Luận văn Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (d-Loop) hệ gen ty thể của gà ri, gà đông tảo và gà tre

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ---------------0o0--------------- LÊ TIẾN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN (D-LOOP) HỆ GEN TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ĐÔNG TẢO VÀ GÀ TRE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào. Tác giả luận văn Lê Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nông Văn Hải đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tôn, KS. Vũ Hải Chi, CN. Địch Thị Kim Hƣơng và tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Đề tài đƣợc hỗ trợ kinh phí từ đề tài nhánh thuộc đề tài "Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội" do PGS. TS. Lê Thị Thuý, Viện Chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn làm chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Lê Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.1.3. Hoá chất......................................................................................... 23 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu……………………………………….……... 23 2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……..………………….…… 24 2.2.1. Điện di trên gel agarose…………..………………………….…… 24 2.2.2. Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)…………………..……..…..…………………...… 26 2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR……..……….…………...……….…... 28 2.2.4. Giải trình tự vùng D-loop…………………………….….………. 29 2.2.5. Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng.……….……… 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…..………………….………. 31 3.1. Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR……..…………………….. 31 3.2. Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank……..……………....…….…...... 36 3.3. Sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 3 giống gà…..…….……. 56 3.4. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu..….. 56 3.5. So sánh mức độ đa dạng di truyền của 3 giống gà nghiên cứu với một số quần thể gà châu Á……………..……………...…................ 58 3.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại……..………………..….……… 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................... 62 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ................................................................ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO……..……..……………………..…………… 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên NHƢ̃NG CHỮ VIẾT TẮT ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặp bazơ) CJF Gà rừng Cyelon ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate DNase Deoxyribonuclease đtg Đồng tác giả EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide ETOH Ethanol GJF Gà rừng màu xám GrJF Gà rừng màu xanh mtDNA Hệ gen ty thể Nxb Nhà xuất bản PCR Polymerase Chain Reaction RJF Gà rừng đỏ RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease rpm Vòng/ phút TAE Tris – acetate – EDTA Tm Nhiệt độ biến tính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 phƣơng, cùng với sự du nhập của vật liệu di truyền mới do việc nhập khẩu một cách ồ ạt các giống nhập ngoại nên chúng đứng trƣớc nguy cơ bị lai tạp, mất dần. Do đó, vấn đề bảo tồn nguồn gen các giống gia cầm quý là một yêu cầu bức thiết của thực tế. Nghiên cứu đa dạng di truyền các giống vật nuôi là bƣớc đầu tiên trong quy trình tiến tới mục tiêu bảo tồn, cải tiến và sử dụng nguồn giống. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử thì việc nghiên cứu đa dạng di truyền đã đƣợc tiến hành ở cấp độ DNA - vật chất di truyền của sự sống. Cũng nhƣ các loài động vật có xƣơng sống khác, hệ gen của gà cũng gồm hệ gen nhân và hệ gen ty thể (mtDNA). Do kích thƣớc của hệ gen nhân là rất lớn, việc sử dụng các gen trong nhân làm đối tƣợng nghiên cứu đa dạng di truyền có một số nhƣợc điểm. Gen nhân có tần số đột biến thấp, mặt khác chúng lại đƣợc di truyền từ cả bố và mẹ và bị phân ly qua mỗi thế hệ nên việc dò tìm tổ tiên và mối quan hệ di truyền của đoạn DNA nào đó trở nên rất khó khăn. Bởi vậy, DNA ty thể với những lợi thế của mình nhƣ tần số đột biến cao, di truyền theo dòng mẹ, không tái tổ hợp, số lƣợng bản sao lớn và khá đồng nhất đã, đang và sẽ là công cụ phân tử hữu hiệu trong các nghiên cứu về di truyền quần thể và phát sinh chủng loại [15], [30], [50], [57]. Hệ gen ty thể có hai vùng chức năng chính. Vùng mã hóa chiếm tới 93% hệ gen ty thể, vùng còn lại đƣợc gọi là vùng D-loop (vùng siêu biến hay vùng điều khiển) không đƣợc dịch mã, chứa trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản của chuỗi nặng và các trình tự điều khiển quá trình phiên mã của các gen trong vùng mã hóa. Vùng D-loop có tốc độ tiến hóa nhanh hơn nhiều so với các vùng khác của hệ gen ty thể, vì vậy nó là vùng thích hợp và có giá trị nhất trong phân tích di truyền quần thể, đặc biệt là đối với các nghiên cứu biến đổi di truyền bên trong loài [25]. Do đó, xác định và so sánh trình tự mtDNA nhất là trình tự vùng D-loop là phƣơng pháp có độ tin cậy cao đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƢỢC VỀ NGUỒN GỐC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI GÀ NHÀ Trong hệ thống phân loại, chi Gallus gồm 4 loài gà rừng khác nhau: 1. Gà rừng đỏ G. gallus (Red junglefowl - RJF) thƣờng gặp ở Đông Dƣơng, Ấn Độ, Myanmar, Malaysia và vài nƣớc khác. 2. G. lafayetti (Lafayette's JF) ở vùng Sri Lanka, loài này còn có tên gọi là gà rừng Ceylon (Cyelon junglefowl - CJF). 3. Gà rừng màu xanh G. varius (Green junglefowl - GrJF) phổ biến ở vùng Java nên còn gọi là gà rừng Java. 4. G. sonneratii (Grey junglefowl - GJF), còn gọi là gà rừng màu xám, thƣờng gặp ở vùng rừng núi Ấn Độ. Trong 4 loài trên thì phổ biến nhất là loài gà rừng đỏ G. gallus (RJF). Hiện nay, loài này gồm 5 phân loài: G. g. gallus (Southeast Asian Red junglefowl - SE Asian RJF), G. g. spadiceus, G. g. bankiva, G. g. murghi (Indian RJF) và G. g. jabuoillei [49]. Sự phân loại này chủ yếu dựa trên các đặc điểm kiểu hình và khu vực phân bố địa lí của các quần thể. Ở Việt Nam có ba phân loài của gà rừng đỏ với số lƣợng còn tƣơng đối nhiều: G. gallus gallus (1), G. gallus jabouibi (2), G. gallus spadiceus (3). Phân loài 1: phân bố từ phía nam tỉnh Hà Tĩnh vào đến Nam Bộ. Phân loài 2: phân bố ở vùng Đông Bắc nƣớc ta. Phân loài 3: phân bố ở vùng Tây Bắc nƣớc ta [8], [10]. Trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau: Giới Động vật (Animalia) Ngành Động vật có xƣơng sống (Chordata) Lớp Chim (Aves) Bộ Gà (Galiformes) Họ Trĩ (Phasianidae) Giống Gallus Loài Gallus gallus Phân loài Gallus gallus domesticus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Hiện nay, gà là một trong những vật nuôi phổ biến và đƣợc nuôi ở nhiều vùng trên toàn thế giới. Tuy nhiên nguồn gốc của gà nuôi chƣa đƣợc thống nhất và vẫn đang đƣợc tranh cãi giữa thuyết đơn nguyên và đa nguyên. Thuyết đơn nguyên cho rằng tổ tiên của tất cả các loại gia cầm là phân loài Gallus gallus gallus của gà rừng đỏ sống ở Đông Nam Á (SE Asian RJF) [26], [27]. Trong khi nhiều tác giả lại đƣa ra bằng chứng chứng tỏ rằng gà nhà có nhiều tổ tiên khác nhau theo dòng mẹ, có tới 3 phân loài của gà rừng đỏ có thể là tổ tiên trực tiếp của gà nhà gồm G. g. gallus, G. g murghi và G. g. spadiceus. Cho đến nay đã có nhiều nghiên cứu góp phần làm sáng tỏ giả thuyết này [34], [42], [43], [50]. Boruxenco (1953) và Valilop (1993) cho rằng Nam Á, Ấn Độ, Đông Dƣơng… là một trong những trung tâm châu Á đầu tiên thuần dƣỡng nhiều loài vật nuôi trong đó có gà nhà [5]. Từ các khu vực rừng nhiệt đới Đông Nam Á và Ấn Độ, gà rừng đỏ Gallus gallus đã lan rộng ra các vùng khác trên thế giới khi con ngƣời thuần hóa chúng, kết quả là tạo ra nhiều giống gà khác nhau [61]. Tiếp theo quá trình thuần hóa là các chƣơng trình chọn giống rộng rãi đã tạo ra 4 dòng gà khác biệt: lấy trứng, lấy thịt, làm cảnh và chọi gà. Trƣớc đây, Ấn Độ đƣợc coi là trung tâm của quá trình thuần hóa gà nhà. Quá trình này diễn ra tại các vùng thung lũng Ấn Độ vào khoảng năm 3200 trƣớc Công nguyên. Tuy nhiên những bằng chứng địa chất gần đây đã chỉ ra rằng quá trình này diễn ra sớm hơn rất nhiều ở đại lục Trung Quốc vào khoảng năm 6000 trƣớc Công nguyên [27], [36]. Gà đƣợc đƣa sang châu Âu vào khoảng thế kỷ XVIII - XIX và nhờ tiến bộ của công tác chọn giống, các giống gà bản địa của châu Á đã đƣợc lai tạo thành những giống cho năng suất cao hơn. Trƣớc đây, phần lớn các tác giả đều cho rằng gà đƣợc đƣa vào châu Mỹ bởi những nhà thám hiểm Tây Ban Nha hoặc Bồ Đào Nha vào khoảng năm 1500 sau Công nguyên. Một giả thuyết khác cho rằng gà đƣợc đƣa trực tiếp từ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 màng. Lớp màng ngoài bao trùm, tạo nên ranh giới ngoài của ty thể; lớp màng trong tạo thành các nếp gấp (mào - cristae) hƣớng vào tâm và là nơi khu trú của các enzyme hô hấp. Các lớp màng chia ty thể thành hai khoang riêng biệt: khoang chứa chất nền nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa hai lớp màng. Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của ty thể Ty thể là bào quan quan trọng, có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí, giữ vai trò trung tâm trong việc sản sinh năng lƣợng, trao đổi amino acid, trao đổi chất béo, trao đổi steroid và chết theo chƣơng trình của tế bào (apoptosis) [30], [40]. Nhờ chứa chuỗi truyền điện tử, các enzyme của chu trình Krebs và phosphoryl hóa, ty thể thực hiện quá trình oxy hóa các carbohydrate, các acid béo, các amino acid… giải phóng ra năng lƣợng dƣới dạng các liên kết phosphate cao năng trong phân tử ATP. Đây là dạng năng lƣợng cần thiết cho mọi hoạt động sống của tế bào. Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể chiếm tỉ lệ từ 1 - 5% DNA của tế bào. Kích thƣớc của hệ gen ty thể (mtDNA) ở phần lớn động vật có xƣơng sống vào khoảng 16,8 kb, tuy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Đáng chú ý là trật tự sắp xếp của các gen trong phân tử DNA dạng vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này đƣợc thể hiện rõ khi so sánh trình tự genome ty thể các taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu phân loại đối với các taxon bậc cao [43]. Một số gen mã hóa protein hoặc tRNA có khung đọc nằm gối lên nhau một phần (overlapping gene). Ngoài các đặc điểm trên, hệ gen ty thể gà có một số đặc điểm đáng chú ý, khác biệt với lớp thú và lƣỡng cƣ [22]: - Thứ nhất, theo chiều 5’ - 3’ của chuỗi nhẹ từ gen ND5 đến vùng D-loop là các gen Cyt b, tRNA Thr , tRNA Pro , ND6 và tRNA Glu, trong khi ở các động vật khác, gen Cyt b lại nằm gần hơn với vùng điều khiển. Trật tự này đƣợc bảo toàn trong các loài thuộc bộ gà (Galliformes). - Thứ hai, một điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nhẹ tƣơng đƣơng với trình tự nằm giữa hai gen tRNACys và tRNAAsn đều có ở tất cả động vật có xƣơng sống đã đƣợc giải trình tự genome ty thể, riêng ở gà không có đặc điểm này. - Thứ ba, gen COI (cytochrome oxydase I) có mã khởi đầu là GTG thay vì ATG. Sơ đồ chi tiết của hệ gen ty thể gà đƣợc trình bày ở hình 1.2. Hình 1.2. Sơ đồ mtDNA gà Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Các tRNA đƣợc tạo thành nhờ ngắt quãng các trình tự dài hơn của rRNA và mRNA, sau đó chúng đƣợc cuộn xoắn trong các bản phiên mã và đƣợc phân cắt. Các mRNA và rRNA tự do đƣợc polyadenyl hóa sau phiên mã và tRNA đƣợc biến đổi thêm CCA vào đầu cuối 3' [21], [58]. 1.3.2. Cấu trúc và vai trò của vùng D-loop trong đánh giá đa dạng di truyền Phân loại học cổ điển trên các đối tƣợng thuộc bộ Gà chủ yếu dựa vào các đặc điểm bộ lông bên ngoài của con trống, đó là những đặc điểm sinh dục thứ cấp. Những đặc điểm này mang một tiềm năng biến đổi nhanh chóng qua các thế hệ nên không đƣợc coi là cơ sở chính xác để xác định quan hệ tiến hóa giữa các loài. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã tìm đến những đặc điểm có thể bộc lộ mức độ biến đổi phù hợp hơn cho việc phân tích quan hệ tiến hóa và phát sinh chủng loại ở các loài. Khi đó, mtDNA và đặc biệt là vùng D-loop với những ƣu điểm nổi bật đã đƣợc chọn làm đối tƣợng nghiên cứu. Thuật ngữ D-loop đƣợc dùng để chỉ một vùng có chức năng điều khiển nằm trong mtDNA. Đây là vùng không mã hóa duy nhất trong DNA ty thể và cũng là vùng liên quan đến sự mở đầu tái bản của mtDNA. Ở gà nhà, vùng này có kích thƣớc 1227 bp [26], nó chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Về mặt cấu trúc, D-loop của gia cầm có thể đƣợc chia thành ba vùng chính là vùng ngoại biên I và III có khả năng biến đổi cao và vùng II là vùng trung tâm ít biến đổi [55]. Vùng I nằm ở đầu 5' vùng điều khiển, kích thƣớc khoảng 400 bp, vùng này chứa chuỗi cytosine (C-stretch), đó là một chuỗi trình tự gồm toàn nucleotide cytosine; chuỗi C là đặc điểm đặc trƣng cho đầu 5' của vùng điều khiển hệ gen ty thể của nhiều họ trong lớp Chim. Vùng I còn chứa trình tự kết thúc quá trình tái bản hệ gen ty thể (TAS) là hộp TATAT hoặc TACAT. Vùng II bảo thủ nhất có chứa một số đơn vị cấu trúc mà trình tự sắp xếp của chúng không Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 này. Ở Nhật Bản có 3 giống gà Naganakidori rất đặc biệt đƣợc nuôi để phát triển tiếng gáy dài khác thƣờng tới trên 15 giây. Nhằm làm sáng tỏ quá trình thuần hóa và nguồn gốc phát sinh của chúng, năm 2004, vùng D-loop ty thể gà Naganakidori đã đƣợc giải trình tự. Các mẫu máu của 9 con gà có tiếng gáy dài và 74 con gà từ 11 giống gà địa phƣơng đã đƣợc thu thập. Dữ liệu về trình tự DNA của 2 loài gà rừng cũng đã đƣợc thu thập từ GenBank. Tiếp theo, cây chủng loại phát sinh đã đƣợc thiết lập, kết quả cho thấy cả 3 giống gà Naganakidori đều có tổ tiên chung từ gà chọi Shamo bất chấp việc chúng có nhiều đặc điểm khác nhau rõ rệt và thú vui nuôi gà có tiếng gáy dài có thể đã đƣợc đến trƣớc bởi thú chơi gà chọi. Hơn nữa, những chủng gà này lần đầu tiên tách biệt khỏi gà chọi ở đảo Okinawa, nơi có vị trí gần với miền Nam Trung Quốc và Đông Dƣơng hơn so với lục địa Nhật Bản (Honshu/ Kyushu). Điều này cho thấy rằng có thể tổ tiên của những con gà có tiếng gáy dài lần đầu tiên đƣợc mang vào lục địa Nhật Bản qua đảo Okinawa là những con gà chọi từ các khu vực xung quanh ở miền Nam Trung Quốc hoặc Đông Dƣơng [36]. Năm 2005, Nishibori và đtg (Nhật Bản) [48] đã xây dựng cây chủng loại phát sinh của các loài gà thuộc chi Gallus dựa trên phân tích trình tự D-loop ty thể và dùng nó để chứng minh cho giả thuyết rằng gà rừng đỏ (Red junglefowl - RJF) là tổ tiên trực tiếp của gà nhà. Vị trí chủng loại phát sinh của gà nhà và các loài gà khác thuộc chi Gallus là rất quan trọng khi có ý định gìn giữ và cải tiến các giống gà bằng chuyển gen từ hệ gen của các chủng hoang dã. Các phân tích chủng loại phát sinh dựa trên trình tự mtDNA đã khám phá ra rằng hai chủng gà rừng xám (GJF) là cùng một nhánh với gà rừng đỏ (RJF) và gà nhà và chỉ có một chủng gà rừng xám nằm ở vị trí xa hơn cùng với gà rừng Cyelon (CJF). Quá trình thuần hóa của gà đƣợc tin rằng đã diễn ra ở Nam Á, đặc biệt là châu thổ Ấn Độ. Tuy nhiên, trong các nghiên cứu trƣớc đó lại không bao gồm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hệ gen ty thể gà nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, phần lớn mang tính cá thể và không đặc trƣng cho quần thể. Mục đích chủ yếu của các nghiên cứu này là tìm hiểu đa hình trình tự nucleotide ở một vài cá thể. Năm 1997, trình tự 641 nucleotide đầu tiên của vùng D-loop 3 mẫu gà Việt Nam (1 mẫu gà nhà và 2 mẫu gà rừng đỏ phân loài G. g. gallus) đã đƣợc Miyake (Nhật Bản) xác định [44]. Đây là tác giả nƣớc ngoài đầu tiên tiến hành nghiên cứu đa hình trình tự vùng D-loop trên đối tƣợng gà Việt Nam, các trình tự này sau đó đƣợc đăng ký trên GenBank với các mã số là AB009435 (G. gallus domesticus), AB009434 (G. gallus gallus) và AB009449 (G. gallus gallus). Năm 1999, Kim Thị Phƣơng Oanh và đtg [9] đã nghiên cứu về sự khác biệt ở ba loài thuộc giống gà Lôi: gà Lôi lam đuôi trắng Hà Tĩnh (Lophura hatinhensis), Trĩ bạc (L. nycthemera) và gà Lôi lông tía (L. diardi). Tác giả đã chỉ ra sự thay đổi nucleotide trên vùng D-loop ty thể của chúng dựa trên vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn SmaI và EcoRI. Năm 2000, Nguyễn Hải Hà và đtg [4] sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 đã nhân đƣợc đoạn D-loop có kích thƣớc 1,3 kb từ DNA genome của 2 mẫu gà Lôi lam đuôi trắng (Lophura hatinhensis) và gà Lôi lam mào trắng (Lophura edwardsi), sau đó gắn thành công vùng D-loop ty thể của 2 cá thể này vào vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc tiến hành phân tích trình tự nucleotide vùng D-loop để nhằm so sánh quan hệ di truyền giữa 2 loài. Năm 2007, Lê Đức Long và đtg [7] đã giải trình tự vùng D-loop gồm 1227 nucleotide của 3 cá thể gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái đƣợc nuôi tại trại gà Nông lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch, qua đó đã xác định đƣợc 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Năm 2008, Bùi Thị Kiều Vân và đtg [12] đã xác định trình tự vùng D-loop gồm 1220 nucleotide của 2 mẫu gà Ri và gà Mông, phát hiện đƣợc 16 điểm đa hình/ đột biến về nucleotide khi so sánh với trình tự gà White Leghorn gốc Nhật Bản mang mã số AB114078 trên GenBank. Năm 2008, Nguyễn Đăng Tôn và đtg [47] đã xác định trình tự 300 nucleotide từ vị trí 131 đến vị trí 430 của 80 mẫu thuộc 4 giống gà Ri, Tre, Chọi và Tàu Vàng (mỗi giống 20 mẫu), qua đó xác định đƣợc 21 vị trí đa hình nucleotide. Năm 2009, Berthouly và đtg [16] đã sử dụng 30 marker vi vệ tinh trên 1082 mẫu gà để nghiên cứu về cấu trúc di truyền của quần thể gà H’mong thuộc tỉnh Hà Giang và đƣa ra bằng chứng di truyền về hiện tƣợng tạp giao của nhóm gà này với gà rừng G. gallus. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển D-loop của 71 mẫu cá thể gà địa phƣơng Việt Nam thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre (các cá thể này không bao gồm 40 cá thể gà Ri và gà Tre đã sử dụng trong nghiên cứu của Nguyễn Đăng Tôn và đtg), sau đó sản phẩm PCR sẽ đƣợc dùng để giải trình tự tự động. Các số liệu đa hình thu đƣợc về vùng điều khiển D-loop của 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre sẽ đƣợc so sánh với trình tự chuẩn AP003580 đã đƣợc công bố trên GenBank, từ đó phân loại các mẫu này vào các kiểu đơn bội khác nhau. Đại học Thái Nguyên 23 2.1.3. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc nhập khẩu từ các hãng Fermentas, Sigma Aldrich, Promega… Các hóa chất này gồm có: - Bộ hóa chất dùng cho PCR: đệm, MgCl2, dNTPs, Taq DNA polymerase… của hãng Fermentas. - Cặp mồi H1255 và L16725 đƣợc đặt tổng hợp tại hãng Invitrogen. + H1255: 5’- CAT CTT GGC ATC TTC AGT GCC -3’ + L16725: 5’- AGG ACT ACG GCT TGA AAG C -3’ - Hóa chất chạy điện di: + Agarose. + Dung dịch đệm TAE (Tris-acetate-EDTA) 1X. + Thang DNA chuẩn. + Dung dịch đệm tra mẫu: Glycerol 20%; Tris-Cl 0,1 M (pH = 8); EDTA 0,01 M (pH = 8); bromophenol blue 0,25%. + Dung dịch nhuộm gel ethidium bromide (EtBr). - Bộ hóa chất thôi gel: Kit Wizard SV gel and PCR Clean - up System của hãng Promega: Dung dịch MBS (Membrane Binding Solution). Dung dịch MWS (Membrane Wash Solution) có bổ sung ethanol 95%. - BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit của hãng Applied BioSystems (ABI, Mỹ) phục vụ cho giải trình tự vùng D-loop. - Ethanol 100% và 70%. - Nƣớc khử ion vô trùng. 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu Đề tài đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Đại học Thái Nguyên 27 - Dung dịch đệm cung cấp ion Mg2+ và nƣớc tinh khiết không có enzyme RNase và DNase. - Enzyme chịu nhiệt Taq polymerase [1], [13]. Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 - 50 µl. Phản ứng PCR gồm một loạt chu kỳ lặp lại của ba giai đoạn cơ bản sau đây [1], [13]: - Giai đoạn biến tính DNA bằng nhiệt: tách sợi DNA kép thành dạng sợi đơn (single strands). Tất cả các phản ứng enzyme (phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ trƣớc đó) trong giai đoạn này đều bị dừng lại. Mỗi sợi đơn sau đó sẽ trở thành một sợi khuôn cho mồi bám vào. Nhiệt độ: 94 - 95oC, tại nhiệt độ này các phân tử DNA mạch kép bị tách ra do sự đứt gãy của các liên kết hydro. Thời gian: khoảng 1 phút - Giai đoạn gắn mồi: thực hiện phản ứng lai giữa mồi và DNA khuôn. Các mồi đƣợc gắn vào vị trí có trình tự tƣơng đồng ở DNA khuôn mẫu, mồi bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion đƣợc tạo thành và đứt gãy liên tục giữa mồi sợi đơn và DNA khuôn sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các mồi đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (DNA khuôn và mồi) Taq polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu. Nhiệt độ: ở giai đoạn này phạm vi nhiệt độ đƣợc sử dụng có thể rất rộng tuỳ thuộc vào trình tự nucleotide của mồi, thông thƣờng khoảng 55oC, nhƣng có khi chỉ 35oC hoặc đôi lúc lên đến 68oC. Thời gian: 20 giây đến 2 phút - Giai đoạn kéo dài: nhiệt độ lúc này đƣợc nâng lên đến 72oC, đây là nhiệt độ tối thích cho Taq polymerase tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ Đại học Thái Nguyên 28 sung các dNTP bắt đầu từ các vị trí có mồi gắn vào theo chiều 5’ - 3’. Ở nhiệt độ này, các mồi bắt cặp chính xác không bị rời khỏi DNA khuôn mẫu do có các mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ liên kết, trong khi đó các mồi ở các vị trí bắt cặp không chính xác sẽ bị rời ra khỏi khuôn (do nhiệt độ cao) do đó không tổng hợp đƣợc DNA từ những mồi này. Thời gian của giai đoạn này từ 30 giây đến vài phút, tuỳ thuộc chiều dài đoạn DNA cần nhân bản. Kết thúc một chu kỳ từ một DNA kép ban đầu tổng hợp đƣợc 2 sợi DNA kép mới. Cứ nhƣ vậy, phản ứng xảy ra trong 25 - 40 chu kỳ. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ đƣợc duy trì ở 72oC trong khoảng từ 5 - 10 phút sao cho tất cả các phản ứng enzyme diễn ra hoàn toàn. Sau đó nhiệt độ đƣợc hạ xuống 4oC để bảo quản sản phẩm. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ 0,8 - 2 %. Hiện nay, kỹ thuật PCR đã đƣợc phát triển, cải tiến so với ban đầu. Ngƣời ta đƣa vào thêm một số bƣớc phụ nhƣ khởi động nóng nhằm làm sợi DNA kép biến tính hoàn toàn, kéo dài thời gian tổng hợp chuỗi ở chu kì cuối cùng và giữ mẫu ở 4oC. 2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR Để thu đƣợc các sản phẩm PCR đủ độ sạch để có thể tiến hành đọc trình tự trực tiếp, chúng tôi tiến hành cắt gel (thạch) sau đó tinh sạch bằng Kit Wizard SV Gel and PCR clean-up system của hãng Promega theo quy trình kỹ thuật sau: - Điện di toàn bộ sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành cắt gel trên máy soi DNA để thu lấy băng DNA quan tâm. Thêm 10 l dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) đối với mỗi 10 mg gel và ủ hỗn hợp ở 50 - 65oC cho tới khi thạch tan hoàn toàn. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR D-loop là vùng không mã hóa duy nhất trên DNA ty thể ở động vật có xƣơng sống. Vùng này chứa điểm khởi đầu sao chép của chuỗi nặng và các promoter phiên mã của DNA ty thể. Với đặc trƣng tích luỹ các đột biến cao gấp 5 - 10 lần so với các gen khác trong ty thể và so với DNA nhân, D-loop trở thành vùng có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Chính vì thế, nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của các cá thể gà thuộc 3 giống Ri, Đông Tảo và Tre, chúng tôi chọn trình tự nucleotide của vùng D-loop hệ gen ty thể làm đối tƣợng nghiên cứu. Nhân gen bằng kỹ thuật PCR thành công khi phản ứng có tính đặc hiệu cao. Do đó, để cho ra sản phẩm tốt nhất thì điều kiện phản ứng phải đƣợc tối ƣu hóa. Để nhân vùng D-loop cần có DNA khuôn, mồi, các dNTP, Taq DNA polymerase, MgCl2, dung dịch đệm và một chu trình nhiệt thích hợp. * Thành phần của phản ứng PCR - Dung dịch đệm (Buffer): phản ứng PCR đƣợc thực hiện trong môi trƣờng đệm có pH 7,2 để ổn định hoạt động của Taq polymerase. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng loại đệm có chứa NH4+ nhƣng không chứa Mg 2+ của hãng Fermentas, đệm này phù hợp cho hoạt động của Taq polymerase và khoảng biến thiên rộng về nồng độ của MgCl2. Hơn nữa, loại đệm này cho chất lƣợng sản phẩm tốt hơn so với loại đệm không chứa NH4+. - Nồng độ Mg2+: trong các thí nghiệm, chúng tôi sử dụng đệm không chứa Mg2+ để có thể khảo sát mức độ ảnh hƣởng của nó tới phản ứng. Nồng độ ion Mg2+ (đƣợc cung cấp dƣới dạng MgCl2) có thể ảnh hƣởng tới nhiệt độ biến tính (Tm) của DNA khuôn, hoạt tính của Taq polymerase và độ chính Đại học Thái Nguyên 33 H1255 và L16725 là cặp mồi bảo thủ, đƣợc thiết kế dựa trên trình tự hai đầu vùng D-loop ở gà nhà do đó có thể sử dụng cho nhiều loài, giống khác nhau trong bộ Gà (Galliformes) [9]. Theo lý thuyết, sản phẩm thu đƣợc khi nhân bản bằng cặp mồi trên có chiều dài khoảng 1,3 kb. Việc điều chỉnh nhiệt độ gắn mồi và nồng độ mồi quyết định lƣợng sản phẩm thu đƣợc. Hai mồi H và L phải có nồng độ bằng nhau và phải đƣợc điều chỉnh thích hợp sao cho không quá cao để tránh hiện tƣợng primer-dimer và hiện tƣợng các mồi gắn nhầm vị trí trên khuôn mẫu, nồng độ mồi cũng không đƣợc quá thấp để tránh làm giảm lƣợng sản phẩm tạo thành. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng mồi có nồng độ 10 pmol/ l đối với mỗi loại H và L. - Nồng độ DNA khuôn: PCR gồm hai giai đoạn: giai đoạn sàng lọc và giai đoạn khuếch đại. Nếu các chất trong thành phần phản ứng (bao gồm mồi) có nồng độ cao trong khi DNA khuôn lại có nồng độ thấp thì giai đoạn sàng lọc của PCR sẽ trở nên khó khăn hơn vì tần suất để mồi và DNA khuôn gặp nhau giảm rõ rệt, trong khi sự tiếp xúc giữa mồi với mồi lại tăng lên gây ra hiện tƣợng primer-dimer trong giai đoạn khuếch đại. Thông thƣờng, nồng độ DNA khuôn mẫu đƣợc sử dụng trong khoảng từ 10 - 100 ng/ 25 µl dung dịch phản ứng. DNA khuôn sử dụng trong đề tài là 71 mẫu DNA tổng số của 3 giống gà: Ri, Đông Tảo và Tre, các mẫu này có độ tinh sạch cao và ít bị đứt gãy. - Taq polymerase: nồng độ enzyme quá cao có thể làm xuất hiện các sản phẩm PCR không đặc hiệu dẫn tới sai lệch kết quả. Ngƣợc lại, nếu nồng độ enzyme quá thấp sẽ không đủ để xúc tác tạo ra đủ lƣợng sản phẩm mong muốn. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng enzyme Taq polymerase nồng độ 5 unit/ l. Thành phần phản ứng khuếch đại đoạn DNA cho một mẫu với tổng thể tích 25 l nhƣ trong bảng 3.1. Đại học Thái Nguyên 34 Bảng 3.1. Thành phần phản ứng khuếch đại DNA Thành phần Nồng độ Thể tích ( l) Buffer 10 X 2,5 MgCl2 10 mM 2,5 dNTPs 10 mM 2,5 M 10 pmol/ l 1 M 10 pmol/ l 1 Taq DNA polymerase 5 unit/ l 0,2 DNA khuôn 15 ng x H2O - y Tổng thể tích 25 * Chu trình nhiệt của PCR: m gia. - Gi : n - 95 o Taq tính - C 0 . - : khuôn. o - Đại học Thái Nguyên 36 3.2. Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank Trình tự 609 nucleotide vùng D-loop từ vị trí 21 đến vị trí 629 trên mtDNA của 71 mẫu thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo, Tre, đƣợc xác định trực tiếp theo phƣơng pháp dideoxy sử dụng mồi L16725, bộ hóa chất BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit trên máy phân tích trình tự DNA tự động ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer. Dữ liệu trình tự nucleotide sau khi đƣợc xử lý bằng phần mềm DNA Sequencing Analysis v5.3.1, SeqScape® v2.6 và BioEdit v7.0.9 đƣợc so sánh với trình tự gà White Leghorn gốc Nhật Bản (thuộc phân loài Gallus gallus domesticus), trình tự này mang mã số AP003580 trên GenBank đƣợc Nishibori và đtg công bố năm 2003. Trình tự 609 nucleotide trong vùng D-loop của 71 mẫu cá thể thuộc 3 giống gà nghiên cứu đƣợc xử lý và so sánh nhƣ sau: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51 Theo kết quả so sánh trình tự nucleotide xác định đƣợc ở 3 giống gà Ri, Đông Tảo, Tre với trình tự của gà White Leghorn, chúng tôi nhận thấy tại một số vị trí trên vùng D-loop của 3 mẫu gà có sự thay đổi so với trình tự nucleotide vùng D-loop của gà White Leghorn AP003580. Các vị trí nucleotide sai khác giữa các mẫu đƣợc thể hiện trên bảng 3.3. Bảng 3.3 Các điểm đa hình trong vùng D-loop của 3 giống gà nghiên cứu Vị trí nucleotide Giống gà Kiểu thay thế Ri Đông Tảo Tre Số mẫu (n = 31) Tỷ lệ % Số mẫu (n = 22) Tỷ lệ % Số mẫu (n = 18) Tỷ lệ % 147 T → C 1 3,2 / / 10 55,6 192 G → A 30 96,8 21 95,5 1 5,6 197 C → T 31 100 22 100 18 100 205 C → T 1 3,2 1 4,5 10 55,6 223 C → T 31 100 22 100 11 61,1 226 C → T 30 96,8 22 100 2 11,1 236 C → T 31 100 22 100 11 61,1 241 T → C 31 100 22 100 15 83,3 261 A → G / / / / 7 38,9 276 C → T 11 35,5 5 22,7 / / 286 T → C / / / / 7 38,9 290 T → C 31 100 22 100 11 61,1 295 C → T 30 96,8 22 100 2 11.1 371 C → T / / / / 4 22,2 426 T → C 31 100 22 100 18 100 Kết quả cho thấy các mẫu nghiên cứu có khá nhiều vị trí đa hình so với trình tự chuẩn. Tổng cộng 71 mẫu có 619 điểm đa hình, tƣơng ứng với sự thay đổi nucleotide ở 15 vị trí so với trình tự gà White Leghorn. Đây là một con số khá lớn song nó phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây cho thấy vùng điều Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53 với 7 điểm đa hình, chiếm tỉ lệ 1,13%. Tần số các kiểu thay thế nucleotide của 71 mẫu nghiên cứu đƣợc thể hiện trên hình 3.4. 35.7 54.77 8.4 1.13 0 10 20 30 40 50 60 Tû lÖ % KiÓu th ay th Õ Hình 3.4. Tỷ lệ % các kiểu thay thế nucleotide của 71 mẫu nghiên cứu Trong 3 giống gà nghiên cứu thì gà Ri có 12 vị trí xảy ra sự thay thế nucleotide với tổng số 289 nucleotide bị thay thế, gà Đông Tảo có 11 vị trí thay thế với 203 nucleotide bị thay thế và gà Tre có 127 nucleotide bị thay thế tƣơng ứng với 14 vị trí nucleotide sai khác so với trình tự chuẩn. Đáng chú ý là sự thay thế nucleotide ở gà Đông Tảo rất giống với gà Ri, 11 vị trí xảy ra sự thay thế nucleotide ở gà Đông Tảo đều có ở gà Ri, qua đó cho thấy sự đồng nhất đáng kể về mặt di truyền giữa các mẫu thuộc 2 giống nghiên cứu. Cả 2 giống gà đều có 7 vị trí xảy ra sự thay thế C bằng T (các vị trí 197, 205, 223, 226, 236, 276 và 295), 3 vị trí xảy ra sự thay thế T bằng C (vị trí 241, 290 và 426), 1 vị trí thay thế G bằng A (vị trí 192). Ở gà Ri còn có thêm vị trí 147 xảy ra sự thay thế T bằng C. Với các mẫu gà Tre, trong tổng số 14 vị trí xảy ra sự thay thế nucleotide có tới 10 vị trí mà sự thay thế nucleotide hoàn toàn giống với 2 giống gà Ri và gà Đông Tảo, điều này cho thấy sự gần gũi về mặt di truyền của 3 giống gà nghiên cứu. Nhƣng thêm vào Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 56 14,08%. Kiểu đơn bội D, E, G và H chỉ có ở gà Tre, kiểu đơn bội F chỉ có ở gà Đông Tảo. Tần số phân bố của các kiểu đơn bội vùng D-loop hệ gen ty thể 3 giống gà nghiên cứu đƣợc minh hoạ trên hình 3.5. Hình 3.5. Tần số phân bố của các kiểu đơn bội vùng D-loop hệ gen ty thể 3 giống gà nghiên cứu 3.3. Sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 3 giống gà Phân tích sự đồng nhất giữa các trình tự nucleotide trong từng giống gà cho thấy gà Đông Tảo có mức độ sai khác di truyền là thấp nhất, giá trị hệ số khoảng cách di truyền (hệ số sai khác về trình tự nucleotide) giữa các mẫu gà Đông Tảo là d = 0,0009, tiếp đến là gà Ri có d = 0,0013 và mức độ sai khác lớn nhất là ở gà Tre (d = 0,0079); điều đó có nghĩa là các mẫu thuộc giống gà Đông Tảo có độ đồng nhất về trình tự nucleotide là cao nhất với hệ số tƣơng đồng là 99,91%, tiếp theo là các mẫu thuộc giống gà Ri với mức độ đồng nhất về trình tự nucleotide giữa các mẫu là 99,87% và cuối cùng là các mẫu gà Tre có mức độ đồng nhất thấp nhất với hệ số tƣơng đồng là 99,21%. 3.4. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu Chúng tôi tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền của 3 giống gà với gà White Leghorn AP003580. Trong 3 giống gà nghiên cứu, gà Tre có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất với gà White Leghorn AP003580, giá trị hệ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 57 số khoảng cách di truyền của các mẫu gà Tre so với gà White Leghorn là d = 0,0117, có nghĩa là sự tƣơng đồng về trình tự nucleotide giữa các mẫu gà Tre so với gà White Leghorn là 98,83%, gà Đông Tảo và gà Ri có khoảng cách di truyền với gà White Leghorn AP003580 gần tƣơng đƣơng nhau, mức độ tƣơng đồng về trình tự nucleotide của 2 giống gà này với gà AP003580 lần lƣợt là 98,46% và 98,44%. Trong 3 phân loài gà rừng đỏ phân bố tại Việt Nam (G. g. gallus, G. g. spadiceus và G. g. jabouibi) có 2 phân loà i G. g. gallus và G. g. spadiceus có trình tự vùng D-loop đƣợc đăng ký trên GenBank. Do đó, chúng tôi đã sử dụng trình tự vùng D-loop gà rừng đỏ Việt Nam mã số AB009434 thuộc phân loài G. g. gallus và trình tự mã số NC007235 thuộc phân loài G. g. spadiceus để đánh giá mối quan hệ di truyền của 2 phân loài này với 3 giống gà nghiên cứu. Kết quả cho thấy, gà rừng AB009434 có mối quan hệ di truyền gần gũi nhất với gà Tre, giá trị hệ số khoảng cách di truyền của gà rừng AB009434 với gà Tre là 0,0171, giá trị này thấp hơn của gà AB009434 với gà Đông Tảo (d = 0,0190) và với gà Ri (d = 0,0191). Trong khi đó, gà rừng NC007235 lại có mối quan hệ di truyền gần gũi với gà Ri và gà Đông Tảo hơn là với gà Tre, giá trị hệ số khoảng cách di truyền của gà NC007235 với gà Ri và gà Đông Tảo là rất thấp, lần lƣợt là 0,0009 và 0,0005, trong khi giá trị hệ số khoảng cách di truyền của nó với gà Tre là 0,0103. Kết quả này cũng phù hợp với sự phân bố của các giống gà, phân loài G. g. gallus và gà Tre tập trung chủ yếu ở các tỉnh Nam Bộ, trong khi phân loài G. g. spadiceus cùng với gà Ri và gà Đông Tảo phân bố ở khu vực miền Bắc. Giữa 3 giống gà, sự sai khác về trình tự nucleotide giữa gà Đông Tảo và gà Ri là thấp nhất, giá trị hệ số khoảng cách di truyền của 2 giống gà này là 0,0011, giá trị này thấp hơn rất nhiều so với giá trị hệ số khoảng cách di Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 60 3.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp tối thiểu Maximum Likelihood (ML) và phƣơng pháp Neighbor-Joining sử dụng kết quả so sánh ClustalW các trình tự của 71 mẫu gà nghiên cứu và 3 trình tự thu thập trên GenBank mã số AP003580, AB009434 và NC007235. Cả hai phƣơng pháp đều cho cây có dạng hình học tƣơng đồng (Hình 3.6), chứng tỏ kết quả phân tích đảm bảo độ tin cậy. Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của 3 giống gà nghiên cứu AP003580: White Leghorn, AB009434: G. g. gallus. NC007235: G. g. spadecius, Dt: gà Đông Tảo, Ri: gà Ri, Tr: gà Tre (Boostrap 500) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 61 Trên cây phát sinh chủng loại, 74 mẫu so sánh đƣợc chia thành 2 nhóm tách biệt, nhóm I gồm 7 mẫu gà Tre (các mẫu Tr-05, Tr-06, Tr-07, Tr-09, Tr-10, Tr-11 và Tr-15). Mẫu AP003580 và mẫu AB009434 cũng thuộc vào nhóm I, điều này phù hợp với phân tích cho thấy gà White Leghorn AP003580 và gà rừng đỏ AB009434 có mối quan hệ di truyền gần gũi với gà Tre hơn là giữa chúng với gà Ri và gà Đông Tảo. Nhóm II gồm các mẫu của 2 giống gà Ri và Đông Tảo; các mẫu còn lại của giống gà Tre và mẫu NC007235. Nhóm này tách thành hai nhóm nhỏ, một nhóm gồm các mẫu gà Tre, nhóm còn lại gồm các mẫu gà Đông Tảo và gà Ri, mẫu NC007235 thuộc vào nhóm này, kết quả này cũng phù hợp với phân tích quan hệ di truyền cho thấy gà rừng NC007235 gần gũi về mặt di truyền với gà Ri và gà Đông Tảo hơn là với gà Tre. Nhƣ vậy, trong 3 giống gà thì giống gà Ri và Đông Tảo có mối quan hệ gần gũi với nhau hơn là giữa chúng với gà Tre, cả hai giống này cùng thuộc về một nhánh. Gà Tre thuộc về cả hai nhánh của cây phát sinh chủng loại, điều này phù hợp với các phân tích cho thấy có sự biến đổi di truyền rất lớn bên trong nội bộ giống gà Tre. Từ các kết quả trên có thể giả thiết rằng, có hai dạng tổ tiên tham gia vào quá trình hình thành giống gà Tre. Giống gà Ri và gà Đông Tảo có thể có chung nguồn gốc, độ tƣơng đồng của hai giống này khá cao, chứng tỏ thời gian phân ly từ chủng gốc ban đầu là tƣơng đối ngắn. Trƣờng hợp ngoại lệ, một số mẫu nằm phân tán không theo quy luật nhƣ mẫu Tr-17 của giống gà Tre nằm lẫn với các mẫu của gà Ri và Đông Tảo, mẫu gà Ri mã số Ri-11 nằm lẫn vào các mẫu gà Tre và mẫu gà Đông Tảo mã số Dt-06 nằm tách biệt khỏi các mẫu khác. Sự khác biệt này có thể là do có những dạng tổ tiên khác tham gia vào tiến hóa hoặc đã xảy ra sự lai tạp giữa các giống gà nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 62 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1. Vùng điều khiển (D-loop) hệ gen ty thể của 71 mẫu thuộc 3 giống gà Đông Tảo, Ri, Tre với kích thƣớc khoảng 1,3 kb đã đƣợc khuếch đại bằng kỹ thuật PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu H1255 và L16725. 2. Trình tự 609 nucleotide từ vị trí 21 đến vị trí 629 của vùng D-loop của 71 mẫu gà nghiên cứu đã đƣợc xác định và phát hiện đƣợc 619 điểm đa hình/ đột biến, tƣơng ứng với sự thay đổi nucleotide ở 15 vị trí so với trình tự chuẩn White Leghorn AP003580. 3. Đã phân loại 71 mẫu cá thể nghiên cứu theo 8 kiểu đơn bội. Trong đó, kiểu đơn bội A đƣợc tìm thấy ở cả 3 giống gà với 36 mẫu, kiểu đơn bội B có ở gà Ri và gà Đông Tảo với 16 mẫu, kiểu đơn bội C đƣợc tìm thấy ở gà Ri và gà Tre với 10 mẫu, kiểu đơn bội D, E, G và H chỉ tìm thấy ở gà Tre, kiểu đơn bội F chỉ tìm thấy ở gà Đông Tảo. 4. Các phân tích về mối quan hệ di truyền bƣớc đầu cho thấy gà Đông Tảo và gà Ri có mối quan hệ di truyền gần gũi với nhau hơn là so với gà Tre, sự đồng nhất về trình tự nucleotide giữa 2 giống này là 99,89%; đối với từng giống riêng rẽ thì gà Đông Tảo có sự đồng nhất về trình tự nucleotide cao nhất 99,91%. Trong 3 giống gà nghiên cứu, gà Tre có quan hệ di truyền gần gũi hơn với gà White Leghorn AP003580 và gà rừng đỏ Việt Nam AB009434, trong khi đó gà Đông Tảo và gà Ri có quan hệ di truyền gần gũi hơn với gà rừng đỏ NC007235. 5. Cây phát sinh chủng loại của 3 giống gà đƣợc xây dựng gồm 2 nhánh trong đó gà Tre thuộc về cả 2 nhánh, gà Đông Tảo và gà Ri thuộc về một nhánh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003), Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr.45-52. 2. Đặng Vũ Bình (2002), Di truyền số lượng và chọn giống vật nuôi, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.16-17, 101-112. 3. Cục Chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2007), Chiến lược phát triển chăn nuôi gia cầm Việt Nam giai đoạn 2006-2015 của Cục Chăn nuôi, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 4. Nguyễn Hải Hà, Lê Thị Thu Thủy, Nguyễn Đăng Tôn, Lê Trần Bình, Trƣơng Văn Lã, Đặng Gia Tùng, Nông Văn Hải (2000), "Tách dòng đoạn gen D-loop vùng điều khiển AND ti thể ở 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam (Lophura hatinhensis và L. edwardsi)", Kỷ yếu 2000-2001, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr.237-244. 5. Nguyễn Minh Hoàn (2005), Cơ sở di truyền và chọn giống vật nuôi, Đại học Huế, Huế, tr.13-16. 6. Nguyễn Đức Hƣng, Phùng Thăng Long, Nguyễn Xuân Bả (2005), Chăn nuôi đại cương, Đại học Huế, Huế, tr.10-59. 7. Lê Đức Long (2008), Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, thành phần sinh hóa thịt và đánh giá sự sai khác di truyền của gà Mông nuôi tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên, Thái Nguyên. 8. Phạm Nhật, Đỗ Quang Huy (1998), Động vật rừng, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.88. 9. Kim Thị Phƣơng Oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà Lôi Việt Nam, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội, Hà Nội. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 68 28. Gongora J., Rawlence N.J., Mobegi V.A., Alcalde J.A., Mtus J.T., Hanotte O., Moran C., Austin J.J., Ulm S., Anderson A.J., Larson G., Cooper A. (2008), "Indo-European and Asian origins for Chilean and Pacific chickens revealed by mtDNA", Proc Natl Acad Sci USA, 105(30), pp.10308-10313. 29. Granevitze Z., Hillel J., Chen G.H., Cuc N.T.K., Feldman M., Eding H., Weigend S. (2007), "Genetic diversity within chicken populations from different continents and management histories", Animal Genetics, (38), pp.576-583. 30. Guan X., Geng T., Silva P., Smith E.J. (2007), “Mitochondrial DNA sequence and haplotype variantion analysis in the chicken (Gallus gallus)”, J Hered, 98(7), pp.723-726. 31. Halifa M. (2008), "Poultry sector country review", ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/011/ai349e/ai349e00.pdf. 32. Hayashi Y., Nishida T, Fujioka T., Tsugiyama I. and Mochizuki K. (1985), "Osteometrical studies on the phylogenetic relationships of Japanese native fowls", Nippon Juigaku Zasshi, 47(1), pp.25-37. 33. Ingman M. (2003), “Mitochondrial genome variation and evolutionary history of Australian and New Guinean aborigines”, Genome Res, 13(7), pp.1600-1606. 34. Kanginakudru S., Metta M., Jakati R.D., Nagaraju J. (2008), “Genetic evidence from Indian red jungle fowl corroborates multiple domestication of modern day chicken”, BMC Evol Biol, 8:174. 35. Kidd M.G., Friesen V.L. (1998), "Sequence variation in the Guillemot (Alcidae: Cepphus) mitochondrial control region and its nuclear homolog", Mol Biol Evol, (15), pp.61-70. 36. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T. (2004), “The evolutionary origin of long-crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 69 disclosed by the mtDNA sequence analysis”, Gene, 333, pp.9-91. 37. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T. (2003), “Where is the origin of the Japanese gamecocks?”, Gene, 317(1-2), pp.195-202. 38. Kvist L. (2000), "Phylogeny and phylogeography of European Parids, Chapter 1. Introduction: Evolution and mitochondrial DNA in birds", Department of Biology, Oulu University Library. 39. L’abbé D., Duhaime J.F., Lang B.F. and Morais R. (1991), “The transcription of DNA in chicken mitochondria initiates from one major bidirectional promoter”, J Bio Chem, 266(17), pp.10844-10850. 40. Li S., Aggrey S. E., Zadworny D., Fairfull W. and Kuhnlein U. (1998), “Evindence for a genetic variation in the mitochondrial genome affecting traits in White Leghorn chickens”, J Hered, 89(3), pp.222-226. 41. Liu Z.G., Lei C.Z., Luo J., Ding C., Chen G.H., Chang H., Wang K.H., Liu X.X., Zhang X.Y., Xiao X.J., Wu S.L. (2004), “Genetic variability of mtDNA sequences in Chinese native chicken breeds”, Science, 17(7), pp.903-909. 42. Lui Y.P., Wu G.S., Yao Y.G., Miao Y.W., Luikart G., Baig M., Beja- Pereira A., Ding Z.L., Palanichamy M.G., Zhang Y.P. (2006), "Multiple matenal origins of chickens: out of the Asian jungles", Mol Phylogenet Evol, 38(1), pp.12-19. 43. Mindell D.P., Sorenson M.D., Dimcheff D.E. (1998), “Multiple independent origins of mitochondrial gene order in birds”, Proc Natl Acad Sci USA, 95(18), pp.10693-1697 44. Miyake T. (1997), "Gallus gallus mitochondrial DNA for D-loop region", Tetsuo Miyake, Wakunaga Pharmaceutical co.,Ltd., Hiroshima Campus; Shimokotachi, Koda-Cho, Takata-Gun, Hiroshima, Japan, 1624, pp.711- 739. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 70 45. Moiseyeva I.G., Romanov M.N., Nikiforov A.A., Sevastyanove A.A., Semyenova S.K. (2002), "Evolutionary relationships of Red jungle fowl and chicken breeds", Genet Sel Evol, 35(4), pp.403-423. 46. Muchadeyi F.C., Eding H., Simianer H., Wollny C.B., Groeneveld E., Weigend S. (2008), "Mitochondrial DNA D-loop sequences suggest a Southeast Asian and Indian origin of Zimbabwean village chickens", Anim Genet, 39(6), pp.615-622. 47. Nguyen Dang Ton, Dich Thi Kim Huong, Vu Hai Chi, Huynh Thu Hue, Le Thi Thuy, Nong Van Hai (2008), "Polymorphism of mitochondrial and DNA control (D-loop) region in four Vietnamses chicken breeds", 13 th AAAP Animal Sciences Congress Hanoi - Vietnam September 22 - 26, 2008. 48. Nishibori M., Shimogiri T., Hayashi T., Yasue H. (2005), “Molecular evidence for hybridization of species in the genus Gallus except for Gallus varius”, Anim Genet, 36(5), pp.75-367. 49. Niu D., Fu Y.D., Luo J., Ruan H., Yu X.P., Chen G., Zhang Y.P. (2002), “The origin and genetic diversity of Chinese native chicken breeds”, Biochem Genet, 40(5-6), pp.74-163. 50. Oka T., Ino Y., Nomura K., Kawashima S., Kuwayama T., Hanada H., Amano T., Takada M., Takahata N., Hayashi Y., Akishinonomiya F. (2007), "Analysis of mtDNA sequences shows Japanese native chickens have multiple origins", Anim Genet, 38(3), pp.187-293. 51. Randi E., Lucchini V. (1998), “Organization and evolution of the mitochondrial DNA control region in the avian genus Alectoris”, J Mol Evol, 47(4), pp.449-462. 52. Razafindraibe H., Mobegi V.A., Ommeh S.C., Rakotondravao M.L., Bjørnstad G., Hanotte O., Jianlin H. (2008), "Mitochondrial DNA origin of indigenous malagasy chicken", Ann N Y Acad Sci, 1149, pp.77-79. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 72 63. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kurmar S. (2007) “MEGA4: Molecular evolution genetics analysis (MEGA) software version 4.0”, Mol Biol Evol, 24, pp.1596-1599. 64. Yamamoto Y., Kakizawa R., Yamagishi S. (2006), “Mitochondrial Genome Project on Endangered Birds in Japan: 2. Red-tailed Tropicbird, Phaethon rubricauda”, J Ymashina Inst Ornithol, 37, pp.137-146. PHỤ LỤC MỘT SỐ HÌNH ẢNH CỦA 3 GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU Gà Ri (Hà Nội) Gà Đông Tảo (Hƣng Yên) Gà Tre (Long An)