Tài liệu Luận văn Nghiên cứu nhân giống các dõng bạch đàn lai ue35 và ue56 giữa eucalyptus urophylla và e. exserta bằng phương pháp nuôi cấy mô: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------------------------ -----------------------
ĐẶNG NGỌC HÙNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ
UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH
THÁI NGUYÊN – NĂM 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Lời nói đầu
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Danh mục hình ảnh
Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3
1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp ........................................... 3
1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp ......................... 3
1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ....
119 trang |
Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1378 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Luận văn Nghiên cứu nhân giống các dõng bạch đàn lai ue35 và ue56 giữa eucalyptus urophylla và e. exserta bằng phương pháp nuôi cấy mô, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
------------------------ -----------------------
ĐẶNG NGỌC HÙNG
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÁC DÕNG BẠCH ĐÀN LAI UE35 VÀ
UE56 GIỮA EUCALYPTUS UROPHYLLA VÀ E. EXSERTA BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ
LUẬN VĂN THẠC SỸ LÂM SINH
THÁI NGUYÊN – NĂM 2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Lời nói đầu
Danh mục bảng
Danh mục biểu đồ
Danh mục hình ảnh
Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...................................... 3
1.1. Khái niệm về nhân giống lai trong lâm nghiệp ........................................... 3
1.2. Khái niệm về nuôi cấy mô và nhân giống cây Lâm nghiệp ......................... 3
1.3. Cơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào ................................ 4
1.3.1. ............................................................ 4
o................................................. 4
1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào ........ 6
................................................................................... 6
.................................................................... 8
........................................................................................ 10
......................................................................................... 11
...................................................................................... 11
........................................................................................... 12
1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống ........................................ 12
..................................................................................... 12
............................................................................. 13
................................................................................ 13
........................................................................ 14
................................................................. 14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI NÓI ĐẦU
Nâng cao chất lượng đào tạo bằng nghiên cứu khoa học là mục tiêu
quan trọng trong việc đào tạo cao học của Trường đại học Nông Lâm Thái
Nguyên. Để hoàn thành chương trình đào tạo cao học Lâm nghiệp khoá học
2006-2009, được sự đồng ý của Khoa sau đại học - Trường Đại học Nông
Lâm Thái Nguyên, tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp
ng pháp nuôi
Sau thời gian học tập và hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tôi đã
nhận được sự quan tâm và giúp đỡ tận tình về nhiều mặt của Trường đại học
Nông Lâm Thái Nguyên, đặc biệt là khoa sau đại học, cùng các thầy cô giáo
trực tiếp giảng dạy, cũng như lãnh đạo Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Hà Nội, bộ môn công nghệ tế bào thuộc
Viện khoa học sự sống - trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên. Cho phép
tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến các thầy cô giáo, đặc biệt là
GS.TS. Lê Đình Khả, Th.s. Đoàn Thị Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và
người thân đã giúp đỡ tôi có được bản luận văn này.
Nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là một vấn đề khó
trong nghiên cứu ứng dụng sản xuất giống cây lâm nghiệp. Việc nghiên cứu
nhân giống một số dòng Bạch đàn lai nói trên trong đề tài nhằm góp phần xây
dựng cơ sở hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất cây với số lượng lớn,
đồng đều, có chất lượng cao do vậy không thể tránh khỏi những khiếm
khuyết, rất mong được sự chỉ bảo bổ sung ý kiến của các nhà khoa học, các
bạn đồng nghiệp để công trình nghiên cứu này được hoàn thiện.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2009
Tác giả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG
TT Tên bảng Trang
3.1a Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE35 (180 mẫu) …... 41
3.1b Bảng tổng hợp kết quả khử trùng mẫu của dòng UE56 (180 mẫu) ….... 42
3.2 Bảng ảnh hưởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi…………….... 43
3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của 5 loại môi trường đến HSNC và
TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trường)
…….….
44
3.4 Ảnh hưởng của việc bổ sung vitamine B2 đến HSNC và TLCHH của
UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức) ……………………………..
47
3.5 Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn lai
dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức) …………………….……...
51
3.6 Ảnh hưởng sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC và TLCHH
của dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/ công thức) ………………………
53
3.7 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công
thức)……………………………………………………………………
56
3.8 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng UE35 và UE56 (180 chồi cấy/công thức) ………
59
3.9 Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/công thức) ………………………….
61
3.10 Ảnh hưởng nồng độ IBA đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và chiều
dài của rễ (180 chồi cây/ công thức) …………………………………..
64
3.11 Ảnh hưởng của IBA + ABT1 đến tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình và
chiều dài rễ của dòng UE35 và UE56 …………………………………
66
3.12 Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại
vườn ươm sau 1 tháng (90 cây mạ /công thức)………………………..
69
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
TT Tên biểu đồ Trang
3.1a: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến HSNC của dòng UE35 và UE.......... 48
3.1b: Biểu đồ ảnh hưởng của vitamin B2 đến TLCHH của dòng UE35 và UE ....... 48
3.2a: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến HSNC của dòng UE35 và UE ................... 51
3.2b: Biểu đồ ảnh hưởng của BAP đến TLCHH của dòng UE35 và UE................. 52
3.3a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến HSNC của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54
3.3b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + IAA đến TLCHH của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 54
3.4a: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC
của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 56
3.4b: Biểu đồ ảnh hưởng của của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến TLCHH
của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 58
3.5a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến HSNC của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 59
3.5b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + Kinetin đến TLCHH
của dòng UE35 và UE ........................................................................................... 60
3.6a: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
HSNC của dòng UE35 và UE ................................................................................ 62
3.6b: Biểu đồ ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
TLCHH của dòng UE35 và UE ............................................................................. 62
3.7a: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tỷ lệ ra rễ của dòng UE35 và UE ......... 65
3.7b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA tới số rễ trung bình của dòng UE35
và UE .................................................................................................................... 65
3.8a: Biểu đồ ảnh hưởng của tổ hợp IBA + ABT1tới tỷ lệ ra rễ của dòng
UE35 và UE .......................................................................................................... 67
3.8b: Biểu đồ ảnh hưởng của nồng độ IBA + ABT1 tới số rễ trung bình của
dòng UE35 và UE ................................................................................................. 67
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
TT Tên bảng Trang
3.1. Ảnh khử trùng mẫu cấy và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày ……………... 43
3.2. Ảnh dòng UE35 cấy trong 5 loại môi trường ………………………. 46
3.3 Ảnh mẫu được cấy sang môi trường có bổ sung vitamin B2 sau 10
ngày nuôi cấy ………………………………………………………..
47
3.4a. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 48
3.4b. Ảnh chồi nuôi cấy trong môi trường MS* có bổ sung 2,0mg/l B2 … 49
3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và
TLCHH ……………………………………………………………...
55
3.6. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1,0
mg/l NAA …………………………………………………………...
58
3.7. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 1 mg/l
N AA + 0,5 mg/l Kinetin ……………………………………………
62
3.8. Ảnh chồi nuôi cấy có bổ sung ABT1 vào môi trường ra rễ sau 15
ngày nuôi cấy ………………………………………………………..
68
3.9. Ảnh cây con tại vườn ươm của 2 dòng ……………………………... 71
3.10. Ảnh sơ đồ cho quy trình nuôi cấy mô 2 dòng UE35 v à UE56 …….. 74
2
đàn liễu (E2), song lại thuộc hai cây khác nhau là E2 và E4 vì vậy có đặc điểm sinh
trưởng khác nhau. Các dòng vô tính này thuộc các tổ hợp lai đã được Bộ NN&PTNT
công nhận là giống tiến bộ kỹ thuật thích hợp với điều kiện lập địa ở vùng đất đồi
nghèo dinh dưỡng có thể cho năng suất gấp 2-4 lần so với loài bố mẹ (Lê Đình Khả,
Nguyễn Việt Cường, 2001). Việc nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô những
giống lai mới được chọn tạo này có ý nghĩa rất lớn để sớm đưa vào sản xuất trên diện
rộng mà vẫn giữ được các đặc tính ưu việt của chúng.
Để hạn chế lây lan của dịch bệnh có thể xảy ra thì một trong những biện
pháp kỹ thuật là trồng hỗn loài các dòng vô tính khác nhau. Ở Nước ta hiện nay có
khoảng 12 dòng Bạch đàn đã được Bộ NN&PTNT công nhận và cho phép trồng
rừng sản xuất, trong khi đó mới có U6, GU8, PN2, PN14, PN32 là những dòng đã
được nhân giống bằng nuôi cấy mô đã qua khảo nghiệm, nghiên cứu nhân giống
bằng phương pháp nuôi cấy mô để cung cấp cho rừng trồng.
Hiện nay, nhu cầu cây giống Bạch đàn có năng suất cao và đã qua khảo
nghiệm, cũng như của hai dòng này nhằm phục vụ trồng rừng khá lớn. Thời gian
qua Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp đã thử
nghiệm áp dụng quy trình nhân giống nuôi cấy mô hai dòng UE35 và UE56 và đã
có kết quả bước đầu. Việc nghiên cứu nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô để
hoàn thiện công nghệ và phục vụ sản xuất giống là rất cần thiết. Từ những đặc
điểm, nhu cầu thực tiễn và nhu cầu khoa học nêu trên, chúng tôi tiến hành đề tài:
“Nghiên cứu nhân giống các dòng bạch đàn lai UE35 và UE56 giữa Eucaliptus
urophyla và E. exserta bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô”. Đây cũng là một phần
kết quả của đề tài “Nghiên cứu nhân giống Keo lai tự nhiên, Keo lai nhân tạo, Bạch
đàn urophyla, Bạch đàn lai nhân tạo (mới chọn tạo) và Lát hoa bằng công nghệ tế
bào” - chủ nhiệm đề tài: Đoàn Thị Mai - Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng
thuộc Viện khoa học Lâm nghiệp Việt Nam thực hiện.
6
của tế bào thực vật. Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, người ta
thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy hai nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực
vật là Auxin và Cytokinin. Tỷ lệ hàm lượng hai nhóm chất này trong môi trường
khác nhau sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau theo quy luật được biểu thị ở
sơ đồ bên. Theo sơ đồ, khi trong môi trường nuôi cấy có tỷ lệ nồng độ Auxin (IAA,
IBA, NAA, 2,4-D)/Cytokinin (BAP, Kinetin, Zeatin, TDZ) thấp thì sự phát sinh
hình thái của mô nuôi cấy theo hướng tạo chồi, ngược lại nếu tỷ lệ cao thì mô nuôi
cấy sẽ theo hướng tạo rễ còn ở tỷ lệ cân đối sẽ phát sinh theo hướng tạo mô sẹo
(callus).
1.4. Các nhân tố ảnh hƣởng tới quá trình nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào
Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào gồm nhiều giai đoạn kế tiếp nhau, quá
trình này có thể chia thành các nhân tố sau:
1.4.1. Môi
Trong nuôi cấy in vitro, môi trưởng nuôi cấy và điều kiện bên ngoài được
xem là vấn để quyết định sự thành bại của quá trình nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy
được xem là phần đệm để cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng
trưởng và phân hoá mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro. Cho đến nay, đã có
nhiều môi trường dinh dưỡng được tìm ra (MS-62, WPM, WV3, N6, B5, LS…) tuỳ
thuộc vào đối tượng và mục đích nuôi cấy. Vấn đề lựa chọn môi trường thích hợp
cho cây sinh trưởng và phát triển tối ưu trong từng giai đoạn của nôi cấy mô là rất
quan trọng. Môi trường nuôi cấy của hầu hết các loài thực vật bao gồm các muối
khoáng đa lượng, vi lượng, nguồn các bon, các acid amine và các chất điều hoà sinh
trưởng (cũng có thể bổ sung thêm một số chất phụ gia khác như than hoạt tính, nước
dừa …) tuỳ từng loài, giống, nguồn gốc mẫu, thậm chí từng cơ quan trên cùng cơ
thể mà dinh dưỡng cần cho sự sinh trưởng tối ưu của chúng khác nhau. Vì vậy, vấn
đề cần lựa chọn môi trường thích hợp cho sinh trưởng, phát triển tối ưu cho từng
giai đoạn của hệ mô trong nuôi cấy mô rất quan trọng, số lượng và các loại hoá chất
phải cần độ chính xác cao và phù hợp cho từng giai đoạn, đối tượng cụ thể.
Môi trường nuôi cấy bao gồm thành phần sau:
7
+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp
để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng
hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh,
1991). Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp
mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài
ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường. Người ta thường sử dụng
2 loại đường đó là saccarose và glucose (Trần Văn Minh, 1994).
+ Nguồn Nitơ: tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển
mô. Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là HN4
+
và
NO3
-
(nitrat). Trong đó, việc hấp thụ NO3
-
của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả
hơn so với NH4
+. Nhưng đôi khi NO3
-
gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì
vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng
rãi nhất.
+ Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg,
Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy. Nhìn chung, các nguyên tố này
được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn). Các nguyên tố này có chức
năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu
trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường
được thuận lợi.
Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể
lựa chọn sử dụng. Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình
thành chồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn.
Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng
nồng độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l).
Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất
khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh
lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng.
+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố
rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng
8
vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym. Chúng được dùng ở nồng độ thấp
hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình
thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin,
nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952). Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu
một số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo
từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy. Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là
những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ
thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994).
+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết
nấm men, cà rốt, chối, khoai tây... được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích
thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan. Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy
mô từ năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in
vitro. Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và
DNA. Đặc biệt trong nước dừa còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi
cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của
Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993).
+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của
tảo có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l. Độ thoáng khí của môi trường thạch có
ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy. Nồng độ thạch dao động trong
khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy.
1.4.2.
Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển
của thực vật. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển
của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá
trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác. Các phytohormon có thể chia thành 5
nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid. Chúng là yếu tố quan
trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy.
12
Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ thuỷ tinh và dụng cụ cấy
Dung dịch khử trùng: để khử trùng vật liệu đưa vào nuôi cấy người ta thường
sử dụng các dung dịch như HgCl2 (clorua thuỷ ngân), Na0Cl (Hypoclorit
natri), Ca (0Cl)2 (Hypoclorit canxi), H202 (ôxi già) (Street, 1974)…cồn dùng
để khử trùng mẫu sơ bộ và đốt các dụng cụ khi nuôi cấy.
Phễu lọc vô trùng: dùng để khử trùng các dung dịch, không khử trùng được ở
nhiệt độ cao như dung dịch Enzym hoặc một số chất điều hoà sinh trưởng.
Hiện nay, người ta thường sử dụng một hệ thống bơm khử trùng dung tích
lớn để thanh trùng các dung dịch nuôi cấy khi nuôi cấy tế bào trần hay huyền
phù tế bào.
Buồng vô trùng: nơi đặt bàn cấy cần kín gió, cao ráo, sạch sẽ. Buồng phải
được tiệt trùng liên tục trước và sau khi làm việc bằng Foocmon kết hợp
chiếu đèn tử ngoại.
Bàn cấy vô trùng: Tốt nhất là sử dụng bàn cấy Laminair flow box. Thiết bị
này làm việc theo nguyên tắc lọc không khí vô trùng qua màng và thổi không
khí vô trùng về phía người ngồi thao tác.
1.4
Buồng nuôi cấy là nơi dùng để đặt các mẫu nuôi cấy. Buồng cấy cần phải
đảm bảo các điều kiện:
- Nhiệt độ: 25 - 300C
- Ánh sáng đạt 2000 - 3000 lux.
Sạch sẽ, tránh tiếp xúc với bên ngoài.
1.5. Các giai đoạn chính trong quá trình nhân giống
1.5
Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn mẫu sạch để phục vụ cho các
bước tiếp theo. Giai đoạn này coi như là một bước thuần hoá vật liệu để nuôi cấy.
Cây giống được đưa ra khỏi nơi phân bố tự nhiên để chúng thích ứng với môi
trường mới, đồng thời giảm bớt khả năng nhiễm bệnh của mẫu nuôi cấy và chủ
17
Bạch đàn E. urophylla có thể mọc lẫn với Bạch đàn E. alba (Martin and Cossalater,
1975 - 1976). Bạch đàn urô là cây thích hợp với các lập địa có đất sâu ẩm ở các tỉnh
miền Bắc, Bắc Trung Bộ và Tây Nguyên. Các xuất xứ có triển vọng nhất cho vùng
trung tâm miền Bắc là Lewotobi và Egor Flores (Nguyễn Dương Tài, 1994; Lê
Đình Khả, 1996). Egor Flores cũng là một trong những suất xứ có triển vọng nhất ở
Mang Linh và Lang Hanh của vùng Đà Lạt (Lê Đình Khả, 1996, Phạm Văn Tuấn và
cs, 2001).
1.6.2 exserta)
Bạch đàn liễu (E. exserta) là loài cây gỗ nhỡ đến gỗ lớn khi mọc trên những
nơi đất tốt và lượng mưa cao có thể cao đến 25m, đường kính 60 cm - 1m ở những
nơi khô cạn thì cao đến 10-15m và chiều dài đoạn thân dưới cành ngắn, dưới 1/2
chiều cao của đoạn thân (Bolandetal, 2006) trong khoảng 1500m dọc bờ biển Bạch
đàn liễu có phân bố tự nhiên ở phía Đông bang Queenland đến phía Bắc của
Newsouth Wale trong khoảng 1500km từ 140-260 vĩ độ Nam và 1400- 1550 kinh độ
Đông dọc theo bờ biển.
Đây là loài có khả năng thích ứng rộng với các điều kiện khí hậu và đất đai
khác nhau, từ vùng đất thấp ven biển, đất xấu, đất dốc ngèo dinh dưỡng, vùng đất
đồi, có thể sống trên đất cát nghèo dinh dưỡng, trên đất đồi trơ sỏi đá và trên đất thịt
nặng. Song sinh trưởng tốt nhất trên đất bồi tụ, giàu dinh dưỡng. Bạch đàn liễu sinh
trưởng ở độ cao gần mặt biển đến 900m trên mặt biển, từ nhiệt độ 2-160C của tháng
lạnh nhất nhiệt độ tối cao trung bình của tháng nóng nhất 26-360C.
Bạch đàn liễu có gỗ lõi màu đỏ nâu, có vân đẹp và có độ bền lớn có khối
lượng riêng 905-1000kg/m3 (Boland et al, 2006).
Giống lai tự nhiên giữa Bạch đàn caman (Eucalyptus camaldulensis) với
Bạch đàn đỏ (E. robusta) đã được Lê Đình Khả phát hiện 1970 tại các rừng trồng
Bạch đàn caman (E. camaldulensis) tại các tỉnh Nghệ An, Quảng Ninh, Phú Thọ,
Thái Nguyên, với tỷ lệ 2-3%. Giống lai có hình thái thân cây, vỏ cây, lá, hoa, quả và
giải phẫu như chiều dày lá, số lượng và kích thước tế bào khí khổng, chiều dày vỏ
18
hạt, chiều dày lá mầm, khối lượng 1000 hạt, v.v… Thể hiện tính trung gian giữa hai
loài bố mẹ, đồng thời có sinh trưởng nhanh hơn rõ rệt so với các loài cây bố mẹ. Ở
giai đoạn 7 tuổi Bạch đàn lai có đường kính 9,9 - 14,4 cm, chiều cao 5,1 - 11,4 m,
thì Bạch đàn đỏ có đường kính là 4,3 - 9,7 cm, chiều cao 3,4 - 6,9 m; còn Bạch đàn
caman có các chỉ tiêu này tương ứng là 1,8 - 6,3 cm và 3,1 - 7,4 m (Lê Đình Khả,
1970), nghĩa là giống Bạch đàn lai tự nhiên này có thể tích thân cây gấp 4 - 5 lần
các loài cây bố mẹ.
Điều thú vị là ngay từ khi phát hiện ra đời F2 của Bạch đàn lai tự nhiên có
hiện tượng phân ly theo kiểu nhị hạng thức bậc n dạng (a + b) n, theo 5 dạng khác
nhau với tỷ lệ phân ly theo phần trăm là 1,7: 14,0: 58,4: 8,3: 1,0 mà cây lai F2 thiên
về hệ mẹ là Bạch đàn caman (Lê Đình Khả, 1970).
Đáng tiếc trong thời kỳ này do chưa có kỹ thuật giâm hom thích hợp nên
Bạch đàn lai đã không được phát triển vào sản xuất ở Việt Nam. Một số nơi đã thử
xây dựng vườn giống bằng cây ghép song cũng không thành công.
Lai nhân tạo cho các loài Bạch đàn E. urophylla, E. exserta và E.
camaldulensis ở Việt Nam đã được trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thực hiện
từ năm 1997. Đến năm 2000 hơn 60 tổ hợp lai giữa 3 loài nói trên đã được tạo ra,
trong đó một số dòng hoặc tổ hợp lai sinh trưởng gấp 1,5 - 2 lần bố mẹ.
Một bộ giống gồm nhiều tổ hợp lai khác loài UC, UE, EU, UC, và UU đã
được khảo nghiệm so sánh với các xuất xứ tốt nhất của các loài bố mẹ như UEgon,
U27, U28, U29, E1, E2, E4. Khảo nghiệm được tiến hành tại Thụy Phương (Hà Nội),
Cẩm Quỳ (Hà Tây) và một số vùng khác trong nước.
Khảo nghiệm đã cho thấy lai thuận nghịch ở những điều kiện lập địa khác
nhau, sinh trưởng của các tổ hợp lai cũng thay đổi theo từng điều kiện lập địa. Ví
dụ, ở Thụy Phương tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất là giống Bạch đàn urô với
Bạch đàn caman. Trong khi ở Ba Vì các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất lại là
giữa Bạch đàn urô và Bạch đàn liễu (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2002).
Sau khi đã tạo được tổ hợp lai và khảo nghiệm giống lai đã chọn lọc được
một số cây trội trong các tổ hợp lai có sinh trưởng nhanh nhất, vượt xuất xứ Egon
19
Flores của E. urophylla (xuất xứ tốt nhất) về thể tích lá 51,3 - 247,4% (có thể tích
thân cây gấp 1,5 - 3,5 lần giống sản xuất tốt nhất). Năm 2001 Bộ NN&PTNT đã có
quyết định số 4356 (ngày 19/9) công nhận 31 cây trội thuộc 8 tổ hợp lai U29E1,
U29E2, U29C3, U29C4, U29U4, U29U26, U15C4, U30E5 (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt
Cường, 2001). Các giống lai này đã được Nguyễn Việt Cường và cs (2007, 2008)
tiếp tục khảo nghiệm ở một số nơi từ đó đã chọn được các dòng vô tính sinh trưởng
nhanh đã được Bộ NN&PTNT công nhận là giống quốc gia hoặc giống tiến bộ kỹ
thuật.
Khảo nghiệm tại lâm trường Vạn Xuân cho thấy các dòng Bạch đàn lai được
chọn có một số dòng sinh trưởng vượt trội rõ rệt so với các dòng đối chứng như:
U6, GU8, PN2, PN14 cả về đường kính, chiều cao và chỉ số thể tích thân cây, đặc
biệt là các dòng U29E1.24, U29E2.5, U15E4.83. Những dòng này có chỉ số thể tích (Iv
= D
2H) bằng 70,4 - 73,9, trong khi dòng Bạch đàn GU8 có chỉ số thể tích 50,3, còn
các dòng khác như PN2, PN14 và U6 có chỉ số thể tích thân cây là 23,5 - 31,7 (Lê
Đình Khả et al, 2003).
Một số tổ hợp lai khác loài mới giữa các loài E. tereticornis (T), E. pellita
(P), E. camandulensis (C) và E. urophylla (U) được tạo ra sau này và khảo nghiệm
tại Minh Đức (tỉnh Bình Dương) cũng thấy rằng sau 2 năm các tổ hợp lai T1P17,
C1P17, P18U29C3, v.v… có thể đạt thể tích thân cây 21,8 - 26,1 dm3/cây, trong lúc
giống U29 có thể tích thân cây 9,7 dm3/cây, một số giống sinh trưởng kém nhất
trong khảo nghiệm chỉ đạt 6,8 - 8,5 dm3/cây (Nguyễn Việt Cường, 2006).
Theo quy trình trồng Bạch đàn urophylla của ta (04-TCN-26-2001) quy định
mật độ trồng rừng là 1100 - 1660 cây/ha. Song kết quả nghiên cứu của Stape C.R.,
C.R. Silva (2007) cho nhiều công thức mật độ trồng Bạch đàn khác nhau tại Brazin
đã thấy là mật độ 500-900 cây/ha chưa cho năng suất cao, mật độ 1500 cây/ha bắt
đầu có năng suất cao, những mật độ khác năng suất tăng lên không đáng kể. Vì thế
với Bạch đàn chúng tôi chỉ dùng một mật độ trồng 1660 cây/ha với các công thức
bón phân khác nhau.
24
P. radiate ở viện nghiên cứu lâm nghiệp New Dilan; Thông P. taera và Pseudotsuga
menziesii ở Mỹ.
Darus H. Ahmas thuộc viện nghiên cứu lâm nghiệp Malaysia đã nuôi cấy mô
tế bào cây keo tai tượng (Accasia mangium) bằng môi trường MS có bổ sung 3%
Sucrose, 0,6% agar và 0,5 mg/l BAP cho giai đoạn nhân chồi. Những chồi có chiều
cao >0,5cm được cấy vào môi trường tạo rễ và chất điều hoà sinh trưởng tốt nhất
cho tạo rễ là IBA 1000 ppm với tỷ lệ ra rễ là 40% (O. L. Gamborg, G. C. Phillips,
1997).
Người ta cũng đã nhân giống thành công Phi lao bằng biện pháp nuôi cây mô
và đã trồng so sánh với cây hạt trong nhà kính. Kỹ thuật này đang được áp dụng để
tạo cây mô Phi lao sinh trưởng nhanh, kháng bệnh và cố định đạm cao cho trồng
rừng (Nguyên Quang Thạch, 2000).
Các biện pháp nuôi cấy mô cũng đã được áp dụng cho cây Tếch (Tectona
grandis). Gupta và các cộng sự (1979) đã mô tả sự hình thành cụm chồi từ phần cắt
của cây non và từ mầm cây 100 tuổi, từ đó họ có thể tạo được 500 cây nuôi cấy mô
từ một chồi ở cây trưởng thành và 3000 cây từ 1 cây non trong một năm. Kaosaard
(1990) cho biết Thái Lan cũng phát triển thành công kỹ thuật nuôi cấy mô vào năm
1986 cho cây Tếch và cho phép tạo ra 500.000 chồi từ một chồi trong một năm
(Ikemori, Y.K., 1987). Perhutani (Indonesia, 1991) đã thử nghiệm và nuôi cấy mô
thành công đối với loài Tếch và một vài cây mô đã được đem trồng thử.
Nhân giống nuôi cấy mô tế bào đối với cây rừng đã thu được những thành
công đáng kể, đây là một khâu quan trọng góp phần tăng năng suất rừng trồng trên
thế giới trong những năm gần đây. Trong đó phải kể đến công nghệ nhân giống nuôi
cấy mô cây Tếch, các dòng Bạch đàn chọn lọc ở Thái Lan, Trung Quốc, các loài
Bạch đàn lai ở Brazin, Công Gô, Australia, cây Vân sam (Picea), Thông Radiata
(Pinus radiata) ở New Zealand, Thông Caribê (Pinus caribaea) và Thông lai (P.
caribaea x P. elliottii) ở Austraylia… (Dr. Phundan sigh, 2001).
W.Nitiwattanachai (Trindate, H. Ferreina, J. G. Pais, M. S. Aloni, R., 1990)
đã nuôi cấy thành công cây Keo lá tràm (Acacia auriculiformis). Môi trường nhân
25
nhanh chồi là MS (1962) + 10 μM BAP + 0,5 μM IBA, môi trường sử dụng cho tạo
rễ là White (1963) + 2 μM IBA + 1 μM NAA.
Cũng với cây Keo tai tượng, V.J. Hartney và cs thuộc (Division of Forest
Research) đã sản xuất cây con thành công bằng nuôi cấy chồi in vitro. Môi trường
nuôi cấy được sử dụng là WPM + 3% Sucrose + 0,8 % agar + 1 μM BAP + 1 μM
NAA. Nhiệt độ trong quá trình nuôi cấy duy trì ở 250C (± 40C), giai đoạn khử trùng
mẫu để tạo vật liệu ban đầu tác giả đã sử dụng muối hypoclorite 4% và khử trùng
trong thời gian 20 phút (sharma, J.K., 1994).
1.7.2. N cây gỗ
Bạch đàn là một trong các loài cây trồng rừng chính của Việt Nam, không
chỉ đối với trồng rừng tập trung mà còn cả đối với trồng cây phân tán, trồng cây
trong các hộ gia đình.
Cho tới trước những năm 1970 đã có trên 50 loài Bạch đàn được khảo
nghiệm ở Việt Nam và từ đó đến nay đã có hàng chục loài được khảo nghiệm trên
diện rộng với khá nhiều xuất xứ làm cơ sở cho chọn loài và xuất xứ sinh trưởng
nhanh phục vụ trồng rừng đại trà (Lê Đình Khả, Nguyễn Hoàng Nghĩa, Hoàng
Trương, 1993).
Những cơ sở hiện nay đang nhân giống bằng nuôi cấy mô ở quy mô lớn
trong lâm nghiệp nước ta là Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng thuộc viện khoa
học lâm nghiệp, Viện nghiên cứu cây nguyên liệu giấy Phù Ninh Phú Thọ, Công ty
giống lâm nghiệp trung ương, trung tâm khoa học sản xuất và ứng dụng Quảng
Ninh, xí nghiệp giống Thành Phố Hồ Chí Minh, Trường đại học Lâm nghiệp…
Hiện nay một số tỉnh và địa phương đã thành lập phòng nuôi cấy mô để phục vụ cho
công tác giống cây trồng và đã đạt được những thành công bước đầu.
Nuôi cấy mô ở nước ta đã áp dụng rộng rãi trong công tác nhân giống một số
giống Bạch đàn nhập nội, các dòng vô tính Bạch đàn lai và keo lai có năng suất cao.
Cùng với những kết quả về cải thiện giống Trung tâm nghiên cứu giống cây rừng đã
nghiên cứu thành công kỹ thuật nuôi cây mô tế bào cho Keo lai, Bạch đàn và một số
cây rừng khác (Lê Đình khả và cs, 2003).
28
CHƢƠNG 2
MỤC TIÊU, ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
Xác định môi trường (hoá học và vật lý) phù hợp để nhân giống 2 dòng
UE35 và UE56 của bạch đàn lai giữa (E. urophylla x E. exserta) bằng
phương pháp nuôi cấy mô.
Tạo ra cây con hoàn chỉnh bằng phương pháp nuôi cấy mô cho các dòng
UE35 và dòng UE56.
Huấn luyện và cấy cây con ra vườn ươm.
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu
Tiến hành nghiên cứu nhân giống cho 2 dòng UE35 và dòng UE56. Hai dòng
này đã được tuyển chọn và trồng khảo nghiệm dòng vô tính tại trung tâm nghiên
cứu giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam.
Dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 đã được tuyển chọn thông qua khảo
nghiệm dòng vô tính và được cho là nhóm có sinh trưởng tương đối nhanh.
Hai dòng Bạch đàn UE35 và UE56 là cây trội được chọn từ các tổ hợp lai
U29E2 và U29E4, đây là những tổ hợp lai thuộc nhóm có sinh trưởng nhanh thích hợp
cho trồng rừng trên đất nghèo dinh dưỡng đồi núi miền Bắc. Dòng UE35 được tạo
ra từ đề tài lai giống Bạch đàn (Lê Đình Khả, 2001), đã qua khảo nghiệm giống.
Cây lấy mẫu là cây 1,5 tuổi trồng tại Trung tâm giống cây rừng thuộc viện
khoa học lâm nghiệp Việt Nam và chồi gốc của cây 3 năm trồng thí nghiệm tại Cẩm
Quỳ (Hà Nội) (Lê Đình Khả, Nguyễn Việt Cường, 2001) và (Lê Đình Khả, Nguyễn
Việt Cường, Ngô Minh Chí, 2007).
29
Mẫu nuôi cấy (explant) lấy từ chồi bên của cây cấp dòng. Mẫu được lấy ở
chồi 15 ngày tuổi, sinh trưởng tốt, không sâu bệnh. Chồi được cắt bỏ phần ngọn
non, một phần cuống lá mà toàn bộ phiến lá. Mẫu cấy có chiều dài từ 1,5 - 3cm,
đường kính từ 2 - 3mm mang từ 2-3 nách lá, trong đoạn từ lá thứ 3 - 6. Đề tài tiến
hành nghiên cứu ở phòng thí nghiệm và vườn ươm tại Trung tâm nghiên cứu giống
cây lâm nghiệp thuộc Viện khoa học Việt Nam và khu nuôi cấy mô tế bào - Viện
khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
2.3. Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục đích nghiên cứu, đề tài thực hiện các nội dung sau đây:
1. Khử trùng mẫu vật nuôi ở các nồng độ khác nhau của HgCl2 và Ca (0Cl)2
trong các khoảng thời gian khác nhau để tìm ra chất khử trùng mẫu thích
hợp.
2. Nuôi cấy mẫu trong 5 loại môi trường và xác định môi trường thích hợp cho
giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu và nhân nhanh chồi.
3. Thử nghiệm ảnh hưởng của vitamin B2 tới hệ số nhân chồi (HSNC) và tỷ lệ
chồi hữu hiệu (TLCHH) của quá trình nuôi cấy.
4. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng
phối hợp của chúng đến HSNC và tỷ lệ chồi hữu hiệu (TLCHH).
5. Thử nghiệm ảnh hưởng của một số chất điều hoà sinh trưởng và ảnh hưởng
của chúng đến hiệu quả của giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (giai đoạn tạo
rễ).
6. Thử nghiệm ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh
trưởng chiều cao của cây con ở giai đoạn vườn ươm.
30
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
UE35 và UE56
Dòng tuyển chọn
Tạo cây hom
Khử trùng mẫu
(Bằng dung dịch HgCl2 hoặc Ca (ClO)2 hay các hoá chất có tính diệt khuẩn khác ở các
nồng độ khác nhau)
Tạo chồi ban đầu
(Xác định môi trường tái sinh chồi thích hợp)
Nhân chồi
(Xác định môi trường nhân chồi thích hợp được bổ sung các chất kích thích sinh
trưởng như BAP và Kinetin ở các nồng độ khác nhau)
Tạo rễ
(Tạo rễ in-vitro: Xác định môi trường và phương pháp ra rễ hiệu quả)
Vƣờn ƣơm
* Cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và tái sinh tốt.
Khử trùng mẫu bằng chất hoá học có hoạt tính diệt nấm khuẩn được tiến hành qua
các bước:
Rửa xà phòng loãng
Rửa dưới vòi nước chảy
Tráng nước cất
Ngâm trong dung dịch khử trùng khoảng 5 - 15 phút
Đổ bỏ dung dịch khử trùng, rửa lại bằng nước cất từ 3-5 lần
Cấy mẫu vào môi trường tái sinh chồi ban đầu, các thao tác được thực hiện
trong buồng cấy vô trùng
35
Từ các thí nghiệm trên, chúng tôi đã thu được môi trường MS* + 30mg/l
đường + 5,5 mg/l agar + mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA là tốt nhất cho HSNC và
TLCHH của 2 dòng. Tuy nhiên, để tìm ra môi trường thích hợp hơn cho nhân nhanh
chồi. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp của Kinetin với tổ hợp
BAP và NAA.
Kinetin được bổ sung vào môi trường MS* + 30mg/l đường + 5,5 mg/l agar
+ mg/l B2 + mg/l BAP + mg/l NAA với hàm lượng thay đổi là:
Bảng 2.6: Công thức thí nghiệm nhân chồi
Công
thức
Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng
Kinetin
ĐC ĐC 0
CT 39
MS* + mg/l BAP
+ mg/l NAA +
0,5 mg/l
CT 40 1,0 mg/l
CT 41 1,5 mg/l
CT 42 2,0 mg/l
2.4.4.6. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và chiều
dài trung bình của rễ
IBA được bổ sung vào môi trường 1/2 MS* + 15 mg/l đường + 5 g/l agar, pH
= 6,5. IBA ở nồng độ thay đổi là:
Bảng 2.7: Công thức thí nghiệm ra rễ
Công
thức
Nồng độ và chất điều hoà sinh trưởng
IBA
ĐC ĐC 0
CT 44
1/2 MS* +
1,0 mg/l
CT 45 2,0 mg/l
CT 46 3,0 mg/l
CT 47 4,0 mg/l
36
2.4.4.7. Ảnh hưởng của nồng độ IBA+ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây và
chiều dài trung bình của rễ
Để xác định ảnh hưởng của nồng độ IBA và ABT1 đến quá trình hình thành
rễ của hai dòng UE35 và UE56, đề tài bổ sung ABT1 vào môi trường 1/2MS*+
30g/l đường + 5,0g/l agar + mg/l IBA + nồng độ ABT thay đổi như sau:
Bảng 2. 8: Công thức thí nghiệm ra rễ
Công
thức
Nồng độ và chất điều hoà sinh
trưởng
ABT1
ĐC ĐC 0
CT 44
1/2 MS* + mg/l IBA +
1,0 mg/l
CT 45 2,0 mg/l
CT 46 3,0 mg/l
CT 47 4,0 mg/l
2.4.4.8. Ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao cây con ở
vườn ươm
Trước khi đưa cây con trong ống nghiệm ra trồng ở vườn ươm, đề tài chuyển
các bình cây (cây hoàn chỉnh ở trong bình) ra môi trường bên ngoài, mục đích để
cây con làm quen dần với điều kiện ngoài vườn ươm (gọi là giai đoạn huấn luyện).
Đặt bình cây ra điều kiện ánh sáng và nhiệt độ tự nhiên với cường độ ánh sáng từ
5.000 - 10.000 lux, không cho ánh nắng chiếu trực tiếp vào bình nuôi cây.
Nhằm xác định thời gian huấn luyện cây con để có thể rút ngắn hoặc kéo dài
so với sản xuất. Chúng tôi thử nghiệm 5 khoảng thời gian huấn luyện cây con.
Huấn luyện cây để ở ánh sáng và nhiệt độ trong điều kiện tự nhiên:
- Không huấn luyện (0 ngày)
- 4 ngày
- 12 ngày
- 16 ngày
37
Sau khi huấn luyện, cây con được trồng ra bầu khoảng 4 tuần thì tiến hành
đo đếm tỷ lệ sống, chiều cao và sinh trưởng của cây để đánh giá ảnh hưởng của thời
gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và sinh trưởng chiều cao của cây trong giai đoạn
vườn ươm.
Quá trình lấy cây con ra khỏi bình, trồng cây vào bầu đất và chăm sóc cây
ngoài vườn ươm được tiến hành theo các bước kỹ thuật được thực hiện tại Trung
tâm giống cây rừng thuộc Viện khoa học lâm nghiệp Việt Nam và khu công nghệ tế
bào Viện khoa học sự sống thuộc Trường đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
1. Tạo bầu cấy cây: Dùng bầu nhựa PE có đường kình 5,5 cm, cao 11 cm, có
đục lỗ dưới đáy. Thành ruột bầu là đất tầng B 100% đập nhỏ, sàng bỏ rễ cây
và các tạp chất khác.
2. Xử lý bầu: Trước khi cấy 1-2 ngày, bầu đất được xử lý khử trùng mầm bệnh
bằng dung dịch thuốc tím 0,1% (hoà thuốc tìm vào nước và dùng ô doa tưới
lên bề mặt bầu cho thấm sâu 2-3cm).
3. Lấy cây ra khỏi bình và cấy vào bầu
- Tạo hỗn hợp hồ rễ: Trộn đất tầng B với dung dịch thuốc tím 0,1% với tỷ
lệ thể tích đất/dung dịch thuốc tím = 1/1 trước khi ra cây 12-24 giờ.
- Lấy cây ra khỏi bình: cây mầm lấy từ trong lọ đổ ra lòng bàn tay, nhặt
từng cây ra khỏi môi trường nuôi cấy và rửa sạch. Nhúng rễ cây vào hỗn
hợp hồ rễ
- Cấy cây đã hồ rễ vào bầu đất đã được xử lý và để bay hơi sau 1 ngày.
4. Chăm sóc cây sau khi cấy: Cây sau khi cấy được che bằng lưới đen (độ tàn
che 50-60%) 10-15 ngày sau khi cấy. Sau 2 tuần tưới phân NPK tỷ lệ
(5:10:3) nồng độ 0,3%, sau khi tưới rửa lại bằng nước sạch. Phun phòng nấm
bệnh bằng dung dịch Bellate nồng độ 5g/10 lít nước, 1 tuần một lần. Thu
thập tỷ lệ sống và đo chiều cao của cây sau khi cấy 4 tuần.
2.4.4.9. Điều kiện thí nghiệm
Quá trình nuôi cấy (nhân chồi và tạo rễ) được tiến hành trong điều kiện nhân
tạo. Ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm được duy trì như sau:
38
- Ánh sáng: Mẫu được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ ánh sáng
từ 1500 - 3000 lux, thời gian chiếu sáng 10h/ngày.
- Nhiệt độ: nhiệt độ trong phòng duy trì từ 23-250C (±2)
- Độ ẩm thường xuyên xấp xỉ 60%
2.4.5.
Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên theo khối với 3 lần lặp (Andrew. I, 1991,
số 71, 39 trang).
Với thí nghiệm về ảnh hưởng nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng, thí
nghiệm chọn loại môi trường, mỗi công thức theo dõi 60 mẫu (ống nghiệm, đánh
giá kết quả sau 4 tuần nuôi cấy qua HSNC).
Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường nhân chồi, mỗi công thức theo dõi 10
bình, mỗi bình 6 mẫu. Môi trường chứa trong bình tam giác, đánh giá kết quả
HSNC và TLCHH sau 4 tuần nuôi cấy.
Các thí nghiệm nghiên cứu môi trường tạo rễ, mỗi công thức theo dõi 10
bình, mỗi bình 30 chồi. Môi trường được chứa trong bình trụ đường kính 6cm hoặc
10cm, chiều cao 15 - 20 cm, với nắp nilong quấn nịt cao su kép. Thu thập tỷ lệ ra rễ,
số rễ tạo thành và chiều dài của rễ sau 2 tuần nuôi cấy.
Thí nghiệm về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều
cao của cây con ở vườn ươm, mỗi công thức theo dõi 30 bình và đo đếm 30 cây tại
vườn ươm.
2.4.6
* Thu thập số liệu
+ Các chỉ tiêu đo đếm trong phòng thí nghiệm:
1. Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) =
Tổng số mẫu nhiễm
x 100
Tổng số mẫu ban đầu
2. Tỷ lệ mẫu sống (%) =
Tổng số mẫu sống
x 100
Tổng số mẫu ban đầu
3. Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) =
Tổng số mẫu nảy chồi
x 100
Tổng số mẫu thí nghiệm
43
Ảnh 3.1. Khử trùng mẫu và mẫu nuôi cấy sau 20 ngày
3.2. Ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi ban đầu
Bảng 3.2: Bảng ảnh hƣởng của mùa vụ đến khả năng tái sinh chồi
Tháng
Dòng UE35 Dòng UE56
Thời gian
bật chồi
Tỷ lệ
mẫu
nhiễm
(%)
Tỷ lệ
mẫu bật
chồi
(%)
Tỷ lệ
mẫu
nhiễm
(%)
Tỷ lệ
mẫu bật
chồi
(%)
1 - 3 53,84 3,24 45,22 2,15 32 ngày
4 - 6 52,56 12,53 41,35 13,10 28 ngày
7 - 9 42,91 15,76 46,22 16,05 27 ngày
10 - 12 65,24 4,25 50,05 5,63 36 ngày
Kết quả thí nghiệm cho thấy, dòng UE35 tháng 4-6 kết quả khử trùng với chỉ
số tỷ lệ mẫu nhiễm là 52,56%, tỷ lệ mẫu bật chồi là 12,53% trong 28 ngày và tháng
7-9 mẫu nhiễm là 42,9%, mẫu bật chồi là 15,76% ở thời gian này trong năm với
thời gian là 27 ngày mẫu đạt tỷ lệ tốt nhất; dòng UE56 ở tháng 4-6 kết quả khử
trùng với chỉ số tỷ lệ mẫu nhiễm là 41,35, tỷ lệ mẫu bật chồi là 13,10 trong 28 ngày
và tháng 7-9 mẫu nhiễm là 46,22, mẫu bật chồi là 16,05 ở thời gian này trong năm
với thời gian là 27 ngày mẫu đạt tỷ lệ tốt nhất. Cũng như một số giống cây rừng nói
chung, thời gian khử trùng mẫu thích hợp nhất là từ tháng 4 đến tháng 10 hàng năm.
Trong khoảng thời gian này, kết quả khử trùng đạt được là cao nhất (tỷ lệ nhiễm
44
thấp, tỷ lệ bật chồi cao và thời gian bật chồi cũng ngắn nhất) do đây là thời điểm
sinh trưởng thích hợp của các đối tượng nghiên cứu.
Tuy nhiên, để xác định chính xác thời gian thích hợp nhất cho các thí nghiệm
khử trùng, đề tài tiếp tục các thí nghiệm lặp lại trong thời gian tới. Nhằm tối ưu hoá
từng khâu trong quá trình nhân giống để xây dựng bản hướng dẫn kỹ thuật nhân
giống cho các đối tượng nghiên cứu.
3.3. Nghiên cứu loại môi trƣờng thích hợp cho nhân nhanh chồi
Để có sự thành công đối với nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô thì
giai đoạn quan trọng đó là xác định môi trường nuôi cấy thích hợp cho đối tượng cần
nhân giống. Với các công bố về môi trường nhân giống cây Bạch đàn còn hạn chế,
thêm vào đó chưa có môi trường cụ thể nào và có độ tin cậy cao cho dòng Bạch đàn
lai. Do vậy, đề tài thử nghiệm một số môi trường, sử dụng để nhân giống các loài cây
thân gỗ. Từ đó chọn ra môi trường thích hợp cho nghiên cứu hai dòng Bạch đàn trên.
Trong điều kiện nuôi cấy mô tế bào HSNC và TLCHH phụ thuộc vào thành
phần môi trường, nồng độ chất dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy. Các
nghiên cứu giai đoạn này nhằm tìm ra được môi trường thích hợp cho giai đoạn
nhân nhanh chồi, giai đoạn có vai trò quyết định đến hiệu quả của quá trình nhân
giống. Kết quả được trình bày bảng dưới đây.
Bảng 3.3: Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của 5 loại môi trƣờng đến HSNC và
TLCHH của dòng UE35 và UE56 (tổng số 180 mẫu/môi trƣờng)
Loại
môi
trường
Dòng UE35 Dòng UE56
Số chồi thu
được
HSNC (lần) Số chồi thu
được
HSNC
(lần)
Litvay 200 1,11 192 1,07
WPM 184 1,02 170 0,94
MS
*
213 1,18 211 1,17
MS 173 0,96 165 0,92
WV3 195 1.08 186 1,03
(MS
*: là môi trường MS cải tiến có bổ sung thêm một số vitamin và khoáng chất)
48
¶nh 3.4a. Chồi nuôi cấy trong môi trƣờng MS* có bổ sung 2.0 mg/l vitamin B2
Đồ thị 3.1b. ¶nh hƣởng của vitamin B2 đến TLCHH của
UE35 và UE56
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0
Nồng độ vitamin B2 (mg/l)
TLCHH
(%)
Dòng UE35
Dòng UE56
Đồ thị 3.1a. ¶nh hƣởng của vitamin B2 đến HSNC
của hai dòng UE35 và UE56 56
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0
Nồng độ vitamin B2 (mg/l)
HSNC (lần)
Dòng 35
Dòng 56
(lần)
50
3.5. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng trong môi trƣờng MS* đến
HSNC và TLCHH
Các đề tài ghiên cứu nuôi cấy mô tế bào cho thấy chất điều hoà sinh trưởng
là rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả của giai đoạn trong nhân giống. Nó ảnh
hưởng đến HSNC (đó là khả năng nhân nhanh chồi, TLCHH) và TLCHH (Đoàn
Thị Ái Thuyên và cs, 2001). Với đề tài này, chất điều hoà sinh trưởng Cytokinin là
BAP, Kinetin và nhóm Auxin đó là NAA, IBA, ABT1.
3.5 TLCHH
BAP là chất kích thích tạo chồi tốt cho quá trình nhân nhanh, nó được sử
dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Với kết quả theo dõi ảnh hưởng của BAP đến HSNC và TLCHH của dòng
UE35 và dòng UE56 và được trình bày tại bảng 3.4 và đồ thị 4a, 4b. Kết quả thấy
rằng BAP có ảnh hưởng tích cực đến quá trình nhân chồi, sinh trưởng và chiều cao
chồi nuôi cấy. Khi tăng nồng độ từ 0 - 2mg/l thì thấy khả năng nhân chồi là rất rõ.
Còn ở công thức không có BAP (đối chứng) thì HSNC và TLCHH của dòng UE35
là 1,43 lần và 19%, dòng 56 là 1,37 lần và 17,5%. Ở môi trường nồng độ BAP là
2,0 mg/l có HSNC và TLCHH của UE35 là 2,16 lần và 24,2%, dòng UE56 là 2,02
lần và 22,3%.
Nhưng khi tăng nồng độ từ 2,0 - 3,0 mg/l thì HSNC và TLCHH của cả 2
dòng đều giảm (dòng UE35 là 1,96 lần, TLCHH là 18,7%; dòng UE56 là 1,78 lần
và 15,9%). Còn nồng độ 4,0 mg/l thì cả 2 dòng HSNC và TLCHH đều giảm mạnh
(dòng UE35 là 1,91 lần và 12,5%; dòng UE56 là 1,63 lần và 12,9%). Ở môi trường
có nồng độ BAP là 4,0mg/l xuất hiện những chồi nhỏ, mảnh, chồi hình thành không
rõ rệt thân, lá, ngọn những chồi này không có tác dụng cho những lần nhân chồi tiếp
theo cũng như cấy chuyển sang môi trường tạo rễ do vậy không được đo đếm.
Nhiều chồi cấy hình thành khối callus to ở gốc. Như vậy thấy rằng nồng độ BAP
cao đã ức chế sinh trưởng và phát triển của chồi. Theo G. J de Klerk, 1999 nồng độ
BAP cao sẽ kìm hãm sự phát triển của quần thể chồi, chồi sinh trưởng và phát triển
không bình thường, mất sắc tố diệp lục.
51
Bảng 3.5: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH của Bạch đàn
lai dòng UE35 và UE56 (180 mẫu/công thức)
Nồng
độ
BAP
(mg/l)
Dòng UE35 Dòng UE56
Chất
lượng
chồi
Số
chồi
thu
được
Chồi
hữu
hiệu
HSNC
(lần)
TLCHH
(%)
Số
chồi
thu
được
Chồi
hữu
hiệu
HSNC
(lần)
TLCHH
(%)
0,0 258 49 1,43 19,0 246 43 1,37 17,5 +
1,0 327 72 1,82 22,0 332 64 1,84 19,3 + +
2,0 388 94 2,16 24,2 363 81 2,02 22,3 + + +
3,0 353 66 1,96 18,7 320 51 1,78 15,9 + +
4,0 344 43 1,91 12,5 294 38 1,63 12,9 +
Ghi chú: + : Chồi sinh trưởng kém
++ : Chồi sinh trưởng ở mức độ trung bình
+++: Chồi sinh trưởng tốt, mập
Biểu đồ 3.2a. ¶nh hƣởng của BAP đến HSNC của
2 dòng UE35 và UE56
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0
Nồng độ BAP (mg/l)
Hệ số nhân chồi (lần)
Dòng UE35
Dòng UE56
55
- HSNC và TLCHH ở các công thức nồng độ IAA có sự khác nhau với α =
0,05 vì bảng Anova cho thấy giá trị Sig của F < 0,05 ở cả 2 chỉ tiêu HSNC và
TLCHH của 2 dòng.
- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan thấy: HSNC của dòng UE35 và UE56 ở
nồng độ 0,5 mg/l là tốt nhất. TLCHH của dòng UE35, UE56 ở nồng độ 0 và 0,5; 1,0
mg/l là những nồng độ tốt nhất trong nhóm.
3.5
*
TLCHH
Do các nồng độ của IAA ảnh hưởng không nhiều đến HSNC và TLCHH của
2 dòng nghiên cứu, bên cạnh đó NAA cũng là chất điều hoà sinh trưởng nhân tạo
thường có tác dụng mạnh hơn IAA ở đa số loài thực vật (Trần Văn Minh, 1994);
(Nguyễn Văn Uyển, 1993); (Vũ Văn Vụ, 1994). Do đó để tìm ra tổ hợp BAP và
auxine thích hợp cho nhân nhanh chồi của 2 dòng Bạch đàn lai này, ngoài IAA đề
tài còn nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ của NAA đến HSNC và TLCHH.
Đề tài bổ sung NAA với các nồng độ đó là: 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l vào môi
trường MS* + 2,0 mg/l B2 + 2,0 mg/l BAP + 30 mg/l đường + 5 g/l agar, pH= 6,5
(môi trường tốt nhất ở mục 3.4.1). Kết quả được trình bày bảng 3.7 và đồ thị 6a, 6b.
Hình 3.5. ¶nh của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA trong môi trƣờng MS* đến
HSNC và TLCHH
0BAP 0,5 mg/l -NAA 1,0 mg/l -NAA 1,5 mg/l -NAA
56
Bảng 3.7: Ảnh hƣởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC và
TLCHH của 2 dòng Bạch đàn lai UE35 và UE56 (180 mẫu cấy/công thức)
Nồng
độ
NAA
(mg/l)
Dòng UE35 Dòng UE56
Chất
lượng
chồi
Chồi
thu
được
Số
chồi
hữu
hiệu
HSNC
(lần)
TLCHH
(%)
Chồi
thu
được
Số
chồi
hữu
hiệu
HSNC
(lần)
TLCHH
(%)
0 396 97 2,20 24,5 369 84 2,05 22,8 ++
0,5 438 117 2,43 26,7 416 106 2,31 25,5 ++
1,0 470 133 2,61 28,3 437 119 2,43 27,2 +++
1,5 392 73 2,18 18,6 382 66 2,12 17,3 +
2,0 363 44 1,02 12,1 354 40 1,97 11,3 +
Qua bảng số liệu trên ta thấy, tổ hợp BAP + NAA có tác động tích cự rõ hơn
tổ hợp BAP + IAA đến HSNC và TLCHH, chỉ tiêu theo dõi tăng ở nồng độ 0,5 - 1,0
mg/l (dòng UE35 là 2,43 lần, 2,67%; dòng UE56 là 2,31 lần, 25,5% và dòng UE35
là 2,61 lần, 28,3 %; dòng UE56 là 2,43 lần, 27,2%).
Môi trường có bổ sung với nồng độ NAA là 1,5 - 2,0 mg/l thì HSNC và
TLCHH đều giảm rõ rệt so với nồng độ 1,0 mg/l, điều này chứng tỏ với nồng độ
NAA cao sẽ tác động hạn chế đến tỷ lệ nhân chồi của 2 dòng Bạch đàn lai nói trên.
Ở nồng độ 0,5 và 1 mg/l chồi mập, sinh trưởng và phát triển tốt, lá xanh, cây
khoẻ, thân lá rõ ràng hơn khi bổ sung IAA. Môi trường bổ sung nồng độ NAA lên
2,0 mg/l thì chiều cao của chồi thấp, hình thái chồi cằn cỗi, hình thành nhiều rễ ở
thân chồi (phụ lục 11).
Biểu đồ 3.4a. ¶nh hƣởng sự phối hợp nồng độ BAP + NAA đến HSNC
của dòng UE35 và UE56
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Nồng độ NAA (mg/l)
HSNC (lần)
Dòng UE35
Dòng UE56
57
Phân tích phương sai về ảnh hưởng của NAA đến HSNC và TLCHH của
dòng UE35 cho thấy (phụ lục 11): Giá trị Sig trong bảng kiểm tra phương sai tổng
thể của 2 chỉ tiêu HSNC = 0,171 > 0,05, TLCHH = 0,510 > 0,05. Như vậy, các biến
ngẫu nhiên của 2 chỉ tiêu trên có phương sai bằng nhau.
- Giá trị Sig trong bảng phân tích phương sai thì HSNC và TLCHH đều bằng
0,00 < 0,05, vậy các công thức có bổ sung nồng độ NAA thấy khác nhau rõ rệt với 2
chỉ tiêu được đánh giá có mức độ tin cậy 95%.
- Bảng phân nhóm Duncan cho thấy HSNC cao nhất ở nồng độ 1,0 mg/l,
TLCHH ở 2 nồng độ 0,5 và 1,0 mg/l là một nhóm cao nhất, với độ tin cây 95%.
Tương tự với dòng UE56 ta thấy: phương sai của biến ngẫu nhiên bằng nhau,
phân tích phương sai thu được kết quả HSNC và TLCHH ở các công thức là khác
nhau rất rõ. Nồng độ 1,0 mg/l với HSNC và TLCHH lần lượt là: 2,43 lần và 27,2%
với độ tin cậy 95%.
Với kết quả phân tích từ bảng biểu trên, môi trường MS* + 2,0 mg/l B2 + 2,0
mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA, pH = 6,5 là tốt nhất cho nhân chồi 2 dòng UE35 và
UE56. Môi trường này được thí nghiệm tiếp cho nhân nhanh chồi tiếp theo.
Việc thử nghiệm tổ hợp chất điều hoà sinh trưởng này (BAP + NAA) phù
hợp với một số nghiên cứu trong và ngoài nước (Mai Đình Hồng, 1999); (Đoàn Thị
Nga, 2003); (Daurus H. Alunad, 1994); (Semsuntud N. and Nitiwattanachai. W.,
1992), tuy nhiên với mỗi loài cây thì nồng độ sử dụng cũng khác nhau. Đặc biệt các
công bố của Đoàn Thị Mai và cs, 2000, 2005, 2008; Đoàn Thanh Nga, 2003 đều sử
dụng tổ hợp BAP + NAA để nhân giống nuôi cấy mô cho cây Bạch đàn một số
dòng và một số cây rừng khác, ở nồng độ khác nhau.
61
thấp hơn so với BAP + NAA. Vậy nên đề tài nghiên cứu thử nghiệm ảnh hưởng của
sự phối hợp Kinetin với tổ hợp BAP + NAA.
Kinetin được bổ sung vào môi trường thí nghiệm 3.4.3 là: MS* + 2,0 mg/l + 2,0
mg/l BAP + 1,0 mg/l NAA + 30 g/l đường + 5 g/l agar, pH = 6,5, với nồng độ Kinetin
là 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l. Kết quả được trình bày ở bảng 3.9 và đồ thị 8a, 8b.
Ở môi trường không bổ sung Kinetin thì HSNC và TLCHH của dòng UE35
là 2,67 lần và 27,9%; dòng UE56 là 2,42 lần, 27,3%. Hai chỉ tiêu này được tăng lên
khi bổ sung ở nồng độ 0,5 mg/l thì dòng UE35 là 3,01 lần, 30,5%; dòng UE56 là
2,59 lần, 27,5%. Còn ở nồng độ 1,0 mg/l thì 2 chỉ tiêu này giảm so với nồng độ
0,5mg/l là (dòng UE35 là 2,83 lần, 29,8%; dòng UE56 là 2,71 lần, 28,3%). Nồng độ
1,5 và 2,0 mg/l thì 2 chỉ tiêu này đều giảm.
Theo dõi quá trình phát triển của chồi cho thấy khi bổ sung Kinetin nồng độ
0,5 và 1,0 mg/l chồi sinh trưởng tốt, lá có mầu xanh non. Nhưng khi tăng nồng độ
lên 1,5 mg/l, 2,0 mg/l xuất hiện nhiều cụm chồi nhỏ, mảnh, mướt các đốt của đoạn
chồi dài không rõ thân lá và ngọn.
Bảng 3.9: Ảnh hƣởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin đến
HSNC và TLCHH (180 chồi cấy/ công thức)
Nồng độ
Kinetin
(mg/l)
Dòng UE35 Dòng UE56
Chất
lượng
chồi
Số
chồi
thu
được
Số
chồi
hữu
hiệu
HSNC
(lần)
TLCHH
(%)
Số
chồi
thu
được
Số
chồi
hữu
hiệu
HSNC
(lần)
TLCHH
(%)
0 480 134 2,67 27,9 436 119 2,42 27,3 ++
0.5 541 165 3,01 30,5 466 128 2,59 27,5 +++
1,0 510 152 2,83 29,8 488 138 2,71 28,3 +++
1,5 478 87 2,66 18,2 435 78 2,42 17,9 +
2,0 447 70 2,48 15,7 381 48 2,12 12,6 +
62
Dòng UE35 Dòng UE56
¶nh 3.7. Chồi nuôi cấy có bổ sung 2.0 mg/l vitamin B2 + 2.0 mg/l BAP + 1.0
mg/l NAA + 0.5 mg/l Kinetin
Biểu đồ 3.6b. ¶nh hƣởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin
đến TLCHH 2 d òng UE35 và UE56
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
35.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Nồng độ Kinetin (mg/l)
TLCHH
(%)
Dòng UE35
Dòng UE56
đến HSNC của 2 dòng UE35 và UE56
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Nồng độ Kinetin (mg/l)
HSNC (lần)
Dòng UE35
Dòng UE56
Biểu đồ 3.6a. ¶nh hƣởng của sự phối hợp nồng độ BAP + NAA + Kinetin
67
Nồng độ ABT1 cho hiệu quả tốt nhất là 1,0 mg/l với dòng UE35 tỷ lệ chồi ra
rễ đạt 82,1%, số rễ trung bình là 2,85 rễ/cây, chiều dài trung bình của rễ là 1,29 cm.
Còn dòng UE56 các chỉ số là 81,7%, 2,59 rễ/cây, chiều dài trung bình 1,16 cm. Ở
những nồng độ cao hơn tỷ lệ chồi ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình
của rễ đều giảm mạnh ở cả 2 dòng, quan sát thấy khi tăng nồng độ lên 1,5 và 2,0
mg/l xuất hiện nhiều rễ bị đen, chiều dài rễ ngắn hơn so với nồng dộ 1,0 mg/.
- Phân tích phương sai về ảnh hưởng của nồng độ ABT1 đến tỷ lệ ra rễ, số rễ
trung bình/cây, chiều dài trung bình của dòng UE35 thấy (phụ lục 15):
- Chỉ tiêu tỷ lệ ra rễ có giá trị Sig = 0,457 > 0,05 trong bảng kiểm tra phương
sai tổng thể nên đề tài sử dụng so sánh phương sai để đánh giá sự sai khác. Chỉ tiêu
Biểu đồ 3.8b.
của 2 dòng UE35 và UE56
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Nồng độ IBA + ABT1 (mg/l)
Số rễ trung bình (rễ/cây)
Dòng UE35
Dòng UE56
Biểu đồ 3.8a. ¶nh hƣởng của nồng độ IBA + ABT1 tới tỷ lệ
ra rễ của 2 dòng UE35 và UE56
0.0
20.0
40.0
60.0
80.0
100.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Nồng độ IBA + ABT1 (mg/l)
Tỷ lệ ra rễ (%)
Dòng UE35
Dòng UE56
¶nh hƣởng của nồng độ IPA + ABT1 tới số rễ trung bình
68
số rễ trung bình/cây có Sig = 0,03 < 0,05 nên đề tài sử dụng tiêu chuẩn
Tamhane’sT2 để so sánh.
- Kết quả phân tích phương sai trong bảng Anova thấy tỷ lệ ra rễ có giá trị Sig
của F= 0,00 < 0,05 vậy tỷ lệ ra rễ ở các công thức có sự sai khác rõ rệt. Chiều dài
trung bình của rễ cũng thay đổi rõ rệt, bảng tiêu chuẩn Tamhane’sT2 cho thấy số rễ
trung bình/cây ở các công thức nồng độ có sự sai khác rõ rệt. Sai khác có độ tin cậy
với α = 0,05.
- Phân nhóm bằng tiêu chuẩn Duncan thu được công thức có nồng độ ABT1
bằng 0,5 mg/l là tốt cho tỷ lệ ra rễ, số rễ trung bình/cây, chiều dài trung bình của rễ
với độ tin cậy 95%.
- Phân tích tương tự như trên, ở dòng UE56 được tỷ lệ ra rễ, số rễ trung
bình/cây, chiều dai trung bình của rễ ở các công thức có nồng độ khác nhau rõ rệt
với α=0,05. Công thức với nồng độ 0,5 mg/l ABT1 là tốt nhất cho tỷ lệ ra rễ, số rễ
trung bình/cây, chiều dài trung bình rễ với độ tin cậy 95%.
Ảnh 3. 8. Chồi nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung ABT1 sau 15 ngày nuôi cấy
3.5.
Đưa cây con ra ngoài vườn ươm là giai đoạn quan trọng trong quá trình sản
xuất cây giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, nó có ý nghĩa đến ứng dụng
quá trình vi nhân giống vào thực tiễn sản xuất. Đề tài thử nghiệm ảnh hưởng của 5
khoảng thời gian huấn luyện cây con như sau: Không huấn luyện; huấn luyện 4, 8,
12, 16 ngày để nghiên cứu tỷ lệ sống và sinh trưởng của cây con ở vườn ươm. Kết
quả thu được sau 4 tuần ngoài vườn ươm là:
69
Bảng 3.12: Ảnh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống của cây con tại
vƣờn ƣơm sau 1 tháng (90 cây mạ/công thức)
Thời gian
huấn luyện
(ngày)
Dòng UE35 Dòng UE56
Tỷ lệ sống
(%)
Chiều cao
trung bình
(cm)
Tỷ lệ sống
(%)
Chiều cao
trung bình
(cm)
0 45,6 6,26 44,4 6,20
4 75,7 6,30 72,2 6,27
8 93,3 6,43 92,2 6,40
12 92,2 6,40 92,2 6,37
16 86,7 6,17 87,8 6,20
(Thời gian huấn luyện 28/8/2007 - 28/9/2008)
Từ kết quả bảng trên, thời gian huấn luyện có ảnh hưởng rõ đến tỷ lệ sống
của cây con tại vườn ươm. Cây con không được huấn luyện đạt tỷ lệ sống rất thấp
(dòng UE35 là 45,6%, dòng UE56 là 44,4%). Tỷ lệ sống tăng lên với thời gian
huấn luyện 4 ngày, 75,6% dòng UE35 và 72,2% ở dòng UE56. Thời gian huấn
luyện 8 ngày đạt tỷ lệ sống giảm không đáng kể, tỷ lệ sống giảm ít ở thời gian
huấn luyện 16 ngày. Qua quan sát thấy với công thức 16 ngày rễ của cây con trong
bình thường bị đen, xuất hiện nhiều rễ chết, có thể đã chết sau khi cấy ra vườn
ươm. Ngược lại với tỷ lệ sống, chiều cao trung bình ở cả 2 dòng thay đổi không
đáng kể ở các công thức.
So sánh phương sai về ảnh hưởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và
chiều cao của 2 dòng thu được kết quả (phụ lục 16): với dòng UE35 có giá trị Sig trong
bảng phương sai tổng thể của chỉ tiêu tỷ lệ sống bằng 0,250, của chỉ tiêu chiều cao
trung bình bằng 0,556. Dòng UE56 có giá trị Sig của chỉ tiêu tỷ lệ sống là 1,71, chỉ tiêu
chiều cao trung bình 1,71. Như vậy phương sai của biến ngẫu nhiên bằng nhau.
Bảng phân tích phương sai thu được kết quả Sig trong bảng Anova, chỉ tiêu
tỷ lệ sống ở 2 dòng đều bằng 0,00. Vì thế, tỷ lệ sống của 2 dòng ở các công thức có
74
Cây cung cấp vật liệu đưa mẫu vào
Chồi cấy; mẫu cấy sau 20 ngày nuôi cấy; chồi cấy dùng nhân nhanh
Mẫu được cấy trong môi trường nhân nhanh
Chồi cấy sang môi trường ra rễ; cây huấn luyện và cấy ra ngoài bầu đất
Cấy ra ngoài bầu đất sau 1 tháng
77
24. Nguyễn Thị Tâm (2003), Những tinh dầu lưu hành trên thị trường, NXB
khoa học và kỹ thuật, tr. 51-55
25. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (2000), Bài giảng môn học công
nghệ sinh học.
26. Nguyễn Ngọc Tân và cộng sự (1995), “Nhân giống Keo lai bằng nuôi cấy
mô phân sinh”, Kết quả nghiên cứu khoa học công nghệ giai đoạn 1990-
1995, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
27. Nguyễn Luyện, “Tìm hiểu về cây bạch đàn E. urophylla”, Tạp chí lâm
nghiệp (số 10, tháng 10/1991).
28. Trần Văn Minh (1994), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Phân viện Công nghệ
sinh học Thành phố Hồ Chí Minh, tr. 58-97.
29. Vũ Văn Vụ (1994), Sinh lý học thực vật, Nhà xuất bản Khoa học - Kỹ thuật,
Hà Nội, tr. 182 - 237.
30. Vũ Ngọc Phượng và cộng sự, (2002), “Nhân giống in vitro cây Tre tàu
(Sinocalamus latiflorus) và Tre mạnh tông (Dendrocalamus asper)”, Tạp chí
sinh học (số 6), tr. 59-64.
Tài liệu tiếng Anh
31. Bhat K. M. and Hwanok Ma (2004), Teak growers unite, in ITTO tropical
forest update, pp. 3-4.
32. Boland D. J., M. I. H. Brooker, G. M. Chippendale, N. Hall, B. P. M. Hyland, R.
D. Jonhson, D. A. Kleing, M. W. Mcdonald and J. D. Turnor (2006), Forest Tree of
Australia (Sixth edition)- CSIRO, ERSIS, Mellbourne, pp. 330 - 331, 736 p.
33. Darus H. Ahmad (1994), “Multiplication of Acacia mangium by stem
cutting and tissue culture techniques”, Advances in tropical acacia research,
pp. 32-34.
34. Gamborg. O. L, G. C. Phillips (1997), “Plant Cell, Tissue and Organ
culture-bG Fundamental Methods cell spinger”, Lab Manual.
78
35. Ikemori Y. K. (1987), “Epicormic shoots from branches of Eucalpytus
grandis as an explant source for in vitro culture”, Commw. For. Rev. (66),
pp. 351-356.
36. Litvay J. D et al (2002), Plant cell and tissue culture media, Duchefa
Biochemie, Hofmanweg 71 2031 BH Haarlem, The Netherlands, p. 44.
37. Lloyd G and McCown B (1980), Commercially - feasible micropropagation
of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot - tip culture, Int. Plant.
Proc. 30, pp. 410 - 421.
38. Murashige T. and Skoog F. (1962), “A resied medium for rapid growth and
bioassays wirh tobacco tissue cultures”, Physiol. Plant (15), pp. 473-495.
39. Nambiar E. K. S. and A. G. Brown (1997), Management of Soil, Nutrients
and Water in Tropical Plantation Forests, ACIAR- CSIRO- CIFOR, 571 p.
40. Nitsch J.P and Nitsch C. (1969), “Tea chrysanthemum improvement through
tissue culture”. Science (85), pp. 47 - 53.
41. Phundan Sigh, Genetics Today, Kalyani Publishers (2001).
42. Street (1974), Plant tissue and cell culture, Bormonogrvol, Black well
scient, London.
43. Sharma J. K. (1994), Pathological investigations in forest nurseries and
plantations in Vietnam, FAO VIE/92/022. Hanoi, Vietnam. 46 p
44. Trindate, H. Ferreina, J. G. Pais, M. S. Aloni, R. (1990), The role of
Cytokinin and auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globolus
grown in vitro, Aust. For. 53(4), pp. 221-223.
45. V. J. Hartney và cs, Division of Forest Research, (Sharma, J. K., 1994)
46. W. Nitiwattanachai (Trindate, H. Ferreina, J.G. Pais, M.S. Aloni, R., 1990)
79
PHỤ LỤC
Phụ lục 01. Thành phần môi trƣờng Litvay
§a l•îng
CaCl2 16. 61 mg/l 0. 15 mM
KH2PO4 340. 00 2. 50 mM
KNO3 1900. 0 0 18. 79 mM
MgSO4 903. 38 7. 51 mM
NH4NO3 1650. 00 20. 61 MM
Vi l•îng
CoCl2.6H2O 0.125 mg/l 0. 53 M
CuSO4 0.500 2. 00 M
FeNaEDTA 36.700 0. 10 mM
H3BO3 31.000 0. 50 mM
KI 4.150 25. 00 M
MnSO4. H2O 21.000 0. 12 mM
Na2MoO4.2 H2O 1.250 5. 17 M
ZnSO4.7 H2O 43.000 0. 15 mM
V i t a m i n
Myo-Inositol 100.00 mg/l 0. 56 mM
Nicotinic acid 0.50 4. 06 M
Pyridoxine HCl (vitamin B6) 0.1 0. 49 M
Thiamine HCl (vitamin B1) 0.1 0. 30 M
84
Phụ lục 06. Phân tích kết quả khử trùng mẫu cấy
► Dòng UE35.
Ty l e song (% )
1. 549 5 12 . 247
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
► Dòng UE56.
85
Ty l e s ong (% )
786. 395 5 157. 279 24. 860 . 000
75. 919 12 6. 327
862. 314 17
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
S um of
S quares df M ean S quare F S i g.
3 27. 2200
3 27. 2233
3 28. 3333 28. 3333
3 32. 2200 32. 2200
3 34. 4467
3 46. 1100
. 616 . 083 . 300 1. 000
P hut
20
12
30
10
40
11
S i g.
Duncan a
N 1 2 3 4
S ubset for al pha = . 05
M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s pl ay ed.
Us es Harm oni c M ean S am pl e S i z e = 3. 000.a.
88
Phụ lục 8. ¶nh hƣởng của nồng độ B2 đến HSNC và TLCHH
► Dòng UE35.
. 683 4 10 . 620
1. 914 4 10 . 185
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e choi huu hi eu (% )
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
. 136 4 . 034 35. 231 . 000
. 010 10 . 001
. 146 14
69. 844 4 17. 461 14. 158 . 000
12. 333 10 1. 233
82. 177 14
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e c hoi huu hieu (% )
S um of
S quares df M ean S quare F S i g.
3 1. 1900
3 1. 4167
3 1. 4167
3 1. 4267
3 1. 4467
1. 000 . 296
Nong do vi t am i nB 2 (m g/ l )
. 0
1. 0
3. 0
4. 0
2. 0
S i g.
Dunc an a
N 1 2
S ubs et for al pha = . 05
M eans for groups i n hom ogeneous s ubs ets are di s pl ay ed.
Us es Harm oni c Mean S am pl e S i z e = 3. 000.a.
90
Phụ lục 9. ¶nh hƣởng của nồng độ BAP đến HSNC và TLCHH
► Dòng UE35.
1. 244 4 10 . 353
. 753 4 10 . 579
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e choi huu hi eu (% )
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
. 854 4 . 214 271. 428 . 000
. 008 10 . 001
. 862 14
234. 546 4 58. 636 59. 655 . 000
9. 829 10 . 983
244. 375 14
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e c hoi huu hieu (% )
S um of
S quares df M ean S quare F S i g.
3 1. 4333
3 1. 8167
3 1. 9133
3 1. 9600
3 2. 1567
1. 000 1. 000 . 069 1. 000
Nong do B A P (m g/ l )
. 0
1. 0
4. 0
3. 0
2. 0
S i g.
Dunc an a
N 1 2 3 4
S ubs et for al pha = . 05
M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s play ed.
Us es Harm oni c Mean S am pl e S i z e = 3. 000.a.
3 12. 4967
3 18. 7067
3 19. 0000
3 22. 0167
3 24. 2067
1. 000 . 725 1. 000 1. 000
Nong do B A P (m g/ l )
4. 0
3. 0
. 0
1. 0
2. 0
S i g.
Dunc an a
N 1 2 3 4
S ubs et for al pha = . 05
M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s play ed.
Us es Harm oni c Mean S am pl e S i z e = 3. 000.a.
91
► Dòng UE56.
93
► Dòng UE56.
. 127 4 10 . 969
1. 052 4 10 . 428
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e choi huu hi eu (% )
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
. 294 4 . 073 297. 662 . 000
. 002 10 . 000
. 296 14
115. 604 4 28. 901 9. 107 . 002
31. 733 10 3. 173
147. 337 14
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e c hoi huu hieu (% )
S um of
S quares df M ean S quare F S i g.
3 1. 8000
3 1. 8633
3 1. 9167
3 2. 0667
3 2. 1833
1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000
Nong do IA A (mg/ l )
2. 0
1. 5
1. 0
. 0
. 5
S i g.
Dunc an a
N 1 2 3 4 5
S ubs et for al pha = . 05
M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s pl ay ed.
Us es Harm oni c M ean S ampl e S i z e = 3. 000.a.
95
► Dòng UE56.
1. 760 4 10 . 213
1. 694 4 10 . 227
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e choi huu hi eu (% )
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
. 435 4 . 109 196. 458 . 000
. 006 10 . 001
. 440 14
509. 303 4 127. 326 193. 897 . 000
6. 567 10 . 657
515. 869 14
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e c hoi huu hieu (% )
S um of
S quares df M ean S quare F S i g.
97
► Dòng UE56.
1. 247 4 10 . 352
9. 323 4 10 . 002
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e choi huu hi eu (% )
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
100
► Dòng UE56.
4. 684 4 10 . 022
1. 245 4 10 . 353
He s o nhan c hoi (l an)
Ty l e choi huu hi eu (% )
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
101
Phụ lục 14. ¶nh hƣởng của IBA đến hiệu quả ra rễ
► Dòng UE35.
2. 509 4 10 . 109
2. 955 4 10 . 075
Ty l e ra re (% )
S o re TB (re/ c ay)
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
6211. 424 4 1552. 856 453. 609 . 000
34. 233 10 3. 423
6245. 657 14
2. 671 4 . 668 27. 354 . 000
. 244 10 . 024
2. 915 14
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
Ty l e ra re (% )
S o re TB (re/ c ay )
S um of
S quares df M ean S quare F S i g.
103
3 1. 280
3 1. 807
3 1. 833
3 2. 027
3 2. 527
1. 000 . 078 1. 000
Nong do IB A (mg/ l )
. 0
4. 0
1. 0
3. 0
2. 0
S i g.
Duncan a
N 1 2 3
S ubset for al pha = . 05
M eans for groups i n hom ogeneous s ubs et s are di s pl ay ed.
Us es Harm oni c M ean S am pl e S i z e = 3. 000.a.
37 . 4811
90 . 6578
90 . 7111
90 . 8600
90 1. 0878
1. 000 . 294 1. 000 1. 000
Nong do IB A (mg/ l )
. 0
4. 0
3. 0
2. 0
1. 0
S i g.
Duncan a , b
N 1 2 3 4
S ubset for al pha = . 05
M eans for groups i n hom ogeneous subs et s are di s pl ay ed.
Us es Harm oni c M ean S ampl e S i z e = 69. 958.a.
The group s i z es are unequal . The harm oni c m ean of t he group s i z es i s us ed. Ty pe I
error l evel s are not guarant eed.
b.
104
Phụ lục 15. ¶nh hƣởng của sự phối hợp giữa nồng độ IBA + ABT1 đến
► Dòng UE35.
. 988 4 10 . 457
4. 059 4 10 . 033
Ty l e ra re (% )
S o re TB (re/ c ay)
Levene
S t at i st i c df1 df2 S i g.
106
2633. 151 4 658. 288 55. 195 . 000
119. 267 10 11. 927
2752. 417 14
1. 371 4 . 343 18. 722 . 000
. 183 10 . 018
1. 555 14
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
Ty l e ra re (% )
S o re TB (re/ c ay )
S um of
S quares df M ean S quare F S i g.
107
Phụ lục 16. ¶nh hƣởng của thời gian huấn luyện đến tỷ lệ sống và chiều cao
của cây con
► Dòng UE35.
1. 595 4 10 . 250
. 794 4 10 . 556
Ty l e song (% )
Chi eu c ao t rung bi nh (c m)
Levene
S t at i s ti c df1 df2 S i g.
4664. 667 4 1166. 167 48. 862 . 000
238. 667 10 23. 867
4903. 333 14
. 137 4 . 034 1. 907 . 186
. 180 10 . 018
. 317 14
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
B et ween Groups
W i t hi n Groups
Tot al
Ty l e song (% )
Chi eu c ao t rung bi nh (c m )
S um of
S quares df M ean S quare F S i g.
3 45. 667
3 75. 667
3 86. 667
3 92. 000
3 93. 333
1. 000 1. 000 . 141
Thoi gian huan
l uy en (ngay )
0
4
16
12
8
S i g.
Dunc an a
N 1 2 3
S ubs et for al pha = . 05
M eans for groups in hom ogeneous s ubs et s are di s pl ay ed.
Us es Harm oni c M ean S am pl e Si z e = 3. 000.a.
► Dòng UE56.
2. 000 4 10 . 171
2. 000 4 10 . 171
Ty l e song (% )
Chi eu c ao t rung bi nh (c m)
Levene
S t at i s ti c df1 df2 S i g.
108
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- doc17.pdf