Luận văn Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin từ hai loại bèo tấm lemna aequinoctialis db1 và spirodela polyrhyza db2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------- TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------- TRẦN THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP CÁC YẾU TỐ ĐIỀU KHIỂN BIỂU HIỆN GEN UBIQUITIN TỪ HAI LOẠI BÈO TẤM LEMNA AEQUINOCTIALIS DB1 VÀ SPIRODELA POLYRHYZA DB2 Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THỊ PHƢƠNG LIÊN Thái Nguyên – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Trần Thị Phương Liên – phòng Công nghệ ADN Ứng dụng – Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Luận văn này được thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen với sự hỗ trợ kinh phí của Đề tài nhánh: “Thiết kế vector tái tổ hợp mang gen H5N1 để chuyển vào bèo tấm” thuộc đề tài: Nghiên cứu tạo giống bèo tấm mang gen kháng nguyên H5N1 phòng chống bệnh cúm ở gia cầm thuộc Chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp 2007-2010. Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học và các thầy cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên , Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và tạo điểu kiện cho tôi học tập và thực hiện luận văn. Tôi xin bày tỏ biết ơn tới toàn thể các cán bộ Phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học , đặc biệt là PGS.TS. Nông Văn Hải – Trưởng phòng Công nghệ ADN Ứng dụng , KS. Hà Hồng Hạnh đã giúp đỡ và chỉ bảo tôi rất tận tình trong suốt thời gian tôi thực tập và thực hiện luận văn vừa qua. Tôi xin chân thành cảm ơn Viện Di truyền Nông nghiệp đã cung cấp nguyên liệu bèo tấm cho luận văn. Cuối cùng , tôi xin dành cho gia đình và bạn bè lòng biết ơn sâu sắc vì sự quan tâm, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận. Học viên Trần Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2009 Tác giả luận văn Trần Thị Kim Dung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên NHƢ̃NG TƢ̀ VIẾT TẮT Amp Ampicilin DNA Deoxyribonucleic acid ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) dNTP Deoxynucleoside triphosphate ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate E. coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid epp Eppendorf EtBr Ethidium bromide IPTG Isopropyl thio-β-D-galactoside kb Kilo base LB Luria – Bertani PCR Polymerase Chain Reaction RNase Ribonuclease RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulphate SHPT Sinh học phân tử TAE Tris – acetate – EDTA X - gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactocide v/p vòng/phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Kích thước gen nhân của một số loài bèo tấm 8 1.2 Thành phần và hàm lượng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo 9 3.1 Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với pJETSpUbipin6 và pJETSpUbipin6R 43 3.2 Các vị trí nucleotide khác biệt giữa La-Ubi-pin (Mỹ) với La-Ubi-10F 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Hoa của Lemna gibba 5 1.2 Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự 5 1.3 Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi ở S. polyrrhiza 6 1.4 Sơ đồ cấu trúc gen điển hình 11 1.5 Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II ở sinh vật nhân chuẩn 12 1.6 Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở thực vật 14 2.1 1. Lemna aequinoctialis DB1; 2. Spirodela polyrrhiza DB2 21 3.1 Điện di DNA tổng số trên gel agarose 0,8% 33 3.2 Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza DB2 (Mỹ) và vị trí các mồi. 34 3.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% 36 3.4 Điện di plasmid trên gel agarose 0,8% 38 3.5 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme 39 3.6 Trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Spirodela polyrrhiza DB2 với dự đoán các vùng chức năng promoter 40 3.7 Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi. 44 3.8 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% 45 3.9 Điện di plasmid trên gel agarose 0,8% 47 3.10 Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme 48 3.11 Trình tự đoạn promoter của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 với dự đoán các vùng chức năng promoter 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Lời cam đoan Những từ viết tắt Danh mục các bảng Danh mục các hình Mục lục Trang MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm 3 1.1.1. Phân bố của bèo tấm 3 1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm 3 1.1.3. Cây phân loại bèo tấm 5 1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm 5 1.1.5. Hệ gen của bèo tấm 7 1.1.6. Giá trị dinh dưỡng 8 1.1.7. Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học 9 1.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật 10 1.2.1. Cấu trúc gen sinh vật 10 1.2.2. Cấu trúc promoter 11 1.2.3. Vai trò biểu hiện gen của promoter 13 1.2.4. Phân loại promoter 13 1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật 15 1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm 17 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới 17 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 19 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 21 2.1. Nguyên liệu 21 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.1. Nguyên liệu thực vật 21 2.1.2. Hóa chất 21 2.1.3. Thiết bị 22 2.2. Phương pháp nghiên cứu 22 2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật 22 2.2.2. Phương pháp điện di DNA trên gel Agarose 24 2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR 24 2.2.4. Các phương pháp sử dụng để tách dòng gen 26 2.2.5. Xác định trình tự gen 30 2.2.6. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm 31 3.2. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài S. polyrhiza 33 3.2.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 33 3.2.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2 33 3.2.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 38 3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 39 3.3. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ở loài L. aequinoctialis 43 3.3.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter 43 3.3.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pCR1.2 44 3.3.3. Xác định đoạn điều khiển biểu hiện gen bằng RE 46 3.3.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter. 48 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Khi con người có cuộc sống định cư, khoảng 8000 năm trước Công nguyên, ở khu vực Tiểu Á và lưu vực sông Nin người ta đã bắt đầu việc trồng trọt truyền thống với mục đích duy trì và cải thiện chất lượng giống cây trồng nhằm thỏa mãn yêu cầu của con người ngày một tốt hơn. Con người đã biết tạo ra giống cây trồng mang các đặc tính mong muốn bằng phương pháp lai tạo giống (lai hữu tính giữa hai dòng cây trồng). Phương pháp này cần nhiều thời gian, công sức và trong nhiều trường hợp cây lai thu được kèm theo cả tính trạng không mong muốn. Ngày nay, công nghệ gen sử dụng các phương pháp hiện đại đã khắc phục được các hạn chế đó. Công nghệ gen cho phép các nhà di truyền và chọn giống thực vật xác định và thiết kế các gen đặc hiệu cho các mục tiêu mong muốn (kể cả các gen có nguồn gốc từ các sinh vật khác loài) rồi chuyển các gen này vào các giống đang sử dụng, tạo ra những giống cây trồng biến đổi gen mang những đặc tính mới đáp ứng yêu cầu của con người và có thể đem lại lợi ích quan trọng như tăng tính chống chịu với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi, tăng năng suất và chất lượng, cải thiện môi trường nhờ giảm lượng thuốc trừ sâu hoá học cần sử dụng. Công nghệ gen thực vật còn mở ra một khả năng mới là sử dụng thực vật như một nhà máy sản xuất các loại thuốc cần thiết cho con người như vitamin, enzyme, kháng thể, vacxin và các loại thuốc chữa bệnh khác [3]. Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật, bên cạnh những gen có giá trị mã hoá cho các tính trạng mong muốn, các promoter cần thiết cho sự biểu hiện của các gen cũng nhận được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu công nghệ gen thực vật. Promoter là thành phần quan trọng trong cấu trúc của tất cả các gen, khởi đầu cho sự phiên mã, đóng vai trò then chốt trong việc biểu hiện gen. Việc phân lập các promoter biểu hiện gen hữu hiệu trên cây trồng, đặc biệt là promoter đặc hiệu cho từng loại cây, biểu hiện trong các loại mô tế bào khác nhau ngày càng được quan tâm đến. Nhiều promoter từ các gen ở thực vật được phân lập trong số đó phải kể đến promoter ubiquitin gen ngô, promoter gen rbcS (ribulose – 1,5-bisphosphate carboxylase small subunit), promoter của gen mã hóa sucrose synthase...[4]. Ubiquitin - protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) với phân tử lượng nhỏ, có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 mặt trong mọi tế bào ở tất cả các giai đoạn sinh trưởng, protein này tham gia vào quá trình phân giải polypeptide trong tế bào chất, đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào và chuyển hóa các chất trong tế bào. Promoter của Ubiquitin gen từ cây ngô được sử dụng rộng rãi trong công nghệ gen thực vật [22], [41], [53]. Bèo tấm là cây một lá mầm nhỏ nhất, có hàm lượng protein và polysaccharide cao. Với đặc thù cấu trúc và quá trình trao đổi chất, bèo tấm được sử dụng trong công nghệ gen thực vật như nhà máy sản xuất protein tái tổ hợp. Một số promoter bèo tấm đã được phân lập như promoter của các gen SSU5A, SSU5B, promoter của gen NPR1 (negatively phytochrome regulated1)... có phản ứng với điều kiện chiếu sáng hoặc cảm ứng ABA trong các nghiên cứu về quá trình quang hợp ở cây [18], [61]. Để tăng cường hiệu quả chuyển gen, ngoài sử dụng promoter truyền thống như promoter 35S CAMV, promoter Ubiquitin từ loài bèo tấm Lemna minor đã phân lập, nghiên cứu và hoàn thiện ở Mỹ, đã được đánh giá có hiệu quả cao hơn và đăng ký thành patent [24]. Ở Việt nam có 3 loài bèo tấm được phát hiện thấy là Lemna aequinoctialis, Spirodela polyrrhiza và Wolffia globosa ở nhiều vùng khác nhau Nhằm mục đích nghiên cứu phân lập promoter đặc hiệu từ các loài bèo tấm Việt Nam phục vụ cho việc thiết kế tiếp theo các vector mang những gen đem lại lợi ích cho con người để chuyển vào bèo tấm, chúng tôi xin đăng ký thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phân lập các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2” với các nội dung chính sau đây: 1. Hoàn thiện các phương pháp tách DNA tổng số từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2; 2. Nghiên cứu thiết kế các mồi đặc hiệu và nhân đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2 bằng PCR; 3. Tách dòng và xác định trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen đặc hiệu từ hai loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và Spirodela polyrrhiza DB2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu chung về cây bèo tấm 1.1.1. Phân bố của bèo tấm Bèo tấm với tên khoa học Lemnaceae là loài sinh vật thủy sinh có khả năng tồn tại và phát triển ở nhiều nơi trên thế giới, trừ những vùng cực bắc và cực nam quanh năm giá lạnh. Ở vùng sa mạc và vùng ẩm ướt thì sự có mặt của bèo tấm cũng ít hơn. Trong các chi thuộc loài bèo tấm thì 3 chi (Spirodela, Lemna, Wolffia) được phân bố khắp thế giới, trong khi đó Wolffia ít tìm thấy ở châu Mỹ và châu Phi. Spirodela có tâm phân bố ở Nam Mỹ. Chi Lemna có tính đa dạng cao nhất ở Bắc Mỹ và Đông Nam Á. Wolffiella phân bố chủ yếu ở vùng ven nhiệt đới của châu Mỹ và châu Phi. Wolffia tồn tại chủ yếu ở châu Mỹ, Đông Nam Á và châu Úc. Lemna aequinoctialis được phân bố rộng rãi ở các vùng có khí hậu ấm áp trên thế giới. Cùng với nghề trồng lúa nước, chúng có mặt rộng rãi ở nhiều vùng khác nhau như: Nam Âu, vùng trung tâm Bắc Mỹ, Bắc Trung Quốc, Bắc Nhật Bản…[36]. Ở Việt Nam, đã phát hiện thấy có 3 loài bèo tấm thuộc 3 chi khác nhau (Spirodela, Lemna, Wolffia) đó là loài L. aequinoctialli, S. polyrrhiza và W. globosa [36]. Hiện nay, các loài bèo này phân bố khá phổ biến trên các vùng mặt nước, ao hồ đồng ruộng và tập trung nhiều ở khu vực đồng bằng Bắc Bộ và Nam bộ [7], [36]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái bèo tấm Lemnaceae thuộc nhóm cây một lá mầm nhỏ nhất phần lớn có cả lá, rễ, hoa, quả, những cây trưởng thành không có thân cây. Lá (cánh bèo) có kích thước khác nhau phụ thuộc vào từng chi, từng loài. 1.1.2.1. Đặc điểm cánh bèo Dạng thân giống lá của các loài Lemnaceae được gọi là “frond” (cánh bèo), là một tập hợp của các mô có sự biệt hóa hạn chế. Mức độ tổ chức của mô cánh bèo trong họ Lemnaceae giảm từ Spirodela tới Lemna, Wolffiella và Wolffia [36]. Cánh bèo không ở dạng phẳng mà tồn tại các u lồi đặc trưng trên đó có định vị các gân lá, cây trưởng thành thường có từ 4-7 gân lá trong khi các cây non chỉ có 3 gân lá. Đa số bèo tấm có cánh mỏng giống lá. Một số loài có cánh không dẹt do có xoang khí Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 lớn. Cánh bèo có hình ô van (hoặc tròn) dài tới 1,5 cm và rộng tới 1 cm (S. polyrrhiza, L. trisulca). Loài nhỏ nhất có cánh đạt kích thước 3 mm ở điều kiện tối ưu. Ở điều kiện thường có thể nhỏ hơn 1 mm (Wolffia). Kích thước và hình dạng của cánh bèo phụ thuộc nhiều vào các điều kiện bên ngoài và kiểu gen của chúng. Các yếu tố ngoại cảnh này bao gồm: ánh sáng, hàm lượng đường, hàm lượng nitơ, phospho, kali, canxi và magie, nhiệt độ…[36]. 1.1.2.2. Đặc điểm rễ bèo Kích thước và số lượng rễ trên 1 cánh bèo ở các loài bèo tấm không giống nhau và phụ thuộc vào từng loài [36]. Đa số các loài thuộc họ Lemna chỉ có một rễ, S. polyrrhiza có từ 7-12 rễ hoặc nhiều hơn và có thể dài đến 10 mm, Landoltia có 2- 3 rễ và có thể lên đến 5 rễ với chiều dài tối đa có thể đạt được là 6 mm. Ngoại trừ điều kiện khắc nghiệt, trong điều kiện thiếu nitơ, phosphate hay các chất khoáng, rễ sẽ dài hơn. Trong khi đó, trong môi trường dinh dưỡng thuận lợi, rễ ngắn hơn và thậm chí có loại không hình thành rễ. Cấu trúc rễ của bèo tấm cũng hết sức đơn giản, không có các rễ con và không phản ánh sự tăng trưởng cũng như sự tạo nhánh. Vì lẽ đó, rễ của bèo tấm rất mảnh và nhỏ. Cũng giống như các loại rễ phổ biến khác, rễ bèo tấm có cấu tạo gồm 4 phần chính: Đỉnh rễ, vùng mô phân sinh, vùng kéo dài, và vùng các tế bào thuần thục. 1.1.2.3. Hoa và quả bèo Hoa của các loài bèo tấm đã được nghiên cứu tương đối kĩ. Chúng thường hình thành và tồn tại trong thời gian ngắn và hiếm khi được quan sát thấy. Hoa của các loài bèo có thể hình thành trong thời gian ngắn hay dài khác nhau tuỳ thuộc vào loài. Mỗi hoa thường có 2 nhị hoa và 1 vòi nhụy hoa duy nhất. Các nhụy hoa thường ngắn và khó quan sát hơn. Quả của bèo tấm đa phần là nhỏ, có lớp vỏ ngoài khô, một số trong đó có thể được quan sát thấy bằng mắt thường. Quả bèo thường có dạng như một túi có răng cưa, đôi khi có dạng dọc hơi phẳng, và thường chứa từ 1-6 hạt [36]. Hình 1.1 thể hiện một số đặc điểm của hoa bèo tấm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Hình 1.1. Hoa của Lemna gibba 1.1.3. Cây phân loại bèo tấm Hình 1.2. Cây phân loại bèo tấm theo Landolt và cộng sự Theo Landolt, bèo tấm thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp Liliopsida, bộ Arales, họ Lemnaceae gồm các chi Lemna, Spirodela, Wolffia, Woffiela với trên 40 loài khác nhau [36]. Ông đã phân loại bèo tấm dựa trên số rễ và kích thước của cánh bèo: Lemna (1 rễ); Spirodela (7-12) rễ; cánh bèo từ 10 mm trở lên); Landoltia (2-3 rễ, cánh bèo 3-6 mm); Wolffia (không có rễ, cánh bèo 0,6-1,2 mm)… Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Năm 2002, Les và cộng sự đã dựa trên đặc điểm về hình thái nhiễm sắc thể và vi phân tử (DNA của nhân và lục lạp) đề ra giả thiết về cây phân loại của bèo tấm gồm 5 chi tức là có thêm một chi mới là Landoltia [38]. Một số nghiên cứu gần đây của Rothwell và cộng sự, dựa trên sự so sánh trình tự đoạn intron tRNALeu UAA (trnL) và tRNAPhe UAA (trnF) của bộ gen lục lạp đã xác định rằng họ Lemnaceae và Pisita cùng thuộc họ ráy Araceae [48]. Hình 1.2 biểu thị cây phân loại bèo tấm [37]. 1.1.4. Hình thức sinh sản của bèo tấm Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để duy trì nòi giống: Sinh sản hữu tính và sinh sản vô tính. Sinh sản vô tính chiếm ưu thế so với sinh sản hữu tính. Hình thức sinh sản hữu tính của bèo tấm chỉ xảy ra khi chúng gặp điều kiện bất lợi để bảo tồn nòi giống [36], [37]. 1.1.4.1. Sinh sản vô tính Bèo tấm sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi từ vùng đỉnh phân sinh nằm trong xoang ở vùng gốc cánh. Hình 1.3 thể hiện quá trình sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi của S. polyrrhiza. Hình 1.3. Sinh sản vô tính bằng hình thức nảy chồi ở S. polyrrhiza Ở điều kiện tối ưu, tốc độ sinh sản vô tính của bèo tấm gần đạt mức tăng theo hàm số mũ. Lượng cánh bèo có thể tăng gấp đôi chỉ sau 24 giờ nuôi cấy ở các loài sinh trưởng nhanh như L. aequinoctialis, W. microscopica. Với hình thức sinh sản vô tính thì thời gian một vòng đời của cánh bèo chỉ vài tuần. Theo nhiều tác giả cho biết, vòng đời của một cánh bèo phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi, ở 30oC vòng đời giảm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 một nửa so với ở 20oC. Trong giai đoạn ngủ, nghỉ và ở nhiệt độ thấp, cánh bèo có thể tồn tại trong vài tháng. Điều kiện dinh dưỡng cũng có ảnh hưởng đến vòng đời của cánh bèo. Sự thiếu hụt các chất dinh dưỡng có thể làm cánh bèo già hoá nhanh và chết chỉ sau 1 đến 2 tuần. Có thể nói, vòng đời sẽ dài hơn khi tốc độ nhân lên của cánh bèo nhỏ. Khi nồng độ dinh dưỡng giảm dưới ngưỡng tối thiểu thì cánh bèo bị tổn thương và chết nhanh hơn bình thường [36]. 1.1.4.2. Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính được thực hiện thông qua sự ra hoa và tạo hạt tương tự như các loài thực vật hạt kín khác. Với kích thước cánh bèo, hoa và hạt nhỏ bé, bèo tấm được coi là loài thực vật hạt kín nhỏ bé nhất trong giới thực vật. Sinh sản hữu tính ở bèo tấm bao gồm 2 giai đoạn: (i) Ra hoa và (ii) Tạo quả và hạt. * Giai đoạn ra hoa: Cơ quan ra hoa ở bèo tấm L. aequinoctialis gồm các thành phần: 1 lá bắc, 2 nhị hoa, 1 nhụy hoa. Ở Spirodela và Lemna, các cơ quan của hoa phát sinh trong xoang phát sinh cánh con. Ở Wolffiella và Wolffia, hoa phát sinh trong 1 xoang ở bề mặt trên của cánh bèo và không ở cung xoang phát sinh cánh con. Hoa của Wolffia nằm dọc theo đường trung tâm cánh. Hoa của Wolffiella nằm ở cạnh đường trung tâm của cánh [36]. * Giai đoạn tạo quả và hạt: Sau khoảng thời gian từ 2 đến 5 tuần tính từ lúc thụ tinh thì quả chín. Mỗi quả có lá bao khô và thường có 1 - 6 hạt. Ở hầu hết các loài, quả gần như đối xứng ngoại trừ L. valdiviana và L. perpusilla. Quả thường dài từ 0,35 mm đến 2,75 mm. Hạt bèo tấm có dạng hình trứng với 1 vảy đen ở đỉnh. Khi quả có nhiều hơn 1 hạt thì quả có thể ở dạng hình trứng hoặc tam giác. Kích thước hạt biến đổi trong cùng một loài và giữa các loài từ 0,3 – 2 mm về chiều dài và 0,2 – 0,8 mm về đường kính. Hạt có vỏ hạt ngoài và vỏ hạt trong, nội nhũ và phôi. Vỏ ngoài gồm 2 – 11 lớp tế bào của biểu bì ngoài, ở đỉnh có nhiều lớp tế bào hơn ở giữa và cuối hạt [36]. 1.1.5. Hệ gen của bèo tấm Các nghiên cứu đối với hệ gen bèo tấm được tiến hành từ đầu những năm 80 của thế kỷ trước cho đến ngày nay. Các kết quả cho thấy, bộ gen bèo tấm giống với bộ gen của thực vật nói chung, bao gồm gen nhân và gen ngoài nhân. Bộ gen của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 bèo tấm có kích thước rất nhỏ, (lượng DNA trên 01 nhiễm sắc thể: 1C=0,6 pg DNA) trong khi đó ở các loài thực vật khác như Triticum monococcum bộ gen lớn hơn nhiều (1C=6,23 pg) [54]. Kích thước gen nhân của các loài bèo tấm là khác nhau, nhỏ nhất ở Spirodela và lớn nhất ở Wolffia. Số lượng nhiễm sắc thể ở các loài khác nhau cũng rất khác nhau từ 2n = 16 đến 2n = 126. Kích thước bộ gen của một số loài bèo tấm so với các loài đối chứng được liệt kê trên bảng 1.1 [36]. Bảng 1.1. Kích thƣớc gen nhân của một số loài bèo tấm Loài 2n pg DNA pg DNA / 1 C pg DNA / chromsome Spirodela polyrrhiza 7110 80 1.19 / 8C 0.15 0.015 Spirodela punctata 7461 46 1.48 / 4C 0.37 0.032 Lemna minor 7115 126 5.82 / 12C 0.49 0.046 Wolffiella oblonga 79 (7166) 42 3.02 / 4C 0.76 0.072 Wolffia arrhiza 7347 42 6.53 / 4C 1.63 0.155 Gen ngoài nhân của bèo tấm bao gồm gen lục lạp và gen ty thể. Gen lục lạp (cpDNA) của bèo tấm là đối tượng được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Tháng 5 năm 2008, bộ gen lục lạp của Lemna minor đã giải trình tự hoàn chỉnh. Bộ gen lục lạp có cấu trúc mạch vòng bao gồm 165 955 bp mã hóa cho 112 gen (78 gen mã hóa protein, 30 tRNA gen và 4 rRNA gen [42]. 1.1.6. Giá trị dinh dƣỡng Bèo tấm có chứa các chất dinh dưỡng với sự đa dạng về cả thành phần và hàm lượng. Sinh khối bèo tấm có chứa các vitamin A, B1, B2… và các amino acid không thay thế trừ methionine. Bèo tấm nuôi ở điều kiện tối ưu là một trong số các loài thực vật cho hàm lượng protein tổng số đạt giá trị cao nhất. Hầu hết các loài bèo tấm có hàm lượng protein đạt từ 6,8 – 45% phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện nuôi cấy [37]. Trong thời gian gần đây, đã có các nghiên cứu sử dụng bèo tấm như là hệ thống sinh tổng hợp các chất thứ cấp, các sản phẩm mang lợi ích cho người dân, các protein với hàm lượng lớn và hoạt tính sinh học cao…[38]. Các yếu tố ảnh hưởng tới hàm lượng protein trong cánh bèo gồm có: ánh sáng, nhiệt độ, thành phần và hàm lượng khoáng chất trong môi trường nuôi (đặc biệt là nitơ). Thành phần và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 hàm lượng các chất dinh dưỡng và các thành phần hữu cơ khác của bèo tấm được liệt kê ở bảng 1.2. Bảng 1.2. Thành phần và hàm lƣợng các hợp chất hữu cơ có trong cánh bèo Thành phần Hàm lượng (% trọng lượng chất khô) Proteins 6,8 – 45 Lipid 1,8 – 9,2 Sợi thô 5,7 – 16,2 Đường 14,1 – 43,6 Tro 12,0 – 27,6 1.1.7. Tiềm năng sử dụng bèo tấm trong công nghệ sinh học Một trong những mục đích chủ yếu của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ DNA tái tổ hợp là tạo ra các sản phẩm chuyển gen có giá trị thương mại cao. Để có thể tiến hành ứng dụng công nghệ sinh học trong quy mô sản xuất lớn, một đòi hỏi cấp thiết là cần phải có hệ thống tái sinh tốt với khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh, ổn định [13]. Cho đến nay, các nhà công nghệ sinh học phân tử đã và đang sử dụng nhiều hệ thống sinh học bao gồm: vi khuẩn, nấm, các dòng tế bào côn trùng, thực vật, động vật có vú, virus của côn trùng, của thực vật, các sinh vật đa bào…Việc lựa chọn hệ thống sinh học phụ thuộc phần lớn vào sản lượng và chất lượng thương phẩm. Hệ thống sinh học từ vi khuẩn có khả năng tạo ra protein với hàm lượng cao nhưng hoạt tính của các protein thu được có một số hạn chế nhất định. Các tế bào động vật bậc cao có khả năng cải biến tốt các protein sau dịch mã nhưng lại tiềm ẩn các tác nhân gây bệnh có nguồn gốc virus do chúng là ký chủ cho nhiều loại virus gây bệnh cho người và gia súc. Do đó nhiệm vụ của các nhà sinh học phân tử là tìm ra được các hệ thống sản xuất protein khác đảm bảo các yêu cầu: rẻ tiền, dễ sử dụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus. Hệ thống đó là thực vật. So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trong việc sản xuất protein tái tổ hợp. Trước hết phải kể đến khả năng glycoside hóa các protein, bởi các glycoprotein là nhóm protein có vai trò quan trọng trong các phản ứng miễn dịch. Lợi thế thứ hai là protein tạo thành từ thực vật tương đối an toàn so với protein có nguồn gốc động vật bậc cao. Thứ ba là lợi thế về giá thành, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 thực vật có thể trồng trên diện tích lớn với chi phí tối thiểu về phân bón, công chăm sóc và nguyên liệu đầu vào. Trong các loài thực vật được nghiên cứu để làm hệ thống tái sinh, các loài thuộc họ bèo tấm đang được đặc biệt quan tâm với vòng đời ngắn và khả năng tăng sinh khối nhanh. Bèo tấm có tốc độ sinh sản rất nhanh, nhân đôi trọng lượng trong vòng 24 – 72 giờ. Một số giống bèo tấm có tốc độ tăng sinh khối cao hơn hẳn so với các loài thực vật khác. Đối với cây ngô, từ 1 g chất khô ban đầu, sau một tuần không thể tạo ra lượng chất khô lớn hơn 2,3 kg. Trong khi đó một số loài bèo tấm lại có thể tạo ra 64 g chất khô từ 1 g chất khô ban đầu sau 1 tuần [31], [50]. Mặt khác hàm lượng các chất dinh dưỡng của bèo tấm rất cao với sự đa dạng về thành phần các vitamin (A, B1, B2…), các amino acid không thay thế. Riêng protein của bèo tấm có thể đạt từ 6,8 – 45 % trọng lượng khô tuỳ theo loài [36], tức là tỷ lệ tương đương với đậu tương. Theo tính toán, chỉ cần 1 - 3 % tổng số protein nói trên có hoạt tính sinh học quan tâm là đủ để bèo tấm được coi là hệ thống tái sinh hiệu quả. Do những ưu điểm đó, trong những năm gần đây, đã có nhiều nghiên cứu chuyển gen để sản xuất các hoạt chất sinh học từ bèo tấm. Các nhà khoa học Mỹ, Israel, Pháp đã sử dụng các loài Lemna để chuyển các gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất các hoạt chất sinh học khác nhau trong đó có vacine. Quy trình chuyển gen vào bèo tấm cũng tương tự như quy trình biến nạp gen ở một số loài thực vật khác, tức là phải tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, tạo callus, sau đó tái sinh callus đã chuyển gen thành cây hoàn chỉnh. Ngoài ra, các loài thuộc họ bèo tấm còn có khả năng chuyển gen sử dụng nguyên cây mà không cần nuôi cấy mô và vật liệu vô trùng. Tháng 10 năm 2004, chính phủ Pháp đã tài trợ để thành lập công ty Lemnagene nhằm mục đích nghiên cứu ứng dụng bèo tấm đối với công nghệ sinh học [68]. 1.2. Promoter và ứng dụng trong công nghệ gen thực vật 1.2.1 Cấu trúc gen sinh vật Gen là một đoạn phân tử DNA, RNA, mang thông tin di truyền xác định cấu trúc của một chuỗi polypeptide hoặc một phân tử RNA nhất định. Một gen có cấu trúc điển hình gồm ba vùng chính: Vùng điều khiển, vùng mang mã di truyền và Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 vùng kết thúc. Vùng điều khiển có một số trình tự đặc hiệu điều khiển hoạt động gen. Vùng mang mã chứa các thông tin di truyền, được phiên mã sang RNA thông tin (mRNA), gen cấu trúc có thể được dịch mã tạo ra sản phẩm là các protein. Vùng kết thúc mang trình tự phân biệt giữa các gen, và các trình tự kết thúc quá trình phiên mã. Cấu trúc gen còn bao gồm một số cấu trúc đặc thù nằm ở phía trước, phía sau hoặc trong gen như các trình tự điều hòa, vùng tăng cường (enhanor), vùng bất hoạt (silencer), vùng đệm (spacer)… [39]. Hình 1.4 là sơ đồ cấu trúc 1 gen điển hình. Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc gen điển hình 1.2.2 Cấu trúc promoter Gen cấu trúc có thể biểu hiện được thành protein cần sự có mặt của các trình tự điều khiển thích hợp nằm ở những vị trí nhất định. Trình tự tham gia tích cực vào quá trình điều khiển biểu hiện gen là trình tự khởi động (promoter). Promoter bao gồm trình tự nucleotide nằm ngược phía trên đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã gen (transcription start site – TSS), đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen như enzyme RNA polymerase, các nhân tố phiên mã (transcription factor – TF). Tùy thuộc vào khoảng cách từ TSS, các thuật ngữ “promoter gần” hay “promoter tối thiểu” (khoảng vài trăm nucleotide quanh vùng TSS) (proximal promoter hay minimal promoter ) và “promoter xa” (hàng nghìn nucleotide ở phía trên TSS) (distal promoter) có thể được sử dụng. Cả hai loại promoter gần và xa đều chứa rất nhiều yếu tố tham gia vào quy trình phức tạp của các nhân tố điều hòa phiên mã đặc hiệu tế bào, mô, cơ quan, giai đoạn phát triển và môi trường [3], [53]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Hình 1.5. Sơ đồ cấu tạo promoter nhóm II ở sinh vật nhân chuẩn [69] Về mặt cấu trúc, promoter có tổ chức phức tạp và chứa rất nhiều yếu tố đặc trưng có chức năng bám/gắn với các nhân tố protein tham gia vào quá trình phiên mã gen. Các nhân tố điều hòa (regulatory elements) nằm trên promoter và cùng một sợi với vùng mang mã của gen được gọi các nhân tố Cis (cis elements) [16]. Mỗi yếu tố được đặt tên dựa trên cơ sở trình tự nucleotide của chúng. Yếu tố cis cơ bản nhất là hộp TATA (TATA box), được tìm thấy ở hầu hết các gen sinh vật nhân chuẩn, nằm ở vị trí -30 (nằm về phía trước vị trí khởi đầu phiên mã (vị trí +1) 1 đoạn 30 nucleotide). Ở sinh vật nhân sơ, hộp TATA thường nằm ở quanh vị trí -10. Ở sinh vật nhân chuẩn có các nhóm promoter tương ứng với ba loại enzyme RNA polymerase I, II và III. Promoter nhóm II bao gồm các promoter của các gen hoạt hoá cho sự phiên mã mRNA và một số loại small RNA, U1, U2, U3… Cấu tạo promoter nhóm II có bốn thành phần: Tâm promoter, trình tự UP (upstream element), trình tự khởi đầu Inr, trình tự dowstream element (DE). Tâm promoter gồm các hộp TATA có vị trí từ -35 đến -25. Hộp TATA giúp RNA polymerase nhóm II nhận biết và gắn chính xác vào vị trí khởi đầu phiên mã. Trình tự UP ở vị trí trước TATA khoảng 25 bp, có chứa nhiều cặp G - C (hộp G - C) và trình tự CCAAT (hộp CAT) là vị trí tiếp xúc đầu tiên của RNA polymerase. Trình tự Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 dowstream element (DE) ở vị trí khoảng 27 - 34 sau hộp TATA. Trình tự khởi đầu (initiator - Inr) nằm giữa hộp TATA và trình tự DE. 1.2.3 Vai trò biểu hiện gen của promoter Quá trình biểu hiện của một gen cấu trúc bao gồm: giai đoạn phiên mã, giai đoạn dịch mã và giai đoạn cải biến sau dịch mã. Quá trình phiên mã (giai đoạn sơ khai đầu tiên để biểu hiện một gen thành protein), chịu sự điều khiển của nhiều yếu tố: promoter, các nhân tố phiên mã, các trình tự tăng cường, trình tự kết thúc… [60]. Trong đó, đoạn promoter đóng vai trò chính trong quá trình biểu hiện gen. Về cơ bản, promoter đóng vai trò như một công tắc đóng mở gen. Tất cả các gen đều cần có promoter để khởi động quá trình biểu hiện. Promoter có rất nhiều module khác nhau hoạt động như các cảm biến (sensor) và cho phép chúng có thể phản ứng theo những cách mà đến nay chúng ta cũng chưa hoàn toàn hiểu rõ, đối với những tín hiệu khác nhau từ những gen khác hoặc từ môi trường, định rõ khi nào thì khởi động và khởi động ở đâu với cường độ và thời gian như thế nào. Trong những điều kiện nhất định, promoter có thể không hoạt động và khi đó thì gen hoàn toàn không được khởi động. Nói chung, đối với một gen bình thường trong một sinh vật, vai trò của promoter là cho phép gen hoạt động đúng trong các chu trình điều hoà hết sức phức tạp. Promoter liên quan đến các gen thuộc từng sinh vật được thích ứng với gen đó trong khi toàn bộ các gen của sinh vật được thích ứng để tồn tại và hoạt động cùng nhau qua hàng triệu hay hàng trăm triệu năm. 1.2.4. Phân loại promoter Promoter có thể được chia làm hai loại chính: Promoter không đặc hiệu hay promoter cơ định (constituve promoter) và promoter đặc hiệu với các yếu tố cis chuyên biệt (specific promoter) [3]. 1.2.4.1. Prompter cơ định Promoter cơ định tham gia điều khiển quá trình biểu hiện gen ở hầu hết các loại mô khác nhau trong nhiều giai đoạn phát triển của sinh vật. CaMV35S promoter điều khiển sự biểu hiện của RNA 35S được phân lập từ virus khảm súp lơ (cauliflower mosaic virus – CaMV) là một ví dụ điển hình của loại promoter này. Promoter này có cấu tạo gồm 3 bộ phận chính: Vùng trung tâm (hộp TATA có vị trí Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 từ - 46 đến + 8) hai đoạn trình tự tăng cường (enhanor). Trong thời gian gần đây, vai trò của các vùng khác nhau trên CaMV35S promoter trong việc gây bệnh của CaMV đã được nghiên cứu [44]. Trong hệ thống các promoter cơ định, promoter ubiquitin đóng một vai trò hết sức quan trọng. Năm 1992, Christensen và cộng sự đã phát hiện ra 8 đến 10 locus mã hoá cho ubiquitin ở cây ngô. Cả hai gen đặc tính Ubi-1 và Ubi-2 đều chứa một khung đọc mở bao gồm 1599 bp sắp xếp thành 7 chuỗi liên tiếp từ đầu đến cuối với đoạn lặp lại có chiều dài 228 bp [22], [43]. Vùng điều chỉnh (regulatory region) là vùng điều điều khiển quá trình biểu hiện gen Ubi-1 ở cây ngô là đoạn trình tự bắt đầu từ vị trí -899 bp từ đầu 5’ của vị trí khởi đầu phiên mã đến vị trí 1093 bp đầu 3’ của vị trí khởi đầu phiên mã. Trình tự vùng điều chỉnh có kích thước khoảng 2 kb bao gồm:  Hộp TATA nằm ở vị trí -30 về đầu 5’ so với vị trí khởi đầu phiên mã  Hai đoạn trình tự trùng khớp (overlaping sequence) có liên quan đến các yếu tố sốc nhiệt nằm ở vị trí -214 đến -204 so với vị trí khởi đầu phiên mã. Nhân tố sốc nhiệt của vùng điều chỉnh làm tăng khả năng biểu hiện của ubiquitin trong quá trình chống chịu lại với nhiệt độ  Một đoạn trình tự exon không phiên mã có kích thước 83 bp nằm liền kề với vị trí khởi đầu phiên mã  Một đoạn trình tự intron kích thước khoảng 1 kb kéo dài từ vị trí +84 đến vị trí +1093. Hình 1.6. Cấu trúc hệ thống điều khiển Ubiquitin ở thực vật Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 1.2.4.2. Promoter đặc hiệu Sự biểu hiện đặc hiệu là sự biểu hiện các sản phẩm của gen giới hạn ở một hoặc một vài mô hay một vài giai đoạn phát triển. Cần nhấn mạnh rằng không có một promoter hoàn toàn đặc hiệu: các promoter hoạt động bình thường ở một số mô nhất định trong khi ở các mô khác thì không hoặc chỉ hoạt động yếu (sự biểu hiện yếu). Trong số các promoter đặc hiệu, có nhóm promoter biểu hiện đặc hiệu mô (tissue specific promoter), biểu hiện đặc hiệu về thời gian, biểu hiện cảm ứng với môi trường (environmentally inducible promoter). * Promoter đặc hiệu mô Promoter đặc hiệu mô là những promoter chỉ điều khiển biểu hiện gen ở những mô đặc hiệu, ví dụ promoter đặc hiệu bó mạch ở thực vật thì điều khiển biểu hiện gen ở bó mạch. Promoter này chứa các trình tự đặc trưng của một promoter như hộp TATA, hộp CCAAT… và các trình tự đặc hiệu quyết định sự biểu hiện gen đặc hiệu bó mạch như hôp ASL, hộp GATA…[66]. Thuộc nhóm promoter này, promoter điều khiển biểu hiện gen mã hoá sucrose synthase đặc hiệu ở bó mạch được biết đến rộng rãi nhất . * Promoter đặc hiệu cảm ứng Trong điều kiện stress (khô hạn, nhiệt độ khắc nghiệt, oxy hoá cao…), các gen chống chịu thường biểu hiện với tốc độ nhanh. Do đó, vấn đề khởi động sự phiên mã cũng như cấu trúc promoter của chúng và các protein tham gia vào việc điều khiển biểu hiện gen được đặc biệt chú ý. Promoter điều khiển biểu hiện gen chống chịu có trình tự đặc trưng nGAAn gọi là HSE (heat shock element). Khi nhân tố phiên mã HSF (heat shock transcription factor) – protein nội bào nhận biết được HSE chúng sẽ hoạt hóa promoter để biểu hiện gen HS [8]. Promoter điều khiển biểu hiện gen rbcS (ribulose – 1,5 – bisphosphate carboxylase small subunit) cảm ứng ánh sáng ở nhóm cây hai lá mầm, chứa trên 30 vùng trình tự bảo thủ trong đó những vùng cảm ứng ánh sáng là hộp G, hộp I, GT – 1 (hộp II)… Hộp G có trình tự đặc trưng là CACGTG, hộp I có trình tự nhận biết là GATAAGR và trình tự ngược chiều của nó – YCTATC cũng được chú ý đặc biệt. Đột biến xảy ra tại vùng này làm giảm rõ rệt mức độ biểu hiện của gen rbcS khi có ánh sáng [63]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 1.2.5. Ứng dụng promoter trong công nghệ gen thực vật Promoter đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển gen nói chung và chuyển gen ở thực vật nói riêng. Việc chuyển nạp gen ở các giống cây có ý nghĩa kinh tế thường rất khó vì vậy, cần phải thử nghiệm tiềm năng biểu hiện của gen chỉ thị chọn lọc với các promoter khác nhau. Nhiều promoter được dùng trong chuyển gen thực vật đã được nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả. Promoter 35S của virus khảm CaMV hoặc FiMV và promoter NOS thường được sử dụng. Promoter 35S có tiềm năng cao và thường được sử dụng nhiều trong các thiết kế vetor chuyển gen. Các promoter cảm ứng có vai trò đối với quá trình biểu hiện các gen chuyển nạp trong những điều kiện cảm ứng như các gen chống lại quá trình oxi hóa giúp cho cây chống lại các stress hiếu khí hay các gen kháng kháng sinh tạo ra do nhiệt độ để chọn các đột biến trong việc tạo ra tín hiệu ở chu trình chuyển hoá các chất dưới tác dụng của nhiệt. Một số các promoter cảm ứng khác cũng được nghiên cứu promoter sốc nóng [11], chuỗi khởi động cảm ứng nitrate từ gen nitrite reductase [12] và các promoter cảm ứng hormone [65]. Do các mối quan tâm ngày càng nhiều về việc sử dụng thực vật như là hệ thống mẫu để phát triển sinh học phân tử, nhiều gen và các chuỗi khởi động liên quan được mô tả. Các gen này được thể hiện trong các loại mô hay trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây như các gen thể hiện ở hạt phấn [9], ở hoa [59], ở rễ [26] và ở thân [17]. Các nghiên cứu về gen ubiquitin ở thực vật đã phát hiện ra một số lượng lớn các nhóm promoter có sự biểu hiện mạnh ở thực vật. Polyubiquitin promoter được phân lập và xác định đặc tính từ cây ngô [22], cây thuốc lá [48], Arabitalic [19], cây hướng dương [15], khoai tây [28], cà chua [50], lúa [55], [61], mía đường [64] và đậu tương [21]. Đa số các promoter này điều khiển ở mức độ cao hơn so với promoter CaMV35S trong quá trình biểu hiện ở các loài thực vật chuyển gen. Do gen Ubiquitin được biểu hiện ở hầu hết các mô thực vật trong điều kiện tự nhiên, nên promoter ubiquitin đã được sử dụng để biểu hiện gen trong các loại thực vật chuyển gen đặc biệt là giữa các loài gần gũi. Sự biểu hiện mạnh của promoter ubiquitin được chi phối bởi sự xuất hiện của các đoạn intron, những đoạn chủ yếu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 định vị trong vùng 5’ không dịch mã của gen ubiquitin [41], [55]. Các đoạn intron gần với bộ 3 khởi đầu dịch mã là những nhân tố cis quan trọng, là nguyên nhân gây ra sự tăng cường gián tiếp có liên quan đến intron (intron-mediate enhancement – IME) của quá trình biểu hiện gen ở thực vật [19]. Ngày nay Ubiquitin promoter và actin promoter của lúa thường được sử dụng để biểu hiện gen ở cây một lá mầm [43]. Trong đó, Ubiquitin promoter được thử nghiệm trong quá trình điều khiển biểu hiện gen ở cây ngô, lúa, đậu tương…[32], [41], [46]. 1.3. Tình hình nghiên cứu chuyển gen ở bèo tấm 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Bèo tấm là loài thực vật có khả năng sinh trưởng và phát triển nhanh trong thành phần có chứa nhiều chất dinh dưỡng quan trọng, có thể sử dụng làm thức ăn cho chăn nuôi, trong sản xuất các protein tái tổ hợp với số lượng lớn. Ngoài ra, bèo tấm còn được sử dụng nhiều trong các quá trình giảm thiểu ô nhiễm mặt nước và trong kỹ nghệ môi trường. Do đặc điểm này mà bèo tấm đã trở thành đối tượng được quan tâm nghiên cứu bởi đông đảo các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới. 1.3.1.1. Các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh Có rất ít các nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh trên bèo tấm được công bố cho đến nay. Từ năm 1978, Chang và Hsing đã tạo được callus thành công trên L. aequinoctialis khi nuôi cấy các cánh của chúng trong môi trường lỏng có chứa 10mg/l 2,4D. Callus được tạo ra từ vùng mô phân sinh xung quanh điểm node phát sinh cánh bèo sau 13 tuần nuôi cấy. Trước đó, trong những năm 1976 - 1978, Chang và Chiu đã tạo thành công callus và tái sinh cánh ở dòng bèo L. gibba G3 [20]. Cho đến năm 1997 - 1998, một số nhà nghiên cứu thuộc đại học phía Bắc bang Carolina phát triển một hệ thống tái sinh thông qua callus ở L. gibba G3. Tuy nhiên, kết quả cuối cùng mới chỉ là dạng cấu trúc giống cánh màu xanh hoặc dạng nốt sần màu xanh [58]. Một quy trình tái sinh cây được xây dựng trên L. minor đã được công bố năm 2002, trong đó callus được tạo ra với tỷ lệ 89% khi cấy từ mẫu cánh bèo L. minor (4 loại mẫu: toàn cánh trưởng thành, cánh bị tổn thương do cắt, nửa cánh, mẫu rễ xấp xỉ 1 cm) trên môi trường có bổ sung 45 µM 2,4D. Cánh tái sinh từ callus thu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 được trên môi trường tái sinh có 22 µM IAA và 4,0 µM kinetin. Tỷ lệ tái sinh đạt 100%, cánh tái sinh thu được khi chuyển lên môi trường nhân cánh đã nhanh chóng tạo ra cánh bình thường [55]. Li và cộng sự, (2004) đã xây dựng hệ thống tái sinh hoàn chỉnh và chi tiết trên các loài bèo S. oligorrhiza, S. punctata, L. gibba và Hurfeish. Báo cáo này đã phân tích ảnh hưởng của các loại đường và các chất kích thích sinh trưởng tới giai đoạn tạo callus. Các auxin sử dụng gồm có dicamba, PCA, NAA, 2,4D. Các cytokinin gồm: TDZ, BA, 2iP, zeatin. Các loại đường gồm có galactose, sorbitol, maltose, sucrose, manitol. Các chất kích thích sinh trưởng, đường và hàm lượng của chúng được sử dụng khác nhau ở các giai đoạn khác nhau trong hệ thống tái sinh và ở mỗi loài bèo [40]. 1.3.1.2. Các nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm Kể từ khi có sự ra đời của các kỹ thuật sinh học phân tử, đã có các nghiên cứu phân lập và xác định đặc tính của hệ gen bèo tấm. Đã có nhiều những nghiên cứu phân lập và tách dòng gen trên đối tượng này. Năm 1991, Okubara và cộng sự đã phân lập được 3 gen được điều khiển với hệ thống phytochrome ở L. gibba [45]. Sau đó, Kehoe và cộng sự đã xác định được 2 đoạn trình tự có kích thước khoảng 10 bp quyết định đến sự điều khiển phytochrome của promoter gen Lhcb từ L. gibba [33]. Trong những năm gần đây, các nghiên cứu phân lập promoter từ bèo tấm cũng được thực hiện như các promoter của gen SSU5A, SSU5B, NPR1…[18], [62]. Cùng với các nghiên cứu phân lập gen, các nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen cũng được quan tâm. Năm 2001, các nhà nghiên cứu thuộc đại học phía Bắc bang Carolina đã áp dụng thành công phương pháp chuyển gen vào bèo tấm thông qua Agrobacterium tumefaciens ở giai đoạn nốt sần trước khi tái sinh cánh L.gibba G3 và L.minor 8744 [63]. Họ đã sử dụng quy trình tái sinh của Moon và Stomp, 1997. Trong báo cáo này, Yamamoto và cộng sự đã xây dựng một quy trình chuyển gen hiệu quả ở hai loài bèo tấm L. gibba (G3) và L. minor (8627 và 8744) và đã tạo ra một dòng bèo chuyển gen từ loài L. gibba G3, hai dòng chuyển gen từ L. minor 8627 và một dòng chuyển gen từ L. minor 8744. Gen được chuyển là gen chỉ thị (gen GUS) được điều khiển bởi promoter CaMV35S [65]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Các loài bèo tấm đã được sử dụng làm hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp với nhiều thuận lợi so với các hệ thống biểu hiện gen và nuôi cấy tế bào hiện tại. Có tới 12 loại protein đã được biểu hiện thành công trên hệ thống Lemna SystemTM, gồm các đoạn peptide nhỏ, mảnh Fab (Fabs), các kháng thể đơn dòng (mAbs) và các enzyme đa tiểu phần lớn… Lemna SystemTM là hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp dựa trên nền tảng các loài bèo tấm thuộc chi Lemna được hãng Biolex phát triển và đăng ký độc quyền tại nhiều nước trên thế giới [27]. Quy trình biến nạp vào bèo tấm cũng tương tự như quy trình biến nạp ở các loài thực vật khác, tức là phải tạo vật liệu vô trùng trong ống nghiệm, tạo đầu callus rồi sau đó tái sinh callus đã chuyển gen thành cây hoàn chỉnh. Bên cạnh đó, phương pháp chuyển gen nguyên cây (in planta) cũng được một số tác giả áp dụng trên bèo tấm đã cho thấy khả năng thu cây chuyển gen bền vững từ phương pháp này [27], [57]. Hướng nghiên cứu sử dụng bèo tấm để sản xuất các loại protein tái tổ hợp có nguồn gốc từ vi khuẩn, thực vật, động vật và người ngày càng được xúc tiến mạnh. Các hệ thống vector chuyển gen sử dụng các promoter được phân lập từ bèo tấm được đặc biệt chú ý đến. Ngoài promoter SSU5B, NPR1, đoạn điều khiển của gen ubiquitin đã được phân lập từ một số loài bèo tấm, bước đầu được sử dụng trong nghiên cứu chuyển gen và chứng minh là có hiệu quả cao [24]. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Tại Việt Nam, các nghiên cứu về bèo tấm còn hết sức hạn chế. Các nghiên cứu ban đầu chủ yếu nhằm mục đích sử dụng cho chăn nuôi và mới chỉ dừng lại ở những khảo sát cơ bản nhất về các đặc tính sinh lý, sinh hóa của một số loài bèo đặc hữu có mặt phổ biến ở Việt Nam. Tại đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh, các nhà khoa học đã thử nghiệm bổ sung bèo tấm làm thức ăn cho hơn 200 con gà giống Tàu Vàng, kết quả gà tăng trọng nhanh và chi phí thức ăn giảm 10 -15%/1 kg thịt. Tại Đại học Huế, khi bổ sung bèo tấm cho heo cũng thu được kết quả hết sức khả quan với khả năng tăng trọng tăng lên 20 - 30%. Đến những năm đầu thế kỷ 21, khi chương trình Công nghệ Sinh học Nông nghiệp chính thức được nhà nước thông qua, các nghiên cứu chuyển gen vào thực vật mới được khởi dựng. Nhiều gen quý có giá trị đã được phân lập từ nguồn tài Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 nguyên sinh vật Việt Nam để tiến tới ứng dụng tạo sinh vật biến đổi gen. Các công trình chuyển gen thường được triển khai sử dụng các vector của nước ngoài với các promoter thông dụng như CaMV35S và NOS promoter [1], [2], [4], [5], [6]. Tại Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, các nghiên cứu đầu tiên chuyển gen vào bèo tấm đã được thực hiện. Bắt đầu từ năm 2006, các loài bèo tấm phổ biến ở Việt Nam đã được thu thập và nghiên cứu. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô, xây dựng hệ thống tái sinh đã được tiến hành với các loài: L. aquinoctiallis, L. minor, S. polyhriza, W. globosa... Năm 2007, Vũ Văn Tiến và các cộng sự thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật, Viện Di truyền nông nghiệp đã bước đầu xây dựng thành công hệ thống tái sinh cây với loài bèo tấm L. aquinoctialis thông qua quá trình nuôi cấy callus với tỷ lệ tái sinh cao. Quá trình thăm dò khả năng chuyển gen vào nguyên cây bèo tấm L. aquinoctialis thông qua A. tumefaciens cũng đã được khảo sát [7]. Tuy vậy, nghiên cứu về phân lập gen, nhất là phân lập các loại promoter ở bèo tấm Việt Nam còn chưa được nghiên cứu đến. Đối với mỗi quá trình sản xuất protein tái tổ hợp, yêu cầu tối quan trọng là cần phải có promoter đủ mạnh để điều khiển quá trình biểu hiện. Hiện nay đã có nhiều loại promoter được phân lập và sử dụng, trong đó promoter ubiquitin là một đối tượng được quan tâm nghiên cứu do nó có khả năng làm tăng mạnh mẽ quá trình biểu hiện gen từ mức độ phiên mã cho tới dịch mã [41]. Bèo tấm là loài sinh vật có tốc độ sinh trưởng nhanh và hơn hết là rất phổ biến ở Việt Nam, do đó việc phân lập promoter từ bèo tấm là một việc làm cần thiết và hứa hẹn nhiều tiềm năng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Chƣơng 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu 2.1.1. Nguyên liệu thực vật Giống bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1và Spirodela polyrrhiza DB2 do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp. Đây là các giống bèo tấm được thu thập tại địa bàn Hà Nội và được định dạng tên loài tại Cộng hòa liên bang Đức. Bèo tấm nguyên cây, được nhân lên trong môi trường đặc chủng và nuôi cấy in-vitro A B Hình 2.1. A. Lemna aequinoctialis DB1; B. Spirodela polyrrhiza DB2 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp bởi nhiều hãng hóa chất khác nhau. - Enzyme giới hạn , Taq DNA polymerase, T4 ligase, thang DNA chuẩn 1kb, dNTP, GeneJET TM PCR Cloning Kit: hãng MBI Fermentas (Đức), tinh sạch sản phẩm PCR bằng Wizard kit của hãng Promega - Vector pCR2.1, vector pJET1.2 và kit tách dòng phân tử của hãng Invitrogen - Agarose: hãng Gibco (Mỹ) - BigDye đ Terminator v3.1 : hãng Applied Biosciences (Mỹ) - Ampicillin (Amp): hãng Serva (CHLB Đức) - Các hóa chất chloroform, isoamyl alcohol, Tris, acetic acid, EDTA, cồn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 tuyệt đối và các hóa chất chuyên dụng khác: hãng Merck (CHLB Đức) - Chủng E. coli DH5α lưu giữ tại Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Thành phần môi trường trong nuôi cấy vi sinh vật (LB lỏng, LB đặc, SOC) các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid và sử dụng trong thí nghiệm được giới thiệu ở phụ lục. 2.1.3. Thiết bị thuộc Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và phòng Công nghệ ADN ứng dụng Tủ lạnh sâu -200C, -700C (Sanyo, Nhật Bản); Lò vi sóng (Samsung, Hàn Quốc); Pipetman các loại (Gilson, Pháp); Cân phân tích (Mettler Toledo 10-4g, Thụy Sĩ); Máy đo pH (Mettler, Thụy Sĩ); Máy ly tâm lạnh cao tốc (Avanti TM 30 Centrifuge Beckman, Mỹ); Máy ly tâm Eppendorf (Eppendorf 5415C, Đức); Máy PCR (MJ Research, Inc., Mỹ); Máy soi DNA (Minitransilluminator BioRad, Mỹ); Máy điện di (PowerPac 300, BioRad, Mỹ); Box cấy; Bể ổn nhiệt; Nồi khử trùng. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số từ thực vật * Nguyên tắc Thành tế bào thực vật được phá vỡ bằng các biện pháp cơ học kết hợp với việc sử dụng các chất tẩy rửa mạnh. DNA được giải phóng và làm sạch tạp chất nhờ dung dịch phenol - chloroform - isoamyl (25 : 24 : l). DNA được kết tủa trong cồn tuyệt đối ở -200C và thu tủa nhờ ly tâm. * Phương pháp tách chiết DNA tổng số: Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB và PVP theo Stewart và Vie (1993) [56]. Bèo tấm nghiền trong nitơ lỏng. Khoảng 1 g mẫu thực vật được chiết trong 5 ml dung dịch đệm có chứa Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 10 mM; 0,1% β-mercaptoethanol, 2% CTAB, 1% PVP và 5 mM ascorbic acid, ủ ở 65oC trong ít nhất 1 giờ. Mẫu được sử lý bằng phenol-chloroform và cuối cùng bằng chloroform. Lớp trên cùng tách ra tủa bằng một phần mười thể tích Na-acetate 3 M và ba thể tích cồn ở -200C trong 2 giờ. Sau đó rửa lại 2 lần bằng cồn 70%. Cặn thu được làm khô ở điều kiện chân không và hòa vào 300 µl TE. Loại RNA bằng RNase. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng SDS và PVP theo Angelaes và cộng sự (2005) [10], có sự thay đổi trong thành phần dung dịch đệm chiết như sau: NaCl 2 M; Tris-HCl (pH= 8) 0,2 M; EDTA (pH=8) 70 µM; β-mercaptoethanol 0,2 M; PVP 100 mg/2ml dung dịch đệm chiết. Sau đó, cho thêm 0,2 ml 20% SDS đối với 1 g mẫu thực vật và ủ ở 65oC trong ít nhất 1 giờ. Phương pháp tách chiết DNA tổng số sử dụng CTAB và PEG theo Zuccarello và cộng sự (2006) [67]: thành phần dung dịch đệm chiết có chứa Tris- HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0.1% β- mercaptoethanol, 2% CTAB và 1% PEG 6000, * Quy trình - Nghiền 1 g lá bằng cối chày sứ (cối, chày sứ phải vô trùng và được giữ ở -70 0 C) trong nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn. - Hòa tan mẫu trong 3 ml dung dịch đệm chiết có thành phần: 5 M NaCl; 1 M Tris HCl pH 8,0; 0,5 M EDTA pH 8,0; CTAB 2%, PVP 2%, β - mercaptoethanol 0,1 M, sau đó ủ ở 65oC trong 60 phút, cứ 5 -10 phút lắc nhẹ một lần hoặc sử dụng thành phần dung dịch chứa PEG 6000: Tris - HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0,1% β - mercaptoethanol; 4% CTAB và 2% PEG 6000 sau đó ủ ở 65oC trong 60 phút, cứ 5 -10 phút lắc nhẹ một lần. - Bổ sung 3 ml phenol - chloroform - isoamyl (25 : 24 : 1), lắc nhẹ. - Ly tâm 12.000 v/p trong 4 0C, 15 phút, tạo thành 3 pha, thu lấy pha trên, chuyển sang ống ly tâm khác. - Bổ sung 3 ml chloroform - isoamyl (24 : 1), lắc nhẹ - Ly tâm 12.000 v/p trong 4 0 C, 15 phút, thu lấy pha trên, chuyển sang ống epp mới, mỗi ống 300 µl. - Tủa DNA: Cho vào mỗi ống epp 50 μl CH3COONa 3 M, 1 ml ethanol 100%. Để ở nhiệt độ -200C trong vòng 3 giờ. - Sau đó ly tâm 12.000 v/p trong 40C, 15 phút. Thu tủa, rửa tủa bằng 700 μl ethanol 70% 2 lần. Sấy khô bằng máy hút chân không speed vac, hòa mẫu trong 50 μl nước khử ion vô trùng. Sau đó chạy điện di kiểm tra. - Loại RNA: Bổ sung RNase vào mẫu DNA thu được để đạt đến nồng độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 cuối cùng là 100 g/ml, ủ mẫu ở 370C trong 1 giờ. - Chạy điện di kiểm tra 5 l sản phẩm DNA thu được trên gel agarose 0,8% 2.2.2. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose [51] * Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Nucleic acid là các đại phân tử tích điện âm, nên dưới tác động của dòng điện một chiều các đoạn DNA có khối lượng và kích thước khác nhau sẽ di chuyển trong điện trường từ cực âm sang cực dương. * Hóa chất Agarose 0,8% (Hòa 0,8 g agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X); Đệm TAE 10mM 1X; EtBr 10 µg/ml; Đệm tra mẫu (glycerol 20%; Tris-HCl 0,1 M, pH 8,0; EDTA 0,01 M, pH 8,0; bromophenol blue 0,25%). * Quy trình - Agarose 0,8% được đun sôi, để nhiệt độ hạ xuống khoảng 50 - 600C, đổ dung dịch agarose vào khay gel đã cài sẵn răng lược thích hợp. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã đông cứng, tháo răng lược, đặt khay gel vào bể điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel ~ 2 mm. - Tra mẫu: Mẫu DNA trộn cùng với đệm tra mẫu theo tỷ lệ thích hợp, tra mẫu vào các giếng trên bản gel. - Tiến hành điện di với dòng điện 1 chiều có hiệu điện thế 100 V, cường độ dòng điện 60-80 mA, quan sát sự di chuyển của vệt màu bromophenol blue để ngừng vào thời gian phù hợp (thường sau khoảng 30 phút). - Nhuộm DNA bằng ethidium bromide (EtBr): Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 10 g/ml trong thời gian 20 phút trên máy lắc nhẹ. Sau đó rửa sạch bản gel bằng nước cất. - Quan sát và chụp ảnh: Gel được quan sát dưới ánh sáng tử ngoại. Quan sát thấy DNA hiện lên dưới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di được chụp trên máy Bio- Rad với tia UV có bước sóng 320 nm 2.2.3. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR Phản ứng chuỗi polymerase do Mullis và cộng sự sáng chế ra năm 1985. Kỹ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 thuật này cho phép nhân nhanh số lượng không hạn chế nguyên bản một đoạn DNA mong muốn từ hệ gen của cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là sử dụng DNA polymerase chịu nhiệt, ví dụ Taq DNA polymerase được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus để tổng hợp trong ống nghiệm các đoạn DNA mới từ mạch khuôn trong môi trường có dư các dNTP và cặp mồi đặc hiệu. * Quy trình nhân bản bằng enzyme này bao gồm ba bước được lặp lại nhiều lần, được tiến hành theo Sambrook và Russell (2001) [51]: - Biến tính DNA từ dạng sợi kép sang dạng sợi đơn bằng cách nâng cao nhiệt độ lên 94 - 950C trong thời gian ngắn. - Tiếp hợp đoạn mồi thông qua hạ nhiệt độ xuống 50-600C. Hai đoạn mới là các oligonucleotide dài khoảng 15-30 base sẽ tiếp hợp theo nguyên tắc bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân. - Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi: Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc thù phản ứng tiếp hợp được thực hiện ở 720C. Như vậy, sau mỗi chu kỳ phản ứng từ 1 đoạn DNA cần nhân sẽ có 2 đoạn được tổng hợp, sau n chu kỳ sẽ có 2n bản sao đoạn DNA mong muốn, chiều dài thực tế của đoạn DNA được nhân bản bằng đúng khoảng cách giữa hai đầu xuất phát của hai đoạn mồi. * Kỹ thuật PCR bao gồm các thành phần sau đây: - Một đoạn DNA khuôn mẫu. - Hai đoạn mồi đặc hiệu có chiều dài 15 - 30 nucleotide. - Bốn loại deoxyribonucleotide triphosphate (dATP, dTTP, dGTP, dCTP). - DNA polymerase chịu nhiệt. Sau khi phản ứng kết thúc, lấy 8 μl sản phẩm PCR điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. * Thành phần của phản ứng PCR đối với mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 - Chu trình nhiệt 95 0 C 95 0 C 55 0 C 72 0 C 72 0 C 4 phút 1 phút 1 phút 1 phút 30chu kỳ 10 phút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nồng độ gốc H2O Taq Buffer (+MgSO4) dNTP La-UbipF La-UbipR Taq DNA polymerase DNA khuôn 16,7 2,5 2,5 1 1 0,3 1 10X 10 mM 10 pM 10 pM 5 U/µl 20 ng/µl Tổng thể tích 25 * Thành phần của phản ứng PCR đối với mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 - Chu trình nhiệt 95 0 C 95 0 C 50 0 C 72 0 C 72 0 C 4 0 C 4 phút 1 phút 1 phút 1 phút 25chu kỳ 10 phút Thành phần phản ứng Thể tích (µl) Nồng độ gốc H2O Pfu Buffer dNTP MgSO4 Sp-UbipF Sp-UbipR Pfu DNA polymerase DNA khuôn 13,1 2,5 2,5 3 1 1 0,4 1,5 10 mM 10 pM 10 pM 5 U/µl 20 ng/µl Tổng thể tích 25 2.2.4. Các phƣơng pháp sử dụng để tách dòng gen [51] 2.2.4.1. Phản ứng nối ghép gen vào vector và biến nạp vào E. coli * Phản ứng ghép nối Phản ứng nối ghép ở đây được thực hiện theo GeneJETTMPCR Cloning Kit của hãng Fermentas. Đây là phương pháp được thiết kế đặc biệt để tách dòng gen mong muốn (hoặc sản phẩm PCR nói chung) được nhân lên bằng enzyme Taq DNA polymerase và đạt hiệu quả gắn đoạn rất cao chỉ trong thời gian ngắn là 10 phút. Đối với mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 phương pháp này cho phép gắn trực tiếp sản phẩm PCR vào vector pCR2.1 với sự tham gia của enzyme T4 DNA Ligase còn đối với mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 phương pháp này cho phép gắn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 trực tiếp sản phẩm PCR vào vector pJET1.2 với sự tham gia của enzyme T4 DNA ligase. Trong cấu trúc của hai vector này có đầy đủ đặc điểm của một vector tách dòng gen như: Trình tự khởi đầu tái bản của DNA; vùng MCS; Vùng mang gen kháng Amp; Vùng mang gen gây chết tế bào vi khuẩn E. coli. - Quy trình đối với mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 Thành phần phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích (l) H2O Đệm T4 ligase pCR2.1 T4 DNA ligase Sản phẩm PCR 2 1 1 1 5 5 Tổng thể tích 10 Vortex ngắn và ly tâm 3-5 giây. Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 140C trong 4 giờ. - Quy trình đối với mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 Thành phần phản ứng Thành phần phản ứng Thể tích (l) H2O 2X đệm T4 DNA ligase pJET1.2 Sản phẩm PCR 3 10 1 1 5 Tổng thể tích 20 Vortex ngắn và ly tâm 3-5 giây. Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 220C trong 2 giờ. * Biến nạp vào tế bào E. coli Nguyên tắc: Màng tế bào vi khuẩn dưới tác động của hóa chất hoặc điện trường sẽ bị thay đổi trở nên xốp, mỏng hơn và tạo các lỗ khiến cho các phân tử DNA có thể chui vào. Sau đó, các tế bào được phục hồi lại trên môi trường nuôi cấy và các thể biến nạp sẽ được phát hiện trên môi trường chọn lọc. Quy trình: Thực hiện biến nạp theo phương pháp sốc nhiệt với các bước: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 - Đặt tế bào khả biến E. coli DH5 vào đá để làm tan khoảng 30 phút. - Bổ sung 5l sản phẩm của phản ứng ghép nối ở trên vào mỗi ống tế bào E. coli DH5, đảo nhẹ. - Ủ trong đá 15 phút. - Sốc nhiệt ở 420C trong 70 giây, đặt vào đá 5 phút. - Bổ sung 300 l môi trường LB lỏng, nuôi lắc 370C trong 1 giờ. - Cấy trải toàn bộ dịch nuôi ra đĩa LB đặc có bổ sung ampicelin (Amp) đến nồng độ cuối cùng là 50 g/ml. - Nuôi ở 370C qua đêm, chọn lấy các khuẩn lạc. 2.2.4.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid lƣợng nhỏ Tế bào chứa plasmid cần tách chiết sẽ được nuôi cấy và để nhân lên đến giai đoạn cuối pha log. Tế bào sau đó được phá vỡ bằng kiềm và các chất tẩy rửa mạnh có trong dung dịch I và dung dịch II. DNA nhiễm sắc thể và protein trong tế bào được loại ra nhờ dung dịch III. DNA plasmid được kết tủa bằng cồn và thu lại nhờ ly tâm với tốc độ 12000 v/p. * Quy trình - Nhân vi khuẩn qua đêm trong ống nghiệm chứa 2 ml môi trường LB lỏng có kháng sinh thích hợp ở 370C trên máy lắc - Thu tế bào vi khuẩn từ dịch nuôi bằng ly tâm 6000 v/p trong 5 phút - Bỏ dịch, thu cặn tế bào - Bổ sung 150 l dung dịch I, vortex mạnh - Bổ sung 150l dung dịch II, đảo nhẹ - Bổ sung 150 l dung dịch III tiếp ngay sau đó, rồi để trong lạnh khoảng 5 phút - Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 40C, thu dịch - Bổ sung 1000l cồn 100%, để tủ lạnh -200C trong 3 giờ để tủa DNA - Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 40C - Bỏ dịch, thu tủa DNA - Hòa tan tủa DNA trong 50 l nước chứa Rnase (0,01 mg/ml). Bảo quản Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 DNA ở -200C - Kiểm tra DNA trên gel agarose 2.2.4.3. Phân tích DNA bằng enzyme giới hạn * Phân tích DNA plasmid tái tổ hợp Để xác định rõ xem plasmid đã lựa chọn có mang đoạn DNA lạ hay không thì cần sử dụng enzyme giới hạn để cắt kiểm tra. Có thể lựa chọn các enzyme giới hạn chỉ cắt gen vùng nhận biết của chúng trên vector, hay lựa chọn enzyme giới hạn có cả điểm cắt trên đoạn DNA lạ. Phản ứng cắt được tiến hành với thành phần: Thành phần phản ứng Thể tích (l) H2O Dung dịch đệm Plasmid Enzyme 5,8 1,0 3 0.2 Tổng thể tích 10 Hỗn hợp phản ứng được trộn nhẹ nhàng và ủ ở 370C trong vòng 3 giờ. Sau đó kiểm tra kết quả trên điện di agarose 0,8% * Kiểm tra đoạn DNA được nhân lên bằng enzyme giới hạn - Đối với mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1, sau khi nhân được đoạn DNA có kích thước đúng như gen mong muốn và đã tách dòng thành công bằng vector pCR2.1 cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng các điểm cắt của enzyme giới hạn trên gel đó. Có thể xử lý enzyme giới hạn với sản phẩm PCR và với cả plasmid tái tổ hợp có mang gel đó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn cắt kiểm tra là EcoRI và SalI. - Đối với mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 , sau khi nhân được đoạn DNA có kích thước đúng như gen mong muốn và đã tách dòng thành công bằng vector pJET1.2 cần kiểm tra lại trình tự đoạn gen được nhân bằng các điểm cắt của enzyme giới hạn trên gel đó. Có thể xử lý enzyme giới hạn với sản phẩm PCR và với cả plasmid tái tổ hợp có mang gel đó. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng enzyme giới hạn cắt kiểm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 tra là HindIII, NotI, HincII và PstI. Các dung dịch đệm thích hợp cho từng loại enzyme như sau: E.coRI Dung dịch đệm EcoRI Sall, PstI, NotI, Dung dịch đệm O HindIII Dung dịch đệm R HincII Dung dịch đệm Tango 2.2.4.4. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật PCR Ngoài việc kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn, cũng có thể kiểm tra bằng cách dùng DNA plasmid này làm khuôn để nhân đoạn gen mong muốn bằng kỹ thuật PCR. Cặp mồi và chu trình nhiệt được sử dụng ở đây cũng giống như ở phản ứng PCR thực hiện với khuôn là DNA tổng số thực vật như trên. 2.2.5. Xác định trình tự gen Trình tự đoạn promoter được xác định trên máy tự động ABI PRISMR 3100 Genetic Analyzer theo nguyên lý phương pháp Sanger. Thành phần hỗn hợp dùng trong xác định trình tự đoạn DNA cả dNTP và ddNTP. Quá trình tổng hợp kéo dài chuỗi sẽ không tiếp tục diễn ra khi ddNTP được lắp vào, kết quả là tạo ra một bộ các đoạn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide. Sử dụng BigDye® Terminator v3.l Cycle Sequencing Kit, chứa các ddNTP được đánh dấu bằng các mầu huỳnh quang khác nhau do đó PCR được tiến hành thuận tiện chỉ trong một Eppendorf. 2.2.6. Xử lý số liệu bằng các phần mềm chuyên dụng Sau khi xác định trình tự, các số liệu được xử lý bằng các phần mềm ClustalW trên BioEdit để so sánh các trình tự này với trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài này ở Mỹ đã được công bố trên GenBank. Trình tự nhận được tiếp tục nghiên cứu bằng phần mềm chẩn đoán các vùng chức năng của promoter như Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chƣơng 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ Bèo tấm Mọi nghiên cứu trên bộ gen đều được bắt đầu từ việc tách chiết DNA tổng số ở dạng tinh sạch với chất lượng tốt và lượng đủ lớn. Một trong những mối quan tâm hàng đầu khi tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các nuclease nội bào. * Quy trình tách chiết DNA tổng số từ bèo tấm Giống bèo tấm nguyên cây do Viện Di truyền Nông nghiệp cung cấp, được nuôi cấy invitro trong khoảng 3-5 ngày sẽ tiến hành tách chiết DNA. Để hạn chế sự phân hủy DNA, việc tách chiết DNA được chúng tôi tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp nhằm ức chế sự hoạt động của các enzyme này. Do vậy, trước khi nghiền mẫu, cối và chày sứ được giữ trong tủ lạnh -700C. Mẫu sau đó được tiến hành nghiền trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn, mẫu được hòa tan trong dung dịch đệm chiết gồm các chất: Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 10 mM; 0.1% β-mercaptoethanol; 2% CTAB; 2% PVP (điều chỉnh tăng lên thêm 1% PVP so với phương pháp gốc) đối với phương pháp của Stewart và Vie (1993), còn đối với phương pháp Zuccarello và cộng sự (2006)[67] dung dịch đệm có thành phần là Tris-HCl (pH=8) 0,1 M; NaCl 1,4 M; EDTA (pH=8) 0,02 mM; 0,1% β- mercaptoethanol; 4% CTAB và 2% PEG 6000 (điều chỉnh tăng lên thêm 2% CTAB và 1% PEG 6000 so với phương pháp gốc). Hỗn hợp dung dịch đệm này sẽ phá vỡ màng tế bào và màng nhân, đồng thời giải phóng DNA ra môi trường. Thành phần CTAB, PVP, PEG trong đệm chiết không những có tác dụng phá vỡ tế bào mà còn có vai trò ức chế sự hoạt động của các nuclease. Trong khi đó, EDTA lại có tác dụng cố định các ion Mg2+ (là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của các nuclease), nên sẽ ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Để loại bỏ protein trong hỗn hợp, mẫu được bổ sung hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol (tỉ lệ 25 : 24 : 1). Chloroform làm tăng cường hoạt động của phenol trong việc biến tính protein nhưng không làm ảnh hưởng đến cấu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 trúc của DNA, đồng thời nó còn tạo điều kiện thuận lợi cho việc tách pha nước với pha hữu cơ. Isoamyl alcohol có tác dụng làm giảm bọt khí trong quá trình tách chiết. Sau khi lắc mạnh và đem ly tâm, hỗn hợp được phân làm 3 pha: pha trên cùng là pha nước có chứa DNA, pha giữa là protein đã bị biến tính, pha dưới cùng là hỗn hợp phenol, chloroform và isoamyl alcohol. Pha nước được hút nhẹ nhàng sang ống mới. Dịch chiết này sau đó được xử lý tiếp bằng hỗn hợp chloroform : isoamyl alcohol (24 : 1) nhằm loại bỏ hoàn toàn phenol có lẫn trong dịch chiết và một lần nữa làm sạch DNA, bước này có thể lặp lại 1 - 2 lần. Tiếp theo là bước kết tủa DNA bằng cách bổ sung vào dung dịch chiết CH3COONa 3M có pH 5,2 và cồn tuyệt đối. Cồn có tác dụng hút lớp nước bao quanh phân tử DNA để lộ ra các gốc phosphate tích điện âm. Khi đó các ion Na+ kết hợp với các gốc phosphate này khiến cho lực đẩy giữa các chuỗi nucleotide giảm, do đó DNA bị kết tủa. Ở điều kiện -200C trong 15 giờ thì DNA kết tủa gần như hoàn toàn. Trong dung dịch này có lẫn nhiều RNA, vì thế chúng tôi đã tiến hành loại RNA bằng cách ủ dung dịch với Rnase 0,01mg/ml ở 370C trong 2 - 3 giờ. DNA tổng số sau đó được điện di trên gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng và nồng độ. Vì agarose là một loại polyme tách từ rong biển, được cấu tạo bởi 2 monomer là D-galactose và 3,6-anhydro L-galactose, nên sau khi đun sôi với dung dịch đệm agarose sẽ đông lại tạo cấu trúc dạng mạng lưới với kích thước lỗ phụ thuộc vào nồng độ của agarose (kích thước lỗ là 150 nm ở nồng độ 1% và 500 nm ở nồng độ 0,16%). Do có cấu trúc dạng mạng lưới, nên sau khi điện di các đoạn DNA có kích thước và trọng lượng khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc và trọng lượng phân tử của chúng. DNA tổng số có kích thước và trọng lượng phân tử lớn nhất nên dưới tác dụng của dòng điện một chiều, DNA tổng số sẽ di chuyển chậm và chiếm vị trí cao nhất trên bản gel. Những đoạn DNA có kích thước nhỏ hơn (do bị phân hủy) và các phân tử RNA chạy nhanh hơn tạo thành vệt sáng phía dưới vạch DNA tổng số. Trong cấu trúc của phân tử DNA có các liên kết hydro giữa 2 mạch đơn nên trong quá trình nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 có khả năng phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV), nên ta có thể phát hiện được các băng vạch khi chiếu bản gel dưới ánh sáng UV. Sau khi nhuộm bản gel trong dung dịch EtBr 15 phút, các băng DNA đã xuất hiện rõ nét dưới ánh sáng tử ngoại. Kết quả điện di được trình bày trên hình 3.1 1 2 Hình 3.1. Điện di DNA tổng số trên gel agarose 1- DNA tổng số mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 2- DNA tổng số mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 Kết quả cho thấy, cả hai băng DNA tổng số của hai mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 và S. polyrrhiza DB2 đều sáng tập trung và tương đối rõ nét. Điều này cho thấy nồng độ DNA tổng số thu được tương đối cao, ít bị phân hủy và sạch RNA. Như vậy, có thể sơ bộ đánh giá DNA tổng số thu được đã đạt yêu cầu về nồng độ để dùng cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen từ loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 3.2.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter Trình tự primer được thiết kế dựa trên trình tự các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 đã được công bố [24]. Các gen Ubiquitin đều có cấu trúc bao gồm promoter, 5’UTR (untranslated region), intron sau đó là trình tự mang mã di truyền được bắt đầu từ ATG (mã của Methionin). Như vậy, trong vùng 5’ trước vị trí khởi đầu phiên mã có đoạn promoter, 5’UTR và đoạn intron, đoạn intron này được xem như có chức năng tăng cường khả năng biểu hiện của gen. Sơ đồ và trình tự mồi được thiết kế nhằm phân lập đoạn promoter Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 (SpUbip) và đoạn bao gồm cả promoter và intron (SpUbipin) được trình bày sau đây: Hình 3.2. Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin của loài bèo tấm S. polyrrhiza (Mỹ) và vị trí các mồi. Trình tự các cặp mồi như sau: Sp-UbipF: 5’ GGC GGA GAT GGA CAG ATA ATG AGA TG 3’ Sp-UbipR: 5’ ACT TGG GAG AGA CGA CGC GCT TCC TC 3’ Sp-UbipinR: 5’ GCT GAT GGA ACA TAT GAC GAC TGA AAG G 3’ 3.2.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pJET1.2 3.2.2.1. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR Chúng tôi PCR nhân đoạn promoter từ DNA tổng số của mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 sử dụng cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR cho đoạn khoảng 2 kb (SpUbipin). Sản phẩm PCR này được sử dụng để tiến hành PCR nhân đoạn promoter với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR với đoạn khoảng 1kb (SpUbip). Kỹ thuật PCR được tiến hành trong môi trường đệm thích hợp với hoạt động xúc tác của enzyme về pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy theo loại enzyme sử dụng trong kỹ thuật PCR. Dung dịch đệm sử dụng cho enzyme Pfu DNA polymerase gồm có: Tris-HCl 100 mM pH 8,3; KCl 500 mM; MgCl2 25 mM; gelatin 0,01%. Một yếu tố quan trọng trong thành phần của đệm là ion Mg2+, khi tạo thành phức với dNTP, Mg2+ có tác dụng gắn dNTP với enzyme, kích hoạt DNA polymerase, tăng sự kết hợp giữa mồi và đoạn khuôn, cũng như tác động vào sự nóng chảy của DNA mạch kép. Nồng độ ion Mg2+ thay đổi tùy thuộc vào quá trình nhân bản những đoạn DNA cụ thể. Nồng độ các dNTP phụ thuộc nhiều vào kích thước đoạn DNA cần nhân, nồng độ ion Mg2+ và nồng độ đoạn mồi. Việc bổ sung ATG Sp-UbipF Promoter Sp-UbipR Intron Sp-UbipinR PstI-474 HincII-934 1033 2013 XbaI-1509 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 các dNTP sẽ làm giảm nhiệt độ nóng chảy. Một thành phần quan trọng khác của PCR là các đoạn mồi. Việc điều chỉnh nồng độ mồi có liên quan đến chất lượng sản phẩm thu được. Khi nồng độ mồi cao, mồi sẽ gắn không đặc hiệu trên khuôn DNA và cho ra sản phẩm gồm nhiều đoạn có kích thước không mong muốn. Ngược lại, nồng độ mồi thấp làm giảm hiệu suất phản ứng. Đối với kỹ thuật PCR, việc thiết lập một chu trình phù hợp là yếu tố quan trọng, bởi vì yếu tố nhiệt đảm bảo cho sự giãn xoắn của phân tử DNA cũng như việc gắn đoạn mồi và kéo dài chuỗi. Chúng tôi tiến hành nhân đoạn promoter với 25 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính như sau: - Giai đoạn biến tính: lựa chọn 950C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ thích hợp để tách hoàn toàn DNA sợi kép thành 2 sợi đơn đồng thời vẫn đảm bảo hoạt tính của Pfu DNA polymerase. - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ gắn mồi phải thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của primer để các primer có thể bắt cặp với DNA khuôn. Đồng thời nhiệt độ gắn mồi cũng không được quá thấp khiến cho khuôn bị biến tính. Giá trị của nó phụ thuộc vào từng loại mồi và thấp hơn Tm từ 2 - 100C, trong đó Tm được tính theo công thức: Tm = 20C x (A + T) + 40C x (G + C) + 3,30C. Sau khi tính được nhiệt độ nóng chảy theo lý thuyết, chúng tôi đã tiến hành PCR thử nghiệm với các nhiệt độ khác nhau và đã chọn được nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 500C trong thời gian một phút. - Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ ở 720C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ làm việc tối ưu của Pfu DNA polymerase và thời gian thì đủ để kéo dài chuỗi DNA kích thước khoảng 2 kb. Ngoài ra, khi bắt đầu phản ứng chúng tôi đã cho chạy trước bước khởi động nóng ở 950C trong 4 phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số. Sau khi kết thúc 25 chu kỳ, chúng tôi đã đặt nhiệt độ 720C trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp DNA được kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở nhiệt độ 40C. Sản phẩm PCR sau đó đã được kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả trên hình 3.3 cho thấy sản phẩm PCR của mẫu bèo tấm rất đặc hiệu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 1 2 M Hình 3.3. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8% M: Thang DNA chuẩn 1 kb 1: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR 2: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm S. polyrrhiza DB2 với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR Căn cứ vào thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR là 2 kb đối với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipinR và 1 kb đối với cặp mồi Sp-UbipF và Sp-UbipR, đúng với dự đoán của gen cần nhân. Sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm tách dòng gen tiếp theo. 3.2.2.2. Tách dòng trong vector pJET1.2 Nhằm mục đích tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter, chúng tôi tiến hành gắn sản phẩm PCR đã nhân được ở giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2 vào vector pJET2.1 sử dụng bộ hóa chất GeneJETTM PCR Cloning Kit. Ưu điểm của việc sử dụng Kit này là thao tác đơn giản, tiện lợi, nhanh và hiệu quả. Vector pJET1.2 có chứa điểm khởi đầu sao chép rep (pMB1) nên có khả năng sao chép độc lập với hệ gen của tế bào chủ E. coli. Gen kháng Amp có trên vector cho phép chọn lọc những tế bào có mang vector này trên môi trường có Amp. Ngoài ra, vector này còn chứa gen eco471IR mã hóa cho nuclease phân hủy DNA nhân gây chết tế bào vật chủ. Khi vector được gắn thêm đoạn DNA ngoại lai thì gen eco471IR bị bất hoạt. Nhờ đó, quá trình lựa chọn dòng khuẩn lạc có mang plasmid tái tổ hợp sẽ hiệu quả hơn. Trên vùng đa gắn MCS có chứa điểm nhận biết của các enzyme giới hạn như KpnI, XhoI, XbaI,… kế tiếp nhau giúp dễ dàng thao 2 kb 1 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 tác lắp ghép, thu lại và kiểm tra đoạn DNA được chèn vào. Cuối cùng, hai trình tự mồi pJET1.2 xuôi và pJET1.2 ngược nằm về hai phía của điểm gắn sản phẩm PCR tạo điều kiện thuận lợi cho việc xác định trình tự gen. Trước khi thực hiện phản ứng ghép nối, chúng tôi tinh sạch sản phẩm PCR bằng Wizard kit. Thành phần phản ứng ghép nối như sau: 10 µl đệm phản ứng 2X, 5 µl sản phẩm PCR, 3 µl H2O, 1 µl vector pJET1.2 và 1 µl enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm của phản ứng ghép nối được biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 370C qua đêm. Kết quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang đoạn DNA cần tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra. 3.2.2.3. Tách chiết plasmid DNA Để tách chiết DNA plasmid, chúng tôi lấy 15 - 40 khuẩn lạc nuôi cấy trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp (50 g/ml) ở 370C từ 12 - 14 giờ. Trước tiên, các tế bào trong dịch nuôi cấy được thu nhận bằng cách ly tâm thu tủa. Tiếp đó chúng được xử lý bằng dung dịch I (có tác dụng rửa sạch tế bào); rồi bằng dung dịch II có chứa NaOH 0,2M và SDS 1%. Các cấu trúc của tế bào cũng như các liên kết hydro trong phân tử bị phá vỡ. SDS cùng với EDTA trong dung dịch II có vai trò ức chế các nuclease do EDTA liên kết các ion Mg2+ (yếu tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease), vì vậy ngăn không cho các nuclease phân giải DNA trong quá trình tách chiết. Tế bào vi khuẩn E. coli có chứa hai dạng DNA: DNA nhiễm sắc thể của E. coli và DNA plasmid nên việc tách riêng, làm sạch DNA plasmid là rất quan trọng. DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dung dịch I, II, III. DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn lại liên kết chặt chẽ với protein trong phức chất nucleoprotein nên khoảng thời gian ngắn không kịp thoát ra ngoài. Trong khi đó, các phân tử DNA plasmid mạch vòng đã được giải phóng ra môi trường. Khi môi trường được xử lý tiếp với dung dịch III thì pH môi trường trở về khoảng acid yếu gắn với điểm đẳng điện của DNA. Vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và được kiểm tra kích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 thước bằng phương pháp điện di trên gel agarose (hình 3.4) ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Hình 3.4. Điện di plasmid trên gel agarose ĐC: DNA plasmid đối chứng 1-15: DNA plasmid mang gen giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2 Theo lý thuyết, các plasmid mang đoạn gen ngoại lai sẽ có kích thước lớn hơn plasmid đối chứng (không được chèn thêm đoạn DNA). Do vậy, độ cao thấp của các băng so với băng đối chứng là cơ sở để dự đoán dòng nào đã được chèn thêm đoạn DNA ngoại lai. Kết quả trên hình 3.4 cho thấy ở giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2 có các dòng đều cao hơn dòng đối chứng, như vậy có thể kết luận sơ bộ là các dòng này đã được chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai. 3.2.3. Xác định đoạn điều khiển gen bằng RE Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid nói trên bằng phương pháp xử lý với enzyme giới hạn. Vector pJET1.2 có chứa điểm nhận biết enzyme XhoI ở phía bên trái và điểm nhận biết enzyme XbaI ở phía bên phải của vị trí ghép nối gen, tuy nhiên trong nghiên cứu này chúng tôi không dùng enzyme XhoI và XbaI như thường lệ mà dùng enzyme HindIII và NotI để kiểm tra đoạn gắn vì trong trình tự của đoạn promoter có các điểm nhận biết hai enzym hạn chế này. Qua đó, chúng tôi đã chọn được 3 dòng pJETSpUbip số 1, 4 và 5 với đoạn cắt kiểm tra bằng khoảng 1,3 kb và 3 dòng pJETSpUbipin số 14, 16 và 21 với đoạn cắt kiểm tra bằng khoảng 2,3 kb (hình3.5 A). Các dòng này lại được tiếp tục kiểm tra bằng các enzym hạn chế HincII và PstI bên trong đoạn này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Hình 3.5. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme A. Plasmid số 1, 4, 5 pJETSpUbip và số 4 pJETSpUbipin cắt bằng HindIII và NotI. B. Plasmid số 14, 16, 21 pJETSpUbipin cắt bằng HincII. C. Plasmid số 14, 16, 21 pJETSpUbipin cắt bằng PstI Các dòng pJETSpUbip, pJETSpUbipin đều có một điểm cắt của HincII tạo thành băng tương ứng khoảng 4 kb và 5 kb (hình 3.5 B). Hai điểm cắt của PstI (pJET1.2 có điểm cắt ở vị trí 158) ở các dòng pJETSpUbip đều cho hai băng 3,3 và 0,8 kb, còn pJETSpUbipin cho hai băng khoảng 4,2 kb và 0,8 kb (hình 3.5 C). Như vậy, kết quả kiểm tra các vị trí của enzym cắt hạn chế có thể dự đoán về đoạn gắn chính là đoạn chúng tôi cần tìm. 3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter Chúng tôi đã xác định trình tự DNA của 6 dòng này, mỗi dòng 3 lần trên máy xác định trình tự tự động dựa trên cơ sở phương pháp của Sanger. Chúng tôi đã sử dụng cặp mồi pJET1.2 để xác định trình tự đoạn promoter trên các plasmid tái tổ hợp theo cả hai chiều. Sau đó số liệu được xử lý bằng các phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection v2.0, DNA Sequencing Analysis v5.2, Seqscape v2.5, BioEdit v7.0.5, đã nhận được trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin có chiều dài 2013 bp, còn đoạn promoter và 5’UTR có chiều dài là 1033 bp ở giống bèo tấm S. polyrrhiza DB2. Sau đó chúng tôi đã tiến hành so sánh các trình tự này với trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài này ở Mỹ đã được công bố trên Ngân hàng gen quốc tế. Kết quả so sánh trình tự đoạn điều khiển trong pJETSpUbipin16 được trình bày trên hình 3.6 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 A B kb kb kb 1.0 2.0 3.0 6.0 4.0 0.75 1.0 2.0 3.0 4.0 6.0 1 4 5 4 14 16 21 14 16 21 6 C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GAGATGGACAGATAATGAGATGAATTAGAAAAAAAAAATTCGTGTTGTAAGATAGAATAC pJETSpUbipin16 ............................................................ 70 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TTGCTATCTACTGATGAATGCAGTTCAGTTTTCCTCACGATCTTAAAGATCGCGCACTAT pJETSpUbipin16 ............................................................ 130 140 150 160 170 180 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CCTCAGCTTCACTCTGGAAATTTTGATTCTCTTCTTCTGCTCAGCAGCCTCGACTCTGTC pJETSpUbipin16 ............................................................ 190 200 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TAGGGTTTCGTACAATCGGACGCCATTCTACATGAATCGAGCACAGGGAATGAAGACAAT pJETSpUbipin16 ............................................................ 250 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TAGGAGATCCTCGATGTCCTCCGACTTACTTGCATGACTTGACGGGGAAGATCTCGAGCA pJETSpUbipin16 ............................................................ 310 320 330 340 350 360 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GGGAAGCGACGCCTCTCCGGAGGACTCGCCTCGCCGAGAGGACCTCCTCCGCGACACGGA pJETSpUbipin16 ............................................................ 370 380 390 400 410 420 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CCATGGCCTCCACGGGGTAGAAGCTGGCCCTGTTCTTTATTCTCTTGAGGATCATCGGCC pJETSpUbipin16 ............................................................ 430 440 450 460 470 480 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GAAGCCTCCGCAAATCCATCCCCGAGGAGTAGAATCTCGCCTGCAGGAAGCATCTGTCGA pJETSpUbipin16 ............................................................ 490 500 510 520 530 540 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GATCCTCGCCGAGGCGGCGGAGATACCTCGCCGGCGCCGCCATGGCGCCGGGGACGGAGC pJETSpUbipin16 ............................................................ 550 560 570 580 590 600 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ACCACCACGGAGAAGAAGAACCCTAACCCAAGGCATTAACGAAGTTGCGCAGATTATACA pJETSpUbipin16 ..........................................................T. 610 620 630 640 650 660 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core AAAGCCCTCAAATATCTTTCATTTTCTATTTCACTGATACATTTTCATTATTGTATATGA pJETSpUbipin16 ............................................................ 670 680 690 700 710 720 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GTGTTTATTTAAATTATTCCGTATTAGAAAAGCACCTCCAGAACCCGACAAAATAGGGTG pJETSpUbipin16 ............................................................ HSE HSE DRE Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 730 740 750 760 770 780 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ACGTCATCATGGTGTCATGACCGCCCAACAGCCGCAGATTTAAAATCGGTGGATGAGTGC pJETSpUbipin16 ........G...........T....................................... 790 800 810 820 830 840 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GGCCACGCCACGAAAGCGATGGGCCTTCGTCGATGCCGTGAGAATCCATCTGACATAAAG pJETSpUbipin16 ............................................................ 850 860 870 880 890 900 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TAAACGGCGCCGTCAGTATTGACGGCGTATGACACGTGGAAAGAAGCTATTGGTTCACGC pJETSpUbipin16 ..................C......................................... 910 920 930 940 950 960 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ATCGGTGGTTCCGCTAGCCTCCGTCGACCGCTAGTACTATAAATACGGTCCCGAGGCCTC pJETSpUbipin16 ............................................................ 970 980 990 1000 1010 1020 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CTCACCACTCGCACATATCCTCTTTGTTTTCCTCTCCGTGAAAGAAGCGAGGAAGCGCGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1030 1040 1050 1060 1070 1080 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CGTCTCTCCCAAGGTAAGGAGCAGATCTCTTTGATCGTTTTTGTTCTTCTTTTGTTTTGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1090 1100 1110 1120 1130 1140 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TTTTTTTTTCTGCGGATCTTCGGTTGCATCATGCCTTGGCTGTTTTTATTAGTTTAGGAT pJETSpUbipin16 ........-................................................... 1150 1160 1170 1180 1190 1200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ATCCTCGTTTGGATCTGAGCCGATCATATATGTTAAAGGTTGTGTTCGATCTCTTTGTTC pJETSpUbipin16 ............................................................ 1210 1220 1230 1240 1250 1260 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ATTTTCGCATGAAAAGGATGTATCCTTTTGATGTGAGGCGATCTTCTATGGTTAAGACTT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1270 1280 1290 1300 1310 1320 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TGTTCGGTCTATTGATCATTTCTGTTCTTCGTTTTTGAGTTTTTTTCTGCGGATATCGCA pJETSpUbipin16 .............................................-.............. 1330 1340 1350 1360 1370 1380 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TCATCCCTAGGTTTTTGCTTTGGTTAGGATGCATCCTTTGGATTTGAGCCGATCTCCCTT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1390 1400 1410 1420 1430 1440 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GGTTAAGGCTGTGTCTGTTGCAGAGGAGAAAGTCTGTCGAGGTCCTTATGCAGGCTTTGT pJETSpUbipin16 ............................................................ ABRE MYC-like G-box TATA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 1450 1460 1470 1480 1490 1500 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CCAGATGCGCGTGCTCTCTCATGCTATGAATTTATGTTTTGAGAACTCCTCCCGGTTTTT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1510 1520 1530 1540 1550 1560 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core CTAGATCCGGATTTGAAGTATTCATTGCGGTTCCCCTTCGGTTTTATGTATTTCTCGAGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1570 1580 1590 1600 1610 1620 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TGATTTGGTCCATGATCGTGTTCTGTCCAGATCTCTCTTGATATGGATGAGATATTCGTT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1630 1640 1650 1660 1670 1680 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core ACCTCTTTCAAACATCGGTGGATGTTCTTTTTAGTCTTGGCTCACCTTTATCTAGAAATT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1690 1700 1710 1720 1730 1740 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core AATTTTCGGTTTGAAACCCCTGCTTGTTAAGGTGATGTATTCCTTCTTTATAGATTTCGG pJETSpUbipin16 ............................................................ 1750 1760 1770 1780 1790 1800 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TGTGTTATTTCTTAACGGTGATCTGTCCGATCCATGTGTTGCACCTCTTGTTTTCTGTGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1810 1820 1830 1840 1850 1860 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core AATCCTCTGTGAATTATAATTATGTTTTGAAAACGTACTTAAGTAAGGGGCATGTTCCCC pJETSpUbipin16 ............................................................ 1870 1880 1890 1900 1910 1920 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core GTTTAAAACTTTTGTTCTATCAATTTGTGGTTAATAGATCCTGATTTGTGGTCGCCTTAT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1930 1940 1950 1960 1970 1980 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| Sp-Ubi-pin-core TCTGTCTTTAATCGTGGATTTTATTTATCTTGAGCGCGTCCTTTTCTTTTAAAATCATGT pJETSpUbipin16 ............................................................ 1990 2000 2010 ....|....|....|....|....|....|... Sp-Ubi-pin-core GTTTAACCTTTCAGTCGTCATATGTTCCATCAG pJETSpUbipin16 ................................. Hình 3.6: Trình tự đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2 với dự đoán các vùng chức năng promoter Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Từ kết quả so sánh trên, chúng tôi đã quan sát thấy rằng đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin có 4 vị trí thay đổi so với loài này của Mỹ được thống kê ở bảng 3.1 như sau: Bảng 3.1. Các vị trí nucleotide khác biệt giữa Sp-Ubi-pin (Mỹ) với Sp-Ubi-pin 16 (Việt Nam) STT Vị trí Sp-Ubi-pin (Mỹ) Sp-Ubi-pin16 1 599 C T 2 729 A G 3 741 C T 4 859 T C Sử dụng phần mềm chuyên dụng dự đoán chức năng trình tự bin/programs/promoter cho thấy đây là đoạn có những vùng chức năng của promoter (hình 3). Hộp TATA ở vị trí 938 và điểm khởi đầu phiên mã dự đoán là vị trí 974. Ngoài ra còn có các trình tự đặc trưng cho G-box (868) , ABRE (719), MYC - like (827), DRE (716), HSE (617 và 676)… Đây là các yếu tố điều hòa trên promoter cả các gen cảm ứng với ánh sáng, abscisic acid, điều kiện mất nước…Vùng có trình tự nGAAn và các trình tự ngược chiều nTTCn được dự đoán là các yếu tố sốc nhiệt (heat shock element - HSE) trên promoter của các gen mã hóa cho các HSP. 3.3. Phân lập đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen từ loài bèo tấm L. aequinoctialis DB1 3.3.1. Thiết kế và tổng hợp cặp mồi đặc hiệu cho đoạn promoter Dựa trên trình tự các yếu tố điều khiển biểu hiện gen Ubiquitin loài bèo tấm L. aequinoctialis DB1 đã được công bố [24] chúng tôi đã thiết kế mồi theo sơ đồ và vị trí các mồi trên hình 3.7. Tương tự như loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2, các mồi La-UbipF và La-UbipR nhằm phân lập đoạn promoter, còn mồi La-UbipinR sẽ kết hợp với La-UbipF để nhân đoạn bao gồm cả promoter , 5’UTR và intron. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Hình 3.7: Sơ đồ cấu trúc đoạn các yếu tố điều khiển biểu hiện gen ubiquitin của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 và vị trí các mồi. Trình tự các cặp mồi như sau: La-Ubip-F: 5’- GGG CAG TGT ACC AAT ATT TTA AAC CC - 3’ La-Ubip-R: 5’- ACT GAG AAA GAA GAA GGA TTC CGC CC - 3’ La-Ubipin-R: 5’- GGG CCT GCA AGG GAA AAT AAT AAA TTG - 3’ 3.3.2. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR và tách dòng trong vector pCR2.1 3.3.2.1. Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR Chúng tôi tiến hành PCR nhân đoạn điều khiển bao gồm cả promoter và intron từ DNA tổng số của mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 sử dụng cặp mồi La-UbipF và La-UbipinR cho đoạn khoảng 2,1 kb (LaUbipin). Sản phẩm PCR này được sử dụng để tiến hành PCR nhân đoạn promoter với cặp mồi La-UbipF và La- UbipR với đoạn khoảng 1 kb (LaUbip). Kỹ thuật PCR được tiến hành trong môi trường đệm thích hợp với hoạt động xúc tác của enzyme về pH, lực ion,… Thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy theo loại enzyme sử dụng trong kỹ thuật PCR. Dung dịch đệm sử dụng cho enzyme Dream Taq DNA polymerase gồm có: Tris-HCl 100 mM; pH 8,3; KCl 500 mM; MgCl2 25 mM; gelatin 0,01%. Chúng tôi tiến hành nhân đoạn promoter với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn chính như sau: - Giai đoạn biến tính: lựa chọn 950C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ thích hợp để tách hoàn toàn DNA sợi kép thành 2 sợi đơn đồng thời vẫn đảm bảo hoạt tính của Taq DNA polymerase. - Giai đoạn gắn mồi: nhiệt độ gắn primer tối ưu của loài bèo tấm Lemna aequinoctialis DB1 cao hơn so loài bèo tấm S. polyrrhiza DB2: 550C trong thời ATG La-UbipF Promoter La-UbipR Intron La-UbipinR Sall-858 964 2068 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 gian một phút. Thông thường nhiệt độ gắn mồi sử dụng Taq DNA polymerase cao hơn so vói sử dụng Pfu DNA polymerase. - Giai đoạn kéo dài chuỗi: đặt nhiệt độ ở 720C trong 1 phút. Đây là nhiệt độ làm việc tối ưu của Taq DNA polymerase và thời gian thì đủ để kéo dài chuỗi DNA kích thước khoảng 2 kb. Ngoài ra, khi bắt đầu phản ứng chúng tôi đã cho chạy trước bước khởi động nóng ở 950C trong 4 phút để đảm bảo biến tính hoàn toàn DNA tổng số. Sau khi kết thúc 32 chu kỳ, chúng tôi đã đặt nhiệt độ 720C trong 10 phút để đảm bảo sự tổng hợp DNA được kết thúc hoàn toàn. Sau đó sản phẩm PCR được bảo quản ở nhiệt độ 40C. Sản phẩm PCR sau đó đã được kiểm tra trên gel agarose. 1 M 2 Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose M: Thang DNA chuẩn 1 kb 1: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 với cặp mồi La-UbipF và La-UbipinR 2: Sản phẩm PCR mẫu bèo tấm L. aequinoctialis DB1 với cặp mồi La-UbipF và La-UbipR Kết quả trên hình 3.8 cho thấy sản phẩm PCR của mẫu bèo tấm rất đặc hiệu. Căn cứ vào thang DNA chuẩn, kích thước của sản phẩm PCR là 2,1 kb cho đoạn promoter và intron còn 1 kb cho đoạn promoter đúng với dự đoán của gen cần nhân. Sản phẩm PCR này hoàn toàn đạt yêu cầu làm nguyên liệu cho thí nghiệm tách dòng gen tiếp theo. 2 kb 1 kb Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 3.3.2.2. Tách dòng trong vector pCR2.1 Nhằm mục đích tách dòng và xác định trình tự đoạn promoter, chúng tôi tiến hành gắn sản phẩm PCR đã nhân được ở giống bèo tấm L.aequinoctialis DB2 vào vector pCR2.1 sử dụng bộ hóa chất GeneJETTM PCR Cloning Kit nhờ những đặc điểm ưu việt của vector pCR2.1. Vecctor pCR2.1 chứa đầy đủ các thành phần cần thiết của một vector tách dòng để có thể tự sao chép trong tế bào chủ. Vector này có khả năng cho số lượng bản sao lớn trong tế bào (200 bản sao/ tế bào), có khả năng tải các đoạn gen tốt và ổn định trong tế bào chủ. Đồng thời nhờ có kích thước nhỏ mà nó dễ dàng được biến nạp vào tế bào. pCR2.1 chứa vùng trình tự đa điểm cắt, mang hai dấu chuẩn chọn lọc là gen kháng sinh ampicilin và kanamycin. Vector pCR2.1 đã được thiết kế để nhân gen ngoại lai ở vùng MCS. Ở mỗi đầu 3’ của mỗi sợi được gắn thêm một nucleotide T. Nucleotide T này rất dễ dàng bắt cặp bổ sung với nucleotide A ở trên đầu 3’ của sản phẩm PCR khi sử dụng Taq DNA polymerase. Khi đó, sản phẩm PCR và vector pCR2.1 có thể tự nối ghép với nhau một cách dễ dàng. Một đặc điểm nữa trong cấu trúc của vector pCR2.1 là trong vùng MCS có chứa operon LacZα mã hóa cho enzym β-galactosidaza như một dấu hiệu chọn lọc trắng- xanh để biến nạp mang plasmid tái tổ hợp: trên môi trường có chứa cơ chất Xgal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D(-)-galactopyranoside) và IPTG (isopropylthio--D-galactoside) các khuẩn lạc tái tổ hợp sẽ có mầu trắng do đoạn chèn làm bất hoạt enzyme này. Để chuẩn bị ghép nối, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng Wizard kit. Như đã biết, việc sử dụng Taq DNA polymerase trong PCR sẽ tạo ra khoảng 70 - 90% sản phẩm PCR có thêm một nucleotide A ở đầu 3’, do đó phản ứng ghép nối sản phẩm PCR được thực hiện như sau: 1 µl đệm phản ứng 10X; 5 µl sản phẩm PCR, 1 µl H2O, 1 µl vector pCR2.1 và 1 µl enzyme T4 DNA ligase. Sản phẩm của phản ứng ghép nối sẽ được đem biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α. Các tế bào này sau đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ml), Xgal (50g/ml) và IPTG (50g/ml) ở 370C qua đêm. Kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 quả chúng tôi thu được rất nhiều khuẩn lạc trắng là các dòng tế bào vi khuẩn có mang plasmid. Để xác định xem các plasmid này có thực sự mang đoạn DNA cần tách dòng (vùng promoter) hay không chúng tôi đã tiến hành tách chiết DNA plasmid từ một số khuẩn lạc để kiểm tra. 3.3.2.3. Tách chiết plasmid DNA Kết quả trên hình 3.9 cho thấy ở giống bèo tấm L. aequinoctialis DB1 có các dòng từ 1, 3, 4, 10, 11, 13, 14,15, 16 cao hơn dòng đối chứng, như vậy có thể kết luận sơ bộ là các dòng này đã được chèn thêm một đoạn DNA ngoại lai. ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Hình 3.9. Điện di plasmid trên gel agarose 0,8% ĐC: DNA plasmid đối chứng 1-16: DNA plasmid mang gen giống bèo tấm L. aequinoctialis DB1 3.3.3. Xác định đoạn điều khiển gen bằng RE Để kiểm tra kích thước thực tế của đoạn DNA được nối vào vector, chúng tôi đã tiến hành phân tích các mẫu DNA plasmid pCRLaUbipin bằng phương pháp xử lý với enzyme giới hạn EcoRI để kiểm tra kích thước đoạn gắn. Các plasmid pCRLaUbipin số 10, 11, 31 thu được 2 băng 3,9 kb và 2,1 kb tương ứng với kích thước của vector pCR2.1 (3,9 kb) và của sản phẩm PCR – LaUbipin (hình 3.10 A) và được chọn để khảo sát tiếp theo. Các dòng này được xử lý tiếp bằng các enzyme hạn chế Sall vì trong trình tự của đoạn promoter có 1 điểm nhận biết của enzyme hạn chế này. Các dòng pCR2.1 LaUbipin thu được băng 5,9 kb (hình 3.10B). Cũng tương tự đối với các dòng pCRLaUbip, sau khi xử lý với enzyme EcoRI chúng tôi chọn được dòng pCRLaUbip số 1 có hai băng 3,9 kb và 1 kb tương ứng với kích Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 thước của vector pCR2.1 và sản phẩm PCR LaUbip. Dòng pCRLaUbip kiểm tra bằng SalI cho một băng 4,9 kb (hình 3.10 C). Như vậy, kết quả kiểm tra các vị trí của enzyme cắt hạn chế có thể dự đoán về đoạn gắn chính là đoạn chúng tôi cần tìm. Hình 3.10. Điện di sản phẩm xử lý DNA plasmid bằng enzyme M. Thang DNA chuẩn 1kb Đ/C. Plasmid đối chứng A. Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt bằng EcoRI. B. Plasmid 10, 11, 31 pCRLaUbipin cắt bằng SalI. C. Plasmid pCRLaUbip cắt bằng EcoRI và Sall. 3.2.4. Xác định và phân tích trình tự đoạn promoter Chúng tôi đã xác định trình tự DNA mẫu các plasmid số 10, 11 pCRLaUbipin và mẫu plasmid số 1 pCRLaUbip trên máy xác định trình tự tự động dựa trên cơ sở phương pháp của Sanger. Sau đó số liệu được xử lý bằng các phần mềm ABI PRISM 3