Luận văn Nghiên cứu sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ

i ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HĨA HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ETHANOL NHIÊN LIỆU TỪ RƠM RẠ SVTH : TRẦN DIỆU LÝ MSSV : 60301608 CBHD : PGS.TS. PHAN ĐÌNH TUẤN BỘ MƠN: KỸ THUẬT HỮU CƠ TP. HỒ CHÍ MINH, 01/2008 ii Đại Học Quốc Gia Tp.HCM. CỘNG HỊA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM. TRƯỜNG ĐH BÁCH KHOA. Độc Lập – Tự Do – Hạnh Phúc. --------------- ------------- Số: ________/ BKĐT NHIỆM VỤ LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP KHOA: KỸ THUẬT HĨA HỌC. BỘ MƠN: KỸ THUẬT HỮU CƠ. HỌ VÀ TÊN: TRẦN DIỆU LÝ MSSV: 60301608 NGÀNH: KỸ THUẬT HỮU CƠ LỚP: HC03KSTN 1. Đầu đề luận án: NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT ETHANOL NHIÊN LIỆU TỪ RƠM RẠ 2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): Nghiên cứu quá trình thuỷ phân rơm rạ đã qua tiền xử lý, sử dụng enzyme cellulase. Nghiên cứu quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời rơm rạ đã qua tiền xử lý,, sử dụng enzyme cellulase và nấm men saccharomyces cerevisiae. 3. Ngày giao nhiệm vụ luận án: 15/9/2007. 4. Ngày hồn thành nhiệm vụ: 15/12/2007. 5. Họ tên người hướng dẫn: Phần hướng dẫn PGS TS. PHAN ĐÌNH TUẤN Tồn bộ. Nội dung và yêu cầu LATN đã được thơng qua Bộ mơn. Ngày 15 tháng 9 năm 2007 CHỦ NHIỆM BỘ MƠN. NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH. (Ký và ghi rõ họ tên) ( Ký và ghi rõ họ tên) PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MƠN: Người duyệt (chấm sơ bộ): Đơn vị: Ngày bảo vệ: Điểm tổng kết: Nơi lưu trữ luận án: iii LỜI CẢM ƠN Luận văn là tác phẩm của một sinh viên trước khi rời khỏi trường đại học. Để hồn thành luận văn, sinh viên cần phải áp dụng tất cả các kiến thức và hiểu biết mà mình đã tích luỹ được trong suốt những năm học ở trường. Chính vì vậy những kiến thức mà em đã tiếp thu được trong 5 năm học tại trường Bách Khoa là nền tảng vững chắc giúp em hồn thành luận văn này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cơ trong khoa KỸ THUẬT HỐ HỌC nĩi chung và các thầy cơ trong bộ mơn KỸ THUẬT HỮU CƠ nĩi riêng vì đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ em trong suốt những năm vừa qua. Em xin chân thành cảm ơn thầy Phan Đình Tuấn, thầy là người đã giúp em đến với hướng nghiên cứu này, đồng thời cũng là người tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em cĩ thể hồn thành tốt luận văn. Em cũng xin cảm ơn anh Ngơ Đình Minh Hiệp vì đã nhiệt tình giúp đỡ em cả về kiến thức chuyên mơn lẫn thực nghiệm trong suốt những ngày hồn thành luận văn tại Tung tâm Lọc Hố Dầu. Cuối cùng, em xin cảm ơn bạn bè và người thân trong gia đình, những người luơn là chỗ dựa vững chắc và luơn ủng hộ em trong mọi việc. Sinh viên thực hiện Trần Diệu Lý iv MỤC LỤC Chương 1 MỞ ĐẦU......................................................................................................1 1.1 CÂY LÚA Ở VIỆT NAM .......................................................................................1 1.2 RƠM RẠ................................................................................................................2 1.2.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam................................................................................2 1.2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam ....................................3 1.3 BIOETHANOL TỪ RƠM RẠ................................................................................3 1.4 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU........................................................4 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................5 2.1 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE .................................................................5 2.1.1 Cấu trúc lignocellulose .....................................................................................5 2.1.2 Cellulose ...........................................................................................................6 2.1.3 Hemicellulose ...................................................................................................8 2.1.4 Lignin .............................................................................................................10 2.1.5 Các chất trích ly..............................................................................................12 2.1.6 Tro ..................................................................................................................13 2.2 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RƠM RẠ ...........................................13 2.2.1 Tổng quát........................................................................................................13 2.2.2 Tiền xử lý........................................................................................................14 2.2.3 Thủy phân.......................................................................................................20 2.2.4 Lên men ..........................................................................................................33 2.2.5 Thủy phân và lên men đồng thời ....................................................................38 2.3 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL VÀ ETHANOL NHIÊN LIỆU ....................................44 2.3.1 Biofuel ............................................................................................................44 2.3.2 Ethanol nhiên liệu...........................................................................................45 Chương 3 THỰC NGHIỆM ......................................................................................48 3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HĨA CHẤT ........................................................................48 3.1.1 Rơm rạ ............................................................................................................48 3.1.2 Enzyme ...........................................................................................................48 3.1.3 Giống nấm men ..............................................................................................49 3.2 CÁC THIẾT BỊ SỬ DỤNG .................................................................................49 3.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG.....................................................................52 3.3.1 Phương pháp phân tích thành phần xơ sợi trong biomass – rơm rạ ...............52 3.3.2 Phương pháp đo nồng độ glucose và ethanol .................................................56 3.3.3 Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu...............................................63 v 3.3.4 Phương pháp nuơi cấy và đếm nấm men........................................................64 3.4 TRÌNH TỰ NGHIÊN CỨU.................................................................................66 3.4.1 Sơ đồ quy trình ...............................................................................................67 3.4.2 Quá trình nổ hơi – tiền xử lý rơm rạ...............................................................67 3.4.3 Quá trình thủy phân ........................................................................................68 3.4.4 Quá trình thủy phân và lên men đồng thời .....................................................69 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .....................................................................71 4.1 PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN RƠM RẠ ..............................................................71 4.1.1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi.....................................................................71 4.1.2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi........................................................................72 4.1.3 So sánh rơm rạ trước và sau nổ hơi ................................................................72 4.1.4 Thành phần dịch nổ hơi. .................................................................................74 4.2 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN.................................................................................76 4.2.1 Thành phần dịch thủy phân ............................................................................76 4.2.2 Ảnh hưởng của phần trăm bã rắn ...................................................................77 4.2.3 Ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào..........................................................79 4.2.4 Ảnh hưởng của pH .........................................................................................84 4.2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................................87 4.2.6 Hiệu suất thủy phân , nồng độ đường tạo thành theo thời gian......................92 4.3 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI ..................................94 4.3.1 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời .........................................94 4.3.2 Ảnh hưởng của lượng emzyme cho vào.........................................................95 4.3.3 Ảnh hưởng của mật độ nấm men ban đầu......................................................98 4.3.4 Hiệu suất tồn quá trình theo thời gian ........................................................101 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................104 5.1 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN...........................................................104 5.2 KẾT LUẬN QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI.............104 5.3 SO SÁNH HIỆU SUẤT TỒN QUÁ TRÌNH CỦA THỦY PHÂN VỚI THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN ĐỒNG THỜI .............................................................................105 5.4 ĐỀ NGHỊ .........................................................................................................105 TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................106 PHỤ LỤC ........................................................................................................................108 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1-1 Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng nơng nghiệp .................................................1 Hình 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000.................................................3 Hình 2-1 Cấu trúc của lignocellulose ...................................................................................6 Hình 2-2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose ..................6 Hình 2-3 Cơng thức hĩa học của cellulose...........................................................................7 Hình 2-4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain ........................................................7 Hình 2-5 Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan.......................................................................9 Hình 2-6 Glucomannan ........................................................................................................9 Hình 2-7 Galactoglucomannan.............................................................................................9 Hình 2-8 Arabinoglucuronoxylan.......................................................................................10 Hình 2-9 Các đơn vị cơ bản của lignin...............................................................................10 Hình 2-10 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhĩm chức chính..................................11 Hình 2-11: Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin); (b) cathechin (flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo).....................................................................13 Hình 2-12 Mơ tả cơ chế quá trình nổ hơi ...........................................................................17 Hình 2-13 Fufural ...............................................................................................................18 Hình 2-14 Hydroxymethyl fufural......................................................................................18 Hình 2-15: Cấu trúc sợi trước và sau khi nổ hơi, bĩ sợi cellulose được giải phĩng ra khỏi lớp lignin bảo vệ sau khi nổ hơi .................................................................................19 Hình 2-16: (d) sợi lignocellulose khơng nổ hơi cĩ cấu trúc sít chặt ngăn cản sự tấn cơng của enzyme, (e) nổ hơi ở 4atm, (f) nổ hơi ở 8atm......................................................19 Hình 2-17 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase .......................................................21 Hình 2-18 Quá trình tác động của cellobiohydrolase lên đầu vùng kết tinh của cellulose. ....................................................................................................................................25 Hình 2-19 Cơ chế tác động hiệp đồng của enzyme exo-endo và endo-endo. Enzyme endoglucanase tấn cơng ngẫu nhiên vào cellulose và tạo cơ chất thích hợp cho enzyme exoglucanase và sau đĩ khuếch tán nhanh ra khỏi bề mặt. Exoglucanse cĩ thể tấn cơng từ đầu đường khử và khơng khử. ...........................................................26 Hình 2-20 Cơ chế quá trình thủy phân ...............................................................................27 Hình 2-21 Tốc độ phản ứng enzyme theo nhiệt độ ............................................................29 Hình 2-22 Ảnh hưởng của pH ............................................................................................30 Hình 2-23 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme.......................................................................30 Hình 2-24 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất .......................................................................31 vii Hình 2-25 Chất kìm hãm cạnh tranh ..................................................................................32 Hình 2-26 Chất kìm hãm khơng cạnh tranh .......................................................................32 Hình 2-27: Quá trình đường phân ......................................................................................34 Hình 2-28 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm men..................................35 Hình 2-29: Giống nấm men Pichia stiptis và Saccharomyces cerevisiae...........................38 Hình 2-30 Nồng độ glucose (ơ vuơng khơng màu) và celllobiose (ơ vuơng màu đen) theo thời gian của quá trình thủy phân và lên men đồng thời. ...........................................41 Hình 2-31 Nồng độ ethanol theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời. ....................................................................................................................................42 Hình 3-1 Rơm chưa nổ hơi .................................................................................................48 Hình 3-2 Saccharomyces serevisiae chủng turbo yeast extra nhìn dưới kính hiển vi........49 Hình 3-3 Thiết bị nổ hơi quy mơ pilot................................................................................50 Hình 3-4 Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)..............................................................50 Hình 3-5 Hình dạng buồng đếm hồng cầu dưới kính hiển vi .............................................51 Hình 3-6 Buồng đếm hồng cầu...........................................................................................51 Hình 3-7 Bộ dụng cụ soxhlet..............................................................................................54 Hình 3-8 Hệ thống phân tích NDS và ADS .......................................................................54 Hình 3-9 Grooch Crucible ..................................................................................................54 Hình 3-10 Đường chuẩn glucose........................................................................................60 Hình 3-11 Đường chuẩn ethanol ........................................................................................61 Hình 3-12 Đường chuẩn cellobiose....................................................................................62 Hình 3-13 Bộ dụng cụ thủy phân và lên men đồng thời ....................................................70 Hình 4-1 Thành phần rơm rạ trước nổ hơi .........................................................................71 Hình 4-2 Thành phần rơm rạ sau nổ hơi. ...........................................................................72 Hình 4-3 So sánh kết quả các thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi. ..............................73 Hình 4-4 Rơm trước nổ hơi ................................................................................................74 Hình 4-5 Rơm sau nổ hơi ...................................................................................................74 Hình 4-6 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất thu được theo % bã rắn cho vào .......78 Hình 4-7 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian tương ứng với các % enzyme khác nhau ............................................................................................................................80 Hình 4-8 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với các % enzyme .................81 Hình 4-9 Nồng độ glucose, cellobiose thu được và hiệu suất theo % enzyme ..................82 Hình 4-10 Tốc độ phản ứng ban đầu theo % enzyme cho vào...........................................83 Hình 4-11 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị pH khác nhau ...85 Hình 4-12 Hiệu suất, nồng độ glucose và nồng độ cellobiose theo pH dung dịch ............86 viii Hình 4-13 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ: nhiệt độ phịng khác nhau.........................................................................................................88 Hình 4-14 Nồng độ cellobiose theo thời gian ứng với các điều kiện nhiệt độ khác nhau. 89 Hình 4-15 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất tại 24 giờ theo nhiệt độ.......................90 Hình 4-16 Tốc độ phản ứng ban đầu theo nhiệt độ. ...........................................................91 Hình 4-17 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian. .................................93 Hình 4-18 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo % enzyme, tại 24 giờ...................96 Hình 4-19 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo % enzyme cho vào tại 48 giờ ..........................................................................................................................97 Hình 4-20 Nồng độ ethanol, glucose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào tại 24 giờ ...............................................................................................................................99 Hình 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo tỉ lệ mật độ nấm men cho vào tại 48 giờ .....................................................................................................100 Hình 4-22 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời. ..............................................................................102 ix DANH MỤC BẢNG Bảng 1-1 Cơ cấu giá trị sản lượng nơng ngư nghiệp Việt Nam năm 2002 [7] ...................1 Bảng 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [8]...........................................2 Bảng 2-1 Thành phần của vài loại lignocellulose theo [10].................................................5 Bảng 2-2 Các thơng số vận hành và kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời được thực hiện trên nhiều nước[9] .............................................................................39 Bảng 2-3 Ảnh hưởng của ethanol, glucose và cellobiose lên enzyme cellulase và β- glucosidase..................................................................................................................39 Bảng 2-4 Kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời tiến hành với rơm đã qua tiền xử lý bằng acid lỗng, quá trình được tiến hành trong điều kiện kỵ khí....................40 Bảng 2-5 Ảnh hưởng của việc thêm các thành phần mới vào dịch thủy phân và lên men đồng thời lúc 80 giờ....................................................................................................43 Bảng 3-1 Thành phần dung dịch NDS ...............................................................................52 Bảng 3-2 Kết quả chạy chuẩn.............................................................................................58 Bảng 3-3 Kết quả chuẩn glucose ........................................................................................59 Bảng 3-4 Kết quả cho chuẩn ethanol.................................................................................60 Bảng 3-5 Kết quả chuẩn cellobiose ....................................................................................62 Bảng 3-6 Thành phần mơi trường Hansen dùng cho việc nuơi cấy, bảo quản gống nấm men. ............................................................................................................................64 Bảng 3-7 Thành phần chất dinh dưỡng bổ sung cho dung dịch thủy phân và lên men đồng thời. .............................................................................................................................69 Bảng 4-1 Thành phần rơm rạ khơ trước nổ hơi ..................................................................71 Bảng 4-2 Thành phần rơm rạ theo Hồ Sĩ Tráng [3] ...........................................................71 Bảng 4-3 Thành phần rơm rạ khơ sau nổ hơi .....................................................................72 Bảng 4-4 So sánh thành phần rơm rạ trước và sau nổ hơi .................................................72 Bảng 4-5 Thành phần dịch nổ hơi ......................................................................................74 Bảng 4-6 Thành phần dịch thủy phân.................................................................................76 Bảng 4-7 Kết quả ảnh hưởng của phần trăm bã rắn ...........................................................77 Bảng 4-8 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau ...................79 Bảng 4-9 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian ứng với % enzyme khác nhau......80 Bảng 4-10 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian ứng với các % enzyme khác nhau ....................................................................................................................................81 Bảng 4-11 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu theo lượng enzyme cho vào........................................................................................................................82 x Bảng 4-12 Nồng độ glucose theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau. ....84 Bảng 4-13 Hiệu suất thủy phân theo thời gian ứng với các giá trị pH ban đầu khác nhau 85 Bảng 4-14 Hiệu suất và nồng độ glucose, cellobiose theo pH dung dịch ..........................86 Bảng 4-15 Nồng độ glucose tạo thành theo thời gian ứng với các giá trị nhiệt độ khác nhau. ...........................................................................................................................87 Bảng 4-16 Nồng độ cellobiose tạo thành theo thời gian tương ứng các chế độ nhiệt độ khác nhau....................................................................................................................88 Bảng 4-17 Hiệu suất quá trình thủy phân theo thời gian tương ứng các nhiệt độ khác nhau ....................................................................................................................................89 Bảng 4-18 Nồng độ glucose, cellobiose, hiệu suất và tốc độ ban đầu đạt được theo nhiệt độ ................................................................................................................................90 Bảng 4-19 Nồng độ glucose, cellobiose và hiệu suất theo thời gian..................................92 Bảng 4-20 Thành phần dịch thủy phân và lên men đồng thời............................................94 Bảng 4-21 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất tồn quá trình theo % enzyme cho vào tại 24 giờ và 48 giờ. .........................................................................96 Bảng 4-22 Nồng độ ethanol, glucose, cellobiose và hiệu suất theo mật độ nấm men cho vào ..............................................................................................................................99 Bảng 4-23 Nồng độ cellobiose, glucose và ethanol tạo thành theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời ...............................................................................101 xi TĨM TẮT LUẬN VĂN Rơm rạ chiếm tỉ lệ lớn trong các phụ phẩm nơng nghiệp ở Việt Nam. Với thành phần chứa hơn 40% là cellulose, rơm rạ là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất ethanol. Luận văn này nghiên cứu quá trình sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ và được chia làm hai phần. Phần đầu nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố :% bã rắn, % enzyme, nhiệt độ, pH lên quá trình thuỷ phân và phần hai nghiên cứu quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời. Rơm rạ được cắt nhỏ và được tiền xử lý bằng phương pháp nổ hơi để phá vỡ cấu trúc. Sau đĩ được tiến hành thuỷ phân bằng enzyme cellulase hoặc thuỷ phân và lên men đồng thời bằng enzyme cellulase và nấm men saccharomyces cerevisiae chủng turbo yeast extra. Kết quả cho thấy rằng, quá trình thuỷ phân diễn ra tốt nhất trong điều kiện: 11% bã rắn, 5% enzyme, 50oC và pH 4,8, tương ứng nồng độ glucose thu được là 55,08g/l và hiệu suất đạt 81%. Quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời đạt được kết quả tốt ở 11% bã rắn, 5% enzyme, 23,6 triệu tế bào nấm men/ml, 50oC và pH 4,8. quá trình này thu được 30,86g/l ethanol tương ứng hiệu suất là 86,61%. Kết quả này cho thấy quá trình thuỷ phân và lên men đồng thời rất thích hợp cho việc sản xuất ethanol từ rơm rạ. xii ABSTRACT In Viet Nam, rice straw composes the main portion in agricultural byproducts. Containing above 40% of cellulose, rice straw is such a potential feedstock for ethanol production. This thesis does research on producing ethanol form rice straw and can be divided into 2 parts. The first part studies the effects of the dry solid concentration, enzyme loading, temperature and pH on the saccharification. The second part explores the simultaneous saccharification and fermentation (SSF) process. Rice straw was pretreated by steam explosion method in order to be more accessible to enzyme. Then, the residue was introduced to hydrolyzed step or to SSF step. These steps were taken place during 2 to 3 days. The former utilized enzyme cellulase to hydrolyze cellulose in rice straw. In the latter, both the yeast saccharomyces cerevisiae and emzyme cellulase were employed. The result indicated that the optimized condition for saccharification is 11% of dry solid, 5% of enzyme, 50oC and pH 4,8. With this condition, 55,08 g/l glucose was formed and the yield of 81% was obtained. The experiments in SSF showed that the best condition for this process includes 11% of dry solid; 5% of enzyme; 23,6 million cell/ml; 37oC and pH 4,8. 30,86g/l ethanol was formed with the yield of 86,61%. This result indicates that SSF is such a suitable process for producing ethanol from rice straw. Chương 1: MỞ ĐẦU 1 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 CÂY LÚA Ở VIỆT NAM Cây lúa luơn giữ vị trí trung tâm trong nơng nghiệp và kinh tế Việt Nam. Hình ảnh đất Việt thường được mơ tả như là một chiếc địn gánh khổng lồ với hai đầu là hai vựa thĩc lớn là Đồng bằng sơng Cửu Long (ĐBSCL) và Đồng bằng sơng Hồng (ĐBSH). Khoảng 80% trong tổng số 11 triệu hộ nơng dân tham gia sản xuất lúa gạo, chủ yếu đựa vào phương thức canh tác thủ cơng truyền thống. Bảng 1-1 Cơ cấu giá trị sản lượng nơng ngư nghiệp Việt Nam năm 2002 [7] Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng Nơng-Lâm-Ngư nghiệp Nơng nghiệp GTSL Nơng- Lâm-Ngư (tỉ đồng) Tổng số Lúa Các nguồn khác Lâm nghiệp Ngư nghiệp Cả nước 154478 78,3 38,0 40,3 3,9 17,8 ĐBSH 24415 91,6 46,3 45,3 1,0 7,4 ĐBSCL 59663 69,9 53,5 16,4 2,1 18,5 Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng nông nghiệp Các nguồn khác 40% Lâm nghiệp 4% Ngư nghiệp 18% Cây lúa38% Hình 1-1 Tỉ lệ % trong tổng giá trị sản lượng nơng nghiệp Chương 1: MỞ ĐẦU 2 Ghi chú: Các nguồn khác: % giá trị sản lượng của cây hoa màu lương thực, rau đậu, cây ăn quả, cây cơng nghiệp, chăn nuơi và dịch vụ nơng nghiệp. Bảng số liệu và đồ thị trên cho ta thấy vai trị quan trọng của cây lúa chiếm 38% trong tổng giá trị sản lượng nơng – lâm - ngư nghiệp cả nước. 1.2 RƠM RẠ Việc sản xuất lúa gạo đã tạo ra một lượng lớn phế phẩm từ cây lúa bao gồm rơm và trấu. Rơm và trấu là hai trong số nhiều nguồn biomass phổ biến và cĩ nhiều tiềm năng ở Việt Nam. 1.2.1 Nguồn rơm rạ ở Việt Nam Rơm rạ chiếm một phần rất lớn trong các nguồn biomass ở Việt Nam. Bảng 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 [8] STT Biomass Lượng (triệu tấn) Năng lượng chứa đựng (GJ) Phần trăm(%) 1 Gỗ thải từ nhà máy cưa 3,1 35,960 2,6 2 Gỗ đốt 12,4 186,000 13,4 3 Rác thải rắn 0,015 57 0 4 Rơm 61,9 866,600 62,6 5 Trấu 5,6 63,840 4,6 6 Vỏ bắp 4,8 60,000 1,3 7 Bã khoai mì 0,6 7,500 0,5 8 Phế phẩm cây mía 1,5 18,750 1,4 9 Bã mía 5,0 36,050 2,6 10 Vỏ đậu 0,1 1,250 0,1 11 Xơ và lá dừa 5,8 104,400 7,5 12 Vỏ hạt cafe 0,3 4,670 0,3 Tổng 101,1 1,385,077 100 Chương 1: MỞ ĐẦU 3 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 4.6 62.6 gỗ thải từ nhà máy cưa gỗ đốt rác thải rắn rơm trấu vỏ bắp bã khoai mì Phế phẩm cây mía bã mía vỏ đậu xơ và lá dừa vỏ hạt cafe Hình 1-2 Các nguồn biomass chính ở Việt Nam năm 2000 Bảng số liệu và đồ thị trên cho thấy vị trí và tiềm năng rất lớn của rơm trong viêc sử dụng làm nguồn nguyên liệu. Rơm chiếm 62,6% trong tổng khối lượng biomass ở Việt Nam năm 2000 với lượng năng lượng chứa đựng là 866.600 GJ. Rơm hứa hẹn là một nguồn năng lượng lớn cho nước ta. 1.2.2 Hiện trạng sử dụng năng lượng từ rơm rạ ở Việt Nam Mặc dù rơm rạ là một nguồn năng lượng lớn, rơm rạ nĩi riêng và từ biomass nĩi chung khơng dược sử dụng một cách hiệu quả ở Việt Nam. Phần lớn rơm rạ được bĩn trở lại ruộng sau khi thu hoạch, sử dụng làm chất đốt cho các hộ nhà nơng, làm thức ăn cho gia súc … Theo [8], biomass chỉ chiếm 3,8% trong tổng năng lượng sử dụng của thành phố Hồ Chí Minh năm 2003, trong khi đĩ, nguồn năng lượng này chiếm 89% trong tổng năng lượng sử dụng ở nơng thơn năm 2001. Ở nơng thơn, biomass chủ yếu được dùng làm chất đốt và hiệu suất sử dụng năng lượng của quá trình này chỉ được 10%. 1.3 BIOETHANOL TỪ RƠM RẠ Ngày nay sức ép từ khủng hoảng dầu mỏ và nhu cầu năng lượng luơn là vấn đề nan giải của bất cứ quốc gia nào trên thế giới. Mỹ và Brazil đã thành cơng trong việc sản xuất Chương 1: MỞ ĐẦU 4 ethanol từ nguồn sinh học là bắp và mía. Điều này đã khích lệ các nước khác đầu tư nghiên cứu vào lĩnh vực nhiên liệu sinh học. Bên cạnh sản xuất ethanol từ nguồn tinh bột (bắp) và đường (mía), ethanol cĩ thể được sản xuất từ lignocellulose. Lignocellulose là loại biomass phổ biến nhất trên thế giới. Vì vậy sản xuất ethanol từ biomass cụ thể là từ nguồn lignocellulose là một giải pháp thích hợp đặc biệt là với các quốc gia nơng nghiệp như Việt Nam. Nền nơng nghiệp Việt Nam hằng năm tạo ra một lượng lớn phế phẩm nơng nghiệp, chủ yếu là lignocellulose từ các vụ mùa. Tận dụng nguồn nguyên liệu này, cụ thể là rơm rạ để sản xuất bioethanol là phương pháp sử dụng rơm rạ một cách hiệu quả đồng thời gĩp phần giải quyết vấn đề năng lượng cho nước ta. 1.4 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Mục đích chính của đề tài là nghiên cứu khả năng xử lý rơm rạ để lên men ethanol. Các mục tiêu chính trong đề tài là: • Nghiên cứu quá trình thủy phân rơm đã qua tiền xử lý nổ hơi bằng enzyme cellulase, tạo ra dịch đường. • Nghiên cứu quá trình thủy phân và lên men đồng thời để chuyển hĩa cellulose trong nguồn rơm rạ ban đầu thành ethanol. Các nội dung chính cần phải thực hiện để đạt được mục tiêu trên: ¾ Đối với quá trình thủy phân: • Khảo sát ảnh hưởng của lượng bã rắn đối với quá trình thủy phân. • Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme cho vào đối với quá trình thủy phân. • Khảo sát ảnh hưởng của pH dung dịch đến quá trình thủy phân. • Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân. • Khảo sát nồng độ đường tạo thành theo thời gian. ¾ Đối với quá trình thủy phân và lên men đồng thời • Khảo sát ảnh hưởng của lượng enzyme đến quá trình. • Khảo sát ảnh hưởng của lượng nấm men cho vào lên quá trình. • So sánh hiệu suất chuyển hĩa quá trình thủy phân với quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 NGUYÊN LIỆU LIGNOCELLULOSE Lignocellulose là vật liệu biomass phổ biến nhất trên trái đất. Lignocellulose cĩ trong phế phẩm nơng nghiệp, chủ yếu ở dạng phế phẩm của các vụ mùa; trong sản phẩm phụ của cơng nghiệp sản xuất bột giấy và giấy; cĩ trong rác thải rắn của thành phố... Với thành phần chính là cellulose, lignocellulose là một nguồn nguyên liệu to lớn cho việc sản xuất bioethanol. Rơm rạ là một dạng vật liệu lignocellulose. 2.1.1 Cấu trúc lignocellulose Thành phần chính của vật liệu lignocellulose là cellulose, hemicellulose, lignin, các chất trích ly và tro. Bảng 2-1 Thành phần của vài loại lignocellulose theo [10] Hemicellulose Nguồn/% Cellulose Xylane Mannan Galactan Arabianan Lignin Chất trích ly Gỗ vân sam 41,9 6,1 14,3 - 1,2 27,1 9,6 Gỗ thơng 37,7 4,6 7,0 - - 27,5 10,8 Gỗ cây bulơ 38,2 18,5 1,2 - - 22,8 4,8 Gỗ dương 49,9 17,4 4,7 1,2 1,8 18,1 - Phế phẩm cây bắp 36,4 18,0 0,6 1,0 3,0 16,6 7,3 Rơm lúa mì 38,2 21,2 0,3 2,5 23,4 13,0 Rơm lúa(*) 34 – 38 32 – 40 12 (*) theo Hồ Sĩ Tráng [3] Theo [10 ] về cơ bản, trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất cĩ chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin. Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hĩa trị với nhau. Các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O- methylglucuronic là các nhĩm thường liên kết với lignin. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6 Hình 2-1 Cấu trúc của lignocellulose Các mạch cellulose tạo thành các sợi cơ bản. Các sợi này được gắn lại với nhau nhờ hemicellulose tạo thành cấu trúc vi sợi, với chiều rộng khoảng 25nm. Các vi sợi này được bao bọc bởi hemicellulose và lignin, giúp bảo vệ cellulose khỏi sự tấn cơng của ezyme cũng như các hĩa chất trong quá trình thủy phân. [9] Hình 2-2 Mối quan hệ cellulose – hemicellulose trong cấu trúc lignocellulose 2.1.2 Cellulose Cellulose là một polymer mạch thẳng của D-glucose, các D-glucose được liên kết với nhau bằng liên kết β 1-4 glucosid. Cellulose là loại polymer phổ biến nhất trên trái đất, độ trùng hợp đạt được 3.500 – 10.000 DP [9]. Các nhĩm OH ở hai đầu mạch cĩ tính chất Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 hồn tồn khác nhau, cấu trúc hemiacetal tại C1 cĩ tính khử, trong khi đĩ OH tại C4 cĩ tính chất của rượu. [2] Hình 2-3 Cơng thức hĩa học của cellulose Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và liên kết Van Der Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vơ định hình. Trong vùng kết tinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khĩ bị tấn cơng bởi enzyme cũng như hĩa chất. Ngược lại, trong vùng vơ định hình, cellulose liên kết khơng chặt với nhau nên dễ bị tấn cơng [9]. Cĩ hai kiểu cấu trúc của cellulose đã được đưa ra nhằm mơ tả vùng kết tinh và vơ định hình. [10] Hình 2-4 Kiểu Fringed fibrillar và kiểu Folding chain 1/ Kiểu Fringed Fibrillar: phân tử cellulose được kéo thẳng và định hướng theo chìều sợi. Vùng tinh thể cĩ chiều dài 500 Å và xếp xen kẽ với vùng vơ định hình. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 8 2/ Kiểu Folding chain: phân tử cellulose gấp khúc theo chiều sợi. Mỗi đơn vị lặp lại cĩ độ trùng hợp khoảng 1000, giới hạn bởi hai điểm a và b như trên hình vẽ. Các đơn vị đĩ được sắp xếp thành chuỗi nhờ vào các mạch glucose nhỏ, các vị trí này rất dễ bị thủy phân. Đối với các đơn vị lặp lại, hai đầu là vùng vơ định hình, càng vào giữa, tính chất kết tinh càng cao. Trong vùng vơ định hình, các liên kết β - glucosid giữa các monomer bị thay đổi gĩc liên kết, ngay tại cuối các đoạn gấp, 3 phân tử monomer sắp xếp tạo sự thay đổi 180o cho tồn mạch. Vùng vơ định hình sẽ dễ bị tấn cơng bởi các tác nhân thủy phân hơn vùng tinh thể vì sự thay đổi gĩc liên kết của các liên kết cộng hĩa trị (β - glucosid) sẽ làm giảm độ bền nhiệt động của liên kết, đồng thời vị trí này khơng tạo được liên kết hydro. [4] Cellulose được bao bọc bởi hemicellulos và lignin, điều này làm cho cellulose khá bền vững với tác động của enzyme cũng như hĩa chất. 2.1.3 Hemicellulose Hemicellulose là một loại polymer phức tạp và phân nhánh, độ trùng hợp khoảng 70 đến 200 DP. Hemicellulose chứa cả đường 6 gồm glucose, mannose và galactose và đường 5 gồm xylose và arabinose. Thành phần cơ bản của hemicellulose là β - D xylopyranose, liên kết với nhau bằng liên kết β -(1,4). Cấu tạo của hemicellulose khá phức tạp và đa dạng tùy vào nguyên liệu, tuy nhiên cĩ một vài điểm chung gồm: • Mạch chính của hemicellulose được cấu tạo từ liên kết β -(1,4). • Xylose là thành phần quan trọng nhất. • Nhĩm thế phổ biến nhất là nhĩm acetyl O – liên kết với vị trí 2 hoặc 3. • Mạch nhánh cấu tạo từ các nhĩm đơn giản, thơng thường là disaccharide hoặc trisaccharide. Sự liên kết của hemicellulose với các polysaccharide khác và với lignin là nhờ các mạch nhánh này. Cũng vì hemicellulose cĩ mạch nhánh nên tồn tại ở dạng vơ định hình và vì thế dễ bị thủy phân. Gỗ cứng, gỗ mềm và nguyên liệu phi gỗ cĩ các đặc điểm hemicellulose khác nhau: Gỗ cứng chủ yếu cĩ hai loại hemicellulose: • Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan, là một loại polymer cĩ mạch chính gồm β-D- xylopyranose liên kết với nhau bằng liên kết β-D (1,4). Trong đĩ 70% các nhĩm OH ở vị trí C2 và C3 bị acetyl hĩa, 10% các nhĩm ở vị trí C2 liên kết với acid 4- Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 9 O-methyl-D-glucuronic. Gỗ cứng cịn chứa glucomannan, polymer này chứa một tỉ lệ bằng nhau β-D-glucopyranose và β-D-mannopyranose. [9] Hình 2-5 Acetyl-4-O-methylglucuronoxylan Hình 2-6 Glucomannan • Loại thứ hai cĩ mạch chính là β-D-galactopyranose, phân nhánh. Loại hemicellulose này tạo liên kết –O tại nhĩm OH ở vị trí C6 với α-L-arabinose, β-D- galactose hoặc acid β-D-glucoronic. [9] Gỗ mềm cũng bao gồm hai loại hemicellulose chính: • Loại quan trọng nhất là galactoglucomannan, đây là polymer cấu thành từ các phân tử D-mannopyranose liên kết với D-glucopyranose bằng liên kết β-(1,4) với tỉ lệ hai monomer tương ứng là 3:1. Tuy nhiên, tỉ lệ này thay đổi tùy theo loại gỗ[9]. Hình 2-7 Galactoglucomannan Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10 • Arabino-4-O-methylglucuronoxylan, cấu tạo từ các D-xylopyranose, các monomer này bị thế ở vị trí 2 bằng acid 4-O-methyl-glucuronic, ở vị trí 3 bằng α- L-arabinofuranose. [9] Đối với cỏ, 20 – 40% hemicellulose là arabinoxylan. Polysaccharide này cấu tạo từ các D-xylopyranose, OH ở C2 bị thế bởi acid 4-O-methylglucuronic. OH ở vị trí C3 sẽ tạo mạch nhánh với α-L-arabinofuranose. [9] Hình 2-8 Arabinoglucuronoxylan Cấu tạo phức tạp của hemicellolose tạo nên nhiều tính chất hĩa sinh và lý sinh cho cây. 2.1.4 Lignin Lignin là một polyphenol cĩ cấu trúc mở. Trong tự nhiên, lignin chủ yếu đĩng vai trị chất liên kết trong thành tế bào thực vật, liên kết chặt chẽ với mạng cellulose và hemicellulose. Rất khĩ để cĩ thể tách lignin ra hồn tồn. Lignin là polymer, được cấu thành từ các đơn vị phenylpropene, vài đơn vị cấu trúc điển hình được đề nghị là: guaiacyl (G), chất gốc là rượu trans-coniferyl; syringly (S), chất gốc là rượu trans-sinapyl; p-hydroxylphenyl (H), chất gốc là rượu trans-p-courmary. Hình 2-9 Các đơn vị cơ bản của lignin Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 Cấu trúc của lignin đa dạng, tùy thuộc vào loại gỗ, tuổi của cây hoặc cấu trúc của nĩ trong gỗ. Ngồi việc được phân loại theo lignin của gỗ cứng, gỗ mềm và cỏ, lignin cĩ thể được phân thành hai loại chính: guaicyl lignin và guaicyl-syringly lignin. Gỗ mềm chứa chủ yếu là guaiacyl, gỗ cứng chứa chủ yếu syringyl. Nghiên cứu chỉ ra rằng guaiacyl lignin hạn chế sự trương nở của xơ sợi và vì vậy loại nguyên liệu đĩ sẽ khĩ bị tấn cơng bởi enzyme hơn syringyl lignin. [10] Hình 2-10 Cấu trúc lignin trong gỗ mềm với các nhĩm chức chính Những nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng lignin hồn tồn khơng đồng nhất trong cấu trúc. Lignin dường như bao gồm vùng vơ định hình và các vùng cĩ cấu trúc hình thuơn hoặc hình cầu. Lignin trong tế bào thực vật bậc cao hơn khơng cĩ vùng vơ định hình. Các vịng phenyl trong lignin của gỗ mềm được sắp xếp trật tự trên mặt phẳng thành tế bào. Ngồi ra, cả cấu trúc hĩa học và cấu trúc khơng gian của lignin đều bị ảnh hưởng bởi mạng polysaccharide. Việc mơ hình hĩa động học phân tử cho thấy rằng nhĩm hydroxyl Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 12 và nhĩm methoxyl trong các oligomer tiền lignin sẽ tương tác với vi sợi cellulose cho dù bản chất của lignin là kỵ nước. Nhĩm chức ảnh hưởng đến hoạt tính của lignin là nhĩm phenolic hydroxyl tự do, methoxy, benzylic hydroxyl, ether của benzylic với các rượu thẳng và nhĩm carbonyl. Guaicyl lignin chứa nhiều nhĩm phenolic hydroxyl hơn syringyl. Lignin cĩ liên kết hĩa học với thành phần hemicellulose và ngay cả với cellulose (khơng nhiều) độ bền hĩa học của những liên kết này phụ thuộc vào bản chất liên kết và cấu trúc hĩa học của lignin và những đơn vị đường tham gia liên kết [4]. Carbon alpha (Cα) trong cấu trúc phenyl propane là nơi cĩ khả năng tạo liên kết cao nhất với khối hemicellulose. Ngược lại, các đường nằm ở mạch nhánh như arabinose, galactose, và acid 4-O-methylglucuronic là các nhĩm thường liên kết với lignin. Các liên kết cĩ thể là ether, ester (liên kết với xylan qua acid 4-O-methyl-D-glucuronic), hay glycoxit (phản ứng giữa nhĩm khử của hemicellulose và nhĩm OH phenolic của lignin) Cấu trúc hĩa học của lignin rất dễ bị thay đổi trong điều kiện nhiệt độ cao và pH thấp như điều kiện trong quá trình tiền xử lý bằng hơi nước. Ở nhiệt độ phản ứng cao hơn 200oC, lignin bị kết khối thành những phần riêng biệt và tách ra khỏi cellulose. Những nghiên cứu trước đây cho thấy đối với gỗ cứng, nhĩm ether β-O-4 aryl bị phá trong quá trình nổ hơi. Đồng thời, đối với gỗ mềm, quá trình nổ hơi làm bất hoạt các nhĩm hoạt động của lignin ở vị trí α như nhĩm hydroxyl hay ether, các nhĩm này bị oxy hĩa thành carbonyl hoặc tạo cation benzylic, cation này sẽ tiếp tục tạo liên kết C-C.[10] 2.1.5 Các chất trích ly Cĩ rất nhiều chất thuộc nhĩm thành phần này, chủ yếu là các chất dễ hịa tan. Theo định nghĩa khái quát trong sách “Kĩ thuật cellulose và giấy” ở trang 64, các chất trích ly là những chất hoặc cĩ khả năng hịa tan trong những dung mơi hữu cơ (như dietyl ether, methyl terbutyl ether, ether dầu hỏa, diclormethene, acetone, ethanol, methanol, hexan, toluen, terahydrofuran) hoặc trong nước. Chính vì thế phương pháp thơng dụng nhất để tách nhĩm chất này trong việc phân tích thành phần sơ xợi lignocellulose là dùng trích ly với dung mơi ethanol-benzene tỉ lệ 1:2. Những chất này cĩ thể cĩ cả tính ưa dầu và ưa nước và khơng được xem là thành phần cấu trúc của gỗ. Chất nhựa là những chất ưa dầu, cĩ lẽ thường chiếm tỉ lệ ưu thế trong chất trích ly, nên thường chất trích ly hay được gọi là nhựa (resin). Các chất trích ly thường cĩ màu, mùi và vị khá đặc trưng. Chúng rất quan trọng để giữ lại những chức năng sinh học của cây. Đa phần các chất nhựa bảo vệ gỗ khỏi những Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 13 tổn thương gây ra bởi vi sinh vật hay cơn trùng. Terpenoid, steroid, chất béo, và những phần tử phenolic như stilbene, lignan, tanmin và flavonoid đều là những chất trích ly. Các phenolic cĩ thuộc tính diệt nấm và ảnh hưởng đến màu của gỗ. Chất béo và sáp, trong nhiều hệ thống sinh học được tận dụng như là nguồn năng lượng trong khi terpenoid và steroid được biết đến là nhựa dầu. Nhĩm cuối cùng cũng cĩ hoạt tính kháng vi sinh vật và cơn trùng. Một số chất trích ly là những dược phẩm quan trọng. Ví dụ, flavonoid được sử dụng như là chất chống tác nhân oxy hĩa và chống virus. Một số cấu trúc chất trích ly được thể hiện ở những hình sau: Hình 2-11: Một số ví dụ về chất trích ly (a) abietic acid (oleoresin); (b) cathechin (flavonoid); (c) palmitic acid (acid béo) 2.1.6 Tro Trong các loại gỗ của xứ ơn đới, các nguyên tố khác so với carbon, hydro, oxy và nito – chiếm khoảng 0,1-0,5% (so với lượng rắn khơ trong gỗ). Với loại gỗ xứ nhiệt đới con số này cĩ thể là 5%. Hàm lượng chất vơ cơ được đo bằng hàm lượng tro của mẫu và nĩ trong khoảng 0,3-1,5% cho hai loại gỗ mềm và gỗ cứng. Hàm lượng này phụ thuộc nhiều vào điều kiện mơi trường tăng trưởng của cây và vào vị trí trong cây. Tương tự chất trích ly, thành phần vơ cơ của biomass thường thực hiện chức năng trong một vài con đường sinh học ở thực vật. Kim loại vết thường tồn tại ở dạng phức hợp như magnesium trong chlorophyll. Một số chất vơ cơ từ muối kim loại tồn tại trong vách tế bào thực vật. Calcium thường là kim loại phong phú nhất, sau đĩ là kali và magnesium. 2.2 QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT ETHANOL TỪ RƠM RẠ 2.2.1 Tổng quát Sơ đồ quá trình sản xuất ethanol từ rơm rạ Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14 2.2.2 Tiền xử lý Để chuyển hĩa các carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành ethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật cĩ thể hồn tất quá trình chuyển hĩa. Tuy nhiên, bản chất của cellulose lại là rất bền vững trước sự tấn cơng của enzyme, nên bước tiền xử lý là bắt buộc để quá trình đường hĩa glucose cĩ thể diễn ra tốt. Cellulose ban đầu cĩ thể bị phá hủy bởi acid mà khơng cần được tiền xử lý. Tuy nhiên, trong luận văn này chỉ đề cập đến việc thủy phân lignocellulose bằng enzyme. Những yếu tố về cấu trúc và thành phần ảnh hưởng đến khả năng chống lại sự tấn cơng của enzyme của lignocellulose gồm cĩ: • Cấu trúc tinh thể của cellulose: cellulose tự nhiên hình thành cấu trúc tinh thể chống lại được sự tấn cơng của enzyme. Trong một bài báo của mình, Fan et al [9] ước tính rằng tỉ lệ cellulose tinh thể là 50-90%. Tuy nhiên, khơng cĩ sự liên quan giữa mức độ tinh thể của cellulose và khả năng phân hủy enzyme đối với rơm rạ và bã mía. Rơm rạ Tiền xử lý Thủy phân Lên men Chưng cất Ethanol Thủy phân và lên men đồng thời Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 15 • Sự bao bọc của lignin quanh cellulose: lignin cùng với hemicellulose tạo thành cấu trúc mơ vững chắc cực kì. Những mơ được bền hĩa với lignin tương tự như nhựa được gia cố bằng sợi, trong đĩ lignin đĩng vai trị kết dính những sợi cellulose. Trong thiên nhiên, lignin bảo vệ cellulose khỏi những tác động của mơi trường và khí hậu. Lignin là yếu tố ngăn cản sự tấn cơng của enzyme đến cellulose được cơng nhận nhiều nhất. Theo [9] cĩ nhà nghiên cứu cho rằng khả năng thủy phân của enzyme tăng khi 40-50% lignin bị tách. Tuy nhiên, phải thừa nhận rằng, khơng cĩ nghiên cứu nào tiến hành loại bỏ lignin mà khơng kèm theo sự phân hủy hemicellulose. Ngay cả trong phương pháp tiền xử lý nguyên liệu bằng kiềm ở nhiệt độ thấp, loại bỏ được 70% lignin thì cũng cĩ 5% hemicellulose bị hịa tan. Vì vậy, những thí nghiệm trên cũng khơng hồn tồn cho thấy ảnh hưởng của việc loại bỏ lignin riêng lẻ. • Bề mặt tiếp xúc tự do của cellulose: liên quan đến bề mặt tiếp xúc của cellulose với enzyme, và thể tích xốp. Stone et al [9] giả thiết rằng tốc độ đầu của quá trình thủy phân là hàm của bề mặt tiếp xúc tự do. Grethlein et al [9] cho rằng thể tích lỗ xốp chứ khơng phải độ kết tinh của cellulose mới ảnh hưởng đến tốc độ đầu. Tuy nhiên, bề mặt tiếp xúc tự do này cĩ liên quan đến độ kết tinh và sự bảo vệ của lignin. • Sự hiện diện của hemicellulose: cũng như lignin, hemicellulose tạo thành lớp bảo vệ xung quanh cellulose. Knappert et al [9], trong nghiên cứu xử lý bằng acid sulfuric với gỗ dương cho thấy khả năng thủy phân tăng theo tỉ lệ hemicellulose bị loại bỏ. Grohman, thí nghiệm tiền xử lý rơm lúa mì bằng acid, kết quả cho thấy việc loại bỏ hemicellulose sẽ gia tăng đáng kể khả năng thủy phân rơm rạ. Họ cho rằng, việc loại bỏ lignin là khơng cần thiết, tuy rằng nếu đạt được thì rất tốt. Trong khi đĩ, hemicellulose được chứng minh là ngăn cản quá trình tấn cơng của enzyme vào rơm rạ [9]. Tuy nhiên, trong những thí nghiệm này, lignin tuy khơng bị loại bỏ nhưng lại cĩ thể bị đơng hoặc chảy ra một phần, làm giảm khả năng bao bọc cellulose của nĩ. Vì thế những thí nghiệm trên chưa cho thấy được hiệu quả của việc loại bỏ riêng lẻ hemicellulose. • Mức độ acetyl hĩa của hemicelluloses: Đây là yếu tố ít được quan tâm, xylan, loại hemicellulose chính trong gỗ cứng và cây thân cỏ bị acetyl hĩa với tỉ lệ rất cao. Grohmann et al [9], nghiên cứu với rơm lúa mì và cây dương, cho thấy rằng khi xylan bị deacetyl hĩa, tỉ lệ cellulose bị thủy phân tăng lên 2-3 lần. Ảnh hưởng này tồn tại đến khoảng 75% hemicellulose bị deacetyl hĩa. Nĩi tĩm lại, quá trình tiền xử lý nhằm: Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 16 • Tăng vùng vơ định hình của cellulose • Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass • Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose. Sau đây là một số cơng nghệ tiền xử lý phổ biến: 2.2.2.1 Các phương pháp tiền xử lý hĩa học: Sử dụng tác động của hĩa chất trong quá trình. Gồm cĩ các quá trình chính: • Với acid: gồm các phương pháp xử lý với acid lỗng, bơm hơi nước cĩ acid và nổ hơi cĩ acid. Trong đĩ, acid sulfuric đã được nghiên cứu kĩ lưỡng nhất, hiển nhiên vì nĩ rẻ và hiệu quả. Tuy nhiên, vấn đề gặp phải trong xử lý acid là thiết bị phải chịu được ăn mịn cao và lượng thạch cao (CaSO4) sinh ra nhiều từ quá trình trung hịa acid với CaOH. • Với kiềm: đã cĩ rất nhiều nghiên cứu liên quan, chủ yếu là về xút hoặc xút cùng các hĩa chất khác. Tuy nhiên, nhiều nhà khoa học cho rằng, dựa trên chi phí hĩa chất, thì vơi tơi là hĩa chất thích hợp. Detroy et al cho thấy rằng amonia lỏng cĩ phần hiệu quả trong việc tăng khả năng thủy phân bã rắn, nhưng ethylenediamine cĩ thể cịn hiệu quả hơn. • Ngồi ra cịn cĩ những phương pháp như xử lý với dung mơi hữu cơ: dùng dung mơi như ethanol, methanol, acetone để hịa tan lignin; xử lý bằng khí SO2, khí CO2, NH3 … Các quy trình này hiện nay chỉ được sử dụng ở quy mơ phịng thí nghiệm. 2.2.2.2 Các phương pháp tiền xử lý cơ học Các phương pháp thuộc nhĩm này khơng sử dụng hĩa chất trong quá trình xử lý. Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao, xử lý thủy nhiệt và nổ hơi. Trong đĩ phương pháp nổ hơi là phương pháp quan trọng nhất, đã được phát triển, áp dụng trên quy mơ pilot và được sử dụng trong đề tài nghiên cứu này. 2.2.2.3 Nổ hơi nước (Steam explosion) Nổ hơi nước được phát triển vào năm 1925 bởi W. H. Mason trong sản xuất gỗ ép[1]. Tiền xử lý biomass bằng nổ hơi nước được giới thiệu từ năm 1980[1]. Cơng ty Iotech Corporation đã tiến hành một vài thí nghiệm tiên phong để tìm hiểu ảnh hưởng của nổ hơi nước lên gỗ cây dương[1]. Iotech đã báo cáo lên bộ năng lượng Mỹ trong đĩ mơ tả ảnh hưởng của thời gian phản ứng và áp suất lên sản lượng xylose và glucose. Iotech cho rằng ở một áp suất nhất định, với thời gian lưu khác nhau sản lượng cực đại của glucose Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 17 và xylose cũng khác nhau, và xylose thường đạt cực đại trước glucose. Tương tự như vậy, sản lượng cực đại của xylose và glucose được tìm thấy lớn nhất ở những áp suất khác nhau. Điều kiện phản ứng tối ưu của holocellulose (xylose + glucose) là 500 – 550 psi trong thời gian 40 giây.[1] Đã cĩ vài nghiên cứu ứng dụng nổ hơi cho các loại nguyên liệu biomass sau khi báo cáo của Iotech được trình bày. Shultz et al [1] so sánh hiệu quả của nổ hơi lên hỗn hợp các mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, rơm bắp, và bã mía. Nổ hơi ở 240 – 2500C và 1 phút sẽ làm gia tăng tốc độ thủy phân enzyme của các mảnh gỗ cứng, vỏ trấu, và bã mía lên ngang bằng với tốc độ thủy phân giấy lọc. Nghiên cứu cũng tìm thấy khơng cĩ sự khác nhau về tốc độ thủy phân của mẫu đã trữ trong 8 tháng trước với tốc độ thủy phân của mẫu được trữ trong thời gian ngắn hơn. Martinez et al [1] sử dụng Onopordum nervosum và Cyanara cardunculus làm nguyên liệu. Hiệu quả đường hĩa (lượng glucose giải phĩng ra sau 48 giờ thủy phân enzyme/lượng glucose cực đại trên cơ chất) đạt được trên 90% đối với O. nervosum ở 2300C, 1 – 2 phút và C. cardunculus ở 2100C, 2 – 4 phút. Theo luận văn cao học của thầy Trịnh Hồi Thanh [6], thời gian xử lý và nhiệt độ xử lý đối với rơm rạ càng tăng thì lượng bã thu hồi được càng giảm. Khi xem xét ảnh hưởng của nhiệt độ xử lý đối với lượng đường cĩ khả năng lên men, nhiệt độ xử lý ở mức độ vừa phải sẽ làm tăng khả năng thủy phân, tăng lượng đường và do đĩ sẽ làm tăng lượng cồn thu được. Điều này cĩ thể được giải thích là do sự đề – lignin hĩa do tác động của nhiệt độ và sự phân hủy của hemicellulose làm giải phĩng và gia tăng kích thước lỗ xốp. Tuy nhiên khi nhiệt độ xử lý cao hơn 210oC, lượng đường thu được do thủy phân cĩ xu hướng giảm xuống vì cellulose bị phân hủy. Theo [6], khi thời gian xử lý tăng thì lượng đường cĩ khả năng lên men được tăng do khả năng tấn cơng vào cellulose đã được cải thiện. Cơ chế quá trình nổ hơi nước Hình 2-12 Mơ tả cơ chế quá trình nổ hơi Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 18 Quá trình nổ hơi nước là một quá trình cơ – hĩa – nhiệt. Đĩ là phá vỡ cấu trúc các hợp phần với sự giúp đỡ của nhiệt ở dạng hơi (nhiệt), lực cắt do sự giãn nở của ẩm (cơ), và thủy phân các liên kết glycosidic (hĩa). Trong thiết bị phản ứng, nước dưới áp suất cao thâm nhập vào cấu trúc lignocellulosic bởi quá trình khuếch tán và làm ẩm nguyên liệu. Ẩm trong biomass thủy phân các nhĩm acetyl của hemicellulose hình thành nên các acid hữu cơ như acetic và uronic acid. Các acid này lần lượt xúc tác quá trình depolymer hĩa hemicellulose, giải phĩng xylan và một phần glucan. Dưới điều kiện khắc nghiệt, vùng vơ định hình của cellulose cĩ thể bị thủy phân đến một mức độ nào đĩ. Dưới điều kiện khắc nghiệt hơn, ví dụ như nhiệt độ cao và áp suất cao, cĩ thể thúc đẩy sự phân hủy xylose thành furfural và glucose thành 5-hydroxymethyl furfural. Furfural và 5-hydroxylmethyl furfural kìm hãm sự phát triển của vi sinh vật, do đĩ nĩ khơng thuận lợi cho quá trình lên men [12]. Hình 2-13 Fufural Hình 2-14 Hydroxymethyl fufural Ẩm trong biomass sẽ hĩa hơi đột ngột ra khi áp suất trong thiết bị phản ứng được giải phĩng và hạ đột ngột từ rất cao khoảng vài chục atm xuống cịn áp suất khí trời. Hiện tượng này cũng giống như hiện tượng nổ. Nguyên liệu được tống mạnh khỏi thiết bị qua một lỗ nhỏ bởi lực ép. Một vài hiện tượng xảy ra tại thời điểm này. Đầu tiên, ẩm ngưng tụ trong cấu trúc biomass bốc hơi tức thời do giảm áp đột ngột. Sự giãn nở của hơi nước gây ra lực cắt bao quanh cấu trúc nguyên liệu. Nếu lực cắt này đủ lớn, hơi nước sẽ gây ra sự phá hủy cơ học lên cấu trúc lignocellulosic. Hình 2-14 mơ tả cơ chế quá trình nổ hơi. Hình 2-15 mơ tả sự giải phĩng cellulose khỏi vỏ bọc lignin. Hình 2-16 mơ tả khả năng làm tăng kích thước lỗ xốp trong xơ sợi. Sự mơ tả quá trình làm nổi bật tầm quan trọng của việc tối ưu hai yếu tố: thời gian lưu và nhiệt độ. Thời gian biomass lưu lại trong thiết bị phản ứng giúp xác định phạm vi thủy phân hemicellulose bởi các acid hữu cơ. Việc thủy phân hemicellulose giúp cho quá trình lên men thuận lợi hơn. Tuy nhiên, thời gian lưu dài cũng làm gia tăng sự phân hủy sản phẩm. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 19 Hình 2-15: Cấu trúc sợi trước và sau khi nổ hơi, bĩ sợi cellulose được giải phĩng ra khỏi lớp lignin bảo vệ sau khi nổ hơi Hình 2-16: (d) sợi lignocellulose khơng nổ hơi cĩ cấu trúc sít chặt ngăn cản sự tấn cơng của enzyme, (e) nổ hơi ở 4atm, (f) nổ hơi ở 8atm Nhiệt độ cĩ liên quan đến áp suất hơi trong thiết bị phản ứng. Nhiệt độ càng cao thì áp suất càng cao, do đĩ càng làm gia tăng sự khác nhau giữa áp suất trong thiết bị phản ứng so với áp suất khí quyển. Sự chênh lệch về áp suất tỷ lệ với lực cắt của ẩm hĩa hơi. Ưu nhược điểm của quá trình nổ hơi nước: Tĩm tắt lại, theo quá trình nổ hơi nước cĩ mấy tác động sau lên cấu trúc nguyên liệu lignocellulose 1. Tăng sự kết tinh của cellulose bằng cách thúc đẩy sự kết tinh của vùng vơ định hình. 2. Hemicellulose bị thủy phân trong quá trình nổ hơi. 3. Sự nổ hơi thúc đẩy việc khử lignin. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 20 Cùng với việc gia tăng kích thước lỗ xốp, tác động (2) và (3) là 3 ưu điểm của quá trình nổ hơi. Tuy nhiên, tác động (1) lại gây ra khĩ khăn cho quá trình thủy phân. Ngồi ra những nhược điểm chính của quá trình nổ hơi là: • Tốn chi phí, năng lượng vận hành. • Địi hỏi thiết bị chịu được nhiệt độ, áp suất rất cao. • Cĩ thể làm phân hủy cellulose. • Mất đi đường từ hemicellulose. • Làm sinh ra fufural và 5-hydroxymethyl fufural gây ức chế quá trình lên men [12] 2.2.3 Thủy phân Phương trình phản ứng 612625106 )( OHnCOnHOHC enzyme n ⎯⎯ →⎯+ 2.2.3.1 Ezyme cellulase a) Khái niệm Cellulase là một loại enzyme, cĩ thể được sản xuất từ nấm mốc, vi khuẩn hoặc sinh vật đơn bào; cĩ khả năng thủy phân cellulose và cả hemicellulose. Ký hiệu là EC 3.2.1.4 b) Yêu cầu đối với cellulase Sự phát triển của quá trình chuyển hĩa biomass – một nguồn nguyên liệu thơ, ít giá trị, thành ethanol thơng qua quá trình lên men đặt ra yêu cầu một số bước đặc biệt là việc sản xuất enzyme cellulase cần phải được tối ưu. Sản xuất cellulase quan trọng vì việc thủy phân cellulose cĩ hiệu quả cần một lượng lớn enzyme cellulase (1kg cellulase cho 50 kg cellulose). Giá của enzyme này khá cao từ 0,3 đến 0,81 dollar/gam [9]. Quá trình sản xuất cellulase gặp hai vấn đề chính: sự sinh trưởng và phát triển chậm của nấm mốc và quá trình tách cellulase ra khỏi nấm mốc tốn rất nhiều thời gian. Để quá trình sản xuất ethanol cĩ thể được xây dựng với quy mơ lớn, vấn đề được đặt ra là hoạt tính của enzyme cellulase phải cao hơn loại enzyme đang được sản xuất từ nấm mốc. Hiện nay, yêu cầu cụ thể đặt ra với enzyme là cellulase phải cĩ giá thành rẻ, hoạt tính đặc hiệu cao, độ ổn định cao, chịu được pH và nhiệt độ. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 21 c) Nhĩm enzyme cellulase Mặc dù phổ biến trên trái đất, cellulose lại rất bền vững và khĩ bị phá vỡ vì cellulose cĩ độ kết tinh cao, khơng tan trong nước, cĩ khả năng chống lại các quá trình depolymer hĩa. Quá trình thủy phân cellulose tạo thành glucose được thực hiện nhờ sự tác dụng hiệp đồng của 3 enzyme khác nhau • “Endo-1,4-β-glucanases” (EG) hay 1,4-β-D-glucan 4-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4), enzyme này sẽ tấn cơng ngẫu nhiên vào các cơ chất 1,4-β-glucan cả tan và khơng tan. • “Exo -1,4-β-D-glucanases” bao gồm 1,4-β-D-glucan glucohydrolase (EC 3.2.1.74), enzyme này cĩ tác dụng giải phĩng D-glucose từ 1,4-β-D-glucan và thủy phân chậm D-cellobiose; ngồi ra cịn cĩ enzyme 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) (CBH), enzyme này sẽ giải phĩng cellobiose từ 1,4-β-glucan. • “β-D-glucosidase” hay cịn gọi là β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) cĩ tác dụng tạo thành D-glucose từ celobiose là cellodextrin, cũng như các olygomer của glucose. Hình 2-17 Tác dụng của từng enzyme trong cellulase Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 22 Nhĩm enzyme endo và exo thường được gọi chung là enzyme cellulase, cịn β- glucosidase do cĩ cấu trúc khác và cơ chế khác nên được tách thành nhĩm riêng. Tuy nhiên trong luận văn này, để tiện việc trình bày nên gọi chung nhĩm 3 enzyme này là cellulase. d) Các nguồn sản xuất cellulase. Người ta thống kê được cĩ hơn 60 loại nấm mốc cĩ khả năng tạo cellulase, gồm cĩ các loại chính là soft-rot, brown-rot và white-rot. Các loại nấm mốc thuộc nhĩm cuối cùng (white-rot) cĩ thể phân hủy cả cellulose và lignin. Nhiều nghiên cứu vẫn đang được tiến hành đối với việc sản xuất cellulase từ vi khuẩn. Gần đây, Coughlan và Ljungdahl trong nghiên cứu của mình [9] đã tìm được 46 loại vi khuẩn cĩ khả năng sản xuất cellulase . Các vi khuẩn này cĩ khả năng phân hủy cellulose cả trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Nhĩm kỵ khí điển hình bao gồm các giống acetivibrio, bacteroides, clostridium, micromonospora và ruminococcus. Nhĩm hiếu khí bao gồm các giống Acidothermus, Bacillus, cellulomonas, cellvibrio, cytophaga, Microbispora, Pseudomonas và Thermomonospora. e) Cấu trúc enzyme cellulase Trong những năm 1970, nhờ những phát triển trong lĩnh vực hĩa sinh và sinh học phân tử, người ta cĩ thể nghiên cứu được cấu trúc của cellulase thơng qua giống nấm mốc Trichoderma reesi. Đây là chủng nấm mốc phổ biến sản sinh ra enzyme cellulase. Vào cuối những năm 1980, Abuja et al [17,18] đã đề nghị cấu trúc bậc 3 của Trichoderma reesei CBH I (enzyme thủy phân cellobiose I – cellobiohydrolase I) và CBH II. Trong đĩ, enzyme gồm: • Trung tâm xúc tác (CD: catalytic domain) với kích thước lớn • Trung tâm tạo liên kết với cellulose (CBD: cellulose binding domain) cĩ kích thước nhỏ hơn. Nghiên cứu cấu trúc của trung tâm tạo liên kết với cellulose CBD của CBH I cho thấy đây là một chuỗi polypeptide gồm cĩ 36 amino acid và cĩ một mặt thể hiện tính chất kỵ nước mạnh. Về mặt lý thuyết, cĩ thể kết luận rằng CBD cĩ vai trị quan trọng trong việc ổn định sự liên kết tạm thời giữa cellulase và bề mặt cellulose. Trên bề mặt cellulose cĩ vùng kỵ nước là do sự sắp xếp chặt chẽ và do liên kết hydrogen mạnh giữa các mạch cellulose, gĩp phần ngăn cản, khơng cho các phân tử lớn như nước xâm nhập vào cấu trúc này. Chính tương tác giữa hai Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 23 vùng cĩ tính chất kỵ nước của cellulose và CBD mà enzyme được liên kết với cellulose. • Cầu nối peptide: cĩ tác dụng liên kết hai trung tâm này lại với nhau. Đối với enzyme cellulase, cầu nối peptide là một vùng ái đường, được cấu tạo bởi các amino acid serine, threonin và proline. Serine Threonine Proline Đối với T. reesei CBH II, lõi protein cĩ tác dụng phá vỡ cấu trúc vi sợi của cellulose. Sản phẩm thủy phân của CHB I giữ nguyên cấu trúc lập thể của C1(C chứa nhĩm OH hemiacetal), trong khi đĩ CBH II tạo sự nghịch đảo cấu hình của C1 thành đồng phân α. Cellulase cĩ nguồn gốc từ các giống nấm mốc khác cũng như từ vi khuẩn đều cĩ cấu trúc tương tự. 2.2.3.2 Cơ chế quá trình thủy phân Quá trình tác dụng thủy phân của cellulase cĩ thể chia thành những giai đoạn sau a) Quá trình hấp phụ enzyme lên xơ sợi Cĩ hai yếu tố quyết định năng lượng hấp phụ của protein lên bề mặt phân pha rắn/lỏng là bản chất của bề mặt và lực liên kết giữa các phân tử. Những tương tác này thường khơng mang bản chất cộng hĩa trị, nĩi cách khác, các tương tác này thường tạo thành do liên kết hydro, lực tĩnh điện hoặc là tương tác giữa các nhĩm kỵ nước. Các phân tử protein hay các ion khối lượng phân tử thấp đã hấp phụ trước trên bề mặt sẽ cĩ ảnh hưởng đến sự hấp phụ mới. Lực tĩnh điện gĩp phần vào việc hấp phụ của protein (enzyme) lên bề mặt phân pha, tuy nhiên khơng phải là yếu tố quyết định quá trình hấp phụ của protein. Protein là một polymer lưỡng cực, chứa cả điện tích dương và âm, điều này làm cho protein cĩ bản chất của một phân tử hoạt động bề mặt. Phần kỵ nước trong phân tử protein là những nhĩm chứa nhân thơm như trong tryptophane, phenylalanine và tyrosine. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 24 Thơng thường, khi phân tử protein bị gấp khúc, các aminoacid mang nhĩm kỵ nước sẽ được giấu vào bên trong. Tuy nhiên, cũng cĩ một vài phần kỵ nước được sắp xếp tại bề mặt ngồi của phân tử protein. Chính các phần này tạo liên kết với các cơ chất mang bản chất kỵ nước nhờ vào tương tác giữa các phần kỵ nước và liên kết hydro. Ái lực của protein sẽ tăng khi bản chất kỵ nước trong phân tử protein tăng mặc dù điều này sẽ ảnh hưởng tới tương tác tĩnh điện. Một cách tổng quát, sự hấp phụ của phân tử protein lên bề mặt kỵ nước là bất thuận nghịch hơn sự hấp phụ lên bề mặt ưa nước. Điều này bởi vì phân tử protein sẽ cĩ một vài thay đổi một khi đã hấp phụ lên bề mặt kỵ nước. Bề mặt cellulose mang bản chất kỵ nước do giữa các mạch tạo liên kết hydro (khơng cịn nhĩm phân cực tự do). Cellulose tinh khiết khơng chứa nhĩm mang điện. Trong thực tế, điện tích bề mặt của các chất sẽ được tạo thành khi cĩ sự phân bố các ion từ bề mặt đĩ. Ví dụ các bề mặt tiếp xúc với nước thường mang điện âm. Các nghiên cứu về quá trình tiền xử lý – nổ hơi cho thấy sau quá trình này, tính chất kỵ nước của cơ chất (được đo bằng thời gian giọt nước thấm vào vật liệu Water drop penetration time WDPT) tăng. Tùy thuộc vào tính chất của protein và bề mặt hấp phụ mà tương tác điện tích – địên tích hay tương tác của các nhĩm kỵ nước sẽ đĩng vai trị quyết định cho quá trình . Ví dụ trong một nghiên cứu về enzyme protease, khi thay đổi một nhĩm ưa nước mang điện tích dương - lysine bằng một amino acid kỵ nước, khơng mang điện – phenylalanine, người ta nhận thấy khả năng hấp phụ của enzyme này lên bề mặt ưa nước cũng như kỵ nước đều giảm. Điều này cho phép kết luận, trong trường hợp của protease, lực tương tác tĩnh điện cĩ tác dụng chủ yếu đối với quá trình hấp phụ của enzyme. Điện tích của cellulase và sự hiện diện của nhĩm khơng phân cực cĩ thể dẫn đến sự hấp phụ khơng chọn lọc lên cả cellulose và lignin. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, cellulase hấp phụ lên cả lignin trong vật liệu lignocellulose. Ngồi ra, đối với β- glucosidase khơng giống các enzyme cellulase khác, khơng cĩ trung tâm tạo liên kết CBD, enzyme này hấp phụ khá mạnh lên lignin đã được tách riêng. Rất cần thiết hạn chế tối đa việc hấp phụ khơng chọn lọc của cellulase lên lignin nếu muốn ứng dụng quá trình thủy phân enzyme một cách kinh tế. Về mặt lý thuyết, cơng nghệ protein cĩ thể làm thay đổi cấu trúc của cellulase để làm cho enzyme này hấp phụ chọn lọc hơn. Tuy nhiên, khả năng hấp phụ của cellulase lên vùng cellulose kết tinh là yếu tố quan trọng trong quá trình thủy phân, vì vậy các tác động lên cấu trúc cần được tránh. Hiện tại, vẫn chưa cĩ nghiên cứu nào thành cơng trong việc thay đổi chuỗi amino acid của cellulase để làm cho enzyme này thủy phân vật liệu lignocellulose hiệu quả hơn. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 25 b) Quá trình tạo liên kết giữa cellulase và cellulose Hình 2-18 Quá trình tác động của cellobiohydrolase lên đầu vùng kết tinh của cellulose. Hình 2-18 mơ tả liên kết của CBH với cellulose. Trung tâm tạo liên kết của cellulase làm phá hủy một phần cấu trúc chặt chẽ của các mạch cellulose. Sau đĩ, các mạch này sẽ được dẫn vào vùng trung tâm hoạt động của cellulase. Quá trình dẫn này xảy ra nhờ sự hiện diện của mạch peptide ưa nước, khu vực này sẽ tạo các liên kết hydro bao bọc sợi cellulose, nhằm tránh sự xâm nhập quá sâu của CBD vào bề mặt cellulose. Cellulase tương tác với bề mặt cellulose thơng qua trung tâm liên kết cellulose CBD và trung tâm hoạt động chính CD. Cellulase tạo được liên kết với cellulose là nhờ vào trung tâm tạo liên kết CBD. Đối với các chủng T. reesi, CBD là trung tâm gồm các phân tử nhỏ, gồm 36 amino acid. Thơng thường, trung tâm liên kết cĩ 3 amino acid tyrosine, chịu trách nhiệm cho việc liên kết với cellulose. Trong CBH I, một tyrosine bị thay bằng tryptophane. Khác biệt trong cấu trúc của các loại enzyme (CBH I, CBH II, EG …) sẽ dẫn đến ái lực khác nhau trong quá trình hấp phụ của các enzyme này lên cơ chất. Đã cĩ nhiều nghiên cứu về cấu trúc của các enzyme và sự liên hệ đến khả năng tạo liên kết với cellulose. Cụ thể số lượng các amino acid cĩ tính khơng phân cực cao (tyrosine, phenylalanine, tryptophan) nằm trong trung tâm hoạt động là bằng nhau đối với CBH I và CBH II ( 5 và 6 nhĩm). Trong khi đĩ, số lượng các amino acid khơng phân cực trong trung tâm hoạt động của CBH II cao hơn. Điện tích bề mặt của các enzyme cũng rất khác biệt. Ví dụ, đối với trung tâm tạo liên kết CBD, CBH II cĩ thể cĩ tương tác tĩnh điện vì cĩ Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 26 aspartic acid ở vị trí 30, trong khi đĩ CBH I và EGII khơng cĩ tính chất này vì ở vị trí 30 là proline Tyrosine Phenylalanin Tryptophan Acid aspartic Quá trình hấp phụ của CBH I khơng bị ảnh hưởng của liên kết tĩnh điện giữa bề mặt cơ chất và enzyme. Ngược lại, CBH II cĩ chịu ảnh hưởng của lực tĩnh điện. c) Cơ chế tác động hiệp đồng của các enzyme. Từ những năm 1954, Gilligan và Reese đã chỉ ra rằng việc pha trộn cellulose từ các nguồn nấm mốc khác nhau cĩ thể làm tăng lượng đường khử tạo thành trong quá trình thủy phân. Từ lúc đĩ, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm mơ tả quá trình tác động hiệp đồng của các enzyme endo, exo cellulase. Hình 2-19 Cơ chế tác động hiệp đồng của enzyme exo-endo và endo-endo. Enzyme endoglucanase tấn cơng ngẫu nhiên vào cellulose và tạo cơ chất thích hợp cho enzyme exoglucanase và sau đĩ khuếch tán nhanh ra khỏi bề mặt. Exoglucanse cĩ thể tấn cơng từ đầu đường khử và khơng khử. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 27 Nghiên cứu về tác động hiệp đồng của endo-exo cơng bố đầu tiên vào năm 1980. Khái niệm endo-exo được mơ tả trong hình 2-19. Sự tác động hiệp đồng của endo-exo cĩ thể nĩi là nhằm mục đích tạo bề mặt tấn cơng mới cho exoglucanse. Enzyme exo thường tấn cơng vào những cellulose đã bị cắt mạch (cellodextrin) cĩ đầu là nhĩm khử (C chứa OH hemiacetal) hoặc khơng khử. Trong khi đĩ, enzyme endo lại tấn cơng ngẫu nhiên vào giữa mạch cellulose, tạo thành các cellodextrin, là các cơ chất thích hợp của enzyme exo. Exoglucanase cĩ những loại enzyme tấn cơng đặc trưng tùy theo tính chất khử được hay khơng khử được của nhĩm đầu mạch. Thật vậy, theo những nghiên cứu của Teeri và cộng sự, nhĩm khử đầu mạch của cellodextrin sẽ được định hướng vào trung tâm xúc tác của CBH I. Trong khi đĩ, CBH II lại ưu tiên tấn cơng vào đầu khơng cĩ nhĩm khử của cellodextrin. Ngồi ra, cũng cĩ nhiều nghiên cứu về sự tác động hiệp đồng của các enzyme endo, exo cĩ nguồn gốc nấm mốc và vi khuẩn. Dựa trên các nghiên cứu này, enzyme celluase cĩ thể được pha trộn với các thành phần từ các nguồn khác nhau nhằm tạo được một hệ enzyme cĩ tác động mong muốn. TĨM TẮT Quá trình thủy phân cĩ thể được tĩm tắt trong hình sau Hình 2-20 Cơ chế quá trình thủy phân Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 28 • Enzyme endo-cellulase tấn cơng ngẫu nhiên vào mạch cellulose nhờ tạo liên kết bằng tương tác giữa CBD với cellulose, tạo thành các oligosaccharide. • Enzyme exo – cellulase tấn cơng vào cellulose và cả oligomer từ đầu đường khử và khơng khử thơng qua tường tác của CBD với cellulose, tạo thành cellobiose, cả glucose. • β-glucosidase tấn cơng cellobiose và oligosaccharide tan, tạo glucose. 2.2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng quá trình thủy phân. a) Ảnh hưởng của cấu trúc nguyên liệu Cấu trúc tự nhiên của lignocellulose tạo ra nhiều cản trở đến quá trình tấn cơng của các tác nhân thủy phân. Ngay cả quá trình thủy phân cellulose tinh khiết, tốc độ thủy phân cũng giảm theo thời gian. Tốc độ phản ứng giảm dần theo thời gian vì một số lý do sau: sự ức chế enzyme do sản phẩm, sự giảm của các phần cơ chất dễ thủy phân, enzyme bị bất hoạt hoặc bị giữ lại trong các lỗ xốp của cellulose. Hiệu suất quá trình thủy phân bị ảnh hưởng mạnh bởi tính chất của nguồn nguyên liệu. Một cách tổng quát, gỗ mềm thường khĩ thủy phân hơn gỗ cứng. Cấu trúc của nguyên liệu và cơ chế tác động của enxyme và cơ chất là hai yếu tố chính làm hạn chế hiệu suất quá trình thủy phân. Khả năng tiếp cận vật liệu lignocellulosic của cellulase đĩng vai trị quan trọng trong quá trình thủy phân. Cellulose cĩ bề mặt trong và ngồi, bề mặt ngồi bao gồm bề mặt bao quanh các xơ sợi, bề mặt trong là bề mặt do các mao quản bên tron xơ sợi tạo thành. Nếu cellulose khơng được tiền xử lý, hiệu quả thủy phân thấp. Xử lý loại bỏ hemicelluose (bằng tiền xử lý acid) sẽ làm tăng khả năng thủy phân cellulose (theo nghiên cứu của Grohmann). Grethlein đã giải thích rằng loại bỏ hemicellulose sẽ làm tăng cấu trúc xốp đồng thời tăng bề mặt cellulose, làm cho enzyme dễ tấn cơng hơn. Kích thước của các lỗ xốp lại liên quan đến độ trương nở của vật lịêu. Thật vậy, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, khi làm khơ vật liệu lignocellulose, các mao quản sẽ bị mất đi, điều này làm giảm kích thước lỗ xốp và vì vậy hiệu suất quá trình thủy phân giảm rõ rệt. Hàm lượng và sự phân bố của lignin trong cấu trúc vật liệu cĩ ảnh hưởng tới khả năng thủy phân của vật liệu đĩ. Hiệu suất thủy phân thu được khá cao đối với các nguyên lịêu đã được loại bỏ gần hết lignin. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 29 b) Ảnh hưởng của nhiệt độ Giống như nhiều phản ứng enzyme khác, phản ứng thủy phân cellulose bằng enzyme cellulase chịu ảnh hưởng lớn của nhiệt độ. Tốc độ phản ứng thủy phân tăng theo nhiệt độ, tuy nhiên đến một nhiệt độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ giảm dần và đến mức triệt tiêu. Hình 2-21 Tốc độ phản ứng enzyme theo nhiệt độ Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng. Nhiệt độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50 oC. Riêng đối với enzyme cellulase, nhiệt độ tối ưu là 50oC. Những enzyme khác nhau đều cĩ nhiệt độ tối ưu khác nhau. Nếu đưa nhiệt độ cao hơn nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm, khi đĩ enzyme khơng cĩ khả năng phục hồi hoạt tính. Ngược lại khi ở nhiệt độ 0oC, enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ, hoạt tính của enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu. Khi nhiệt độ cao thường gây cho enzyme mất hoạt tính. Phản ứng vơ hoạt của enzyme dưới tác dụng của nhiệt thường biểu diễn là phản ứng bậc một. kt E E o −== ][ ][ln Trong đĩ – k – hằng số vận tốc phản ứng. E – nồng độ enzyme hoạt động ở thời điểm t Eo – nồng độ ban đầu của enzyme hoạt động Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 30 c) Ảnh hưởng của pH pH mơi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hĩa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH cĩ ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme. Ảnh hưởng đĩ được trình bày trong hình Hình 2-22 Ảnh hưởng của pH Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng cĩ nhiều enzyme hoạt động ở mơi trường acid yếu. Một số enzyme khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid. Đối với enzyme cellulase, khoảng pH thích hợp là 4-5, trong đĩ tốt nhất là 4.8. d) Nồng độ enzyme Hình 2-23 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme Khi nồng độ enzyme tăng, tốc độ phản ứng tăng theo đường thẳng. Tuy nhiên, khi nồng độ enzyme đạt đến một ngưỡng nào đĩ, nồng độ cơ chất sẽ trở thành yếu tố hạn chế tốc độ phản ứng. Khi đĩ, tốc độ phản ứng sẽ khơng tăng nữa mà là một đường nằm ngang như trong hình vẽ. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 31 e) Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Hình 2-24 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng enzyme tăng, vì sẽ cĩ nhiều cơ chất va chạm với enzyme tiến hành phản ứng. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn, các enzyme bị bão hịa cơ chất, vì vậy, tăng nồng độ cơ chất thì tốc độ phản ứng sẽ khơng thay đổi đáng kể. f) Ảnh hưởng của các chất kìm hãm Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất cĩ mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại khơng bị enzyme làm thay đổi tính chất hĩa học, cấu tạo hĩa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất gây kìm hãm hoạt động của enzyme bao gồm các ion, các phần tử vơ cơ, các chất hữu cơ và cả protein. Các chất kìm hãm cĩ ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật. Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm cĩ thể là thuận nghịch hoặc khơng thuận nghịch. Trong trường hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chĩng đạt được cân bằng. EIIE k k ↔+ 1 2 trong đĩ E – enzyme, I – chất kìm hãm k1, k2 hằng số vận tốc phản ứng thuận nghịch. Trong trường hợp phản ứng ức chế là khơng thuận nghịch, hằng số k2 sẽ rất nhỏ và khơng đáng kể. Ở đây, các chất kìm hãm kết hợp với enzyme bằng liên kết cộng hĩa trị. Ngồi ra các chất kìm hãm cịn kết hợp với enzyme bằng một cơ chế khác mà đến nay các Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 32 nhà khoa học vẫn chưa giải thích một cách trọn vẹn. Theo đĩ, các chất kìm hãm gắn rất chặt vào enzyme, tạo thành phức hợp EI. Phức hợp này bị phân rã rất chậm. Tùy thuộc vào bản chất phức EI, bản chất chất kìm hãm người ta chia ra những chất kìm hãm: • Chất kìm hãm cạnh tranh: là những chất cĩ cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng cĩ khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Khi đĩ chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động và vì vậy, cơ chất khơng cịn cơ hội tiếp cận với trung tâm này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm hoạt động làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với cơ chất. Kết quả là hoạt động của enzyme sẽ giảm. • Chất kìm hãm khơng cạnh tranh: chất kìm hãm khơng chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở một vị trí ngồi trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu trúc khơng gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế các chất kìm hãm làm giảm hoạt động của enzyme. Các chất kìm hãm khơng cạnh tranh thường gồm hai loại: kìm hãm do sản phẩm phản ứng và kìm hãm do thừa cơ chất. Hình 2-25 Chất kìm hãm cạnh tranh Hình 2-26 Chất kìm hãm khơng cạnh tranh Đối với enzyme cellulase, người ta nhận thấy, sản phẩm của phản ứng thủy phân, bao gồm cả cellobiose và glucose đều cĩ tác động kìm hãm hoạt tính của cellulase, đặc biệt là cellobiose. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 33 2.2.4 Lên men 2.2.4.1 Cơ sở lý thuyết Lý thuyết quá trình lên men đã được nhiều nhà sinh học nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1769, Lavoisier phân tích sản phẩm lên men rượu và nhận thấy khi lên men, đường khơng chỉ tạo thành ethanol và CO2 mà cịn tạo ra acid acetic. Năm 1810, Gay-Lussac nhận thấy rằng cứ 45 phần khối lượng đường sẽ chuyển thành 23 phần ethanol và 22 phần khí carbonic. Trên cơ sở đĩ ơng đưa ra phương trình tổng quát như sau: C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q Năm 1857, Louis Pasteur tiếp tục nghiên cứu và thu nhận kết quả sau: cứ 100 phần đường saccharose khi lên men sẽ tạo ra 51.1 phần ethanol, 48.4 phần CO2, 32.0 phần glycerin, 0.7 phần acid succinic và hai phần các sản phẩm khác. Từ đĩ suy ra cứ 45 phần khối lượng glucose khi lên men sẽ tạo ra 21.8 phần ethanol chứ khơng phải 23 phần như Gay-Lussac đã tính. Tuy nhiên phương trình lên men do Gay-Lussac đưa ra vẫn đúng và dùng làm cơ sở lý thuyết để tính hiệu suất thu hồi rượu theo lý thuyết. Gay-Lussac cịn kết luận sự lên men là quá trình sinh học cĩ liên hệ mật thiết đến sự hoạt động của tế bào nấm men. Vào khoảng 1871-1872 Manaxemi đem nghiền tế bào nấm men với cát thạch anh rồi mới cho vào lên men dịch đường thì hiện tượng lên men vẫn xảy ra.Năm 1879, Buchuer tiến hành nghiền nát tế bào nấm men rồi chiết lấy dịch trong khơng chứa xác nấm men rồi cho vào dịch đường thì thấy dịch chiết vẫn cĩ khả năng lên men. Từ đĩ người ta gọi các chất trong dịch tế bào nấm men là zymase. Đây chính là hợp chất của nhiều enzyme cùng tham gia chuyển hĩa đường thành ethanol và khí carbonic [1]. Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hĩa khử. Quá trình oxy hĩa này lại xảy ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme, cho nên người ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hĩa sinh học. Sự tạo thành rượu từ glucose phải trải qua nhiều giai đoạn, sơ đồ hình thành rượu từ glucose được biễu diễn ở hình 2.27 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 34 Hình 2-27: Quá trình đường phân Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 35 Sau đĩ, pyruvate sẽ chuyển thành ethanol theo các phương trình sau: CH3 C COOH O CH3CHO-CO2 pyruvat decarbonxylase CH3CHO C2H5OH alcol- dehydrogenase NADH + H+ NAD+ 2.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men a) Nhiệt độ Mỗi vi sinh vật đều cĩ một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng. Đối với nấm men Saccharomyces, nhiệt độ tối ưu nằm trong khoảng 28-320C. Ở nhiệt độ cao, hoạt tính của nấm men giảm nhanh nhưng chủ yếu là dễ bị nhiễm vi sinh vật như vi khuẩn lactic và nấm men hoang dại. Ở nhiệt độ 30oC, nấm men hoang dại phát triển nhanh hơn Saccharomyces 2-3 lần, cịn ở nhiệt độ 35-38oC chúng phát triển nhanh gấp 6-8 lần. Mặt khác, khi lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều sản phẩm phụ như ester, aldehyd và tổn thất ethanol theo CO2 sẽ tăng. Hình 2-28 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm men b) pH Nồng độ ion H+ trong canh trường ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men. Chúng cĩ khả năng làm thay đổi điện tích của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ cĩ thể hoạt động tốt trong trạng thái ion nhất định, trạng thái này phụ thuộc vào pH của canh truờng. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 36 Trong điều kiện lên men ethanol, pH tối ưu để tạo ethanol là 4.5-5.0. Nếu pH thấp khoảng 3.0-4.0 nấm men cịn hoạt động được và vi khuẩn bị ức chế. pH hơi cao hơn thì sẽ tạo ra sản phẩm cĩ độ chua thấp, sản phẩm dễ bị nhiễm khuẩn và các sản phẩm phụ trong quá trình lên men sẽ tạo nhiều hơn, lên men cĩ hiệu suất thấp. c) Nồng độ của dịch lên men Nếu nồng độ dịch đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men. Kết quả là ethanol nhiều sẽ ức chế khơng những các tạp khuẩn mà cả nấm men. Mặt khác đường nhiều sẽ dẫn đến tổn hao nguồn nguyên liệu và phải kéo dài thời gian lên men. Mặt khác nếu nồng độ đường của dịch lên men thấp thì sẽ làm giảm năng suất thiết bị lên men và làm cho nấm men khơng đủ chất dinh dưỡng để phát triển. Thơng thường nồng độ dịch đường được giới hạn ở 22% khối lượng hoặc ít hơn (nếu cao hơn thành tế bào cĩ thể bị vỡ). d) Thời gian Thời gian cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm. Thời gian lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nhiệt độ lên men, nồng độ đường, chủng nấm men,… Thời gian lên men được tính bắt đầu từ khi cấy chủng nấm men vào mơi trường lên men, nhưng thời gian kết thúc thì tùy thuộc vào từng mơi trường lên men cụ thể và tùy thuộc vào mục đích lên men mà ta dừng quá trình lên men. Trong giai đoạn đầu của quá trình lên men phải cho dịch đường tiếp xúc với oxy. Lúc này nấm men cần oxy để tích lũy một lượng sinh khối cần thiết cho quá trình lên men. Tiếp theo, để chuyển hĩa đường thành ethanol, nấm men phải được phát triển trong điều kiện yếm khí hồn tồn. Vì trong mơi trường này, sự hơ hấp của nấm men bị ức chế và bắt đầu phải tìm năng lượng cần thiết bằng con đường lên men. Để đáp ứng năng lượng cần thiết thì nấm men cần phân hủy một lượng đường lớn và đường sẽ chuyển hĩa thành ethanol và CO2. Đĩ là nguyên nhân muốn cĩ ethanol nhiều thì khơng được thống khí mơi trường. Nếu cĩ oxy thì trong giai đoạn này rượu sẽ tiếp tục chuyển hĩa thành acid acetic làm sản phẩm bị chua. e) Nồng độ CO2 trong mơi trường CO2 được hình thành trong quá trình lên men rượu từ đường. Một phần sẽ tồn tại trong mơi trường; một phần tách lên trên bề mặt mơi trường; phần cịn lại tích tụ lại thành một lớp ngăn cách giữa khơng khí và mơi trường. CO2 tích tụ lại trong mơi trường chỉ làm Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 37 giảm khả năng sinh sản của nấm men, nhưng khơng thể làm cho khả năng lên men của nấm men yếu đi. Trong mơi trường cĩ hàm lượng đường cao sẽ cản trở CO2 thốt ra ngồi, dẫn đến ức chế sinh sản của nấm men và sự lên men cĩ hiệu suất thấp. CO2 nằm trong khoảng khơng giữa bề mặt mơi trường và khơng khí cĩ tác dụng kiềm chế sự phát triển của những vi sinh vật hiếu khí gây hại. Do vậy, các thùng lên men phải cĩ nút đặc biệt chỉ cho phép CO2 bay ra mà khơng cho khơng khí vào. f) Thành phần các chất dinh dưỡng của mơi trường lên men Mơi trường nuơi cấy cần phải cĩ đầy đủ các thành phần dinh dưỡng chủ yếu là glucid ở dạng monosaccharide và disaccharide, nitơ ở dạng acid amin, các muối vơ cơ, trừ dạng muối nitrit, nitrat, các vitamin và muối khống. g) Hàm lượng giống nấm men Nấm men là nhân tố tạo ra quá trình lên men, chuyển hĩa đường thành ethanol và khí carbonic. Mỗi lồi nấm men cĩ khả năng lên men khác nhau. Cùng lồi nấm men, nhưng ở những điều kiện lên men khác nhau thì khả năng lên men khác nhau và sản phẩm của quá trình lên men cũng khác nhau. Việc bổ sung tỷ lệ giống lên men cũng phải được lựa chọn. Thơng thường lượng men giống cấy vào 15 triệu tế bào/ml dịch lên men. 2.2.4.3 Các loại giống nấm men Nấm men tiến hành lên men đường tạo thành ethanol. Lignocellulose được cấu tạo từ đường 5 và đường 6. Nấm men Saccharomyces Cerevisiae cĩ thể lên men đường 6 (glucose) hiệu quả nhưng vẫn chưa tìm được chủng nấm men thích hợp để lên men đường 5 (xylose). Nấm men thích hợp cho quá trình lên men cần cĩ một số tính chất sau: hiệu suất lên men cao; chịu được ethanol; chịu được các sản phẩm phụ của quá trình thuỷ phân; lên men ở pH thấp, cĩ thể tiêu thụ nhiều cơ chất khác nhau. Cĩ hai chủng nấm men đang được sử dụng phổ biến: Saccaromyces Cerevisiae là loại nấm men được sử dụng phổ biến cho lên men glucose. S.cerevisiae cĩ các ưu điểm như: chịu được nồng độ ethanol cao, ít sản phẩm phụ, tốc độ lên men cao trong mơi trường acid, chịu được acid acetic. Tuy nhiên, nấm men này khơng cĩ khả năng lên men đường 5 cụ thể là khơng thể lên men xelose. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 38 Pichia stipitis: là loại nấm men phổ biến nhất trong các chủng nấm men cĩ thể lên men đường 5. Pichia stipitis cĩ các ưu điểm như cho hiệu suất tiêu thụ xylopse cao, chịu được nhiệt độ và nồng độ cơ chất cao. Tuy nhiên lại bị ức chế bởi ethanol nồng độ cao. Hình 2-29: Giống nấm men Pichia stiptis và Saccharomyces cerevisiae Ngày nay, thế giới cĩ xu hướng sử dụng cơng nghệ gene để kết hợp các chủng nấm men vừa cĩ khả năng lên men đường 6, vừa cĩ khả năng lên men đường 5. Trong nghiên cứu này, chỉ nghiên cứu quá trình lên men đường 6 (hexose) nên chúng tơi chỉ sử dụng nấm men saccharomyces cerevisiae. 2.2.5 Thủy phân và lên men đồng thời 2.2.5.1 Tổng quát Quá trình thủy phân và lên men đồng thời (cịn gọi là quá trình đường hĩa và lên men đồng thời) tiến hành cả thủy phân và lên men trong cùng một bước. So với quá trình thơng thường (thủy phân rồi mới lên men), quá trình thủy phân và lên men đồng thời cĩ nhiều ưu điểm: • Glucose tạo thành trong quá trình thủy phân được tiêu thụ ngay lập tức bởi nấm men vì vậy, lượng cellobiose và glucose tích tụ trong hệ thống là rất ít. Điều này sẽ giải quyết vấn đề ức chế enzyme nhờ đĩ tốc độ tạo glucose sẽ được tăng đáng kể, lượng enzyme cần dùng cũng nhỏ đi. • Số thiết bị cần cho quá trình thủy phân và lên men đồng thời cũng ít hơn số cần cho phương pháp truyền thống vì cả quá trình thủy phân và lên men được tiến hành trong cùng một thiết bị. Điều này giúp giảm vốn đầu tư. • Việc ethanol tạo thành trong suốt quá trình sẽ làm giảm khả năng phát triển của vi sinh vật cũng như tạp chất, rất cĩ lợi cho các quy trình liên tục. Chính vì những ưu điểm trên mà quá trình thủy phân và lên men đồng thời được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới với các nguồn nguyên liệu khác nhau. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 39 Bảng 2-2 Các thơng số vận hành và kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời được thực hiện trên nhiều nước[9] Nồng độ glucose Nồng độ cellulase Ethanol Thời gian lưu Biomass g/l IFTU/g cellulose Hiệu suất % g/l Ngày Bột cellulose 100 - 62 35 3 Bột sulfate 100 - 48 27 3 Rác thải nhà máy bột giấy 70 - 56 22 1 Rơm lúa mì 51 28 49 14 1 Bã mía 50 28 53 15 1 Rơm lúa mì 75 7 66 28 4-7 Rơm lúa mì 75 13 73 31 4-7 Rơm lúa mì 75 26 75 32 4-7 Nhiệt độ tối ưu cho quá trình là 37-38oC, nhiệt độ này là sự kết hợp của nhiệt độ tốt nhất cho quá trình thủy phân (45-50oC) và nhiệt độ tốt nhất cho hoạt động của nấm men (30oC). Khi % bã rắn (cellulose) tăng, lượng ethanol tạo thành sẽ giảm. Mặc dù nồng độ đường luơn duy trì ở một mức thấp trong suốt quá trình, hiệu suất giảm là do khả năng khuếch tán của enzyme bị giảm và ethanol sẽ gây ức chế lên cả enzyme và nấm men. Trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời, enzyme cellulase (endo và exoglucan) và β-glucosidase bị ức chế bởi cellobiose, glucose và ethanol. Bảng sau thể hiện mức độ ức chế của các chất trên với từng enzyme cụ thể. Bảng 2-3 Ảnh hưởng của ethanol, glucose và cellobiose lên enzyme cellulase và β-glucosidase Mức độ ức chế Enzyme Cellobiose Glucose Ethanol Cellulase K1B=5.85 g/l K1G=53.16 g/l K1E=50.35 g/l Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 40 (ức chế mạnh ) (ức chế yếu) (ức chế trung bình) β-glucosidase Km=10.56 g/l (cơ chất) K2G=0.62g/l (ức chế rất mạnh) Khơng ức chế Cellobiose là sản phẩm trực tiếp của enzyme cellulase và cĩ ức chế mạnh đối vối enzyme này. Hoạt tính của enzyme cellulase sẽ bị giảm 60% khi nồng độ cellobiose đạt mức 6g/l. Khi nồng độ glucose đạt 20g/l, hoạt tính của cellulase sẽ giảm khoảng 20%. Ngược lại, glucose lại cĩ ức chế rất mạnh đối với β-glucosidase: khi glucose đạt nồng độ khoảng 3g/l, giá trị này nằm trong khoảng nồng độ glucose tạo thành trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời, 75% hoạt tính của enzyme này bị mất. Ngược lại, ethanol khơng ức chế đáng kể β-glucosidase. Cellulase và β-glucosidase thể hiện những tính chất động học khác nhau. Điều này là do hai enzyme này thực hiện hai cơ chế khác nhau: cellulase xúc tác cho phản ứng dị thể dựa trên sự tác động hiệp đồng của một nhĩm các enzyme, trong khi đĩ β-glucosidase xúc tác cho phản ứng đồng thể. Keikhosro Karimi et al [13] nghiên cứu quá trình thủy phân và lên men đồng thời cho rơm rạ được tiền xử lý bằng acid lỗng, sử dụng chủng nấm men saccharomyces cerevisiae; mucor indicus và rhizopus. Kết quả của nghiên cứu này đối với chủng saccaromyces cerevisiae được trình bày trong bảng sau. Bảng 2-4 Kết quả quá trình thủy phân và lên men đồng thời tiến hành với rơm đã qua tiền xử lý bằng acid lỗng, quá trình được tiến hành trong điều kiện kỵ khí. Chủng nấm men Enzym FPU/g Cơ chất Ethano- l (g/l) Hiệu suất (%) Glycer- -ol (mg/g) Succini -c acid (mg/g) Pyvuri- c acid (mg/l) Acetic acid (mg/g) S. cerevisiae 15 Avicel 12,64 ± 0,46 44,62± 1,62 62,6 0,3 1,1 1,2 S. cerevisiae 30 Avicel 15,20±0 ,55 53,65± 1,94 79,4 0,8 1,5 1,9 S. cerevisiae 15 Rơm 6,83±0, 25 40,69± 1,49 83,9 0,5 2,0 3,9 Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 41 Ghi chú : avicel là loại cellulose tinh khiết. Các sản phẩm phụ được tính theo mg sản phẩm phụ/g cellulose cĩ trong nguyên liệu. Đối với nấm men saccharomyces cerevisiae, glycerol là sản phẩm phụ lớn nhất, ngồi ra cịn cĩ các sản phẩm phụ như acid acetic, pyvuric, succinic với nồng độ nhỏ hơn, cĩ thể xem là khơng đáng kể. Glycerol tạo thành tăng theo nhiệt độ của quá trình và sẽ cĩ ảnh hưởng đến nồng độ ethanol trong dung dịch. Nồng độ ethanol và hiệu suất quá trình là khơng cao. Nghiên cứu này cịn cho thấy tốc độ tạo thành ethanol đạt lớn nhất trong khoảng 24 giờ đầu của quá trình thủy phân và lên men đồng thời sử dụng nấm men saccaromyces cerevisiae. Thí nghiệm được thực hiện trong 1 tuần, tuy nhiên nồng độ ethanol hầu như khơng đổi trong 4 ngày cuối và đơi khi cịn giảm nhẹ. Cĩ thể kết luận rằng, quá trình sản xuất ethanol cĩ thể kết thúc trong vịng 1 đến 2 ngày, tuy nhiên,cần thêm 2 ngày nữa để cĩ thể tạo thành lượng ethanol tối đa. 2.2.5.2 Các hạn chế trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời Theo nghiên cứu được trình bày trong sách Sổ tay quy trình sản xuất bioethanol [9], người ta tiến hành thí nghiệm với nguyên liệu là gỗ Populus eugenii được qua quá trình tiền xử lý acid. Thành phần ban đầu gồm 60g/l bã rắn, cellulase : 25 IFPU/g cellulose, nấm mem saccharomicyes cerevisiae, nhiệt độ 38oC, pH 5,0; thu số liệu theo thời gian và tiến hành phân tích số liệu. Hình 2-30 Nồng độ glucose (ơ vuơng khơng màu) và celllobiose (ơ vuơng màu đen) theo thời gian của quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 42 Như mơ tả trong hình, glucose sẽ tích tụ trong 6-12 giờ đầu tiên của quá trình, vì nấm men khơng thể tiêu thụ glucose với tốc độ mà enzyme thủy phân ra sản phẩm này trong giai đoạn đầu của quá trình. Việc glucose tích tụ lại gây ảnh hưởng lên hoạt tính của enzyme β-glucosidase, tiếp theo sẽ tạo sự tích tụ cellobiose. Khi sinh khối của nấm men tăng lên, tỉ lệ glucose được tiêu thụ tăng lên và nồng độ glucose trong thiết bị phản ứng giảm xuống. Kết quả là β-glucosidase khơng cịn bị ức chế, enzyme này sẽ tiến hành thủy phân cellobiose, thiết lập cân bằng hĩa học giữa tốc độ đường (bao gồm cellobiose và glucose) tạo thành và mất đi. Hình 2-31 Nồng độ ethanol theo thời gian trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời. Sau 40-60h, tốc độ tạo ethanol giảm đáng kể và sau 80h dường như khơng đổi mặc dù lúc đĩ chỉ cĩ 65% cellulose là đã bị thủy phân. Hiện tượng này được quan sát thấy trong nhiều nghiên cứu, tuy nhiên đến nay vẫn chưa cĩ một giải thích hợp lý được đưa ra. Cĩ giải thích cho rằng do tính chất chống thủy phân của cellulose tăng lên, sự giảm tác động hiệp đồng của các thành phần enzyme cellulase, khả năng chuyển động của enzyme và kích thước của xơ sợi đều bị giảm trong suốt quá trình thủy phân. Để làm tăng hiệu suất cho quá trình, người ta làm thí nghiệm đưa thêm các thành phần mới vào quá trình lúc 80h. Các thí nghiệm được tiến hành với việc thêm các thành phần riêng biệt: (1) 20g/l bã rắn vừa qua tiền xử lý; (2) cellulase 10FIPU cho mỗi gram bã cellulose cịn lại trong dung dịch; (3) 1g/l nấm men tính dựa trên khối lượng khơ, (4) thêm thành phần dinh dưỡng cho nấm men. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 43 Bảng 2-5 Ảnh hưởng của việc thêm các thành phần mới vào dịch thủy phân và lên men đồng thời lúc 80 giờ Các thành phần thêm vào Nồng độ ethanol (g/l) Điều chỉnh Cơ chất (20g/l) Enzyme 10 IFPU/g Nấm men 1g/l Mơi trường dinh dưỡng Trước khi thêm vào 10.95 9.17 9.95 10.28 10.14 6h sau khi thêm 10.95 10.64 10.00 10.93 10.26 % thay đổi 0.0 16.0 0.5 6.3 1.2 Kết quả cho thấy chỉ cĩ thêm nguồn nguyên liệu mới mới tạo sự thay đổi khác biệt nhất lên hiệu suất tồn quá trình 16%. Kết quả này cho thấy enzyme vẫn giữ được hoạt tính ngay cả sau 80 giờ trong quá trình SSF, vấn đề nằm ở chỗ lượng cellulose cịn lại trong dung dịch. Enzyme khơng thể tiếp cận các cellulose này làm cho enzyme khơng thể tiếp tục quá trình thủy phân. Trong quá trình này, khi mà khơng cĩ glucose được sinh ra, nấm men sẽ thiếu chất dinh dưỡng và cĩ thể chết. Khi cellulose mới được thêm vào ở 80h, nấm men ngay lập tức tiêu thụ glucose tạo thành và tạo ra ethanol, điều này cho thấy nấm men vẫn duy trì quá trình sinh tổng hợp của mình ngay cả khi lượng glucose trong dung dịch giảm. Nghiên cứu này chỉ ra rằng sự chuyển hĩa cellulose thành glucose bao gồm hai giai đoạn chính (1) giai đoạn ban đầu (thời gian ngắn) sự lên men glucose là bước quyết định tốc độ phản ứng vì lượng nấm men trong giai đoạn ban đầu này ít; (2) giai đoạn tiếp theo dài hơn, trong giai đoạn này, quá trình thủy phân là quá trình quyết định tốc độ phản ứng, lúc này khả năng tiếp cận của enzyme với cơ chất trở nên quan trọng. Bằng cách cho nhiều nấm men ban đầu sẽ rút ngắn được giai đoạn một, tuy nhiên sẽ khĩ khăn hơn nếu muốn giải cải thiện giai đoạn sau, cụ thể là quá trình tiền xử lý phải tạo khả năng tiếp cận với cellulose tốt. Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 44 2.3 SƠ LƯỢC VỀ BIOFUEL VÀ ETHANOL NHIÊN LIỆU 2.3.1 Biofuel Nhiên liệu sinh học (cịn được gọi là nhiên liệu từ nơng nghiệp – agrofuel) theo định nghĩa rộng là những nhiên liệu rắn, lỏng hay khí được chuyển hĩa từ sinh khối. Tuy nhiên, phần này chỉ đề cập chính đến nhiên liệu sinh học dạng lỏng được sản xuất từ sinh khối. Nĩi chung, nhiên liệu sinh học mang lại những lợi ích sau: giảm khí thải nhà kính, giảm gánh nặng lên nhiên liệu hĩa thạch, tăng sự an tồn về năng lượng quốc gia, gĩp phần phát triển nơng thơn và là một nguồn năng lượng bền vững trong tương lai. Ngược lại, nhiên liệu sinh học cũng cĩ một số hạn chế: nguồn nguyên liệu phải được tái tạo nhanh, cơng nghệ sản xuất phải được thiết kế và tiến hành sao cho cung cấp lượng nhiên liệu lớn nhất với giá thấp nhất và mang lại lợi ích về mơi trường nhất. Nhiên liệu sinh học và những dạng nhiên liệu tái tạo khác nhắm đến tính chất trung tính về carbon. Điều này cĩ nghĩa là carbon được thải ra trong quá trình đốt cháy nhiên liệu để cung cấp năng lượng vận chuyển hay sinh điện năng được tái hấp thụ và cân bằng với lượng carbon hấp thụ bởi cây cối. Những cây này sau đĩ lại được thu hoạch để tiếp tục sản xuất nhiên liệu. Những nhiên liệu trung tính về carbon khơng gây ra sự tăng carbon trong khí quyển, vì thế khơng gĩp phần vào hiệu ứng trái đất nĩng lên. Sau đây là một số các loại nhiên liệu sinh học thế hệ đầu tiên theo phân loại của tự điển bách khoa tồn thư trực tuyến Wikipedia.org: • Dầu thực vật: dầu thực vật cĩ thể dùng để làm nhiên liệu sử dụng cho rất nhiều những loại động cơ diesel đời cũ, và chỉ ở điều kiện khí hậu ấm áp. Trong đa số trường hợp, dầu thực vật được sử dụng để sản xuất biodiesel. • Biodiesel: được sản xuất từ dầu hoặc chất béo qua quá trình tranesterification và là một chất lỏng giống như diesel từ dầu mỏ. • Bioalcohols: là những rượu được sản xuất từ quá trình lên men sinh học. Bioalcohols phổ biến là ethanol, rồi đến propanol và butanol. • Biogas: biogas được sinh ra từ quá trình tiêu hủy kỵ khí các chất hữu cơ bởi các vi sinh vật kỵ khí. Sản phẩm phụ dạng rắn từ quá trình này cĩ thể được sử dụng làm nhiên liệu hoặc phân bĩn. Biogas chứa chủ yếu là methane. • Nhiên liệu sinh học dạng rắn: ví dụ như: gỗ, than hoặc phân khơ Cũng theo tự điển Wikipedia.org, nhiên liệu sinh học thế hệ thứ 2 bao gồm: Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 45 • BioHydrogen: là khí Hydro được sản xuất từ nguồn nguyên liệu sinh khối. BioHydrogen được dùng trong pin nhiên liệu (fuel cell). • DMF: được sản xuất DMF từ fructose và glucose sử dụng cơng nghệ sinh khối- nhiên liệu lỏng cĩ xúc tác. • Bio-DME: là DME được sản xuất từ biomethanol qua quá trình dehydration cĩ xúc tác, được sử dụng trong động cơ khí nén. • Biomethanol: methanol được sản xuất từ sinh khối, cĩ thể được pha vào dầu đến 10-20% mà khơng làm thay đổi tính chất cơ bản của dầu. Để đảm bảo an ninh năng lượng bảo vệ mơi trường phát triển bền vững, nhiều quốc gia và các tổ chức quốc tế trong vài thập kỉ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng nhiên liệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu hĩa thạch, tiến tới xây dựng ngành “nhiên liệu sạch” ở quốc gia mình. Các nước đã cĩ thành cơng nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học là Brazil, Mỹ, Canada, Mexico, Châu Âu cĩ Anh, Pháp, Đức, Tây Ban Nha, Bỉ, Áo… Châu Á cĩ Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật. Sở dĩ nhiều nước đẩy nhanh chương trình nghi