Luận văn Nghiên cứu thành phần hoá học có trong cây phèn đen (phyllanthus reticulatus poir euphorbiaceae)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ------------------------------ PHAN VĂN DÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÓ TRONG CÂY PHÈN ĐEN (PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR EUPHORBIACEAE) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- PHAN VĂN DÂN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CÓ TRONG CÂY PHÈN ĐEN (PHYLLANTHUS RETICULATUS POIR EUPHORBIACEAE) Chuyên ngành : Hoá hữu cơ Mã số : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới PGS.TS.NGƯT Phạm Văn Thỉnh - người Thầy đã tận tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị Hồng Minh, ThS. Vũ Anh Tuấn đã giúp đỡ tôi nhiều kiến thức bổ ích và những kinh nghiệm trong nghiên cứu khoa học. Nhân dịp này, tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo khoa Hóa, khoa Sau Đại học - Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên, phòng hoạt chất sinh học - Viện Hóa học, Hội đồng giáo dục trường THPT Bắc Đông Quan - Thái Bình, Bố - Mẹ tôi cùng những người thân trong gia đình, anh em bè bạn… đã hết lòng tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong thời gian học tập, nghiên cứu khoa học và hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên, tháng 9 năm 2009 Tác giả Phan Văn Dân Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả PHAN VĂN DÂN Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN SKLM : Sắc kí lớp mỏng UV : Ultraviolet spectrocopy MS : Mass Spectroscopy EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy LC-MS : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HSQC : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation HIV : Human Immunodeficiency Virus U : Unit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục các chữ viết tắt dùng trong luận văn Danh mục các bảng, hình và sơ đồ Mục lục MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .................................................................................... 3 1.1. Mô tả thực vật ............................................................................................... 3 1.2. Các hợp chất hoá học có hoạt tính sinh học trong chi Phyllanthus ................. 4 1.2.1 Một số đại diện của khung axit .................................................................... 4 1.2.2 Một số đại diện của nhóm tecpenoit ............................................................ 6 1.2.3 Một số đại diện của lignan ........................................................................... 9 1.2.4 Một số đại diện của khung flavonoit .......................................................... 12 1.2.5 Một số hợp chất phenolic khác .................................................................. 14 1.2.6 Một số hợp chất nhóm ankaloit .................................................................. 17 1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus reticulatus Poir ............ 18 1.4 Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus ......................................................... 19 1.4.1 Một số công dụng của chi Phyllanthus ...................................................... 19 1.4.2 Một số tác dụng dược lý của chi Phyllanthus............................................. 21 CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM ............................................................................. 22 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ........................................................ 22 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu .............. 22 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ............................... 22 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ............. 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ..................................................... 23 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất ................................................................................. 23 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu ................................................................................... 24 2.3. Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) ........................ 25 2.3.1. Các dịch chiết ........................................................................................... 25 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết .............................................................. 26 2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) ..... 29 2.4.1. Dịch chiết n-hexane (HP) ......................................................................... 29 2.4.1.1 Chất HP-2 ............................................................................................... 29 2.4.1.2 Chất HP-4 ............................................................................................... 30 2.4.1.3 Chất HP-5 ............................................................................................... 30 2.4.2. Dịch chiết ethylacetate (EP) ..................................................................... 31 CHƯƠNG III. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .......................................... 32 3.1. Nguyên tắc chung ........................................................................................ 32 3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất ............................................................ 32 3.2.1. Chất HP-2 ................................................................................................ 33 3.2.2. Chất HP-4 ................................................................................................. 34 3.2.3. Chất HP-5 ................................................................................................. 36 KẾT LUẬN .......................................................................................................... 43 KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 44 PHỤ LỤC ............................................................................................................ 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH & SƠ ĐỒ Trang Bảng 2.1: Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn của cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus P., Euphorbiaceae……………...…...……….26 Bảng 2.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir, Euphorbiaceae ……………………..………………28 Bảng 3.1: Độ chuyển dịch hóa học 13C-NMR của một số sterol trong loài Phyllanthus …………………………...………………………….…..35 Bảng 3.2: Số liệu phổ NMR của HP-5………….................................................38 Bảng 3.3: Bảng so sánh số liệu phổ 1H và 13C-NMR (500MHz, CDCl3) của - acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropinoate và chất thực nghiệm (HP-5) ......................................................................... 40 Hình 1.1: Cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus P., Euphorbiaceae……............ 3 Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu...................................................................25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Lãnh thổ Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, gió mùa, độ cao không đều, diện tích vùng núi và vùng trung du chiếm đến 70% - với điều kiện môi trường tự nhiên thuận lợi tạo nên một hệ thực vật rất phong phú và đa dạng. Theo các số liệu thống kê mới nhất, thảm thực vật Việt Nam - nguồn tài nguyên sinh học quý giá - có trên 12000 loài, trong số đó có tới hơn 3200 loài được sử dụng làm thuốc hay thực phẩm chức năng trong Y học dân gian. Dân số Việt Nam gồm nhiều dân tộc anh em sinh sống, từ xa xưa đã có truyền thống chữa bệnh bằng cây cỏ mà Hải Thượng Lãn Ông gọi chung là Thảo dược. Từ nhiều thế hệ, người dân đã sử dụng tri thức bản địa để phòng và chữa bệnh cho bản thân và cộng đồng. Ngày nay, mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược đã phát triển mạnh mẽ nhờ những thành tựu mang tính đột phá và hiện đại của khoa học công nghệ nhằm giảm thiểu bệnh tật và làm tăng tuổi thọ của con người. Song nhu cầu sử dụng cây cỏ để làm thuốc vẫn ngày càng tăng lên, vì trong chúng có chứa những biệt dược rất khó tổng hợp, ngoài ra, việc dùng thuốc Nam hầu như không gây tác dụng phụ. Theo điều tra của Bộ Y tế, trong những năm gần đây, ở Việt Nam số người có mầm bệnh viêm gan chiếm tỷ lệ khá lớn, nó đã trở thành đề tài nghiên cứu cho nhiều ngành khoa học nhằm chăm lo tốt hơn đối với sức khỏe cộng đồng. Tham gia vào việc tìm thuốc từ nguồn thực vật, Y học dân gian đã phát hiện khoảng 20 loại cây cỏ có khả năng chữa trị viêm gan, trong đó đáng chú ý là các loài thuộc chi Phyllanthus (họ Thầu dầu, Euphorbiaceae) [2]. Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir) là thực vật thuộc chi Phyllanthus được dùng trong Y học cổ truyền của Việt Nam và nhiều nước trên Thế giới. Các bộ phận của cây đều được sử dụng làm thuốc: rễ Phèn đen được dùng trị lỵ, viêm ruột, ruột kết hạch, viêm gan, viêm thận và trẻ em cam tích. Lá thường dùng chữa sốt, lỵ, ỉa chảy, phù thũng, ứ huyết do đòn ngã, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 huyết nhiệt sinh đinh nhọt, còn dùng chữa bị thuốc độc mặt xám da vàng và rắn cắn. Vỏ thân dùng chữa lên đậu có mủ và tiểu tiện khó khăn. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học của cây Phèn đen. Với mong muốn làm sáng tỏ kinh nghiệm sử dụng trong dân gian, nâng cao tính hiệu quả, an toàn của dược liệu, đưa dược liệu vào sử dụng một cách khoa học hơn và có thể đẩy mạnh khai thác sử dụng cây thuốc này vào việc phòng và chữa bệnh cho nhân dân trong cộng đồng các dân tộc Việt Nam. Chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu thành phần hóa học có trong cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir, họ Thầu dầu, Euphorbiaceae)” - đó chính là tên của đề tài cho công trình nghiên cứu này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1- Mô tả thực vật Hình 1.1: Cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus Poir, Euphorbiaceae). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Cây Phèn đen còn được gọi là cây Nỗ hay Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp. Tên khoa học là: Phyllanthus reticulatus Poir, họ Thầu dầu, Euphorbiaceae. Phân bố địa lý: là loài cổ nhiệt đới, mọc hoang khắp nơi, ở bờ bụi ven đường, ven rừng có khi được trồng làm hàng rào phổ biến ở nước ta. Trên thế giới thấy nhiều ở vùng Đông Á, ở Nhật Bản cũng có mọc. Mô tả: cây bụi, cao 2 - 4m, cành gầy mảnh đen nhạt, đôi khi họp từng 2 đến 3 cành trên cùng một đốt dài 10 - 20cm. Lá có hình dạng thay đổi, hình trái xoan, hình bầu dục hay hình trứng ngược nhọn, hay tù ở hai đầu, phiến lá rất mỏng, dài 1,5 - 3cm, rộng 6 - 12mm, mặt trên màu sẫm hơn mặt dưới, lá kèm hình tam giác hẹp. Cụm hoa hình chùm mọc ở nách lá, riêng lẻ hay xếp 2 - 3 cái một. Quả hình cầu, khi chín màu đen dài 5 mm, rộng 3mm. Hạt hình 3 cạnh, màu nâu có những đốm rất nhỏ. Ra hoa kết quả tháng 8 - 10 [7]. 1.2- Các hợp chất hoá học có hoạt tính sinh học trong chi Phyllanthus Người ta đã phát hiện chi Phyllanthus, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) có trên 700 loài gồm từ những cây thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ. Ở Việt Nam có 44 loài, các loài đáng được chú ý nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L. (cây Chó đẻ răng cưa), Phyllanthus reticulatus Poir (cây Phèn đen) và Phyllanthus amarus Schum et Thonn (cây Diệp hạ châu đắng). Thành phần hoá học của chi này rất phong phú và đa dạng [20]. 1.2.1- Một số đại diện của khung axit Năm 1995, từ loài Phyllanthus amarus L. Yeap Foo [40] và Thales R. Cipriani, Caroline G. Mellinger - năm 2008 đã phân lập được axit amariinic, axit thiobarbituric và axit ascorbic [61]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 OH OH OHOH OHOH O O OH OH OH O O O O O OH OH OO OO OH OH O OH O O 1. Axit amariinic Ying-Jun Zhang đã tách được axit phyllaemblic [70], axit amlaic [62], axit ascorbic (vitamin C) là một enđiol-lacton [38], 2-O-(3,4,5-trihydroxy benzoyl) có tên khác là 2-O-galloylgalactaric acid hay 2-O-galloylmucic acid [10, 19, 92], O-(3,4,5-trihydroxybenzoyl) còn gọi là axit galloylmalic [43, 69] từ loài Phyllanthus emblica . O O OH OH H OH OH H O O OOH OH O OH OH OH 2. Axit ascorbic 3. Axit galloylmalic O O O OH OH OHOH O O OH OH OH OH OH O O O O O OH OH OH O OH OH OH OH OOH 4. Axit amlaic 5. Axit 2-O-galloylgalactaric Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Từ loài Phyllanthus fraternus năm 1997, Rajasubramaniam cùng các cộng sự đã tách được axit indole-3-butyric, axit 1-naphthaleneacetic [52]. Còn Mericli và Wanxing Wei khi nghiên cứu độc lập từ loài Phyllanthus urinaria đã phân lập được axit pentahydroxybenzoic [46, 67]. O OH OH OHOH OH OH O OH 6. Axit 1-naphthaleneacetic 7. Axit pentahydroxybenzoic 1.2.2- Một số đại diện của nhóm tecpenoit Tanaka và các cộng sự từ loài Phyllanthus flexuosus đã phân lập được 5 tritecpen mới, cấu trúc được chỉ ra là: olean-12-en-3β,15α-diol; lup-20 (29)- en-3β,24-diol; olean-12-en-3β,24-diol; olean-11:13(18)-dien-3β,24-diol và olean-12-en-3β,15α,24-triol và hai chất đã biết là: tritecpendiolbetulin [64]; lup-20(29)-en-3β,15α-diol [60]. OH CH3CH3 CH3 OH CH3 CH3CH3 CH3CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 OH 8. Olean-12-en-3β,15α-diol 9. Olean-11:13(18)-dien-3β,24-diol Năm 1988, từ loài Phyllanthus fraternus - Shunyo Matsunaga và Reiko Tanaka công bố đã tách được axit trichadenic B có cấu trúc như axit 3β-hydro xy-D:A-friedooleanan-27-oic, được xác định dựa vào phương pháp phân tích X-ray [58]. Còn từ loài Phyllanthus engleri Hnatyszyn và Sengupta đã tách được phyllanthol có cấu trúc được chỉ ra là 13,27-cyclo-3-taraxastanol (hay 13,27-cyclo-3-ursanol) [31, 56]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 HO H HOOC OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 29 20 23 27 28 30 21 22 24 25 26 10. Axit trichadenic B 11. Phyllanthol Zhang L. Z. đã tách được một số triterpen như: lupeol acetat, β-amyrin, β-amyrylglucosid, lup-28 (29)-en-3 β-ol từ loài Phyllanthus urinaria L. [71]. Cấu trúc một số hợp chất tritecpen điển hình đã được xác định như sau: HO glucozo- O 12. β-Amyrin 13. β-Amyrylglucosid CH3 CH3 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 14. Lupeol Theo Sutthivaiyakit và Nakorn N. từ loài Phyllanthus oxyphyllus tách được: 29-nor-3,4-seco-friedelan tritecpen (axit 29-nor-3,4-seco-friedelan- 4(23),20(30)-dien-3-oic) và một secquitecpen mới là guaiane secquitecpen (5- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 hydroxy-6,9-epoxyguaiane). Những hợp chất này được đánh giá là có khả năng chống oxi hóa tốt ở nồng độ thử nghiệm IC50 = 0.017 ± 0.001 mM [59]. HOOC HO O 15. 29-nor-3,4-seco-friedelane tritecpen 16. Guaiane secquitecpen Tại Châu Phi từ loài Phyllanthus plyanthus, Vuyelwa J.N. và Neil R.C. đã tìm ra được một số tritecpenoit có công thức cấu trúc được xác lập là: (20S)-3β-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, δ-amyrin acetate, lupenone và (20S)-3α-acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol, họ đặt tên cho nó là phyllanthol và phyllanthone [65]. H HO CH3OCO H H H 17. (20S)-3β-Acetoxy-24-methylenedammaran-20-ol Trên tạp chí “Phytochemistry” năm 1966 đăng tải, Sengupta và Mukhopadhyay đã tách được hai pentacyclic tritecpenoit, đó là: phyllanthol và olean-12-en-3β-ol (β-amyrin) từ loài Phyllanthus acidus [56]. Trước đó từ loài Phyllanthus niruri Bikram Singh đã tách được một acyclic tritecpen, cấu trúc của nó được dự đoán dựa trên các phương pháp phân tích phổ là: 3, 7,11,15,19,23-hexamethyl-2Z,6Z,10Z,14E,18E,22E-tetracoshexen-1-ol [17]. Còn từ loài Phyllanthus watsonii đã tách được hợp chất tritecpen mới: 26- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Nor-D:A-friedooleanane tritecpen cùng với lupenyl palmitate, friedelin, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, lup-20(2) [45]. 1.2.3- Một số đại diện của Lignan Năm 1998 - Chen và năm 2003 - Li thông báo từ loài Phyllanthus niruri đã tách được demethyleneniranthin C23H32O7 (cấu trúc của demethyl eneniranthin được chỉ ra là 4,5-dihydroxy-3,3',4',9,9'-pentamethoxylignan), linnanthin C25H36O7 hay 3-methoxyphyllanthin (cấu trúc của linnanthin là 3,3',4,4',5,9,9'-heptamethoxylignan) [22, 41]. Phyllanthin C24H34O6, hypo phyllanthin C24H30O7, niranthin C24H32O7 (cấu trúc của niranthin được chỉ ra là 3,4-methylene, 3',4',5,9,9'-penta-Me ether hay 3',4',5,9,9'-pentamethoxy- 3,4-methylenedioxylignan), nirtetralin C24H30O7 và phyllteralin C24H34O6 [11]. Dựa trên các dữ liệu phổ khối lượng và phổ cộng hưởng từ hạt nhân, cấu trúc của nirtetralin và phylltetralin được xác định là 1-phenyl tetralins. O O CH3 CH3 O CH3 O CH3 OH OH O CH3 18. Demethyleneniranthin O O CH3 CH3 O CH3 O CH3 O O O CH3 CH3 CH3 O O CH3 CH3 O CH3 O CH3 O O O CH3 19. Linnanthin 20. Niranthin Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Trong loài Phyllanthus discoides người ta đã tách được phyllanthin C14H17O2N, phyllantin C13H15O3N [44] và phyllantidin C13H15O2N [33]. CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 OCH3 H H RO R1O R2 CH2OCH3 CH2OCH3 O OCH3 H H H3CO H3CO H O 21. Phyllanthin 22. Hypophyllantin O O O CH3 O CH3 O CH3 O CH3 O CH3 CH2OCH3 CH2OCH3 OCH3 H OCH3 OCH3 H H H3CO 23. Nirtetralin 24. Phyllteralin Ở Việt Nam năm 2003, các chất hypophyllanthin, phyllanthin cũng được phân lập trong cặn n-hexan bằng phương pháp sắc kí lỏng trung áp (MPLC) từ loài Phyllanthus niruri L ở vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh [4], đây là hai lignan đã được chứng minh là có hoạt tính bảo vệ gan trên mô hình gây độc tế bào gan bằng CCl4 và D- GalN/ TNF- [3, 64]. Theo Satyanarayana và Venkateswarlu [54], từ loài Phyllanthus niruri đã tách được 4 diarylbutane lignan mới, chúng được coi là sản phẩm chuyển hóa thuộc hệ thống 5′-desmethoxy niranthin. Trong đó hai chất (25) và (26) là sản phẩm chuyển hóa từ axit veratrylidene piperonylidene succinic, (27) được chuyển hóa từ axit veratrylidene 3,4,5-trimethoxy benzylidene succinic và (28) được chuyển hoá từ (27). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 O O OMe OMe CH2OR CH2OR OMe OMe CH2OMe CH2OMe RO RO OMe 25. R = H 27. R = H 26. R = CH3 28. R = CH3 Đầu những năm 90 thế kỷ trước, các nhà khoa học do Pettit đứng đầu khi nghiên cứu về loài Phyllanthus acuminatus đã tách được phyllanthostatin 1 có công thức phân tử C40H52O17 công thức cấu tạo đã được làm rõ là ([3-O- Acetyl-6-deoxy-D-glucopyranosyl-(12)-4-O-acetyl-6-deoxy-D-gluco pyra nosyl]ester). Phyllanthostatin 2 có công thức phân tử C40H52O18 ứng với cấu tạo ([3-O-Acetyl-6-deoxy-D-glucopyranosyl-(12)-3-O-acetyl-D-glucopyra nosyl]ester). Phyllanthostatin 3 có công thức phân tử C40H54O18: (7,14- Deepoxy,7,14-dihydroxy, [3-O-acetyl-6-deoxy-D-glucopyranosyl-(12)-3-O- acetyl-6-deoxy-D-glucopyranosyl]ester). Phyllanthostatin 4 có công thức phân tử C40H52O17: ([4-O-Acetyl-6-deoxy-D-glucopyranosyl-(12)-3-O-acetyl- 6-deoxy-D-glucopy ranosyl]ester). Phyllanthostatin 5 có công thức phân tử C40H52O17: [4-O-Acetyl-6-deoxy-D-glucopyranosyl-(12)-4-O-acetyl-6-deoxy- D-glucopy ranosyl]ester). Phyllanthostatin 6 có công thức phân tử C36H48O16: và cấu trúc được làm rõ, đó là: ([6-Deoxy-D-glucopyranosyl(12)-D-glucopy ranosyl]ester) [49, 50, 51]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 O O O CH3 O O O O O OH OH OH O O OH OH OH CH3 29. Phyllanthostatin 6 1.2.4- Một số đại diện của khung flavonoit Từ tài liệu của Asakawa [12], Bick [16] và Bilia [18] - từ loài Phyllanthus tenellus đã phân lập được flavonoit tenellus-1 có công thức phân tử C35H28O17 là chất bột màu vàng với tên gọi 7-O-[4,6-[(S)-4,4',5,5',6,6'- Hexahydroxydiphenoyl]-D-glucopyranoside] có cấu tạo: O OH O O OH OH O O O O OH OH OH O OH OH OH 30. Flavonoit tenellus-1 và flavonoit tenellus-2 có công thức phân tử C42H32O21 ứng với tên gọi và cấu tạo là: 7-O-[4,6-[(S)-4,4',5,5',6,6'-Hexahydroxydiphenoyl]-3-O- (3,4,5-trihydroxybenzoyl)--D-glucopyranoside]: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 O OH O O O OH O O OH OH OH O O O OH OH OH O OH OH OH 31. Flavonoit tenellus-2 Từ dịch chiết ethanol loài Phyllanthus emblica L đã phân lập được quecxetin và catechin - đây là hai chất có hoạt tính chống oxi hóa tốt [68]. O O HO OH OH OH OH OHO OH OH OH OH * * 32. Quecxetin 33. Catechin Các nhà khoa học Ấn Độ đã khảo sát khả năng chống oxi hóa từ dịch chiết methanol của 5 loài Phyllanthus là: Phyllanthus debilis, Phyllanthus urinaria, Phyllanthus virgatus, Phyllanthus maderaspatensis, Phyllanthus amarus và khẳng định; các dịch chiết này đều cho kết quả tốt [37]. Từ loài Phyllanthus sellowianus Hnatyszyn đã phân lập được rutin và isoquercitrin là hai flavonoit chiếm thành phần chủ yếu trong cây này [32]. O OH HO O -Ramnozo -glucozo OH OH O O O OH OH HO OH 34. Rutin 35. iso-Quercitrin Theo Shakil và Pankaj, từ loài Phyllanthus niruri đã tách được 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 flavanon: 8-(3-metyl-but-2-enyl)-2-phenyl chroman-4-on (36) và 2-(4- hydroxy phenyl)-8-(3-metyl-but-2-enyl)-chroman-4-on (37). Hai chất trên được các tác giả nhận định là có khả năng làm thuốc chữa bệnh gút và bệnh thận [57]. O O 1 2 3 4 5 6 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4a 8a 8 O O 1 2 3 4 5 6 7 1' 2' 3' 4' 5' 6' 1'' 2'' 3'' 4a 8a 8 OH 36. 37. 1.2.5- Một số hợp chất phenolic khác Từ loài Phyllanthus myrtifolius và Phyllanthus urinaria ở Đài Loan, Lin và Chen Lui đã phân lập và nhận dạng được 4-O-Brevifolincarbonyl-1- O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranos là chất bột màu vàng có công thức phân tử C40H28O25 và cấu tạo được xác lập là glycozit của axít gallic với đường galactozơ theo kiểu liên kết ete [23, 42]. O OH OH OH O O O O OH OH OH O O OH O O O O OH OH OH OH OH OH O 38. 4-O-Brevifolincarbonyl-1-O-galloyl-3,6-O-hexahydroxydiphenoyl--D-glucopyranos Một số hợp chất được tách từ loài Phyllanthus emblica như: 2-O-D- Glucopyranoside C17H24O9 ở dạng tinh thể và 2-O-[-D-Apiofuranosyl-(16)-D- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 glucopyranoside] C22H32O13 (40) là chất vô định hình màu vàng [15, 36, 73]. Chất 3'-Epimer còn được gọi là (Epigallocatechin-(27,48)-gallocatechin hay prodelphinidin A1: C30H24O14 [72], putranjivain A C46H36O31 [25]. Ở quả của loài này còn phân lập được phyllanemblinin A C27H20O17 là chất bột màu trắng, emblicanin A C34H22O22, emblicanin B C34H20O22 [28]. Những thông tin mới đây của Farah Naaz và Herbert Kolodziej cho biết từ loài Phyllanthus amarus đã tách được axit shikimic (3-and 5-O-gallat), flavan-3-ol (epigallocatechin 3-gallat), proanthocyanidin và hydrolysable tannin (corilagin, casuariin, geraniin) [26, 30]. OH OH CH3 O O CH3 O OH OH OH OH OH OH CH3 O O CH3 O OH OH OH O O OH OH OH 39. 2-O-D-Glucopyranoside 40. 2-O-[-D-Apiofuranosyl-(16)-D-glucopyranoside] OH OH OH O OH OH O OH OH OH OH O OH OH 41. Prodelphinidin A1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 COOH OHHO OH OHO OH O OH OH OH OH OH OH C O 42. Axit shikimic 43. Epigallocatechin-3-gallat HO HO OH HO OH OH CO OC O OH O O OH OH OH OH O C O 44. Proanthocyanidins Cũng từ loài này L.Yeap Foo và Herbert Wong đã tách được một sản phẩm từ tannin thủy phân và đặt tên là phyllanthusiin D có cấu trúc được xác định: 1-galloyl-2,4-(acetonyl-dehydrohexahydroxydiphenoyl)-3,6-hexahydro xydiphenoylglucopyranozit [39]. Từ phần dịch chiết ethylaxetat của loài Phyllanthus niruri L, ở vùng Đình Bảng, Từ Sơn, Bắc Ninh đã phân lập được hai chất là: 2,4,6- xyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-on và 5,7,8 - trihidroxi-9,10- peoxi-4-ethoxy benzo[2,3-d] coumarin, hai chất này cho đến nay chưa thấy thông báo có mặt trong các loài Phyllanthus [4]. O HO HO OH O - CH2 -CH3 45. 2,4,6-xyclohepta-trien-2,3,7-trihydroxy-5-ethoxy-1-on Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 O HO HO O O OH O OCH2CH3 46. 5,7,8-trihidroxi-9,10-peoxi-4-ethoxybenzo[2,3-d]coumarin Hoạt tính chống oxy hóa của 5,7,8-trihidroxi-9,10-peoxi-4-ethoxy benzo[2,3-d] coumarin cùng với quercetin làm đối chứng đã được thử bằng phương pháp Potterat trong cùng một điều kiện. Cho thấy chất này thể hiện hoạt tính chống oxy hóa yếu hơn so với quercetin (ở nồng độ 25 mg/l vẫn còn phản ứng dương tính) [4]. 1.2.6- Một số hợp chất nhóm ankaloit Từ loài Phyllanthus niruri đã tách được nirurine, 4-methoxy (4- methoxynorsecurinine) [29, 35]. O O N O N O CH3 O O 47. Nirurine 48. 4-Methoxynorsecurinine Từ loài Phyllanthus amarus đã tách được 2 ankaloit mới là isobubbialine (7-epimer) và epibubbialine (2-epimer. Prenirurine)) cùng với 3 ankaloit đã biết là phyllanthine, securinine và norsecurinine. Cấu trúc của chúng được xác định trên cơ sở phân tích các dữ liệu phổ UV, IR, phổ khối lượng và phổ NMR [48]. Tại bang Florida nước Mĩ, từ loài Phyllanthus niruroides - Babady Bila, Thomas E. Gedris và Werner Herz đã phân lập được một hợp chất mới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 thuộc nhóm ankaloit là niruroidine (2,7-diepimer), cấu trúc của nó được làm sáng tỏ dựa trên các phương pháp phổ [13]. Từ loài Phyllanthus simplex lần đầu tiên đã phân lập được một ankaloit là simplexine (14-hydroxy-4- methoxy-13,14-dihydronorsecurinine) và một ankaloit đã biết là phyllanthine [53]. Chất này đã và đang được sử dụng làm thuốc Tây y dạng viên nén (sản phẩm có tên là simplexin), phổ biến trên thị trường. Ngoài những nhóm hợp chất trên, từ loài Phyllanthus discoides đã tách được 14,15-Dihydroallosecurinine-15-ol C13H17NO3 tinh thể màu vàng da cam [14, 21, 47] và phyllalbine (vanillyl tropate) C16H21NO4 [55]. N OH O O N OH O O 49. Epibubbialine 50. 14,15-Dihydroallosecurinine-15-ol 1.3- Tình hình nghiên cứu hóa học của loài Phyllanthus reticulatus Poir Theo tài liệu của GS Đỗ Tất Lợi thì tại Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu nào về thành phần hóa học của loài Phyllanthus reticulatus Poir [7]. Ở Kenya - các nhà khoa học của nước này đã sử dụng dịch chiết từ lá của loài Phyllanthus reticulatus Poir để khảo sát khả năng chống sốt rét trên chủng chloroquine - nhạy (K67) và chloroquine - kháng (ENT36) ở nồng độ thử nghiệm cho kết quả IC50  10 g /ml [24]. Một số nghiên cứu ở Đại học Hồng Kông cho biết, từ loài Phyllanthus reticulatus đã phân lập được một hợp chất mới là: 21-α-hydroxyfriedel-4(23) -en-3-on và một vài triterpenoit khác. Các nhà khoa học tại đây cũng khẳng định họ đã tách được friedelin, sitosterol, friedelan-3β-ol, glochidonol và 21α- hydroxyfriedelan-3-one [66] từ loài Phyllanthus reticulatus. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 OH CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 O CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH2 CH3CH3 OH 51. β-Sitosterol 52. 21α-Hydroxyfriedelan-3-one 1.4- Tác dụng sinh học của chi Phyllanthus 1.4.1- Một số công dụng của chi Phyllanthus Các loài cây thuộc chi Phyllanthus (Euphorbiaceae) được sử dụng rộng rãi trong y học dân tộc của nhiều nước để chữa bệnh thận, bệnh tiểu đường, bệnh viêm gan B…[9]. Các loài được dùng làm thuốc nhiều hơn cả là Phyllanthus urinaria L, Phyllanthus reticulatus Poir và Phyllanthus amarus Schum et Thonn [4]. Một số bài thuốc dùng cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn) [8]: Chữa viêm gan do virus: Cây Diệp hạ châu đắng sao khô 20g, sắc nước 3 lần. Trộn chung các nước sắc. Thêm 50g đường, đun sôi cho tan đường. Chia làm 4 lần uống trong ngày. Khi kết quả xét nghiệm HBsAg (-) thì ngừng thuốc. Chữa xơ gan cổ trướng thể năng: Cây Diệp hạ châu đắng sao khô 100g sắc nước 3 lần. Trộn chung nước sắc, thêm 150g đường, đun sôi cho tan đường, chia nhiều lần uống trong ngày, liệu trình 30 - 40 ngày. Khẩu phần ăn hàng ngày phải hạn chế muối, tăng đạm (thịt, cá, trứng, đậu phụ). Cây Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) trong y học dân tộc được nhân dân dùng để chữa đau viêm họng, đinh râu, mụn nhọt, viêm da, lở Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 ngứa, sản hậu ứ huyết đau bụng, trẻ em tưa lưỡi, chàm má, chữa bệnh gan, sốt, rắn rết cắn rất có hiệu quả. Một số bài thuốc dùng cây Chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L) [6, 8]: Nhân dân ta thường dùng toàn cây hái về làm thuốc, mùa thu hái quanh năm nhưng tốt nhất là vào mùa hạ. Thường dùng tươi có khi phơi khô, ngày uống 20 - 40g cây tươi, sao khô, sắc đặc, uống thay nước. Chữa suy gan (do sốt rét, sán lá, lỵ amip, ứ mật, nhiễm độc): Chó đẻ răng cưa sao khô 20g, cam thảo đất sao khô 20g. Sắc nước uống hàng ngày. Đối với bệnh ngoài da: Cây tươi giã nát với một ít muối đắp ngoài da với liều lượng không hạn chế. Theo các lương y, lá cây Phèn đen có vị chát, tính mát, đã được dùng lâu đời trong y học dân tộc với tác dụng làm mát máu, cầm máu, thu sáp và giảm đau. Rễ tính lạnh có tác dụng tiêu viêm, thu liễm, chỉ tả. Vỏ gây chuyển hóa [5]. Một số bài thuốc dùng cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) [5, 7]: Chữa kiết lỵ: dùng rễ cây Phèn đen, dây mơ lông, cỏ seo gà, cỏ tranh bằng nhau, mỗi vị 20g, gừng 2 lát 2g - sắc uống (Nam dược thần hiệu). Chữa bị đòn máu ứ ở trong nguy cấp: lá Phèn đen giã nhỏ, chế rượu vào và vắt lấy nước uống (Bách gia trân tàng), hoặc dùng 40g sắc rồi chế thêm một chén rượu - uống. Chữa nhọt độc mới phát: lá Phèn đen và lá Bèo ván giã nát rồi đắp (Bách gia trân tàng). Chữa nhiệt tả và lỵ: cây Phèn đen cả cành và lá, đậu đen sao, mỗi thứ 40g, đổ 4 bát nước sắc lấy 1 bát, chia ra uống làm 3 lần (Hoạt nhân toát yếu của Hoàng Đôn Hòa). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Chữa đại tiện ra máu: cây Phèn đen cả cành và lá, thái nhỏ 3 bát, sắc đặc uống (Bách gia trân tàng). Chữa chảy máu nướu răng: lá Phèn đen phối hợp với lá Long não và lá Xuyên tiêu phơi khô, chế thành viên rồi ngậm. Trị rắn cắn: lá Phèn đen tươi nhai nát nuốt hết nước rồi lấy bã đắp lên chỗ rắn cắn. 1.4.2- Một số tác dụng dược lý của chi Phyllanthus Năm 1961, phòng Đông Y - viện Vi trùng Việt Nam, nghiên cứu tác dụng kháng sinh của cây chó đẻ răng cưa thấy kết quả tác dụng kháng sinh như sau: Tụ cầu trùng (0,5 cm), Typhi (0,9 cm), Flexneri (1,1cm), Sonnei (0 cm), Shiga (1cm), Subtilis (0,4 cm), Coli (0 cm). Năm 1988 các tác giả Blunberg và Thiogarajan công bố đã điều trị 37 bệnh nhân viêm gan siêu vi B bằng chó đẻ răng cưa Phyllanthus amarus và Phyllanthus niruri đạt kết quả âm tính 22/37 bệnh nhân sau 30 ngày. Các tác giả còn chứng minh Phyllanthus amarus có chứa chất làm ức chế men pelymerase DNA của virus viêm gan siêu vi B [6]. Tại bệnh viện Thanh Nhàn - Hà Nội, năm 2002, Nguyễn Bá Kinh và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu lâm sàng, sử dụng chế phẩm LIV/94 điều trị cho các bệnh nhân viêm gan mãn tính trong 2 năm (2001-2002) đạt kết quả tốt. Thuốc có tác dụng làm giảm và sạch HBsAg của bệnh nhân [8]. Những công trình nghiên cứu hóa học gần đây về các loài Phyllanthus đã phát hiện một vài lignan, flavonoit và tanin thủy phân có tác dụng bảo vệ gan, có khả năng làm sạch phần lớn các kháng nguyên HBsAg, ức chế mạnh HIV transcriptase ngược [34]. Các thí nghiệm in vitro của cây chó đẻ với kháng nguyên HBsAg và với tổn thương gan do cacbontetraclorit gây nên đã chứng minh cây chó đẻ răng cưa có khả chống virus viêm gan B. Cây chó đẻ răng cưa có tác dụng kháng khuẩn đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn mủ xanh, trực khuẩn Coli, Shigella dysenteriae, S. flexneri, S. shigae, Moraxella và kháng nấm đối với Aspergillus fumigatus [1]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Chương 2 THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu gồm toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen, được thu hái vào tháng 11 năm 2008 tại làng Nguyễn, huyện Đông Hưng, tỉnh Thái Bình. Cây Phèn đen có tên khác là cây Nỗ hay Sáp tràng thảo, Tảo phàn diệp, dân địa phương còn gọi là Thèn đen. Mẫu cây đã được bộ môn Phân loại thực vật của khoa Sinh - trường ĐHSP Thái Nguyên giám định tên khoa học là “Phyllanthus reticulatus Poir”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae). Mẫu cây tươi sau khi thu hái gồm thân và lá được đem sấy ở 800C trong 10 phút để diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 600C cho tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô được nghiền nhỏ và ngâm chiết trong ethanol ở nhiệt độ phòng nhiều lần, liên tục trong nhiều ngày. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô đến dưới dạng xirô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexane, ethylacetate, n-butanol, methanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 500C dưới áp suất thấp. Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch . 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây phèn đen chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 - Sắc kí lớp mỏng bằng bản tráng sẵn trên đế nhôm. - Sắc kí cột silicagel, thường dùng silicagel Merck 63 - 200nm. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất phân lập được ở dạng tinh khiết là đối tượng để khảo sát các đặc trưng vật lý: màu sắc, mùi, dạng thù hình, Rf, điểm nóng chảy, đo hoạt tính quang học v.v.. khi các chất đủ sạch sẽ tiến hành ghi các phổ tử ngoại, phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), cacbon-13 ( 13 C-NMR), phổ DEPT, phổ HSQC và phổ HMBC với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và hai chiều (2D-NMR) tuỳ theo chất cụ thể. Các số liệu thực nghiệm của các chất sạch được dùng xác định cấu trúc hoá học của chúng. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi khai triển SKLM: 1. n-hexane - EtOAc (8 : 1) hệ A 2. n-hexane - EtOAc (4 : 1) hệ B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 3. n-hexane - EtOAc (2 : 1) hệ C 4. n-hexane - EtOAc (1 : 1) hệ D 5. Chloroform - methanol (9 : 1) hệ E 6. Chloroform - methanol (5 : 1) hệ F 7. Chloroform - methanol (3 : 1) hệ G 8. Chloroform - methanol (2 : 1) hệ H 9. Chloroform - methanol (1 : 1) hệ I Các bản SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở bước sóng  = 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, sau đó sấy trên 100 0 C . Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức: Rf = chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai biểu thị là Rf x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 70 - 230 mesh (0,040 - 0,063 mm) và 230 - 400 mesh (0,063 - 0,200 mm). 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên kính hiển vi Boёtus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410 (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) dưới dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP (Viện Hoá học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo kiểu va chạm electron (EI) ở 70eV, sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L hoặc trên máy sắc ký lỏng ghép khối phổ với đầu dò MSD (LC-MSD-Trap-SL) sử dụng mode ESI và đầu dò DAD. - Phổ 1H và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz AVANCE, chuẩn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 nội TMS, dung môi CDCl3, CD3OD, DMSO-D6. 2.3. Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) 2.3.1. Các dịch chiết Toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen đã phơi khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng ethanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao khô, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexane, ethylacetate, đuổi hết nước và chiết bằng n-butanol, tiếp tục đuổi hết nước và chiết bằng methanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng máy cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ ≤ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định khối lượng. Như vậy, từ toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen đã thu nhận được 4 phân đoạn là n-hexane, ethylacetate, n-butanol và methanol với các ký hiệu tương ứng là: cặn trong n-hexane (HP), cặn trong ethylacetate (EP), cặn trong n-butanol (BP) và cặn trong methanol (MP). Sơ đồ 2.1: Quy trình ngâm chiết mẫu 1. Ethanol 2. Cặn trong nước n-hexane EtOAc BuOH MeOH MẪU KHÔ Cặn n-hexane (HP) (PH) Cặn BuOH (BP) (PB) Cặn EtOAc (EP) (PE) Cặn MeOH (MP) EP-1 EP-2 EP-3 HP-2 HP-4 HP-5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Bảng 2.1: Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn của cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) Khối lượng nguyên liệu khô (g) Khối lượng cặn cồn tổng số (g) Khối lượng cặn chiết (g) n-hexane Ethylacetate n-butanol methanol 1250 315,60 37,75 26,90 26,47 47,28 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết 2.3.2.1. Phát hiện các hợp chất sterol Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 2ml dung dịch NaOH 10% đun cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn trong 3ml chloroform - lấy dịch chloroform để làm phản ứng định tính các sterol và thuốc thử Lieberman - Bourchardt (gồm hỗn hợp 1ml anhydridacetic + 1ml chloroform để lạnh ở 00C, sau đó cho thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Lấy 1ml dịch chloroform rồi thêm 1 giọt thuốc thử, dung dịch xuất hiện màu xanh trong 1 thời gian là phản ứng dương tính. 2.3.2.2. Phát hiện các ancaloid Lấy 0.01g cặn các phân đoạn, thêm 5ml HCl, khuấy đều, lọc qua giấy lọc, lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit. Ống (1): 1 - 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là phản ứng dương tính. Ống (2): 1 - 2 giọt thuốc thử Dragendorf, nếu xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống (3): 3 - 5 giọt thuốc thử Mayer, nếu xuất hiện tủa trắng là phản ứng dương tính. 2.3.2.3. Phát hiện các flavonoid Lấy 0,01g cặn của các phân đoạn, thêm 10ml methanol, đun nóng cho tan và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml nước lọc vào ống nghiệm, thêm một ít bột Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 magiê (Mg) hoặc Zn, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc, đun trong bình cách thuỷ vài phút. Dung dịch xuất hiện màu đỏ, hoặc màu hồng là phản ứng dương tính với các flavonoid. 2.3.2.4. Phát hiện các cumarin Dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.2.1. Lấy vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2ml dịch thử cho vào một trong 2 ống đó 0,5ml dung dịch NaOH 10%. Đun cách thuỷ cả hai ống trên đến sôi, để nguội rồi mỗi ống cho thêm 4ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống có kiềm trong hơn ở ống không kiềm có thể xem là phản ứng dương tính, nếu đem axit hoá ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đậm đặc sẽ làm cho dịch đang trong mất màu vàng xuất hiện vẩn đục và có thể tạo ra tủa là phản ứng dương tính. Ngoài ra có thể làm phản ứng điazo hoá với axit sulfanilic trong môi trường axit, nếu cho màu da cam đến cam nhạt, sẽ là dương tính cho cumarin. 2.3.2.5. Định tính các glucosid tim Chuẩn bị dịch thử định tính cũng làm như mục 2.3.2.1. + Phản ứng Legal: cho vào ống nghiệm 0,5ml dịch thử, thêm vào 1 giọt dung dịch natri prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu xuất hiện màu đỏ là phản ứng dương tính với vòng butenolid. + Phản ứng Keller - Kilian: Thuốc thử gồm 2 dung dịch. Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100ml axit H2SO4 đậm đặc + 1ml FeCl3 5% Cách tiến hành: lấy 0,01g cặn các dịch chiết cho vào ống nghiệm thêm vào 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ống nghiệm và cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện của màu đỏ hay nâu đỏ, giữa hai lớp chất lỏng. Nếu không xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 2.3.2.6. Định tính các saponin Chuẩn bị dịch thử như ở mục 2.3.2.1. Lấy 2 ống nghiệm mỗi ống cho 2ml dịch thử. Ống 1 cho 1ml HCl loãng, ống 2 cho 1 ml NaOH loãng rồi bịt miệng ống nghiệm, lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền vững của bọt. Nếu bọt cao quá 3 - 4 cm và bền trên 15 phút là phản ứng dương tính. Kết quả phân tích định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir, Euphorbiaceae được nêu trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Kết quả định tính các nhóm chất trong cây Phèn đen Phyllanthus reticulatus Poir, Euphorbiaceae STT Nhóm chất Thuốc thử Hiện tượng Cặn tổng 1 Sterol Lieberman- Bourchardt Màu xanh Màu vàng + 2 Ancaloit Dragendorff Vàng da cam + 3 Flavonoit Zn(Mg) + HCl Dung dịch nhạt màu dẫn đến màu đỏ nhạt + H2SO4 đặc Hồng nhạt + NaOH đặc Vàng + FeCl3 5% Xanh thẫm + 4 Cumarin Phản ứng tạo kết tủa bông Có kết tủa + 5 Glucosit trợ tim FeCl3 trong CH3COOH +H2SO4đ Vàng nâu rõ ─ 6 Saponin Phản ứng tạo bọt Bọt bền trong NaOH + Chú giải : + : Phản ứng dương tính ─ : Phản ứng âm tính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.4. Phân lập, tinh chế các chất từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) 2.4.1. Dịch chiết n-hexane Từ 15g cặn dịch n-hexane của toàn bộ phần trên mặt đất của cây Phèn đen, ký hiệu HP được phân chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexane : ethylacetate với các tỷ lệ tăng dần ethylacetate từ 0% đến 100%, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu được ba chất HP-2, H-4, HP-5. 2.4.1.1. Chất HP-2 (β-sitosterol hay stigmast-5-en-24R-3-ol ) Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexane : ethylacetate = 9 : 1. Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, phát hiện chất HP-2 bằng vanilin 1% trong dung dịch methanol-H2SO4 5%, kết tinh lại trong n-hexane thu được 29 mg chất rắn, có nhiệt độ nóng chảy ở 139 - 1400C và Rf = 72 (trong hệ dung môi A). Đo phổ chất HP-2 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ FT-IR (KBr): νmax(cm -1 ): 3431,5 (OH); 2983; 2932; 2868; 1647,2 (C=C); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Phổ 13C-NMR (125MHz, CDCl3):  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,6 (s, C-5); 121,6 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). 2.4.1.2. Chất HP-4 (β-sitosterolglucosid hay -sitosterol-3-O--D- glucopyranosyl) Ở hệ rửa giải n-hexane : ethylacetate = 2 : 3, những phân đoạn có cùng Rf = 80 trong hệ dung môi D được gộp lại, thu được cặn thô. Tinh chế lại cặn này trong CHCl3 thu được 23 mg một chất rắn vô định hình, nóng chảy ở nhiệt độ 269 - 270C. Tiến hành đo phổ chất HP-4 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ FT-IR max (cm -1): 3390 (rộng); 2934; 1644; 1461; 1373; 1073; 1026. Phổ EI-MS: m/z (%): 396 [M - C6H12O6] + (9); 273 (2); 255 (9); 185 (5); 161 (15); 145 (25); 133 (21); 105 (42), 91 (46); 81 (51); 69 (100). Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6);  (ppm): 0,65 (3H, s, Me-18); 0,93 (3H, s, Me-19). Phổ 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6);  (ppm): 140,6 (s, C-5); 121,3 (d, C- 6); 100,9 (d, C-1'); 77,1 (d, C-3'); 76,8 (d, C-5'); 76,8 (d, C-3); 73,6 (d, C-2'); 70,2 (d, C-4'); 61,2 (t, C-6'); 56,3 (d, C-14); 55,5 (d, C-17); 50,7 (d, C-9); 49,7 (d, C-24); 45,2 (s, C-13); 38,4 (t, C-4); 36,9 (t, C-12); 36,3 (t, C-1); 35,6 (s, C-10); 33,4 (d, C- 20); 31,5 (t, C-22); 31,5 (d, C-8); 29,4 (t, C-16); 28,8 (t, C-23); 27,9 (t, C-2); 25,5 (t, C-25); 23,9 (t, C-15); 22,7 (t, C-28); 21,0 (t, C-11); 20,7 (d, C-27); 19,8 (q, C-19); 19,0 (q, C-26); 12,2 (q, C-29); 11, 9 (q, C-18). 2.4.1.3. Chất HP-5 (2-Acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3- phenylpropanoate hay -acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino- phenylpropinoate) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform : methanol = 9 : 1, loại bỏ dung môi thu được 12mg chất rắn là những tinh thể hình kim, màu trắng, Rf = 87,5 trong hệ dung môi F, nóng chảy ở nhiệt độ 193-195 o C. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Đo phổ chất HP-5 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ FT-IR max (cm -1 ): 3323 (OH, NH), 3031, 2924, 2853 (CH3, CH2, CH), 1726 (C=O), 1661, 1632 (CO amit bậc I), 1532 (NH amit), 1449, 1264, 1052 (C-O-C), 699 (cấu dạng của liên kết CH=CH). Phổ ESI-MS (m/z): [M+H]+ 445 amu. Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3),  (ppm) : 7.70 (2H, dd, J 1.4 ; 8.5Hz), 7.52 (1H, tdd, J1.1, 2.3, và 7.4Hz), 7.42 (2H, dd, J 1.6 và 7.4Hz), 7.28 (2H, ddd, J 1.5, 6.7 và 7.3 Hz), 7.21 (2H, dd, J 2.3, 6.8Hz), 7.14 (3H, m), 6.72 (1H, d, J 7.4Hz), 5.96 (1H, d, J 8.6Hz), 4.75 (1H, ddd, J 6.0, 5.7, và 8.1Hz), 4.34 (1H, m), 3.93 (1H, dd, J 4.9 và 11.3Hz), 3.82 (1H, dd, J 4.3 và 11.3Hz), 3.22 (1H, dd, J 5.9 và 13.7Hz), 3.05 (1H, dd, J 8.4 và 13.7Hz), 2.74 (2H, ddd, J 6.7, 7.5 và 13.7Hz), 2.02 (3H, s, OCH3). Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3,  (ppm) : 170.75 (s, C), 170.26 (s, C), 167.12 (s, C), 136.72 (s, C), 136.65 (s, C), 133.72 (s, C), 131.91 (d, C), 129.30 (d, 2C), 129.14 (d, 2C), 128.78 (d, 2C), 128.64 (d, 2C), 128.59 (d, 2C), 127.16 (d, C), 127.06 (d, 2C), 126.76 (d, C), 64.61 (t, C), 55.01 (t, C), 49.50 (d, C), 38.43 (t, C), 37.47 (t, C), 20.78 (q, CH3O). 2.4.2. Dịch chiết ethylacetate Ở phần cặn dịch ethylacetate của cây Phèn đen, ký hiệu chung là EP được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi chloroform : methanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, từ 0 - 100% methanol, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% và hơi I2 sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi thu được 3 cặn thô tương ứng là: EP-1, EP-2 và EP-3. Những tín hiệu từ hình ảnh của phổ 1H-NMR cho thấy những chất trên chưa tinh khiết, theo đó không xác định được cấu trúc hóa học của chúng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Chương 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung Trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hóa học của các chất sẵn có trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi mẫu thu hái xong phải được diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo. Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ v.v… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật, đó là: Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu - nước để tách hầu hết các chất ra khỏi thực vật. Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các dịch chiết chứa các hợp chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho các quá trình tách tiếp theo. Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung môi từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lượt là: n- hexane, chlorofom, ethylacetate, n-butanol, methanol (ethanol), ethanol-nước. Việc chiết lấy chất từ mẫu thực vật (Phyllanthus reticulatus P.) được thực hiện theo cách 1 (Sơ đồ 2.1). 3.2. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây Phèn đen Các dịch chiết từ cây Phèn đen (Phyllanthus reticulatus P.) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phương pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng. Khi phân lập các thành phần hoá học từ lá cây Phèn đen được thực hiện như trong sơ đồ 2.1. Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng n- hexane của cây Phèn đen chúng tôi đã thu được 3 hợp chất sạch là: . 3.2.1. Chất HP-2 (β-sitosterol) Tiến hành phân chia nhờ sắc kí cột bằng hệ dung môi n-hexane: ethylacetate = 9 : 1. Sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi A, thu được 29 mg chất HP-2 có Rf = 72. Chất HP-2 là những tinh thể hình kim, không màu, nhiệt độ nóng chảy ở 139-1400C, tan tốt trong n-hexane, chloroform… Khi trộn lẫn với chất chuẩn cho một hỗn hợp có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Phổ EI- MS, m/z (%) cho [M+] = 414 (23), [M-1]+ = 413 (41). Từ phổ EI-MS cho pic [M+] = 414 ứng với công thức phân tử C29H50O. Phổ hồng ngoại, phổ 1H-NMR và phổ 13C-NMR cho thấy trong phân tử có nhóm OH tại vị trí C-3 (IR có vân 3450 cm-1 rộng, δH-3α = 3,57ppm và δC-3 = 72,1ppm). Một liên kết đôi tại C6 (phổ IR có νmax= 3010cm -1 và 1650cm -1 ứng với dao động hoá trị của liên kết đôi; còn trên phổ 1H-NMR cho δH-6 = 5,42ppm (1H, d, J, 5,2Hz), phổ 13C-NMR cho δC-5 = 141,1ppm và δC-6 = 121,7ppm). So sánh các số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của chất với số liệu phổ NMR của β-sitosterol chuẩn hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ ra ở bảng 3.1. Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của hợp chất hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất β-sitosterol. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 3.2.2. Chất HP-4 (β-sitosterolglucosid hay -sitosterol-3-O--D- glucopyranosyl) Ở hệ rửa giải n-hexane : ethylacetate = 2 : 3, những phân đoạn có cùng Rf = 80 trong hệ dung môi D được gộp lại, thu được cặn thô. Tinh chế lại cặn này trong CHCl3 thu được 23 mg một chất rắn vô định hình, nóng chảy ở nhiệt độ 269 - 270C. Tiến hành đo phổ chất HP-4 thu được các thông tin phổ như sau: Phổ IR xác nhận sự có mặt của một liên kết đôi (1640cm-1, H-6 ở 5,30ppm) và hấp thụ của nhiều nhóm hyđroxyl nằm trong vùng (3390 cm-1). Quan sát trên các phổ 13C-NMR và DEPT thấy có 35 tín hiệu của nguyên tử cacbon, trong đó có có 3 cacbon bậc 4, 14 nhóm metin (CH), 12 nhóm metylen (CH2), và 6 nhóm metyl (CH3). Đặc biệt trên phổ 13 C-NMR cho biết thấy có tín hiệu 6 nguyên tử cacbon gắn với oxy đặc trưng cho phần đường (nằm trong vùng 61,59 đến 100,92 ppm), có 2 tín hiệu ở 140,14 và 121,80ppm thuộc về một liên kết olefin. Ngoài ra có trên phổ 1H-NMR cũng quan sát thấy proton của phần đường xuất hiện ở dạng doublet tại 4,32ppm, có J=7,8Hz và C-1’ tương ứng là 100,92 ppm. Số liệu các phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR thu được cho phép nghĩ đến cấu trúc của một hợp chất glucosid có công thức C35H60O6. Những điểm trình bày ở trên và kết hợp so sánh điểm nóng chảy với sterolglucosid chuẩn đã cho phép khẳng định HP-4 là -sitosterol-3-O--D-glucopyranosyl. Phổ 1H-NMR và 13C-NMR của HP4 so với phổ của HP2 cho thấy có sự khác nhau ở vùng 61.59ppm đến 100.92ppm, các tín hiệu khác còn lại gần như giống nhau và được so sánh trên bảng 3.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Bảng 3.1: Độ dịch chuyển hóa học 13C-NMR của một số sterol trong loài Phylanthus CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 RO 1 3 5 8 9 10 11 13 15 1718 19 21 24 26 27 28 29 R (1) -sitosterol H (2) -sitosterol-glucosid Gluc STT -sitosterol (1) -sitosterolglucosid (2) 1 37.28 t 37.04 t 2 28.25 t 27.96 t 3 71.82 d 78.85 d 4 39.80 t 38.43 t 5 140.78 s 1414 s 6 121.72 d 121.80 d 7 31.68 t 31.67 t 8 31.93 d 31.67 d 9 50.16 d 50.01 d 10 36.52 s 36.47 s 11 21.10 t 20.81 t 12 42.32 t 39.55 t 13 42.34 s 42.09 s 14 56.79 d 56.55 d Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 15 24.32 t 24.00 t 16 29.71 t 29.33 t 17 56.09 d 55.85 d 18 11.87 q 11.48 q 19 19.82 q 19.36 q 20 36.16 d 35.89 d 21 19.40 q 18.94 q 22 33.97 t 33.72 t 23 26.12 t 25.85 t 24 45.57 d 45.67 d 25 29.19 d 28.94 d 26 19.05 q 18.61 q 27 18.79 q 18.41 q 28 23.09 t 22.81 t 29 11.99 q 11.54 q 1' 100.92 d 2' 73.37 d 3' 75.70 d 4' 70.05 d 5' 76.31 d 6' 61.59 t 3.2.3. Chất HP-5 (2-Acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3- phenylpropanoate hay -acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino- phenylpropinoate) Tiếp tục rửa giải cột bằng hệ dung môi chloroform : methanol = 9 : 1, cặn thu được kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi F cho Rf = 87,5, loại bỏ dung môi thu được 12mg chất rắn là những tinh thể hình kim, màu trắng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Đo phổ chất HP-5 thu được các thông tin phổ như sau: Trong phổ hồng ngoại FT-IR (KBr) có thể quan sát thấy một vài tần số dao động của các liên kết sau: max ở 3323 cm -1 là dao động của các liên kết OH hoặc NH, hấp thụ ở vùng 2924, 2853 cm-1 là dao động của các liên kết CH3, CH2, CH đặc trưng cho các nhóm OCH3 hoặc CH3-N. Tại vùng 1661cm -1 đặc trưng cho dao động hoá trị của nhóm CC hệ vòng thơm, hấp thụ đặc trưng của nhóm C=O ở vùng 1726 cm-1 còn vân 1632 cm-1 (rất mạnh) là dao động của liên kết CO amit bậc I (CONH); ở 1532 cm-1 là dao động của liên kết NH amit; còn tại 1052 cm-1 là dao động của liên kết C-O-C và ở 699 cm-1 là dao động của liên kết CH cấu dạng cis của liên kết olefin CH=CH. Trên phổ 1H-NMR cho biết có tín hiệu của các proton vòng thơm nằm trong vùng 7.06 đến 7.70ppm. Trong đó có tín hiệu đặc trưng của một nhóm CH3CO nằm ở độ dịch chuyển hoá học 2.02 (3H, s, CH3CO) đặc trưng cho các proton ở nhóm CH3 liên kết trực tiếp với nhóm C=O. Ngoài ra là các tín hiệu proton của các nhóm CH rất rõ ở độ dịch chuyển H 4.75 (1H, ddd, J 6.0, 5.7 và 8.1Hz) và 4.34 (1H, m). Các cặp tín hiệu của proton CH2 ở H 3.93 (1H, dd, J 4.9 và 11.3Hz), H 3.82 (1H, dd, J 4.3 và 11.3 Hz) với cacbon tương ứng là C 64.61ppm và ở H 3.05 (1H, dd, J 8.4 và 13.7Hz), H 3.82 (1H, dd, J 5.9 và 13.7Hz) ứng với cacbon C là 38.43ppm. Tín hiệu H ở 2.74ppm (2H, ddd, J 6.7, 7.5 và 13.7Hz) là của proton CH2 có C 37.47ppm. Đặc biệt trên phổ 1H-NMR còn quan sát thấy tín hiệu của 2 proton dạng doublet ở độ chuyển dịch H 6.72ppm (1H, J 7.4Hz) và H 5.91ppm (1H, J 8.6Hz) rất đặc trưng cho dấu hiệu của proton liên kết với nitơ (NH). Điều này cũng phù hợp với các đặc trưng dao động hấp thụ của nhóm NH trên phổ FT-IR. Quan sát trên các phổ 13C-NMR và DEPT thấy có 27 tín hiệu của nguyên tử cacbon, trong đó có có 6 cacbon bậc 4, 17 nhóm metin (CH), 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 nhóm metylen (CH2), và 1 nhóm metyl (CH3). Phổ 13 C-NMR cho biết có tín hiệu của các nhóm xeton (C=O) ở độ dịch chuyển C 170.75, 170.26 và 167.12ppm. Đặc biệt trên phổ 13C-NMR còn cho thấy có tín hiệu 6 nguyên tử cacbon (CH) nhân thơm nằm trong vùng 129.30, 129.14, 128.78, 128.64, 128.59 và 127.06ppm với cường độ lớn gấp 2 lần cacbon khác và tín hiệu của 3 cacbon còn lại nằm trong vùng C 131.91, 127.16 và 126.76ppm điều này chứng tỏ trong phân tử có 3 vòng thơm. Phổ khối ESI-MS (m/z) cho biết khối lượng phân tử của chất HP-5 là [M+H] + 445 amu. Việc phân tích các phổ 1H và 13C-NMR 1 chiều và 2 chiều đã chỉ ra HP-5 ứng với công thức C27H28N2O4. Mặt khác kết hợp các dữ liệu phổ và tài liệu thu thập được [74] đã cho phép khẳng định cấu trúc của chất HP-5 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc hoá học của chất 2-Acetamido-3-phenylpropyl 2-benzamido-3-phenylpropanoate (-acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropinoate). Bảng 3.2 : Số liệu phổ 1H và 13C-NMR (500MHz, CDCl3) của - acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropinoate (HP-5) STT C (độ bội, ppm) H (ppm, J Hz) HMBC Nhóm A 1 136.65 s H-2, H-6, H-7a, H-7b, H-8 2 129.30 d 7.28 2H, ddd, 1.5, 6.7 và 7.3Hz H-3, H-7a, H-7b 3 128.78 d 7.20 1H, m H-2, H-4 4 127.16 d 7.21 1H, m H-3, H-5 5 128.78 d 7.20 1H, m H-4, H-6 6 129.30 d 7.28 2H, ddd, 1.5, 6.7 và 7.3Hz H-5, H-7a, H-7b 7 38.43 t 3.22 3.06 1Ha, dd, J 13.5 ; 5.9Hz 1Hb, dd, J 13.5 ; 8.4Hz H-2, H-6, H-8 8 55.01 d 4.75 1H, ddd, J 6.0 ; 5.7 ; 8.1Hz H-7a, H-7b, 9 170.26 s H-7a, H-7b, H-8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 10 6.72 1H, d, J 7.4Hz Nhóm B 1’ 136.72 s H-2’, H-6’, H-7’a, H-7’b, H-8’ 2’ 129.14 d 7.07 1H, m H-3’, H-7’a, H-7’b 3’ 128.64 d 7.16 1H, m H-2’, H-4’ 4’ 126.76 d 7.14 1H, m H-3’, H-5’ 5’ 128.64 d 7.16 1H, m H-4’, H-6’ 6’ 129.14 d 7.07 1H, m H-5’, H-7’a, H-7’b 7’ 37.47 t 2.74 2H, dd, J 13.7 ; 7.5Hz H-2’, H-6’, H-8’, H-9’a, H- 9’b. 8’ 49.50 d 4.34 1H, m H-7’, H-9’a, H-9’b, H-10’ 9’ 64.61 t 3.93 3.82 1Ha, dd, J 11.3 ; 4.9Hz 1Hb, dd, J 11.3 ; 4.3Hz H-8’ 10’ 5.96 1H, d, J 8.6Hz 10’-CO 170.75 s CH3, H-9’a, H-9’b COCH3 20.78 q 2.02 3H, s 10’-CO Nhóm C 1’’ 133.7 s H-3’’ 2’’ 127.06 d 7.71 1H, dd, J 8.5; 1.4Hz H-3’’, H-4’’ 3’’ 128.59 d 7.42 1H, dd, J 7.4; 1.6Hz H-2’’, H-4’’, H-5’’ 4’’ 131.91 d 7.52 1H, td, J 7.4; 1.1Hz H-2’’, H-6’’, 5’’ 128.59 d 7.42 1H, dd, J 7.4; 1.6Hz H-4’’, H-6’’ 6’’ 127.06 d 7.71 1H, dd, J 8.5; 1.4Hz H-5’’, H-4’’ 7’’ 167.12 s H-2’’, H-6’’, H-10, H-8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 HN O O HN O O 1 2 3 4 5 6 7 8 910 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7'8' 9' 10' 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 7'' Bảng 3.3 : Bảng so sánh số liệu phổ 1H và 13C-NMR (500MHz, CDCl3) của -acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropinoate và chất thực nghiệm (HP-5) Vị trí cacbon C (độ bội, ppm) H (ppm, J Hz) [74] HP-5 [74] HP-5 Nhóm A 1 136.6 136.65 2 129.3 129.30 7.20 -7.30 (5H, m) 7.28 (1H, ddd, J 1.5 ; 6.7 và 7.3Hz) 3 128.8 128.78 7.20 (1H, m) 4 127.1 127.16 7.21 (1H, m) 5 128.8 128.78 7.20 (1H, m) 6 129.3 129.30 7.28 (1H, ddd, J 1.5 ;6.7 và 7.3Hz) 7 38.4 38.43 3.22 (1H, dd, J 13.5; 5.7Hz) 3.06 (1H, dd, J 13.5; 8.5Hz) 3.22(1H, dd, J 13.5 ; 5.9Hz) 3.06 (1H, dd, J 13.5 ; 8.4Hz) 8 55.0 55.01 1H, ddd, J 6.0 ; 5.7 ; 8.1Hz 9 170.2 170.26 10 6.72 (1H, d, J 7.8Hz) 6.72 (1H, d, J 7.4Hz) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Nhóm B 1’ 136.7 136.72 2’ 129.1 129.14 7.07 (1H, m) 7.07 (1H, m) 3’ 128.6 128.64 7.16 (1H, m) 7.16 (1H, m) 4’ 126.7 126.76 7.14 (1H, m) 7.14 (1H, m) 5’ 128.6 128.64 7.16 (1H, m) 7.16 (1H, m) 6’ 129.1 129.14 7.07 (1H, m) 7.07 (1H, m) 7’ 37.4 37.47 2.75 (2H, m) 2.74 (2H, dd, J 13.7 ; 7.5Hz) 8’ 49.4 49.50 4.35 (1H, m) 4.34 (1H, m) 9’ 64.6 64.61 3.93 (1H, dd, J 11.2; 4.8Hz) 3.82 (1H, dd, J 11.2; 4.3Hz) 3.93 (1H, dd, J 11.3 ; 4.9Hz) 3.82 (1H, dd, J 11.3 ; 4.3Hz) 10’ 5.91 (1H, d, J 7.8Hz) 1H, d, J 8.6Hz 10’-CO 170.75 CO CH3 20.78 2.02 (3H, s) Nhóm C 1’’ 133.6 133.7 2’’ 127.0 127.06 7.71 (1H, m) 7.71 (1H, dd, J 8.5; 1.4Hz) 3’’ 128.6 128.59 7.44 (1H, m) 7.42 (1H, dd, J 7.4; 1.6Hz) 4’’ 131.9 131.91 7.53 (1H, tt, J 7.6; 1.1Hz) 7.52 (1H, td, J 7.4; 1.1Hz) 5’’ 128.6 128.59 7.44 (1H, m) 7.42 (1H, dd, J 7.4; 1.6Hz) 6’’ 127.0 127.06 7.71 (1H, m) 7.71 (1H, dd, J 8.5; 1.4Hz) 7’’ 167.1 167.12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Những kết quả thu được ở cây Phèn đen (Phyllantyhus reticulatus ) cho biết sự có mặt của các sterol: -sitosterol, -sitosterol-3-O--D-glucopyranosid, -acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropinoate. Đặc biệt là sự có mặt của hợp chất 2-Acetamido-3-phenylpropyl 2- benzamido-3-phenylpropanoate là hợp chất có chứa 2 nitơ lần đầu tiên được các nhà khoa học Trung Quốc phân lập từ loài Gastrodia elata Blumei vào năm 2002. Kết quả nghiên cứu trên cho biết đây là lần đầu tiên trong chi Phyllanthus đã phân lập được hợp chất này và Phyllanthus reticulatus cũng là loài thực vật thứ 2 trong thiên nhiên đã phân lập được nó. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 KẾT LUẬN 1. Phân tích sàng lọc hóa thực vật một số nhóm chất của cây Phèn đen (Phyllanthus reticulates P.,) mọc hoang ở Thái Bình đã chỉ ra sự có mặt của sterol, saponin và ancaloit. 2. Lần đầu tiên nghiên cứu hoá thực vật cây Phèn đen (Phyllanthus reticulates P.,) đã xác định các tính chất hoá lý của 3 chất thuộc nhóm chất sterol và polyphenol. 3. Bằng các phương pháp vật lý, hoá học và các phương pháp phổ hiện đại IR, LC-MS, 1H và 13C-NMR với kỹ thuật ghi 1D và 2D đã xác định được cấu trúc của 3 chất nói trên -sitosterol, -sitosterol-3-O--D- glucopyranosyl và -acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino- phenylpropionate. 4. Lần đầu tiên từ chi Phyllanthus đã phân lập được hợp chất - acetylamino-phenylpropyl -benzoylamino-phenylpropionate và Phyllanthus reticulatus cũng là loài thực vật thứ 2 trong thiên nhiên đã phân lập được chất này. KIẾN NGHỊ Cây Phèn đen là một cây thuốc có nhiều tác dụng trong y học. Đề tài này của chúng tôi mới chỉ là những nghiên cứu ban đầu, vì vậy chúng tôi đề nghị với các cấp có thẩm quyền tiếp tục tổ chức nghiên cứu một cách sâu rộng hơn về cây Phèn đen nhằm làm rõ các ứng dụng của nó - phục vụ tốt trong đời sống nhân dân. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích và cộng sự (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội. 2. Nguyễn Văn Đậu, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyễn Đình Chung (2003), “Nghiên cứu hoạt chất sinh học từ cây chó đẻ thân xanh (Phyllanthus niruri LINN. Euphorbiaceae)”, Tạp chí Dược học, số 329 năm 43, tr. 12-15. 3. Nguyễn Văn Đậu, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyễn Đình Chung (2003), “Phân lập một số hoạt chất từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, số 9 năm 43, tr. 12-15. 4. Nguyễn Văn Đậu, Trần Thị Thu Hà (2007), “Nghiên cứu hóa thực vật cây chó đẻ răng cưa (Phyllanthus urinaria L. Euphorbiaceae)”. Tạp chí dược học, số 369 năm 47, tr. 15-18. 5. Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr. 724-725. 6. Đỗ Tất Lợi (1997), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học Hà Nội, tr. 65-67. 7. Đỗ Tất Lợi (2000), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr. 550-551. 8. Nguyễn Thượng Phong và cộng sự (2001), “Khảo sát công dụng làm thuốc của một số loài Phyllanthus ở Việt Nam”, Tạp chí dược liệu, 6 (2+3), tr. 72-75. 9. Trần Đình Thắng, Bùi Quang Chính, Hoàng Văn Lựu, Nguyễn Xuân Dũng (2007), “Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất phenolic từ cây chó đẻ răng cưa”, Tạp chí Dược học, số 371 năm 47, tr. 14-17. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 B. Tài liệu tiếng Anh 10. Anet (1954), “E.F.L.J. et al.”, Nature (London), 174, p.930. 11. Anjaneyulu (1973), “A.S.R. et al.”, Tetrahedron, 29(1), p.1291. 12. Asakawa (1971), “Y. et al.”, Bull. Chem. Soc. Jpn., 44, p.271. 13. Babady-Bila (1996), “Niruroidine, a norsecurinine-type alkaloid from Phyllanthus niruroides”, Phytochemistry, 41(5), p.1441-1443. 14. Bevan (1964), “C.W.L. et al.”, Chem. Ind. (London), p.2054. 15. Bohr (2005), “G. et al.”, J. Nat. Prod., 68, p.1545-1548. 16. Bick (1972), “I.R.C. et al.”, Aust. J. Chem., 25, p.449. 17. Bikram Singh, P.K. Agrawal and R.S. Thakur (1989), “An acyclic triterpene from Phyllanthus niruri”, Phytochemistry, 28(7), p.1980-1981. 18. Bilia (1993), “A. R. et al.”, Phytochemistry, 33, p.1449. 19. Burden (1974), “I.J. et al.”, J.C.S. Perkin 1, p. 863 . 20. Calixto J. B., Santos A. R. (1998), “A review of the plants of the genus Phyllanthus”, Pharmacology, 4(18), p.225-258. 21. Chatterjee (1964), “A. et al.”, J. Indian Chem. Soc., 41, p.163-172. 22. Chen (1998), “C.-C. et al.” , J. Nat. Prod., 61, p.227-229. 23. Chen Lui (1999), “K.C.S. et al.”, Planta Med. 65, p.43-46. 24. E. Omulokoli, B. Khan, S.C. Chhabra (1997), “Antiplasmodial activity of four Kenyan medicinal plants”, Journal of Ethnopharmacology, 56, p. 133-137. 25. El-Mekkawy (1995), “S. et al.”, Chem. Pharm. Bull., 43, p.641-648. 26. Farah Naaz, Saleem Javed, M.Z. Abdin (2007), “Hepatoprotective effect of ethanolic extract of Phyllanthus amarus Schum. et Thonn”, Ethnopharmacology, 113(3), p.503-509. 27. Foo (1995), “L.Y”, Phytochemistry, 39, p.217-224. 28. Ghosal (1996), “S. et al.”, Indian J. Chem., Sect. B, 35, p.941. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 29. Hassarajani (1990), “S. A. et al.”, Indian J. Chem., Sect. B., 29, p.801. 30. Herbert Kolodziej (2005), “Tannins and related compounds induce nitric oxide synthase and cytokines gene expressions in Leishmania major”, Bioorganic, 13(23), p.6470-6476. 31. Hnatyszyn (1985), “O. et al.”, Planta Med, p.467. 32. Hnatyszyn, (2002), “The hypoglycemic effect of Phyllanthus sellowianus fractions”, Phytomedicine, 9(6), p.556-559. 33. Horii Z. (1972), “Et all”, Tetrahedron Letters, p.1887. 34. Jangfang Quian-Cutrone (1996), “J. Nat.” Prod., (59), p.196-199. 35. Joshi (1986), “B.S. et al.”, J. Nat. Prod., 49, p.614. 36. Kosasi (1989), “S. et al.”, Phytochemistry, 28, p.2439-2441. 37. Kumaran, Karunakaran (2007), “In vitro antioxidant activities of methanol extracts of five Phyllanthus species from India”, Food Science, 40(2), p.344-352. 38. Kumar Roy, H. Dhir, A. Sharma (1992), “Modification of metal-induced micronuclei formation in mouse bone marrow erythrocytes", Toxicology Letters, 62(1), p.9-17. 39. L. Yeap Foo (1992), “Phyllanthusiin D, an unusual hydrolysable tannin from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 31(2), p.711-713. 40. L. Yeap Foo (1995), “Amariinic acid and related ellagitannins from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 39(1), p.217-224. 41. Li (2003), “N. et al.”, J. Nat. Prod., 66, p.1421-1426. 42. Lin (1995), “J.H. et al.”, Chin. Pharm. J. (Taipei) , 47, p.113. 43. Lutz (1902, 1908), “O.”, Ber, 35, p.2460, 41, p.841. 44. Manske R. H. F (1973), “The Alkaloids chemistry and physiology”, Phytochemistry, (15), p.428. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 45. Matsunaga, Tanaka (1992), “26-Nor-D:A-friedooleananetrit erpenes from Phyllanthus watsonii”, Phytochemistry, 32(1), p.165-170. 46. Mericli (1991), “A.H. et al.”, Phytochemistry, 30, p. 4195-4196. 47. Mukherjee (1966), “R. et al.”, Indian J. Chem., 4, p.459. 48. Peter J. Houghton, Tibebe Z. Woldemariam (1996), “Two securinega-type alkaloids from Phyllanthus amarus”, Phytochemistry, 43(3), p.715-717. 49. Pettit (1984), “G.R et al.”, J.O.C., 49, p.4258-4266. 50. Pettit (1985), “G.R et al.”, J.O.C., 50, p.5060-5063. 51. Pettit (1990), “G.R et al.”, J.Nat.Prod., 53, p.1406-1413. 52. Rajasubramaniam, Pardha Saradhi (1997), “Rapid multiplication of Phyllanthus fraternus: a plant with anti-hepatitis viral activity”, Industrial Crops and Products, 6(1), p.35-40. 53. Rajkishor S. Negi, Thawra M. Fakhir (1998), “An alkaloid from Phyllanthus simplex”, Phytochemistry, 27(9), p.3027-3028. 54. Satyanarayana, Venkateswarlu (1991), “Isolation, structure and synthesis of new diarylbutane lignans from Phyllanthus niruri”, Tetrahedron, 47(42), p.8931-8940. 55. Sharova (1980), “S.F. et al.”, Khim. Prir. Soedin., 16, p.672; Chem. Nat. Compd. (Engl. Transl.), 16, p.487. 56. Sengupta, Mukhopadhyay (1966), “Terpenoids and related compounds- VII : Triterpenoids of Phyllanthus acidus skeels”, Phytochemistry, 5(3), p.531-534. 57. Shakil, Pankaj (2008), “Nematicidal prenylated flavanones from Phyllanthus niruri”, Phytochemistry, 63(3), p.759-764. 58. Shunyo Matsunaga, Reiko Tanaka, (1988), “Revised structure of trichadenic acid B”, Tetrahedron Letters, 29(37), p.4751-4754. 59. Sutthivaiyakit, Nakorn N. (2003), “ A new guaiane sesquiterpene from the roots of Phyllanthus oxyphyllus”, Tetrahedron, 59(50), p.9991-9995. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 60. Tanaka, K. Masuda and S. Matsunaga (1993), “Lup-20(29)-en-3β,15α- diol and ocotillol-II”, Phytochemistry, 32(2), p.472-474. 61. Thales R. Cipriani, Caroline G. Mellinger (2008), “Acidic heteroxylans from medicinal plants and their anti-ulcer activity”, CarbohydratePolymers, 74(2), p.274-278. 62. Therasa (1967), “Y.M. et al.”, Leather Sci. (Madras), 14(16-17), p.67. 63. Tongasawa (1955), “Y et al.”, CA, 49, p.7064. 64. Van der B.D.A.(1991), “Viettlink A. J.”, Plant Biochemistry, 6, p.47-70. 65. Vuyelwa J. N., Neil R. C. (2008), “Triterpenoids from the African tree Phyllanthus polyanthus”, Phytochemistry Letters, 1(1), p.11-17. 66. Wai-Haan Hui, Man-Moon Li, Kam-Moon Wong (1976), “A new compound, 21α-hydroxyfriedel-4(23)-en-3-one and other triterpenoids from Phyllanthus reticulatus”, Phytochemistry, 5(15), p.797-798. 96. Wanxing Wei, Yuanjiang Pan (2005), “Carboxylic acids from Phyllanthus urinaria”, Chemistry of Natural Compounds, 41(1), p.17-20. 68. Xiaoli Liu, Chun Cui, M. Zhao (5/2008), “Antioxidant activity of methanolic extract of emblica fruit”, Journal of Food, 21(3), p.219-228. 69. Yoshihara (1977), “ T. et al.” , Agric. Biol. Chem., 41, p.2427. 70. Ying-Jun Zhang (2006). “A novel highly oxygenated norbisabolane from the roots of Phyllanthus emblica”, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Japan, p.1-14. 71. Zhang L. Z., Guo Y. J. (2000), “Studies on chemical constituents of Phyllanthus urinaria L”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 10(25), p.615-617. 72. Zhang (2000), “Y.-J. et al.”, J. Nat. Prod. , 63, p.1507-1511. 73. Zhang (2002), “Y.-J. et al.”, Chem. Pharm. Bull., 50, p. 841-843. 74. Zyi-Tao Wang and Yong-Qing Xiao, Lili, Bao-Lin Bian, Xin-Miao Liang (2002), “A new compound from gastrodia elata blume”, Journal of Asian Pro Research, 4(1), p.73-79. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 PHỤ LỤC 1. Phổ FT-IR của β-sitosterol HP-2 2. Phổ 1H-NMR của β-sitosterol HP-2 3. Phổ 13C-NMR và DEPT của β-sitosterol HP-2 4. Phổ 1H-NMR của β-sitosterolglucosid HP-4 5. Phổ 13C-NMR và DEPT của β-sitosterolglucosid HP-4 6. Phổ 1H-NMR của HP-5 7. Phổ 13C-NMR và DEPT của HP-5 8. Phổ LC-MS của HP-5 9. Phổ HSQC của HP-5 10. Phổ HMBC của HP-5 11. Phổ 1H-NMR của EP-1 12. Phổ 1H-NMR của EP-2 13. Phổ 1H-NMR của EP-3 14. Phổ FT-IR của HP-5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 88 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 89 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 90 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 91 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 92 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 93 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 94 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 95 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 96 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 97 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 98 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 99 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 100 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 101 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 102 XÁC NHẬN CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... ......................................................................................................................... .........................................................................................................................