ pha lỗng V: thể tích enzym ban đầu (ml) 10: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml) M: khối lượng canh trường (g) 2.3.3.4. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (theo Miller)  Nguyên tắc: Dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử. Dựa theo đồ thị đường chuẩn glucose tinh khiết với thuốc thử dinitrosalisylic sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.  Hĩa chất: Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate. Đun nhẹ cho tan rồi định mức đến 100ml. Dung dịch glucose mẫu (500μg/ml) cân 0,5g D – glucose pha trong nước cất thành 1 lít.  Cách tiến hành: Lấy 3 ống nghiệm, dùng pipet cho vào mỗi ống nghiệm 2ml dung dịch hồ tinh bột 1%, thêm vào 0,5ml nước cất rồi đặt vào nồi cách thủy (t=300C). Sau 10 phút ta cho vào mỗi ống 0,5ml dịch chiết enzym (đã pha lỗng 100 lần), khuấy nhẹ và giữ ở 300C trong 30 phút. Tiếp theo, lấy ngay ống nghiệm ra và cho vào mỗi ống nghiệm 0,5ml dung dịch HCl 1N để ngừng hoạt động của enzym. Bảng xác định hoạt độ đường khử Mẫu thật Mẫu khơng Tinh bột 1% (ml) 2ml 2ml Nước cất (ml) 0,5 ml 0,5 ml Để cách thủy 10 phút để đạt nhiệt độ 300C Dung dịch enzym (ml) 0,5ml 0 Để cách thủy 30 phút cho enzym phản ứng với tinh bột Dung dịch HCl 1N (ml) 0,5 ml 0,5ml Dung dịch enzym (ml) 0 0,5m  Dựng đồ thị chuẩn glucose Từ dung dịch glucose 500μ/ml chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn cĩ nồng độ 50 - 250 μ/ml. Bảng: Xây dựng đường chuẩn glucose Cho 0,5ml dung dịch glucose chuẩn vào các ống nghiệm sạch và khơ, thêm vào 0,5 ml thuốc thử DNS. Đun cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phịng. Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sĩng 530nm với ống đối chứng là nước cất. Vẽ đường chuẩn là glucose với trục tung là mật độ quang, trục hồnh là nồng độ glucose. + Mẫu thí nghiệm: Phản ứng của dung dịch đường cần phân tích với thuốc thử DNS được tiến hành như trong phần xây dựng đồ thị chuẩn. Nồng độ đường trong mẫu được xác định nhờ vào đường chuẩn glucose đã dựng.  Tính kết quả: Hoạt độ (UI/g) = Trong đĩ X: số mg glucose (µg/ml) n: độ pha lỗng V: thể tích enzym ban đầu (ml) 3,5: thể tích hỗn hợp phản ứng (ml) M: khối lượng canh trường (g) 2.3.3.5. Phương pháp xác định các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và hoạt độ amylase của 2 chủng NS a. Ảnh hưởng của thời gian Ống số 0 1 2 3 4 5 Nồng độ glucose ( μ /ml) 0 50 100 150 200 250 Thể tích dung dịch glucose mẫu (ml) 0 10 20 30 40 50 Nước cất 100 90 80 70 60 50 - Xác định sự sinh trưởng: Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa petri. Quan sát sự phát triển KL sau 1, 2, 3, 4, 5, 6 và 7 ngày. Đo đường kính mỗi ngày để xác định tốc độ sinh trưởng của KL các chủng NS - Xác định hoạt độ amylase: Cấy mỗi chủng NS vào MT xốp (MT11) nuơi trong tủ ấm ở các thời gian khác nhau: 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108 giờ. Sau đĩ tiến hành thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định thời gian sinh enzym tối ưu của từng chủng b. Ảnh hưởng của nhiệt độ - Xác định sự sinh trưởng: Cấy chấm điểm các chủng NS lên MT1 trong đĩa. Để các đĩa petri trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35, 40, 45, 500C. Ủ sau 3 ngày thì đo đường kính khuẩn lạc d (mm) - Xác định hoạt độ amylase: Cấy mỗi chủng NS vào MT xốp (MT11) nuơi trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 25, 30, 35, 40, 45, 500C. Ủ trong tủ ấm theo thời gian đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định nhiệt độ sinh enzym tối ưu của từng chủng c. Ảnh hưởng của pH - Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT1, điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay HCl 10% để cĩ các giá trị pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Thanh trùng MT rồi đổ ra đĩa petri. Sau đĩ, cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng NS dựa vào đường kính KL d (mm). Mẫu đối chứng là cĩ pH 6,5 - Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), điều chỉnh pH bằng NaOH 10% hay HCl 10% để cĩ các giá trị pH khác nhau: 3, 4, 5, 6, 7, 8. Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định pH sinh enzym tối ưu của từng chủng. Mẫu đối chứng là cĩ pH 6,5 d. Ảnh hưởng của độ ẩm - Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT1, bổ sung các lượng nước biển khác nhau để đạt được độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70%. Thanh trùng MT rồi đổ ra đĩa petri, cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu, ủ ấm 3 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng NS dựa vào đường kính KL d (mm) - Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), bổ sung các lượng nước biển khác nhau để đạt được độ ẩm MT 50, 55, 60, 65, 70%. Thanh trùng MT, để nguội, rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định độ ẩm sinh enzym tối ưu của từng chủng. e. Ảnh hưởng của độ mặn - Xác định sự sinh trưởng: Sử dụng MT2 khơng dùng nước biển, bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 1, 3, 5, 10, 20%. Thanh trùng MT đổ đĩa petri, rồi cấy chấm điểm chủng NS nghiên cứu lên MT với các nồng độ muối. Ủ ấm 3 ngày Đo đường kính KL d (mm) để đánh giá khả năng chịu mặn. Mẫu đối chứng sử dụng nước cất độ mặn 0% Quy ước: d = 0 mm : Khơng mọc, d = 1÷ 2 mm: Mọc yếu, d = 2,1 ÷ 5 mm: Mọc trung bình, d = 5,1 ÷ 10 mm: Mọc tốt, d = 11 ÷ 30 mm: Mọc rất tốt - Xác định hoạt độ amylase: Sử dụng MT xốp (MT11), bổ sung các nồng độ muối khác nhau: 1, 3, 5, 10, 20%. Thanh trùng MT, để nguội rồi cấy chủng NS nghiên cứu, ủ trong điều kiện thời gian, nhiệt độ, pH, độ ẩm đã xác định ở trên rồi thu dịch enzym để tiến hành đo OD xác định độ mặn sinh enzym tối ưu của từng chủng. Mẫu đối chứng sử dụng nước cất độ mặn 0% 2.3.4. Phương pháp tốn học - Các kết quả thu được là trung bình của ba lần lặp lại thí nghiệm Phương pháp tính giá trị trung bình Trong đĩ : : Giá trị trung bình kết quả n lần thí nghiệm : Giá trị lần thí nghiệm thứ i n : Số lần lặp lại thí nghiệm Phương pháp tính khoảng ước lượng : Trong đĩ : tra bảng phân phối Student với n-1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng 2 phía. Là phương sai mẫu - Số liệu được xử lý bằng các hàm Avegare (Giá trị trung bình), Stud (Phương sai), Var (Sai số) trong excel. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân lập và tuyển chọn các chủng NS cĩ khả năng sinh amylase từ RNM Cần Giờ 3.1.1. Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ Tiến hành lấy mẫu từ lá vàng, lá mục, cành khơ, cành mục, đất mặt và đất sâu 5-10 cm, chúng tơi đã phân lập được 409 chủng NS khác nhau (xem phụ lục1) và trình bày tĩm tắt trong bảng 3.1 dưới đây. Bảng 3.1. Sự phân bố các chủng NS Cơ chất phân lập Số lượng chủng NS Tỷ lệ % Lá: - Lá vàng - Lá mục 152 71 81 37,2% 17,4% 19,8% Cành: - Cành khơ - Cành mục 140 59 81 34,2% 14,4% 19,8% Đất: - Đất mặt - Đất sâu 5-10 cm 117 64 53 28,6% 15,6% 13% (Ghi chú: Kết quả bảng 3.1 được tổng hợp từ phụ lục 1) Từ kết quả bảng 3.1 cho thấy, hệ NS ở RNM Cần Giờ vơ cùng phong phú. Chúng phân bố rộng rãi trên tất cả các cơ chất như trên lá, cành, trên đất và cĩ cả trong đất sâu 5-10 cm. Các chủng NS phân lập tập trung nhiều trên nguồn cơ chất lá (152/409 chủng) chiếm 37,2% tổng số chủng NS phân lập được, cịn ở cành là (140/409 chủng) chiếm 34,2%, trên đất là (117/409 chủng) chiếm 28,6%. Kết quả này cho thấy, cĩ lẽ hầu hết các chủng NS ở RNM là các chủng du nhập từ đất liền (Nguyễn Hồng Trí, 1999). Cịn các lồi nấm biển chủ yếu cĩ trên rễ cây hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn. Đây là những nấm gĩp phần phân hủy xác thực vật ở RNM Cần Giờ [36]. Đặc biệt, trên cơ chất lá mục, thân cành mục số lượng NS nhiều hơn, vì đây là những nguồn hữu cơ đang bị phân hủy, một phần đã phân giải thành glucose là nguồn cacbon mà nấm dễ hấp thụ nhất. Kết quả này thống nhất với nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) và Nguyễn Thị Lan Hương (2009) về khảo sát sự phân bố của các chủng NS. Ngồi ra, trên lớp đất mặt số chủng NS chiếm (15,6%) nhiều hơn lớp đất sâu (13%) vì NS là VSV hiếu khí mà lớp đất mặt là nơi cĩ nguồn O2 và nguồn thức ăn dồi dào (xác lá, cành, động vật, STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 1 L1 17 2 L3 11,5 3 L4 4 4 L5 8,5 5 L6 11,5 6 L8 15 7 L11 15,5 8 L12 13,5 9 L13 11,5 10 L14 16 11 L15 11 12 L16 8 13 L17 16,5 14 L18 16 15 L19 2,5 16 L20 3 17 L21 6 18 L22 16 19 L23 7 vỏ xác tơm cua, giáp xác,…) đang phân hủy. Đồng thời, với điều kiện thủy triều lên xuống hàng ngày nên lớp đất mặt luơn giữ độ ẩm thích hợp cho các chủng NS sinh trưởng phát triển. Cĩ thể thấy MT sống ở RNM Cần Giờ mặc dù rất khắc nghiệt nhưng cĩ đầy đủ các yếu tố cần thiết cho NS sinh trưởng và phát triển. Chúng sử dụng các chất hữu cơ cĩ sẵn để tồn tại, đồng thời tham gia phân hủy các chất thải, giúp giảm bớt ơ nhiễm MT ở RNM Cần Giờ. Từ các chủng phân lập được nĩi trên, chúng tơi tiến hành tuyển chọn các chủng NS dựa trên khả năng sinh amylase của chúng. 3.1.2. Tuyển chọn những chủng NS cĩ khả năng sinh amylase  Tuyển chọn lần 1 Kiểm tra khả năng sinh enzym amylase của 409 chủng NS theo phương pháp 2.3.2.6. Kết quả trình bày ở bảng 3.2 Phân tích số liệu từ bảng 3.2 cho thấy: - Tổng số chủng cĩ enzym: 261/409 chủng chiếm 63,81% + Chủng sinh enzym mạnh : 0/261 chiếm 0% + Chủng sinh enzym khá mạnh : 3/261 chiếm 1,15% + Chủng sinh enzym trung bình : 43/ 261 chiếm 16,48% + Chủng sinh enzym yếu : 156/261 chiếm 59,77% Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 71 LM32 11 72 LM33 12 73 LM35 14 74 LM36 7 75 LM37 8 76 LM38 4,5 77 LM39 15,5 78 LM40 4,5 79 LM41 14 80 LM45 13,5 81 LM46 10,5 82 LM47 6 83 LM48 17,5 84 LM50 3,5 85 LM51 8 86 LM52 3 87 LM53 18,5 88 LM54 18 89 LM56 4 90 LM57 6 91 LM58 5,5 92 LM59 5,5 93 LM61 1,5 94 LM62 7,5 95 LM68 4 96 LM78 9 97 CK1 11,5 98 CK2 5 99 CK3 15 100 CK4 13 101 CK6 16 102 CK8 16,5 103 CK11 23 104 CK12 12 105 CK14 5 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 141 CK53 7 142 CK54 2 143 CK55 2,5 144 CK57 8 145 CK58 13 146 CK59 9 147 CM2 3 148 CM3 2 149 CM8 21 150 CM9 16,5 151 CM10 19 152 CM11 15 153 CM13 10 154 CM14 17 155 CM15 3 156 CM16 4 157 CM17 7 158 CM18 12 159 CM20 11 160 CM21 14 161 CM22 5,5 162 CM23 10 163 CM26 18 164 CM28 14,5 165 CM29 6 166 CM31 5 167 CM32 3 168 CM33 16,5 169 CM34 13 170 CM35 6 171 CM36 8 172 CM38 6,5 173 CM39 5 174 CM40 13 175 CM41 17 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 176 CM43 15,5 177 CM44 14 178 CM46 4 179 CM48 4 180 CM52 9 181 CM53 4 182 CM54 17 183 CM63 9 184 CM66 8 185 CM73 2 186 CM76 11 187 CM77 4 188 CM78 7 189 CM79 3 190 CM80 8 191 Đ2 12 192 Đ3 12 193 Đ5 16,5 194 Đ8 4 195 Đ10 20,5 196 Đ12 9 197 Đ13 10 198 Đ14 10 199 Đ16 9 200 Đ17 4 201 Đ18 8 202 Đ19 4 203 Đ20 10 204 Đ21 13 205 Đ22 11 206 Đ23 2 207 Đ24 10 208 Đ25 16,5 209 Đ26 12 210 Đ28 7 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 36 L52 10,5 37 L57 2,5 38 L58 1,5 39 L59 11,5 40 L61 4 41 L62 4 42 L63 10 43 L64 5 44 L65 12 45 L66 4 46 L67 14 47 L69 2 48 L70 10 49 LM1 12 50 LM2 11 51 LM5 16,5 52 LM6 15 53 LM8 5 54 LM9 10 55 LM10 12 56 LM11 7 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 211 Đ29 15 212 Đ31 6 213 Đ33 8,5 214 Đ34 15 215 Đ35 10 216 Đ36 4 217 Đ37 11 218 Đ39 8 219 Đ41 4 220 Đ42 5 221 Đ43 5,5 222 Đ44 3 223 Đ45 2,5 224 Đ46 3 225 Đ47 6 226 Đ48 4 227 Đ51 8 STT Kí hi chủng 106 CK15 107 CK16 108 CK17 109 CK18 110 CK19 111 CK20 112 CK21 113 CK22 114 CK23 115 CK24 116 CK25 117 CK26 118 CK27 119 CK28 120 CK29 121 CK30 122 CK31 123 CK32 124 CK33 125 CK34 126 CK35 127 CK36 128 CK38 129 CK39 130 CK40 131 CK41 132 CK4 133 CK43 134 CK44 135 CK46 136 CK47 137 CK48 138 CK49 139 CK51 140 CK52 Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập (tiếp theo) 57 LM12 9 58 LM13 13 59 LM16 9 60 LM18 17,5 61 LM21 5 62 LM22 16,5 63 LM23 18 64 LM24 9,5 65 LM25 7 66 LM26 4 67 LM28 16,5 68 LM29 1 69 LM30 10 70 LM31 9 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 228 Đ52 9 229 Đ53 4 230 Đ54 4 231 Đ55 7,5 232 Đ56 19 233 Đ58 7 234 Đ61 9 235 Đ64 5 236 ĐS2 13 237 ĐS4 1 238 ĐS5 3 239 ĐS8 2 240 ĐS9 3 241 ĐS14 11 242 ĐS15 9 243 ĐS17 7 244 ĐS18 7,5 STT Kí hiệu chủng D-d (mm) 245 ĐS19 4 246 ĐS20 3 247 ĐS21 3 248 ĐS24 16 249 ĐS25 2 250 ĐS26 13 251 ĐS28 6 252 ĐS29 4 253 ĐS30 5 254 ĐS32 15,5 255 ĐS33 14,5 256 ĐS34 7 257 ĐS36 14 258 ĐS39 9 259 ĐS42 6 260 ĐS43 5 261 ĐS50 3 Bảng 3.2 Khả năng sinh amylase của 261/409 chủng NS phân lập (tiếp theo) - Trong đĩ: + Số chủng trên lá là : 96/261 chiếm 36,8% + Số chủng trên cành là : 94/261 chiếm 36% + Số chủng trên đất là : 71/261 chiếm 27,2% Từ bảng 3.2 cho thấy các chủng NS ở RNM cần Giờ cĩ khả năng sinh enzym amylase khá cao (261/409) chiếm 63,81% số chủng NS phân lập được. Phần lớn các chủng này tập trung ở lá chiếm 36,8% và cành chiếm 36% . Do nguồn thức ăn chủ yếu của NS sinh amylase là tinh bột - sản phẩm chuyển hĩa của quá trình quang hợp, nên các VSV sinh amylase tập trung ở lá và cành nhiều hơn. Kết quả này cũng cho thấy số lượng chủng NS ở RNM Cần Giờ cĩ hoạt tính amylase mạnh đến khá mạnh chiếm tỉ lệ ít (1,15%), trong khi đĩ tỉ lệ các chủng cĩ hoạt tính yếu chiếm rất cao (59,77%). Kết quả này trùng hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương (2009) về khả năng sinh amylase các chủng NS phân lập được từ RNM [15]. Sở dĩ như vậy, là vì nguồn cơ chất tinh bột ở RNM chiếm một tỉ lệ rất nhỏ so với lượng chất hữu cơ giàu cellulose và chitine. Đồng thời, quá trình phân giải các hợp chất chứa tinh bột trong tự nhiên diễn ra chậm. Do đĩ, quá trình phân giải các chất trong MT khơng chỉ dựa vào hệ NS mà cịn cĩ sự tham gia của nhiều VSV khác như VK, xạ khuẩn. Trong 261/409 chủng NS sinh enzym amylase, chúng tơi bước đầu chọn 10 chủng cĩ hiệu số D-d (mm) cao nhất để tiếp tục nghiên cứu (xem bảng 3.3) Bảng 3.3: 10 chủng NS cĩ khả năng sinh amylase cao STT Kí hiệu chủng Nguồn gốc phân lập D-d (mm) 1 L45 Lá vàng 19,5 2 LM23 Lá mục 18 3 LM53 Lá mục 18,5 4 LM54 Lá mục 18 5 CK11 Cành khơ 23 6 CM8 Cành mục 21 7 CM10 Cành mục 19 8 CM26 Cành mục 18 9 Đ10 Đất mặt 20,5 10 Đ56 Đất mặt 19 (Số liệu rút ra từ bảng 3.2 và phụ lục 1)  Tuyển chọn lần 2 Để đánh giá chính xác khả năng sinh enzym amylase của 10 chủng làm cơ sở cho sự tuyển chọn tiếp theo, chúng tơi tiến hành xác định hoạt độ α – amylase theo phương pháp Heinken trong phần 2.3.3.1 và xác định lượng đường khử trong phần 2.3.3.2 Kết quả trình bày trong bảng 3.4 Bảng 3.4. Hoạt độ α – amylase và lượng đường khử của 10 chủng NS (đơn vị IU/g) STT Kí hiệu chủng Nguồn gốc phân lập D-d (mm) Hoạt độ α- amylase (UI/g) Hoạt độ Glucoamylase (UI/g) 1 L45 Lá vàng 19,5 42.628 273.467 2 LM23 Lá mục 18 49.038 380.800 3 LM53 Lá mục 18,5 79.487 1015.467 4 LM54 Lá mục 18 39.423 866.133 5 CK11 Cành khơ 23 34.615 516.133 6 CM8 Cành mục 21 76.282 264.133 7 CM10 Cành mục 19 53.846 418.133 8 CM26 Cành mục 18 73.077 492.800 9 Đ10 Đất mặt 20,5 166.026 1164.800 10 Đ56 Đất mặt 19 268.590 1612.800 Đồ thị 3.1. Hoạt độ α- amylase của 10 chủng NS Qua bảng 3.4 cho thấy kết quả định tính và định lượng enzym amylase của 10 chủng NS thu được cĩ sự khác biệt. Đĩ là, khi khảo sát khả năng sinh amylase các chủng tập trung nhiều ở lá và thân nhưng chủng cĩ hoạt độ amylase cao lại là chủng ở đất (Chủng Đ10, Đ56). Theo chúng tơi, cĩ thể bào tử của các chủng NS cĩ khả năng sinh amylase từ lá, thân đã phát tán ra MT và rơi xuống đất. Mặc khác, khi nuơi NS trong MT xốp chứa cơ chất cảm ứng, cĩ nguồn gốc tự nhiên dễ làm phát huy khả năng sinh amylase tối đa của một số chủng NS. Cuối cùng, hai chủng NS đều cĩ nguồn gốc từ đất mặt và đều cĩ họat độ α-amylase, glucoamylase cao nhất nên được chúng tơi lựa chọn để nghiên cứu tiếp theo đĩ là chủng Đ10 và Đ56. Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.1 và 3.2 3.2. Nghiên cứu các đặc điểm hình thái và phân loại hai chủng NS 3.2.1. Phân loại NS đến chi  Chủng Đ10: Sau 3 ngày nuơi cấy trên MT Czapek Dox cải tiến và mơi trường YEA ở nhiệt độ 300C, KL đạt đường kính 9mm. KL cĩ dạng trịn, bột rời, bề mặt KL nhung mịn. Đồ thị 3.2. Hoạt độ glucoamylase của10 chủng NS Chủng Đ10 Mặt trước Mặt sau Hinh 3.1. Hình thái đại thể và vi thể chủng Đ10 Sau 5 ngày nuơi cấy đường kính đạt 16,5mm; KL cĩ viền màu trắng, bên trong cĩ màu xanh đậm, khơng tiết sắc tố vào MT. Bào tử trần hình cầu, cĩ màu trong đến xanh nhạt. Bảng 3.5. Đặc điểm hình thái đại thể, vi thể và phân loại đến chi của hai chủng NS Đặc điểm hình thái 2 chủng NS nghiên cứu Đặc điểm phân loại tương ứng theo Bùi Xuân Đồng (2004) C h ủ n g Đ 1 0 - Hình thái đại thể: KL trịn, nhung mịn, bột rời. Màu xanh đậm, mép viền trắng, mặt trái cĩ màu trắng. Khơng cĩ giọt tiết và sắc tố (Hình 3.1) - Hình thái vi thể: Sợi nấm ngăn vách. Cuống sinh bào tử khơng phân nhánh, khối bào tử trần, hình cầu nhẵn A sp er gi ll u s -Hình thái đại thể: KL trịn, dạng nhung mịn hay bột rời. Hệ sợi nấm gồm các sợi cĩ vách ngăn, phân nhánh, khơng màu hay màu nhạt. -Hình thái vi thể: Khối C h ủ n g Đ 56 - Hình thái đại thể: KL trịn, bề mặt trơn, nhung mịn, cĩ màu nâu nhạt, mặt trái màu vàng nhạt, tiết sắc tố màu nâu cam vào MT. (Hình 3.2) - Hình thái vi thể: Khối bào tử trần, đỉnh bọng hình hoa cúc, cuống bào tử khơng phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn, bào tử trần hình cầu nhẵn. bào tử trần, đỉnh bọng cĩ hình cột, giá bào trần hay ráp. Bọng đỉnh giá hình chùy hay chỉ thể bình. Bào từ hình cầu hay elip, nhẵn, ráp hay mịn  Chủng Đ56: Sau 3 ngày nuơi cấy trên MT Czapek Dox cải tiến và mơi trường YEA ở nhiệt độ 300C, KL đạt đường kính 16mm. KL cĩ dạng trịn, bột rời, bề mặt KL nhung mịn. sau 5 ngày nuơi cấy đường kính đạt 40,5mm; KL cĩ viền màu trắng, bên trong cĩ màu nâu đỏ, tiết sắc tố màu cam nâu vào MT. Hệ sợi màu trắng, cuống bào tử khơng phân nhánh, đầu phình to thành bọng ngắn, đỉnh bọng hình hoa cúc, bào tử trần, hình cầu, nhẵn. 3.2.2. Phân loại NS đến lồi bằng kĩ thuật di truyền phân tử (PCR) Từ kết quả trên chúng tơi tiến hành định danh đến lồi hai chủng nấm tại NK – Biotek (Cơng ty Nam Khoa)  Kết quả xác định trình tự gen của chủng Đ10 Chủng Đ56 Mặt trước Mặt sau Khuẩn ty Bào tử Hinh 3.2. Hình thái đại thể và vi thể chủng Đ56 Sau khi tiến hành so sánh, đối chiếu với trình tự gen phân loại của lồi này trên ngân hàng NCBI, độ trùng khớp là 258/258 (100%). Từ đĩ kết luận chủng Đ10 cĩ tên lồi là Aspergillus protuberus (Phụ lục 19 )  Kết quả xác định trình tự gen của chủng Đ10 Sau khi tiến hành so sánh, đối chiếu với trình tự gen phân loại của lồi này trên ngân hàng NCBI, độ trùng khớp là 257/258 (99%). Từ đĩ kết luận chủng Đ56 cĩ tên lồi là Aspergillus terreus (Phụ lục 20). 3.3. Khảo sát một số yếu MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của NS 3.3.1. Khảo sát thời gian sinh trưởng của hai chủng NS Mỗi chủng NS cĩ sự sinh trưởng và phát triển ở những thời gian khác nhau. Chúng tơi tiến hành cấy 2 chủng NS tuyển chọn vào MT1, mỗi ngày đo đường kính KL từ ngày thứ 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Thực hiện theo phương pháp 2.3.3.4 để khảo sát thời gian sinh trưởng của chúng. Kết quả trình bày ở bảng 3.6 và đồ thị 3.3 Bảng 3.6. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng của hai chủng NS Từ bảng 3.6 cho thấy từ ngày 1-5 hai chủng NS nghiên cứu cĩ KL lớn dần theo thời gian, trong đĩ chủng A. protuberus cĩ tốc độ sinh trưởng chậm, đến ngày thứ 5 là giai đoạn hình thành bảo tử thì sự sinh trưởng của chủng này chậm lại hẳn và kích thước KL nhỏ. Chủng A. terreus cĩ tốc độ sinh trưởng rất mạnh và nhanh, tạo KL cĩ kích thước lớn song đến ngày thứ 7 thì sự sinh trưởng cũng chậm dần, do thời gian này bắt đầu sinh bào tử. Đây là điểm đặc trưng của nấm sợi RNM, vì nơi đây điều kiện sống khắc nghiệt đã phần nào hạn chế sự sinh trưởng của NS. Thời gian (ngày) Chủng 1 2 3 4 5 6 7 Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 1,4 4,5 8,7 12 16,2 16,8 17 A. terreus 3,2 9,1 15,5 27,5 40,1 40,5 41 Trong khi đĩ, các chủng NS trên đất liền cĩ thời gian sinh trưởng nhanh hơn, chỉ sau 3 ngày là cĩ khả năng tạo bào tử. Cịn các chủng NS ở RNM thì phải sau 5-7 ngày mới bắt đầu sinh bào tử. Điều này cho thấy, điều kiện sống khắc nghiệt ở RNM cũng ảnh hưởng rất nhiều đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng NS nĩi riêng và hệ SV tồn tại ở đây nĩi chung. Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.3 Đồ thị 3.3. Ảnh hưởng thời gian đến sinh trưởng của hai chủng NS 3.3.2. Khảo sát nhiệt độ sinh trưởng của hai chủng NS Để xác định khoảng nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng NS tuyển chọn, chúng tơi cấy các chủng NS trên MT2, sau khi ủ 3 ngày ở các nhiệt độ khác nhau, chúng tơi thu được kết quả như bảng 3.7 Bảng 3.7. Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS Qua kết quả trên cho thấy, 2 chủng NS sinh trưởng tốt ở nhiệt độ dao động trong khoảng 35 – 400C và cao hơn nhiệt độ trung bình ở RNM Cần Giờ (30 - 320C). Cĩ lẽ đây là những chủng NS cĩ khả năng thích nghi khá tốt với điều kiện sống nơi này nên sinh trưởng được với cả giới hạn nhiệt độ cao hơn mức bình thường. Điều đĩ hồn tồn phù hợp với nhận định của tác giả Nguyễn Thị Huệ, Từ Thị Hường (1997) [14] và nhiều tác giả khác cho rằng NS cĩ nhiệt độ tối ưu 20 – 390C, và cĩ khả năng sống ở nhiệt độ cao hơn trong giới hạn cho phép. Từ đĩ, cho thấy 2 chủng NS tuyển chọn cĩ khả năng chịu nhiệt cao và thích nghi tốt với điều kiện sống ở RNM Cần Giờ. Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.4 và hình 3.2 Nhiệt độ Chủng 250C 300C 350C 400C 450C Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 8 14 17 13 9 A.terrus 14 19 29 48 7 Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS Hình 3.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh trưởng của hai chủng NS 3.3.3. Khảo sát pH sinh trưởng của hai chủng NS Để xác định pH thích hợp cho sự sinh trưởng của 2 chủng NS, chúng tơi tiến hành nuơi chủng NS theo phương pháp ở phần 2.3.3.3. Sau khi ủ NS 5 ngày trên các MT cĩ pH khác nhau và mẫu đối chứng là MT1 pH 6,5. Kết quả xem ở bảng 3.8 và đồ thị 3.5 Bảng 3.8. Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng của hai chủng NS Từ bảng trên cho thấy, 2 chủng NS cĩ khả năng mọc tốt trong khoảng pH rất rộng từ 3-8, nhưng pH thích hợp nhất cho sinh trưởng của 2 chủng là pH 5-6. So sánh với kết quả nghiên cứu ảnh hưởng pH đến một số chủng NS ở RNM Cần Giờ của Khưu Phương Yến Anh (2007) [1] và Nguyễn Thị Lan Hương (2009) [15] thì pH thích hợp nhất cho sinh trưởng đều nằm ở khoảng pH 6-7, nhưng tất cả các chủng NS ở RNM đều cĩ phổ hoạt động pH rất rộng 3-8. 0C pH Chủng NS 3 4 5 6 7 8 Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 12 13,5 17 19 15 16,5 A.terrus 19 25 31,5 34 20 18,5 Trong khi đĩ, pH của RNM Cần Giờ tại thời điểm thu mẫu là pH 7,02. Như vậy ta cĩ thể kết luận 2 chủng nấm A. protuberus và A. terreus thích nghi tốt với điều kiện MT của RNM Cần Giờ. Kết quả được minh họa bằng đồ thị 3.5 Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng của hai chủng NS 3.3.4. Khảo sát khả năng chịu mặn của hai chủng NS Một đặc điểm nổi bật ở RNM Cần Giờ là hệ NS phải chịu tác động của nồng độ NaCl khá cao. Để xác định khả năng sinh trưởng của 2 chủng NS nghiên cứu trong các nồng độ muối NaCl khác nhau, chúng tơi nuơi cấy NS trên MT1 theo phương pháp 2.3.3.3 cĩ nồng độ NaCl thay đổi từ 0-20%. Kết quả xem ở bảng 3.9 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của độ mặn đến sinh trưởng của hai chủng NS Từ bảng 3.9 cho thấy 2 chủng NS tuyển chọn đều cĩ khả năng sinh trưởng tốt (d>10mm) trên MT nước ngọt lẫn nước mặn. Hai chủng này cĩ thể sinh trưởng ở độ mặn 10-20%, tuy nhiên A. protuberus chỉ chịu được độ mặn cao nhất ở 3%, cịn A. terreus chịu được độ mặn cao hơn từ 3-5%. Cả 2 chủng đều cĩ nguồn gốc phân lập từ đất. Đây là các chi điển hình thường gặp ở đất liền (Tadayoshi I., Akira N., Tanichatoen and Leka M., 2001). Vì vậy, cĩ thể chúng là các chủng NS du nhập, lâu dần thích ứng với MT nước lợ trong RNM Cần Giờ nên khơng phải là NS ưa mặn vì các nấm biển ưa mặn thường cĩ trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn (Nguyễn Hồng Trí, 1999) [36] Kết quả nghiên cứu cũng phù hợp với quan điểm của Mai Thị Hằng và cộng sự (2001) [10], [12]; Nguyễn Thị Lan Hương (2009) [15] khi khảo sát khả năng chịu mặn của các chủng NS, và kết luận hầu hết đây là các chủng du nhập từ đất liền. Độ mặn (%) Chủng NS 0 1 3 5 10 20 Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 9 11 17 16 15 5 A. terreus 18 20 26 25 13 4 Khả năng chịu mặn của các chủng NS cho thấy chúng là những VSV thường trú của RNM, thậm chí ngay cả khi triều rút đất bị phơi nắng và trở nên mặn hơn. Chúng là tác nhân khơng thể thiếu và rất quan trọng của hệ sinh thái RNM. 3.3.5. Khảo sát ảnh hưởng nguồn Cacbon đến sự sinh trưởng của hai chủng NS Cacbon cĩ vai trị kích thích hoạt động của VSV và cung cấp mơi trường thuận lợi hơn để VSV tổng hợp enzyme rồi tích lũy nĩ trong đất của RNM (Dinesh et al., 1998). Nuơi cấy 2 chủng NS tuyển chọn lên MT1, thay glucose bằng các nguồn cacbon khác nhau để khảo sát khả năng đồng hĩa cacbon của chúng. Sau thời gian ủ 5 ngày, tiến hành đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm bằng cách đo đường kính KL d (mm). Kết quả trình bày ở bảng 3.10 Bảng 3.10. Khả năng đồng hĩa nguồn cacbon của hai chủng NS Kết quả cho thấy cả hai chủng NS đều cĩ khả năng sinh trưởng trên các nguồn cacbon khác nhau. Tuy nhiên chúng sinh trưởng yếu, chỉ cĩ A. terreus cĩ khả năng sinh trưởng khá tốt trên nguồn cacbon sucrose (d=17,4mm). So với nuơi trên MT1 làm đối chứng cĩ chứa nguồn cacbon là glucose cho thấy chúng sinh trưởng mạnh hơn hẳn. Sở dĩ, cĩ sự khác nhau này do glucose là nguồn cacbon dễ đồng hĩa nhất của hầu hết các VSV. Ngồi ra, giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của NS cịn phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần hĩa học của nguồn cacbon, tùy vào từng chủng NS. Nguồn cacbon Chủng NS Lactose Sucrose Maltose Sorbitol Galactose Glucose Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 8,3 9,7 6,9 8,2 10,2 12 A. terreus 7,1 17,4 12,1 11,2 6,2 25 Hình 3.4. Khả năng đồng hĩa nguồn cacbon của chủng A. protuberus 3.3.6. Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ đến sự sinh trưởng của hai chủng NS NS cũng như tất cả các cơ thể sống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào. Tuy nhiên, mỗi loại NS lại hấp thụ được những nguồn nitơ khác nhau. Chúng tơi tiến hành khảo sát khả năng đồng hĩa các nguồn thức ăn nitơ khác nhau của 2 chủng NS tuyển chọn. Kết quả được trình bày ở bảng 3. 11 Bảng 3.11. Khả năng đồng hĩa nguồn nitơ của hai chủng NS Kết quả cho thấy cả hai chủng NS đểu cĩ khả năng đồng hĩa các nguồn nitơ vơ cơ và hữu cơ khác nhau. Trong đĩ, mỗi chủng cĩ sự sinh trưởng khác nhau theo từng loại nitơ. Sở dĩ cĩ sự khác nhau này là do giá trị dinh dưỡng và khả năng hấp thụ của NS phụ thuộc vào cấu trúc, thành phần hĩa học của từng loại nitơ và tùy vào từng chủng NS. Với chủng A. protuberus sinh trưởng mạnh ở bột đậu nành (d=13,4mm), cịn chủng A. terreus lại sinh trưởng rất mạnh ở nguồn nitơ cao thịt (d=38,5mm). Một điều dễ nhận ra là cả 2 chủng NS đều sử dụng nguồn nitơ hữu cơ dễ hấp thụ. Nguồn nitơ ở đây là các hợp chất protein vừa làm nguồn N và nguồn C, đồng thời cịn cũng cấp các chất sinh trưởng cần thiết cho sự tổng hợp các sản phẩm và hệ enzym để tiến hành các phản ứng sinh hĩa theo hướng cĩ lợi (Nguyễn Đức Phẩm, 2004) [26]. Nguồn nitơ Chủng NS Bột đậu nành Cao thịt Casein Ure NH4NO3 NaNO3 Đường kính khuẩn lạc (mm) A. protuberus 13,4 11,8 10,1 9,1 10,8 12 A. terreus 12,3 38,5 15,7 7,2 12,7 31 Hình 3.5. Khả năng đồng hĩa nguồn cacbon của chủng A. terreus Hình 3.6. Khả năng đồng hĩa nguồn nitơ của 2 chủng NS Ở lơ đối chứng với nguồn nitơ NaNO3 cho thấy 2 chủng NS này phát triển khá tốt vì đây là nguồn nitơ dễ hấp thụ đối với hầu hết các chủng NS. RNM Cần Giờ là nơi cĩ nhiều xác động thực vật phân hủy, là nguồn cung cấp thức ăn nitơ cần thiết cho sự sinh trưởng và phát triển của các chủng NS.  Tổng hợp kết quả nghiên cứu từ mục 3.3.1 đến mục 3.3.6 chúng tơi cĩ thể rút ra những điều kiện ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của 2 chủng NS là: Các yếu tố A. protuberus A. terreus Nhiệt độ 350C 400C pH 5 - 6 5 - 6 Độ mặn 3% 3 - 5% Nguồn cacbon Galactose Sucrose Nguồn nitơ Bột đậu Cao thịt Hai chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ thích nghi rất tốt với điều kiện MT khắc nghiệt nơi đây: chịu được ảnh hưởng của biên độ nhiệt cao, thích ứng lâu dài với MT nước lợ trong RNM. Chúng là các VSV chịu mặn tùy tiện; cĩ khả năng đồng hĩa nhiều nguồn cacbon và nitơ khác nhau nên tham gia vào vịng tuần hồn vật chất, khép kín chu trình sinh địa hĩa, duy trì sự cân bằng sinh thái nơi này. 3.4. Ảnh hưởng các điều kiện nuơi cấy đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS 3.4.1. Tuyển chọn MT bán rắn thích hợp Tiến hành tuyển chọn MT bán rắn thích hợp dựa trên đặc điểm của 2 chủng NS nghiên cứu từ một số MT bán rắn sau: Bảng 3.12: Khảo sát khả năng sinh amylase trên một số MT bán rắn Hầu hết các MT tuyển chọn đều chứa hàm lượng tinh bột cao, nhưng cĩ các thành phần khác nhau. Tùy vào tính đặc điểm sinh học của từng chủng mà thích hợp với những MT khác nhau. Từ số liệu của bảng 3.12, ta thấy trên MT11 hai chủng NS tuyển chọn cho hoạt độ amylase cao nhất. Trên cơ sở đĩ ta chọn MT này sử dụng chung trong các khảo sát về khả năng sinh amylase ở các điều kiện khác nhau. 3.4.2. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS Thí nghiệm nhằm mục đích xác định thời gian nuơi cấy để thu nhận enzym amylase cĩ hoạt độ cao nhất. Quá trình nuơi cấy hai chủng NS được thực hiện trên MT11 theo mục 2.3.4. Chúng tơi tiến hành khảo sát hoạt độ hệ enzym thủy phân tại các thời điểm nuơi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ, 108 giờ với các điều kiện nuơi cấy như sau: - Nhiệt độ 300C - Khối lượng canh trường là 15g/một erlen - Lượng giống cho vào canh trường: 105 – 106 bào tử/1g MT - Độ ẩm 50 - 60% - Pha lỗng dịch chiết enzym 100 lần trước khi đem xác định hoạt độ amylase theo mục 2.3.3 Mơi trường A. protuberus A. terreus α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase MT11 273,253 1268,810 311,612 1339,713 MT12 214,532 644,754 252,563 745,246 MT13 233,182 648,852 153,346 813,244 MT14 167,308 723,244 189,359 1070,131 MT15 185,567 459,689 242,799 578,765 Tiến hành thí nghiệm theo mục 2.3.4, kết quả được trình bày trong bảng 3.13 Bảng 3.13: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ hai loại amylase của 2 chủng NS Kết quả cho thấy, hai chủng nấm sợi RNM đều cĩ hoạt độ amylase tăng dần từ 24-48 giờ theo thời gian, sau đĩ đạt cực đại ở 60 giờ và giảm dần từ 60-108 giờ. Chủng A. protuberus cĩ thời gian nuơi cấy thích hợp giao động từ 48-60 giờ với hoạt độ a- amylase là 196,47 UI/g canh trường ở 48 giờ; hoạt độ glucoamylase là 1302,69 UI/g canh trường ở 60 giờ. A. terreus cĩ thời gian nuơi cấy thích hợp là 60 giờ với hoạt độ a-amylase là 416,56 UI/g canh trường; hoạt độ glucoamylase là 1787,02 UI/g canh trường. Như vậy, thời gian sinh enzym của A. terreus chậm hơn A. protuberus. Căn cứ vào mục 3.3.1 khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sinh trưởng của 2 chủng NS ta thấy điều này là hợp lí vì chủng A. protuberus tạo bào tử sớm hơn chủng A. terreus mà để thu nhận enzym cĩ hoạt độ cao nhất, người ta thường ta chọn nấm mốc ở giai đoạn mới bắt đầu tạo bào tử. Ở giai đoạn bào tử đã già thì hoạt độ enzym giảm mạnh. Thời gian (h) Hoạt độ amylase (UI/g) A. protuberus A. terreus α-amylase glucoamylase α-amylase glucoamylase 24 77,35 192,58 209,29 52,58 36 85,36 475,69 216,77 130,36 48 196,47 858,36 408,55 774,36 60 189,53 1301,69 416,56 1787,02 72 185,26 1010,80 369,02 1412,13 84 172,97 912,80 366,88 995,24 96 159,62 864,58 365,28 816,36 108 140,92 779,02 361,54 740,13 Đồ thị 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ α-amylase 2chủng NS 3.4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS Sau khi xác định được thời gian nuơi cấy NS để thu nhận amylase cĩ hoạt độ cao nhất. Chúng tơi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ amylase của 2 chủng NS theo thời gian trên. Quá trình nuơi cấy hai chủng NS được thực hiện trên MT11 theo mục 2.3.4. Kết quả được trình bảy trong bảng 3.14 Bảng 3.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ amylase hai chủng NS Từ bảng 3.14 ta thấy chủng A. protuberus cho hoạt độ α-amylase cao ở nhiệt độ 350C và cho hoạt độ glucoamylase cao ở 400C. Cịn chủng A. terreus ở nhiệt độ 400C cho hoạt độ 2 lo