Luận văn Nghiên cứu hóa học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả ké đầu ngựa (xanthium strumarium l.)

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------------------------- NGUYỄN THỊ HỒNG THÁI NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) Chuyên ngành: Hoá học hữu cơ. Mã số: 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Văn Thỉnh Thái Nguyên 2007 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ---------------------------- NGUYỄN THỊ HỒNG THÁI NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC TRONG QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) LUẬN VĂN THẠC SĨ HOÁ HỌC Thái Nguyên 2007 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ CÚC (ASTERACEAE) VÀ CHI XANTHIUM .......................... 3 1.1.1. Họ cúc (asteraceae) ....................................................................... 3 1.1.2. Chi xanthium .................................................................................. 3 1.2. GIỚI THIỆU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY KÉ ĐẦU NGỰA ........................... 4 1.2.1. Đặc điểm thực vật. ........................................................................ 4 1.2.2. Đặc điểm sinh thái ....................................................................... 4 1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CHI XANTHIUM ................................... 5 1.3.1. Một số nghiên cứu hoá thực vật quả Ké đầu ngựa ................. 5 1.3.2. Sử dụng trong y học dân gian .................................................. 8 1.3.3. Một số bài thuốc dân gian từ quả Ké đầu ngựa .................... 9 1.4. CÁC DẠNG AXIT BÉO HAY GẶP TRONG TỰ NHIÊN ....................................... 10 CHƢƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 18 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp sử lý mẫu .................................................................................... 18 2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết ......... 20 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất ................................................................................ 20 2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU ........................................... 20 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất ................................................................. 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu .................................................................. 22 2.3. CÁC DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) .............................................................................. 22 2.3.1. Các dịch chiết ............................................................................ 22 2.3.2. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity) ................................................................ 24 2.3.3. Phát hiện định tính các nhóm chất ........................................ 25 2.3.3.1. Các ancaloit ................................................................. 25 2.3.3.2. Các sterol .................................................................... 26 2.3.3.3. Các flavonoit ............................................................... 26 2.3.3.4. Các saponin ................................................................ 26 2.3.3.5. Các cumarin .............................................................. 26 2.3.3.6. Các tanin .................................................................... 27 2.3.3.7. Các glucozit trợ tim .................................................... 27 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT .................................................................. 28 2.4.1. Phân tích thành phần các axit béo trong dịch chiết n-hexan của quả Ké đầu ngựa trên GC ................................................................... 29 2.4.2. Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-hexan; etylaxetat của quả ké đầu ngựa bằng phƣơng pháp sắc ký cột ............... 31 2.4.2.1.  – Sitosterol (KĐN.H8) ................................................. 31 2.4.2.2. 3-O- -D-glucopyranosyl--Sitosterol (KĐN.E33) ......... 32 CHƢƠNG 3: THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG ............................................................................................ 35 3.2. PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) ................................................................................. 36 3.3. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L) ............................................. 36 3.4. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA .................................................................................................................. 38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.4.1. Các axit béo ................................................................................... 38 3.4.2. Các hợp chất sterol ....................................................................... 41 3.4.2.1. β-sitosterol hay 24R-stigmast-5 en-3-õ-ol (KĐN.H8) .................. 41 3.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33) ............... 44 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 46 PHỤ LỤC .......................................................................................................................... 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các số liệu, kết quả nêu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả Nguyễn Thị Hồng Thái Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lời cảm ơn Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS Phạm Văn Thỉnh người thầy đã chỉ ra hướng nghiên cứu, hướng dẫn tận tình, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu để hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Quyết Tiến, TS. Phạm Thị Hồmg Minh, phòng Hoạt chất sinh học, Viện Hoá học - Viện khoa học và công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công việc nghiên cứu của mình. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn Phòng Phân tích cấu trúc - Viện Hóa học, Phòng Hoá - Sinh Biển Viện Hoá học các hợp chất thiên nhiên, đã giúp tôi thực hiện các phép phân tích phổ và phân tích thành phần axit béo trong mẫu nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn hoá hữu cơ, các thầy, cô trong khoa Hoá học, các phòng ban của trường ĐHSP Thái Nguyên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới những người thân trong gia đình, các bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên, tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên , ngày 20 tháng 9 năm 2007 Tác giả Nguyễn Thị Hồng Thái Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN  Các phương pháp sắc ký SKLM : Sắc ký lớp mỏng CC : Column chromatography  Các phương pháp phổ UV : Ultraviolet spectroscopy GC : Gas Chromatography GC - MS : Gas Chromatography - Mass Spectroscopy EI - MS : Electron Impact Mass Spectroscopy ESI - MS : Electron sprayionisation - Mass Spectroscopy FAB - MS : Fast Atom Bombardment Mass spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HMQC : Heteronuclear Multiple - Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation NOESY : Nuclear Overhauser and Exchange Spetroscopy MIC : Minimum inhibitory concentration Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ TRONG LUẬN VĂN Hình Và sơ đồ Nội dung Trang Hình 1.1 Công thức dạng tổng quát của các chất I, II, III 7 Hình 1.2 Cấu trúc của chất I 8 Hình 2.1 Cây Ké đầu ngựa 19 Hình 2.2: Quả Ké đầu ngựa 19 Sơ đồ 2.1 Quy trình ngâm chiết mẫu 23 Sơ đồ 2.2: Sơ đồ chung nghiên cứu một số thành phần hoá học quả Ké đầu ngựa thuộc chi Xanthium strumarium L. 28 Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa 31 Sơ đồ 2.4 Phân lập chất từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa 33 Sơ đồ 3.1 Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8 42 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN Tên bảng Nội dung Trang Bảng 1.1 Các dạng axit béo no thường gặp trong tự nhiên 13 Bảng 1.2 Các axit béo không no thường gặp trong tự nhiên 15 Bảng 2.1 Khối lượng cặn chiết từng phân đoạn của quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) 24 Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết từ quả Ké đầu ngựa 25 Bảng 2.3 Phát hiện định tính các nhóm chất 27 Bảng 2.4 Kết quả thành phần axit béo 30 Bảng 3.1 Các cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1% trong quả Ké đầu ngựa 39 Bảng 3.2 Các cấu tử có hàm lượng axit béo dưới 1% trong quả Ké đầu ngựa 39 Bảng 3.3 Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của õ-sitosterol 43 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỞ ĐẦU Nước ta có khí hậu và thảm thực vật khá phong phú và đa dạng. Dân tộc Việt Nam có truyền thống về sử dụng các loài thảo mộc làm thuốc chữa bệnh. Những năm gần đây xu hướng tìm kiếm một số hoạt chất trong các loài thảo mộc có tác dụng chữa bệnh ngày một tăng, thu hút các nhà khoa học nghiên cứu. Theo các số liệu thống kê mới nhất thảm thực vật Việt Nam có trên 12000 loài, trong số đó có trên 3200 loài thực vật được sử dụng làm thuốc trong Y học dân gian [1], [2], [3], [4], [5]. Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian vẫn đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc chăm sóc sức khoẻ cho con người. Ngày nay những hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học được phân lập từ cây cỏ đã được ứng dụng trong rất nhiều ngành công nghiệp, nông nghiệp và chăm sóc sức khoẻ con người. Chúng được dùng để sản xuất thuốc chữa bệnh, thuốc bảo vệ thực vật, làm nguyên liệu cho ngành công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm v.v... Mặc dù công nghệ tổng hợp hoá dược ngày nay đã phát triển mạnh mẽ, tạo ra các biệt dược khác nhau sử dụng trong công tác phòng, chữa bệnh, nhờ đó giảm tỷ lệ tử vong rất nhiều, song những đóng góp của các thảo dược cũng không vì thế mà mất đi chỗ đứng trong Y học. Nó vẫn tiếp tục được dùng như là nguồn nguyên liệu trực tiếp, gián tiếp hoặc cung cấp những chất đầu cho công nghệ bán tổng hợp nhằm tìm kiếm những dược phẩm mới cho việc điều trị các 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên chứng bệnh thông thường cũng như các bệnh nan y. Các số liệu gần đây cho thấy rằng, có khoảng 60% dược phẩm được dùng chữa bệnh hiện nay, hoặc đang thử cận lâm sàng đều có nguồn gốc từ thiên nhiên [7]. Trong công tác phòng chữa bệnh ở nước ta, Đảng và Nhà nước luôn chủ trương và khuyến khích Đông Tây y kết hợp để chăm sóc sức khoẻ cho nhân dân, kế thừa và phát huy vốn quý của nền Y học cổ truyền trong đó có nhiều cây thuốc quý. Trong thế giới thực vật muôn màu, nhiều loài cây cỏ đã được sử dụng như những dược liệu quý. Trong số đó có cây Ké đầu ngựa đặc biệt là bộ phận quả của cây. Loài cây này mọc rất phổ biến ở Việt Nam, thường mọc ở vùng đất hoang, bờ ruộng, bờ đường, xen kẽ với các loại cỏ khác. Dân gian thường dùng Ké đầu ngựa chữa phong hàn, đau đầu, chân tay đau co rút, phong tê thấp, đau khớp, mũi chảy nước hôi, mày đay, lở ngứa, chữa đau răng, đau họng, biếu cổ, hủi, eczema [4]. Để góp phần nghiên cứu làm rõ thành phần, tính chất của các chất hoá học trong thực vật làm thuốc chữa bệnh chúng tôi chọn hướng nghiên cứu hoá học các hợp chất thiên nhiên. Tên đề tài là: “Nghiên cứu hoá học các hợp chất có hoạt tính sinh học trong quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.)”, nhằm làm rõ các cơ sở khoa học cho việc sử dụng cây Ké đầu ngựa như một nguồn dược liệu quý, dùng làm thuốc chữa bệnh. Với ý nghĩa khoa học và thực tiễn nêu trên, nhiệm vụ của đề tài này là tiến hành phân lập các chất hoá học có trong quả Ké đầu ngựa, nhận dạng cấu tạo hoá học của một số chất tách được bằng các phương pháp hoá lý hiện đại. 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. KHÁI QUÁT VỀ HỌ CÚC (ASTERACEAE) VÀ CHI XANTHIUM 1.1.1. Họ cúc (Asteraceae) Họ cúc (Asteraceae) là họ lớn nhất trong thực vật có hoa, gồm 2 phân họ. Ở Việt Nam có khoảng 125 chi và trên 350 loài [1], chủ yếu là cỏ dại, một số được trồng làm thực vật cảnh (các loại Cúc), rau ăn (Ngải cứu, Cải cúc, Rau diếp), gia vị (Cúc tần), phẩm nhuộm (Hồng hoa). Họ cúc gồm 2 phân họ là: + Phân họ hoa ống (Rubuliflorae): Trên cụm hoa chỉ có hoa hình ống, hoặc hoa hình ống ở giữa, hoa hình lưỡi nhỏ ở xung quanh đầu. Cây không có nhựa mủ, + Phân họ hoa lưỡi nhỏ (Liguliflorae, Cichorioideae) : Tất cả các hoa trong cụm hoa đầu là hoa lưỡi nhỏ, không có hoa ống. Cây có nhựa mủ. Họ cúc là họ có số loài làm thuốc lớn nhất trong thực vật giới, có khoảng 51 loài thường làm thuốc, trong đó có 18 loài dùng trong công nghiệp dược là: Atiso, Bạch truật, Cỏ nhọ nồi, Cỏ ngọt, Cúc hoa, Cúc tần, Hồng hoa, Hy thiêm, Ké đầu ngựa, Khoản đông hoa, Mần tưới, Mộc hương, Ngải cứu, Ngưu bàng, Sài đất, Thương truật, Thanh cao hoa vàng, Tử uyển. 1.1.2. Chi xanthium Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.): Thân xù xì, lá chia 3-5 thuỳ hay hình bầu dục có khía răng. Quả Ké đầu ngựa có răng móc, cây thường mọc ở ven đường bãi hoang ven sông, suối. Quả dùng làm thuốc gọi là Thương nhĩ tử, chữa phong tê thấp, mụn nhọt. Theo Đỗ Tất Lợi quả Ké đầu ngựa là thành phần thuốc nam thiết yếu trong một số bài thuốc Y học cổ truyền Việt Nam. Trên thế giới có 25 loài còn ở Việt Nam có 2 loài đó là: 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Xanthium Strumarium L. là loài rất phổ biến, mọc hoang ở mọi nơi trong nước ta, được dùng làm nguyên liệu cho Đông y và Xanthium Inaequilaterum DC., loài này phân bố từ miền Trung trở vào, cũng được làm thuốc như loài trên [6]. 1.2. GIỚI THIỆU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÂY KÉ ĐẦU NGỰA 1.2.1. Đặc điểm thực vật. Cây Ké đầu ngựa còn gọi là thương nhĩ (tên Trung Quốc), phắt ma (Thổ). Tên khoa học là Xanthium strumarium L. thuộc họ cúc (Asteraceae). Cây Ké đầu ngựa mọc hoang ở khắp nơi trong nước ta, từ vùng núi cao tới vùng trung du, đồng bằng. Trên thế giới loài này cũng được phân bố ở hầu hết các nước có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Mọc nhiều ở các nước Châu Á như Trung Quốc, Malaixia, Ấn độ. Ngoài ra, Xanthium strumarium còn được biết đến ở Brazin, Mỹ. Ở Việt Nam Xanthium strumarium là một loài rất phổ biến. 1.2.2. Đặc điểm sinh thái. Cây Ké đầu ngựa là một cây nhỏ, cao độ 2m, thân có khía rãnh, lá mọc so le, phiến lá hơi 3 cạnh, mép có răng cưa có chỗ khía hơi sâu thành 3-5 thuỳ, có lông ngắn cứng. Hoa tự hình đầu có thứ lưỡng tính ở phía trên, có thứ chỉ gồm có 2 hoa cái nằm trong hai lá bắc dầy và có gai. Quả giả hình thoi, có móc, có thể móc vào lông động vật, cắt đôi ở trong có hai quả thực [4]. Cây Ké đầu ngựa có thể sống trên nhiều loại đất khác nhau, cây bắt đầu mọc vào mùa Xuân sinh trưởng và phát triển nhanh trong mùa mưa ẩm, sang Hạ cây ra hoa, kết trái, cuối Hạ sang Thu quả chín. Cây ưa ánh sáng và có thể chịu hạn, thường mọc thành đám ở ven đường, vùng đồi, bãi hoang, bờ sông . Mùa Xuân, nhân dân thường trồng cây Ké đầu ngựa bằng cách đào lỗ nhỏ cho vào 3-4 hạt mỗi hố cách nhau chừng 50-60cm, phủ ít đất lên và tưới ẩm, độ 10 ngày sau cây mọc [5]. 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT CHI XANTHIUM 1.3.1. Một số nghiên cứu hoá thực vật quả Ké đầu ngựa. Trong quả Ké đầu ngựa có nhiều iốt và vitamin C, ngoài hai chất này trong quả Ké đầu ngựa còn có các glucoza, -sitosterol, -(D,L)-glucozit có tác dụng chống viêm [11]. Trong quả Ké đầu ngựa ở Liên Xô có chứa ancaloit nhưng theo sự phân tích của Viện Y học Bắc Kinh (1958) thì trong quả Ké đầu ngựa có chất saponin (glucozit), không có ancaloit [6]. Theo Khafagy trong quả Ké đầu ngựa có một số secqiutecpen - lacton chưa no có khung xanthonolit: xanthinin (nhiệt độ nóng chảy 123- 1240), xanthanol và izoxanthanol [5]. Trong quả Ké đầu ngựa có 30% dầu béo. Nghiên cứu thực nghiệm cho thấy có hoạt tính giảm đường huyết của chuột bình thường, ức chế thần kinh trung ương, kháng khuẩn Gr (-), kháng nấm [11]. Theo Wehmer trong quả Ké đầu ngựa có 1,27% một glucozit (xanthostrumarin) tương ứng với chất datixin, chưa rõ hoạt tính, 3.3% nhựa và vitamin C. Quả Ké đầu ngựa có chứa: + Carboxy atractylozit ở dạng muối có tác dụng hạ đường huyết rất mạnh, có độc tính. + Xanthetin và Xanthamin là những chất có tác dụng kháng khuẩn [4]. Theo nghiên cứu của Ying-Tsun Ma, Mu-Chi Huang và các cộng sự, họ đã tìm ra hai chất mới thiazinediones cùng với năm chất đã biết được tách ra từ quả của Xanthium strumarium L. Cấu trúc của 2 chất mới này đã được xác định là: 6 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên * 7-Hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol [1,4] thiazine- 3,5-dione-11-0--D-glucopyranoside (chất I). * 2-Hydroxy-7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol [1,4] thiazine-5,5-dione-11-0-- D-glucopyranoside (chất II). Năm chất đã biết được xác định là: * Xanthiazone (chất III) * chlorogenic acid (chất IV) * Ferulic acid (chất V) * Fomononetin (chất VI) * Ononin (chất VII). Trên thế giới chi Xanthium có 25 loài [10]. Các loài Xanthium được sử dụng như một loại thuốc thảo mộc cổ truyền trong một thời gian dài ở các nước phương Đông. Xanthium strumarium L. là loài chính được tìm thấy nhiều ở Trung Quốc, quả của nó là Fructus Xanthi (Tên Trung Quốc là Cang- Er-Zi), người dân Trung Quốc sử dụng quả này để chữa viêm xoang, đau đầu do cảm lạnh, viêm khớp [9]. Từ Xanthium strumarium L người ta đã phân lập và nhận dạng được một số chất thuộc các nhóm sau: * Diterpenoit * Secquiterpen lacton * Caffeoylquinic axit * Thiazinedion Các chất trên đã được I. R. Chu công bố năm 1965. Các hợp chất dầu trong hạt của Xanthium strumarium L. đã được V. K. Kapoor công bố năm 1976. Chất I: R1= - D-Glu; R2=H Chất II: R1= - D-Glu; R2=OH Chất III: R1=H; R2=H 7 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Hình 1.1 Công thức cấu tạo tổng quát của các chất I, II, III. N S O O H R2 R1O 1 2 3 4a56 7 8a 9 10 11 4 Trong những năm gần đây các nhà khoa học của trường Đại học Y Thượng Hải tiếp tục nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất này. Họ tách được các chất từ Xanthium strumarium L., bằng cách phân chia chúng trên cột sắc ký silicagel kết hợp với cột sephadex LH-20 trong các hệ dung môi khác nhau, kết quả thu được hai chất mới: 7-hydroxymethyl-8,8- dimethyl-4,8-dihydrobenzol[1,4]thiazine-3,5-dione-11-0--D-glucopyranoside (chất I) và 2-hydroxy-7-hydroxymethyl-8,8-dimethyl-4,8-dihydrobenzol [1,4] thiazine-5,5-dione-11-0--D-glucopyranoside (chất II), cùng với năm chất đã biết là: Xanthiazone (chất III), chlorogenic acid (chất IV), ferulic acid (chất V) từ phần chiết trong n-butanol, fomononetin (chất VI) và ononin (chất VII) từ phần chiết trong ethyl acetate. Hợp chất I thu được là chất bột mầu trắng vô định hình, có nhiệt độ nóng chảy là: 180-1820C, phổ tử ngoại-khả kiến có ởmax (MeOH) là: 280 nm; phổ khối ion hoá bụi electron (ESI) cho tín hiệu m/z = 402 [M+H]+, công 8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên thức hoá học là C17H23N2SO8, được xác định bằng phổ khối phân giải cao. Phổ hồng ngoại của chất I chỉ ra sự hiện diện của nhóm hydroxyl (3369cm-1) và hai nhóm cacbonyl (1680 cm -1 ,1655cm -1 ). Từ các dữ liệu về phổ IR, UV, nhất là phổ NMR và phổ MS, Ting Han đã đề xuất cấu trúc hợp chất I là glucozit. Liên kết glucozit với gennin được thực hiện ở nhóm OH tại C-11. Đường tham gia tạo liên kết là đường glucoza và liên kết glucozit là õ-glucozit. Hình 1.2: Cấu trúc của chất (I) O N S H H O O H H H O OH HO HO CH2 OH H 2 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1.3.2. Sử dụng trong y học dân gian Quả Ké đầu ngựa (Thương nhĩ tử) có vị ngọt nhạt, hơi đắng, tính ấm, có tác dụng tiêu độc, sát trùng, tán phong, trừ thấp. Lương y Việt Cúc ghi nhận về Ké đầu ngựa như sau: Thương nhĩ thảo ấm, giải phong nhiệt thấp tê, bổ não tuỷ, chữa nhức đầu, viêm mũi dị ứng bạch đới, lâm lậu [4]. Hiện nay Ké đầu ngựa là một vị thuốc thường dùng trong nhân dân Việt Nam, được dùng chủ trị các bệnh ngoài da, bệnh mũi xoang, bệnh xương khớp. Trong bài thuốc Y học cổ truyền của Trung Quốc quả Ké đầu ngựa được dùng để chữa viêm xoang, đau đầu do cảm lạnh, viêm khớp, ung thư phát bối (sau lưng), đau răng, viêm mũi [12]. 9 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nhân dân Liên xô cũ dùng Ké đầu ngựa để chữa bướu cổ, các bệnh mụn nhọt, nấm tóc, hắc lào, lỵ và đau răng. Nhân dân ta và Trung Quốc thường chế Ké đầu ngựa thành cao thương nhĩ để chuyên chữa lỏ loét, mụn nhọt. Ở Ấn Độ, người ta dùng Ké đầu ngựa trị sốt rét, làm toát mồ hôi, trị bệnh tràng nhạc, ung thư, quả làm dịu kích thích, trị bệnh đậu mùa. Một số loài của chi Xanthium có nguồn gốc từ Bắc Mỹ được dùng trong y học. 1.3.3. Một số bài thuốc dân gian từ quả Ké đầu ngựa Chữa phong tê thấp, tay chân co rút: Quả Ké đầu ngựa 12g giã nát sắc uống [6]. Chữa đau răng: Sắc nước quả Ké đầu ngựa, Ngậm lâu lại nhổ. Ngậm nhiều lần [6]. Chữa mũi chảy nước trong, đặc: Quả Ké đầu ngựa sao vàng tán bột. Ngày uống 4-8g [6]. Chữa thuỷ thũng, bí tiểu tiện (lợi tiểu): Thương nhĩ tử, thiêu tồn tính; đình lịch. Hai vị bằng nhau, tán nhỏ. Uống với nước mỗi lần 8g, ngày hai lần [2]. Chữa biếu cổ: Ngày uống 4-5g quả Ké đầu ngựa dưới dạng thuốc sắc (đun sôi, giữ sôi 15 phút ) (Đỗ tất lợi ) Chữa tổ đỉa: Quả Ké đầu ngựa 50g, hạ khô thảo 50g, vỏ núc nác 30g, sinh địa 20g, hạt dành dành 15g, được tán bột làm viên. Ngày uống 20-25g. Chữa các bệnh phong, dị ứng gan, mẩn ngứa, mày đay: Ké đầu ngựa 15g, kinh giới bông 10g, muồng trâu 15g, cỏ mần trầu 15g, cam thảo đất 10g, bạc hà 10g, cỏ hôI 10g, bèo tai tượng 10g, chổi đực 10g, nghề bà 10g. Các 10 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên vị hiệp chung 1 thang, đổ 1 bát nước, sắc còn 8 phần, uống ngày 1 thang (bài thuốc ở An Giang). Các bệnh ngoài da do dị ứng, chàm (BS. Nguyễn Xuân Sơn, khoa da liễu Bệnh viện Việt- Tiệp): Ké đầu ngựa 9kg, thổ phục linh 9kg, cồn benzoic 10% 300ml. Nước vừa đủ 23lit. Nếu không dùng đường thì nấu nước, cô cao, tán bột làm viên. Đã điều trị 124 trường hợp cho kêt quả tốt. Chữa ung thư não: Thương nhĩ tử 15g, thất diệp nhất chi hoa (cây 7 lá 1 hoa) 16g, viễn chi 10g, xương bồ 6g, sắc uống ngày 1 thang [6]. 1.4. CÁC DẠNG AXÍT BÉO HAY GẶP TRONG TỰ NHIÊN [7] Lipit là những hợp chất hữu cơ tự nhiên rất phổ biến trong tế bào các cơ thể sống, trong động vật, thực vật và vi sinh vật. Chúng có thành phần hoá học và cấu tạo khác nhau nhưng cùng có tính chất chung là không hoà tan trong nước mà hoà tan tốt vào các dung môi hữu cơ như: ete, clorofom, benzen, ete dầu hoả… Cấu trúc đa dạng của lipit được bắt nguồn từ các axit béo khác nhau tham gia vào trong thành phần của nó. Ngày nay, đã phát hiện được hơn 500 axit béo khác nhau ở mức độ và đặc điểm phân nhánh của mạch hydrocacbon, số lượng và vị trí các nối đôi trong mạch, vị trí và số lượng các nhóm chức, độ dài của mạch hydrocacbon. Các axít béo có mặt trong thành phần lipit thực vật, động vật, thường có từ 16-20 nguyên tử cacbon trong phân tử. Theo Ackman trong sinh vật biển số lượng nguyên tử các bon của axít béo còn nhiều hơn có khi đến 30 nguyên tử cacbon. Hầu hết các axit béo no có mặt trong tự nhiên có cấu tạo mạch thẳng với số nguyên tử cacbon chẵn. Các axit với số nguyên tử cacbon từ C2-C30 được biết đến, nhưng phổ biến và quan trọng nhất là C12-C22. Chúng có thể được gọi tên theo tên thường và tên khoa học hoặc gọi theo kí hiệu số như 11 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16:0 (nghĩa là axit béo có 16 cacbon và không có nối đôi). Những axit béo đơn giản trong tự nhiên là các axit béo no, với mạch hydrocacbon dài, không phân nhánh có công thức chung như sau: CH3(CH2)nCOOH Trước đây người ta cho rằng số n bao giờ cũng là số chẵn, hiện nay nhờ các phương pháp phân tích hiện đại, người ta đã phát hiện trong dầu mỡ tự nhiên có cả các axit béo no có số nguyên tử cacbon n lẻ. Các axit này chiếm khoảng 1% so với tổng số các axit béo. Hơn một trăm axit béo một nối đôi được tìm thấy trong tự nhiên, nhưng hầu hết chúng là những hợp chất hiếm. Thực tế tất cả các axit béo một nối đôi đều có công thức chung là: CH3 (CH2)mCH=CH(CH2)nCOOH Đa số các axit béo có một nối đôi tham gia vào thành phần lipit tồn tại ở dạng cấu hình –cis: CH3(CH2)m (CH2)nCOOH H C=C H Các axit béo tự nhiên có nhiều hơn một liên kết đôi có thể chia thành một số nhóm. Nhóm quan trong nhất cả về mặt cấu trúc và mức độ tồn tại, là nhóm có vị trí nối đôi được phân cách đều đặn bởi nhóm metylen (methylene- interrupted) và nối đôi cấu hình dạng cis (Z), đại diện cho nhóm này là 2 axit linoleic và axit archidonic. Nhóm khác là các axit có tất cả một hoặc một phần không no trong một hệ liên kết đôi liên hợp dạng cis (Z) hoặc trans (E). Nhóm thứ ba thường xuyên miêu tả là liên kết đôi C=C không bị phân cách đều đặn bởi nhóm metylen (non methylene-interrupted diens NMID), axit 5,9,12-18:3 có trong dầu hạt cây tùng lớn là ví dụ: 12 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên COOH Các axit béo không no đa nối đôi phân cách đều đặn bởi nhóm allyl (-CH=CHCH2)- đều có chung công thức là: CH3(CH2)m(CH=CHCH2)n(CH2)COOH Các axit béo đa nối đôi liên hợp (conjugated polyenenoic fatty acids) là các axit béo không no chứa nhiều liên kết đôi liên hợp tồn tại trong thành phần. Các axit béo đa nối đôi liên hợp không có dấu hiệu tồn tại trong lipit bất kì một loại động vật nào và được thừa nhận có vai trò đáng kể chỉ trong một số dầu hạt thực vật, trong đó có dầu trẩu là một loại dầu thương mại quan trọng. Phần lớn các axit béo đa nối đôi liên hợp trong tự nhiên thường tồn tại dưới 7 dạng đồng phân của axit octadecatrienoic. Trước đây đã có thời gian người ta cho rằng chỉ có 1dạng của axit này tồn tại, nhưng gần đây nhờ phổ 13 C- NMR phân giải cao và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã chỉ ra rằng các axit béo đa nối đôi liên hợp khác nhau bởi chính các dạng đồng phân cis (Z) hoặc trans (E) của chúng. Điều đó được chỉ ra trên phổ tử ngoại UV, chúng có nhiệt độ nóng chảy cao và thường tồn tại dưới dạng không no cấu hình trans (E). Tính đặc biệt của dầu hạt sồi (Sapium sebierum) là trong một vài dạng glyxerit của nó có chứa 4 nhóm RCO (axyl), bao gồm 2 axit C18 thông thường, một axit C8 hydroxy allenic và 1 axit deca-2E,4Z-dienoic. Dạng glyxerit trong dầu hạt sồi có công thức như sau: CH2OCO(CH2)7CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH3 CHOCO(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3 CH2OCO(CH2)3CH=C=CHCH2OCOCH=CHCH=CH(CH2)4CH3 13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Mặc dù các axit béo mạch nhánh có mặt nhiều trong tự nhiên, nhưng chúng thường tồn tại như những thành phần phụ và hiếm khi chúng có số lượng đáng kể trong các axit béo tổng. Hầu hết kiểu nhánh chỉ là một nhóm metyl. Các axit với một nhóm metyl ở các vị trí hai hoặc ba [n-2 (izo axit), n- 3 (anteiso axit)], hoặc có thể ở vị trí khác. Các axit có nhiều hơn một nhóm metyl thường gắn với các nguyên tử cacbon chẵn. Đây là sự giải thích về mặt sinh tổng hợp cho hầu hết các cấu trúc chung của các axit béo mạch nhánh. Các axit béo có mạch vòng là các axit béo tồn tại trong tự nhiên mà trong phân tử có chứa cacbon mạch vòng gồm 3 nguyên tử cacbon (cyclo propan), chúng thường có mặt trong dầu hạt họ thông, tùng. Các axit béo cyclopropanyl cũng thường xuất hiện nhiều trong phốtpholipit màng vi khuẩn, chúng cũng thường đi kèm axit cyclopropenyl có trong thành phần axit béo của dầu các hạt thực vật. Trong tự nhiên các axit béo với nhóm chức khác nhóm cacboxyl và một hoặc nhiều dạng khác của axit béo không no thì thường gặp, tuy nhiên phổ biến hơn cả là dạng hydroxy axit và eproxy axit. Các epoxy axit và furanoic axit là các axit béo có chứa vòng epoxy hoặc vòng furan trong phân tử, chúng có mặt trong thành phần một số dầu hạt thực vật, thường tồn tại ở dạng triaxylglyxerol và trong cutin mà ở đó chúng tồn tại dưới dạng polyme của các hydroxy axit. Bảng 1.1. Các dạng axít béo no thường gặp trong tự nhiên [7] Số nguyên tử C Tên hệ thống khoa học Tên thông dụng Điểm chảy Mpt. ( 0 C) Phân bố trong tự nhiên 2 n-Ethanoic Acetic 16,7 Phổ biến dạng ancol acetate có 14 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên nhiều trong thực vật và một vài triglycerit thực vật. Thường they trong dạ cỏ động vật dưới dạng muối 3 n-Propanoic Propionic -22.0 Thường thấy trong dạ cỏ động vật 4 n-Butanoic Butyric -7,9 Thường gặp trong dạ cỏ và sữa béo của động vật nhai lại 8 n-Octanoic Caprylic 16,7 Cấu phần thứ yếu trong mỡ động vật thực vật 10 n-Decanoic Capric 31,6 Cấu phần thứ yếu 12 n-Dodecanoic Lauric 44,2 Phân bố rải rác, là cấu phần quan trọng trong thành phần dầu 1 vài hạt thực vật, sinh vật biển 14 n-Tetradecanoic Myristic 54,1 là cấu phần quan trọng của các đối tượng trong thiên nhiên 16 n-Hexadecanoic Palmitic 62,7 Là cấu phần quan trọng hay gặp trong tự nhiên và là một trong những axít béo phổ biến nhất của quá trình sinh tổng hợp chất béo trong thực vật, động vật biển. 18 n-Octadecanoic Stearic 69,9 Là cấu phần quan trọng trong dầu béo thiên nhiên 20 n-Eicosanoic Arachidic 75,4 Là cấu tử thứ yếu đôi khi đóng vai trò rất quan trọng ở một vài 15 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên đối tượng như sinh vật biển 22 n-Docosanoic Behenic 80,0 Tham gia vào thành phần triglycerit của dầu một số hạt thực vật 24 n-Tetracosanoic Lignoceric 84,2 Khá phổ biến ở triglycerit của dầu hạt các loài thực vật biển 26 n-Hexacosanoic Cerotic 57,7 Phổ biến là cấu của dầu hạt thực vật và nhựa sáp của côn trùng, sâu bọ 28 n-Octacosanoic Montanic 90,9 Cấu phần quan trọng của một vài loài sáp thực vật, sinh vật biển Bảng 1.2: Các axít béo không no thường gặp trong tự nhiên [7] Số ng tử C Tên hệ thống khoa học Tên thông dụng Điểm chảy ( 0 C) Phân bố trong tự nhiên 16 Axít béo 1 nối đôi tran-3- hexadecenoic cis-5- hexadecenoic cis-7- hexadecenoic -Có trong lá cây thực vật, đặc biệt là cấu phần chính của phosphatidylglycerol -Có trong thực vật, khuẩn que -Có trong dong tảo, thực vật bậc cao, vi khuẩn 16 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên cis-9- hexadecenoic Palmitoleic -Phổ biến trong động vật, thực vật, tổ chức vi sinh vật, là cấu phần chủ yếu của một vài loài hạt thực vật 18 cis-11- hexadecenoic cis-9-octadecenoic cis-11-ctadecenoic Palmivacceni c Oleic Vaccenic 10,5 13,0 -Có trong dầu các hạt thực vật. -Phổ biến hầu hết trong các động vật, thực vật và tổ chức vi sinh vật -Có trong E-coli và các vi khuẩn khác 16 18 Axít béo 2 nối đôi cis,cis-7,10- hexadecadienoic cis,cis-9,12- hexadecadienoic cis,cis-6-9- octadecenoic cis,cis-9-12- octadecenoic Linoleic -5,0 Phổ biến trong thực vật, rong, tảo… -Cấu tử thứ yếu Cấu phần thứ yếu ở động vật sống. -Cấu phần chủ yếu trong lipit thực vật, ở động vật và con người, nó chỉ bổ xung vào qua con đường thức ăn rau quả hoặc dầu mỡ thực vật và sinh vật biển Axít béo 3 nối đôi 17 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 18 16 16 20 (Phân cách đều đặn bởi một nhóm metylen) all-cis-7,10,13- hexadecatrienoic all-cis-6,9,12- octadecatrienoic all-cis-9,12,15- hexadecatrionic Axít béo 3 nối đôi (nối đôi liên hợp) Cis-9,trans- 11,trans-13- octadecatrienoic Axít béo 4 nối đôi all-cis-4,7,10,13- hexadecatrionic all-cis-5,8,11,14- eicosatetraenoic ó-Linoleic ỏ-Linolenic Elecostearic Arachidonic -11 44 -49,5 -Có ở thực vật bậc cao và rong tảo biển -Là cấu phần thứ yếu trong động vật và một vài loài rong biển.Là cấu thành rất quan trọng của một vài loài thực vật -Phổ biến ở thực vật bậc cao và rong tảo biển, là cấu phần đặc biệt của galatosyl diglycerit. -Có trong dầu hạt một số loài cây đặc biệt dầu trẩu -Là cấu phần quan trọng của lipit động vật và một vài rong tảo biển. Đặc biệt là thành phần chủ yếu của phospholipit Axit béo 5 nối đôi 18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 22 All-cis- 7,10,13,16,19- Docosapentaenoic Axít béo 6 nối đôi All-cis- 4,7,10,13,16,19- docosahexanenoic clupanodonic DHA Phổ biến ở động vật sống, đặc biệt tham gia cấu thành phospholipit, rất đa dạng ở trong mỡ cá biển Phổ biến ở động vật sống, đặc biệt tham gia cấu thành phospholipit, rất đa dạng ở trong mỡ cá biển Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 CHƢƠNG 2: PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phƣơng pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu là quả của cây Ké đầu ngựa được thu hái vào cuối tháng 8 đầu tháng 9 năm 2006 tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên. Quả Ké đầu ngựa còn được gọi là Thương nhĩ tử (Trung Quốc). Có tên khoa học là Xanthium strumarium L., thuộc họ Cúc Asteraceae [5]. Mẫu quả tươi thu hái về (16kg), đưa đi sấy ngay ở nhiệt độ 1100 C khoảng 10 phút để diệt men. Sau đó sấy khô ở 50-600 C cho tới khi độ ẩm nhỏ hơn 10% thu được 8.8kg mẫu khô. Mẫu khô được nghiền nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng etanol 900 ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết lần lượt bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, etylaxetat và metanol. Các dịch chiết được đuổi kiệt dung môi bằng thiết bị cô quay ở nhiệt độ khoảng 500 C dưới áp suất giảm. Các cặn thô được đưa lên các loại cột sắc ký khác nhau để phân lập các chất có trong từng phân đoạn và thường phải kết hợp nhiều phương pháp khác nhau như: dùng hệ dung môi chạy cột có độ phân cực tăng dần để phân ly các chất có độ phân cực gần giống nhau, kết hợp với kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong dung môi thích hợp. Riêng cặn thô n-Hexan được metyl hoá (este hoá) bằng MeOH xúc tác HCl. Đun hồi lưu khoảng 8 tiếng, sau đó trung hoà bằng NaHCO3 cho đến pH = 7, chiết 3 lần bằng n-Hexan. Dịch chiết tổng cô khô và được đưa đi phân tích bằng thiết bị GC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Hình 2.1. Cây Ké đầu ngựa Hình 2.2. Quả Ké đầu ngựa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.1.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Để phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch cô khác nhau của quả Ké đầu ngựa cần phối hợp sử dụng các phương pháp sắc ký và kết tinh lại trong dung môi thích hợp : - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) - Sắc ký cột Silicagel thường 2.1.3. Phƣơng pháp khảo sát và xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Các chất tinh khiết phân lập ra sẽ được xác định những hằng số lý hoá đặc trưng: màu sắc, mùi vị, Rf, điểm nóng chảy, v.v...Sau đó sẽ tiến hành ghi các các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR), cacbon-13 (13C-NMR) với các kỹ thuật một chiều (1D-NMR) và 2 chiều (2D-NMR) tuỳ theo từng hợp chất. 2.2. DỤNG CỤ, HOÁ CHẤT VÀ THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU 2.2.1. Dụng cụ và hoá chất Các loại dung môi dùng để ngâm chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), còn các loại dung môi dùng để chạy sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Loại Silicagel G60 của hãng hoá chất Merck được dùng để tráng ra các loại sắc ký lớp mỏng với các kích cỡ khác nhau trên tấm thuỷ tinh, và được hoạt hoá 4 giờ ở nhiệt độ 1100 C. Ngoài ra các tấm sắc ký lớp mỏng đế nhôm DC-Alufolien Kieselgel 60F254 Art.5554 và đế nhựa (polyme) DC- Plastikfolien Kieselgel 60F254 Art.5735 tráng sẵn, độ dày 0,2mm cũng đã được sử dụng để xác định số thành phần có trong các dịch chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung môi triển khai SKLM. 1. n-Hexan-etylaxetat (2:1) Hệ A Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 2. n-Hexan-etylaxetat (5:1) Hệ B 3. n-Hexan-etylaxetat (8:1) Hệ C 4. Cloroform-metanol (9:1) Hệ D 5. Cloroform-metanol (5:1) Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khô được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK) ở bước sóng =254nm (365nm) rồi được phun bằng thuốc thử Vanilin 1% trong hỗn hợp metanol + H2SO4 đặc và sấy trên 100 0C hoặc đưa vào buồng I2 để xác định thành phần cấu tử. Các giá trị Rf trong hệ dung môi triển khai được biểu thị: RfA(B, C)x100. Sắc ký cột thường sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 230-400 mesh (0,040 đến 0,063mm hoặc 0,1 đến 0,16mm). Các dụng cụ khác được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là: - Cân phân tích. - Máy cất quay chân không. - Bộ chiết Shoxlet. - Bình nón, bình định mức, bình cầu, buret, picromet, pipet - Cột thủy tinh các cỡ có khóa để làm cột sắc ký Hoá chất:  Dung dịch axit sunfuric (H2SO4).  Dung dịch axit chlohiđric (HCl).  Dung dịch axit axetic (CH3COOH).  Tinh thể muối natrisunfat khan (Na2SO4).  Dung dịch Sodium metanolat, axetyl chlorit.  Dung dịch axit HCl 0,5N trong nước  Dung dịch KOH 0,5N trong cồn  Dung dịch KOH 0,1N trong nước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22  Hỗn hợp dung môi ete etylic - cồn 950 (2:1 theo thể tích) 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Boátus (Đức) hoặc trên máy Electrothermal IA-9200. - Góc quay cực []D đo trên máy Polartronic-D, chiều dài cuvet = 1cm. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT-410 (Viện Hoá học - TTKHTN & CNQG) dạng viên nén KBr. - Phổ khối lượng ghi trên máy MS-Engine-5989-HP ion hoá bằng va chạm electron (EI-MS) 70eV, và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/WILLEY 250L. Phổ FAB-MS(NaCH3COO) ghi trên máy LC- MS-Trap-00127. - Phổ 1H-NMR và 13C-NMR ghi trên máy Bruker 500MHz (Viện Hoá học –Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam ) hoặc Bruker 200MHz, 400MHz AVANCE (Bruker) nội chuẩn TMS, dung môi CDCl3 , DMSO-d6 hoặc C5H5N-d5. - Phổ GC-MS ghi trên máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột: BFX70 (50Mx0.32MM x 0.25uM). Carrier: N2, Pressure cant: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min, H2:35ml/min. Chương trình chạy nhiệt độ: 850(0/min.) -1500(10/min) -2000(10/min) - 230 0 (5/min). 2.3. CÁC DỊCH CHIẾT TỪ QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) 2.3.1 Các dịch chiết. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Quả Ké đầu ngựa đã sấy khô, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol ở nhiệt độ phòng cho đến khi thu được dịch không màu. Dịch chiết được cất loại dung môi ở áp suất giảm đến dạng cao lỏng, sau đó lần lượt chiết với các loại dung môi: n-hexan, etylaxetat và metanol. Các dịch chiết nói trên được làm khan bằng Na2SO4, lọc và cất kiệt dung môi bằng cô quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 500 C. Cặn được sấy khô và cân để xác định trọng lượng. Như vậy từ quả Ké đầu ngựa thu nhận được 3 phân đoạn là n-hexan, etylaxetat, metanol với các ký hiệu tương ứng là: KĐN.H, KĐN.E và KĐN.M (xem trong sơ đồ 2.1). Kí hiệu: - KĐN.H sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng n-Hexan - KĐN.E sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng EtOAc - KĐN.M sản phẩm thu được từ dịch chiết quả Ké đầu ngựa bằng MeOH Sơ đồ 2.1 Qui trình ngâm chiết mẫu n-hexan EtOAc Mẫu khô nghiền nhỏ 1. n-hexan (KĐN.H) 2. Etylaxetat (KĐN.E) 3. Dịch cái 1.Etanol 2.Cặn + H2O 4. Metanol (KĐN.M) 1.Cô khô 2. Metanol Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Bảng 2.1: Khối lƣợng cặn chiết từng phân đoạn của quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) Bộ phận Khối lượng mẫu (g) Cặn chiết n-hexan (g) EtOAc (g) MeOH (g) KĐN.H KĐN.E KĐN.M Quả 1600 62,7 14,8 93,2 2.3.2 Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (antimicrobial activity). * Đối tượng thử: Các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh kiểm định - Vi khuẩn Gr (-): Pseudomonas aeruginosa (Pa), E. coli (Ec) - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (Bs), Staphylococcus aureus (Sa). - Nấm men : Candida albicans (Ca). Chất tham khảo: Amphotericin B Amoxicilin *Phương pháp thử : Bước1: Pha loãng mẫu thử bằng phương pháp pha loãng đa nồng độ Mẫu ban đầu có nồng độ 20mg/ml được pha loãng bằng các nồng độ khác nhau để thử hoạt tính với các chủng có từ nồng độ 128ỡg/ml; 32ỡg/ml; 8ỡg/ml; 2ỡg/ml; 0,5ỡg/ml đối với chất sạch, 256ỡg/ml; 64ỡg/ml; 16ỡg/ml; 4ỡg/ml; 1ỡg/ml đối với dịch chiết. Bước 2: Thử hoạt tính: Chuẩn bị dung dịch vi sinh vật hoặc nấm với nồng độ 5.105 khi tiến hành thử. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Lấy 10ỡl dung dịch mẫu thử theo các nồng độ đã được pha loãng thêm 200ỡl dung dịch vi sinh vật hoặc nấm, ủ 370 sau 24 giờ, đọc độ đục tế bào trên máy Tecan, xử lý số liệu và tính toán giá trị IC50. Bảng 2.2 Kết quả thử hoạt tính sinh học các dịch chiết từ quả Ké đầu ngựa STT Tên mẫu Tên chủng vi sinh vật kiểm định Ec. Escherichia coli IC50 g/ml Pa: Pseudomonas aeruginosa IC50 g/ml Bs: Bacillus subtilis IC50 g/ml Sa: Staphylococcus aureus IC50 g/ml Ca: Candida albicans IC50 g/ml 01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 Nhận xét : Các mẫu thử không có hoạt tính kháng các chủng vi sinh vật kiểm định trên ở nồng độ < 256 g/ml. 2.3.3 Phát hiện định tính các nhóm chất 2.3.3.1. Các ancaloit Lấy 0,01g cặn chiết của các phân loại, thêm 5ml H2SO4 5%, khuấy đều lọc qua giấy lọc, sau đó lấy vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 1ml nước lọc axit này. Ống 1: cho 1 – 2 giọt dung dịch silicostungtic axit 5%, nếu có tủa trắng và nhiều là dương tính. Ống 2: cho 1 – 2 giọt thuốc thử Dragendorff: nếu thấy xuất hiện màu da cam là phản ứng dương tính. Ống 3 : cho 3 – 5 giọt thuốc thử Mayer: nếu xuất hiện kết tủa trắng là dương tính. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 2.3.3.2. Các sterol Lấy 0,01gam cặn chiết của các phân đoạn cho thêm 2ml NaOH 10% đun trên bếp cách thuỷ đến khô. Hoà tan cặn vào 2ml Clorofoc, sau đó thêm một giọt thuốc thử Liebermann - Burchard (hỗn hợp 1ml anhyđric axetic+ 1ml cloroform để lạnh ở 00C sau đó thêm 1 giọt H2SO4 đậm đặc). Nếu thấy giữa hai lớp chất xuất hiện các màu xanh nhạt (có thể có màu lục, cam, hồng hoặc đỏ) bền vững trong một thời gian là dương tính. 2.3.3.3. Các flavonoit Lấy 0,01g cặn chiết của các phân đoạn, thêm 10ml Metanol , đun nóng cho tan hết rồi lọc qua giấy lọc . Lấy 2ml dung dịch trên cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Magiê kim loại, sau đó cho vào 5 giọt HCl đậm đặc. Đun trong bình cách thuỷ vài phút, quan sát thấy dung dịch xuất hiện màu đỏ hoặc hồng là dương tính với các flavonoit. 2.3.3.4. Các saponin. Chuẩn bị các dung dịch thử như 2.3.3.3. Lấy 2ml dịch thử cho vào ống nghiệm cao 25cm, rồi thêm 25ml nước cất, bịt miệng ống nghiệm và lắc trong vòng 5 phút theo chiều dọc, quan sát sự xuất hiện và mức độ bền của bọt (nếu bọt cao quá 3 - 4cm và bền trên 15 phút là có dấu hiệu dương tính). Dung dịch không tạo bọt là phản ứng âm tính. 2.3.3.5. Các Cumarin Dung dịch để thử định tính được chuẩn bị như mục 2.3.3.3. Lấy vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml dung dịch thử, cho vào một trong hai ống đó 0,5ml NaOH 10%. Đun cả hai ống trên bếp cách thuỷ đến sôi, lấy ra để nguội rồi mỗi ống lại cho thêm 5ml nước cất. Nếu chất lỏng ở ống nghiệm có kiềm trong hơn ống không có kiềm có thể xem là dương tính. Nếu đem axit hoá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 ống có kiềm bằng một vài giọt HCl đặm đặc sẽ làm cho dung dịch đang trong xuất hiện vẩn đục và có thể tạo kết tủa là dương tính. 2.3.3.6. Các tanin. Lấy 0,01gam chiết phẩm, thêm 10ml nước cất, khuấy đều, nhỏ 2 đến 3 giọt FeCl3 5%, nếu có màu xanh lục hoặc đen là dương tính. 2.3.3.7. Các glucozit trợ tim Cần thực hiện 02 phản ứng Phản ứng Kellere – Kaliani: Thuốc thử gồm 2 dung dịch: Dung dịch 1: 100ml axit axetic loãng + 1ml FeCl3 5% Dung dịch 2: 100 ml H2SO4 đậm đặc + 1mlFeCl3 5% Cách làm : Lấy 0,01 gam cặn chiết các phân đoạn cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 1ml dung dịch 1, lắc đều cho tan hết, nghiêng ông nghiệm rồi cho từ từ 1ml dung dịch 2 theo thành ống nghiệm, quan sát sự xuất hiện màu đỏ hay nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng. Nếu không thấy xuất hiện màu là phản ứng âm tính với các glucosit tim vì các glucozit tim luôn luôn có mặt các desoxysacarit. Phản ứng Legal : Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dịch thử , thêm vào 1 giọt dung dịch prussiat 0,5% và 2 giọt NaOH 10% nếu thấy xuất hiện màu đỏ là dương tính với vòng butenolid. Bảng 2.3. Phát hiện định tính các nhóm chất STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn KĐN.H KĐN.E KĐN.M 1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + + 2 Sterol Liebermanm-Burchard + + + 3 Flavonoit Xianidin - - - 4 Saponin Tạo bọt - + + 5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - + Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 Chiết n - hexan Chiết Etylaxetat Cất loại dung môi Cất loại dung môi GC - MS Sắc ký cột Silicagel Sắc ký cột Silicagel 6 Tanin FeCl3 5% - - + 7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - - 2.4. PHÂN LẬP VÀ TINH CHẾ CÁC CHẤT Sơ đồ 2.2. Sơ đồ chung nghiên cứu một số thành phần hoá học quả Ké đầu ngựa thuộc chi Xanthium strumarium L. Metyl hoá Dịch chiết n- hexan Dịch chiết Etylaxetat Dầu béo Cặn chiết Etylaxetat Xác định hàm lượng và TP axit béo Căn chiết n- hexan Chiết Shoxlet 1. n - hexan 2. Etylaxetat KĐN.H8 KĐN.E33 Quả Ké đầu ngựa sấy khô, nghiền nhỏ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 2.4.1. Phân tích thành phần các axít béo trong dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa trên GC. Hàm lượng lipit tổng: % (so với trọng lượng mẫu tươi) Thành phần axit béo được xác định dưới dạng metyl este trên sắc ký khí GC theo phương pháp tiêu chuẩn ISO/FDIS 5509:1998, LB Đức. Trong thực nhiệm 10mg dầu béo được hoà tan với 1ml n-Hexan lắc kĩ trong lọ nhỏ, nút kín. Bổ xung 25ml dung dịch CH3ONa trong metanol (2mol/l) và lắc kĩ trong 1 phút Bổ xung 1ml nước cất vào, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Hút lớp sáp không phản ứng ở dưới loại đi. Bổ xung 100 ml HCl, lắc kĩ và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Loại bỏ kiệt lớp bẩn dưới đáy, lớp dung môi trên được làm khan bằng Na2SO4 và phân lớp bằng ly tâm 3000 vòng/phút. Chuyển mẫu đã metyl hoá sang ống mẫu đem phân tích thành phần axit béo bằng máy sắc kí khí . * Điều kiện phân tích GC mẫu methyl este axit béo: Máy sắc ký khí Finigan Trace GC ultra-Colum, cột: BPX70 (50Mx0.32MM x 0.25uM). Carrier: N2, Pressure const: 1000kPa, split 15:1, Air: 350ml/min, H2:35ml/min Chương trình nhiệt độ: 850 (0/min) -1500 (10/min) -2000(10/min) - 230 0 (5/min). Bảng 2.4. Kết quả thành phần axit béo 88 x100% = 4,4% 2000 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 (Phổ và điều kiện phân tích máy GC kèm theo) TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu(R1) Hàm lƣợng (%) 1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03 2 C15:0 Axit pentadecanoic - 13.00 0.35 3 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28 4 C18:1(n-9) Axit cis-9-Octadecenoic Oleic 25.72 27.67 5 C18:2(n-6) Axit 9,12-Octadecadienoic Linoleic 27.90 23.21 6 C18:3(n-6) Axit 6,9,12-Linolenic Linolenic 28.39 38.60 7 C19:1(n-9) Axit 10-nonadecaenoic - 28.44 5.24 8 C22:5(n-3) Axit 5,8,11,14,17- Docosapentaenoic DPA 53.60 0.24 9 others 0.84 Tổng các axit béo no 4.2 Tổng các axit béo không no 94.96 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 2.4.2. Phân lập và tinh chế các chất trong dịch chiết n-Hexan; Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa bằng phƣơng pháp sắc ký cột. 2.4.2.1.β – Sitosterol (KĐN.H8) Lấy 62,7g cặn chiết n- hexan đem tách trên cột có đường kính 1,5 cm dài 45 cm, với chất hấp phụ là silicagel khối lượng 100g, có kích thước hạt 60m – 100 m, dung môi rửa giải là n – hexan: etylaxetat với tỷ lệ etylaxetat tăng dần từ 0% - 100%. Các phân đoạn thu được từ cột được kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi triển khai là n – hexan: etylaxetat (8: 1), hiện màu bằng thuốc thử vanilin/H2SO4 10%. Sơ đồ 2.3 Phân lập chất từ dịch chiết n-Hexan của quả Ké đầu ngựa Các phân đoạn có thành phần giống nhau được gộp lại với nhau và đem cất loại dung môi thu được 8 phân đoạn với nhiều cấu tử khác nhau. Các phân đoạn từ 1 đến 6 và phân đoạn 7 đều là hỗn hợp, riêng phân đoạn 8 (rửa giải cột bằng hỗn hợp n – hexan: etylaxetat (20: 1)) có Rf C là 32, cất loại dung môi thu khối chất rắn vô định hình màu vàng nhạt, kết tinh lại trong axeton thu được 0,9870g những tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 138-1400C. KĐN.H 62,7g Silicagel n-Hexan:EtOAc (20:1) KĐN.H8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Phổ FT-IR (KBr): ớmax(cm -1): 3426 (rộng, mạnh); 2983; 2932; 2868; 1651 (yếu); 1464; 1384; 1064, 804. Phổ EI-MS, m/z (%): 414 [M]+ (20), 413 [M-1]+ (41), 398 (28), 397 (100), 395 (32), 383 (11), 361 (11), 257 (3), 255 (6,3), 151 (5,6), 139 (11). Phổ 1H-NMR (200MHz, CDCl3,  (ppm): 5,31 (1H, dd, J=5 Hz và 2 Hz, H-6); 3,51 (1H, m, H-3); 0,84 (3H, d, J29-27 = 6,6Hz, H-29); 0,81 (3H, d, J28-27 = 6,6Hz, H-28); 0,92 (3H, d, J21-20 = 6,6Hz, H-21); 0,85 (3H, t, J26-25 = 7,1Hz, H-26); 0,68 (3H, s, H-19); 1,01 (3H, s, H-18). Phổ 13C -NMR (50MHz, CDCl3),  (ppm): 37,3 (t, C-1); 31,7 (t, C-2); 71,8 (d, C-3); 42,3 (t, C-4); 140,8 (s, C-5); 121,7 (d, C-6); 31,9 (t, C-7); 33,9 (d, C-8); 50,2 (d, C-9); 36,5 (s, C-10); 21,1 (t, C-11); 39,8 (t, C-12); 37,8 (s, C-13); 56,8 (d, C-14); 24,3 (t, C-15); 28,3 ( t, C-16); 56,1 (d, C-17); 11,9 (q, C-18); 19,4 (q, C-19); 36,2 (d, C-20); 18,8 (q, C-21); 29,5 (t, C-22); 26,2 (t, C-23); 45,9 (d, C-24); 29,2 (d, C-25); 19,8 (q, C-26); 19,1 (q, C-27); 23,1 (t, C-28); 11,9 (q, C-29). 2.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33). Lấy 14,8g cặn chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa đem tách trên cột silicagel với khối lượng 70g. Cột có đường kính 2,5 cm, dài 45 cm. Rửa giải cột bằng hỗn hợp dung môi Cloroform: metanol với tỷ lệ metanol tăng dần từ 0 – 100%. hệ dung môi chạy bản mỏng là Cloroform: metanol (5:1). Hiện màu bằng thuốc thử vanilin/ H2SO4 10%, thu được tất cả 33 phân đoạn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Sơ đồ 2.4 Phân lập chất từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa Phân đoạn 33 (rửa giải cột bằng cloroform: metanol (95:5)), sau khi cất đuổi dung môi và kết tinh lại trong etylaxetat/metanol, rửa lại bằng axeton thu được 0,007 g khối chất rắn vô định hình, nóng chảy ở 273 - 2750C, Rf E=35 Phổ 1H-NMR (CDCl3/MeOD, 500MHz,): (ppm) 0,71 (3H, s, Me-18); 0,77 (3H, s, Me-19); 5,36 (1H, H-6); Phổ 13C – NMR (125 MHz, DMSO – d6); (ppm): 140,41 (s, C-5) ; 121,12 (d, C-6); 100,76 (d, C-1’); 76,89 (d, C-3’); 76,73(d, C - 5’); 76,69 (d - C3); 73,42 (d, C - 2’); 70,01 (d, C- 4’); 61,06 (t, C - 6’); 56,13 (d, C - 14); 55,39 (d, C-17); 50, 53 ( d, C-9); 49, 56 (d, C- 24); 45, 11 (s, C – 13); 40, 92 (t, C – 4); 39, 76 (t, C- 12); 36, 78 (t, C – 1); 35, 43 (s, C - 10); 33, 31 (d, C- 20); 31, 37 (t, C- 22); 31, 32 (d, C- 8); KĐN.E 14,8g KĐN.E33 Silicagel Clorofom:metanol (95:5) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 29, 22 (t,C – 16); 28, 68 (t, C- 23); 27, 73 (t, C- 2); 25, 43 (t, C-25); 23, 80 (t, C- 15); 22, 572 (t, C – 28); 21, 05 (t, C–11); 20,86 (d, C–27); 19, 64 (q, C- 19); 19, 04 (q, C–26); 12, 05 (q,C– 29); 11, 73 (q, C – 18). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 CHƢƠNG3 THẢO LUẬN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN TẮC CHUNG Để phân lập được các hợp chất trong bất kỳ một thực vật nào mà không làm ảnh hưởng tới thành phần hoá học có trong nó thì trước khi ngâm chiết bằng dung môi hữu cơ, mẫu thực vật phải được đưa đi khử men ngay sau khi thu mẫu và sấy khô ở điều kiện thích hợp. Về nguyên tắc việc ngâm chiết mẫu thực vật có thể tiến hành theo 2 cách phổ biến sau [4]. 1. Chiết và phân lập các hợp chất từ mẫu thực vật bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần: ete dầu hoả hoặc n-hexan, cloroform, etylaxetat, metanol hoặc etanol v.v.... 2. Chiết tổng bằng các ancol (metanol, etanol) hay hệ dung môi ancol/nước. Sau đó tách loại các hợp chất bằng các loại dung môi có độ phân cực tăng dần như phương pháp 1 để thu được các dịch chiết có chứa các hợp chất có độ phân cực tương đối giống nhau. Việc chiết mẫu quả Ké đầu ngựa được thực hiện theo phương án 2. (Sơ đồ 2.1). Các dịch chiết thô đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) giúp cho việc định hướng tìm kiếm các hoạt chất trong những dịch chiết có phản ứng dương tính với các biotest. Kết quả thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định cho biết một số dịch chiết có hoạt tính mạnh với vi sinh vật kiểm định. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 3.2. PHÁT HIỆN CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG DỊCH CHIẾT N – HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT METANOL CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) Việc phát hiện định tính các nhóm chất trong dịch chiết n-hexan và dịch chiết etylaxetat của quả Ké đầu ngựa, được tiến hành thực nghiệm như ở mục 2.3.3. Kết quả thực nghiệm thu được chỉ ra ở bảng 2.3 như sau: Bảng 2.3 Phát hiện định tính các nhóm chất STT Nhóm chất Phản ứng đặc hiệu Kết quả thử các phân đoạn KĐN.H KĐN.E KĐN.M 1 Ancaloit dd silicostungtic axit 5% + + + 2 Sterol Liebermanm-Burchard + + + 3 Flavonoit Xianidin - - - 4 Saponin Tạo bọt - + + 5 Cumarin Tác dụng kiềm và axit - - + 6 Tanin FeCl3 5% - - + 7 Glucozit trợ tim Kelle-Kaliani - - - 3.3 KẾT QUẢ THỬ HỌAT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH DỊCH CHIẾT N-HEXAN, DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT VÀ DỊCH CHIẾT ETYLAXETAT CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA (XANTHIUM STRUMARIUM L.) . Việc nghiên cứu hoá thực vật của bất kỳ 1 loài thực vật (hay những bài thuốc dân gian) nào thường được bắt đầu bằng việc thử hoạt tính sinh học các loại dịch chiết cô của nó, nhằm định hướng cho việc phân lập các hoạt chất có trong cây. Các mẫu nghiên cứu được đem thử nghiệm với các phản ứng sinh học (biotest) và hoá học đặc hiệu sẽ cho biết chúng có những hoạt tính gì và lớp chất nào có trong thực vật. Kết quả thử hoạt tính sinh học giúp cho việc định Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 hướng tìm kiếm hoạt chất, lựa chọn các phân đoạn ưu tiên để phân lập và nhận dạng cấu trúc hoá học của hoạt chất. Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n-hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa được thực hiện tại phòng Thử nghiệm hoạt tính Sinh học-Viện Hoá học các hợp chất Thiên nhiên – Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ Quốc gia. Qui trình thử chúng tôi đã trình bày cụ thể ở mục (2.3.2). Kết quả thử nghiệm được trình bày ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của dịch chiết n – hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa. STT Tên mẫu Tên chủng vi sinh vật kiểm định Ec. Escherichia coli IC50 g/ml Pa: Pseudomonas aeruginosa IC50 g/ml Bs: Bacillus subtilis IC50 g/ml Sa: Staphylococcus aureus IC50 g/ml Ca: Candida albicans IC50 g/ml 01 KĐN.H > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 02 KĐN.E > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 03 KĐN.M > 256 > 256 > 256 > 256 > 256 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định cho thấy : dịch chiết n - hexan, dịch chiết etylaxetat và dịch chiết metanol của quả Ké đầu ngựa đều cho phản ứng âm tính với các chủng vi khuẩn. Điều này chính tỏ rằng các dịch chiết trên của quả Ké đầu ngựa không có khả năng kháng khuẩn. Những công trình nghiên cứu trước đây về khả năng kháng khuẩn của dầu béo một số loài thực vật chi Xanthium strumarium L.cho thấy : trong dầu hạt thưc vật thuộc chi Xanthium strumarium L., có khả năng kháng khuẩn khá cao. Vậy sự khác nhau về kết quả nghiên cứu này, phải chăng nguyên nhân là sự khác nhau về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Trong tài liệu mà chúng tôi thu thập được không thấy tài liệu nào nói về quy trình thu nhận dầu béo từ hạt thực vật. Theo chúng tôi, có thể các nhà nghiên cứu trước đã thu nhận dầu béo từ hạt thực vật bằng phương pháp ép trích li từ hạt, khi đó các hợp chất có chứa trong thành phần của hạt, kể cả những chất có hoạt tính và những chất không có hoạt tính, đều được ép ra cùng với dầu. Chính vì vậy hỗn hợp các chất này đã tạo cho dầu béo Quả Ké đầu ngựa thu được bằng phương pháp này có khả năng kháng khuẩn cao. Còn dầu Quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi tiến hành nghiên cứu được tách ra từ hạt theo phương pháp chiết shoxlet trong các dung môi khác nhau (n-hexan, etylaxetat và metanol) chính vì lẽ đó mà các chất chứa trong dầu béo của quả Ké đầu ngựa được chúng tôi tách chiết ra đã có sự chọn lọc theo độ phân cực tăng dần của dung môi. Kết quả thử hoạt tính sinh học cho thấy không có dịch chiết trong các dung môi n – hexan, etylaxetat, metanol của quả Ké đầu ngựa là có khả năng kháng khuẩn yếu, như vậy chứng tỏ những chất có khả năng kháng khuẩn trong quả Ké đầu ngựa là những chất phân cực. Nhưng trong quá trình chiết quả Ké đầu ngựa chúng tôi mới chỉ dừng lại ở dung môi metanol, nên có thể những chất có độ phân cực cao hơn và có khả năng kháng khuẩn cao chưa được tách ra . 3.4. XÁC ĐỊ NH HÀM LƯỢNG VÀ THÀNH PHẦN HOÁ HỌC CỦA QUẢ KÉ ĐẦU NGỰA. 3.4.1. Các axit béo. Sắc kí đồ của dầu quả Ké đầu ngựa xem ở phụ lục. Bằng phương pháp GC chúng tôi đã xác định được, trong quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nghiên cứu có 9 cấu tử, trong đó có 5 cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1%, 4 cấu tử có hàm lượng axit béo dưới 1% và một số cấu tử khác chưa xác định cấu trúc cũng có hàm lượng axit béo dưới 1%. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 Bảng 3.1: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo trên 1% trong quả Ké đầu ngựa TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu Hàm lƣợng % 1 C16:0 Axit hexadecanoic Palmitic 16.84 3.28 2 C18:1 (n-9) Axit cis-9-Octadecenoic Oleic 25.72 27.67 3 C18:2 (n-6) Axit 9,12- Octadecadienoic Linoleic 27.90 23.21 4 C18:3 (n-6) Axit 6,9,12- Linolenic Linolenic 28.39 38.60 5 C19:1 (n-9) Axit 10- nonadecaenoic - 28.44 5.24 Bảng 3.2: Các cấu tử có hàm lƣợng axit béo dƣới 1% trong quả Ké đầu ngựa TT Axit béo Tên khoa học Tên thƣờng Thời gian lƣu Hàm lƣợng % 1 C10:0 Axit decanoic Caprylic 7.22 0.03 2 C15:0 Axit pentadecanoic - 13.00 0.35 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 3 C22:5 (n-3) Axit 5,8,11,14,17- Docosapetaenoic DPA 53.60 0.24 4 Other 0.84 Trong các cấu tử của quả Ké đầu ngựa mà chúng tôi nhận được qua GC/MS, có 4.2 % cấu tử đã nhận dạng được là các axít béo no, 94.96 % các cấu tử là các axít béo không no. Các cấu tử chưa nhận dạng được đều là các chất có hàm lượng dưới 1%, chúng đều là những chất chưa có kết luận chắc chắn về cấu trúc phân tử. Nhìn chung các axit có số nguyên tử cacbon chẵn và nối đôi có cấu hình dạng cis hoặc Z, định vị bắt đầu từ nguyên tử cacbon số 9 kể từ nhóm cacboxyl hoặc kể từ nhóm metyl (n-9). Đồng phân 9Z được tìm thấy nhiều trong axit hexadecenoic. Nó là một hợp chất có nhiều trong dầu cá và là thành phần chính trong một vài loại dầu hạt. Axit oleic được phân bố rộng dãi nhất trong tất cả axit béo và đại diện cho axit ở dạng một nối đôi. Axit này có hàm lượng khá cao trong quả Ké đầu ngựa. Axit linolenic chiếm hàm lượng cao nhất trong quả Ké đầu ngựa, đây là một loại axit có nhiều trong hầu hết dầu hạt thực vật. Ngoài ra, nó có trong lipit động vật và dầu cá ở mức độ thấp. Axit ó – Linolenic (n-6) – 18:3, là bước chuyển hoá trung gian của axit linolenic tới axit archidonic. Các dầu chứa axit này trong Y học được dùng để chữa trị một số bệnh: Eczema, viêm khớp, xơ cứng động mạch, lão hoá. Dựa vào sắc kí đồ ta thấy: Thành phần chính của quả Ké đầu ngựa là 6,9,12 - Linolenic axit (chiếm 38.60 %); Cis-7-Octadecenoic axit (chiếm 27,67 %); 9,12- Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Octadecadienoic axit (chiếm 23,21 %). Ngoài ra trong thành phần của quả Ké đầu ngựa còn chứa một số axit béo không no khác. Dưới đây là công thức cấu tạo của chất chính có hàm lượng tương đối cao trong quả Ké đầu ngựa. o o 9, 12 - octadecadienoic axit (23,21 %) COOH Oleic axit (27,67%) COOH 9,6,12 – Linolenic axit (38,60 %) 3.4.2. Các hợp chất sterol Những chất có khung steroit được tìm thấy trong các dịch chiết của quả Ké đầu ngựa thường là các sterol C29 với bộ khung 3-ol 5-pregnan hoặc dẫn xuất của nó, trong đó mạch nhánh có cấu hình và cấu dạng khác nhau. Dựa vào các hằng số lý hoá và đặc tính quang phổ của các chất đã phân lập được, so sánh với số liệu phổ của các chất chuẩn, đã chỉ ra những chất dưới đây. 3.4.2.1. -sitosterol hay 24R-stigmast-5-en-3--ol (KĐN.H8) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 Là những tinh thể hình kim không màu cũng thu được từ dịch chiết n- hexan của quả Ké đầu ngựa, điểm nóng chảy 138-1400C. Khi trộn lẫn với chất chuẩn có nhiệt độ nóng chảy không thay đổi. Trong phổ EI-MS, quan sát thấy pic phân tử [M]+ của nó là 414, từ các phổ FT-IR, 1H-NMR và 13C-NMR có thể khẳng định sự có mặt của nhóm hydroxi (OH) : max = 3426 cm-1 (rộng, mạnh), H-3 = 3,53 ppm và C-3 = 71,7 ppm, một nối đôi C=C : max = 1651cm-1 (yếu), H-6 = 5,35 ppm (d), J=5Hz, C-5 = 140,7 ppm và C-6 = 121,7 ppm. Sơ đồ 3.1: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8 H O m/z = 414 H O m/z = 329 m/z = 396 CH2 H O m/z = 273 m/z = 381 - H2O - 15 - C4 H8 - H2O - C6H13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 Các số liệu về phổ FT-IR, MS, NMR và các hằng số vật lý của hợp chất này hoàn toàn phù hợp với -sitosterol. Bảng 3.3: Số liệu phổ 13C-NMR (CDCl3, 125Mhz) của õ-sitosterol STT -sitosterol ppm 1 37.3 t 2 31.7 t 3 71.8 d 4 42.3 t 5 140.8 s 6 121.7 d 7 31.9 t 8 31.9 d 9 50.2 d 10 36.5 s 11 21.1 t 12 39.8 t 13 42.3 s 14 56.8 d 15 24.3 t m/z = 255 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 STT -sitosterol ppm 16 28.3 t 17 56.1 d 18 11.9 q 19 19.4 q 20 36.2 d 21 18.8 q 22 33.9 t 23 26.1 t 24 45.9 d 25 29.2 d 26 19.1 q 27 19.4 d 28 23.13 t 29 11.9 q 3.4.2.2. 3-O--D-glucopyranosyl--sitosterol (KĐN.E33) Chất rắn ở dạng vô định hình, không tan trong cloroform, metanol, dễ tan trong hệ dung môi cloroform / metanol, nóng chảy ở 273- 275 0 C. Phổ 13C-NMR quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử cacbon, trong đó có 7 nguyên tử cacbon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,1ppm đến 100,8ppm). Hai tín hiệu ở 140,41 và 121,12ppm thuộc về một liên kết olefin. Phổ 1H- NMR xác nhận sự có mặt của một liên kết đôi ở 5,36 ppm và của nhóm hydroxy ở vùng 3,5ppm đến 4,0 ppm. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Số liệu từ các phổ 1H- NMR, phổ 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến cấu trúc của hợp chất glucozit có công thức C35H60O6. Đem chất này thuỷ phân trong axit loãng đã thu được -sitosterol, đồng thời trong phổ cũng thấy mất đi tín hiệu của gốc đường. Điều này cũng chứng tỏ rằng một phân tử đường đã bị loại ra khỏi phân tử -sitosterol glucozit. Các số liệu phổ thực nghiệm thu được so với số liệu phổ chuẩn đã khẳng định chất rắn vô định hình nóng chảy ở 273-2750C chính là -sitosterol-3-O--D- glucopyranosyl. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 14 56,79 (d) 56,75 15 24,32 (t) 24,15 16 28,26 (t) 28,25 17 56,09 (d) 56,02 18 0,6 (3H, s) 11,89 (q) 11,84 19 1,01 (3H, s) 19,41 (q) 19,46 20 36,16 (c) 36,07 21 0,92 (3H, d) 18,80 (q) 18,68 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 22 . 33,98 (t) 33,95 23 26,13 (t) 26,10 24 45,88 (d) 45,82 25 29,19 (d) 29,05 26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) 19,77 27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) 19,21 28 23,13 ()t 23,13 29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) 11,04 OH * Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của KĐN.H8 mà chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của (3, 24R)  - sitosterol thấy rằng kết quả tơng đối giống nhau. Tuy nhiên một vài số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau. Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của  - Sitosterol mà dữ liệu phổ đa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau. Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng phân mảnh của KĐN.H8 có thể xảy ra như sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Sơ đồ 3: Sự phân mảnh EI – MS của chất KĐN.H8 H O m/z = 414 H O m/z = 329 m/z = 396 CH2 - H2O - 15 - C4 H8 - C6H13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 19 11 12 18 14 13 17 16 15 20 21 23 22 24 25 26 27 28 * Tóm lại : Qua việc phân tích các số liệu phổ, kết hợp với các đặc trưng vật lý, các tài liệu, một lần nữa chúng tôi khẳng đị nh rằng chất KĐN.H8 mà chúng tôi phân lập được là (3, 24 R)  - sitosterol có công thức phân tử là C29 H50 O, và có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên. 3.4.2.2.  - Sitosterol glucosid ( - Sitosterol –3 – o -  - D - Glucopyranosyl). - Chất rắn vô định hình không màu (KĐN.E33) không tan trong cloroform, axeton dễ tan trong metanol. tonc = 282 – 283. Rf = 35. Phổ FT – I R (viên nén KBr) có các vân hấp thụ đặc trưng sau m/z = 255 R O Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 3390 cm -1 (mạnh, rộng) ứng với dao động hoá trị của nhóm hiđroxyl (- OH) 2934, 2960 cm -1 (mạnh) CH ứng với dao động hoá trị của các nhóm – CH3 và > CH2 no. 1640 cm -1 (yếu) C = C ứng với dao động hoá trị > C = C < an ken 1461 cm -1 (trung bình) CH ứng với dao động biến dạng của các nhóm > CH2 và - CH3 1373 cm -1 (trung bình) CH3 ứng với dao động biến dạng mới xứng của nhóm – CH3 (xem phụ lục). - Phổ 1H – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: 3,648 (1H, m, - CH – OH); 5,330 (1H, t, > CH -). - Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome” (H–1’) của hexosa xuất hiện dưới dạng doublet tại 4,32 ppm, có J = 7,8 Hz, và c – 1’ tương ứng là 100,8 ppm. - Phổ 13C – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: có hai tín hiệu ở 140, 56 (s, C - 5) và 121,33 (d, C – 6) thuộc về một liên kết olephin. - Ngoài ra với các kỹ thuật khác nhau của 13C – NMR đã quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử các bon, trong đó có 7 nguyên tử các bon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,20 – 100,8 ppm) - Từ số liệu của các phổ IR, MS, 1H và 13C – NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến của 1 hợp chất glucozit có công thức phân tử C35 H60 O6. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được  - sitosterol đồng thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác nhận một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 - Từ những dữ kiện trên và đem tiến hành đo điểm nóng chảy với hỗn hợp chất mẫu, thấy không có sự thay đổi, đã cho phép khẳng định chất (KĐN.E33) đã thu được từ dịch chiết Etylaxetat của quả Ké đầu ngựa là  - sitosterol – 3 – O -  - D – glucopyranosyl. 31,69 (t) CH2 31,63 71,84 (d) CH 71,73 42,29 (t) CH2 42,20 140,78 (s) C 140,71 121,74 (d) CH 121,63 31,94 (t) CH2 31,90 31,95 (d) CH 31,81 50,17 (d) CH 51,13 36,53 (s) C 36,43 21,11 (t) CH2 21,09 39,81 (t) CH2 39,79 42,33 (s) C 42,37 56,79 (d) CH 56,75 24,32 (t) CH2 24,15 28,26 (t) CH2 28,25 56,09 (d) CH 56,02 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52 11,89 (q) CH3 11,84 19,41 (q) CH3 19,46 36,16 (c) CH 36,07 18,80 (q) CH3 18,68 33,98 (t) CH2 33,95 26,13 (t) CH2 26,10 45,88 (d) CH 45,82 29,19 (d) CH 29,05 26 0,81 (3H, d) 19,05 (q) CH3 19,77 27 0,88 (3H, d) 19,41 (q) CH3 19,21 28 23,13 ()t CH2 23,13 29 0,83 (3H, d) 11,99 (q) CH3 11,04 OH * Nhận xét: So sánh độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của BĐQ mà chúng tôi phân lập được với độ chuyển dịch hoá học 13C – NMR của (3, 24R)  - sitosterol thấy rằng kết quả tương đối giống nhau. Tuy nhiên một vài số liệu hơi khác có thể là do chế độ máy chạy khác nhau. Mặt khác trên phổ EI – MS dựa vào các pic cơ bản thấy sự phân mảnh cũng phù hợp với sự phân mảnh của  - Sitosterol mà dữ liệu phổ đưa ra (độ trùng lặp 83%) song pic ion phân tử và các mảnh chính đều tương đương nhau. Dựa vào các kích cơ bản trên phổ EI – MS chúng tôi đưa ra khả năng phân mảnh của BĐQ có thể xảy ra như sau. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 Sơ đồ 3: Sự phân mảnh EI – MS của chất BĐQ H O m/z = 414 H O m/z = 329 m/z = 396 CH2 H O m/z = 273 m/z = 255 m/z = 381 - H2O - 15 - C4 H8 - H2O - C6H13 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 19 11 12 18 14 13 17 16 15 20 21 23 22 24 25 26 27 28 * Tóm lại : Qua việc phân tích các số liệu phổ, kết hợp với các đặc trưng vật lý, các tài liệu, một lần nữa chúng tôi khẳng đị nh rằng chất BĐQ mà chúng tôi phân lập được là (3, 24 R)  - sitosterol có công thức phân tử là C29 H50 O, và có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên 3.4.2.  - Sitosterol glucosid ( - Sitosterol –3 – o -  - D - Glucopyranosyl). - Chất rắn vô định hình không màu (HBĐ) không tan trong cloroform, axeton dễ tan trong metanol. tonc = 282 – 283. Rf = 32. Phổ FT – I R (viên nén KBr) có các vân hấp thụ đặc trưng sau 3390 cm -1 (mạnh, rộng) ứng với dao động hoá trị của nhóm hiđroxyl (- OH) 2934, 2960 cm -1 (mạnh) CH ứng với dao động hoá trị của các nhóm – CH3 và > CH2 no. 1640 cm -1 (yếu) C = C ứng với dao động hoá trị > C = C < an ken 1461 cm -1 (trung bình) CH ứng với dao động biến dạng của các nhóm > CH2 và - CH3 1373 cm -1 (trung bình) CH3 ứng với dao động biến dạng mới xứng của nhóm – CH3 (xem phụ lục ). - Phổ 1H – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: 3,648 (1H, m, - CH – OH); 5,330 (1H, t, > CH -). R O Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 55 - Trong phổ 1H – NMR cũng cho thấy vân hấp thụ dày đặc của nhiều nhóm hiđroxyl, đặc biệt trong phổ NMR cũng quan sát thấy proton “anome” (H–1’) của hexosa xuất hiện dưới dạng doublet tại 4,32 ppm, có J = 7,8 Hz, và c – 1’ tương ứng là 100,8 ppm. - Phổ 13C – NMR (DMSO, 500 MHz), ppm: có hái tín hiệu ở 140, 56 (s, C - 5) và 121,33 (d, C – 6) thuộc về một liên kết olephin. - Ngoài ra với các kỹ thuật khác nhau của 13C – NMR đã quan sát thấy 35 tín hiệu của nguyên tử các bon, trong đó có 7 nguyên tử các bon gắn với oxy (nằm trong vùng 61,20 – 100,8 ppm) - Từ số liệu của các phổ IR, MS, 1H và 13C – NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho phép nghĩ đến của 1 hợp chất glucozit có công thức phân tử C35 H60 O6. Khi đem thuỷ phân chất này bằng axit loãng đã thu được  - sitostrol đồng thời có một mảnh 396 m/z (M – C6 H12 O6), trong phổ EI – MS cũng xác nhận một phân tử hexosa đã bị loại ra khỏi phân tử sitosterol glucozit. - Từ những dữ kiện trên và đem tiến hành đo điểm nóng chảy với hỗn hợp chất mẫu, thấy không có sự thay đổi, đã cho phép khẳng định chất (HBĐ) đã thu được từ dịch chiết metanol của hạt Ba đậu là  - sitostrol – 3 – O -  - D – glucopyranosid. 3.4.3.  - amyrin axetat (urs – 12 – en - 3 - yl axetat) AcO Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 Trong phổ EI – MS quan sát thấy mảnh ion phân tử M+ ở 468 (1,7) m/z và có kiểu phân mảnh giống như urs – 12 – en – 3 – yl axetat [129 mh]. Phổ 13 C – NMR với các kỹ thuật khác nhau đã chỉ ra sự có mặt của 32 nguyên tử các bon (xem bảng ). Bảng : Độ chuyển dịch hoá học 1H – NMR và 13C – NMR của KSQ. STT của nguyên tử cacbon Chất KSQ C (độ bội) H (J, Hz) 1 38,493 (t) 2 23,265 (t) 3 80,975 (d) 4,507dd, J 6.0, 10.6 Hz 4 37,729 (s) 5 55,290 (d) 6 18,263 (t) 7 32,891 (t) 8 40,055 (d) 9 47,6,1 (d) 10 36,817 (d) 11 23,391 (t) 12 124, 344 (d) 5,126t, J 3.6 Hz 13 139,649 (s) 14 42,099 (s) 15 28,115 (t) 16 26,624 (t) 17 33,764 (s) 18 59,092 (d) 19 39,629 (d) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 20 39,673 (d) 21 31,266 (t) 22 41,553(t) 23 28,053 (q) 0,877s 24 16,885 (q) 0,865s 25 15,747 (q) 0,970s 26 16,748 (q) 1,012s 27 23,241 (q) 1,067s 28 28,759 (q) 0,800s 29 17,513 (q) 0,796d, J4.20 Hz 30 21,403 (q) 0,922d, J 5.13 Hz 31 170,996 - 32 121,312 2,046s (Ghi chú : Các dòng để trống trong phổ 1H là các tín hiệu không phân giải hoặc cacbon bậc 4 (không chứa H)). Phổ 1H – NMR chỉ ra sự có mặt của 6 nhóm metyl dạng singlet, 2 nhóm metyl ở dạng doublet trong vùng trường cao (0,79 đến 1,07 ppm) hoàn toàn chứng tỏ đó là một tritecpen kiểu khung ursan. Sự có mặt của nhóm axetyl trong (KSQ) được xác nhận bằng các tín hiệu cộng hưởng proton và cac bon – 13 (2,0460 s; 170,990 s; 21,312q). Các số liệu phổ 13C – NMR (bảng …..) hoàn toàn phù hợp với cấu trúc của urs – 12 – en - 3 - yl axetat hay  - amyrin axetat [91 mH]. Có công thức cấu tạo như đã trình bày ở trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I. KẾT LUẬN 1. Lần đầu tiên quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) mọc hoang tại huyện Phú Lương, tỉnh Thái Nguyên được nghiên cứu sàng lọc hoá thực vật. Một số dịch chiết của quả Ké đầu ngựa được thử hoạt tính với vi sinh vật kiểm định cho thấy không có tác dụng với một số vi sinh vật kiểm định. 2. Từ quả Ké đầu ngựa (Xanthium strumarium L.) chúng tôi đã phân lập được 4 chất hữu cơ tinh khiết, trong đó có hai chất đã được nhận dạng là: KĐN.H8: β-sitosterol KĐN.E33: 3-O-β-D-glucopyranosyl-β-sitosterol Còn 2 chất rắn khác (do thời gian có hạn) đang được ghi các loại phổ để xác định cấu trúc hoá học của chúng. 3. Bằng phương pháp GC so với các chất chuẩn chúng tôi đã xác định được, trong quả Ké đầu ngựa có 9 cấu tử có hàm lượng axit béo cao, trong đó có 5 cấu tử có hàm lượng axit béo trên 1% như: Axit 6,9,12 – linolenic (38,60%), Axit oleic (27,67%), đặc biệt một số axit béo có những hoạt tính sinh học tốt. II. KIẾN NGHỊ Cây Ké đầu ngựa là một loại thực vật mọc hoang dã ở Việt Nam, là một cây thuốc quý, rất phổ biến và có nhiều ứng dụng đối với Y học dân gian. Do điều kiện thời gian có hạn nên dịch metanol của quả Ké đầu ngựa chúng tôi chưa tiến hành phân lập thành phần hoá học được, đặc biệt là thành phần axit béo có trong quả Ké đầu ngựa. Chúng tôi mong muốn được tạo điều kiện tiếp tục nghiên cứu phân lập thành phần axit béo có trong quả Ké đầu ngựa, cũng như các thành phần khác trong dịch chiết MeOH của nó, nhằm làm sáng tỏ thành phần hoá học của quả Ké đầu ngựa, định hướng cho việc sử dụng hữu hiệu loài thực vật này. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tiếng Việt 1. 1900 loài cây có ích ở Việt Nam, NXB thế giới, Hà Nội, (9/1993). 2. Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, (1999). 3. Trần Đình Đại, Khái quát về hệ thực vật Việt Nam, Hội thảo Việt - Đức về hoá học và các hợp chất thiên nhiên, Hà Nội, (1998). 4. Nguyễn văn Đàn, Nguyễn Viêt tựu, Phương pháp nghiên cứu hoá học cây thuốc, NXB Y học chi nhánh thành phố Hồ Chí Minh, (1985). 5. Phạm Hoàng Hộ, Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ, (1999). 6. Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt nam, NXB Y học, (2001). 7. Phạm Quốc Long, Châu Văn Minh, Lipit và các axit béo hoạt tính sinh học có nguồn gốc thiên nhiên, NXB khoa học và kỹ thuật, (2006) 8. Nguồn tài nguyên đa dạng sinh học rừng Việt Nam, Tạp chí Lâm nghiệp,(1997). 9. Sách đỏ Việt Nam, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội , (1996). 10. Ngô Văn Thu, Bài giảng dược liệu, tập 1, Trường Đại học dược Hà Nội, (1998). 11. Nguyễn Quyết Tiến, Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của cây Ráy, luận án tiến sĩ. Hà Nội, (2003). 12. Vnexpress.net, Ké đầu ngựa chữa bệnh hiệu quả cao, Sức khoẻ, (3B9E0855). (2005). B. Tiếng Anh 13. Ageta.I.Goto.S., Hatano, T., Nishibe.S. and Okuda, T., Phytochemistry, (33.508). (1993). 14. C. J. Kelley, R. C. Harruff, M Carmack, J Org.Chem., 41 (3), 449 (1976). 15. Chiu, N. Y. and Chang, K. H., in the Illustrated Medicinal Plants of Taiwan, Vol. l. Southern Materials Center, lnc., Taipei, p.233. (1987) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 16. Chang. H. M, and But, P. P.H., in Pharmacology and Applications of Chinese Materia Medica, Vol. l. World Scientific, Singapore, p. 589. (1986). 17. Editorial Board of China Herbal, State Administration of Traditional Chinese Medicine, China Herbal, 7. Shanghai Science and Technology Press, Shanghai, (1999). 18. Huang, K. C., in The Pharmacology of Chinese Herbs. CRC Press. Boca Raton, p. 160. (1993). 19. N. Isutomu, I. Akira, K. Kazuco, Phytochemistry, 24 (2), 339 (1985) Merfort. I., Phytochemistry. 31, 2111. (1992). 20. Morishita, H., Iwahashi, H, and Osaka, N., Kido, R., J. Chromatogr., 984, 315,325. (2000). 21. Pharmacopoeia of P. R. China (English Edition), Book 1. Chemical Industry Press, Beijing, (2000). 22. Pohl, P. and Wagner, Fette Seifen Anstrichm., 74, 541 (1972) 23. Ting Han, Huiliang Li, Qiaoyan Zhang, HanchenZheng, Luping Qin, “New Thiazinediones and other components from xanthium strumarium”, Xumuò npupoỏohx coeỏueầuŭ, ạ5. (2006). 24. TCVN, 3703-90: Phương pháp xác định hàm lượng mỡ. 25. Takagi T. ct.al., Lipids, 17, p.716, (1982). 26. Turner A., Sereening methods in pharmacology, Academic Press. P.60- 68. (1965). 27. Vickery J.R., J. Am. Oil chem Soc., Vol. 57, P.87-91 (1980). 28. Warnaar,F. Lipids, 12, 707 (1993). 29. WHO: Research guidelines for evaluating the safaty and efficacy of herbal medicines, Manila P. 35-42 (1993). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 30. William W.C., Topics in Lipid Chemitry. Vol. I, F.D (1969). 31. Ying Tsun Ma, Mu Chi Huang, Feng Lin Hsu, “Thiazinedione from Xanthium strumarium”, Phytochemistry, Vol. No. 6, pp. 1083-1085, (1998) Elsevler Science Ltd, All rights reserved Printed in Great Britain 32. Y., I., Chen, L., Xanthium, Flora Reipublicae Populariss Smicae. 75, S cience Press, Beijing, (1979). 33. Youngken H.W: Marine Technology Soc. (1970). Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 PHỤ LỤC 1. Kết quả phân tích mẫu Trang 1.1 Hàm lượng lipit tổng ……………………………………….50 1.2 Thành phần axit béo ………………………………………...50 1.3 Bảng kết quả thành phần axit béo……………………………51 1.4 Sắc kí đồ …………………………………………………….53 2. Các sterol và glucozit 2.1 õ-sitosterol (KĐN.H8) 2.1.1 Phổ EI-MS của β-sitosterol…………………………….54 2.1.2 Phổ FT-IR của β-sitosterol…………………………….55 2.1.3 Phổ 1H-NMR của β-sitosterol………………………...56 2.1.4 Phổ 13C-NMR và của β-sitosterol…………………….57 2.2 õ-sitosterol glucozit 2.2.1 Phổ 1H-NMR β-sitosterol glucozit …………………..58 2.2.2 Phổ 13C-NMR của β-sitosterol glucozit ……………...59 KĐN.E33 - 13C-CPD…………………………..59 KĐN.E33 - 13C-DEPT…………………….62 2.2.3 Bảng số liệu phổ………………………………………..64 3. Phiếu trả kết quả thử hoạt tính kháng sinh……………………………...67