Luận văn Nghiên cứu thành phần hóa học của cây bán hạ ba thùy (typhonium trilobatum, araceae)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------------------------------- NGUYỄN KHẮC HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BÁN HẠ BA THÙY (TYPHONIUM TRILOBATUM, ARACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -------------------------------------- NGUYỄN KHẮC HỒNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY BÁN HẠ BA THÙY (TYPHONIUM TRILOBATUM, ARACEAE) CHUYÊN NGÀNH : HOÁ HỌC HỮU CƠ MÃ SỐ : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN QUYẾT TIẾN THÁI NGUYÊN - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lời cảm ơn Bản luận văn này được hoàn thành tại phòng Hoạt chất Sinh học, Viện Hóa học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Tôi xin chân thành bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc của mình tới TS. Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị Hồng Minh, PGS.TS. Phạm Hoàng Ngọc, PGS.TS. Phạm Văn Thỉnh, những người thầy đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ từng bước đi của tôi trong quá trình nghiên cứu thực hiện luận văn. Xin chân thành cảm ơn Phòng Hoạt chất Sinh học, Phòng Nghiên cứu Cấu trúc -Viện Hóa học đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành các kế hoạch nghiên cứu. Nhân dịp này, tôi cũng xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Khoa Hóa, Khoa Sau đại học –Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, Ban Giám hiệu Trường Cao đẳng Y Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành bản luận văn này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Bố, Mẹ tôi, những người thân trong gia đình và các đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi rất nhiều trong quá trình thực hiện luận văn. Thái Nguyên, tháng 10 năm 2008 Tác giả Nguyễn Khắc Hồng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang Lời cam đoan Lời cảm ơn Danh mục chữ viết tắt dùng trong luận văn Danh mục các hình, bảng và sơ đồ Mở đầu 1 Chương 1 Tổng quan 3 1.1. Khái quát về họ Ráy (Araceae) 3 1.2. Các hợp chất và hoạt tính sinh học của chúng có trong họ Ráy (Araceae) 3 1.2.1. Các axit béo 3 1.2.2. Các hợp chất neolignan 3 1.2.3. Các hợp chất terpenoit 6 1.2.4. Các hợp chất chứa nitơ 8 1.2.4.1. Các hợp chất ancaloit 8 1.2.4.2. Các Cerebrozit 1.2.4.2.1. Giới thiệu chung 1.2.4.2.2. Các Cerebrozit trong họ ráy 11 11 12 1.2.4.3. Các hợp chất chứa nitơ khác 13 1.2.5. Các hợp chất glycozit 14 1.2.6. Các hợp trong chi Typhonium 15 1.3. Phổ 13C – NMR trong nghiên cứu cấu trúc và thành phần của lipit (axit béo và este của nó) 16 1.3.1. Giới thiệu chung 16 1.3.2. Ankanoic axit và este 17 1.3.3. Các axit béo monoenoic và este 19 1.3.4. Các axit béo polyenoic và este 22 1.3.5. Các axit béo không no và este khác 25 1.3.6. Các axit xyclopropen và este 26 1.3.7. Các axit béo bị oxi hóa và este 27 1.3.8. Những nguyên tử C1 3 trong các gốc acyl và ankyl 28 1.3.9. Glycerol este 29 Chương 2. Phần thực nghiệm 32 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 33 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu 33 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết 34 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 34 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất 34 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu 35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 34 2.3. Các dịch chiết từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 36 2.4. Phân lập và tinh chế các chất từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 37 2.4.1. Dịch chiết n-hexan (RTtH) 37 2.4.1.1. Các axit béo (RTtH1-RTtH5) 37 2.4.1.2. Stigmast-5,22-dien-3- -ol (RTtH6) 38 2.4.1.3. -Sitosterol (RTtH7) 39 2.4.2. Dịch chiết etylaxetat (RTtE) 39 2.4.2.1. Hợp chất terpen-glucozit (RTtE1) 40 2.4.2.2. 3-O- -D-glucopyranosyl-stigmasterol (RTtE2) 40 2.4.2.3. Typhotrilozit A (RTtE3) 41 Chương 3. Thảo luận kết quả nghiên cứu 44 3.1. Nguyên tắc chung 44 3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 44 3.2.1. Axit cacboxylic 45 3.2.2. Các hợp chất sterol 45 3.2.2.1. Stigmast-5,22-dien-24R-3 -ol (RTtH6) 45 3.2.2.2. -sitosterol hay 24R-stigmast-5-en-3- -ol (RTtH7) 47 3.2.2.3. 3-O- -D-glucopyranosyl-stigmasterol (RTtE2) 47 3.2.3. Hợp chất terpen-glucozit (RTtE1) 48 3.2.3. Hợp chất typhotrilozit A (RTtE3) 48 Kết luận 60 Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận văn 61 Tài liệu tham khảo 62 Phụ lục 68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN Các phương pháp sắc ký CC : Column Chromatography TLC : Thin-layer Chromatography SKLM : Sắc ký lớp mỏng Các phương pháp phổ CAD : Collisional Activated Dissociation MS : Mass Spectroscopy EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy ESI-MS : Electron Spray Ionization Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation Các lĩnh vực khác MIC : Minimum inhibitory concentration HIV : Human Immunodeficiency Virus đvC : Đơn vị Cacbon v/v : Thể tích/thể tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH , BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Trang Hình 1.1 Phổ 13C-NMR phân giải cao của dầu béo hoa rượu Rum (Safflower) 16 Hình 2.1 Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 32 Hình 2.2 Hoa, thân , rễ và củ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 33 Hình 3.1 Phổ FT-IR của typhotrilozit A (RTtE3 ) 51 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của typhotrilozit A (RTtE3 ) 52 Hình 3.3 Phổ 13C-DEPT của typhotrilozit A (RTtE3 ) 53 Hình 3.4 Phổ 1H-1H-cosy của typhotrilozit A (RTtE3 ) 54 Hình 3.5 Phổ HSQC của typhotrilozit A (RTtE3 ) 55 Hình 3.6 Phổ HMBC của typhotrilozit A (RTtE3 ) 56 Bảng 1.1 Độ dịch chuyển hóa học ( , ppm) của các nguyên tử C1 -6 và 1-4 của axit palmitic, metyl và glycerol este của nó 18 Bảng 1.2 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C trong glyceroleste của các axit ancanoic C4, C6, và C8 (trong chuỗi và ) 19 Bảng 1.3 Sự chênh lệch về độ dịch chuyển hóa học ( ppm) giữa 2 nguyên tử C olefinic trong các chuỗi , - glycerol este, cis- 2- 11 20 Bảng 1.4 Sự chênh lệch về độ dịch chuyển hóa học ( ppm) giữa 2 nguyên tử C olefinic trong các chuỗi , - glycerol este, cis- 2- 11 20 Bảng 1.5 Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) từ phổ 13C-NMR của dầu hạt Càrốt 22 Bảng 1.6 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C trong phổ 13C-NMR của polyenoat este n -3, n-6 và 6 23 Bảng 1.7 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C 1-3 của một vài axit và este 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 1.8 Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) và cường độ tín hiệu từ phổ 13C-NMR của dầu thực vật BorageMột vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) và cường độ tín hiệu từ phổ 13 C-NMR của dầu thực vật Borage 24 Bảng 1.9 Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C từ phổ 13C-NMR của sterculic và malvanic este 27 Bảng 1.10 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1-3 trong phổ 13CNMR của một số lớp chất mạch dài 29 Bảng 1.11 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1 -3 từ phổ 13C-NMR của hỗn hợp axít palmitic, metyloleat và glycerol trioleat 29 Bảng 1.12 Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C -glycerol trong phổ 13C-NMR của các acylglycerol 30 Bảng 2.1 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 36 Bảng 2.2 Các axit béo trong dịch n-hexan của cây Bán hạ ba thùy 38 Bảng 3.1 Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của một số phytosterol trong cây Bán hạ ba thùy 46 Bảng 3.2 Độ dịch chuyển hóa học của Typhotrilozit A (CD3OD/CDCl3) 59 Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu 37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Nước ta có diện tích khoảng 330.000 km2, nằm ở trung tâm Đông Nam Á và trải dài trên 15 độ vĩ (khoảng 1650 km). Đồi núi chiếm 3/4 diện tích trong đó núi cao trên 500 m chiếm khoảng 1/3 diện tích lãnh thổ. Khí hậu nhiệt đới, gió mùa có 2 mùa rõ rệt thay đổi theo địa hình. Nhiệt độ trung bình hàng năm trên 22 0 C, lượng mưa trung bình hàng năm vào khoảng 1200-2800 mm, độ ẩm tương đối cao (trên 80%) [4]. Những đặc thù về khí hậu thiên nhiên như vậy đã làm cho nước ta có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng. Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian [1], [3], [4], [5], [6]. Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hàng ngày của con người. Ngày nay những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp cũng như nông nghiệp, chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v... Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều, song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y. Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dược phẩm được dùng chữa bệnh hiện nay, hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên nhiên [54]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Vì vậy, nguồn cây thuốc dân gian cũng như vốn sử dụng phong phú của đồng bào các dân tộc vẫn là kho tàng quí giá để khám phá, tìm kiếm nhiều loại thuốc mới có hiệu lực cao cho công tác phòng và chữa bệnh, kể cả những bệnh nan y của thời đại như là ung thư, HIV/AIDS v.v... Có thể nêu một số ví dụ như là vinblastin, vincristin chữa bệnh ung thư máu là những hoạt chất được chiết xuất từ cây dừa cạn (Catharanthus roseus họ Apocynaceae); Taxoter - thuốc chữa ung thư vú là sản phẩm chuyển hoá của một số diterpenoit chiết xuất từ một số loài Taxus họ Pinaceae. Và gần đây nhất là cây Xạ đen (Celastrus hindsic Benth., họ Celastraceae) có ở vùng Hoà Bình, miền Bắc Việt Nam được dùng làm thuốc hỗ trợ điều trị ung thư. Chế phẩm CADEF - là một tổ hợp của hàng chục loại dược liệu được dùng để hạn chế và hỗ trợ điều trị ung thư .v.v... là một số ví dụ trong việc khai thác và sử dụng kho tàng cây thuốc dân gian. Theo hướng nghiên cứu nói trên, cây Bán hạ ba thùy có tên khoa học là Typhonium trilobatum được y học cổ truyền Việt Nam sử dụng trị nhiều chứng bệnh [3], [6]. Cây Bán hạ ba thùy là một trong những vị thuốc được xếp trong nhóm thuốc ôn hoá hàn đờm. Theo Hải Thượng Lãn Ông và Tuệ Tĩnh thì vị thuốc này là vị chủ chốt để chữa các chứng bệnh do đờm hàn gây ra [7], [8]. Mặc dù vậy, cho đến nay có ít công trình khoa học nghiên cứu về loài thực vật này. Với mục đích nghiên cứu và tìm hiểu thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của cây Bán hạ ba thùy, góp phần làm tăng thêm sự hiểu biết về nguồn thực vật làm thuốc phong phú và quý giá của Việt Nam. Với những căn cứ nói trên, cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) được chọn làm đối tượng nghiên cứu cho công trình nghiên cứu này, tên đề tài là: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bán hạ ba thùy” với mục đích xác định thành phần, bản chất hoá học của các chất có trong cây Bán hạ ba thùy. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Khái quát về họ Ráy (Araceae) Họ Ráy (Araceae) gồm những loài thực vật thân thảo, ở Việt Nam có khoảng 30 chi và trên 100 loài [1], nhưng nói chung họ Ráy ít được nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật hơn so với các họ thực vật khác kể cả trong và ngoài nước. Trong họ Ráy người ta đã tìm thấy một số hợp chất, chúng là những axít béo, tecpenoit, anc aloit, cerebrozit và glucozit v.v...[23]. 1.2. Các hợp chất và hoạt tính sinh học của chúng có trong họ Ráy (Araceae) 1.2.1. Các axit béo Trong tự nhiên, các axit béo đóng vai trò hết sức quan trọng, chúng là nguồn cung cấp dinh dưỡng không thể thiếu cho cơ thể, đặc biệt cần thiết cho sự phát triển của trẻ nhỏ. Trong cây Ráy (Alocasia macrorrhiza), người ta đã phân lập được các axit béo palmatic (2.1), linoleic (2.2), oleic (2.3) và một số glycerit của chúng [10]. OH O 1 16 2.1 Axit palmatic OH O 1 18 9 12 2.2 Axit linoleic OH O 1 18 9 2.3 Axit oleic 1.2.2. Các hợp chất neolignan Neolignan là các hợp chất thuộc nhóm lignan, tồn tại phổ biến trong tự nhiên. Lignan là các hợp chất được tạo bởi 2 đơn vị phenylpropanoit (C6-C3) hợp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 thành thông qua liên kết C-8 C-8’. Các hợp chất bis-arylpropanoit trong tự nhiên có liên kết hợp thành, khác với C-8 C-8’ là các hợp chất neolignan [10], [11], [24], [56], [57]. Chi Arum chưa có tài liệu nào khẳng định có ở Việt Nam. Các nhà khoa học Ý đã phân lập từ loài Arum italiacum (Araceae) được một số hợp chất neolignan (2.4a,b) [17-23]. 2.4a,b 2.4a: 1-(4-hidroxy-3-methoxy-phenyl)-2-[3-(3-hidroxy-1-propenyl)-5-methoxy- phenoxy]-1,3-propanediol 2.4b: 1-(5-hidroxy-3-methoxy-phenyl)-2-[3-(3-hidroxy-1-propenyl)-5-methoxy- phenoxy]-1,3-propanediol . 2.5 Dehydrodiconiferyl ancol Ngoài hai neolignan trên Della Greca và các cộng sự còn phân lập được thêm một hợp chất neolignan khác (2.5) [21], [22]. Cả 3 hợp chất thu được từ loài Arum italiacum đều chưa có kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chúng. O CH2OH HOH2C OCH3 OH OH 4' 3' 7' 8' 9' 5 9 O H3CO OH OH OCH3 OH HO 4 5 1 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 2.6a Polysyphorin 2.6b Rhaphidecursinol A Chi Rhaphidophora (Araceae) ở Việt Nam có khoảng 11 loài [5]. Chúng là những thực vật thân thảo. Cây Ráy leo lá rách (Rhaphidophora decursiva) được phân bố khắp các tỉnh miền núi nước ta từ Lào Cai, Yên Bái,... đến Ninh Thuận, Bình Thuận. Trong Y học dân gian người ta đã dùng nó để chữa một số bệnh như: giảm đau, cầm máu, tiêu thũng, thanh nhiệt giải độc, chống ho, trừ thấp, chống viêm nhiễm [6]. Từ loài này, mới đây người ta đã phân lập được 3 neolignan (2.6a-c), 2 dẫn xuất của tetrahydrofuran (2.8a,b) và một hợp chất benzoperoxit (2.7). Tất cả những hợp chất thu được từ loài Rhaphidophora decursiva có hoạt tính chống sốt rét rất tốt và cao hơn nhiều lần so với các hợp chất chống sốt rét đã quen biết như chloroquine, quinine, artemisinin [32]. 2.6c Rhaphidecursinol B 2.7 Rhaphidecurperoxin O OCH3 OCH3 H3CO OCH3H3CO HO CH3 O OCH3 OCH3 H3CO OCH3H3CO OH O OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 HO CH3 O O OH OCH3 O Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 H3CO H3CO O OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 H3CO H3CO O OCH3 OCH3 OCH3 OCH3 2.8a Grandisin 2.8b Epigrandisin Từ loài Acorus calamus, 2 neolignan (2.9 và 2.10) cũng đã được phân lập [23], [44]. 2.9 Diasaron 2.10 1,2-dimethyl-3,4-bis(2,4,5- trimetoxyphenyl)c.butan 1.2.3. Các hợp chất tecpenoit Từ loài Xanthosoma robustum (Araceae) 2 hợp chất tecpenoit khung norlanostan (2.11a,b) đã được phân lập [23], [35]. HO O HO O HO HO 33 8 8 23 25 252 4 2.11a 29-Norlanosta-8,23-dien-3,25- diol-(3- ,23E),25-hydroperoxit 2.11b 29-Norlanosta-8,25-dien-3,24- diol-(3- ,24 ),24-hydroperoxit. OMe MeO OMe OMe OMe MeO OMeMeO OMeMeO MeO MeO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 Những hợp chất hydroperoxysterol này có hoạt tính kháng khuẩn cao đối với các chủng E. coli, Bacillus subtilis và Micrococcus luteus. Từ loài Acorus calamus người ta đã thu được một tinh dầu chứa thành phần chủ yếu là các hợp chất khung acoran thuộc nhóm chất tecpenoit (sesquitecpenoit). Dưới đây là một vài thành phần chính của tinh dầu [23], [50], [53]. O O 1 23 7 8 O O 1 23 7 8 2.12 3,8-Acorandion 2.13 4-Acoren-3,8-dion 2.14 4-Acoren-3-on 2.15 Axit acoric Từ thân rễ cây Thiên niên kiện (Homalomena occulta) ở Việt Nam [3], người ta đã lấy được tinh dầu màu vàng nhạt, có mùi thơm dễ chịu mà thành phần chính trong tinh dầu là các tecpenoit và l-linalol đạt tới 40%. 2.16 6,10-Epoxy-7,10-isodaucandiol 2.17 6,10-Epoxy-7-isodaucanol O 1 3 4 7 O OH O O O HO HO 1 4 5 6 7 10 O HO 1 4 5 67 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 2.18 1,4,7-Eudesmantriol 2.19 7(11)-Oppositen- 1,4-diol 2.20. 11- Oppositen-1,4- diol Ngoài ra còn một số thành phần khác như: terpineol, linalyl axetat, limonen, -terpinen v.v....Theo tài liệu [55], thì trong loài Homalomena aromatica người ta cũng phân lập được một số sesquitecpenoit. Trong loài Colocasia esculenta có chứa 2 hợp chất tecpenoit (2.21, 2.22) [23]. 2.21 14-Metylcholesta-9(11),24-dien- 3,7-diol 2.22 14-Metylergosta-9(11),24-dien- 3,7-diol Từ loài Pistia stratiotes một số hợp chất khung steran cũng đã được phát hiện như: 11-Hydroxystigmast-22-en-3,6-dion (5 ,11 ,22E,24S) và 11- Hydroxystigmast-22-en-3,6-dion (5 ,11 ,22E,24R) [23]. 1.2.4. Các hợp chất chứa nitơ 1.2.4.1. Các ancaloit Chi Arisarum không thấy tài liệu nào xác nhận là có mặt ở Việt Nam. Trong chi này cũng chỉ có một loài Arisarum vulgare (Araceae) được người ta nghiên cứu OH OH HO 1 4 57 HO OH 1 4 5 6 7 11 10 HO OH 1 4 6 7 10 11 HO OH 3 7 9 11 24 14 HO OH 3 7 9 11 14 24 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 sàng lọc hoá thực vật, và đã phân lập được một số ancaloit dẫn xuất của pyperidin (2.23) và pyrrolidin (2.24) [39],[40], [41], [46], [47]. 2.23 2.23a R = H Irnigaine [3-Hidroxy-2-methyl-6-(9-phenylnonyl)pyperidin] 2.23b R=CH3 N-Methyl-Irnigaine [3-Hidroxy-1,2-dimetyl-6-(9- phenylnonyl ) pyperidin] Các hợp chất 2.23a và 2.23b là những chất lỏng dạng dầu và độc đối với ấu trùng tôm nước mặn, có hoạt tính kháng khuẩn Gram(+) và kháng một số chủng nấm filamentous. 2.24 2.24a R = H Irniine [1-Methyl-2-(9-phenylnonyl)- pyrrolidin] 2.24b R = CH3O Irnidine [2-(9-(2-metoxyphenyl)nonyl)-1-methyl-pyrrolidin] Hai hợp chất ancaloit 2.24a và 2.24b trong loài Arisarum vulgare này cũng đều là những chất lỏng dạng dầu. Chúng đều có hoạt tính kháng khuẩn Gram(-) và hoạt tính chống nấm [39], [40]. Từ loài Arum maculatum người ta đã phân lập được một ancaloit khung pyperidin khác (2.25a), [23]. NH 2.25a 2-Propylpiperidine; (S) N R OH 2 3 6 R N H3C 1 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Trong loài Caladium maculatum người ta cũng đã phát hiện một dẫn xuất của pyperidin nữa ở dạng dầu (2.25b), [23]. N CH3 2.25b 2-Propyl-N-metylpiperidine (S). Chi Pinellia (Araceae) không thấy có ở Việt Nam. Từ loài P. pedatisecta các nhà khoa học Trung Quốc đã thu được một số ancaloit (2.26, 2.27, 2.28, và 2.29a-b) [43], [48], [49]. NH N O O 2.26 Hexahydropyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dion. 2.27 Pedatisectin A 2.28 Pedatisectin C 2.29a Pedatisectin D 2.29b Pedatisectin E H N N O O O H N N N N NH2 N OH N N OH N N OH OH OH OH OH OH Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Các hợp chất ancaloit trên chưa có các số liệu về hoạt tính sinh học của chúng. 2.30a Lysicamin 2.30b Liriodenin Người ta cũng đã phân lập được một số hợp chất trong các chi khác thuộc họ Ráy như từ chi Lysichiton (Araceae) hợp chất ancaloit lysicamin và liriodenin có công thức cấu tạo 2.30a và 2.30b đã được phân lập [23]. 1.2.4.2. Các cerebrozit 1.2.4.2.1. Giới thiệu chung Cerebrozit là một lớp chất của glycosphingolipit, chúng là thành phần rất quan trọng của rất nhiều loại mô và các cơ quan trong các hệ thống sinh học. Về mặt hóa học các cerebrozit được tạo thành bởi một phần đường hexoza và một phần ceramit. Phần ceramit thường chứa một amino ancol mạnh dài được gọi là bazơ sphingoit (sphingosine hay sphingol) được gắn với một axít béo mạch dài bằng liên kết amit. Các cerebrozit được phân loại như sau: Glucocerebrozit Galactocerebrozit zwiterionic glycosphingolipit Các cerebrozit tự nhiên đầu tiên được Thudichum phân lập từ tế bào não năm 1874 và được Carter và cộng sự xác định cấu trúc hóa học năm 1950. Sau đó, Shapiro và Flowers cùng tổng hợp toàn phần được các cerebrozit này năm 1961. Hsu và Turk đã đưa ra tính chất cấu trúc hóa học của các cerebrozit bằng phương pháp va chạm hoạt hóa phân ly (Collisional Activated Dissociation-CAD) và phương pháp khối phổ nối tiếp, ion hóa bằng bụi electoron (ESI). N O O CH3 O CH3 N O O O Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Về mặt sinh học, một vài cerebrozit đóng vai trò cấu trúc hỗ trợ, các yếu tố quan trọng của màng tế bào và hoạt động như các chất truyền dẫn các sự kiện sinh học ví dụ như: hoạt hóa, dính kết các tế bào, sự truyền tin nội bào và đóng góp vào sự phát triển của tế bào phần lớn thông qua sự gắn kết của chúng vào protein. Hơn thế nữa, các cerebrozit còn đóng vai trò quan trọng trong màng tế bào chúng như là bề mặt tế bào cho các kháng nguyên và các thụ thể. Trong thực tế, các cerebrozit có chức năng sinh học rất rộng liên quan đến tính lưỡng tính của phân tử ví dụ như: đối với hệ số phát triển thần kinh (NGF-Nerve Growth Factor) các phân tử sinh học lớn là nhân tố có tính quyết định nhất đến sự điều chỉnh phát triển, sự khác biệt và sự tồn tại của nơ-ron thần kinh. Ngoài ra, các cerebrozit còn được dùng để điều trị bệnh mất trí nhớ (Alzheimer) và một số bệnh khác [51], [56]. 1.2.4.2.2. Các cerebrozit trong họ Ráy Trong họ Ráy (Araceae), người ta cũng đã phát hiện thấy các hợp chất cerebrozit có trong một số loài như loài Typhonium giganteum có chứa các hợp chất typhonizit (3.28a,b) [57]. NH OH O 19 8 OH O H HO H HO H H OHH O OH OH NH OH O 19 8 OH O H HO H HO H H OHH O OH 3.28a 3.28b O H HO H HO H H OHH O OH NH OH O 23 4 OH NH OH O 23 n OH HO OH 3.29a n=9 3.29b n=11 3.29c Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Còn trong loài Alocasia macrohirrza, người ta cũng đã phân lập được các cerebrozit (alocerebrozit A-C) 3.29a-c, chúng đều có hoạt tính kháng khuẩn Gram(-/+) [10]. Trong cây Bán hạ Trung Quốc (Typhonium giganteum), người ta cũng đã tìm thấy hợp chất cerebrozit 3.30, còn từ cây Arisaema amurense các nhà khoa học cũng đã phân lập được 4 cerebrozit mới (3.31a-d) [51]. NH OH O 13 8 OH O H HO H HO H H OHH O OH 3.30 NH OH O m 8 OH O H HO H HO H H OHH O OH NH OH O m 8 OH O H HO H HO H H OHH O OH 3.31a m=15, 3.31b m=17 3.31c m=15, 3.31d m=17 Trong loài Bán hạ Việt Nam (Typhonium blumei) người ta đã phân lập được một cerebrozit nhưng chưa xác định được cấu trúc. [2] 1.2.4.3. Các hợp chất chứa ni-tơ khác Một hợp chất amit (2.31) cũng được phát hiện có trong loài Acorus tatarinowii [23]. 2.31 9,9’-Dicarboxylic axit, bis[2-(4-hydroxyphenyl)etylamit]. HO H N O O OH OMe O HN OMe HO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Những nghiên cứu gần đây cho biết, từ loài Alocasia macrorrhiza thuộc họ Ráy, có một số cerebrozit và hợp chất nitryl (2.32) [10], [24], [33]. Triglochinin 1.2.4 Các hợp chất glycozit Theo Phạm Hoàng Hộ và các cộng sự thì chi Arisaema họ Ráy ở Việt Nam có khoảng 5 loài, chúng đều là các địa thực vật có củ tròn, to [5]. Từ loài Arisaema amurense người ta đã phân lập được một số hợp chất glycerol (2.33, 2.34 và 2.35) [34]. 2.33 Glycerol 1-hexadecanoat-2-(9,12-octadecadienoat) 3-O- -D-galactopyranozit. 2.34 Glycerol1-(9,12-octadecadienoat)-2-(9-octadecenoat)3-O- -D-alactopyranozit O CH2OH OH OH OHO O O O O 9 12 18 16 O CH2OH OH OH OHO O O O O 9 12 9 18 18 CN O O HO O HO O CH2OH OH OH OH HO H N O O OH OMe O HN OMe HO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 2.35 Glycerol 2-(9,12- octadecadienoat) 1-octadecanoat 3-O-[ -D- Galactopyranosyl-(1 6)- -D-galactopyranozit. Tất cả các hợp chất glycerolglycozit trên mới chỉ xác định được độ độc tế bào đối với chủng P388 và DLD-1 còn hoạt tính sinh học của chúng vẫn chưa được phát hiện [34]. Một số hợp chất glucozit cũng đã được phân lập ra từ các loài Pistia stratiotes, Acorus tatarinowii, và Amorphophallus konjac [23]. 2.36a 5,6-Epoxy-7-megastigmen-3,9- diol (3 ,5 ,6 ,7E,9R),3-O- -D- Glycopyranozit 2.36b 7-Megastigmen-3,5,6,9-tetrol (3S,5R,6R,7E,9R), 3-O- -D- Glycopyranozit 2.37 15-isopimaren-1,3,6,8,11,12,19- heptol (1 ,3 ,6 ,11 ,12 )-12-O- -D- Glycopyranozit 2.38 -D-Glycopyranosyl-(1 4)- -D- Glycopyranosyl- (1 4)-D-manosơ O O O O O OH OH OH O O O OH OH OH H H2C 9 12 18 18 HO O H HO H H OH H O HO O OH 3 7 5 6 HO O H H HO H H OH H O HO OH OH OH 3 5 6 7 9 OH HO OH OH HO HO O H H HO H H OH H O OH OH 1 3 19 6 8 11 12 15 O H H HO OH H HH OH OH HO O H H HO H H OH H O HO O H HO H H OH H OHO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 1.2.5 Các hợp chất trong chi Typhonium Chi Typhonium ở Việt Nam theo Phạm Hoàng Hộ và cộng sự có khoảng 4 loài [5] Chưa có nhiều nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật về các loài trong chi này được tiến hành. Gần đây loài bán hạ (Typhonium blumei) đã được tác giả Khổng Thị Bình nghiên cứu sàng lọc hóa thực vật [2]. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum). Các kết quả thu được sẽ được trình bày trong phần kết quả và thảo luận của luận văn. Từ cây Bán hạ Trung Quốc Typhonium giganteum người ta đã phân lập được một số hợp chất cerebrozit [57], từ cây bán hạ Việt Nam (Typhonium blumei) người ta đã phân lập được một hợp chất cerebrozit [2]. Nói chung, chi Typhonium thuộc họ Ráy ít được nghiên cứu hơn so với các chi khác. Các kết quả nghiên cứu về chi này còn khá khiêm tốn. Theo phân tích sơ bộ trong cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum), chúng tôi cũng đã phân lập được một cerebrozit, để xác định cấu trúc hoàn thiện của nó cần có nghiên cứu tiếp theo. 1.3. Phổ 13 C-NMR phân giải cao trong nghiên cứu cấu trúc và thành phần của lipit (axít béo và este của nó) 1.3.1 Giới thiệu chung Phổ 13C-NMR phân giải cao cung cấp cho chúng ta rất nhiều thông tin hữu ích về cấu trúc hoá học của các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất lipít nói riêng. Các chuỗi tín hiệu (pic của độ dịch chuyển hoá học) cho chúng ta 2 giá trị quan trọng 1. Thông tin về phần định tính (vị trí xuất hiện của pic ppm), 2. Thông tin về phần định lượng (độ cao hay cường độ của pic) [26]. Phổ 13C-NMR của dầu béo hoa rượu Rum (Safflower) được thể hiện ở hình 1. 1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Hình 1.1. Phổ 13 C-NMR phân giải cao của dầu béo hoa rượu Rum (Safflower). Độ dịch chuyển hoá học (ppm) rất nhạy cảm trên toàn bộ chuỗi các bon (C) của một axít béo cụ thể và còn có thể bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi cấu trúc phân tử cách xa nguyên tử trung tâm từ 6 nguyên tử trở lên. Ví dụ: Độ dịch chuyển hoá học của nguyên tử C trong nhóm axyl (C-1) bị ảnh hưởng bởi liên kết đôi 9 cách nguyên tử trung tâm (C-1) là 8 nguyên tử C. Rất nhiều thông tin về độ dịch chuyển hoá học (ppm) của các hợp chất axít béo, glyceroleste, phospholipit … Cụ thể đã được tập hợp thành thư viện thông tin về chất béo và chúng ta có thể sử dụng những thông tin này để xác định các nhóm chức và vị trí của nó trong chuỗi ankyl mạch dài. Việc sử dụng những số liệu đặc trưng của một số loại phân tử cho phép chúng ta có thể xác định được giá trị định tính cũng như giá trị định lượng của một số hỗn hợp axít béo tự nhiên (hoặc dẫn xuất của nó như: glyceroleste, lipit...) [26]. 1.3.2 Axit ankanoic và este Phổ 13C-NMR của các axít no mạch ngắn không cho chúng ta nhiều thông tin, tuy nhiên ta cũng cần hiểu cặn kẽ về nó trước khi bắt đầu nghiên cứu cấu trúc của các axít béo và các dẫn xuất của chúng. Trong bảng 1.1. phổ 13 C-NMR của axit palmitic cho ta biết rõ 6 tín hiệu của các nguyên tử các bon C -1, C-2, C-3 và 1, 2 và 3. Các tín hiệu còn lại xuất hiện gần nhau hoặc trùng lên nhau trong khoảng 29,0-29, 8 ppm. Phần tín hiệu này rõ ràng là của các nguyên tử C thuộc các nhóm metylen (CH2) còn lại trong mạch. Một vài tín hiệu này có thể nhận biết được trong một số trường hợp đặc biệt nhưng sẽ khó nhận dạng hơn trong một hỗn hợp. Riêng 6 tín hiệu pic được nhận biết rõ ràng có thể xuất hiện như một chùm píc trong các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 phổ 13C-NMR của một hỗn hợp các axít béo hoặc dẫn xuất của nó. Sự hiểu biết về chùm tín hiệu này là rất quan trọng để nhận biết cặn kẽ hơn về các thành phần có trong hỗn hợp. Độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C1 -3 tương đối khác nhau tùy thuộc vào bản chất của nhóm acyl. Bảng 1. 1 còn cho biết thêm về độ dịch chuyển hoá học của metylpalmitat và glyceroleste của nó. Mặc dù độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C1 -3 có sự thay đổi ít nhiều trong các phổ 13C-NMR của các chuỗi , -glyceroleste nhưng sự khác biệt đó ổn định trong khoảng giá trị là 0,41; 0, 17 và 0, 04 ppm. Chúng ta rất dễ dàng phát hiện ra sự khác biệt đó ở trường hợp C-1 và C -2 nhưng ở C -3 chúng ta chỉ có thể phân biệt chúng bằng phổ 13C-NMR phân giải cao của nó. Trong trường hợp của những axit và este mạch ngắn các nhóm metyl (CH3) và nhóm R-cacboxy (-COOR) bị ảnh hưởng rõ ràng trên toàn mạch C nhưng sẽ có độ dịch chuyển hoá học tương đối khác nhau ở những đồng đẳng mạch dài do có 2 nhóm cuối không bị trùng lặp. Bảng1. 1. Độ dịch chuyển hóa học ( , ppm) của các nguyên tử C1-6 và 1-4 của axit palmitic, metyl và glycerol este của nó [28]. Axit palmitic Metyleste Glyceroleste C-1 180,6 174,08 173,27 172,86 C-2 34,26 34,18 34,07 34,24 C-3 24,84 25,12 24,89 24,94 C-4 29,26 29,37 29,15 29,12 C-5 29,41 29,46 29,31 29,34 C-6 29,60 29,65 29,52 29,54 max 29,84 29,85 29,74 4 29,53 29,55 29,40 3 32,11 32,11 31,98 2 22,82 22,84 22,72 1 14,13 14,14 14,12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Từ đó cho thấy tất cả 4 nguyên tử C của axít butanoic và este của nó có độ dịch chuyển hoá học khác nhau, do vậy chúng ta hoàn toàn có thể xác định được những hợp chất C4. Tương tự như vậy đối với những axít chứa 6 nguyên tử C có các tín hiệu đặc biệt C3 -6 còn ở các hợp chất C8 ta có tín hiệu đặc biệt của C -6( 3) [26], [28], [30]. Những tín hiệu về độ dịch chuyển hoá học trong phổ 13C-NMR của các axit ankanoic C4, C6, C8 được tập hợp trong bảng 1.2. Bảng 1.2. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C trong glyceroleste của các axit ancanoic C4, C6, và C8 (trong chuỗi và ) [26]. Axít ankanoic CB4 Axít ankanoic CB6 Axít ankanoic CB8 C-1 173,14 172,74 173,31 172,89 173,29 172,89 C-2 35,94 36,09 34,03 34,19 34,08 34,24 C-3 - - 24,56 24,59 24,88 24,92 C-4 - - - - 29,09 29,05 C-5 - - - - 28,94 28,96 3 - - 31,26 31,22 31,68 31,70 2 18,37 18,4 22,31 22,63 1 13,63 13,57 13,90 14,07 1.3.3 Các axit béo monoenoic và este Trong trường hợp của các axit và este mạch dài có chứa một nối đôi ta thấy xuất hiện thêm tín hiện của các nguyên tử C olefin và tín hiệu của các nguyên tử C thuộc các nhóm metylen (CH2) liên kết trực tiếp với các nguyên tử C olefin, những nguyên tử C này được gọi là các nguyên tử C allylic. Chúng ta có thể xác định được cấu dạng và vị trí của liên kết đôi này dựa vào độ dịch chuyển hoá học của 2 nguyên tử C allylic. Từ đó có thể sử dụng những thông tin thu được để nghiên cứu những dầu thực vật được hydro hoá từng phần mà thường là những hỗn hợp của các axit béo không no [29]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Đối với phần lớn các axít monoenoic và este thì các nguyên tử C olefin cho độ dịch chuyển hoá học riêng biệt phụ thuộc vào vị trí, cấu dạng của liên kết olefin đó trong mạch. Trên cơ sở này chúng ta có thể nhận dạng được những đồng phân cis, trans của các axít monoenoic và este 2-11 và 1-4. Đối với glyceroleste thì độ dịch chuyển hoá học của chúng đôi khi có sự khác nhau đáng kể ở chuỗi và [27]. Một số giá trị của độ dịch chuyển hoá học cụ thể được xem trong bảng 1.3 và bảng 1.4. Bảng 1.3. Sự chênh lệch về độ dịch chuyển hóa học ( ppm) giữa 2 nguyên tử C olefinic trong các chuỗi , - glycerol este, cis- 2- 11 [26]. , 2 33,19 - 33,23 3 13,79 - 13,78 4 - 4,79 - 5 - 3,13 - 6 - 1,60 - 7 0,87 - 0,91 8 - 0,54 - 9 0,30 - 0,34 10 0,17 - 0,21 11 0,11 - 0,12 Bảng 1.4. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C olefinic trong metyl este chọn lọc [26]. Metyleste Độ dịch chuyển hóa học (ppm) Chênh lệch 6c 18:1 130,55 128,95 1,60 9c 18:1 130,01 129,68 0,33 11c 18:1 129,92 129,84 0,08 13c 22:1 129,88 129,85 0,03 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Trong các trường hợp đồng phân 2-11 thì sự khác nhau giữa 2 độ dịch chuyển hoá học của 2 nguyên tử C olefin đủ cho phép xác định vị trí của liên kết đôi. Người ta đã sử dụng những số liệu này để nghiên cứu những dầu thực vật có chứa axít petroselinic (là các đồng phân của axít oleic). Những nguyên tử C allylic có độ dịch chuyển hoá học = 27,2 - 27, 3 ppm cho ta biết liên kết đôi (olefin) có cấu hình cis (Z) còn độ dịch chuyển hoá học của chúng nằm trong khoảng = 32,6 - 32, 7 ppm thì liên kết olefin có cấu hình trans (E). Từ đó thấy rằng những tín hiệu của các nguyên tử C allylic này làm sáng tỏ cấu hình của cả phân tử. Những độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C allylic và các nguyên tử C 2-5 sẽ khác nhau trong cả 2 cấu hình cis (Z) và trans (E) của các hợp chất axit monoenic và este 3-7 cho phép nhận dạng các đồng phân bằng tín hiệu của các C allylic và khi đã xác định được các tín hiệu của các nguyên tử C allylic của cả cấu hình cis và trans thì cho phép chúng ta rút ra kết luận về tỷ lệ đồng phân cis/trans trong hỗn hợp [30]. Các liên kết olefin tạo ảnh hưởng nhỏ lên nhóm -metylen ( -CH2) trong các đồng phân cis, trans. Những thay đổi nhỏ này có thể nhận thấy được khi ta chồng các tín hiệu của các nguyên tử C1 -3 và 1-3. Từ đó nhận biết được liên kết đôi ở các vị trí 4-7 và 4-7 [27]. Phổ 13C-NMR cũng cho ta biết liên kết đôi của axít béo và este nằm gần nhóm cuối metyl (-CH3) hoặc R -carboxy (-COOR) trong mạch. Axit petroselinic (18 : 16c) là một ví dụ về axít monoenoic với nối đôi nằm gần nhóm R-carboxy (=COOR). Một vài tín hiệu đặc trưng độ dịch chuyển hoá học của dầu béo hạt cà rốt trong phổ 13C-NMR của nó được liệt kê trong bảng 1.5. Phổ 13C-NMR của axit petroselinic rất dễ dàng xác định tín hiệu của các nguyên tử C1-3, các nguyên tử C olefin và các nguyên tử C allylic. Người ta đã sử dụng cường độ của các tín hiệu C1-3 để xác định tỷ lệ % của axít petroselinic có trong dầu hạt cà rốt và chúng có giá trị lần lượt là 70,9% (theo cường độ của tín hiệu pic C -1), 70,3% (theo C-2) và 70,5% (theo C-3). Các phép tính toán cũng chỉ ra rằng hàm lượng của axít petroselinic đạt tới 80-83% của tổng axít chuỗi và có tới 48-51% trong chuỗi [29]. Những giá trị này rất có ý nghĩa vì việc phân tích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 thành phần axít petroselinic có trong dầu thực vật là rất khó khăn và việc phân lập metyloleat cũng như metylpetroselinat bằng sắc ký không phải là việc làm dễ dàng hơn nữa phân giải lipit cũng không phải là phương pháp thích hợp cho việc xác định các axít béo có liên kết đôi nằm gần nhóm R-cacboxy (COOR). Bảng 1.5. Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) từ phổ 13C-NMR của dầu hạt Cà rốt [26]. Nguyên tử C Độ dịch chuyển hóa học Cường độ Nguyên tử C Độ dịch chuyển hóa học Cường độ C-1 SU 173,16 0,70 Allylic P8 27,29 10,11 P 173,05 3,39 O,L 27,26 4,89 SU 172,76 1,11 27,23 P 172,66 1,01 27,21 P5 26,83 8,57 C-2 SU 34,21 2,12 L11 22,67 1,71 P 34,11 2,18 SU 34,05 1,67 Olefinic P7 130,54 9,31 P 33,95 6,81 L13 130,19 1,59 O10 130,01 1,73 C-3 SU 24,90 3,03 L9 129,97 24,87 129,95 P 24,53 7,23 O9 129,7 1,19 24,51 129,68 P6 128,94 8,50 L10 128,12 1,33 L12 127,92 1,38 Ghi chú: S là hợp chất no; U là hợp chất không no không phải là axit petroselinic; P axit petroselinic; O axít oleic; L axít linoleic. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 1.3.4 Các axit béo polyenoic và este Thông thường các hợp chất axit béo polyenoic tự nhiên có những nhóm metylen (CH2) chia cắt giữa các nối đôi. Người ta đã chia các axít polyenoic này thành các nhóm khác nhau, tuỳ thuộc vào vị trí của nối đôi đầu tiên so với nhóm metyl (CH3) cuối. Các nhóm thường gặp nhất là (n-3) và (n-6) tương ứng với các axít -linoleic và linolenic. Hệ thống polyen càng dài thì càng dễ dàng nhận biết các tín hiệu của các nguyên tử C ở một hoặc cả 2 đầu mạch. Tất cả các axit polyenoic (n-3) và este đều có tín hiệu chung cho các nguyên tử C -5 (bảng 1.6) và tất cả các hợp chất axít polyenoic (n-6) và este có tín hiệu chung cho các nguyên tử C -8 (bảng 1.6). Các hợp chất axit polyenoic và este với nối đôi đầu tiên có vị trí C như nhau cũng chỉ ra được một số tính chất chung (xem tín hiệu của các nguyên tử C1x -8 trong axít và este 6 ở bảng 1.6). Điều này cho thấy trong axit polyenoic và este có sự ngăn cách của nhóm methylen (CH2) giữa những nối đôi dạng cis và ta có thể xác định được vị trí của nối đôi ngoài cùng so với nhóm cuối. Trong các phổ 13C-NMR của dầu thực vật tín hiệu của các nguyên tử C 1-3 cho ta biết thông tin về sự có mặt, thành phần % của các este (n-9), no (thường là không tách được), (n-6), (n-3) và (n-7) thông qua độ dịch chuyển hoá học và cường độ píc của các nguyên tử C đó phần lớn là những este của axít -linoleic và linolenic (bảng 1.7). Bảng 1.6. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C trong phổ 13C-NMR của polyenoat este n -3, n-6 và 6 [26]. n-3 n-6 6 8 - 25,7 C-1 174,1 7 - 127,6 C-2 34,0 6 - 130,4 C-3 24,6 5 25,6 27,3 C-4 29,1 4 127,1 29,4 C-5 26,9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 3 132,0 31,6 C-6 129,6 2 20,6 22,6 C-7 128,3 1 14,3 14,1 C-8 25,6 Những hợp chất có các nối đôi nằm gần nhóm R-carboxy (COOR) hơn phần nhiều là có ở lipit động vật và dầu cá, tuy vậy cũng có một vài loại dầu thực vật như dầu hoa Ngọc Trâm, Borage,... có chứa axit -linoleic và một vài axit polyenoic với nối đôi 5 [25], [26]. Bảng 1.7. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C 1-3 của một vài axít và este [25]. C no n-9 n-7 n-6 n-3 8:0 10:0 1 - 14,13 - 14,09 14,29 14,09 14,12 2 - 22,60 - 22,71 20,57 22,63 22,69 3 31,95 - 31,83 31,55 - 31,69 31,90 Bảng 1.8. Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) và cường độ tín hiệu từ phổ 13 C-NMR của dầu thực vật Borage [48] C Axit (ppm) Cường độ C- Allylic (ppm) Cường độ C-1 SU 173,19 4,39 Đơn 27,49 0,25 G 173,02 0,85 27,22 23,21 SU 172,78 2,30 G5 26,86 4,68 G 172,62 1,62 Kép 25,92 0,24 25,65 17,67 C-2 SU 34,19 4,52 25,25 0,30 G 34,04 10,57 25,07 0,26 SU G 33,91 2,06 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 C-3 SU 24,87 11,67 G 24,50 3,68 Olefinic G13 130,42 4,27 G10 128,44 3,89 L13 130,18 7,91 G7 128,34 4,39 O10 129,97 7,43 L10 128,08 7,70 L9 129,89 2,21 G9 128,01 3,80 129,82 1,48 L12 127,90 7,08 O9 129,69 3,51 G12 127,58 3,77 G6 129,46 4,23 Ghi chú: S no; U không no trừ axit -linoleic; G axit -linoleic; O axit oleic; L axit linoleic; Đơn C-allylic cho 1 nối đôi; Kép C-allylic cho 2 nối đôi. Kết quả phân tích dầu thực vật Borage được liệt kê ở bảng 1.8. Axit - linoleic có thể nhận biết được từ tín hiệu của các nguyên tử C1-3, của C-5-allylic và 6 tín hiệu của các nguyên tử C olefin của 3 axit G9, G10 và G12 (G: axit -linoleic) được xuất hiện như những vạch kép đối với chuỗi và . Những kết quả này cũng được sử dụng bằng phương pháp tương tự để nghiên cứu thành phần axit petroselinic, và thành phần % của axit -linoleic là 27% (Từ cường độ tín hiệu píc C-1) và 24% (từ C-3). Hàm lượng của axit này đạt tới 16% trong chuỗi và 41% của chuỗi . Wollenberg cũng chỉ ra rằng nếu từ phổ 13C-NMR người ta thu thập các số liệu ở những thời gian phục hồi thích hợp trong khoảng 5-10 giờ thì những mạch acyl 9 ( oleat, linoleat, -linoleat) có thể xác định từ cả các tín hiệu của C-1 và các tín hiệu của nguyên tử C olefin thích hợp, ví dụ như trên cơ sở của tín hiệu nguyên tử C-1 thì trong dầu lúa mạch thành phần axít oleic chiếm 27% còn thành phần axít linoleic chiếm 57% [59]. Những giá trị này hoàn toàn phù hợp với kết quả thu được bằng phương pháp phân tích GC (27, 4 và 57,7%). Từ những số liệu của phổ 13 C-NMR Wollenberg đã tính được tỷ lệ phân bổ của những axít này giữa mạch và của oleat este là 66/34 và của linoleat este là 59/41. Những kết quả tương tự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 cũng đã được rút ra từ tín hiệu olefin của dầu lạc (các kết quả chỉ đúng cho các axít béo không no) [60]. 1.3.5 Các axit béo không no và este khác Chúng ta ít gặp những axít béo có chứa nhiều nối đôi liên hợp trong tự nhiên hơn so với những axít cùng loại nhưng nhưng các nối đôi của chúng bị xen kẽ bởi các nhóm metylen (CH2). Tuy nhiên người ta cũng đã biết một số axít béo có nhiều nối đôi liên hợp như các axít octadecatrienoic với các nối đôi 9,11,13 và 8,10,12 và có cấu hình cis, trans khác nhau. Trong những trường hợp này người ta dễ dàng xác định được cấu hình của nối đôi ngoài cùng là cis hoặc trans dựa vào độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C allylic. Hai mạch trien khác nhau cũng có thể nhận biết được thông qua độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C 1-4 của chúng. Những kết quả nghiên cứu trên cũng có thể áp dụng để xác định các axít acetylenic và allenic. Độ dịch chuyển hoá học cho acetylenic là 80, 2 ppm và nguyên tử C propargylic là 18, 8 ppm có sự khác biệt rất lớn so với độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C olefin và C allylic trong cả 2 cấu hình cis và trans. Đối với nguyên tử C allenic có độ dịch chuyển hoá học vào khoảng 91, 204 ppm và 91 ppm, nhưng cả khối 3 nguyên tử C này ít ảnh hưởng đến nguyên tử C của nhóm metylen (CH2) liền kề (29,1 ppm) còn độ dịch chuyển hoá học của nguyên tử C của nhóm CH2 bên cạnh cis-olefin là 27, 2 ppm và trans-olefin là 32,6 ppm , nguyên tử C của nhóm CH2 liền kề với liên kết 3 là 18,8 ppm [13], [14], [26], [28], [29], [36], [37]. 1.3.6 Axit cyclopropen và este Những axit này có trong dầu hạt gòn (gạo), hàm lượng vào khoảng 12% còn trong dầu hạt bông chỉ có vào khoảng 1%. Dầu hạt gòn có một số tín hiệu được xác định là của 2 axit sterculic và malvanic. 38. 38.a. n = 7 Axit sterculic 38.b n = 6 Axit malvanic OH O ( )n Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Những độ dịch chuyển hoá học đáng chú ý được liệt kê trong bảng 1.9. Từ những cường độ píc đó ta có thể xác định được tỷ lệ % của 2 axít trên trong dầu hạt gòn [26]. Bảng 1.9. Một vài độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C từ phổ 13C-NMR của sterculic và malvanic este [26]. C (S) (M) C Tỷ lệ (S/M) C-7 27,37 27,43 C-6 28/77 C-8 26,01 25,96 C-7 38/62 C-9 109,20 109,11 C-8 26/74 CH2 7,42 CH2 C-10 109,47 109,56 C-9 26/74 C-11 26,07 C-10 C-12 27,37 27,43 C-11 28/77 1.3.7 Các axit béo bị oxi hoá và este Các phổ 13C-NMR của hydroxy, oxo, epoxy và furanoit axit và este cũng đã được nghiên cứu. Dưới đây là những kết quả nghiên cứu về dầu Hải ly và dầu hạt Vernonia galamenis. Trong dầu Hải ly axit ricinoleic (12-hydroxyoleic) có hàm lượng rất cao (98%). Những tín hiệu đặc trưng cho glyceroleste của axit này dễ dàng được xác định tương ứng với 7 nguyên tử C giữa C -8 và C -14: C-8 (27,38 ppm), C-9 (125,39 ppm), C-10 (133 ppm), C-11 (35,7 ppm), C-12 (71,44 ppm), C- 13 (36,85 ppm) và C -14 (25,73 ppm). Những tín hiệu nhỏ đi kèm gần với giá trị của nguyên tử C -12 là 71, 68 ppm và 71, 18 ppm cho biết sự có mặt của hydroxyaxit khác có hàm lượng nhỏ hơn chiếm vào khoảng 1,25% tổng tín hiệu của C -12 [31]. Tín hiệu của nguyên tử C 2 (22,63 ppm) đi kèm với các tín hiệu 22, 85 và 22, 40 ppm chiếm khoảng 1,25% tổng tín hiệu của nguyên tử C 2 [31]. Dầu hạt Vernonia galamenis có chứa axit vernolic (axit 12,13-epoxyoleic). Các độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C từ C8 -18 cũng rất đặc trưng, tuy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 nhiên có một vài tín hiệu không chắc chắn: C-8 và C -14 (27, 79 và 27,40 ppm), C- 9 (124,05 ppm), C-10 (132,4 ppm), C-11 và C -15 (26, 33 và 26,28 ppm), C-12 (57,05 ppm), C-13 (56,4 ppm), C-16/ 3 (31,77 ppm), C-17/ 2 (22, 61 ppm trùng với pic 2 của linoleate) và C -18/ 1 (14,01 ppm). So sánh cường độ píc của C - 16/ 3 với tổng cường độ píc 3 ta thấy hàm lượng của axít vernolic là 75% còn tính theo pic C -18/ 1 thì hàm lượng của nó là 70%. Đi kèm với 2 tín hiệu của 2 nguyên tử C epoxy (57, 05 và 56,40 ppm) là các tín hiệu 56,80; 56, 70 và 56, 10 ppm với tỷ lệ píc lần lượt là 0,7; 0, 6 và 0,5% cho thấy các epoxyaxit khác có hàm lượng nhỏ đi kèm. Sự có mặt của các axít béo no, oleate, linoleate cũng được xác định bằng các tín hiệu của các nguyên tử C 1-3 và C olefin cũng như C allylic. 1.3.8 Những nguyên tử C1 3 trong các gốc acyl và ankyl Độ dịch chuyển hoá học của nguyên tử C1 3 phụ thuộc vào những nhóm liên kết trực tiếp với nhóm acyl hoặc ankyl của mạch và các gi á trị của chúng được liệt kê trong bảng 1.10 và bảng 1.11. Những hợp chất acyl bao gồm các axít, methyleste, este mạch dài, glyceroleste, amit, nitril. Phần ankyl gồm các lớp chất sau: ancol, axêtat, este mạch dài v.v... Hai nhóm này cho độ dịch chuyển hoá học rất khác nhau. Trong một nhóm chất tuy rằng mức chênh lệch của độ dịch chuyển hoá học là nhỏ nhưng đó là sự khác nhau đáng chú ý. Trong những dẫn xuất của axít oleic và axít linoleic thì độ dịch chuyển hoá học của các nguyên tử C olefin có độ chênh lệch không lớn [26], [27], [29], [30]. Đối với hỗn hợp của ancol và axetat ta sẽ nhận được 2 tín hiệu cho mỗi nguyên tử C1 -3, còn hỗn hợp của axít, este và glyceroleste sẽ có 4 tín hiệu cho mỗi nguyên tử C1 -3. O’connor và các cộng sự đã sử dụng sự khác nhau giữa các độ dịch chuyển hoá học này để nghiên cứu quá trình phản ứng với xúc tác enzym giữa axít và ancol. Tiến trình phản ứng được theo dõi thông qua sự giảm tín hiệu của độ dịch chuyển hoá học 61,1 ppm (tín hiệu của C -1 ancol) và sự tăng tín hiệu của độ dịch chuyển hoá học 64,3 ppm (tín hiệu của C -1 este) [45]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Bảng 1.10. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1 -3 trong phổ 13C-NMR của một số lớp chất mạch dài [26]. Hợp chất (C-1) (C-2) (C-3) Axit cacboxylic 180,62 34,25 24,8 Metyleste 174,05 34,17 25,12 Este mạch dài Acyl 173,94 34,48 25,06 Ankyl 64,39 28,70 25,98 Glyceroleste 173,27 34,07 24,90 172,86 34,24 24,94 Amit 176,37 36,02 25,57 Nitril 119,82 25,43 17,14 Ancol 63,01 32,81 25,78 Axetat* 64,64 28,67 25,97 * Độ dịch chuyển hoá học cho 2 nguyên tử C của nhóm CH3BCO là: 171, 14 và 20,97 ppm. Bảng 1.11. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C1 -3 từ phổ 13C-NMR của hỗn hợp axít palmitic, metyloleat và glycerol tri -oleat [26]. C Axit Metyleste Glyceroleste C-1 179,69 174,28 173,23 172,82 C-2 34,12 34,10 34,07 34,23 C-3 24,77 25,01 24,91 24,93 1.3.9 Glycerol este Glyceroleste có 5 loại sau đây: 1- và 2-monoaxyl; 1,2-diaxyl; 1,3-diaxyl và triacyleste. Những nguyên tử C của glycerol trong mỗi loại este cho những tín hiệu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 đặc biệt trong phổ 13C-NMR của nó và người ta có thể sử dụng để xác định, định lượng các thành phần trong hỗn hợp [25], [38]. Bảng 1.12. Độ dịch chuyển hóa học ( ppm) của các nguyên tử C -glycerol trong phổ 13C-NMR của các axylglycerol [26]. O CDCl3 P CDCl3 S CDCl3 O và P CDCl3/CD3OD (2:1) 2-mono 72,12 74,97 74,70 75,36 1,2-di 72,83 72,25 72,06 72,40 1-mono 69,90 70,27 - 70,24 Tri 68,84 68,93 68,85 69,41 1,3-di 67,55 68,23 68,15 67,71 1-mono 64,64 65,04 - 65,58 1,3-di 64,73 65,04 64,96 65,36 1-mono 63,12 63,47 - 63,46 1,2-di 62,22 62,20 62,10 62,92 Tri 62,03 62,12 62,06 62,50 2-mono 61,02 62,05 60,90 61,06 1,2-di 60,74 61,58 61,37 60,82 Ghi chú: O = axit oleic; P = axit palmitic; S = Các axit no; Độ dịch chuyển hóa học của các nguyên tử C của glycerin là: C- 63,66; C- 72,78 ppm. Trong trường hợp của các glyceroleste “đối xứng” (2-monoacyl; 1,3-diacyl và triacyleste) nó cho chúng ta 2 tín hiệu với tỷ lệ píc 2:1, còn trong trường hợp glyceroleste “không đối xứng” (1-monoacyl và 1,2-diacyleste) nó cho ta 3 tín hiệu píc với tỷ lệ 1:1: 1. Trong dung dịch chloroform một vài tín hiệu này rất gần nhau và có khi trùng lên nhau, đặc biệt là trong trường hợp một tín hiệu có cường độ lớn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 và một tín hiệu có cường độ nhỏ. Trong hỗn hợp dung dịch cloroform /metanol (2:1) chúng sẽ có độ phân giải tốt hơn [25], [26], (bảng 1.12). Rất nhiều dầu thực vật có chứa diacylglycerol và trong phổ 13 C-NMR của nó ta nhận thấy có 2 tín hiệu lớn của triacylglycerol và 2 tín hiệu nhỏ đi kèm của 1,3- diacylglycerol còn những tín hiệu của những isomer 1,2-diacylglycerol không thể nhận biết được trong phổ. Những diacylglycerol bền vững có thể là sản phẩm của sự isomer hoá, ví dụ: trong phổ 13C-NMR của dầu cọ có những tín hiệu ở 68,93 (cường độ píc 2,96), 68,35 (0,27), 65,05 (0,45) và 62,10 ppm (5,53) tương ứng vào khoảng 8,4% (mol) 1,3-diacylglycerol có trong dầu [26], [38], [60]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 CHƢƠNG 2. THỰC NGHIỆM Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) còn có tên gọi là củ chóc, Lá ba chìa, Cây chóc chuột [4], là thực vật thân thảo, bụi (là một loại cỏ không có thân), có củ hình cầu, đường kính có thể to tới 2cm. Lá hình tim hay hình mác, hoặc chia ba thùy dài 4 đến 15cm, rộng 3,5 đến 9cm. Bông mo với phần hoa đực dài từ 5 đến 9mm, phần trần dài 17 đến 27mm. Quả mọng, hình trứng dài 6mm. Hình 2.1: Cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) Chúng mọc hoang ở những nơi đất ẩm hoặc được trồng làm cảnh, phân bố rộng khắp ở Việt Nam, Ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản … Bán hạ ba thùy còn là một vị thuốc [5] dùng theo kinh nghiệm dân gian để chữa: Chống nôn (phụ nữ có thai hoặc trong trường hợp viêm dạ dày mãn tính), trị ho, tiêu đờm, chữa nhức đầu, đau dạ dày mãn tính v.v... nhưng ít có những nghiên cứu về dược lý cũng như thành phần hoá học của nó kể cả ở trong và ngoài nước. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Nhiệm vụ của bản luận án này là phân lập các thành phần hoá học có trong cây Bán hạ và sử dụng các phương pháp phân tích vật lý, hoá học hiện đại để xác định cấu trúc hoá học của các chất sạch đã thu được. Hình 2.2: Hoa , thân , củ và rễ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là thân, lá, rễ và củ khô của cây Bán hạ ba thùy, thu hái tại huyện Đông Triều, tỉnh Quảng Ninh tháng 7 năm 2007, được TS. Ninh Khắc Bản - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh học – Viện KH&CN Việt Nam giám định tên khoa học là Typhonium trilobatum. Mẫu cây tươi thu hái về (củ được thái thành lát mỏng), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 110 0 C khoảng 10 phút để diệt men. Sau đó sấy khô ở 50-60 0 C cho tới khi độ ẩm ≤ 10%. Mẫu khô thân được vò nhỏ, rễ và củ được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng etanol 96% ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat và metanol. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ ≤ 50 0 C dưới áp suất giảm. Các cặn thô được đưa lên các loại cột sắc ký khác nhau để phân lập các chất có trong từng phân đoạn và thường phải kết hợp nhiều phương pháp như: dùng hệ dung môi chạy cột có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết hợp với kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch. 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết. Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau của cây Bán hạ đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột Silicagel thường - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất. Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v.... Sau đó sẽ tiến hành ghi các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), cacbon-13 ( 13 C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC, phổ HMBC với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để khẳng định cấu trúc hóa học của chúng. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùng trong phân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra các loại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và được hoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C. Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 cũng đã được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi triển khai SKLM. 1. n-Hexan-etylaxetat (8:1) Hệ A 2. n-Hexan-etylaxetat (4:1) Hệ B 3. Chloroform-metanol (9:1) Hệ C 4. Chloroform-metanol (5:1) Hệ D 5. Chloroform-metanol (2:1) Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK) ở bước sóng =254nm (365nm) rồi được phun thuốc thử vanilin 1% trong metanol/H2SO4 đặc và sấy trên 100 0C, để xác định các cấu tử. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B,C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,040 - 0,063mm hoặc 0,1 - 0,16mm). 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boëtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực [ ]D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - Viện KH&CN Việt Nam) dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên thiết bị ESI-MS HP-1100 LS/MS Trap spectrometer. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 - Phổ GC/MS ghi trên máy HP-GC/MS Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. - Phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz (Viện Hoá học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, CDCl3/MeOD, pyridin-D5. 2.3. Các dịch chiết từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.3.1 Các dịch chiết Thân, lá, rễ và củ cây Bán hạ ba thùy đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm nhiệt độ < 50 0C đến dạng cao đặc khô, xác định khối lượng cặn thô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxêtat, sau đó đuổi hết nước và chiết bằng metanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ củ, rễ và thân lá cây Bán hạ ba thùy đã thu nhận được 3 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các cặn tương ứng được tóm tắt trong bảng 2.1. Bảng 2.1 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) Mẫu chiết Dịch chiết Rễ, củ (RTt) 1700 gam Thân, lá (LTt) 450 gam n-hexan (H) RTtH: 19,7g LTtH: 8,6g Etyl axetat (E) RTtE: 15,4g LTtE: 8,8g Metanol (M) RTtM: 100g LTtM: 100g Quy trình ngâm chiết mẫu được tóm tắt theo sơ đồ 2.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu 2.4. Phân lập và tinh chế các chất từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) 2.4.1. Dịch chiết n-hexan Từ 19,7 g cặn dịch n-hexan của củ, rễ cây Bán hạ ba thùy (Kí hiệu RTtH), được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Hệ dung môi rửa giải là n–hexan/ etylaxetat với tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi etylaxetat (EtOAc) từ 0-100%, kiểm tra các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi đã thu được hỗn hợp các axit béo được xác định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 trên máy GC/MS (được so sánh với phổ chuẩn với độ trùng lặp ≥ 98% cao). 2.4.1.1. Các axit béo Các axit béo trong dịch hexan của Typhonium trilobatum được tiến hành phân tích trên máy GC/MS với ngân hàng dữ liệu phổ của các axit béo đã biết được trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2 Các axit béo trong dịch n-hexan của cây Bán hạ ba thùy Stt Tên axit Ký hiệu Độ trùng lặp (%) 1 Axit hexadecanoic (axit palmitic) RTtH1 99 2 Axit 11,14-octadecadienoic RTtH2 99 3 Axit 9,12-octadecadienoic RTtH3 99 4 Axit cis-linoleic RTtH4 99 5 Axit docosanoic RTtH5 98 2.4.1.2. Stigmast-5,22-dien-3-β-ol (RTtH6) Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan/etylaxetat (10:1), sau khi cất lại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng SKLM trong hệ A, kết tinh lại trong dung môi metanol thu dược 19mg tinh thể hình kim, không màu, không mùi. RfA 100 = 64, nóng chảy ở 155-157 0 C, [ ] 25 D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Phổ FT-IR(KBr), νmax(cm -1 ): 3429,1(OH); 2864,9(C-H); 1642,5 và 1651,4(C=C) Phổ EI-MS m/z, (%): 412[M + ](7), 300(7), 255(11), 231(4), 213(8), 173(7), 145(20), 133(20), 83(49,3), 55(100), 43(90). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), (ppm): 5,35 (1H, dd, J=5Hz và 2Hz, H6); 5,14 (1H, dd, J22,23=15 Hz, J22,20= 5Hz, H-22); 5,03 (1H, dd, J23,22=15 Hz, J23,24=5 Hz, H-23); 3,49 (1H, m, H-3). Phổ 13 C -NMR (125MHz, CDCl3), (ppm): 36,5 (t, C-1); 29,67 (t, C-2); Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 71,8 (d, C-3); 42,25 (t, C-4); 140,71 (s, C-5); 121,67 (d, C-6); 37,21 (t, C-7); 31,84 (d, C-8); 51,2 (d, C-9); 36,11 (s, C-10); 24,32 (t, C-11); 42,17 (t, C-12); 31,6 (s, C- 13); 56,83 (d, C-14); 25,38 (t, C-15); 31,6 (t, C-16); 55,9 (d, C-17); 12,01 (q, C-18); 18,95 (q, C-19); 40.47 (d, C-20); 21,03 (q, C-21); 138,3 (d, C-22); 129,3 (d, C-23); 50,01 (d, C-24); 33,9 (t, C-25); 21,19 (q, C-26); 19,79 (d, C-27); 28,89 (q, C-28); 12,22 (q, C-29). 2.4.1.2. -Sitosterol (RTtH7) Tiếp tục rửa cột với hệ dung môi n-hexan/etylaxêtat (5:1), sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra SKLM trong hệ B, kết tinh lại trong metanol thu được 17 mg chất rắn, tinh thể hình kim, không màu, hiệu suất 5,5.10 -3 %, RfB 100 = 43, nóng chảy ở 138-140 0C. Phổ FT-IR (KBr), νmax(cm -1 ): 343,15 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3), (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H- 6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3), (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,6 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 2.4.2. Dịch chiết etylaxetat (RTtE) Từ 15,4 g cặn chiết etylaxêtat của củ, rễ cây Bán hạ ba thùy (Kí hiệu RTtE) cũng được tiến hành phân lập các chất trên sắc kí cột silicagel. Rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi cloroform/metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi metanol từ 0-100%, kiểm tra các phân đoạn bằng SKLM, sau đó gộp các phân đoạn có thành phần giống nhau, đuổi hết dung môi và kết tinh phân đoạn đã thu được các chất sau. 2.4.2.1. Hợp chất terpen-glycozit (RTtE1) Rửa giải cột bằng hệ dung môi cloroform/metanol (95:5), sau khi kiểm tra bằng SKLM với hệ C cất loại dung môi, thu được cặn thô. Kết tinh lại trong MeOH thu được 20,5mg một chất rắn kết tinh vô định hình, không màu, RfC 100 = 50. Phổ 1 H-NMR (Pyridin-D6, 500MHz), (ppm): 0.65 - 2,35 tín hiệu thuộc các nguyên tử H của các nhóm CH3, CH2 và CH trong phần genin của phân tử glycozit; độ dịch chuyển hóa học trong khoảng 3,0-3,7 là tín hiệu các mguyên tử H của các nhóm CH2 và CH liên kết trực tiếp với O của phần đường và khung terpen ; 4,8 (d, H-1’phần đường ); 5-5,53 là tín hiệu các nguyên tử H của các liên kết olefin. Phổ 13C-NMR (Pyridin, 125MHz), (ppm): 11,8-57,0 là tín hiệu của các nguyên tử Cacbon thuộc các nhóm metyl, metylen, metin và nguyên tử cacbon bậc bốn; độ dịch chuyển hóa học từ 61,8-77,7 là tín hiệu của các nguyên tử cacbon thuộc phần đường và các cacbon trong khung tecpen có liên kết trực tiếp với oxi. Độ dịch chuyển hóa học ở 102,1 là tín hiệu của cacbon C1 thuộc phần đường. Còn tín hiệu các cacbon ở 121,6 và 123,1 thuộc các nguyên tử cacbon olefin. 2.4.2.2. 3-O- -D-glucopyranosyl-stigmasterol (RTtE2) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi CHCl3-MeOH (9:1), phân đoạn dịch được kiểm tra SKLM trong hệ C, sau khi cất loại dung môi, cặn được kết tinh lại trong hệ dung môi cloroform/metanol (2/1) thu được 25mg tinh thể hình kim, không màu, không mùi, có RfC 100 = 48, nóng chảy ở 289-290 0 C. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Phổ 1H-NMR (CDCL3/MeOD, 500MHz, ), (ppm): 5,32 (1H, m,H-6); 4,3 (1H , d,C-1’ phần đường ); 0,95 (3H, s,C-19); 0,78; 0,81; 0,82 là tín hiệu thuộc 3 nhóm metyl ở các vị trí C-21, C-28, C-29 còn 0,89 là của 3 nguyên tử H của C-26 (t,C-26). Phổ 13C-NMR (CDCL3/MeOD, 500 MHz), (ppm ): 140,6(s,C-5); 137,(d, C-22); 128,7(d,C-23); 120,8(d C-6); 100,7 (d, C-1); 76,9 (d,C-3); 76,9(d, C-5’); 76,4(d, C-3); 73,2(d, C-2); 70,1(d, C-4’); 61,9(t, C-6’); 56,1 (d, C-14); 55,4(d, C- 17); 50,3(d, C-9); 49,5(d, C-24); 29,5(t,C-2); 38,22(t,C-7); 31,5 (d, C-8); 36,0(s,C- 10) ; 24,4(t,C-11); 38,2(t,C-12); 31,5(s,C-13); 25,6(t,C-15); 31,1(t,C-16); 15,0(q,C- 18); 18,6(q,C-19); 45,1(d,C-20); 20,8(q,C-21); 33,2(t,C-25); 20,5(q ,C-26); 19,3(d,C-27); 18,8(q,C-280; 11,7(q,C-29). 2.4.2.3. Typhotrilozit A (RTtE3) Sau khi thu được hợp chất RttE2, tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi CHCl3 - MeOH (9:1), dịch phân đoạn này được kiểm tra SKLM trong hệ D, sau khi cất loại dung môi, cặn được kết tinh lại trong hệ dung môi cloroform/metanol thu được 120mg chất màu xám, dạng tinh thể vô định hình Rf.D x100 = 37, có nhiệt độ nóng chảy 189-190 0 C. Phổ FT-IR (viên nén KBr), νmax(cm -1 ): 3380,35; 3365 (O-H hoặc N-H); 2917,06 và 2815 (các dao động hóa trị C-H); 1646,5 (C=O); 1622 (C=C); 1537,0 ( dao động CO-NH); 1464,3; 1087,8 và 651. Phổ 1H-NMR (CDCl3/MeOD, 500MHz, ); (ppm): Phần aminoancol : 0,87 (t, J=8,7Hz); 1,26 (br s); 5,35 (m); 5,25 (m); 3,85 (dd, J=3,2Hz, 4,5Hz); 3,9 (m); 3,7 (dd, J=6,0Hz, 12,8Hz); 3,85 (dd, J=6,1Hz, 12,5Hz); 7,35 (d, J=9,1Hz). Phần axit 2-hidroxicacboxylic: 0,89 (t, J=8,7Hz); 1,26 (brs); 2.2 (m); 2,0 (m); 3,3 (dd, J=8,0Hz, 3,7Hz); không xác định. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Phần đường: 3,75 (dd, J=11,7Hz; 5,36Hz) và 3,6 (dd, J=11,6Hz; 2,15Hz); 3,3 (m); 3,2 (m); 3,25 (m); 3,2 (m); 4,2 (d, J=7,8Hz). Phổ 13C-NMR (CDCl3/MeOD-d6, 125MHz); (ppm,): Phần aminoancol : 13,2 (q, C27); 21,5-32,4 (t, C6-C26); 128,9 (d, C5 ); 130,9 (d, C4 ); 71,8 (d, C3 ); 52,1 (d, C2); 68,2 (t, C1). Phần axit 2-hidroxicacboxylic: 13,2 (q, C23’) ; 22,5-32,4 (C4’-C22’); 128-131 (d, CH olefin) ; 34,3 (t, C3’) ; 71,9 (d, C2’) ;: 175,2 (s, C1’). Phần đường: 61,1 (t, C6’’) ; 76,1 (d, C5’’) ; 69,6 (d, C4’’) ; 75,9 (d, C3’’) ; 73,2 (d, C2’’) ; 102,8 (d, C1’’). Thủy phân typhotrilozit A: Cho 80mg typhtrilozit A, 50ml metanol, 5ml HCl 1M vào bình cầu 100ml. Sau đó đun hồi lưu 18 h, sau khi phản ứng kết thúc (kiểm tra bằng SKLM), dịch phản ứng được đưa vào phễu chiết 500ml, thêm 300ml nước cất, lắc đều. Hỗn hợp dịch được chiết với 3x100ml n-hexan, gộp các dịch chiết n-hexan, rửa bằng nước cất đến pH = 7, tiếp theo được làm khan bằng Na2SO4, đuổi hết dung môi thu được chất rắn trắng thuộc lớp chất axit 2- hydroxicarboxylic. Dịch nước còn lại được trung hòa bằng NH4OH (dd NH3 28%) đến pH = 7-8, sau đó chiết với 3x100ml clorofoc, gộp các dịch chiết, rửa bằng nước cất đến pH = 7, làm khan bằng Na2SO4, cô khô thu được chất lỏng màu nâu là hợp chất aminoancol. Hợp chất metyl-2-hidroxicacboxylat (RTtE3.1) (metyl-2-idroxitricosadienoat) C24H44O3: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Phổ EI- MS m/ z (%): 380 [M]+ (39 ,3), 442 (100) , 328 (25,0) , 300 (8,0 ), 272 (5,0 ), 124 (2,0) Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz); (ppm): 4,06 (H, t, H-2), 3,79 (3H, s, CH3-O), 0,89 (3H, t, 8,7); 5,2-5,65 (m, H-olefin). Phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125MHz); (ppm,): 179,7 (C-1’); 127,9;128,1; 130,1 và 130,2 (C-olefin); 70,4 (C-2’); 56,0 (CH3-O); 34,7 (C-3’); 21,4-30,9 (C-metilen); 14,4 (C-23’). Hợp chất aminoancol (RTtE3.2)C27H53NO2.HCl: Phổ EI-MS m/z (%): 460,1 [M+H]+ (Tính ra được công thức C27H53NO2: 423,1). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 CHƢƠNG 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau. 1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxêtat, metanol hoặc etanol v.v.... 2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol/nước. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau. Việc chiết mẫu thực vật Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) được thực hiện theo phương án 2 (Sơ đồ 2.1). 3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây Bán hạ ba thùy Các dịch chiết từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp, đã sử dụng các phương pháp sắc ký cột như: Cột nhồi silicagel, với các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ đó sẽ thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các nhu cầu để khảo sát tính chất hóa lý và quang phổ của chúng. Đó là những yếu tố quan trọng trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 quá trình nhận dạng và xác định cấu trúc hóa học của các chất đã phân lập được từ các đối tượng nghiên cứu nói trên. Việc phân lập các thành phần hóa học từ thân rễ cây Bán hạ ba thùy được thực hiện như sơ đồ 2.1 và đã thu được các hợp chất sạch gồm các nhóm chất: Axit béo cacboxylic, sterol, glucozit, terpenoit và cerebrozit. 3.2.1. Axit cacboxylic Từ các dịch chiết n-hexan của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) đã thu được một hỗn hợp các axit béo. Đó là các hợp chất tương đối đơn giản, dễ dàng nhận biết bằng những hằng số vật lý đặc trưng, các phổ GC-MS có so sánh với các phổ chuẩn trong thư viện phổ của máy phân tích GC/MS (Nist 98.1) với độ trùng lặp cao (xem phần thực nghiệm và phần phụ lục). 3.2.2. Các hợp chất sterol Những chất có khung steran được tìm thấy trong các dịch chiết của cây Bán hạ ba thùy thường là các sterol C29 với bộ khung 3 -ol 5 -pregnan hoặc dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau. Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập được, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dưới đây: 3.2.2.1. Stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol (RTtH6) Cặn thô màu trắng thu được kết tinh lại trong dung môi n-hexan cho tinh thể hình kim, không màu, không mùi. Nóng chảy ở 155-1570C, [ ]25D = - 43 0 (c=0,05; CHCl3). Trong phổ EI-MS có thể thấy pic ion phân tử [M] + ở 412 m/z, các phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và FT-IR khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl (OH) H-3 = 3,49 ppm và C-3 = 71,8 ppm và max = 3406cm -1, có 3 proton thuộc nhóm metin (CH) của 2 nối đôi không liên hợp (FT-IR: 1621cm-1), 1H-NMR: H-6 = 5,33ppm, dd, J=5Hz và 2Hz; H-22 = 5,11 ppm, dd, J=15Hz và 5Hz; H-22 = 5,03 ppm; dd, J=15Hz và 5Hz; 13 C-NMR: C-5 = 140,7 ppm, C-6 = 121,6 ppm, C-22 = 138,3 ppm, C-23 = 129,2 ppm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Các số liệu về phổ 1H-NMR và 13C-NMR của nó hoàn toàn phù hợp với phổ của stigmast-5,22-dien-24R-3β-ol. Bảng 3.1. Số liệu phổ 13 C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của một số phytosterol trong cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) STT Stigmasterol (ppm) -Sitosterol (ppm) 1 36.5 t 37.3 t 2 29.1 t 31.7 t 3 71.7 d 71.8 d 4 42.2 t 42.3 t 5 140.7 s 140.8 s 6 121.7 d 121.7 d 7 37.2 t 31.9 t 8 31.8 d 31.9 d 9 51.2 d 50.2 d 10 36.1 s 36.5 s 11 24.3 t 21.1 t 12 42.2 t 39.8 t 13 39.7 s 42.3 s 14 56.8 d 56.8 d 15 25.4 t 24.3 t 16 29.7 t 28.3 t 17 56.0 d 56.1 d 18 11.8 q 11.9 q 19 19.4 q 19.4 q 20 40.5 d 36.2 d 21 18.8 q 18.8 q 22 138.3 d 33.9 t 23 129.2 d 26.1 t Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 STT Stigmasterol (ppm) -Sitosterol (ppm) 24 50.1 d 45.9 d 25 31.6 d 29.2 d 26 21.2 q 19.1 q 27 21.0 q 19.4 d 28 18.9 t 23.13 t 29 12.0 q 11.9 q 3.2.2.2. -sitosterol (RTtH7) Là những tinh thể hình kim không màu cũng thu được từ dịch chiết n-hexan của cây Bán hạ, điểm nóng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nó là 414, từ các phổ FT-IR, 1 H-NMR và 13 C-NMR có thể khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxi (OH) : max = 3426 cm -1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và C-3 = 71,7 ppm, một nối đôi C=C : max = 1651cm -1 (yếu), H-6 = 5,35 ppm (d), J=5Hz, C-5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm. Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với -sitosterol. Độ dịch chuyển hoá học các nguyên tử C của nó được nêu trong bảng 3.1. 3.2.2.3. 3-O- -D-glucopyranosyl-stigmasterol (RTtE2) Chất rắn vô định hình, không tan trong cloroform, metanol, dễ tan trong hỗn hợp dung môi cloroform / metanol, nóng chảy ở 289-2900C. Phổ 13 C-NMR cũng cho biết có 35 tín hiệu của cacbon, trong đó có 7 tín hiệu của phần đường nằm trong vùng từ 61,9 ppm đến 100,7 ppm. Thêm vào đó là xuất hiện tín hiệu của nối đôi nằm ở C 137,5 ppm và 128,7 ppm. Các số liệu ở phổ 1 H-NMR cho biết, cũng phù hợp với các tín hiệu của phổ 13C-NMR. Chất này đem thuỷ phân trong axit loãng thu được stigmasterol, các phổ 1H-NMR và 13C-NMR Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 của sản phẩm thủy phân không còn những tín hiệu của gốc đường. Điều này cũng đã chứng tỏ chất rắn thu nhận được ở dạng vô định hình có điểm nóng chảy 296 - 298 0 C là 3-O- -D-glucopyranosyl-stigmasterol. 3.2.3. Hợp chất terpen-glycozit (RTtE1) Phổ 1H-NMR (CDCl3/MeOD-d6, 500MHz), (ppm): 0,65-2,35 là tín hiệu các nguyên tử H của các nhóm CH3, CH2 và CH trong mạch các bon; 3,95-4.85 là tín hiệu các mguyên tử H của các nhóm CH2và CH liên kết trực tiếp với O của phần đường và khung terpen ; 4,85 (d, H-1’phần đường ); 5-5,53 là tín hiệu các nguyên tử H của các liên kết olefin. Phổ 13 C-NMR (CDCl3/MeOD-d6, 125MHz) : (ppm): 11,8-57 là tín hiệu các nguyên tử C trong khung terpen, 61,8-77,7 là tín hiệu các nguyên tử C liên kết trực tiếp với O của phần đường và khung genin, 102,1 (C-1’ phần đường ), 121,6 và 123 tín hiệu các nguyên tử C olefin. (Xem phổ 1H-NMR và 13C-NMR & DEPT phần phụ lục). Qua phân tích các số liệu phổ NMR của hợp chất RTtE1, có thể khẳng định nó là một hợp chất terpen-glucozit. Để xác định được cấu trúc hóa học chính xác của RTtE1 cần có những nghiên cứu tiếp theo (Cần thực hiện nghiên cứu với khối lượng mẫu lớn hơn để thu được khối lượng RTtE1 đủ cho việc ghi các loại phổ cần thiết tiếp theo như: FT-IR, UV-VIS, MS phân giải cao) và một số phổ NMR 1chiều và 2 chiều...). 3.2.4. Hợp chất Typhotrilozit A (RTtE3) Cerebrozit hay glycosphingolipit (GSL), sphingosin, ceramit là nhóm hợp chất thiên nhiên lần đầu tiên phân lập được từ dịch chiết mô não và được mô tả vào nửa sau của thế kỷ 20. Đó là các amit hợp bởi một axít béo với aminoancol đều có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 mạch cácbon dài với kích thước khác nhau, có mức độ no hóa và hydroxyl hóa cũng khác nhau, chúng có cấu trúc tổng quát như sau. R2 NH R1 HO OH O 1 2 3 1' 2' Trong cơ thể người có tới 40% lượng ceramit tập trung ở da với chức năng chủ yếu là hình thành rào cản ngăn nước thoát ra khỏi cơ thể. Những chất này cũng tham gia vào hệ miễn dịch của cơ thể với vai trò như là những kháng thể liên kết những tế bào khối u cũng như trong miễn dịch trị liệu ở những dạng ung thư cá biệt. Người ta cũng đã biết các cerebrozit có hoạt tính chống lở loét (anti-ulcerogenic), bảo vệ gan (hepatoprotective), ức chế enzym và kháng khuẩn cao. Gần đây đã phát hiện thấy các cerebrozit trong nấm, trong cây Aralia elata, loài bán hạ Trung Quốc (Typhonium giganteum), loài bán hạ Việt Nam (Typhonium blumei), Penilla ternata, Kỷ tử (Lycium chinense), tỏi (Allium sativum), đậu nành (Glycine max), trong động vật không xương sống như đỉa, cua biển, vi sinh vật biển, trong sao biển, bọt biển, hải sâm, san hô mềm (Xem phần tổng quan, Mục 1.2.4.2.). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Từ dịch chiết etylaxetat củ, rễ của cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) đã thu được một hợp chất rắn kết tinh dạng vô định hình (0,021g/800g=0,003%), màu xám, có điểm nóng chảy 189-190 0 C, không tan trong nước, tan ít trong metanol, nhưng tan rất tốt trong hệ dung môi CHCl3/MeOH (tỷ lệ 2:1 v/v). Trong phổ FT-IR (KBr), quan sát thấy các hấp thụ đặc trưng ở tần số 3380,35; và 3365 cm -1 là dao động của các liên kết O-H hoặc N-H, ở 2917,06 và 2815 cm -1 là dao động của các liên kết hóa trị C-H; tại 1646,5 cm -1 (rất mạnh) là dao động của liên kết C=O amit bậc I; ở 1622 cm-1 là dao động của liên kết olefin (C=C), ở 1537,0 cm-1 là dao động biến dạng của liên kết NH amit; còn tại 1087,8 cm -1 là dao động của liên kết C-O-C và ở 651 cm-1 là dao động biến dạng của liên kết C-H (trang 51). Qua việc phân tích các số liệu phổ 1 H-NMR (trang 52), 13 C-NMR, DEPT- 135, DEPT-90 (trang 53), HSQC (trang 55) và HMBC (trang 56) của nó, có thể thấy hợp chất này có chỉ chứa một gốc đường -D-glucopyranoza, có nguyên tử H- 1'' ở H 4,2 ppm (1H, d, JH-1"-H-2" 7,8Hz), và phần genin là một gốc ceramit. Từ các phổ DEPT-90 và DEPT-135 cho biết, trong toàn bộ phân tử RTtE3 có 15 nhóm CH (các nguyên tử C có độ dịch chuyển hóa học C ở: 53,1; 69,6; 71,8; 71,9; 73,2; 75,9; 76,1; 102,8; 128,9; 128 - 131 ppm), trong đó có 5 nhóm metin (CH) là thuộc của phần đường -D-glucozơ, 7 nhóm metin (CH) là thuộc của các C olefin, 3 nhóm metin còn lại trong phần genin, thì 1 thuộc nhóm CH liên kết trực tiếp với N có C ở 53,1 ppm, 2 nhóm metin kia thuộc phần genin liên kết trực tiếp với oxi. Ngoài ra, phổ DEPT-135 của nó còn cho biết thêm, trong RTtE3 còn có 2 nhóm metylen (CH2) liên kết trực tiếp với O, một C-6’ ở 61,1 ppm (C-6’’) là nhóm CH2 thuộc phần đường, còn một tại C-1 ở 68,2 ppm (C-1) là nhóm CH2 thuộc nhánh aminoancol trong phần genin. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Hình 3.1 Phổ FT-IR của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Hình 3.2 Phổ 1H-NMR của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Hình 3.3 Phổ 13C-DEPT của typhotrlozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Hình 3.4 Phổ 1H-1H-COSY của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Hình 3.5 Phổ HSQC của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Hình 3.6 Phổ HMBC của typhotrilozit A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Trong phổ 1H-NMR, có thể quan sát thấy độ dịch chuyển hóa học ( H) của một nguyên tử Ha ở 7,35 ppm (d, JHa-H2 =9,1Hz) đây là tín hiệu của nguyên tử Ha (NH) thuộc amit bậc 1, rất phù hợp với dao động hóa trị của liên kết CO amit ở tần số max=1646,5 và 1537 cm -1 trong phổ FT-IR, đồng thời cũng quan sát thấy có sự tương tác xa giữa nguyên tử Ha (NH) trong nhóm amit này với nguyên tử C-1’ trong nhóm carbonyl có C ở 175,2 ppm và với nguyên tử C-2 trong nhóm metin (CH) cận kề. Theo phổ HMQC của chất (RTtE3), thì một nguyên tử H có H ở 4,2 ppm, d, JH-H = 7,8 Hz có thể khẳng định đây là H-1" thuộc phần đường -D- glucozơ, có thể quan sát thấy tương tác xa giữa nó và nguyên tử C-1 của gốc aminoancol trong phần genin và C-2" trong phần đường. Các độ dịch chuyển hóa học ( H) của các nguyên tử H thuộc các nhóm metin trong phần đường có H nằm trong khoảng 3,2 – 3,75 ppm. Một nguyên tử H có H ở 3,9 ppm thuộc nhóm metin (CH), đây là nguyên tử H-2, cũng có thể quan sát thấy tương tác xa của nó với các nguyên tử C-1 và C-3 trong phổ HMBC. Còn nguyên tử H có H ở 3,85 ppm, chính là H-3 trong phần aminoancol và cũng có thể quan sát thấy tương tác xa giữa nguyên tử H này với các nguyên tử C-2 và C-4 trong phổ HMBC. Trong phổ 1 H-NMR và HSQC của RTtE3 còn cho thấy các nguyên tử H có H ở 0,87 ppm, đây là các nguyên tử H của 2 nhóm metyl (CH3) trong phần genin. Ngoài ra, nguyên tử H có H ở 3,70 và 3,85ppm, chính là các nguyên tử H-1a,b mà trong phổ HMBC cũng có thể quan sát thấy tương tác xa với C-1" trong phần đường có C-1’ ở 102,8 ppm và với C-2 (53,1 ppm) trong phần genin, và còn rất nhiều pic nằm trong khoảng 1,25- 2,5 ppm trong phổ 1H-NMR là thuộc về các nguyên tử H thuộc các nhóm metylen (CH2) trong phần genin của phân tử RTtE3. Những nguyên tử H có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 5,25 – 5,35 ppm là thuộc các nguyên tử H của các nhóm metin (CH) trong các liên kết olefin, có từ 3-4 liên kết olefin trong phần genin. Tương tác xa giữa các nguyên tử H olefin này với các nguyên tử C trong phần genin của RTtE3 cũng có thể quan sát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 thấy trong phổ HMBC của nó (Xem các phổ của RTtE3 ở các trang 51, 52, 53, 54, 55, 56 ). Những độ dịch chuyển hoá học đáng chú ý của typhtrilozit A được liệt kê ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Độ dịch chuyển hóa học của Typhotrilozit A (CD3OD/CDCl3) C C a,b H a,c (J, Hz) 1H-1H COSY HMBC (H ↔ C) Phần aminoancol NH - 7.35 d (9.1) H-2 C-1, 2, 3, 1′, 2′ 1a 1b 68.2 t 3.85 dd (6.1, 12.5) 3.70 dd (6.0, 12.8) H-1b, 2 H-1a, 2 C-2, 3 C-2, 3 2 53.1 d 3.9 m H-1a, 1b, 3, NH C-1’, 3, 4 3 71.8 d 3.85 dd, (3.2, 4.5) H-2, H-4 C-1, 2, 4 4 130.9 d 5.25 m H-3, 5a, 5b C-2, 3 5 128.9 d 5.35 m H-4, 6 C-3,4,6 6- 26 21.5 -32.4 t 1.26 br s 27 13.2 q 0.87 t (8.7) H-13 Phần axit 2-hidroxicacboxylic 1′ 175.2 s - 2′ 71.9 d 3.30 dd, (8.0, 3.7) H-3′a, 3′b C-1′, 3′ 3′a 3′b 34.3 t 2.00 m 2.20 m H-2′, 4′ H-2′, 4′ C-1′, 2′ C-1′, 2′ 4′-22′ 22.5-32.4 t; 128-131 1.26 br s 23′ 13.2 q 0.89 t (8.7) H-25′ Phần đường 1′’ 102.8 d 4.2 d (7.8) H2’’ C2’’ 2′’ 73.2 d 3.2 m H1’’,3’’ C1’’,3’’ 3′’ 75.9 d 3.25 m 4′’ 69.6 d 3.2 m 5’′ 76.1 d 3.3 m 6’’ 61.1 t 3.6 dd, (11.6; 2.15) 3.75 dd, (11.7; 5.36) H5’’ C5’’ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Hợp chất RTtE3 được thủy phân bằng axit HCl 1M trong metanol, thu được một este metyl- 2-hidrocacboxylat (RTtE3.1). Phổ EIS/MS của nó cho pic phân tử là 380 (M+) phù hợp với công thức phân tử C24H44O3. Phổ 1 H-NMR cho biết một số độ dịch chuyển hóa học đặc trưng của một số nguyên tử H như: 4,06 (H, t, H-2), 3,79 (3H, s, CH3-O), 0,89 (3H, t, 8,7); 5,2-5,65 (m, H-olefin). Còn từ phổ 13C-NMR của nó có thể khẳng định được một số nguyên tử C có độ dịch chuyển hóa học như sau: 179,7 (C-1’); 127,9;128,1; 130,1 và 130,2 (C-olefin); 70,4 (C-2’); 56,0 (CH3-O); 34,7 (C-3’); 21,4-30,9 (C- metilen); 14,4 (C-23’). Ngoài ra, còn thu được một aminoancol (RTtE3.2) mà từ phổ EIS/MS của nó cho pic phân tử là 459 (M+) (xem phần phụ lục). Qua các phân tích tổng hợp các số liệu phổ của RTtE3 như trên, có thể khẳng định chất RTtE3 là một cerebrozit, chúng tôi đặt tên cho nó là typho trilozit A, và có thể đây là một chất mới lần đầu tiên phân lập được từ cây Bán hạ ba thùy. Công thức của hợp chất này có dạng sau. R2 NH R1O OH O 1 2 3 1' 2' O H HO H HO H H OHH OH R 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' Do thời gian và khối lượng mẫu thực nghiệm còn ít, vì vậy để xác định cấu trúc hóa học hoàn thiện của cerebrozit này cần làm thực nghiệm với khối lượng mẫu nhiều hơn (khoảng 4-5kg) để thu được khối lượng chất RTtE3 đủ cho làm các thực nghiệm hóa lý (đo thêm các loại phổ như NMR, HR-FAB/MS và các loại phổ khác ..., tiến hành thực hiện các phản ứng hóa học như acyl hóa, thủy phân giáng vị để thu được các thành phần xây dựng lên phân tử RTtE3 như phần đường, phần genin gồm nhánh aminoancol và nhánh axit béo) nhằm thu thập các thông tin đầy đủ và cần thiết cho việc nhận dạng hợp chất typhotrilozit A. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 KẾT LUẬN 1. Lần đầu tiên, cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum) mọc hoang dại ở Việt Nam được nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật. Đã xác định được tên khoa học và phương pháp ngâm chiết hợp lý. 2. Từ thân, lá và rễ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum), đã phân lập được các lớp chất gồm: các axit béo no và không no, các hợp chất phytosterol, terpen- glycozit và cerebrozit. 3. Đã xác định được cấu trúc hóa học của 5 axit béo (axit palmitic, axit 11,14- octadecadienoic, axit 9,12-octadecadienoic, axit cis-linoleic, axit docosanoic), ba hợp chất phytosterol và glycozit của chúng ( -sitosterol, stigmasterol, 3-O- -D- glucopyranosyl-stigmasterol), khẳng định được một hợp chất tecpen-glycozit (RTtE1). 4. Lần đầu tiên 1 hợp chất cerebrozit (Typhotrilozit A) được phân lập từ cây Bán hạ ba thùy (Typhonium trilobatum), cấu trúc hóa học cơ bản của nó đã được khẳng định bằng các hằng số vật lý và các số liệu phổ hiện đại như: IR, MS, NMR với các kỹ thuật phổ 1D và 2D. Để khẳng định cấu trúc chính xác của nó cần có những nghiên cứu tiếp theo (vị trí các liên kết đôi, cấu hình tuyệt đối R,S, ... của phân tử). Đây là lớp chất có nhiều hoạt tính sinh học lý thú đóng vai trò quan trọng cho sự sống. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 1. Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Ngọc Tuấn, Phạm Hoàng Ngọc, Phạm Quốc Long, Lành Thị Ngọc, Nguyễn Khắc Hồng . Primary Results on the Chemical Composition of Typhonium trilobatum, 30 th anniversary of the Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology, VAST-Proceedings, 9/2008. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt 1. 1900 loài cây có ích ở Việt Nam, NXB thế giới, Hà Nội, tr. 251-257, (9/1993). 2. Khổng Thị Bình, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Bán hạ (Typhonium blumei, Araceae), họ Ráy, Luận văn thạc sĩ hóa học, Đại học Sư phạm Thái Nguyên, (2007). 3. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Tr. 969, (1999). 4. Trần Đình Đại, Khái quát về hệ thực vật Việt Nam, Hội thảo Việt - Đức về hoá học và các hợp chất thiên nhiên, tr. 17-27, Hà Nội (1998). 5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, (1999). 6. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb. Y học, tr. 44-47, (2001). 7. Lê Hữu Trác, Hải thượng y tôn tâm lĩnh. Hội YHDT T.P Hồ Chí Minh, Hội YHDT Tây Ninh , Tập VI. 1989 8. Tuệ Tĩnh, Hồng nghĩa giác tư y thư . Nxb. Y học, 1978 9. Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Hoàng Ngọc , Trần Vân Hiền, Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học của cây Ráy (Alocasia macrorrhiza (L.) Schott.) mọc hoang ở Việt Nam, Tuyển tập các kết quả nghiên cứu khoa học viện Hoá học, tr. 22-25, (2001). 10. Nguyễn Quyết Tiến, Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Ráy (Alocasia macrorrhiza (L.) Schott, Arceae), Luận án tiến sĩ hóa học , Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, (2005). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 B. Tiếng Anh 11. Achebach H.; Gross J.; Domingez X. A.; Cano G.; Lignan, neolignan and norneolignans from Karameria cystisoides, Phytochemistry, 26, p.1159-1166, (1987). 12. Achebach H.; Utz W.; Lozano B.; Touche’ E. M. G.; Moreno S.; Lignan and neolignan from Karameria parifolia, Phytochemistry, 43, p.1093-1095, (1996). 13. Bus I.; Sies I. And Lie Ken Jie; 13 C-NMR of methyl, methylene, and carbonyl carbon atoms of methylalkenoates and alkynoates, Chem. Phys. Lipids., 18, p.130-144, (1977). 14. Bus I.; Sies I. And Lie Ken Jie, M. S. F.; 13 C-NMR of double and triple bond carbon atoms of unsaterated faty acid methylesters, Chem. Phys. Lipids, 17, p.501-518, (1976). 15. (a), Chan T. Y. K.; Chan L. Y.; Tam L. S. A.; Critchley J. A. J. H.; Neurotoxicity following the ingestion of chinese medicinal plant, Alocasia macrorrhiza., H. E. Toxicology, 14(9), p. 727-728, (1976). (b), Chen J. H., Cui G. Y.; Lin J. Y. Tan R. X.; Pinelloside and antimicrobial cerebrosides from Pinellia ternata (Thumb) Breit (Araceae). Phytochemistry., 64, 903-906, (2003). 16. Chow W. S.; Qian Luping; Good child D. J.; Anderson J. M.; Photosynthetic acclimation of Alocasia macrorrhiza (L.) G. Don to growth irradiance : Structure, function and composition of chloroplast., C.A., 109, 146500d, (1988). 17. Della G. M.; Molinaro A.; Monaco P.; Previtera L.; Dihydrobenzofuran neolignan from Arum italiacum, Heterocycles, 38, p.1099-1101, (1994). 18. Della G. M.; et. Al.; Neolignans from Arum italiacum, Phytochemistry, 35, p.777-779, (1994). 19. Della G. M.; Fiorentino A.; Monilaro A.; Monaco P.; Previtera L. Hydroperoxysterols in Arum italiacum, Nat. Prod. Lett., 5(1), p.7-14, (1994). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 20. Della G. M.; Fiorentino A.; Monilaro A.; Monaco P.; Previtera L.; Steroidal 5,6-epoxides from Arum italiacum, Nat. Prod. Lett., 2(1), p.27-32, (1993). 21. Della G. M.; Monilaro A.; Monaco P.; Previtera L.; Studies on aquatic plants, J. Nat. Prod., 53(6), p.1430-1435, (1990). 22. Della G. M.; Monilaro A.; Monaco P.; Previtera L.; Two new lignan glucosides from Arum italiacum, Heterocycles 36(9), p.2081-2086, (1993). 23. Dictionary of Natural Products (CD-ROM), Version 15.1, (August 2006). 24. Fox M. G.; French J. C.; Systematic occurence of sterols in latex of Araceae : Subfamily Colocasioideae, Am. J. Bot ., 75(1), (1998). 25. Gunstone F. D.; 13 C-NMR studies of mono-, di- and triacylglycerols leading to qualitative and semiquantatitave information about mixtures of these glycerolesters, Chem. Phys. Lipids, 58, p.219-224, (1991). 26. Gunstone F. D.; High resolution 13 C-NMR a technique for the study of lipid structure and composition. Prog. Lipid Res., 33(1/2), p.19-28, (1994). 27. Gunstone F. D.; High resolution 13 C-NMR spectra of long chain acids methylester, glycerolesters, Wax esters, nitriles, amides, alkohols and acetates, Chem. Phys. Lipids, 66, p.189-193, (1990). 28. Gunstone F. D.; Information on the composition of fats from their high resolution 13 C-NMR spectra, J. Am. Oil Chem. Soc., 70, p.361-366, (1993). 29. Gunstone F. D.; The 13 C-NMR spectra of six oil containing petroselinic acid and of aquilegia oil and meadowfoam oil, which contain 5 acids. Chem., Phys. Lipids, 58, p.159-167, (1991). 30. Gunstone F. D.; The composition of hydrogenated fats by high resolution 13 C- NMR spectroscopy, J. Am. Oil Chem. Soc., 70, p.965-970, (1993). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 31. Gunstone F. D.; The study of natural epoxy oil and epoxidized vegetable oils by 13 C-NMR spectroscopy, J. Am. Chem. Soc., 70, p.1139-1144, (1993). 32. Hong Jie Zhang; Pamela A. Tamez; Vu Dinh Hoang; Ghee Teng Tan; Nguyen Van Hung; Le Thi Xuan; Le Mai Huong; Nguyen Manh Cuong; Do Thi Thao; D. Doel Soejarto; Harry H. S. Fong and John M. Pezzuto.; Antimalarial compounds from Rhaphidophora decursiva, J. Nat. Prod., 64(6), p.772-777, (2001). 33. Jaroszewski J. M. et. Al.; Ring cleavage of phennols in higher plants: Bisoynthesis of triglochinin, Phytochemistry, 20, p.819, (1981). 34. Jung J. H.; Lee H.; Kang S. S.; Diacylglycerylgalactosides from Arisaema amurense, Phytochemistry, 42(2), p. 447-452, (1996). 35. Kato T.; Frei B.; Heindrich U.; Sticher O.; Antibacterial hydroperoxysterols from Xanthosoma robustum, Phytochemistry, 41(4), p. 1191-1195, (1996). 36. Lie Ken Jie M. S. F.; and Wong C. F.; Synthesis and NMR properties of positional isomers of methyl allenic fatty ester, Chem. Phys. Lipids, 61, p.243-254, (1992). 37. Mallet J. F.; Gaydou E. M. and Archarlis. A.; Quantitative high resolution 13 C- NMR of the olefinic and carbonyl carbons of edible vegetable oils, J. Am. Chem. Soc., 67, p.607-610, (1990). 38. Mazur A. W.; Hiler G. D.; Lee S. S. C.; Armstrong M. P. and Wendel J. D.; Regio- and stereoselective enzymatic esterification of glycerol and its derivatives, Chem. Phys. Lipids, 60(2), p.189-199, (1991). 39. Mehaoui Ahmed; Bodo Bernard; Irnigaine and N-methylirnigaine, two new piperidinol alkaloids from tubers of Arisarum vulgare, Nat. Prod. Lett., 7(2), p.101-108, (1995). 40. Mehaoui Ahmed; Jossang Akino; Bodo Bernard; Antibiotic and antifungal pyrrolidine alkaloids from Arisarum vulgare, Nat. Prod. Lett., 2(3), p.237-242, (1993). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 41. Mehaoui Ahmed; Jossang Akino; Bodo Bernard; Structure of irniine, a pirrolidine alkaloid from Arisarum vulgare, J. Nat. Prod., 55(7), p. 950-952, (1992). 42. Naoki Asai, Nobuhiro Fusetani, Shigeki Matsynagaa and Jun Sasakib; Sex pheromones of the hair crab Erimacrus isenbeckii. Part 1: Isolation and structures of novel ceramides, Tetrahedron, 56, 9895-9899, (2000). 43. Naofi Noda, Ryuichirro Tanaka, Kazushige Tsdino, Machiko Miura, Kazumoto Miyahara, and Junko Hayakawab; Two amphoteric galactocerebrosides possessing a tri-unsaturated long-chain base from the Leech (Hirudo nipponica), Chem. Pharm. Bull. 43(4), 567-570, (1995). 44. Nuzillard J. M.; Massiot G.; Logic for structure determination, J. Am. Oil Chem. Soc., 47(22),p.3655- 3664, (1991). 45. O’connor G. J.; Petrocevic S. F.; Coddington J. M. and Standley R. A. ; J. Am. Chem. Soc., 69, p.295-300, (1992). 46. Qin W. J.; et. al.; Elucidation of the structure of pedatisectine A, CA., 105, 94501a, (1986). 47. Qi J., Ojika M., Sakagami Y.; Termitromycesphins A-D, Novel neuritogenic cerebrosides from the edible Chinese mushroom Termitomyces albuminocusi. Tetrahedron, 56, 5835-5841, (2000). 48. Qin W. J.; et. al.; Study on the chemical constituents of Penilla pedate (Penilla pedatisecta), CA., 102, 109744f, (1985). 49. Qin W. J.; Ma L.; Wen Y.; Yang Lan; Chemical constituens of Pinellia pedate (Pinellia pedtisecta), C.A., 122, 298789m, (1995). 50. Rohr M.; Naegeli P.; Daly J. J.; New sesquiterpenoids of sweet flag oil (Acorus calamus), Phytochemistry, 18(2), p.279-281, (1979). 51. R. X. Tan and J.H. Chen; The cerebrosides, Nat. Prod. Rep., 20, 509-534, (2003). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 52. Sam Sik Kang, Ju Sun Kim, Yong Nan Xu, and Young Hee Kim; Isolation of a new cerebroside from the root bark of Aralia elata, J. Nat. Prod, 62, 1059-1060, (1999). 53. Saxena D. B.; Phenylindane from Acorus calamus., Phytochemistry, 25(2), p.553-555, (1986). 54. Shu Y. Z.; Recent natural products based drug development : A pharmaceutical industry perspective, J. Nat. Prod., 61, p. 1054-1071, (1998). 55. Sung T. V.; Kutschabsky L.; Porzel A.; Steglich W. and Adam G.; Sesquiterpenes from the roots of Homalomena aromatica., Phytochemistry, 31, p.1659-1661, (1992). 56. Thomas Kolter and Konrad Sandhoff; Sphingolipids - Their metobolic pathways and the pathobiochemistry of neurodegenerative diseases, Angew. Chem. Int. Ed, 38, 1532-1568, (1999). 57. Xuesong Chen, Yu-Lin Wua, and Dihua Chenb; Structure determination and synthesis of a new cerebroside isolated from the traditional chinese medcine Typhonium giganteum Engl,. Tetrahedron Letter, 43, 3529-3532, (2002). 58. Ward R. S.; Lignan, neolignan and related compounds, Nat. Prod. Rep., p.1-28, (1993). 59. Wollenberg K. F.; Quantitative high resolution 13 C-NMR of the olefinic and carbonyl carbons of edible vegetable oils, J. Am. Oil Chem. Soc., 67(8), p.487- 494, (1990). 60. Wollenberg K. F.; Quantitative triacylglycerol analysis of whole vegetable seed by 1 H and 13 C-NMR magic angle sample spinning NMR spectroscopy, J. Am. Oil chem. Soc., 68, p. 391-400, (1991). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 PHỤ LỤC 1. Các Axit cacboxylic 1.1. Axit béo (RTtH1-5) 1.1.1. Kết quả phân tích các axit béo trên máy GC/MS 2. Các hợp chất sterol 2.1. Stigmast-5,22-dien-3β-ol (RTtH6) 2.1.1. Phổ hồng ngoại FT-IR 2.1.2. Phổ khối lượng EI-MS 2.1.3. Phổ 1H-NMR 2.1.4. Phổ 13C-NMR 2.2.  -Sitosterol (RTtH7) 2.2.1. Phổ hồng ngoại FT-IR 2.2.2. Phổ khối lượng EI-MS 2.2.3. Phổ 1H-NMR 2.2.4. Phổ 13C-NMR và APT 2.3. 3-O--D-glucopyranosyl-β-stigmasterol (RTtE2) 2.3.1. Phổ 1 H-NMR 2.3.2. Phổ 13 C-NMR và DEPT 3. Hợp chất terpen-glucozit (RTtE1) 3.1. Phổ 1H-NMR 3.2. Phổ 13C-NMR và DEPT 4. Hợp chất typhotrilozitA (RTtE3) 4.1.Hợp chất metyl-2-hidroxicacboxylat (RTtE3.1) 4.1.1. Phổ LC/MS của RTtE3.1 4.1.2. Phổ 1H-NMR của RTtE3.1 4.1.3. Phổ 13C-NMR của RTtE3.1 4.2. Hợp chất aminoancol (RTtE3.2) 4.2.1. Phổ LC/MS của RTtE3.2