Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây cà phê chè (coffea arabica, rubiacea)

Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––– NGUYỄN QUỐC NAM HẢI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ (COFFEA ARABICA, RUBIACEA) LUẬN VĂN THẠC SĨ HỐ HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––– NGUYỄN QUỐC NAM HẢI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ (COFFEA ARABICA, RUBIACEA) CHUYÊN NGÀNH: HỐ HỌC HỮU CƠ MÃ SỐ: 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HỐ HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUYẾT TIẾN THÁI NGUYÊN - 2009 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chƣa từng đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác. Tác giả NGUYỄN QUỐC NAM HẢI Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 LỜI CẢM ƠN Bản luận văn này đƣợc hồn thành tại phịng Hoạt chất Sinh học, Viện Hĩa học - Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. Tơi xin chân thành bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc của mình tới TS. Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị Hồng Minh, PGS.TS. Phạm Văn Thỉnh những ngƣời thầy đã chỉ ra hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ từng bƣớc đi của tơi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn Phịng Hoạt chất Sinh học, Phịng Nghiên cứu Cấu trúc -Viện Hĩa học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành các kế hoạch nghiên cứu. Nhân dịp này, tơi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Hĩa, Khoa Sau đại học - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên, Sở giáo dục và đào tạo tỉnh Bắc Ninh, Ban Giám hiệu Trƣờng THPT Thuận Thành số 3 đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành bản luận văn này. Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Bố, Mẹ tơi, những ngƣời thân trong gia đình và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tơi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2009 Tác giả Nguyễn Quốc Nam Hải Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt dùng trong luận văn Danh mục các hình, bảng và sơ đồ MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN ............................................................................. 3 1.1. CHI COFFEA VÀ THÀNH PHẦN HỐ HỌC CỦA CHÚNG .............. 3 1.1.1. Giới thiệu về chi Coffea ........................................................................ 3 1.1.2. Những nghiên cứu thành phần hố học. ................................................ 3 1.2. CÂY CÀ PHÊ CHÈ VÀ NHỮNG SỬ DỤNG TRONG Y HỌC. ............ 5 1.2.1. Mơ tả thực vật....................................................................................... 5 1.2.2. Một số bài thuốc chữa bệnh sỏi thận trong Y học cổ truyền. ................. 7 1.3. MỘT SỐ ANCALOIT SỬ DỤNG TRONG Y HỌC . ............................ 9 1.3.1. Giới thiệu chung về ancalnoit .............................................................. 9 1.3.2. Phƣơng pháp phân tích ......................................................................... 10 1.3.2.1. Phân tích định tính ........................................................................... 10 1.3.2.1.1. Các phản ứng tạo tủa...................................................................... 10 1.3.2.1.2. Các phản tạo màu ........................................................................... 11 1.3.2.2. Phân tích định lượng ........................................................................ 12 1.3.2.2.1 Xác định hàm lượng ancaloit bằng phương pháp phân tích trọng lượng ..................................................................................... 13 1.3.2.2.2. Xác định hàm lượng ancaloit bằng phương pháp “khơng nước”. ....... 15 1.3.3. Phƣơng pháp phân lập ancaloit ............................................................. 15 1.3.3.1. Chiết tách phân lập ancaloit bằng phương pháp bazơ - dung mơi hữu cơ ................................................................................................ 15 1.3.3.2. Chiết tách phân lập ancaloit bằng phương pháp axit-nước .......... 16 1.3.4. Phân loại các ancaloit quan trọng trong Y dƣợc theo khung cơ bản ...... 16 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 1.3.4.1. Ancaloit khung indol .......................................................................... 17 1.3.4.2. Ancaloit khung pyridin - (pyperidin) .................................................. 18 1.3.4.3. Ancaloit vịng ngưng tụ pyrrolidin-pyperidin (khung tropan) ............ 20 1.3.4.4. Ancaloit khung ruban (quinin, quinidin, cinchonin, cinchonidin) ...... 21 1.3.4.5. Ancaloit khung benzyl-isoquinolin .................................................... 22 1.3.4.6. Ancaloit khung morphinan ................................................................. 23 1.3.4.7. Ergot ancaloit (dẫn xuất axit lysergic) .............................................. 23 1.3.4.8. Ancaloit khung imidazol .................................................................... 24 1.3.4.9. Ancaloit strychnin .............................................................................. 25 1.3.4.10. Ancaloit kháng sinh ......................................................................... 25 Chƣơng 2. THỰC NGHIỆM ....................................................................... 30 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................. 30 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu .......... 30 2.1.2. Phƣơng pháp ngâm chiết ...................................................................... 31 2.1.3. Thử hoạt tính sinh học ......................................................................... 31 2.1.4. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ dịch chiết ................................. 31 2.1.5. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hố học các chất .................................. 31 2.2. DỤNG CỤ, HỐ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ....................... 32 2.2.1. Dụng cụ, hố chất ................................................................................. 32 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu .............................................................................. 33 2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ .............. 33 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết ....................................................................... 33 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết ......................................................... 35 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol ............................................................ 35 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit ...................................................................... 35 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid ..................................................................... 36 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin ....................................................................... 36 2.3.2.5. Định tính các glucosit tim ................................................................. 36 2.3.2.6. Định tính các saponin ....................................................................... 37 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 2.3.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định(antimicrobial activity) ........ 38 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT ............................................... 39 2.4.1 Cặn dịch chiết n-hexan (Cof H) ............................................................ 39 2.4.1.1. Ancol mạch dài E4C (hexatriacontan-1-ol) ....................................... 40 2.4.1.2. -Sitosterol ....................................................................................... 40 2.4.1.3. Stigmast-5,22-dien-3-β-ol . ................................................................ 41 2.4.2. Cặn dịch chiết etylaxetat. ..................................................................... 42 2.4.2.1. Tritecpenoit 31H6 ............................................................................. 42 2.4.2.2. 3-O--Sitostery - glucopyranosit ....................................................... 43 2.4.3. Cặn dịch chiết MeOH .......................................................................... 44 Chƣơng 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................ 45 3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG ........................................................................ 45 3.2. PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HỢP CHẤT CĨ TRONG CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU CỦA LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ. ....... 45 3.2.1. Ancol mạch dài E4C(hexatriacontanol) COF.E4C: C36H74O ................ 46 3.2.2. Các hợp chất sterol ............................................................................... 46 3.2.2.1.-Sitosterol ........................................................................................ 47 3.2.2.2. Stigmast-5,22-dien-24R-3-ol .......................................................... 47 3.2.2.3. 3-Sitostery-1l-O--D-glucopyranosit .............................................. 49 3.2.2.4. Hợp chất axit lupan-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic (COF18E3-C30H48O3) .... 50 3.2.2.5. Hợp chất cafein (COF.An – C8H10N4O2) ............................................ 60 3.3. HOẠT TÍNH BÀI SỎI THẬN CỦA LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ ................ 61 KẾT LUẬN ................................................................................................... 62 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN................................................................................................... 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 64 PHỤ LỤC...................................................................................................... 67 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN  Các phƣơng pháp sắc ký CC : Column Chromatography TLC : Thin-layer Chromatography SKLM : Sắc ký lớp mỏng  Các phƣơng pháp phổ CAD : Collisional Activated Dissociation MS : Mass Spectroscopy EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy ESI-MS : Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation  Các lĩnh vực khác MIC : Minimum inhibitory concentration HIV : Human Immunodeficiency Virus đvC : Đơn vị Cacbon v/v : Thể tích/thể tích Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các hệ dung mơi triển khai SKLM ............................................. 32 Bảng 2.2: Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của lá cây Cà phê chè ....... 35 Bảng 2.3: Kết quả định tính nhĩm các chất trong lá cây Cà phê chè ........... 37 Bảng 2.4: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cặn chiết của lá cây Cà phê chè ..................................................... 39 Bảng 3.1: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125MHz) của một số sterol trong lá cây cà phê chè (Coffea arabica) ..................................... 48 Bảng 3.2: Bảng tƣơng tác xa C  H(HMBC) của COF18E3..................... 59 Bảng 3.3: Bảng tƣơng tác xa C  H(HMBC) của COF.Anc ...................... 60 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Cây Cà phê chè (Coffea arabica) .................................................. 6 Hình 3.1: Phổ FT - IR của COF18E3 ......................................................... 51 Hình 3.2: Phổ EIS - MS của COF18E3 ...................................................... 52 Hình 3.3: Phổ 1H-NMR của COF18E3 ...................................................... 53 Hình 3.4: Phổ 13C- NMR của COF18E3.................................................... 54 Hình 3.5: Phổ DEPT của COF18E3 ........................................................... 55 Hình 3.6: Phổ HSQC của COF18E3 ........................................................... 56 Hình 3.7: Phổ HMBC của COF18E3 .......................................................... 57 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết lá cây cà phê chè ............................................. 34 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Nƣớc ta cĩ diện tích khoảng 330.000 km2. Đồi núi chiếm 3/4 diện tích trong đĩ núi cao trên 500 m chiếm 1/3 diện tích lãnh thổ. Khí hậu nhiệt đới giĩ mùa, cĩ 2 mùa rõ rệt thay đổi theo địa hình. Nhiệt độ trung bình hàng năm trên 22 0C, lƣợng mƣa vào khoảng 1200 - 2800 mm, độ ẩm tƣơng đối cao (trên 80%). Những đặc thù về điều kiện tự nhiên nhƣ vậy rất thuận lợi cho hệ sinh thái phát triển. Vì thế nƣớc ta cĩ hệ thực vật vơ cùng phong phú và đa dạng. Theo số liệu thống kê mới nhất cĩ trên 12000 lồi, trong đĩ cĩ trên 3200 lồi thực vật đƣợc sử dụng làm thuốc trong y học dân gian [5]. Từ xƣa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đĩng vai trị hết sức quan trọng trong đời sống của con ngƣời. Ngày nay, những hợp chất tự nhiên cĩ hoạt tính sinh học đƣợc phân lập từ cây cỏ đã đƣợc ứng dụng trong rất nhiều ngành cơng nghiệp cũng nhƣ ngành nơng nghiệp, chúng đƣợc sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành cơng nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm… Ngày nay, ngành cơng nghệ tổng hợp hố dƣợc phát triển mạnh mẽ đã tạo ra các biệt dƣợc khác nhau đƣợc sử dụng trong cơng tác phịng, chữa bệnh nhờ đĩ giảm tỉ lệ tử vong, nâng cao tuổi thọ. Tuy nhiên, vai trị của những thảo dƣợc khơng vì thế mất đi chỗ đứng trong Y học. Nĩ vẫn tiếp tục đƣợc dùng làm nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất dẫn đƣờng (lead-compounds) cho cơng nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dƣợc phẩm mới đáp ứng cho việc điều trị các chứng bệnh thơng thƣờng cũng nhƣ các bệnh nan y (Ung thƣ, HIV, ...). Trên cơ sở trên cho thấy, nguồn cây thuốc dân gian cũng nhƣ các bài thuốc của đồng bào dân tộc vẫn là kho tàng vơ cùng quí giá để khám phá, tìm kiếm các loại thuốc mới cĩ hiệu lực cao cho cơng tác phịng và chữa Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 bệnh. Việc nghiên cứu cây thuốc đã giúp cho chúng ta hiểu rõ về thành phần và cấu trúc hố học, hoạt tính sinh học, tác dụng dƣợc lí của cây thuốc. Từ đĩ, ngƣời ta cĩ thể tạo ra các chất mới cĩ hoạt tính sinh học cao hơn để làm thuốc chữa bệnh. Cây Cà phê chè (Coffea arabica) khơng chỉ là một cây cơng nghiệp quan trọng, mà nĩ cịn là một trong những dƣợc liệu quí. Ở Malaysia và Indonesia ngƣời ta sử dụng lá cây Cà phê chè sắc nƣớc để làm thuốc lợi tiểu. Lá cây Cà phê chè cịn đƣợc dùng điều trị các bệnh hen xuyễn, nhiễm độc atropin, cúm, đau đầu, nhiễm độc thuốc phiện. Ngồi ra, đồng bào dân tộc Dao, huyện Đơng Triều, tỉnh Quảng Ninh cịn sử dụng lá cây Cà phê chè để chữa bệnh sỏi thận. Đây là bài thuốc độc vị cổ truyền khá độc đáo. Mặc dù vậy, cho đến nay cĩ rất ít cơng trình nghiên cứu về thành phần hố học và dƣợc lí của lá cây Cà phê chè. Với mục đích nghiên cứu và tìm hiểu thành phần hố học cũng nhƣ hoạt tính sinh học của lá cây Cà phê chè gĩp phần làm tăng thêm kho tàng tri thức về cây thuốc cổ truyền Việt Nam [28-36]. Với những lý do trên, lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc chọn làm đối tƣợng cho luận văn nghiên cứu này với tên đề tài là: “ Nghiên cứu thành phần hố học của lá cây Cà phê chè (Coffea arabica)”. Nhằm xác định thành phần và cấu trúc hố học của các hợp chất cĩ trong lá cây Cà phê chè. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng I TỔNG QUAN 1.1. CHI COFFEA VÀ THÀNH PHẦN HỐ HỌC CỦA CHÚNG 1.1.1. Giới thiệu về chi Coffea Theo tác giả Phạm Hồng Hộ, chi Coffea ở Việt Nam hiện cĩ năm lồi là: Coffea arabica L. (Cà phê chè), Coffea canephora Pierre ex. Froehner (Coffea rubusta - Cà phê vối), Coffea dewevrei (Coffea excelsa - Cà phê mít), Coffea liberica Bull ex Hiern. (Cà phê dâu da), Coffea tetrandra P. Chev. in Herbier (Cà phê tứ hùng). Hiện nay, nƣớc ta trồng cà phê vối và tập trung chủ yếu ở Tây Nguyên [1], [3]. 1.1.2. Những nghiên cứu về thành phần hố học Từ các bộ phận của các lồi cà phê, ngƣời ta đã phân lập đƣợc một số lớp chất nhƣ: glycosit (este), ancaloit, aminoaxit, tecpenoit và các amit [9], [20]. Ancaloit: NH2 H NO O H N NH2 O OH NH O CH3 N OH CH3 1.1 Axit allantoic 1.2a 3-Metylindolin-2-on 1.2b 2-Hydroxy-3-metyl-1H-indol N N O O N N CH3 CH3 H3C N N O H3CO N NH3C CH3 O N N O H3CO N NH3C CH3 O CH3 1.3 Caffein 1.4 Liberin 1.5 Methylliberin Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Glycosit: O OH OH HO OHO O OH OH OH O O Acylsucroz¬-6-O-(3-Methylbutanoyl) 1.6 O HO O O OH OH OH O O HO OH 6-O--D-Apiofuranosyl- 1- -3-Methylbut -D-glucoz¬ 1.7 O HO O O OH OH OH O O HO OH 6-O--D-Apiofuranosyl- 1-O-3-Methy -2-butenoyl-D-glucoz¬ 1.8 O O OH OHHO O O H HO HO OH O O O OH HO O OH HO HO OH 1.9 Mascaroside 1.10 Mozambioside Terpenoit. O O OH O 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 2021 (3,19-Abeo-11,16-diepoxy-17-hydroxy-3,18-kauradien-2-on) Bengalensol1.11 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Amit N H HN O OH O HO N-coumaroyltryptophan 1.12 N H HN O OH O HO N-Caffeoyltryptophan OH 1.13 N H H N O RHO R=C19H39 Eicosanoylserotonin R=C23H45 Tetracosanoylserotonin 1.14 Hiện ngay ngƣời ta cũng chỉ biết nhiều về hạt cà phê nhƣng thành phần hố học và tác dụng của lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) chƣa thấy cĩ tài liệu, báo cáo nào đề cập. 1.2. CÂY CÀ PHÊ CHÈ VÀ SỬ DỤNG TRONG Y HỌC CỔ TRUYỀN 1.2.1. Mơ tả thực vật Cây Cà phê chè cĩ tên khoa học là Coffea arabica, thuộc chi Coffea, họ Rubiacea, lớp Magloniopsida, ngành Magloniophta, giới Platae. Cà phê chè là tên gọi theo tiếng Việt, vì lồi cà phê này cĩ lá nhỏ, cây thƣờng để thấp giống cây chè một loại cây cơng nghiệp phổ biến ở Việt Nam. Phân bố địa lí: Cây cà phê chè (Coffea arabica) cĩ nguồn gốc từ Ethiopia. Cây cà phê chè đƣợc đƣa vào Ả Rập trƣớc thế kỉ XV và đƣợc trồng ở đảo Java của Indonesia vào năm 1690. Sau đĩ, đƣợc trồng rộng rãi ở khá nhiều nơi trên thế giới nhƣ: Suriman, Jamaica, Tây Ấn, Trung Mỹ, Yemen, Việt Nam …[39] Ở nƣớc ta, cây cà phê chè đƣợc trồng lần đầu tiên vào năm 1984, lấy giống từ Cuba. Cho đến nay đã phát triển rộng rãi ra các tỉnh Quảng Ninh, Đắk Lắk, Đắk Nơng, Gia Lai, Kon Tum, Lâm Đồng…[6], [45], [46]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Đặc điểm sinh trƣởng và phát triển: Cây cĩ tán lớn màu xanh đậm, lá hình bầu dục chiều dài 12cm rộng 5 cm. Cây trƣởng thành cĩ thể cao từ 4 - 6 m, nếu để mọc hoang dã cĩ thể cao tới 15 m. Hoa màu trắng, nhị vàng, hoa thƣờng nở về đêm và nở hết vào 4 - 5 giờ sáng, cây cà phê chè cĩ khả năng tự thị phấn cao khoảng 90%. Quả hình oval, mỗi quả chứa hai hạt cà phê. Hình 2.1: Cây Cà phê chè (Coffea arabica) Cây Cà phê chè đƣợc trồng chủ yếu ở các nƣớc cĩ khí hậu nhiệt đới. Tuy nhiên điều kiện thuận lợi nhất cho sự phát triển của cây Cà phê chè là những vùng đất cao từ 1375-1830 m và khơ ráo. Nhiệt độ thích hợp từ 16-25 0C, lƣợng mƣa khoảng trên 1000 mm. Cà phê chè sau khi trồng khoảng 3 đến 4 năm thì cĩ thể bắt đầu cho thu hoạch cho đến 25 năm thì dừng lại. Thực tế nĩ cĩ thể sống đƣợc khoảng 70 năm [1], [5], [6], [38-44]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Đây là lồi cây cĩ giá trị kinh tế nhất trong các lồi cà phê, nĩ chiếm 61% các sản phẩm cà phê trên tồn thế giới. Colombia và Brasil là hai nƣớc xuất khẩu chính hai loại cà phê này. Việt Nam là nƣớc xuất khẩu cà phê lớn thứ hai thế giới nhƣng chủ yếu là cà phê vối. Năm 2003, Việt Nam giảm 15% diện tích (khoảng 40.000 ha) cà phê vối để chuyển đổi sang cà phê chè nhằm đem lại giá trị kinh tế cao hơn. Trên thực tế, do khơng trồng thử nghiệm trƣớc mà đã trồng diện rộng đã vấp phải nhiều khĩ khăn nhƣ sâu bệnh và nấm phá hoại, điều kiện tự nhiên khơng phù hợp nên năng xuất thấp [41]. 1.2.2. Một số bài thuốc chữa bệnh sỏi thận trong Y học cổ truyền Cho đến nay, Y học dân gian Việt Nam đã sử dụng khá nhiều bài thuốc, dƣợc liệu để điều trị bệnh sỏi thận. Dƣới đây là một số bài thuốc và dƣợc liệu để điều trị sỏi thận. * Giáng Thạch Thang: Cam thảo tiêu 30g, Đơng quỳ tử 10g, Giáng hƣơng 3g, Hải kim sa: 10g, Hoạt thạch: 10g, Kê nội kim 10g, Kim tiền thảo: 30g, Ngƣ não thạch: 10g, Xuyên ngƣ đằng: 10g. Sắc uống. Tác dụng: thanh nhiệt, lợi thấp, trị hạ tiêu cĩ thấp nhiệt, sỏi đƣờng tiết niệu. * Tang Căn Tam Kim Nhị Thạch Thang: Hải kim sa: 30g, Hoạt thạch: 30g, Kê nội kim(rang với cát): 10g, Kim tiền thảo: 30g, Ngƣ đằng: 10g, Tang phụ căn: 30g, Thạch vi: 16g, Tỳ giải: 10g, Vƣơng bất lƣu hành: 10g. Sắc uống. Tác dụng: thanh nhiệt, lợi thấp, thơng lâm, chỉ thống, trị thận hƣ, thấp nhiệt uẩn kết, sỏi đƣờng tiểu. * Thơng Phao Thang: Bại tƣơng thảo: 16g, Biển súc: 6g, Cát cánh: 4g, Cù mạch: 6g, Lậu lơ: 10g, Mơng hoa: 16g, Thanh bì: 10g, Vƣơng bất lƣu hành: 15g. Sắc uống. Tác dụng: Hành ứ, thơng lâm. Trị thấp nhiệt ở bàng quang, ứ trệ hạ tiêu, sỏi đƣờng tiểu. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 * Trân Kim Thang Gia Giảm: Hải kim sa: 16g, Kê nội kim: 12g, Lộ lơ thơng: 16g, Mạch mơn: 10g, Tiểu hồi: 10g, Trạch tả: 12g, Trân châu: 60g, Ty qua lạc: 12g, Vƣơng bất lƣu hàng: 12g. Sắc uống. Tác dụng: Thanh nhiệt lợi thấp, thơng lâm, bài thạch. Trị thấp nhiệt hạ chú, uất kết lâu ngày làm cho tạp chất của nƣớc tiểu đọng lại thành sỏi, đƣờng tiểu cĩ sỏi. * Niệu Lộ Bài Thạch Thang: Biển súc: 24g, Chi tử: 20g, Chỉ xác: 10g, Chích thảo: 10g, Cù mạch: 15g, Đại hồng: 12g, Hoạt thạch: 15g, Kim tiền thảo 30g, Mộc thơng: 10g, Ngƣ tất 15g, Thạch vi: 30g, Xa tiền sử: 24g. Sắc uống. Tác dụng: Tiêu sỏi, thơng lâm, hành khí, hố ứ, thanh lợi thấp nhiệt. Trị thấp hạ chú, sỏi ở đƣờng tiểu. Bài thuốc này thích hợp với các chứng sau: + Sỏi cĩ đƣờng kính ngang nhỏ hơn 1cm, đƣờng kính dài nhỏ hơn 2cm. + Hệ tiết niệu khơng cĩ dị dạng về giải phẫu và những biến đổi bệnh lý. * Liệu Lộ Kết Thạch Thang: Bạch vân linh: 10g, Hải kim sa: 15g, Hoạt thạch: 12g, Hổ phách: 3g, Kim tiền thảo: 15g, Mộc thơng: 6g, Thanh bì: 10g, Xa tiền tử: 10g. Sắc uống. Tác dụng: lợi thấp, hố ứ, trị sỏi ở bàng quang. * Thược Dược Cam Thảo Thang Gia Vị: Bạch thƣợc, Trân châu mẫu: 30g, Cam Thảo, Đàn hƣơng, Nga truật, Nguyên hồ, Hồi hƣơng đều: 10g, Điền sâm, Mạch mơn, Bạch vân linh đều 12g. Sác uống. Tác dụng: Hỗn cấp, chỉ thống. Trị thận hƣ, lƣng đau, khí âm đều suy, khí nghịch, sỏi niệu quản. * Phụ Kim Thang: Kim tiền thảo: 30g, Phụ tử 12g, Thục địa: 20g, Trạch tả 10g. Sắc uống. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Tác dụng: Ơn thận, hành thuỷ. Trị thận khí hƣ tổn, sỏi đƣờng tiểu [28-36]. Hầu hết các bài thuốc trị sỏi thận ở trên gồm nhiều vị thuốc phổ biến cĩ mặt Kim tiền thảo, điều trị kéo dài. Riêng bài thuốc cổ truyền của dân tộc Dao, thuộc loại độc vị, đĩ là bài thuốc cổ truyền khá độc đáo chỉ sử dụng một loại thảo dƣợc là lá cây cà phê chè, tác dụng bài sỏi thận với kích thƣớc nhỏ hơn 10mm là rất tốt trong thời gian ngắn 20 - 30 ngày. Bài thuốc này đã đƣợc đồng bào dân tộc Dao sử dụng rất cĩ hiệu quả nhƣ sau: + Thu hái thuốc: Thu hái quanh năm, thời gian thu hái thích hợp nhất trong ngày từ 9 - 12 giờ sáng, lá thu hái là các lá bánh tẻ hoặc già hơn. + Sơ chế và bảo quản thuốc: Sau khi thu hái, lá cà phê đƣợc hong khơ hoặc sấy ở nhiệt độ 600C, tránh ánh nắng càng tốt. Khi lá đủ khơ đƣợc đem đi thái hoặc nghiền nhỏ (giống nhƣ chè cám) và bảo quản nơi khơ ráo thống mát. + Cách sử dụng: Lấy 15 - 20g lá cà phê chè đã sấy khơ nghiền nhỏ cho vào 3 x 250 ml nƣớc sơi (giống nhƣ pha trà) chiết đƣợc khoảng 700 ml dịch và dùng uống hết trong ngày (4-5 lần: sáng, trƣa, chiều và tối giống nhƣ uống trà). Khoảng thời gian điều trị từ 20 - 30 ngày, tuỳ thuộc vào kích cỡ của viên sỏi. + Tác dụng: Cĩ tác dụng bài sỏi thậnvới kích cỡ nhỏ hơn 10 mm rất tốt chỉ trong thời gian ngắn 20 - 30 ngày. Hiện ngay ngƣời ta cũng chỉ biết nhiều về hạt cà phê nhƣng thành phần hố học và tác dụng của lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) chƣa thấy cĩ tài liệu, báo cáo nào đề cập. 1.3. MỘT SỐ ANCALOIT QUAN TRỌNG SỬ DỤNG TRONG Y HỌC 1.3.1. Giới thiệu chung về ancalnoit Ngày nay, khái niệm ancaloit đƣợc hiểu là các hợp chất tồn tại trong giới thực vật (thƣờng là các hợp chất vịng) chứa nitơ, cĩ tính kiềm yếu và phần lớn trong số chúng cĩ hoạt tính sinh học mạnh, ở liều cao là những chất độc, cịn với liều thấp hơn chúng lại là những dƣợc phẩm vơ cùng hữu ích và tên “alcaloids” nghĩa là cĩ tính kiềm yếu. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Các hợp chất ancaloit là một trong những nhĩm dƣợc phẩm dị vịng chứa nitơ quan trọng nhất, cho dù trong những năm gần đây cĩ rất nhiều dƣợc phẩm dị vịng chứa nitơ đã đƣợc tổng hợp và đƣa ra chữa bệnh. Trong cùng một thực vật, các ancaloit thƣờng cĩ cấu trúc hĩa học gần giống nhau. Ancaloit trong tự nhiên phần lớn thƣờng ở dạng liên kết (dạng muối) với các axit hữu cơ đơn giản (axit axêtic, axit oxalic, axit sữa, táo, axit 2,3-dihydroxisuccinic, axit chanh, ...), đơi khi trong một vài thực vật (đặc biệt trong các thực vật giàu ancaloit) các ancaloit chỉ liên kết với các axit hữu cơ đặc chƣng với chúng nhƣ: axit fumaric, axit cevadinic, axit meconic, ... Phần lớn các ancaloit là hợp chất tinh thể rắn, một vài hợp chất trong số chúng dạng lỏng cĩ thể làm sạch bằng phƣơng pháp chƣng cất mà khơng bị phân hủy (coniin, arecolin, nicotin ...) ở nhiệt độ phịng. Các ancaloit rắn thƣờng cĩ vị đắng cịn các ancaloit lỏng thƣờng cĩ vị cay. Các hợp chất ancaloit dạng bazơ tự do hầu hết khơng tan trong nƣớc, tuy nhiên tan tốt trong chloroform. Trong các ancaloit thƣờng chứa các cacbon bất đối, hoạt động quang học (αD) và thƣờng chỉ tồn tại trong thực vật ở một dạng nhất định [21], [22]. 1.3.2. Phƣơng pháp phân tích 1.3.2.1. Phân tích định tính Ngƣời ta đã sử dụng khá nhiều thuốc thử để xác nhận sự cĩ mặt của ancaloit trong thực vật. Do cơ sở các phản ứng hĩa học của ancaloit phần lớn khơng rõ ràng, nên ngƣời ta chỉ phân biệt các phản ứng này là phản ứng màu hoặc phản ứng tạo tủa. 1.3.2.1.1. Các phản ứng tạo tủa  Thuốc thử Mayer (1865): K2HgI4 [kali-thủy ngân (II) iodua - kaliumiodomercurat]: Là thuốc thử ancaloit thơng thƣờng cho tủa màu trắng (vàng trắng) khơng tan kể cả trong dung dịch axit lỗng. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11  Thuốc thử Dragendorff hay Kraut (1881): KBiI4 [Kali-bizmut-iodua]: Thuốc thử ancaloit cho tủa kết tinh màu vàng cam (đỏ).  Thuốc thử Bouchardat (1839) hay Wagner (1863): KI3 [dung dịch kali-iodua 0,1N + I2]: cho tủa kết tinh màu nâu đỏ sẫm với ancaloit.  Thuốc thử Sonnenchein (1857): H3[P(Mo3O10)4], axit phosphormolibdenic: Tạo tủa tƣơng đƣơng mol với hầu hết các ancaloit. Đặc biệt nhạy đối với quinin và strychnin.  Thuốc thử Godeffroys: K4[Si(W3O10)4], axit silicowonframic: Ngƣời ta sử dụng dung dịch nƣớc 5% muối natri của nĩ, cho phản ứng rất nhạy với ancaloit cho tủa màu trắng.  Axit cheric (tannin): Tạo tủa vơ định hình khơng màu hoặc trắng vàng.  Muối Reinecke: NH4[Cr(SCN)4(NH3)2], Amoni-tetrarodanato-diammin- cromat(III): Ban đầu, ngƣời ta sử dụng nĩ nhƣ tác nhân tạo tủa với các amin bậc II và amin tercier. Rosenhaler đã sử dụng nĩ để xác nhận sự cĩ mặt của các ancaloit và cho tinh thể rất đặc trƣng.  Natri-tetraphenyl-borat (Kalignost), Na[B(C6H5)4]: Ban đầu, ngƣời ta sử dụng nĩ nhƣ tác nhân thử kali, sau đĩ đƣợc sử dụng thử ancaloit thơng thƣờng, cho tủa màu trắng trong axit axêtic. Cần lƣu ý rằng: các amin tổng hợp tercier hoặc quaternary amin cũng thƣờng cho phản ứng tủa ancaloit [21], [22]. 1.3.2.1.2. Các phản ứng tạo màu Trong số các phản ứng ancaloit, phản ứng của ancaloit với các axit khống đặc đơi khi cho chúng ta khả năng phân biệt. Các phản ứng chỉ cho kết quả tốt đối với các ancaloit cĩ độ sạch cần thiết. Đặc biệt là các phản ứng tạo màu với axit H2SO4 đậm đặc dựa trên cơ sở khả năng hút nƣớc và ơxy hĩa của nĩ [21], [22]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12  Tác nhân Erdmann: 20ml axit H2SO4 đậm đặc + 10 giọt (dung dịch 100ml chứa 10 giọt axit HNO3). Phản ứng khơng màu với các ancaloit: atropin, koniin, nicotin, caffein, quinin, cocain, strychnin Đỏ, vàng: Brucin Vàng cam, đỏ máu: Veratrin Nâu đỏ, nâu sẫm: Papaverin Đỏ máu, vàng: Tebain  Tác nhân Frưhde: axit H2SO4 đậm đặc + 5% ammoni-molibdat. Xanh tím: Morphin Xanh oliu: Hydrastin  Tác nhân Mandelin: axit H2SO4 đậm đặc + vanadin (axit H2SO4 đậm đặc + 5% ammoni-vanadat). Xanh da trời sang đỏ: strichnin  Tác nhân Marquis: Formaldehide + axit H2SO4 đậm đặc (1ml axit H2SO4 đậm đặc + 1 giọt formaldehide). Đỏ tím: Morphin và các dẫn xuất  Tác nhân Arnold-Vitali: lƣợng nhỏ KNO2 + axit H2SO4 đậm đặc. Màu tím: Atropin, hyoscyamin, scopolamin Đỏ tím: strichnin  Tác nhân Thalleiochin: nƣớc clo (brơm) + amoniac. Xanh lá cây: quinin, quinidin 1.3.2.2. Phân tích định lượng Những năm trƣớc đây, để xác định đƣợc hàm lƣợng ancaloit cần tiến hành hai bƣớc. Bước 1. Muối ancaloit tan trong nƣớc đƣợc kiềm hĩa bằng bazơ thích hợp để giải phĩng ancaloit ở dạng bazơ khơng tan trong nƣớc. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Bước 2. ancaloit tự do đƣợc chiết bằng dung mơi thích hợp (chloroform), sau đĩ đuổi dung mơi và xác định hàm lƣợng ancaloit bằng phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng (gravimetric analysis). Sau này, khi ngƣời ta phát hiện thấy nếu hằng số phân ly của ancaloit đủ lớn (pKb ≥ 7), thì cĩ thể sử dụng phƣơng pháp chuẩn độ để xác định hàm lƣợng của nĩ. Trong trƣờng hợp này, sau khi đuổi hết dung mơi hữu cơ ngƣời ta cho vào dung dịch ancaloit thừa lƣợng axit H2SO4 0,1N hoặc 0,2N để tạo muối, dung dịch thừa axit đƣợc chuẩn độ bằng dung dịch kiềm 0,1N hoặc 0,2N. Ngày nay, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp chuẩn độ trong mơi trƣờng „‟khơng nước‟‟, các muối ancaloit trong dung dịch axit axêtic băng của chúng đƣợc chuẩn độ trực tiếp bằng axit percloric (HClO4). Tác nhân gây nhiễu trong khi đo nếu do thành phần axit (trong trƣờng hợp muối ancaloit đƣợc tạo bởi các axit halogenid) cĩ thể loại trừ bằng muối thủy ngân (II) axêtat. Phƣơng pháp này cĩ thể xác định hàm lƣợng cho cả các ancaloit cĩ hằng số phân ly nhỏ (pKb ≤7) nhƣ quinin hay papaverin [21], [22]. Để xác định hàm lƣợng ancaloit cĩ thực hiện theo các phƣơng pháp sau: 1.3.2.2.1. Xác định hàm lƣợng ancaloit bằng phƣơng pháp phân tích trọng lƣợng a) Kiềm hĩa giải phĩng ancaloit tự do trƣớc khi chuẩn độ Để kiềm hĩa, thơng thƣờng ngƣời ta sử dụng amoniac, đơi khi là natri-bicacbonat (NaHCO3) hoặc nƣớc vơi trong. Nếu kiềm hĩa bằng dung dịch kiềm mạnh (NaOH, KOH) cĩ thể tạo ra các phản ứng khơng mong muốn. Ví dụ: các hợp chất ancaloit dạng este (atropin) cĩ thể bị xà phịng hĩa, các ancaloit dạng phenol (morphin) cĩ thể tạo phenolat khơng thể chiết đƣợc bằng chloroform... Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Một số bazơ dùng để giải phĩng ancaloit tự do khỏi muối của nĩ nhƣ:  NaOH: Muối quinidin, muối quinin, codein-phốtphat, dihydrocodeinon - tartarat, dihydrocodein-tartarat.  Amoniac (NH3): Muối của các este-ancaloit khung tropan, muối clorua của các dẫn xuất morphin-ancaloit (khơng dùng cho muối clorua của morphin), papaverin, ephedrin, pilocarpin, strichnin.  Natri-bicacbonat (NaHCO3): Morphin-clorua, phyzostigmin-salicylat. b) Phƣơng pháp tiến hành: Cho lƣợng muối ancaloit đã cân vào phễu chiết và hịa tan trong 5ml nƣớc, kiềm hĩa dung dịch muối đến pH = 10. Ancaloit tự do thƣờng ít tan trong nƣớc, do vậy ngƣời ta chiết nĩ bằng chloroform (ete). Dung dịch kiềm hĩa đƣợc chiết 6 lần (mỗi lần 10 ml CHCl3). Tách loại và kiểm tra sự cĩ mặt của ancaloit trong pha hữu cơ lần cuối (dịch chiết lần 6) bằng thuốc thử Dragendorff hoặc Mayer. Gộp các pha hữu cơ, sau đĩ làm khan bằng Na2SO4 khan. Lọc qua giấy lọc. Dung dịch thu đƣợc chứa ancaloit tự do, ngƣời ta xác định hàm lƣợng ancaloit theo các phƣơng pháp thích hợp (phân tích chuẩn độ hay phân tích trọng lƣợng) tùy thuộc vào độ lớn hằng số phân ly của nĩ. Phương pháp chiết nhanh Schulek: Phƣơng pháp chỉ một lần chiết này chỉ áp dụng đƣợc đối với các muối ancaloit tan tốt trong nƣớc. Cách tiến hành nhƣ sau: Hịa tan lƣợng muối ancaloit đã biết trong 2 ml nƣớc, thêm 70 ml CHCl3 và lắc đều, trong thực tế lƣợng ancaloit sau khi đƣợc giải phĩng sẽ hịa tan hồn tồn trong pha hữu cơ (pha CHCl3), sau đĩ làm khơ bằng Na2SO4 khan, lọc lấy dịch chiết CHCl3 và tiến hành xác định hàm lƣợng ancaloit nhƣ trên [21], [22]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 1.3.2.2.2. Xác định hàm lƣợng ancaloit bằng phƣơng pháp “khơng nước”. Trƣớc khi chuẩn độ ngƣời ta cho dung dịch thủy ngân (II) axêtat (trong axit axêtic băng) vào dung dịch axit axêtic băng của muối ancaloit-halogenua để tạo ancaloit-axêtat và chất khơng tan thủy ngân (II) halogenua. 2 B.HCl + Hg(AcO)2 → 2 B. AcOH + HgCl2 Thủy ngân (II) axêtat trong axit axêtic băng là một bazơ yếu khơng gây ảnh hƣởng đến xác định hàm lƣợng ancaloit bằng phƣơng pháp chuẩn độ. Ngồi ra, ngƣời ta cịn sử dụng phƣơng pháp chuẩn độ axit thành phần muối ancaloit. Ví dụ: Để xác định thành phần ancaloit thơng qua muối clorua của nĩ đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp sau. Ngƣời ta cho CHCl3 vào dung dịch nƣớc của ancaloit-clorua, lắc đều. Sau đĩ, chuẩn độ dung dịch 2 pha bằng dung dịch NaOH 0.1N. Ancaloit tự do tan vào trong CHCl3 và muối NaCl tan vào nƣớc. Do vậy, cĩ thể coi đây là phƣơng pháp xác định lƣợng axit đơn giản. Phƣơng pháp này áp dụng cho các ancaloit quinin và papaverin rất tốt. Trong số các phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ancaloit trên, phƣơng pháp xác định hàm lƣợng ancaloit bằng phƣơng pháp “khơng nước” cịn cĩ thể áp dụng cho những muối amin cĩ phân tử lớn và các tercier hay quaternary amin [21], [22]. 1.3.3. Phƣơng pháp phân lập ancaloit Trên cơ sở tính chất hĩa học và lí học của các hợp chất ancaloit ngƣời ta tiến hành phân lập chúng chủ yếu theo hai phƣơng pháp sau [21], [22]. 1.3.3.1. Chiết tách phân lập ancaloit bằng phương pháp bazơ - dung mơi hữu cơ Nhƣ đã đề cập ở trên, các hợp chất ancaloit trong thực vật chủ yếu ở dạng liên kết với các axit hữu cơ đơn giản. Do vậy, mẫu thực vật chứa Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 ancaloit sau khi thu hái, xấy khơ và nghiền nhỏ đƣợc kiềm hĩa bằng bazơ yếu (nƣớc amoiac, nƣớc vơi trong hoặc Mg(OH)2) ở nhiệt độ thấp để giải phĩng ancaloit tự do khỏi muối của nĩ. Quá trình chiết tách, phân lập ancaloit thơng thƣờng cần tránh sử dụng kiềm mạnh và nhiệt độ cao để tránh sự phân hủy hay các phản ứng phụ khơng mong muốn nhƣ raxem hĩa. Ancaloit tự do ít khơng tan trong nƣớc đƣợc chiết bằng dung mơi hữu cơ (chloroform, ete) theo phƣơng pháp phân đoạn hoặc liên tục. Cặn sau chƣng cất ngồi các ancaloit cịn chứa các hợp chất cĩ tính kiềm khác, do vậy cần tiếp tục các bƣớc làm sạch tiếp theo nhƣ kết tinh, chạy cột để thu đƣợc sản phẩm mong muốn. 1.3.3.2. Chiết tách phân lập ancaloit bằng phương pháp axit-nước Trong trƣờng hợp các ancaloit tự do tan rất kém trong nƣớc, ngƣời ta sử dụng phƣơng pháp chiết axit-nƣớc, với việc sử dụng lƣợng nƣớc-axit lớn (nồng độ axit ≤ 5%). Sáu đĩ, kiềm hĩa trở lại để tủa hĩa ancaloit-bazơ tự do và thu nhận chúng sau khi lọc. Lợi thế của phƣơng pháp chiết axit-nƣớc là các ancaloit cĩ thể thu đƣợc ngay sau khi cho dịch nƣớc axit chứa ancaloit qua cột trao đổi ion dƣơng bằng cách dùng kiềm để giải phĩng các ancaloit-bazơ tự do đƣợc giữ lại trên cột trao đổi ion và với dung mơi hữu cơ thích hợp (chloroform, ete) rửa giải chúng ra khỏi cột, các bƣớc làm sạch tiếp theo thực hiện giống nhƣ trƣờng hợp bazơ-dung mơi hữu cơ. 1.3.4. Phân loại các ancaloit quan trọng trong Y dƣợc theo khung cơ bản Theo hiểu biết ngày nay về các hợp chất ancaloit, thì thơng thƣờng chúng là các chất quang hoạt. Trong số các đồng phân của chúng thì đồng phân quang học quay trái (L) cĩ hoạt tính sinh học cao hơn rất nhiều so với các đồng phân quay phải (D). Sản phẩm raxemic của chúng thƣờng cĩ hoạt tính nằm ở giữa đồng phân cĩ hoạt tính cao hơn [2], [4], [21], [22]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 1.3.4.1. Ancaloit khung indol Trong số các ancaloit khung indol đƣợc sử dụng rộng rãi trong Y học là hợp chất physostigmin (tên khác: ezerin) thành phần chính (0,15%) trong hạt thực vật Physostigma venenosum (đậu Kalabar) N N CH3 CH3 CH3 H3CNHOCO 3.1 Physostigmin Physostigmin-salycilat là chất tinh thể rắn, khơng màu, khơng mùi vị cay nhẹ, trong khơng khí và dƣới tác dụng của ánh sáng nĩ chuyển sang màu đỏ, ít tan trong nƣớc (1:100), tan khá tốt trong cồn và chloroform (1:13,1:9),  25Dα = -89 đến -940. Physostigmin cĩ hoạt tính kích thích phĩ giao cảm trực tiếp, nĩ ức chế men acetylcolinesteraza khơng cho phân hủy acetylcolin, đƣợc sử dụng chủ yếu trong điều trị mắt, làm giảm nhãn áp [4], [21], [26]. N H N HO O O N N O O OH O O H O 3.2 Vinblastin Một ancaloit khác khung indol đã đƣợc sử dụng để điều trị bệnh ung thƣ máu (máu trắng - lymphogranulomatosis) đĩ là hợp chất vinblastin, nĩ cĩ hàm lƣợng rất thấp trong cây Dừa cạn (Vinca rosea) khá phổ biến ở Việt Nam [2], [36]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Trong một số lồi của chi Ba gạc (Rauwolfia) nhƣ Rauwolfia verticillata và Rauwolfia serpentina cũng cĩ chứa các ancaloit khung indol (reserpin và các dẫn xuất) đƣợc sử dụng trong y học, cả trong Tây y và Đơng y. Nĩ cĩ tác dụng hạ huyết áp, giảm hoạt động của hệ thần kinh trung ƣơng (an thần chữa động kinh và stress) và cĩ tác dụng gây buồn ngủ. Nĩ cĩ tác dụng làm giảm các catecholamin và serotonin từ các dây thần kinh của hệ thần kinh trung ƣơng. Các chất tinh chế từ rễ Ba gạc đã đƣợc sử dụng khá tích cực trong thời gian gần đây để điều trị cao huyết áp. Tuy nhiên, các nghiên cứu trên động vật lại cho thấy nĩ cĩ thể gây ung thƣ [4]. N N O C O OCH3 OR2 OCH3 OCH3 H H C O H3CO H R1 R3 R4 3.3 Tªn R1 R2 R3 R4 Reserpin (Rausedil) MeO Me H H Deserpidin H Me H H Syrosingopin MeO EtO-CO- H H Methoserpidin H Me MeO H Bietaserpin MeO Me H Et2-N-(CH2)2- 1.3.4.2. Ancaloit khung pyridin - (pyperidin) Các ancaloit trong tự nhiên thuộc nhĩm này bao gồm các ancaloit quan trọng nhƣ: nicotin, arecolin, coniin, ricinin, lobelin, ... Các ancaloit nicotin, arecolin, coniin là các chất lỏng ở nhiệt độ phịng. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Nicotin là một ancaloit tìm thấy trong một số thực vật họ Solanaceae, hàm lƣợng vào khoảng 0,6-3,0% trọng lƣợng thuốc lá khơ. Nĩ đƣợc sinh tổng hợp trong thân rễ sau đĩ đƣợc tích tụ trong lá. Trƣớc đây, nĩ đƣợc sử dụng rộng rãi để trừ cơn trùng bảo vệ mùa màng, và ngày nay các đồng đẳng của nĩ, ví dụ nhƣ: imidacloprid vẫn đƣợc sử dụng phổ biến với tác dụng tƣơng tự. Trong Y học nĩ đƣợc sử dụng để nghiên cứu khoa học là chủ yếu, đặc biệt đối với hệ thần kinh. Do nĩ đƣợc coi là tác nhân gây ra một số loại ung thƣ (ung thƣ phổi) nên phong trào từ bỏ thuốc lá đã đƣợc Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và các Chính phủ trên thế giới ủng hộ mạnh mẽ [21]. N N CH3 3.4 Nicotin Arecolin là ancaloit dạng lỏng của quả cau (Areca nut, Areca catechu ) cĩ thể tan trong nƣớc, cồn, ete, chloroform, ... Arecolin đƣợc biết nhƣ là tác nhân kháng acetylcolin trên các thụ thể phĩ giao cảm M1, M2 và M3 (gây co con ngƣơi mắt, phế nang phổi) và nĩ cịn đƣợc sử dụng để trừ một số loại giun sán. N O OCH3 H3C 3.5 Arecolin Coniin là ancaloit rất độc (với nồng độ 0,2g/kg gây chết ngƣời) đƣợc tìm thấy trong cây Conium maculatum và một số lồi họ Ráy nhƣ Arum maculatum, Arisarum vulgare, Amorphophallus rivieri, điểm sơi 166-167 0C. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 NH 3.6 Coniin Lobelin là ancaloit dạng bột trắng rắn vơ định hình tan trong nƣớc cĩ trong các lồi Lobelia inflata, Lobelia nicotianaefolia, Lobelia hassleri, Lobelia stallfeldii và trong một số lồi Lobelia spp khác [21]. OH N O CH3 3.7 Lobelin Lobelin đƣợc sử dụng để hỗ trợ cai thuốc lá, cai nghiện ma túy ví dụ nhƣ cai nghiện amphetamin, cocain hay rƣợu. Trong cây Ricinus communis L., họ Thầu dầu, ngƣời ta đã phân lập đƣợc ancaloit ricinin dạng rắn cĩ điểm nĩng chảy 201 0C, tan trong nƣớc nĩng. Độc đối với gan và cĩ thể gây chết ngƣời [21]. N OCH3 CN CH3 3.8 Ricinin 1.3.4.3. Ancaloit vịng ngưng tụ pyrrolidin-pyperidin (khung tropan) Các ancaloit khung tropan bao gồm các chất chủ yếu nhƣ: atropin, hyoscyamin, homatropin, scopolamin, ... Các ancaloit này đƣợc sử dụng hết sức rộng rãi trong Y học, chúng là các chất ức chế phĩ giao cảm, làm giảm co thắt cơ trơn (mật, ruột, thận ...), giảm huyết áp, giãn con ngƣơi. Đây là các thuốc giải độc kích thích phĩ giao cảm [2], [37]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 N CH3 O O CH2OH C6H5 N CH3 O O CH2OH C6H5 O N CH3 O O CH2OH C6H5 3.9 (+/-)-Atropin 3.10 Scopolamin 3.11 (S)-Hyoscyamin 1.3.4.4. Ancaloit khung ruban (quinin, quinidin, cinchonin, cinchonidin) N HHO R N CH R = MeO Quinin R = H Cinchonidin CH2 N H R N CH CH2 H R = MeO Quinidin R = H Cinchonin 3.12 3.13 Các ancaloit tìm thấy trong cây Canh ki na, thuộc nhĩm chất khung ruban, đĩ là các chất quinin, quinidin và một số chất khác, chúng là các chất tinh thể rắn, màu trắng cĩ vị đắng. Các hợp chất này đã đƣợc sử dụng trong Y học từ thế kỷ XVII để điều trị bệnh sốt rét cho đến những năm 1940 sau khi ngƣời ta tìm ra các loại thuốc chống sốt rét khác thay thế. Ngồi ra, chúng cịn là thuốc sát khuẩn, (antipyretic, fever-reducing), thuốc giảm đau (painkilling), chống viêm (anti-inflammatory). Quinin cịn để điều trị bệnh luput (lupus), viêm khớp (arthritis)... 3.12b 3.12a 3.13a 3.13b Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 1.3.4.5. Ancaloit khung benzyl-isoquinolin Ancaloit nhĩm này là một số ancaloit của cây Á phiện (Anh túc) gồm papaverin, laudanosin, noscapin, berberin, tetrahydropalmatin, ... Noscapin (cịn gọi là Narcotin, Nectodon, Nospen, và Anarcotin) là benzylisoquinolin ancaloit tìm thấy trong thực vật họ Papaveraceae mà khơng cĩ hoạt tính giảm đau. Noscapin là hoạt chất đƣợc sử dụng để điều trị ho. Ngồi ra nĩ cịn thể hiện rất tốt những hoạt tính chống ung thƣ. Laudanosin hay N- methyltetrahydropapaverin cũng đƣợc phát hiện cĩ trong thuốc phiện với hàm lƣợng khoảng 0,1%, lần đầu tiên phân lập đƣợc năm 1871. Nĩ cĩ khả năng tƣơng tác với các thụ thể phĩ giao cảm. Papaverin cũng là một ancaloit của thuốc phiện nĩ cĩ tác dụng điều trị làm dãn cơ trơn (dạ dày, ruột, mật, đƣờng tiết niệu, dãn mạch giảm đau tuần hồn ngoại vi và tuần hồn não. C2H5O C2H5O N OC2H5 OC2H5 N OCH3 OCH3 O CH3 N OCH3 O CH3 O O OCH3 3.14 Noscapin 3.15 Laudanosin 3.16 Papaverin Trong củ bình vơi (Stephania rotunda) thuộc chi Stephania, ngƣời ta đã phân lập đƣợc một ancaloit tetrahydropalmatin (THP) là thành phần chính. THP đƣợc sử dụng làm thuốc an thần (thuốc ngủ), ngồi ra nĩ cịn đƣợc dùng để điều trị cai nghiện ma túy (nghiện cocain, thuốc phiện), ở Việt Nam nĩ cĩ trong thành phần thuốc cai nghiện HEANTOS. Trong cây Hồng đằng (Fibraurea tinctoria), họ Tiết dê (Menispermaceae), một ancaloit khung benzyl-isoquinolin cũng đã đƣợc phát hiện đĩ là hợp chất berberin. Hoạt chất Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 này cĩ khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, kháng kí sinh trùng. Gần đây, ngƣời ta cịn thử hoạt tính của nĩ đối với các bệnh đái tháo đƣờng, giảm lƣợng cholesteron trong máu, chống ung thƣ, ... [4], [21]. O N O O O ON+ O O O HSO4 3.17 Tetrahydropalmatin 3.18 Berberin-sunphat 1.3.4.6. Ancaloit khung morphinan Morphin và các dẫn xuất của nĩ (codein, tebain, ...) là các ancaloit chính của cây Anh túc cĩ thể coi chúng là các dẫn xuất của phenantren hoặc isoquinolin. Chúng đều là các hoạt chất giảm đau, morphin cho đến nay vẫn là một thuốc giảm đau tốt nhất, đặc biệt đƣợc sử dụng cho các bệnh nhân ung thƣ giai đoạn cuối, mặc dù nĩ là chất ma túy bị kiểm sốt. Codein tuy khơng cĩ hoạt tính giảm đau mạnh nhƣ morphin, nhƣng nĩ lại là một trong các thuốc giảm ho tốt nhất và vẫn đang đƣợc sử dụng điều trị [2], [4]. O OHHO N CH3 O OHH3CO N CH3 O OCH3H3CO N CH3 3.19 Morphin 3.20 Codein 3.21 Tebain 1.3.4.7. Ergot ancaloit (dẫn xuất axit lysergic) Các ancaloit dẫn xuất axit lysergic đƣợc phát hiện trong Nấm cựa gà [4], [21], [37] cĩ thể gặp trên các vùng cao cĩ trồng lúa mạch của nƣớc ta. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Ngƣời ta thu hái khi nấm bắt đầu chín và phơi khơ ở 30-45 0C. Thành phần hố học của nĩ gồm ergotasin, ergotamin, ergocornin là những hoạt chất rất mạnh mà với liều lƣợng thƣờng dùng làm co mạch các cơ trơn và cơ tử cung. Với liều cao, Nấm cựa gà rất độc, cĩ thể gây nên hoại thƣ ở đầu ngĩn tay chân, cơ cứng mạch, mê sảng. N N O O OH R2 HN R1 O N NH CH3 C R1 = Me, R2 = Benzyl Ergotamin R1 = Me, R2 = -CH2-i.Pr Ergosin R1 = i.Pr, R2 = Benzyl Ergocristin R1 = i.Pr, R2 = -CH2-i.Pr Ergocryptin R1 = i.Pr, R2 = -i.Pr Ergocornin O 3.22 1.3.4.8. Ancaloit khung imidazol O C2H5 O N N CH3 3.23 Pilocarpin Trong nhĩm ancaloit này, pilocarpin là ancaloit chính tìm thấy trong cây Pilocarpus jaborandi và Pilocarpus microphyllus ở Trung và Nam Mỹ quan trọng hơn cả. Nĩ đƣợc sử dụng chủ yếu trong lĩnh vực điều trị nhãn khoa, đặc biệt là bệnh glơcơm (glaucoma) nĩ cĩ tác dụng làm giảm nhãn áp [2], [4], [37]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 1.3.4.9. Ancaloit strychnin Strychnin là ancaloit trong hạt Mã tiền (Strychnos nux vomica), ở dạng tinh thể khơng màu, nĩ đƣợc biết đến là một trong những chất đắng nhất (cĩ thể nhận biết độ đắng của nĩ ở nồng độ ≤ 1 ppm), độc tính cao (LD50 = 10 mg). N O N O H H H H 3.24 Strychnin Ngƣời ta sử dụng nĩ để trừ các động vật cĩ hại mùa màng (chim, bộ gặm nhấm). Strychnin cĩ tác dụng kích thích thần kinh trung ƣơng, co cơ mạnh (cường cơ strychnin). Nĩ là một trong những thuốc hồi sức tốt nhất thơng qua tác dụng kích thích lên hệ thần kinh trung ƣơng tại trung tâm hơ hấp và trung tâm vận mạch làm cho khả năng hơ hấp và lƣu thơng máu đƣợc tăng cƣờng [2], [4], [37]. 1.3.4.10. Ancaloit kháng sinh Ngồi các nhĩm ancaloit dƣợc phẩm quan trọng kể trên khơng thể khơng nhắc đến các loại kháng sinh ancaloit mà do một số chủng nấm tạo ra trong quá trình phát triển sinh học của chúng. Kỷ nguyên kháng sinh bắt đầu từ năm 1929, khi Fleming phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của penicillin do chủng nấm Penicillin notanum tạo ra trong quá trình trao đổi chất và đến năm 1949, ngƣời ta đã phân lập đƣợc penicillin tinh sạch [4], [21], [22]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26  Kháng sinh β-lactam (penicillin và cephalosporin) Penicillin và cephalosporin khơng cĩ hoạt tính kháng động vật nguyên sinh đơn bào (protozoa) và nấm, bởi vì thành tế bào của chúng đƣợc tạo ra khác với của vi khuẩn. Các vi khuẩn Gram(+) và khuẩn xoắn rất nhạy cảm với các kháng sinh β-lactam. Các vi khuẩn Gram(-) phần lớn kháng thuốc đối với các penicillin cổ điển. Tuy nhiên, các penicillin bán tổng hợp (ampicillin, carbenicyllin) và cephalosporin đều cĩ tác dụng đối với vi khuẩn Gram(-). N S CH3 CH3 COOH HH O N H C O R 3.25 Một số kháng sinh penicillin quan trọng R Tên Ph-CH2- Penicillin G CH3-CH2-CH=CH-CH2- Penicillin F CH2=CH-CH2-S-CH2- Penicillin O Ph-O-CH2- Penicillin V HOOC CH CH2 NH2 CH2 CH2 Penicillin N N S R2 COOH R3 O HNC O R1 3.26 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Một số cephalosporin quan trọng R1 R2 R3 Tên Cách dùng HOOC CH NH2 CH2 5 AcOCH2- H Cephalosporin C Thuốc uống S CH2CO- AcOCH2- H Cephalotin Thuốc dùng ngồi ruột CH NH2 D CH3- H Cephalexin Thuốc uống N N N N CH2 CO N S N S3 CH2 H Cephazolin Thuốc dùng ngồi ruột S CH2CO -CH2-O-CONH2 CH3O Cefoxitin Thuốc dùng ngồi ruột  Kháng sinh aminoglycozit (nhĩm streptomycin) Một số chế phẩm kháng sinh streptomycin quan trọng. Hoạt chất Tên Phổ tác dụng Điều trị OH HO H N HO C NH NH2 N H C NH NH2 O O O O CHOHO H3CHOH2C OH HO NH CH3 3.27 Streptomycin A Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Bệnh lao, Viêm màng não, Viêm màng tim O CH2NH2 OH OH OH O NH2 NH2 OH O O H2C OH NH2 OH HO 3.28 Kanamycin A Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Bệnh lao, Viêm màng não, Viêm màng tim Nhiễm khuẩn ruột NH CH3 H3C O H2N HO NH2 O O CH3 OH HN CH3 3.29 Gentamycin Gram(+), (-) Khuẩn lao (TBC) Pseudomonas Nhiễm khuẩn đường liệu đạo Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Các kháng sinh streptomycin, sản phẩm sinh ra trong quá trình sống của nấm Streptomyces griseus, đƣợc Waksman và cộng sự phân lập vào năm 1944. Về mặt cấu tạo, chúng là các aminoglycosit, gồm 2 phần, phần genin (aglicon) là các dẫn xuất của streptamin, phần đƣờng là các monosacarit nhƣ L-xilozơ, L-streptozơ, 5-hydroxistreptozơ, N-metyl-L-glucozamin, D- mannozơ. Steptomycin cĩ hoạt tính kháng khuẩn Gram(-). Các kháng sinh streptomycin cĩ hoạt tính kháng khuẩn Gram(-), khơng cĩ tác dụng với phần lớn khuẩn Samonella và Pseudomonas. Hoạt tính quan trọng nhất là kháng vi trùng lao (TBC). Tuy nhiên chúng dễ bị kháng thuốc khi dùng điều trị đơn lẻ. Các kháng sinh streptomycin khơng bền đối với kiềm, chỉ dùng dƣới dạng muối.  Kháng sinh tetracyclin Năm 1947, ngƣời ta phát hiện ra chlotetracyclin là kháng sinh đƣợc tạo ra bởi nấm Streptomyces aureofaciens. Năm 1949, ngƣời ta phân lập đƣợc oxitetracyclin từ lồi Streptomyces rimosus. Tetracyclin là các kháng sinh cĩ phổ tác dụng rất rộng, nĩ cĩ hoạt tính đối với tất cả các loại khuẩn, các loại khuẩn Proteus, Pseudomonas và khuẩn xoắn. Chlotetracyclin cĩ hoạt tính yếu hơn, cịn doxicyclin và minocyclin cĩ thể điều trị hiệu quả đối với các bệnh lậu và viêm màng não. O OH O OH CO-NH-R1 R2R3R4R5 OH OH NMe2 3.30 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Tên R1 R2 R3 R4 R5 Độ bền Chlotetracyclin (Aureomycin) H H OH CH3 Cl Khơng bền Oxitetracyclin (Terramycin) H OH OH CH3 H Khơng bền Metacyclin H OH =CH H Bền Doxicyclin (Vibramycin) H OH H CH3 H Bền Minocyclin (Klinomycin) H H H H Me2N- Bền  Kháng sinh chlorocid (chloramphenicol) Năm 1947, ngƣời ta phát hiện ra một chủng Streptomyces mới cĩ thể tạo ra chlorocid trong quá trình sống. Ngày nay, chlorocid đã đƣợc điều chế bằng con đƣờng tổng hợp tồn phần [2], [36]. Kháng sinh chlorocid cĩ phổ tác dụng rộng nhất bên cạnh tetracyclin. Nĩ cĩ tác dụng lên mọi vi khuẩn trừ khuẩn Pseudomonas. Tuy nhiên, nĩ lại cĩ hoạt tính cả với khuẩn Salmonella, khuẩn Proteus, Trùng rận, khuẩn Chlamydia. Lĩnh vực sử dụng điều trị hiện nay chủ yếu là chữa viêm màng tim, bệnh nhiễm trùng nặng do vi khuẩn Gram(-) gây ra. R CH CH OH CH2-OH NH-CO-CHCl2 3.31a R = NO2 Chlorocid 3.31b R = MeSO2 Thimaphenicol Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 CHƢƠNG 2 PHẦN THỰC NGHIỆM Cây cà phê chè (Coffea arabica) là loại cây cơng nghiệp đƣợc du nhập sớm vào Việt Nam. Đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về hạt cà phê chè nhƣng những hiểu biết về thành phần hố học và tác dụng dƣợc lí của lá cây cà phê chè vẫn cịn rất sơ sài. Ở Malaysia và Indonesia, ngƣời ta sử dụng lá cây cà phê chè sắc nƣớc để làm thuốc lợi tiểu. Cà phê chè cịn đƣợc dùng nhƣ bài thuốc cổ truyền điều trị các bệnh hen xuyễn, nhiễm độc atropin, cúm, đau đầu,... Từ bài thuốc cổ truyền khá độc đáo của dân tộc Dao, sử dụng lá cây Cà phê chè để bài sỏi thận với kích cỡ nhỏ hơn 10 mm trong thời gian khoảng 20 - 30 ngày. Vì thế, lá cây cà phê chè đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu hố thực vật. Nhiệm vụ của luận văn là tìm hiểu một số thành phần hố học cĩ trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc trồng tại xã Hồng Quế, huyện Đơng Triều, tỉnh Quảng Ninh. 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là lá cây Cà phê chè, lá cây tƣơi đƣợc thu hái 12/2008 tại Lâm Xá - Tràng Bạch - Hồng Quế - Đơng Triều - Quảng Ninh. Mẫu lá cà phê chè để nghiên cứu hố thực vật đã đƣợc TS. Ninh Khắc Bản (Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật - Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam) giám định tên khoa học là Coffea arabica (chi: Coffea, họ: Rubiacea, bộ: Gentianales, lớp: Magloniopsida, ngành: Magloniophta, giới: Platae). 10,5 kg mẫu cây tƣơi đem sấy ở nhiệt độ 110 0C trong 10 phút để diệt men, sau đĩ hong khơ ở nơi thống mát rồi sấy ở nhiệt độ 50 0C - 60 0C tới khi độ ẩm dƣới 10% đƣợc 1,2 kg mẫu khơ. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.1.2. Phƣơng pháp ngâm chiết 1,2 kg mẫu khơ đã nghiền nhỏ đƣợc ngâm chiết lần lƣợt với từng loại dung mơi: n-Hexan, etylaxetat, metanol trong thiết bị siêu âm, ở nhiệt độ 50 0 C, thời gian ngâm mỗi lần 1 giờ. Mẫu nghiên cứu đƣợc ngâm với từng loại dung mơi trên mỗi loại 5x 5lit. Dồn chung mỗi loại dịch chiết riêng biệt và làm khan bằng Na2SO4. Sau đĩ các dịch chiết riêng biệt đƣợc lọc qua giấy lọc và loại bỏ dung mơi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt ≤ 50 0C dƣới áp xuất giảm. Thu đƣợc thu đƣợc 3 cặn tƣơng ứng n -Hexan, etylaxetat và metanol. Quá trình nghiên cứu sẽ nêu chi tiết ở phần thực nghiệm 2.1.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định đối với 3 loại cặn thơ thu đƣợc ở trên tại Phịng thử hoạt tính sinh học -Viện Hố học -Viện khoa học và Cơng nghệ Việt Nam. 2.1.4. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ dịch chiết Để phân tích và phân tách hỗn hợp các chất cũng nhƣ phân lập các hợp chất cần sử dụng phối hợp các phƣơng pháp sắc ký nhƣ: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột thƣờng dùng Silica gel Merck 63-200 nm, cột pha đảo bằng các dung mơi và hệ dung mơi thích hợp. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại . 2.1.5. Phƣơng pháp khảo sát cấu trúc hố học các chất Các chất phân lập đƣợc ở dạng tinh khiết là đối tƣợng để khảo sát các đặc trƣng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nĩng chảy (Mp), đo độ quang hoạt (αD) v.v.. khi thu đƣợc các chất sạch, tiến hành ghi các phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lƣợng (MS), phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC và phổ HMBC với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Các số liệu thực nghiệm của các chất sạch đƣợc dùng xác định cấu trúc hố học của chúng. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 2.2. DỤNG CỤ, HỐ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dụng cụ, hố chất Các dung mơi để ngâm chiết mẫu đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng, sắc ký lớp mỏng điều chế phải sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc ký lớp mỏng tự chế với các kích thƣớc khác nhau đã dùng loại silica gel G60 của hãng Merck tráng trên tấm thuỷ tinh và hoạt hố ở nhiệt độ độ dày 0,2 mm (Art. 5554). Bảng 2.1: Các hệ dung mơi triển khai SKLM: STT Hệ dung mơi (Tỉ lệ thể tích) Kí hiệu 1 n-Hexan - EtOAc (8: 1) hệ A 2 n-Hexan - EtOAc (4: 1) hệ B 3 n-Hexan - EtOAc (2: 1) hệ C 4 Cloroform - metanol (9: 1) hệ D 5 Cloroform - metanol (5: 1) hệ E 6 Cloroform - metanol (3: 1) hệ F Các sắc ký lớp mỏng (SKLM) đƣợc soi dƣới đèn tử ngoại ở 254 nm (cho loại kieselgel 60F254) rồi phun thuốc thử vanilin - H2SO4 5% và sấy ở trên 100 oC, để phát hiện các hợp chất. Các giá trị Rf trong hệ dung mơi triển khai biểu thị là Rf A (B, C)x100. Sắc ký cột thƣờng sử dụng silica gel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230-400 mesh (0,063 - 0,200 mm). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nĩng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Gĩc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hố học - Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt nam) dƣới dạng viên nén KBr. - Phổ khối lƣợng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hố học - Khoa học và Cơng nghệ Việt nam) ion hĩa bằng va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dị MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dị DAD. - Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn nội TMS, dung mơi CDCl3, CD3OD, DMSO-d6. 2.3. THU NHẬN CÁC DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ 2.3.1. Thu nhận các dịch chiết Mẫu tƣơi sau khi diệt men, sấy khơ, nghiền nhỏ rồi ngâm, chiết kiệt với n-hexan ở nhiệt độ phịng cho đến khi nhạt màu. Phần bã tiếp tục ngâm, chiết lần lƣợt với etylaxetat và metanol. Các dịch chiết n-hexan, etylaxetat, metanol đƣợc làm khan bằng Na2SO4. Sau đĩ, lọc lấy dịch chiết đem cất loại dung mơi ở áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 50 0C thu đƣợc các cặn tƣơng ứng. Đem cân để xác định khối lƣợng các cặn. Việc thu nhận các dịch chiết từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) xem sơ đồ 2.1. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Sơ đồ 2.1: Sơ đồ ngâm chiết mẫu lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) MÉu kh« nghiỊn nhá 1,2 kg CỈn n-Hexan Cof H: 80g B· 1 CỈn EtOAc Cof E: 42,3 g B· 2 B· 3 (Bá) n-Hexan(5x5l) C« kh« EtOAc 5x5l C« kh« MeOH5x5l C« kh« CỈn MeOH Cof M: 92,7g Cặn đƣợc làm khơ đến khối lƣợng khơng đổi và cân xác định trọng lƣợng. Từ lá cây Cà phê chè đã thu đƣợc 3 loại cặn chiết đƣợc ký hiệu là: Cof H, Cof E, Cof M Ở đĩ: Cof H : Cặn chiết n-Hexan Cof E : Cặn chiết EtOAc Cof M : Cặn chiết MeOH Kết quả thu nhận các cặn dịch chiết từ lá cây Cà phê chè ở Hồng Quế, Đơng Triều, Quảng Ninh đƣợc nêu trong bảng 2.1 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Bảng 2.2: Khối lƣợng các cặn chiết thu đƣợc từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) Mẫu thu vào tháng 12/2008 Khối lƣợng mẫu khơ (g) (% so với trọng lƣợng khơ) Khối lƣợng cặn chiết khơ (g) n-Hexan (% so với trọng lƣợng khơ) EtOAc (% so với trọng lƣợng khơ) MeOH (% so với trọng lƣợng khơ) Lá 1200 (11,43%) 80,0 (6,67%) ( Cof H) 42,3 (3,53%) ( Cof E) 92,7 (7,73%) (Cof M) 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khơ. Hồ tan cặn trong 3 ml cloroform - lấy dịch cloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1 ml anhydric axetic + 1 ml cloroform để lạnh ở 00C, sau đĩ cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1 ml dịch chloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dƣơng tính. 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloit Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nƣớc lọc axit. Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu cĩ tủa trắng và nhiều là phản ứng dƣơng tính. Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorff, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dƣơng tính. Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dƣơng tính. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml mêtanol, đun nĩng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nƣớc lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột magiê (Mg) hoặc Zn, sau đĩ cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dƣơng tính với các flavonoit. 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin Dịch để thử định tính đƣợc chuẩn bị nhƣ mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đĩ 0,5 ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sơi, để nguội rồi cho thêm 4 ml nƣớc cất vào mỗi ống. Nếu chất lỏng ở ống cĩ kiềm trong hơn ở ống khơng kiềm cĩ thể xem là phản ứng dƣơng tính, nếu đem axit hố ống cĩ kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong vẩn đục và màu vàng xuất hiện cĩ thể tạo ra tủa là phản ứng dƣơng tính. Ngồi ra cĩ thể làm phản ứng điazo hố với axit sulfanilic trong mơi trƣờng axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, cho kết quả dƣơng tính đối với cumarin. 2.3.2.5. Định tính các glucosit tim Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm nhƣ mục 2.3.2.1. + Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dƣơng tính với vịng butenolit. + Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic lỗng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5% Cách tiến hành: Lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu khơng xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim. 2.3.2.6. Định tính các saponin Chuẩn bị dịch thử nhƣ ở mục 2.3.2.1. lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1 ml HCl lỗng, ống 2 cho 1 ml NaOH lỗng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vịng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dƣơng tính. Kết quả phân tích định tính các nhĩm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc nêu trong bảng 2.2. Bảng 2.3: Kết quả định tính các nhĩm chất trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) STT Nhĩm chất Thuốc thử Hiện tƣợng Cặn tổng 1 Sterol Lieberman-Bourchardt Màu xanh Màu vàng + 2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam + 3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt _ H2SO4 đặc Hồng nhạt _ NaOH đặc Vàng _ FeCl3 5% Xanh thẫm _ 4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa bơng Cĩ kết tủa _ 5 Glucosit trợ tim FeCl3 trong CH3COOH +H2SO4đ Vàng nâu rõ ─ 6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH + Chú giải: + : Phản ứng dƣơng tính ─ : Phản ứng âm tính Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 2.3.3. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity) * Các chủng vi sinh vật và nấm đại diện gây bệnh ở ngƣời gồm các nhĩm: - Vi khuẩn Gr (-): Pseudomonas aeruginosa(Pa) ATCC 15442. Escherichia coli (Ec)ATCC 25922, - Vi khuẩn Gr (+): Staphylococcus aureus(Sa) ATCC 13709. Bacillus subtillis (Bs) ATCC 6633 Lactobasillus fermentun N4, Enterococus faecium B650 - Nấm men: Candida albicans (Ca) ATCC10231. * Mơi trƣờng nuơi cấy. MHB (Mueller - Hinton Broth), MHA (Mueller - Hinton Agar), TSB (Tryptic Soy Broth), TSA (Tryptic Soy Agar)cho vi sinh vật; SAB, SA cho nấm * Pha lỗng mẫu thử. - Mẫu ban đầu đƣợc pha trong DMSO với nồng độ thích hợp theo yêu cầu và mục đích thử. - Mẫu ban đầu cĩ nồng độ 40mg/ml đƣợc pha lỗng thành các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng từ nồng độ 256 μg/ml, 64μg/ml, 16μg/ml; 4μg/ml, 1μg/ml. * Thử hoạt tính các cặn. - Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.10 cfu/ml khi tiến hành thử. - Lấy 10μl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã đƣợc pha lỗng, thêm 200μl dung dịch vi sinh vật và nấm, ủ 370C. Sau 24 giờ, đọc giá trị MIC bằng mắt thƣờng. Giá trị MIC đƣợc xác định tại giếng cĩ nồng độ chất thử thấp nhất ức chế hồn tồn sự phát triển của vi sinh vật. Giá trị IC50 đƣợc tính tốn dựa trên số liệu đo độ đục tế bào bằng máy Tecan (Genios) và phần mềm raw data. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 + Thử định tính theo phƣơng pháp khuếch tán trên thạch, sử dụng khoanh giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn. + Các mẫu cho hoạt tính (+) ở bƣớc 1 sẽ đƣợc tiến hành thử tiếp bƣớc 2 để tính ra nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) theo phƣơng pháp hiện đại của Vanden Bergher và Vlietlink tiến hành trên phiến vi lƣợng 96 giếng, kháng sinh kiểm định bao gồm: Ampicilin, Tetracylin, Amphoterixin B và Nystatin. Bảng 2.4: Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định các cặn chiết của lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) STT Tên mẫu Tên chủng vi sinh vật kiểm định ChủngVSV vi Gram dƣơng Chủng VSV Gram âm Nấm men Staphylococcus aureus IC50(g/ml) Bacillus subtilis IC50(g/ml) Escherichia coli IC50 (g/ml) Pseudomonas aeruginosa IC50 (g/ml) Candida albicans IC50 (g/ml) 1 Cof H > 256 >256 >256 >256 >256 2 Cof E > 256 >256 >256 >256 >256 3 Cof M > 256 >256 >256 >256 >256 Nhận xét: Các mẫu thử khơng cĩ tác dụng kháng các chủng vi sinh vật trên. 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT 2.4.1. Cặn dịch chiết n-hexan (Cof H) Lấy 45 g cặn n-hexan đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung mơi n-hexan-etylaxetat cĩ tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 - 100% etylaxetat. Dịch rửa giải đƣợc thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin-H2SO4 5% sau đĩ các phân đoạn giống nhau đƣợc dồn làm một rồi đem cất loại dung mơi. Sau đĩ để yên dịch cơ ở nhiệt độ phịng cho tự kết Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 tinh, các chất kết tinh thể thu đƣợc tiếp tục cho kết tinh lại bằng dung mơi thích hợp để nhận đƣợc chất tinh khiết (sạch) và ghi các loại phổ để xác định cấu trúc hố học, các chất thu đƣợc nhƣ sau: 2.4.1.1. Ancol mạch dài E4C (hexatriacontan-1-ol) Chạy sắc ký cột 45 g cặn Cof H bằng dung mơi n - hexan thu đƣợc khối chất rắn, kết tinh là những tinh thể hình kim, khơng màu, cĩ khối lƣợng 7,7 mg (0,0257%), kiểm tra SKLM trong hệ dung mơi chloroform: metanol (9:1) (Hệ D) hiện màu bằng hơi I2 thấy cĩ 1 vết trịn trên bản mỏng . Xác định Rfx100= 81, nĩng chảy ở 88 - 89 C. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3);  (ppm): 3.64 (t, 2H1), 1.55 (m, 2H2), 1.28 (H3-35, br), 0.88 (t, 3H36). 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3);  (ppm): 63.12 (t, C1), 32.83 (t, C2), 31,93 (t, C34 ), 29.62(br, C3-32), 25.75(t, C3 ), 22.69(t, C35 ), 14.11 (q, C36). 2.4.1.2. -Sitosterol Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung mơi n-hexan/etylaxetat (20:1), thu đƣợc khối chất rắn vơ định hình, tách lặp lại trên cột silicagel và kết tinh lại trong n-hexan đã thu đƣợc những tinh thể hình kim, khơng màu, cĩ khối lƣợng 23mg (0,051%), Rfx100=50, nĩng chảy ở 135-136C. Phổ FT-IR (KBr): νmax(cm -1 ): 343,15 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3): (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Phổ 13C -NMR (125MHz, CDCl3):  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,6 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). 2.4.1.3. Stigmast-5,22-dien-3-β-ol . Rửa giải cột với hệ dung mơi n-hexan:etylaxetat (10:1), sau khi cất lại dung mơi, cặn thu đƣợc kiểm tra SKLM trong hệ A, kết tinh lại trong dung mơi n-hexan thu dƣợc 19 mg (0,042%) tinh thể hình kim, khơng màu, khơng mùi, Rf100 = 64, nĩng chảy ở 155-157 0 C, []25D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Phổ FT-IR(KBr): νmax(cm -1 ):3429,1(OH); 2864,9(C-H); 1642,5 và 1651,4(C=C) Phổ EI-MS (m/z (%): 412[M+](7), 300(7), 255(11), 231(4), 213(8), 173(7), 145(20), 133(20), 83(49,3), 55(100), 43(90). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm): 5.35 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz, H6); 5.14 (1H, dd, J22,23=15 Hz, J22,20= 5Hz, H-22); 5.03 (1H, dd, J23,22=15 Hz, J23,24=5 Hz, H-23); 3.49 (1H, m, H-3). Phổ 13C -NMR (125MHz, CDCl3),  (ppm): 36.5 (t, C-1); 29.67 (t, C-2); 71.8 (d, C-3); 42.25 (t, C-4); 140.71 (s, C-5); 121.67 (d, C-6); 37.21 (t, C-7); 31.84 (d, C-8); 51.2 (d, C-9); 36.11 (s, C-10); 24.32 (t, C-11); 42.17 (t, C-12); 31.6 (s, C-13); 56.83 (d, C-14); 25.38 (t, C-15); 31.6 (t, C-16); 55.9 (d, C-17); 12.01 (q, C-18); 18.95 (q, C-19); 40.47 (d, C-20); 21.03 (q, C-21); 138.3 (d, C-22); 129.3 (d, C-23); 50.01 (d, C-24); 33.9 (t, C-25); 21.19 (q, C-26); 19.79 (d, C-27); 28.89 (q, C-28); 12.22 (q, C-29). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 2.4.2. Cặn dịch chiết etylaxetat. Lấy 30 g cặn etylaxetat đem tách trên cột silica gel, rửa giải cột bằng hệ dung mơi chloroform: metanol cĩ tỷ lệ tăng dần độ phân cực từ 0 - 100% metanol. Dịch rửa thốt ra từ cột đƣợc thu ở những thể tích nhỏ (510ml/phân đoạn). Kiểm tra cặn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng và hiện màu bằng thuốc thử vanilin - H2SO4 5% xấy ở nhiệt độ > 100 0C, sau đĩ các phân đoạn giống nhau đƣợc gộp lại một và đuổi kiệt dung mơi. 2.4.2.1. Tritecpen (COF18E3). Rửa giải cột bằng dung mơi chlorofom, cất loại dung mơi, thu đƣợc khối chất rắn, kiểm tra SKLM trong hệ dung mơi chlorofom: metanol (9:1) thấy chất rắn cĩ hai chất là thành phần chính. Phân tích tiếp bằng cột nhỏ bắt đầu từ hệ hexan: etylaxetat (5:1), (3:1), (2:1), (1:1), etyl axetat, chloroform, chloroform: metanol (9:1), (7:1), (5:1), (3:1), (1:1) và MeOH đã thu đƣợc hai nhĩm chất rắn là tinh thể hình kim, khơng màu trong dung mơi chloroform . Nhĩm I kí hiệu là COF18E3 cĩ khối lƣợng 118,7 mg (0,394%), nhĩm II kí hiệu là COF.Anc, khi phân tích cặn Cof M cũng thu đƣợc COF.Anc cĩ tổng khối lƣợng 520,7mg (1,74%). Kiểm tra SKLM với 18E3 trong hệ dung mơi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin thấy một vệt trịn màu hồng trên bản mỏng, Rfx100 = 62, nĩng chảy ở 258 - 259 o C. IR: (ν cm-1); 3440,3 (OH); 2930,19-2873,52 (C-H: metyl, metylen, metin); 1691,09 (C=O), ... ESI-MS, m/z: 457,36 [M + +H], 1 H-NMR: 500MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung mơi (CDCl3 + CD3OD): H1 (1,7); H2 (1,55); H3 (3,15); H5 (0,69); H6 (1,3 và 1,49); H7 (1,3); H9 (1,93); H11 (1,8); H12 (5,2); H15 (1,82); H16 (1,93); H18 (2.16); H19 (1,65); H20 (1,65); H21 (1,9); H22 (1,72); H23 (1,05); H24 (0,7); H25 (0,8); H26 (0,9); H27 (0,7); H29 (0,85); H30 (1,1). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 13 C-NMR: 125 Mhz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung mơi (CDCl3 + CD3OD): C1 (t, 38,8); C2 (t, 27); C3 (d, 79); C4 (s, 38,7); C5 (d, 55.3); C6 (t, 18,8); C7 (t, 33,1); C8 (s, 39,6); C9 (d, 47,7); C10 (s, 37,1); C11 (t, 23,4); C12 (d, 125,7); C13 (s, 138,4); C14 (s, 42,2); C15 (t, 28,1); C16 (t, 30,8); C17 (s, 47,9); C18 (d, 52,9); C19 (d, 39,2); C20 (d, 39); C21 (t, 24,3); C22 (t, 36,9); C23 (q, 28,2); C24 (q, 17); C25 (q, 17,1); C26 (q, 21,2); C27 (q, 15,5); C28 (s, 180,7); C29 (q, 15,7); C30 (q, 23,5). 2.4.2.2. 3-O--Sitosteryl-glucopyranosit. Tiếp tục rửa giải cột bằng dung mơi chloroform thu đƣợc khối chất rắn vơ định hình, kết tinh lại trong dung mơi n-hexan thu đƣợc 16 mg (0,036%), kiểm tra SKLM bằng hệ dung mơi CM(9:1) (hệ D) Rfx100=35, nĩng chảy ở 279-280 o C. Phổ FT-IR max (cm -1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026. Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6] + (9); 273 (2); 255 (9); 185 (5); 161 (15); 145 (25); 133 (21); 105 (42), 91 (46); 81 (51); 69 (100). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6);  (ppm): 0,65 (3H, s, Me-18); 0,93 (3H, s, Me-19). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6);  (ppm): 140,6 (s, C-5); 121,3 (d, C-6); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 76,8 (d, C-3); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6'); 56,3 (d, C-14); 55,5 (d, C-17); 50,7 (d, C- 9); 49,7 (d, C-24); 45,2 (s, C-13); 38,4 (t, C-4); 36,9 (t, C-12); 36,3 (t, C-1); 35,6 (s, C-10); 33,4 (d, C-20); 31,5 (t, C-22); 31,5 (d, C-8); 29,4 (t, C-16); 28,8 (t, C-23); 27,9 (t, C-2); 25,5 (t, C-25); 23,9 (t, C-15); 22,7 (t, C-28); 21,0 (t, C-11); 20,7 (d, C-27); 19,8 (q, C-19); 19,0 (q, C-26); 12,2 (q, C-29); 11, 9 (q, C-18). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 2.4.3. Cặn dịch chiết MeOH Lấy 45 gam cặn MeOH cho vào axit hố để PH = 1. Sau đĩ, lọc qua giấy lọc đƣợc dịch đem kiềm hố bằng NaHCO3 đến PH = 10 rồi đem chiết với chloroform mỗi lần chiêt 150 ml dịch với 200 ml chloroform, dịch sau khi chiết đem làm khơ và cất dƣới áp xuất giảm thấy những tinh thể màu trắng, rửa bằng MeOH đƣợc tinh thể đem xác định nhiệt độ nĩng chảy, xác định cấu trúc cho kết quả giống nhƣ COF.Anc. COF.Anc thu đƣợc bằng phƣơng pháp sắc kí cột khi phân tích cặn Cof E. Kểm tra SKLM với COF.Anc hệ dung mơi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin khơng hiện màu trên bản mỏng nhƣng dùng hơi I2 thấy cĩ 1 vết trịn. Xác định Rfx100= 84,3 nĩng chảy ở 237 - 238 C. Phổ 1H-NMR: 500MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung mơi CDCl3: H8 (s, 7,53); H10 (s, 3,4); H11 (s, 3,58); H12 (s, 4,0). Phổ 13C-NMR: 125 MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung mơi CDCl3: C2 (s, 151,8); C4 (s, 148,8); C5 (s, 107,7); C6 (s, 155,5); C8 (d, 141,4); C10 (q, 27,9); C11 (q, 29,8); C12 (q, 33,6). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 CHƢƠNG 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG Để phân lập đƣợc các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà khơng làm ảnh hƣởng tới thành phần hố học cĩ trong nĩ thì trƣớc khi ngâm chiết bằng dung mơi hữu cơ, mẫu thực vật phải đƣợc đƣa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khơ ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật cĩ thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau. 1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol v.v.... 2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung mơi ancol/ nƣớc. Sau đĩ tách loại các hợp chất bằng các loại dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần nhƣ phƣơng pháp 1 để thu đƣợc các dịch chiết cĩ chứa các hợp chất cĩ độ phân cực tƣơng đối giống nhau. Quá trình ngâm chiết lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đƣợc thực hiện theo phƣơng án 1 (Sơ đồ 2.1). 3.2. PHÂN LẬP VÀ NHẬN DẠNG CÁC HỢP CHẤT CĨ TRONG CÁC DỊCH CHIẾT KHÁC NHAU CỦA LÁ CÂY CÀ PHÊ CHÈ Các dịch chiết từ lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng các phƣơng pháp sắc ký cột nhƣ: Cột nhồi silicagel, với các hệ dung mơi rửa giải thích hợp và thƣờng phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thƣờng dùng phƣơng pháp kết tinh lại trong dung mơi hoặc hệ dung mơi thích hợp. Nhờ đĩ sẽ thu đƣợc các đơn chất cĩ độ tinh khiết cao, đáp ứng Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 các nhu cầu để khảo sát tính chất hĩa lý và quang phổ của chúng. Đĩ là những yếu tố quan trọng trong quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hĩa học của các chất đã phân lập đƣợc từ các đối tƣợng nghiên cứu nĩi trên. Việc phân lập các thành phần hĩa học từ lá cây cà phê chè đƣợc thực hiện nhƣ sơ đồ 2.1 và đã thu đƣợc các hợp chất sạch gồm các nhĩm chất: ancol mạch dài, sterol, terpenoit và cafein 3.2.1. Ancol mạch dài (hexatriacontanol) COF.E4C: C36H74O Chất rắn vơ định hình, khơng màu, Kiểm tra SKLM trong hệ dung mơi CM (9:1) (Hệ D) dùng hơi I2 hiện màu thấy cĩ 1 vết trịn cĩ Rfx100 = 81, nĩng chảy ở 88-89 0C, cĩ mặt trong dịch chiết hexan của lá. Trong phổ 1H- NMR của chất này cho thấy tín hiệu của nhĩm CH3 ở độ dịch chuyển hố học 0.88 ppm tƣơng ứng với 3 proton, tín hiệu singlet của nhĩm OH nằm trong vùng 2.16 ppm, ngồi ra cịn cĩ tín hiệu 3.64 ppm ở dạng triplet tƣơng ứng với 2 proton của nhĩm CH2 cĩ liên kết với OH. Đƣờng tích phân phổ 1 H- NMR cho biết cĩ 60 proton ở độ dịch chuyển hố học 1.28 ppm và 8 proton ở 1.55 ppm đều là các tín hiệu của nhĩm CH2, nhƣ vậy tổng số proton cĩ mặt trong phân tử là 74. Mặt khác, trong phổ 13C-NMR và DEPT cũng quan sát thấy tín hiệu của nhĩm CH3 ở 14.11ppm, một tín hiệu của nhĩm CH2 liên kết với OH ở 63.12 ppm và một dãy CH2 mạch dài nằm trong khoảng 22.69 - 32.83 ppm hồn tồn phù hợp với phổ 1H-NMR. Những số liệu phổ nĩi trên cho phép kết luận hợp chất COF4C là một ancol mạch dài cĩ cơng thức phân tử C36H74O với tên gọi: hexatriacontanol. 3.2.2. Các hợp chất sterol Những chất cĩ khung steran đƣợc tìm thấy trong các dịch chiết của cây Cà phê chè thƣờng là các sterol C29 với bộ khung 3-ol  5 -pregnan hoặc dẫn xuất của nĩ, trong đĩ mạch nhánh cĩ cấu hình và cấu dạng khác nhau. Dựa vào các hằng số lý hố và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập đƣợc, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dƣới đây: Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 3.2.2.1. -sitosterol Là những tinh thể hình kim khơng màu cũng thu đƣợc từ dịch chiết n- hexan của lá cây cà phê chè, điểm nĩng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn cĩ nhiệt độ nĩng chảy khơng thay đổi. Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nĩ là 414, từ các phổ FT-IR, 1H-NMR và 13C-NMR cĩ thể khẳng định sự cĩ mặt của nhĩm hydroxi (OH): max = 3426 cm -1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và C-3 = 71,7 ppm, một nối đơi C=C: max = 1651cm -1 (yếu), H-6 = 5,35 ppm (d), J=5Hz, C- 5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm. Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất này hồn tồn phù hợp với -sitosterol chuẩn. Độ dịch chuyển hố học các nguyên tử C của nĩ đƣợc nêu trong bảng 3.1. 3.2.2.2. Stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol Cặn thơ màu trắng thu đƣợc kết tinh lại trong dung mơi n-hexan cho tinh thể hình kim, khơng màu, khơng mùi. Nĩng chảy ở 155-1570C, []25D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Trong phổ EI-MS cĩ thể thấy pic ion phân tử [M] + ở 412 m/z, các phổ 1H-NMR, 13C-NMR và FT-IR khẳng định sự cĩ mặt của nhĩm hydroxyl (OH) H3 = 3,49 ppm và C3 = 71,8 ppm và max = 3406cm -1 , cĩ 3 proton thuộc nhĩm metin (CH) của 2 nối đơi khơng liên hợp (FT-IR: 1621cm -1 ), 1 H-NMR: H6 = 5,33ppm, dd, J=5Hz và 2Hz; H22 = 5,11 ppm, dd, J=15Hz và 5Hz; H22 = 5,03 ppm; dd, J=15Hz và 5Hz; 13 C-NMR: C5 = 140,7 ppm, C6 = 121,6 ppm, C22 = 138,3 ppm, C23 = 129,2 ppm. Các số liệu về phổ 1H-NMR và 13C-NMR của nĩ hồn tồn phù hợp với phổ của stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Bảng 3.1. Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của một số sterol trong lá cây Cà phê chè (Coffea arabica) STT Stigmasterol (ppm) -Sitosterol (ppm) 3β-Sitosteryl-1-O-β- D-glucopyranosit 1 36.5 t 37.3 t 36.3 t 2 29.1 t 31.7 t 27.9 t 3 71.7 d 71.8 d 77.1 d 4 42.2 t 42.3 t 38.4 t 5 140.7 s 140.8 s 140.6 s 6 121.7 d 121.7 d 121.3 d 7 37.2 t 31.9 t 31.5 t 8 31.8 d 31.9 d 31.5 d 9 51.2 d 50.2 d 50.7 d 10 36.1 s 36.5 s 35.6 s 11 24.3 t 21.1 t 21.0 t 12 42.2 t 39.8 t 39.9 t 13 39.7 s 42.3 s 45.2 s 14 56.8 d 56.8 d 56.3 d 15 25.4 t 24.3 t 23.9 t 16 29.7 t 28.3 t 29.4 t 17 56.0 d 56.1 d 55.5 d 18 11.8 q 11.9 q 11.9 q 19 19.4 q 19.4 q 19.8 q 20 40.5 d 36.2 d 36.9 d 21 18.8 q 18.8 q 19.2 q 22 138.3 d 33.9 t 33.4 t Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 STT Stigmasterol (ppm) -Sitosterol (ppm) 3β-Sitosteryl-1-O-β- D-glucopyranosit 23 129.2 d 26.1 t 28.8 t 24 50.1 d 45.9 d 49.7 d 25 31.6 d 29.2 d 25.5 d 26 21.2 q 19.1 q 19.0 q 27 21.0 q 19.4 d 20.7 d 28 18.9 t 23.13 t 19.4 t 29 12.0 q 11.9 q 12.0 q 1' 100.9 d 2' 73. 6 d 3' 76.8 d 4' 70.2 d 5' 76.8 d 6' 61.2 t 3.2.2.3. 3β-Sitosteryl-1-O-β-D-glucopyranosit GluO Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Tiếp tục rửa giải cột bằng dung mơi chlorofom thu đƣợc khối chất rắn vơ định hình, Kiểm tra SKLM trong hệ dung mơi CM (9:1) (Hệ D) dùng thuốc thử vanilin thấy cĩ 1 vệt trịn, Rfx100 = 35, nĩng chảy ở 279-280 o C. Phổ FT-IR max (cm -1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026. Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6] + (9); 273 (2); 255 (9); 185 (5); 161 (15); 145 (25); 133 (21); 105 (42), 91 (46); 81 (51); 69 (100). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6);  (ppm): 0,65 (3H, s, Me-18); 0,93 (3H, s, Me-19). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6);  (ppm): 140,6 (s, C-5); 121,3 (d, C-6); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 76,8 (d, C-3); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6'); 56,3 (d, C-14); 55,5 (d, C-17); 50,7 (d, C- 9); 49,7 (d, C-24); 45,2 (s, C-13); 38,4 (t, C-4); 36,9 (t, C-12); 36,3 (t, C-1); 35,6 (s, C-10); 33,4 (d, C-20); 31,5 (t, C-22); 31,5 (d, C-8); 29,4 (t, C-16); 28,8 (t, C-23); 27,9 (t, C-2); 25,5 (t, C-25); 23,9 (t, C-15); 22,7 (t, C-28); 21,0 (t, C-11); 20,7 (d, C-27); 19,8 (q, C-19); 19,0 (q, C-26); 12,2 (q, C-29); 11, 9 (q, C-18). 3.2.2.4. Hợp chất axit lup-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic (COF18E3-C30H48O3) Hợp chất COF18E3 là chất rắn màu trắng vơ định hình, nhiệt độ nĩng chảy 2580C- 2590C, Rf x100 = 62, phân lập đƣợc từ dịch hexan của lá cà phê chè, các số liệu phổ IR, MS, proton (1H) và cacbon (13C) NMR (xem phần thực nghiệm). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 H ìn h 3 .1 : P h ổ F T - I R c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 H ìn h 3 .2 : P h ổ E S I – M S c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 H ìn h 3 .3 . P h ổ 1 H -N M R c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 H ìn h 3 .4 : P h ổ 1 3 C - N M R c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 H ìn h 3 .5 : P h ổ D E P T c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 H ìn h 3 .6 : P h ổ H S Q C c ủ a C O F 1 8 E 3 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Hình 3.7: Phổ HMBC của COF18E3 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Quan sát phổ FT-IR của COF18E3 (trang 56)cho thấy các vân phổ đặc trƣng cho các dao động hĩa trị của các liên kết sau: 3440,3 (OH); 2930,19- 2873,52 (C-H: metyl, metylen, metin); 1691,09 (C=O). Phổ ESI-MS của COF18E3 (trang 57) cho pic phân tử [M+] = 456,36 ([M + +H] = 457,36), ứng với cơng thức phân tử C30H48O3, điều này cũng phù hợp với số lƣợng nguyên tử cac bon quan sát từ phổ 13C-NMR (trang 59) của nĩ. Từ số liệu các phổ IR, MS, 1H, 13C, DEPT và phổ 2D NMR cĩ thể khẳng định COF18E3 là một triterpen thuộc khung lupan. Phổ 1H-NMR cho biết một vài độ dịch chuyển hĩa học đặc trƣng của các H gắn trên các C nhƣ: δH3 (3,15 ppm) là tín hiệu của H3 mà nguyên tử C3 liên kết trực tiếp với nguyên tử ơ-xi, δH12 (5,2 ppm) là tín hiệu của H12 mà nguyên tử C12 và C13 liên kết với nhau bằng liên kết đơi (liên kết olefin). Ngồi ra, phổ 1H-NMR cịn cho biết một số tín hiệu singlet của một số nhĩm metyl cĩ trong phân tử ở trƣờng cao (δH trong khoảng 0,7 -1,1 ppm). Phổ 13 C-NMR và DEPT (trang 60) cho biết phân tử COF18E3 cĩ 30 nguyên tử C, trong đĩ gồm 7 nhĩm metyl (CH3) ở các độ dịch chuyển hĩa học (ppm) δC23 = 28,2; δC24 = 17; δC25 = 17,1; δC26 = 21,2; δC27 = 15,5; δC29 = 15,7; δC30 = 23,5; 9 nhĩm metylen (CH2) ở các độ dịch chuyển hĩa học (ppm) δC1 = 38,8; δC2 = 27; δC6 = 18,4; δC7 = 33,1; δC11 = 23,4; δC15 = 28,1; δC16 = 30,8; δC21 = 24,3; δC22 = 36,9; 7 nhĩm metin (CH) ở các độ dịch chuyển hĩa học (ppm) δC3 = 79; δC5 = 55,3; δC9 = 47,7; δC12 = 125,6; δC18 = 52,9; δC19 = 39,2; δC20 = 39 và 7 các bon bậc 4 ở các độ dịch chuyển hĩa học (ppm) δC4 = 38,7; δC8 = 39,6; δC10 = 37,1; δC13 = 38,3; δC14 = 42,2; δC17 = 47,9; δC28 = 180,7. Phân tích phổ HSQC (trang 61) của COF18E3 cĩ thể xác định đƣợc từng độ dịch chuyển hĩa học của các nguyên tử các bon và các nguyên tử H tƣơng ứng (xem phần thực nghiệm). Quan sát và phân tích phổ HMBC (trang 62), cho phép xác định đƣợc các tƣơng tác xa dị hạt nhân (qua 2 hay nhiều liên kết) trong bảng dƣới đây. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Bảng 3.2: Bảng tƣơng tác xa C H(HMBC) của COF.18E3 STT Tƣơng tác xa C → H (HMBC) STT Tƣơng tác xa C → H (HMBC) C1 H2 C16 H15 C2 H1, H3 C17 H18, H22 C3 H2, H23, H24 C18 H19 C4 H3, H23, H24 C19 H21, H20 C5 H6, H23, H24 C20 H19, H30,H29 C6 H5, H7 C21 H19, H22 C7 H6 C22 H21 C8 H9, H7 C23 H5, H3 C9 H11, H26 C24 H5, H3 C10 H1, H9, H25 C25 H1, H9 C11 H9, H12 C26 H9, H7 C12 H11 C27 H15 C13 H12, H18 C28 H22, H216 C14 H15, H27 C29 H20 C15 H16 C30 H20 Qua phân tích các số liệu phổ IR, ESI-MS và 1D, 2D NMR của hợp chất COF18E3 nhƣ trên và so sánh với các số liệu phổ 13C-NMR của các hợp chất khung lupan tƣơng tự [25] cĩ thể khẳng định nĩ là một triterpen khung lupan và tên của nĩ là axit lup-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic (C30H48O3), đây là hợp chất mới lần đầu tiên phân lập đƣợc từ cây Coffea arabica với cấu trúc hĩa học nhƣ sau. Axit lup-3-ol-12(13)-en-28-oic COOH HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 3.2.2.6. Hợp chất cafein (COF.Anc - C8H10N4O2) 1 H-NMR: 500MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung mơi CDCl3: H8 (s, 7,53); H10 (s, 3,4); H11 (s, 3,58); H12 (s, 4,0). 13 C-NMR: 125 MHz, δ (ppm), nội chuẩn TMS, dung mơi CDCl3: C2 (s, 151,8); C4 (s, 148,8); C5 (s, 107,7); C6 (s, 155,5); C8 (d, 141,4); C10 (q, 27,9); C11 (q, 29,8); C12 (q, 33,6). Phổ 1H-NMR cho biết phân tử COF.Anc cĩ 4 loại H xuất hiện ở các độ dịch chuyển hĩa học 3,4; 3,58; 4,0 và 7,53 ppm. Theo tính tốn tích phân cho biết trong phân tử cĩ 10 nguyên tử H. Phân tích phổ 13C-NMR thấy rằng phân tử nay cĩ 8 cacbon ở các độ dịch chuyển hĩa học 151,8; 148,8; 107,7; 155,5; 141,4; 33,6; 29,8; và 27,9 ppm. Các phổ 13C-NMR, DEPT và HSQC cho biết trong phân tử cĩ 3 nhĩm metyl (CH3) ở các độ dịch chuyển hĩa học 33,6; 29,8; và 27,9 ppm, 1 nhĩm metin (CH) ở độ dịch chuyển hĩa học 141,4 ppm và 4 cacbon bậc 4 ở các độ dịch chuyển hĩa học 151,8; 148,8; 107,7; 155,5. Quan sát phổ HMBC của COF.Anc cho thấy các tƣơng tác xa nhƣ bảng sau. Bảng 3.3: Bảng tƣơng tác xa C H(HMBC) của COF.Anc STT Tƣơng tác xa C → H (HMBC) STT Tƣơng tác xa C → H (HMBC) C2 H10, H11 C8 H11 C4 H8 C10 - C5 H8, H11 C11 - C6 H10 C12 - Qua phân tích các số liệu phổ 1D và 2D-NMR của chất COF.Anc và so sánh các số liệu phổ chất chuẩn cafein cĩ thể khẳng định hợp chất COF.Anc chúng tơi phân lập đƣợc từ dịch chiết EtOAc của lá cây cà phê chè là cafein với cấu trúc hĩa học nhƣ sau: Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 O N N N N O 1 2 3 4 56 7 8 9 10 11 12 Cafein 3.3. VỀ HOẠT TÍNH BÀI SỎI THẬN CỦA LÁ CÀ PHÊ CHÈ Để thử hoạt tính bài sỏi thận của lá cây cà phê chè, chúng tơi đã thực hiện theo phƣơng pháp Đơng Y kết hợp với việc kiểm tra bằng phƣơng pháp siêu âm cho 5 bệnh nhân sỏi thận đã đƣợc điều trị bằng thuốc kim tiền thảo mà khơng cĩ kết quả tích cực. Cả 5 bệnh nhân sỏi thận đƣợc sử dụng bài thuốc độc vị lá cà phê chè trong thời gian 25 - 30 ngày cho kết quả rất tốt (các bệnh nhân sỏi thận đƣợc kiểm tra kích cỡ trƣớc, trong và sau khi sử dụng thuốc). Tất cả các bệnh nhân đều khỏi bệnh sau khi điều trị. Kết quả siêu âm cho thấy bệnh nhân đều hết sỏi và trở lại trạng thái bình thƣờng. Các kết quả về hoạt tính bài sỏi thậncủa lá cây cà phê chè xem phần phụ lục. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 KẾT LUẬN 1. Lần đầu tiên lá cây cà phê chè trồng ở Việt Nam đƣợc sàng lọc hố thực vật cho biết trong lá cây cà phê chè cĩ các lớp chất sau: ancol mạch dài (chất béo), phytosterol, ancaloit, glycosit, triterpen . 2. Các dịch cĩ n-hexan, EtOAc và MeOH của lá cà phê chè khơng cĩ tác dụng kháng các vi sinh vật đã thử gồm: - Vi khuẩn Gr (-) - Vi khuẩn Gr (+) - Nấm men 3. Từ lá cây cà phê chè đã phân lập đƣợc 6 chất sạch gồm: Ancol mạch dài (hexatriacontanol), -sitosterol,, Stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol, 3β-Sitosteryl-1-O- β-D-glucopyranosit, axit lup-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic và cafein. 4. Triterpen (axit lup-3β-hydroxi-12(13)-en-28-oic) là một chất lần đầu tiên phân lập đƣợc từ lá cà phê chè. Bằng các phƣơng pháp phổ hiện đại (IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, 1D và 2D) cấu trúc hố học của nĩ đã đƣợc chứng minh. 5. Hoạt tính bài sỏi thận của lá cây cà phê chè đã đƣợc khẳng định bằng phƣơng pháp Đơng Y thực nghiệm và kiểm tra bằng phƣơng pháp siêu âm cho kết quả tốt. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN Báo cáo hội nghị khoa học cơng nghệ sinh học tồn quốc năm 2009: „„VỀ THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA LÁ CÀ PHÊ CHÈ (COFFEA ARABICA)’’ Nguyễn Quyết Tiến1, Phạm Thị Hồng Minh1, Nguyễn Quốc Nam Hải2 1. Viện Hĩa học, Viện KH và Cơng nghệ Việt Nam, 18-Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội 2. Đại học Thái Nguyên, Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên, thành phố Thái Nguyên Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt 1 Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, tr. 155, 1999. 2 Phan Đình Châu, Hố Dƣợc và Kĩ Thuật Tổng Hợp I, tr. 244- 245,186-187, 2006. 3 Phạm Hồng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, quyển III, NXB trẻ, tr. 175- 176, 2003 4 Phạm Hữu Điển, Nguyễn Quyết Tiến, Giáo trình Hố Dƣợc. NXB ĐHSP 2008. 5 1900 lồi cây cĩ ích ở Việt Nam, NXB thế giới, Hà Nội, (9/1993). 6 Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề, Giáo trình cây nơng nghiệp, tr.168- 169, 2001 7 Nguyễn Văn Đàn (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, NXB Y- Dƣợc, Tp. Hồ Chí Minh. B. Tiếng nƣớc ngồi 8 Schlee, D. et al.,biosynth, Phytochemistry, 1963, 2, 231-236 . 9 Weckerle, B. et al., coffee constits, Phytochemistry, 2002, 60, 409-414. 10 Hasan, C.M. et al., Nat. Prod. Lett., 1994, 5, 55 (isol, pmr, cmr) 11 Weinberg, B.A. et al., The World of Caffeine, Routledge, 2001 (book) 12 Gremaud, G. et al., Phytochemistry, 1996, 42, 1547 (isol) 13 Folstar, P. et al., J. Agric., coffee amides, hplc, Food Chem, 1979, 27, 12-15 14 Nishida, R. et al., Experientia, 1987, 43, 342-344 (5-Hydroxy-N- methyltryptamine) Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 15 Wanner, H. et al., Phytochemistry, 1975, 14, 747-750 (isol, synth, uv, ms) 16 Zheng, X.-Q. et al., Phytochemistry, 2002, 60, 129-134 (isol, bibl) 17 Ducruix, A. et al., Chem. Comm., 1975, 396 (Mascaroside) 18 Prewo, R. et al., Phytochemistry, 1990, 29, 990 (cryst struct, Mozambiosi_ de) 19 Murata, M. et al., Biosci., Biotechnol., Biochem., 1995, 59, 1887 (cinnamoyltryptophans) 20 Natural products Dictionary CD-ROM 2007 21 Végh Anital- Szász Gyưrgy- Takács Mihály, Gyĩgyszerészi kémia, Franklin nyomda, Budapest, 1977. 22 Tưke Lászlĩ, Szeghy Lajos, Fejzetek a gyĩgyszerkémiábĩl, Tankưnyvkiadĩ, Budapest, 2002. 23 Pual Pual Cos, Louis Maes, Jean - BoscoSindambiwe, Arnold J.Vlietinck, Dirk Vanden Berghe,” Bioassay for antibacterial and antifungal activities”, Laboratory for Microbiology, Pasitology and Hygien, Faculty of Pharmaceutical, Biomedical and Veterinary Sciences, University of Antwerp Belgium, tr. 1-13, 2005. 24 Franz Hadacek, Harald Greger “ Testing of Antifungal Natural Products: Methodologies, Comparability of Results and Assay Choice”, Phytochemical analyis, tr. 137-147, 2000. 25 Shashi B., Mahato and Asish P. Kundu; 13 C-NMR spectra of pentacyclic triterpenoids - a compilation and some salient features; Phytochemistry, Vol.39, No.6, pp. 1517-1575; 1994 26 Arnoln Weiss Berger and Edward C. Taylor, Indoles Parts 1, 2, The chemistry of Heterocyclic compounds, John Wiley and Sons. Inc, New York, London, Sydney, Toronto, 1972. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 C. Trang Web 27 &sid=344 28 VanS_ /SoiThan.htm 29 BA%A_ dn 30 uong_ /soithan.html 31 YHCT/Chua-soi-than-bang-Dong-y/60/20085209275869.htm 32 33 34 35 36 37 38 - Wiki Cà phê chè.htm 39 40 41 24h.htm 42 43 NƠNG HỌC.htm 44 dap ve ca phe-Rubiaceae 45 http:// www.diendan.bacgiangview.com/showthread.php?t=401 46 47 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 PHỤ LỤC 1. Ancol mạch dài (hexatriacontanol) COF.4C 1.1. Phổ 1H - NMR của COF.E4C ...................................................... 69 1.2. Phổ 13C-NMR của COF.E4C ....................................................... 70 1.3. Phổ DEPT của COF.E4C ............................................................. 71 2. Các hợp chất sterol 2.1. -Sitosterol 2.1.1.Phổ hồng ngoại FT-IR ............................................................... 72 2.1.2. Phổ khối lƣợng EI-MS .............................................................. 73 2.1.3. Phổ 1H-NMR ........................................................................... 74 2.1.4. Phổ 13C-NMR.......................................................................... 75 2.2. Stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol 2.2.1. Phổ hồng ngoại FT-IR .............................................................. 76 2.2.2. Phổ khối lƣợng EI-MS .............................................................. 77 2.2.3. Phổ 1H-NMR ............................................................................ 78 2.2.4. Phổ 13C-NMR ........................................................................... 79 2.3. 3β-Sitosteryl-1-O-β-D-glucopyranosit 2.3.1. Phổ 1H-NMR ............................................................................ 80 2.3.2. Phổ 13C-NMR và DEPT ............................................................ 81 3. Hợp chất caffein COFE.4C 3.3.1. Phổ 1H-NMR ............................................................................ 82 3.3.2. Phổ 13C-NMR .......................................................................... 83 3.3.3. Phổ DEPT ................................................................................ 84 3.3.4. Phổ HSQC ................................................................................ 85 3.3.5. Phổ HMBC .............................................................................. 86 4. Kết quả thử hoạt tính chữa sỏi thận của chị Tùng ..................... 87 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 P h ổ 1 H -N M R c ủ a C O F E 4 C Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 P h ổ 1 3 C – N M R c ủ a C O F E 4 C Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 P h ổ D E P T c ủ a C O F 4 E C Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 P h ổ 1 H -N M R c ủ a C O F .A n c Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 P h ổ 1 3 C – N M R c ủ a C O F .A n c Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 P h ổ D E P T c ủ a C O F .A n c Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 Phổ HMBC của COF.Anc Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 88 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 89