Luận văn Nghiên cứu hoá học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn (cratoxylum prunifolium kurtz)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- BÙI VĂN BÌNH NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY ĐỎ NGỌN (CRATOXYLUM PRUNIFOLIUM KURTZ) LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC THÁI NGUYÊN - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM --------------------------------- BÙI VĂN BÌNH NGHIÊN CỨU HOÁ HỌC VÀ NHẬN DẠNG MỘT SỐ NHÓM CHẤT CÓ TRONG CÂY ĐỎ NGỌN (CRATOXYLUM PRUNIFOLIUM KURTZ) Chuyên ngành: Hoá hữu cơ Mã số: 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH THÁI NGUYÊN - 2008 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN SKLM : Sắc kí lớp mỏng UV : Ultraviolet spectrocopy MS : Mass Spectroscopy EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy LC-MS : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HSQC : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation HIV : Human Immunodeficiency Virus U : Unit Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, gió mùa, mưa thuận gió hoà nên hệ thực vật rất phong phú, đa dạng. Đó là nguồn tài nguyên sinh học quý giá thuộc loại có thể tái tạo được. Ngay từ xa xưa cha ông ta đã biết khai thác nguồn tài nguyên quý báu này để làm đồ ăn, thực phẩm, thuốc chữa bệnh, vật liệu xây dựng và nhiên liệu phục vụ cuộc sống. Trong thế giới thực vật ấy có những loài cung cấp thức ăn cho chúng ta, có những loài cung cấp vật liệu, có loài cung cấp hương thơm, quả ngọt, có nhiều loài được dùng để làm thuốc chữa bệnh, thuốc trừ sâu, cung cấp nguyên liệu cho các ngành công nghiệp thực phẩm, mĩ phẩm và dược phẩm. Việt nam có một vị trí thuận lợi về thiên nhiên như vậy nên nền Y học dân tộc cổ truyền phát triển từ lâu đời, chiếm vị trí đặc biệt trong việc bảo vệ sức khoẻ nhân dân trong suốt hàng ngàn năm đấu tranh dựng nước và giữ nước. Tiếp thu truyền thống quý báu của các thế hệ cha ông, ngày nay Đảng và Nhà nước ta đã xây dựng nhiều chính sách, nhiều hình thức động viên nhằm kế thừa và phát huy tốt nguồn tài nguyên quý báu có thể tái tạo được phục vụ con người có hiệu quả nhất. Nhiều cây cỏ đã được trồng để dùng làm thuốc, nhiều loài dùng làm nguyên liệu cung cấp tinh dầu cho công nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm như bạc hà, thanh hao hoa vàng, hoa hồi…, có loại được dùng làm thực phẩm chức năng đồ uống như các loại trà, các loại sâm v.v... Trong số đó có cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) thuộc loại cây mọc hoang dại và phổ biến khắp các vùng trên lãnh thổ nước ta. Đặc biệt cây đỏ ngọn có nhiều ở các tỉnh miền núi phía Bắc, Tây Nguyên và Nam Bộ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Cây đỏ ngọn đã và đang được dùng để làm thuốc và làm nước uống trong phạm vi dân gian một cách khá phổ biến ở các nước châu Á, ở Việt Nam đặc biệt vùng đồng bào dân tộc miền núi phía Bắc nước ta. Gần đây người ta phát hiện dịch chiết của lá cây đỏ ngọn có tác dụng chữa bệnh gan, có tác dụng tốt với hệ thần kinh và tác dụng của nó không thua kém gì các thuốc nhập ngoại. Cây đỏ ngọn được dùng trong dân gian đã có từ lâu, nghiên cứu hoá thực vật cây đỏ ngọn thì mới chỉ được các nhà khoa học chú ý đến trong một số năm gần đây, để góp phần làm rõ thêm thành phần hoá thực vật của cây đỏ ngọn tạo thuận lợi cho việc dùng, sử dụng cây thuốc này làm dược liệu và nguyên liệu cho các mục đích khác, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu hóa học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium). Đối tượng nghiên cứu là cây đỏ ngọn mọc hoang, thu hái vào tháng 11 năm 2007 tại xã Thịnh Đức thành phố Thái Nguyên . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Mô tả thực vật Theo tài liệu về phân loại thực vật, cây đỏ ngọn còn gọi là cây thành ngạnh, lành ngạnh tuỳ thuộc vào từng địa phương tên khoa học là “Cratoxylum prunifolium Kurtz” thuộc họ Ban “Hypericaceae” [1, 2, 5, 8, 11] Cây đỏ ngọn phân bố rộng rãi ở vùng Nhiệt đới, Cận Nhiệt đới, Ôn đới, chủ yếu ở vùng ôn đới bán cầu Bắc. Chi Cratoxylum ở Việt Nam có 5 loài: Cratoxylum maingayi Kurz có tên là lành ngạnh nhỏ, phân bố ở Bắc Trung Bộ và Lâm Đồng; Cratoxylum prunifolium Kurz lành ngạnh lá hẹp phân bố ở vùng Đông Nam Bộ trên lãnh thổ VIệt Nam; Cratoxylum prunifolium Kurtz cây đỏ ngọn, còn gọi là thành ngạnh đẹp mọc phổ biến ở vùng Đông Bắc nước ta; Cratoxylum polyanthum Korth hay Cratoxylum ligustrinum Blume lành ngạnh; Cratoxylum cochinchinense Blumer còn gọi là lành ngạnh Nam Bộ. Hai loài cuối chủ yếu mọc ở Nam Bộ song cũng khá phổ biến ở các tỉnh Đông Bắc Bộ. Cây đỏ ngọn - Cratoxylum prunifolium Kurtz thường thấy mọc tự nhiên ở hầu hết các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc Việt Nam có nhiều ở Xuân Mai - Ba Vì, Hà Tây, Sapa, Phú Thọ, Thái Nguyên, Bắc Cạn, Lạng Sơn, Vĩnh Phú. Cây đỏ ngọn cũng phân bố phổ biến ở các nước Châu Á như: Trung Quốc, Malaysia, Philippin, Ấn Độ, Indonexia, Myanma, Thái Lan. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây đỏ ngọn: Cây đỏ ngọn là loại cây nhỏ, thân gỗ, có gai ở gốc (trong rừng lâu năm cây có thể cao và to) cành non có lông tơ, màu đỏ nên gọi là đỏ ngọn [11]. Lá hình mác dài 12 - 13 cm, rộng 3,5 - 4 cm, mọc đối xứng, cuống ngắn 3 - 5 mm. Mặt gân chính màu đỏ đến 1/3 lá non, gân lá và lá có màu đỏ đến quá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 nửa. Hoa mọc trên những cành ở kẽ lá màu trắng hoặc hồng có lông màu tía. Quả nang dài 15mm, rộng 7 - 8mm. Hạt hình trứng dài 6mm, rộng 3mm Hình 1.1. Ảnh cây đỏ ngọn (Cratoxylum Prunifolium Kurt, Hypericaceae) 1.2. Một số công dụng của chi Cratoxylum Hầu hết các loài thực vật thuộc chi Cratoxylum đều được nhân dân sử dụng làm các bài thuốc dân gian để chữa bệnh, để chăm sóc và bồi dưỡng sức khoẻ. Cây đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium mới thấy dùng trong phạm vi nhân dân, làm thuốc kích thích tiêu hoá, ăn ngon hàng ngày hoặc sau khi đau yếu, sau khi sinh. Kinh nghiệm cho thấy ngày uống chừng 15 - 30 g lá khô dưới hình thức sắc hoặc pha như trà. Có khi phối hợp với lá vối nấu nước uống cho tiêu cơm đã đem lại hiệu quả cao cho sức khoẻ con người [11]. Nhân dân ta ở các vùng đã thu hái lá cây đỏ ngọn vào dịp tết Đoan Ngọ phơi khô để nấu nước uống mỗi khi cảm thấy cơ thể mệt mỏi.. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Trong những năm gần đây một số tác giả đã nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của dịch chiết toàn phần lá và thân cây đỏ ngọn. Nhóm nghiên cứu của Học viện Quân Y - Hà Nội cho biết cây đỏ ngọn ít độc, dịnh chiết toàn phần của lá và thân cây đỏ ngọn có tác dụng chống ôxi hoá tốt, hoạt tính đạt 69% trong khi tanakan chỉ đạt 48% [9] và có tác dụng hoạt huyết, làm lưu thông máu, giảm đông ở những trường hợp tăng đông [12]. Bộ môn Dược học quân sự - Học Viện Quân Y trên cơ sở nghiên cứu lâm sàng dịnh chiết của lá đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium trên chuột nhắt trắng và thỏ có so sánh với thuốc tanakan do hãng Beaufour Ipsen của Pháp sản xuất đã đưa ra kết luận: Dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn và dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn đều có ảnh hưởng lên hoạt động của hệ thần kinh ở các mức độ khác nhau: - Dịch chiết etylaxetat và dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn, Tanakan đều có tác dụng hoạt hoá hệ thần kinh thực vật, thể hiện ở sự tăng rõ hàm lượng Catecholamin trong máu động vật thí nghiệm sau khi uống các thuốc này. - Dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn có tác dụng tương đương Tanakan gây hoạt hoá đồng bộ các tế bào não ở thỏ thực nghiệm, thể hiện làm giảm thành phần sóng chậm delta, tăng thành phần sóng alpha trên điện não đồ, còn dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn không thể hiện rõ tác dụng hoạt hoá hệ thần kinh trung ương. - Dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn có tác dụng làm tốt cả hai quá trình hưng phấn và ức chế có điều kiện ở não bộ động vật thí nghiệm (thông qua hoạt động phản xạ có điều kiện), tương đương với Tanakan và tốt hơn tác dụng này của dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn. - Mức độ ảnh hưởng làm tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương của các chất theo thứ tự giảm dần: dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn, Tanakan, dịch chiết toàn phần lá đỏ ngọn [4]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Đối với cao nước (cặn tổng) 30 - 80 mg/kg có hoạt tính kháng khuẩn với các vi khuẩn staphylococcus auresu, Escherichia coli, Salmonella typhi. DÞch chiÕt tæng sè tõ l¸ c©y Cratoxylum cochinchinense ë Th¸i Lan ®· được ng•êi ta thö nghiÖm vµ cho thÊy chóng cã t¸ c dông chèng nhiễm khuẩn, chống ôxi hoá, những hoạt động của tế bào [22, 23, 24]. Ở Singapo dịch chiết cây Cratoxylum cochinchinense được sử dụng trong nhân dân có tác dụng chống các gốc tự do để chữa các bệnh liên quan đến sự căng thẳng, mệt mỏi [25]. Tại Nhật Bản, từ rễ cây của một số loài thuộc chi Cratoxylum người ta bào chế thành thuốc làm tăng trí nhớ, chống lão hoá, mất ngủ ở người già. Ở Trung Quốc, lá của cây đỏ ngọn người ta chế biến thành trà pha nước uống hàng ngày và sử dụng một cách rộng rãi. Từ phần dịch chiết etylaxetat của lá cây đỏ ngọn đã tách được các xanthone có tác dụng kháng ấu trùng của muỗi gây sốt da vàng hơn cả chất rotenon, không những thế các chất này còn có nhiều triển vọng làm thuốc chống mối [28]. Phần dịch chiết etylaxetat của Cratoxylum cochinchinense có tác dụng kìm hẵm peroxit hoá lipit màng tế bào gan, kìm hãm sự xuất hiện lipit ác tính gây viêm gan và có tác dụng bảo vệ gan tốt [27]. Theo các lương y, cây đỏ ngọn có vị ngọt, tính mát bộ phận dùng lá non, vỏ cây, vỏ rễ. Người bị đau bụng ăn không tiêu, uống nước nấu của lá lành ngạnh giúp tiêu hoá tốt thường dùng 100g lá non nấu một lít nước, thay nước uống hàng ngày. Khi bị cảm nắng, sốt thì dùng lá non 50g nấu với 1 lít nước uống. Trong dân gian Việt Nam, cây đỏ ngọn mới thấy dùng trong phạm vi nhân dân làm thuốc kích thích tiêu hóa, phục hồi sức khoẻ khi ốm đau, sinh đẻ, bảo vệ thành mạch, chống lão hoá, tăng trí nhớ ở người cao tuổi. Người ta thu hái lá đỏ ngọn vào dịp Tết mồng 5 tháng 5 (Tết Đoan Ngọ) để làm thực vật nấu nước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 uống hoặc có thể ủ sau đó đem phơi khô mới dùng. Gần đây có một vài tác giả ở Việt Nam đã nghiên cứu và cho thấy lá đỏ ngọn có tác dụng chữa bệnh, có tác dụng chống gốc tự do, bảo vệ thành mạch, bảo vệ tế bào gan chống mù loà, chống ôxi hoá và miễn dịch invitro khá rõ [7]. Tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên, Bác sĩ Hoàng Sầm đã sử dụng dịch chiết của lá đỏ ngọn để làm thực phẩm chức năng, thay chè làm nước uống, chữa các bệnh nan y như: ngứa, ghẻ lở, ronan thần kinh, mất ngủ, miệng đắng ăn không ngon, giảm trí nhớ… 1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học thực vật chi Cratoxylum 1.3.1. Các hợp chất có khung triterpen Theo tài liệu [19] từ dịch chiết n-hexan của thực vật Cratoxylum cochinchinense đã tách được ngoài các triterpen có 5 vòng ngưng tụ nhóm lupeol và β-mangostin còn phân lập được các triterpen có hai vòng ngưng tụ. Sau khi tách bằng các phương pháp sắc kí và dựa vào kết quả phân tích các phổ của các chất được tách ra người ta đề nghị công thức cấu tạo của 7 hợp chất triterpen hai vòng là: R I.a: (13E,17E)-polypoda-8 (26),13,17,21-tetraen-3β-ol; (R= β-OH). I.b: -polypodatetraene; (R= H). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 30 27 28 29 26 R 25 II.a: (13E,17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3β-ol; (R= β - OH). II.b:  - polypodatetraene; (R = H). II.c: (13E,17E)-3β-axetoxypolypoda-7,13,17,21-tetraene; (R= β - OAc). II.d: (13E,17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3-one; (R= O). R III.a: Polypoda-13,17,21-trien-8-ol; (R=H). III.b: Polypoda-13,17,21-trien-3-one; (R =β - OH). III.c : Polypoda-13,17,21-trien-3β, 8-diol; (R= O). 1.3.2. Các chất axit hữu cơ Từ lá một loại rau thuộc loài Cratoxylum formosum ở Thái Lan Pilchaon Maisuthisakul [23] đã phân lập được hai axit hữu cơ IV, V và cho biết các hợp chất ấy đều có hoạt tính chống oxi hóa. Sau khi tách, phân lập tác giả đã đề nghị cấu trúc của nó có công thức là: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 COOH HO OH HO O O OH OH IV: Acid chlorogenic HO HO O OH OH O HO O OHHO O O V: Acid dicaffeoylquinic 1.3.3. Các chất có khung xanthone Các xanthone là nhóm chất lớn nhất, phổ biến nhất có ở hầu hết các loài thuộc chi Cratoxylum [6, 14, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30]. Đã phát hiện ra là các xanthone và dẫn xuất dưới dạng C-glycoside của chúng. Từ loài Cratoxylum cochinchinense [25] Soon Yew Tang cùng với các cộng sự đã phân lập được C-glicoside của xanthone và xác định được công thức cấu tạo của nó có dạng VI. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 O OH OH HO OH O O HO HO OH VI: 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone- C2-β-D-glycoside. Từ loài Cratoxylum formosum Nawong Boonnak cùng các cộng sự [22] cũng đã phân lập được các xanthone có cấu trúc VII dưới đây: O OCH3HO O O OH OHO O OH MeO R1 VII.a: Dulxis-xanthone VII.b: Β-mangostin; (R1 = OMe) VII.c: -mangostin; (R1 = OH) O OH R1 OH OH VII.d: Formoxanthone A; (R1 = ). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 O O MeO HO O OHR1 VII.e: 3-isomangostin; (R1 = ). VII.e1: 3,4-dihidro- 5,9-dihidroxy-8-methoxy-7-(3-methoxy-3-methylbutyl)- 2,2- dimethyl-2H,6H-pyrano-[3,2-β] xanthen-6-one; (R1 = ). VII.e2: 3,4-dihidro-5,9-dihidroxy-7-(3- hidroxy-3-methybutyl)-8-methoxy- 2,2- dimethyl-2H,6H-pyrano-[3,2-β] xanthen-6-one; (R1 = ). O R2 R1 O OH OH HO VII.f: Isocudraniaxanthone B; (R1 = H; R2 = OMe). VII.f1: Gerontoxanthone I; (R1 = ; R2 = OH). O OR2 O OH OH R1 VII.g: 10-O-methylmaclur-xanthone; (R1 = ; R2 = OMe). VII.g1: Macluraxanthone; (R1 = ; R2 = OH). OMe OH Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 VII.g2: Xanthone V1. (R1 = ; R2 = OH). VII.g3: 6 - deoxyjacreubin; (R1 = H; R2 = H). O R1 O OH OH O VII.h: Formoxanthone B; (R1 = ). Từ loài Cratoxylum cochinchinese của miền Nam nước ta Lê Thị Diệu Nguyên và Leslie J. Harrison [19] đã phân lập được ngoài các triterpen I, II và III. Hai nhà nghiên cứu xác định được các xanthone có cấu trúc VIII.a,VIII.b. O R O OH HO OH VIII.a: 1,3,7-trihydroxy-2,4-di (3-methyl-but-2-enyl) xanthone; (R = prenyl). VIII.b: 2-geranyl-1,3,7- trihydroxy-4-3- methylbut-2-enyl) xanthone; (R=geranyl). Từ loài Cratoxylum maingayi [14] người ta cũng phân lập được một số hợp chất xanthone (IX), các chất này có cấu trúc đơn giản nhưng đều có tác dụng như các chất có hoạt tính chống oxi hoá tốt. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 O O OH R HO IX.a: 1-7- dihidroxyxanthone; (R = H). IX.b: 1,7- dihidroxy - 4- methoxyxanthone; (R = OMe). O O OMe OH OH 8 7 6 5 8' 10 ' 4' 9' 1 3 2 4 IX.c: 2,8 - dihidroxy - 1- methoxyxanthone. O O OMe OMe OMe OMe RO 1 2 3 45 6 7 9' 4'10' 8'8 IX.d: 7-hidroxy-1,2,3,8 -tetramethoxyxanthone; (R = H). Từ loài Cratoxylum formosanum người ta cũng phát hiện được các xanthone có cấu trúc phân tử như sau [21, 22] . O OMe OMe R3 R1 R2 O X.a: 1,7-dihidroxy-5,6-dimethoxy xanthone; (R1 = R2 =R3 = OMe). X.a1: 1,2,3,8-tetramethoxy xanthone; ( R1 = R3 = OH; R2 = H). X.a2: 1,2,3,4,8-pentamethoxy xanthone; (R1=R3=OMe;R2=H). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 O OH R1 O HO R2 X.b: 1,7-dihidroxy-4-methoxy xanthone; (R1 = OMe; R2 = H). X.b1: 1,7-dihidroxymethoxy xanthone; (R1 = R2 = H). X.b2: 1,7-dihidroxy-8-methoxy xanthone; ( R1 = H; R2 = OMe). O O OH O OH HO O OMeO Me MeO OMe X.c: Maclurathone X.d: 1,5,6,7-tetramethoxy xanythone O O OHHO OMe OMe X.e: 2,7-dihidroxy-1,8-dimethoxy xanthone. O O HO OMe OH OH X.f: 1,4,7-trihidroxy-8-methoxy xanthone. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 O O HO OH OH O O OH HO OH OH X.g: 1,4,7-trihydroxy xanthone. X.h: 1,3,5,6-tetrahidroxy xanthone. O O O HO OCH3 R H3CO 2' 1'1 A 34'4'' 9'8 ' B X.i: Fruniflorone; (R= ) [22] 1.3.4. Một số đại diện của khung anthraquinon Từ loài Cratoxylum formosum ngoài việc xác định các xanthone Nawong Boonnak, Chatchanok Karalai và các cộng sự [22] còn phân lập được các anthraquinon có các cấu trúc XI. Các tác giả còn cho biết các chất này có hoạt tính sinh học rất cao. Chúng có tác dụng tốt trong việc điều trị bệnh tiểu đường, viêm nhiễm, hạ đường huyết [20]. OHOOH OR O XI.a: 3-geranyloxy-6-methyl-1,8-dihidroxy-anthraquinon; (R= ) XI.a1: madagascin; (R = ) 5'' 4''' OH 2'' 1'' 3'' Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 XI.a2: physcion; (R = Me) XI.a3: emodin; (R = H ) XI.b: 11-hidroxyl-5-methoxy-2,2,9-trimethyl-2H-anthra-[1,2-β] pyran-7, 12-dion. OMe OHO O OH O O OH O OH HO XI.c: Vismiaquinon XI.d: 3,4 - dihidrojacareubin 1.3.5. Một số đại diện của khung flavonoit Từ loài Cratoxylum cochinchinense, Cratoxylum formosanum nhiều tác giả đã phân lập được 2 flavonoit XII.a và XII.b [18, 13, 15]. Chúng có hoạt tính kìm hãm peroxit hoá lipit màng tế bào gan, có tác dụng tăng khả năng thải độc của gan, có tác dụng kìm hãm sự xuất hiện lipit ác tính. OHO OH O OH OH OHO OH O OH OH OH XII.a: Đihiđrokampherol XII.b: Taxifolin OOOH OMe O Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 1.4. Những nghiên cứu hoá thực vật loài Cratoxylum prunifolium. Từ lá của loài Cratoxylum prunifolium, Xue-Li-Cao, Yoichiro Ito đã dùng phương pháp sắc kí khí lỏng tốc độ cao phân lập được epigallocatechin gallat (XIII.a) và epicatechin gallat (XIII.b) [27]. O CO OH OH OH OH OH OH OH HO O XIII.a: Epigallocatechin-3-O- gallate O CO OH OH OH OH OH OH HO O XIII.b: Epicatechin-3-O-gallate Theo Nguyễn Liêm và các cộng sự [10], bằng các phản ứng định tính cho biết Cratoxylum prunifolium có chứa các flavonoit, tanin pyrocatechic phitosterol saponin triterpen và các axit hữu cơ, đường khử. Tác giả còn cho biết ở cây đỏ ngọn của Việt Nam không thấy có ancaloit và anthraquinon Từ vỏ cây đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium. Phạm Đình Hùng, Nguyễn Diệu Liên Hoa và các cộng sự tại Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được macluraxanthone, 1,7-đihidroxanthone và hai xanthone mới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 [6] và cho biết chúng đều có tác dụng diệt muỗi gây sốt rét và có tác dụng tốt trong việc diệt mối. Từ vỏ và rễ cây Cratoxylum prunifolium trồng ở tỉnh Nông Khai miền Nam Thái Lan, Nawong Boonnak và các cộng sự đã chiết bằng điclometan, phân lập các chất bằng sắc kí đã tách được 10 xanthone với sự khác nhau chỉ là ở các mạch nhánh (R1 và R2) [22] và tác giả đã gọi tên chúng là các prunifloron được đánh số từ 1 đến 10. Công thức của chúng có cấu trúc XIV. O OR1 R2 OH OR RO HO Prunifloron XIV; R1 ≠ R2 và đều là gốc ankyl hoặc dẫn xuất của nó. R: là H hoặc CH3 Tên của chúng lần lượt là: XIV.1 Pruniflorone A; XIV.2 Pruniflorone B; XIV.3 Pruniflorone C; XIV.4 Pruniflorone D; XIV.5 Pruniflorone E; XIV.6 Pruniflorone F; XIV.7 Pruniflorone G; XIV.8 Pruniflorone H; XIV.9 Pruniflorone I; XIV.10 Pruniflorone J. Cũng từ rễ của thực vật Cratoxylum prunifolium các tác giả Thái Lan lại phát hiện được một anthraquinon mà cấu trúc của nó được tác giả mô tả có dạng XV. OOH OH O O OH XV: Anthraquinon Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Chương 2 PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu gồm lá cây đỏ ngọn, thu hái vào tháng 11 năm 2007 tại xã Thịnh Đức - Thành phố Thái Nguyên. Cây đỏ ngọn, còn gọi là cây thành ngạnh đẹp, lành ngạnh đẹp, có tên khoa học là: “Cratoxylum prunifolium Kurtz ”, họ Hyperaceas hay họ Ban. Mẫu cây tươi thu hái gồm cả cành nhỏ và lá được đem sấy ở 80 0 C để diệt men, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 50 0 C cho tới khi khô hoàn toàn. Mẫu khô được chia riêng thành các phần lá, và cành. Chọn mẫu lá làm đối tượng nghiên cứu. Nghiền nhỏ mẫu ngâm, chiết trong etanol 90 o ở nhiệt độ phòng nhiều lần. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được dưới dạng xiro, chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol, các dịch chiết được bay hơi dung môi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50 0 C dưới áp suất thấp. Các cặn thô được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung môi rửa giải có độ phân cực tăng dần để phân lập các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung môi thích hợp để thu được các chất sạch . 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thô khác nhau của cây đỏ ngọn chúng tôi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung môi thích hợp, các phương pháp gồm: - Sắc kí lớp mỏng (SKLM). - Sắc kí cột silicagen thường dùng Merck 63- 200nm. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những tính chất vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nóng chảy, ghi các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H- NMR, phổ 13 C- NMR, tuỳ theo từng loại chất. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hoá học của chúng. 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhôm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần có trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi khai triển SKLM: 1. n-Hexan - etylaxetat 90:10 Hệ A 2. n-Hexan - etylaxetat 95:10 Hệ B 3. Clorofom - metanol 90:10 Hệ C 4. Clorofom - metanol 50:10 Hệ D 5. Clorofom - metanol 20:10 Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở bước sóng  = 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 , sau đó sấy ở nhiệt độ trên 100 0 C Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai có biểu thức: 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boetus (Đức) hoặc trên máy Eletronthermal IA - 9200. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410. - Phổ UV đo trên máy UV 1700 Phamaspec. - Phổ khối ghi trên máy MS- Engine - 5989- HP ion hoá bằng va chạm eletron (LC- MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/ WILLEY 250L. - Phổ 1 H- NMR và 13 C- NMR ghi trên máy Bruker 500MHz nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3, MeOD. 2.3. Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) 2.3.1. Các dịch chiết Lá cây đỏ ngọn đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol 90 0 ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại hết dung môi ở áp suất giảm cho đến dạng cao lỏng, xác định khối lượng cặn khô, sau đó thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung môi clorofom, etylaxetat, n-butanol, cuối cùng đuổi hết nước và hoà tan bằng metanol. Các dịch chiết trên được làm khô bằng Na2SO4 lọc và cất dung môi bằng thiết bị cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 0 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung môi Rf = Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Như vậy từ lá cây đỏ ngọn đã thu nhận được 04 phân đoạn cặn là: cặn trong clorofom (ĐC), cặn trong etylaxetat (ĐE), cặn trong butanol (ĐB) và cặn trong metanol (ĐM). Sơ đồ 2.1 1. Etanol 2. Cặn trong nước CHCl3 EtOAc BuOH MeOH Sơ đồ 2.1. Quy trình ngâm chiết Bảng 2.1. Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) Khối lượng mẫu lá (gam) Cặn chiết Clorofom Etylaxetat n-Butanol Metanol 787,4 52,264 34,654 40,411 26,604 100% 6,63% 4,40% 5,13% 3,38% MẪU KHÔ Cặn CHCl3 (ĐC) Cặn BuOH (ĐB) Cặn EtOAc (ĐE) Cặn MeOH (ĐM) ĐC1 ĐE1 ĐC2 ĐC3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có trong hoạt tính sinh lí cao trong thực vật [3] chúng tôi thu được kết quả thử định tính với các nhóm chất, kết quả được chỉ ra ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Phát hiện các nhóm chất trong cây đỏ ngọn Stt Nhóm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tượng Kết quả 1 Saponin Tạo bọt Bọt bền trong axit ++ 2 Glicozttim Kelle-Kiliani Vàng nâu - 3 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bông ++ 4 Poliphenol (FeCl3+K3[Fe(CN)6]) 1% Xanh thẫm +++ 5 Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ ++ 6 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++ 7 Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam - 8 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++ Ghi chú: Dấu (+) là có phản ứng dương tính, (++) là có phản ứng tính rất rõ, (-) là không có phản ứng. 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn tại bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Thái Nguyên. Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhóm:  Vi khuẩn Gr (-) Escherichia coli.  Vi khuẩn Gr (+) Staphylococcus auresu.  Vi khuẩn: Salmonella typhi. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Hình 2.1. Ảnh được gây ức chế xung quanh giếng thạch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chúng tôi còn tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên. Kết quả thử hoạt tính các dịch chiết thô được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) Dịch chiết Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch(mm) Staphylococcus auresu Escherichia coli Salmonella typhi Đường kính (mm) Hoạt tính Đường kính (mm) Hoạt tính Đường kính (mm) Hoạt tính Cặn tổng (H2O) 30 + 26 + 27 + Cặn EtOAc 29 + 17 + 18 + Chú ý: Dấu (+) là phản ứng có hoạt tính. 2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ cây đỏ ngọn Từ 787,4g lá Cratoxylum prunifolium khô chiết nhiều lần bằng etanol 90 0 đến khi dịch chiết trong suốt không màu, loại bỏ bớt dung môi rượu bằng máy cất quay ở nhiệt độ 50 0 C đến khi dịch chiết còn lại ở dạng xiro đặc, thêm nước, lắc cặn tổng số này với c lorofom đến khi thu được tất cả các chất có thể tan được trong CHCl3 đều được lấy ra hết, cô cạn dung dịch CHCl3 ở nhiệt độ thấp thu đuợc 52,264g chất (kí hiệu các chất ĐC). Phần cặn không tan trong CHCl3 được lắc nhiều lần với EtOAc cho đến khi dịch chiết EtOAc hoàn toàn không màu và trong suốt, cô cạn dịch EtOAc trong máy cất quay thu được 34,654g chất tổng số (kí hiệu là các chất ĐE). Phần không tan được trong EtOAc, được lắc với n-butanol sau đó cũng cô cạn trong điều kiện áp suất thấp được 40,410g chất (kí hiệu là các chất ĐB). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Các chất cặn còn lại không tan trong các dung môi trên cho tan trong MeOH thu đựoc 32,346g chất (kí hiệu là các chất ĐM). 2.4.1. Dịch chiết clorofom Từ 11g cặn từ dịch clorofom của lá đỏ ngọn kí hiệu (ĐC) được phân chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung môi n-hexan - c lorofom với các tỷ lệ tăng dần clorofom từ 0% đến 100% kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung môi thu được ba chất ĐC-1, ĐC-2, ĐC-3. 2.4.1.1. Taraxeron (Friendoolean - 14- en-3-on) (ĐC1) Rửa giải với các hệ dung môi n- hexan-clorofom (50:1), sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung môi B và phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong dung môi trên thu được 21mg chất rắn, tinh thể hình kim, màu trắng có nhiệt độ nóng chảy 278-280 0 C và cho các đặc trưng của một tritecpen. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 1720 (C=O); 1500 (C=C); 3050 (CH3); 2940 (CH). Phổ LC- MS, m/z (%) 424 [M + ]; 408 [M-O] + . PHổ 1 H- NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm) 0,762ppm (3H, s, CH3); 0,84ppm (3H, s, CH3); 0,885ppm (3H, s, CH3); 0,996ppm (3H, s, CH3); 1,011ppm (3H, s, CH3); 1,02ppm (3H, s, CH3); 1,07ppm (3H, s, CH3) 5,48ppm (1H, dd, 3,21 và 8,17Hz). Phổ 13 C - NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 38,35 (Cl); 33,08 (C2); 217,3 (C3); 47,56 (C4); 55,77 (C5); 19,91 (C6); 33,57 (C7); 38,87 (C8); 48,80 (C9); 33,57 (C10); 17,44 (C11); 36,67 (C12); 37,74 (C13); 157,59 (C14); 117,19 (C15); 34,12 (C16); 35,57 (C17); 48,70 (C18); 40,64 (C19); 28,79 (C20); 35,11 (C21); 37,69 (C22); 29,56 (C23); 21,57 (C24); 14,79 (C25); 25,56 (C26); 29,92 (C27); 26,12 (C28); 33,39 (C29); 21,47 (C30). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2.4.1.2. Stigmast- 5,22- đien-24R-3β-ol Rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan- clorofom (50:5), sau khi cất loại dung môi cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung môi A, phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong hệ dung môi trên thu được 29mg tinh thể hình kim, không màu, không mùi, có nhiệt độ nóng chảy 152-155 0 C, Rf  100 =61. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3429,2 (OH); 2864,7 (C-H); 1651 (C=C). Phổ EI- MS; m/z (%): 412 [M + ] (7); 300 (7); 255 (11); 231 (4); 213 (8); 173 (7); 145 (20); 133 (20); 83 (49,3). Phổ 1 H- NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 5,33 (1H, dd, j = 5Hz và 2H, H6); 515 (1H, dd, j22,23 = 15, Hz, j22,20= 5Hz, H-22); 5,01 (1H, dd, j23,22 = 15Hz, j23,24 = 5Hz, H-23). Phổ 13 C- NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 36,4 (t, C1); 29,67 (t, C2); 71,8 (d, C3); 42,3 (t, C1); 139,2 (s, C5); 121,4 (d, C6); 37,3 (t, C7); 31,85 (d, C8); 51,15 (d, C9); 36,12 (s, C10); 24,35 (t, C11); 42,18 (t, C12); 31,4 (s, C13); 56,83 (d, C14); 25,38 (t, C15); 31,6 (t, C16); 55,9 (d, C17); 12,01 (q, C18); 18,95 (q, C19); 40,47 (d, C20); 21,03 (q, C21); 138,4 (d, C22); 129,2 (d, C23); 50,01 (d, C24); 33,9 (t, C25); 21,19 (q, C26); 19,79 (d, C27); 28,89 (q, C28); 12,22 (q, C29). 2.4.1.3. β- Sitosterol Tiếp tục rửa giải trên cột với hệ dung môi n-hexan- clorofom (40:10), sau khi cất loại dung môi, cặn thu được kiểm tra trên sắc kí lớp mỏng trong hệ dung môi B, phát hiện nó bằng vanillin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại thu được 27mg chất rắn, tinh thể hình kim, nóng chảy 140- 141 0 C, Rf .100 = 71. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3450 vân rộng (H32, C3); 3010- 1650 (liên kết đôi). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Phổ EI- MS; m/z (%): 414 [M + ] (20); 413 [M-H] + (41); 398 (28); 397 (100); 395 (32); 383 (11); 361 (11); 257 (3); 255 (6,3); 151 (5,6); 139 (11). Phổ 1 H-NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 0,68 (3H, s, CH3-18); 1,01 (3H, s, CH3-19); 0,81 (3H, d, j, 7Hz, CH3-26); 0,88 (3H, d, j, 7Hz, CH3-27); 0,83 (3H, t, 7,32Hz, CH3-29); 0,92 (3H, d, j, 10Hz, CH3-21); 3,52 (1H, m, H- 3); 5,42 (1H, d, j, 5Hz, H-6). Phổ 13 C- NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 141,1 (s, C5); 121,8 (d, C6); 71,8 (d, C3); 56,8 (d, C14); 56,1 (d, C17); 50,2 (d, C9); 45,7 (d, C24); 42,5 (s, C13); 42,4 (t, C4); 39,8 (t, C12); 37,3 (t, C1); 36,5 (s, C10); 36,2 (d, C20); 33,9 (d, C8); 31,9 (t, C7); 31,7 (t, C2); 29,2 (d, C25); 28,3 (t, C16); 26,2 (t, C23); 24,2 (t, C15); 21,1 (t, C11); 19,8 (q, C26); 19,4 (q, C19); 19,1 (q, C27); 18,8 (q, C21); 11,9 (q, C29); 11,9 (q, C18); 23,2 (t, C28). 2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (ĐE) Từ 15g cặn chiết etylaxetat của lá cây đỏ ngọn (ký hiệu ĐE) được tiến hành tách các chất trên sắc kí cột silicagel, rửa giải cột sắc kí bằng hệ dung môi clorofom- metanol có tỷ lệ theo độ tăng dần của dung môi phân cực, metanol 0% -100%, kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, thuốc thử phát hiện (FeCl3 + K3[Fe(CN)6]) 1% sau đó gộp các phân đoạn giống nhau, đuổi hết dung môi và kết tinh lại thu đựơc chất (ĐE1). * Axit gallic (ĐE1) Rửa giải trên cột bằng hệ dung môi clorofom- metanol (90:10), sau khi kiểm tra bằng SKLM với hệ dung môi C, cất loại dung môi, thu được cặn thô, kết tinh lại trong hệ dung môi trên thu được 70mg chất rắn màu vàng, tinh thể hình kim, có tn/c khoảng 248- 258 0 C. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 1700 (C=O); 3100 (OH) rất tù. Phổ 1 H-NMR (500MHz, MeOD); (ppm): 7,092 (2H, C2 và C6). PHổ 13 C-NMR (500MHz, MeOD); (ppm): 121,960 (C1); 139,559 (C4); 110,349 (C2, C6); 146,345 (C3, C5); 170,364 (C7). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Chương 3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Nguyên tắc chung Trong quá trình nghiên cứu hóa thực vật cần phải tôn trọng nguyên tắc chung là không được làm thay đổi cấu trúc hóa học của các chất sẵn có trong thực vật và không làm ảnh hưởng đến thành phần hoá học của chúng tại thời điểm lấy mẫu. Như vậy, ngay sau khi mẫu thu hái xong phải được diệt men để tránh sự chuyển hoá do các quá trình sinh tổng hợp xảy ra ở thực vật, sấy khô ở nhiệt độ thích hợp, bảo quản mẫu trong điều kiện khô ráo. Để tách các chất ra khỏi thực vật có thể được tiến hành bằng nhiều cách khác nhau: ép lấy dầu béo, cất lôi cuốn bằng hơi nước để tách các tinh dầu, ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ v.v… Tuy nhiên có hai phương pháp phổ biến hơn cả để tách các chất ra khỏi thực vật: Cách 1: Trước tiên chiết bằng dung môi rượu-nước để tách hầu hết các chất ra khỏi thực vật. Sau đó chiết sàng lọc bằng các dung môi từ không phân cực đến các dung môi có độ phân cực tăng dần. Các dịch chiết chứa các hợp chất có độ phân cực gần nhau sẽ được cất đuổi dung môi, bảo quản dùng cho các quá trình tách tiếp theo. Cách 2: Chiết và phân lập các chất mẫu thực vật bằng các loại dung môi từ không phân cực đến có độ phân cực tăng dần như lần lươt là: n-hexan, clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol(etanol), etanol-nước. Việc chiết lấy chất từ lá thực vật (Cratoxylum prunifolium) được thực hiện theo cách 1 (sơ đồ 2.1). Các dịch chiết tổng số và các phần chiết thô đem thử nghiệm với các tác động sinh học và độc tố tế bào nhằm giúp cho việc định hướng tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh lý cao trong những dịch chiết. Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định nêu trong bảng (2.2) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao trong thực vật [3] cho thấy trong dịch chiết bằng clorofom của lá cây đỏ ngọn có chứa các axit hữu cơ, streroit, triterpenoit. Ở dịch chiết bằng etylaxetat của lá cây đỏ ngọn có chứa các hợp chất polyphenol, các hợp chất flavonoit, cũng ở phần dịch chiết này đã tách được axit gallic và dẫn xuất của nó. Trong dịch chiết n-butanol có chứa các tanin, các đường khử. Không phát hiện thấy có ancaloit, các xianua trong các dịch chiết của lá đỏ ngọn. Kết quả của các phản ứng định tính để xác định các nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao được chỉ ra ở bảng 2.2. 3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây đỏ ngọn Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) đều là những hỗn hợp phức tạp chứa các hợp chất khác nhau. Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất hấp phụ dùng là silicagel, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần. Việc tinh chế các chất thường dùng phuơng pháp kết tinh lại trong dung môi hoặc hệ dung môi thích hợp. Nhờ cách làm đó đã thu được các đơn chất có độ tinh khiết cao, đáp ứng các yêu cầu để khảo sát tính chất hoá lý và xác định quang phổ của chúng. Khi phân lập các thành phần hoá học từ lá cây đỏ ngọn được thực hiện như trong sơ đồ 2.1. Bằng phương pháp phân lập trên, từ dịch chiết bằng clorofom của lá cây đỏ ngọn chúng tôi đã thu được 3 hợp chất sạch là: một tritecpen và hai steroit; còn dịch chiết etylaxetat phân lập được axit gallic và hỗn hợp các xanthone với flavonoit. 3.3.1. Taraxeron ( hay Frendoolean-14-en-3-on) (ĐC-1) Chất ĐC-1 là chất rắn tinh thể hình kim, màu trắng có nhiệt độ nóng chảy ở 278-280 0 C nó được tách từ phần cặn chiết clorofom. Bằng sắc kí cột Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 silicagen với hệ dung môi n-hexan:clorofom thu được chất ĐC-1, chất này cho các phản ứng định tính của terpenoit. Khối lượng phân tử của chất ĐC-1 được xác định bằng phổ khối LC- MS cho biết khối lượng phân tử của [M + ] m/z bằng 424,2 tương ứng với khối lượng phân tử bằng 424 u và tương ứng với công thức phân tử C30H48O. Trong phổ LC-MS còn xuất hiện pic m/z 408,2 điều này tương ứng với mảnh [M-O] + với m/z bằng 408 Phổ FT-IR: cho thấy các vân hấp thụ của nhóm xeton (C=O) ở νmax = 1720cm -1 , liên kết đôi (C=C) ở νmax = 1500cm -1 , các nhóm CH3 ở νmax = 3050cm -1 và các nhóm CH ở νmax = 2940cm -1 , không phát hiện thấy các vân hấp thụ của nhóm OH. Điều này có thể khẳng định được hợp chất ĐC-1 không có chức rượu mà là có chức xeton. Phổ 1 H-NMR và phổ DEPT: cho biết hợp chất ĐC-1 có tín hiệu của 8 nhóm CH3 đều ở dạng singlet (xem hình 3.2 và 3.4) có các độ chuyển dịch hoá học như sau: ở độ chuyển dịch δ = 0,762ppm (3H, s, CH3); δ = 0,841ppm (3H, s, CH3); δ = 0,847ppm (3H, s, CH3); δ = 0,885ppm (3H, s, CH3); δ = 0,996ppm (3H, s, CH3); δ = 1,011ppm (3H, s, CH3); δ = 1,021ppm (3H, s, CH3); δ = 1,07ppm (3H, s, CH3). Độ dịch chuyển hoá học ở δ = 5,48ppm (1H, d, J = 3,21 và 8,17Hz) là của proton liên kết tại cacbon ở liên kết đôi (nhóm = CH tại C15). Phổ 13 C-NMR: nhận thấy nguyên tử cacbon ở trạng thái lai hoá sp 2 thuộc nhóm =CH có độ chuyển dịch hoá học δ = 117,19ppm. Nguyên tử cacbon bậc 4 cũng ở trạng thái lai hoá sp 2 tham gia vào liên kết đôi với nguyên tử này có độ chuyển dịch hoá học ở δ = 157,59ppm. Phổ 13 C-NMR còn cho một tín hiệu ở trường rất yếu tương ứng với độ chuyển dịch hoá học δ = 217,43ppm đặc trưng cho cacbon trong nhóm cacbonyl tại vị trí C-3. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Như vậy, phổ NMR hoàn toàn phù hợp với phổ FT-IR không thấy có vân đặc trưng của nhóm OH mà lại thấy xuất hiện vân đặc trưng của C=O. Các nguyên tử H đối với nhóm C=O thấy chỉ có 2H với δ = 2,50ppm (2H, dd, J = 7,1 và 11Hz), còn có 2 proton ở vị trí  của nhóm =CH (tại C16) có độ chuyển dịch hoá học δ = 2,27ppm (2H, dd, J = 3,3 và 4,08 và 6,39). Trên cơ sở phân tích các tính chất hoá học, nhất là phân tích các thông tin có được từ phổ LC- MS, FT-IR, phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR, 13 C-NMR, phổ DEPT, phổ HMBC, HSQC, phổ H-H COSY và phần mềm ACD/HNMR ACD/CNMR mô phỏng phổ NMR cũng đã cho phép chúng tôi quy kết hợp chất ĐC-1 là một triterpen phải có công thức cấu tạo như sau: 27 O 29 30 28 23 24 25 26 1 3 5 6 8 9 10 15 18 20 22 13 19 21 7 11 14 16 2 4 12 17 Taraxeron (hay Frendoolean-14-en-3-on) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Bảng 3.1. Phổ 13 C-NMR và 1 H-NMR của taraxeron (ĐC-1) từ lá đỏ ngọn Vị trí cacbon 13 C-NMR (δ-ppm) ACD/ 13 C- NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm) 1 38,35 38,4 Vùng (1,2 - 1,6) 2 33,08 34,1 2,5 (2H; dd; 7,1 và 11,0) 3 217,3 217,3 - 4 47,56 47,6 - 5 55,77 55,8 (1,99) 6 19,91 20,0 Vùng (1,2 - 1,6) 7 33,57 35,2 Vùng (1,2 - 1,6) 8 38,87 38,9 - 9 48,8 48,7 (1,78 - 1,87) 10 33,57 37,6 - 11 17,44 17,5 Vùng (1,2 - 1,6) 12 36,67 35,8 Vùng (1,2 - 1,6) 13 37,74 37,7 - 14 157,59 157,6 - 15 117,19 117,2 5,48 (1H; d; 3,21; 8,17) 16 34,12 36,7 2,27 (2H; dd; 3,3; 4;1; 6,4) 17 35,57 37,7 - 18 48,7 48,8 (1,78 - 1,87) 19 40,64 40,7 Vùng (1,2 - 1,6) 20 28,79 28,8 - 21 35,11 33,6 Vùng (1,2 - 1,6) 22 37,69 33,1 Vùng (1,2 - 1,6) 23 29,92 29,9 0,76 - 1,07 (24H của 8 nhóm CH3) 24 14,79 14,8 25 29,86 29,9 26 21,34 21,5 27 25,56 25,6 28 26,12 26,2 29 33,36 33,4 30 21,47 21,4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Hình 3.1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 Hình 3.2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Hình 3.3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Hình 3.4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 3.3.2. Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol (ĐC-2) Chất ĐC-2 là chất rắn kết tinh, có nhiệt độ nóng chảy ở 152 0 -155 0 C, tách được từ dịch chiết clorofom, phân lập bằng sắc kí cột silicagen, rửa giải bằng hệ dung môi n-hexan-clorofom (90:10). Phổ EI-MS cho pic ion phân tử [M + ] ở 412 m/z. Các phổ FT-IR, 1 H- NMR và 13 C-NMR đều khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxyl, phổ FT- IR có vân 3410cm -1 rộng, còn ở phổ NMR cho δH-3α = 3,47ppm và δC-3 = 71,6ppm). Phân tử có hai nối đôi không liên hợp (IR cho νmax ở 1622cm -1 ). Phổ 1 H-NMR của các proton thuộc nhóm metyl (CH) cũng đã khẳng định điều ấy, δH-6 = 5,33ppm (1H, dd, j =15Hz và 2Hz); δH-22 = 5,15ppm (1H, dd, j =15Hz và 5Hz); δH-23 = 5,01ppm (1H, dd, j =15Hz và 5Hz). Phổ 13 C- NMR cho thấy δC-5 = 139,2ppm; δC-6 = 121,4ppm; CC-22 = 138,4ppm và δC-23 = 129,2ppm. So sánh các số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất ĐC-2 với số liệu phổ NMR của stingmasterol [16] hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ ra ở bảng 3.2. Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của hợp chất ĐC-2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất Stingmast -5,22-dien- 24R-3β-ol. HO 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 18 12 13 16 17 19 21 22 24 26 27 28 29 11 14 15 23 2520 Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Bảng 3.2. Phổ 13 C-NMR của các chất ĐC-2 và stingmasterol [16] Phổ 13 C-NMR của Stigmasterol (ĐC-2) Phổ 13 C-NMR của Stigmasterol [16] Vị trí cacbon 13 C-NMR(δ-ppm) Vị trí cacbon 13 C-NMR(δ-ppm) 1 36 1 37,28 2 29 2 31,66 3 71 3 71,78 4 42 4 42,31 5 140 5 140,76 6 122 6 121,69 7 37 7 31,91 8 31 8 31,91 9 51 9 50,18 10 36 10 36,52 11 24 11 21,09 2 42 2 39,70 13 40 13 42,22 14 57 14 56,88 15 25 15 24,38 16 30 16 28,92 17 56 17 55,97 18 12 18 19,40 19 19 19 12,06 20 40 20 40,50 21 19 21 21,23 22 138 22 138,31 23 129 23 129,29 24 50 24 51,25 25 32 25 31,91 26 21 26 21,09 27 21 27 19,00 28 19 28 25,41 29 12 29 12,25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Hình 3.5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Hình 3.6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Hình 3.7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Hình 3.8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 3.3.3. β-sitosterol (ĐC-3) Chất ĐC-3 là chất rắn tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy 140- 141 0 C, nó được tách từ dịch chiết clorofom, trong hệ dung môi n-hexan- clorofom (40:10). Phổ EI- MS, m/z (%) cho [M + ] = 414 (23), [M-1] + = 413 (41). Từ phổ EI-MS cho pic [M+] = 414 ứng với công thức phân tử C29H50O. Phổ hồng ngoại, phổ 1 H-NMR và phổ 13 C-NMR cho thấy trong phân tử có nhóm OH tại vị trí C-3 (IR có vân 3450 cm -1 rộng, δH-3α = 3,57ppm và δC-3 = 72,1ppm). Một liên kết đôi tại C6 (phổ IR có νmax= 3010cm -1 và 1650cm -1 ứng với dao động hoá trị của liên kết đôi; còn trên phổ 1 H-NMR cho δH-6 = 5,42ppm (1H, d, J, 5,2Hz), phổ 13 C-NMR cho δC-5 = 141,1ppm và δC-6 = 121,7ppm). So sánh các số liệu phổ 1 H-NMR và 13 C-NMR của chất ĐC-3 với số liệu phổ NMR của β-sitosterol [16] hoàn toàn tương tự nhau và được chỉ ra ở bảng 3.3. Dựa trên phân tích các số liệu về phổ EI-MS, FT-IR và các phổ NMR của hợp chất ĐC-3 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của chất β-sitosterol. HO 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 18 12 13 16 17 19 21 22 24 26 27 28 29 11 14 15 23 2520 β-sitosterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Bảng 3.3. Phổ 13 C-NMR của các chất ĐC-3 và β-sitosterol [16] Phổ 13 C-NMR của β-sitosterol (ĐC-3) Phổ 13 C-NMR của β-sitosterol [16] Vị trí cacbon 13 C-NMR(δ-ppm) Vị trí cacbon 13 C-NMR(δ-ppm) 1 37 1 37,27 2 31 2 32,54 3 71 3 71,77 4 42 4 42,29 5 140 5 140,75 6 121 6 121,69 7 32 7 31,92 8 32 8 31,92 9 50 9 50,15 10 36 10 36,51 11 21 11 21,10 12 40 2 39,80 13 42 13 42,23 14 57 14 56,78 15 24 15 24,31 16 28 16 28,25 17 56 17 56,08 18 12 18 19,39 19 19 19 11,89 20 36 20 36,16 21 19 21 18,80 22 34 22 33,96 23 26 23 26,11 24 46 24 45,85 25 29 25 29,18 26 19 26 18,82 27 19 27 19,05 28 23 28 23,08 29 12 29 11,99 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Hình 3.9 Hình 3.9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 Hình 3.10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Hình 3.11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 Hình 3.12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 3.3.4. Axit gallic (ĐE-1) Các chất thu được từ dịch chiết etylaxetat (ĐE) được phân chia trên sắc kí cột với chất hấp phụ silicagel, rửa giải bằng hỗn hợp dung môi clorofom- metanol với tỉ lệ metanol tăng dần từ 0% - 100% thu được nhiều phân đoạn khác nhau trong đó có phân đoạn CHCl3:MeOH (9:1) chứa một chất sạch được kí hiệu là chất ĐE-1. Chất ĐE-1 là chất rắn, tinh thể hình kim có nhiệt độ nóng chảy ở 248 0 C-250 0 C. Phổ IR cho vân hấp thụ mạnh ở νmax= 1700cm -1 đặc trưng cho nhóm cacboxyl có νmax = 1700cm -1 , với vân rất tù có số sóng νmax = 3100cm -1 đặc trưng cho nhóm OH của phenol. Phổ 1 H-NMR cho tín hiệu 7,092ppm ứng với hai proton ở hai vị trí C2 và C6. Phổ 13 C-NMR cho thấy các tín hiệu: δC-1 = 121,960ppm; δC-4 =139,559 ppm; δC-2 = δC-6 =110,349ppm; δC-3 = δC-5 =146,345ppm; δC-7 =170,364ppm. Những số liệu về phổ NMR của chất ĐE-1 hoàn toàn phù hợp với phần mềm ACD/NMR của axit gallic (xem bảng 3.4). Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của ĐE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của axit gallic Vị trí cacbon Phổ của chất ĐE-1 Phần mềm ACD của axit gallic 13 C-NMR (δ-ppm) 1 H-NMR (δ-ppm) ACD/ 13 C- NMR (δ-ppm) ACD/ 1 H-NMR (δ-ppm) 1 121,96 - 123,88 - 2 110,35 7,092 111,35 7,11 3 146,35 - 147,44 - 4 139,56 - 138,18 - 5 146,35 - 147,44 - 6 110,35 7,092 111,35 7,11 7 170,36 - 167,37 - Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Trên cơ sở phân tích các số liệu về phổ FT-IR, NMR và phần mềm ACD/NMR. Cấu trúc của axit gallic là: COOH OH HO OH 2 3 4 5 6 7 1 Axit gallic Từ dịch chiết etylaxetat, ngoài axit gallic còn thu được một số phân đoạn không sạch khác có chứa các chất cho phản ứng màu với xianidin; cho phản ứng tạo màu xanh đen với FeCl3. Các mẫu này có chứa hỗn hợp các flavonoit, các polyphenol có hệ số Rf rất gần nhau và việc tách chúng bằng cột silicagen chưa đạt được sự phân chia tốt. Khi rửa giải bằng CH3OH 100% thu được phân đoạn cho các phản ứng màu giống dịch chiết tổng số bằng n-butanol. Khi thực hiện phản ứng thuỷ phân các mẫu này trong axit HCl 2N thu được glucozơ và axit gallic. Từ kết quả thuỷ phân này có thể cho rằng các phân đoạn chiết bằng etylaxetat và bằng n-butanol đều chứa các tannin và đó là galotanin. Tuy nhiên các tannin ấy được tạo ra bởi liên kết C-glycoside hay O-glycoside cấu trúc và thứ tự liên kết của chúng như thế nào, còn chưa được làm rõ vì chưa tách chúng thành các đoạn sạch. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 Hình 3.13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Hình 3.14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 Hình 3.15. Phổ 1 H-NMR của chất axit gallic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 Hình 3.16. Phổ 13 C-NMR của chất axit gallic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 3.4. Thử hoạt tính sinh học Các chất tổng số được chiết, tách bằng dung môi có độ phân cực khác nhau sau khi làm khô kiệt, loại bỏ hoàn toàn dung môi được gửi tới phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Y khoa Thái Nguyên để thử tác dụng sinh học của chúng. Kết quả được nêu ở bảng 2.3 và hình 2.1 cho thấy tất cả các chất thu được từ các dịch chiết của lá cây đỏ ngọn đều có tác dụng kháng khuẩn đối với khuẩn Staphylococcus, E.coli, Salmonella typhi. Chúng tôi cũng đã gửi mẫu chiết bằng etylaxetat và chiết bằng etanol sau khi đã làm sạch dung môi đến cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên. Các mẫu đều có tác dụng tốt đối với việc chăm sóc sức khoẻ con người, các chất có trong các dịch chiết trên đều không gây độc đối với con người. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 KẾT LUẬN 1. Nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật của lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) đã phát hiện thấy nhiều nhóm hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh lý cao; đó là đường khử, tritecpenoit, steroit, saponin, cumarin, axit hữu cơ, các flavonoit, các chất polyphenol, các tannin, các chất xanthone. 2. Từ lá cây đỏ ngọn lần đầu tiên đã phân lập và dựa vào các đặc trưng hoá lý, các số liệu phổ EI-MS, NMR, FT-IR đã nhận dạng được cấu trúc của 4 hợp chất hữu cơ thuộc các nhóm polyphenol, steroit, terpenoit. 3. Phân tích các phổ IR, UV, MS và NMR các chất tinh khiết được tách ra nói trên đã nhận dạng được chúng là: taraxeron, stigmasterol , β- sitosterol và axit gallic. 4. Từ dịch chiết tổng của lá đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) chúng hoàn toàn không gây độc hại với con người, có thể chế biến thành thức uống hằng ngày như một thực phẩm chức năng có tác dụng kháng các khuẩn Staphylococcusauresu (Tụ cầu vàng), E.coli (Thực khuẩn đường ruột) và Salmonella typhi (Thương hàn). KIẾN NGHỊ Cây đỏ ngọn là một cây thuốc quý có nhiều tác dụng trong y học vì vậy tôi đề nghị với các cấp có thẩm quyền tiếp tục cho nghiên cứu một cách sâu rộng hơn về cây đỏ ngọn nhằm phục vụ tốt trong đời sống nhân dân. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt 1. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, trang 969. 2. Trần Đình Đại (1998), “Khái quát về hệ thực vật Việt Nam”, Hội thảo Việt - Đức về hoá học các hợp chất thiên nhiên, Hà Nộ i, trang 17-27. 3. Nguyễn Văn Đàn (1997), Các phương pháp nghiên cứu cây thuốc, Nxb Y-Dược, TP Hồ Chí Minh . 4. Đề tài cấp bộ quốc phòng của Học viện Quân Y (2002) , “Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết từ cây đỏ ngọn lên một số chức năng của hệ thần kinh trên động vật thực nghiệm”, Hà Nội 5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, Hà Nội. 6. PGS.TS Phạm Đình Hùng (2007), Nghiên cứu xác định cấu trúc các hợp chất có hoạt tính sinh học cao, (Mã số đề tài 510402). 7. Hoàng Thanh Hương, Cầm Thị Ích, Hà Việt Sơn (2006), Khảo sát phần dịch chiết etylaxetat của lá thành ngạnh, tạp chí Hoá học, T.44(1), trang 71-75. 8. Lê Khả Kế (1977), Cây cỏ thường thấy ở Việt Nam, tập 2, Nxb Khoa học và kỹ thuật, trang 189. 9. Nguyễn Liêm, Triệu Duy Điệt, Đỗ Văn Bình (1996), Nghiên cứu tác dụng chống oxi hoá (Antioxidant invitro) của một số cây thuốc Việt Nam, Công trình nghiên cứu khoa học quân sự số 3, trang 30-33. 10. Nguyễn Liêm và cộng sự (1996), “Nghiên cứu tác dụng chống oxi hoá (antioxydant), của cây đỏ ngọn để phòng và chứa các bệnh về rối loạn huyết động”. Đề tài cấp Bộ quốc phòng, Hà Nội. 11. Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc Việt Nam, Nxb Y học, trang 122-123. 12. Trần Cẩm Vinh (1997), “Tác dụng của cây đỏ ngọn trong quá trình đông máu”, Công trình nghiên cứu y học quân sự, số 3, trang 7- 9. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 59 Tiếng Anh 13. A.K.Ratty, N.P.Das (1988), “Biochemical medicine and metabolic biologo”, 39, 69-79. 14. Anake Kijjoa, Maria Jose, T.G.Gonzalez, Madalena M.M.Ana M.Damas, §Ing-on Mondranondra, Llartur M.S.Silva and Werner Herz (1998), “Xanthones from Cratoxylum Maingayi”. Phytochemistry Vol 49, No.7, 2159-2162. 15. G.M.Kitanov, I.Assenov I and Dam The Van (1988), “Flavonols and Xanthones from Cratoxylum prunifloum kurz”, Pharnazie 43, 879 . 16. Goat J.L, Akihisa T.Analysis of steroit frested, pp.324. Chapman & Hall. London, New York - Tokyo. 17. Guat-Lee Sia, Graham J.Bennett, Leslie J.Harrison and Keng-Yeow Sim (1995), “Minor xanthones from the Bark of Cratoxylum cochinchinense”. Phytochemistry, Vol 38, No.6, pp.1521-1528. 18. J. Graham (1993), “et al, triterpenoids, tocotrienols and xanthones from the Bark of cratoxylon cochinchinense”, phytochemistry, Vol 32, No 5, 1245. 19. Lien Hoa Dieu Nguyen, Le Li J. Harrison (1998), “ritecpenoid and xanthone constituents fo Cratoxylum conchinchinese”, phytochemisty 50, 471-476. 20. Macias, M.Ulloa, M.Ulloa, M. Gamboa, A. and Mata, R. “Phytotoxic comopounds from the new coprophilous fungus Gnanomyces polytlrix”. 21. Munekazu Iinuma, Hideki, Tðtero Ito, Toshiyuki Tanaka and Domingo A.Madulid (1996), “Two xanthones from roots of Cratoxylum formosanum”. Phytochemistry, Vol, 42, No 4, PP.1195-1198. 22. Nawong Boonnak, Chatchanok Karalai, Suchada Chantrapromma, Channita Ponglimanont, Hoong-Kun Fun (2006), “Bioac tive prenylated xanthones and anthraquinones from Cratoxylum formosun ssp.pruniflorum”. Tetrahedron 62 ,8850-8859. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 23. Pitchaon Maisuthisakul, Rungnaphar Pongsawatmanit, Michael H.Gordon (2007), “Charaterization of the phytochemicals and antioxidant properties of extracts from Teaw (Cratoxylum fromosum Dyer)”. Food chemistry 100 1620-1629. 24. Sompong Boonsri, Chatchanok Karalai, Chanita Ponglimanont, Akkharawit Kanjana-Opas, Kan Chantrapromma (2006), “Anibac terial and cytotoxic xanthones from the roots of Cratoxylum fomosum”. Phytochemistry 67,723-727. 25. Soon Yew Tang, Matthew Whiteman, Zhao Feng Peng, Andrew Jeniner, Eu Leong Yong and Barry Halliwell (2004), “Charcterition of Antioxidant and Antiglycation Properties and Isolation of Active Ing redients from Traditional Chinese medicines”. Free Radical Biology & Medicine, Vol.36, No.12, pp.1575-1587, . 26. Soon Yew Tang, Matthew Whiteman, Andrew Jeniner, Zhao Feng Peng and Barry Halliwell (2004), “Mechanisin of cell death induced bi an antioxidant extract of Cratoxylum cochinchinense”, Free Radical Biology and Medicine, Vol 36, No.12,pp, 1588-1611. 27. Xue- Li Cao, Yu Tian, Tian-You Zhang, Yoichiro Ito (2000), “Supercritical fluid extraction of catechins Cratoxylum prunifolium Dyer”. Joumal of Chromatography A, 898, 75-81. 28. Xue- Li Cao, Yu Tian, Tian-You Zhang and Yoichiro Ito (2000), “Beijing Institute of New Technology Application, Xizhimen Southstree” No.16, Beijing 100035, China. 29. W. Mahabusaraka, W. Nuangnaowarat, W.C. Taylor (2006), “xanthone derivativens from Cratoxylum cochinchinense roots”, Phytochemistry 67 470- 474. 30. K. Tawaraya, Y. Takaya, M. Turjaman, S.J. Tuah, S.H. Limin, Y. Tamai, J.Y. Cha, T. Wagatsuma, M. Osaki (2003), “Arbuscular mycorrhizal colonization of tree species grown in peat swamp forests of central kalimantan, indonesia”, Forest Ecology and Management 182, 381- 386. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 PHỤ LỤC I. Chất taraxeron Trang Phổ LC-MS của taraxeron…………………………………………………. 62 Phổ FT-IR của taraxeron................................................................................65 Phổ 1 H-NMR của taraxeron…………………………………………………66 Phổ 13 C-NMR của taraxeron………………………………………………...71 Phổ C13CPD & DEPT của taraxeron……………………………………….73 Phổ C13CPD-COSYGP của taraxeron……………………………………...78 Phổ C13CPD-HSQC của taraxeron…………………………………………81 Phổ C13CPD-HMBC của taraxeron………………………………………...82 II. Chất stigmasterol Phổ EI-MS của stigmasterol…….……………………………………….......84 Phổ FT-IR của stigmasterol ………………………………………………...85 Phổ 1 H-NMR của stigmasterol………………………………………………86 Phổ 13 C-NMR của stigmasterol……………………………………………...87 III. Chất β- Sitosterol Phổ EI-MS của β- Sitosterol…………………………………………………88 Phổ FT-IR của β- Sitosterol………………………………………………….89 Phổ 1 H-NMR của β- Sitosterol………………………………………………90 Phổ 13 C-NMR của β- Sitosterol……………………………………………...95 Phổ C13CPD & DEPT của β- Sitosterol…………………………………….97 IV. Chất axit gallic Phổ FT-IR củaaxit gallic ……………………………………………………98 Phổ tử ngoại UV của axit gallic............... ................................................... 99 Phổ 1 H-NMR của axit gallic………………………………………………..100 Phổ 13 C-NMR của axit gallic………………………………………………101 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 Phổ FT-IR của taraxeron Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 66 Phổ 1 H-NMR của taraxeron Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 67 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 71 Phổ 13 C-NMR của taraxeron Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 73 Phổ DEPT của taraxeron Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 76 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 77 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 Phổ COSYGP của taraxeron Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 80 Hình… Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 81 Phổ HSQC của taraxeron Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 82 Hình… Phổ HMBC của taraxeron Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 83 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 84 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 85 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 86 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 87 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 88 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 89 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 90 Phổ 1 H –NMR của β - Sitosterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 91 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 92 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 93 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 94 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 95 Phổ 13 C –NMR của β - Sitosterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 96 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 97 Phổ DEPT của β - Sitosterol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 98 Phổ IR của axit gallic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 99 Phổ UV của axit gallic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 100 Phổ 1 H – NMR của axit gallic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 101 Phổ 13 C – NMR của axit gallic Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 102 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 103 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 104 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 105 MỤC LỤC MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN........................................................................... 3 1.1. Mô tả thực vật .................................................................................. 3 1.2. Một số công dụng của chi Cratoxylum............................................... 4 1.3. Tình hình nghiên cứu hóa học thực vật chi Cratoxylum ...................... 7 1.3.1. Các hợp chất có khung triterpen ................................................. 7 1.3.2. Các chất axit hữu cơ .................................................................. 8 1.3.3. Các chất có khung xanthone ....................................................... 9 1.3.4. Một số đại diện của khung anthraquinon.................................. 15 1.3.5. Một số đại diện của khung flavonoit......................................... 16 1.4. Những nghiên cứu hoá thực vật loài Cratoxylum prunifolium. .......... 17 Chương 2. PHẦN THỰC NGHIỆM ........................................................ 19 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu ............................................ 19 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu ...................................................................................... 19 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ................ 19 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất................................................................................... 20 2.2. Dụng cụ, hoá chất và thiết bị nghiên cứu ......................................... 20 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất ................................................................ 20 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu .................................................................. 21 2.3. Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) ........ 21 2.3.1. Các dịch chiết .......................................................................... 21 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết .............................................. 23 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học.............................................................. 23 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 106 2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ cây đỏ ngọn................... 25 2.4.1. Dịch chiết clorofom.................................................................. 26 2.4.1.1. Taraxeron (Friendoolean - 14- en-3-on) (ĐC1) ................... 26 2.4.1.2. Stigmast- 5,22- đien-24R-3β-ol .......................................... 27 2.4.1.3. β- Sitosterol....................................................................... 27 2.4.2. Dịch chiết trong etylaxetat (ĐE) ............................................... 28 Chương 3. THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.............................. 29 3.1. Nguyên tắc chung........................................................................... 29 3.2. Phân tích định tính và phát hiện các nhóm chất ................................ 30 3.3. Phân lập và nhận dạng các hợp chất có trong các dịch chiết khác nhau của cây đỏ ngọn ............................................................................ 30 3.3.1. Taraxeron ( hay Frendoolean-14-en-3-on) (ĐC-1) .................... 30 3.3.2. Stingmast -5,22-dien-24R-3β-ol (ĐC-2) .................................... 38 3.3.3. β-sitosterol (ĐC-3) ................................................................... 44 3.3.4. Axit gallic (ĐE-1) .................................................................... 50 3.4. Thử hoạt tính sinh học .................................................................... 56 KẾT LUẬN .............................................................................................. 57 KIẾN NGHỊ ............................................................................................. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................ 58 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 107 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) ..................................... 22 Bảng 2.2. Phát hiện các nhóm chất trong cây đỏ ngọn ................................. 23 Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thô từ lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) ................................................... 25 Bảng 3.1. Phổ 13 C-NMR và 1 H-NMR của taraxeron (ĐC-1) từ lá đỏ ngọn ...... 33 Bảng 3.2. Phổ 13 C-NMR của các chất ĐC-2 và stingmasterol [16] ............... 39 Bảng 3.3. Phổ 13 C-NMR của các chất ĐC-3 và β-sitosterol [16] .................. 45 Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của ĐE-1 và số liệu phổ NMR trong phần mềm ACD/NMR của axit gallic .................................................. 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 108 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Ảnh cây đỏ ngọn (Cratoxylum Prunifolium Kurt, Hypericaceae) ... 4 Hình 2.1. Ảnh được gây ức chế xung quanh giếng thạch............................ 24 Hình 3.1 ................................................................................................... 34 Hình 3.2 ................................................................................................... 35 Hình 3.3 ................................................................................................... 36 Hình 3.4 ................................................................................................... 37 Hình 3.5 ................................................................................................... 40 Hình 3.6 ................................................................................................... 41 Hình 3.7 ................................................................................................... 42 Hình 3.8 ................................................................................................... 43 Hình 3.9 ................................................................................................... 46 Hình 3.10 ................................................................................................. 47 Hình 3.11 ................................................................................................. 48 Hình 3.12 ................................................................................................. 49 Hình 3.13 ................................................................................................. 52 Hình 3.14 ................................................................................................. 53 Hình 3.15. Phổ 1 H-NMR của chất axit gallic ............................................. 54 Hình 3.16. Phổ 13 C-NMR của chất axit gallic ............................................. 55 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quy trình ngâm chiết ................................................................ 22