Luận văn Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển d-Loop ty thể của ba giống gà: ri, mông và đa cựa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ––––––––––––––––––––––––– HỨA THỊ NGA NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH PROTEIN HUYẾT THANH VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng - Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên đã hƣớng dẫn tôi tận tình, chu đáo trong quá trình tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản khóa luận này. Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tôi đã đƣợc các anh chị NCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim Hƣơng, CN Vũ Hải Chi - cán bộ nghiên cứu trong phòng quan tâm, hƣớng dẫn và cho tôi những lời khuyên quý báu. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào Tạo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà...................................................16 Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số ............................................................. 33 Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR ...................................... 36 Hình 3.3. So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 ................................. 40 Hình 3.4. Quan hệ di truyền của một số giống gà ......................................... 42 Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh. ............................. 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.1. Hóa chất ............................................................................................. 22 2.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 23 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 23 2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật ................. 23 2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................................ 24 2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ....................................................... 25 2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR .............................. 27 2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA ................................................................... 29 2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự ............................................................ 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ .................... 31 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ................................. 31 3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể .................................. 33 3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể ............................. 37 3.2. THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM ............. 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Gần một thế kỉ qua ngành chăn nuôi gia cầm đƣợc cả thế giới quan tâm và phát triển mạnh cả về số lƣợng và chất lƣợng. Chăn nuôi gia cầm chiếm một vị trí quan trọng trong chƣơng trình cung cấp protein động vật cho con ngƣời. Gia cầm chiếm 20-25% trong tổng sản phẩm thịt, ở các nƣớc phát triển thịt gà chiếm tới 30% hoặc hơn thế nữa. Ở nƣớc ta ngành chăn nuôi gia cầm là một nghề sản xuất truyền thống, giữ vị trí quan trọng thứ hai trong tổng giá trị sản xuất. Đàn gia cầm ở nƣớc ta phân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (66%), ở các tỉnh phía Nam chiếm 34%. Đàn vịt thì ngƣợc lại phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Nam (60%) và ở miền Bắc đàn vịt chỉ chiếm khoảng 40%. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, số lƣợng đàn gia cầm của nƣớc ta đến ngày 1/8/2004 là 218,15 triệu con, tƣơng đƣơng với số đầu con năm 2001 (218,1 triệu con) thấp hơn năm 2002 ( 233,3 triệu con) và năm 2003 (254,06 triệu). Sản lƣợng thịt là 316,41 ngàn tấn, thấp hơn năm 2001 (322,6 ngàn tấn), năm 2002 (338,4 ngàn tấn) và 2003 (372,72 ngàn tấn). Sản lƣợng trứng là 3,94 tỷ quả, thấp hơn năm 2001 (4,16 tỷ quả), 2002 (4,85 tỷ quả) và 2003 (4,85 tỷ). Nguyên nhân là do ảnh hƣởng của dịch cúm gia cầm [10].Năm 2005, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã hoàn thành việc xây dựng đề án đổi mới hệ thống chăn nuôi gia cầm ở nƣớc ta. Theo đề án, ngành chăn nuôi gia cầm phải chuyển đổi mạnh từ chăn nuôi phân tán, quy mô nhỏ sang sản xuất hàng hóa lớn theo hƣớng công nghiệp hóa và bán công nghiệp trên cơ sở có quy hoạch vùng chăn nuôi hàng hóa tập trung tại từng địa phƣơng; mục tiêu là đến năm 2015, tổng đàn gia cầm đạt 560-580 triệu con, khối lƣợng thịt 1000 nghìn tấn , sản lƣợng trứng 11,0 tỷ quả và tổng giá trị sản xuất chăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mô máu của gà Ri, gà Mông, và gà Đa cựa. - Phân lập vùng D-Loop của hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR. - Xác định trình tự vùng D-Loop và so sánh với trình tự tham khảo đã đƣợc công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế. Trên cơ sở đó, đánh giá sơ bộ về sự khác biệt di truyền giữa ba đại diện của ba giống gà nói trên. Từ đó cung cấp dữ liệu ban đầu cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền và cải tạo giống gà bằng Công nghệ gen và Công nghệ tế bào. - Dùng phƣơng pháp điện di để điện di huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà từ đó phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà nói trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà Các giống gà hiện nay đƣợc hình thành từ quá trình lai tạo, tiến hóa lâu dài và phức tạp của 4 loại hình sau của gà rừng. - Gallus Bankiva: Phân bố ở Miến Điện, Đông Dƣơng và Philippin. - Gallus Soneratii: Phân bố ở Tây và Nam Ấn Độ. - Gallus Lafazetti: Phân bố ở Sri Lanca. - Gallus Varius: Phân bố ở Inđônêxia. Ở các vùng thung lũng sông Ấn, sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà diễn ra ở thời kỳ đồ đồng, khoảng 3000 năm trƣớc Công nguyên (CN). Vào khoảng 2000 năm trƣớc CN gà đƣợc đƣa sang Trung Quốc. Sau đó gà phân bố ở Hy Lạp, ở đây gà vừa là con vật để làm cảnh, tế lễ, và giải trí (chọi gà). Thông qua ngƣời Hy Lạp có mối quan hệ buôn bán rộng rãi mà gà đƣợc đƣa sang các nƣớc thuộc miền Địa Trung Hải và giữa Châu Âu. Đến thế kỉ I gà nuôi đã đƣợc phân bố rộng rãi ở Trung Âu và Đông Âu. Dẫn theo Nguyễn Đình Ân và nhiều tác giả, trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau: Giới Động vật (Animalia) Nghành Động vật có xƣơng sống (Chordata) Lớp Chim (Aves) Bộ Gà (Galliformes) Họ Trĩ (Phasianidae) Giống Gallus Loài Gallus gallus Phân loài Gallus gallus domesticus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 lông gà Mông thƣờng rất đa dạng: Vàng rơm, nâu, đen, xám, hoa mơ, trắng...... Về tập tính, trƣớc đây, gà Mông đƣợc nuôi thả tự do nên tập tính có phần hoang dại. Ban ngày gà đƣợc thả rông tự kiếm ăn, tối về chuồng hoặc đậu trên cây ngủ. Thức ăn có thể là giun, dế, ngô, thóc....., ngƣời nuôi ít cho ăn thêm. 1.1.2 Là giống gà địa phƣơng đƣợc nuôi ở chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía bắc trong các gia đình dân tộc thiểu số. Tầm vóc tƣơng đối lớn, màu sắc lông đa dạng: Xám, vàng, đỏ nâu.....Phẩm chất thịt ngon, ít mỡ. Gà có khả năng chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật. Đặc điểm đặc biệt dễ nhận thấy là chân có nhiều cựa nên đƣợc gọi là gà Đa cựa. 1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ Sinh học phân tử nghiên cứu ở mức độ phân tử các phản ứng sinh học xảy ra trong tế bào. Hoạt động của từng gen cũng nhƣ sự phối hợp giữa các gen; Kiểm soát sự phiên mã, dịch mã cũng nhƣ sự phân bố của các protein trong tế bào; các phản ứng sinh học đảm bảo hoạt động sống của tế bào cũng nhƣ điều hòa hoạt động giữa các tế bào trong một mô, giữa các mô với nhau.... Sự phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA bởi James D.Watson và Francis H.C. Crick (1953) chính thức khởi đầu cho thời kì hiện đại của sinh học phân tử. Trải qua hơn nửa thế kỉ sinh học phân tử đã đạt đƣợc những thành tựu vĩ đại mà đỉnh cao của sự phát triển này là những khám phá bản chất sinh học của sự sống ở cấp độ phân tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng vào thực tiễn. Geneomics và Proteomics là vấn đề đang đƣợc quan tâm đặc biệt hiện nay mà cơ sở của các lĩnh vực này là những phát hiện về cấu trúc và chức năng của axit nucleic, về đặc điểm của genome nhân, genome ty thể, genome lạp thể. Những đặc điểm khác nhau về cấu trúc và chức năng của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết thanh máu Trong những năm gần đây, nhờ các phƣơng pháp và kỹ thuật phân tích sinh hóa hiện đại phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là phƣơng pháp điện di và các phƣơng pháp nhuộm hóa tế bào đã góp phần quan trọng để nghiên cứu, phát hiện cấu trúc enzym của protein huyết thanh, sữa, các kiểu hemoglobin…trên cơ sở đó nghiên cứu cơ chế phân tử của trao đổi chất, hoạt động của gen trong tế bào. Nhiều dẫn liệu trong lĩnh vực phân tích tính đa hình di truyền của các tính trạng hóa sinh đã đƣợc ứng dụng trong công tác chọn giống vật nuôi một cách có hiệu quả. Các tính trạng hoá sinh là những tính trạng muốn xác định nó, ngƣời ta phải dùng các phƣơng pháp phân tích hoá học, hoá sinh học. Hƣớng nghiên cứu di truyền học hoá sinh ngày càng phát triển mạnh mẽ trên tất cả các đối tƣợng vi sinh vật, thực vật, động vật và ngƣời. Nhờ cải tiến các kĩ thuật phân tích hoá sinh ngày càng hiện đại, chính xác, có sự kết hợp giữa các máy phân tích tự động với máy vi tính đã rút ngắn khá nhiều thời gian phân tích các tính trạng tới hàng trăm, hàng nghìn lần. Nghiên cứu tính đa hình di truyền của hemoglobin, protein, huyết thanh máu, protein trong sữa hoặc các enzym trong máu và các cơ quan…..đã đƣợc tiến hành từ lâu. Năm 1955, Smithies O. đã chứng minh tính đa dạng di truyền các protein huyết thanh máu động vật. Ông đã dùng hai phƣơng pháp chính là: Phƣơng pháp miễn dịch học phát hiện nhóm globin, lipoprotein…và phƣơng pháp miễn dịch học phát hiện hemoglobin, haptoglobin, transferin. Nhiều nhà nghiên cứu về sau đã sử dụng các phƣơng pháp điện di trên giấy, trên gel tinh bột, gel agarose, gel polyacrylamide…để xác định tính đa hình của hemoglobin, các protein trong máu, mô cơ quan, sữa, trứng và các enzym trong máu, trong các dịch của cơ thể. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Giữa hai lớp màng trong và màng ngoài có chứa dịch kẽ màng. Mặt ngoài của lớp ngoài và mặt trong của lớp trong có chứa nhiều hạt với kích thƣớc từ 80- 90 A o chứa các enzyme và cofacto. Ty thể nhƣ một nhà máy để sản sinh ra năng lƣợng của tế bào. Hệ thống sản sinh ra năng lƣợng trong ty thể bao gồm hai quá trình oxy hóa và photphoril hóa. Quá trình oxy hóa giải phóng ra các điện tử, các điện tử tác dụng nhƣ tác nhân tích lũy và biến đổi năng lƣợng. Trong điều kiện nếu thiếu oxy sẽ diễn ra quá trình tổng hợp ATP là chất tích lũy năng lƣợng dƣới dạng các cầu nối photphát giầu năng lƣợng. Tại ty thể sẽ tiếp nhận các sản phẩm đƣợc phân giải từ các chất nhƣ protein, lipit và gluxit diễn ra trong bào tƣơng đến dạng pyruvat và chuyển sang dạng Axetyl coenzimA. Trong ty thể, axetyl coenzimA đã qua quá trình oxy hóa trong chu trình Krebs. Với chu trình này, đã có bốn lần giải phóng 2H+ nghĩa là giải phóng hai điện tử. Các ion H+ giải phóng ra đƣợc các chất vận chuyển H+ tiếp nhận chuyển vào chuỗi hô hấp và cuối cùng chuyển hydro cho oxy. Trong chuỗi hô hấp, năng lƣợng giải phóng đƣợc tích lại dƣới dạng ATP. Ty thể còn có đặc điểm là trong dịch nền của nó có những hạt DNA và ARN. Ty thể đã sử dụng DNA làm khuôn mẫu để sản sinh ra ty thể mới. 1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể Nhờ có đủ các nhân tố riêng của mình (mtDNA, mARN, tARN và riboxom) nên ty thể có thể tự tổng hợp các protein cho mình. Sự tổng hợp protein cũng diễn ra trên riboxom theo cơ chế chung, nhƣng axit amin khởi động, giống nhƣ ở Bacteria là N-fomyl- methionin, chứ không phải methionin nhƣ ở tế bào Eukaryota. Ty thể không thể tự tổng hợp tất cả protein của ty thể bởi vì mtDNA chỉ chứa lƣợng nucleotit mã hóa cho khoảng 500 axit amin. Rất nhiều protein của ty thể đƣợc tổng hợp từ mạng lƣới nội chất có hạt trong tế bào chất theo mã của các gen trong nhiễm sắc thể của nhân, sau đó đƣợc vận chuyển vào ty thể. Ty thể tự tổng hợp một số protein không hòa tan cần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 này có đặc điểm: Thứ nhất, kiểu gen của con hoàn toàn do mẹ quyết định. Nếu mẹ mang đột biến ở gen bào quan thì con sẽ có kiểu hình đột biến cho dù bố bình thƣờng. Thứ hai, ảnh hƣởng đến kiểu di truyền này là số lƣợng bản sao nhiễm sắc thể trong bào quan. Phân tử mtADN có các đặc điểm chú ý sau: - Tốc độ đột biến lớn gấp 5 lần so với gen nhân. - Số lƣợng bản sao lớn. - Đơn bội, không có sự tái tổ hợp. - Chỉ di truyền theo dòng mẹ. Mt DNA của động vật có xƣơng sống nói chung có dạng vòng kép, gồm một chuỗi nặng (chuỗi H) giàu Guamin, và một chuỗi nhẹ (chuỗi L) giàu cytozin, có chiều dài khoảng 5µm. Phân tử mtDNA không liên kết với protein histone, có khả năng tái bản theo cơ chế bán bảo toàn nhờ sử dụng các enzyme DNA polymerase trong chất nền ty thể. Ở đa số các động vật, phân tử mtDNA chứa khoảng 16-17kb, mã hóa cho các loại protein/enzyme tham gia vào các quá trình tổng hợp năng lƣợng, trao đổi chất...của tế bào, trong đó gồm 22 loại tRNA, 2 loại rRNA 16S và 12S, 13 chuỗi polypeptide [15, 25]. Tất cả các động vật có xƣơng sống đã đƣợc phân tích đều có 37 gen trên phân tử DNA ty thể và thƣờng không có khoảng trống giữa các gen (không có intron). Tuy nhiên, trật tự sắp xếp các gen trong phân tử DNA dạng vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này đƣợc thể hiện rõ khi so sánh trình tự genome ty thể các bậc taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu phân loại với các taxon bậc cao [30]. Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 lần so với các gen nhân do thiếu cơ chế sửa chữa DNA do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong cùng một loài. Bên cạnh đó, các biến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, Công , Trĩ, chim Cun cút...dựa trên các phân tích đoạn điều khiển ty thể. Kết quả phân tích đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đƣa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định đƣợc trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA. Kết quả nhận đƣợc đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển mtDNA là điểm đặc trƣng của giống Gallus. Randi và cộng sự (1997) [19]; Scott(1997) [24] phân tích trình tự của một phân đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-Loop)của 2 loài gà lôi đặc hữu ở Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này. Năm 1999, Kimball và cộng sự [21] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ của gen cytochrom b (1143 bp) và đoạn siêu biến 1 (350 bp) của vùng điều khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô. Hai cây phân loại đƣợc xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận đƣợc trên một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết quả phân tích trên toàn bộ gen cytochrom b, điều này cho thấy trình tự vùng điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại. Năm 2001, D.Niu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và đánh giá đa dạng di truyền 6 giống gà bản địa của trung Quốc. Họ giải trình tự 539 nucleotide vùng trình tự D-Loop của 6 giống gà, so sánh với trình tự nucleotide của các giống gà G. gallus, G.sonneratii, G.varius, G. lafayettei lƣu giữ trong GenBank và thiết lập cây chủng loại phát sinh giữa các giống. Đồng thời, dựa trên đoạn trình tự phân tích đƣợc họ cũng nhân thấy sự khác biệt đáng kể về mặt di truyền giữa các giống gà chuyên trứng và các giống nuôi với mục đích khác, chủ yếu là do sự khác biệt về dòng mẹ giữa các giống [31]. Năm 2002 Zang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nucleotide đầu tiên trong vùng D-Loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Năm 2006 Địch Thị Kim Hƣơng và cộng sự [6] đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1277 nucleotide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lƣơng Phƣợng, đã phát hiện đƣợc 22 vị trí khác biệt về nuclotide giữa hai đại diện. Năm 2007 Lê Đức long và cộng sự đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái đƣợc nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định đƣợc 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này. Năm 2008 Nguyễn Trƣờng Huy và cộng sự [5] đã xác định đƣợc trình tự 300 nucleotide đầu tiên trong đoạn D-Loop của 4 mẫu thuộc 4 giống gà: Gà Ác, gà Mía, gà Hồ và gà Mông và so sánh với trình tự tƣơng ứng trên đoạn D-Loop 2 giống gà Leghorn và gà bản địa Lào. Dựa trên cây chủng loại phát sinh xây dựng đƣợc, có thể đƣa ra kết luận sơ bộ về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc 4 giống gà nghiên cứu so với 2 giống gà đƣợc chọn để so sánh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA đƣợc tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phƣơng pháp ly tâm. • Quy trình kĩ thuật Làm tan máu đông lạnh ở 37-39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia máu vào các ống eppendof 1,5 ml với thể tích 500µl/ống, tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [35] các bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1: Hòa tan 500 µl PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4oC, đổ dịch, thu cặn. Bƣớc 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 µl proteinase K. Mẫu thu đƣợc ủ ở 65oC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống Epp 500 µl dịch. Bƣớc 3: Bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng Phenol: Chlroform: Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4oC. Hút pha trên vào ống mới. Bƣớc 4: Thêm một thể tích tƣơng đƣơng Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4oC. Thu pha trên. Bƣớc 5: Thêm CH3COONa một lƣợng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20oC trong 15h (qua đêm). Bƣớc 6: Ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung 500µl cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC, bỏ dịch và thu cặn. Bƣớc 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hòa tan cặn trong 50 µl H2O, búng nhẹ. 2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose • Nguyên tắc chung Điện di là kĩ thuật dùng để tách và định lƣợng axit nucleic với các kích thƣớc và hàm lƣợng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO4 3- trên bề Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy . 2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (polimerase chain reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên đƣợc Mullis và cộng sự mô tả năm 1986. • Nguyên tắc: Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại invitro một trình tự DNA lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất thuận lợi cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene từ những đoạn DNA ngắn đƣợc phân lập hoặc từ một lƣợng rất nhỏ lấy ra đƣợc khuếch đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp. Đồng thời nó giúp cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự DNA trong bộ gene của các cơ thể sinh vật khác nhau. Phản ứng chuỗi polimerase đƣợc thực hiện khi có DNA mẫu, 2 đoạn mồi, Taq polimerase, bốn loại deoxyronucleotit triphotphat( dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng chuỗi PCR đƣợc thực hiện trên thiết bị nhân DNA. Một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau: - Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng kép sang sợi đơn ở nhiệt độ 94o- 95oC trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1- 1.5 phút) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự • Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-Loop đƣợc xác định dựa trên nguyên tắc chung của phƣơng pháp Sanger: Tạo ra các đoạn Oligonuclotide hơn kém nhau 1 nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDya Terminator v3.1 Cycle Squencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs,ddNTPs, DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn và mồi phù hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đx đƣợc đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, 200ng DNA khuôn, BigDye và nƣớc với tổng thể tích là 15 µl. Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 96oC 50oC 60oC 4oC Thời gian 1' 10'' 5'' 4' ∞ Số chu kì 1 25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba giống gà Ri, Mông, Đa cựa chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, xác định trình tự của vùng D-Loop. Từ đó, so sánh các trình tự này để tìm ra sự khác biệt giữa chúng. 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà Để tiến hành đánh giá đa dạng di truyền các giống gà, vấn đề quan trọng đầu tiên là phải thu nhận đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch và không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết DNA từ máu động vật nhƣng việc lựa chọn một phƣơng pháp tách chiết có nhiều ƣu điểm và phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu cho nên chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russel để tách chiết DNA. Trƣớc tiên, máu đông đƣợc làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39oC trong 2 giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian nhƣ vậy, plasminogen trong huyết tƣơng sẽ đƣợc chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein nhƣ fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào đƣợc giải phóng. Sau khi rã đông đem ly tâm dung dịch máu đã đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối này có tác dụng duy trì dộ pH của máu. Các tế bào thu đƣợc đem hòa tantrong dung dịch đệm tách có chứa EDTA và SDS. Sự có mặt của SDS làm cho màng tế bào bị phá vỡ và giải phóng DNA ra môi trƣờng. Thành phần EDTA sẽ liên kết với các Mg2+, nhờ vậy mà hoạt động của các nuclease bị ức chế. Nhƣ vậy, cả SDS và EDTA đều Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 1: DNA tổng số gà Ri; 2: DNA tổng số gà Mông; 3: DNA tổng số gà Đa Cựa Trên ảnh điện di, các mẫu đều xuất hiện một vạch DNA sáng đậm ở vị trí cao nhất trên bản gel. Theo lý thuyết, DNA tổng số bao gồm các đoạn có kích thƣớc từ 10 kb đến 300 kb, khi điện di sẽ tập trung thành một vạch đậm. Nếu DNA tách chiết đƣợc có lẫn protein, các phân tử protein chƣa đƣợc loại hoàn toàn sẽ tạo thành vạch sáng kéo dài phía trên vạch DNA tổng số. Hình 1.3 cho thấy sản phẩm DNA tách chiết ít bị lẫn protein tạp và dựa vào độ sáng của vạch DNA tổng số, có thể thấy nồng độ DNA thu đƣợc khá cao. Chúng tôi kết luận DNA tổng số tách chiết từ các mẫu máu gà đảm bảo chất lƣợng để phục vụ các thí nghiệm tiếp theo. 3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể Tốc độ tích lũy đột biến trong vùng trình tự điều khiển cao gấp 5-10 lần so với các gen khác trong hệ gen ty thể, do đó nó rất có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu đa dạng sinh học và sự phát sinh chủng loại của sinh vật. Nhằm mục đích đánh giá tính đa dạng di truyền của 3 giống gà Ri, Mông và Đa cựa, chúng tôi đã sử dụng vùng trình tự D-Loop trong hệ gen ty thể làm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 - Thành phần cuối cùng của PCR là DNA khuôn có chứa trình tự đích cần nhân lên, nó phải đảm bảo yêu cầu đƣợc tinh sạch và ít bị đứt gãy. Thông thƣờng, hàm lƣợng DNA khuôn trong mỗi hỗn hợp phản ứng là 10 - 100ng/ phản ứng. Sản phẩm PCR đƣợc bảo quản ở 4oC. Sau khi đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8%. Kết quả thu đƣợc thể hiện trên hình 3.2. Hình M: Marker; 1: Mẫu gà RI; 2: Mẫu gà Mông; 3: Mẫu gà Đa Cựa Quan sát ảnh chụp kết quả điện di, cả 3 mẫu đều xuất hiện băng DNA nằm ở vị trí giữa vạch 1,5 kb và 1 kb trên thang kích thƣớc chuẩn (marker), cho thấy kích thƣớc phân tử của sản phẩm PCR vào khoảng 1,3 kb, tức là phù hợp với tính toán theo lý thuyết. Các băng sáng đậm, rõ nét, tập trung và chỉ nhìn thấy băng phụ rất mờ bên dƣới chứng tỏ sản phẩm PCR tƣơng đối đặc hiệu. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã nhân đƣợc vùng D-loop. Sản phẩm PCR đặc hiệu chứng tỏ chƣơng trình đã lựa chọn và nồng độ các chất tham gia phản ứng là phù hợp. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể Đoạn D-Loop đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Sanger. Do xác định trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR nên chúng tôi sử dụng cặp mồi H1255 và L16725 làm cặp mồi cho 2 chiều đọc. Sở dĩ phải dùng cả mồi xuôi và mồi ngƣợc vì đoạn DNA cần xác định trình tự dài 1,3 kb trong khi ở điều kiện thí nghiệm tối ƣu, chỉ có thể xác định trình tự tối đa 900 - 1000 nuclotitde. Kết quả đƣợc kết hợp và xử lý bằng phần mềm Seqscape và BioEdit giúp xác định đƣợc trình tự đầy đủ của vùng D-Loop của các mẫu gà. Do mẫu gà Mông đọc trình tự gặp phải khó khăn nên trình tự D-Loop của gà Mông chƣa đầy đủ. Vì vậy chúng tôi công bố và so sánh kết quả hai mẫu Da và RI. So sánh trình tự Da và RI với nhau và với trình tự D-Loop của gà đã đƣợc công bố Galuss galuss gốc Nhật lấy trình tự trong trên ngân hàng gen mang mã số AB114078 quốc tế EMBL (EBI)/Gen Bank/DDBJ, chúng tôi thu đƣợc kết quả hình 3.3. A B 11 40 78 aa tt tt a t tt t tt aa cc t a a c t cc cc t a c t a a g t g t a c cc c cc c t tt cc c cc cc a g gg gg D A G . C G .. T. A . . .. T . .. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . .. . .. . . .. .. . .. .. . . .. .. R I C . .. .. . . .. . .. .. .. . . . . . .. .. . . . . . . . . . . . . .. . .. . . .. .. . .. .. . . .. .. A B 11 40 78 gg t a t a c t a t g c a t a a t c g t g c a t a c a t tt a t a t a c c a c a t a t a t t a t g g t a cc gg t a a t D A .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . R I 1 .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . A B 11 40 78 a t a t a c t a t a t a t g t a c t a a a c cc a t t a t a t g t a t a c g gg c a t t a a c c t a t a tt cc a c a t D A . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . T . . . . . .. .. . . . . R I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. .. . . . . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 A B 11 40 78 c a aa aa tt t a c a t g c c a c t t aa c t cc cc t c a c a a a c aa t c g tt a t tt a t a tt g t t a a t t a D A . . .. .. .. . . . . . . . . . . . . .. . . .. .. . . . . . . . . .. . . . .. . . .. . . . .. A . . . . . . . R I . . .. .. .. . . . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . .. . . . .. . . .. . . . .. . . . . . . . . A B 11 40 78 g c aa a c a c aa a a c cc g c c t t D A . . .. . . . . .. . . . .. A . . . . R I . . .. . . . . .. . . . .. . . . . . -Loop c ) So sánh hai mẫu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự chuẩn chúng tôi thấy có 16 điểm đa hình/ đột biến (khác biệt nucleotide). Mẫu gà Da có 15 điểm (chiếm 1,23%) và RI có 4 điểm (chiếm 0.33%) khác với trình tự chuẩn. Cả hai giống thuộc mẫu gà Da và RI đều có cùng sự khác biệt nucleotide so với trình tự chuẩn AB114078 đó là các đột biến: Thay thế C bằng T ở vị trí 355, thay thế A bằng T ở vị trí 504 và vị trí 992. Ngoài ra giữa hai giống thuộc mẫu gà Da và RI còn có sự khác biệt với nhau ở 14 điểm đa hình ở các vị trí: Mẫu Da đột biến thay A thành G ở vị trí 1; đột biến thay G thành A ở vị trí 212, 792, 1193,1216; đột biến thay A thành T ở vị trí 7, 14; đột biến thay T thành A ở vị trí 9; đột biến thay T thành C ở vị trí 3, 225; đột biến C thành T ở vị trí 246, 315; Mẫu RI đột biến thay A thành C ở vị trí 1. Các sai khác giữa các mẫu là đột biến kiểu đồng hoán, và dị hoán đƣợc thống kê ở bảng 3.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 Đƣờng chạy M: Thang protein marker chuẩn; Đƣờng chạy 1 đến 3: Dung dịch huyết thanh pha loãng của ba đại diện của giống gà Ri Mông và Đa cựa. Kết quả điện di cho thấy hệ protein trong huyết thanh gà tƣơng đối phức tạp về thành phần và hàm lƣợng: số lƣợng băng – vạch thu đƣợc rất nhiều nhƣng cũng rất đa dạng về hàm lƣợng. Trong khi đa số các băng protein đều nhỏ và có hàm lƣợng thấp thì 2 protein có hàm lƣợng lớn nhất trong huyết thanh là Albumin (chiếm từ 50 – 75%) và IgG (khoảng 10%) lại hiện băng khá lớn. Số băng điện di protein huyết thanh gà thí nghiệm dao động từ 7 đến 10 băng. Trong đó gà Ri có 10 băng, gà Mông có 8 băng, gà Đa cựa có 9 băng. Trong đó gà Ri xuất hiện thêm 4 băng ở các kích thƣớc: 15.4 KDa; 16.4Kda ; 32Kda ; 36KDa . Gà Mông xuất hiện băng 16.4 Kda, 32Kda; mất băng 14.4 Kda, 15.4KDa; Gà Đa cựa xuất hiện băng 15.4Kda; 16.4Kda ;32Kda ;mất băng 14.4. Quan sát hình ta thấy băng Albumin của gà Đa cựa là lớn nhất, băng lớn thứ 2 là gà Mông, băng nhỏ nhất là băng của gà Ri. Hàm lƣợng IgG (protein miễn dịch) của gà Đa cựa lớn nhất biểu hiện ở băng ta thấy đậm và lớn nhất so với băng của gà Mông và gà Ri. Điều đó có khả năng gà Đa cựa có hệ thống miễn dịch tốt hơn so với gà Mông và gà Ri, có tác dụng chống chịu với điều kiện khí hậu khắc nghiệt, chống lại các kháng nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể và có vai trò quan trọng trong bảo tồn nòi giống. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 11. Lê Minh (2002), Ảnh hưởng của thuốc Avicoc và Rigecocsin đến khả năng sản xuất gà thịt Lương Phượng và Sasso nuôi bán chăn thả tại Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Đại Học Thái Nguyên. 12. Trần Thanh Vân, Hoàng Văn Tiêu, Nguyễn Khánh Quắc (1997), Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu vịt Khakicampbell, vịt cỏ và con lai F1 của chúng nuôi chăn thả tại Thái Nguyên, Báo cáo khoa học NCTY, hội nghị khoa học Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn 8/1997 Nha Trang, Khánh Hòa. 13. Kim Thị Phƣơng oanh (1999), Ứng dụng các phương pháp sinh học phân tử trong nghiên cứu sự khác biệt di truyền ở một số loài gà lôi Việt Nam, luận án Thạc sĩ Sinh học, trƣờng Đại Học Sƣ Phạm, ĐHQG Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14. Baker A. J., Marshall H. D. (1997), "Mitochondrial control region sequences astools of understanding evolution of avian taxa", In "Avian Molecular Systematics and Evolution" (Mindell D. P., Ed), 51-80, Academic Press, San Diego. 15. Chinnery P. F., Schon E. A. (2003), "Mitochondria", J. neurol. Neurosurg. Psychiatry, 74: 1188-1199. 16. Desjadins P., Morais R. (1990), "Sequence DNA gene organisation of the chicken mitochondrial genome, A novel gene order in higher vertebrates", J.Mol.Biol.,212,pp.599-635). 17. Ingman M.,(2001), Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 18. Ingman M.,(2003), summaries of Uppsala Dissertations from the Faculty of Medicine 1288. 50, Acta University, Uppsala. 19. Gilbert, A.B (1971), "The egg, ist physical and biochemical aspectc", In:domestic fowl, Bd.3, Academic press, London/ NewYork,1971). 20. Hillis D. M., Moritz C., Mable B. K., 1996. Molecular Systematics. Sinamer Associates, Inc., second edition. 21. Kimball R.T.,Braun E.L., Zwarrtjes P.W., Crowe T.M.(1999),and ligon J.D.A Molecula phylogeny of the pheasants and partridges suggests that these lineages are not monophyletic. Mol. Phylogenet. Evol., 11(1)tr.38-54). 22. Komiyama T., Ikeo K., Tateno Y., Gojobori T. (2004), "Japanese domesticated chickens have been derived from Shamo traditional fighting cocks", Mol. Phylogenet. Evol., 33(1):16-21). 23. Komiyama T., Ikeo K., Gojobori T (2004)," The evolutionary origin of long-crowing chicken: its evolutionary relationship with fighting cocks disclose by the mtDNA sequence analysis", Gene,333: 91-99)) 24. krist L.(2000), Phylogeny DNA phylogeography of European parids, Oulu university, Oulu). 25. Kris L (2002) "Phylogeny and phylogeography of Euro pean Parids", chapter 1. Introduction: Evolution and mitochondrial DNA in birds. Department of Biology, Oulu Universsity library. 26. Laemli U.K(1970), Cleava of structural proteins during the assembly of head of baterio phage T4, Nature, 277, pp.680.685. 27. Lander E. S., Botstein D. (1989), "Mapping Mendelian factors underlying quantitive traits using RFLP linkege maps", Genet. 121: 185-199. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50 28. Litti M., Luty J. A. (1989), "A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of dinucleotide repeat winthin the cardiac muscle actin gene", Am. J .hum. Genet. 44:397-401. 29. Moulin S., Randi E., Tabarroni C., Hennache A.(2003),"Mitochondrial DNA diversification among the subspecies of the Silver and Kalij pheasants, Lophura nycthemera and L. leucomelanos, phasinidae", Ibis, 145(online), E1-E11.) 30. Mindell D. P, Sorenson M. D., Dimcheff D. E (1998), "Multi endependent origins of mitochondrial gene order in birds", Mol. Biol. Evol., 95, pp. 10693-10697. 31. Niu D., Fu Y., Luo., Ruan H., Yu X., Chen G., Zhang Y. (2002),"The origin and genetic diversity of Chinese native chicken breeds",Biochem. Genet., 40:5-6.) 32. Niu D., Fu Y., Luo J., Ruan H., Yu X.P., Chen G., Zang Y. P. (2002),"The origin DNA genetic diversity of Chinese native chicken breeds", Biochem. Gene., 40(5),pp. 163-174)) 33. Fuhimito A., Miyake T.,Takada M., Shinggu R., Endo T., Gojobori T., Kondo N., Ohno S.(1996), "Monophyletic origin DNA unique dispersal patterns of domestic fowls", Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 93(13),pp.6792-6795). 34. Pereira S. L., Bakern A. J (2004),"Low number of mitochondrial pseudogenes in the chiken (GALLUS GALLUS) nuclear genome: implications for molecular inference of population history DNA phylogenetics", BMC Evol. Biol., 4(17).) 35. SambrookJ., Russell D.W, (2001), Moleular Cloning: Alabroratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory press, NewYork.