Luận văn Nghiên cứu thu nhận enzym a – amylase từ trực khuẩn cỏ khô

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM α – AMYLASE TÖØ TRÖÏC KHUAÅN COÛ KHOÂ LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2009 BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM TP. HOÀ CHÍ MINH ------------------------------------ NGUYEÃN THÒ HOAØNG HAÛI NGHIEÂN CÖÙU THU NHAÄN ENZYM α – AMYLASE TÖØ TRÖÏC KHUAÅN COÛ KHOÂ Chuyeân ngaønh: Vi sinh vaät hoïc Maõ soá: 60 42 40 LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC NGÖÔØI HÖÔÙNG DAÃN KHOA HOÏC: PGS.TS. LÖÔNG ÑÖÙC PHAÅM Thaønh phoá Hoà Chí Minh – 2009 MỞ ÑAÀU Vi sinh vaät trong töï nhieân raát ña daïng vaø phong phuù. Chuùng coù maët khaép nôi: trong ñaát, trong nöôùc, trong khoâng khí,… keå caû trong cô theå con ngöôøi. Ngoaøi taùc haïi do vi sinh vaät gaây ra nhö: gaây beänh cho thöïc vaät, ñoäng vaät vaø con ngöôøi; thì nguoàn lôïi maø chuùng mang laïi cho chuùng ta voâ cuøng to lôùn neáu ta hieåu, bieát vaø söû duïng chuùng hôïp lyù. Caùc chuûng vi sinh vaät noùi chung vaø vi khuaån Bacillus noùi rieâng ñaõ vaø ñang ñöôïc söû duïng raát phoå bieán trong caùc cheá phaåm sinh hoïc ñeå phuïc vuï cho caùc ngaønh saûn xuaát nhö: röôïu, bia, coâng nghieäp deät, thuoäc da, boå sung vaøo thöùc aên cho gia suùc ñeå deã tieâu hoaù, thöùc aên trong nuoâi troàng thuyû saûn, trong y hoïc vaø nghieân cöùu,… laø nhôø khaû naêng sinh caùc loaïi enzym thuyû phaân cuûa caùc chuûng vi sinh vaät naøy. Enzym laø nhöõng chaát xuùc taùc sinh hoïc, ngoaøi nhöõng tính chaát cuûa moät chaát xuùc taùc noù coøn coù nhöõng tính chaát öu vieät hôn nhö: coù hieäu suaát xuùc taùc raát cao ôû ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng, coù tính ñaëc hieäu cao. Caùc tính chaát naøy vaãn ñöôïc baûo toàn khi taùch enzym ra khoûi heä thoáng soáng, hoaït ñoäng trong ñieàu kieän invitro. Vì vaäy, enzym ngaøy caøng ñöôïc söû duïng roäng raõi trong thöïc teá, vôùi quy moâ ngaøy caøng lôùn, daãn ñeán vieäc hình thaønh vaø phaùt trieån ngaønh coâng ngheä saûn xuaát enzym. Vieäc söû duïng enzym trong thöïc teá khoâng chæ coù yù nghóa veà kinh teá maø coøn giaûi quyeát nhieàu vaán ñeà xaõ hoäi, caùc vaán ñeà böùc xuùc veà moâi tröôøng. Tröôùc kia, enzym thöôøng ñöôïc thu nhaän töø teá baøo thöïc vaät hoaëc ñoäng vaät (chaúng haïn amylase ñöôïc laáy töø haït naûy maàm, protease töø nhöïa ñu ñuû, daï daøy,…). Tuy nhieân quaù trình sinh toång hôïp enzym ôû ñoäng vaät vaø thöïc vaät gaén lieàn vôùi söï trao ñoåi chaát vaø nhu caàu cuûa teá baøo. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn phaûi phaù boû caùc toå chöùc teá baøo ñeå taùch chieát vaø thu nhaän enzym. Nhö vaäy, vieäc duøng teá baøo ñoäng vaät, thöïc vaät laøm nguoàn nguyeân lieäu ñeå thu nhaän enzym laø khaù haïn cheá, thieáu tính kinh teá vaø khoâng ñaùp öùng ñöôïc nhu caàu veà soá löôïng enzym caàn thieát cho saûn xuaát. Trong khi ñoù, ôû vi sinh vaät haàu nhö chöùa ñaày ñuû caùc loaïi enzym vaø vieäc söû duïng nguoàn enzym töø vi sinh vaät mang laïi lôïi ích lôùn hôn, cuï theå nhö nguoàn nguyeân lieäu duøng ñeå nuoâi caáy vi sinh vaät thöôøng reû tieàn hôn vì chuùng thöôøng laø pheá phuï phaåm coâng noâng nghieäp (nhö caùm, traáu, baõ mía, baõ khoai myø,…) hoaëc nguoàn nguyeân lieäu töï nhieân nhö daàu moû, khí ñoát,… Maët khaùc, ñieàu kieän nuoâi caáy deã daøng, vaø enzym coù hoaït tính cao hôn. Vì theá, khoaûng 50 naêm gaàn ñaây caùc cheá phaåm enzym töø vi sinh vaät ñaõ daàn thay theá caùc enzym coù nguoàn goác thöïc vaät, ñoäng vaät. Trong haøng loaït caùc loaïi enzym khaùc nhau thì amylase laø enzym phaân giaûi tinh boät taïo ñöôøng cho caùc sinh vaät. Töø nhöõng naêm ñaàu theá kyû 18 caùc nhaø khoa hoïc ñaõ baét ñaàu nghieân cöùu veà amylase vaø ñeán nay ñaõ bieát khaù roõ veà loaïi enzym naøy. Amylase ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong nhieàu lónh vöïc saûn xuaát nhö coâng nghieäp thöïc phaåm, coâng nghieäp deät,…Saûn xuaát amylase coâng nghieäp ñaõ ñöôïc chuù yù töø raát laâu vaø ngaøy caøng phaùt trieån ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi. Vieät Nam chuùng ta laø moät trong nhieàu nöôùc ñaõ vaø ñang coù raát nhieàu nghieân cöùu vaø öùng duïng enzym amylase, nhöng neàn coâng nghieäp saûn xuaát enzym ôû nöôùc ta chöa thaät söï phaùt trieån. Xuaát phaùt töø cô sôû treân chuùng toâi choïn ñeà taøi cho luaän vaên: “Nghieân cöùu thu nhaän enzym α-amylase töø tröïc khuaån coû khoâ”. Noäi dung cuûa ñeà taøi goàm moät soá vaán ñeà sau: 1. Phaân laäp vaø tuyeån choïn caùc chuûng vi khuaån coù khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh enzim amylase coù hoaït tính maïnh töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ. 2. Nghieân cöùu hình thaùi teá baøo, hình thaùi khuaån laïc, vaø caùc ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng tuyeån choïn. 3. Khaûo saùt caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå thu ñöôïc dòch enzym amylase coù hoaït ñoä cao. 4. Ñònh danh chuûng ñöôïc tuyeån choïn baèng kyõ thuaät di truyeàn phaân töû. 5. Nuoâi caáy chuûng ñaõ tuyeån choïn trong thieát bò bình leân men tam giaùc 1 lít vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu. Nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình sinh toång hôïp amylase vôùi 3 thoâng soá laø pH, sinh tröôûng vaø hoaït ñoä enzym. 6. Taùch chieát enzym amylase töø dòch leân men nhôø caùc taùc nhaân tuûa. 7. So saùnh hieäu suaát thu nhaän vaø hoaït ñoä cheá phaåm enzym (CPE) amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau. 8. Nghieân cöùu ñoä beàn nhieät vaø ñoä beàn pH cuûa CPE amylase. Chương I: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 1.1. Giống vi khuaån Bacillus [5], [16], [38], [39] Bacillus laø vi khuaån Gram döông, hình que coù kích thöôùc khaùc nhau (0,5 – 2,5) ×(1,2 - 10) μm. Chuùng phaân boá roäng raõi trong töï nhieân, trong ñaát, nöôùc, khoâng khí. Laø vi khuaån dò döôõng hoaù naêng, thu naêng löôïng nhôø söï oxi hoaù caùc hôïp chaát höõu cô, coù chuøm tieân mao giuùp chuùng coù khaû naêng di ñoäng, soáng hieáu khí hoaëc hieáu khí tuyø tieän. Bacillus coù khaû naêng sinh baøo töû, baøo töû ñöôïc hình thaønh khi teá baøo ñaõ traûi qua giai ñoaïn phaùt trieån maïnh nhaát, hoaëc khi thieáu chaát dinh döôõng. Moãi teá baøo sinh döôõng sinh ra moät baøo töû. Khi baøo töû tröôûng thaønh, teá baøo sinh döôõng töï phaân giaûi giaûi phoùng baøo töû. Caùc teá baøo Bacillus ñaëc tröng laø sinh baøo töû maøø vaãn giöõ hình daùng tröïc khuaån khi mang baøo töû, trong moät soá tröôøng hôïp teá baøo vi khuaån chæ phình to moät ít khi chöùa baøo töû. Tuyø loaøi maø baøo töû coù theå naèm chính taâm, leäch taâm hay gaàn ñaàu teá baøo. Baøo töû coù khaû naêng chòu nhieät, tia töû ngoaïi, phoùng xaï vaø nhieàu ñoäc toá, vì vaäy chuùng coù khaû naêng giöõ ôû traïng thaùi baøo töû nhieàu naêm. Baøo töû khoâng phaûi cô quan sinh saûn maø laø moät traïng thaùi baûo veä noøi gioáng, noù ñöôïc taïo ra ñeå giuùp teá baøo chòu ñöôïc caùc ñieàu kieän baát lôïi cuûa moâi tröôøng. Ñoù laø daïng nghæ cuûa teá baøo. Baøo töû ôû daïng töï do khoâng coù quaù trình trao ñoåi chaát, khi gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi moãi baøo töû cho ra moät teá baøo sinh döôõng. Ña soá Bacillus sinh tröôûng toát ôû pH = 7, moät soá phuø hôïp vôùi pH = 9 – 10 nhö Bacillus alcalophillus, hoaëc vôùi pH = 2 – 6 nhö Bacillus- acidocaldrius. Veà nhieät ñoä, coù nhieàu chuûng öa nhieät ñoä cao (450C – 750C), hoaëc öa laïnh (50C –250C), nhöng thöôøng gaëp Bacillus soáng ôû nhieät ñoä toái öu laø 340C – 370C. Haàu heát Bacillus khoâng gaây beänh cho ngöôøi vaø ñoäng vaät. Moät soá loaïi gaây beänh cho coân truøng nhö Bacillus thuringiensis, B. poplliae, B. lentimorbus, B. cereus, B. anthracis (trong ñoù B. cereus vaø B. anthracis coù theå gaây beänh cho ngöôøi)…ña soá coøn laïi trong töï nhieân laø coù ích. Bacillus coù khaû naêng sinh enzym ngoaïi baøo: α-amylase, protease kieàm, cellulase… vaø caùc enzym naøy ñöôïc öùng duïng raát nhieàu trong coâng nghieäp, baûo veä moâi tröôøng, noâng nghieäp… Sau ñaây laø moät soá loaøi Bacillus thöôøng gaëp trong töï nhieân 1.1.1 Bacillus subtilis Bacillus subtilis ñöôïc phaùt hieän vaø ñaët teân vaøo naêm 1872, noù phaân boá phoå bieán trong ñaát vaø ñaëc bieät laø ôû coû khoâ neân Bacillus subtilis ñöôïc goïi laø tröïc khuaån coû khoâ. Laø nhöõng vi khuaån hình que, ngaén, nhoû, kích thöôùc (3 -5) × 0,6 μm, nhieàu khi teá baøo noái laïi vôùi nhau thaønh chuoãi daøi ngaén khaùc nhau hoaëc teá baøo ñöùng rieâng reõ. Khuaån laïc khoâ, khoâng maøu hoaëc maøu xaùm nhaït, hôi nhaên hoaëc taïo ra lôùp maøng mòn lan treân beà maët thaïch, coù meùp nhaên baùm chaët vaøo moâi tröôøng thaïch. Nhieät ñoä thích hôïp cho Bacillus subtilis sinh tröôûng laø 300C – 500C, thöôøng nuoâi caáy ôû 370C. Baøo töû hình baàu duïc, kích thöôùc 0,6 – 0,9 μm, phaân boá leäch taâm, gaàn taâm nhöng khoâng chính taâm. Baøo töû coù theå soáng vaøi naêm ñeán vaøi chuïc naêm. Ñaõ coù nhöõng chöùng cöù veà vieäc duy trì söùc soáng baøo töû B. subtilis trong 200-300 naêm. Vi khuaån B. subtilis coù maøng nhaøy (giaùc maïc) giuùp vi khuaån coù khaû naêng chòu ñöôïc ñieàu kieän khaéc nghieät vì maøng nhaøy coù theå döï tröõ thöùc aên vaø baûo veä vi khuaån traùnh toån thöông khi khoâ haïn. Maøng nhaøy coù theå quan saùt ñöôïc khi nhuoäm tieâu baûn, qua kính hieån vi chuùng ta coù theå nhìn thaáy maøng nhaøy cuûa B. subtilis laø khoâng maøu, trong suoát, coøn teá baøo vi khuaån baét maøu naâu ñoû treân neàn tieâu baûn xanh hoaëc ñen. B. subtilis coù khaû naêng sinh ra moät soá enzym nhö: α-amylase, protease kieàm coù giaù trò cao, ñaëc bieät coù khaû naêng toång hôïp riboflavin (tieàn vitamin B2). Vì vaäy, B. subtilis ñöôïc öùng duïng khaù nhieàu trong caùc ngaønh coâng nghieäp. 1.1.2. Bacillus mesentericus Bacillus mesentericus coøn ñöôïc goïi laø tröïc khuaån khoai taây do chuùng coù maët chuû yeáu treân khoai taây. Chuùng gaàn gioáng Bacillus subtilis khuaån laïc aên saâu vaø baùm chaët vaøo moâi tröôøng thaïch, beà maët nhaên nhuùm, khoâ, khoâng moïc lan ra moâi tröôøng, maøu xaùm nhaït-traéng, hoaëc hôi vaøng naâu, hoaëc hoàng nhö Bacillus mensentericus ruber hoaëc ñen nhö Bacillus mensentericus niger . Bacillus mensentericus sinh tröôûng phaùt trieån toát nhaát ôû nhieät ñoä 36 – 450C, toái ña 50 – 550C, pH = 4,5 – 5 thì ngöøng phaùt trieån. Bacillus mensentericus coù hoaït tính amylase vaø protease lôùn hôn haún Bacillus subtilis, nhöng leân men ñöôøng laïi keùm hôn. Bacillus mensentericus vaø Bacillus subtilis raát phoå bieán trong töï nhieân, chuùng laây nhieãm laøm hö hoûng thöïc phaåm, nhaát laø caùc loaïi thöïc phaåm coù chöùa nitô vaø caùc saûn phaåm giaøu ñöôøng (baùnh keïo, hoa quaû). Ngoaøi ra, chuùng coøn sinh ra moät loaïi hôïp chaát coù hoaït tính khaùng moät soá vi khuaån khaùc goïi laø bacterioxin, ôû Bacillus subtilis goïi laø subtilin. 1.1.3. Bacillus cereus Vi khuaån naøy coù moái quan heä gaàn guõi vôùi Bacillus anthracis, B. mycoides, B. thuringiensis. Baøo töû cuûa chuùng hình baàu duïc, kích thöôùc 0,9 × (1,2 – 1,5) μm, naèm leäch taâm, phaùt taùn khaép nôi, trong ñaát, trong khoâng khí…Chuùng thöôøng sinh soâi naûy nôû treân thöïc phaåm nhö côm vaø coù theå sinh ra ñoäc toá laøm cho thöïc phaåm hö hoûng vaø gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm. Teá baøo cuûa B. cereus daøy, kích thöôùc (1 -1,5) × (3 – 5) μm coù khi daøi hôn, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh chuoãi. Khuaån laïc cuûa B. cereus phaúng, hôi loõm, beà maët hôi xuø xì (daïng boät, hoaëc daïng haït nhoû) traéng ñuïc, meùp loài loõm. 1.1.4. Bacillus megaterium Megaterium coù nghóa laø “con thuù lôùn”, teá baøo cuûa noù khaù lôùn khoaûng gaáp hôn 2 laàn teá baøo cuûa Bacillus subtilis, kích thöôùc (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm. ÔÛ caùc oáng nuoâi giaø thì teá baøo ngaén hôn, troøn hôn, ñoâi khi hình thoi vôùi ñaàu heïp laïi. Teá baøo chöùa nhieàu haït nhoû vaø chaát döï tröõ (haït môõ, glycogen). Baøo töû lôùn, hình ovan hay baàu duïc, kích thöôùc 1,5 × (0,7 – 1) μm, chuùng naèm leäch taâm thöôøng theo chieàu ngang hoaëc chieàu xieân cuûa teá baøo. Khuaån laïc troøn ñeàu, loài nhaün nhöng thöôøng coù voøng vieàn quanh khuaån laïc hoaëc caùc voøng ñoàng taâm treân beà maët, khoâng thuyø, khoâng neáp, meùp troøn ñeàu hay löôïn soùng, maøu traéng söõa hay ñuïc, coù khi coù maøu naâu nhaït. Sinh tröôûng treân moâi tröôøng dinh döôõng ñôn giaûn khoâng caàn theâm baát kyø yeáu toá dinh döôõng naøo khaùc. 1.1.5. Bacillus pumilus Baøo töû phaùt taùn roäng, coù maët trong ñaát nhieàu hôn Bacillus subtilis. Khuaån laïc nhoû, xung quanh vieàn môø lan khoâng ranh giôùi. Teá baøo cuûa noù gaàn gioáng teá baøo B. subtilis. 1.1.6. Bacillus polymyxa Kích thöôùc teá baøo laø (0,6 – 1) × (2 – 7) μm, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh ñoâi, chuoãi ngaén. Khi hình thaønh baøo töû teá baøo seõ phoàng leân hình quaû chanh. Baøo töû hình baàu duïc keùo daøi khoaûng (1,7 – 2,6 μm), treân beà maët caét ngang nhö hình sao, naèm giöõa teá baøo, chuùng phaùt taùn roäng. Khuaån laïc cuûa B. polymyxa voâ maøu, phaúng hoaëc loài, trôn, lan daàn ra xung quanh, meùp ñoâi khi coù thuyø. Chuùng thöôøng sinh tröôûng phaùt trieån treân thöïc vaät ñang bò hoûng. Vì vaäy, ngöôøi ta thöôøng phaân laäp chuùng töø thöïc phaåm. Chuùng laø nguoàn ñeå saûn xuaát khaùng sinh polymyxin. 1.1.7. Bacillus simplex Teá baøo B. simplex nhoû beù, coù kích thöôùc (2 – 5) × 0,6 μm, thöôøng ñöùng rieâng reõ khoâng gaén thaønh chuoãi. Baøo töû hình baàu duïc coù kích thöôùc 0,6 × 0,9 μm, naèm leäch taâm. Khuaån laïc cuûa B. simplex gioáng khuaån laïc B. cereus, chæ khaùc laø khuaån laïc cuûa B. simplex coù khaû naêng sinh saéc toá luïc nhaït, vaøng vaø tieát vaøo moâi tröôøng. 1.1.8. Bacillus brevis B. brevis laø tröïc khuaån coù kích thöôùc (0,7 – 1,0) × (3 – 5) μm, ñöùng rieâng reõ, ñoâi khi xeáp thaønh chuoãi. Baøo töû coù hình baàu duïc naèm cuoái teá baøo laøm cho teá baøo coù moät ñaàu hôi phoàng to. Khuaån laïc cuûa B. brevis maøu traéng, ñoâi khi coù maøu vaøng, loài hoaëc phaúng, laáp laùnh, meùp raêng cöa gioáng nhö daïng môõ ñaëc. 1.1.9. Bacillus aslersporus Teá baøo daøy (1,0–1,2) × (3 –7) μm, ñöùng rieâng reõ hoaëc xeáp thaønh ñoâi. Baøo töû hình truï hay hình keùo daøi, kích thöôùc 1,0 × (1,5–2) μm, naèm giöõa teá baøo. Khi hình thaønh baøo töû teá baøo phoàng leân moät chuùt troâng gioáng nhö daïng Clostridium. Khuaån laïc cuûa B. aslersporus nhoû, maøu traéng hay maøu luïc nhaït, phaúng, meàm, nhaøy, ñoàng chaát. 1.2. Khaùi quaùt chung veà enzym [1], [4], [15], [23], [49]. Sinh vaät ñöôïc xem nhö laø moät heä thoáng môû coù lieân quan chaët cheõ ñeán quaù trình trao ñoåi chaát trong teá baøo cuûa cô theå, vaø giöõa cô theå vôùi moâi tröôøng ngoaøi. Quaù trình trao ñoåi chaát cuûa sinh vaät laø bieåu hieän sinh ñoäng nhaát cuûa söï soáng. Khi cô theå khoâng coøn khaû naêng trao ñoåi chaát thì cô theå seõ cheát. Quaù trình trao ñoåi chaát lieân tuïc ñöôïc xaûy ra giöõa trong vaø ngoaøi teá baøo, taïo neân söï bieán ñoåi lieân tuïc cuûa vaät chaát trong thieân nhieân. Caùc phaûn öùng sinh hoïc xaûy ra thöôøng xuyeân khoâng chæ ôû trong teá baøo sinh vaät maø ôû caû ngoaøi moâi tröôøng bao quanh teá baøo. Caùc phaûn öùng sinh hoïc naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi moät loaïi protein ñaëc bieät ñöôïc goïi laø enzym. Caùc enzym tham gia phaûn öùng trong teá baøo goïi laø enzym noäi baøo, coøn caùc enzym thuyû phaân coù chöùc naêng phaân huyû chaát höõu cô ngoaøi teá baøo thaønh chaát dinh döôõng coù theå haáp thuï vaøo teá baøo goïi laø enzym ngoaïi baøo. Caû hai loaïi enzym naøy ñeàu ñöôïc toång hôïp trong teá baøo. 1.2.1. Enzym caûm öùng. Nhöõng enzym ñöôïc taïo thaønh töø VSV khoâng phaûi chæ phuï thuoäc vaøo loaïi VSV maø coøn phuï thuoäc thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy, ñieàu kieän nuoâi caáy. Hieän töôïng treân laø do trong moâi tröôøng coù chaát khoù ñoàng hoaù, VSV tieát vaøo moâi tröôøng moät hoaëc caùc enzym töông öùng ñeå taïo thaønh chaát coù theå ñoàng hoaù ñöôïc. Caùc enzym ñöôïc tieát ra nhö theá ñöôïc goïi laø enzym caûm öùng vaø caùc cô chaát kích thích quaù trình toång hôïp enzym caûm öùng goïi laø chaát caûm öùng. 1.2.2. Baûn chaát sinh hoïc cuûa enzym. Caùc loaïi enzym ñeàu coù caùc ñaëc tính sinh hoïc chung nhö sau: + Enzym ñöôïc taïo ra trong teá baøo sinh vaät. + Enzym tham gia phaûn öùng caû trong teá baøo soáng vaø caû khi enzym ñöôïc taùch khoûi teá baøo soáng. + Enzym tham gia phaûn öùng trong ñieàu kieän nhieät ñoä oân hoaø, vì enzym ñöôïc toång hôïp vaø hoaït ñoäng trong ñieàu kieän nhieät ñoä cuûa teá baøo vaø nhieät ñoä cuûa cô theå. Phaàn lôùn nhieät ñoä cuûa cô theå sinh vaät dao ñoäng trong khoaûng 30-40oC. + Enzym coù theå tham gia xuùc taùc caùc phaûn öùng trong vaø ngoaøi cô theå. + Phaûn öùng enzym laø nhöõng phaûn öùng tieâu hao naêng löôïng raát ít. Trong khi ñoù, caùc phaûn öùng hoaù hoïc ñöôïc xuùc taùc bôûi caùc chaát xuùc taùc hoaù hoïc ñoøi hoûi naêng löôïng raát lôùn. + Enzym chòu söï ñieàu khieån bôûi gen vaø caùc ñieàu kieän phaûn öùng. Ñieàu naøy coù yù nghóa raát lôùn trong vieäc ñieàu khieån söï toång hôïp enzym trong teá baøo sinh vaät. 1.2.3. Baûn chaát hoaù hoïc cuûa enzym. Phaân tích thaønh phaàn hoaù hoïc cuûa enzym ngöôøi ta chia thaønh hai nhoùm: + Nhoùm enzym ñôn caáu töû: laø caùc enzym ñöôïc caáu taïo chæ coù protein. Caùc hydrolase thuoäc loaïi naøy. + Nhoùm enzym ña caáu töû: bao goàm nhöõng enzym coù hai thaønh phaàn: • Phaàn protein thuaàn ñöôïc goïi laø apoprotein hay apoenzym. Ngaøy nay môùi tìm thaáy moät soá ARN coù hoaït tính enzym chuyeån hoaù tieàn chaát thaønh caùc ARN. Caùc enzym ARN ñöôïc goïi laø Ribozim. Hieän nay ñaõ bieát coù 3500 enzym coù baûn chaát protein vaø 100 ribozim. • Phaàn thöù hai laø thaønh phaàn khoâng phaûi protein maø laø nhöõng chaát höõu cô ñaëc hieäu coù vai troø thuùc ñaåy quaù trình xuùc taùc. Thieáu thaønh phaàn thöù hai naøy thì caùc enzym khoâng hoaït ñoäng, neân goïi chuùng laø chaát coäng taùc (cofactor). Caùc chaát höõu cô ñaëc hieäu naøy coù theå gaén raát chaët vôùi phaàn protein baèng lieân keát ñoàng hoaù trò ñöôïc goïi laø nhoùm phuï (prosthetic), hoaëc cuõng coù theå gaén loûng leûo vaø deã daøng taùch chuùng khoûi protein ñöôïc goïi laø coenzym. Apoenzym quyeát ñònh tính ñaëc hieäu cao vaø laøm taêng hoaït ñoä xuùc taùc cuûa enzym. Coøn nhöõng chaát höõu cô ñaëc hieäu quyeát ñònh kieåu phaûn öùng, tröïc tieáp tham gia phaûn öùng vaø laøm taêng ñoä beàn cuûa apoenzym ñoái vôùi caùc yeáu toá gaây bieán tính. Ngoaøi ra, trong thaønh phaàn cuûa enzym coøn coù söï hieän dieän moät soá kim loaïi, caùc kim loaïi naøy thöôøng raát deã taùch ra khoûi enzym. Trong tröôøng hôïp enzym maát kim loaïi chuùng seõ maát hoaït tính. Khi ñöa trôû laïi caùc kim loaïi töông öùng vaøo enzym thì hoaït tính cuûa enzym laïi ñöôïc khoâi phuïc, tính chaát naøy mang tính thuaän nghòch. Vai troø cuûa kim loaïi trong hoaït ñoäng cuûa enzym vaãn chöa thöïc söï laøm saùng toû. Tuy nhieân caùc nhaø khoa hoïc cho raèng coù theå kim loaïi ñoùng vai troø lieân keát giöõa enzym vaø cô chaát, giöõa apoenzym vaø coenzym, tham gia tröïc tieáp vaøo quaù trình vaän chuyeån ñieän töû nhö vai troø cuûa saét trong cytochrome vaø peroxydase. 1.2.4. Tính chaát hoaù hoïc cuûa enzym. Enzym coù theå hoaø tan trong nöôùc, trong dung dòch muoái loaõng taïo thaønh caùc dung dòch keo öa nöôùc, nhöng enzym khoâng tan trong dung moâi khoâng phaân cöïc. Khi enzym ñöôïc hoaø tan vaøo nöôùc, caùc phaân töû nöôùc löôõng cöïc seõ keát hôïp vôùi caùc ion, caùc nhoùm ion hoaëc caùc nhoùm phaân cöïc trong phaân töû enzym taïo thaønh lôùp voû hydrat. Löôïng nöôùc hydrat naøy khaù lôùn vaø coù vai troø quan troïng laøm moâi tröôøng cho caùc phaûn öùng sinh hoaù. Enzym bò keát tuûa bôûi caùc taùc nhaân gaây tuûa protein nhö muoái trung tính baõo hoaø (NaCl, (NH4)2SO4 …), dung moâi höõu cô ôû nhieät ñoä thaáp (etanol, aceton…) neân caùc chaát naøy ñöôïc duøng ñeå thu cheá phaåm enzym hoaït ñoäng. Tuy nhieân, protein seõ bò bieán tính laøm cho enzym maát hoaït tính do söï taùc ñoäng cuûa caùc taùc nhaân nhö: nhieät ñoä cao, moâi tröôøng acid hay kieàm quaù cao, caùc muoái kim loaïi naëng. Vì vaäy, ngöôøi ta ñaõ duøng caùc yeáu toá treân ñeå kìm haõm hoaït tính enzym khi caàn thieát. 1.2.5. Caáu truùc enzym. Khoâng phaûi toaøn boä caùc thaønh phaàn cuûa enzym tham gia vaøo hoaït ñoäng xuùc taùc, maø chæ coù nhöõng boä phaän raát ñaëc bieät mang tính ñaëc hieäu trong phaân töû enzym môùi tham gia xuùc taùc phaûn öùng. Boä phaän ñaëc hieäu naøy ñöôïc goïi laø trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Phaàn coøn laïi ñoùng vai troø nhö moät caùi khung, giöõ cho caáu truùc khoâng gian thích hôïp vôùi khaû naêng xuùc taùc. Moãi enzym thöôøng coù moät trung taâm hoaït ñoäng. Tuy nhieân cuõng coù enzym coù hai thaäm chí coù boán trung taâm hoaït ñoäng. 1.2.6. Cô cheá taùc duïng cuûa enzym Baûn chaát cuûa caùc phaûn öùng enzym laø khi coù söï tham gia xuùc taùc cuûa caùc enzym, caùc cô chaát seõ ñöôïc hoaït hoaù maïnh, töø ñoù laøm thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc cuûa cô chaát. Döôùi taùc duïng cuûa enzym, cô chaát coù theå coù nhöõng thay ñoåi khoâng chæ veà caáu truùc hoaù hoïc, maø coøn thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc. Quaù trình xuùc taùc cuûa enzym xaûy ra qua ba giai ñoaïn: • Giai ñoaïn thöù nhaát: enzym seõ keát hôïp vôùi cô chaát baèng nhöõng lieân keát yeáu, nhôø ñoù seõ taïo ra phöùc heä enzym-cô chaát thöôøng khoâng beàn, phaûn öùng xaûy ra raát nhanh, ñoøi hoûi moät ít naêng löôïng. • Giai ñoaïn thöù hai: cô chaát bò thay ñoåi caáu hình khoâng gian vaø möùc ñoä beàn vöõng cuûa caùc lieân keát. Keát quûa laø caùc lieân keát trong cô chaát bò phaù vôõ. • Giai ñoaïn thöù ba: ñaây laø giai ñoaïn cuoái cuøng, saûn phaåm ñöôïc taïo thaønh vaø taùch khoûi enzym. Enzym ñöôïc giaûi phoùng döôùi daïng töï do nhö ban ñaàu. Cô cheá xuùc taùc toång quaùt cuûa enzym ñöôïc toùm taét nhö sau: E + S ↔ ES → E + P Trong ñoù, E: enzym (enzyme); S: cô chaát (substrate); P: saûn phaåm (products). 1.2.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng enzym. • Noàng ñoä cô chaát Khi phaân giaûi moät loaïi cô chaát naøo ñoù, phaàn cô cheá taùc duïng cuûa enzym cho thaáy phaûn öùng khi coù enzym tham gia seõ traûi qua ba giai ñoaïn: Giai ñoaïn ñaàu neáu noàng ñoä cô chaát thaáp thì vaän toác phaûn öùng (V) phuï thuoäc tuyeán tính vôùi noàng ñoä cô chaát. Giai ñoaïn keá tieáp neáu V xaáp xæ giaù trò cöïc ñaïi thì V khoâng phuï thuoäc vaøo cô chaát. Giai ñoaïn tieáp theo neáu noàng ñoä cô chaát tieáp tuïc taêng cao thì haàu nhö V khoâng taêng nöõa maø ñaït giaù trò gaàn vôùi Vmax vì caùc enzym ñaõ baõo hoaø cô chaát. • Noàng ñoä enzym Neáu thöøa cô chaát, V phuï thuoäc tuyeán tính vaøo noàng ñoä enzym: V = k[E] Trong ñoù: V: vaän toác phaûn öùng [E]: noàng ñoä enzym k: haèng soá vaän toác phaûn öùng. • Nhieät ñoä Nhieät ñoä coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán phaûn öùng enzym. Toác ñoä phaûn öùng chæ taêng ñeán moät giôùi haïn nhieät ñoä nhaát ñònh, vöôït quaù nhieät ñoä ñoù vaän toác phaûn öùng seõ giaûm vaø daãn ñeán möùc trieät tieâu do caáu truùc protein ñaõ bò phaù vôõ. Nhieät ñoä toái öu cuûa nhöõng enzym khaùc nhau laø hoaøn toaøn khaùc nhau. Phaàn lôùn enzym hoaït ñoäng maïnh nhaát ôû nhieät ñoä 40-50oC, coù moät soá enzym khaùc laø 600C hoaëc 700C, thaäm chí moät soá enzym cuûa vi khuaån Bacillus subtilis laïi hoaït ñoäng maïnh ôû 900C. Neáu taêng nhieät ñoä cao hôn möùc toái öu thì hoaït tính cuûa enzym seõ bò giaûm, khi ñoù enzym khoâng coù khaû naêng phuïc hoài laïi hoaït tính. Ngöôïc laïi, ôû nhieät ñoä 00C thì hoaït tính cuûa enzym bò haïn cheá raát maïnh, nhöng khi ñöa nhieät ñoä leân töø töø thì hoaït tính cuûa enzym seõ taêng daàn ñeàu ñeán möùc toái öu. Nhieät ñoä toái öu cuûa moät enzym phuï thuoäc raát nhieàu vaøo söï coù maët cuûa cô chaát, kim loaïi, pH, caùc chaát baûo veä. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng heä soá nhieät Q10 ñeå bieåu thò aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán vaän toác phaûn öùng. Heä soá naøy caøng lôùn thì phaûn öùng caøng khoù xaûy ra ôû nhieät ñoä thöôøng. • pH moâi tröôøng pH thöôøng aûnh höôûng ñeán möùc ñoä ion hoaù cô chaát, enzym, vaø ñaëc bieät aûnh höôûng ñeán ñoä beàn cuûa enzym. Ña soá enzym beàn ôû pH = 5-9, ñoä beàn cuûa enzym taêng neáu coù maët cô chaát, coenzym, hoaëc Ca2+. Moãi enzym coù moät giaù trò pH toái öu (pHopt) taïi ñoù V ñaït Vmax. Nhieàu enzym hoaït ñoäng raát maïnh ôû pH trung tính, cuõng coù enzym hoaït ñoäng ôû pH acid hoaëc pH kieàm. • Caùc chaát kìm haõm (I) Caùc chaát kìm haõm hoaït ñoäng cuûa enzym laøm giaûm hoaït tính enzym nhöng laïi khoâng bò enzym laøm thay ñoåi tính chaát hoaù hoïc, caáu taïo hoaù hoïc vaø tính chaát vaät lyù cuûa chuùng. Caùc chaát naøy bao goàm caùc ion, caùc phaân töû voâ cô, caùc chaát höõu cô vaø caû protein. Caùc chaát kìm haõm coù yù nghóa raát lôùn trong ñieàu khieån caùc quùa trình trao ñoåi chaát ôû teá baøo sinh vaät. Cô cheá kìm haõm cuûa caùc chaát kìm haõm coù theå thuaän nghòch hoaëc khoâng thuaän nghòch, ñaëc hieäu hoaëc khoâng ñaëc hieäu. Sau ñaây chuùng ta chæ xeùt caùc chaát kìm haõm thuaän nghòch. Tuyø thuoäc vaøo baûn chaát taïo phöùc EI, baûn chaát cuûa chaát kìm haõm ngöôøi ta chia thaønh caùc loaïi chaát kìm haõm sau:  Caùc chaát kìm haõm caïnh tranh Caùc chaát naøy coù caáu truùc töông töï nhö caáu truùc cuûa cô chaát vì theá chuùng coù khaû naêng keát hôïp vôùi trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Keát quaû laø trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym bò chaát kìm haõm chieám maát, do ñoù cô chaát maát moät phaàn khaû naêng töông taùc laøm toác ñoä phaûn öùng giaûm.  Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh Caùc chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh keát hôïp vôùi enzym ôû moät vò trí khoâng phaûi trung taâm hoaït ñoäng, keát quaû laø chuùng laøm thay ñoåi caáu truùc khoâng gian cuûa phaân töû enzym theo chieàu höôùng baát lôïi cho hoaït ñoäng xuùc taùc. Vì theá caùc chaát kìm haõm laøm giaûm hoaït ñoäng cuûa enzym. Khi keát hôïp vôùi chaát kìm haõm, enzym vaãn coù khaû naêng keát hôïp vôùi cô chaát khi ñoù seõ taïo thaønh phöùc hôïp EIS. Trong thöïc teá chaát kìm haõm chæ keát hôïp vôùi phöùc hôïp ES maø khoâng keát hôïp vôùi E töï do. Caùc chaát kìm haõm coù theå laø nhöõng chaát sau:  Kìm haõm bôûi saûn phaåm cuûa phaûn öùng Caùc saûn phaåm cuûa phaûn öùng coù theå ñoùng vai troø nhö chaát kìm haõm khoâng caïnh tranh. Neáu enzym xuùc taùc cho phaûn öùng cuûa cô chaát A vaø B taïo thaønh saûn phaåm P1 vaø P2, enzym coù aùi löïc vôùi P1, P2 vaø caû cô chaát A, B. Khi ñoù P1vaø P2 trôû thaønh chaát kìm haõm cuûa enzym.  Kìm haõm do thöøa cô chaát Khi ES ñöôïc taïo thaønh coù theå coù moät cô chaát gaén vôùi ES laøm chuùng khoâng theå chuyeån hoaù tieáp ñöôïc: ES + S ↔ ESS • Chaát hoaït hoaù Laø nhöõng chaát coù taùc duïng laøm taêng hoaït tính enzym. Chaát hoaït hoaù enzym coù theå laø anion, caùc ion kim loaïi, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc phöùc taïp coù nhieäm vuï chuyeån nhoùm hydrogen hoaëc phaù vôõ moät soá lieân keát trong phaân töû tieàn enzym hoaëc phuïc hoài caùc nhoùm chöùc naêng trong trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzym. Caùc chaát hoaït hoaù chæ coù taùc duïng hoaït hoaù ôû moät noàng ñoä nhaát ñònh, vöôït quaù noàng ñoä naøy chuùng seõ gaây öùc cheá hoaït ñoäng cuûa enzym. 1.3. Heä enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44] Amylase thuoäc heä enzym thuyû phaân (hydrolase) chuùng thuyû phaân caùc lieân keát α-1,4 vaø α-1,6 glucoside cuûa tinh boät. Töø xöa chuû yeáu ngöôøi ta thu nhaän amylase töø malt, nhöng ngaøy nay vieäc thu nhaän chuû yeáu töø nuoâi caáy VSV. Cuõng nhö nhieàu VSV khaùc, vi khuaån Bacillus taïo ra raát nhieàu enzym ngoaïi baøo nhö: amylase, protease, celullase,... Trong ñoù amylase raát quan troïng vì chuùng ñöôïc söû duïng phoå bieán vaø mang laïi nhieàu lôïi ích cho neàn saûn xuaát coâng nghieäp. Caùc loaïi amylase thöôøng gaëp khi nuoâi caáy VSV goàm: α – amylase, β- amylase vaø γ-amylase. 1.3.1. Giôùi thieäu veà enzym α – amylase. • Caáu taïo: α-amylase coù caáu taïo goàm 3 tieåu ñôn vò: * A laø tieåu ñôn vò loõi coù caáu truùc ñaëc tröng helix (α/β) 8 barel. * Tieåu ñôn vò C ñöôïc noái vôùi A coù caáu truùc taùm ñoaïn β-sheet song song. * Tieåu ñôn vò B goàm hai ñoaïn β-sheet ñöôïc loàng vaøo giöõa ñoaïn β-sheet thöù ba vaø α-helix thöù ba cuûa tieåu ñôn vò A. Tieåu ñôn vò B quyeát ñònh ñoä beàn hoaït ñoä cuûa enzym vaø lieân keát enzym-cô chaát. Ion canxi noái giöõa tieåu ñôn vò A vaø B, coù töø 1-30 nguyeân töû gam Ca/mol. Khi taùch hoaøn toaøn canxi ra khoûi enzym thì α-amylase maát heát hoaït tính, vì Ca duy trì caáu hình hoaït ñoäng cuûa enzym. Maët khaùc, Ca coøn coù taùc duïng ñaûm baûo ñoä beàn raát lôùn cuûa enzym ñoái vôùi caùc taùc ñoäng gaây bieán tính vaø söï thuyû phaân cuûa caùc enzym phaân giaûi protein. Tuyø thuoäc vaøo daïng enzym maø coù theå coù theâm moät soá tieåu ñôn vò khaùc ñöôïc gaén vôùi ñaàu C-terminal hoaëc ñaàu N-terminal cuûa phaân töû protein. Taâm hoaït ñoäng cuûa α-amylase coù chöùa caùc nhoùm –COOH vaø NH3 . • Tính chaát lyù hoùa Ñieàu kieän hoaït ñoäng cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau thöôøng khoâng Hình 1.1. Caáu truùc phaân töû α-amylase [50] gioáng nhau. - pH pH toái thích cho hoaït ñoäng cuûa α-amylase töø naám sôïi laø 4,5-4,8 vaø cuûa vi khuaån laø 5,8-6,0. Nhìn chung pH toái öu naèm trong khoaûng acid yeáu 4,8-6,9. pH<4,0 α-amylase cuûa vi khuaån bò voâ hoaït hoaøn toaøn, tuy nhieân moät soá α- amylase chòu acid cao nhö cuûa Bacillus acidocaldarious (pH toái thích laø 3,5) vaø chòu kieàm maïnh nhö B. licheniformis (pH toái thích laø 9,0). - Nhieät ñoä Nhìn chung α-amylase beàn nhieät hôn so vôùi caùc amylase khaùc, ñaëc tính naøy ñöôïc cho raèng coù lieân quan ñeán haøm löôïng ion canxi trong phaân töû (α- amylase cuûa caùc vi khuaån öa nhieät coù chöùa canxi nhieàu hôn α - amylase cuûa naám moác 3 - 4 laàn). α - amylase cuûa vi khuaån coù ñoä beàn nhieät cao hôn caû. Baûng 1.1. Ñoä beàn nhieät cuûa α-amylase töø caùc nguoàn khaùc nhau (theo Miller, Johson vaø Palmer) Hoaït ñoä α-amylase, % so vôùi hoaït ñoä ban ñaàu Nhieät ñoä (oC) cuûa naám sôïi cuûa malt cuûa vi khuaån 65 70 75 80 85 90 95 100 52 3 - - - - 100 100 58 25 1 - - 100 100 100 92 58 52 8 Tính beàn nhieät cao cuûa α-amylase vi khuaån laø moät öu ñieåm lôùn. Vì trong saûn xuaát α-amylase ñöôïc söû duïng ñeå xöû lyù nguyeân lieäu ôû coâng ñoaïn phaûi duøng nhieät ñoä cao. • Cô cheá taùc duïng α-amylase coù khaû naêng phaân caét caùc lieân keát α-1,4 glucoside trong phaân töû polysaccharid moät caùch ngaãu nhieân. Vì theá ngöôøi ta goïi noù laø enzym amylase noäi phaân (endoamylase). Khi taùc duïng leân tinh boät taïo ra saûn phaåm chuû yeáu laø dextrin phaân töû löôïng thaáp (phaûn öùng khoâng maøu vôùi iod), ngoaøi ra coøn coù maltose, vaø moät ít glucose. Vì vaäy, ngöôøi ta goïi α-amylase laø amylase dextrin hoaù hay amylase dòch hoaù. 1.3.2 Nguoàn thu nhaän enzym amylase. Enzym coù theå ñöôïc thu nhaän töø nhieàu nguoàn khaùc nhau nhö ñoäng vaät, thöïc vaät, vi sinh vaät (VSV). Tuy nhieân vieäc khai thaùc enzym töø thöïc vaät, ñoäng vaät thöôøng gaëp khoù khaên vì nguoàn nguyeân lieäu haïn cheá, hieäu suaát thaáp neân giaù thaønh cao. Hieän nay phaàn lôùn enzym ñeàu ñöôïc thu nhaän töø vi sinh vaät, vì coù nhöõng ñieåm noåi baät sau: - VSV coù toác ñoä sinh tröôûng, phaùt trieån vaø sinh saûn cöïc kyø nhanh, töø ñoù toång hôïp enzym vôùi cöôøng ñoä raát maïnh, neân trong moät thôøi gian ngaén coù theå thu ñöôïc moät löôïng enzym raát lôùn. - Heä enzym cuûa VSV raát phong phuù, töø caùc chuûng VSV khaùc nhau ta coù theå thu nhaän ñöôïc nhieàu loaïi enzym khaùc nhau, trong ñoù coù nhöõng enzym chuyeân bieät chæ coù ôû VSV maø haàu nhö khoâng thaáy ôû ñoäng vaät, thöïc vaät. - Moâi tröôøng nuoâi caáy VSV ñôn giaûn, reû tieàn, thöôøng laø nhöõng pheá phuï lieäu cuûa ngaønh coâng nghieäp neân giaù thaønh enzym reû hôn vaø deã aùp duïng cho caùc cô sôû saûn xuaát. - VSV chòu aûnh höôûng raát lôùn bôûi thaønh phaàn dinh döôõng, caùc taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng, do ñoù ngöôøi ta coù theå thay ñoåi thaønh phaàn dinh döôõng hoaëc caùc yeáu toá taùc ñoäng ñeå ñieàu khieån quaù trình toång hôïp enzym theo yeâu caàu. - Vieäc caûi taïo gioáng VSV ñeå taïo ra caùc chuûng VSV coù khaû naêng toång hôïp ra caùc loaïi enzym theo yù muoán coù theå thöïc hieän ñöôïc vaø chæ trong thôøi gian ngaén, vì khaû naêng thích öùng vôùi moâi tröôøng cuûa VSV laø raát maïnh. - Saûn xuaát enzym töø VSV coù theå thöïc hieän treân qui moâ coâng nghieäp, töï ñoäng hoùa vaø cô giôùi hoaù. Ngöôøi ta ñaõ bieát nhieàu loaïi VSV coù khaû naêng toång hôïp amylase, trong ñoù ñöôïc söû duïng nhieàu hôn caû laø naám sôïi, giaû naám men vaø vi khuaån, coøn xaï khuaån thì ít hôn. - Caùc gioáng naám sôïi thöôøng ñöôïc duøng ñeå thu amylase laø Aspergillus, Rhizopus. - Nhieàu chuûng vi khuaån cuõng coù khaû naêng taïo löôïng lôùn amylase nhö: Bacillus polymyxa, Phytomonas destructans, Clostridium acetobutylicum,… trong ñoù caùc chuûng vi khuaån öa nhieät taïo nhieàu amylase ñaùng chuù yù laø Bacillus diastaticus, B. stearothermophilus, B. coagulans, B. circulans; vi khuaån öa aåm taïo amylase maïnh ñöôïc nghieân cöùu nhieàu hôn caû vaø söû duïng roäng raõi nhaát laø B. subtilis. Nhöõng chuûng VSV taïo nhieàu amylase thöôøng ñöôïc phaân laäp töø caùc nguoàn töï nhieân. Trong coâng nghieäp, caùc bieán chuûng taïo ra ñöôïc baèng caùch gaây ñoät bieán, nhôø taùc nhaân lyù hoïc hoaëc hoaù hoïc hoaëc phoái hôïp caû hai loaïi taùc nhaân treân, laø nhöõng chuûng hoaït ñoäng raát maïnh vaø coù khaû naêng sinh toång hôïp nhieàu amylase. 1.3.3 Moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán sinh toång hôïp amylase cuûa VSV [18], [23]  Gioáng vi sinh vaät Coù raát nhieàu yeáu toá aûnh höôûng ñeán söï hình thaønh amylase vaø löôïng amylase cuûa VSV nhö: chuûng VSV, moâi tröôøng dinh döôõng, ñieàu kieän nuoâi caáy,… Trong caùc yeáu toá treân thì chuûng gioáng VSV laø ñieàu kieän ñaàu tieân vaø cô baûn nhaát. Khoâng phaûi caùc chuûng VSV ñeàu coù khaû naêng toång hôïp amylase nhö nhau. Ngay caû nhöõng chuûng cuøng chi, thaäm chí laø cuøng loaøi cuõng raát khaùc nhau veà löôïng enzym do chuùng sinh ra. Chính vì theá maø vieäc tuyeån choïn chuûng VSV coù khaû naêng taïo nhieàu amylase laø voâ cuøng quan troïng. Ngoaøi vieäc tuyeån gioáng coù khaû naêng sinh amylase cao, thì vieäc baûo quaûn gioáng, tieán haønh nuoâi caáy trong ñieàu kieän toái öu cuõng voâ cuøng quan troïng nhaèm ñaûm baûo khaû naêng sinh toång hôïp enzym cao nhaát vaø oån ñònh nhaát. Vì taàm quan troïng nhö vaäy maø nhieàu nöôùc treân theá giôùi ñaõ ñöa coâng taùc naøy leân taàm côõ quoác gia vaø ñaõ thaønh laäp caùc trung taâm, chi nhaùnh giöõ gioáng goïi laø baûo taøng VSV.  Nguoàn dinh döôõng Trong moâi tröôøng nuoâi caáy VSV caàn phaûi ñaûm baûo ñaày ñuû, thích hôïp caùc thaønh phaàn vaø tæ leä caùc chaát dinh döôõng cho töøng VSV cuï theå. • AÛnh höôûng nguoàn cacbon Thaønh phaàn vaø haøm löôïng cacbon coù aûnh höôûng lôùn ñeán sinh toång hôïp enzym. Theo soá lieäu cuûa Grigorev veà aûnh höôûng cuûa nguoàn cacbon tôùi cöôøng ñoä sinh toång hôïp amylase coù theå xeáp theo thöù töï sau: Vôùi α–amylase: tinh boät > dextrin > maltozô > lactozô > glucozô > sacarozô > galactozô > manozô > arabinozô. Vôùi glucoamylase: tinh boät > dextrin > maltozô > sacarozô > glucozô > lactozô > lactozô > arabinozô > galactozô > manozô. Noàng ñoä nguoàn cacbon cuõng aûnh höôûng lôùn ñeán söï taïo thaønh enzym. Moãi loaøi VSV chæ coù theå thích hôïp vôùi moät noàng ñoä hydratcacbon nhaát ñònh. • AÛnh höôûng nguoàn nitô Nitô caàn cho söï hình thaønh caùc axit amin ñeå caáu taïo neân caùc protein caáu truùc cho caùc phaân töû cuûa enzym. Nguoàn nitô boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy coù theå laø nitô voâ cô hoaëc nitô höõu cô. Nguoàn nitô thöôøng duøng laø nitrat amon, sunfat amon, ureâ,… Caùc hôïp chaát höõu cô laø nhöõng nguyeân lieäu giaøu ñaïm nhö cao ngoâ, boät ñaäu töông, khoâ laïc, khoâ ñaäu,… Ngoaøi ra moät soá axit amin, bazô purin, pyrimidin cuõng thöôøng ñöôïc boå sung vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy VSV. Ngoaøi hai nhaân toá cô baûn treân, trong moâi tröôøng dinh döôõng cuûa VSV sinh enzym noùi chung caàn phaûi coù maët nhieàu nguyeân toá khoaùng ôû daïng muoái magieâ, photpho, kali,…vaø caùc nguyeân toá vi löôïng. Ví duï ion Mg2+ coù taùc duïng laøm oån ñònh amylase ôû nhieät ñoä cao, Ca2+ coù trong thaønh phaàn protein cuûa α – amylase.  Ñieàu kieän nuoâi caáy Trong moâi tröôøng nuoâi caáy VSV caùc yeáu toá nhö, nhieät ñoä, ñoä pH, ñoä aåm, thôøi gian nuoâi caáy,… cuõng aûnh höôûng lôùn ñeán söï taïo thaønh enzym cuûa VSV. • AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Nhieät ñoä toái thích cho sinh toång hôïp enzym cuûa caùc VSV laø khaùc nhau. Ví duï ôû ña soá naám moác treân moâi tröôøng raén laø 28-32oC, cuûa vi khuaån 30-35oC. • AÛnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng aûnh höôûng khoâng nhoû ñeán söï phaùt trieån vaø taïo thaønh enzym. Ña soá naám moác phaùt trieån vaø taïo amylase ôû moâi tröôøng axit yeáu, trong khi ñoù vi khuaån laïi thích hôïp trong moâi tröôøng trung tính. pH moâi tröôøng khoâng chæ aûnh höôûng ñeán löôïng enzym toång hôïp maø coøn aûnh höôûng ñeán chuûng loaïi enzym ñöôïc toång hôïp. Ví duï ôû Asperillus oryzae khi pH moâi tröôøng laø 6,5 thì öu theá toång hôïp thuoäc veà α – amylase, trong khi ñoù öu theá toång hôïp glucoamylase khi pH moâi tröôøng laø 4,5. • AÛnh höôûng ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy Trong quaù trình saûn xuaát caàn phaûi duy trì ñoä aåm cuûa moâi tröôøng, vì ñoä aåm seõ laøm giaûm ñoä thoaùng khí cuûa moâi tröôøng, coøn ñoä aåm thaáp laïi kìm haõm söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa VSV. Ñoä aåm moâi tröôøng xoáp thích hôïp nuoâi naám moác laø 50 – 60%, coøn ñoái vôùi vi khuaån laø 50 – 70%. • AÛnh höôûng thôøi gian nuoâi caáy Thôøi gian nuoâi caáy aûnh höôûng lôùn ñeán söï hình thaønh enzym. Ñoái vôùi ña soá naám moác khi nuoâi ôû moâi tröôøng xoáp söï taïo thaønh amylase cöïc ñaïi thöôøng keát thuùc khi naám moác baét ñaàu sinh baøo töû, thôøi gian keát thuùc söï taïo thaønh amylase thöôøng töø 30-42 giôø. Coøn ñoái vôùi vi khuaån söï taïo thaønh amylase toát nhaát töø khoaûng 40-50 giôø. Coøn nuoâi caáy chìm sinh tröôûng cuûa chuûng gioáng ñaït cöïc ñaïi tôùi pha oån ñònh tröôùc, khoaûng töø 5 ñeán 8 giôø sau thì hoaït ñoä enzym ñaït cöïc ñaïi. 1.3.4. Taùch chieát enzym töø caùc nguoàn nguyeân lieäu [4], [10], [12], [14] - Ñoái vôùi enzym ngoaïi baøo: ngöôøi ta taùch sinh khoái vaø caùc chaát caën baõ khoûi canh tröôøng baèng phöông phaùp loïc hoaëc ly taâm. Söû duïng theâm caùc chaát trôï loïc (diatomite, than hoaït tính…) hoaëc caùc chaát taïo keát tuûa ñeå caùc chaát naøy deã daøng bò laéng caën keùo theo sinh khoái giuùp quaù trình loïc deã daøng hôn. - Ñoái vôùi enzym noäi baøo: ñeå thu nhaän enzym caàn phaûi phaù vôõ teá baøo baèng caùc phöông phaùp sau: ▪ Phöông phaùp vaät lyù Nghieàn teá baøo trong maùy ñoàng hoaù hoaëc nghieàn vôùi boät thuyû tinh hay caùt traéng saïch trong coái söù. Thay ñoåi nhieät ñoä ñoät ngoät hoaëc taïo aùp suaát thaåm thaáu cao ñeå phaù vôõ thaønh teá baøo. ▪ Phöông phaùp hoaù hoïc Söû duïng acid ñeå thuyû phaân thaønh teá baøo. Tuy nhieân cho acid quaù nhieàu coù theå laøm bieán tính enzym. Hoaëc coù theå duøng kieàm, nhöng neáu enzym coù tính acid thì khoâng duøng ñöôïc. ▪ Phöông phaùp sinh hoïc Phöông phaùp sinh hoïc ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát laø phöông phaùp enzym. Duøng caùc enzym töông öùng vôùi caùc cô chaát coù trong thaønh teá baøo ñeå thuyû phaân, nhö vaäy thaønh teá baøo seõ bò phaù vôõ. Sau khi phaù vôõ teá baøo, caùc enzym ñöôïc taùch chieát baèng caùc dung moâi khaùc nhau nhö: nöôùc, dung dòch ñeäm, muoái trung tính. Phaàn lôùn caùc enzym thuyû phaân tan toát trong nöôùc, do ñoù nöôùc laø dung moâi toát nhaát ñeå chieát ruùt enzym, coù theâm moät ít focmalin ñeå saùt truøng. Nhieät ñoä nöôùc ñeå ruùt chieát enzym thöôøng laø 25-280C. Caàn laøm laïnh nhanh dòch chieát xuoáng 10-120C ñeå ngaên caûn VSV laï phaù hoûng dòch enzym. 1.3.5 ÖÙng duïng cuûa amylase trong thöïc teá saûn xuaát vaø ñôøi soáng [6], [15], [28], [29], [46]  Trong saûn xuaát baùnh keïo Muïc ñích cuûa vieäc söû duïng enzym vaøo saûn xuaát caùc loaïi baùnh quy laø laøm taêng muøi vaø vò cuûa baùnh. Theâm caùc enzym protease vaø amylase khi cheá bieán boät laøm taêng haøm löôïng caùc acid amin töï do vaø löôïng ñöôøng khöû, töø ñoù chuùng tham gia vaøo caùc phaûn öùng oxi hoaù khöû vaø keát quûa taïo cho baùnh quy coù muøi, vò vaø maøu haáp daãn.  Trong coâng ngheä saûn xuaát baùnh mì Trong saûn xuaát baùnh mì, enzym ñöôïc xem nhö chaát phuï gia ñeå laøm taêng chaát löôïng baùnh: laøm taêng theå tích baùnh, baùnh coù maøu saéc ñeïp hôn vaø muøi thôm hôn. Trong quaù trình saûn xuaát ngöôøi ta söû duïng enzym protease, α-amylase, β- amylase, trong ñoù: o Enzym protease coù taùc duïng laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa boät nhaøo do gluten gaây ra vaø laøm taêng heä soá tieâu hoaù protein. o Enzym α-amylase, β-amylase tham gia thuyû phaân tinh boät taïo ra ñöôøng, nhôø ñoù naám men deã daøng chuyeån hoaù ñöôøng thaønh coàn, CO2, töø ñoù laøm taêng theå tích cuûa baùnh vaø taïo maøu saéc, höông vò cuûa baùnh. Ngaøy nay, nguoàn enzym amylase vaø protease ñöôïc söû duïng chuû yeáu töø naám moác Aspergillus oryzae, vaø A. awamori.  Trong saûn xuaát bia Ngaøy nay, caùc nöôùc treân theá giôùi öùng duïng enzym trong caùc coâng ñoaïn saûn xuaát bia. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng enzym amylase vaø protease cuûa vi khuaån, vì caùc loaïi enzym thu nhaän töø vi khuaån thöôøng coù hoaït tính cao vaø khaû naêng chòu nhieät ñoä cao raát toát maø nhieät ñoä cao thöôøng laøm bieán tính enzym trong malt. Ngöôøi ta söû duïng roäng raõi cheá phaåm enzym amylase cuûa naám moác Aspergillus oryzae, A. niger, A. awamori,…vaø cuûa vi khuaån Bacillus subtilis, B. diastaticus,…ñeå ñöôøng hoaù thay malt. Duøng amylase VSV coù theå thay theá töø 50- 100% malt baèng nguyeân lieäu khaùc nhö boät gaïo, boät baép, boät saén…nhöng thoâng thöôøng chæ thay theá töø 60-70% malt thì chaát löôïng bia toát hôn, thôm ngon hôn. YÙ nghóa cuûa vieäc söû duïng enzym VSV thay theá malt trong saûn xuaát bia ñaõ tieát kieäm ñöôïc haøng taán malt ñaïi maïch loaïi toát, giaûm giaù thaønh vaø ruùt ngaén thôøi gian saûn xuaát. Ñoái vôùi Vieät Nam cuõng nhö nhöõng nöôùc phaûi nhaäp malt vôùi giaù thaønh cao thì bieän phaùp treân coù yù nghóa to lôùn.  Trong saûn xuaát röôïu Söû duïng amylase cuûa VSV ôû giai ñoaïn ñöôøng hoaù trong saûn xuaát röôïu, coàn ñaõ ruùt ngaén thôøi gian vaø taêng hieäu suaát do khaû naêng thuyû phaân saâu saéc cuûa phöùc heä enzym VSV. Vai troø cuûa α-amylase trong saûn xuaát röôïu laø laøm dòch hoaù nhanh ôû giai ñoaïn naáu vaø ôû caû giai ñoaïn ñaàu cuûa söï ñöôøng hoaù, dextrin hoaù vaø tích tuï ñöôøng. Enzym amylase ñöôïc thu nhaän töø naám moác Aspergillus usamii, A. awamori, A. oryzae vaø töø vi khuaån Bacillus subtilis, B. diastaticus. Saûn phaåm cuoái cuøng cuûa söï thuyû phaân tinh boät nhôø amylase naám moác chuû yeáu laø glucose, ñöôøng deã leân men, do ñoù söï leân men röôïu xaûy ra nhanh hôn. Coøn cheá phaåm amylase töø vi khuaån chòu ñöôïc nhieät ñoä cao neân ñöôïc söû duïng trong giai ñoaïn dòch hoaù tinh boät tröôùc khi ñöôøng hoaù laø raát thích hôïp.  Trong saûn xuaát maät tinh boät Ngaøy nay ngöôøi ta duøng cheá phaåm amylase VSV thay cho acid vaø malt ñeå thuyû phaân tinh boät taïo maät tinh boät (maät glucose, maltose). Khi thuyû phaân tinh boät nhôø amylase VSV laøm cho chaát löôïng dòch thuyû phaân toát hôn vaø deã daøng tinh cheá hôn, vì khoâng xaûy ra söï phaân huyû ñöôøng bôûi acid, bôûi nhieät, vaø khoâng phaân huyû caùc taïp chaát coù laãn trong tinh boät. Hai loaïi enzym ñöôïc söû duïng chuû yeáu laø α-amylase vaø γ-amylase (glucoamylase) töø naám moác, vi khuaån vaø giaû naám men. α-amylase duøng ñeå dòch hoaù tinh boät vaø taïo maltose, coøn γ-amylase duøng ñeå ñöôøng hoaù taïo glucose.  Trong saûn xuaát chaát taåy röûa Enzym amylase coù khaû naêng phaân giaûi caùc veát baån do carbohydrate trong quaàn aùo. Ngöôøi ta thöôøng söû duïng α-amylase cuûa vi khuaån vì enzym naøy thöôøng chòu ñöôïc nhieät ñoä cao (ñeán 90oC) vaø pH kieàm (pH = 9). Ngoaøi ra, enzym naøy coøn ñöôïc duøng phoái hôïp vôùi protease kieàm cho hieäu quaû taåy röûa caùc chaát carbohydrate vaø protein ñöôïc toát hôn.  Trong coâng nghieäp deät Enzym amylase ñöôïc duøng ñeå ruõ hoà vaûi tröôùc khi taåy traéng vaø nhuoäm. Trong vaûi moäc chöùa 5% tinh boät vaø nhieàu taïp chaát khaùc. Ñeå laøm vaûi meàm, coù khaû naêng nhuùng öôùt, taåy traéng vaø baét maøu toát khi nhuoäm thì nhaát thieát phaûi taùch boû tinh boät. Ngaøy nay, ngöôøi ta söû duïng α-amylase cuûa VSV nhö vi khuaån Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus hay naám moác Aspergillus oryzae thay cho amylase malt vaø pancreatin. α-amylase cuûa vi khuaån chòu ñöôïc nhieät ñoä cao, hoaït ñoäng maïnh ôû 85-90oC. Moät soá enzym cuûa amylase cuûa B.subtilis coù theå hoaït ñoäng ôû 105-115oC. Khi ruõ hoà vaûi, löôïng cheá phaåm enzym tính cho moãi lít dung dòch laø 0,3-0,6g, nhieät ñoä xöû lyù laø 90oC, trong thôøi gian töø 5-15 phuùt. Phöông phaùp naøy khoâng laøm haïi vaûi, maø taïo ñoä mao daãn toát ñoàng thôøi ñaûm baûo veä sinh.  Trong chaên nuoâi Amylase ñöôïc söû duïng rieâng reõ hay phoái hôïp vôùi caùc enzym khaùc nhö protease, cellulase, pectinase…ñeå saûn xuaát caùc loaïi thöùc aên deã tieâu hoaù cho gia suùc, gia caàm, ñaëc bieät laø vaät nuoâi coøn non giuùp taêng troïng nhanh, sinh saûn toát, söùc ñeà khaùng cao…  Trong y hoïc vaø nghieân cöùu khoa hoïc Amylase cuøng caùc enzym khaùc ñöôïc duøng trong chöõa trò beänh do thieáu enzym, khaû naêng chuyeån hoaù caùc chaát keùm, caùc beänh veà tieâu hoaù,… Ngoaøi ra, cheá phaåm amylase coøn ñöôïc duøng ñeå ñieàu cheá moâi tröôøng nuoâi VSV phuïc vuï cho coâng taùc khoa hoïc. Moät dung dòch beàn vöõng chöùa α-amylase cho pheùp phaùt hieän caùc oligosaccharide phaân töû löôïng lôùn vôùi ñoä nhaïy raát cao. Chương II: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 2.1 Vaät lieäu 2.1.1 Ñoái töôïng Laø caùc chuûng tröïc khuaån ñöôïc phaân laäp töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ. 2.1.2. Duïng cuï Caùc duïng cuï, thieát bò cuûa phoøng thí nghieäm Vi sinh – sinh hoaù Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Thieát bò goàm coù: Tuû caáy voâ truøng Beáp oån nhieät Caân ñieän töû Maùy laéc Kính hieån vi ñieän töû Maùy ño OD Tuû aám Tuû laïnh Tuû saáy Maùy ño pH Noài haáp thanh truøng Maùy ly taâm 2.1.3. Hoaù chaát Caùc hoaù chaát cuûa phoøng Vi sinh – sinh hoaù Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Thaønh phoá Hoà Chí Minh, goàm coù: NaCl Cao thòt MgCl2 Pepton CaCl2 Cao naám men Agar KI Iot Tinh boät tan Tím Gentian H2O2 Etanol 96oC Aceton (NH4) 2SO4 Na2HPO4.12H2O2 KH2PO4 Thuoác thöû Folin HCl ñaäm ñaëc Na2CO3 CaCO3 K2HPO4 2.2. Caùc moâi tröôøng ñöôïc söû duïng 2.2.1 Moâi tröôøng phaân laäp vaø nuoâi Bacillus (MPA) [5] Pepton 10g Cao thòt 5g NaCl 5g Agar 10g Nöôùc caát 1000ml 2 2.2. Moâi tröôøng caûm öùng sinh toång hôïp α-amylase cuûa Bacillus [7] Pepton 5g Cao naám men 2g MgSO4 0,5g NaCl 0,5g K2HPO4 1g Tinh boät 10g KH2PO4 1g Nöôùc caát 1000ml CaCl2 0,15g 2.2.3. Moâi tröôøng thöû hoaït tính amylase [17] Pepton 5g Nöôùc 1000ml Cao men 2,5g pH 5,5 – 7,8 Tinh boät tan 1% Ñeå thöû hoaït tính amylase söû duïng dung dòch lugol, ño voøng thuyû phaân tinh boät. 2.3. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu 2.3.1 Phöông phaùp phaân laäp caùc chuûng Bacillus töø ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ [5], [17]. Laáy moät ít ñaát vöôøn (10g) cho vaøo bình tam giaùc vaø theâm 90ml nöôùc caát voâ truøng laéc ñeàu ñeå taïo huyeàn phuø, gia nhieät tôùi 850C trong 20 – 25 phuùt. Caét nhoû moät ít coû khoâ, raéc xung quanh coû ít boät CaCO3 roài cho vaøo bình tam giaùc treân sao cho nöôùc vöøa ngaäp coû, ñeå töø 1 – 2 ngaøy ôû nhieät ñoä phoøng. Ñoå 10ml moâi tröôøng phaân laäp vaøo ñóa petri voâ truøng, ñeå nguoäi vaø caáy moät laàn que caáy voøng töø maøng VSV moïc treân maët lôùp coû khoâ leân beà maët moâi tröôøng ñaëc, duøng que gaït gaït ñeàu, sau ñoù goùi ñóa petri vaø cho vaøo tuû aám 25-35oC. Sau 2-3 ngaøy thaáy xuaát hieän caùc khuaån laïc rieâng bieät treân maët moâi tröôøng thaïch. 2.3.2. Phöông phaùp giöõ gioáng caáy chuyeàn [11] Ñoå moâi tröôøng giöõ gioáng vaøo oáng nghieäm, ñeå nghieâng oáng nghieäm. Tieáp theo, duøng que caáy voâ truøng laáy dòch vi khuaån phaân laäp ñaõ ñöôïc pha loaõng baèng nöôùc caát voâ truøng, vaø caáy zic zaéc treân beà maët thaïch nghieâng. Nuùt oáng nghieäm laïi ñaët vaøo tuû aám ôû 34oC, sau 24h thaáy xuaát hieän khuaån laïc thì chuyeån oáng nghieäm vaøo tuû laïnh ôû 4oC ñeå giöõ gioáng. Gioáng ñöôïc caáy chuyeàn haøng thaùng vaø hoaït hoaù tröôùc khi nhaân gioáng. 2.3.3. Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa Bacillus  Phöông phaùp nhuoäm Gram [18] Vôùi muïc ñích choïn caùc chuûng coù khaû naêng nhuoäm maøu Gram (+). Ñaây laø phöông phaùp laøm tieâu baûn nhuoäm maøu ñöôïc söû duïng phoå bieán ñeå quan saùt ñaëc ñieåm hình thaùi, ñeám soá löôïng vi khuaån. Nhöõng tieâu baûn naøy coù theå giöõ ñöôïc laâu. • Nguyeân taéc: Khaû naêng baét maøu cuûa VSV coù lieân quan ñeán muoái Magie cuûa acid Ribocleic. Khi nhuoäm muoái naøy coù phaûn öùng vôùi thuoác nhuoäm loaïi tryphenylmetan (gelatin violet, oryatan violet, metyl violet) vaø khoâng bò maát maøu döôùi taùc duïng cuûa coàn. Nhöõng vi khuaån nhö theá goïi laø vi khuaån Gram döông, ngöôïc laïi nhöõng vi khuaån khoâng giöõ ñöôïc maøu khi nhuoäm goïi laø vi khuaån Gram aâm. • Caùch tieán haønh: Cho moät gioït nöôùc caát leân phieán kính, duøng que caáy voâ truøng laáy moät ít teá baøo vi khuaån moïc treân moâi tröôøng ñaëc hoaø vaøo gioït nöôùc. Hô phieán kính leân ngoïn löûa ñeøn coàn 2-3 laàn, chuù yù khoâng ñeå phieán kính noùng quaù vì nhö theá teá baøo vi khuaån seõ bò bieán daïng. Khi gioït nöôùc bay hôi daàn vi khuaån seõ gaén chaët vaøo phieán kính. Nhuoäm maøu nhôø tím Gentian baèng caùch nhoû thuoác nhuoäm naøy leân veát boâi, giöõ 1-2 phuùt roài röûa baèng nöôùc caát. Tieáp theo nhoû dung dòch Lugol leân tieâu baûn ñeå trong 1 phuùt, roài ñoå thuoác ñi vaø traùng baèng nöôùc caát. Sau ñoù röûa baèng coàn 96o trong thôøi gian khoaûng 30-40 giaây. Röûa laïi tieâu baûn baèng nöôùc caát roài ñeå khoâ veát boâi. Sau ñoù nhuoäm boå sung baèng Fucshin loaõng khoaûng 1-2 phuùt. Röûa laïi baèng nöôùc caát cho ñeán khi heát maøu roài ñôïi khoâ. Quan saùt döôùi kính hieån vi quang hoïc, neáu vi khuaån nhuoäm maøu tím laø vi khuaån Gram döông, ngöôïc laïi vi khuaån nhuoäm maøu hoàng laø vi khuaån Gram aâm.  Phöông phaùp nhuoäm baøo töû [11] Baøo töû vi khuaån khoâng phaûi laø cô quan sinh saûn vaø thöôøng coù 2 daïng: hình caàu vaø hình baàu duïc. Khi teá baøo soáng trong moâi tröôøng khoâng thích hôïp cho söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån hoaëc khi teá baøo ñaõ traûi qua giai ñoaïn phaùt trieån maïnh nhaát thì baøo töû ñöôïc hình thaønh. • Nguyeân taéc: Khi teá baøo ñöôïc xöû lyù baèng nhieät hay/vaø acid thì teá baøo chaát cuûa baøo töû raát deã baét maøu. Nhuoäm caû teá baøo chaát cuûa baøo töû vaø teá baøo vôùi thuoác nhuoäm coù hoaït tính nhuoäm maïnh roài taåy maøu cuûa teá baøo chaát cuûa teá baøo vaø nhuoäm noù vôùi moät thuoác nhuoäm phaân bieät khaùc. Khi ñoù teá baøo chaát mang moät maøu vaø baøo töû seõ mang maøu khaùc. • Caùch tieán haønh: Nuoâi vi khuaån treân moâi tröôøng MPA ñaëc trong tuû aám 34oC, sau 5 ngaøy laøm veát boâi treân moät phieán kính saïch vaø ñeå khoâ töï nhieân. Nhoû vaøi gioït HCl 0,5% leân veát boâi, hô noùng treân ngoïn löûa ñeøn coàn cho boác hôi trong 2 phuùt roài röûa vôùi nöôùc. Nhuoäm veát boâi vôùi thuoác nhuoäm Fuchsin, qua mieáng giaáy loïc, hô noùng cho ñeán boác hôi trong voøng 5 phuùt. Röûa veát boâi baèng nöôùc. Taåy maøu baèng dung dòch H2SO4 1% trong 2 phuùt. Röûa veát boâi baèng nöôùc. Nhuoäm veát boâi baèng xanh methylene trong 5-15 phuùt. Röûa laïi vôùi nöôùc vaø ñeå khoâ töï nhieân. Quan saùt döôùi kính hieån vi vôùi vaät kính daàu (×100). Baøo töû seõ mang maøu ñoû, teá baøo sinh döôõng mang maøu xanh.  Phöông phaùp phaùt hieän hoaït tính catalase [19] Phöông phaùp naøy duøng ñeå xaùc ñònh vi khuaån hieáu khí. Tröôùc khi thöû hoaït tính catalase caàn phaûi tieán haønh caáy daøn vi khuaån treân ñóa petri coù moâi tröôøng MPA ñaëc, nuoâi trong tuû aám 340C. Sau 24h thaáy xuaát hieän khuaån laïc thì nhoû moät gioït dung dòch H2O2 10% leân khuaån laïc. Neáu thaáy coù boït khí xuaát hieän thì chöùng toû coù catalase trong teá baøo, vaø keát luaän laø chuûng vi khuaån hieáu khí.  Quan saùt ñaëc ñieåm khuaån laïc [17] Quan saùt moät soá chæ tieâu cuûa chuûng nghieân cöùu treân moâi tröôøng nuoâi Bacillus: - Khaû naêng phaùt trieån cuûa khuaån laïc. - Beà maët khuaån laïc. - Maøu saéc khuaån laïc.  Laøm tieâu baûn teá baøo soáng [5] Loaïi tieâu baûn naøy duøng ñeå xem hình daïng, kích thöôùc vaø söï saép xeáp caùc teá baøo, khaû naêng hình thaønh baøo töû. • Caùch tieán haønh: Laáy moät phieán kính khoâ vaø saïch ñaët leân giaù ñôõ, nhoû moät gioït nöôùc caát leân giöõa phieán kính. Duøng que caáy laáy moät ít VSV moïc treân moâi tröôøng ñaëc MPA hoaø nheï vaøo gioït nöôùc treân phieán kính ñeå taïo huyeàn phuø. Ñaäy nheï laù kính ñeå traùnh taïo thaønh boït khí. Duøng giaáy thaám huùt löôïng nöôùc thöøa ôû quanh laù kính. Moïi thao taùc phaûi ôû caïnh ngoïn löûa ñeøn coàn, vaø moïi duïng cuï phaûi ñöôïc laøm saïch, voâ truøng. Sau ñoù ñaët tieâu baûn leân baøn kính vaø quan saùt vôùi vaät kính 40X. 2.3.4. Phöông phaùp xaùc ñònh söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån theo maät ñoä quang [11], [25] • Nguyeân taéc: Phöông phaùp xaùc ñònh noàng ñoä teá baøo baèng maùy so maøu quang hoïc ñöôïc söû duïng roäng raõi. Cô sôû cuûa phöông phaùp naøy laø tính chaát haáp phuï hoaëc laøm leäch moät phaàn aùnh saùng cuûa caùc dung dòch coù vaät chaát lô löûng. Ñeå ñaùnh giaù toác ñoä phaùt trieån cuûa vi khuaån ta coù theå ño söï taêng sinh khoái qua giaù trò OD (Optical Density) ôû böôùc soùng 620nm (OD620). • Caùch tieán haønh: Sau khi nuoâi caáy vi khuaån trong moâi tröôøng loûng vôùi caùc ñieàu kieän phuø hôïp vôùi muïc ñích thí nghieäm treân maùy laéc, thì laáy dòch sau nuoâi caáy ño OD baèng maùy so maøu ôû böôùc soùng 620nm. Taát caû dòch nuoâi caáy ñeàu ñöôïc pha loaõng 10 laàn tröôùc khi ño OD620. 2.3.5. Phöông phaùp nghieân cöùu khaû naêng phaân huyû tinh boät [17], [20] Söû duïng phöông phaùp ñuïc loã treân ñóa thaïch. • Nguyeân taéc: Enzym ngoaïi baøo α-amylase coù khaû naêng phaân huyû tinh boät taïo ra ñöôøng, maø tinh boät laø moät polysaccharide coù caáu truùc khoâng gian töông ñoái phöùc taïp. Khi moâi tröôøng chöùa tinh boät ñöôïc nhuoäm baèng iod, iod ñöôïc giöõ laïi trong caáu truùc maïng khoâng gian cuûa tinh boät vaø laøm cho moâi tröôøng coù maøu xanh ñaäm. Neáu VSV coù khaû naêng phaân giaûi tinh boät thì caáu truùc khoâng gian cuûa tinh boät bò phaù vôõ, neân xuaát hieän voøng phaân giaûi trong suoát. • Caùch tieán haønh: Nuoâi vi khuaån treân moâi tröôøng caûm öùng sinh toång hôïp amylase daïng loûng ôû 37oC treân maùy laéc vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt. Sau 36- 40h laáy caùc dòch nuoâi ñoù ñem ly taâm vôùi cheá ñoä 5000 voøng/phuùt trong 15 phuùt ñeå thu dòch enzym. Tieáp theo, ñoå moâi tröôøng ñaëc thöû hoaït tính amylase coù chöùa 1% tinh boät ñaõ ñöôïc khöû truøng vaøo ñóa petri, chôø cho moâi tröôøng nguoäi vaø ñoâng laïi. Sau ñoù duøng khuyeân ñuïc loã (ñöôøng kính khoaûng 1cm) ñaõ ñöôïc khöû truøng ñeå ñuïc loã treân beà maët moâi tröôøng taïo thaønh caùc gieáng. Duøng pipet Man huùt dòch enzym nhoû vaøo caùc gieáng trong ñóa petri. Goùi ñóa laïi vaø ñaët vaøo tuû laïnh 3-4h ñeå dòch trong gieáng khueách taùn ñeàu, sau ñoù ñaët vaøo tuû aám 34oC. Sau 24h duøng dung dòch Lugol ñoå leân moâi tröôøng coù chöùa tinh boät. Neáu coù enzym amylase thì xuaát hieän vuøng chöa bò phaân giaûi coù maøu xanh möïc, vaø vuøng trong suoát xung quanh gieáng laø do tinh boät bò phaân giaûi bôûi amylase. Tieán haønh ñaùnh giaù khaû naêng sinh amylase baèng caùch ño ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh boät cuûa amylase. 2.3.6. Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït ñoä α- amylase theo Heinkel, 1956 [7] • Nguyeân taéc Amylase xuùc taùc phaûn öùng thuyû giaûi tinh boät thaønh ñöôøng (ñöôøng ñôn, ñöôøng ñoâi, hay dextrin phaân töû lôùn). Löôïng tinh boät coøn laïi phaûn öùng maøu vôùi iod. Xaùc ñònh löôïng tinh boät bò thuyû giaûi, töø ñoù suy ra hoaït ñoä amylase theo ñònh nghóa: Hoaït ñoä amylase ñöôïc bieåu thò laø soá mg tinh boät bò thuyû giaûi bôûi 1ml dòch enzym (hay 1mg nguyeân lieäu chöùa enzym) trong 1 phuùt ôû ñieàu kieän chuaån laø 500C, pH=6. • Hoaù chaát Dung dòch NaH2PO4 0,05M Dung dòch Na2HPO4 0,05M Dung dòch ñeäm phosphate 0,05M pH 6: troän 87,7ml dung dòch NaH2PO4 0,05M vaø 12,3ml dung dòch Na2HPO4 0,05M theâm 100ml nöôùc caát, ño laïi pH. Dung dòch tinh boät 1% pha trong pH 6: laáy 50ml dung dòch ñeäm phosphate 0,05M pH 6 ñem ñun soâi. Caân 1g tinh boät tan, hoaø vaøo moät ít ñeäm, khuaáy ñeàu, ñoå vaøo dung dòch ñeäm ñang soâi, vöøa khuaáy vöøa ñun soâi trong 3 phuùt cho ñeán khi dung dòch trong suoát. Ñònh möùc tôùi 100ml baèng dung dòch ñeäm. Dung dòch iod: 1g I2 vaø 2g KI, theâm nöôùc thaønh 100ml, baûo quaûn laïnh. Khi duøng pha loaõng 500 laàn. Dung dòch HCl 1N: 8,4ml HCl ñaäm ñaëc pha thaønh 100ml. Dung dòch HCl 0,1N: pha loaõng töø dung dòch HCl 1N. • Tieán haønh thí nghieäm Döïng ñöôøng chuaån tinh boät OÁng nghieäm 1 2 3 4 5 6 Tinh boät 1% (ml) 0 1 2 3 4 5 Dung dòch ñeäm (ml) 10 9 8 7 6 5 Haøm löôïng tinh boät (mg/ml) 0 1 2 3 4 5 - Huùt 1ml dung dòch töø caùc oáng nghieäm, theâm vaøo 5ml dung dòch I2KI ñaõ pha loaõng 500 laàn. Ñem so maøu ôû böôùc soùng 560nm. -Veõ ñoà thò töông quan giöõa haøm löôïng tinh boät vaø giaù trò ΔOD. Phaûn öùng enzym Thöû thaät (3 oáng) Thöû khoâng (3 oáng) Tinh boät 1% (ml) 5 5 Dung dòch enzym (ml) 0,5 0 Ñeå oån nhieät ôû 500C, 10 phuùt Dung dòch HCl 0,1N (ml) 5 5 Dung dòch enzym (ml) 0 0,5 - Huùt 1ml dung dòch töø caùc oáng nghieäm treân, theâm vaøo moãi oáng 5ml dung dòch I2KI ñaõ pha loaõng. - Laéc ñeàu, ñem ño OD taïi böôùc soùng 560nm. • Coâng thöùc tính: hoaït ñoä α-amylase trong 1ml dòch enzym HñA vt KVX * ** = Trong ñoù: X: soá mg tinh boät suy ra töø ñöôøng chuaån. V: toång theå tích hoãn hôïp phaûn öùng enzym (10,5ml). t: thôøi gian enzym phaûn öùng (10 phuùt). v: theå tích enzym cho vaøo hoãn hôïp phaûn öùng enzym (0,5ml). K: heä soá pha loaõng. 2.3.7. Caùc phöông phaùp nghieân cöùu xaùc ñònh ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu [5], [12], [14], [20], [21], [45]. Khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh amylase khoâng chæ phuï thuoäc vaøo chuûng gioáng VSV maø ñieàu kieän nuoâi caáy cuõng aûnh höôûng raát nhieàu. Do ñoù chuùng toâi tieán haønh caùc thí nghieäm sau ñeå xaùc ñònh caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå chuûng nghieân cöùu sinh tröôûng vaø sinh amylase toát nhaát. 2.3.7.1. Loaïi cô chaát Tieán haønh nuoâi caáy chuûng ñaõ choïn trong moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase coù chaát caûm öùng khaùc nhau: boät gaïo, boät myø, boät baép, tinh boät tan ôû nhieät ñoä 37oC vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt. Sau moãi moác thôøi gian: 20h, 30h, 40h, 45h, 50h, 55h, 60h, 70h ño OD620 xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng, vaø ly taâm loaïi boû sinh khoái ôû 5000 v/p trong 15 phuùt laáy dòch enzym ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Choïn loaïi cô chaát vaø thôøi gian nuoâi caáy thích hôïp thu amylase coù hoaït ñoä cao nhaát. 2.3.7.2. Noàng ñoä cô chaát Nuoâi chuûng ñaõ choïn trong moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase coù chöùa loaïi cô chaát thích hôïp nhö ñaõ xaùc ñònh ôû thí nghieäm 2.3.7.1 vôùi noàng ñoä khaùc nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% treân maùy laéc vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt ôû nhieät ñoä 37oC. Sau thôøi gian toái öu ñöôïc xaùc ñònh ôû muïc 2.3.7.1 ño OD620 xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng vaø ño hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc noàng ñoä cô chaát toái öu cho khaû naêng sinh amylase cuûa chuûng ñang nghieân cöùu . 2.3.7.3. Nhieät ñoä Chuûng ñaõ choïn ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase coù chöùa loaïi cô chaát vôùi noàng ñoä thích hôïp nhö ñaõ xaùc ñònh ôû muïc 2.3.7.1 vaø 2.3.7.2 ôû nhieät ñoä khaùc nhau: 25 – 280C; 30 – 330C; 35 – 370C; 40 – 420C treân maùy laéc 200 voøng/phuùt. Sau thôøi gian thích hôïp ño OD620 xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø ño hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Töø ñoù suy ra nhieät ñoä toái öu cho chuûng ñang nghieân cöùu sinh amylase. 2.3.7.4. pH ban ñaàu Nuoâi chuûng ñaõ choïn treân moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase coù caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu nhö ñaõ xaùc ñònh ôû caùc thí nghieäm treân, vôùi pH ban ñaàu khaùc nhau: töø 5,0 ñeán 8,5 (moãi böôùc nhaûy laø 0,5) treân maùy laéc vôùi cheá ñoä 200 voøng/phuùt vôùi thôøi gian thích hôïp. Tieán haønh xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase. Töø ñoù veõ ñoà thò bieåu dieãn söï bieán thieân cuûa hoaït ñoä amylase theo pH. Suy ra pH ban ñaàu toái öu cho chuûng ñaõ choïn sinh amylase. 2.3.7.5. Ñoä hieáu khí Chuûng vi khuaån ñaõ choïn ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng sinh toång hôïp amylase vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu nhö ñaõ xaùc ñònh ôû caùc thí nghieäm treân trong caùc bình tam giaùc 500ml vôùi dòch leân men coù theå tích khaùc nhau : 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300ml treân cuøng maùy laéc vôùi cheá ñoä 200 voøng/phuùt, cuøng thôøi gian thích hôïp. Xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase, keát quaû thí nghieäm naøy cho pheùp xaùc ñònh ñöôïc tæ leä theå tích dòch leân men vaø theå tích bình nuoâi caáy toái öu ñeå thu ñöôïc hoaït ñoä amylase cao nhaát. 2.3.7.6. AÛnh höôûng cuûa caùc loaïi muoái • Noàng ñoä NaCl Nuoâi chuûng ñaõ choïn trong moâi tröôøng caûm öùng sinh amylase vôùi caùc ñieàu kieän toái öu, coù noàng ñoä muoái NaCl thay ñoåi: 0; 0,03; 0,05; 0,08; 0,1; 0,12% treân cuøng maùy laéc vôùi cheá ñoä 200 voøng/phuùt . Sau thôøi gian thích hôïp xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase. Suy ra noàng ñoä NaCl toái öu cho khaû naêng sinh amylase. • Noàng ñoä CaCl2 Chuûng nghieân cöùu ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng caûm öùng coù noàng ñoä muoái CaCl2 khaùc nhau: 0; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025% treân maùy laéc 200 voøng/phuùt vaø caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñaõ xaùc ñònh ôû caùc thí nghieäm treân. Sau thôøi gian phuø hôïp ño khaû naêng sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase. Töø ñoù keát luaän ñöôïc noàng ñoä CaCl2 toái öu ñeå sinh amylase coù hoaït ñoä cao. 2.3.7.7. Noàng ñoä NaCl öùc cheá sinh tröôûng Nuoâi chuûng ñaõ choïn treân moâi tröôøng MPA coù noàng ñoä muoái NaCl khaùc nhau: töø 1% ñeán 7% (moãi böôùc nhaûy 1%) vôùi ñieàu kieän nhieät ñoä, pH thích hôïp treân maùy laéc 200 voøng/phuùt. Sau thôøi gian sinh tröôûng toái öu nhö ñaõ xaùc ñònh ôû muïc 2.3.7.1 tieán haønh ño pH vaø söï sinh tröôûng OD620, so saùnh vôùi pH vaø OD620 cuûa moâi tröôøng MPA. Töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá söï sinh tröôûng cuûa chuûng nghieân cöùu. 2.3.8. Phöông phaùp phaân loaïi ñeå xaùc ñònh loaøi cuûa chuûng ñaõ tuyeån choïn [20]: söû duïng kyõ thuaät PCR  Nguyeân taéc: Khueách ñaïi moät trình töï leân nhieàu laàn baèng moät caëp moài chuyeân bieät. Phaûn öùng PCR laø moät chu kyø noái tieáp nhau, moãi chu kyø goàm 3 böôùc: • Böôùc 1 (bieán tính): trong moät dung dòch ñaày ñuû thaønh phaàn cho söï sao cheùp, DNA ñöôïc bieán tính ôû nhieät ñoä cao hôn Tmax cuûa phaân töû, thöôøng laø 94- 950C trong voøng 30s-1phuùt. • Böôùc 2 (lai): nhieät ñoä ñöôïc haï thaáp ñeå caùc moài baét caëp vôùi khuoân, nhieät ñoä naøy dao ñoäng trong khoaûng 40-700C vaø keùo daøi 30s-1phuùt. • Böôùc 3 (toång hôïp): nhieät ñoä ñöôïc naâng leân ñeán 720C ñeå DNA polymerase hoaït ñoäng toát nhaát. Thôøi gian cuûa giai ñoaïn naøy phuï thuoäc vaøo ñoä daøi ngaén cuûa trình töï DNA, thöôøng keùo daøi töø 30s ñeán vaøi phuùt.  Giaûi trình töï caùc axit nucleic Caùc phöông phaùp nhaèm xaùc ñònh trình töï axit nucleic ñeàu döïa vaøo 2 nguyeân taéc: • Nguyeân taéc hoaù hoïc (phöông phaùp Maxam vaø Gilbert): döïa vaøo caùc phaûn öùng thuyû giaûi hoaù hoïc ñaëc hieäu phaân töû DNA, taïo thaønh moät taäp hôïp nhieàu phaân ñoaïn coù kích thöôùc cheânh nhau 1 nucleotide. • Nguyeân taéc enzym hoïc (phöông phaùp Sanger vaø caùc phöông phaùp caûi bieân): döïa vaøo söï toång hôïp maïch boå sung cho trình töï caàn xaùc ñònh nhôø DNA polymerase. Vôùi vieäc toång hôïp theâm caùc dideoxynucleotide cuøng vôùi caùc deoxynucleotide thoâng thöôøng, keát quaû toång hôïp cuõng laø söï hình thaønh moät taäp hôïp nhieàu ñoaïn DNA coù kích thöôùc cheânh nhau 1 nucleotide. ÔÛ caû 2 phöông phaùp treân, caùc phaân ñoaïn DNA seõ ñöôïc phaân taùch qua ñieän di treân gel polyacrylamid. Neáu söû duïng ñaùnh daáu baèng ñoàng vò phoùng xaï thì keát quaû trình töï caàn xaùc ñònh seõ ñöôïc ñoïc treân baûn phoùng xaï töï ghi töø baûn ñieän di. 2.3.9. Phöông phaùp nghieân cöùu ñoäng hoïc Vôùi caùc ñieàu kieän toái öu ñaõ xaùc ñònh ñöôïc ôû muïc 2.3.7 seõ tieán haønh nuoâi caáy chuûng saûn – chuûng ñaõ tuyeån choïn coù hoaït ñoä enzym α - amylase cao nhaát - trong bình leân men tam giaùc 1lít. Chuùng toâi seõ nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình sinh toång hôïp α – amylase vôùi 3 thoâng soá laø pH, sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase. Qua caùc moác thôøi gian: 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70h tieán haønh ño pH, ño OD620 khaû naêng sinh tröôûng, vaø ly taâm taùch sinh khoái ñeå ño hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. 2.3.10. Phöông phaùp thu dòch chieát α – amylase thoâ töø moâi tröôøng nuoâi caáy [7], [11]. Sau khi thu nhaän ñöôïc dòch nuoâi caáy vi khuaån, ñem ly taâm 5000 voøng/ phuùt trong 15 phuùt ñeå loaïi boû sinh khoái, thu nhaän phaàn dòch beân treân, dung dòch naøy ñöôïc söû duïng nhö dòch enzym α – amylase thoâ vaø ñöôïc baûo quaûn ôû 40C. 2.3.11. Phöông phaùp thu nhaän cheá phaåm enzym (CPE) α - amylase töø dòch chieát enzym thoâ baèng caùc taùc nhaân tuûa [4], [11] Caùc taùc nhaân taïo tuûa enzym thöôøng ñöôïc söû duïng laø caùc dung moâi höõu cô: etanol, aceton; muoái trung tính (NH4)2SO4 ñeå thu nhaän cheá phaåm enzym töø dòch chieát enzym thoâ. Töø ñoù so saùnh vaø choïn taùc nhaân gaây tuûa thích hôïp.  Nguyeân taéc: döïa vaøo tính hoaø tan cuûa protein. Trong phaân töû protein coù ñoàng thôøi caùc nhoùm kî nöôùc (goác alkyl) laøm cho protein khoâng tan trong nöôùc, vaø nhoùm öa nöôùc (-COOH, -OH,…) laøm cho protein tan trong nöôùc. Caùc taùc nhaân tuûa enzym coù theå aûnh höôûng ñeán tính hoaø tan cuûa protein nhö sau: • Dung moâi höõu cô: chuùng coù theå hoaø tan hoaëc gaây tuûa protein. Ví duï khi theâm nhöõng chaát laøm taêng haèng soá ñieän moâi cuûa nöôùc nhö glycin, laøm taêng khaû naêng ion hoaù töø ñoù taêng ñoä hoaø tan cuûa protein. Ngöôïc laïi, neáu theâm chaát laøm giaûm haèng soá ñieän moâi cuûa nöôùc nhö etanol, aceton,…seõ laøm giaûm tính hoaø tan cuûa protein. • Muoái trung tính: noàng ñoä muoái quaù cao seõ laøm giaûm ñoä hoaø tan cuûa protein. Toùm laïi, nguyeân nhaân gaây tuûa protein laø do lôùp hydrate bao phuû protein bò taùc nhaân gaây tuûa giaønh laáy. Caùc protein bò maát voû hydrate seõ keát hôïp vôùi nhau vaø keát tuûa xuoáng. Do ñoù, ñöa taùc nhaân tuûa daàn daàn vaøo dung dòch enzym thoâ theo töøng noàng ñoä khaùc nhau ñeå thu nhaän töøng loaïi protein.  Caùch tieán haønh • Ñoái vôùi caùc taùc nhaân tuûa laø etanol 96o, aceton Duøng 600 ml dòch enzym thoâ, chia laøm hai phaàn baèng nhau, moät phaàn tuûa vôùi etanol, phaàn coøn laïi tuûa vôùi aceton. Dòch chieát enzym vaø caùc dung moâi höõu cô ñeàu ñöôïc giöõ laïnh khoaûng 4oC. Cho töø töø etanol 96o hoaëc aceton vaøo dòch chieát enzym vôùi tæ leä theå tích dung moâi vaø dòch chieát enzym laø 3:1. Khuaáy ñeàu hoãn hôïp vaø ñeå yeân trong ñieàu kieän laïnh khoaûng 1h, sau ñoù ñem ly taâm vôùi 5000 voøng/phuùt trong 15 phuùt. Thu laáy phaàn caën tuûa, saáy khoâ baèng caùch thoåi quaït gioù ôû < 40oC (vì nöôùc toàn taïi trong ñoù seõ laøm giaûm hoaït ñoä enzym), caân troïng löôïng cheá phaåm enzym, vaø baûo quaûn trong ñieàu kieän laïnh. • Ñoái vôùi taùc nhaân tuûa laø muoái sunphat amon Laáy 300 ml dòch enzym thoâ ñem tuûa vôùi muoái sunphat amon (47,2g/100ml dòch enzym). Muoái sunphat amon ñöôïc cho töø töø löôïng nhoû vaøo dòch chieát enzym vaø khuaáy ñeàu ôû nhieät ñoä phoøng. Thôøi gian tuûa laø 2 giôø, sau ñoù ñem ly taâm 5000 voøng/phuùt trong 15 phuùt ñeå laáy tuûa. Tuûa ñöôïc saáy khoâ ôû < 400C, caân troïng löôïng roài cho vaøo tuùi dialise thaåm tích ñeå loaïi muoái trong nöôùc caát ôû ñieàu kieän laïnh. Thu laáy phaàn coøn laïi trong tuùi ñem saáy khoâ, thoåi gioù < 400C, caân cheá phaåm enzym vaø baûo quaûn laïnh. - Caùch tieán haønh thaåm tích baèng tuùi dialise: caân troïng löôïng tuùi baùn thaám dialise, vaø caân löôïng CPE ñöôïc tuûa baèng muoái (NH4)2SO4 cho CPE vaøo tuùi baùn thaám. Tieáp tuïc cho tuùi naøy vaøo moät coác thuyû tinh coù ñöïng nöôùc caát ñeå laïnh. Khuaáy vaø thay nöôùc laïnh thöôøng xuyeân (5-6 laàn trong moät ngaøy ñeâm, tuùi naøy chæ cho chaát coù phaân töû löôïng nhoû thaåm tích qua tuùi maø giöõ laïi nhöõng chaát coù phaân töû löôïng lôùn nhö protein, enzym). Saáy quaït gioù laøm khoâ tuùi ôû < 400C, caân laïi troïng löôïng tuùi. Nhöõng vaán ñeà caàn löu yù khi tuûa enzym - Chuùng ta phaûi cho töø töø taùc nhaân tuûa vaøo dung dòch enzym thoâ baèng caùch söû duïng pipet nhoû töøng gioït, muïc ñích laø traùnh hieän töôïng tuûa cuïc boä. Vì neáu theâm vaøo moät löôïng lôùn taùc nhaân tuûa seõ taïo ra noàng ñoä quaù cao ngay taïi vuøng tieáp xuùc trong dung dòch enzym, ñieàu ñoù seõ daãn ñeán tuûa cuïc boä taïi moät vò trí ñoù, vaø coù theå laøm bieán tính baát thuaän nghòch. - Khi theâm taùc nhaân tuûa vaøo caàn phaûi laéc ñeàu ñeå taêng ñoä khueách taùn vaøo dung dòch enzym thoâ. 2.3.12. Xaùc ñònh hoaït ñoä cheá phaåm enzym (CPE) amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa [4] Caân 0,1g CPE amylase töø moãi taùc nhaân tuûa pha vôùi 50ml nöôùc caát, roài tieáp tuïc pha loaõng tôùi noàng ñoä thích hôïp. Xaùc ñònh hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. 2.3.13. Xaùc ñònh ñoä beàn cuûa CPE amylase [12], [20], [33] 2.3.13.1. Ñoä beàn nhieät cuûa amylase Amylase ñöôïc giöõ trong dung dòch ñeäm coù pH 6, ôû caùc nhieät ñoä khaùc nhau töø 30-1000C (moãi böôùc nhaûy 100C) trong 1 giôø. Sau ñoù xaùc ñònh hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Ñoä beàn cuûa dòch enzym ñöôïc ñaùnh giaù baèng soá phaàn traêm hoaït ñoä coøn laïi trong caùc dòch ñaõ xöû lyù nhieät ñoä, maãu ñoái chöùng laø hoaït ñoä amylase cuûa dòch enzym khoâng xöû lyù nhieät ñoä vaø giöõ ôû 40C. 2.3.13.2. Ñoä beàn pH cuûa amylase Dòch amylase ñöôïc giöõ trong dung dòch ñeäm coù pH khaùc nhau töø 4,0-8,0 (moãi böôùc nhaûy laø 0,5) trong 1 giôø ôû 300C theo tæ leä 1:1. Xaùc ñònh hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Ñoä beàn cuûa dòch enzym ñöôïc ñaùnh giaù baèng soá phaàn traêm hoaït ñoä coøn laïi trong caùc dòch ñaõ xöû lyù pH, maãu ñoái chöùng laø hoaït ñoä amylase cuûa dòch enzym khoâng xöû lyù pH vaø giöõ ôû pH 6. 2.3.14. Phöông phaùp xöû lyù soá lieäu thöïc nghieäm [4]. Söû duïng caùch tính toaùn thoáng keâ ñeå xöû lyù caùc soá lieäu thöïc nghieäm thu ñöôïc. • Xaùc ñònh giaù trò trung bình Giaù trò trung bình cuûa caùc soá lieäu laø toång giaù trò thöïc cuûa moãi laàn ño chia cho soá laàn ño: n x x n i = Trong ñoù: x : giaù trò trung bình ix : giaù trò cuûa moät laàn ño n : soá laàn ño Neáu thöïc hieän söï ño ñaïc laëp laïi nhieàu laàn treân moät maãu thí nghieäm thì chuùng ta coù theå tieäm caän ñeán moät giaù trò trung bình thaät. Ñeå giaù trò trung bình cuûa caùc laàn ño nhö laø moät giaù trò gaàn ñuùng vôùi giaù trò trung bình thaät, ta phaûi duøng phöông phaùp thoáng keâ ñeå ñaùnh giaù möùc ñoä chính xaùc cuûa caùc laàn ño. • Tính toaùn ñoä leäch maãu vaø ñoä leäch chuaån o Ñoä leäch maãu (Sample deviation): Laø söï khaùc bieät giöõa giaù trò cuûa moät laàn ño vôùi giaù trò trung bình. Ñoä leäch maãu = xi - x Trong ñoù: xi : giaù trò cuûa moät laàn ño. x : giaù trò trung bình. o Ñoä leäch chuaån (Standard deviation): söï sai soá coù theå coù trong moät laàn ño S ( )2i 1n xx − − =  Vôùi S : ñoä leäch chuaån ix : giaù trò cuûa moät laàn ño x : giaù trò trung bình n : soá laàn ño Vaäy giaù trò trung bình coù theå dieãn ñaït nhö sau: Sx ± Ñoä leäch chuaån coù theå chuyeån ñoåi thaønh ñoä leäch chuaån cuûa giaù trò trung bình hay coøn goïi laø sai soá chuaån ñöôïc kyù hieäu laø Sm. Sm n S = S: ñoä leäch chuaån; n: soá laàn ño. Coâng thöùc treân cho thaáy, soá laàn ño caøng lôùn (n caøng lôùn) thì ñoä leäch chuaån cuûa giaù trò trung bình (Sm) caøng nhoû, hay möùc ñoä chính xaùc cuûa laàn ño ñaïc caøng cao. Chương III: KEÁT QUAÛ VAØ THAÛO LUAÄN 3.1. Phaân laäp vaø tuyeån choïn caùc chuûng tröïc khuaån coù hoaït tính amylase cao Töø maãu coû khoâ vaø ñaát vöôøn chuùng toâi tieán haønh phaân laäp theo phöông phaùp ôû muïc 2.3.1, thu ñöôïc 17 chuûng thuaàn. Tieáp tuïc xaùc ñònh hoaït tính amylase theo phöông phaùp ñuïc loã treân ñóa thaïch nhö ôû muïc 2.3.5. Töø keát quaû ño ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh boät chuùng toâi choïn 3 chuûng coù hoaït tính amylase cao, kyù hieäu: CK1, CK2, CK3. Keát quaû trình baøy ôû baûng 3.1 vaø hình 3.1 Baûng 3.1. Ñöôøng kính voøng phaân giaûi tinh boät cuûa 3 chuûng CK Chuûng D-d (mm) CK1 20 CK2 22 CK3 25 Hình 3.1. Voøng phaân giaûi tinh boät cuûa 3 chuûng CK CK3 CK1 CK2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 20 30 35 40 45 50 55 60 70 Thôøi gian (h) O D 62 0 CK1 CK2 CK3 3.2. Xaùc ñònh söï sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK ñaõ choïn 3.2.1. Xaùc ñònh söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK Chuùng toâi tieán haønh nuoâi moãi chuûng trong moâi tröôøng MPA loûng treân maùy laéc 200 voøng/phuùt ôû 370C. Tieán haønh ño OD620 xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng cuûa moãi chuûng theo moãi moác thôøi gian: 20,30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70 giôø. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.2 vaø ñoà thò 3.1. Baûng 3.2. Söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK OD620 Thôøi gian (h) CK 1 CK 2 CK 3 20 0,575 0,711 0,637 30 0,679 0,868 0,855 35 0,808 1,242 1,128 40 0,955 1,483 1,320 45 1,126 1,468 1,284 50 1,104 1,436 1,217 55 1,051 1,355 1,149 60 0,985 1,224 0,986 70 0,847 1,113 0,829 Ñoà thò 3.1. So saùnh söï sinh tröôûng cuûa 3 chuûng CK 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 CK1 CK2 CK3 Chuûng H oa ït ñ oä am yl as e (U I/m l) Töø keát quaû treân cho thaáy caû 3 chuûng CK ñeàu sinh tröôûng toát, tuy nhieân chuûng CK2 coù khaû naêng sinh tröôûng cao hôn, vaø thôøi gian sinh tröôûng cao nhaát cuûa CK2 vaøo luùc 40h. 3.2.2. Xaùc ñònh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK Chuùng toâi tieán haønh nuoâi moãi chuûng trong moâi tröôøng caûm öùng sinh amylase daïng loûng treân maùy laéc 200 voøng/phuùt ôû 370C. Sau thôøi gian khoaûng 45- 50 giôø chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm ño hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Keát quaû nhö sau: Baûng 3.3. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK Chuûng Hoaït ñoä amylase (UI/ml) CK1 10,398 ± 0,239 CK2 16,168 ± 0,147 CK3 9,119 ± 0,089 Bieåu ñoà 3.1. So saùnh hoaït ñoä amylase cuûa 3 chuûng CK Qua keát quaû treân thì chuûng CK2 cho hoaït ñoä amylase cao nhaát. Vaäy töø 3 chuûng treân chuùng toâi choïn chuûng CK2 coù khaû naêng sinh tröôûng vaø taïo amylase coù hoaït ñoä cao ñeå tieáp tuïc nghieân cöùu. 3.3. Moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2 3.3.1. Ñaëc ñieåm hình thaùi khuaån laïc Chuùng toâi tieán haønh caáy daøn chuûng CK2 leân beà maët thaïch moâi tröôøng MPA cuûa ñóa petri. Sau ñoù ñeå vaøo tuû aám 340C trong 24 giôø ñeå thu caùc khuaån laïc rieâng bieät. Keát quaû ñöôïc neâu trong hình 3.2 Qua quan saùt chuùng toâi nhaän thaáy khuaån laïc chuûng CK2 coù ñaëc ñieåm laø: khuaån laïc khoâ, maøu traéng ñuïc, maët khuaån laïc mòn, meùp nhaên, baùm vaøo moâi tröôøng thaïch. 3.3.2. Ñaëc ñieåm hình thaùi teá baøo chuûng CK2 Sau 24 giôø nuoâi caáy chuùng toâi tieán haønh laøm tieâu baûn soáng chuûng CK2 vaø quan saùt döôùi kính hieån vi ôû vaät kính 40X, nhaän thaáy chuûng CK2 coù teá baøo hình que, ngaén, nhoû, ñöùng rieâng reõ. Nhuoäm Gram vaø quan saùt döôùi kính hieån vi vôùi ñoä phoùng ñaïi 100X, chuùng toâi nhaän thaáy chuûng CK2 baét maøu tím. Ñieàu ñoù chöùng toû chuûng naøy laø vi khuaån Gram döông. Keát quaû thu ñöôïc ôû hình 3.3 Hình 3.2. Hình thaùi khuaån laïc chuûng CK2 Hình 3.3. Hình thaùi teá baøo chuûng CK2 3.3.3. Khaû naêng hình thaønh baøo töû cuûa chuûng CK2 Nuoâi chuûng CK2 treân moâi tröôøng MPA ôû tuû aám 340C, sau 5 ngaøy nhuoäm baøo töû theo phöông phaùp nhö ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.3. Keát quûa quan saùt döôùi kính hieån vi chuùng toâi nhaän ñöôïc hình 3.4 Hình 3.4. Baøo töû cuûa chuûng CK2 Vaäy chuûng CK2 coù khaû naêng hình thaønh noäi baøo töû (baøo töû baét maøu ñoû). 3.3.4. Nghieân cöùu khaû naêng sinh enzym catalase Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 treân beà maët thaïch moâi tröôøng MPA, trong tuû aám ôû 340C. Sau 24 giôø khi thaáy xuaát hieän khuaån laïc nhoû leân khuaån laïc 1 gioït H2O2 10% thì thaáy xuaát hieän boït khí, chöùng toû chuûng CK2 coù khaû naêng sinh enzym catalase: H2O2 H2O + O2↑. Phaân töû oxy sinh ra laøm phaûn öùng taïo ra boït khí, vaäy chuûng CK2 laø vi khuaån hieáu khí.  Toùm taét moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2 Baûng 3.4. Moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2 Ñaëc ñieåm Chuûng CK2 Hình thaùi khuaån laïc Khoâ, maøu traéng ñuïc, maët khuaån laïc mòn, meùp hôi nhaên, baùm vaøo moâi tröôøng thaïch. Hình thaùi teá baøo Hình que, ngaén, nhoû, ñöùng rieâng reõ Phaân giaûi tinh boät + Gram + Hình thaønh noäi baøo töû + Khaû naêng phaân giaûi H2O2 + Nhu caàu veà oxy + 3.4. Nghieân cöùu caùc ñieàu kieän aûnh höôûng tôùi khaû naêng sinh toång hôïp α – amylase cuûa chuûng CK2. 3.4.1. Loaïi cô chaát Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 trong moâi tröôøng loûng sinh toång hôïp enzym α – amylase coù chaát caûm öùng khaùc nhau: boät gaïo, boät myø, boät baép, tinh boät tan ôû nhieät ñoä 37oC vôùi cheá ñoä laéc 200 voøng/phuùt. Sau moãi moác thôøi gian: 20, 30, 40, 45, 50, 55, 60, 70 giôø ño OD620 xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng, vaø ly taâm loaïi boû sinh khoái ôû 5000 v/p trong 15 phuùt ñeå xaùc ñònh hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.5 vaø ñoà thò 3.2. catalase Baûng 3.5. AÛnh höôûng loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase Thôøi gian (h) Cô chaát OD620 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) Boät gaïo 0,672 2,221 ± 0,05 Boät myø 0,655 3,819 ± 0,045 Boät baép 0,798 3,920 ± 0,034 20 Tinh boät tan 0,841 4,913 ± 0,034 Boät gaïo 0,734 4,172 ± 0,017 Boät myø 0,711 5,131 ± 0,073 Boät baép 0,943 6,326 ± 0,089 30 Tinh boät tan 1,055 7,403 ± 0,067 Boät gaïo 1,203 6,477 ± 0,045 Boät myø 1,121 6,545 ± 0,034 Boät baép 1,286 8,059 ± 0,061 40 Tinh boät tan 1,502 10,263 ± 0,045 Boät gaïo 1,155 8,311± 0,045 Boät myø 1,100 7,672 ± 0,077 Boät baép 1,206 10,212 ± 0,073 45 Tinh boät tan 1,488 14,890 ± 0,058 Boät gaïo 1,045 8,227 ± 0,077 Boät myø 0,962 7,537 ± 0,034 Boät baép 1,131 10,128 ± 0,061 50 Tinh boät tan 1,374 14,654 ± 0,073 0 2 4 6 8 10 12 14 16 20 30 40 45 50 55 60 70 Thời gian (h) H oạ t đ ộ a m yl as e (U I/m l) Bột gạo Bột mỳ Bột bắp Tinh bột tan Boät gaïo 0,964 8,008 ± 0,034 Boät myø 0,902 7,453 ± 0,017 Boät baép 1,067 9,960 ± 0,045 55 Tinh boät tan 1,228 14,419 ± 0,034 Boät gaïo 0,876 7,722 ± 0,077 Boät myø 0,844 7,319 ± 0,058 Boät baép 0,981 9,186 ± 0,058 60 Tinh boät tan 1,163 13,796 ± 0,089 Boät gaïo 0,711 7,134 ± 0,089 Boät myø 0,689 6,578 ± 0,045 Boät baép 0,843 8,446 ± 0,017 70 Tinh boät tan 0,936 12,517 ± 0,050 Baûng 3.5. AÛnh höôûng loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase (tieáp theo) Ñoà thò 3.2. AÛnh höôûng caùc loaïi cô chaát ñeán hoaït ñoä amylase Chuûng CK2 ñaõ choïn khi nuoâi caáy vôùi caùc loaïi cô chaát khaùc nhau ñeàu sinh tröôûng toát nhaát vaøo thôøi gian laø 40h. Tuy nhieân vôùi cô chaát laø tinh boät tan thì chuûng CK2 sinh tröôûng cao hôn haún laø 1,502, vaø cuõng loaïi cô chaát naøy thì hoaït ñoä amylase cuõng cao nhaát khi thôøi gian nuoâi caáy ñöôïc 45 - 50h. Töø keát quaû treân coù theå thaáy nguoàn cô chaát thích hôïp cho chuûng CK2 sinh tröôûng vaø sinh enzym amylase ñöôïc saép xeáp theo thöù töï nhö sau: Tinh boät tan > boät baép > boät gaïo > boät myø. Vaäy chuûng CK2 coù thôøi gian sinh tröôûng cao nhaát luùc nuoâi caáy ñöôïc 40h vaø hoaït ñoä amylase cao nhaát luùc 45-50h. 3.4.2. AÛnh höôûng noàng ñoä tinh boät tan Töø keát quaû treân cho thaáy tinh boät tan laø nguoàn cô chaát thích hôïp nhaát ñeå chuûng CK2 sinh amylase coù hoaït ñoä cao. Tuy nhieân noàng ñoä khaùc nhau cuûa cô chaát cuõng aûnh höôûng khoâng nhoû ñeán hoaït ñoä amylase. Vì theá chuùng toâi tieán haønh nuoâi chuûng CK2 trong moâi tröôøng caûm öùng coù chaát caûm öùng laø tinh boät tan vôùi noàng ñoä khaùc nhau: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5% treân maùy laéc 200 voøng/phuùt ôû 370C. Sau 40h tieán haønh ño söï sinh tröôûng OD620 vaø sau 45-50h ño hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.6 vaø bieåu ñoà 3.2 Baûng 3.6. Noàng ñoä tinh boät tan aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase Noàng ñoä tinh boät (%) OD620 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0,5 1,185 9,354 ± 0,034 1,0 1,584 13,359 ± 0,094 1,5 1,612 16,370 ± 0,061 2,0 1,622 14,200 ± 0,045 2,5 1,228 9,439 ± 0,050 0 5 10 15 20 0,5% 1% 1,5% 2% 2,5% % Tinh boät tan H oa ït ño ä a m yl as e (U I/ m l) Bieåu ñoà 3.2. Noàng ñoä tinh boät tan aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase Töø keát quaû treân coù theå thaáy noàng ñoä tinh boät tan trong moâi tröôøng thích hôïp cho khaû naêng sinh enzym amylase cuûa chuûng CK2 töø 1% - 2%. Ñaëc bieät vôùi noàng ñoä tinh boät tan laø 1,5% cho hoaït ñoä amylase cao nhaát (16,37 UI/ml). 3.4.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Vi khuaån Bacillus haàu heát laø loaøi öu nhieät trung bình vôùi nhieät ñoä dao ñoäng töø 25 – 45oC. Chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä ñeán khaû naêng sinh amylase chuûng CK2 theo phöông phaùp nhö ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.7.3. Keát quaû ôû baûng 3.7 vaø bieåu ñoà 3.3. Baûng 3.7. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase Nhieät ñoä (0C) OD620 Hoaït ñoä amylase(UI/ml) 25-28 1,248 13,981 ± 0,058 30-33 1,395 20,829 ± 0,061 35-37 1,653 31,983 ± 0,045 38-40 1,505 28,383 ± 0,073 40-42 1,342 24,025 ± 0,058 42-45 1,143 18,827 ± 0,101 0 5 10 15 20 25 30 35 25-28 30-33 35-37 38-40 40-42 42-45 Nhiệt độ (oC) H oạ t đ ộ a m yl as e (U I/m l) Bieåu ñoà 3.3. Nhieät ñoä aûnh höôûng ñeán hoaït ñoä amylase Nhieät ñoä thích hôïp cho chuûng CK2 sinh tröôûng vaø sinh enzym amylase töø 30-420C; toát nhaát ôû 35-370C. Keát quaû naøy cuõng phuø hôïp vì caùc chuûng Bacillus laø caùc chuûng VSV öa aám. 3.4.4. AÛnh höôûng cuûa pH ban ñaàu pH cuõng laø moät trong nhöõng taùc nhaân quan troïng aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase ñöôïc toång hôïp. Thí nghieäm nhaèm xaùc ñònh pH toái öu giuùp VSV sinh enzym amylase coù hoaït ñoä cao nhaát. Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh theo muïc 2.3.7.4 chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû ôû baûng 3.8 vaø bieåu ñoà 3.4. Baûng 3.8. AÛnh höôûng pH ban ñaàu ñeán hoaït ñoä amylase pH OD620 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 5,0 1,021 1,144 ± 0,045 5,5 1,148 1,615 ± 0,058 6,0 1,202 8,900 ± 0,017 6,5 1,437 14,907 ± 0,135 7,0 1,588 24,009 ± 0,094 7,5 1,602 27,609 ± 0,077 8,0 1,531 15,63 ± 0,045 8,5 1,350 4,963 ± 0,073 0 5 10 15 20 25 30 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 pH Ho ạt độ a m yl as e (U I/m l) Bieåu ñoà 3.4. AÛnh höôûng pH ban ñaàu ñeán hoaït ñoä amylase pH ban ñaàu thích hôïp cho söï sinh tröôûng cuõng nhö sinh amylase cuûa chuûng CK2 töø 7,0-7,5; maïnh nhaát ôû pH = 7,5. pH ngaõ veà axit hoaëc kieàm ñeàu khoâng toát cho hoaït ñoäng cuûa chuûng CK2. Vaäy moâi tröôøng trung tính thuaän lôïi hôn cho chuûng naøy sinh tröôûng vaø sinh enzym amylase. 3.4.5. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí Caùc chuûng Bacillus ñeàu laø VSV hieáu khí, tuy nhieân vôùi möùc ñoä hieáu khí thích hôïp thì chuùng môùi hoaït ñoäng toát nhaát.. Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 theo phöông phaùp nhö ôû muïc 2.3.7.5. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.9 vaø bieåu ñoà 3.5. Baûng 3.9. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase Theå tích dòch nuoâi caáy (ml) OD620 Hoạt độ amylase (UI/ml) 50 1,518 16,404 ± 0,050 75 1,664 22,326 ± 0,061 100 1,658 28,198 ± 0,034 150 1,532 16,538 ± 0,045 200 1,480 13,359 ± 0,034 250 1,455 10,734 ± 0,073 300 1,406 9,253 ± 0,034 0 5 10 15 20 25 30 50 75 100 150 200 250 300 Theå tích dòch nuoâi caáy (ml) H oa ït ño ä a m yl as e (U I/ m l) Bieåu ñoà 3.5. AÛnh höôûng cuûa ñoä hieáu khí ñeán hoaït ñoä amylase Qua thí nghieäm treân khi nuoâi chuûng CK2 trong bình tam giaùc 500ml thì theå tích dòch nuoâi caáy 75ml cho söï sinh tröôûng cao nhaát. Nhöng enzym amylase laïi coù hoaït ñoä cao khi theå tích dòch nuoâi caáy laø 100ml. Vì vaäy, chuùng toâi choïn tæ leä theå tích dòch nuoâi caáy so vôùi theå tích bình nuoâi laø 100ml/500ml ñeå laøm caùc thí nghieäm tieáp theo. 3.4.6. AÛnh höôûng cuûa caùc loaïi muoái Haàu heát caùc chuûng Bacillus ñeàu öu maën, neân muïc ñích cuûa thí nghieäm nhaèm xaùc ñònh ñoä maën thích hôïp cuûa moâi tröôøng giuùp chuûng CK2 sinh tröôûng vaø sinh enzym coù hoaït ñoä cao. 3.4.6.1. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä NaCl Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh theo muïc 2.3.7.6. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.10 vaø bieåu ñoà 3.6. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 0.03 0.05 0.08 0.1 0.12 %NaCl H oa ït ño ä a m yl as e (U I/ m l) Baûng 3.10. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä muoái NaCl ñeán hoaït ñoä amylase Nồng ñoä NaCl (%) OD620 Hoaït ñoä amylase(UI/ml) 0 0,955 4,206 ± 0,061 0,03 1,268 11,760 ± 0,050 0,05 1,382 19,533 ± 0,050 0,08 1,624 40,665 ± 0,017 0,1 1,506 33,498 ± 0,061 0,12 1,470 26,532 ± 0,034 Bieåu ñoà 3.6. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä NaCl ñeán hoaït ñoä amylase Do caùc chuûng Bacillus ñeàu thuoäc nhoùm chòu maën neân khi moâi tröôøng nuoâi caáy khoâng coù NaCl thì hoaït ñoä amylase raát thaáp (4,206 UI/ml). Caøng taêng noàng ñoä muoái NaCl thì khaû naêng sinh tröôûng vaø hoaït ñoä amylase caøng taêng, noàng ñoä thích hôïp laø 0,08-0,1% NaCl, toát nhaát laø 0,08% vaø vöôït quaù möùc naøy thì hoaït ñoä amylase caøng giaûm. 3.4.6.2. AÛnh höôûng cuûa noàng ñoä muoái CaCl2 Vai troø cuûa ion canxi ñoái vôùi enzym amylase laø voâ cuøng quan troïng, ñaëc bieät laø ñoái vôùi α-amylase. Vì söï coù maët ion naøy trong caáu truùc ñaëc hieäu baäc 3, 0 5 10 15 20 25 30 0 0.01 0.015 0.02 0.025 %CaCl2 H oa ït ño ä a m yl as e (U I/ m l) baäc 4 cuûa α-amylase giuùp cho caáu truùc cuûa enzym naøy ñöôïc oån ñònh, beàn vöõng ñaëc bieät laø döôùi taùc duïng cuûa trypsin vaø nhöõng protease khaùc cuûa oáng tieâu hoaù. Ñieàu naøy khoâng nhöõng coù yù nghóa veà maët sinh hoïc maø coøn coù yù nghóa veà maët thöïc tieãn, giuùp cho amylase hoaït ñoäng toát trong moâi tröôøng cuûa dòch tieâu hoaù. Vaäy söï coù maët cuûa ion canxi trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñaõ goùp phaàn laøm taêng hoaït ñoä cuûa amylase. Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 theo muïc 2.3.7.6. Keát quaû theå hieän ôû baûng 3.11 vaø bieåu ñoà 3.7. Baûng 3.11. AÛnh höôûng noàng ñoä CaCl2 ñeán hoaït ñoä amylase Nồng ñộ CaCl2 (%) OD620 Hoaït ñoä amylase (UI/ml) 0 1,428 24,379 ± 0,058 0,01 1,624 28,568 ± 0,050 0,015 1,496 23,033 ± 0,045 0,02 1,370 20,475 ± 0,061 0,025 1,314 18,944 ± 0,073 Bieåu ñoà 3.7. AÛnh höôûng noàng ñoä CaCl2 ñeán hoaït ñoä amylase 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1 2 3 4 5 6 7 % NaCl O D (6 20 nm ) Töø keát quaû treân cho thaáy noàng ñoä CaCl2 toái öu laø 0,01%. Vaäy khi coù maët ion Ca vôùi noàng ñoä toái öu ñaõ laøm taêng hoaït ñoä amylase. 3.4.7. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng Ña soá Bacillus ñeàu thuoäc nhoùm öu maën trung bình, do ñoù noàng ñoä muoái NaCl quaù cao seõ laøm cheát teá baøo. Chuùng toâi tieán haønh nuoâi caáy chuûng CK2 theo phöông phaùp ôû muïc 2.3.7.7 . Moâi tröôøng MPA coù pH = 6,0; OD620nm = 0,037. Sau 40-45h nuoâi caáy chuùng toâi thu ñöôïc keát quaû ôû baûng 3.12 vaø bieåu ñoà 3.8. Baûng 3.12. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng Nồng ñộ NaCl (%) OD620 pH 1 0,886 7,77 2 0,625 7,45 3 0,413 7,03 4 0,261 6,84 5 0,108 6,65 6 0,052 5,55 7 0,035 5,38 Bieåu ñoà 3.8. Noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng Theo keát quaû thu ñöôïc vôùi noàng ñoä NaCl laø 7% coù OD620 = 0,035 maø OD620 cuûa moâi tröôøng = 0,037. Ñieàu ñoù coù nghóa noàng ñoä NaCl cao nhaát öùc cheá sinh tröôûng laø 7%. Vaäy khaû naêng chòu maën cuûa chuûng CK2 naøy töông ñoái cao. 3.5. Xaùc ñònh teân cuûa chuûng CK2 ñaõ tuyeån choïn Töø nhöõng ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng CK2 nhö ñaõ trình baøy ôû baûng 3.4, chuùng toâi ñi ñeán keát luaän: chuûng CK2 laø moät loaøi thuoäc chi Bacillus. Vaø ñeå xaùc ñònh chính xaùc laø loaøi naøo chuùng toâi döïa vaøo keát quaû phaân tích trình töï 16S- rARN, vaø trình töï naøy do phoøng xeùt nghieäm NK-BIOTEK cuûa Coâng ty Nam Khoa xaùc ñònh. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû hình 3.5 CATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGC GGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAAC TCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTC AAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCG CATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAG CCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGT CTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAG CTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTG ACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCA Hình 3.5. Trình töï 16S-rARN cuûa chuûng CK2 Trình töï 16S-rARN cuûa chuûng CK2 ñöôïc so saùnh vôùi trình töï 16S-rARN cuûa loaøi chuaån ñaõ ñöôïc ñònh loaïi trong ngaân haøng gen BLAST. Keát quaû cho thaáy möùc ñoä gioáng nhau cuûa chuûng CK2 vôùi loaøi Bacillus subtilis laø 100%. Keát quaû naøy cho pheùp keát luaän chuûng CK2 ñaõ phaân laäp ñöôïc laø Bacillus subtilis vaø chuùng toâi goïi chuûng naøy laø Bacillus subtilis CK2. 3.6. Nghieân cöùu ñoäng hoïc cuûa quaù trình leân men trong bình tam giaùc 1 lít. Qua caùc keát quaû nghieân cöùu ôû muïc 3.4, chuùng toâi ñaõ coù keát luaän veà caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu ñeå chuûng Bacillus subtilis CK2 ñaõ phaân laäp ñöôïc sinh amylase coù hoaït ñoä cao nhaát nhö sau: moâi tröôøng söû duïng chaát caûm öùng laø tinh boät tan vôùi noàng ñoä 1,5%; pH ban ñaàu = 7,5; nhieät ñoä nuoâi caáy töø 35-370C; ñoä hieáu khí vôùi tæ leä 100ml dòch nuoâi caáy/500ml theå tích bình; noàng ñoä toái öu cuûa 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 20 30 35 40 45 50 55 60 70 Thời gian (h) O D 62 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 H oạ t đ ộ a m yl as e (U I/m l) Sinh trưởng Hoạt độ caùc loaïi muoái: NaCl 0,08%; CaCl2 0,01%. Chuùng toâi tieán haønh nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình leân men chuûng Bacillus subtilis CK2 theo phöông phaùp ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.9. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.13 vaø ñoà thò 3.3. Baûng 3.13. Nghieân cöùu ñoäng hoïc quaù trình leân men Bacillus subtilis CK2 Thôøi gian (h) pH OD620 Hoạt ñộ amylase (UI/ml) 20 6,86 0,943 19,516 ± 0,045 30 7,21 1,176 21,367 ± 0,061 35 7,27 1,353 25,523 ± 0,061 40 7,32 1,688 32,354 ± 0,077 45 7,58 1,676 44,585 ± 0,084 50 7,55 1,630 44,147 ± 0,102 55 7,54 1,597 43,020 ± 0,089 60 7,48 1,524 40,513 ± 0,160 70 7,40 1,458 38,091 ± 0,094 Ñoà thò 3.3. Ñoäng hoïc quaù trình nuoâi caáy B. subtilis CK2 sinh α-amylase Chuùng toâi nhaän thaáy keát quûa ở baûng 3.13 phuø hôïp vôùi nhöõng keát quaû ñaõ thu ñöôïc ôû treân. Cuï theå laø Bacillus subtilis CK2 sinh tröôûng cao nhaát vaøo thôøi 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 Etanol Aceton Sunfate amon Taùc nhaân tuûaH ie äu su aát th u nh aän C P E am yl as e (g /1 00 m l) gian 40 giôø sau khi nuoâi caáy, vaø hoaït ñoä amylase cao nhaát luùc 45 giôø. Khi leân men vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy toái öu thì hoaït ñoä amylase cao hôn haún so vôùi khi khaûo saùt töøng ñieàu kieän nuoâi caáy. 3.7. Taùch enzym töø dòch nuoâi caáy, xaùc ñònh hoaït ñoä vaø ñoä beàn cuûa enzym 3.7.1. Taùch enzym töø dòch nuoâi caáy vôùi caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau Sau khi nghieân cöùu ñoäng hoïc thu ñöôïc amylase coù hoaït ñoä cao, chuùng toâi tieán haønh taùch amylase nhôø caùc taùc nhaân tuûa nhö: etanol 960C, aceton, sulphate amon theo phöông phaùp ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.11. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.14 vaø bieåu ñoà 3.9. Baûng 3.14. Hieäu suaát thu nhaän CPE amylase töø caùc taùc nhaân tuûa Taùc nhaân tuûa Hieäu suaát thu nhaän enzym (g/100ml) Etanol 960C 1,23 Aceton 1,85 Sulphate amon 0,87 Bieåu ñoà 3.9. Hieäu suaát thu nhaän CPE amylase bôûi caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau Keát quaû thu ñöôïc cho thaáy hieäu suaát thu nhaän CPE amylase ñaït giaù trò cao khi duøng taùc nhaân tuûa laø aceton. Do aceton laø dung moâi khoâng phaân cöïc, coù haèng 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 Etanol Aceton Sulphate amon Taùc nhaân tuûa H oa ït ño ä C PE a m yl as e (U I/ g) soá ñieän moâi nhoû neân ngaên caûn söï phaân taùn cuûa caùc protein trong dung dòch. Vì theá trong moâi tröôøng coù moät löôïng lôùn aceton ñaõ laøm keát tuûa caùc enzym, protein vaø caùc taïp chaát phaân töû lôùn khaùc. 3.7.2. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc bôûi caùc taùc nhaân tuûa Caân 0,1g CPE amylase töø caùc taùc nhaân tuûa khaùc nhau pha vôùi 50ml nöôùc caát, roài tieáp tuïc pha loaõng vôùi noàng ñoä thích hôïp. Tieán haønh thí nghieäm xaùc ñònh hoaït ñoä amylase theo phöông phaùp Heinkel. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.15 vaø bieåu ñoà 3.10. Baûng 3.15. Hoaït ñoä CPE amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa Taùc nhaân tuûa Hoaït ñoä amylase (UI/g CPE) Etanol 960 10902,28 ± 21,86 Aceton 8525,82 ± 15,17 Sulphate amon 3974,79 ± 19,27 Bieåu ñoà 3.10. Hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc töø caùc taùc nhaân tuûa Keát quaû theå hieän ôû baûng 3.15 cho thaáy khi duøng taùc nhaân tuûa laø etanol 960 thì hoaït ñoä cuûa CPE amylase thu ñöôïc cao hôn so vôùi khi duøng taùc nhaân tuûa laø 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 4 30 40 50 60 70 80 90 100 Nhiệt độ ( 0C) H oa ït ño ä C PE a m yl as e co øn la ïi ( % ) aceton, sulphate amon. Vaäy chuùng toâi seõ duøng CPE amylase ñöôïc tuûa bôûi etanol 960C ñeå laøm caùc thí nghieäm tieáp theo. 3.7.3. Xaùc ñònh ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase Chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm nhö phöông phaùp ôû muïc 2.3.13.1. Keát quaû ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.16 vaø bieåu ñoà 3.11. Baûng 3.16. Ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase Nhiệt ñộ (oC) Hoaït ñoä CPE amylase (UI/g CPE) Hoaït ñoä coøn laïi (%) 4 11032,67 ± 41,43 100 30 11024,25 ± 15,17 99,92 40 10691,97 ± 15,17 96,91 50 10225,09 ± 11,13 92,68 60 9699,32 ± 18,33 87,91 70 8790,80 ± 8,41 79,68 80 3974,79 ± 19,27 36,03 90 88,33 ± 12,62 0,80 100 0,00 0,00 Bieåu ñoà 3.11. Ñoä beàn nhieät cuûa CPE amylase Keát quaû thu ñöôïc cho thaáy nhieät ñoä caøng cao thì hoaït ñoä cuûa amylase caøng giaûm; ñaëc bieät laø töø 80-1000C: hoaït ñoä giaûm maïnh ôû 800C vaø gaàn nhö maát khaû naêng hoaït ñoäng ôû 900C trôû leân. ÔÛ nhieät ñoä töø 30-700C CPE amylase hoaït ñoäng töông ñoái toát. Vaäy CPE amylase cuûa chuûng Bacillus subtilis CK2 töông ñoái beàn nhieät. Nhöõng amylase beàn nhieät coù yù nghóa raát lôùn trong thöïc teá saûn xuaát vaø baûo quaûn saûn phaåm sau naøy. Vì nhieät ñoä khoâng nhöõng aûnh höôûng ñeán thôøi gian baûn quaûn saûn phaåm maø coøn aûnh höôûng ñeán caùch thöùc taïo cheá phaåm. Neáu chuùng ta neùn saûn phaåm thaønh vieân ta coù theå baûo quaûn chuùng deã daøng hôn laø daïng boät hoaëc daïng dòch loûng. Nhöng neáu ôû daïng vieân neùn thì phaûi xöû lyù ôû 1000C trong voøng 30 phuùt, maø caùc amylase thu ñöôïc ôû treân seõ maát hoaït tính ôû 1000C neân chuùng chæ thích hôïp baûo quaûn ôû daïng boät hoaëc daïng loûng. Ngoaøi ra, caùc enzym beàn nhieät coøn coù nhieàu lôïi theá trong quaù trình xöû lyù thöùc aên tröôùc khi cho vaät nuoâi aên. Thöùc aên ñöôïc uû ôû nhieät ñoä cao trong voøng vaøi giôø maø vaãn khoâng laøm giaûm hoaït ñoä nhieàu maø coøn taêng toác ñoä phaûn öùng. Hôn nöõa vieäc troän enzym vaøo thöùc aên ôû nhieät ñoä cao tröôùc khi cho vaät nuoâi aên coøn coù taùc duïng laøm giaûm söï taïp nhieãm VSV coù haïi thöôøng phaùt trieån ôû nhieät ñoä 30-400C. 3.7.4. Xaùc ñònh ñoä beàn pH cuûa CPE amylase pH laø yeáu toá aûnh höôûng nhieàu leân hoaït ñoäng cuûa enzym noùi chung vaø cuûa amylase noùi rieâng. Vì theá chuùng toâi ñaõ tieán haønh xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa pH leân ñoä beàn cuûa CPE amylase theo phöông phaùp ñaõ trình baøy ôû muïc 2.3.13.2. Keát quaû thu ñöôïc trình baøy ôû baûng 3.17 vaø bieåu ñoà 3.12 0 20 40 60 80 100 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 pH H oa ït ño ä C PE a m yl as e co øn la ïi ( % ) Baûng 3.17 . Ñoä beàn pH cuûa CPE amylase pH Hoaït ñoä CPE amylase (UI/ g CPE) Hoaït ñoä amylase coøn laïi (%) 4,0 715,04 ± 8,41 6,27 4,5 4206,13 ± 11,13 36,89 5,0 8361,78 ± 8,41 73,33 5,5 10183,03 ± 14,57 89,30 6,0 11402,81 ± 8,41 100 6,5 10670,94 ± 15,17 93,58 7,0 9291,33 ± 11,13 81,48 7,5 8408,04 ± 15,17 73,74 8,0 5850,72 ± 18,33 51,31 Bieåu ñoà 3.12. Ñoä beàn pH cuûa CPE amylase CPE amylase töông ñoái beàn ôû pH töø 5,0 ñeán 7,5; ngoaøi möùc pH naøy thì CPE amylase hoaït ñoäng yeáu vaø chuùng hoaït ñoäng toát ôû pH = 6. Chương IV: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ  KEÁT LUAÄN Töø nhöõng keát quaû ôû treân, chuùng toâi ñöa ra moät soá keát luaän nhö sau: 1. Töø maãu ñaát vöôøn qua trung gian coû khoâ chuùng toâi ñaõ phaân laäp ñöôïc 17 chuûng thuaàn (kyù hieäu laø CK). Trong ñoù tuyeån choïn ñöôïc 3 chuûng laø CK1, CK2, CK3 coù khaû naêng sinh enzym amylase coù hoaït tính cao (vô