Luận văn Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5-T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ----------------///---------------- Phạm Ngọc Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ----------------///---------------- Phạm Ngọc Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nghiêm Ngọc Minh Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lời cảm ơn Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nghiêm Ngọc Minh. Trưởng Phòng Công nghệ sinh học Môi trường – Viện Công Nghệ sinh Học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Trong quá trình nghiên cứu vửa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, đặc biệt là Ths. Nguyên Bá Hữu, CN. Nguyễn Văn Bắc, KS. Cung Thị Ngọc Mai, những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án của mình. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Khoa sau đại học, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 1 tháng 10 năm 2009 Phạm Ngọc Long BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-Pentaclorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria - Bertani PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxins PCDFs Polychlorinated dibenzofurans PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN 3 1. Sự ô nhiễm của 2,4,5-T và 2,4-D 3 2. Đặc điểm và tính chất của 2,4,5-T và 2,4-D 5 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 5 2.2 Chất diệt cỏ 2,4-D 7 3. Ảnh hƣởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trƣờng và con ngƣời 8 3.1 Ảnh hưởng của 2,4,5-T và 2,4-D tới môi trường 8 3.2 Ảnh hưởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến con người 9 4. Một số phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học trong đó có 2,4,5-T và 2,4-D 9 4.1 Phương pháp xử lý chất độc hóa học bằng hóa học, lý học, cơ học 9 4.2 Phương pháp phân hủy sinh học 10 5. Khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của một số vi sinh vật 15 6. Phân loại vi sinh vật 21 6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển 21 6.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 22 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 1. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 25 1.1 Vật liệu 25 1.2 Hóa chất 25 1.3 Thiết bị, máy móc 25 2. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.1 Môi trường nuôi cấy 26 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l) 26 2.1.2 Môi trường SH1 thạch 26 2.1.3 Môi trường muối khoáng 26 2.1.4 Môi trường LB dịch 27 2.1.5 Môi trường LB thạch 27 2.1.6 Nước muối sinh lý 27 2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiếu khí 27 2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật 27 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 27 2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 28 2.3.1 Nhuộm Gram 28 2.3.2 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét 28 2.4 Phương pháp phân tích khả năng phân hủy 2,4,5-T 29 2.5 Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 29 2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật 29 2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR 30 2.5.3 Điện di kiểm tra trên gel agarose 31 2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA 31 2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli 31 2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) 32 2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit của hãng Fermentas 33 2.5.8 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA 34 2.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 34 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 1. Nuôi cấy, phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiểu khí 35 1.1 Nuôi cấy, làm giàu tập đoàn vi sinh vật 35 1.2 Phân lập chủng vi khuẩn 37 2. Đặc điểm phân loại của chủng HR5.1 38 2.1 Hình thái tế bào 38 2.2 Phân loại dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA 39 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 39 2.2.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng HR5.1 bằng kỹ thuật PCR 40 2.2.3 Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pBT 41 2.2.4 Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng HR5.1 43 3 Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng HR5.1 47 3.1 Khả năng phát triển của chủng HR5.1 trên PAH 47 3.2 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng HR5.1 49 3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có chứa 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 49 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 50 3.2.3 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng vi khuẩn HR5.1 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 MỞ ĐẦU Trong cuộc chiến tranh xâm lược của Mỹ tiến hành ở Việt Nam, hơn 100 triệu lít chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và 2,3,7,8 TCDD đã được rải xuống hơn 20% diện tích của miền Nam. Theo công bố của Stellman và cộng sự trên tạp chí Nature năm 2003 thì 20 chất diệt cỏ khác nhau đã được sử dụng. Chu kỳ bán hủy của dioxin và các chất tương tự dioxin rất dài, có khi đến vài chục năm hoặc hàng trăm năm [15],[42]. Qua các điều tra nghiên cứu của nhiều cơ quan khoa học và công nghệ ở Việt Nam và quốc tế cho thấy, đất của sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa độ tồn lưu của PCDD, PCDF, 2,4,5-T và 2,4-D vẫn còn cao. 2,4,5-T, 2,4-D có hàm lượng lên tới hàng vài trăm nghìn đến vài triệu µg/kg đất. Ngoài ra một lượng không nhỏ các chất DCP, TCP và PAH cũng đã được xác định trong các mẫu đất tại khu vực bị nhiễm độc. Nghiên cứu áp dụng phương pháp sinh học để khử độc tại “điểm nóng” ở Đà Nẵng thu được kết quả rất khả quan. Tuy nhiên để xử lý các điểm ô nhiễm cục bộ chất diệt cỏ/dioxin với thời gian ngắn cần có các công nghệ phân hủy sinh học phù hợp. Hiện nay, phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học đang tiến hành xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin bằng công nghệ tăng cường sinh học trong các bioreactor hiếu khí và kỵ khí. Trong quá trình xử lý, ngoài sự điều khiển về điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ thì vai trò của các vi sinh vật có trong bioreactor là rất quan trọng. Để tăng hiệu quả và hoàn thiện công nghệ cần tăng thêm hiểu biết về đặc điểm vi sinh vật có trong bioreactor, cũng như vai trò của các vi sinh vật phân hủy chất độc được bổ sung vào bioreactor. Nhằm đáp ứng yêu cầu của thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5-T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin“ đã được thực hiện. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Luận án đã thực hiện đƣợc các nội dung nghiên cứu sau đây  Làm giầu vi sinh vật từ các mẫu đất trong bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.  Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên 2,4,5-T và 2,4-D.  Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng vi khuẩn phân lập được.  Phân loại định tên chủng vi khuẩn được chọn lựa.  Xác định khả năng sử dụng 2,4,5-T của chủng vi khuẩn nghiên cứu. Luận án này được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học và là một phần đề cấp Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam: “Nghiên cứu xử lý tẩy độc một số hợp chất hữu cơ chứa clo bằng các phương pháp hóa học và sinh học tiên tiến“ do PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ trì. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 PHẦN 1 TỔNG QUAN 1. Sự ô nhiễm của 2,4,5-T và 2,4-D Từ năm 1961 đến năm 1971 quân đội Mỹ đã rải hơn 100 triệu lít chất diệt cỏ xuống nhiều vùng ở miền Trung và Nam Việt Nam [42]. Các chất diệt cỏ đã được sử dụng bao gồm: chất da cam, chất trắng, chất xanh lục, chất xanh lam, chất tím, chất hồng, các chất này được gọi tên theo mầu đánh dấu trên các thùng phuy chứa chúng, mỗi thùng khoảng 250l [42]. Các chất diệt cỏ thường là hỗn hợp của hai chất 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) và 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) với tỷ lệ 50:50 (Bảng 1). Dioxin là tạp chất được sinh ra trong quá trình sản xuất 2,4,5-T. Hàm lượng dioxin trong các chất diệt cỏ rất khác nhau, ước tính số lượng dioxin chứa trong chất diệt cỏ mà Mỹ đã dùng trong chiến tranh Việt Nam từ 170 - 1000 kg [42], [15]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của các chất diệt cỏ quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh Việt Nam [42]. Tên chất Thành phần hoá chất Độ đậm đặc tƣơng đƣơng Sử dụng trong trong năm Số lƣợng ƣớc tính đã rải (lít) Chất hồng 60% - 40% n-Butyl: isobutylester của 2,4,5-T 961-1081 g/l acid tương đương 1961-1965 503.121; 413,852 Chất xanh lá cây n-Butylester của 2,4,5-T Giống như chất hồng Chưa rõ, rải cùng thời gian với chất hồng 31.026 Chất tím 50%n-Butylester 2,4,D 30% Butylester 1033 g/l acid tương đương 1962-1965 1.892.773 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 2,4,5-T 20% isobutyl ester 2,4,5-T Chất da cam (1) 50% n-Butyl ester 2,4-D 50% n-Butyl ester 2,4,5-T 1033 g/l acid tương đương 1965-1970 45.677.937 (có thể bao gồm cả chất da cam) Chất da cam (2) 50% n-Butyl ester 2,4-D 50% n-Butyl ester 2,4,5-T 910 g/l acid tương đương Sau 1968 (?) Chưa rõ nhưng đã gửi sang Việt Nam ít nhất là: 3.591.000 Chất trắng Khối lượng acid cơ bản: 21,1% tri- isopropanolamine muối của 2,4-D và 5,7% picloram Khối lượng acid: 240,2 g/l 2,4-D và 64,9 g/l picloram 1966-1971 20.556.525 Chất xanh (dạng bột) Acid dimethylarsinic và Natri cacodylat Acid: 65% tương đương Muối: 70% tương đương 1962-1964 25.650 Chất xanh (dạng dịch) 21% Natri cacodylat+ acid cacodylic ít nhất chiếm 26% tổng lượng acid tương đương Khối lượng acid: 360,3 g/l 1964-1971 4.715.731 Tại các căn cứ quân sự cũ của Mỹ trước đây là nơi tàng trữ và nạp chất diệt cỏ lên máy bay như sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng, Phù Cát có độ tồn lưu các chất độc ở mức cao và rất cao, lên tới hàng trăm nghìn ppt [15]. Đặc biệt là các sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng hàm lượng 2,3,7,8-TCDD chiếm 90% tổng độ độc, nhiều mẫu đất 2,3,7,8-TCDD > 99% tất cả độ độc của PCDD và Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 PCDF. Các kết quả phân tích còn phát hiện một lượng lớn 2,4,5-T, 2,4-D, dichlorphenol, trichlorophenol và một số lượng nhỏ hydrocarbon thơm đa nhân trong các mẫu đất tại khu vực nhiễm độc [15]. Ngoài ra, ô nhiễm 2,4,5-T và 2,4-D ở Việt Nam còn từ các nguồn khác. Tuy nhiên, trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi chỉ nghiên cứu về vi sinh vật có nguồn gốc từ nguồn ô nhiễm chất diệt cỏ do chiến tranh. 2. Đặc điểm và tính chất của 2,4,5-T và 2,4-D 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 2,4,5-T là tên gọi tắt của acid 2,4,5-trichlorophenoxyaxetic. Công thức hóa học là C8H5O3Cl3, khối lượng phân tử 255,49 g/mol. Công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 1.1. Hình 1.1 Công thức cấu tạo 2,4,5-T 2,4,5-T tinh khiết có dạng tinh thể rắn, không mùi, từ không màu đến vàng nâu nhạt, tan ít trong nước, độ hòa tan trong nước ở 30oC là 238 mg/kg, tan tốt trong dung môi hữu cơ. Tỷ trọng là 1,8 g/cm3 ở 20oC. Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 154oC -158oC [43]. 2,4,5-T được sử dụng như một chất diệt cỏ có tác dụng làm rụng lá cây, được phát triển vào cuối thập niên 40 của thế kỷ XX và sử dụng trong nông nghiệp. 2,4,5-T là chất có độc tính mạnh, gây ung thư, dị thai, rối loạn nội Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 tiết, nhiễm độc tuyến sinh dục và nhiều bệnh nghiêm trọng khác. Sơ đồ tổng quát quá trình tổng hợp 2,4,5-T được trình bày ở hình 1.2. i ii Hình 1.2 Sơ đồ tổng hợp 2,4,5-T i : Nhiệt độ với NaOH trong CH3OH dưới áp suất hơi nước ii: ClCH2COOH trong NaOH ở 140 o C Trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T đi từ nguyên liệu ban đầu là 1,2,4,5- tetrachlorobenzene, cần phải có nhiệt độ từ 225 đến 3000C và áp suất dao động trong khoảng từ 400 đến 1500 psi. Tuy nhiên, ở điều kiện như vậy sản phẩm phụ là 2,3,7,8-TCDD đã được tạo ra và theo các tác giả, hàm lượng 2,3,7,8-TCDD có trong 2,4,5-T vào khoảng từ 0,07 tới 6,2 ppm (hình 1.3) [40]. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Hình 1.3 Cơ chế tạo ra sản phẩm phụ 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp chất diệt cỏ 2,4,5-T 2.2 Chất diệt cỏ 2,4-D Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) có công thức hóa học là C8H6Cl2O3 công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 1.4. Hình 1.4 Cấu trúc của 2,4-D. 2,4-D có khối lượng phân tử 221,04g/mol, ở dạng tinh khiết 2,4-D ở dạng bột, có mầu trắng đến mầu vàng. Nhiệt dộ nóng chảy là 140,5oC và nhiệt Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 độ bay hơi là 160oC. Ở nhiệt độ 25oC, 2,4-D có thể được hòa tan cới hàm lượng 900mg/l. 2,4-D là thuốc diệt cỏ được tổng hợp từ các auxin, là thuốc diệt cỏ tán rộng Hiện nay chủ yếu 2,4-D được sử dụng trong những hỗn hợp pha trộn với các loại thuốc diệt cỏ khác, có vai trò như một chất tăng cường tác dụng. Nó đang được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới. 3. Ảnh hƣởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trƣờng và con ngƣời 3.1 Ảnh hƣởng của 2,4,5-T và 2,4-D tới môi trƣờng Quân đội Mỹ đã rải chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và tạp chất dioxin lên khoảng 27% tổng diện tích Việt Nam. Khoảng hơn 2 triệu ha rừng đã bị tác động của chất diệt cỏ [17]. Tác dụng tức thời của chất diệt cỏ là làm cho các loài cây rừng bị trụi hết lá, rất nhiều loài cây bị chết, môi trường và sinh cảnh bị thay đổi nhanh chóng [17]. Tại các vùng rừng bị rải lặp đi lặp lại nhiều lần, hệ sinh thái rừng bị phá hủy hoàn toàn và cho đến nay tại những nơi này chưa có cây mọc tự nhiên như khu rừng Mã Đà (Đồng Nai), thung lũng A Lưới (Thừa Thiên Huế) v.v.[17] Chất diệt cỏ sau khi được phun xuống có thể tích tụ không những trong đất mà còn phân tán trong lớp nước mặt, nước ngầm, không khí, tích tụ trong thực vật, gây nhiều sự cố và hiểm họa cho môi trường và từ đó tác động dây chuyền đến con người, động thực vật và các vi sinh vật. Hậu quả là làm suy thoái hệ sinh thái tự nhiên. Các chất này giết chết các động vật, thực vật, vi sinh vật và nhiều loại sinh vật khác làm cho chúng không thể phục hồi lại được, làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc quần xã và chủng loại động vật, thực vật [4], [22]. Chất độc hóa học ngấm vào trong đất, tích tụ lại trong cơ thể thực vật nên ít bị phân hủy bởi một số yếu tố như ánh sáng mặt trời, tia cực tím, nhiệt độ. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Các chất này tồn tại dưới dạng hỗn hợp và các yếu tố môi trường nhiều khi chưa thuận lợi cho các quá trình phân hủy sinh học tự nhiên. Chiến tranh kết thúc đã hơn 30 năm, lượng chất độc hóa học còn lại trong đất rất lớn, đặc biệt là 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin tại các điểm nóng. Tại các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng, Biên hòa và Phù Cát bị ô nhiễm 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin .v.v. ở mức độ cao. Nghiên cứu chọn lựa và áp dụng các phương pháp thích hợp để tấy độc ngay các “Điểm nóng” là nhiệm vụ rất cần thiết đặt ra cho các nhà khoa học và công nghệ cần quan tâm giải quyết. 3.2 Ảnh hƣởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến con ngƣời Ước tính có 3181 ngôi làng Việt Nam bị rải trực tiếp, với khoảng 4,8 triệu người đã tiếp xúc với chất độc hóa học do Mỹ rải xuống [42]. Theo báo cáo mới nhất của Viện Y khoa Hoa Kỳ năm 2002, có 37 bệnh ở người liên quan đến dioxin ở các cấp độ khác nhau như ban clo, ung thư mô mềm, ung thư dạng Hodkin, ung thư dạng không Hodkin, một số bệnh thần kinh cấp tính, gai đốt cột sống, sẩy thai, dị tật bẩm sinh v.v. [32]. Trong số những người đã tiếp xúc với các chất độc hóa học này. Nhiều người bị phơi nhiễm đã mắc phải những căn bệnh nguy hiểm và một số bệnh di truyền cả sang các thế hệ sau [16]. 4. Một số phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học trong đó có 2,4,5- T và 2,4-D 4.1 Phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học bằng hóa học, lý học, cơ học Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng cho chất thải nguy hại, rác thải, kể cả các chất độc hóa học. Ưu điểm của phương pháp là giá thành rẻ nhưng chất Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 độc vẫn nằm trong các hố chôn lấp không được phân hủy nên các chất độc hóa học này có thể là nguồn ô nhiễm tiềm tàng cho môi trường và con người. Các phương pháp vật lý như quang hóa, sử dụng các tia cực tím, hay dùng áp suất cao cũng có hiệu quả. Theo các kết quả công bố cho thấy rằng sử dụng phương pháp quang hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ 20W/cm3 ở nhiệt độ 20oC trong 3 ngày. Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng cho những lớp đất mỏng bề mặt dầy dưới vài milimet [14], [41]. Phương pháp thiêu đốt cũng được nhiều nước lựa chọn để xử lý dioxin. Nguyên lý của phương pháp là dùng nhiệt độ cao để phân hủy dioxin đạt hiệu quả đến 99,99%, nhưng phương pháp này có nhược điểm là giá thành xử lý cao, đó là chưa kể đến kinh phí đào, vận chuyển đất đến lò đốt và có thể tạo ra các sản phẩm phụ gây ô nhiễm thứ cấp [18]. Phương pháp declo hóa và oxy hóa cũng được nghiên cứu áp dụng với các chất chứa clo và cả 2,3,7,8-TCDD. Phương pháp này cũng cho kết quả khá tốt, thường tạo ra những hợp chất ít clo và ít độc hơn [19], [24],[14]. Nhược điểm của phương pháp hóa học là không kiểm soát được sản phẩm tạo thành, các sản phẩm này thường gây ô nhiễm thứ cấp. Các phương pháp xử lý cơ học, vật lý, hóa học nói chung đều có nhược điểm là tốn kém và không triệt để, dễ gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường. Phương pháp xử lý ô nhiễm bằng công nghệ sinh học đang được đặc biệt chú ý do tính an toàn và kinh tế của nó. Phương pháp này đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu, phát triển. 4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học Phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học tuy mới mẻ nhưng đã được đặc biệt chú ý bởi giá thành hạ và thân thiện với môi trường. Phương pháp Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp như nhiệt độ cao, áp suất, quá trình xúc tác v.v. Phương pháp này tuân theo qui luật chuyển hóa thuộc chu trình cacbon, nitơ, photpho v.v. không gây ra ô nhiễm thứ cấp, an toàn, thân thiện với môi trường và hệ sinh thái, chi phí thấp do đó rất phù hợp với điều hiện kinh tế ở nước ta. Mặt khác, diện tích đất bị nhiễm độc ở Việt Nam rất lớn nên việc ứng dụng các phương pháp tẩy độc khác như hóa học và lý học khó có khả năng thực hiện [2]. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thời gian dài. Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác. Sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ bằng phương pháp phân hủy sinh học [9]. Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học có thể đi theo hai hướng chính là làm giàu sinh học và kích thích sinh học [9]. Làm giàu sinh học (Bioaugmentation) là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các địa điểm ô nhiễm. Kích thích sinh học (Biostimulation) là quá trình thúc đẩy sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông qua việc thay đổi các yếu tố môi trường như pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v. Việc bổ sung vi sinh vật vào các địa điểm ô nhiễm đòi hỏi chi phí cao và nhiều khi không mang lại hiệu quả cao do nhiều nguyên nhân như sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường, sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật [15]. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Ở Việt Nam, biện pháp chôn lấp tích cực để phân hủy chất diệt cỏ/dioxin đã được nghiên cứu và áp dụng thành công trên quy mô pilot hiện trường. Chôn lấp tích cực là sự kết hợp của phân hủy sinh học, cô lập, hấp phụ và chôn lấp. Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm phân hủy sinh học đối với các lô xử lý 0,5m3; 1,5m3; 10m3 và 100m3 đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Đà Nẵng [2], năm 2009 nhóm nghiên cứu đã xử lý hơn 3000 m2 đất nhiêm chất độc hóa học tại sân bay Biên Hòa bằng công nghệ phân hủy sinh học. Các công thức xử lý phân hủy sinh học được bổ sung các dạng chế phẩm khác nhau cung cấp chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho quá trình oxy hóa, khử loại bỏ clo các chất vi lượng và các chất thêm cho tập đoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình tẩy độc ở điều kiện kị khí và hiếu khí. Số lượng các nhóm vi sinh vật trước, trong suốt quá trình xử lý đã được theo dõi. Các chủng nấm, vi khuẩn hiếu khí, kị khí, xạ khuẩn đã được sử dụng để nghiên cứu khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử điểm chỉ như DGGE và các kỹ thuật sinh học phân tử khác đã được tiến hành để nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật đồng thời phân lập các chủng vi sinh vật, định tên loài vi sinh vật sử dụng dioxin, dibenzofuran, hydrocabon thơm đa nhân phân lập từ nguồn ô nhiễm kể trên. Độ tồn lưu của dioxin và các ô nhiễm khác được xác định bằng phương pháp miễn dịch và sắc ký khối phổ. Phương pháp miễn dịch phân tích dioxin của EPA Hoa Kỳ được tiến hành theo EnviroGrardTM kít [2]. Sau tám năm nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam đã thu được những kết quả rất khả quan. Số lượng vi sinh vật dị dưỡng ở đất nhiễm độc trước khi xử lý không cao, dao động từ 102 - 105 MPN/g hay CFU/g [2]. Những nhóm vi sinh vật khác cũng tồn tại trong loại đất này với số lượng và đa dạng thấp. Trong quá trình xử lý ở qui mô khác nhau, số lượng vi sinh vật đã tăng đáng Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 kể từ 1.000-10.000 lần [2]. Sau hơn hai năm xử lý bằng cách bổ sung chế phẩm Slow-D, DHS1, DHS2 và các hợp chất, vi lượng, thành phần xúc tác, các chất hoạt động bề mặt sinh học, phối hợp với sự thay đổi hàm lượng oxy và thay đổi độ ẩm, hiệu quả của quá trình xử lý “chôn lấp tích cực” (kết hợp cô lập, hấp phụ, chôn lấp và phân hủy sinh học) rất rõ rệt. Trong tất cả các lô xử lý, sau 8 đến 24 tháng, từ 50 đến 70% tổng độ độc đã bị giảm [2]. Trong quá trình xử lý ở các quy mô, hình thức khác nhau, trong những năm qua, các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ sinh học môi trường Viện Công nghệ sinh học đã phân lập được một số chủng vi sinh có khả năng vật sử dụng dibenzofuran, dioxin, chất diệt cỏ 2,4,5-T, 2,4-D và PAH từ đất nhiễm chất độc hóa học tại sân bay Đà Nẵng. Các vi khuẩn đã được phân lập gồm Bacillus sp. BU3, Pseudomonas sp. BDN15, Pseudomonas sp. SETDN1, Terrabacter sp. DMA, Rhodoccocus sp. HDN3 v.v. Một số chủng nấm sợi chủ yếu thuộc chi Aspergillus như Aspergillus sp. FDN30, Aspergillus sp. FDN22, Aspergillus sp. FDN20. Xạ khuẩn cũng đã được phân lập tuy không nhiều nhưng cũng đã, phân lập được một số chủng thuộc chi Streptomyces như các chủng Streptomyces sp. XKDN11, Streptomyces sp. XKDN12 [1], [2], [5], [8], [10], [11]. Việc định tên và xác định khả năng phân hủy chất ô nhiễm của các chủng vi sinh vật này góp phần làm sáng tỏ cơ chế và hiệu quả của sự phân hủy sinh học diễn ra trong quá trình xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học đã được triển khai để xử lý khử độc ở qui mô 3.000 m3 tại “điểm nóng” Biên Hòa, Đồng Nai. Kết quả phân tích vi sinh vật và hóa học cho thấy các chế phẩm sử dụng tại hiện trường đã thành công trong việc kích thích quá trình phân hủy sinh học tại chỗ. Tất cả các chế phẩm, các hợp chất trên đều có thể tìm được và sản xuất tại Việt Nam vì vậy chủ động và giảm giá thành xử lý đất nhiễm dioxin trong các căn cứ quân sự cũ. Hơn nữa, phương pháp chôn lấp tích cực có tính Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 an toàn cao và khả thi đối với khối lượng bị ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin đến vài ha và ở độ sâu trung bình từ một đến hai mét. Để đẩy nhanh tốc độ phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin, các nghiên cứu xử lý khử độc trong các bioreactor đã được nhóm nghiên cứu công nghệ xử lý POP, Viện Công nghệ sinh học tiến hành. Đây là phương pháp xử lý kiểu tăng cường sinh học (bioaugmentation) trong hệ thống có khả năng điều khiển các thông số quan trọng liên quan đến quá trình chuyển hóa sinh học như nồng độ oxy, độ ẩm, độ pH, nhiệt độ, nồng độ các chất bổ sung và thành phần các nhóm vi sinh vật liên quan đến từng giai đoạn chuyển hóa sinh học chất ô nhiễm. Đây là kiểu xử lý ex situ và tốc độ chuyển hóa được cải thiện so với biện pháp xử lý chôn lấp tích cực do các điều kiện đều được kiểm soát. Đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng đã được xử lý trong các bioreactor với quy mô 50 kg [3]. Các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy tốt các chất ô nhiễm chính được phân lập tại đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại chính sân bay Đà Nẵng và tập đoàn vi sinh vật nuôi cấy làm giàu trên môi trường dinh dưỡng chứa các thành phần chất ô nhiễm trong phòng thí nghiệm được bổ sung trong quá trình xử lý. Các chất bổ sung trong quá trình xử lý được tính toán và bổ sung theo từng giai đoạn trong quá trình kết hợp với kiểm soát chặt chẽ các yếu tố về độ ẩm và độ thông khí. Ngoài ra, còn kết hợp xử lý theo kiểu kết hợp hiếu khí – kỵ khí để có thể chuyển hóa hiệu quả trong cả hai điều kiện khử loại chlo và oxi hóa cắt vòng 2,3,7,8-TCDD. Thành phần vi sinh vật trong thời gian xử lý đã tăng đáng kể, từ 106 lên đến 1012 MPN/g, trong đó trong các bioreactor hiếu khí, vai trò của nấm sợi đã được khẳng định là rất quan trọng với hệ sợi phát triển mạnh trên đất xử lý và khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào như laccase, và các peroxidase với hoạt tính cao. Sau thời gian 17 tuần, tổng độ độc đã giảm 44,1%[3]. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 5. Khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của một số vi sinh vật 2,4-D và 2,4,5-T là hai thành phần chủ yếu của các chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh Việt Nam [42]. Hiện tại đất tại các khu nhiễm chất độc hóa học ở các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở miền Trung và Nam Việt Nam hai hợp chất trên vẫn ở nồng độ cao. Trên thế giới do 2,4-D và 2,4,5-T đã được sử dụng từ rất lâu nên có nhiều công bố về khả năng phân hủy sinh học hai hợp chất này bởi vi sinh vật phân lập từ nguồn khác nhau như đất nông nghiệp, đất công nghiệp và trầm tích. Khác với 2,4-D, 2,4,5-T khó phân hủy hơn, hiện không có nhiều công bố về phân hủy sinh học hợp chất này. Tuy nhiên cũng đã có một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam công bố về vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4,5-T như Burkholderia cepacia AC1100, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus cornucopiae, Stenotrophomonas maltophilia PM, .v.v. Một vài chủng nấm Aspergillus terreus FDN41, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus.v.v. [12],[21],[36] Chủng Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18087 và Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18086 do Roy phân lập được có khả năng phát triển trên cả hai cơ chất 2,4,5-T, 2,4-D. Hai chủng này đều có khả năng sử dụng 2,4-D và 2,4,5-T là nguồn năng lượng và carbon duy nhất cho chúng [23]. Theo Haugland và cộng sự, chủng Pseudomonas cepacia AC1100 có khả năng phân hủy rất mạnh 2,4,5-T, chủng này phân hủy được 960μg/ml trong 24h ở 29oC [26]. Một chủng mới có nguồn gốc từ chủng Pseudomonas cepacia AC1100 được nhận thêm plasmid pJP4 quy định khả năng phân hủy 2,4-D từ chủng Alcalugenes eutrophus JMP134, chủng này được đặt tên là RHJ1. Chủng này có khả năng phân hủy 1000 μg/ml 2,4-D và 2,4,5-T μg/ml trong 24h ở 29oC trên môi trường có chứa hai cơ chất này. Trong khi đó khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của chủng Pseudomonas cepacia AC1100 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 giảm hẳn khi nuôi trên môi chứa cùng một lúc hai cơ chất, chủng này phân hủy được 26 μg/ml 2,4,5-T và 24 μg/ml 2,4-D cung trong 24h [26]. Ở chủng RHJ1 2,4,5-T được chuyển hóa thông qua con đường chlorohydroquinon, còn 2,4-D được phân hủy thông qua con đường chloroatechol [26]. Vi khuẩn sử dụng 2,4,5-T như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất được nghiên cứu đầy đủ nhất hiện nay là Burkholderia phenoliruptrix AC110 (tên cũ là Burkholderia cepacia AC1100) [20]. Các gen tftA và tftB mã hóa hai dưới đơn vị (subunit) của enzyme 2,4,5-T oxygenase tham gia chuyển hóa 2,4,5-T sang 2,4,5-TCP (hình 1.5). Tiếp theo 2,4,5-TCP chuyển thành DCHQ nhờ gen tftC mã hóa enzyme monooxynase chứa putative flavin. Sau đó DCHQ chuyển hóa thành CHQ, maleylaxetat, oxoadipat, succinat và axetat bởi các gen tftCDEF [21]. Hình 1.5 Con đường phân huỷ 2,4,5-T bởi Burkholderia cepacia AC1100 [20] Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 Một vi khuẩn khác có khả năng khoáng hóa hoàn toàn 2,4-D và 2,4,5-T đó là Nocardioides simplex 3E được phân lập bằng cách làm giàu với 2,4,5-T, vi khuẩn này có thể phân hủy cả hai hợp chất trên thành trihydroxylat benzen [45]. Nghiên cứu khác của Mai và cộng sự cho thấy quá trình đồng trao đổi chất của vi khuẩn Stenotrophomonas maltophilia PM. Vi khuẩn này cần mecoprop để đồng trao đổi chất 2,4,5-T [36]. La Thị Thanh Phương và cộng sự đã công bố nghiên cứu phân lập chủng Pseudomonas sp. BDN15, chủng này có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung 2,4,5-T. Sau 90 ngày ở điều kiên nuôi tĩnh và nhiệt độ phòng chủng BDN15 đã phân hủy 39,37% với nồng độ ban đầu là 1000ppm 2,4,5-T đây cũng là nguồn năng lượng và carbon duy nhất trong môi trường nuôi cấy [6]. Nguyễn Thanh Thủy và cộng sự đã công bố chủng nấm sợi FDN41 có khả năng phân hủy 43,46% 2,4,5-T trong 20 ngày với hàm lượng 2,4,5-T ban đầu 905,34 μg/ml. Ngoài ra chủng này còn có khả năng sử dụng một số PAH như anthrancen, phenanthren .v.v. là nguồn năng lượng và carbon duy nhất [12]. Khác với số lượng ít của các vi khuẩn phân hủy 2,4,5-T, rất nhiều vi khuẩn phân hủy 2,4-D đã được phân lập từ nhiều vị trí ô nhiễm khác nhau như đất nông nghiệp, trầm tích, khu vực xử lý rác thải và đất nguyên thủy. Các vi khuẩn phân hủy 2,4-D được xếp thành 3 nhóm dựa vào enzyme phân hủy và các đặc tính lý hóa của chúng. Nhóm thứ nhất nằm trong lớp β và γ- Proteobacteria như Achromobacter, Burkholderia, Delftia, Halomonas, Pseudomonas. Những vi khuẩn này có chứa gen tfd thường nằm ở các plasmid và có thể chuyển được từ cơ thể vi sinh vật nọ sang cơ thể vi sinh vật kia. Nhóm thứ hai gồm những vi khuẩn nằm trong lớp α- Proteobacteria thuộc chi Sphingomonas. Chúng được phân lập từ môi trường có chứa clo. Nhóm thứ ba thuộc chi Bradyrhizobium trong lớp α- Proteobacteria. Các vi Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 khuẩn này được phân lập từ đất nguyên thủy ở Canada, Hawaii, Chile và một số khu vực khác [28],[ 44]. Trong số các vi khuẩn tham gia phân hủy 2,4-D, chủng Alcaligenes eutrophus JMP134 là chủng được nghiên cứu khá kỹ về con đường chuyển hóa cũng như các gen mã hóa cho những enzyme tham gia phân hủy 2,4-D (Hình 1.6). Họ gen tfd gồm có 6 gen tfdA, tfdB, tfdC, tfdD, tfdE, tfdF mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình phân hủy 2,4-D tạo thành axit succinic [44]. Hình 1.6 Con đường phân hủy 2,4-D của chủng Alcaligenes eutrophus JMP134 [44] Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Maltseva và cộng sự đã công bố chủng Halomonadaceae strain 1-18 có khả năng phân hủy 3000 mg 2,4-D/l trong 3 ngày trên môi trường có bổ sung 50 mg cao men [37], khi nghiên cứu sâu hơn, chủng Halomonadaceae strain 1-18 nhóm tác giả đã phát hiện ra con đường phân hủy 2,4-D của chủng này giống với con đường phân hủy 2,4-D của chủng Alcaligenes eutrophus JMP134, ngoài ra Maltseva cũng tìm thấy sự có mặt của gen tfdA ở chủng này. Nhóm tác giả này đã công bố 5 chủng thuộc các chi Acinetobacter, Serratiamarcescens, Stenothrophomonas, Flavobacterium và Penicillium phân lập được từ đất ô nhiễm 2,4-D ở Brazin cũng có khả năng phân hủy 2,4- D [37]. Năm 2002, Kitagawa đã tìm thấy một số gen mới tham gia vào quá trình phân hủy 2,4-D. Các gen cadABC, cadK được tách dòng từ chủng Bradyrhizobium sp. strain HW13. Khi so sánh trình tự nucleotide của các gen cadABC với trình tự gen TftA, TftB của chủng Burkholderia cepacia AC1100 cho thấy các gen này có độ tương đồng 46%, 44% và 37% với nhau. Trình tự gen cadK cũng được so sánh với trình tự gen TfdK của chủng Ralstonia eutropha JMP134, kết quả cho thấy 2 gen này có độ tương đồng 60%. [33] Trong một nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu và cộng sự trên mẫu đất nhiễm độc chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng, nhóm tác giả đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn phân hủy 2,4-D đều thuộc chi Athrobacter có tên lần lượt là Athrobacter sp. DNB19, Athrobacter sp. DNB20 và Athrobacter sp. DNB21. Hai gen cadA và tfdA mã hóa cho các enzyme tham gia phân hủy 2,4-D của chủng Athrobacter sp. DNB19 đã được xác định với mức độ tương đồng 93 đến 94% với các trình tự gen tương ứng đã được công bố trên GenBank [8]. Theo Hoàng Thị Mỹ Hạnh và cộng sự đã công bố chủng nấm FDN20 cũng có nguồn gốc từ mẫu đất nhiễm chất độc hóa học, có khả năng Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 loại bỏ 72,92 μg/ml tương đương với 44,18% hàm lượng 2,4-D đưa vào ban đầu [4]. Ngoài 2,4,5-T, 2,4-D là thành phần chính của chất diệt cỏ còn có sản phẩm phụ của chất diệt cỏ là dioxin. Dioxin là thành phần rất độc với con người và môi trường vì vậy trên thế giới cũng như ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng phân hủy dioxin bởi vi sinh vật. Lyama và cộng sự đã sử dụng Bacillus midousuji để phân hủy dioxin, sau 24h nuôi cấy, Bacillus midousuji đã phân hủy 34% 2,3,7,8-TCDD và sau 48h khoảng 70% dioxin đã bị loại bỏ [35]. Theo Hong và cộng sự chủng Sphingomonas sp. RW1 có khả năng chuyển hóa 2,7-DCDD và 1,2,3,4-TCDD thành 4-chlorocatechol và 3,4,5,6-tetrachlorocatechol. Sau đó chủng RW1 tiếp tục chuyển hóa 3,4,5,6- tetrachlorocatechol thành 2-methyoxy-3,4,5,6-tetrachlorophenol [27]. Habe và cộng sự đã công bố hai chủng Pseudonomas sp. CA10 và Terrabacter sp. DBF63 đều có khả năng sử dụng từ 10-35% 2,7-DCDD và 1,2,3-TrCDD với nồng độ ban đầu là 10 ppm [25]. Ngoài vi khuẩn hiếu khí có khả năng phân hủy dioxin thì vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, vi khuẩn kị khí không bắt buộc cũng có khả năng chuyển hóa dioxin. Vi khuẩn kị khí có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ khó phân hủy chứa clo trong đó có dioxin. Rất nhiều nhóm vi khuẩn có khả năng khử clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo trong môi trường hoạt động của vi khuẩn khử sắt, vi khuẩn khử sunphát, và nhóm khử halogen v.v. Một số chủng vi khuẩn kị khí có khả năng khử clo đã được nghiên cứu như: Desulfitobacterium dehalogenans JW/IU-DC1 [34], Dehalococcoides ethenogens 195, Dehalococcoides sp. CBDB1 [30], Desulfitobacterium sp. PCE-1, Dehalococcoides sp. FL2 v.v. Trong số các vi sinh vật kị khí đã nghiên cứu trong hai thập kỷ qua thì các vi khuẩn thuộc chi Dehalococcoides được quan tâm hơn cả bởi chúng có khả năng loại khử clo Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 của rất nhiều hợp chất chứa clo như Trichlorethylene , Vinyl Chloride, Trichlorodibenzo-p-dioxins, Polychlorinated dibenzofurans v.v. [30]. Theo Bunge và cộng sự, chủng Dehalococcoides sp. 195, Dehalococcoides sp. CBDB1 đã được chứng minh là có khả năng phân hủy dioxin [19], chủng CBDB1 đã đề khử clo 1,2,3,4-TeCDD (46 µM ) trong 84 ngày nuôi cấy thành 2,3-DiCDD và 2-MCDD [19]. Chủng CBDB1 sử dụng clo trong dioxin là chất nhận điện tử, từ đó loại bỏ clo ra khỏi phân tử dioxin. Kết quả tạo ra sản phẩm ít độc hơn là 2,7; 2,8-DiCDD và 2-MCDD. Các hợp chất này sẽ dễ bị phân hủy sinh học bởi các vi sinh vật hiếu khí. Chủng CBDB1 còn có thể sử dụng 1,2,3,7,8-PCDD là chất có độ độc là 1 tương đương với 2,3,7,8-TCDD [19]. Tại Việt Nam, Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã công bố chủng FDN30 có khả năng phân hủy hiếu khí 2,3,7,8-TCDD. Đây là chủng vi nấm được phân lập từ đất nhiễm chất độc hoá học tại Đà Nẵng. Sau hai tuần, chủng này đã phân huỷ 59% dioxin chứa trong môi trường nuôi cấy [20]. Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở các quy mô, hình thức khác nhau, trong những năm qua, nhóm tác giả này đã phân lập được một số chủng vi sinh vật sử dụng dibenzofuran, dioxin, từ đất nhiễm chất độc hóa học tại sân bay Đà Nẵng. Các vi khuẩn đã được phân lập là Bacillus sp. BU3, Pseudomonas sp. BDN15, Pseudomonas sp. SETDN1, Streptomyces sp. XKDN11, Streptomyces sp. XKDN12 [1], [2], [10], [13]. 6. Phân loại vi sinh vật 6.1. Phân loại theo phƣơng pháp cổ điển Phương pháp phân loại cổ điển dựa trên các đặc điểm về hình thái, sinh lí- sinh hóa. Các đặc điểm hình thái như kích thước, hình dạng, mầu sắc của khuẩn lạc, hình dạng, kích cỡ của tế bào vi sinh vật; cách sắp xếp của tế bào (đơn, kép Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 hay dạng chùm, dạng chuỗi v.v. khả năng bắt mầu khi nhuộm Gram; các đặc điểm vi cấu trúc như có tiên mao, tiêm mao hay không?, số lượng của tiên mao, tiêm mao, cách thức di chuyển của tế bào; hình dạng và vị trí của các cơ quan trong tế bào v.v. Các đặc điểm về sinh lý và trao đổi chất như nguồn năng lượng, nguồn cacbon và nitơ mà sinh vật sử dụng, kiểu dinh dưỡng, các sản phẩm lên men, giới hạn về nhiệt độ và nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng và phát triển; dải pH và pH tối thích cho sinh trưởng, các sản phẩm trao đổi thứ cấp v.v. Khóa phân loại vi khuẩn của Bergey là ví dụ điển hình của phương pháp phân loại vi sinh vật theo phương pháp truyền thống, khóa phân loại này hiện vẫn đang được cập nhật và được nhiều nhà vi sinh vật sử dụng. 6.2 Phƣơng pháp phân loại bằng sinh học phân tử Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử và quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [7]. Bảng 1.2. Phân tích các thành phần hóa học của tế bào theo hệ thống hóa học Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại DNA nhiễm sắc thể Thành phần bazơ(%G+C) Chi Biến tính DNA:DNA Loài Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của RNA riboxome Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 RNA riboxom Trình tự nucleotid Loài, chi và trên chi Lai DNA: rRNA Protein Trình tự amino acid Loài, chi và trên chi So sánh bằng phản ứng huyết thanh Loài và chi Các kiểu điện di Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Thành tế bào Cấu trúc peptidoglycan Loài và chi Polysaccharid Acid teichoic Màng Acid béo Loài và chi Lipid phân cực Acid mycolic Isoprenoid quinones Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có khả năng xác định, có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật. Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật. Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA thì gen 16S rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Gen mã hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotid do có kích thước nhỏ nên thông tin chứa đựng ít do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi, giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen mã hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotid vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn lựa trong phân loại vi khuẩn. Cấu trúc của gen mã hóa 16S đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA [29]. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 1. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 1.1 Vật liệu Mẫu đất từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất độc hóa học ở sân bay Đà Nẵng thuộc đề tài “Nghiên cứu xử lý tẩy độc một số hợp chất hữu cơ chứa clo bằng các phương pháp hóa học và sinh học tiên tiến” do PGS.TS Đặng Thị Cẩm Hà là chủ trì đã được sử dụng để nghiên cứu phân lập chủng vi sạch vật có khả năng sử dụng 2,4,5-T và 2,4-D. 1.2 Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm có độ tinh khiết cao của các hãng Roche, Sigma, Merk v.v. Các dung dịch tách DNA plasmid (Sol I (glucose: 50 mM; tris - HCl (pH 8): 25 mM; EDTA (pH 8): 10 mM); Sol II (NaOH: 0,2N; SDS: 1%); Sol III (CH3COOK 5M: 60 ml; CH3COOH: 11,5 ml; H2O: 28,5ml). Vectơ pCR2.1 (Promega), đệm TAE 1X để điện di (Tris- acetate: 40 mM; EDTA: 1 mM). Loading dye 6x (bromophenol blue: 0,25%; xylen cyanol FF: 0,25%; glyxerol: 30%) v.v. Dịch chiết đất chứa hơn 99% là 2,3,7,8-TCDD, ngoài ra còn có các chất khác như 2,4,5-T, 2,4-D v.v. được chiết từ đất ô nhiễm của sân bay Đà Nẵng. Trình tự cặp mồi Mồi xuôi 27F: 5’ AGA GTT TGA TTC MTG GCT CAG 3’ Mồi nguợc 1492R: 5’ GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3’ 1.3 Thiết bị, máy móc Các thiết bị, máy móc sử dụng tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trường và phòng thí nghiệm trọng điểm quốc gia về công nghệ gen – Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Viện Công nghệ sinh học bao gồm Box cấy vô trùng, kính hiển vi, cân điện tử, nồi khử trùng, tủ sấy, máy nuôi lắc nhiệt độ 30oC, tủ nuôi ổn nhiệt 30oC, máy ly tâm, máy PCR, máy xác định trình tự gen ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, máy soi DNA, máy chụp ảnh Gel-Doc, máy điện di Bio- Rad, tủ lạnh các loại 4oC, -20oC, -80oC, các dụng cụ thí nghiệm như bình tam giác, pipet, đầu typ, ống ly tâm v.v. 2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.1 Môi trƣờng nuôi cấy 2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l) - KH2PO4 0,5 - K2HPO4 0,5 - MgSO4 2 - NaCl 1 - NH4Cl 1 - NH4NO3 1 - CH3COONa 1 - CaSO4 1 - Lactat Natri 1 ml - Axít Butyric 10 µl - Axít Propionic 10 µl - Axít Isobutyric 1 µl - Axít Succinic 3,5 µl - Và các chất bổ sung khác 2.1.2 Môi trường SH1 thạch Thành phần các loại hóa chất giống như môi trường khoáng dịch nhưng có bổ sung 18g agar/l. 2.1.3 Môi trường muối khoáng (g/l) KNO3 3 MgSO4 0,4 KH2PO4 0.3 Na2HPO4 0,7 NaCl 0,4 pH 7-7,2 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.1.4 Môi trường LB dịch (g/l) NaCl 10 Tryptone 10 Cao men 5,0 Nước cất vừa đủ 1 lít pH 7 2.1.5 Môi trường LB thạch (g/l) Công thức các hóa chất tương tự môi trường LB dịch nhưng có bổ sung thêm 18g agar/l. 2.1.6 Nước muối sinh lý (0,85%) NaCl 8,5g Nước máy vừa đủ 1 lít 2.2 Phƣơng pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiếu khí 2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật Vi khuẩn được phân lập theo phương pháp làm giàu trên môi trường SH1/5 có bổ sung 2,4,5-T. Cân 5g đất từ bioreactor cho vào bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trương SH1/5 có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T, nuôi lắc 5- 7 ngày ở 30oC. Chuyển 10% giống ở lần làm giàu thứ nhất sang bình làm giàu lần hai chứa môi trường SH1/5 bổ sung 200 ppm 2,4,5-T. Quá trình làm giầu này được lặp lại 3. 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Từ mẫu làm giầu lần thứ 3, pha loãng từ 101 đến 107, sau đó bơm 100μl dung dịch pha loãng có chứa vi khuẩn lên các đĩa môi trường SH 1/5 thạch có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T. Sau 5 đến 7 ngày nuôi ở điều kiện tối 30oC, những Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên đĩa thạch được tách và chuyển sang nuôi cấy trong bình tam giác chứa 20 ml môi trường SH 1/5 dịch có bổ sung 200 ppm 2,4,5-T sau đó nuôi lắc 200vòng/phút 7 đến 10 ngày ở 30oC. 2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 2.3.1 Nhuộm Gram Nhỏ một giọt môi trường nuôi cấy có chứa vi sinh vật vào giữa lam kính, giàn đều dịch, cố định mẫu trên ngọn lửa đèn cồn. Tiếp theo, nhỏ dung dịch tím kết tinh (crystal violet) lên mẫu, để 1 phút. Mẫu được rửa bằng nước cất 2 lần, thấm khô, sau đó nhỏ dung dịch lugon lên mẫu, để yên mẫu trong 1 phút. Cố định mẫu bằng cồn 900 trong 30 giây sau đó để bay hơi tự nhiên đến khô bề mặt. Tiếp theo, nhỏ dung dịch safarin lên mẫu, để yên trong 1-2 phút và rửa lại mẫu bằng nước cất 2 lần, để khô tự nhiên. Mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học với vật kính dầu với độ phóng đại 100 lần. Vi khuẩn gram âm bắt mầu hồng, vi khuẩn gram dương bắt mầu xanh. 2.3.2 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét Vi khuẩn được nuôi cấy 7 ngày trên môi trường CNSH1 dịch có chứa dịch chiết đất. Dịch nuôi cấy được lọc qua giấy lọc thô để loại bỏ cặn bẩn rồi ly tâm 5000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. Sau đó rửa lại sinh khối bằng nước cất 2 lần để loại các chất cặn bẩn trong môi trường nuôi cấy. Tế bào vi khuẩn được hũa trong glutaraldehyt 2,5 % trong đệm phosphat natri 100 mM (pH 7,2) trong 30 phút. Tiếp theo, lấy một giọt tế bào đã xử lý (khoảng 106- 108 tế bào/ ml) đưa lên lưới đồng và để 1 phút để mẫu bám vào lưới. Rửa nhẹ nhàng với vài giọt nước và mẫu được làm khô qua cồn 25, 50, 75 và 100%, T-butyl. Sau đó, các mẫu được làm khô bằng máy đông khô và phủ vàng và quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL 5410 LV. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 2.4 Phƣơng pháp phân tích khả năng phân hủy 2,4,5-T Bước 1 Lấy 22 ml mẫu bổ sung thêm 2 gam NaCl, 30 ml n-hexan và lắc trong 30 phút. Bước 2 Chiết lấy tương hữu cơ và chất chuyển hóa, cho isopropanol và một hai giọt H2SO4 đặc, rửa bằng nước cất đến pH = 7, thổi khô mẫu bằng N2 sạch đến 1 ml. Bơm dịch vào máy sắc ký khí (GC) với detechter ECD. 2.5 Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật Màng tế bào được phá bằng enzyme lyzozym. Enzyme protease K được dùng để loại bỏ protein. Việc bổ sung thêm các hóa chất như phenol, chloroform, isoamylalcohol nhằm loại protein và các tạp chất ra khỏi dung dịch chứa DNA. Thu hồi DNA bằng cách tủa trong cồn hay isopropanol và ly tâm. Các bước được tiến hành theo thứ tự sau: Bước 1: Thu sinh khối tế bào vào eppendorf 1,5 ml bằng cách ly tâm 6000 vòng trong 10 phút. Bước 2: Hòa tan mẫu trong 400µl dịch đệm lysis. Thành phần đệm: 20 mM Tris-Cl (pH 8) 50 mM NaCl 10 mM EDTA Bước 3: Bổ sung lyzozyme, ủ ở 37oC trong 15-30 phút. Bước 4: Bổ sung protease K, ủ ở 56oC trong 1 giờ. Bước 5: Bổ sung phenol (tỷ lệ 1:1 v/v), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Bước 6: Bổ sung chloroform : isoamylalcohol (tỷ lệ 1: 1 v/v), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Bước 7: Hút dịch phía trên chuyển sang eppendorf mới. Tủa DNA bằng ethanol 100% giữ ở -20oC trong 2-3 giờ. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Bước 8: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu kết tủa DNA. Bước 9: Rửa DNA bằng cồn 70%. Bước 10: Làm khô, hoà tan trong nước khử ion vô trùng. Bước 11: Loại RNA bằng RNase (10 mg/ml), ủ 37oC trong 2 giờ. 2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Cho đến nay kỹ thuật PCR được coi là một trong những phương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại. Thành phần phản ứng Buffer MgCl2 2,5 µl dNTPs ( 10mM ) 2,5 µl Mồi xuôi 27 F 1 µl Mồi ngược 1492 R 1 µl Taq polymeraza 0,2 µl DNA 1 µl MgCl2 ( 10 mM ) 3 µl H2O 13,8 µl Tổng thể tích 25 µl Chu trình nhiệt độ Bước 1 95oC trong 5 phút Bước 2 94oC trong 1 phút Bước 3 55oC trong 1 phút Bước 4 72oC trong 1 phút 30 giây Bước 5 Lặp lại 30 lần từ bước 2 đến bước 4 Bước 6 72oC trong 8 phút Bước 7 4oC để qua đêm Trình tự cặp mồi Mồi xuôi 27F: 5’ AGA GTT TGA TTC MTG GCT CAG 3’ Mồi nguợc 1492R: 5’ GGY TAC CTT GTT ACG ACTT 3’ Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 2.5.3 Điện di kiểm tra trên gel agarose Phương pháp này dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic. Axit nucleic là những đại phân tử luôn tích điện âm, dưới tác dụng của dòng điện một chiều chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dương. Trong các thí nghiệm này chúng tôi sử dụng gel agarose 1%, nhuộm bằng Ethidium Bromide và tiến hành soi DNA dưới ánh sáng tử ngoại. 2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA Sản phẩm PCR đặc hiệu được gắn vào vector pCR2.1 nhờ T4 DNA ligase. Phản ứng thực hiện ở 14oC trong 18 giờ. Thành phần phản ứng như sau: Nước đề ion vô trùng 4,0 µl Đệm T4 DNA ligase 1,0 µl Sản phẩm PCR 2,5 µl Vector pCR 2.1 (25mg/µl) 1,5 µl T4 DNA ligase 1,0 µl Đảo trộn rồi cho vào tủ lai 14oC trong 18 giờ. 2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli Bước 1: Cho 1,5 µl dịch vector pCR2.1 đã gắn sản phẩm PCR vào ống chứa 50 µl tế bào khả biến Escherichia coli INVαF’, ủ trong đá 30 phút. Bước 2: Sốc nhiệt ở 42oC trong 30 giây. Bước 3: Bổ sung 250 µl môi trường SOC, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC trong 1 giờ. Bước 4: Cấy gạt dịch sản phẩm trên lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (môi trường LB có bổ sung ampicillin 100 mg/ml và X-Gal 50 mg/ml). Bước 5: Nuôi ở 37oC trong 18 giờ. Bước 6: Bảo quản ở 4oC để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Trên môi trường LB có bổ sung X-gal, những khuẩn lạc có màu trắng là những dòng có thể được đính đoạn DNA ngoại lai, còn những khuẩn lạc màu xanh có thể là những cá thể không được đính đoạn DNA ngoại lai. 2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) Sau khi nuôi khuẩn lạc đã biến nạp trên môi trường chọn lọc, khuẩn lạc tròn màu trắng đã được chọn ra để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi 27F-1492R nhắm xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn gen quan tâm hay không. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose 1% để chọn ra những khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn. Thành phần và chu kỳ nhiệt cũng giống như phản ứng PCR, nhưng chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng khuẩn lạc. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Nước cất khử ion, khử trùng 14.75 2 Buffer PCR (NH + 4) 2.5 3 Mgcl2 3 4 dNTPs 2.5 5 Mồi xuôi 27F 1 6 Mồi ngược 1492R 1 7 Taq polymerase 0,25 8 Template Khuẩn lạc Tổng 25 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ ( O C) Thời gian Chu Kỳ 1 Biến tính 95 5 phút 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 52 1 phút 32 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 30 giây 5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit của hãng Fermentas Bước 1: Cho 1,5ml dịch nuôi cấy của dòng vi khuẩn được chọn vào eppendorf, ly tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút. Bước 2: Đổ dịch, úp eppendorf trên giấy thấm. Bổ sung 250l đệm P1 vortex cho đến khi sinh khối tan hết. Bước 3: Bổ sung 250l đệm P2 và đảo nhẹ 15 lần cho tới khi dịch trở nên trong. Bước 4: Bổ sung 350l đệm N3 và đảo nhẹ 15 lần. Bước 5: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút. Bước 6: Chuyển dịch sang cột QIAprep, cột đặt trên eppendorf 2ml. Bước 7: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang eppendorf mới. Bước 8: Bổ sung 500l đệm PB và ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút, chuyển cột sang eppendorf mới. Bước 9: Bổ sung 750l đệm PE, để trong 3 phút. Bước 10: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 1 phút. Chuyển cột sang eppendorf mới. Bước 11: Ly tâm lại một lần nữa 12000 vòng/phút trong 1 phút. Bước 12: Chuyển cột sang eppendorf mới, bổ sung 60ul nước deion. Để trong 1 phút. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Bước 13: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút. Bỏ cột và giữ lại eppendorf chứa DNA plasmid. 2.5.8 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA Đọc trình tự đoạn gen 16S rRNA theo hương pháp của Sanger sử dụng máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Data Analyzer. Trình tự nucleotide được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 và DNA Sequencing Analysis. 2.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA thu được với đoạn gen có kích thước và vị trí tương tự ở các vi sinh vật khác thuộc nhóm prokaryote đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen thế giới EMBL (European Molecular Biology Laboratory) và sử dụng phần mềm tin sinh học Clustal để xây dựng cây phát sinh chủng loại. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Nuôi cấy, phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiểu khí 1.1 Nuôi cấy, làm giàu tập đoàn vi sinh vật Mẫu đất của ba bioreactor hiếu khí HKR3, HKR4 , HKR5, được tiến hành làm giàu trong môi trường SH1/5 có bổ sung hai nguồn cơ chất là 2,4,5-T, 2,4-D. Các mẫu đất được tiến hành làm giàu 3 lần trên môi trường SH1/5 với nồng độ các cơ chất là 100ppm. Kết quả làm giàu tập đoàn vi sinh vật nuôi cấy làm giàu lần một trên cơ chất 2,4,5-T, 2,4-D được trình bày ở hình 3.1. A B Hình 3.1 Tập đoàn vi sinh vật của bioreactor HKR3, HKR4, HKR5 trên môi trường chứa 2,4,5-T (A) và 2,4-D (B) Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Trên hình 1.A và 1.B tập đoàn vi sinh vật trong các mẫu đất ở các bioreactor HRK3, HRK4, HRK5 phát triển rất tốt trong lần làm giàu đầu tiên, các bình nuôi cấy đều thấy có viền sinh khối ở trên thành bình. Quá trình làm giầu được tiến hành hai lần nữa và kết quả của lần làm giàu cuối cùng được thể hiện trên hình 3.2. A B C Hình 3.2 Tập đoàn vi sinh vật của bioreactor HKR3(A), HKR4 (B), HKR5 (C) trong môi trường chứa 2,4,5-T và 2,4-D. Quan sát hình 3.2 nhận thấy các bình nuôi cấy tập đoàn vi sinh vật phát triển mạnh, viền sinh khối rõ ràng và môi trường có mầu trắng đục. Điều này cho thấy tập đoàn vi sinh vật được nghiên cứu của ba bioreactor HKR 3, HKR4, HKR5 có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung hai nguồn carbon là 2,4,5-T và 2,4-D. Để nghiên cứu, tìm hiểu khả năng sử dụng 2,4,5-T hoặc 2,4-D của từng chủng đơn, các nghiên cứu sàng lọc tìm kiếm và phân lập các chủng vi khuẩn từ các bình nuôi cấy làm giầu lần 3 đã được tiến hành. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 1.2 Phân lập chủng vi khuẩn Từ các mẫu làm giàu lần 3 tập đoàn vi sinh vật của bioreactor HKR3, HKR4, HKR5, đã được nuôi trên môi trường thạch. Từ các đĩa thạch này một số khuẩn lạc đã được chọn để chuyển sang nuôi cấy trên môi trường dịch thể. Sau quá trình phân lập và chọn lọc các chủng vi khuẩn sạch HR3.1 , HR4.1, HR5.1 đã được phân lập (hình 3.3, bảng 3.1). A B C Hình 3.3 Hình thái khuẩn lạc các chủng HR3.1 (A), HR4.1 (B), HR5.1 (C) trên môi trường thạch có 2,4,5-T. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của chủng HR3.1, HR4.1, HR5.1 trên môi trường chứa 2,4,5-T Chủng vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc HR3.1 Khuẩn lạc hình tròn, lồi, mầu trắng đục, đường kính khoảng 2 mm. HR4.1 Khuẩn lạc hình tròn bé, lồi, mầu trắng, đường kính khoảng 0,5 mm. HR5.1 Khuẩn lạc hình tròn, mầu trắng đục, đường kính khoảng 1,9-2,1 mm Từ kết quả nhận được ở hình 3.3 và bảng 3.1 cho thấy, trong 3 chủng đơn đã phân lập được, chủng HR5.1 có khả năng phát triển tốt hơn hai chủng HR3.1 và HR4.1. Vì vậy chủng HR5.1 đã được chọn để tiếp tục nhiên cứu phục vụ cho mục đích cũng như nội dung của luận văn. 2. Đặc điểm phân loại của chủng HR5.1 2.1 Hình thái tế bào Chủng HR5.1 là vi khuẩn Gram âm, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét có độ phóng đại 10.000 lần cho thấy chủng HR5.1 tế bào của chủng HR5.1 có dạng hình que ngắn kích thước khoảng 1,6-1,9 x 0,5-0,6 μm. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Hình 3.4 Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn HR5.1 Để xác định vị trí phân loại của chủng vi khuẩn HR5.1 Các nghiên cứu tách dòng gen mã hóa 16S rRNA, giải trình tự và so sánh với các dự liệu trên ngân hàng Gen đã được tiến hành. 2.2 Phân loại dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số Để tiến hành các nghiên cứu phân loại vi khuẩn, việc thu được DNA tổng số không bị đứt gãy, có độ tinh sạch cao là rất quan trong. Hiện nay có nhiều phương pháp tách chiết DNA tổng số của vi sinh vật được sử dụng, phụ thuộc vào loại mẫu nghiên cứu. Mẫu vi khuẩn HR5.1 đã được tiến hành tách chiết DNA tổng số theo mô tả của Sambrook và Russell [40]. Quá trình tách chiết được thực hiện theo các buớc mô tả ở phần phương pháp, sản phẩm được điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Kết quả trình bày ở hình 3.5 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Hình 3.5 Phổ điện di DNA tổng số chủng HR 5.1 Kết quả ở hình 3.5 chứng tỏ DNA tổng số của chủng HR5.1 không bị đứt gẫy, sạch để có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng HR5.1 bằng kỹ thuật PCR Sử dụng DNA tổng số tách từ chủng HR5.1 để làm khuôn, cặp mồi đặc hiệu (27F và 1492R) và chu trình nhiệt như đã trình bày ở phần phương pháp để nhân gen 16S rRNA của chủng HR5.1 đã được nhân lên nhờ PCR. Sau phản ứng, sản phẩm PCR đã được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% kết quả được thể hiện trên hình 3.6 DNA tổng số Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Hình 3.6 Phổ điện di sản phẩm PCR của chủng HR5.1 Giếng M Thang DNA chuẩn 1Kb Giếng HR5.1 Sản phẩm PCR của chủng HR5.1 Trên điện di đồ sản phẩm PCR là một băng duy nhất và có kích thước khoảng 1500bp, đúng với kích thước theo tính toán lý thuyết. Điều này chứng tỏ phản ứng PCR đã nhân khá đặc hiệu đoạn gen 16S rRNA có kích thước mong muốn. 2.2.3 Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pBT Sản phẩm PCR đã được tiến hành gắn sản phẩm vào vector pBT nhờ T4 DNA ligase và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli. Sau khi nuôi qua đêm ở 37 oC, trên đĩa biến nạp xuất hiện các khuẩn lạc xanh và trắng xen kẽ nhau (hình 3.7). Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Hình 3.7 Đĩa biến nạp sản phẩm ligation của chủng HR 5.1. Để kiểm tra nhanh tế bào vi khuẩn có mang gen mong muốn hay không, phương pháp colony-PCR đã được sử dụng. Một số khuẩn lạc trắng được sử dụng làm khuôn cho phản ứng colony-PCR với chu trình nhiệt và thành phần phản ứng như ở phần phương pháp. Kết quả phản ứng colony-PCR được thể trình hình 3.8. Hình 3.8 Phổ điện di sản phẩm colony-PCR Giếng M Thang DNA chuẩn 1Kb Giếng 1,2,3 Thứ tự các dòng được chọn để tiến hành colony-PCR Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Quan sát trên hình 3.8 ta thấy sản phẩm PCR của ba khuẩn lạc được chọn để PCR kiểm tra là một đoạn DNA có kích khoảng 1500bp phù hợp với kích thước của sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA. Điều này chứng tỏ cả ba khuẩn lạc được chọn đều có DNA plasmid mang đoạn gen 16S rRNA. Một dòng DNA plasmid đã được chọn để tách DNA plasmid bằng Kit Plasmid DNA purification. Sau khi tách DNA plasmid, enzyme BamHI được sử dụng để cắt dòng DNA plasmid này. Kết quả điện di sản phẩm cắt cho thấy có một đoạn DNA có kích thước khoảng 1500bp đã được cắt (hình 3.9). Kích thước đoạn DNA này phù hợp với kích thước đoạn gen cần nghiên cứu. Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid bằng enzyme BamHI Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb Giếng pBT-HR5.1: dòng Plasmid được chọn Giếng pBT: dòng plasmid đối chứng 2.2.4 Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng HR5.1 Dòng vi khuẩn mang DNA plasmid có gen mong muốn đã được tách DNA plasmid và làm sạch sản phẩm. Sau đó, DNA plasmid được xác định trình tự Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 nucleotide theo phương pháp của Sanger. Sau khi xử lý số liệu trình tự chủng HR5.1 như sau: Kết quả đọc trình tự cho thấy, đoạn gen có kích thước 1503kb là đúng với tính toán lý thuyết. So sánh trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng HR5.1 với các trình tự gen của các vi sinh vật nhân sơ đã được công bố trên ngân hàng gen thế giới và phân tích bằng phần mềm Clustal, đồng thời sử dụng chương trình Blast, độ tương đồng giữa chủng HR5.1 với một số chủng vi sinh vật khác được xác định (bảng 3.2). Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Bảng 3.2. Mức độ tương đồng đoạn gen mã hóa 16S rRNA của chủng HR5.1 với một số chủng vi khuẩn khác Tên vi sinh vật Mức độ tương đồng Pseudomonas putida strain ZB-16A 98% Pseudomonas putida strain ppnb1 98% Pseudomonas putida isolate PD39 98% Pseudomonas putida strain YJF3-34 98% Dựa trên trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng HR5.1 và trình tự nucleotide tương ứng của các chủng VSV thuộc nhóm prokaryate, cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng (hình 3.10). Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Hình 3.10 Cây phát sinh chủng loại của vi khuẩn Pseudomonas sp. HR5.1 Từ vị trí của chủng HR5.1 trên cây phát sinh chủng loại cho thấy chủng này gần gũi với các chủng vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas. Trình tự gen 16S RNA của chủng HR5.1 có mức tương đồng 98% với các vi khuẩn Pseudomonas putida sp.ZB-16A, Pseudomonas putida isolate PD39, Pseudomonas putida strain ppnb1, Pseudomonas putida strain YJF3-34, Pseudomonas sp. PHD-8. Kết hợp với một số đặc điểm hình thái và trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn HR5.1, chủng vi khuẩn này có thể được xếp vào chi Pseudomonas , và được đặt tên là Pseudomonas sp. HR5.1. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 Một số nghiên cứu gần đây cũng cho thấy một số loài vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả năng phân hủy 2,4,5-T và các hợp chất thơm chứa clo. La Thị Thanh Phương và cộng sự đã phân lập được chủng Pseudomonas sp. BDN15, từ nguồn đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Chủng BDN15 có khả năng phát triển trên môi trường có bổ sung 2,4,5-T [6]. Chủng Pseudomonas pseudoalcaligenes strain NRRL B-18087 được Dipak Roy phân lập đã phân hủy 2,4,5-T, 2,4D và 2,4,5-T 2,4D là nguồn cung cấp carbon cho chủng này [23]. Chủng vi khuẩn HR5.1 cũng thuộc chi Pseudomonas vậy liệu chủng này có khả năng phân hủy 2,4,5-T hay không các nghiên cứu tiếp theo đã được tiến hành. 3 Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng HR5.1 3.1 Khả năng phát triển của chủng HR5.1 trên PAH Trong đất nhiễm chất diệt cỏ ở sân bay Đà Nẵng ngoài thành phần ô nhiễm là chất diệt cỏ 2,4,5-T và 2,4-D còn có một số các thành phần ô nhiễm khác như dichlorphenol, trichlorophenol, PAH .v.v. Để kiểm tra khả năng phát triển của vi khuẩn HR5.1 trên nguồn PAH, chủng HR5.1 được nuôi trên môi trường SH1/5 có bổ sung 100ppm các PAH như Pyren, Napthalen, Phananthren. Kết quả cho thấy sau một tuần nuôi ở 30oC lắc 200vòng/phút, chủng HR5.1 phát triển mạnh trên cả 3 cơ chất bổ sung vào (bảng 3.3). Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Bảng 3.3 Khả năng phát triển của chủng HR5.1 trên PAH Khả năng phát triển +++ +++ +++ Chú thích - : Không phát triển + : Phát triển yếu ++ : Phát triển bình thường +++ : Phát triển tốt C : Đối chứng Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Trên thế giới, người ta đã phát hiện ra khá nhiều chủng Pseudomonas có khả năng phân hủy PAH như Pseudomonas putida NCIB 9816-4 có khả năng phân hủy napthelen [38], Pseudomonas rhodesiae KK1có khả năng phát triển trên nguồn cơ chất trộn ba loại PAH anthracene, naphthalene và phenanthrene [31]. Như vậy chủng HR5.1 có khả năng phát triển tốt trên nguồn PAH. Tuy nhiên để khẳng định chắc chắn khả năng phân hủy PAH của chủng này cần phải có các nghiên cứu xác định bằng HPLC. 3.2 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng HR5.1 3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có chứa 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật phụ thuộc vào rất nhiều điều kiện như nhiệt độ, độ ẩm, pH, thành phần môi trường .v.v. Đặc biệt là thành phần môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng phát triển của vi sinh vật. Để xác định ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên sự phát triển của vi khuẩn HR5.1, chủng này được nuôi trên ba môi trường khác nhau là môi trường SH1 (môi trường giầu dưỡng chất), môi trường muối khoáng nghèo chất dinh dưỡng và môi trường SH1/5 (môi trường trộn giữa môi trường SH1 và môi trường muối khoáng). Kết quả được chỉ ra ở hình 3.12. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Hình 3.12 Ảnh hưởng của môi trường lên sự phát triển của Chủng HR5.1 Chủng HR5.1 phát triển tốt nhất trên môi trường SH1, chủng này làm đổi mầu môi trường sang mầu xanh có ánh huỳnh quang (hình 3.12). Trên môi trường muối khoáng chủng HR5.1 tuy có mọc nhưng yếu hơn rất nhiều so với khi nuôi trên môi trường SH1 hay SH1/5. 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 Mỗi chủng vi sinh vật đều có một ngưỡng nhất định đối với một chất độc mà tại đó nó có thể phát triển được. Tùy thuộc vào từng chủng cũng như loại chất độc mà ngưỡng này có thể cao hay thấp. Để tìm hiểu sơ bộ ngưỡng của 2,4,5-T đối với sự phát triển của chủng HR5.1, chủng này được nuôi trên môi trường SH1/5 với các nồng độ 2,4,5-T khác nhau. Kết quả ở bảng 5 cho thấy, sau 7 ngày nuôi cấy trong môi trường có nồng độ 300 ppm chủng vẫn phát triển nhưng yếu. Chủng này phát triển tốt từ nồng độ 50 ppm đến 200 ppm. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Bảng 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 Khả năng phát triển +++ +++ +++ + Chú thích - : Không phát triển + : Phát triển yếu ++ : Phát triển bình thường +++ : Phát triển tốt C : Đối chứng Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 3.2.3 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng vi khuẩn HR5.1 Để đánh giá khả năng sử dụng 2,4,5-T của chủng vi khuẩn HR5.1 chúng tôi đã tiến hành phân tích lượng 2,4,5-T còn lại trong dịch nuôi cấy có và không có vi sinh vật (mẫu đối chứng) bằng phương pháp sắc ký. Mẫu đem đi phân tích được nuôi lắc ở 30oC và bổ sung 200ppm 2,4,5-T. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.13. Bảng 3.5 Khả năng phân hủy 2,4,5-T bởi HR 5.1 Hàm lượng thu hồi 2,4,5-T bị loại bỏ (%) Không có vi sinh vật (ppm) Có vi sinh vật (ppm) 183,35 117,9 35,7% Từ kết quả bảng 5 và hình 3.13 ta thấy chủng HR5.1 sau một tuần nuôi cấy đã sử dụng được 35,69% lượng 2,4,5-T đưa vào môi trường nuôi cấy. Liên quan tới khả năng sử dụng 2,4,5-T tác giả Nguyễn Thanh Thủy và cộng sự đã công bố chủng nấm FDN41 có khả năng loại bỏ 43,46% lượng 2,4,5-T đưa vào sau 20 ngày nuôi lắc. Chủng này phân hủy 2,4,5-T trong môi trường chỉ chứa 2,4,5-T là nguồn cacbon và năng lượng duy nhất [12]. La Thanh Phương và cộng sự đã phân lập được chủng Pseudomonas sp BDN15 cũng từ nguồn đất ô nhiễm tại sân bay Đà Nẵng, chủng này có khả năng phân hủy 39,37% 2,4,5-T trong 90 ngày ở điều kiện tĩnh và nồng độ 2,4,5-T ban đầu là 1000 ppm đây cũng là nguồn năng lượng và carbon duy nhất trong môi tường nuôi cấy [6]. Khi so sánh trình tự nucleotid của chủng BDN15 và chủng HR5.1 cho thấy trình tự của chúng giống nhau 94%. Điều này cho thấy tuy hai chủng BDN15 và HR5.1 cùng thuộc chi Pseudomonas nhưng chúng có thể là hai chủng khác nhau, đây là sự đa dạng của sinh vật có mặt trong vùng bị ô nhiễm. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 Trên thế giới có khá nhiều nghiên cứu công bố về sinh vật có khả năng phân hủy 2,4,5-T. Theo Haugland và cộng sự đã công bố khả năng phân hủy mạnh 2,4-D và 2,4,5-T của một số chủng vi khuẩn. Với đặc tính sinh trưởng nhanh của vi khuẩn, chỉ sau 24h nuôi, chủng Pseudomonas cepacia AC1100 đã phân hủy được 960 μg/ml 2,4,5-T, 280 μg/ml 2,4-D. Chủng này thậm chí còn có khả năng phân hủy hỗn hợp 2,4,5-T và 2,4-D tuy nhiên khả năng phân hủy hai chất này giảm hẳn xuống còn 26 μg/ml 2,4,5-T và 24 μg/ml 2,4-D [26]. Người ta đã tạo ra một chủng tái tổ hợp có nguồn gốc từ chủng Pseudomonas cepacia AC1100 được nhận thêm plasmid pJP4 quy định khả năng phân hủy 2,4-D từ chủng Alcalugenes eutrophus JMP134, chủng này được đặt tên là RHJ1. Chủng tái tổ hợp RHJ1 có khả năng phân hủy mạnh chất độc ở môi trường có bổ sung riêng rẽ 2,4,5-T, 2,4-D cũng như môi trường có bổ sung hai loại cơ chất này [26]. Như vậy chủng HR5.1 có khả năng phát triển tốt trên các nguồn cơ chất khác ngoài 2,4,5-T như PAH, 2,4-D, điều này rất phù hợp với công nghệ xử lý bằng bioreactor. Vi khuẩn HR5.1 có khả năng phân hủy khá tốt 2,4,5-T điều này đóng góp thêm hiểu biết về vi sinh vật có mặt trong bioreactor nhằm hoàn thiện công nghệ này. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết Luận 1. Từ 3 mẫu đất ở trong bioreactor HRK3, HRK4, HRK5, 3 chủng vi khuẩn HR3.1, HR4.1, HR5.1 đã được phân lập. Chủng HR3.1 có khả năng phát triển trên môi trường SH1/5 có bổ sung 2,4-D, Chủng HR4.1 và HR5.1 có khả năng phát triển trên môi trường SH1/5 có bổ sung 2,4,5-T. 2. Chủng vi khuẩn HR5.1 là vi khuẩn Gram âm, khuẩn lạc hình tròn, mầu trắng đục, đường kính từ 1,9-2,1 mm. Chủng HR5.1 có dạng que ngắn kích thước khoảng 1,6-1,9 x 0,5-0.6 μm. Chủng HR5.1 có mối quan hệ gần gũi với các loài thuộc chi Pseudomonas đặc biệt trình tự gen 16S rRNA của chủng HR5.1 có độ tương đồng cao tới 98% với một số loài thuộc chi Pseudomonas. Chủng HR5.1 được đặt tên là chủng Pseudomonas sp. HR5.1. 3. Chủng HR5.1 phát triển tốt nhất trên môi trường SH1 và phát triển yếu trên môi trường khoáng có chứa 2,4,5-T. Vi khuẩn HR5.1 có khả năng phát triển tốt trên môi trường SH1/5 có chứa PAH. 4. Chủng HR5.1 phát triển tốt ở nồng độ 2,4,5-T bổ sung từ 50 ppm đến 200 ppm, giảm dần ở nồng độ 2,4,5-T 300 ppm. 5. Trên môi trường SH1/5 chứa 200 ppm 2,4,5-T sau 1 tuần, chủng HR5.1 phân hủy 35,7%. Kiến nghị 1. Tiếp tục nghiên cứu khả năng phân hủy các nguồn carbon khác như PAH, 2,4-D, dioxin .v.v. của chủng vi khuẩn HR5.1 nhằm đánh giá khả năng phân hủy nhiều loại chất độc của chủng này. 2. Nghiên cứu sâu hơn về gen chức năng tham gia quá trình phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của chủng HR5.1 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Đương Nhã, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Nguyên Quang (2008), Khảo sát vi sinh vật trong vùng nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở khu vực sân bay Đà Nẵng và khử độc đất nhiễm ở điều kiện phòng thí nghiệm, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4A), tr. 837-846. 2. Đặng Thị Cẩm Hà, Phạm Hữu Lý, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Đệ, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Đương Nhã, Mai Anh Tuấn, La Thanh Phương, Nguyễn Thị Sánh, Nguyễn Thu Thủy, Đỗ Bích Thanh, Đỗ Ngọc Tuyên, Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Văn Hồng (2005), Nghiên cứu phát triển công nghệ phân hủy sinh học và kỹ thuật nhả chậm làm sạch chất độc hóa học trong đất, Báo cáo nghiệm thu đề tài nhà nước thuộc chương trình 33, Hà Nội. 3. Đặng Thị Cẩm Hà (2008). Nghiên cứu xử lý tẩy độc một số hợp chất hữu cơ chứa clo bằng các phương pháp hóa học và sinh học tiên tiến. Báo cáo nghiệm thu đề tài cấp Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Hà Nội. 4. Hoàng Anh Cung (1993). Ảnh hưởng của 2,4,5-T đến cây lúa và vi sinh vật trong đất. Chất diệt cỏ, tác hại lâu dài đối với con người và thiên nhiên. Hội thảo quốc tế lần II: 139-141. 5. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thanh Thủy, Ngô Xuân Quý, Nghiêm Xuân Trường, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004), Khả năng phân hủy 2,4-D và dibenzofuran của chủng nấm sợi FDN20, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2(4), tr. 517-528. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 6. La Thị Thanh Phương, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thi Cẩm Hà (2005). Một số đặc điểm sinh học và khả năng phân sử dụng 2,4,5-T của chủng vi khuẩn BDN15 phân lập từ vung đất ô nhiễm chất độc hóa học. Tạp Chí Công nghệ Sinh học 3(3): 389-396, 2005. 7. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003). Áp dụng các kĩ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam. Nhà xuất bản KH&KT Hà Nội: 325-329. 8. Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học phân tử của ba chủng vi khuẩn sử dụng 2,4-D phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Đà Nẵng, Tạp chí Sinh học, 29(4), tr. 80-85. 9. Nguyễn Bá Hữu. 2002. Nghiên cứu các nhóm vi sinh vật và khả năng phân hủy hydrocacbon thơm đa nhân của một số chủng vi khuẩn trong quá trình xử lí ô nhiễm dầu tại Khe Chè, Quảng Ninh. Luận án thạc sĩ sinh học. 10. Nguyên Đương Nhã, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Ngọc Bảo, Đặng Thị Cẩm Hà (2005), Khả năng phân hủy hydrocarbon thơm đa nhân và dibenzofuran của chủng xạ khuẩn XKDN12, Tạp chí công nghệ sinh học, 3(1), tr. 123-132. 11. Nguyễn Thanh Thủy, Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2006), Nghiên cứu phân loại và khả năng phân hủy chất độc của chủng nấm sợi FDN22 phân lập từ đất xử lý ô nhiễm chất độc hóa học, Tạp chí công nghệ sinh học, 4(1), tr. 125-132. 12. Nguyễn Thanh Thủy, Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Vũ Xuân Đạt, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007). Phân loại và khả năng phân hủy chất diệt cỏ 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid của chủng nấm sợi FDN41 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Tạp chí công nghệ sinh học, 6(1), tr. 119-126 13. Nguyễn Thị Sánh, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2005). Phân loại và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của chủng Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN1 từ đất nhiễm độc hóa học tại Đà Nẵng. Tạp chí Công nghệ Sinh học. 3(2): 257-264. 14. Nguyễn Văn Minh (2003). Nghiên cứu tẩy độc ở Việt Nam. Hội thảo Việt Nam-Hoa Kỳ về các phương pháp xác định, xử lý và đánh giá vùng ô nhiễm dioxin: 80-85. 15. Trần Xuân Thu (2003). Bước đầu đánh giá mức độ ô nhiễm dioxin trong môi trường Việt Nam. Hội thảo Việt Nam-Hoa Kỳ về các phương pháp xác định, xử lý và đánh giá vùng ô nhiễm dioxin: 38-47. 16. Trịnh Ngọc Bảo, Phan Thị Hoan, Đào Ngọc Phan, Nguyễn Thị Vĩnh (1993). Nghiên cứu nhiễm sắc thể ở thế hệ F2 của những người tiếp xúc với chất độc hóa học trong cuộc chiến tranh Việt Nam. Chất diệt cỏ, tác hại lâu dài đối với con người và tự nhiên. Hội thảo quốc tế lần II: 399-402. 17. Võ Quý, Đặng Huy Huỳnh, Mai Đình Yên, Phùng Tửu Bôi, Phạm Bình Quyền (2002). Thử đánh giá lại hậu quả của chất mầu da cam/dioxin lên một trường tại vùng a lưới sau gần 30 năm kết thúc chiến tranh. Chất diệt cỏ, tác hại lâu dài đối với con người và thiên nhiên. Hội thảo quốc tế lần II: 205-213. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài 18. Barry Dellinger (2003). Treatment and prevention of formation of dioxins. U.S.-Viet Nam Scientific workshop on dioxin screening, remediation methodologies and site characterization: 76-79. 19. Bunge, M., Adrian, L., Klaus, A., Opel, M., Lorenz, W.G., Andresen, J.R., Gorisch, H., Lechner, U (2003). Reductive dehalogenation of chlorinated dioxins by an anaerobic bacterium. Nature. 421: 357-360. 20. Dang T. C. H., Mai A. T., Nguyen Q. V., Nguyen T. S., Trinh K. S., Olaf P (2004). Biodegradation of 2,3,7,8 TCDD by anaerobic and aerobic Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 microcosms collected from bioremediation treatments for cleaning up dioxin contaminated soils. Dioxin in Viet Nam: Characterisation, monitoring, remediation and effects. Organohalogen compounds. 66: 3695-3701. 21. Daubaras, D.L., Danganan, C.E., Hubner, A., Ye, R.W., Hendrickson, W., Chakrabarty, A.M (1996). Biodegradation of 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid by Burkholderia cepacia strain AC1100: evolutionary insight. Gene. 179: 1-8. 22. Dinh H (1984). Long-term changes in dense inland forest following herbicidal attack. Herbicides in war, the long-term Ecology and Human Consequences. Taylor and Francis: 31-32. 23. Dipak Roy, Baton Rouge (1989). Detoxification of chlorinated aromatic compounds by organism NRRL B-18087. United States Patent 4804629. 24. Dolezar S., Buzer H. R., Rappe C. (1991). Polychlordibenzothiophenes, the sulphur analogues of the polychlordibenzofurans identified in incineration sample. Environ. Scien. Technol. 25: 1637-1643. 25. Habe H., Chung J., Lee J., Kasuga K., Yoshida T., Nojiri H., and Omori T (2001), Degradation of Chlorinated dibenzofurans and Dibenzo-p- Dioxins by Two Types of Bacteria Having Angular Dioxygenases with Different Features, Appl. Environ. Microbiol. 67: 3610-3617. 26. Haugland R.A.; Schelenm D.J. ; Lyons R.P.III ; Sferra P.R; Chakrabarty A.M (1990). Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by pure and mixed bacterial cultures. Appl. Environ. Microbiol. 56, pp 1357 1362. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 27. Hong, H. B., Chang, Y. S., Nam, I. H., Fortnagel, P., and Schmidt, S (2002). Biotransformation of 2,7-Dichloro-and 1,2,3,4- tetrachlorodibenzo-p- dioxin by Sphingomonas wittichii RW1. Appl. Environ. Microbiol. 68: 2584- 2588. 28. Itoh K., Tashiro Y., Uobe K., Kamagata Y., Suyama K., Yamamoto H (2004), Root nodule Bradyrhizobium spp. Harbor tfdAα and cadA, homologous with gene encoding 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degrading proteins, Appl Environ Microbiol, 70, pp. 2110-2118. 29. Jesus G.M. Silvia G.A., Ana I.A., Francisco R.V (1999). Use of 16S- 23S ribosomal genes spacer region in studies of prokaryotic diversity. Journal Microbiol Methods. 36: 55-64. 30. Jik A.Field, Reyes Sierra (2004). Review of scientific literature on microbial dechlorination and chlorination of key chlorinated compounds: 7-23. 31. Kahng HY, Nam K, Kukor JJ, Yoon BJ, Lee DH, Oh DC, Kam SK, Oh KH (2002). PAH utilization by Pseudomonas rhodesiae KK1 isolated from a former manufactured-gas plant site. Microbiol Biotechnol. 60(4). pp 475-80. 32. Kilbane J.J., Chatterjee D.K., Karns J.S., Kellogg S.T., and Chakrabarty A.M (1982). Biodegradation of 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid by a pure culture of Pseudomonas cepacia. Applied and environmental microbiology. 44: 72-78. 33. Kitagawa W, Takami S, Miyauchi K, Masai E, Kamagata Y, Tiedje JM, Fukuda M (2002). Novel 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation genes from oligotrophic Bradyrhizobium sp. strain HW13 isolated from a pristine environment. Journal of Bacteriology, Vol. 184, No. 2, p. 509-518, 34. Krisztina Gábor. (2006). Molecular analysis of halorespiration in sesulfitobacterium spp.: catalysis and transcriptional regulation: 3-27. 28.1 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 35. Liyama, N., Atsushi, T., Hitoshi, I., and Sadayori, H (2003). An introduction of biodegradation system of dioxin in contaminated water and soil. Organohalogen compounds. 63: 256-259. 36. Mai P., O. Stig Jacobsen, J. Aamand (2001). Mineralization and co- metabolic phenoxyalkanoic acid herbicide by a pure bacterial culture isolated from an aquifer. Appl. Microbiol. Biotechnol. 56: 486-490 37 37. Olga Maltseva, Catherine McGowan, Roberta Fulthorpe and Patrick Oriel (1996). Degradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid by haloalkaliphilic bacteria Microbiology 142, pp 1115-1122 38 38. Park W; Jeon C O; Cadillo H; DeRito C; Madsen E L (2004). Survival of naphthalene-degrading Pseudomonas putida NCIB 9816-4 in naphthalene- amended soils: toxicity of naphthalene and its metabolites. Microbiol Biotechnol. 64(3) pp 429-35 39 39. Sambrook J, Russell D. W. (2001). Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 40 40. Schecter A., Thomas A. Gasiewicz (2003), Dioxin and health, A John Wiley  Sons, Inc, New York. 41 41. Sinkkonen S., Paasivirta J. (2000). Degradation half-life times of PCDDs, PCDFs and PCBs for environmental fate modeling. Chemosphere 40: 943-949. 42 42. Stellman, J.M., Stellman, S.D., Christian, R., Weber, T.A., Tomassalla (2003). The extent and patterns of usage of agentorange and the herbicides in Vietnam. Nature. 422: 681-687. 43 43. The agrochemicals handbook. 1991. 3rd ed, Cambridge, Royal Society of Chemistry. 44 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 44. Top E. M., Holben W. E. , Forney L. J (1995), Characterization of Diverse 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid-Degradative Plasmids Isolated from Soil by Complementation, Applied and environmetal microbiology, 61(5), pp. 1691-1698. 45 45. Travkin V. M., A. P. Jadan, F. Briganti, A. Scotzzafava, L. A. Golovleva (1997). Characterisation of an intradiol dioxygenase involved in the biodegradation of the chlorophenoxy herbicides 2,4-D and 2,4,5-T. FEMS Letters 407: 69-72 46