Luận văn Nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh trong phân tích urea

iÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA KHOA KYÕ THUAÄT HOAÙ HOÏC LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP ÑAÏI HOÏC NGHIEÂN CÖÙU CHEÁ TAÏO KIT THÖÛ NHANH TRONG PHAÂN TÍCH UREA SVTH : TRÒNH THÒ THANH TAÂM MSSV : 60302440 CBHD : TS. TRAÀN BÍCH LAM BOÄ MOÂN KYÕ THUAÄT THÖÏC PHAÅM TP Hoà Chí Minh, 01/2008 NHAÄÄN XEÙÙT CUÛÛA GIAÙÙO VIEÂÂN HÖÔÙÙNG DAÃÃN ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... NHAÄÄN XEÙÙT CUÛÛA GIAÙÙO VIEÂÂN PHAÛÛN BIEÄÄN ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... ........................................................................................................................................................... LÔØI CAÙM ÔN GVHD: TS. Traàn Bích Lam ii LÔØØI CAÛÛM ÔN  Tröôùc heát, em xin gôûi lôøi caùm ôn ñeán thaày coâ tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa, ñaëc bieät laø caùc thaày coâ Boä moân Coâng ngheä Thöïc phaåm ñaõ truyeàn ñaït nhöõng kieán thöùc vaø kinh nghieäm quyù baùu cho chuùng em trong suoát gaàn naêm naêm ngoài treân gheá giaûng ñöôøng ñaïi hoïc. Em xin göûi lôøi caùm ôn saâu saéc ñeán coâ Traàn Bích Lam ñaõ taän tình höôùng daãn, giuùp ñôõ em raát nhieàu ñeå em coù theå hoaøn thaønh toát luaän vaên naøy. Cuoái cuøng, toâi xin caûm ôn caùc baïn lôùp HCTP03 ñaõ giuùp ñôõ toâi raát nhieàu trong thôøi gian laøm luaän vaên. Chuùc caùc baïn luoân vui veû vaø thaønh coâng trong cuoäc soáng. Sinh vieâân Trònh Thò Thanh Taââm MUÏC LUÏC GVHD: TS. Traàn Bích Lam iii MUÏÏC LUÏÏC ÑEÀÀ MUÏÏC: Trang TRANG BÌA ................................................................................................................ i LÔØØI CAÛÛM ÔN ................................................................................................................................ ii MUÏÏC LUÏÏC..................................................................................................................................... iii DANH SAÙÙCH HÌNH VEÕÕ ........................................................................................................... vii DANH SAÙÙCH BAÛÛNG BIEÅÅU....................................................................................................... ix LÔØØI MÔÛÛ ÑAÀÀU ................................................................................................................................ 1 CHÖÔNG 1 ................................................................................................................................... 2 1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5) ................................................................................................ 3 1.1.1. Danh phaùp quoác teá vaø phaân loaïi .................................................................................. 3 1.1.2. Tính chaát vaät lyù cuûa enzyme urease ............................................................................ 3 1.1.3. Tính chaát hoùa lyù cuûa enzyme urease ........................................................................... 6 1.1.4. Trung taâm hoaït ñoäng .................................................................................................... 6 1.1.5. Cô cheá xuùc taùc .............................................................................................................. 9 1.1.6. Cô chaát cuûa urease...................................................................................................... 10 1.1.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng cuûa urease ......................................... 12 1.2. Caùc phöông phaùp thu nhaän urease .................................................................................... 23 1.2.1. Nguoàn thu nhaän........................................................................................................... 23 1.2.2. Moät soá phöông phaùp taùch chieát vaø tinh cheá enzyme................................................. 26 1.3. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính urease..................................................................... 27 1.3.1. Xaùc ñònh hoaït tính urease döïa treân vieäc ñònh löôïng NH3 ñöôïc giaûi phoùng.............. 29 MUÏC LUÏC GVHD: TS. Traàn Bích Lam iv 1.3.2. Xaùc ñònh hoaït tính urease baèng caùch ñònh löôïng CO2 ñöôïc giaûi phoùng................... 30 1.4. ÖÙng duïng cuûa enzyme urease ........................................................................................... 31 1.4.1. Trong noâng nghieäp...................................................................................................... 31 1.4.2. Trong thöïc phaåm ......................................................................................................... 31 1.4.3. Trong phaân tích hoùa sinh ............................................................................................ 31 1.4.4. Trong coâng ngheä moâi tröôøng ...................................................................................... 32 1.4.5. Trong y hoïc ................................................................................................................. 32 1.5. Toång quan veà urea ............................................................................................................. 32 1.5.1. Caáu taïo hoùa hoïc cuûa urea........................................................................................... 32 1.5.2. Phaùt hieän ..................................................................................................................... 33 1.5.3. Coâng duïng ................................................................................................................... 34 1.5.4. Möùc ñoä nguy hieåm...................................................................................................... 35 1.5.5. Caùc nguoàn phaùt sinh urea ........................................................................................... 35 1.5.6. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh urea ................................................................................. 39 1.6. Kit thöû nhanh trong phaân tích urea.................................................................................... 46 1.6.1. Tình hình caùc loaïi kit thöû nhanh ôû Vieät Nam [52]..................................................... 46 1.6.2. Caùc loaïi kit phaân tích urea ......................................................................................... 47 CHÖÔNG 2 ................................................................................................................................. 50 2.1. Nguyeân lieäu........................................................................................................................ 51 2.1.1. Hoùa chaát ...................................................................................................................... 51 2.1.2. Duïng cuï ....................................................................................................................... 51 2.2. Phöông phaùp nghieân cöùu ................................................................................................... 52 2.2.1. Sô ñoà nghieân cöùu ........................................................................................................ 52 2.2.2. Phöông phaùp tìm chaát chæ thò maøu toái öu ................................................................... 52 2.2.3. Phöông phaùp xaùc đònh löôïng chaát chæ thò thích hôïp cho leân kit................................. 54 2.2.4. Phöông phaùp choïn dung moâi thích hôïp duøng ñeå pha urease..................................... 54 MUÏC LUÏC GVHD: TS. Traàn Bích Lam v 2.2.5. Phöông phaùp choïn theå tích chaám enzyme phuø hôïp ................................................... 58 2.2.6. Phöông phaùp nghieân cöùu löôïng enzyme urease thích hôïp cho leân kit ..................... 59 2.2.7. Phöông phaùp khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän cuûa kit, xaây döïng thang maøu baùn ñònh löôïng urea vaø ñöôøng chuaånpH........................................................................................ 60 2.2.8. Phöông phaùp xaùc ñònh thôøi gian hieän maøu cuûa kit .................................................... 60 2.2.9. Phöông phaùp xaùc ñònh thôøi gian söû duïng cuûa kit ....................................................... 60 2.2.10. Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong maãu thöïc.............................................. 61 2.2.11. Caùc phöông phaùp xöû lyù soá lieäu................................................................................. 61 CHÖÔNG 3 ................................................................................................................................. 62 3.1. Khaûo saùt caùc loaïi chaát chæ thò maøu .................................................................................... 63 3.2. Khaûo saùt löôïng chaát chæ thò thích hôïp cho leân kit ............................................................. 65 3.3. Khaûo saùt dung moâi pha urease .......................................................................................... 68 3.3.1. Khaûo saùt hoaït tính cuûa enzyme urease theo phöông phaùp Nessler .......................... 68 3.3.2. Khaûo saùt dung moâi duøng ñeå pha urease .................................................................... 70 3.4. Khaûo saùt löôïng enzyme thích hôïp cho leân kit .................................................................. 72 3.4.1. Khaûo saùt theå tích chaám enzyme urease leân kit.............................................................. 72 3.4.2. Khaûo saùt noàng ñoä dung dòch enzyme urease cho leân kit............................................... 72 3.5. Khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän cuûa kit, xaây döïng thang maøu baùn ñònh löôïng urea vaø ñöôøng chuaånpH.............................................................................................................................. 76 3.5.1. Xaùc ñònh khaû naêng phaùt hieän cuûa kit ......................................................................... 76 3.5.2. Xaây döïng thang maøu baùn ñònh löôïng urea................................................................. 77 3.5.3. Xaây döïng ñöôøng chuaånpH ñeå ñònh löôïng urea .................................................... 78 3.6. Khaûo saùt thôøi gian hieän maøu cuûa kit ................................................................................. 83 3.7. Khaûo saùt thôøi gian söû duïng cuûa kit.................................................................................... 85 3.8. Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong maãu thöïc...................................................... 87 3.8.1. Söõa............................................................................................................................... 87 MUÏC LUÏC GVHD: TS. Traàn Bích Lam vi 3.8.2. Nöôùc maém................................................................................................................... 89 3.8.3. Thuûy saûn...................................................................................................................... 90 CHÖÔNG 4 ................................................................................................................................. 95 4.1. Keát luaän.............................................................................................................................. 96 4.2. Kieán nghò:........................................................................................................................... 97 TAØØI LIEÄÄU THAM KHAÛÛO............................................................................................................ 98 DANH SAÙCH HÌNH VEÕ GVHD: TS. Traàn Bích Lam vii DANH SAÙÙCH HÌNH VEÕÕ Chöông 1: TOÅNG QUAN Hình 1.1: Tinh theå urease ñöôïc J.B.Summer chieát taùch vaø keát tinh............................................... 4 Hình 1.2: Khoái löôïng phaân töû cuûa urease qua coät loïc gel Agarose A_15m .................................. 4 Hình 1.3: Caáu truùc cuûa enzyme urease........................................................................................... 6 Hình 1.4: Trung taâm hoaït đoäng cuûa urease.................................................................................... 8 Hình 1.5: Urease töø K.aerogenes vaø töø Bacillus pasterrii ............................................................. 8 Hình 1.6: Cô cheá xuùc taùc cuûa enzyme............................................................................................. 9 Hình 1.7: Cô cheá xuùc taùc cuûa urease ............................................................................................ 10 Hình 1.8: Coâng thöùc caáu taïo cuûa moät soá cô chaát chöùa phospho cuûa urease .............................. 11 Hình 1.9: Đoà thò bieåu dieãn vaän toác phaûn öùng theo noàng đoä cô chaát............................................ 12 Hình 1.10: Đoà thò hoaït tính urease theo pH trong 3 loaïi đeäm noàng ñoä M/8 ............................... 14 Hình 1.11: AÛnh höôûng cuûa chaát kìm haõm caïnh tranh vaø khoâng caïnh tranh ................................ 16 Hình 1.12: Cô cheá öùc cheá cuûa hydroxamic acid vôùi urease ......................................................... 17 Hình 1.13: Coâng thöùc hoùa hoïc cuûa caùc α-hydroxyketones (1–13) and α – diketones (14–20) ... 19 Hình 1.14: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát thiols, urea vaø acid boric tôùi khaû naêng öùc cheá urease cuûa dòch chieát toûi tröôùc khi uû........................................................................................................ 21 Hình 1.15: Ñoäng hoïc cuûa söï öùc cheá urease bôûi dòch chieát toûi ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau........... 21 Hình 1.16: Caáu truùc phaân töû urease cuûa Helicobacter Pylori..................................................... 23 Hình 1.17: Caùc loaïi ñaäu chöùa enzyme urease .............................................................................. 25 Hình 1.18: Caáu truùc phaân töû cuûa urea ......................................................................................... 32 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Hình 3.1: Maøu saéc cuûa chæ thò trong nöôùc caát (pH = 6.5) ........................................................... 64 Hình 3.2: Maøu saéc cuûa chæ thò trong nöôùc maùy (pH = 6.8) ......................................................... 64 Hình 3.3: Vò trí chaát chæ thò vaø enzyme urease treân kit ................................................................ 66 DANH SAÙCH HÌNH VEÕ GVHD: TS. Traàn Bích Lam viii Hình 3.4: Kit thöû vôùi caùc noàng ñoä phenol red khaùc nhau tröôùc khi nhuùng dung dòch urea........ 66 Hình 3.5: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò PR treân kit sau khi nhuùng urea................................. 66 Hình 3.6: Kit thöû vôùi caùc noàng ñoä phenol red khaùc nhau sau khi nhuùng dung dòch urea 2% .... 67 Hình 3.7: Kit thöû sau khi dung dòch urea chaïy heát kit ................................................................. 67 Hình 3.8: Kit thöû traéng sau khi dung dòch urea chaïy heát kit........................................................ 68 Hình 3.9: Đoà thò NH3 chuaån duøng đeå xaùc đònh hoaït tính urease ................................................. 69 Hình 3.10: Bieåu đoà so saùnh hoaït tính urease trong caùc loaïi dung moâi ....................................... 71 Hình 3.11: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit chaám 30µl urease 4% trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm................................................ 74 Hình 3.12: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit chaám 60µl urease 4% trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 1000ppm, 3 – 800ppm, 4 – 600ppm, 5 – 400ppm, 6 – 200ppm, 7 – 100ppm, 8 – 50ppm ....................................................................................................................... 75 Hình 3.13: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 40ppm, 4 – 30ppm, 5 – 20ppm, 6 – 10ppm, 7 – 5ppm ................ 76 Hình 3.14: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä: 1 – 0ppm, 2 – 50ppm, 3 – 100ppm, 4 – 200ppm, 5 – 400ppm, 6 – 600ppm, 7 – 800ppm, 8 – 1000ppm ........................................................................................................................................ 77 Hình 3.15: Söï thay ñoåi maøu saéc cuûa chæ thò treân kit sau khi nhuùng dung dòch urea 0.5% vaø 1%78 Hình 3.16: Caùc böôùc ñònh tính söï coù maët urea trong maãu thöû .................................................... 78 Hình 3.17: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong nöôùc... 80 Hình 3.18: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong nöôùc maém ............................................................................................................................................... 81 Hình 3.19: Ñoà thò ñöôøng chuaån bieåu dieãn söï thay ñoåi cuûa pH theo noàng ñoä urea trong söõa..... 83 Hình 3.20: Ñoà thò bieãu dieãn hoaït tính urease treân kit theo thôøi gian .......................................... 86 Hình 3.21: Söû duïng kit ñeå phaùt hieän urea trong söõa .................................................................... 88 Hình 3.22: Söû duïng kit ñeå phaùt hieän urea trong nöôùc maém......................................................... 89 Hình 3.23: Caùch söû duïng kit thöû ñeå phaùt hieän urea trong maãu nöôùc ñaù öôùp thuûy saûn vaø maãu caù ....................................................................................................................................................... 92 DANH SAÙCH BAÛNG BIEÅU GVHD: TS. Traàn Bích Lam ix DANH SAÙÙCH BAÛÛNG BIEÅÅU CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN Baûng 1.1: Thaønh phaàn amino acid cuûa urease đaäu naønh vaø đaäu röïa ........................................... 5 Baûng 1.2: Km vaø vmax cuûa enzyme urease...................................................................................... 13 Baûng 1.3: Giaù trò pHopt ôû caùc loaïi đeäm ........................................................................................ 14 Baûng 1.4: AÛnh höôûng cuûa caùc ion leân hoaït tính urease ............................................................... 18 Baûng 1.6: Haøm löôïng urease trong caùc loaïi đaäu......................................................................... 25 Baûng 1.7: Caùc phöông phaùp ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzyme ......................................................... 28 Baûng 1.8: Tính chaát hoùa lyù cuûa urea............................................................................................ 33 Baûng 1.9: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa söõa boø töôi vaø söõa toång hôïp............................................... 36 Baûng 1.10: Xaùc ñònh haøm löôïng urea theo phöông phaùp Rappoport .......................................... 43 Baûng 1.11: Xaùc ñònh haøm löôïng urea theo phöông phaùp Perkins ............................................... 45 Baûng 1.12: Caùc loại kit thử nhanh chế tạo bởi Tổng cục Kỹ thuật (Bộ Coâng an) ....................... 47 CHÖÔNG 2: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Baûng 2.1: Khoaûng chuyeån maøu vaø maøu saéc cuûa caùc chaát chæ thò ................................................ 53 Baûng 2.2: Khaûo saùt phaûn öùng hieän maøu trong dung dòch NH4OH .............................................. 53 Baûng 2.3: Khaûo saùt noàng ñoä chaát chæ thò thích hôïp cho leân kit ................................................... 54 Baûng 2.4: Phöông phaùp laäp ñöôøng NH3 chuaån ............................................................................ 57 Baûng 2.5: Phöông phaùp choïn theå tích chaám enzyme phuø hôïp ..................................................... 59 Baûng 2.6: Phöông phaùp nghieân cöùu löôïng enzyme thích hôïp cho leân kit .................................... 59 Baûng 2.7: Phöông phaùp khaûo saùt giôùi haïn phaùt hieän cuûa kit ...................................................... 60 Baûng 2.8: Phöông phaùp xaùc ñònh thôøi gian söû duïng cuûa kit ........................................................ 61 CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Baûng 3.1: Khoaûng chuyeån maøu vaø maøu saéc cuûa caùc chaát chæ thò................................................ 65 DANH SAÙCH BAÛNG BIEÅU GVHD: TS. Traàn Bích Lam x Baûng 3.2: Xaây döïng ñöôøng chuaån NH3......................................................................................... 68 Baûng 3.3: Keát quaû ño hoaït tính enzyme urease ............................................................................ 69 Baûng 3.4: Hoaït tính cuûa urease trong caùc dung moâi khaùc nhau ................................................. 70 Baûng 3.5: Khaûo saùt theå tích chaám enzyme urease leân kit ............................................................ 72 Baûng 3.6: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau ....................................................................................................................................................... 73 Baûng 3.7: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong dung dòch urea ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau khi taêng soá laàn chaám urease leân kit .............................................................................................. 74 Baûng 3.8: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit khi thay ñoåi löôïng urease/kit ........................... 75 Baûng 3.9: Caùc thoâng soá cheá taïo cuûa kit ....................................................................................... 76 Baûng 3.10: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän cuûa kit trong caùc dung dòch urea coù noàng ñoä thaáp ... 77 Baûng 3.11: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa dung dòch urea tröôùc vaø sau khi cho urease .............. 79 Baûng 3.12: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa nöôùc maém chöùa urea tröôùc vaø sau khi cho urease .... 80 Baûng 3.14: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa söõa chöùa urea tröôùc vaø sau khi cho urease ............... 82 Baûng 3.15: Khaûo saùt thôøi gian hieän maøu cuûa kit.......................................................................... 84 Baûng 3.16: Khaûo saùt hoaït tính cuûa urease treân kit theo thôøi gian .............................................. 86 Baûng 3.17: Khaûo saùt söï coù maët cuûa urea trong söõa..................................................................... 88 Baûng 3.18: Khaûo saùt söï thay ñoåi pH cuûa caùc maãu nöôùc maém .................................................... 90 Baûng 3.19: Khaûo saùt khaû naêng phaùt hieän urea cuûa kit trong thuûy saûn ....................................... 93 LÔØI MÔÛ ÑAÀU GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 1 LÔØØI MÔÛÛ ÑAÀÀU “AÊn ngon maëc ñeïp” laø nhu caàu khoâng theå thieáu cuûa con ngöôøi. Thöïc phaåm hieän nay ñoøi hoûi khoâng chæ ngon maø coøn phaûi baét maét, thu huùt ngöôøi tieâu duøng, do ñoù maø ngaønh coâng ngheä sau thu hoaïch ra ñôøi vôùi muïc ñích taïo ra giaù trò cho thöïc phaåm nhö baûo toaøn giaù trò dinh döôõng, taêng giaù trò caûm quan, ñaûm baûo an toaøn veä sinh thöïc phaåm, tieän duïng…Caùc giaù trò naøy khoâng taùch rôøi nhau; coù taùc ñoäng taêng hay buø tröø nhau nhöng toång theå phaûi taïo ra giaù trò gia taêng cho saûn phaåm. Tuy nhieân, ôû moät soá loaïi thöïc phaåm maø giaù trò caûm quan hay dinh döôõng ñoùng vai troø quan troïng thì ngöôøi baùn ñaõ söû duïng nhöõng thuû thuaät khoâng ñöôïc pheùp söû duïng nhö phun hoùa chaát ñeå laøm boùng traùi caây, ngaâm thòt gia suùc hay gia caàm trong dung dòch haøn the, öôùp urea cho thuûy saûn ñeå nhìn beà ngoaøi troâng töôi laâu hôn, cho urea vaøo trong nöôùc maém ñeå laøm taêng ñoä ñaïm…Nhöõng thuû thuaät “haøng chôï” naøy khoâng chæ ñaùnh löøa ngöôøi tieâu duøng trong vieäc mua caùc saûn phaåm thöïc phaåm khoâng coøn töôi ngon, khoâng ñuû chaát dinh döôõng maø coøn coù nguy cô aûnh höôûng tôùi söùc khoûe. Hieän nay, coâng taùc kieåm tra veä sinh an toaøn thöïc phaåm coøn nhieàu baát caäp, thieáu phöông tieän, chöa ñöôïc tieán haønh roäng raõi, vì vaäy ngöôøi tieâu duøng caàn chuû ñoäng traùnh mua thöïc phaåm keùm chaát löôïng, khoâng an toaøn. Moät bieän phaùp deã thöïc hieän daønh cho moïi ngöôøi laø söû duïng kit thöû nhanh ñeå kieåm tra söï coù maët cuûa moät hoùa chaát ñoäc haïi trong thöïc phaåm ngay khi vöøa mua veà vì ñôn giaûn, deã söû duïng, giaù thaønh reû vaø thôøi gian phaùt hieän ngaén. Kit thöû nhanh cuõng laø phöông tieän giuùp cho coâng taùc kieåm tra nhanh chaát löôïng thöïc phaåm ôû caáp cô sôû. Hieän nay, treân thò tröôøng coù baùn nhieàu loaïi kit thöû nhanh nhöng ña phaàn laø caùc kit ngoaïi chöa phuø hôïp laém vôùi ñieàu kieän cuûa Vieät Nam, khi söû duïng phaûi ñong, ño hoùa chaát töø caùc loï nhoû ñoùng saün, vì vaäy khoâng loaïi tröø ñöôïc sai soá chuû quan do ngöôøi söû duïng gaây ra. Trong soá caùc kit noäi baùn treân thò tröôøng chöa coù loaïi kit duøng ñeå phaân tích urea trong thöïc phaåm. Vôùi lyù do ñoù, chuùng toâi ñaõ tieán haønh nghieân cöùu cheá taïo kit thöû nhanh duøng trong phaân tích urea trong khuoân khoå baøi luaän vaên naøy. Noäi dung nghieân cöùu goàm 2 phaàn chính:  Cheá taïo kit thöû nhanh duøng ñeå phaân tích urea döïa treân nguyeân taéc söû duïng enzyme urease ñeå thuûy phaân ñaëc hieäu urea.  ÖÙng duïng kit thöû ñeå phaân tích urea trong caùc maãu thöïc. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 2 CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 3 1.1. Enzyme urease (EC 3.5.1.5) 1.1.1. Danh phaùp quoác teá vaø phaân loaïi [2]  Danh phaùp: Urease coù teân heä thoáng laø carbamine amidohydrolase töùc laø enzyme xuùc taùc cho quaù trình thuûy phaân urea thaønh ammonia vaø khí cacbonic theo phöông trình phaûn öùng sau:  Phaân loaïi: Trong baûng phaân loaïi enzyme theo quy öôùc quoác teá, urease mang maõ soá EC 3.5.1.5 trong đoù:  Soá 3: chæ nhoùm chính laø nhoùm hydrolase (nhoùm caùc enzyme thuûy phaân nhö esterase, carbohydrase, peptidase, amidase…)  Soá 5: chæ nhoùm phuï enzyme taùc duïng leân lieân keát C–N, khaùc lieân keát peptid (asparaginase, glutaminase, urease…)  Soá 1: chæ phaân nhoùm phuï caét caùc amid thaúng (amidohydrolase).  Soá 5: chæ soá thöù töï cuûa urease trong phaân nhoùm phuï. 1.1.2. Tính chaát vaät lyù cuûa enzyme urease Urease laø enzyme laàn đaàu tieân đöôïc J.B.Sumner taùch chieát vaø keát tinh töø đaäu röïa (jack bean – Canavalia ensiformis) vaøo naêm 1926 [37]. Vaø chính coâng trình nghieân cöùu naøy đaõ đoaït giaûi Nobel vaøo naêm 1946 đoàng thôøi cuõng đaêït neàn taûng đaàu tieân cho caùc coâng trình nghieân cöùu veà urease sau naøy. Urease laø caùc tinh theå coù 8 caïnh, khoâng maøu, trong suoát, quan saùt đöôïc qua kính hieån vi vaø coù đöôøng kính d = 4 – 30µm tuøy theo phöông phaùp chieát taùch. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 4 Hình 1.1: Tinh theå urease ñöôïc J.B.Summer chieát taùch vaø keát tinh [37] Khoái löôïng phaân töû cuûa urease đöôïc 2 nhaø nghieân cöùu Joseph vaø Evelyn xaùc đònh baèng phöông phaùp loïc gel treân coät Agarose A_15m đoái vôùi urease đaäu röïa vaø đaäu naønh Brasil vaø so saùnh vôùi caùc protein đaõ bieát tröôùc khoái löôïng phaân töû [17]. Keát quaû cho thaáy urease töø đaäu naønh coù 2 peak öùng vôùi 2 phaân töû löôïng khaùc nhau đoù laø 540.000 Da vaø 420.000 Da, trong khi đoù urease töø đaäu röïa chæ xuaát hieän 1 peak duy nhaát vôùi phaân töû löôïng laø 480.000 Da. Hình 1.2: Khoái löôïng phaân töû cuûa urease qua coät loïc gel Agarose A_15m [17] Nhö vaäy, urease töø nhöõng nguoàn khaùc nhau coù khoái löôïng phaân töû khaùc nhau vaø ngay caû trong cuøng moät nguoàn laø đaäu naønh, coù tôùi 2 loaïi urease. Hai loaïi urease naøy khaùc nhau ôû thaønh phaàn apoenzyme nhöng baûn chaát cuûa coenzyme vaãn khoâng thay đoåi. Caùc apoenzyme laø nhöõng chuoãi polypeptide đöôïc hình thaønh töø nhieàu acid amin. Thaønh phaàn caùc acid amin naøy khoâng CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 5 gioáng nhau ôû nhöõng nguoàn khaùc nhau đaõ giaûi thích cho söï khaùc nhau veà khoái löôïng phaân töû nhö đaõ noùi ôû treân. Baûng 1.1: Thaønh phaàn amino acid cuûa urease đaäu naønh vaø đaäu röïa [17] a – Döõ lieäu do Joseph vaø Evelyn khaûo saùt b – Döõ lieäu đeå so saùnh (do Staples vaø Reithel khaûo saùt). Enzyme urease coù caáu truùc baäc 4. Theo nghieân cöùu cuûa Kunio TAKISHIMA, Tatsuko SUGA, Gunji MAMIYA (1988), enzyme urease ñaäu röïa coù 840 acid amine. Khoái löôïng phaân töû töông ñoái cuûa 1 tieåu ñôn vò protein laø 90770 Da, töø ñoù suy ra phaân töû urease goàm coù 6 tieåu ñôn vò. Coù 13 trong soá 25 histidine naèm taäp trung trong vuøng acid amine 479 ñeán 607 do ñoù vuøng naøy coù theå chöùa nikel. Cys•592, acid amine caàn thieát cho hoaït tính cuûa enzyme cuõng naèm trong vuøng giaøu histidine naøy. [23] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 6 Hình 1.3: Caáu truùc cuûa enzyme urease 1.1.3. Tính chaát hoùa lyù cuûa enzyme urease Theo Sumner, caùc tinh theå urease hoøa tan deã daøng trong dung dòch ammonia loaõng vaø dung dòch kieàm loaõng, coù theå hoøa tan hoaëc ñoâng tuï trong dung dòch muoái loaõng vaø acid höõu cô tuøy thuoäc noàng ñoä acid. [37] Sumner vaø Hand đaõ xaùc đònh đöôïc đieåm đaúng đieän cuûa urease naèm trong khoaûng pH = 5.0 – 5.1. Taïi đieåm đaúng đieän, đoä hoøa tan cuûa urease laø cöïc nhoû. Urease cuõng mang nhöõng đaëc tính cuûa protein nhö:  Tan trong nöôùc vaø dung dòch muoái loaõng.  Khoâng đi qua đöôïc maøng thaåm tích vì coù kích thöôùc phaân töû lôùn.  Tan khi coù lôùp aùo nöôùc vaø tích đieän, tuûa khi maát lôùp aùo nöôùc vaø trung tính.  Bò bieán tính döôùi taùc duïng cuûa caùc yeáu toá nhö acid, kieàm đaëc, caùc ion kim loaïi naëng vaø nhieät đoä cao…Khi đoù, urease maát tính xuùc taùc sinh hoïc, maát khaû naêng hoøa tan trong nöôùc, maát khaû naêng keát tinh vaø caùc tính chaát hoùa lyù khaùc nhau (đoä nhôùt, söùc caêng beà maët…), bieán đoåi hình daïng vaø kích thöôùc, deã bò phaân huûy bôûi protease.  Deã bò tuûa thuaän nghòch trong caùc dung moâi höõu cô nhö ethanol, acetone…hoaëc muoái ammonium sulfate, sodium chloride.  Tính chaát hoùa lyù cuûa enzyme coù theå thay đoåi khi keát hôïp vôùi moät soá chaát nhö cô chaát, coenzyme, ion kim loaïi hoaëc moät soá chaát höõu cô đaëc hieäu khaùc.  Phaân töû enzyme coù theå toàn taïi ôû caùc traïng thaùi ion nhö anion, cation hoaëc trung hoøa tuøy theo pH cuûa moâi tröôøng. 1.1.4. Trung taâm hoaït ñoäng CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 7 Trung taâm hoaït đoäng cuûa enzyme bao goàm caùc amino acid coù nhoùm hoùa hoïc hoaït đoäng maïnh. Caùc nhoùm hoùa hoïc hoaït đoäng naøy coù khaû naêng gaén vôùi cô chaát đeå taïo thaønh phöùc chaát enzyme – cô chaát. Caùc goác amino acid thöôøng khoâng naèm caïnh nhau trong chuoãi polypeptide nhöng do thöïc teá chuoãi polypeptide toàn taïi ôû traïng thaùi khoâng gian (caáu truùc caáp ba vaø boán) neân caùc amino acid thöôøng toàn taïi gaàn nhau. Ngoaøi ra trong trung taâm hoaït đoäng coøn coù maët cuûa ion kim loaïi. Caùc ion kim loaïi coù vai troø xuùc taùc raát lôùn, coù taùc duïng lieân keát giöõa enzyme vaø cô chaát hoaëc apoenzyme vaø coenzyme hoaëc tham gia vaøo quaù trình vaän chuyeån đieän töû. [2] Đaëc đieåm chung cuûa caùc hydrolase laø khoâng coù nhoùm ngoaïi neân taâm hoaït đoäng cuûa chuùng phaûi coù caùc goác acid amin đaëc hieäu. Taâm hoaït đoäng cuûa hydrolase thöôøng chöùa voøng imidazol cuûa histidine vaø nhoùm hydroxyl cuûa serine. Do caáu truùc baäc 3 cuûa enzyme/protein maø voøng imidazol vaø nhoùm hydroxyl naøy gaàn nhau hình thaønh neân lieân keát hydro nhö hình veõ sau: Sumner chöùng minh raèng urease laø enzyme khoâng coù baát cöù cofactor höõu cô naøo maø cuõng khoâng coù saét, manganese hay phosphorus [37]. Theo E. Jabri, M.B. Carr, R.P. Hausinger, P.A. Karplus thì trung taâm hoaït đoäng cuûa urease coù chöùa 2 nguyeân töû Ni. Urease coù đoä tinh khieát cao coù khoaûng 2g nguyeân töû Ni treân 1 tieåu đôn vò. Hai nguyeân töû Ni lieân keát vôùi nhau thoâng qua caàu noái carbamate. Moãi nguyeân töû Ni đöôïc noái vôùi 2 nguyeân töû N trong voøng imidazole vaø 1 nhoùm carboxylate, 1 phaân töû H2O (hình 1.4). Vaø chính 2 nguyeân töû Ni naøy đoùng vai troø raát quan troïng trong vieäc xuùc taùc phaûn öùng cuûa urease. Đoù cuõng chính laø lí do maø urease coøn đöôïc goïi laø “Nikel dependent enzyme”. [12] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 8 Hình 1.4: Trung taâm hoaït đoäng cuûa urease (Ni: 2 quaû caàu maøu xanh) [9][39] Tuy nhieân urease coù caùc nguoàn goác khaùc nhau nhö urease töø vi khuaån Bacillus pasteurii trong trung taâm hoaït đoäng chöùa ion kim loaïi Zn2+ [31], coøn ôû Klebsiella aerogenes coù cofactor laø Cu2+ [36] nhö hình beân döôùi: Hình 1.5: Urease töø K.aerogenes vaø töø Bacillus pasterrii ÔÛ pH trung tính, EDTA coù theå đöôïc söû duïng đeå baûo veä enzyme khoûi caùc kim loaïi taïp trong quaù trình tinh saïch. Tuy nhieân, ôû pH thaáp (3.6 – 4.0), EDTA coù theå khoâng nhöõng thuùc đaåy söï maát Ni maø coøn öùc cheá khoâng thuaän nghòch hoaït tính cuûa enzyme. [11] Ngoaøi ra, trong trung taâm hoaït đoäng cuûa urease coøn chöùa nhoùm –SH, baèng chöùng laø hoaït tính urease bò öùc cheá khi caùc nhoùm –SH bò khoùa. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 9 1.1.5. Cô cheá xuùc taùc Naêm 1913, hai nhaø khoa hoïc Leonom Michaelis vaø Maud Menten đöa ra moâ hình đoäng hoïc đeå giaûi thích phaûn öùng đöôïc xuùc taùc bôûi enzyme. Theo moâ hình naøy, enzyme vaø cô chaát seõ keát hôïp vôùi nhau, taïo neân phöùc hôïp enzyme – cô chaát (ES). Phöùc hôïp ES seõ laïi đöôïc chuyeån hoùa tieáp tuïc đeå taïo thaønh saûn phaåm (P) vaø giaûi phoùng enzyme (E). Enzyme đöôïc giaûi phoùng laïi thöïc hieän nhöõng phaûn öùng môùi. [2] Hoaït đoäng xuùc taùc cuûa trung taâm hoaït đoäng (TTHÑ) cuûa enzyme coù lieân quan đeán cô chaát vaø quan đieåm đöôïc nhieàu nhaø khoa hoïc chaáp nhaän laø thuyeát trung taâm hoaït đoäng cuûa Koshland. Theo thuyeát naøy, trung taâm hoaït đoäng cuûa enzyme chæ đöôïc taïo thaønh khi coù söï taùc đoäng caûm öùng cuûa cô chaát, đònh höôùng thích hôïp đeå cô chaát gaén chính xaùc vaøo vaø thöïc hieän quaù trình xuùc taùc. Hình 1.6: Cô cheá xuùc taùc cuûa enzyme Đoái vôùi enzyme urease, cô cheá cuûa quaù trình xuùc taùc phaûn öùng theo phöông trình: CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 10 Cuï theå xaûy ra ôû trung taâm hoaït đoäng nhö sau: Hình 1.7: Cô cheá xuùc taùc cuûa urease Theo sô đoà treân ta thaáy: ban đaàu phaân töû urea seõ taán coâng vaø taïo lieân keát vôùi 2 nguyeân töû Ni đoàng thôøi coù 2 phaân töû H2O đöôïc giaûi phoùng ra. Tieáp theo laø söï saép xeáp laïi cuûa caùc đieän töû, hình thaønh nhöõng moái lieân keát môùi taïi trung taâm hoaït đoäng. Cuoái cuøng laø söï taùi caáu truùc ôû trung taâm hoaït đoäng cuûa urease vôùi söï tham gia cuûa 2 phaân töû nöôùc, đaåy goác carbamate ra ngoaøi đoàng thôøi giaûi phoùng 1 phaân töû NH3. Nhö vaäy, vai troø cuûa 2 ion kim loaïi Ni laø raát quan troïng trong vieäc taïo lieân keát giöõa enzyme vôùi cô chaát ôû giai đoaïn taïo phöùc chaát trung gian. Đaây chính laø moät cofactor cuûa urease. Moät soá taùc giaû cho raèng vai troø cuûa 2 nguyeân töû Ni khaùc nhau. Moät nguyeân töû Ni giöõ nhieäm vuï lieân keát vaø hoaït hoùa phaân töû urea, nguyeân töû Ni coøn laïi giöõ nhieäm vuï lieân keát vaø hoaït hoùa phaân töû nöôùc aùi nhaân. [6] 1.1.6. Cô chaát cuûa urease Vieäc khaùm phaù ra daõy cô chaát cuûa enzyme urease khaù quan troïng trong vieäc moâ taû vai troø cuûa trung taâm hoaït đoäng Ni2+ trong quaù trình xuùc taùc. Moät soá cô chaát đöôïc bieát đeán cuûa enzyme urease laø: [6]  Urea CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 11  Semicarbazide  Formamide  Acetamide  N – Methylurea  N – Hydroxyurea  Dihydroxyurea  N – Benzoylphosphoric triamide  Phosphoramidate (hình 1.a)  Diamidophosphate (hình 1.b)  Phosphoric triamide (hình 1.c)  Phenyl phosphorodiamidate (Ar = Ph, PPD) (hình 1.d)  N-(3-methyl-2-butenyl)phosphoric triamide (Alk = (H3C)2C=CH, MBPT) (hình 1.e) Trong đoù urea laø cô chaát đaëc hieäu cuûa urease vôùi naêng löôïng hoaït hoùa laø 8700 hoaëc 11700 calories/g.mol ôû 25oC coøn đoái vôùi caùc cô chaát nhö hydroxyurea hoaëc dihydroxyurea thì vaän toác nhoû hôn 120 laàn. Phaân töû urea raát beàn. Trong khoaûng pH = 2 – 12, söï phaân huûy urea khoâng enzyme trong dung dòch khoâng phuï thuoäc pH vaø coù chu kyø baùn huûy laø 3.6 naêm ôû 38oC. Ngöôøi ta chöùng minh raèng phaûn öùng naøy laø phaûn öùng khöû maø saûn phaåm duy nhaát laø ammonia vaø acid cyanic. Toác đoä khöû taêng khi pH > 12 vaø giaûm khi pH < 2. Neáu coù söï tham gia cuûa enzyme, enzyme seõ chuyeån phaûn öùng khöû thaønh phaûn öùng thuûy phaân vaø đieàu naøy noùi leân vai troø quan troïng cuûa Ni2+ nhö 1 acid Lewis trong tính chaát hoùa hoïc cuûa urease. Hay noùi caùch khaùc enzyme đaõ choáng laïi söï phaân huûy vaø taïo đieàu kieän cho urea bò nöôùc hay ion OH– taán coâng đeå taïo ra carbamate. Hình 1.8: Coâng thöùc caáu taïo cuûa moät soá cô chaát chöùa phospho cuûa urease CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 12 1.1.7. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán vaän toác phaûn öùng cuûa urease 1.1.7.1. AÛnh höôûng cuûa noàng đoä enzyme: [1][37] Noùi chung trong đieàu kieän thöøa cô chaát, vaän toác phaûn öùng phuï thuoäc tuyeán tính vaøo noàng đoä enzyme: V = k . [E], V: vaän toác phaûn öùng, [E]: noàng đoä enzyme. Tuy nhieân, dung dòch enzyme urease loaõng deã bò maát hoaït tính hôn dung dòch coù noàng ñoä cao vôùi ñieàu kieän laø enzyme phaûi ñöôïc baûo quaûn laïnh. Cuõng coù tröôøng hôïp khi noàng đoä enzyme quaù lôùn, vaän toác phaûn öùng taêng chaäm. 1.1.7.2. Aûnh höôûng cuûa noàng đoä cô chaát, moâ hình Michaelis_Menten: [1][53] Phöông trình Michaelis_Menten: ]S[K ]S[vv m max    Trong đoù: Km: haèng soá Michaelis, laø haèng soá aùi löïc cuûa enzyme đoái vôùi cô chaát hay noàng đoä cô chaát đuû laøm cho toác đoä phaûn öùng đaït đeán ½ toác đoä cöïc đaïi, đaëc tröng cuûa moãi loaïi enzyme đoái vôùi moãi loaïi cô chaát. vmax: vaän toác phaûn öùng đaït cöïc đaïi. [S]: noàng đoä cô chaát Hình 1.9: Đoà thò bieåu dieãn vaän toác phaûn öùng theo noàng đoä cô chaát Töø phöông trình ta coù theå xeùt đeán 3 tröôøng hôïp:  Neáu [S] << Km thì: m max K ]S[vv  . Nhö vaäy, ôû noàng đoä cô chaát thaáp, v phuï thuoäc tuyeán tính vaøo [S]. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 13  Neáu [S] >> Km thì: v = vmax: töùc vaän toác phaûn öùng đaït cöïc đaïi, khoâng phuï thuoäc [S]. Nhö vaäy [S] đaõ đuû lôùn đeán möùc naøo đoù, neáu tieáp tuïc taêng [S], v cuõng khoâng taêng theo.  Neáu [S] = Km thì v = vmax/2: vaän toác phaûn öùng baèng nöûa vaän toác cöïc đaïi. Hoaëc ta cuõng coù theå xaùc đònh Km vaø Vmax theo phöông trình đöôïc vieát laïi töø phöông trình treân nhö sau: ]S[ 1 v K v 1 v 1 max m maxi  Töø đoù ta seõ bieåu dieãn söï phuï thuoäc cuûa 1/vi theo 1/[S] baèng moät phöông trình đöôøng thaúng vaø xaùc đònh Km, Vmax. Moät soá giaù trò Km vaø vmax cuûa urease trong caùc nghieân cöùu đöôïc cho baûng sau: Baûng 1.2: Km vaø vmax cuûa enzyme urease [53] Nguoàn goác pH Nhieät đoä (oC) Dung dòch đeäm Km (mol/l) vmax Đaäu naønh 7.0 25 Phosphate 19×10-3 10.5×10-6 (mol/l/s) Đaäu naønh 7.0 25 Sulfite 476×10-3 37×10-6(mol/l/s) Đaäu naønh 7.0 25 Thiosulfate 56×10-3 17.2×10-6(mol/l/s) 1.1.7.3. AÛnh höôûng cuûa nhieät đoä: Gioáng nhö phaûn öùng hoùa hoïc, khi nhieät đoä taêng, vaän toác chuyeån đoäng cuûa caùc phaân töû taêng, söï tieáp xuùc giöõa caùc phaân töû cuõng taêng neân vaän toác phaûn öùng taêng. Tuy nhieân do baûn chaát enzyme laø protein neân nhieät đoä cao seõ laøm bieán tính protein, enzyme maát hoaït tính [1]. Do đoù, moãi enzyme seõ toàn taïi moät nhieät đoä maø ôû đoù hoaït tính cao nhaát, goïi laø nhieät đoä toái thích topt. Theo caùc nghieân cöùu töø đaäu röïa (jack bean) thì nhieät đoä topt vaøo khoaûng 45-50oC, khi nhieät đoä vöôït quaù 65oC thì hoaït tính urease bò giaûm vaø coù theå maát haún khi nhieät đoä đaït 85oC [17]. Tuy nhieân nhieät đoä topt cuûa urease khoâng coá đònh, maø noù phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö: nguoàn thu nhaän, noàng đoä enzyme, noàng đoä cô chaát, pH, thôøi gian phaûn öùng… Ngöôøi ta đaõ thaáy raèng đoä beàn nhieät cuûa urease taêng khi coù maët cô chaát hoaëc chaát oån đònh, chaát hoaït hoùa nhö L_cysteine, 2_mercaptoethanol...Urease ôû dung dòch loaõng khoâng coù cô chaát thöôøng keùm beàn nhieät nhaát, coøn ôû daïng boät khoâ vaø coù cô chaát thì khaù beàn nhieät [9]. ÔÛ nhieät đoä thaáp, hoaït tính cuûa urease giaûm nhöng khoâng bò bieán tính. 1.1.7.4. AÛnh höôûng cuûa pH vaø dung dòch ñeäm: [1][16] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 14 Enzyme raát nhaïy caûm vôùi söï bieán đoåi pH cuûa moâi tröôøng do pH aûnh höôûng đeán söï phaân ly ion cuûa phaân töû cô chaát. Do đoù moãi enzyme coù moät pH maø hoaït tính cuûa noù đaït cöïc đaïi, goïi laø pH toái thích (pHopt). Khi pH caøng xa pHopt thì hoaït tính caøng giaûm. Trong ñeäm phosphate, urease hoaït ñoäng toát trong khoaûng pH 5 – 9, trong ñeäm citrate laø pH 4 – 8.5, trong ñeäm acetate laø pH döôùi 3 – 7.5. Hoaït tính cao nhaát cuûa urease theo nghieân cöùu cuûa Stacey F. Howell and James B. Sumner laø vôùi dung dòch urea 1% trong ñeäm citrate M/8 pH 6.5. [16]. Nhö vaäy, hoaït tính cuûa urease phuï thuoäc vaøo dung dòch đeäm, giaù trò pH, noàng đoä urea, nhieät đoä, noàng ñoä muoái… Baûng 1.3: Giaù trò pHopt ôû caùc loaïi đeäm [16] Noàng đoä urea (%) Loaïi đeäm pHopt 2.5 Acetate Citrate Phosphate 6.4 6.5 6.9 0.1 Acetate Citrate Phosphate 6.7 6.7 7.6 Hình 1.10: Đoà thò hoaït tính urease theo pH trong 3 loaïi đeäm noàng ñoä M/8 [16] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 15 1.1.7.5. AÛnh höôûng cuûa chaát hoaït hoùa, chaát öùc cheá: Moãi enzyme đeàu toàn taïi moät soá hôïp chaát voâ cô hoaëc höõu cô maø söï coù maët cuûa chuùng coù khaû naêng kích thích hoaëc kìm haõm hoaït đoäng cuûa enzyme, goïi laø chaát kích thích (chaát hoaït hoùa) vaø chaát kìm haõm (chaát öùc cheá). Tuy nhieân khoâng coù söï phaân bieät roõ raøng chaát öùc cheá vaø kìm haõm vì moät chaát coù theå laø kích thích vôùi enzyme naøy nhöng laø kìm haõm cuûa enzyme khaùc hoaëc ôû noàng đoä naøy laø kích thích, noàng đoä khaùc laø kìm haõm [1].  Cô cheá taùc duïng cuûa chaát hoaït hoùa: [1][2] Caùc chaát hoaït hoùa coù theå laø chaát bieán enzyme töø traïng thaùi khoâng hoaït đoäng sang traïng thaùi hoaït đoäng, coù theå laø caùc chaát dò laäp theå döông hoaëc caùc chaát coù khaû naêng bieán tieàn enzyme khoâng hoaït đoäng sang hoaït đoäng maïnh. Caùc chaát naøy coù theå laø caùc anion, caùc ion kim loaïi töø oâ thöù 11 đeán oâ thöù 55 trong baûng tuaàn hoaøn Mendeleev, caùc chaát höõu cô coù caáu truùc phöùc taïp, coù theå đoùng vai troø nhoùm ngoaïi cuûa caùc enzyme 2 caáu töû hoaëc tham gia vaøo caáu taïo cuûa coenzyme, hoaëc laø noái giöõa enzyme vôùi cô chaát, hoaëc laø caàu noái giöõa phaàn apoenzyme vôùi coenzyme. Theo caùc nghieân cöùu thì nhoùm –SH (sulfuhydryl) cuûa cysteine laø nhoùm chöùc naêng thöôøng coù maët trong trung taâm hoaït đoäng cuûa phaân töû urease neân nhöõng chaát coù taùc duïng phuïc hoài nhoùm chöùc naêng naøy đeàu coù taùc duïng laøm hoaït hoùa urease nhö glutation daïng khöû hay L_cysteine. Nhoùm –SH chòu söï oxy hoùa döôùi taùc đoäng cuûa nhieàu yeáu toá trong đoù coù oxy khoâng khí. Tuy nhieân söï oxy hoùa töï nhieân bôûi oxy phaân töû chæ xaûy ra vôùi toác đoä đaùng keå khi coù maët ion kim loaïi xuùc taùc đaëc bieät laø saét vaø đoàng. Khi duøng EDTA đeå keát hôïp nhöõng veát kim loaïi naøy trong dung dòch thöôøng laøm taêng tính oån đònh cuûa urease noùi rieâng vaø caùc enzyme chöùa nhoùm –SH noùi chung. Nhö vaäy, baèng caùch giaùn tieáp, EDTA–Na2 cuõng laø moät chaát hoaït hoùa enzyme. Do ño,ù trong tinh saïch enzyme, ñeå baûo veä urease khoûi caùc kim loaïi taïp ngöôøi ta thöôøng duøng EDTA.  Cô cheá taùc duïng cuûa chaát öùc cheá: Caùc chaát kìm haõm ngöôïc laïi laø caùc chaát coù taùc duïng bieán enzyme töø traïng thaùi hoaït đoäng sang khoâng hoaït đoäng, hoaëc töø traïng thaùi hoaït đoäng maïnh sang hoaït đoäng yeáu. Caùc chaát naøy coù theå laø dò laäp theå aâm, toàn taïi hai loaïi kìm haõm: caïnh tranh vaø khoâng caïnh tranh. [1][2] Ngöôøi ta chöùng minh raèng cô cheá vaø tính chaát ñoäng hoïc cuûa hoaït ñoäng öùc cheá ñoái vôùi enzyme urease töø vi khuaån vaø ñaäu röïa laø nhö nhau. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 16 Nhöõng chaát öùc cheá maïnh nhaát enzyme urease bao goàm phosphoroamides, acetohydroxamic acid vaø kim loaïi naëng trong ñoù caùc hôïp chaát thiols coù tính öùc cheá yeáu hôn [10][36][50]. Trong nhöõng chaát öùc cheá ñöôïc ñeà caäp ôû treân thì acetohydroxamic ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát vì tính hieäu quaû vaø khoâng ñoäc cuûa noù, thöôøng ñöôïc söû duïng trong vieäc chöõa caùc beänh gaây ra bôûi vi khuaån sinh urease. Hình 1.11: AÛnh höôûng cuûa chaát kìm haõm caïnh tranh vaø khoâng caïnh tranh  ÖÙc cheá caïnh tranh: xaûy ra trong tröôøng hôïp chaát kìm haõm coù caáu truùc töông đoàng vôùi cô chaát, vì vaäy cuõng coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme, giaûm moái lieân keát giöõa enzyme vaø cô chaát. [1][2] Đoái vôùi urease thì hydroxyurea, dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid laø nhöõng chaát öùc cheá đaëc hieäu caïnh tranh cuûa urease. Vì chuùng coù caáu taïo gaàn gioáng cô chaát neân chuùng cuõng coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme. Do đoù söï coù maët cuûa chuùng trong dung dòch laøm giaûm toác đoä phaûn öùng thuûy phaân urea. Coù theå laøm giaûm taùc duïng cuûa nhöõng chaát öùc cheá naøy baèng caùch taêng noàng đoä cô chaát urea. Ví duï ñoái vôùi hydroxamic acid, cô cheá öùc cheá nhö sau: CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 17 Cuï theå nhö sau: Hình 1.12: Cô cheá öùc cheá cuûa hydroxamic acid vôùi urease [9] Hydroxamic acid do coù caáu taïo gaàn gioáng urea neân noù taán coâng vaøo trung taâm hoaït đoäng cuûa urease laø 2 quaû caàu Ni vaø đaõ “khoùa” chaët 2 quaû caàu naøy. Trong nhoùm caùc chaát öùc cheá caïnh tranh enzyme urease coøn coù phosphoroamides, acetohydroxamic acid, acid boric, sodium tetraborate…  ÖÙc cheá khoâng caïnh tranh: xaûy ra trong tröôøng hôïp chaát öùc cheá coù khaû naêng keát hôïp vôùi enzyme hoaëc cô chaát.  Ion kim loaïi [38] Caùc ion kim loaïi nhö Hg2+, Cu2+, Pb2+, Mn2+… laø nhöõng chaát öùc cheá khoâng caïnh tranh vì noù coù hoùa trò cuøng vôùi cofactor cuûa urease laø Ni2+. Caùc ion kim loaïi naøy seõ tranh giaønh caùc lieân keát vôùi Ni2+, vaø do đoù seõ laøm “khoùa”ù trung taâm hoaït đoäng cuûa urease. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 18 Baûng 1.4: AÛnh höôûng cuûa caùc ion leân hoaït tính urease [38] Daáu (–) bieåu thò söï maát hoaït tính hoaøn toaøn cuûa urease Theo baûng treân, vôùi haøm löôïng AgNO3 0.002mg/ml đaõ laøm maát hoaït tính cuûa urease, đoái vôùi HgCl2 laø 0.004mg/ml vaø đoái vôùi Cu2+ laø 0.01mg/ml. Söï voâ hoaït urease cuûa caùc ion kim loaïi đöôïc trình baøy theo daõy sau: Ag+ > Hg2+ > Cu2+ > Zn2+ > Cd2+ > UO22+ > Au3+ > Pb2+ > Co2+ > Ni2+ > Ce2+ > Mn2+ Trong đoù Ag+ coù taùc duïng öùc cheá urease cao nhaát, coù leõ noù taùc duïng vôùi nhoùm –SH cuûa Cys592 naèm ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Caùc chaát hoaït hoùa hay baûo veä urease (nhö protein, acid amin, gum arabic) lieân keát vôùi caùc ion kim loaïi naøy, vì theá baûo veä đöôïc nhoùm – SH cuûa enzyme.  Moät soá α–hydroxyketones (hôïp chaát coù chöùa nhoùm –COCH(OH)–) [43] Theo nghieân cöùu cuûa Toru Tanaka vaø coäng söï [43], khi khaûo saùt 13 loaïi α- hydroxyketones vaø 7 loaïi α – diketones nhö sau: CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 19 Hình 1.13: Coâng thöùc hoùa hoïc cuûa caùc α-hydroxyketones (1–13) and α – diketones (14–20) Keát quaû cho thaáy vôùi noàng đoä 400µg/ml thì caùc α-hydroxyketones nhö 2,2'-thenoin (10), furoin (9), 2-hydroxy-1-phenylethanone (5) vaø acetol (1) theå hieän tính öùc cheá. Taùc duïng öùc cheá naøy phuï thuoäc vaøo thôøi gian tieàn uû vôùi urease vaø bò khoùa hoaøn toaøn bôûi 2_mercaptoethanol (2-ME), dithiothreito (DTT), tuy nhieân trong đoù chæ coù (5) vaø (9) bò khoùa bôûi NiCl2 vaø phuï thuoäc vaøo noàng đoä. Ngöôïc laïi, đoái vôùi hydroxyurea vaø acetohydroxamic acid, tính öùc cheá khoâng bò aûnh höôûng bôûi 2-ME vaø DTT nhöng bò aûnh höôûng bôûi NiCl2. Tính öùc cheá cuûa α-hydroxyketones đöôïc cho laø do lieân keát vôùi Cysteine naèm ôû trung taâm hoaït đoäng. Đieàu naøy cuõng coù nghóa laø α–hydroxyketones coù theå öùc cheá caùc enzyme SH khaùc nhö alcohol dehydrogenase, amylase…Beân caïnh đoù, taùc duïng giaûm söï öùc cheá cuûa NiCl2 đoái vôùi (5), (9), hydroxyurea vaø acetohydroxamic acid đöôïc cho laø do lieân keát vôùi trung taâm kim loaïi cuûa enzyme.  Dòch chieát toûi : [4] Toûi ñöôïc söû duïng nhö laø moät döôïc thaûo töø haøng ngaøn naêm nay. Ngaøy nay, nhöõng saûn phaåm töø toûi nhö nöôùc coát toûi töôi, dòch chieát trong nöôùc vaø coàn, boät toûi saáy laïnh vaø daàu toûi laø ñoái töôïng cuûa nhieàu nghieân cöùu hoùa hoïc, döôïc lyù vaø laâm saøng. Toûi ñöôïc bieát tôùi vì coâng duïng khaùng khuaån, khaùng naám vaø choáng oxy hoùa maïnh. Toûi laø taùc nhaân khaùng khuaån maïnh, laø chaát öùc cheá vi khuaån Gram döông laãn Gram aâm nhö caùc loaøi Escherichia, Salmonella, CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 20 Streptococcus, Staphylococcus, Klebsiella, Proteus vaø Helicobacter pylori [5][33][40]. Trong ñoù, Helicobacter Pylori, vi khuaån coù khaû naêng khaùng nhieàu loaïi khaùng sinh, laïi nhaïy caûm vôùi dòch chieát toûi ôû noàng ñoä khaù thaáp. Beân caïnh ñoù, noù ngaên ngöøa söï keát tuï maùu giuùp giaûm hieäu quaû löôïng serum cholesterol, triglicerydes vaø haï thaáp aùp suaát thò giaùc [5][33]. Nhöõng lôïi ích cho söùc khoûe naøy cuûa toûi laø töø hôïp chaát sulfur coù hoaït tính sinh hoïc cao [7][14][23]. Thaønh phaàn chính cuûa dòch chieát toûi töôi trong nöôùc laø alk(en)yl thiosulfinates ñöôïc taïo ra töø alk(en)ylcysteine sulfoxides trong phaûn öùng xuùc taùc enzyme sau khi daäp toûi theo 2 phöông trình sau: Ñaàu tieân pyruvate, ammonia vaø alk(en)yl sulfenic acid RS(O)H ñöôïc taïo ra sau ñoù alk(en)yl sulfenic acid ngöng tuï nhanh choùng thaønh thiosulfinates R–S(O)S–R (R coù theå laø caùc nhoùm: methyl, 1–propenyl hoaëc 2–propenyl/allyl). 60–80% thiosulfinates laø diallyl thiosulfinate hay allicin. Theo [4], dòch chieát toûi coù khaû naêng öùc cheá hoaït tính cuûa enzyme urease vaø thaønh phaàn gaây öùc cheá chuû yeáu laø thiosulfinates. Söï maát hoaït tính naøy tyû leä vôùi löôïng alk(en)yl thiosulfinates coù trong dòch chieát, thôøi gian uû vôùi enzyme nhöng khoâng phuï thuoäc vaøo loaïi nhoùm alk(en)yl trong thiosulfinates. Dòch chieát toûi neân ñöôïc baûo quaûn ôû 4oC ñeå duy trì khaû naêng öùc cheá vì thiosulfinates khoâng beàn vaø bieán ñoåi theo thôøi gian thaønh caùc hôïp chaát beàn hôn nhö polysulfides vaø thiosulphonates) [7]. Khi nghieân cöùu khaû naêng phuïc hoài vaø baûo veä hoaït tính cuûa enzyme urease khoûi söï voâ hoaït bôûi toûi cuûa caùc hôïp chaát thiols (monothiols: cysteine, 2-ME, glutathione vaø dithiol: DTT) tröôùc vaø sau thôøi gian urease uû vôùi dòch chieát toûi trong 15 phuùt, Adam vaø coäng söï ñaõ cho keát quaû sau: CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 21 Hình 1.14: AÛnh höôûng cuûa caùc hôïp chaát thiols, urea vaø acid boric tôùi khaû naêng öùc cheá urease cuûa dòch chieát toûi tröôùc khi uû. Sau 15 phuùt urease uû vôùi dòch chieát toûi, söï coù maët cuûa DDT coù theå phuïc hoài hoaït tính cuûa urease, löôïng hoaït tính phuïc hoài ñöôïc phuï thuoäc vaøo thôøi gian DDT uû vôùi enzyme, nhöng caùc monothiols khoâng coù khaû naêng naøy. Ngoaøi ra, acid boric vaø urea cuõng coù theå baûo veä hoaït tính cuûa urease khoûi söï öùc cheá cuûa toûi nhöng yeáu hôn. Acid boric ñoàng thôøi laø chaát öùc cheá caïnh tranh enzyme urease, coù tính thuaän nghòch, khaû naêng öùc cheá trung bình (Ki = 0.12m [43]). Caáu truùc hoaït ñoäng nhaát cuûa acid boric laø B(OH)3, kích thöôùc nhoû neân noù deã daøng lieân keát vôùi ion Ni2+ do ñoù khoùa trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme, baûo veä enzyme khoûi söï voâ hoaït cuûa thiosulfinates. Keát quaû naøy cuõng cho thaáy söï voâ hoaït urease bôûi thiosulfinates xaûy ra ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme. Tieán haønh nghieân cöùu ñoäng hoïc cuûa cuûa cô cheá öùc cheá urease bôûi toûi, Adam vaø coäng söï thaáy raèng ñoà thò semi-log bieåu dieãn hoaït tính coøn laïi coù 2 pha, pha nhanh coù 30% hoaït tính ban ñaàu bò maát vaø pha chaäm coù 70% hoaït tính ban ñaàu bò maát. Moãi pha coù ñoäng hoïc baäc 1 nhö ñoà thò döôùi ñaây: Hình 1.15: Ñoäng hoïc cuûa söï öùc cheá urease bôûi dòch chieát toûi ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 22 Ñoà thò log treân ñöôïc bieãu dieãn töø phöông trình sau: t.k slow t.k fastt slowfast eAeAA   Trong ñoù: At – hoaït tính coøn laïi cuûa urease so vôùi ban ñaàu ôû thôøi ñieåm t (%) Afast, Aslow – bieân ñoä tính theo phaàn traêm hoaït tính baét ñaàu cuûa pha nhanh vaø pha chaäm (%) kfast, kslow – haèng soá vaän toác baäc 1 cuûa pha nhanh vaø pha chaäm Khi noàng ñoä thiosulfinates trong dòch chieát toûi taêng thì giaù trò kfast vaø kslow taêng theo nhöng giaù trò bieân ñoä Afast vaø Aslow gaàn nhö khoâng thay ñoåi. Ñoäng hoïc 2 pha nhö treân cuõng ñaõ ñöôïc tìm thaáy trong caùc nghieân cöùu veà söï öùc cheá enzyme urease töø 2 loaøi thöïc vaät khaùc laø Cajanus cajan vaø Citrullus vulgaris) bôûi 5.5’- dithiobis-2-nitrobenzoic acid, p-chloromercuribenzoate, N-ethylmaleimide, acetohydroxamic acid vaø caùc kim loaïi naëng [29][30][41][42]. Caùc urease treân cuõng gioáng nhö urease ñaäu röïa laø nhöõng homohexameric protein chöùa 1 goác cysteine/tieåu ñôn vò ôû trung taâm hoaït ñoäng. Caùc taùc giaû cho raèng tính chaát 2 pha laø keát quaû cuûa khaû naêng phaûn öùng khaùc nhau cuûa caùc goác cysteine naøy. Saùu nhoùm –SH ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm, 1 nhoùm phaûn öùng nhanh hôn vaø 1 nhoùm phaûn öùng chaäm hôn. Ñoái vôùi urease ñaäu röïa, nhoùm –SH thuoäc veà Cys592 naèm treân vaønh di ñoäng gaàn trung taâm hoaït ñoäng [10]. Keát quaû cuûa Adam vaø coäng söï cho thaáy tính chaát öùc cheá baát thuaän nghòch vaø phuï thuoäc vaøo thôøi gian ñoái vôùi enzyme urease ñaäu röïa bôûi dòch chieát toûi laø do phaûn öùng cuûa nhoùm –SH naèm ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa urease vôùi thiosulfinates. Rabinkov, Miron, Konstatinovski, Wilchek, Mirelman vaø Weiner (1998) ñaõ nghieân cöùu chi tieát cô cheá phaûn öùng cuûa diallyl thiosulfinate vôùi nhoùm –SH trong moâ hình chöùa L_cysteine. S-allylmercaptocysteine (Cys-S-S- All) ñöôïc taïo ra vaø ñöôïc chöùng minh baèng NMR vaø SM [34]. Noùi toùm laïi, söï öùc cheá urease ñaäu röïa bôûi thiosulfinates ñöôïc cho laø do phaûn öùng giöõa nhoùm –SH (Cys592) ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa urease vaø goác sulfur cuûa –S(O)-S- trong thiosulfinates daãn tôùi söï hình thaønh cuûa hôïp chaát disulfur ñoàng hoùa trò theo phöông trình sau: E-SH + R-S(O)S-R  E-S-S-R + R-SOH trong ñoù R coù theå laø caùc nhoùm methyl, 1-propenyl hay 2-propenyl. Phaûn öùng treân ñöa tôùi söï bieán daïng caáu truùc urease vaø keát quaû laø urease maát hoaït tính. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 23 Keát quaû nghieân cöùu veà urease ñaäu röïa cuõng phuø hôïp vôùi caùc keát quaû nghieân cöùu veà caùc enzyme chöùa nhoùm thiol khaùc. Rabinkov vaø coäng söï (1998) ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa allicin leân hoaït tính cuûa caùc protein chöùa nhoùm thiol laø papain vaø dehydrogenase vaø thaáy raèng söï öùc cheá coù tính chaát baát thuaän nghòch vaø phuï thuoäc vaøo thôøi gian, nguyeân nhaân laø do söï lieân keát vôùi nhoùm –SH cuûa enzyme. Gupta vaø Porter (2001) ñaõ chöùng minh raèng söï öùc cheá enzyme squalene monooxygenase bôûi dòch chieát toûi töôi cuõng coù tính chaát baát thuaän nghòch vaø phuï thuoäc vaøo thôøi gian, nguyeân nhaân cuõng laø do söï lieân keát chaát öùc cheá vôùi nhoùm –SH ôû trung taâm hoaït ñoäng cuûa enzyme [15]. Ngoaøi ra coøn coù caùc chaát öùc cheá khoâng caïnh tranh enzyme urease khaùc nhö lansoprasole, rabeprazole, α,β – unsaturated ketones [44], biscoumarin [20] …Hoaït đoäng öùc cheá phuï thuoäc vaøo thôøi gian tieàn uû vôùi urease. 1.2. Caùc phöông phaùp thu nhaän urease 1.2.1. Nguoàn thu nhaän Urease đöôïc caùc nhaø khoa hoïc tìm thaáy khaù sôùm ôû nhöõng nguoàn nguyeân lieäu khaùc nhau. 1.2.1.1. Vi sinh vaät: [4][37] Naêm 1980, Miquel tìm thaáy urease ôû nhieàu loaøi vi sinh vaät, nhaát laø trong caùc vi sinh vaät đaát, trong thöïc vaät vaø moät soá ít ôû đoäng vaät. OÂng đaõ tìm ra ôû hôn 200 loaøi vi khuaån, nhieàu loaïi naám men vaø ôû đa soá caùc loaïi thöïc vaät baäc cao. Caùc vi khuaån coù chöùa urease tham gia vaøo quaù trình đoàng hoùa urea thaønh muoái amon coù nhieàu loaøi, chuùng coù teân chung laø Ureabacterium, haàu heát chuùng thuoäc 2 hoï: Cocoaceae vaø Bacilaceae [37]. Moät soá vi khuaån sinh toång hôïp urease laø Helicobacter Pylori, Klebsiella aerogenses, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica, Bacillus pasteurii, Escherchia coli, Staphylococcus… Hình 1.16: Caáu truùc phaân töû urease cuûa Helicobacter Pylori CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 24 Helicobacter Pylori ñöôïc cho laø moät trong nhöõng nguyeân nhaân chính cuûa beänh loeùt daï daøy vaø taù traøng cuõng nhö ung thö daï daøy. Nhöõng nghieân cöùu in vivo vaø in vitro gaàn ñaây ñaõ chöùng minh raèng Helicobacter pylori coù khaû naêng khaùng laïi nhieàu loaïi chaát khaùng sinh nhöng laïi nhaïy caûm vôùi dòch chieát toûi ôû noàng ñoä khaù thaáp. Sivam, Lampe, Ulness, Swanzy, and Potter (1997) ñaõ khaûo saùt hoaït tính khaùng khuaån cuûa dòch chieát toûi tan trong nöôùc ñoái vôùi H. pylori vaø thaáy raèng noàng ñoä öùc cheá thaáp nhaát cuûa dòch chieát toûi laø 40mg thiosulfinates/ml. Cellini, Di Campli, Masulli, Di Bartolomeo, and Allocati (1996) ñaõ thöû treân 16 maãu phaân laäp H. pylori beänh phaåm vaø ñöa ra noàng ñoä dòch chieát toûi caàn thieát ñeå öùc cheá söï phaùt trieån cuûa vi khuaån laø 2 – 5mg/ml. Keát quaû naøy thu ñöôïc töø caùc nghieân cöùu daï daøy sau khi tieâu thuï moät teùp toûi côõ trung bình. H. pylori laø moät vi khuaån hieám khi “thoáng trò” trong daï daøy ngöôøi. Moät ñieàu thuù vò laø chuùng coù theå soáng soùt vaø phaùt trieån trong moâi tröôøng acid cuûa daï daøy baèng caùch sinh ra moät löôïng dö thöøa enzyme urease (chieám 10 – 15% toång soá protein theo khoái löôïng) coù taùc duïng thuûy phaân urea coù trong dòch vò. Ammonia sinh ra töø phaûn öùng naøy taïo ra moâi tröôøng kieàm cuïc boä ôû ñoù vi khuaån ñöôïc baûo veä khoûi ñieàu kieän acid baát lôïi. 1.2.1.2. Đoäng vaät: [37] Naêm 1922, Przylecki tìm thaáy urease trong gan cuûa đoäng vaät thaân meàm, trong moät soá loaøi aáu truøng vaø loaøi giaùp xaùc. Ngoaøi ra urease coøn đöôïc tìm thaáy ôû con Sam (Limulus polyphemus), ôû aáu truøng cuûa ruoài Lucilia sericata, dòch tieâu hoùa cuûa traâu, boø, deâ vaø choù… 1.2.1.3. Thöïc vaät: [18] Caùc loaïi caây hoï đaäu nhö đaäu röïa, đaäu naønh, đaäu ngöï, đaäu raèn đeàu coù chöùa moät löôïng đaùng keå urease. Trong caùc loaïi đaäu keå treân thì đaäu röïa (jack bean) chöùa moät löôïng urease raát lôùn, tôùi gaàn 20% troïng löôïng chaát khoâ cuûa haït. Đaäu röïa coù nguoàn goác töø AÁn Đoä. ÔÛ nöôùc ta, gioáng đaäu röïa đöôïc troàng nhieàu ôû mieàn Baéc, ôû mieàn Nam coù gioáng đaäu röïa leo. Haït đaäu röïa đoäc, aên say do trong haït coù chöùa chaát Concanavalin laø chaát đoäc. Noù phaân laäp immunoglobulin vaø glucoprotein trong maùu, laøm giaûm khaû naêng haáp thu chaát dinh döôõng qua ruoät non. Vì lí do treân neân ôû nöôùc ta đaäu röïa ít đöôïc troàng nhieàu. So vôùi 3 loaïi đaäu coøn laïi: đaäu raèn, đaäu ngöï, đaäu naønh thì đaäu naønh coù chöùa moät löôïng urease lôùn hôn caû vaø cho hoaït tính cao hôn 2 loaïi coøn laïi. Đaäu naønh do coù giaù trò dinh döôõng cao neân đöôïc troàng khaù phoå bieán ôû nöôùc ta, giaù thaønh laïi reû neân raát thích hôïp đöôïc duøng laøm nguyeân lieäu đeå nghieân cöùu thu nhaän urease ôû Vieät Nam. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 25 Nguoàn enzyme urease töï nhieân töø caùc caây hoï ñaäu naøy khaù phong phuù neân ngay töø raát sôùm caùc nhaø khoa hoïc ñaõ khoâng ngöøng nghieân cöùu trích ly enzyme urease töø chuùng vaø öùng duïng roäng raõi trong caùc ngaønh phaân tích thöïc phaåm vaø y hoïc. Naêm 1916, Mateer vaø Marshall kieåm tra haøm löôïng urease trong 13 loaïi caây hoï đaäu vaø laáy löôïng enzyme urease trong đaäu naønh laøm chuaån thì löôïng urease trong caùc loaïi đaäu khaùc nhö sau: Baûng 1.5: Haøm löôïng urease trong caùc loaïi đaäu Teân thoâng thöôøng Teân thoâng thöôøng Löôïng urease Glycine max L. Đaäu naønh (soybean) 1 Canavalia ensiformis Đaäu röïa (jack bean) 15 Canavalia gladiata Đaäu kieám (sword bean) 5 Dolichos biflorus Đaäu ngöïa (horse gram) 1/5 Lupinus albus Ñaäu lupin 1/50 Phaseolus aureus (Vigna radiata) Ñaäu xanh 1/350 Ñaäu naønh Ñaäu röïa Ñaäu kieám Ñaäu ngöïa Ñaäu lupin Ñaäu xanh Hình 1.17: Caùc loaïi ñaäu chöùa enzyme urease CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 26 1.2.2. Moät soá phöông phaùp taùch chieát vaø tinh cheá enzyme [1][2] Caùc enzyme thöôøng coù trong caùc teá baøo đoäng thöïc vaät vaø vi sinh vaät vaø moät soá enzyme ngoaïi baøo seõ coù trong moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät. đeå taùch chieát chuùng ra coù caùc caùch nhö sau:  Nghieàn teá baøo (phaù vôõ teá baøo): coù theå duøng phöông phaùp vaät lyù, hoùa hoïc hoaëc sinh hoïc.  Phöông phaùp vaät lyù: caùc phöông phaùp xay nghieàn ôû nhieät đoä thaáp hay duøng Nitô loûng. Khi đoù nöôùc trong teá baøo bò keát tinh vaø taêng löïc ma saùt khi xay nghieàn phaù vôõ maøng teá baøo.  Phöông phaùp hoùa hoïc: xöû lyù teá baøo baèng caùc dung moâi coù khaû naêng hoøa tan maøng teá baøo. Phaàn lôùn ngöôøi ta coù theå choïn caùc dung moâi höõu cô hoøa tan đöôïc chaát beùo hoaëc xöû lyù kieàm.  Phöông phaùp sinh hoïc: hay coøn goïi laø phöông phaùp töï phaân (autolyse). Söû duïng lyxosom trong teá baøo đeå giaûi phoùng caùc enzyme phaù huûy teá baøo hoaëc boå sung caùc cheá phaåm enzyme phaù vôõ maøng teá baøo.  Trích ly enzyme: Tuøy loaïi enzyme ngöôøi ta seõ choïn dung moâi thích hôïp đeå trích ly. Phaàn lôùn dung moâi laø caùc muoái loaõng hay laø dung dòch đeäm coù pH xaùc đònh.  Keát tuûa enzyme: Söû duïng caùc dung moâi khaùc nhau đeå keát tuûa enzyme. Caùc taùc nhaân naøy phaûi laø caùc taùc nhaân bieán tính thuaän nghòch protein đeå sau khi keát tuûa coù theå hoøa tan laïi đöôïc. Bao goàm:  Muoái trung tính: töøng loaïi protein coù theå keát tuûa bôûi caùc noàng đoä muoái khaùc nhau. Caùc muoái trung tính thöôøng đöôïc choïn laø (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4, MgCl2, NaCl. Phöông phaùp naøy coøn goïi laø phöông phaùp dieâm tích.  Duøng pH đaúng đieän (pI): moãi protein deã bò keát tuûa bôûi pH đaúng đieän rieâng.  Duøng dung moâi höõu cô ôû nhieät đoä thaáp: coù khaû naêng phaù maøng hydrate cuûa protein nhö: butanol, ethanol, polyethylenglycol, acetone ôû nhieät đoä gaàn 0 – 3oC. Nguyeân taéc: Dòch chieát enzyme : coàn = 1 : 3-4 (v/v) Dòch chieát enzyme: aceton = 1 : 1-2 (v/v) CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 27 Sau đoù ly taâm, thu keát tuûa enzyme vaø saáy ôû nhieät đoä khoâng quaù 40oC.  Loaïi taïp chaát coù phaân töû löôïng nhoû: Baèng phöông phaùp thaåm tích, duøng caùc maøng baùn thaám baèng vaät lieäu coù kích thöôùc loã maøng nhoû coù theå cho caùc chaát coù phaân töû löôïng nhoû đi qua do cheânh leäch aùp suaát vaø giöõ laïi caùc chaát coù phaân töû löôïng lôùn.  Loaïi protein taïp: Duøng phöông phaùp saéc kyù, goàm saéc kyù haáp phuï hoaëc saéc kyù trao đoåi ion, saéc kyù loïc gel. Hoaëc duøng phöông phaùp đieän di: duøng đieän tröôøng đeå taùch caùc protein tích đieän khaùc nhau.  Laøm đaëc – tieâu chuaån hoùa saûn phaåm: Duøng saáy thaêng hoa hoaëc caùc cheá phaåm loûng đöôïc sieâu loïc vaø phaûi tieâu chuaån hoùa saûn phaåm: cheá phaåm phaûi coù hoaït tính rieâng nhaát đònh. 1.3. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính urease E + S [ES] E + P Trong enzyme hoïc, ngöôøi ta khoâng đònh löôïng enzyme moät caùch tröïc tieáp maø thöôøng xaùc đònh giaùn tieáp thoâng qua xaùc đònh möùc đoä hoaït đoäng (hoaït tính) cuûa enzyme đoù. Veà nguyeân taéc, coù theå chia ra 3 nhoùm phöông phaùp sau:  Đo löôïng cô chaát bò maát đi hay löôïng saûn phaåm đöôïc taïo thaønh trong moät thôøi gian nhaát đònh öùng vôùi moät noàng đoä enzyme xaùc đònh.  Đo thôøi gian caàn thieát đeå thu đöôïc moät löôïng bieán thieân nhaát đònh cuûa cô chaát hay saûn phaåm öùng vôùi moät noàng đoä enzyme nhaát đònh.  Choïn noàng đoä enzyme nhö theá naøo đeå trong moät thôøi gian nhaát đònh thu đöôïc söï bieán thieân nhaát đònh veà cô chaát hay saûn phaåm. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 28 Baûng 1.6: Caùc phöông phaùp ñeå xaùc ñònh hoaït tính enzyme Nhoùm Caùc thoâng soá coá đònh Caùc thoâng soá thay đoåi 1 Thôøi gian Noàng đoä E Löôïng S hay P 2 Löôïng S maát đi (hay löôïng P taïo thaønh) Noàng đoä E Thôøi gian 3 Thôøi gian Löôïng S maát đi (hay löôïng P taïo thaønh) Noàng đoä E Đeå deã daøng cho vieäc nghieân cöùu, ngöôøi ta đaõ đöa ra caùc khaùi nieäm: [2]  Đôn vò enzyme quoác teá (International Units): laø löôïng enzyme coù khaû naêng xuùc taùc laøm chuyeån hoùa đöôïc moät µmol cô chaát sau moät phuùt ôû đieàu kieän tieâu chuaån.  Katal (Kat): laø löôïng enzyme coù khaû naêng xuùc taùc laøm chuyeån hoùa đöôïc 1 mol cô chaát sau moät giaây ôû đieàu kieän tieâu chuaån.  Hoaït tính rieâng cuûa cheá phaåm (specific activity): baèng soá löôïng đôn vò hoaït đoä coù trong 1 đôn vò theå tích protein (đoái vôùi cheá phaåm loûng) hoaëc trong 1 đôn vò khoái löôïng protein (đoái vôùi cheá phaåm raén). Hoaït tính rieâng cuûa cheá phaåm enzyme noùi leân möùc đoä tinh khieát cuûa cheá phaåm enzyme. Trong quaù trình tinh cheá, hoaït tính rieâng seõ taêng leân đaùng keå.  Hoaït tính toaøn phaàn cuûa cheá phaåm enzyme (total activity): laø toång soá đôn vò hoaït đoä coù trong cheá phaåm. Trong quaù trình tinh cheá, hoaït tính toaøn phaàn cuûa cheá phaåm seõ bò giaûm. đoù laø söï thaát thoaùt trong quaù trình xöû lyù.  Hoaït tính phaân töû (molecular activity): laø soá phaân töû cô chaát ñöôïc chuyeån hoùa bôûi moät phaân töû enzyme trong 1 phuùt. Ñaïi löôïng naøy chæ söû duïng đoái vôùi moät soá ít cheá phaåm enzyme đaõ taùch ra đöôïc hoaøn toaøn tinh khieát vaø đaõ xaùc đònh đöôïc phaân töû löôïng cuûa enzyme.Urease töø ñaäu naønh ôû pH = 7, nhieät ñoä 20oC laø 460000. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 29 Đoái vôùi enzyme urease, caùc saûn phaåm taïo thaønh sau phaûn öùng laø CO2, NH3 đeàu coù theå đònh löôïng moät caùch deã daøng. Chính vì vaäy maø nhoùm phöông phaùp đaàu tieân đöôïc aùp duïng trong vieäc xaùc đònh hoaït tính urease. 1.3.1. Xaùc ñònh hoaït tính urease döïa treân vieäc ñònh löôïng NH3 ñöôïc giaûi phoùng  Phöông phaùp xaùc đònh hoaït tính urease ôû đaäu töông theo TCVN 4847 – 89 (ISO 5506 – 1988): Nguyeân taéc: Troän 1 löôïng maãu vôùi dung dòch đeäm urea, sau khi giöõ hoãn hôïp trong 30 phuùt ôû 30oC, trung hoøa löôïng NH3 giaûi phoùng ra baèng 1 löôïng dö HCl vaø chuaån đoä ngöôïc baèng dung dòch NaOH theå tích chuaån 0.1N. Nhaän xeùt: veà nguyeân taéc thì phöông phaùp naøy cuõng gioáng nhö phöông phaùp chuaån đoä formol. Tuy nhieân phöông phaùp naøy keùm chính xaùc hôn vì ôû giai đoaïn chuaån đoä ngöôïc baèng dung dòch NaOH bò sai soá thöøa do 1 löôïng NaOH phaûn öùng vôùi muoái amoni coù trong dung dòch.  Phöông phaùp Nessler: [32] Nguyeân taéc: Duøng phaûn öùng maøu vôùi thuoác thöû Nessler đeå đònh löôïng ammonia đöôïc taïo thaønh trong phaûn öùng thuûy phaân urea bôûi urease. NH3 taïo thaønh seõ phaûn öùng vôùi thuoác thöû Nessler taïo phöùc maøu vaøng vaø cöôøng đoä maøu thay đoåi tuøy theo löôïng NH3 taïo ra. K2HgI4 + 3 KOH + NH3 OHg2NH2I + 7 KI + 3 H2O Tieán haønh: - Laáy 0.4ml nöôùc caát cho vaøo oáng nghieäm vaø 0.5ml dung dòch urea 3% trong đeäm phosphate 0.5M pH=7, giöõ trong tuû aám đeán khi đaït 30oC. - Theâm 0.1 ml dung dòch urease coù đoä pha loaõng thích hôïp, laéc vaø giöõ 30oC trong 5 phuùt. - Laøm ngöøng phaûn öùng baèng caùch theâm 0.5ml dung dòch HCl 1M vaø laéc đeàu. - Xaùc đònh ammonia nhö sau: laáy 0.15ml hoãn hôïp phaûn öùng cho vaøo oáng nghieäm, theâm 7ml nöôùc, 0.5ml thuoác thöû Nessler vaø theâm nöôùc vaøo đeán 10ml. Laéc đeàu vaø đem so maøu treân maùy quang phoå keá (coù maãu đoái chöùng baèng nöôùc caát). CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 30 Phaûn öùng xaûy ra trong moâi tröôøng kieàm pH < 12. Neáu dö KOH seõ aûnh höôûng đeán đoä chính xaùc cuûa phaûn öùng theo chieàu thuaän. Dö KI seõ aûnh höôûng đeán đoä chính xaùc phaûn öùng theo chieàu nghòch. Chaát maøu thu đöôïc raát nhaïy vôùi moâi tröôøng phaûn öùng, caøng ít KI caøng nhaïy vôùi NH3. Khi löôïng KI lôùn, phaûn öùng noùi chung khoâng nhaïy nöõa. đoä nhaïy phaûn öùng coøn tyû leä vôùi löôïng dung dòch HgI2.  Phöông phaùp chuaån đoä: [32] Nguyeân taéc: Duøng dung dòch acid coù noàng đoä xaùc đònh đeå chuaån đoä ammonia đöôïc taïo thaønh. Tieán haønh: - Laáy dung dòch enzyme vaø 5ml dung dòch urea 2% trong đeäm phosphate pH=7 vaø giöõ ôû 30oC trong 30 ph. - Theâm 10 gioït dung dòch methyl red 0.05% vaø chuaån đoä baèng dung dòch H2SO4 0.1N cho đeán khi coù maøu hoàng. 1.3.2. Xaùc ñònh hoaït tính urease baèng caùch ñònh löôïng CO2 ñöôïc giaûi phoùng – Phöông phaùp formol [3] Nguyeân taéc: Urease laø moät enzyme thuûy phaân đaëc hieäu urea: (NH2)2CO + 2 H2O  (NH4)2CO3 Khi theâm formaldehyde vaøo moâi tröôøng seõ taïo thaønh hexamethylene tetramine vaø giaûi phoùng acid carbonic: 2(NH4)2CO3 + 6HCHO (CH2)6N4 + 2H2CO3 + 6H2O Duøng kieàm đònh phaân löôïng acid taïo thaønh seõ tính đöôïc löôïng urea bò thuûy phaân. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 31 1.4. ÖÙng duïng cuûa enzyme urease Urease phaân boá khaù roäng raõi trong töï nhieân vaø noù đöôïc öùng duïng chuû yeáu trong caùc lónh vöïc noâng nghieäp, thöïc phaåm vaø y teá. 1.4.1. Trong noâng nghieäp Urea laø moät nguoàn Nitô quan troïng đoái vôùi caây troàng. Tuy nhieân, thöïc vaät khoâng söû duïng đöôïc tröïc tieáp nguoàn N naøy maø phaûi thoâng qua con đöôøng khoaùng hoùa nhôø vi sinh vaät (vi sinh vaät seõ phaân huûy urea đeå saûn phaåm cuoái cuøng laø ammonia). Quaù trình phaân huûy naøy đöôïc thöïc hieän nhôø enzyme urease trong caùc vi sinh vaät đaát laøm cho ñaát trôû neân phì nhieâu, taêng saûn löôïng caây troàng. Caùc loaøi vi khuaån söû duïng urea laøm nguoàn N coù teân chung laø Ureabacterium, haàu heát chuùng thuoäc hoï Cocoaceae vaø Bacilaceae. 1.4.2. Trong thöïc phaåm Trong danh muïc caùc phuï gia đöôïc söû duïng trong thöïc phaåm do boä y teá ban haønh khoâng coù teân urea. Đieàu naøy chöùng toû noù khoâng đöôïc pheùp coù maët trong thöïc phaåm. Tuy nhieân trong thöïc phaåm coù theå coù urea do nhieàu nguyeân nhaân khaùc nhau nhö nhieãm töø nguoàn nöôùc hoaëc töø nguyeân lieäu…Đaây laø nhöõng nguyeân nhaân naèm ngoaøi döï kieán cuûa caùc nhaø saûn xuaát. Ví duï: trong caùc loaïi thöïc phaåm leân men neáu phaûi qua coâng ñoaïn nhaân gioáng vi sinh vaät vaø coù söû duïng urea ñeå boå sung nguoàn dinh döôõng Nitô vaøo moâi tröôøng thì urea coù theå nhieãm vaøo caùc saûn phaåm naøy. Nöôùc maém, moät saûn phaåm maø haøm löôïng Nitô toaøn phaàn đöôïc xem laø chæ tieâu đaàu tieân đeå đaùnh giaù chaát löôïng saûn phaåm. Tuy nhieân, hieän nay haøm löôïng urea trong moät soá saûn phaåm nöôùc maém ñöôïc phaùt hieän laø khaù cao. Đeå kieåm soaùt chaát löôïng, taïi phoøng kieåm đònh Hoùa hoïc cuûa Vieän Pasteur đaõ söû duïng cheá phaåm urease đeå xaùc đònh haøm löôïng urea coù trong thöïc phaåm. ÔÛ nhieàu ñoäng vaät, urea ñöôïc hình thaønh trong quaù trình trao ñoåi chaát vaø quaù trình hö hoûng nhö caù đuoái, caù nhaùm neân trong cheá bieán ngöôøi ta söû duïng urease đeå thuûy phaân urea, goùp phaàn khöû muøi khai cho thòt caù naøy. 1.4.3. Trong phaân tích hoùa sinh Đieän cöïc urease khoâng tan duøng đeå xaùc đònh töï đoäng urea treân doøng lieân tuïc. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 32 1.4.4. Trong coâng ngheä moâi tröôøng Enzyme urease ñöôïc söû duïng ñeå phaân tích haøm löôïng caùc kim loaïi naëng coù trong nöôùc ñaëc bieät laø thuûy ngaân vaø qua ñoù noùi leân möùc ñoä oâ nhieãm cuûa nguoàn nöôùc. 1.4.5. Trong y hoïc Urease đöôïc gaén trong caùc vi tieåu caàu duøng đeå loaïi urea cuûa maùu trong thaän nhaân taïo. Urea đöôïc taïo thaønh chuû yeáu ôû gan vaø đöôïc vaän chuyeån qua thaän đeå thaûi ra ngoaøi. Haøng ngaøy, moãi ngöôøi baøi xuaát chöøng 7 – 16g urea hay hôn nöõa tuøy vaøo cheá đoä aên. Maëc duø baûn thaân urea laø chaát khoâng đoäc nhöng söï öù đoïng cuûa noù trong cô theå thöôøng keøm theo nhöõng saûn phaåm chuyeån hoùa đoäc nhö NH3. Vì vaäy, neáu noàng đoä urea trong maùu taêng cao keùo daøi laø moät daáu hieäu nghieâm troïng. Do đoù, vieäc söû duïng enzyme urease đeå xaùc đònh haøm löôïng urea trong maùu, nöôùc tieåu đaõ đöôïc caùc baùc só söû duïng do tính đaëc hieäu cuûa urease vaø cho keát quaû nhanh, chính xaùc, ít toán keùm vaø deã thöïc hieän. 1.5. Toång quan veà urea 1.5.1. Caáu taïo hoùa hoïc cuûa urea [48] Hình 1.18: Caáu truùc phaân töû cuûa urea CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 33 Baûng 1.7: Tính chaát hoùa lyù cuûa urea Tên hệ thống Diaminomethanal Tên gọi khác Carbamide resin; Isourea; Carbonyl diamide, Carbonyldiamine Công thức phân tử (NH2)2CO Phân tử gam 60.06 g/mol Trạng thái Tinh thể màu trắng hoặc dạng bột trắng, mùi ammonia Độ tan Tan nhiều trong nước pH 7.2 (dung dịch 10% trong nước) Số CAS [57-13-6] Tỷ trọng và pha 1,33 g/cm3, rắn Độ hòa tan trong nước 108 g/100ml (20 °C) Điểm nóng chảy 133 °C (406 K) Số đăng ký CAS (Chemical Abstracts Service) là sự xác định bằng chuối số định danh duy nhất cho các nguyên tố hóa học, các hợp chất hóa học, các polyme, các chuối sinh học, các hỗn hợp và các hợp kim. Urea là một chất dễ kết tinh, ít tan trong ether, không tan trong chloroform. Dung dịch urea bão hoà trong nước ở 30oC có nồng độ 135.3% (w/v). Urea thường có mùi khai do phóng thích NH3. Trong dung dịch nước urea sẽ dần dần bị thuỷ phân thành amonium carbonate hoặc ammonia và carbon dioxide. Trong một số động vật, các phân tử urea được tạo ra từ carbon dioxide, nước, muối aspartate và ammonia trong quá trình trao đổi chất được biết đến như là chu trình urea- một chu trình đồng hóa. Sự tiêu hao năng lượng này là cần thiết do ammonia, một chất thải phổ biến trong quá trình trao đổi chất, là một chất độc và cần được trung hòa. Việc sản xuất urea diễn ra trong gan và dưới sự điều chỉnh của N-acetylglutamate. Các động vật sống dưới nước không sản sinh ra urea, khi sống trong môi trường nhiều nước, chúng chỉ đơn giản là thải ammonia ngay lập tức khi nó vừa được tạo ra. Các loài chim, với sự hạn chế hơn nhiều so với các động vật khác trong tiêu thụ nước, tạo ra acid uric, một hợp chất ít độc hại hơn urea. Cơ thể người sản xuất ra ít acid uric do kết quả của sự phân hủy purine, do việc sản xuất acid uric dư thừa có thể dẫn đến một loại chứng viêm khớp gọi là bệnh gút. 1.5.2. Phaùt hieän [48] Urea được Hilaire Rouelle phát hiện năm 1773. Nó là hợp chất hữu cơ được tổng hợp nhân tạo đầu tiên từ các chất vô cơ, được Friedrich Woehler thực hiện vào năm 1828 bằng cách cho cyanate kali phản ứng với sulfat ammonia. Điều này đã bác bỏ thuyết cho rằng các chất hóa học CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 34 trong cơ thể sinh vật về cơ bản là khác hẳn các hóa chất không có gốc sinh vật, và mở đầu cho ngành khoa học về hóa hữu cơ. 1.5.3. Coâng duïng [48]  Trong công nghiệp: - Nguyên liệu cho sản xuất chất dẻo, đặc biệt là nhựa urea formaldehyde. - Thành phần của phân hóa học và chất bổ sung vào thức ăn cho động vật, nó cung cấp một nguồn đạm cố định tương đối rẻ tiền để giúp cho sự tăng trưởng. - Chất thay thế cho muối (NaCl) trong việc loại bỏ băng hay sương muối của lòng đường hay đường băng sân bay. Nó không gây ra hiện tượng ăn mòn kim loại như muối. - Thành phần bổ sung trong thuốc lá để tăng hương vị. - Đôi khi được sử dụng như là chất tạo màu nâu vàng trong sản xuất bánh quy. - Thành phần của một số dầu dưỡng tóc, sữa rửa mặt, dầu tắm và nước thơm. - Chất phản ứng trong một số gạc lạnh sử dụng để sơ cứu, do phản ứng thu nhiệt tạo ra khi trộn với nước. - Thành phần hoạt hóa để xử lý khói thải từ động cơ diesel (AdBlue).  Trong phòng thí nghiệm: Urea là một chất biến tính protein mạnh. Thuộc tính này có thể khai thác để làm tăng độ hòa tan của một số protein. Vì tính chất này, nó được sử dụng trong các dung dịch đặc tới 10M.  Trong y học:  Thuốc: Urea được sử dụng trong các sản phẩm da liễu cục bộ để giúp cho quá trình tái hydrate hóa của da.  Chẩn đoán sinh lý học: Do urea được sản xuất và bài tiết khỏi cơ thể với một tốc độ gần như không đổi, nồng độ urea cao trong máu chỉ ra vấn đề về sự bài tiết nó hoặc trong một số trường hợp nào đó là sự sản xuất quá nhiều urea trong cơ thể. Nguyên nhân phổ biến của bệnh ureamia là các vấn đề về hệ tiết niệu. Nó được lấy thông số cùng với creatinin để chỉ ra các vần đề trực tiếp liên quan tới thận (ví dụ: hư thận mãn tính) hay các vấn đề thứ cấp như chứng giảm hoạt động tuyến giáp. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 35 Nồng độ urea cũng có thể tăng trong một số rối loạn máu ác tính (ví dụ bệnh bạch cầu và bệnh Kahler). . Nồng độ cao của urea (ureamia) có thể sinh ra các rối loạn thần kinh (bệnh não). Thời gian dài bị uremia có thể làm đổi màu da sang màu xám.  Sử dụng trong chẩn đoán khác: Các loại urea chứa cacbon 14 - đồng vị phóng xạ, hay cacbon 13 - đồng vị ổn định) được sử dụng trong xét nghiệm thở urea, được sử dụng để phát hiện sự tồn tại của Helicobacter pylori trong dạ dày và tá tràng người. Xét nghiệm này phát hiện enzym urease đặc trưng, được H. pylori sản xuất ra theo phản ứng để tạo ra ammonia từ urea để làm giảm độ pH của môi trường trong dạ dày xung quanh vi khuẩn. Các loài vi khuẩn tương tự như H. pylori cũng có thể được xác định bằng cùng một phương pháp xét nghiệm đối với động vật (khỉ, chó, mèo bao gồm cả các loại "mèo lớn" như hổ, báo, sư tử v.v). Urea không nằm trong danh mục các chất phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm của Bộ Y tế. Urea không có một tác dụng gì trong việc bảo quản thực phẩm, nó không ức chế được vi khuẩn, không chống mốc, không là chất điều vị, không là chất chống oxy hoá. 1.5.4. Möùc ñoä nguy hieåm [52] Urea có thể gây ảnh hưởng cho sức khỏe thông qua khả năng gây kích ứng cho da, mắt, hệ hô hấp và hệ tiêu hóa. - Gây kích ứng đối với hệ hô hấp. Các triệu chứng có thể bao gồm ho, khó thở, có thể hấp thụ vào trong máu với các triệu chứng tương tự như tiêu hóa. Trong trường hợp này, cho bệnh nhân hít thở không khí trong lành hoặc hô hấp nhân tạo nếu thở không được hoặc thở khó khăn. - Gây kích ứng tới hệ tiêu hóa. Các triệu chứng có thể bao gồm buồn nôn, ói mửa và tiêu chảy, còn có nhức đầu, đau đầu. Khi đó, cho bệnh nhân ói ngay lập tức theo hướng dẫn của nhân viên y tế, không cho bệnh nhân bất tỉnh ăn bất cứ thứ gì. - Gây kích ứng da như làm đỏ da, ngứa và đau da. Khi đó nhanh chóng dội thật nhiều nước vào da trong ít nhất 15 phút đồng thời với việc cởi quần áo và giày đã bị nhiễm, giặt lại quần áo và giày thật kỹ trước khi sử dụng. - Gây kích ứng mắt như làm đỏ và đau mắt. Biện pháp giảm đau là nhanh chóng dội thật nhiều nước vào mắt trong ít nhất 15 phút bằng cách nâng mí trên và dưới xen kẽ. - Gây ngộ độc mãn tính như rối loạn trao đổi protein, giảm cân nặng... 1.5.5. Caùc nguoàn phaùt sinh urea  Con ngöôøi [28] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 36 Urea laø chaát trao đoåi cuoái cuøng chieám cao nhaát trong caùc hôïp chaát nitô ôû đoäng vaät coù vuù, chieám 80 – 90% löôïng baøi tieát nitô ôû con ngöôøi. Đöôïc hình thaønh ôû gan, urea đöôïc vaän chuyeån chuû yeáu baèng maùu tôùi thaän đeå baøi tieát vaøo nöôùc tieåu. Khoaûng noàng đoä urea trong serum vaø plasma khoaûng töø 1 – 10mM (6 – 60mg/ml) vôùi đoä dao đoäng cao giöõa moãi ngöôøi. Urea coù theå đaäm đaëc gaáp 50 laàn trong maãu nöôùc tieåu. Vôùi taùc duïng chæ thò hoaït đoäng cuûa gan vaø thaän neân vieäc xaùc đònh urea trong caùc dung dòch naøy laø caàn thieát vaø laø coâng vieäc thöôøng đöôïc yeâu caàu trong caùc phoøng xeùt nghieäm.  Söõa boø [27][52] “Söõa toång hôïp” laø hoãn hôïp cuûa urea, sodium chloride, sodium bicarbonate, sucrose, daàu thöïc vaät, chaát taåy vaø nöôùc. Moãi thaønh phaàn ñoùng vai troø nhaát ñònh: urea ñöôïc duøng ñeå taêng haøm löôïng Nitô trong söõa, daàu thöïc vaät ñeå thay theá chaát beùo söõa, sodium chloride ñeå ñieàu chænh giaù trò lactose, sodium carbonate ñeå ñieàu chænh tính kieàm vaø giaù trò lactose trong söõa vaø chaát taåy ñöôïc duøng nhö chaát taïo nhuõ. Söõa toång hôïp gioáng vôùi söõa boø töôi veà maøu saéc vaø tính ñoàng nhaát neân deã daøng ñöôïc duøng ñeå giaû söõa boø töôi. Neáu thaønh phaàn söõa toång hôïp khoaûng 5% thì khoâng theå phaùt hieän ñöôïc vì söï khaùc bieät veà vò, maøu saéc vaø ñoä ñoàng nhaát vôùi söõa boø töôi khoâng ñaùng keå. Giaù caû thaáp vaø deã tìm cuûa caùc thaønh phaàn giaû söõa cuøng vôùi vieäc thieáu caùc phöông phaùp hieäu quaû ñeå phaùt hieän söï coù maët cuûa caùc thaønh phaàn naøy coù theå ñem laïi nhieàu lôïi nhuaän maø vaãn khoâng coù nguy cô bò phaùt hieän cho caùc tay buoân söõa khoâng chaân chính. [27] Baûng 1.8: Thaønh phaàn hoùa hoïc cuûa söõa boø töôi vaø söõa toång hôïp [27] Thaønh phaàn (% khoái löôïng) Söõa boø töôi Söõa toång hôïp Nöôùc 86.91 ± 0.18 86.63 ± 0.18 Lipid 3.96 ± 0.06 4.17 ± 0.04 Protein (%N × 6.38) 3.47 ± 0.05 3.07 ± 0.02 Tro 0.70 ± 0.03 1.46 ± 0.03 Carbohydrate 4.96 4.67 Urea laø thaønh phaàn thöôøng thaáy trong söõa vaø chieám khoaûng 55% toång soá Nitô phi protein trong söõa. Haøm löôïng urea trong söõa boø vaø söõa traâu laàn löôït laø 40 vaø 17.5mg/100ml söõa. Urea ñöôïc cho theâm vaøo ñeå taêng ñoä beàn nhieät cuûa söõa [35]. Ngoaøi ra, urea coøn đöôïc duøng nhö chaát chæ thò hieäu quaû söû duïng thöùc aên protein. Vieäc cho aên thöùc aên coù chöùa urea coù theå laøm giaûm giaù thaønh, taêng löôïng protein trong söõa, taêng saûn CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 37 löôïng vaø giaûm baøi tieát nitô ra moâi tröôøng. Tuy nhiên, việc trộn urea vào thức ăn cho gia súc cũng rất dễ gặp rủi ro. Vì vậy, để sử dụng cần có những hiểu biết đầy đủ về cách phối trộn urea. Cũng như các loại gia súc nhai lại, bò có khả năng sử dụng nguồn nitơ phi protein có trong khẩu phần để đáp ứng nhu cầu về protein của chúng. Trong dạ cỏ, nitơ phi protein này được phân giải thành ammonia. Các vi sinh vật (VSV) khu trú trong dạ cỏ sẽ dùng ammoniac để tạo nên cơ thể chúng sẽ tổng hợp ra protein của VSV. Những VSV này đi từ dạ cỏ vào phần dưới hệ thống tiêu hoá (dạ dày – ruột) và được tiêu hoá tại đây, chúng sẽ giải phóng ra các amino acid. Các amino acid này sau đó sẽ được hấp thụ vào máu gia súc. Vieäc xaùc đònh chính xaùc urea trong söõa gaëp khoù khaên bôûi đoä đuïc vaø đoä bieán đoäng haøm löôïng chaát beùo trong söõa. Trong moät baùo caùo naêm 1995 taïi hieäp hoäi söõa quoác teá (IDF), Lefier nhaän xeùt raèng "phöông phaùp tin caäy vaø hieäu quaû đeå xaùc đònh urea trong söõa chöa đöôïc tìm ra". Moät phöông phaùp tieâu chuaån giöõa caùc phoøng thí nghieäm döïa treân söï thuûy phaân choïn loïc urea baèng urease vaø quan saùt söï thay đoåi pH đöôïc coâng nhaän naêm 2002 bôûi IDF vaø toå chöùc tieâu chuaån hoùa quoác teá (ISO).  Röôïu vang [28] Kieán thöùc veà röôïu vang baûo đaûm raèng haøm löôïng ethyl carbamate đaùp öùng caùc yeâu caàu. Ethyl carbamate (urethane), 1 thaønh phaàn xuaát hieän töï nhieân trong taát caû saûn phaåm leân men, đaõ đöôïc chöùng minh laø gaây ung thö trong caùc thí nghieäm vôùi đoäng vaät ôû lieàu löôïng cao. Arginine, coù trong dòch nho đöôïc chuyeån hoùa thaønh urea bôûi naám men röôïu vang vaø giaûi phoùng töø trong teá baøo ra röôïu tôùi 1 noàng đoä tôùi haïn. Söï hình thaønh ethyl carbamate xaûy ra laø do phaûn öùng giöõa urea vaø röôïu, caøng maïnh khi ôû nhieät đoä cao. US Food & Drug Administration khuyeân caùc thaønh vieân cuûa ngaønh coâng nghieäp röôïu vang neân coù giaûi phaùp nhö traùnh boå sung quaù nhieàu nitô vaø theo doõi tình traïng nitô trong röôïu vaø đaát đeå giaûm löôïng ethyl carbamate trong röôïu.  Chu kyø nitô döôùi nöôùc [28] Urea đoùng vai troø quan troïng trong chu kyø nitô döôùi nöôùc bao goàm söï baøi tieát bôûi caùc đoäng vaät khoâng xöông soáng vaø caù, söï phaân huûy nitô bôûi vi sinh vaät. Urea chieám 20 – 50% toång löôïng nitô söû duïng bôûi thöïc vaät phuø du. Noàng đoä urea hoøa tan trong moâi tröôøng gaàn bôø bieån vaø cöûa soâng cao hôn vaø bieán đoäng hôn ôû đaïi döông (< 5.10-7M)  Caùc ngaønh coâng nghieäp [28] CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 38 Saûn xuaát urea theá giôùi haèng naêm vöôït 100 trieäu meùt khoái phaàn lôùn laøm phaân boùn. Maëc duø urea coù đoä đoäc thaáp đoái vôùi sinh vaät nhöng söï phôi nhieãm giaùn tieáp, laâu daøi, vöôït möùc urea coù theå gaây ra oâ nhieãm nöôùc ngaàm, acid hoùa đaát vaø thaûi ammonia vaøo khoâng khí. Ngoaøi ra urea coøn đöôïc söû duïng trong caùc ngaønh: saûn xuaát thöùc aên gia suùc, resin, keo daùn, dung moâi, thuoác, vaø caùc saûn phaåm haøng tieâu duøng nhö xaø phoøng loûng, thuoác taåy, myõ phaåm…  Nöôùc maém [47] Hiện nay, sự xuất hiện của urea trong nước mắm đang là vấn đề được xã hội khá quan tâm. Nguyên nhân có thể do người ta cho urea vào nước mắm, hoặc là trong quá trình chế biến nước mắm đã hình thành urea một cách tự nhiên, cũng có thể là do lượng urea còn tồn tại trong sản phẩm hải sản trước khi đưa vào chế biến nước mắm, mà cũng có thể do có một vài loại cá như cá nhám chẳng hạn, bên ngoài da của nó cũng tiết ra urea. Với lượng dùng nước mắm như một chất gia vị, hàm lượng urea qua kết quả phân tích ở trên, không ảnh hưởng đến sức khoẻ người tiêu dùng. Tuy nhiên trong quá trình sản xuất chế biến, nếu có sự tham dự của urea, khả năng lẫn các kim loại nguy hại đến sức khoẻ như As, Cr, Ni, Hg, Pb, chất lượng... là điều khó tránh khỏi, trong khi đó người ta chỉ quan tâm đến hàm lượng Nitơ (độ đạm) trong giao nhận mua bán nước mắm để xác định giá cả mà không chú ý đến chỉ tiêu giới hạn về nồng độ các kim loại này. Tại các phòng thử nghiệm, phương pháp xác định hàm lượng nitơ toàn phần là chưng cất và chuẩn độ dung dịch ammonium hydroxide thu được để tính ra tổng lượng nitơ. Với cách này nếu trong một mẫu nước mắm đem đi thử nghiệm có cho thêm vào một lượng muối amoni (sulfate hoặc chloride) có trong phân bón hoá học SA (Sulfate amonium) thì kết quả phân tích đạm toàn phần sẽ cao hơn. Tuy nhiên việc cho muối amoni vào sản phẩm sẽ dễ dàng bị phát hiện nếu phân tích xác định cả ba thành phần Nitơ toàn phần, Nitơ formol và Nitơ ammonia (hay còn gọi là đạm muối). Để đối phó với trường hợp này, thay vì cho muối amoni người ta cho thêm urea. Muốn tăng 1 độ đạm thì cần thêm tối thiểu 3,3g urea cho mỗi lít nước mắm. Cách đánh giá định lượng Nitơ ammonia như trên sẽ không phát hiện được. Vấn đề đặt ra là cần có một kết quả nghiên cứu để đưa ra giới hạn tối đa về nồng độ urea trong nước mắm (tương tự như vậy trong nước chấm, xì dầu) không ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng (ngăn chặn việc phát sinh các kim loại nguy hại cho sức khoẻ trong quá trình sản xuất, chế biến). Viện Pasteur Nha Trang đã xác định được hàm lượng urea trong nước mắm bằng thuốc thử DMAB dựa trên phương pháp AOAC-967, 1997, với một vài sự điều chỉnh cho phù hợp với điều kiện mẫu. Phương pháp này rất thuận tiện khi phân tích nhiều mẫu cùng lúc và có thể áp dụng cho nhiều loại mẫu thực phẩm khác. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 39  Thuûy saûn [47] Gần đây, urea được ngư dân sử dụng như là một chất bảo quản hải sản tươi sống. Khi urea hoà tan trong nước, nước sẽ trở nên lạnh do phản ứng thu nhiệt, người ta ngộ nhận và sử dụng thay thế một phần nước đá để ướp. Hải sản ướp urea nhìn bề ngoài trông có vẻ tươi lâu hơn, ngoại hình bắt mắt hơn, do tác dụng làm cho sản phẩm hút và giữ nước, nên hải sản sẽ căng mọng hơn như mới vừa đánh bắt, do đó urea được người ta lạm dụng như là một chất làm đẹp cho hải sản hòng đánh lừa người tiêu dùng. Trong khi đó, thực chất urea hoàn toàn không có khả năng bảo quản, không thể ức chế sự phân huỷ sinh học của sản phẩm hay ngăn chặn quá trình hóa học làm biến chất sản phẩm. Trong một nghiên cứu gần đây của Khoa Y tế Công cộng, Viện Pasteur Nha Trang có liên quan đến tình hình sử dụng urea trong thực phẩm tươi sống, cho thấy tỷ lệ mẫu sản phẩm có urea không đạt tiêu chuẩn vi sinh vật cao hơn mẫu không có urea. điều đó chứng tỏ rằng urea không ức chế sự phát triển vi sinh vật mà ngược lại nó là nguồn cung cấp thêm nitơ dễ hấp thụ làm cho vi sinh vật phát triển. Từ đó, có thể suy ra bằng sản phẩm hải sản được ướp urea chỉ có dáng vẻ bề ngoài, còn bên trong đã bắt đầu hư hỏng. 1.5.6. Caùc phöông phaùp xaùc ñònh urea Caùc phöông phaùp phaân tích urea coù theå phaân loaïi thaønh 2 nhoùm phöông phaùp: tröïc tieáp vaø giaùn tieáp. - Giaùn tieáp: goàm caùc phöông phaùp coù söï thuûy phaân baèng enzyme cô chaát urea tröôùc khi thaêm doø. - Tröïc tieáp: goàm caùc phöông phaùp taïo ra saûn phaåm coù maøu saéc maø khoâng coù söï thuûy phaân tröôùc đoù nhöng phöông phaùp naøy thöôøng môû roäng bao goàm caùc phöông phaùp khoâng coù söï thuûy phaân bôûi enzyme, đo aùp suaát, chæ soá khuùc xaï, đo hoàng ngoaïi hay haáp thu UV…  Phöông phaùp DMAB (Tieâu chuaån ngaønh 28 TCN 184: 2003, AOAC-967, 1997: [51] Phạm vi áp dụng: Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định tính urea trong sản phẩm thủy sản. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,5 %. Nguyên tắc: Mẫu sản phẩm được chiết với dung dịch nước. Urea có trong dịch chiết phản ứng với thuốc thử p - dimethylaminobenzaldehyde (DMAB) tạo phức màu vàng chanh đặc trưng. Thiết bị, dụng cụ: CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 40 - Cân phân tích, độ chính xác 0,1 mg. - Giấy lọc Whatman số 40. - Bếp điện. - Máy nghiền đồng thể. - Bình tam giác dung tích 50 ml. - Đũa thủy tinh. - Mặt kính đồng hồ. Hóa chất: phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích, gồm: - P-dimethylaminobenzaldehyde. - Ethanol, 95%. - Acid chlohydride đậm đặc, 12M. Pha chế thuốc thử - dung dịch p-dimethylaminobenzaldehyde (DMAB): hòa tan 8.00 g DMAB trong 500ml ethanol rồi thêm 50ml acid chlohydric. Bảo quản dung dịch nơi tránh ánh sáng. Dung dịch sử dụng được trong vòng 1 tháng. Pha loãng dung dịch 10 lần trước khi sử dụng và chỉ sử dụng trong ngày. Cách tiến hành: - Chuẩn bị mẫu: + Đồng nhất khoảng 200 g mẫu thủy sản bằng máy nghiền đồng thể. + Cân 25 g mẫu đã xay nghiền đưa vào bình tam giác dung tích 50 ml. Thêm 25 ml nước cất rồi khuấy trộn đều bằng đũa thủy tinh. Sau đó, đậy miệng bình bằng mặt kính đồng hồ. + Đun từ từ bình tam giác trên bếp điện cho đến sôi. Chú ý, khi đun phải lắc đều. Làm nguội mẫu rồi dùng giấy lọc Whatman để lọc lấy dịch trong. Tiến hành: + Nhỏ 5 - 6 giọt dịch mẫu vào trong ống nghiệm chứa 5 ml dung dịch thuốc thử urea. Dun nóng dung dịch trong 1 phút. + Quan sát màu dung dịch. Kết luận mẫu có urea nếu mầu dung dịch trong ống nghiệm chuyển sang màu vàng chanh đậm. Nồng độ của Urea trong mẫu càng cao thì màu vàng của dung dịch càng đậm.  Phöông phaùp xaùc đònh noàng đoä urea baèng vi khuaån Helibacter pylori vaø chaát chæ thò pH laø BromoCresol purple: [45] Nguyeân taéc: CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 41 Söû duïng huyeàn phuø teá baøo vi khuaån Helibacter pylori nhö nguoàn enzyme urease thoâ đeå thuûy phaân urea taïo ammonia laøm thay đoåi pH đoåi maøu chaát chæ thò. Hoùa chaát: - BromoCresol purple: 8mg BCP hoøa tan trong 1.48 ml NaOH 10mM, đònh möùc tôùi 100ml baèng nöôùc caát. Theâm EDTA vaøo đeå noàng đoä EDTA laø 0.2mM. Đieàu chænh pH hoãn hôïp tôùi 5.1 baèng NaOH 0.1M. Baûo quaûn ôû 4oC cho tôùi khi söû duïng. - Huyeàn phuø teá baøo vi khuaån Helibacter pylori: Nuoâi vi khuaån H.pylori treân thaïch chocolate ôû 37oC, tyû leä CO2/khoâng khí laø 1/9 (v/v), đoä aåm 98% (v/v) trong 3 ngaøy. Röûa teá baøo khoûi đóa thaïch baèng đeäm phosphate (phosphate buffer saline PBS, 0.05M, pH 7.2). Sau đoù röûa 3 laàn baèng PBS. Tieán haønh ly taâm toác đoä 12000 v/p trong 10 phuùt vaø baûo quaûn ôû -70oC cho tôùi khi söû duïng. Caùch tieán haønh: - Cho 10µl dung dòch maãu troän vôùi 990µl dung dòch BCP, chænh pH tôùi 5.1 baèng HCl 0.1M. - Cho 2µl huyeàn phuø H.pylori töông öùng vôùi hoaït tính laø 1U. - UÛ hoãn hôïp trong 20 phuùt nhöng khoâng quaù 3 giôø ôû nhieät đoä phoøng, đo quang phoå maøu dung dòch taïo thaønh ôû böôùc soùng 588nm. Đeå xaây döïng đöôøng chuaån, söû duïng caùc dung dòch chuaån urea coù noàng đoä töø 0 tôùi 50µM. Vôùi phöông phaùp naøy, đöôøng chuaån urea coù theå tuyeán tính tôùi 8.3mM. Beân caïnh đoù, do khoâng caàn ly taâm vaø keát tuûa neân pheùp phaân tích naøy coù theå đöôïc phaùt trieån đeå söû duïng vôùi 96- well microplates.  Phöông phaùp DAM (DIACETYLMONOXIME) Nguyeân taéc: Phöông phaùp naøy döïa treân tính oxy hoùa khöû cuûa diacetyl momoxime (coøn goïi laø 2,3 butadion-monoxime) đoái vôùi urea taïo daãn xuaát diazine. Trong moâi tröôøng acid vaø đun noùng, vôùi söï hieän dieän cuûa ion Fe3+, urea phaûn öùng vôùi DAM taïo ra phöùc chaát maøu hoàng. Maøu cuûa phöùc caøng đaäm (đoû tím) khi noàng đoä urea caøng cao. Thiosemicarbazide coù taùc duïng đeäm vaø giöõ cho beàn maøu nhôø >C=S. Noù cho pheùp khoâng caàn khöû taïp chaát protein vaø giuùp cho phaûn öùng đöôïc nhaïy hôn neân giuùp cho noàng đoä urea xeùt nghieäm seõ tuyeán tính theo maät đoä quang OD. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 42 Hoùa chaát: - Dung dòch urea chuaån 15 mg/dl - Maãu thöû (serum hay plasma) - Nöôùc caát - Thuoác thöû DAM, thuoác thöû hieän maøu Ferrithiocyanate - Thiosemicarbazide Duïng cuï: - OÁng nghieäm, pipette, cuvet - Maùy ño quang phoå, beå ñun nöôùc, beå nöôùc ñaù laïnh Tieán haønh: - Chuaån bò 3 oáng nghieäm laàn löôït chöùa 0.05ml nöôùc caát, 0.05ml dung dòch chuaån, 0.05ml maãu thöû. - Cho vaøo moãi oáng 3ml thuoác thöû DAM vaø laéc ñeàu. - Cho thuoác thöû hieän maøu vaø laéc ñeàu laàn nöõa. - Ñaët caùc oáng nghieäm vaøo beå nöôùc ñaõ ñun soâi, chôø trong 15 phuùt. - Laøm nguoäi caùc oáng nghieäm trong beå nöôùc ñaù laïnh khoaûng 2 phuùt. - Ñeå chôø ôû nhieät ñoä phoøng trong 1 phuùt. - Ño quang phoå ôû böôùc soùng 520nm. Tính keát quaû: Haøm löôïng N_urea (BUN) trong maãu thöû ñöôïc tính theo coâng thöùc: 357.0BUN OD ODBUN std std t  (mmol/l) Trong ñoù: ODt: maät ñoä quang hoïc maãu thöû ODstd: maät ñoä quang hoïc maãu chuaån BUNstd: haøm löôïng N_urea trong maãu chuaån (15mg/dl) 0.357: heä soá chuyeån ñoåi ñôn vò töø mg/dl sang mmol/l Giaù trò BUN bình thöôøng: 2.86 – 7.14 mmol/l (hay 8 – 20mg/dl) CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN GVHD: TS. Traàn Bích Lam Trang 43  Phöông phaùp Rappoport Nguyeân taéc: töông töï nhö phöông phaùp Nessler. Hoùa chaát: - Dung dòch urease trong đeäm phosphate pH 7 - Dung dòch urea chuaån 100mg/100ml - Dung dòch acid tungstic: A – dung dòch tungstate 2.2%: 2.2g Na2WO4.2H2O + 1000ml nöôùc caát B – dung dòch acid H2SO4 0.15N: 4.17ml H2SO4 đaäm đaëc đònh möùc thaønh 1l. Trong ngaøy duøng, troän A vaø B vôùi theå tích baèng nhau. - Thuoác thöû Nessler Tieán haønh: Baûng 1.9: Xaùc ñònh haøm löôïng urea theo phöông phaùp Rappoport Hoùa chaát Maãu traéng (ml) Maãu chuaån urea (ml) Maãu thí nghieäm (ml) Dd urease 0.5 0.5 0.5 Dd urea chuaån 0.1 Dd serum 0.1 Dd nöôùc caát 0.6 0.5 0.5 Laéc oáng nghieäm thaät kyõ, đeå ôû 40– 45oC trong 15 phuùt. Acid tungstic 1 1 1 Ly taâm laáy dòch phaûn öùng sau 3 – 5 phuùt. Thuoác thöû Nessler 0.5 0.5 0.5 Nöôùc caát 4.5 4.5 4.5 Đeå 15 phuùt taïo maøu roài đo ôû böôùc soùng 490nm. Töø caùc giaù tròOD cuûa maãu thí nghieäm vaø maãu chuaån so v