Luận văn Nghiên cứu chế biến và bảo quản chế phẩm koji nếp than

văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 1 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHẠM THẾ DƯƠNG THANH THẢO NGHIÊN CỨU CHẾ BIẾN VÀ BẢO QUẢN CHẾ PHẨM KOJI NẾP THAN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 08 Người hướng dẫn NGUYỄN CÔNG HÀ LÂM THỊ VIỆT HÀ văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 2 LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn thầy cô trường đại học Cần Thơ, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng và bộ môn Công nghệ thực phẩm đã trang bị cho tôi những kiến thức chuyên môn cần thiết để tôi hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Công Hà và cô Lâm Thị Việt Hà đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp. Chân thành cảm ơn quí thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm và bộ môn Chăn nuôi - thú y đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất các thí nghiệm. Và sau cùng tôi gởi lời cảm ơn đến các bạn lớp Công nghệ thực phẩm khóa 28 về tất cả những gì các bạn đã dành cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn! Cần thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN PHẠM THẾ DƯƠNG THANH THẢO văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 3 TÓM TẮT Với mục tiêu tìm ra qui trình chế biến chế phẩm enzyme thô trên môi trường nếp than từ nấm mốc Aspergillus oryzae, hướng tới sản xuất rượu nếp than. Đề tài được thực hiện gồm 2 thí nghiệm: - Khảo sát độ ẩm nguyên liệu, nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy tối thích Aspergillus oryzae sinh sản và phát triển, có khả năng tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất. - Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than không làm chết nấm mốc và giảm hoạt tính của enzyme amylase. Qua quá trình thí nghiệm đã cho các kết quả như sau: - Độ ẩm nếp than nuôi cấy: 60%. - Nhiệt độ môi trường nuôi cấy tối ưu: 300C. - Thời gian thu nhận chế phẩm koji thích hợp: 2 ngày. - Nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than sau nuôi cấy: 500C,16 - 18h Trong quá trình chế biến chế phẩm koji nếp than cần quan tâm đến những nhân tố trên. Giữa chúng có sự tương tác qua lại và mỗi nhân tố có ảnh hưởng nhất định đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae cũng như khả năng tổng hợp enzyme amylase. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 4 MỤC LỤC Lời cảm ơn....................................................................................................i Tóm tắt .........................................................................................................ii Mục lục.........................................................................................................iii Danh sách bảng.............................................................................................v Danh sách hình .............................................................................................vi Chương1. GIỚI THIỆU ................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................1 Chương 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................2 2.1 Giới thiệu sơ lược về chế phẩm koji................................................2 2.2 Nguyên liệu làm chế phẩm koji nếp than .......................................2 2.3 Nấm mốc Aspergillus oryzae ..........................................................4 2.4 Hệ enzyme......................................................................................5 2.4.1 Enzyme amylase ....................................................................5 2.4.2 Enzyme protease....................................................................6 2.5 Phương pháp nuôi cấy ....................................................................7 2.5.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt ................................................7 2.5.2 Phương pháp nuôi cấy chìm...................................................8 2.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme amylase ....9 2.7 Sấy .................................................................................................10 2.7.1 Đặc điểm của quá trình sấy ....................................................11 2.7.2 Độ ẩm cân bằng .....................................................................12 2.8 Các công trình nghiên cứu ..............................................................13 2.8.1 Các công trình nghiên cứu trong nước....................................13 2.8.2 Các công trình nghiên cứu nước ngoài ...................................13 2.9 Các vấn đề cần nghiên cứu và giải quyết trong đề tài ......................14 2.9.1 Qui trình ................................................................................15 văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 5 2.9.2 Giải thích qui trình.................................................................15 Chương 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ...............16 3.1 Phương tiện thí nghiệm...................................................................16 3.1.1 Địa điểm, thời gian ................................................................16 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu ............................................................16 3.1.3 Thiết bị, hoá chất ...................................................................16 3.1.4 Môi trường nuôi cấy ..............................................................16 3.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................17 3.2.1 Phương pháp phân tích...........................................................17 3.2.2 Phương pháp thí nghiệm ........................................................17 3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm .........................................................17 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát độ ẩm môi trường, nhiệt độ môi .. trường và thời gian nuôi cấy Aspergillus oryzae....................17 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than .19 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................22 4.1 Hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ môi trường, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy khác nhau......22 4.2 Hoạt tính enzyme amylase trong quá trình sấy chân không ở những nhiệt độ khác nhau ............................................................27 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................32 5.1 Kết luận ..........................................................................................32 5.2 Đề nghị ...........................................................................................32 Tài liệu tham khảo ........................................................................................34 Phụ lục..........................................................................................................vii văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 6 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc ..........................................4 Bảng 2: Thành phần hóa học của nếp than ....................................................9 Bảng 3: Hoạt tính của enzyme amylase.........................................................22 Bảng 4: Biến đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ môi trường, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy ...........................................25 Bảng 5:Thay đổi trạng thái ẩm của sản phẩm koji trong quá trình sấy ...........27 Bảng 6: Hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình sấy ở những nhiệt độ sấy khác nhau .....................................................................30 văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 7 DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Nếp than...........................................................................................3 Hình 2: Aspergillus oryzae............................................................................4 Hình 3: Chế phẩm koji gạo ...........................................................................13 Hình 4: Quá trình chế biến koji .....................................................................15 Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ..................................................................19 Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ..................................................................21 Hình 7: Hoạt tính enzyme amylase................................................................22 Hình 8: Chế phẩm koji nếp than sau 2 ngày nuôi cấy ....................................26 Hình 9: Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase ( chế phẩm được nuôi ở 300C, 60% ẩm, 2ngày) ..............................26 Hình 10: Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase ( chế phẩm được nuôi ở 270C, 70% ẩm, 3 ngày) .............................26 Hình 11:Thay đổi độ ẩm của chế phẩm theo thời gian sấy.............................27 Hình 12: Chế phẩm koji nếp than trước khi sấy.............................................29 Hình 13: Chế phẩm koji nếp than sau khi sấy................................................29 Hình 14: Chế phẩm koji nếp than sau khi nghiền ..........................................29 Hình 15: Thay đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ sấy ..............30 Hình 16: Hoạt tính của enzyme amylase theo thời gian sấy ở 400C ...............31 Hình 17: Hoạt tính của enzyme amylase theo thời gian sấy ở 500C ...............31 Hình 18: Quá trình chế biến koji nếp than đề xuất.........................................33 văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 8 Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Các loại sản phẩm lên men truyền thống là một trong các sản phẩm lên men phổ biến của các dân tộc trên thế giới. Đó là một loại sản phẩm được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc, được truyền từ đời này sang đời khác. Theo thời gian các sản phẩm lên men truyền thống càng được mở rộng cả về chủng loại lẫn về phương pháp chế biến. Hầu như mỗi dân tộc trên thế giới đều có riêng những sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống của mình. Sản phẩm này có thể là một bộ phận không thể tách rời trong đời sống hàng ngày của dân tộc. Bộ môn Công nghệ thực phẩm trường đại học Cần Thơ nghiên cứu rượu nếp than nhằm phát triển thành sản phẩm truyền thống của đất nước. Bên cạnh qui trình công nghệ sản xuất rượu thì vấn đề được quan tâm nhiều nhất là nguồn vi sinh vật hay những chế phẩm enzyme dùng trong lên men nếp than. Do đó enzyme được lấy từ nhiều nguồn: enzyme thương mại, enzyme được trích ly từ hạt ngũ cốc nảy mầm hay enzyme của vi sinh vật, chúng được so sánh và chọn ra nguồn thích hợp cho rượu nếp than có chất lượng tốt nhất. Chỉ tiêu để đánh giá chất lượng của enzyme, cụ hể là hệ enzyme amylase dùng trong sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa nhiều tinh bột như nếp than là khả năng thủy phân tinh bột thành đường đơn, cung cấp chất dinh dưỡng cho quá trình lên men tiếp theo. Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme amylase chủ đạo. Tùy theo mục đích sử dụng người ta thường sản xuất các loại chế phẩm: chế phẩm enzyme thô, chế phẩm enzyme bán tinh khiết, chế phẩm enzyme tinh khiết, chế phẩm vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme mạnh. Ba dạng chế phẩm đầu, người ta quan tâm đến hoạt tính xúc tác và độ tinh sạch của enzyme. Dạng sau cùng, được quan tâm cả đến hoạt tính sinh học và khả năng sinh sản, phát triển của vi sinh vật tạo ra enzyme đó. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Chế phẩm koji nếp than thuộc dạng chế phẩm enzyme thô với nấm mốc Aspergillus oryzae trong môi trường nuôi cấy là nếp than. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường nếp than, khảo sát độ ẩm nguyên liệu, nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy Aspergillus oryzae sinh sản và phát triển, có khả năng tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất. Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than không làm giảm hoạt tính của enzyme amylase. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 9 Chương 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu sơ lược về chế phẩm koji Thuật ngữ “Koji” có nghĩa là hạt ngũ cốc lên mốc, nó còn có tên khác như: “shui” ở Trung Quốc, “ku” ở Hàn Quốc và “koji” ở Nhật. Chế phẩm koji được xem như là một bước tiến quan trọng trong quá trình lên men từ các nguồn thực phẩm đa dạng ở Đông Á. Cơ bản đó là quá trình nuôi cấy mốc trên môi trường dinh dưỡng rắn để tạo ra những enzyme thủy phân từ hạt đậu nành hay những hạt ngũ cốc khác. Vì vậy koji được xem là một nguồn đa dạng các enzyme xúc tác sự thủy phân nguyên liệu thô rắn để hoà tan các chất có trong nguyên liệu cung cấp chất dinh dưỡng cho nấm men và vi khuẩn phát triển ở giai đoạn lên men tiếp theo. Ngoài những enzyme chính có trong nguyên liệu thì còn nhiều chất quan trọng khác, cần thiết cho giai đoạn lên men thứ hai hoặc tạo mùi thơm cho sản phẩm. Phương pháp làm koji được truyền đến Nhật vào thế kỷ XIV bởi những tăng ni đạo Phật. Mặc dù nó bắt nguồn từ Trung Quốc nhưng việc nghiên cứu và phát triển hướng tới cải tiến phương pháp này lại được thực hiện ở Nhật. Kết quả là hiện nay việc làm koji ở Nhật có sự khác biệt so với cách trước đây và dây chuyền này trở nên nổi tiếng khắp thế giới bởi người Nhật với thuật ngữ “koji”. Khi việc nuôi cấy mốc trên hạt ngũ cốc được quan tâm thì hàng loạt các sản phẩm lên men được sản xuất ở các nước trong đó có sản phẩm rượu gạo. Trung Quốc được coi là cái nôi của chế phẩm này nhưng ở các nước khác lại cho đó là phương pháp cổ truyền của cha ông họ, được truyền qua nhiều thế hệ. Trong các sản phẩm lên men thì rượu Saké (rượu gạo) của Nhật là bằng chứng tốt ở cả hai khía cạnh lịch sử và kỹ thuật. Do đặc tính có ích, dễ làm của koji đồng thời dây chuyền sản xuất koji ngày càng hiện đại đã thúc đẩy quá trình sản xuất tạo nhiều loại sản phẩm phi thực phẩm (enzyme công nghiệp, chất độc, thuốc chống vi sinh vật). Tóm lại koji là loại bán thành phẩm, được sử dụng như một nguồn cung cấp enzyme và những chất hóa học cần thiết cho quá trình lên men tiếp theo. 2.2 Nguyên liệu làm chế phẩm koji nếp than Nếp than là một đặc sản của Việt Nam và được trồng nhiều ở các tỉnh Hòa Bình, Bắc Giang, Lạng Sơn, Cao Bằng, Yên Bái và ở vùng Nam Bộ... Việc mở rộng hơn nữa diện tích trồng lúa nếp than ở các tỉnh trên và một số tỉnh khác là hoàn toàn có thể được khi nhu cầu chế biến nếp than tăng cao. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 10 Ở Nam Bộ, nếp than được chia ra thành bốn loại: Nếp cẩm Đức Hoà. Nếp đen Khánh Vinh. Nếp than Long Đất. Lúa lứa nếp cẩm. Các loại này có năng suất không cao, thường chỉ đạt 2,8 – 3,3 tấn/ha. Hiện nay dân vùng đồng bằng Nam Bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo. Theo cách này nếp than được chia thành hai loại: Nếp than đen tuyền. Nếp than hồng đỏ. Các sắc tố của nếp than dễ tan trong nước, vì thế sản phẩm rượu mang màu sắc đặc trưng của loại gạo nguyên liệu.Tuy khác nhau về hình thức bên ngoài nhưng các loại nếp than có thành phần hoá học không khác nhau nhiều. Trong những năm gần đây, khi mức thu nhập của người dân tăng nhanh thì nhu cầu sử dụng rượu nếp than cũng tăng nhanh, yêu cầu về chất lượng của sản phẩm cũng đòi hỏi ngày càng phải được nâng cao. Điều đó chứng tỏ sản xuất rượu nếp than của Việt Nam là hướng đi phù hợp và cần thiết. Tuy nhiên để nếp than trở thành rượu đặc sản thực sự thì cần phải có sự đầu tư thỏa đáng không chỉ khoa học, kỹ thuật, kinh nghiệm cổ truyền mà còn phải có kinh phí dành cho các cơ sở nghiên cứu và sản xuất chuyên ngành, tạo ra một bước “đột phá” về công nghệ, để tạo được một sản phẩm có chất lượng cao. Hình 1: Nếp than ( văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 11 2.3 Nấm mốc Aspergillus oryzae Aspergillus spp. hiện diện rất nhiều trong thiên nhiên, không phải loài nào cũng được sử dụng trong thực phẩm. Chẳng hạn trong số 278 loài Aspergillus spp. được tiến hành thử nghiệm thì chỉ có 34 loài tạo α - amylase và maltase với lượng đáng kể (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Một số loài có khả năng sinh độc tố gây ung thư. Loài vi sinh vật được dùng trong thí nghiệm là Aspergillus oryzae. Nấm sợi này có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, protease, pectinase và cả cellulase tùy theo cơ chất cảm ứng mà ta đưa vào. Khi được tổng hợp, enzyme lẫn trong các thành phần môi trường, tan trong nước, có trong sinh khối của nó. Toàn bộ khối vật chất thu nhận được trong quá trình nuôi cấy bao gồm: sinh khối vi sinh vật, nước trong đó, enzyme trong và ngoài tế bào, và cả khối lượng môi trường mà vi sinh vật không sử dụng hết được gọi là chế phẩm enzyme thô. Aspergillus oryzae là loài hiếu khí bắt buộc, mới phát triển có màu trắng, khi già thì khuẩn ty chuyển sang màu vàng nên còn được gọi là nấm sợi màu vàng. Bảng 1: Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004) Hình 2: Aspergillus oryzae (http:// www004.upp.so-net.ne.jp/ichi/r9707066.jpg) Độ ẩm pH môi trường Độ ẩm không khí Nhiệt độ nuôi Thời gian 45 ÷ 55 % 5,5 ÷ 6,5 85 ÷ 95 % 27 ÷ 30 0C 30 ÷ 36 giờ văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 12 2.4 Hệ enzyme Để thu amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus và một số loài của Neurospora, Mucor sinh tổng hợp mạnh mẽ không những chỉ có α -amylase mà cả glucoamylase (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường nếp than nên các enzyme được tổng hợp chủ yếu là: amylase và protease. 2.4.1 Enzyme amylase Enzyme amylase bao gồm nhiều loại: α - amylase, β - amylase, γ - amylase, glucose isomease, pullulanose và isoamylase. Trong đó hoạt lực α -amylase, β - amylase, γ -amylase tiêu biểu cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose. • Enzyme α - amylase (1,4-α -glucan 4-glucanhydrolase) Có khả năng phân cắt các liên kết α -1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội bào (endoenzyme). α -amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn. Sự thủy phân tinh bột của α -amylase trải qua nhiều giai đoạn. Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị phân hủy tiếp tục để tạo ra maltose và glucose. Sau thời gian tác dụng lâu dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylose là 13% glucose và 87% maltose. Còn sản phẩm thủy phân amylopectin là 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% do α - amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin. Khả năng dextrin hóa của α -amylase rất cao do đó người ta còn gọi α -amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột: - Giai đoạn dextrin hoá: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp - Giai đoạn đường hoá: Dextrin tetra và trimaltose di- và monosaccharide Amylose oligosaccharide polyglucose Maltose maltosetriose maltotetrose α -amylase α -amylase α -amylase văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 13 • Enzyme β -amylase (1,4-α -glucan-maltohydrolase): β -amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α -1,4 glucan trong tinh bột, phân cắt từng tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch. Khác với α -amylase, nó hầu như không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β -amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylosepectin thành maltose. Quá trình thủy phân amylosepectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Mỗi nhánh ngoài có từ 10-26 gốc glucose nên tạo thành 10-12 phân tử maltose. Khi gặp liên kết α -1,4 glucoside đứng kế liên kết α -1,6 glucoside thì nó ngừng tác dụng. Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn chứa rất nhiều liên kết α -1,6 glucoside cho màu tím đỏ với iod. Độ nhớt của dung dịch giảm chậm. Tác dụng của β -amylase lên tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau: Tinh bột 54-58% maltose + 42-46% dextrin Nếu cho cả α -amylase và β -amylase cùng tác dụng đồng thời lên tinh bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95%. • Enzyme γ -amylase (glucoamylase, α -1,4-glucan-glucohydrolase) Glucoamylase là enzyme ngoại phân, thủy phân liên kết α -1,4 glucoside trong tinh bột, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase xúc tác thủy phân cả liên kết α -1,6 glucoside thành glucose. Tóm lại nó có thể thủy phân hoàn toàn tinh bột tới glucose. 2.4.2 Enzyme protease Protease là nhóm enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein hoặc các polypeptid. Ngoài ra còn có peptidase. Protease phân hủy phân tử protein thành polyleptid và pepton, chúng có đặc tính đặc hiệu tương đối rộng. Tiếp theo đó la sự phân hủy các peptid phân tử nhỏ này thành các acid amin tự do dưới tác dụng của peptidase. Protease nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật và vi khuẩn. Protease của vi khuẩn hoạt động ở pH = 7 – 8. Còn protease của A. oryzae hoạt động trong khoảng pH = 3.5 – 9, tối thích ở pH = 7 – 8. Dựa vào khoảng pH hoạt động người ta chia protease thành ba loại: loại acid hoạt động ở vùng pH = 2.5 – 3, loại trung tính hoạt động ở pH = 6 – 6.5 và loại kiềm hoạt động trong khoảng pH = 8 – 11. (Lương Đức Phẩm, 1998) β -amylase văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 14 Theo Oresenko (1963) ngoài amylase canh trường bề mặt của Aspergillus- oryzae còn có protease acid và trung tính (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004), phân hủy protein thành các chuỗi peptid và amino acid. 2.5 Phương pháp nuôi cấy 2.5.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Sau đó, phương pháp nuôi cấy chìm được thay thế vào những năm 50 – 60 của thế kỷ trước. Phương pháp nuôi cấy bề mặt là tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, phương pháp này lại được phục hồi rất mạnh vào những năm 1970 đến nay. • Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt Dễ thực hiện. Qui trình công nghệ thường không phức tạp. Thực chất của phương pháp nuôi cấy bề mặt theo qui mô công nghiệp được xuất phát từ các quá trình lên men truyền thống của các nước. Ở đó người dân đã biết sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên. Người ta chỉ cần nấu (hoặc hấp) các nguyên liệu, để nguội và khi đó vi sinh vật trong không khí sẽ rơi xuống khối nguyên liệu, tự chúng phát triển tuân theo qui luật cạnh tranh trong tự nhiên. Những giống vi sinh vật nào đó có khả năng trao đổi chất mạnh, có khả năng phát triển mạnh sẽ lấn át các vi sinh vật khác. Và như vậy người ta đã đặt nền móng cho sự ra đời của công nghệ nuôi cấy bề mặt. Lượng enzyme tạo thành từ môi trường thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm rất ưu việt rất quan trọng giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường, sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. Không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. Trong trường hợp nhiễm vi sinh vật lạ, dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. • Những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt Phải có diện tích lớn khi thực hiện phương pháp này. Trong phương pháp này, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng và môi trường bán rắn) văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 15 nên cần rất nhiều diện tích. Trong những năm gần đây, người ta đã cải tiến các thiết bị để vi sinh vật có thể phát triển ở 4 mặt. Phương pháp nuôi cấy bề mặt khó cơ giới hoá, tự động hóa. 2.5.2 Phương pháp nuôi cấy chìm Phương pháp nuôi cấy chìm là vi sinh vật phát triển hẳn trong lòng môi trường. Chính vì thế người ta thường sử dụng môi trường lỏng. • Phương pháp nuôi cấy chìm có những ưu điểm Phương pháp nuôi cấy chìm thường chiếm diện tích ít. Quá trình nuôi cấy thường được thực hiện trong các thiết bị lên men. Các thiết bị lên men thường rất gọn. Phương pháp nuôi cấy chìm có thể tự động hóa và cơ giới hóa ở mức độ cao. Trong nuôi cấy chìm thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và hệ thống thổi khí bằng hệ thống tự động hoàn toàn có thể thực hiện với bất kỳ dung tích nào của thiết bị lên men. Ngoài ra, ta có thể kiểm soát được nhiệt độ và điều hòa sự thay đổi nhiệt độ bằng hệ thống điều khiển tự động. Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng trong môi trường. Enzyme thu được ít lẫn tạp chất. • Những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy chìm Trong nuôi cấy chìm, sự nhiễm các vi sinh vật lạ nếu xảy ra sẽ gây ra sự nhiễm toàn bộ hệ thống trong một thời gian rất ngắn. Dung dịch lên men trong thiết bị lên men luôn luôn trong trạng thái nhờ hoạt động của cánh khuấy và hệ thống thổi khí. Do đó, chỉ cần một điểm nào trong môi trường bị nhiễm ngay lập tức toàn bộ hệ thống bị nhiễm, khi đó ta rất khó kiểm soát và giải quyết hậu quả do sự nhiễm vi sinh vật lạ gây nên. Phương pháp nuôi cấy chìm thường đòi hỏi chi phí rất lớn. Những chi phí này bao gồm chi phí cho hệ thống lên men, năng lượng cho cánh khuấy, cho quá trình hoạt động của hệ thống cung cấp khí trong suốt quá trình lên men Nồng độ enzyme trong canh trường thấp nên phải cô đặc, giá thành cao.( Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002) Với những ưu nhược điểm của hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật được trình bày ở trên. Trong thí nghiệm này, nấm mốc Aspergillus oryzae sẽ được nuôi cấy theo phương pháp bề mặt. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 16 2.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp hoạt tính amylase • Thành phần môi trường dinh dưỡng Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh tạo các enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết vi sinh vật đều hấp thụ cacbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin,…) và oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo amylase bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt là nếp than. Bảng 2: Thành phần hoá học của nếp than ( Nguyễn Thị Hiền, Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền) • Độ ẩm của nguyên Độ ẩm môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh tổng hợp enzyme. Nếu độ ẩm môi trường tăng cao quá sẽ làm giảm độ thoáng khí, thấp quá sẽ kiềm hãm sự sinh trưởng và phát triển cũng như tạo enzyme. • Nhiệt độ nuôi Nhiệt độ luôn thay đổi trong quá trình nuôi do mốc thủy phân tinh bột sinh ra nhiệt, cần phải đảo trộn đuổi bớt nhiệt nhằm duy trì nhiệt độ cần thiết cho mốc phát triển. Nếu nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt tính amylase. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) • Thời gian nuôi Thời gian nuôi để có lượng enzyme cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus oryzae, sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Thành phần Hàm lượng (%) Nước 14 Protein 8,2 Lipid 1,5 Gluxit 74,9 Axit hữu cơ 0,6 Tro 0,8 văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 17 • pH Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm sợi và sự tạo enzyme. Đa số nấm mốc phát triển tốt và tạo enzyme trong môi trường acid yếu, nên có thể dùng HCl, H2SO4 và acid lactic làm ẩm môi trường. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) 2.7 Sấy Khi Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất, tiến hành sấy đến độ ẩm khoảng 12% sẽ thu được chế phẩm thô dạng khô (PGS – TS Đặng Thị Thu và ctv, 2004). Đối tượng của quá trình sấy là vật liệu ẩm. Vật liệu ẩm được chia làm 3 nhóm chính: - Nhóm 1: Vật keo đặc trưng - vật liệu của nhóm này khí tách ẩm vẫn giữ nguyên kích thước và tính đàn hồi dẻo. - Nhóm 2: Vật mao dẫn xốp - vật liệu của nhóm này khi tách ẩm trở nên dòn (ví dụ: thạch cao, gốm, sứ,…). - Nhóm 3: Vật keo mao dẫn xốp - vật liệu của nhóm này có thành mao dẫn dẻo và đàn hồi, khi thấm nước thì trương nở (ví dụ: gỗ và các loại ngũ cốc,…). Vật keo mao dẫn xốp có tính chất tổng hợp của 2 nhóm kia. Trong thực tế, hầu hết các vật liệu ẩm đều thuộc nhóm này. Quá trình sấy là quá trình làm khô các vật thể, các vật liệu, các sản phẩm,… bằng phương pháp bay hơi. Như vậy muốn sấy khô một vật ta phải tiến hành các biện pháp kỹ thuật sau: - Gia nhiệt cho vật để đưa nó đến nhiệt độ bão hoà ứng với áp suất trên bề mặt vật. - Cấp nhiệt để làm bay hơi ẩm trong vật thể. - Vận chuyển hơi ẩm đã thoát ra khỏi bề mặt vật thể vào môi trường. Có nhiều cách gia nhiệt vật thể và cũng có nhiều cách vận chuyển hơi ẩm từ bề mặt vật thể vào môi trường. Tương ứng với chúng có nhiều phương pháp sấy khác nhau. Từ những điểm đã nêu ở trên ta thấy trong quá trình sấy xảy ra các quá trình trao đổi nhiệt và trao đổi chất cụ thể là: quá trình truyền nhiệt từ chất tải nhiệt cho vật liệu sấy, quá trình truyền nhiệt từ vật liệu ẩm ra ngoài bề mặt vật liệu sấy, quá trình văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 18 truyền ẩm từ bề mặt vật sấy vào môi trường. Các quá trình truyền nhiệt, truyền chất trên xảy ra đồng thời trên vật liệu sấy, chúng có ảnh hưởng quá lại với nhau. 2.7.1 Đặc điểm của quá trình sấy Nếu chế độ sấy tương đối dịu, tức là nhiệt độ và tốc độ chuyển động của không khí không lớn, đồng thời vật có độ ẩm tương đối cao, thì quá trình sấy sẽ xảy ra 3 giai đoạn: giai đoạn làm nóng vật, giai đoạn sấy tốc độ không đổi và giai đoạn sấy tốc độ giảm dần. • Giai đoạn làm nóng vật Giai đoạn này bắt đầu từ khi đưa vật vào buồng sấy tiếp xúc với không khí nóng cho đến khi nhiệt độ vật đạt đến bằng nhiệt độ nhiệt kế ướt. Trong quá trình này toàn bộ vật liệu vật liệu sấy được gia nhiệt. Ẩm lỏng trong vật cũng được gia nhiệt cho đến khi đạt được nhiệt độ sôi ứng với áp suất hơi nước trong môi trường không khí trong buồng sấy. Do được làm nóng nên độ ẩm của vật liệu có giảm chút ít do bay hơi ẩm còn nhiệt độ của vật thì tăng dần từ nhiệt độ ban đầu cho đến khi bằng nhiệt độ nhiệt kế ướt. Tuy vậy sự tăng nhiệt độ xảy ra không đồng đều ở phần ngoài và phần bên trong vật. Vùng trong vật đạt tới nhiệt độ bầu ướt chậm hơn. Đối với những vật dễ sấy thì giai đoạn làm nóng vật xảy ra rất nhanh. • Giai đoạn tốc độ sấy không đổi Kết thúc giai đoạn gia nhiệt, nhiệt độ vật bằng nhiệt độ nhiệt kế ướt. Tiếp tục cung cấp nhiệt, ẩm trong vật sẽ hoá hơi còn nhiệt độ của vật giữ không đổi nên nhiệt lượng cung cấp chỉ làm hoá hơi nước. Ẩm sẽ hoá hơi ở lớp vật liệu sát bề mặt vật, ẩm lỏng ở bên trong vật sẽ truyền ra ngoài bề mặt vật để hóa hơi. Do nhiệt độ không khí nóng không đổi, nhiệt độ vật cũng không đổi nên chênh lệch nhiệt độ giữa vật và môi trường không đổi. Do vậy tốc độ bay hơi ẩm của vật cũng không đổi. Do vậy tốc độ bay hơi ẩm của vật cũng không đổi. Trong giai đoạn sấy tốc độ không đổi biến thiên của độ chứa ẩm theo thời gian là tuyến tính. Ẩm được thoát ra trong giai đoạn này là ẩm tự do. Chấm dứt giai đoạn thoát ẩm tự do chuyển sang giai đoạn sấy tốc độ giảm. • Giai đoạn sấy tốc độ giảm dần Kết thúc giai đoạn sấy tốc độ không đổi ẩm tự do đã bay hơi hết, còn lại trong vật là ẩm liên kết lớn hơn so với ẩm tự do. Do đó tốc độ bay hơi ẩm trong giai đoạn này nhỏ hơn giai đoạn sấy tốc độ không đổi nghĩa là tốc độ sấy trong giai đoạn này nhỏ hơn và càng giảm đi theo thời gian sấy. Quá trình sấy càng tiếp diễn, độ ẩm của vật càng giảm, tốc độ sấy cũng giảm cho đến khi độ ẩm của vật giảm đến bằng độ ẩm cân bằng ứng với điều kiện môi trường không khí ẩm trong buồng sấy thì quá trình thoát ẩm của vật ngừng lại có nghĩa là tốc độ sấy bằng không. Trong giai văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 19 đoạn sấy tốc độ giảm nhiệt độ ở các lớp bên ngoài bề mặt tăng nhanh hơn, còn càng sâu vào bên trong vật liệu nhiệt độ tăng chậm do đó hình thành gradient nhiệt độ trong vật sấy. Khi độ ẩm của vật đã đến độ ẩm cân bằng thì lúc này giữa vật sấy và môi trường có sự cân bằng nhiệt và ẩm. Có nghĩa không có sự trao đổi nhiệt và chất giữa vật và môi trường (nhiệt độ của vật bằng nhiệt độ môi trường, còn độ ẩm của vật là độ ẩm cân bằng). Ở cuối quá trình sấy do tốc độ sấy nhỏ nên thời gian sấy kéo dài. Về lý thuyết để cho độ ẩm giảm đến độ ẩm cân bằng thì thời gian sấy ∞→τ tức là đường cong u = f(τ ) tiệm cận với đường thẳng ucb = const. Tuy vậy trong thực tế người ta sấy đến độ ẩm cuối lớn hơn độ ẩm cân bằng. Trong ba giai đoạn sấy trên, giai đoạn thứ nhất thường xảy ra rất nhanh so với hai giai đoạn tiếp theo. Vì vậy trong nhiều trường hợp người ta chia quá trình sấy thành hai giai đoạn: giai đoạn sấy tốc độ không đổi (bao gồm cả giai đoạn gia nhiệt) hay giai đoạn đẳng nhiệt và giai đoạn sấy tốc độ giảm hay giai đoạn nhiệt độ tăng (Hoàng Văn Chước, 2004) 2.7.2 Độ ẩm cân bằng Độ ẩm cân bằng là độ ẩm của vật khi ở trạng thái cân bằng với môi trường xung quanh vật đó. Ở trạng thái này độ chứa ẩm trong vật là đồng đều và áp suất hơi nước trên bề mặt vật ẩm bằng áp suất hơi nước trong không khí ẩm. Lúc này không tồn tại sự trao đổi chất ẩm giữa vật và môi trường. Như vậy độ ẩm cân bằng phụ thuộc vào trạng thái môi trường bao quanh vật. Trong kỹ thuật sấy độ ẩm cân bằng có ý nghĩa rất lớn, nó xác định giới hạn quá trình sấy. Một vật có độ ẩm 1ϖ đặt trong môi trường không khí ẩm có trạng thái nhất định t1, 1cbϖ . Nếu độ ẩm của vật lớn hơn độ ẩm cân bằng tương ứng với trạng thái không khí thì vật ẩm sẽ thoát ẩm cho tới khi đạt đến trị số độ ẩm cân bằng 1cbϖ .Ngược lại nếu 11 cbϖϖ < thì vật sẽ hấp thu ẩm để cho độ ẩm của nó tăng lên cho tới khi đạt trị số cân bằng. Vì vậy khi cần bảo quản một sản phẩm có độ ẩm nhỏ hơn độ ẩm cân bằng ứng với không khí trong phòng ta không thể để sản phẩm trong điều kiện không khí trong phòng vì như vậy sản phẩm sẽ hấp thu ẩm làm cho độ ẩm của nó tăng lên dẫn đến giảm đáng kể thời gian bảo quản an toàn, sản phẩm mau hỏng. Ta thường dùng bao gói hoặc nhà kho mà độ ẩm tương đối của không khí nhỏ hơn so với môi trường bên ngoài. Tức là làm sao cho độ ẩm cân bằng của sản phẩm tương ứng với điều kiện môi trường trong kho bảo quản phải nhỏ hơn hay bằng độ ẩm của vật cần bảo quản. Có như vậy khi sản phẩm đạt đến trạng thái cân bằng với môi trường trong kho thì độ ẩm của nó không vượt quá trị số độ ẩm cho phép (Hoàng Văn Chước., 2004). văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 20 2.8 Các công trình nghiên cứu Koji được biết đến hầu hết ở các quốc gia trên thế giới dưới những tên gọi địa phương khác nhau. Chúng được làm từ đậu nành, đậu phộng, gạo lức, gạo đỏ, chúng được xem là chế phẩm trung gian làm nước tương, rượu gạo, tạo màu cho sản phẩm và còn được dùng trong y học. 2.8.1 Các công trình nghiên cứu trong nước Các công trình nghiên cứu trong nước chủ yếu trên môi trường cám nhằm thu nguồn enzyme phục vụ cho các quá trình chế biến thực phẩm và rượu các loại. Đặc biệt chế phẩm nuôi cấy trên đậu nành dùng trong sản xuất nước tương được sử dụng rộng rãi trong nước. 2.8.2 Các công trình nghiên cứu ngoài nước Koji là loại bán thành phẩm, được sử dụng như một nguồn cung cấp enzyme và những chất hóa học cho quá trình lên men tiếp theo. Chúng đựơc dùng sản xuất các sản phẩm truyền thống của các quốc gia Châu Á như: rượu sake và nước tương. Hình 3: Chế phẩm koji gạo ( http:// www.membranetransport.0rg/media/organism/aory1.jpg) Phương pháp làm koji cổ truyền vẫn còn được sử dụng trong qui mô công nghiệp nhỏ, trong khi đó những công ty lớn đã đưa dây chuyền sản xuất tự động. Dây chuyền hiện đại bao gồm nồi nấu làm việc liên tục, máy cấy truyền tự động, máy trộn tự động, thiết bị buồng kín có hệ thống thông gió. Có những báo cáo về những lợi ích vượt trội trong việc dùng thiết bị tự đông làm koji so với phương pháp thủ công, dùng trong chế biến nước tương giúp tăng năng suất từ 65% lên đến 95%. Và cũng có báo cáo cho rằng nước tương được sản xuất từ dây chuyền tự động cho hương vị ưu việt, ngăn ngừa sự lây nhiễm của các vi sinh vật không mong muốn vào koji. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 21 2.9 Các vấn đề cần nghiên cứu và giải quyết trong đề tài Nhìn chung các nghiên cứu về koji trên thế giới khá nhiều, mốc Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên nhiều môi trường khác nhau tương ứng với những sản phẩm nhất định. Ở đây, nhằm phát triển rượu nếp than thành sản phẩm truyền thống của Việt Nam với chất lượng cao thì việc nuôi mốc Aspergillus oryzae là một trong hàng loạt những nghiên cứu liên quan đến rượu nếp than. Thông qua đề tài, cần xác định một qui trình chế biến koji với các thông số về nhiệt độ nuôi cấy, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy thích hợp. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 22 2.9.1 Qui trình sản xuất koji nếp than Hình 4: Quy trình chế biến koji 2.9.2 Giải thích qui trình Nếp than được rửa và ngâm trong nước khoảng một giờ, giúp giai đoạn nấu được nhanh hơn và hạt nở to hơn. Nếp sau khi chín được đem đi xác định độ ẩm nhằm chỉnh ẩm theo yêu cầu, rồi đem thanh trùng để tiêu diệt những vi sinh vật từ không khí hay dụng cụ nhiễm vào, đồng thời tạo điều kiện cho nếp hút phần nước bổ sung vào khi chỉnh ẩm hay là khi nếp có độ ẩm sau khi nấu vượt quá mức yêu cầu thì thanh trùng sẽ làm giảm đi một phần ẩm nào đó. Sau thanh trùng để nguội và cấy mốc giống vào với tỷ lệ 0.2% và đem đi ủ. Khi đã xác định được các thông số tốt nhất để mốc có hoạt tính cao nhất thì tiến hành sấy để bảo quản. Giống Làm nguội Nguyên liệu Ngâm Nấu Phối trộn Tủ nuôi cấy Sấy Thành phẩm Thanh trùng Điều chỉnh ẩm văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 23 Chương 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1 Phương tiện thí nghiệm 3.1.1 Địa điểm, thời gian Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng, trường đại học Cần Thơ. Thời gian: từ 26/2/2007 đến 18/5/2007. 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu Nấm mốc Aspergillus Oryzae được lấy từ Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Cần Thơ. 3.1.3 Thiết bị, hoá chất • Thiết bị - Nồi nấu - Thiết bị thanh trùng - Máy đo độ ẩm - Khay - Tủ ấm - Máy xay - Bể điều nhiệt - Máy đo mật độ quang - Tủ sấy chân không - Các dụng cụ thủy tinh • Hoá chất - Dung dịch hồ tinh bột 2% - Dung dịch HCl 0,1N - Dung dịch iod 0,05% (0.05% trong 0.5% KI) 3.1.4 Môi trường nuôi cấy Aspergillus oryzae được nuôi cấy trong môi trường nếp than theo phương pháp nuôi cấy bề mặt. Nếp than được ngâm, nấu, thanh trùng và để nguội rồi trộn giống vào, tạo điều kiện cho nấm phát triển. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 24 \3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phương pháp phân tích Nấm mốc Aspergillus oryzae được nuôi trên nếp than đã được hồ hoá ở những độ ẩm khác nhau, đưa vào tủ ủ ở những nhiệt độ khác nhau. Hoạt tính của enzyme amylase do Aspergillus oryzae sinh ra theo thời gian được xác định bằng phương pháp đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng màu với iodine. Khi có amylase tác dụng thì các sản phẩm phân giải của tinh bột sẽ cho màu khác nhau đối với iodine. 3.2.2 Phương pháp thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, kết quả thí nghiệm trước là cơ sở để thực hiện thí nghiệm tiếp theo. 3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm 3.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát độ ẩm môi trường, nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy Aspergillus oryzae a. Mục đích Nuôi Aspergillus oryzae ở độ ẩm nguyên liệu, nhiệt độ môi trường và thời gian khác nhau. Từ đó xác định các điều kiện môi trường và thời gian để Aspergillus oryzae sinh tổng hợp amylase mạnh nhất. b. Tiến hành Nếp than được ngâm trong nước nhằm loại bỏ những tạp chất và hạt hư hỏng, tạo điều kiện cho hạt hút nước trương nở. Kế đến, nếp than được nấu, điều chỉnh ẩm và hấp thanh trùng. Làm nguội khối nếp than và phối trộn, tiến hành nuôi cấy ở độ ẩm nguyên liệu, nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy khác nhau. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 25 Nhân tố nhiệt độ: A
A1: 270C
A2: 300C
A3: 350C Nhân tố độ ẩm: B
B1: 50%
B2: 60%
B3: 70% Nhân tố thời gian: C
C1: 1 ngày
C2: 2 ngày
C3: 3 ngày
Số nghiệm thức: (3 x 3 x 3) = 27 nghiệm thức
Số mẫu thí nghiệm: 27 x 3 = 81 mẫu văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 26 A1 A2 A3 B1 B2 B3 B1 B2 B3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 C1 C2 C3 Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 Đo hoạt tính amylase Giống (0.2%) Làm nguội Nguyên liệu (100g) Ngâm (1 giờ) Nấu Phối trộn Tủ nuôi cấy Điều chỉnh ẩm (B1, B2, B3) Thanh trùng (1210C, 15 phút) văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 27 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than a. Mục đích Sau khi xác định được điều kiện môi trường và thời gian nuôi Aspergillus oryzae sinh tổng hợp amylase mạnh nhất thì tiến hành sấy nhằm bảo quản chế phẩm lâu dài. b. Tiến hành Nấm mốc được nuôi cấy ở những điều kiện thích hợp, chế phẩm enzyme thô thu được đem đi sấy chân không nhằm hạn chế nhiệt độ cao ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme. Thực hiện ở ba mức nhiệt độ sấy: 400C, 450C, 500C.
Số nghiệm thức: 3 nghiệm thức
Số mẫu thí nghiệm: 3 mẫu Đo lại hoạt tính của enzyme amylase. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 28 400C 450C 500C Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 Đo hoạt tính amylase Giống (0.2%) Làm nguội Nguyên liệu (100g) Ngâm (1 giờ) Nấu Phối trộn Tủ nuôi cấy Sấy Điều chỉnh ẩm (60%) Thanh trùng (1210C, 15 phút) văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 29 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Hoạt tính enzyme amylase trong quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ môi trường, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy khác nhau Ba nhân tố nhiệt độ, độ ẩm và thời gian được bố trí thí nghiệm theo sơ đồ hình 5. Mốc giống Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường nếp than đã được hồ hóa ở những độ ẩm nhất định, chúng được ủ ở 3 mức nhiệt độ khác nhau và sau mỗi ngày được thử hoạt tính. Kết thúc thí nghiệm kết quả thu được là giá trị trung bình của 3 lần lập lại. Bảng 3: Hoạt tính của enzyme amylase Nhiệt độ (0C) Độ ẩm (%) Thời gian (ngày) Hoạt tính (đv/g) 27 50 1 4,382 27 50 2 6,808 27 50 3 7,963 27 60 1 5,381 27 60 2 6,354 27 60 3 8,459 27 70 1 1,926 27 70 2 4,646 27 70 3 4,574 30 50 1 5,934 30 50 2 7,078 30 50 3 6,273 30 60 1 6,164 30 60 2 8,614 30 60 3 7,328 30 70 1 5,014 30 70 2 6,372 30 70 3 6,247 35 50 1 2,759 35 50 2 6,495 35 50 3 6,052 35 60 1 3,268 35 60 2 6,349 35 60 3 5,054 35 70 1 4,705 35 70 2 2,546 35 70 3 2,259 văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 30 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Hoạt tính (đv/g) 1 ngày 2 ngày 3 ngày 50% 60% 70% 50% 60% 70% 50% 60% 70% 270C 300C 350C Hình 7: Hoạt tính enzyme amylase Bảng được trình bày theo hình 7 cho thấy: - Hoạt tính enzyme amylase được sinh ra cao nhất sau 2 ngày nuôi cấy, ở nhiệt độ môi trường 300C và 60% ẩm của nếp than. - Hoạt tính enzyme amylase cũng được tổng hợp mạnh sau 3 ngày nuôi cấy, ở nhiệt độ 270C và 60% ẩm của nếp than. - Nhiệt độ môi trường 350C kiềm hãm sự phát triển của mốc làm giảm khả năng tổng hợp enzyme amylase, đặc biệt khi độ ẩm cao (70%) thì hoạt tính giảm theo từng ngày. - Nhiệt độ môi trường 270C cho thấy hoạt tính enzyme amylase tăng chậm qua từng ngày, ngày thứ 3 cho hoạt tính cao hơn 2 ngày đầu. - Nhiệt độ môi trường 300C, hoạt tính enzyme cao hơn so với hai mức độ trên. - Độ ẩm 50% và 70% đều cho hoạt tính thấp. Nhiệt độ môi trường ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng tổng hợp enzyme amylase của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình nuôi cấy. Nhiệt độ cao 350C thì mốc khó phát triển, hoạt tính enzyme thấp. Nhiệt độ thấp 270C mốc phát triển chậm, thời gian tổng hợp enzyme kéo dài. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 31 Cùng với nhiệt độ môi trường, độ ẩm nếp than sau thanh trùng có ý nghĩa quan trọng nhất định đến sự phát triển của nấm mốc cũng như khả năng sinh enzyme. Aspergillus oryzae là loài hiếu khí bắt buộc do đó 70% ẩm trong nếp than làm giảm mức độ thoáng khí của môi trường, mốc phát triển kém đồng thời quá trình nuôi cấy không phải là vô trùng tuyệt đối, với độ ẩm cao sẽ tạo điều kiện cho các vi khuẩn tạp phát triển. Ngoài ra để sinh trưởng và phát triển trên môi trường nếp than thì nấm mốc cần phải tiết enzyme amylase thực hiện phản ứng thủy phân nguồn dinh dưỡng từ nếp than nên rất cần sự hiện diện của nước trong nguyên liệu. Khi độ ẩm 50%, môi trường nuôi cấy khô thì mốc sẽ sinh nhiều bào tử làm hoạt tính bị giảm. Thời gian nuôi cấy hay thời điểm thu nhận chế phẩm enzyme là một trong những nhân tố quyết định hoạt tính enzyme thu được cao hay thấp. Ngay sau khi nuôi cấy (1ngày) nấm mốc chưa gia tăng mật số, có thể đây là thời gian chúng làm quen với môi trường nuôi sống và chuẩn bị cho sự tăng trưởng vượt bậc sau đó, cho nên thu chế phẩm quá sớm thì mốc chưa tổng hợp nhiều enzyme. Từ 2 – 3 ngày khi nấm mốc đã thích nghi với môi trường mới thì bắt đầu nhân mật số lên với tốc độ rất nhanh, quá trình này diễn ra đồng thời với lượng enzyme được mốc tiết ra môi trường càng nhiều để lấy thức ăn. Đây chính là thời điểm tốt nhất để thu chế phẩm enzyme. Từ ngày thứ 3 trở đi có thể mốc đã làm cạn dần thành phần dinh dưỡng thì mốc chết dần hay tạo bào tử làm lượng enzyme hiện diện trong canh trường sẽ giảm đáng kể. Ngoài ra enzyme có bản chất là protein, theo thời gian protein sẽ bị phân hủy làm giảm hoạt tính enzyme. Qua hình 7 ta có thể rút ra các thông số thích hợp trong quá trình nuôi cấy: - Nhiệt độ môi trường: 300C - Độ ẩm nếp than: 60% - Thời gian: 2 ngày văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 32 Kết quả trên bảng còn được thống kê với tiêu chí tìm ra sự khác biệt cũng như tổ hợp nghiệm thức tốt nhất cho quá trình nuôi cấy. Bảng 4: Biến đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ môi trường, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy. Kết quả thống kê cho thấy các mẫu nuôi ở nhiệt độ 300C, 60% ẩm, thời gian 2 ngày sẽ cho hoạt độ amylase cao nhất là 8,614 đv/g và khác biệt không ý nghĩa với các mẫu nuôi ở nhiệt độ 270C, 60% ẩm, thời gian 3 ngày là 8,46 đv/g. Các mẫu nuôi ở 300C, 50% ẩm, 2 ngày; 300C, 60% ẩm, 3ngày và mẫu ở 270C, 50% ẩm, 3 ngày cũng có hoạt tính cao (7,007 – 7,962 đv/g) nhưng thấp hơn các mẫu ở hai tổ hợp nghiệm thức trên. Ở tổ hợp nghiệm thức 270C, 70% ẩm, 1 ngày các mẫu cho hoạt tính enzyme thấp nhất là 1,926 đv/g và khác biệt có ý nghĩa so với các mẫu khác. Như vậy thông qua hình 7 và bảng 4 có thể rút ra 2 tổ hợp nghiệm thức tối thích cho sự phát triển của nấm mốc cũng như khả năng tổng hợp enzyme nhiều nhất như sau: - Tổ hợp 1: Nhiệt độ môi trường 300C, độ ẩm nếp than 60% sau 2 ngày nuôi cấy. - Tổ hợp 2: Nhiệt độ môi trường 270C, độ ẩm nếp than 60% sau 3 ngày nuôi cấy. Xét về tính kinh tế thì tổ hợp 1 thích hợp nhất cho quá trình chế biến koji nếp than. Thời gian nuôi cấy (ngày) 1 2 3 27 4,382i 6,808cde 7,963ab 50 27 5,381gh 6,354ef 8,46a 60 27 1,926l 4,646i 4,547i 70 30 5,933fg 7,077cd 6,273ef 50 30 6,164ef 8,614a 7,328bc 60 30 5,014hi 6,372def 6,25ef 70 35 2,76jk 6,494def 6,052fg 50 35 3,268j 6,35ef 5,054hi 60 35 4,705hi 2,545kl 2,259kl 70 Nhiệt độ (0C) Độ ẩm (%) văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 33 Hình 8: Chế phẩm koji nếp than (300C, 60%, 2ngày) Hình 9:Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase (chế phẩm nuôi ở 300C, 60% ẩm, 2ngày) Hinh 10: Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase (chế phẩm nuôi ở 270C, 70% ẩm, 1 ngày) văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 34 4.2 Hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình sấy chân không ở nhiệt độ khác nhau Với kết quả nhận được từ thí nghiệm trước, nấm mốc phát triển tốt và cho hoạt tính enzyme amylase mạnh nhất ở 300C, 60% ẩm và thời gian 2 ngày. Chế phẩm koji được thu nhận lúc này nếu để trong môi trường tự nhiên thì nấm mốc sẽ chết dần kéo theo hoạt tính enzyme giảm. Vì vậy, để đảm bảo chất lượng chế phẩm koji sẽ tiến hành sấy chế phẩm ở những nhiệt độ khác nhau (400C, 450C và 500C) làm giảm lượng ẩm có trong chế phẩm, kéo dài thời gian bảo quản. Hướng tới tiêu chí hạn chế sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến tế bào nấm mốc và hoạt tính enzyme amylase, trong thí nghiệm này chế phẩm koji tươi được sấy bằng thiết bị sấy chân không. Trong quá trình sấy, sau mỗi 2 giờ chế phẩm sẽ đựơc cân và đo hoạt tính. Kết thúc quá trình sấy, sản phẩm khô được đem đi nghiền, đo hoạt tính và bảo quản. Bảng 5: Thay đổi trạng thái ẩm (%) của sản phẩm koji nếp than trong khi sấy Nhiệt độ sấy (0C) 400C 450C 500C 0 62,88 64,54 61,91 2 52,95 54,69 52,78 4 44,51 47,37 39,47 6 34,02 33,76 2415 8 25,16 14,41 10,31 10 18,06 7,608 7,436 12 14,33 4,831 4,368 14 5,787 3,615 4,20 16 4,649 3,168 3,91 18 4,231 3,062 3,764 Thời gian sấy (giờ) văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 35 0 10 20 30 40 50 60 70 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thời gian (giờ) Độ ẩm tương đối (%) Series1 Series2 Series3 400C 450C 500C Hình 11: Thay đổi độ ẩm của chế phẩm theo thời gian sấy Quan sát bảng 5 và hình 11 cho thấy ở 500C tốc độ mất ẩm cao nhất và thấp nhất ở 400C. Khi sấy ở nhiệt độ càng cao thì ẩm trong vật được gia nhiệt (quá trình truyền nhiệt) đến nhiệt độ sôi ứng với áp suất hơi nước trong môi trường không khí trong buồng sấy càng nhanh thúc đẩy quá trình trao đổi chất giữa chế phẩm và môi trường diễn ra với tốc độ cao hơn và lượng ẩm mất nhiều hơn. Từ 0 – 8 giờ tốc độ mất ẩm diễn ra rất nhanh, ở chế độ nhiệt độ 500C ẩm giảm tuyến tính theo một đường thẳng, còn ở mức 450C tốc độ bay hơi ẩm từ 0 – 4 giờ chậm hơn so với mẫu được sấy ở 400C nhưng sau 8 giờ thì nhanh hơn. Từ 8 – 12 giờ kế tiếp lượng ẩm thoát ra càng chậm do ẩm tự do đã bay hơi hết còn lại trong vật là ẩm liên kết. Nhìn vào đồ thị lúc này thì tốc độ mất ẩm ở 450C và 500C gần bằng nhau và nhanh hơn so với ở 400C. Từ 14 giờ trở đi ẩm giảm rất ít, quá trình sấy càng tiếp diễn thì độ ẩm của vật càng giảm đến khi độ ẩm của vật giảm đến độ ẩm cân bằng ứng với điều kiện môi trường không khí ẩm trong buồng sấy. Lúc này khối lượng của chế phẩm không thay đổi giữa 2 lần sấy gần nhất, mẫu sấy ở 400C không thay đổi khối lượng sau 18 giờ còn mẫu sấy ở 450C và 500C là sau 16 giờ và quá trình sấy kết thúc. Nhìn chung ở mức nhiệt độ 500C, 16 – 18h thì sản phẩm được sấy nhanh nhất. Sản phẩm koji nếp than khô có độ ẩm nhỏ hơn độ ẩm cân bằng ứng với không khí trong phòng ta không thể để sản phẩm trong điều kiện này và như vậy sản phẩm sẽ hấp thu ẩm làm độ ẩm của nó tăng lên dẫn đến giảm đáng kể thời gian bảo quản an toàn, sản phẩm mau hỏng do đó cần phải bao gói sản phẩm. (%) văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 36 Hình 12: Chế phẩm koji nếp than trước khi đem sấy (300C, 60%, 2 ngày) Hình 13: Chế phẩm koji nếp than sau khi sấy ở 500C Hình 14: Chế phẩm koji nếp than sau khi nghiền văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 37 Bảng 6: Hoạt tính của enzyme trong quá trình sấy ở những nhiệt độ sấy khác nhau Nhiệt độ sấy (0C) 400C 450C 500C 0 7,059 7,092 6,967 2 7,021 6,782 6,864 4 6,829 6,229 6,777 6 7,103 6,174 6,820 8 7,092 5,805 6,945 10 6,902 6,402 7,037 12 6,728 5,045 7,287 14 6,956 6,087 6,798 16 6,912 5,729 7,227 18 6,945 6,011 7,707 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Thời gian (giờ) Hoạt tính (đv/g) Series1 Series2 Series3 400C 450C 500C Hình 15: Thay đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ sấy Qua hình15 thể hiện hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình sấy ở nhiệt độ 400C và 500C không thay đổi lớn. Còn ở 450C thì hoạt tính giảm bất thường, điều này do chế phẩm koji khi được đem xác định hoạt tính sau mỗi 2 giờ sấy đã không được ngâm đúng thời gian (1 giờ) làm cho chế phẩm hút nước và trương nở tạo điều kiện thuận lợi cho công đoạn trích ly enzyme amylase tiếp theo. Ở nhiệt độ 400C và 500C hoạt lực của enzyme không thay đổi theo thời gian sấy. Nhưng ở 500C thì sản phẩm đạt trạng thái cân bằng nhanh hơn. Vì thế chúng tôi chọn nhiệt độ sấy chế phẩm koji tốt nhất là 500C. Thời gian sấy (giờ) văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 38 Hình 15: Hoạt tính enzyme amylase theo thời gian sấy ở 400C Hình 16: Hoạt tính enzyme amylase theo thời gian sấy ở 500C văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 39 Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Chế phẩm koji nếp than là một chế phẩm enzyme ở dạng thô. Trong quá trình nuôi cấy nếu không đảm bảo các điều kiện tối thích cho sự phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae dẫn đến làm giảm khả năng tổng hợp hoạt tính enzyme amylase, hay kéo dài thời gian nuôi cấy làm giảm năng suất sản xuất. Ở công đoạn sấy cần phải chú ý đến nhiệt độ sấy, nhiệt độ quá cao làm hoạt tính giảm, nhiệt độ thấp thì mốc sẽ tiếp tục phát triển. Qua thời gian nghiên cứu, những thông số tối ưu cho qui trình sản xuất chế phẩm koji nếp than như sau: - Độ ẩm nếp than sau khi hồ hoá: 60% - Nhiệt độ tủ ủ: 300C - Thời gian nuôi: 2 ngày - Nhiệt độ sấy: 500C, 16 – 18h 5.2 Đề nghị Với thời gian nghiên cứu có hạn nên không thể nghiên cứu quá trình bảo quản sản phẩm sau khi sấy. Vì vậy, tôi xin đề nghị một số vấn đề cần nghiên cứu tiếp theo: - Khảo sát hoạt tính protease được sinh ra trên môi trường nếp than sau nuôi cấy. - Khảo sát ở nhiệt độ sấy cao hơn và thử hoạt tính. - Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại bao bì chứa chế phẩm sau khi sấy và nhiệt độ bảo quản chế phẩm. - Xác định hàm lượng enzyme có trong chế phẩm sau khi sấy. - Nghiên cứu khả năng phát triển của nấm mốc và hoạt lực enzyme amylase trong chế phẩm sau khi sấy. - Nghiên cứu thử nghiệm chế phẩm khô thu được trong sản xuất rượu nếp than và so sánh với rượu nếp than được làm từ các nguồn enzyme thương mại. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 40 Qui trình sản xuất đề nghị Hình 17: Qui trình chế biến koji nếp than đề xuất Giống (0.2%) Làm nguội Nguyên liệu Ngâm (1giờ) Nấu Phối trộn Nuôi cấy (300C, 60% ẩm, thời gian nuôi:2 ngày) Sấy (500C, 16 – 18h) Điều chỉnh ẩm (60%) Thanh trùng (1210C, 15 phút)) Thành phẩm văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Đức Lượng,2004, Công nghệ enzyme, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Đức Lượng, 2004, Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, Thí nghiệm vi sinh vật học, đại học Quốc gia Tp.HCM, NXB Đại học Quốc Gia Tp.HCM. Đặng Thị Thu, 2004, Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Văn May, 2002, Kỹ thuật sấy nông sản thực phẩm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Văn Lụa, Kỹ thuật sấy vật liệu, trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM. Hoàng Văn Chước, 2004, Kỹ thuật sấy, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Đình Thưởng, Nguyền Thanh Hằng, 2005, Công nghệ sản xuất và kiểm tra cồn etylic, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Thị Hồng Ngân, luận văn 2006, ngành Công nghệ thực phẩm, GVHD Lý Nguyễn Bình. Tiếng Anh Microbiology of Fermented Foods, Blackie Academic and Professional, 1998, Volume 2, Edited by Brian J.B. Wood. Cong Ha Nguyen, Ryoji Tsurumizu, Tsutomu Sato, and Michio Takeuchi, 2005, Take – Amylase A in the Conidia of Aspergillus oryzae RIB40. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 42 PHỤ LỤC Xác định hoạt tính của enzyme amylase theo phương pháp so màu bằng điện quang sắc kế Nguyên tắc: Hoạt tính của enzyme amylase được xác định dựa trên sự giảm cường độ màu xanh từ kết quả thủy phân tinh bột của enzyme amylase với iodine làm chất chỉ thị màu. Hoá chất: Dung dịch enzyme: Cân chế phẩm sau khi nuôi cấy, nghiền nhỏ trong cối sứ hoặc dùng máy xay sinh tố và cho vào 100ml nước cất. Tiếp đó đem đi lọc, dịch thu được được xem là dịch enzyme và dùng để xác định hoạt độ. Dung dịch iod cơ bản: Cân 0,25g I2 và 2,5g KI hòa tan trong cốc bằng 5-10 ml nước cất. Tiếp theo cho toàn bộ vào bình định mức 100 ml rồi thêm nước cất đến ngấn bình. Dung dịch cần bảo quản trong bình nâu hoặc đặc trong bóng tối. Dung dịch phân tích được chuẩn bị từ dung dịch iod cơ bản bằng cách hút 2 ml dung dịch iod cơ bản cho vào bình định mức 100 ml rồi thêm nước cất đến ngấn bình. Dung dịch này khi đo trên máy so màu phải có mật độ quang học D = 0,16 ± 0,01 với chiều dày lớp chất lỏng 1cm, kính lọc sáng có bước sóng 453=λ milimicron. Dung dịch HCl 0,1N: Cho 8,2 ml HCl đặc vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất tới vạch, lắc đều. Tiến hành: Lấy 2 ống nghiệm (20 ml) khô rồi cho vào mỗi ống 10 ml dịch tinh bột 2%. Cho 5 ml nước cất vào ống nghiệm 1 (ống kiểm chứng) và 5 ml dung dịch enzyme đã được pha loãng vào ống nghiệm 2. Lắc đều và cho vào bể điều nhiệt ở 500C. Sau 10 phút, lấy 1ml của ống kiểm chứng cho vào ống nghiệm 3 chứa sẵn 10 ml HCl 0,1N. Tương tự lấy 1 ml mẫu thí nghiệm chi vào ống nghiệm 4 cũng chứa sẵn 10 ml HCl 0,1N với mục đích ngừng hoạt động của enzyme và giữ thời gian xúc tác đến 10 phút. Lắc đều dung dịch ở ống nghiệm 3 và 4 rồi từ đó mỗi ống lấy ra 1 ml cho vào ống nghiệm 5 và 6 đã chứa sẵn 10 ml dung dịch iod phân tích. Lắc đều rồi đem đo mật độ quang của mẫu dung dịch trên máy so màu với chiều dày dung dịch 1 cm, kính lọc sáng có bước sóng 656.10-9m. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 43 Mật độ quang của ống kiểm chứng ứng với nồng độ tinh bột ban đầu; còn mật độ quang của mẫu thí nghiệm ứng với nồng độ tính bột còn lại sau thủy phân. Hiệu số mật độ quang giữ mẫu kiểm chứng và mẫu thí nghiệm sẽ tương ứng với lượng tinh bột đã được thủy phân. Lượng tinh bột đã được thủy phân tính theo công thức: 2,0 D i 2 × − = DDC i Di - mật độ quang của mẫu kiểm chứng; D2 - mật độ quang của mẫu thí nghiệm; 0,2 - lượng tinh bột chứa trong 10 ml dịch tinh bột. Hoạt tính của enzyme amylase theo công thức n CH 03766.0264,7 −×= đv/g n – lượng chế phẩm enzyme ứng với 5 ml dịch tính theo gam. văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 44 Kết quả phân tích ANOVA về nhiệt độ, độ ẩm và thời gian nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae Analysis of Variance for Hoat tinh - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:Doam-Nhietdo-Thoigian 241.965 24 10.0819 22.18 0.0000 RESIDUAL 25.4542 56 0.454539 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 267.419 80 -------------------------------------------------------------------------------- All F-ratios are based on the residual mean square error. Multiple Range Tests for Hoat tinh by Do am moi truong-Nhiet do nuoi cay-Thoi gian nuoi cay -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 70_27_1 3 1.92633 X 70_35_3 3 2.25920 XX 70_35_2 3 2.54561 XX 50_35_1 3 2.75943 XX 60_35_1 3 3.26811 X 50_27_1 3 4.38176 X 70_27_3 3 4.57424 X 70_27_2 3 4.64586 X 70_35_1 3 4.7048 XX 70_30_1 3 5.01414 XX 60_35_3 3 5.05429 XX 60_27_1 3 5.38118 XX 50_30_1 3 5.93377 XX 50_35_3 3 6.05244 XX 60_30_1 3 6.16402 XX 70_30_3 3 6.24741 XX 50_30_3 3 6.27332 XX 60_35_2 3 6.34896 XX 60_27_2 3 6.35443 XX 70_30_2 3 6.37172 XXX 50_35_2 3 6.49456 XXX 50_27_2 3 6.80824 XXX 50_30_2 3 7.07755 XX 60_30_3 3 7.32845 XX 50_27_3 3 7.96283 XX 60_27_3 3 8.4591 X 60_30_2 3 8.61375 X