Luận văn Nghiên cứu sử dụng trái thanh long (hylocereus undatus) để chế biến nước uống lên men

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH LE THÒ KIEÀU OANH NGHIEÂN CÖÙU SÖÛ DUÏNG TRAÙI THANH LONG (Hylocereus undatus) ÑEÅ CHEÁ BIEÁN NÖÔÙC UOÁNG LEÂN MEN LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH - 2005 LÔØI CAÛM ÔN Em xin traân troïng baøy toû loøng bieát ôn saâu saéc ñeán coâ Traàn Thò Thanh – caùn boä giaûng daïy cuûa tröôøng Ñaïi Hoïc Sö Phaïm Thaønh phoá Hoà Chí Minh ñaõ taän tình giuùp ñôõ, höôùng daãn vaø truyeàn ñaït cho em nhieàu kinh nghieäm quyù baùu trong suoát quaù trình thöïc hieän luaän vaên naøy. Em xin chaân thaønh caûm ôn quyù thaày coâ Khoa Sinh vaø caùn boä giaûng daïy lôùp cao hoïc khoùa 13 chuyeân ngaønh Vi sinh vaät ñaõ taän taâm giaûng daïy vaø truyeàn ñaït cho em nhieàu kieán thöùc quyù baùu trong suoát khoùa hoïc. Em xin baøy toû loøng bieát ôn ñeán caùc thaày coâ, caùn boä phuï traùch phoøng thí nghieäm sinh lyù-sinh hoùa- vi sinh ñaõ nhieät tình giuùp ñôõ vaø taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho em hoaøn thaønh toát luaän vaên naøy. Caûm ôn caùc baïn cuøng khoùa ñaõ ñoùng goùp nhieàu yù kieán, giuùp ñôõ ñoäng vieân trong suoát thôøi gian qua. Con xin chaân thaønh kính toû loøng bieát ôn boá meï vaø anh Leâ Kim Nhaät ñaõ ñoäng vieân an uûi vaø laø choã döïa tinh thaàn cuõng nhö vaät chaát taïo ñieàu kieän thuaän lôïi ñeå hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Hoïc vieân Leâ Thò Kieàu Oanh MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan I Mục lục II Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt VI Danh mục các bảng VII Danh mục các hình X Danh mục các đồ thị XI MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………1 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU…………………………………………… 3 Chương 1: Nấm men và lên men etylic.................................................................. 3 1.1 Đặc điểm hình thái nấm men ..................................................................... 3 1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa ......................................................................... 3 1.3 Phân loại nấm men .................................................................................. 12 Chương 2: Ứng dụng của nấm men trong công nghiệp chế tạo đồ uống lên men 23 2.1 Đồ uống có độ rượu nhẹ ........................................................................... 23 2.2 Đồ uống có độ rượu cao ........................................................................... 32 2.3 Thực trạng chế biến thức uống lên men ở Việt Nam ............................... 33 Chương 3: Những hiểu biết về trái thanh long.................................................... 36 3.1 Đặc điểm của cây, trái thanh long ............................................................ 36 3.2 Tình hình sản xuất và sử dụng trái thanh long ......................................... 37 3.3 Những khó khăn khi sử dụng trái thanh long chế biến thành nước uống lên men .......................................................................................... 39 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………….40 Chương 4: Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị .......................................................... 40 4.1 Nguyên liệu .............................................................................................. 40 4.2 Hóa chất ................................................................................................... 41 4.3 Thiết bị...................................................................................................... 41 4.4 Các loại môi trường nghiên cứu ............................................................. 41 Chương 5: Các phương pháp nghiên cứu ............................................................ 45 5.1 Các phương pháp vi sinh vật ................................................................... 45 5.2 Các phương pháp hóa lý .......................................................................... 51 5.3 Các phương pháp toán học ....................................................................... 55 5.4 Phương pháp đánh giá cảm quan.............................................................. 55 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ............................................................. 56 Chương 6: Kết quả xử lý và chế biến trái thanh long thành dịch quả làm môi trường nuôi cấy nấm men 56 6.1 Khảo sát thành phần dịch trái thanh long Bình Thuận ............................ 56 6.2 Chế biến và xử lý trái thanh long làm môi trường nuôi cấy nấm men .... 58 Chương 7: Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm men phù hợp với yêu cầu chế biến đồ uống lên men từ dịch trái thanh long ............................ 63 7.1 Phân lập và thuần khiết các chủng nấm men có nguồn gốc khác nhau ................................................................................................................ 63 7.2 Tuyển chọn các chủng nấm men phù hợp với yêu cầu chế biến đồ uống lên men từ dịch trái thanh long ................................................. 65 Chương 8: Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men LT2............................................................................................. 78 8.1 Đặc điểm hình thái.................................................................................... 78 8.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men LT2............. 81 8.3 Khảo sát khả năng tạo chất kháng sinh của chủng nấm men LT2 ........... 85 8.4 Tìm hiểu khả năng kháng một số kháng sinh của chủng LT2 ................... 88 8.5 Định danh ................................................................................................. 90 Chương 9: Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trong quá trình nhân giống ................................................................................................. 93 9.1 Xác định thời gian sinh trưởng và chế độ lắc thông khí thích hợp đối với chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trong quá trình nhân giống....................................................................................................... 93 9.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu ...................................................................... 95 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường............................................................ 96 9.4 Sử dụng dịch ép trái thanh long làm môi trường nhân giống................... 98 Chương 10: Khảo sát khả năng sử dụng chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long................ 105 10.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên quá trình lên men etylic ở môi trường dịch trái thanh long của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ....................................................................................... 105 10.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên quá trình lên men etylic ở môi trường dịch trái thanh long của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ....................................................................................... 110 Chương 11: Khảo sát động thái lên men rượu của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trong quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long ...................................................................... 115 11.1 Khảo sát giai đoạn lên men hiếu khí .................................................... 115 11.2 Khảo sát giai đoạn lên men kị khí ....................................................... 117 11.3 Khảo sát lên men kị khí ở nhiệt độ thấp ............................................... 120 11.4 Hoàn thiện sản phẩm ........................................................................... 122 11.5 Xây dựng quy trình chế tạo nước uống lên men từ trái thanh long ở quy mô phòng thí nghiệm..................................................................... 129 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................ 132 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT C: Cacbon [C]: Nồng độ glucose CP: Centipoise N: Nitơ Pthô: Protein thô Sac: Saccharomyces cerevisiae TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam TL: Thanh long TL450, TL465, TL580: lượng dịch thu được lần lượt là 450, 465, 480ml/1kg trái thanh long được trích ly bằng nhiệt độ cao. V/p: Vòng/phút DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng của trái thanh long Bình Thuận .......... 37 Bảng 6.1 Thành phần hóa học dịch trái thanh long Bình Thuận .............. 56 Bảng 6.2 Thành phần một số dịch quả được sử dụng trong sản xuất rượu vang.................................................................................. 57 Bảng 6.3 Dịch trái thanh long (100ml) được xử lý bằng Ca(OH)2 và lòng trắng trứng gà ................................................................... 61 Bảng 7.1 Đặc điểm hình thái của các chủng nấm men ............................. 64 Bảng 7.2 Khả năng tạo hương thơm của các chủng nấm men ................. 66 Bảng 7.3 Khả năng kết lắng của các chủng nấm men ............................. 67 Bảng 7.4 Hoạt lực lên men của các chủng nấm men trên môi trường sirô (MT12) và môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) ..................................................................................... 69 Bảng 7.5 Khảo sát hoạt lực lên men và đánh giá cảm quan sản phẩm lên men của các chủng nấm men đơn lẻ và tổ hợp các chủng nấm men trên môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) ............................................................................... 71 Bảng 7.6 Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men mạnh trên môi trường thanh long thích hợp............................. 73 Bảng 7.7 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT2 trên các loại môi trường nước trái thanh long đã xử lý ……………...…………………..........................................76 Bảng 8.1 Đặc điểm hình thái của chủng nấm men LT2............................. 79 Bảng 8.2 Khả năng lên men các loại đường của chủng nấm men LT2 ......83 Bảng 8.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của nấm men LT2 .............................................................................................83 Bảng 8.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu lên sự sinh trưởng của chủng nấm men LT2 84 Bảng 8.5 Khả năng chịu nồng độ cồn của chủng nấm men LT2 ..........85 Bảng 8.6 Khả năng tạo chất kháng sinh kháng các vi khuẩn kiểm định của chủng nấm men LT2 .................................................86 Bảng 8.7 Khả năng kháng một số kháng sinh của chủng nấm men LT2 .............................................................................................88 Bảng 8.8 Đặc điểm sinh học và phân loại của chủng nấm men LT2 và chủng Saccharomyces cerevisiae 91 Bảng 9.1 Sự thay đổi mật độ tế bào theo thời gian nhân giống của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ..................................... 94 Bảng 9.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình tăng sinh khối chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ................................................95 Bảng 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình tăng sinh khối của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2........................97 Bảng 9.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long.........................................99 Bảng 9.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long..............................................100 Bảng 9.6 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long..............................................101 Bảng 9.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ là hỗn hợp (NH4)2SO4 và pepton hoặc cao nấm men đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long .............................................103 Bảng 10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ...............................................106 Bảng 10.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ....................................107 Bảng 10.3 Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2..............................109 Bảng 10.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2..............................111 Bảng 10.5 Ảnh hưởng của hàm lượng hỗn hợp (NH4)2SO4 và vitamin B1 đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ...............................................113 Bảng 11.1 Quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long trong điều kiện hiếu khí ........................................... 116 Bảng 11.2 Khảo sát thời gian lên men kị khí ở 300C của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trên môi trường dịch trái thanh long ............................................................................. 119 Bảng 11.3 Khảo sát thời gian lên men kị khí ở 100C của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 trên môi trường dịch trái thanh long ............................................................................... 121 Bảng 11.4 Kết quả phân tích các chỉ tiêu về chất lượng sản phẩm đồ uống lên men từ dịch trái thanh long ........................... 123 Bảng 11.5 Một số chỉ tiêu chất lượng nước thanh long lên men sau thời gian bảo quản .................................................................. 124 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 4.1 Trái thanh long ruột trắng Bình Thuận ...................................... 40 Hình 8.1 Hình thái khuẩn lạc của chủng nấm men LT2 ............................ 78 Hình 8.2 Hình thái tế bào nấm men LT2 (×100) ....................................... 79 Hình 8.3 Nang bào tử của nấm men LT2 (×100)....................................... 80 Hình 8.4 Khuẩn ty của chủng nấm men LT2 (×40) ................................... 81 Hình 8.5 Khả năng đồng hóa các nguồn nitơ vô cơ của chủng nấm men LT2 ................................................................................... 82 Hình 8.6 Chủng nấm men LT2 kháng E. coli và Bacillus pimitilis ........... 87 Hình 8.7 Chủng nấm men LT2 kháng Salmonella typhimurium và Klebsiella ................................................................................. 87 Hình 8.8 Chủng nấm men LT2 kháng Serratia sp. và Streptococcus sp………………………………………………………………………87 Hình 8.9 Khả năng kháng chloramphenicol và ceftazidime ..................... 89 Hình 8.10 Khả năng kháng gentamycin và kanamycin ............................ 89 Hình 8.11 Khả năng kháng neomycin và acid nalidixic ........................... 89 Hình 11.1 Sản phẩm nước thanh long lên men..................................... ..127 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 7.1 Khả năng kết lắng của các chủng nấm men .......................... 67 Biểu đồ 7.2 Hoạt lực lên men của các chủng nấm men trên môi trường sirô (MT12) và môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) ................................................................... 69 Biểu đồ 7.3 Hoạt lực lên men của chủng nấm men đơn lẻ và tổ hợp các chủng nấm men trên môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) ........................................................... 72 Biểu đồ 7.4 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT2 trên môi trường dịch trái thanh long qua lọc (MT13) và môi trường dịch trái thanh long không lọc (MT14)................... 74 Biểu đồ 7.5 Hoạt lực lên men của chủng nấm men LT2 trên các loại môi trường nước trái thanh long đã xử lý ........................... 76 Biểu đồ 9.1 Động thái sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae LT2 ......................................................................................... 94 Biểu đồ 9.2 Ảnh hưởng pH ban đầu đến quá trình tăng sinh khối Saccharomyces cerevisiae LT2 .............................................. 96 Biểu đồ 9.3 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình tăng sinh khối của Saccharomyces cerevisiae LT2 ........................ 97 Biểu đồ 9.4 Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long ........................................... 102 Biểu đồ 9.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ là hỗn hợp (NH4)2SO4 và pepton hoặc cao nấm men đến quá trình nhân giống trên môi trường dịch trái thanh long .......................................... 103 Biểu đồ 10.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2.................................. 106 Biểu đồ 10.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2.................................. 108 Biểu đồ 10.3 Ảnh hưởng của hàm lượng giống đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ................... 109 Biểu đồ 10.4 Ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ................... 111 Biểu đồ 10.5 Ảnh hưởng của hàm lượng hỗn hợp (NH4)2SO4 và vitamin B1 đến khả năng lên men của chủng Saccharomyces cerevisiae LT2 ........................................... 113 Biểu đồ 11.1 Động thái quá trình lên men tạo nước giải khát từ dịch trái thanh long trong điều kiện hiếu khí............................... 116 Biểu đồ 11.2 Hàm lượng chất khô trong giai đoạn lên men kị khí......... 119 1 MÔÛ ÑAÀU Ñoà uoáng leân men ñaõ ñöôïc con ngöôøi bieát ñeán vaø söû duïng caùch ñaây vaøi theá kyû. Daàn daàn söï tieán boä cuûa khoa hoïc kyõ thuaät, ñaëc bieät khi ngaønh coâng ngheä thöïc phaåm vaø coâng ngheä vi sinh ngaøy caøng phaùt trieån thì caùc saûn phaåm veà ñoà uoáng ñöôïc caûi tieán khoâng ngöøng veà chaát löôïng vaø caû veà chuûng loaïi nhaèm ñaùp öùng thò hieáu ngöôøi tieâu duøng. Hôn nöõa, con ngöôøi ngaøy caøng hieåu roõ hôn giaù trò dinh döôõng vaø hieäu quaû kinh teá lôùn lao cuûa caùc saûn phaåm veà ñoà uoáng maø giôø ñaây chuùng coù maët ôû haàu heát caùc nöôùc treân theá giôùi. Ñoà uoáng leân men thöôøng söû duïng nguoàn nguyeân lieäu tinh boät hoaëc töø caùc loaïi traùi caây. Trong taát caû caùc loaïi ñoà uoáng, ñoà uoáng leân men töø traùi caây raát ñöôïc quan taâm bôûi ngoaøi höông vò thôm ngon töï nhieân noù coøn chöùa caùc chaát dinh döôõng nhö caùc loaïi muoái khoaùng, ñöôøng, vitamin…chöùa saün trong traùi caây. Vieät Nam vôùi ñaëc ñieåm laø nöôùc noâng nghieäp nhieät ñôùi thích hôïp cho vieäc troàng caùc loaïi caây aên quaû neân coù nguoàn nguyeân lieäu raát phong phuù thuaän lôïi cho vieäc saûn xuaát caùc loaïi ñoà uoáng leân men. Trong caùc loaïi quaû hieän coù cuûa Vieät Nam, traùi thanh long ôû caùc tænh cuûa mieàn Nam coù saûn löôïng lôùn vaø chaát löôïng cao nhöng hieän nay traùi thanh long chæ môùi ñöôïc söû duïng laøm thöùc aên traùng mieäng, cheá bieán coctail, thôø cuùng vaø xuaát khaåu traùi töôi [17] [20]. Ñeå goùp phaàn laøm ña daïng hoùa caùc saûn phaåm ñoà uoáng leân men vaø söû duïng coù hieäu quaû hôn nguoàn ñaëc saûn doài daøo laø traùi thanh long ôû caùc ñòa phöông, chuùng toâi ñeà xuaát moät höôùng môùi nghieân cöùu söû duïng traùi thanh long vôùi ñeà taøi “Nghieân Cöùu Söû Duïng Traùi Thanh Long (Hylocereus undatus) Ñeå Cheá Bieán Nöôùc Uoáng Leân Men”. Muïc tieâu cuûa ñeà taøi: cheá bieán traùi thanh long laøm nöôùc uoáng leân men nhaèm laøm ña daïng hoùa caùc saûn phaåm töø traùi thanh long vöøa coù giaù trò giaûi khaùt, boå sung dinh döôõng vöøa coù taùc duïng trò lieäu. 2 Nhieäm vuï cuûa ñeà taøi: 1. Phaân laäp caùc chuûng naám men ñeå laøm nguoàn gioáng naám men cho quaù trình tuyeån choïn. 2. Tuyeån choïn caùc chuûng naám men thích hôïp vôùi yeâu caàu leân men dòch traùi thanh long. 3. Nghieân cöùu moät soá ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng naám men choïn ñöôïc, treân cô sôû ñoù tieán haønh ñònh danh. 4. Nghieân cöùu moät soá yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh tröôûng, phaùt trieån vaø leân men cuûa chuûng ñaõ choïn treân moâi tröôøng dòch traùi thanh long ñeå taïo nöôùc giaûi khaùt leân men ñaït chaát löôïng cao. 5. ÖÙng duïng chuûng naám men choïn ñöôïc ñeå leân men taïo nöôùc giaûi khaùt treân moâi tröôøng dòch traùi thanh long. 3 PHAÀN I: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU CHÖÔNG 1: NAÁM MEN VAØ LEÂN MEN ETYLIC 1.1 Ñaëc ñieåm hình thaùi naám men Teá baøo naám men coù nhieàu hình daïng khaùc nhau: hình troøn, hình tröùng nhö Saccharomyces cerevisiae, hình elip nhö Saccharomyces ellipsoideus, hình quaû chanh nhö Saccharomyces apiculatus, ñoâi khi coù hình chai nhö Saccharomyces Ludwigu hoaëc hình oáng daøi nhö Pichia. Moät soá teá baøo naám men coù hình daøi, noái tieáp nhau taïo thaønh daïng sôïi goïi laø khuaån ty giaû nhö Endomyces, Endomycopsis, Candida… Nhieàu loaøi naám men chæ taïo khuaån ty giaû khi soáng trong moâi tröôøng thieáu oxy [32]. Noùi chung hình daùng cuûa teá baøo naám men ôû caùc loaøi khaùc nhau thì khaùc nhau, trong cuøng moät loaøi hình daùng cuûa teá baøo coù theå thay ñoåi tuøy thuoäc vaøo ñieàu kieän moâi tröôøng, ñieàu kieän nuoâi caáy vaø tuoåi cuûa teá baøo. Teá baøo naám men coù kích thöôùc trung bình 3-5× 5-10μm, kích thöôùc cuûa teá baøo naám men thay ñoåi nhieàu tuøy thuoäc vaøo loaøi, gioáng vaø ñieàu kieän cuûa moâi tröôøng soáng …[64]. Trong moâi tröôøng loûng coù nhieàu loaøi naám men coù khaû naêng sinh ra moät lôùp maøng bao boïc nhö taám voan moûng nhö ôû Saccharomyces hoaëc daøy ôû Drojdiile micodermice. Treân moâi tröôøng ñaëc, khuaån laïc naám men coù nhieàu hình daïng khaùc nhau, maøu traéng ñuïc, vaøng hoaëc hoàng nhaït. Teá baøo naám men trong töï nhieân coù theå ñöùng rieâng leû hoaëc sau khi naûy choài vaãn dính vôùi nhau taïo thaønh chuoãi [32]. 1.2 Ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa Naám men laø nhoùm vi sinh vaät coù caáu taïo ñôn baøo, khoâng di ñoäng vaø sinh saûn chuû yeáu baèng caùch naûy choài [34], soáng dò döôõng [54]. Naám men coù khaû naêng sinh saûn raát nhanh vaø taïo ñöôïc löôïng lôùn sinh khoái trong thôøi gian ngaén. Sinh khoái naám men raát giaøu protein, vitamin vaø lipid. 4 Ñeå quan saùt hình thaùi vaø ño kích thöôùc teá baøo naám men ngöôøi ta thöôøng söû duïng moâi tröôøng maïch nha dòch theå nuoâi trong 3 ngaøy ôû 25-300C. Moät soá teá baøo naám men coù hình daøi, noái tieáp nhau taïo thaønh daïng sôïi goïi laø khuaån ty giaû. Nhieàu loaøi naám men chæ taïo khuaån ty giaû khi soáng trong moâi tröôøng thieáu O2. Muoán quan saùt khuaån ty giaû, ngöôøi ta caáy nhöõng ñöôøng ngaén naám men treân moâi tröôøng thaïch ñóa sau ñoù ñaäy laù kính noåi leân ñöôøng caáy vaø nuoâi ôû 25-300C trong 3-4 ngaøy. Nhieàu loaøi naám men coù khaû naêng sinh baøo töû tuùi. Naám men thöôøng taïo baøo töû tuùi sau 5-7 ngaøy nuoâi caáy treân moâi tröôøng thaïch-maïch nha [6]. 1.2.1 Leân men etylic [31] [32] Leân men röôïu laø quaù trình hoâ haáp kò khí, trong ñoù ñöôøng bò phaân giaûi thaønh röôïu (C2H5OH) vaø CO2 döôùi taùc duïng cuûa vi sinh vaät, ñaëc bieät naám men. Phöông trình phaûn öùng toång quaùt: C6H12O6 n a ám m e n 2 C2H5OH + 2 CO2 + 113,4 KJ Glucose etylic 1.2.1.1 Caùc giai ñoaïn leân men röôïu Coù theå chia quaù trình leân men röôïu thaønh 2 giai ñoaïn: Giai ñoaïn taêng sinh khoái naám men: Giai ñoaïn naøy naám men naûy choài vaø phaùt trieån maïnh ñeå taêng sinh khoái vì trong moâi tröôøng ñaày ñuû chaát dinh döôõng vaø O2. Giai ñoaïn leân men: Khi thieáu O2, naám men baét ñaàu bieán ñoåi ñöôøng thaønh röôïu vaø CO2 . Quaù trình naøy thöïc chaát raát phöùc taïp, goàm nhieàu phaûn öùng hoaù hoïc lieân tieáp ñeå taïo thaønh etanol. Coù theå chia thaønh 5 giai ñoaïn chính: ™ Giai ñoaïn phosphorin hoùa D-glucose + ATP Mg2+ D-glucose 6 phosphat + ADP hexokinase D-glucose 6 phosphat phosphohexoizomerase D-fructose 6 phosphat 5 D-fructose 6 phosphat + ATP phosphofructokinase D-fructose 1,6 diphosphat ™ Giai ñoaïn caét ñoâi maïch : D-fructose 1,6 diphosphat aldolase dioxyacetophosphat + D-glyceraldehyd 3 phosphat Trong teá baøo dioxyacetophosphat coù theå bieán ñoåi hoaøn toaøn thaønh glyceraldehyd 3 phosphat Dioxyacetophosphat D-glyceraldehyd 3 phosphat ™ Giai ñoaïn oxy hoùa: D-glyceraldehyd 3 phosphat + NAD dehydrogenase 1,3-diphosphoglycerat + NADH2 1,3-diphosphoglycerat + ADP 3-phosphoglycerat + ATP 3-phosphoglycerat phosphoglyceromatase 2-phosphoglycerat 2-phosphoglycerat enolase phosphoenol pyruvat + H2O ™ Giai ñoaïn taïo piruvat: Phosphoenol pyruvat + ADP pyruvatkinase pyruvat + ATP ™ Giai ñoaïn piruvat taïo thaønh etanol Pyruvat pyruvatdecacboxylase acetaldehyd + CO2 Acetaldehyd + NADH2 alcoldehydrogenase etanol + NAD Keát thuùc quaù trình treân ta thu ñöôïc röôïu etylic, ngoaøi ra coøn thu ñöôïc hoãn hôïp caùc saûn phaåm phuï khaùc (nguoàn goác laø amin vaø caùc chaát khaùc). Do ñoù caùc ñoà uoáng leân men coù giaù trò dinh döôõng cao. 1.2.1.2 Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men etylic 6 Naám men ñoøi hoûi phaûi coù nhöõng ñieàu kieän nhaát ñònh môùi coù theå leân men. Trong saûn xuaát röôïu, ngoaøi vieäc löïa choïn chuûng naám men, coøn phaûi nghieân cöùu taïo ñieàu kieän thích hôïp ñeå ñaït hieäu suaát leân men cao. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình leân men: AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä Nhieät ñoä laø yeáu toá aûnh höôûng raát lôùn. Moãi vi sinh vaät coù moät yeâu caàu veà nhieät ñoä thích hôïp cho söï phaùt trieån cuûa mình. Nhieät ñoä caøng cao leân men caøng sôùm baét ñaàu, toác ñoä nhanh vaø keát thuùc sôùm, nhöng haøm löôïng ñöôøng coøn laïi vôùi moät löôïng khaù lôùn. Ñieàu naøy coù theå laø nguy hieåm, vì haøm löôïng ñöôøng soùt coù theå ñöôïc vi khuaån lactic söû duïng ñeå taïo thaønh acid lactic aûnh höôûng nhieàu ñeán chaát löôïng cuûa saûn phaåm. Ngoaøi ra nhieät ñoä coøn aûnh höôûng ñeán khaû naêng sinh toång hôïp caùc saûn phaåm thöù caáp vaø caùc saûn phaåm phuï. Nhieät ñoä caøng cao caøng deã sinh vaø tích tuï caùc saûn phaåm phuï ngaøy caøng nhieàu. Ñieàu naøy khoâng coù lôïi cho saûn phaåm chính [22]. Trong coâng nghieäp röôïu coàn ngöôøi ta thöôøng duøng caùc chuûng naám men thích hôïp cho leân men ôû 30-35°C, leân men röôïu vang 20-30°C vaø döôùi 10°C trong thôøi gian taøng tröõ (leân men phuï). AÛnh höôûng pH cuûa moâi tröôøng pH moâi tröôøng coù yù nghóa quan troïng trong quaù trình leân men röôïu. Ñoái vôùi men röôïu vang khoaûng pH thích hôïp laø 2,8-3,8, Saccharomyces vini pH=3,5. So vôùi men röôïu (Saccharomyces cerevisiae) vaø men bia (Saccharomyces carbergensis) thì men röôïu vang chòu ñöôïc acid cao hôn. Caùc loaøi khuaån laøm hoûng röôïu hoaït ñoäng ôû pH cao hôn 3,5 nhöng yeáu hôn ôû pH thaáp hôn 3,5. Do ñoù giöõ pH trong giôùi haïn 3-3,5 laø ñeå öùc cheá hoaït ñoäng cuûa khuaån haïi [22]. AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng ñöôøng 7 Haøm löôïng ñöôøng coù aûnh höôûng raát lôùn ñeán naêng löïc leân men. Haøm löôïng ñöôøng thích hôïp nhaát laø 13-15% töông ñöông vôùi noàng ñoä chaát khoâ töø 16-18%. Neáu haøm löôïng ñöôøng quaù cao seõ laøm taêng aùp suaát thaåm thaáu vaø laøm maát caân baèng traïng thaùi sinh lyù cuûa naám men. Neáu haøm löôïng ñöôøng thaáp seõ khoâng taïo ñieàu kieän cho quaù trình leân men. Trong thöïc teá, ôû haøm löôïng ñöôøng 30-35% thì söï leân men bò ñình chæ cho duø coù loaïi naám men coù khaû naêng leân men ñöôïc ôû haøm löôïng ñöôøng leân ñeán 60% [34]. O2 Naám men laø vi sinh vaät hieáu khí tuøy tieän vaø chæ trong ñieàu kieän kò khí noù môùi tieán haønh leân men röôïu, do ñoù khi muoán coù röôïu ta phaûi taïo ñieàu kieän kò khí. Tuy vaäy, duø trong tröôøng hôïp coù ñaày ñuû O2 vaãn coù moät löôïng röôïu ñöôïc taïo thaønh [34]. Noàng ñoä röôïu vaø khí CO2 Ña soá naám men chæ leân men ñöôïc tôùi noàng ñoä röôïu 13-14%, chæ coù moät soá ít leân men ôû noàng ñoä röôïu 17-20%. Tuy khí CO2 öùc cheá söï leân men nhöng vieäc thoaùt khí CO2 laïi coù taùc duïng toát ñeán quaù trình leân men. Söï thoaùt khí CO2 seõ laøm cho moâi tröôøng luoân bò khuaáy ñoäng, keùo daøi ñöôïc traïng thaùi lô löõng cuûa naám men do ñoù laøm taêng nhanh söï leân men. Qua ñoù ta thaáy moät ñieàu phoå bieán chính saûn phaåm cuûa söï trao ñoåi chaát khi ñaït tôùi moät noàng ñoä naøo ñoù seõ coù taùc duïng öùc cheá ñoái vôùi baûn thaân vi sinh vaät ñoù [34]. 1.2.2 Khaû naêng söû duïng caùc hôïp chaát cao phaân töû [32] 1.2.2.1 Hydratcacbon Ñoái vôùi naám men nguoàn cacbon thích hôïp nhaát laø caùc loaïi ñöôøng nhö glucose, fructose, sacarose, maltose, rafinose, lactose, dextrin. Ñoái vôùi caùc chuûng thuoäc loaøi Saccharomyces cerevisiae coù khaû naêng ñoàng hoaù ñöôïc caùc loaïi ñöôøng hexose vaø noùi chung khoâng ñoàng hoaù ñöôïc ñöôøng pentose. 8 Caùc chuûng naám men rieâng bieät söû duïng caùc nguoàn ñöôøng raát khaùc nhau. Ví duï: caùc chuûng naám men röôïu söû duïng nguoàn ñöôøng glucose; vôùi caùc gioáng men bia, söû duïng ñöôøng maltose. Caùc teá baøo naám men tröôùc khi söû duïng caùc loaïi ñöôøng coù trong moâi tröôøng ñeàu phaûi thöïc hieän moät trong hai quaù trình sau: ™ Haáp thuï hoaøn toaøn caùc loaïi ñöôøng ñoù qua maøng nhö maltose vaø maltotriose coù khaû naêng thaám thaáu tröïc tieáp qua maøng teá baøo. ™ Thuyû phaân trong moâi tröôøng roài môùi haáp thuï nhö sacarose caàn phaûi thuyû phaân tröôùc bôûi enzim ngoaïi baøo roài sau ñoù caùc saûn phaåm thuyû phaân naøy môùi ñöôïc haáp thu. Nhö vaäy naám men chæ söû duïng caùc loaïi ñöôøng coù trong moâi tröôøng maø khoâng coù khaû naêng phaân giaûi nguoàn nguyeân lieäu tinh boät baèng enzim. Do ñoù caàn giai ñoaïn ñöôøng hoùa caùc nguyeân lieäu tröôùc khi tieán haønh caùc quaù trình leân men. 1.2.2.2 Protein Söï phaùt trieån cuûa naám men lieân quan ñeán söï haáp thu nitô, chuû yeáu laø caùc loaïi acid amin. Chuùng ñöôïc teá baøo söû duïng ñeå toång hôïp protein vaø caùc hôïp chaát chöùa nitô khaùc. Naám men tieâu hoaù toát caùc acid amin, keùm hôn laø pepton vaø hoaøn toaøn khoâng tieâu thuï ñöôïc protein töï nhieân. Ñoái vôùi naám men röôïu khoâng phaûi taát caû caùc acid amin ñeàu söû duïng ñöôïc. Ngöôøi ta chia caùc acid amin thaønh caùc nhoùm: ™ Nhoùm haáp thu nhanh: izolôxin, triptophan, arginin, valin, histidin, asparatic acid. ™ Nhoùm haáp thu chaäm: trionin, phenylalanin, tirozin, metionin, serin, glyxin, acid glutamic, lôxin. ™ Nhoùm khoâng haáp thu: prolin [32]. 1.2.2.3 Lipid 9 Trong suoát quaù trình leân men, naám men haáp thuï caùc acid beùo töï do, phaàn lôùn chuùng ñöôïc keát hôïp laïi thaønh caùc lipid caáu truùc trong thaønh teá baøo naám men. Naám men Saccharomyces cerevisiae vaø nhöõng loaøi gaàn vôùi chuùng coù nhu caàu acid beùo khoâng no trong quaù trình phaùt trieån ôû ñieàu kieän hieáu khí vaø kò khí, thì trong quaù trình hoâ haáp naám men coù nhu caàu tieâu thuï acid beùo khoâng no gaáp 4 laàn so vôùi bình thöôøng do tham gia vaøo quaù trình phosphoryl hoaù ñeå toång hôïp ATP [32]. 1.2.3 Khaû naêng taïo chaát khaùng sinh cuûa chuûng naám men 1.2.3.1 Khaùng sinh vaø caùc con ñöôøng toång hôïp Theo Waksman ñònh nghóa raèng: Khaùng sinh laø nhöõng chaát hoùa hoïc coù nguoàn goác töø cô theå soáng coù taùc duïng öùc cheá söï sinh tröôûng hay tieâu dieät moät soá vi sinh vaät khaùc moät caùch moät choïn loïc ngay khi ôû noàng ñoä thaáp [59]. Coù nhieàu quan ñieåm khaùc nhau veà khaû naêng hình thaønh chaát khaùng sinh töø vi sinh vaät: 9 Söï hình thaønh chaát khaùng sinh laø cô cheá giuùp vi sinh vaät toàn taïi. 9 Söï hình thaønh chaát khaùng sinh laø do söï caïnh tranh moâi tröôøng dinh döôõng, thöôøng chaát khaùng sinh khoâng coù moät vai troø roõ reät ñoái vôùi teá baøo sinh ra chuùng. 9 Chaát khaùng sinh chæ laø saûn phaåm thaûi ra moâi tröôøng cuûa quaù trình trao ñoåi chaát, do ñoù maø söï maát khaû naêng hình thaønh chaát khaùng sinh khoâng laøm maát khaû naêng sinh tröôûng. Chaát khaùng sinh coù caáu truùc khaùc nhau vaø vi sinh vaät sinh ra chuùng cuõng ña daïng nhö: vi khuaån Staphylococcus aureus 209 P hoaëc Bac. mycoides HB (loaïi nhaün) vaø naám Penicillium notatum cho chaát khaùng sinh penicilline, khaùng sinh streptomycine thu nhaän töø xaï khuaån Streptomyces griseus, khaùng sinh kanamycin thu nhaän töø xaï khuaån Streptomyces fradie [59]. 10 Maëc duø chaát khaùng sinh coù caáu truùc khaùc nhau nhöng quaù trình toång hôïp gaàn nhö theo moät soá con ñöôøng nhaát ñònh. Cô cheá sinh toång hôïp chaát khaùng sinh töø vi sinh vaät coù theå qua moät soá con ñöôøng sau: 9 Chaát khaùng sinh ñöôïc toång hôïp töø moät chaát trao ñoåi chaát sô caáp duy nhaát. Ví duï chloramphenicol, chaát khaùng sinh thuoäc nhoùm nucleozit. 9 Chaát khaùng sinh ñöôïc hình thaønh töø 2, 3 chaát trao ñoåi baäc 1 khaùc nhau, ví duï lincomycin. 9 Chaát khaùng sinh ñöôïc toång hôïp baèng caùch polymer hoùa caùc chaát trao ñoåi chaát baäc moät sau ñoù coù theå tieáp tuïc bieán ñoåi qua caùc phaûn öùng enzym khaùc; coù theå phaân bieät thaønh boán daïng: o Chaát khaùng sinh nhoùm polypeptit theo con ñöôøng truøng hôïp caùc axit amin. o Chaát khaùng sinh amyloglucozid ñöôïc taïo thaønh töø caùc phaûn öùng truøng hôïp polymersaccarit: neomicine, streptomycine. o Chaát khaùng sinh ñöôïc taïo thaønh nhôø phaûn öùng polymer hoùa caùc ñôn vò acetat, propionat. o Chaát khaùng sinh ñöôïc hình thaønh theo con ñöôøng toång hôïp caùc chaát izopreonit töø caùc ñôn vò acetat [25]. 1.2.3.2 Chaát khaùng sinh coù töø naám men Ketler toxin hay coøn goïi laø zymocine: laø loaïi chaát khaùng sinh ñöôïc moät soá chuûng naám men vaø vi naám tieát ra nhaèm choáng laïi söï caïnh tranh giöõa caùc chuûng cuøng loaøi hoaëc chuûng thuoäc hoï gaàn. Hieän töôïng naøy laàn ñaàu tieân ñöôïc Bevan vaø Macower phaùt hieän naêm 1936 treân chuûng naám men Saccharomyces. Cho ñeán nay khaû naêng sinh zymocine ñaõ ñöôïc tìm thaáy ôû nhieàu chuûng naám men thuoäc hoï khaùc nhau nhö: Pichia, Kluyveromyces, Debaryomyces, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces, Candida, Sporidiobolus, Cryptcoccus (Schmitt vaø 11 Neuhansen, 1994, Magliani et al., 1997, Vondrejs vaø Palkova, 1997). Taát caû caùc zymocine ñöôïc bieát ñeán ñeàu laø nhöõng polypeptid hoaëc glycoprotein. Ñaëc tính sinh hoïc coù theå ñöôïc maõ hoùa treân ARN maïch keùp, DNA plasmid vaø maïch thaúng treân chromosome. Do tính chaát choïn loïc raát cao, zymocine coù tieàm naêng nhö nhöõng chaát khaùng sinh höõu hieäu choáng laïi moät soá beänh nang y [45]. Khaû naêng taïo chaát khaùng sinh cuûa moät loaøi naám men ñöôïc nhieàu coâng trình nghieân cöùu, öùng duïng nhaéc tôùi ñoù laø chuûng naám men Saccharomyces boulardii vôùi coâng trình nghieân cöùu “Xaây döïng quy trình nuoâi caáy vaø thöû taùc duïng trò loaïn khuaån cuûa chuûng naám men Saccharomyces boulardii”. Thaïc só Nguyeãn Kim Minh Taâm cho thaáy khaû naêng coù theå saûn xuaát moät loaïi thuoác trò loaïn khuaån ñöôøng ruoät môùi vôùi öu ñieåm vöôït troäi so vôùi caùc loaïi thuoác trò loaïn khuaån khaùc: coù khaû naêng ñeà khaùng caùc chaát khaùng sinh. Trong töông lai coù theå saûn xuaát loaïi thuoác noùi treân vôùi chi phí thaáp. Beân caïnh ñoù caùc keát quaû nghieân cöùu cuõng cho thaáy naám men Saccharomyces boulardii coøn coù khaû naêng tieát ra protease tieâu giaûi ñoäc toá cuûa Clostridium difficile, vi khuaån gaây vieâm ruoät keát maøng giaû cuõng nhö trung hoøa ñöôïc noäi ñoäc toá E. coli vaø Vibrio cholerae neân coù theå duøng trong döï phoøng tieâu chaûy caáp tính [37]. Hieän nay coâng ty döôïc cuûa Myõ ñaõ cheá taïo khaùng sinh töø naám men Saccharomyces boulardii ôû daïng vieân neùn, loï 50 vieân [69]. 1.3 Phaân loaïi naám men 1.3.1 Phöông phaùp phaân loaïi naám men Ñeå phaân loaïi naám men, ngöôøi ta söû duïng phöông phaùp phaân loaïi coå ñieån (döïa vaøo caùc ñaëc ñieåm hình thaùi hoïc, sinh lyù sinh hoùa) vaø phöông phaùp phaân loaïi döïa vaøo keát quaû cuûa phaân tích kyõ thuaät di truyeàn [27] [32]. 1.3.1.1 Phöông phaùp döïa vaøo ñaëc ñieåm hình thaùi hoïc, ñaëc ñieåm sinh lyù sinh hoùa 12 Chuûng naám men ñöôïc caáy vaøo caùc ñóa petri chöùa moâi tröôøng Hansen ñeå quan saùt hình thaùi khuaån laïc (hình daïng, kích thöôùc, maøu saéc), hình daïng teá baøo, kích thöôùc teá baøo, hình thöùc naûy choài, xaùc ñònh khaû naêng sinh baøo töû cuûa caùc chuûng naám men, quan saùt khuaån ty, khaû naêng leân men caùc nguoàn hydratcacbon, thöû khaû naêng sinh tröôûng treân moâi tröôøng agar chöùa muoái nitrat, aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä, pH, khaû naêng phaân giaûi ureâ…[6] [27]. 1.3.1.2 Phöông phaùp phaân loaïi döïa vaøo kyõ thuaät di truyeàn Phaân loaïi theo phöông phaùp coå ñieån coù ñoä chính xaùc khoâng cao vaø bò haïn cheá khi xaùc ñònh caùc chuûng coù ñaëc ñieåm gaàn gioáng nhau. Maëc khaùc thôøi gian kieåm tra thöôøng bò keùo daøi [32]. Ngaøy nay cuøng vôùi söï tieán boä cuûa sinh hoïc phaân töû nhieàu phöông phaùp phaân loaïi môùi vôùi ñoä chính xaùc cao ñaõ ñöôïc nghieân cöùu vaø öùng duïng. Trong ñoù phöông phaùp phaân tích trình töï chuoãi RNA ribosom cuûa teá baøo naám men ñaõ ñöôïc bieát ñeán nhö moät phöông phaùp phaân loaïi hieän ñaïi, nhanh choùng vaø coù ñoä tin caäy cao [27]. Phöông phaùp naøy döïa vaøo trình töï chuoãi RNA cuûa caùc gen r18S, 26S vaø ITS. ™ Caùc gen naøy ñöôïc khueách ñaïi baèng phaûn öùng PCR (Polymerase Chain Reaction) ™ Caùc caëp moài (primers) ñöôïc söû duïng vaø coù trình töï acid nucleic nhö sau: Moài cho khueách ñaïi gen 18S rRNA: NS1: GTAGTCATATGCTTGTCTC NS8: TCCGCAGGTTCACCTACGGA Moài cho khueách ñaïi gen ITS rRNA: ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG 13 ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC Moài cho khueách ñaïi moät phaàn gen 26S rRNA vuøng D1/D2: NC1: GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG NC4: GGTCCGTGTTTCAAGAAGG Chu kyø nhieät phaân cuûa phaûn öùng ñöôïc aùp duïng: 980C/giaây, 580C/60giaây, 720C/120giaây vôùi 35 chu kyø vaø moät thôøi gian môû roäng 720C/15phuùt treân maùy PCR. Saûn phaåm ñöôïc tinh saïch baèng kít Wizard PCR Preps DNA purification system (Promega, Southampton, United Kingdom) theo höôùng daãn söû duïng cuûa haõng. ™ Xaùc ñònh tröïc tieáp baèng trình töï caùc gen 18S rRNA, ITS rRNA, 26S rRNA ñöôïc tieán haønh baèng vieäc söû duïng caùc kít phaûn öùng Applied Biosystem ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Caùc caëp moài ñöôïc söû duïng cho xaùc ñònh trình töï chuoãi cuûa gen 18S rRNA laø: NS1: GTAGTCATATGCTTGTCTC NS2: GGCTGCTGGCACCAGCTTGC NS3: GCAAGTCTGGTGCCAGCAGCC NS4: CTTCCGTCAATTCCTTTAAG NS5: AACTTAAGGAATTGACGGAAG NS6: GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC NS7: GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC NS8: TCCGCAGGTTCACCTACGGA Caùc caëp moài ñöôïc söû duïng cho xaùc ñònh tröïc tieáp trình töï chuoãi cuûa gen ITS1 rRNA laø: ITS1: TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS2: GCTGCGTTCTTCATCGATGC 14 Caùc caëp moài ñöôïc söû duïng cho xaùc ñònh tröïc tieáp trình töï chuoãi cuûa gen ITS2 rRNA laø: ITS3: GCATCGATGAAGAACGCAGC ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC Caùc caëp moài ñöôïc söû duïng cho xaùc ñònh tröïc tieáp trình töï chuoãi cuûa gen 26S rRNA vuøng D1/D2 laø: NC1: GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG Chu trình nhieät ñöôïc tieán haønh theo caùc böôùc: 960C/10giaây, 500C/5giaây vaø 400C/4phuùt vôùi 25 chu kyø ñöôïc thöïc hieän treân maùy PCR Perkin Elmer 9600. Saûn phaåm PCR naøy ñöôïc tinh saïch vaø ñieän di treân gen polyacrylamide. Trình töï chuoãi ñöôïc ñoïc töï ñoäng baèng maùy Sequencer 373 Acid DNA (Appied Biosystem GmbH-Germany). Keát quaû trình töï chuoãi cuûa gen 18S rRNA, ITS rRNA, 26S rRNA cuûa naám men ñöôïc phaân tích so saùnh vôùi caùc trình töï chuoãi coù saün trong ngaân haøng gen vôùi söï trôï giuùp cuûa phaàn meàm editor (ae2) alignment (DSMZ-Germany). Phaàn traêm gioáng nhau giöõa caùc trình töï chuoãi cuûa gen cuûa naám men ñöôïc trình baøy döôùi daïng ma traän. 1.3.2 Khoùa phaân loaïi naám men Phaân loaïi naám men laø coâng vieäc khoâng ñôn giaûn. Töø tröôùc ñeán nay coù raát nhieàu khoùa phaân loaïi naám men cuûa nhieàu taùc giaû khaùc nhau. Hansen laø ngöôøi ñöa ra khoùa phaân loaïi naám men ñaàu tieân, oâng chia naám men thaønh 8 gioáng: Saccharomyces, Saccharomycopsis, Monospora, Zygosaccharomyces, Pichia, Nematospora, Saccharomycodes, Willia. Naêm 1907, Klocker chia naám men thaønh 12 gioáng vôùi 3 gioáng phuï: Saccharomyces (gioáng phuï Zygosaccharomyces), Hanseniaspora, Nadsonia, 15 Torulaspora, Pichia (gioáng phuï Pichia vaø gioáng phuï Zygopichia), Monospora, Atichia, Debaryomyces, Schwanniomyces, Saccharomycodes, Nematospora. Naêm 1920, Guilliermond chia naám men thaønh hai nhoùm vôùi 18 gioáng Nhoùm naám men thaät: Schizosaccharomyces, Nadsonia, Saccharomycodes, Hansenia, Monospora, Zygosaccharomyces, Schwanniomyces, Saccharomycopsis, Pichia, Nematospora, Debarymyces, Torulaspora, Saccharomyces, Willia. Nhoùm naám men giaû: Torula, Mycoderma, Pseudosaccharomyces, Cryptococcus Naêm 1952, J.Lodder cuøng vôùi Kreger Van Rij toång keát laïi moät caùch khaù hoaøn thieän veà vaán ñeà phaân loaïi naám men. Naêm 1971, boå sung vaø söûa chöõa laïi taøi lieäu phaân loaïi naám men ñaày ñuû nhaát vaø coù uy tín nhaát hieän nay. Naêm 1954, Kudriavtxev (Lieân Xoâ) ñaõ xeáp naám men vaøo boä Unicellomycetables bao goàm 3 hoï: Saccharomycetaceae, Schizosaccharomycetaceae vaø Saccharomycodaceae. Naêm 1962, Phöông phöông Taâm (Trung Quoác) ñaõ chia naám men 31 gioáng vaø 11 gioáng phuï. Maëc duø heä thoáng phaân loaïi cuûa Kudriavtxex (Lieân Xoâ) vaø Phöông Phöông Taâm ñaùng ñöôïc chuù yù nhöng ñeán nay vaãn khoâng ñöôïc söû duïng roäng raõi vaø thoâng duïng nhö heä thoáng phaân loaïi cuûa Lodder vaø Kreger Van Rij. Theo khoùa phaân loaïi cuûa Lodder (1971) naám men ñöôïc chia thaønh 39 gioáng vaø 4 nhoùm [22] Nhoùm thöù 1: Nhoùm naám men hình thaønh nang (tuùi) thuoäc lôùp naám tuùi (Ascomycetes) goàm 22 gioáng: Gioáng Citeromyces: 1 loaøi, teá baøo hình caàu hay hình elip, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khuaån ty giaû hoaëc vaùng, baøo töû tuùi hình caàu, chæ coù moät 16 baøo töû tuùi, tuùi coù thaønh moûng, baøo töû tuùi coù thaønh saàn suøi, coù khaû naêng ñoàng hoùa nitrat. Gioáng Coccidiascus: 1 loaøi, teá baøo hình caàu hay hình chöõ nhaät, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khuaån ty giaû hoaëc vaùng, baøo töû tuùi hình thoi (fusiform), coù theå coù 8 baøo töû tuùi. Gioáng Debaryomyces: 8 loaøi teá baøo hình caàu, hình elip, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, moät soá coù khuaån ty giaû, coù theå taïo vaùng, baøo töû tuùi hình caàu, baàu duïc, saàn suøi, coù 1- 4 baøo töû tuùi, tieáp hôïp ngay tröôùc khi hình thaønh tuùi. Gioáng Dekkera: 2 loaøi, teá baøo thöôøng hình nhoïn ñaàu, coøn coù hình caàu, eâlip, oáng, hoaëc hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, coù khuaån ty giaû, coù theå taïo vaùng, baøo töû tuùi hình muõ, coù 1-4 baøo töû tuùi, sinh acid acetic, coù hoaëc khoâng coù khaû naêng ñoàng hoùa nitrat. Gioáng Endomycopsis: 10 loaøi, teá baøo coù hình daïng thay ñoåi, naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty, khuaån ty giaû, moät soá taïo vaùng, coù 1-4 baøo töû tuùi, hình caàu, muõ, hình löôõi lieàm, tuùi coù khuaån ty giaû. Tuùi naèm ôû ñaàu ôû giöõa khuaån ty. Nhieàu loaøi coù khaû naêng ñoàng hoùa hoùa toát tinh boät. Gioáng Henseniaspora: 3 loaøi, teá baøo hình quaû chanh Chaâu AÂu hoaëc hình ong, hình baàu duïc, naûy choài nhieàu phía, khoâng sinh khuaån ty vaø vaùng, moät soá ít coù khuaån ty giaû, coù 1-4 baøo töû tuùi hình muõ caùt, hình muõ saét, hình quaû hoà ñaøo. Taát caû caùc loaøi ñeàu caàn söû duïng inoâzitol vaø pantotenat. Gioáng Hansenula: 25 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình chöõ nhaät, hình oáng, naûy choài hình phía, coù hoaëc khoâng coù khaû naêng sinh khuaån ty, khuaån ty giaû vaø vaùng, coù 1-4 baøo töû tuùi hình muõ, hình baùn caàu, hình caàu, khuaån laïc coù daïng nhaày, daïng bô hay daïng phaán ñuïc. Nhieàu loaøi sinh photphamannan hoaëc Sphingolipit. Coù khaû naêng ñoàng hoùa nitrat. 17 Gioáng Kluyveromyces: 18 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình oáng, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, nhieàu loaøi coù khuaån ty giaû vaø ñoâi khi taïo vaùng, coù moät hoaëc nhieàu baøo töû tuùi hình baùn nguyeät, hình thaän, hình keùo daøi vôùi ñaàu tuø, hình caàu, hình caàu daøi-eâlip, coù theå taïo saéc toá ñoû (khoâng phaûi carotenoit) treân moâi tröôøng sinh baøo töû. Gioáng Lipomyces: 3 loaøi, teá baøo hình eâlip, hình caàu, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khuaån ty giaû, deïp-eâlip, hình thaáu kính loài, baøo töû tuùi maøu naâu, choài “hoaït ñoäng” coù theå tieáp hôïp hoaëc thaønh tuùi (asci), teá baøo coù theå saûn sinh nhieàu lipid. Gioáng Lodderomyces: 1 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình oáng, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, coù khuaån ty giaû khoâng taïo vaùng, 1-2 baøo töû tuùi hình keùo daøi vôùi ñaàu tuø, hình caàu daøi-eâlip, kích thöôùc khaù roäng, coù khaû naêng ñoàng hoùa toát parafin. Gioáng Metschnikowia: 5 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình quaû leâ, hình oáng, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, nhieàu loaøi coù khuaån ty giaû vaø moät soá loaøi taïo vaùng, coù 1-2 baøo töû tuùi hình kim vôùi phaàn phuï (appendage), tuùi hình keùo daøi, moät soá loaøi coù baøo töû aùo (chlamydospore), moät vaøi loaøi sinh pulcherimin. Gioáng Nadsonia: 2 loaøi, teá baøo hình oáng hay hình quaû chanh Chaâu AÂu, hay hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài theo 2 cöïc hay phaân caét choài (bud fission), khoâng coù caû khuaån ty laãn khuaån ty giaû, moät soá coù theå taïo vaùng, coù 1-2 baøo töû tuùi hình caàu saàn suøi, choài tieáp hôïp ngay vôùi teá baøo meï, phaùt trieån toát ôû nhieät ñoä thaáp hôn 260C. Gioáng Nematospora: 1 loaøi, hình daïng thay ñoåi (dò hình), naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty, thöôøng khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, tuùi roäng chöùa 2 boù, moãi boù 4 baøo töû hình kim, kyù sinh treân thöïc vaät, sinh riboflarin (vitamin B2). 18 Gioáng Pachysolen: 1 loaøi, teá baøo coù hình eâlip, hình caàu, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, coù 4 baøo töû tuùi hình baùn caàu vôùi rìa heïp, tuùi phaùt trieån ôû ñaàu cuûa moät oáng daøi, sinh ra ngoaøi teá baøo photphomannan coù daïng nhaày, coù khaû naêng ñoàng hoùa nitrat. Gioáng Pichia: 35 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình chöõ nhaät, naûy choài nhieàu phía, thöôøng coù khuaån ty giaû, moät ít loaøi coù khuaån ty thaät, coù hoaëc khoâng coù khaû naêng taïo vaùng, coù 1-4 baøo töû tuùi hình caàu, hình muõ, hình sao Thoå, saàn suøi, khuaån laïc, coù daïng nhaày, daïng boät nhaõo (pasty) hay daïng phaán ñuïc. Moät soá loaøi sinh photphomannan. Gioáng Saccharomyces: 41 loaøi, teá baøo hình caàu, hình eâlip, hình oáng, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, coù 1-4 baøo töû tuùi hình caàu, hình caàu daøi-eâlip, khuaån laïc coù daïng boät nhaõo, hôi boùng. Gioáng Saccharomycodes: 1 loaøi, teá baøo hình ong hay hình quaû chanh chaâu AÂu, hình keùo daøi naûy choài, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, coù 4 baøo töû tuùi hình caàu, teá baøo lôùn, baøo töû tieáp hôïp ngay trong tuùi, baøo töû coù moät rìa raát heïp. Gioáng Saccharomycopsis: 1 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình oáng, hình naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù khuaån ty giaû, coù 1-4 baøo töû tuùi hình baàu duïc, hình oáng, baøo töû coù 2 lôùp thaønh, soáng trong ñöôøng tieâu hoùa cuûa thoû vaø moät ñoäng vaät gaëm nhaám khaùc, chæ phaùt trieån ôû nhieät ñoä giöõa 30 vaø 400C, caàn CO2 vaø nitô höõu cô. Gioáng Schizosaccharomyces: 4 loaøi, teá baøo hình caàu, hình oáng, sinh saûn theo loái phaân caét teá baøo, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty, khoâng coù khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, coù 4-8 tuùi hình caàu, hình baàu duïc, thaønh teá baøo khoâng chöùa kitin (chitin). 19 Gioáng Schwanniomyces: 4 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình caàu, hình keùo daøi, hình oáng, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, coù 1-2 baøo töû tuùi hình quaû hoà ñaøo (walnut), saàn suøi, choài phaân baøo giaûm nhieãm (meiosis), taát caû caùc loaøi ñeàu coù khaû naêng ñoàng hoùa tinh boät tan. Gioáng Wikerhamia: 1 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình keùo daøi, hình ong hay hình quaû chanh chaâu AÂu, naûy choài theo 2 cöïc hay phaân caét choài, khoâng sinh khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, coù 1-16 baøo töû tuùi hình muõ (cap), sinh ra ngoaøi teá baøo riboflavin (vitamin B2). Gioáng Wingea: 1 loaøi, teá baøo hình caàu, hình elip, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, coù hoaëc khoâng coù khaû naêng taïo vaùng, coù 1- 4 baøo töû tuùi hình caàu deïp-eâlip hoaëc hình thaáu kính loài [5]. Nhoùm thöù 2: Nhoùm naám men giaû thuoäc boä Ustilaginales Goàm 2 gioáng: Gioáng Leucosporidium: 6 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình keùo daøi, coù naûy choài, coù khuaån ty thaät nhieàu loaøi coù khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng. Khaùc vôùi Candida ôû choã khoâng phaùt trieån ñöôïc ôû 370C, nhieàu loaøi coù khaû naêng saûn sinh tinh boät, nhieàu loaøi laøm dòch hoùa gelatin, coù baøo töû ñoäng. Gioáng Rhodosporidium: 4 loaøi, teá baøo coù hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, coù naûy choài, coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, sinh saéc toá hoàng, khoâng leân men. Khaùc vôùi Rhodotorula ôû choå coù baøo töû ñoäng [6] Nhoùm thöù 3: Nhoùm naám men giaû thuoäc hoï Sporobolomycetaceae Goàm 3 gioáng: Gioáng Bullera: 3 loaøi, teá baøo coù hình caàu, hình baàu duïc, coù naûy choài, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, khoâng coù baøo töû ñoäng, coù baøo töû baén vôùi hình daïng ñoái xöùng, coù hoaëc khoâng sinh saéc toá carotenoit. 20 Gioáng Sporidiobolus: 2 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình keùo daøi, hình oáng, coù naûy choài, coù khuaån ty, coù taïo vaùng, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, sinh saéc toá carotenoit, coù baøo töû baén vôùi hình daïng khoâng ñoái xöùng, coù baøo töû aùo vôùi thaønh daøy maøu naâu. Gioáng Sporobolomyces: 9 loaøi, teá baøo hình baàu duïc, hình keùo daøi, coù naûy choài, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty, khuaån ty giaû vaø vaùng, coù baøo töû baén vôùi hình daïng khoâng ñoái xöùng, nhieàu loaøi sinh saéc toá carotenoit [6]. Nhoùm thöù 4: Nhoùm naám men khoâng sinh baøo töû khoâng thuoäc hoï Sporobolomycetaceae: Goàm 12 gioáng: Gioáng Bretlanomyces: 7 loaøi, teá baøo hình nhoïn ñaàu (ogival), hình eâlip, hình caàu, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty giaû, khoâng coù khuaån ty, coù hoaëc khoâng coù vaùng, khoâng coù baát kyø baøo töû naøo, saûn sinh acid acetic, khaùng xicloheximit, sinh tröôûng chaäm. Gioáng Candida: 81 loaøi, teá baøo hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty giaû, moät soá ít loaøi coù khuaån ty, coù hoaëc khoâng coù vaùng, moät soá ít loaøi coù baøo töû aùo. Gioáng Cryptococcus: 17 loaøi, teá baøo hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, khoâng coù khuaån ty, moät ít loaøi taïo vaùng vaø coù khuaån ty giaû, moät soá ít loaøi coù baøo töû aùo, coù hoaëc khoâng sinh saéc toá, teá baøo cuûa ña soá caùc loaøi coù bao nhaày (capsules). Gioáng Kloeckera: 4 loaøi, teá baøo coù hình ong, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài 2 cöïc, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, khoâng coù khuaån ty vaø khoâng taïo vaùng. Hoaøn toaøn coù nhu caàu ñoái vôùi inoâzitol vaø pantotenat. 21 Gioáng Oosporidium: 1 loaøi, teá baøo coù hình daïng thay ñoåi, naûy choài nhieàu phía, coù khuaån ty giaû, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, coù baøo töû noäi (endospores), coù sinh saéc toá. Teá baøo thöôøng xeáp thaønh chuoãi. Gioáng Pityrosporum: 3 loaøi, teá baøo hình chai, hình caàu, hình eâlip, naûy choài theo 2 cöïc hoaëc caét phaân choài, moät soá ít loaøi coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, khoâng coù baát kyø loaïi baøo töû naøo, sinh tröôûng caàn lipid. Gioáng Phodotorula: 9 loaøi, hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, moät soá ít loaøi coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng taïo vaùng, coù saéc toá thuoäc loaïi carotenoit taïo maøu töø hoàng ñeán da cam. Gioáng Schizoblastosporion: 1 loaøi, teá baøo hình eâlip, hình oáng, hình chai, naûy choài theo 2 cöïc hoaëc phaân caét choài, coù hoaëc khoâng coù khuaån ty giaû, khoâng coù khuaån ty, khoâng taïo vaùng, khoâng coù baát kyø baøo töû naøo. Gioáng Sterigmatomyces: 3 loaøi, teá baøo hình caàu, hình baàu duïc, sinh saûn baèng baøo töû traàn (conidia) treân nhöõng cuoáng moïc töø teá baøo meï, taïo vaùng, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû. Gioáng Torulopsis: 36 loaøi, teá baøo hình caàu, hình baàu duïc, hình keùo daøi, naûy choài nhieàu phía, moät soá ít loaøi coù khuaån ty giaû vaø taïo vaùng, khoâng coù khuaån ty, khoâng coù baát kyø loaïi baøo töû naøo. Gioáng Trichosporon: 8 loaøi, teá baøo coù hình daïng thay ñoåi, coù khuaån ty, khuaån ty giaû, coù hoaëc khoâng coù vaùng, coù baøo töû ñoát, moät soá loaøi coù baøo töû voâ tính. Gioáng Trigonopsis: 1 loaøi, teá baøo hình tam giaùc vaø naûy choài ôû ñænh, coù taïo vaùng, khoâng coù khuaån ty vaø khuaån ty giaû, khoâng coù baát kyø baøo töû naøo [6]. 22 CHÖÔNG 2: ÖÙNG DUÏNG CUÛA NAÁM MEN TRONG COÂNG NGHIEÄP CHEÁ TAÏO ÑOÀ UOÁNG LEÂN MEN Hieän nay caùc loaïi ñoà uoáng leân men treân theá giôùi raát phong phuù vaø ña daïng. Döïa vaøo noàng ñoä röôïu, ngöôøi ta chia ñoà uoáng leân men thaønh 2 nhoùm: ñoà uoáng coù ñoä röôïu nheï vaø ñoà uoáng coù ñoä röôïu cao [8]. 2.1 Ñoà uoáng coù ñoä röôïu nheï Tuøy thuoäc vaøo nguoàn nguyeân lieäu cheá bieán maø ta coù ñoà uoáng töø tinh boät vaø ñoà uoáng töø traùi caây. 2.1.1 Ñoà uoáng töø tinh boät 2.1.1.1 Bia Bia laø loaïi thöùc uoáng coù ñoä röôïu nheï vaø coù tính giaûi khaùt cao, ñöôïc nhieàu ngöôøi öa chuoäng. Bia coù töø haøng ngaøn naêm tröôùc coâng nguyeân vaø hieän nay khoâng nöôùc naøo treân theá giôùi laø khoâng saûn xuaát hoaëc tieâu thuï bia. Bia ñöôïc saûn xuaát töø malt hoaëc keát hôïp vôùi caùc nguyeân lieäu coù chöùa tinh boät (khoâng phaûi laø malt), hoa houblon vaø nöôùc. Thaønh phaàn cuûa bia goàm coù 80-90% nöôùc; 1,5-7% coàn; 3-10% chaát hoøa tan; 0,3-0,4% CO2. Chaát hoøa tan chuû yeáu laø hydratcacbon (dextrin, maltose, glucose vaø moät ít pentose, caùc protein vaø saûn phaåm thuûy phaân cuûa noù (anbumin, pepton, caùc acid amin), caùc chaát khoaùng (muoái kali, natri, phospho, canxi, mangan,…), moät soá acid höõu cô, caùc vitamin (B1, B2, B6, PP, biotin) vaø caùc chaát ñaéng, chaát thôm cuûa hoa houblon [32]. 23 Sô ñoà 2.1 Coâng ngheä saûn xuaát bia (theo Löông Ñöùc Phaåm, naêm 2001) Baõ duøng chaên nuoâi nghieàn loïc nhaân gioáng röûa Chai röûa saïch saùt khuaån Haáp Pasteur Nguyeân lieäu chính: thoùc malt, gaïo (ngoâ) Naáu (ñöôøng hoùa) Naáu vôùi hoa Laøm laïnh dòch Leân men chính 8-12°C Men gioáng: Saccharomyces Leân men phuï 1-4°C Loïc Baõo hoøa CO2 Baõ men CO2 Caáp laïnh Ñoùng chai hoaëc lon Bia chai hoaëc bia lon Bia hôi thaønh phaåm Laéng caën 24 2.1.1.2 Saûn phaåm treân theá giôùi Nöôùc uoáng coù coàn-Bubju cuûa Trieàu Tieân [23] Nguyeân lieäu: gaïo 25%, gaïo neáp 11%, nöôùc 60%, Nuruk 2%, koji 2% Quy trình saûn xuaát: Gaïo teû Naáu chín Gaïo neáp troän ñeàu cho theâm nöôùc leân men Nuruk, koji Loïc Bubju Ñaëc tính vaät lyù: daïng dung dòch, maøu traéng, coù coàn Ñaëc tính hoùa hoïc: coàn etylic 16% Vi sinh vaät chuû yeáu: Saccharomyces sp. Saûn xuaát theo qui moâ coâng nghieäp Bouza moät loaïi ñoà uoáng ôû Ai Caäp ñöôïc cheá bieán töø luùa mì. Loaïi ñoà uoáng naøy coù vò chua vaø coù thaønh phaàn röôïu 4-5% v/v. Thoå Nhó Kyø vaø moät soá nöôùc khaùc coù saûn phaåm Bouza laø moät loaïi nöôùc uoáng leân men, ñöôïc cheá bieán töø luùa mì, coù haøm löôïng röôïu thaáp (0,5-1,2 % khoái löôïng) vôùi ñoä chua 1,3 ñoä. Saûn phaåm naøy coù maøu traéng ñuïc, vò chua ngoït ñaëc tröng do keát quaû cuûa kieåu leân men hoãn hôïp giöõa leân men röôïu vaø leân men lactic [8]. ÔÛ Nga coù Kvass laø loaïi nöôùc uoáng truyeàn thoáng laøm töø malt ñaïi maïch, malt luùa maïch ñen, boät mì vaø thöôøng boå sung baïc haø. Ñaây laø loaïi thöùc uoáng leân men hoãn hôïp caû leân men röôïu vaø leân men lactic. Kvass coù nhieàu loaïi vôùi thaønh phaàn trung bình nhö sau: noàng ñoä chaát khoâ (xaùc ñònh baèng sacaromet) 5-6%; ñoä chua 2-3 ñoä; haøm löôïng röôïu etylic 0,3-0,5% v/v [8]. 25 ÔÛ Chaâu Myõ La Tinh coù nhieàu thöùc uoáng cheá bieán töø ngoâ vaø ngoâ naûy maàm nhö Chicha, Tesquino. Nhöõng saûn phaåm leân men töø ngoâ naøy coù vò chua vaø coù chöùa 2-4% röôïu etanol [8]. ÔÛ Chaâu AÙ coù moät loaït caùc saûn phaåm leân men röôïu töø gaïo nhö Sakeâ (Nhaät Baûn), Basi (Philippine), Shaosing chu (Trung Quoác), Tapeketan (Inñoâneâxia), Pachwai (AÁn Ñoä). Sakeâ laø loaïi thöùc uoáng ñaëc tröng cuûa vaên hoùa Nhaät Baûn. Röôïu Sakeâ quyù nhaát laø Ghiugioâ, coù höông vò thôm thoaûng nhö taùo, chuoái, döùa. Tröôùc ñaây Ghiugioâ saûn xuaát ít thöôøng ñöôïc söû duïng trong nhöõng ñôït thi neám. Ngaøy nay do caïnh tranh vôùi bia, röôïu vang, Ghiugioâ ñöôïc saûn xuaát nhieàu hôn, vôùi höông vò ñaëc bieät röôïu Sakeâ ñaõ trôû neân noåi tieáng treân theá giôùi, trong khu vöïc laø moät bieåu töôïng cuûa ñôøi soáng vaên hoùa töông ñoái caàu kyø nhöng tinh teá cuûa ngöôøi Nhaät [66]. 2.1.2 Ñoà uoáng töø traùi caây 2.1.2.1 Röôïu vang [4] [9] [30] Röôïu vang (vin, wine) ñuùng nghóa laø röôïu leân men khoâng caát töø nöôùc eùp quaû nho. Gaàn ñaây ngöôøi ta môû roäng khaùi nieäm röôïu vang ñeå chæ caû caùc loaïi röôïu hoa quaû khaùc (khoâng caát) [4]. Röôïu vang thöôøng coù ñoä röôïu 9-14%. Ñaëc ñieåm nöôùc quaû vaø caùc yeâu caàu veà nguyeân lieäu laøm röôïu vang Nguyeân lieäu laøm röôïu vang laø caùc loaïi quaû. Quaû chín sau khi thu hoaïch choïn loaïi quaû töôi, chaát löôïng toát ñem eùp laáy nöôùc hoaëc ngaâm vôùi ñöôøng ñeå thu dòch nöôùc quaû duøng cho leân men. Taát caû caùc loaïi quaû ñeàu coù ñöôøng, nhieàu vitamin, nhieàu acid höõu cô, trong ñoù coù nhieàu vitamin C, coù ñaày ñuû chaát khoaùng vaø moät löôïng protein ñaùng keå. Ngoaøi ra, nöôùc quaû coøn coù chöùa tanin, pectin. Trong caùc loaïi quaû duøng laøm röôïu vang tröôùc heát phaûi keå laø nho, döa, mô, daâu, maän, taùo… Caùc chuûng naám men trong saûn xuaát röôïu vang 26 Trong quaù trình saûn xuaát röôïu vang, ngöôøi ta ít duøng chuûng naám men daïi saün coù trong nguyeân lieäu maø thöôøng duøng caùc chuûng naám men thuaàn chuûng bôûi chuùng coù öu ñieåm hôn choã: chaát löôïng leân men cao, taïo haøm löôïng ñöôøng soùt ít, khaû naêng keát laéng toát, laøm trong dòch röôïu nhanh, chòu ñöôïc ñoä röôïu cao vaø ñoä acid cuûa moâi tröôøng, taïo ñöôïc höông vò thôm ngon tinh khieát. Caùc chuûng naám men thöôøng duøng trong röôïu vang laø: ¾ Saccharomyces vini: coù khaû naêng keát laéng nhanh, sinh saûn theo loái naûy choài, taïo thaønh baøo töû, coù khaû naêng khöû ñöôøng sacarose thaønh fructose vaø glucose. Tuy nhieân, giai ñoaïn cuoái cuûa quaù trình leân men caùc teá baøo Saccharomyces vini bò giaø vaø cheát nhanh. ¾ Saccharomyces uvarum: khaû naêng sinh baøo töû maïnh. Chòu ñöôïc ñoä coàn 12-13 ñoä trong dung dòch nöôùc nho. ¾ Saccharomyces oviformis: chòu ñöôøng cao, coàn cao, leân men kieät ñöôøng vaø taïo tôùi 18 ñoä coàn, coù khaû naêng leân men nhieàu loaïi ñöôøng khaùc nhau. Qua phaân tích ngöôøi ta nhaän thaáy ñeå leân men nöôùc quaû khoâng neân duøng moät chuûng ñôn ñoäc maø coù theå phoái hôïp caùc chuûng chòu coàn cao ñeå coù theå söû duïng trieät ñeå ñöôøng trong dòch leân men vaø cho ñoä coàn cao. Leân men Quaù trình leân men ñöôïc thöïc hieän qua hai giai ñoaïn: leân men chính vaø leân men phuï ¾ Leân men chính: tyû leä tieáp gioáng vaøo leân men chính laø 3-10%. Nhieät ñoä leân men toát nhaát laø 20-220C vaø trong khoaûng thôøi gian töø 10-20 ngaøy. Leân men ôû nhieät ñoä 25-280C vôùi thôøi gian ngaén hôn. Trong khoaûng 6-7 ngaøy ñöôøng giaûm nhanh, röôïu taêng chaäm vaø chaäm laïi. Dòch leân men chính thöôøng ñaït ñöôïc 8-10% ñoä coàn. 27 ¾ Leân men phuï ôû 15-180C trong 15-20 ngaøy. Sau khi leân men phuï ñoä coàn chöa ñuû 140 thì phaûi theâm coàn ñeán noàng ñoä naøy hoaëc cao hôn (chæ ñöôïc duøng loaïi coàn thöïc phaåm) roài chuyeån sang taøng tröõ ôû 100C. Taøng tröõ ít nhaát 10 ngaøy, sau ñoù taùch caën vaø coù theå hoaøn thaønh saûn phaåm hoaëc taøng tröõ tieáp. Röôïu vang caøng taøng tröõ laâu chaát löôïng caøng ñöôïc caûi thieän vaø höông vò caøng ñaäm ñaø. Phaân loaïi röôïu vang Röôïu vang ñöôïc phaân loaïi theo nhieàu tieâu chí khaùc nhau nhö: theo nguoàn nguyeân lieäu (vang daâu, vang nho, vang döùa…), hoaëc theo ñoä röôïu, haøm löôïng ñöôøng, haøm löôïng acid coøn laïi trong vang (vang ngoït, vang dòu, vang khoâ) hoaëc theo maøu saéc saûn phaåm (vang ñoû, vang traéng, vang hoàng…). Theo xu höôùng chung, ngöôøi ta chia thaønh hai loaïi vang chính laø vang khoâng ga (röôïu cay, röôïu nöûa cay, röôïu nöûa ngoït, röôïu naëng, röôïu ñieåm taâm, röôïu taïo höông) vaø röôïu vang coù ga (saâm banh, röôïu vang boït) [32]. Moät soá loaïi röôïu vang tieâu bieåu ÔÛ Vieät Nam: ÔÛ Vieät Nam coù moät soá loaïi röôïu vang nhö: vang Ñaø Laït ñoû, vang Ñaø Laït traéng, vang Ñaø Laït daâu taây, vang Thaêng Long, vang daâu (Haø Noäi) [60] [67]. Saûn phaåm ôû nöôùc ngoaøi: Röôïu traùi caây cuûa Philippine [23] Nguyeân lieäu: coù theå söû duïng nhieàu loaïi traùi caây khaùc nhau nhö taùo, chuoái, ñaøo loän hoät,…100%, ñöôøng vaø gioáng vi sinh vaät moät löôïng raát nhoû. Quy trình saûn xuaát: Traùi caây töôi → röûa saïch → boùc voû → taùch nöôùc hay eùp laáy dòch → cho theâm ñöôøng → thanh truøng hay ñun soâi khoaûng 1 giôø → laøm laïnh ôû nhieät ñoä phoøng → cho theâm gioáng vi sinh vaät → leân men ôû nhieät ñoä phoøng 3-4 ngaøy → leân 28 men phuï khoaûng 2 naêm → taùch caën → thanh truøng Pasteur → ñoùng chai → thaønh phaåm. Ñaëc tính vaät lyù: daïng loûng, coù coàn, chua vaø ngoït Ñaëc tính hoùa hoïc: pH=4; ñoä acid 0,5-1%, coàn 12% Giaù trò dinh döôõng: ñöôøng 10% Saûn xuaát coâng nghieäp: 2000 lít/naêm Röôïu Koha cuûa New zealand [23] Nguyeân lieäu: dòch traùi caây kiwi 50%, ñöôøng, pectinase, SO2 Ñaëc tính vaät lyù: daïng loûng, maøu vaøng aùnh kim Vi sinh vaät chuû yeáu: Saccharomyces cerevisiae R92 Thôøi gian baûo quaûn vaø söû duïng 2 naêm ôû ñieàu kieän laïnh 2.1.2.2 Nöôùc giaûi khaùt leân men ™ Ñònh nghóa: nöôùc giaûi khaùt leân men thöïc chaát laø saûn phaåm cuûa quaù trình leân men röôïu chöa keát thuùc. Ñaây laø loaïi thöùc uoáng thôm ngon, boå döôõng, coù lôïi cho söùc khoûe ngöôøi duøng, coù taùc duïng kích thích tieâu hoùa [24]. ™ Ñaëc ñieåm cuûa nöôùc giaûi khaùt leân men Do laø saûn phaåm cuûa quaù trình leân men röôïu chöa keát thuùc neân caùc quaù trình sinh hoïc vaãn tieáp dieãn; Saûn phaåm khoâng baûo quaûn ñöôïc laâu duø ôû nhieät ñoä raát thaáp (4°C); Neân söû duïng ngay trong ngaøy vaø uoáng khi coøn töôi; Thaønh phaàn giaøu dinh döôõng, höông vò haøi hoøa ñaëc tröng, coù taùc duïng kích thích tieâu hoùa. Nhìn chung, caùc loaïi nöôùc giaûi khaùt leân men ñeàu coù ñaëc ñieåm töông ñoàng veà haøm löôïng nhö sau: Noàng ñoä chaát tan theo phaàn traêm troïng löôïng laø 5-8%; Noàng ñoä röôïu theo phaàn traêm theå tích laø: 0,5-1,5%V (nheï hôn röôïu vang quaû côõ chuïc laàn); Ñoä chua: 2-4 (soá mol NaOH/100ml dòch leân men); Thôøi gian taøng tröõ: 5-6 giôø; Thôøi gian baûo quaûn bình thöôøng 2 ngaøy. 29 Tuy nhieân, ñoái vôùi moät soá loaïi nöôùc giaûi khaùt coù chaát löôïng cao ngöôøi ta coù theå keùo daøi thôøi gian baûo quaûn 2-3 thaùng (töông töï nhö bia) baèng caùch loaïi bôùt teá baøo men, roùt vaøo chai, ñaäy nuùt roài ñem thanh truøng ôû nhieät ñoä thích hôïp. So vôùi caùc loaïi nöôùc siroâ quaû hieän baùn treân thò tröôøng thì nöôùc quaû leân men ngon vaø coù taùc duïng giaûi nhieät hôn. Saûn xuaát nöôùc giaûi khaùt leân men töø nöôùc quaû coù öu ñieåm laø ñôn giaûn, ñoøi hoûi ít trang thieát bò, coù theå laøm ôû quy moâ nhoû (keå caû gia ñình), nhöng nhöôïc ñieåm laø giaù thaønh cao vaø neáu khoâng caån thaän thì saûn phaåm deã hö hoûng nhaát laø khaâu veä sinh vaø khöû truøng phaûi ñöôïc quan taâm ñaày ñuû [24]. ™ Caùc chuûng naám men duøng trong nöôùc giaûi khaùt leân men Do ñaëc ñieåm cuûa nöôùc giaûi khaùt leân men coù ñoä coàn thaáp neân khoâng caàn thieát söû duïng caùc chuûng naám men ñeå leân men nhanh. Tuy nhieân, noù caàn taïo ñöôïc höông vò haøi hoøa, haáp daãn. Moät yeâu caàu cuûa nöôùc giaûi khaùt leân men laø phaûi coù ñoä chua xaùc ñònh, neáu chæ söû duïng naám men thì khoâng ñaûm baûo ñöôïc yeâu caàu naøy. Hieän nay ngöôøi ta nghieân cöùu söû duïng naám men phoái hôïp vôùi vi khuaån lactic nhaèm taïo ñoä chua oån ñònh cho nöôùc giaûi khaùt leân men. Tuy nhieân, ñaây laø lónh vöïc khaù phöùc taïp caàn coù söï ñaàu tö nghieân cöùu theâm. ™ Moät soá loaïi nöôùc giaûi khaùt leân men tieâu bieåu Röôïu nöôùc döøa-lambanog cuûa Philippine [23] Quy trình coâng ngheä: Nöôùc döøa → cho leân men töï nhieân ôû nhieät ñoä phoøng 2-7 ngaøy → loïc→ ñoùng chai → Lambanog Ñaëc tính vaät lyù: dòch loûng, maøu saùng coù coàn Ñaëc tính hoùa hoïc: pH=6,5; Toång chaát raén 16,88%; Tro 033%; Ñoä acid 0,09%; Coàn 7,9-8,6%. 30 Giaù trò dinh döôõng: ñöôøng 10,63%, ñöôøng khöû 0,27%, protein 0,23% Saûn xuaát thuû coâng: 53 903 lít/naêm Nöôùc eùp taùo leân men goïi laø applejack hay “hard cider” cuûa Myõ [4]. Loaïi naøy chöùa 0,5-8% röôïu. Loaïi taùo thích hôïp nhaát ñeå saûn xuaát “cider” laø loaïi chöùa khoaûng 10% fructose, 2% sacarose, 1,5% glucose, 0,2-0,9% acid malic, 0,1- 0,5% tanin. Quy trình cheá taïo “cider” ñöôïc toùm taét nhö sau: Quaû taùo → caát tröõ trong silo → röûa → xay nghieàn → eùp → thuøng leân men → loïc → nöôùc loïc “cider” → loïc → boå sung CO2 → ñoùng chai. Ñeå haïn cheá taïp khuaån, nöôùc eùp taùo thöôøng ñöôïc khöû truøng Pasteur (85°C trong 30 phuùt), hoaëc ñöôïc khöû truøng baèng phöông phaùp qua loïc hoaëc baèng phöông phaùp ly taâm. Bieän phaùp ñeå haïn cheá taïp khuaån laø boå sung SO2. ÔÛ pH = 3,5, ngöôøi ta thöôøng söû duïng noàng ñoä SO2 laø 30ppm ñeå xöû lyù qua ñeâm. Neáu pH cao hôn thì phaûi duøng noàng ñoä SO2 cao hôn. Naám men duøng ñeå caáy vaøo thuoäc loaøi Saccharomyces uvarum khi leân men ngoaøi vieäc saûn sinh etanol (tôùi 8,5%) vaø CO2, naám men coøn sinh ra caùc chaát thôm, acid höõu cô, röôïu baäc cao. Quaù trình leân men thöôøng keùo daøi vaøi tuaàn leã ôû nhieät ñoä 15-25°C. Sau quaù trình leân men nhôø naám men thöôøng xaûy ra quaù trình leân men nhôø vi khuaån lactic, chuû yeáu laø Lactobacillus pastorianus vaø Leuconostoc mesenteroides. Chuùng laøm chuyeån hoùa acid malic thaønh acid lactic vaø CO2. Cuõng coù khi coù söï tham gia cuûa Lb. plantarum, Lb. mali vaø Pediococcus cerevisiae. Vi khuaån lactic coøn chuyeån hoùa caùc acid khaùc coù maët trong “cider”, chaúng haïn nhö acid citric. Coù khi ngöôøi ta coøn boå sung theâm acid DL-malic (toång hôïp hoùa hoïc) vaøo dòch leân men ñeå cheá taïo “cider”. 31 2.2 Ñoà uoáng coù ñoä röôïu cao 2.2.1 Röôïu ñeá hay röôïu Laøng Vaân Röôïu ñaõ ñöôïc con ngöôøi saûn xuaát vaø söû duïng töø caùch ñaây raát laâu vaøo khoaûng 6000 naêm tröôùc coâng nguyeân. Trong quaù trình leân men röôïu, dòch leân men thu ñöôïc sau khi keát thuùc quaù trình leân men ngoaøi sinh khoái naám men coøn coù caùc thaønh phaàn sau: ethanol chuû yeáu, CO2 vaø caùc saûn phaåm phuï nhö glycerin, acid succinic, caùc aldehyde, moät soá röôïu baäc cao (isoamylic, isobutylic, propiolic,…) Hieän nay trong coâng ngheä saûn xuaát röôïu duøng phoå bieán nguyeân lieäu coù saün ñöôøng vaø tinh boät chuû yeáu laø gaïo neáp. Gaïo neáp uû röôïu cho höông vò thôm ngon vaø mang nhieàu giaù trò dinh döôõng cao. Röôïu ñeá hay röôïu laøng vaân (Haø Baéc) laø saûn phaåm röôïu qua chöng caát vaø nguyeân lieäu duøng ñeå saûn xuaát laø gaïo neáp deûo (khoâng maøu) Taát nhieân moãi vuøng queâ coù kinh nghieäm rieâng khoâng chæ ôû khaâu leân men, khaâu chöng caát, khaâu pha cheá maø ñaëc bieät laø nguyeân lieäu vaø chaát löôïng baùnh men thuoác baéc. Baùnh men thuoác baéc cuûa ngöôøi daân phía Baéc Vieät Nam ñöôïc saûn xuaát vôùi löôïng thuoác baéc cho vaøo nhieàu hôn men thuoác baéc ôû caùc vuøng khaùc. Ngöôøi ta cho löôïng thuoác baéc nhö sau: Ñaïi hoài 3g Nha taïo 2g Taïo giaùc 1g Tieåu hoài 3g Queá chi 3g Queá khaâu 3g Thaát phaùt 2g Cam thaûo 3g 32 Sô ñoà 2.2 Quy trình saûn xuaát röôïu ñeá hay röôïu laøng vaân Nguyeân lieäu ↓ xöû lyù ↓ naáu chín ↓ troän ← men thuoác baéc ↓ leân men ↓ chöng caát ↓ röôïu ñeá hay röôïu Laøng Vaân [44] 2.2.2 Saûn phaåm treân theá giôùi ¾ Bourbon whiskey laø loaïi röôïu ñöôïc laøm töø ngoâ (50-70%) vaø moät soá loaïi haït nhö maïch ñen, ñaïi maïch, luùa mì. Trong ñoù coù söû duïng malt ñaïi maïch vaø luùa mì. Glucoamylase töø A. niger laøm taùc nhaân ñöôøng hoùa. Naám men duøng cho quaù trình leân men laø Saccharomyces cerevisiae. ¾ Scotch whiskey laøm töø malt ñaïi maïch 100% ¾ Irish whiskey coù hai loaïi. Loaïi thöù nhaát laøm töø malt ñaïi maïch, ñaïi maïch, maïch ñen, luùa mì. Loaïi thöù hai laøm töø ngoâ laø chuû yeáu [8]. 2.3 Thöïc traïng veà cheá bieán thöùc uoáng leân men ôû Vieät Nam Hieän nay ôû nhieàu nöôùc treân theá giôùi, saûn xuaát röôïu vang vaãn gaén lieàn vôùi kinh teá noâng traïi, nghóa laø nhöõng gia ñình coù troàng nho thöôøng coù moät xöôûng saûn xuaát röôïu vang taïi noâng traïi cuûa mình vôùi quy moâ nhoû, nhöng röôïu ñöôïc taøng tröõ raát caån thaän trong caùc haàm haøng naêm, coù khi haøng chuïc naêm, thaäm chí tôùi traêm naêm [30]. Treân theá giôùi coù nhöõng vuøng troàng nho ñeå laøm röôïu vang raát noåi tieáng chaúng haïn nhö Bordeau, Burgundy (Phaùp), Rhineland (Ñöùc), Tokai (Hungari) [4] 33 ÔÛ Vieät Nam kyõ thuaät saûn xuaát thöùc uoáng leân men vaãn coøn môùi meõ, saûn xuaát vôùi quy moâ nhoû theo phöông phaùp thuû coâng thoâ sô. Chính vì vaäy maø chaát löôïng veà thöùc uoáng cuûa ta vaãn coøn yeáu keùm. Nguyeân nhaân: 9 Phong tuïc taäp quaùn: haàu heát caùc daân toäc treân theá giôùi ñeàu söû duïng ñoà uoáng coù ñoä coàn khaùc nhau. Tuy nhieân theo phong tuïc taäp quaùn ôû nöôùc ta thöôøng söû duïng ñoà uoáng coù ñoä coàn cao. 9 Kyõ thuaät cheá bieán röôïu vang chöa phoå bieán, vieäc naém baét kyõ thuaät coøn haïn cheá, hôn nöõa ñoøi hoûi trang thieát bò vôùi quy trình kheùp kín [9]. ÔÛ Vieät Nam nhöõng naêm gaàn ñaây coù moät soá loaïi röôïu vang ñöôïc baùn ra thò tröôøng nhö vang Thaêng Long, vang Gia Laâm, vang Ñaø Laït laø nhöõng loaïi röôïu leân men hoãn hôïp caùc loaïi quaû coù pha theâm coàn [32]. Rieâng röôïu vang töø nguoàn nguyeân lieäu tinh boät coù töø raát laâu ñôøi ñöôïc saûn xuaát baèng phöông phaùp leân men truyeàn thoáng. Tuøy thuoäc vaøo nguoàn nguyeân lieäu moãi vuøng vaø phong tuïc taäp quaùn khaùc nhau maø chaát löôïng röôïu cuõng khaùc nhau nhö röôïu neáp than (röôïu caåm)-Nam Boä, röôïu caàn-Taây Nguyeân. Ngoaøi ra chöa coù moät loaïi nöôùc giaûi khaùt leân men naøo ñöôïc saûn xuaát vaø ñöa ra tieâu thuï ngoaøi thò tröôøng. Coù moät soá coâng trình nghieân cöùu ñeå tieán tôùi saûn xuaát nöôùc giaûi khaùt leân men nhö: ™ Quaûn Leâ Haø (1998) “Nghieân cöùu moät soá ñaëc tính vaø öùng duïng heä enzim thuûy phaân tinh boät vaø protein trong saûn xuaát caùc ñoà uoáng” vaø ñaõ ñeà xuaát 3 quy trình cheá bieán ñoà uoáng töø gaïo neáp vaø gaïo caåm: ñoà uoáng khoâng coù röôïu, daïng nöôùc giaûi khaùt; siroâ töø gaïo neáp vaø gaïo caåm; ñoà uoáng leân men coù ñoä röôïu nheï töø gaïo caåm [8]. ™ Hoà Thuùy Vaân (2002) “Nghieân cöùu thöû nghieäm cheá bieán nöôùc uoáng vaø röôïu vang töø quaû mô” [61]. 34 ™ Traàn Thanh Thuûy (2003) “Nghieân cöùu söû duïng vi sinh vaät leân men lactic ñoà uoáng töø saén” [51]. ™ Traàn Vaên Khoa (2003) “Nghieân cöùu ñaëc ñieåm sinh lyù sinh hoùa cuûa chuûng naám men Saccharomyces boulardii” vaø öùng duïng chuûng naám men naøy trong vieäc taïo ñoà uoáng leân men vöøa coù tính giaûi khaùt vöøa coù taùc duïng trò lieäu töø caùc loaïi quaû nho, thôm, xoaøi, sôri [31]. ™ Hieän nay chöa thaáy coù coâng trình naøo ñöôïc coâng boá veà saûn phaåm nöôùc giaûi khaùt leân men töø traùi thanh long. Traùi thanh long hieän chæ ñöôïc söû duïng ñeå aên töôi, cheá bieán coktail hay taïo nöôùc uoáng ñoùng hoäp (saûn phaåm cuûa coâng ty thöïc phaåm noâng saûn vaø thuûy haûi saûn L&D Enterprise) [68]. 35 CHÖÔNG 3: NHÖÕNG HIEÅU BIEÁT VEÀ TRAÙI THANH LONG 3.1 Ñaëc ñieåm cuûa caây, traùi thanh long Caây thanh long coù teân khoa hoïc laø Hylocereus undatus thuoäc hoï xöông roàng Cactaceae [1]. Thanh long coøn coù teân goïi laø Töôøng Lieân. Ngöôøi Phaùp goïi thanh long laø Oeil de Dragon coøn ngöôøi Anh goïi laø Dragon fruit. Thanh long coù nguoàn goác trong caùc röøng töï nhieân cuûa Nicaragoa, Meâhicoâ, Columbia (Nam Myõ). Sau ñöôïc lan daàn sang caùc nöôùc khaùc ôû Chaâu Phi nhö Madagascar, Srilanka vaø caùc chaâu khaùc [1] [57]. ÔÛ Vieät Nam, thanh long ñöôïc du nhaäp töø thôøi Phaùp thuoäc, ñöôïc troàng ñaàu tieân ôû Nha Trang vaø Phan Thieát. Sau khi xí nghieäp cheá bieán rau quaû xuaát khaåu TP. Hoà Chí Minh thu mua vaø ñem giôùi thieäu traùi thanh long ra thò tröôøng nöôùc ngoaøi, thì phong traøo troàng thanh long phaùt trieån maïnh ôû Phan Rang, Phan Thieát, Buoân Ma Thuoäc, cho ñeán caùc tænh ñoàng baèng Soâng Cöûu Long nhö: Tieàn Giang (huyeän Chôï gaïo), Long An (huyeän Chaâu Thaønh) vaø thaønh phoá Hoà Chí Minh (Leâ Minh Xuaân, Phaïm Vaên Hai, huyeän Bình Chaùnh).... trong nhöõng naêm gaàn ñaây, thanh long ñaõ trôû thaønh moät maët haøng traùi caây xuaát khaåu qua caùc nöôùc Ñoâng Nam AÙ vaø ñang môû roäng thò tröôøng ra moät soá nöôùc khaùc... [35] [56]. Traùi thanh long hình baàu duïc, daøi, cöùng… tuøy theo töøng loaïi gioáng coù nhieàu tai laù xanh, luùc chín traùi chuyeån maøu qua ñoû roài tôùi ñoû ñaäm. Moãi traùi coù chöùa nhieàu haït nhoû, maøu ñen naèm beân trong khoái thòt maøu traéng gioáng nhö haït meø. Luùc coøn xanh, haït coù maøu naâu vaø sau ñoù chuyeån sang maøu ñen ñeán khi chín [10] [18] [62]. 36 Baûng 3.1 Thaønh phaàn dinh döôõng cuûa traùi thanh long Bình Thuaän Thaønh phaàn g/100g thòt traùi Thaønh phaàn mg/100g thòt traùi Nöôùc 85,3 Vitamin C 3 Protein 1,1 Niacin 2,8 Glucose 5,7 Vitamin A 0,0111 Fructose 3,2 Calcium 10,2 Sorbitol 0,33 Saét 3,37 Cacbonhydrat 11,2 Magnesium 38,9 Chaát xô 1,34 Phospho 27,5 Tro 0,56 Kali 2,72 Naêng löôïng (Kcal) 67,7 Natri 8,9 “Nguoàn: Leâ Vaên Toá vaø ctv, 2000” 3.2 Tình hình saûn xuaát vaø söû duïng traùi thanh long Phaùt hieän ñöôïc giaù trò dinh döôõng, giaù trò chöõa beänh vaø nhu caàu xuaát khaåu neân caây thanh long ñöôïc phaùt trieån ôû caùc tænh Bình Thuaän, Ninh Thuaän, Khaùnh Hoøa, Phuù Yeân, Long An (Chaâu Thaønh), Tieàn Giang (Chôï Gaïo). Trong ñoù, Bình Thuaän laø nôi coù dieän tích vaø saûn löôïng thanh long cao nhaát. Vieät Nam laø nöôùc Ñoâng Nam AÙ troàng thanh long vôùi quy moâ thöông maïi khaù lôùn, dieän tích troàng öôùc löôïng khoaûng 7000 ha [2]. Hieän nay thanh long tröïc tieáp ñöôïc xuaát khaåu qua hai thò tröôøng Ñaøi Loan vaø Hoàng Koâng chieám hôn 50%, döôùi 50% coøn laïi laø caùc nöôùc ASEAN, trong ñoù Malasya chieám 20%, soá coøn laïi laø Singapore vaø Indonesia. Rieâng thò tröôøng Trung Quoác coù moät soá doanh nghieäp thöïc hieän nhöng haàu heát theo phöông thöùc baùn noäi ñòa taïi bieân giôùi Vieät Nam cho thöông nhaân Trung Quoác khoâng qua thuû tuïc xuaát khaåu (do thueá nhaäp khaåu traùi caây cuûa Trung Quoác quaù cao gaàn 34%) [2]. 37 Ngaøy nay moät soá doanh nghieäp tö nhaân xuaát khaåu thanh long ñaõ töøng böôùc vöôn leân ñaàu tö trang bò cô sôû vaät chaát, kho laïnh, phöông tieän vaän chuyeån phuïc vuï nhu caàu xuaát khaåu, aùp duïng phöông phaùp baûo quaûn quaû ñaûm baûo veà hình thöùc vaø chaát löôïng trong quaù trình löu thoâng [35]. Hieän nay Thaùi Lan laø nöôùc ñang caïnh tranh vôùi Vieät Nam veà maët haøng thanh long, caùc nöôùc Israel, UÙc, Ñaøi Loan cuõng ñang phaùt trieån thanh long. Do ñoù neáu khoâng chuù troïng naâng cao chaát löôïng saûn phaåm, taêng cöôøng khueách tröông, quaûng baù vaø taêng caùc yeáu toá caïnh tranh cuûa saûn phaåm thì thò tröôøng khoâng chæ khoù môû roäng maø thu heïp daàn [2]. Hieän nay traùi thanh long ñöôïc söû duïng döôùi nhieàu hình thöùc khaùc nhau: Traùi coù maøu ñoû ñeïp ñöôïc nhaân daân laøm quaû trang trí hoaëc thôø cuùng; Baûo quaûn laïnh ñeå aên töôi hoaëc cheá bieán coktail; Xay thaønh boät ñeå pha nöôùc uoáng; Troän vôùi rau laøm salad; Nhaân daân ta duøng hoa vaø thaân thanh long ñem saéc leân laøm thuoác chöõa beänh ho. Ngoaøi ra, thòt traùi thanh long coù vò ngoït, hôi chua, maùt, duøng ñeå giaûi khaùt toát, laø vò thuoác giaûi nhieät, lôïi tieåu, chöõa beänh thieáu maùu, chöõa taùo boùn [17] [20]. Gaàn ñaây thanh long coøn ñöôïc cheá bieán laøm kem traùi caây thanh long [65] vaø söû duïng döôùi daïng nöôùc eùp ñoùng hoäp [68]. Nguyeãn Kim Vuõ vaø coäng söï thuoäc Vieän Coâng Ngheä Sau Thu Hoaïch ñaõ taïo ra saûn phaåm maøu döôùi daïng boät töø voû thanh long [70]. 3.3 Nhöõng khoù khaên khi söû duïng traùi thanh long cheá bieán thaønh nöôùc uoáng leân men Thôøi gian baûo quaûn traùi thanh long ngaén, nhanh hö hoûng, coù theo muøa. Vaøi naêm gaàn ñaây, nhaø vöôøn ôû Bình Thuaän ñaõ söû duïng kyõ thuaät chong ñeøn ñieän taïo cho thanh long ra traùi nghòch muøa vôùi nhieàu vuï trong naêm ñaït hieäu quaû cao. 38 Trong thaønh phaàn cuûa traùi thanh long coù nöôùc, ñöôøng, protein, vitamin, chaát khoaùng neân dòch traùi thanh long laø moâi tröôøng toát cho quaù trình leân men nhöng coù nhöõng haïn cheá: haøm löôïng nöôùc cao, ñöôøng thaáp, ñoä chua khoâng ñaäm do ñoù dòch quaû coù vò laït, saéc toá ñoû hoàng töø voû deã phaân huûy trong moâi tröôøng acid [70]. Ñeå leân men ñöôïc dòch thanh long caàn phaûi boå sung ñöôøng vaø ñieàu chænh ñoä chua phuø hôïp. Dòch traùi thanh long thu ñöôïc qua maùy eùp traùi caây coù maøu traéng ñuïc do coù nhieàu boät quaû, nhôùt, coù laãn moät soá maûnh voû raát nhoû cuûa haït ñen thanh long. Vì vaäy khi söû duïng dòch traùi thanh long laøm nguyeân lieäu cho quaù trình leân men gaëp khoù khaên. Xuaát phaùt töø vaán ñeà naøy, chuùng toâi söû duïng nhieàu bieän phaùp ñeå xöû lyù vôùi muïc ñích tìm moâi tröôøng dòch thanh long thích hôïp cho quaù trình leân men. Ñoàng thôøi taïo ñöôïc saûn phaåm coù chaát löôïng, taêng hình thöùc vaø ñaït hieäu quaû kinh teá cao. 39 PHAÀN II: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU CHÖÔNG 4: NGUYEÂN LIEÄU, HOÙA CHAÁT, THIEÁT BÒ 4.1 Nguyeân lieäu 4.1.1 Traùi thanh long Traùi thanh long thuoâïc gioáng thanh long ruoät traéng cuûa tænh Bình Thuaän. Hình 4.1 Traùi thanh long ruoät traéng Bình Thuaän 4.1.2 Gioáng vi sinh vaät ™ Caùc chuûng naám men ñöôïc kyù hieäu laø: LT2, Mn7 vaø chuûng Saccharomyces cerevisiac (Sac.) töø boä söu taäp gioáng cuûa phoøng thí nghieäm vi sinh tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm TP. Hoà Chí Minh. ™ Chuûng naám men phaân laäp ñöôïc töø baùnh men coù kyù hieäu BM. ™ Chuûng naám men phaân laäp ñöôïc töø dòch thanh long ñeå leân men töï nhieân ñöôïc kyù hieäu TL1, TL2 vaø TL3. ™ Caùc chuûng vi khuaån kieåm ñònh: Escherichia coli, Klebsiella, Serratia sp., Streptococcus sp., Bacillus pimitilis vaø Salmonella typhimurium töø Vieän Pasteur Thaønh phoá Hoà Chí Minh. 40 4.2 Hoùa chaát Glucose (Trung Quoác) Agar (Vieät Nam) Fructose (Trung Quoác) Cao naám men (Myõ) Lactose (Trung Quoác) Cao malt (Myõ) Galactose (Vieät Nam) Pepton (Trung Quoác) Sacarose (Trung Quoác) Cao thòt (Myõ) Dextrin (Trung Quoác) Vitamin B1 (Vieät Nam) Ñöôøng tinh luyeän Bieân Hoøa (Vieät Nam) (NH4)2SO4 (Trung Quoác) H2SO4 ñaäm ñaëc (Trung Quoác) NaOH (Trung Quoác) Acid citric (Vieät Nam) KOH (Trung Quoác) Caùc ñóa khaùng sinh cuûa coâng ty Nam Khoa Quaän 7, Thaønh phoá Hoà Chí Minh. 4.3 Thieát bò Maùy ño pH Hana Maùy eùp traùi caây Philip Noài haáp thuûy löïc Huxley (Ñaøi Loan) Maùy laéc Gerhardt Maùy ño quang phoå UV-1601PC Tuû saáy Memmert (Ñöùc) Bình Elgol-smith (Ñöùc) Kính hieån vi soâi noåi (Nhaät Baûn) Chieát quang keá caàm tay (Nhaät Baûn) Pipetman Nichigo (Nhaät Baûn) Tuû caáy voâ truøng (Trung taâm nhieät ñôùi Vieät Nga) Kính hieån vi quang hoïc Olympus (Nhaät Baûn) Maùy ño ñoä nhôùt Brook Kfield DV-II+ (Myõ) 4.4 Caùc loaïi moâi tröôøng nghieân cöùu: 4.4.1 Moâi tröôøng Hansen ñaëc (MT1). Glucose 50g Agar 20g Pepton 10g Nöôùc caát vöøa ñuû 1000ml KH2P04 3g pH=5,5 41 4.4.2 Moâi tröôøng Hansen loûng (MT2). Thaønh phaàn gioáng MT1 nhöng khoâng coù agar. 4.4.3 Moâi tröôøng hoaït hoùa (MT3). Cao malt 30g Nöôùc caát 1000ml Pepton 5g pH=5,5 4.4.4 Moâi tröôøng nhaân gioáng (MT4). Cao naám men 1g KH2PO4 3g Glucose 50g Nöôùc caát 1000ml Pepton 10g pH = 6 4.4.5 Moâi tröôøng thöû khaû naêng leân men caùc nguoàn hydratcacbon (MT5). Nöôùc chieát giaù ñaäu 1000ml. Boå sung ñöôøng nghieân cöùu 2%. Caùch pha cheá nöôùc chieát giaù ñaäu: Giaù ñaäu röûa saïch, ñeå raùo nöôùc, caân 200g giaù vaø 1000ml nöôùc, ñun soâi 30 phuùt, loïc laáy phaàn dòch trong. Theâm cho ñuû 1000ml, boå sung ñöôøng nghieân cöùu 2%. 4.4.6 Moâi tröôøng xaùc ñònh khaû naêng sinh baøo töû (MT6). Glucose 0,4g Agar 16g Acetat khoâng ngaäm nöôùc 1,4g Nöôùc caát 1000ml. 4.4.7 Moâi tröôøng thaïch-pepton-glucose (MT7) Pepton 10g Agar 20g Glucose 20g Nöôùc caát 1000ml. 4.4.8 Moâi tröôøng xaùc ñònh khaû naêng söû duïng caùc nguoàn nitô khaùc nhau (MT8). Glucose 20g Agar 16g KH2PO4 1g Nöôùc caát 1000ml MgSO4.7H2O 0,5g 42 Khi muoán xaùc ñònh khaû naêng söû duïng caùc nguoàn nitô khaùc nhau thì boå sung nguoàn nitô vaøo moâi tröôøng voâ ñaïm (MT8) döôùi daïng KN03, (NH4)2S04 hoaëc Pepton vôùi caùc tyû leä khaùc nhau theo yeâu caàu cuûa thí nghieäm. 4.4.9 Moâi tröôøng xaùc ñònh khaû naêng keát laéng cuûa teá baøo naám men (MT9). CaSO4 0,51g CH3COONa 6,8g CH3COOH 4,05g Nöôùc caát 1000ml 4.4.10 Moâi tröôøng MPA – agar (MT10) Cao thòt 3g Agar 16g NaCl 5g Nöôùc caát 1000ml Pepton 10g 4.4.11 Moâi tröôøng MPA-dòch theå (MT11) Thaønh phaàn gioáng MT10 nhöng khoâng coù agar. 4.4.12 Moâi tröôøng siroâ thanh long (MT12) Choïn traùi thanh long coøn töôi, coù maøu ñoû ñaäm, tai laù coøn xanh, khoâng bò daäp naùt. Loät voû, caét thaønh mieáng moûng cho vaøo bình thuûy tinh, cöù moät lôùp thanh long phuû moät lôùp ñöôøng. Thöôøng 1kg thanh long söû duïng ½ kg ñöôøng. Ta thu ñöôïc dòch chieát sau 7-10 ngaøy. Dòch chieát naøy coù noàng ñoä ñöôøng raát cao neân caàn pha loaõng 2-4 laàn baèng nöôùc soâi ñeå nguoäi nhaèm ñaït ñöôïc ñoä ñöôøng phuø hôïp. Sau ñoù ñieàu chænh ñoä chua baèng acid citric 5%. Ñem khöû truøng dòch theo kieåu Pasteur ôû 700C trong 15-20 phuùt. 4.4.13 Moâi tröôøng dòch traùi thanh long Choïn thanh long töông töï nhö treân, loät boû voû roài caét thaønh töøng mieáng cho vaøo maùy eùp traùi caây. Thu ñöôïc dòch traùi thanh long khoâng qua loïc (MT14). Löôïng dòch thu ñöôïc ñem loïc ñeå laáy phaàn dòch trong-dòch traùi thanh long qua loïc 43 (MT13). Thöôøng 1kg traùi thanh long thu ñöôïc khoaûng 300-400ml dòch traùi thanh long khoâng qua loïc vaø 200-250ml dòch traùi thanh long qua loïc. Dòch traùi thanh long nguyeân chaát ñoä ñöôøng khoaûng 10-140Bx vaø pH = 4,0- 4,5 neân caàn theâm ñöôøng vaø ñieàu chænh pH=3,5 baèng acid citric. Sau ñoù ñem khöû truøng ôû 700C trong 15-20 phuùt. 4.4.14 Moâi tröôøng dòch trích ly traùi thanh long (MT15) Thòt traùi thanh long ñöôïc caét mieáng moûng, nhoû, boå sung nöôùc vaø ñun vöøa ñeán soâi, giöõ trong 15 phuùt ñeå caùc chaát hoøa tan vaøo moâi tröôøng. Vôùt boû xaùc baõ thu ñöôïc löôïng dòch trích ly. Tuøy theo löôïng dòch thu ñöôïc coù 3 moâi tröôøng: MT15-1: 1kg traùi thanh long thu ñöôïc 450ml dòch trích ly. MT15-2: 1kg traùi thanh long thu ñöôïc 465ml dòch trích ly. MT15-3: 1kg traùi thanh long thu ñöôïc 480ml dòch trích ly. Dòch trích ly ñöôïc boå sung ñöôøng, acid citric vaø ñem khöû truøng Pasteur ôû 700C trong 15-20 phuùt. 4.4.15 Moâi tröôøng nhaân gioáng thích hôïp ñeå leân men dòch traùi thanh long (MT16). Dòch traùi thanh long khoâng qua loïc ñöôïc boå sung ñöôøng sacarose ñeán 180Bx, chænh pH baèng acid citric veà 3,5 vaø boå sung (NH4)2SO4 5g/l. 4.4.15 Moâi tröôøng leân men (MT17) Dòch traùi thanh long khoâng qua loïc ñöôïc boå sung ñöôøng sacarose ñeán 200Bx, ñieàu chænh pH baèng acid citric ñeán 3,5. Trong 1 lít nöôùc quaû boå sung 10mg/l hoãn hôïp coù amon Sulfat 100 g/l vaø vitamin B1 (Thiamin) 0,25 g/l. 44 CHÖÔNG 5: CAÙC PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU 5.1 Caùc phöông phaùp vi sinh vaät 5.1.1 Phaân laäp vaø thuaàn khieát gioáng theo phöông phaùp pha loaõng cuûa Koch [5] [50] [51]. * Nguyeân taéc: muïc ñích ñeå taùch rôøi moät loaïi teá baøo töø quaàn theå vi sinh vaät ban ñaàu, sau ñoù gieo caáy treân ñóa petri vôùi moâi tröôøng dinh döôõng choïn loïc vaø uû ôû ñieàu kieän thích hôïp. Moãi teá baøo naøy hình thaønh neân khuaån laïc ñôn rieâng bieät (chæ chöùa moät loaïi teá baøo môùi goïi laø khuaån laïc thuaàn) [50]. * Tieán haønh: [5] Neáu maãu laø cô chaát daïng raén: caân 1g maãu cho vaøo coái söù nghieàn naùt. Sau ñoù chuyeån vaøo bình tam giaùc chöùa 99ml nöôùc caát voâ truøng, laéc ñeàu ñöôïc ñoä pha loaõng 10-2. Neáu maãu laø cô chaát daïng loûng hay seät: duøng pipet voâ truøng huùt 1ml maãu chuyeån vaøo bình tam giaùc chöùa 99ml nöôùc caát voâ truøng, laéc ñeàu ñöôïc ñoä pha loaõng 10-2. Tieáp tuïc pha loaõng cho tôùi heä soá pha loaõng thích hôïp theo sô ñoà 5.1 [22] Sô ñoà 5.1 Phöông phaùp pha loaõng maãu 45 Tieán haønh phaân laäp maãu ôû ñoä pha loaõng thích hôïp treân moâi tröôøng MT1 ôû thaïch ñóa vaø nuoâi ôû 300C trong 3 ngaøy. Choïn caùc khuaån laïc rieâng leõ, caáy ra thaïch nghieâng moâi tröôøng MT1. Neáu khoâng thuaàn thì laøm thuaàn baèng phöông phaùp caáy trang vaø kieåm tra hình thaùi teá baøo döôùi kính hieån vi. 5.1.2 Phöông phaùp nghieân cöùu hình thaùi teá baøo [5] [6] [29] [50] [51]. 5.1.2.1 Quan saùt hình thaùi ™ Quan saùt ñaïi theå: quan saùt khuaån laïc treân kính hieån vi soâi noåi. ™ Quan saùt vi theå: quan saùt teá baøo döôùi kính hieån vi quang hoïc vôùi vaät kính ×40, ×100. 5.1.2.2 Ño kích thöôùc teá baøo: baèng traéc vi thò kính. 5.1.2.3 Phöông phaùp tính soá löôïng teá baøo baèng phoøng ñeám Goriaep (phoøng ñeám hoàng caàu) * Nguyeân taéc caáu taïo: phoøng ñeám laø moät phieán kính daøy hình chöõ nhaät, giöõa laø phaàn loõm phaúng, taïi ñaây coù keû moät löôùi goàm 400 hình vuoâng coù dieän tích toång coäng laø 1mm2. Vì vaäy dieän tích moät hình vuoâng nhoû laø 1/400mm2 vaø moät hình vuoâng lôùn laø 1/25mm2. * Coâng thöùc tính: N: Soá löôïng teá baøo trong 1ml dòch huyeàn phuø. n sh a N . 1000.= a: Soá löôïng teá baøo trung bình trong 1 oâ nhoû. h: Chieàu saâu cuûa khung ñeám. n: Ñoä pha loaõng cuûa maãu. s: Dieän tích hình vuoâng cuûa löôùi. 5.1.2.4 Phöông phaùp quan saùt nang baøo töû naám men [5] [29] [52] * Nguyeân taéc: moät soá naám men coù khaû naêng hình thaønh baøo töû hay nang baøo töû trong moâi tröôøng ngheøo dinh döôõng nhaèm baûo veä naám men choáng laïi nhieàu aûnh höôûng coù haïi cuûa moâi tröôøng. 46 * Tieán haønh: caáy naám men treân moâi tröôøng MT6 töø 10-15 ngaøy, laøm tieâu baûn soi töôi ñeå quan saùt nang baøo töû. 5.1.2.5 Phöông phaùp quan saùt khuaån ty [5] [52] Phaân phoái moâi tröôøng MT7 vaøo caùc ñóa petri moät lôùp caøng moûng caøng toát. Duøng que caáy ñaàu troøn laáy naám men vaø caáy thaønh 3 ñöôøng thaúng song song. Duøng Panh gaép 1 laù kính ngaâm trong coàn 700, ñoát nheï cho heát coàn, ñeå nguoäi roài ñaët nheï nhaøng caån thaän treân veát caáy. Chuù yù: Beà maët thaïch phaûi thaät khoâ, khi ñaäy laù kính moûng phaûi traùnh boït khí, ñaäy xong phaûi traùnh di chuyeån laøm xoâ leäch laù kính. Nuoâi ôû 28-300C töø 3-5 ngaøy, quan saùt döôùi kính hieån vi. 5.1.3 Nghieân cöùu ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa 5.1.3.1 Khaû naêng ñoàng hoùa caùc nguoàn nitô khaùc nhau [5] [52] Nuoâi caáy naám men trong 3 loâ oáng nghieäm Loâ 1: chöùa moâi tröôøng voâ ñaïm (MT8) Loâ 2: moâi tröôøng MT8 coù boå sung 0,1% KNO3 Loâ 3: moâi tröôøng MT8 coù boå sung 0,1% (NH4)2SO4 Quan saùt veát caáy ôû caùc loâ oáng nghieäm sau 5-7 ngaøy nuoâi caáy, loâ naøo coù veát caáy chöùng toû naám men coù khaû naêng söû duïng nguoàn nitô ñoù ñeå phaùt trieån. 5.1.3.2 Phöông phaùp xaùc ñònh khaû naêng leân men caùc nguoàn hydratcacbon [5] [47] [52] * Nguyeân taéc: Söû duïng bình Einhorn-Smith ñeå ñaùnh giaù hoaït löïc leân men. Trong quaù trình leân men seõ sinh ra CO2, ñaåy dòch leân men trong coät chia vaïch xuoáng; coät khí CO2 caøng cao chöùng toû khaû naêng leân men caøng maïnh. * Tieán haønh: Cho 9ml dung dòch moâi tröôøng MT5 chöùa caùc loaïi ñöôøng nghieân cöùu 2% (Glucose, dextrin, sacarose, lactose, galactose vaø maltose) vaøo moãi bình Einhorn-smith. Boå sung 1ml gioáng vaøo, ñaäy nuùt boâng roài duøng keo 47 parafilm quaán kín leân naép bình. Theo doõi thôøi gian taïo ra 5ml khí CO2 trong bình ñeå ñaùnh giaù hoaït löïc leân men cuûa moãi chuûng vôùi moãi loaïi ñöôøng khaùc nhau. Chuù yù: Caùc thí nghieäm baét ñaàu baèng ñöôøng glucose. Neáu naám men leân men ñöôïc glucose thì tieáp tuïc thí nghieäm vôùi caùc loaïi ñöôøng khaùc. 5.1.3.3 Phöông phaùp khaûo saùt aûnh höôûng cuûa nhieät ñoä [52] * Nguyeân taéc: duøng oáng nghieäm coù moâi tröôøng MT2 ñaõ chöùa saün oáng thuûy tinh nhoû (oáng Durham) cuõng chöùa ñaày moâi tröôøng vaø coù ñaùy quay leân phía treân ñeå ñaùnh giaù khaû naêng sinh tröôûng. * Tieán haønh: caáy naám men vaøo oáng nghieäm chöùa moâi tröôøng MT2 vaø chöùa saün moät oáng Durham cuõng chöùa ñaày moâi tröôøng coù ñaùy quay leân phía treân. Nuoâi ôû nhieät ñoä khaùc nhau: 100C, 200C, 300C, 350C vaø 400C. Quan saùt traïng thaùi oáng Durham sau moãi ngaøy vaø theo doõi trong 3 ngaøy. OÁng Durham noåi leân: sinh tröôûng maïnh OÁng Durham lô löõng: sinh tröôûng yeáu OÁng Durham khoâng coù khí: khoâng sinh tröôûng 5.1.3.4 Phöông phaùp khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH [52] Caáy naám men vaøo moâi tröôøng MT2 ñieàu chænh moâi tröôøng baèng NaOH 0,1N hoaëc baèng acid citric 5% veà caùc giaù trò pH: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 vaø 6,5. Nuoâi caáy tónh ôû 300C trong 3 ngaøy. Xaùc ñònh khaû naêng sinh tröôûng cuûa chuûng naám men ôû caùc trò soá pH khaùc nhau döïa vaøo traïng thaùi cuûa oáng Durham nhö muïc 5.1.3.3 5.1.3.5 Phöông phaùp khaûo saùt khaû naêng chòu coàn [52] Thí nghieäm ñöôïc tieán haønh töông töï nhö muïc 5.1.3.3 nhöng oáng nghieäm coù chöùa moâi tröôøng MT2 coù boå sung noàng ñoä coàn khaùc nhau: 1%, 2%, 3%, 4% vaø 5%. Quan saùt traïng thaùi cuûa oáng Durham sau moãi ngaøy vaø theo doõi khaû naêng sinh tröôûng cuûa chuûng naám men trong 3 ngaøy. 48 5.1.4 Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït löïc leân men [7] [22] Ñeå xaùc ñònh hoaït löïc leân men cuûa caùc chuûng naám men söû duïng phöông phaùp caân bình. * Nguyeân taéc: Khaû naêng leân men röôïu ñöôïc xaùc ñònh baèng löôïng CO2 thoaùt ra trong quaù trình leân men theo phöông phaùp caân bình taïi caùc thôøi ñieåm khaùc nhau. Löôïng CO2 thoaùt ra laøm giaûm troïng löôïng bình, troïng löôïng bình caøng giaûm chöùng toû chuûng naám men leân men caøng maïnh. * Tieán haønh: Ñöa caùc chuûng naám men vaøo nhaân gioáng treân maùy laéc 150 voøng/phuùt trong 24 giôø ôû nhieät ñoä phoøng. Phaân phoái 95ml moâi tröôøng vaøo caùc bình tam giaùc 250ml, boå sung dòch nhaân gioáng vôùi tyû leä 5% (caàn ñieàu chænh löôïng gioáng cho vaøo bình leân men ñeàu baèng nhau), ñaäy nuùt cao su ñaõ voâ truøng coù noái oáng thoaùt. Trong oáng thoaùt cho H2SO4 ñaäm ñaëc hoaëc glycerin ñeå haáp thu löôïng nöôùc boác hôi. Xaùc ñònh löôïng CO2 thoaùt ra baèng caùch caân bình taïi caùc thôøi ñieåm 0giôø, 24 giôø, 48 giôø vaø 72 giôø. 5.1.5 Phöông phaùp kieåm tra ñoä keát laéng [16] [47] * Nguyeân taéc: Khaû naêng keát laéng cuûa töøng chuûng naám men ñöôïc xaùc ñònh baèng toác ñoä laéng sinh khoái. * Tieán haønh: Hoøa sinh khoái naám men vaøo dung dòch ñeäm acetat ñöïng trong caùc oáng nghieäm baèng nhau. Laéc kyõ trong 1 phuùt, ñeå laéng 15 phuùt. Nhaän xeùt keát quaû laéng theo chieàu cao sinh khoái naám men keát laéng vaø ño ñoä trong cuûa lôùp dòch trong moãi oáng nghieäm. 5.1.6 Phöông phaùp xaùc ñònh khaû naêng taïo höông [13] Höông thôm cuõng laø moät trong ba chæ tieâu quan troïng ñeå tuyeån choïn chuûng naám men thích hôïp cho leân men dòch thanh long. 49 Xaùc ñònh khaû naêng taïo höông thôm cuûa caùc chuûng naám men baèng giaùc quan nhö sau: Caáy caùc chuûng naám men caàn khaûo saùt vaøo thaïch ñóa coù chöùa moâi tröôøng Hansen ñaëc (MT1) vaø vaøo oáng nghieäm coù chöùa moâi tröôøng dòch theå (MT2). Nuoâi ôû nhieät ñoä phoøng trong 72 giôø. Sau ñoù ñaùnh giaù, so saùnh khaû naêng taïo höông cuûa caùc chuûng baèng khöùu giaùc vôùi hai tröôøng hôïp nuoâi caáy thaïch ñaëc vaø nuoâi caáy dòch theå. 5.1.7 Phöông phaùp xaùc ñònh khaùng sinh baèng phöông phaùp khueách taùn treân thaïch [11] [26] [52] * Nguyeân taéc: döïa vaøo söï khueách taùn cuûa chaát öùc cheá trong dòch nuoâi caáy vaøo moâi tröôøng thaïch, choå naøo coù chaát öùc cheá khueách taùn nôi ñoù vi sinh vaät kieåm ñònh khoâng moïc ñöôïc vaø taïo thaønh voøng voâ khuaån. * Tieán haønh: 9 MT10 coù chöùa töøng loaïi vi khuaån kieåm ñònh (Escherichia coli, Klebsiella, Serratia sp., Streptococcus. sp, Bacillus pimitilis vaø Salmonella typhimurium) ñöôïc ñoå vaøo caùc ñóa petri baèng nhau, moãi ñóa 20ml. 9 Khoan loã thaïch 9 Nhoû 0,1ml dòch nuoâi caáy vaøo loã thaïch, giöõ ôû 40C trong 4-5 giôø 9 Chuyeån sang nuoâi ôû tuû aám vôùi nhieät ñoä thích hôïp tuøy töøng loaïi vi khuaån kieåm ñònh. Sau 24 giôø kieåm tra voøng voâ khuaån. Hoaït tính khaùng sinh ñöôïc ñaùnh giaù baèng hieäu soá D – d (mm) Vôùi: D: ñöôøng kính voøng öùc cheá (mm) d: ñöôøng kính loã khoan (d = 8mm) 50 5.1.8 Phöông phaùp xaùc ñònh khaû naêng khaùng caùc khaùng sinh cuûa dòch nuoâi caáy baèng phöông phaùp duøng ñóa khaùng sinh chuaån [3] Duøng que gaït caáy chuûng naám men treân caùc ñóa petri coù chöùa moâi tröôøng MT1, sau ñoù ñaët caùc ñóa giaáy coù taåm chaát khaùng sinh leân maët thaïch. Ñeå sau 24 giôø kieåm tra coù hay khoâng voøng voâ khuaån. 5.2 Caùc phöông phaùp hoùa lyù 5.2.1 Phöông phaùp xaùc ñònh haøm löôïng nöôùc [47] Caân chính xaùc 1g dòch nghieân cöùu, ñem saáy khoâ ôû nhieät ñoä 100-1050C ñeán khoái löôïng khoâng ñoåi. Laáy khoái löôïng ban ñaàu tröø khoái löôïng sau khi saáy khoâ töø ñoù ta tính ñöôïc haøm löôïng nöôùc trong maãu. 5.2.2 Phöông phaùp ñònh löôïng haøm löôïng ñöôøng baèng phöông phaùp so maøu treân maùy quang phoå UV-1601 PC [14] [15] [43] * Nguyeân taéc: xaùc ñònh haøm löôïng ñöôøng trong maãu döïa treân phaûn öùng maøu ñaëc tröng bôûi ñöôøng vaø chaát höõu cô vôùi söï hieän dieän cuûa H2SO4 ñaäm ñaëc. * Tieán haønh: Böôùc 1: Thieát laäp ñoà thò chuaån vaø moái töông quan giöõa haøm löôïng glucose chuaån vôùi OD490 Chuaån bò glucose chuaån vôùi caùc noàng ñoä sau: Soá thöù töï 1 2 3 4 5 6 7 Glucose (ml) 1 2 3 4 5 6 7 H2O (ml) 99 98 97 96 95 94 93 [C] mg/l 10 20 30 40 50 60 70 Ghi chuù: [C]: noàng ñoä glucose Tieán haønh phaûn öùng so maøu: dung dòch glucose chuaån : phenol 5% : H2SO4 ñaäm ñaëc = 1 : 1 : 5, laéc nheï, ñeàu, ñeå laéng. Ño OD vôùi böôùc soùng 490 nm. 51 ¾ Böôùc 2: Xaùc ñònh glucose trong dòch nghieân cöùu Caân 1g dòch traùi thanh long. Dòch ñöôïc chieát vôùi coàn 900 noùng 3 laàn vôùi tyû leä coàn : maãu = 10 : 1. Tieáp tuïc nhö treân (2 laàn) vôùi coàn 800 noùng. Coâ caïn dòch loïc roài pha loaõng vôùi nöôùc caát. Cho phaûn öùng maøu: dung dòch ñöôøng : phenol 5% : H2SO4 ñaäm ñaëc = 1 : 1 : 5 laéc nheï, ñeàu, ñeå laéng. Ño OD490. Suy ra löôïng ñöôøng coù trong dòch nghieân cöùu döïa vaøo ñoà thò chuaån. 5.2.3 Phöông phaùp xaùc ñònh haøm löôïng chaát khoâ baèng chieát quang keá caàm tay [49] Khi ñi töø moät moâi tröôøng (khoâng khí) vaøo moät moâi tröôøng khaùc (chaát loûng) tia saùng seõ bò leäch ñi (khuùc xaï). Neáu chaát loûng laø moät dung dòch chaát hoøa tan (dung dòch ñöôøng, muoái,…) döïa treân ñoä leäch cuûa tia saùng ta coù theå xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng chaát khoâ. 5.2.4 Phöông phaùp xaùc ñònh noàng ñoä röôïu [15] Chöng caát 100ml dòch leân men ôû heä thoáng chöng caát coàn, thu nhaän 70-80ml dòch ngöng ñoïng, pha loaõng baèng nöôùc caát ñeán 100ml. Ño ñoä coàn trong dòch ngöng ñoïng baèng coàn keá roài quy veà ñoä coàn chuaån ôû 150C. 5.2.5 Phöông phaùp xaùc ñònh acid toång soá [63] * Nguyeân taéc: Xaùc ñònh haøm löôïng acid trong dung dòch nghieân cöùu baèng dung dòch kieàm chuaån, nhôø söï ñoåi maøu cuûa thuoác thöû. * Tieán haønh: Laáy 20ml maãu nghieân cöùu, theâm 30ml nöôùc caát vaø 5 gioït chaát chæ thò (chaát chæ thò goàm hoãn hôïp: 0,2% metyl ñoû trong dung dòch röôïu 700 vaø 0,1% xanh metylen trong dung dòch röôïu 700 theo tyû leä 1 : 1) 52 Ñem chuaån ñoä baèng KOH 0,1N cho ñeán khi dung dòch chuyeån töø maøu tím sang maøu xanh laù maï. Töø soá ml KOH 0,1N ñaõ söû duïng coù theå tính ñöôïc haøm löôïng acid toång soá coù trong dung dòch baèng bieåu thöùc V ba X 1000..= X: haøm löôïng acid toång soá (g/l) a: löôïng KOH ñaõ chuaån ñoä b: löôïng acid töông ñöông 1ml KOH 0,1N tính theo mg (heä soá quy ñoåi) V: theå tích maãu phaân tích (ml) Heä soá quy ñoåi: acid acetic 0,0060; acid lactic 0,0090; acid tartric 0,0075; acid malic 0,0067; acid citric 0,0064. 5.2.6 Phöông phaùp xaùc ñònh nitô toång soá baèng phöông phaùp Kjeldahl [12] [33] * Nguyeân taéc: Döôùi taùc duïng cuûa H2SO4 ñaëc ôû nhieät ñoä cao, caùc hôïp chaát coù chöùa nitô bò phaân huûy vaø bò oxy hoùa ñeán CO2 vaø H2O, coøn nitô chuyeån thaønh amoniac (NH3) vaø tieáp tuïc keát hôïp vôùi H2SO4 taïo thaønh muoái amoni sulfat. * Tieán haønh: ¾ Böôùc 1: Voâ cô hoùa nguyeân lieäu Laáy 10ml maãu cho vaøo bình Kjeldahl, theâm 5ml H2SO4 ñaäm ñaëc vaø 1-2 gioït chaát xuùc taùc (CuSO4 : K2SO4 = 1 : 9). Ñaët bình Kjeldahl vaøo tuû hoát vaø ñun cho ñeán khi dòch trong bình trong suoát vaø coù maøu xanh da trôøi. Ñeå nguoäi vaø ñònh möùc thaønh 100ml. ¾ Böôùc 2: Caát ñaïm Cho vaøo bình höùng 10ml H2SO4 0,1N vaø 3 gioït chæ thò Tashiro. Ñaët bình höùng sao cho ñaàu muùt cuûa oáng sinh haøn ngaäp trong dung dòch H2SO4 0,1N. 53 Huùt 10ml dung dòch maãu ñaõ voâ cô hoùa ñaõ pha loaõng thaønh 100ml cho vaøo bình phaûn öùng. Theâm vaøo ñoù 5ml NaOH 30%. Cho nöôùc töø voøi qua oáng laøm laïnh, ñun soâi nöôùc trong bình ñoát. Quaù trình chöng caát tieán haønh trong khoaûng 10 phuùt. ¾ Böôùc 3: Chuaån ñoä löôïng H2SO4 coøn thöøa trong bình höùng baèng NaOH 0,1N cho ñeán luùc dung dòch bieán ñoåi maøu töø tím hoàng sa