Tài liệu Luận văn Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp: -1-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
ĐẶT VẤN ĐỀ
“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa
mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của
nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang
trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,
2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu
đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5%
dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một
người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái
tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do
biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên
quan tới đái th...
4 trang |
Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1954 | Lượt tải: 1
Bạn đang xem nội dung tài liệu Luận văn Nghiên cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
-1-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
ĐẶT VẤN ĐỀ
“Thế kỷ 21 là thế kỷ của các bệnh Nội tiết và các Rối loạn chuyển hóa
mà điển hình là bệnh đái tháo đường (Bệnh tiểu đường)”. Nhận xét này của
nhóm chuyên gia về dự báo tình hình bệnh tật của Tổ chức Y tế thế giới đã đang
trở thành hiện thực với những con số cụ thể. Theo Tổ chức Y tế thế giới (WHO,
2008) [77], hiện nay trên toàn thế giới có khoảng 180 triệu người mắc bệnh tiểu
đường và ước tính con số này sẽ tăng gấp đôi vào năm 2030, chiếm khoảng 5%
dân số thế giới. Đáng lo ngại hơn là các biến chứng của bệnh, cứ 10 giây có một
người tử vong do nguyên nhân đái tháo đường, cứ 30 giây lại có một người đái
tháo đường bị cắt cụt chi và cứ mỗi ngày có 5000 người mất khả năng nhìn do
biến chứng mắt của bệnh. Mỗi năm có hơn 3,2 triệu người chết vì các bệnh liên
quan tới đái tháo đường tương đương với số người tử vong vì bệnh HIV/AIDS [1].
Bệnh tiểu đường (BTĐ) đang trở thành gánh nặng cho mỗi nền kinh tế xã
hội, mặc dù mỗi năm hàng nghìn tỷ đôla Mỹ được chi phí cho điều trị bệnh,
nhưng chưa bao giờ và sẽ không bao giờ những chi phí khổng lồ về kinh tế có
thể lấp đầy được những tổn thất, nhất là những mất mát về tinh thần do bệnh tật
gây ra. Thực tế đáng lo ngại hơn là tình trạng bệnh xuất hiện ngày càng nhiều từ
lớp trẻ [1].
Ở Việt Nam, tỷ lệ người mắc BTĐ ngày càng cao và ở các thành phố lớn
tỷ lệ này đã tăng gấp đôi từ 2% lên 4% trong 10 năm giai đoạn 1990-2000. Số
người mắc BTĐ hiện nay khoảng 4,5 triệu người, chiếm 5,7% dân số, trở thành
nước có tốc độ phát triển BTĐ nhanh nhất thế giới [1].
Nguyên nhân của BTĐ là do thiếu insulin hoặc do cơ thể người bệnh
kháng insulin. Insulin là một polypeptide hormone được sinh ra nhờ các tế bào β
của tuyến tụy động vật, có vai trò điều hoà lượng đường trong máu. Phương
-2-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
pháp điều trị BTĐ phổ biến hiện nay là tiêm insulin định kỳ cho người bệnh. Do
số lượng người mắc BTĐ ngày càng cao nên nhu cầu sử dụng insulin càng lớn. Ở
châu Âu, lượng insulin đã tăng lên 3 lần trong vòng 12 năm từ 1995-2007. Theo
ước tính, nhu cầu insulin trên thế giới tăng từ khoảng 5.000kg trong năm 2007
lên khoảng 16.000kg vào năm 2010, với thị trường dự tính khoảng 11,8 tỷ Mỹ
kim [41].
Năm 1978, lần đầu tiên các nhà khoa học của công ty công nghệ sinh học
Genetech đã dòng hóa thành công gen mã hóa cho insulin người vào vector biểu
hiện trong E. coli và đã cho phép công ty Eli Lilly sử dụng kỹ thuật này để sản
xuất insulin người tái tổ hợp với tên thương mại là Humulin. Năm 1982, Humulin
đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực
phẩm Hoa Kỳ) cho phép lưu hành. Hiện nay có nhiều công ty dược phẩm trên
thế giới sản xuất insulin tái tổ hợp như: Eli Lilly, Novo disk, Sanofi Aventis … với
nhiều loại sản phẩm insulin khác nhau. Công nghệ sản xuất insulin hiện nay
thường được tiếp cận theo hai phương pháp: phương pháp một chuỗi polypeptide
và phương pháp hai chuỗi polypeptide. Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp
bằng phương pháp một chuỗi polypeptide bao gồm ba bước cơ bản. Đầu tiên là
bước tạo dòng chủng chủ (thường là E. coli) có khả năng mang gen ngoại tổng
hợp các chất tiền thân của insulin (proinsulin). Đây là khâu then chốt quyết định
sự thành công của công nghệ do cần phải biến đổi các codon thích hợp để tăng
cường hiệu quả biểu hiện. Tiếp theo là bước lên men, cảm ứng biểu hiện, thu
nhận proinsulin và xử lý để thu nhận insulin. Protein được biểu hiện dưới dạng
thể vùi nằm trong tế bào chất, do vậy cần phải biến tính để làm tan, sau đó tiến
hành tái gấp cuộn để có proinsulin có cấu hình tự nhiên. Proinsulin tái gấp cuộn
được xử lý bằng protease cắt loại đoạn nối nội phân tử (đoạn peptide C) để thu
insulin có hoạt tính. Đối với phương pháp sản xuất theo 2 mạch polypeptide,
-3-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
trước hết phải tạo dòng các chủng chủ riêng rẽ mang các gen mã hóa cho 2
chuỗi polypeptide khác nhau (chuỗi A, chuỗi B). Sau đó tinh chế thu nhận các
chuỗi polypeptide A và B và thực hiện phản ứng tạo cầu nối disulfide để thu
nhận insulin có hoạt tính.
Ở Việt Nam, nhu cầu sử dụng insulin rất cao, tuy nhiên toàn bộ nguồn
insulin sử dụng cho bệnh nhân mắc BTĐ đều phải nhập ngoại nên vừa gây tốn
kém ngoại tệ vừa không chủ động được nguồn thuốc để đáp ứng chữa trị kịp thời
cho bệnh nhân. Để đảm bảo cho điều trị toàn bộ bệnh nhân mắc BTĐ hàng ngày
với liều dùng 0,5-1,0 U/kg trọng lượng cơ thể trong một ngày [78], thì Việt Nam
cần phải nhập ngoại khoảng từ 120-240 triệu U/ năm, tương đương 420-840 kg
insulin/ năm (100U =3,5 mg). Năm 2001, giấy phép độc quyền sản xuất insulin
tái tổ hợp chính thức hết hiệu lực, mở ra cơ hội lớn cho các nước đang phát triển
trong đó có Việt Nam, có thể tiếp cận được công nghệ hiện đại để phát triển qui
trình sản xuất insulin người tái tổ hợp trong nước, mang lại triển vọng góp phần
giải quyết khó khăn trên.
Mặc dù bản quyền sản xuất insulin bằng công nghệ DNA tái tổ hợp đã
hết hạn tuy nhiên các công ty dược phẩm vẫn tiếp tục giữ những bí quyết công
nghệ có tính thế mạnh của công ty nên rất khó tiếp cận để có được qui trình
công nghệ đầy đủ nhằm sản xuất insulin. Do vậy, cần phải nghiên cứu xây dựng
qui trình công nghệ riêng dựa trên những thông tin đã công bố và trình độ công
nghệ sẵn có để tiến đến việc sản xuất insulin trong nước đáp ứng được yêu cầu
đặt ra.
Năm 2007, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học quốc gia Thành
phố Hồ Chí Minh được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài cấp nhà nước “Nghiên
cứu công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp điều trị bệnh đái tháo đường”, mã số
-4-
Luận án Tiến sĩ Đặt vấn đề
KC.04.09/06-10. Nội dung nghiên cứu của luận án là thực hiện một phần trong
nội dung của đề tài cấp nhà nước này.
Về mặt khoa học, mục tiêu của luận án nhằm bước đầu nghiên cứu qui
trình tổng hợp insulin người tái tổ hợp theo phương pháp một chuỗi polypeptide
trong E. coli bao gồm tạo dòng E. coli tái tổ hợp biểu hiện mini-proinsulin, lên
men, tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý để tạo insulin có hoạt tính. Ý nghĩa
thực tiễn của đề tài là ứng dụng công nghệ gen, công nghệ lên men và công
nghệ protein để tạo ra chế phẩm insulin có hoạt tính dùng làm thuốc trị bệnh
tiểu đường.
Luận án tập trung nghiên cứu cụ thể các vấn đề sau:
- Tạo chủng E. coli tái tổ hợp có mang vector biểu hiện mini-proinsulin tái
tổ hợp của người.
- Xây dựng qui trình lên men nuôi cấy chủng E. coli tái tổ hợp biểu hiện
mini-proinsulin.
- Thiết lập qui trình thu nhận và tinh sạch mini-proinsulin từ tế bào chủng
E. coli.
- Xây dựng qui trình tái gấp cuộn mini-proinsulin và xử lý thu nhận insulin
có hoạt tính.
- Thử nghiệm hoạt tính insulin tái tổ hợp trên chuột.