Luận văn Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. Lê Quỳnh Liên THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NGUYỄN NGỌC GIANG NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN PEPTIT KHÁNG NGUYÊN TỪ PROTEIN VỎ CỦA VIRUT VIÊM NÃO NHẬT BẢN LÀM TIỀN ĐỀ ĐỂ SẢN XUẤT VĂCXIN DÙNG QUA ĐƯỜNG MIỆNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN – 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan các kết quả trong thí nghiệm này đều được tôi làm thực tế và chưa có công trình nào công bố trên các bài báo, tạp chí, hay các phương tiện thông tin đại chúng. Tác giả Nguyễn Ngọc Giang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Quỳnh Liên đã tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài tôi đã nhận được sự giúp đỡ và những kinh nghiệm quý báu từ GS.TS. Lê Trần Bình, TS. Chu Hoàng Hà, TS. Lê Văn Sơn, TS. Nguyễn Hữu Cường cùng tập thể cán bộ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Từ đáy lòng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc với sự gúp đỡ đó để tôi có thể hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong bộ môn Sinh, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Thái Nguyên đã dạy dỗ, giúp đỡ tôi trong suốt quãng thời gian học tập tại trường. Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè và những người thân bên cạnh đã động viên khích lệ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Thái Nguyên, ngày 1 tháng 10 năm 2009 Học viên Nguyễn Ngọc Giang Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Amp: Ampicillin AS: Acetosyringone A. Tumefaciens: Agrobacterium Tumefaciens Bp : cặp baze Carbe: Carbenicillin CNSH: Công nghệ sinh học CNTBTV: Công nghệ tế bào Thực vật Da: Dalton Đoạn 27aa: Đoạn gen mã hoá cho đoạn peptít 27 axit amin của virut viêm não Nhật Bản Đoạn 27aa_LTB: Đoạn gen nối giữa đoạn 27aa và gen LTB DNA: Deoxyribonucleic acid E.coli: Escheria Coli EDTA: Ethylen dimine tetra- acetic acid HEPES: N-2-huydroxyethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid IPTG: Isopropylthio-beta-D-glactoside Kana: Kanamycin Kb: kilobaze LB: Luria Bertani LTB: Labile enterotoxin B OD: Mật độ quang học PBS: Phosphate buffer saline PCR: Polymerase chain reaction Rifa: Rifampicin SDS: Sodium dodecyl sulphat Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên SDS- PAGE: SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis Spec: Spectinomycin TE: Tris-EDTA VNNB: viêm não Nhật Bản X-gal: 5-bromo-4 chloro- 3 indolyl-beta-D-glactoside Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU .......................................................... Error! Bookmark not defined. Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............... Error! Bookmark not defined. 1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản ........................ Error! Bookmark not defined. 1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật BảnError! Bookmark not defined. 1.1.2 Nguồn lây truyền bệnh ................. Error! Bookmark not defined. 1.1.3 Đặc điểm biểu hiện của bệnh: ...... Error! Bookmark not defined. 1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB) Error! Bookmark not defined. 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất lý hoá của virut VNNBError! Bookmark not defined. 1.2.2. Sự nhân bản của virut ................. Error! Bookmark not defined. 1.2.3. Cấu trúc của virut VNNB ........... Error! Bookmark not defined. 1.2.4. Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của đoạn peptit kháng nguyên 27 axit amin của virut VNNB .. Error! Bookmark not defined. 1.3 Các loại văcxin phòng bệnh VNNB ........ Error! Bookmark not defined. 1.3.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuộtError! Bookmark not defined. 1.3.2 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ tế bàoError! Bookmark not defined. 1.3.3 Văcxin sống giảm độc lực ............. Error! Bookmark not defined. 1.3.4 Nghiên cứu phát triển văcxin mớiError! Bookmark not defined. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not defined. 2.1 Vật liệu .................................................... Error! Bookmark not defined. 2.1.1. Vật liệu thực vật .......................... Error! Bookmark not defined. 2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử ............ Error! Bookmark not defined. 2.1.2.1. Mồi............................................. Error! Bookmark not defined. 2.1.2.2. Plasmid ...................................... Error! Bookmark not defined. 2.1.2.3 Các chủng vi sinh vật và các nguyên liệu dùng trong thí nghiệm.................................................... Error! Bookmark not defined. 2.1.2.4 Các loại máy móc ....................... Error! Bookmark not defined. 2.1.3 Hoá chất ........................................ Error! Bookmark not defined. 2.1.4 Các môi trƣờng nuôi cấy và các dung dịchError! Bookmark not defined. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu ....................... Error! Bookmark not defined. 2.2.1. Nhân đoạn 27 aa và LTB bằng PCRError! Bookmark not defined. 2.2.2 Phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc (colony PCR)Error! Bookmark not defined. 2.2.3 Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli ............................... Error! Bookmark not defined. 2.2.4. Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coliError! Bookmark not defined. 2.2.5. Thiết kế vector pCB_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vật ................ Error! Bookmark not defined. 2.2.6. Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vậtError! Bookmark not defined. 2.2.7. Kiểm tra biểu hiện của protein tái tổ hợpError! Bookmark not defined. Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........ Error! Bookmark not defined. 3.1 Nhân đoạn gen 27 aa ............................... Error! Bookmark not defined. 3.2 Nhân gen LTB và nối với gen 27 aa ....... Error! Bookmark not defined. 3.3 Thiết kế vector biểu hiện gen 27 aa_LTB trong E.coliError! Bookmark not defined. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli BL21Error! Bookmark not defined. 3.4.1 Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn E.coli BL21Error! Bookmark not defined. 3.4.2 Biểu hiện gen 27aa_LTB trong E.coli BL21Error! Bookmark not defined. 3.5. Biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong thực vậtError! Bookmark not defined. 3.5.1 Thiết kế vector biểu hiện gen 27aa_LTB trong thực vậtError! Bookmark not defined. 3.5.2 Lai đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL với vector chuyển gen pCB301 .................................................. Error! Bookmark not defined. 3.5.3 Biến nạp vào A. tumefaciens......... Error! Bookmark not defined. 3.5.4 Biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong cây thuốc láError! Bookmark not defined. KẾT LUẬN ...................................................... Error! Bookmark not defined. KIẾN NGHỊ ..................................................... Error! Bookmark not defined. TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................... Error! Bookmark not defined. PHỤ LỤC Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1 Mồi nhân gen 27 aa và gen LTB 17 Bảng 2 Các loại plasmid dùng trong thí nghiệm 18 Bảng 3 Máy móc dùng trong thí nghiệm 19 Bảng 4 Hóa chất dùng trong thí nghiệm 19 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Tên hình Trang Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc các protein đƣợc mã hoá bởi hệ gen của virut VNNB 7 Hình 1.2: Sơ đồ vị trí đoạn 27 axit amin trên protein E 10 Hình 1.3: Khả năng sinh ra tế bào lympho từ các peptid khác nhau 11 Hình 1.4 Khả năng sản sinh ra IFN-γ và IL-4 11 Hình 1.5: Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của văcxin thực vật 15 Hình 2.1: Sơ đồ quá trình gắn nối đoạn 27 axit amin với gen LTB 20 Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptide kháng nguyên trong E.coli 22 Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong cây thuốc lá 24 Hình 3.1: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen 27aa 27 Hình 3.2: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn LTB và ghép nối 27aa_LTB 28 Hình 3.3: Điện di sản phẩm cắt plasmid pBT_27aa_LTB 29 Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự đoạn 27 aa_LTB với trình tự gốc lần 30 Hình 3.5: Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB 32 Hình 3.6: Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB tách từ E.coli BL21 33 Hình 3.7: Điện di sản phẩm biểu hiện protein ở E.coli BL21 34 Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt plasmid pTRA_27aa_LTB bằng HindIII 36 Hình 3.9: Điện di sản phẩm cắt plasmid pCB_27aa_LTB bằng HindIII 37 Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR colony 38 Hình 3.11: Kết quả PCR từ plasmid các dòng A. tumefaciens 39 Hình 3.12: Sơ đồ ảnh các bƣớc Agro- infiltration 40 Hình 3.13: Mẫu lá tiêm gen Gus đƣợc nhuộm bởi X-Gluc 41 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên PHỤ LỤC * Các dung dịch: - Dung dịch Lameli buffer Stock 1X 2X 50mM Tris pH 6,8 1M 0,5ml 1ml 2%SDS 20% 1ml 2ml 10% Glycerin 87% 1-1,5ml 2,3ml 0,01% DTT 1M 50μl 50μl 0,2% Bromphenol blue 1% 50μl 50μl H2O 6,8ml 3,7ml - Các dung dịch sử dụng trong tách chiết plasmid từ vi khuẩn: + SolI: Tris- HCL 25mM, pH=8; EDTA 10mM, pH=8; glucose 50mM. + SolII: NaOH 0,2M; SDS 1%. + SolIII: kali axetat 3M; axit axetic 11,5%; natri axetat 3M. - Dung dịch đệm TE: Tris-HCL 10mM, pH=8; EDTA 1mM, pH=8 - Dung dịch chloroform: isoamylalcohol (24:1): 24ml chloroform: 1ml isoamylalcohol - Dung dịch đệm TAE đặc 50 lần: Tris- HCL 24,2%, axit axetic 5,71 ml, 10ml EDTA 0,5M pH=8 - Dung dịch nhộm gel ethidium bromide: 0,5μg/ml - Các dung dịch trong điện di trên gel polyacrylamid(SDS- PAGE) + Bis- Acrylamid 30%; APS 10%; Glycerol 50%; TEMED + Đệm Tris- HCL 1,5M(pH=6,8) * Các loại môi trƣờng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên - Môi trường LB lỏng: 0,5% dịch chiết nấm men; 1% bacto-pepton; 1% NaCl. - Môi trường LB đặc: môi trường LB lỏng thêm 1,5% Bacto-aga - Môi trường chứa chất cảm ứng IPTG: môi trường LB có bổ xung IPTG tới nồng độ cuối cùng 1mM Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Virut là nguyên nhân gây ra những căn bệnh nguy hiểm cho con người trong đó có virut viêm não Nhật Bản (Japanese Encephalitis Virus- JEV). Virut viêm não Nhật Bản xâm nhập vào cơ thể làm tổn hại hệ thần kinh gây ra những tổn thương nghiêm trọng dẫn đến tử vong hoặc để lại các di chứng nặng sau khi hồi phục. Ðến nay, bệnh viêm não Nhật Bản cũng như nhiều bệnh do siêu vi gây ra khác chưa có thuốc đặc trị. Ðiều trị chủ yếu là làm bớt đi phần nào các triệu chứng, cứu người bệnh qua khỏi cơn nguy kịch do suy hô hấp, trụy tim mạch, nhiễm trùng. Sau đó thì điều trị những di chứng phục hồi vận động, tâm thần kinh nhưng kết quả điều trị phục hồi này rất hạn chế. Do vậy, việc phòng tránh là hết sức cần thiết. Đã từ lâu văcxin là phương thuốc phòng ngừa bệnh hiệu quả cho con người. Và để phòng bệnh viêm não Nhật Bản thì cũng đã có rất nhiều loại văcxin được sản xuất. Tuy nhiên, đại đa số các loại văcxin này thường có quy trình sản xuất phức tạp, trải qua các quá trình làm lạnh khắt khe... Gần đây, văcxin thực vật được quan tâm nhiều vì nó có nhiều ưu điểm như dễ dàng thu sinh khối, dễ tăng quy mô sản xuất, có tính ổn định cao trong quá trình bảo quản và sử dụng, an toàn. Bên cạnh đó, những nghiên cứu trên protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản cho thấy đoạn 27 axit amin nằm trên protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản có khả năng tạo ra kháng thể chống lại virut này. Ngoài ra, nghiên cứu trên tiểu đơn vị liên kết nội độc tố không bền nhiệt của E.coli (heat- labile enterotoxin: LT) cho thấy tiểu đơn vị B (LTB) có khả năng sinh miễn dịch ở niêm mạc ruột. LTB tái tổ hợp có thể kích thích các đáp ứng miễn dịch niêm mạc để chống lại LT. Do vậy, LTB có thể được sử dụng tăng cường hiệu quả miễn dịch của văcxin thực vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Dựa theo những căn cứ trên, do đó chúng tôi đã chọn đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện peptit kháng nguyên từ protein vỏ của virut viêm não Nhật Bản làm tiền đề để sản xuất văcxin dùng qua đường miệng ”. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh viêm não Nhật Bản 1.1.1 Nguồn gốc bệnh viêm não Nhật Bản Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) được phát hiện vào năm 1871. Năm 1924, tại Nhật Bản xảy ra một vụ dịch có tới 6000 người mắc và có đến 60% trong số này tử vong [20]. Năm 1959, Buecher và Scherer đã khẳng định chim và lợn là những vật chủ chính bị nhiễm virut và nhờ có muỗi là vectơ hút máu các động vật nhiễm truyền virut sang cho người [5]. Các nước trong khu vực châu Á bao gồm: Nhật Bản, Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Philippine, vùng viễn đông Nga, tất cả các nước Đông Nam Á và Ấn Độ đều nằm trong vùng lưu hành của virut VNNB. Dần dần nó đã lây lan đến các vùng khác không thuộc châu Á như vùng Torres của Australia [13] [36]. Hàng năm, trong khu vực này có khoảng 50.000 trường hợp mắc và trong đó có khoảng 10.000 tử vong, số sống sót mang nhiều di chứng thần kinh rất nặng nề [42]. Bệnh VNNB thường xảy ra quanh năm, nhưng dịch thường bắt đầu trong mùa mưa khi quần thể muỗi phát triển tối đa và nhiệt độ ở các khu vực này thích nghi cho nguồn bệnh [52]. Thường là vào khoảng tháng 5 đến tháng 9 ở các nước bán nhiệt đới và nhiệt đới phụ thuộc vào mật độ muỗi và động vật khuếch đại, lượng mưa, chim di cư và canh tác nông nghiệp là các yếu tố quan trọng. Tỷ lệ mắc giảm dần ở Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản nhưng lại tăng lên ở Bangladest, Myanmar, Ấn Độ, Nepal, Bắc Thái Lan và Việt Nam [52]. 1.1.2 Nguồn lây truyền bệnh Hầu hết các trường hợp lây truyền bệnh là do muỗi hoặc côn trùng đốt các loài chim, chim là ký chủ mang mầm bệnh, nhưng bản thân chim thường Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 không biểu hiện bệnh. Ngoài ra còn có các vật chủ khác mang mầm bệnh như động vật có vú, nhất là lợn [3]. Muỗi Culex là vector truyền bệnh, chủ yếu là các loài: Culex tritaeniorhyncus: là muỗi thường gặp ở châu Á. Culex gelidus: thường gặp ở Malaysia và Singapore. Culex vishnui: ở Ấn Độ. Culex pseudovishnui: ở Ấn Độ. Culex annulirostris: ở Guam. Culex pipiens: ở phía đông Liên Xô cũ. Muỗi cái có thể truyền bệnh từ đời mẹ sang đời con, muỗi Culex tritaeniorhyncus sinh sản phát triển nhiều nhất ở đồng ruộng, nó đốt chim, gia súc và người. Muỗi Culex đốt truyền vào ban đêm. Tỷ lệ nhiễm ở muỗi vào khoảng 1-3% [21]. Loài muỗi này sống chủ yếu ở đồng ruộng lúa nước nhưng có thể di chuyển vào vùng dân cư sinh sống gần đó. Các ca bệnh thường là ở vùng ngoại ô thành phố [21], [45], [52]. Ở Việt Nam có hai nhóm chim có khả năng truyền bệnh: - Nhóm chim sống trong làng mạc, lũy tre, ở các loài cây ăn quả như: chim bông lau, chim rẻ quạt, chim sẻ nhà, chim liếu điếu, chim chích chòe. - Nhóm chim ăn ngoài đồng: cò, sáo, quạ, cu gáy, chèo bẻo. Có một số loài súc vật khác bị nhiễm trùng tiềm tàng như gà, dê, bò, ngựa, lợn và loài bò sát (rắn, rùa). Ở nước ta loài muỗi này có nhiều ở miền Bắc vào các tháng nóng. Ban ngày sống trong các bụi cây ngoài vườn, ban đêm bay vào nhà cắn hút máu gia súc và người, chúng thích đẻ trứng trong ruộng lúa và mương máng. Lợn tham gia dây truyền bệnh thường ở dưới dạng nhiễm trùng thể ẩn [3]. 1.1.3 Đặc điểm biểu hiện của bệnh: Triệu chứng của bệnh thường là sốt, đau người, mệt mỏi, đặc biệt là viêm não ở người lớn. Ở trẻ em có thể gây đau dạ dày, ruột và rối loạn tinh thần, ngủ gà ngay ở giai đoạn đầu, lên cơn co giật. Bệnh nặng có thể dẫn đến hôn mê và có thể không hồi phục lại được. Một số trường hợp tiến triển bệnh Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 viêm màng não rất nhanh, chỉ trong phút chốc. Hầu hết các trường hợp đều để lại những di chứng hết sức nặng nề. Hầu hết di chứng để lại ở trẻ dưới 10 tuổi. Thời kỳ ủ bệnh 5-16 ngày. Sau đó, khởi bệnh ồ ạt bằng các triệu chứng sốt cao đột ngột, đau đầu, đau cơ, buồn nôn, nôn. Tiếp đến là rối loạn ý thức xuất hiện các dấu hiệu như lú lẫn, mê sảng, hôn mê. Rối loạn vận động như trương lực cơ tăng, chân tay co cứng, cứng gáy, cử động bất thường, có các cơn co giật. Nặng hơn là liệt nửa người hoặc liệt toàn thân. Bệnh để lại di chứng liệt vận động hoặc rối loạn tinh thần [2]. 1.2 Virut viêm não Nhật Bản (virut VNNB) 1.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất lý hoá của virut VNNB Virut VNNB nằm trong nhóm virut Arbo (arthropod borne viruses). Hệ gen của virut Arbo thường là ARN, hầu hết chúng đều có vỏ lipit và bị bất hoạt bởi ether hoặc sodium deoxycholate [4] [7]. Nhóm virut Arbo có trên 350 loài, trong đó Arbo gây bệnh cho người có trên 75 loài. Nhiều virut Arbo được xếp vào họ Togaviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Rhabdoviridae... Họ Togaviridae được chia thành 2 chi là Alphavirus thuộc nhóm A và họ Flaviviridae thuộc nhóm B trong đó virut VNNB thuộc họ Flaviviridae [2]. Virut VNNB có đường kính trung bình 40-50nm, dạng hình cầu. Màng lipid kép của virut gắn vào lớp vỏ là glycoprotein E và protein màng M. Sợi ARN làm vật liệu di truyền được bao bọc bởi nucleocapsid. Hệ gen của virut VNNB mã hóa cho 10 protein gồm 3 protein cấu trúc và 7 protein không cấu trúc trong một khung đọc mở liên tục và trật tự từ đầu 5’ đến đầu 3’ và các vùng không mã hóa [31]. Hạt virut VNNB tinh khiết cho thấy sợi ARN chiếm 6%, protein 66%, lipid 17% và carbonhydrate chiếm 9%, cấu trúc của lớp lipid kép phụ thuộc vào tế bào chủ, nơi virut nhân lên [41] [48]. Virut VNNB có hệ số lắng 200S. Trọng lượng phân tử 60-70 x 106 dalton. Độ bền vững thích hợp nhất là pH 8. Virut dễ bị bất hoạt bởi nhiệt độ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 cao: 50 o C trong 50 phút, 37 oC trong vài giờ. Nhiệt độ thấp như -80oC, -20oC virut tồn tại trong nhiều năm và trong nitơ lỏng (-196oC) virut tồn tại vĩnh cửu. Virut VNNB rất nhạy với dung môi hòa tan như ether, sodium deoxycholate, dễ dàng bị bất hoạt bởi tia cực tím, formaldehyt... [1] 1.2.2. Sự nhân bản của virut Trên màng tế bào thường có những thụ thể, khi virut xuất hiện sẽ nhận biết và tiến đến bám vào thụ thể. Màng tế bào bao bọc hạt virut và đưa virut vào trong nội bào. Màng tế bào bị tác động và tạo khe hở cho virut thâm nhập vào bên trong tế bào gây cảm ứng tổng hợp ARN [9] [33] [38]. Bước vào quá trình cởi áo, sợi ARN được bộc lộ là sợi ARN đơn để tạo thành ARN phân cực (-) bổ sung thành chuỗi ARN kép nhờ phiên mã sớm và thông tin trung gian sao chép sợi ARN kép được làm khuôn để tổng hợp các sợi ARN mới theo cách bán bảo tồn và không đối xứng. Protein cũng được tổng hợp liên tiếp thành các đoạn protein cấu trúc và không cấu trúc [44]. ARN và protein của virut được tổng hợp trên lưới nội chất có hạt, vùng quanh nhân trong nguyên sinh chất của tế bào chủ. Sản phẩm tổng hợp được lắp ráp ở màng tế bào chất tạo ra các hạt virion. Các hạt virion được giải phóng qua bộ máy Golgi bằng ngoại bào xuất tiết và các virut mới tiếp tục xâm nhập vào tế bào khác [14] [15] [16]. Virut VNNB nhân lên trên nhiều loại tế bào cả ở trên tế bào tiên phát và tế bào thường trực có nguồn gốc từ người, khỉ, gặm nhấm, lợn, chim, gia cầm và muỗi [6] [7] [12]. Virut nhân lên gây hủy hoại tế bào (CPE) nhưng cũng có một số loại tế bào quan sát dưới kính hiển vi quang học, không thấy hiện tượng CPE [33]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 1.2.3. Cấu trúc của virut VNNB Hình 1.1: Sơ đồ cấu trúc các protein được mã hoá bởi hệ gen của virut VNNB Hệ gen của virut VNNB mã hoá cho các protein khác nhau, các protein này được chia thành hai nhóm chính là protein cấu trúc và protein phi cấu trúc. Nhóm protein cấu trúc chiếm ¼ chiều dài hệ gen bao gồm: protein lõi C, protein tiền màng (preM) và protein màng. Các protein không cấu trúc là phần còn lại của hệ gen. Đầu 3’ sợi ARN của virut VNNB không chứa đuôi polyA nhưng được coi là làm khuôn mẫu cho các cấu trúc tiếp theo. Từ đầu 5’ các gen được mã hóa cho protein C của ARN [39] [49]. Nhóm protein cấu trúc bao gồm: a) Protein C Protein C rất vững chắc, chứa khoảng 127 axit amin, trong đó thành phần bao gồm một số lớn axit amin Lys và Arg. Protein C có các axit amin liên kết với nhau rất chặt chẽ, có thể loại trừ khả năng trung hòa của phân tử ARN của virut với các tác nhân liên quan [31] [38]. b) Protein M Phía ngoài tế bào của virut trưởng thành có chứa protein M. Protein M có chứa dạng protein preM chưa trưởng thành trong tế bào chủ và preM có tới 165 axit amin không trùng lặp với protein E. Từ đó đã có một số nghiên cứu sản xuất văcxin VNNB tái tổ hợp sử dụng protein E để tổng hợp preM của C preM E NS1 5’ Protein cấu trúc Protein không cấu trúc NS3 NS4 NS5 3’ NS2 NS2A NS2B NS4A NS4B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 virut với mục đích tạo các nếp gấp chính xác tại protein M và lắp ráp vào protein E của 1 flavivirus nào đó. Trước khi virut được giải phóng ra ngoài tế bào,preM được phân cắt bởi một phân tử protease để tạo thành protein M hoàn chỉnh [38] [43] [53]. Sự sắp xếp lại các cấu trúc oligo trên bề mặt hạt virut do sự ly giải preM ra ngoài tế bào làm tăng khả năng gây nhiễm của virut trưởng thành tới vật chủ [18] [30]. c) Protein E Protein E là một glycoprotein. Protein E bao gồm khoảng 494-501 axit amin có trọng lượng phân tử 55-60KDa và là thành phần cấu tạo chính của vỏ (E). Các chuỗi axit amin tương đồng cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo tồn cao trong các virut thuộc nhóm flavivirus. Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hòa kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào chủ [35] [37]. So sánh cấu trúc protein E của JEV với cấu trúc có trình tự axit amin tương đồng khác cho thấy protein E là một protein cấu trúc có tính bảo thủ cao, Nhờ đặc điểm tương đồng của các protein vỏ trong chi flavivirus người ta đã xác định cấu trúc không gian của JEV dựa trên cơ sở cấu trúc không gian của TBE (tick-bome encephalitis) và phương pháp xây dựng mô hình với kiến thức đã biết. Kolaskar và Kulkami-Kale năm 1999 và năm 2002 đã đưa ra mô hình cấu trúc không gian protein E của JEV là một homodimer gồm: khoảng 30 chuỗi ( có thể ít hơn hoặc nhiều hơn tùy thuộc vào chủng) chia làm 9 phiến β (8 phiến đối song song và một phiến có cấu truc hình học topo), hai xoắn α và ba domain [1]. Các chuỗi không ở vị trí cố định trong không gian mà thường trôi và chuyển động trong không gian nhờ một số axit amin. Cấu trúc không gian của protein E được duy trì bởi 6 cấu trúc disulfide bảo thủ. Một liên kết disulfide Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 trong đó có vai trò trong việc duy trì cấu trúc mà gấp nếp giống như protein lõi kháng trypsin. Domain I là một trung tâm thùng AY ( AY- barrel) gồm 128 axit amin từ vị trí 1- 51, 137-196 và 293-311. Domain II là vùng nhị trùng hoá kéo dài gồm 71 axit amin từ vị trí 52-136 và 197-192. Domain III có phân tử giống Ig đầu C gồm 100 axit amin từ vị trí 312-411. Dựa vào cấu trúc không gian của protein E của TBE cho thấy phiến ABED của domain III nối với domain I và vùng thong lọng cd (loop-cd) của domain III. Cấu trúc không gian protein E của một số chủng khác nhau có một số sai khác giữa các chủng về số lượng chuỗi, số lượng phiến và số lượng axit amin trong mỗi chuỗi biến đổi mặc dù điểm bắt đầu và kết thúc vẫn khớp nhau. Chủng JEV Sri Lanka có thêm 6 chuỗi ngắn và hai phiến nhỏ so với chủng JEV NakaYama nhưng có một chuỗi chỉ có ở chủng JEV Nakayama. Một phiến nằm trên domain II tạo 2 sợi từ axit amin 335-336 và 360-361. Protein E có liên quan chặt chẽ đến chức năng sinh học của virut như chức năng bám dính, thụ cảm thể, ngưng kết hồng cầu, trung hoà kháng thể, điều chỉnh pH nội nguyên sinh chất của tế bào [1]. 1.2.4. Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của đoạn peptit kháng nguyên 27 axit amin của virut VNNB Với mỗi loại kháng nguyên khác nhau thì có thể sinh ra các kháng thể tương ứng để trung hoà kháng nguyên hoặc không sinh ra kháng thể nào. Với virut thì những kháng nguyên này thường nằm ngay trên bề mặt hạt virut. Trong virut VNNB thì kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và hoạt tính trung hòa là preM và E [8] [28] [32] [40]. Hai thành phần preM và E có khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch với hạt virut nguyên vẹn. Điều này được thể hiện bởi thí nghiệm của Kitano và Suzuki bằng cách tách chiết ngưng kết tố hồng cầu trên bề mặt hạt virut VNNB rồi gây miễn dịch cho chuột nhắt trắng. Kết Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 quả là kháng thể trung hòa ở chuột được gây miễn dịch với hạt virut VNNB nguyên vẹn. Có nhiều nghiên cứu cho thấy glycoprotein E đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây ra đáp ứng miễn dịch. Protein E khi bị cắt đầu C không những vẫn có khả năng gây đáp ứng miễn dịch mà còn bảo vệ cơ thể vật chủ tốt hơn so với protein E hoàn chỉnh. Trên protein E có chứa một đoạn 27 axit amin (từ axit amin 373 đến 399). Theo những nghiên cứu cho thấy đoạn 27 axit amin này có thể kéo dài và tăng cường khả năng tạo ra kháng thể trung hoà chống lại virut VNNB. Hình 1.2: Sơ đồ vị trí đoạn 27 axit amin trên protein E Một nghiên cứu gần đây của một nhóm tác giả người Trung Quốc đã tiến hành khi gắn nối đoạn gen mã hoá cho đoạn 27 axit amin này với protein sốc nhiệt Hsp70. Sau đó biểu hiện trong E.Coli đoạn 27 axit amin riêng lẻ và đoạn 27 axit amin đã gắn với Hsp70, protein biểu hiện được thu lại và tiêm vào chuột. Kết quả cho thấy khả năng sinh kháng thể của đoạn 27 axit amin khi gắn với Hsp70 cao hơn so với đoạn peptit 27 axit amin riêng rẽ [10]. Hình 1.3 so sánh về khả năng sản sinh ra các tế bào lympho từ chuột được gây miễn dịch bởi các peptit 27 aa có hoặc không có dầu khoáng, peptit 27 aa dung hợp với hsp70 và JEV SA14-14-2. 27aa Protein E Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Peptit 27 aa dung hợp với hsp70 tổng hợp có giá trị OD 570 cao nhất, trong khi sự có mặt của dầu khoáng không có hiệu quả đặc biệt. Không có sự khác biệt lớn giữa xử lý văcxin JEV SA 14-14-2 với kiểm soát không miễn dịch [10]. Mặt khác tính miễn dịch của chuột bởi đoạn 27 aa với hsp70 cũng được thể hiện bằng khả năng sản sinh ra lượng IFN-γ (hình 1.4) Nồng độ IFN-γ được tạo ra cao hơn hẳn so với ở các đối tượng kháng nguyên khác cho thấy việc gắn kết giữa đoạn peptit 27 aa với hsp70 đã làm gia tăng khả năng gây đáp ứng miễn dịch [10]. Điều này suy ra rằng cũng có Hình 1.4. Khả năng sản sinh ra IFN-γ và IL-4 1: Peptit 27 aa riêng lẻ 2: Peptit 27 aa có dầu khoáng 3: Peptit 27 aa dung hợp với hsp70 4: JEV SA14-14-2 5: Không miễn dịch 1 2 3 4 5 1: Peptit 27 aa riêng lẻ 2: Peptit 27 aa có dầu khoáng 3: Peptit 27 aa dung hợp với hsp70 4: JEV SA14-14-2 5: Không miễn dịch Hình 1.3. Khả năng sinh ra tế bào lympho từ các kháng nguyên khác nhau Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 thể gắn kết đoạn peptit 27 aa này với một gen nào đó có ưu điểm như hsp70 cũng sẽ hứa hẹn mang lại hiệu quả đáp ứng miễn dịch cao. 1.3 Các loại văcxin phòng bệnh VNNB Từ những năm 1935 cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sản xuất văcxin VNNB. Theo thời gian thì công nghệ sản xuất văcxin cũng dần nâng cao và đảm bảo sản xuất ra những loại văcxin tốt nhất. Tuy nhiên không thể nói rằng những văcxin đó không có những nhược điểm. Với mỗi loại văcxin khác nhau thì có những ưu nhược điểm khác nhau. Hiện tại có 3 loại văcxin đang được lưu hành là: Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột, văcxin bất hoạt trên nuôi cấy tế bào, văcxin sống giảm độc lực trên nuôi cấy tế bào 1.3.1 Văcxin bất hoạt sản xuất từ não chuột Những năm 1940 khi bắt đầu nghiên cứu sản xuất văcxin này ở dạng thô, văcxin này chứa toàn bộ protein não chuột và hàm lượng Myelin rất cao do đó tỷ lệ gây viêm não dị ứng cũng cao. Ngày nay công nghệ tinh chế hiện đại hơn đã làm giảm tối đa protein Myelin (<2ng/ml) và 2 chủng virut VNNB dùng để sử dụng sản xuất văcxin này là Nakayama và Beijing-1. Loại văcxin bất hoạt này được sản xuất ở một số nước Châu Á và được lưu hành rộng dãi trên thế giới [11]. 1.3.2 Văcxin VNNB bất hoạt sản xuất từ tế bào Chủng virut VNNB P3 có khả năng đáp ứng kháng thể với nhiều chủng virut viêm não khác trên chuột và nhân lên rất tốt trên tế bào thận tiên phát ở chuột. Văcxin được bất hoạt bằng formalin và hiệu quả gây miễn dịch cho trẻ em đạt 80% đáp ứng kháng thể. 1.3.3 Văcxin sống giảm độc lực Chủng SA14-14-2 là chủng giảm độc lực và không gây ảnh hưởng thần kinh. Qua thử nghiệm tại 1 vùng không lưu hành dịch ở Trung Quốc cho thấy Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 có tới hơn 83% đáp ứng kháng thể ở trẻ em 6-7 tuổi. Trẻ lớn hơn tiêm 2 liều cách nhau 1-3 tháng đạt 94-100% có đáp ứng miễn dịch. Phản ứng phụ của văcxin là rất ít gặp phải [19] [51]. 1.3.4 Nghiên cứu phát triển văcxin mới Hiện nay có nhiều nghiên cứu và phát triển theo hướng công nghệ văcxin tái tổ hợp. Dựa trên những hiểu biết chi tiết về vai trò và cấu trúc của glycoprotein E và preM/M nên nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu và tìm ra nhiều loại văcxin thế hệ mới như: văcxin protein, văcxin dựa trên virut tái tổ hợp, văcxin DNA… Và gần đây văcxin thực vật là một hướng đi mới mang nhiều hứa hẹn cho một loại văcxin với nhiều ưu điểm nổi bật: a) Có tính ổn định cao: Vì các kháng nguyên biểu hiện được sản xuất và bao bọc bởi các mô thực vật nên chúng có thể ổn định ngay ở nhiệt độ phòng. Những kháng nguyên này được định vị ở trong lưới nội chất, thể golgi hay bề mặt tế bào, đây là những vị trí lý tưởng cho các việc biểu hiện kháng nguyên. b) Có thể dễ dàng tăng quy mô sản xuất và dễ thu sinh khối, chẳng hạn ta có thể mở rộng diện tích trồng cây chuyển gen để tăng sản lượng. c) Dễ dàng sử dụng và bảo quản: Văcxin thực vật không cẩn giữ lạnh như các văcxin tiêm khác. Thông thường, ngay sau khi tinh sạch, văcxin tiêm được đông khô và vận chuyển từ nơi sản xuất đến nơi tiêu thụ thông qua một hệ thống bảo quản lạnh ở quy mô quốc tế, quốc gia và khu vực hết sức phức tạp và tốn kém. Nhưng nếu sản xuất văcxin ăn được, người ta chỉ cần vận chuyển và sử dụng ngay bộ phận thực vật chứa văcxin đó. c) Ăn được: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Vì văcxin thực vật nằm trong những bộ phận của thực vật như lá, quả…Do vậy ta có thể ăn được một cách dễ dàng. Nếu văcxin dùng qua đường miệng mà ở dạng được bao gói nó sẽ dễ dàng bị dịch tiêu hoá của đường ruột phân huỷ. Văcxin này có thể ăn tươi (quả, lá) hoặc nấu chín (hạt, củ). Xử lý nhiệt có tính khả thi khi kháng nguyên không biến tính ở nhiệt độ cao, ví dụ nấu chín khoai tây chứa văcxin trong 3 phút làm giảm 50% thành phần văcxin đó d) An toàn cho người và động vật: Văcxin dưới đơn vị sử dụng gen mã hoá cho một phần protein vỏ virut mà không cần đến virut sống như văcxin giảm độc lực hay virut chết như văcxin bất hoạt. Do đó, văcxin này không trở lại thành virut gây bệnh cho người và động vật, đồng thời nó cũng tránh được nguy cơ nhiễm mầm bệnh tiềm tàng từ văcxin như hệ thống động vật có vú. Nhiều sinh vật gây bệnh chưa biết ở động vật không thể phát hiện được trong dịch nuôi cấy dễ dàng truyền cho người và động vật, trong khi các bệnh thực vật không lây nhiễm được như vậy. Do đó, không cần phải tách chiết và tinh sạch kháng nguyên văcxin. e) Kích thích sản xuất kháng thể của hệ thống thể dịch hiệu quả hơn văcxin tiêm. Các vi sinh vật gây bệnh đều xâm nhập vào cơ thể qua bề mặt nhầy trong đường tiêu hoá, hô hấp và đường tiết niệu. Những con đường này đều thuộc hệ thống miễn dịch thể dịch, nơi tập trung những mô có khả năng đáp ứng miễn dịch lớn nhất của cơ thể và là hàng rào bảo vệ đầu tiên chống lại những vi sinh vật đó. Đây cũng chính là vị trí tác động hiệu quả nhất của các văcxin ăn được từ thực vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Hình 1.5: Khả năng gây đáp ứng miễn dịch của văcxin thực vật Khi văcxin này vào cơ thể qua đường miệng sẽ cảm ứng hệ thống miễn dịch thể dịch sản xuất các kháng thể chống lại sinh vật gây bệnh, tiếp đó hệ thống thể dịch lại tác động vào hệ thống miễn dịch tế bào, tạo ra các globulin miễn dịch, tăng cường khả năng bảo vệ sớm và hiệu quả cho cơ thể. Khi tiêu hoá văcxin ăn được, kháng nguyên được giải phóng trong ruột non [1]. Việc sản xuất văcxin ăn được xem là hệ thống sản xuất văcxin lý tưởng đơn giản và giá thành thấp. Nhiều thành công khác về văcxin thực vật cũng đựoc công bố trên nhiều loài cây khác nhau như thuốc lá, rau diếp, cà chua, khoai tây…Số lượng nghiên cứu về văcxin ăn được đựơc gia tăng đã chứng tỏ tính ưu việt của thực vật như một hệ thống biểu hiện hiệu quả cao, chi phí sản xuất thấp, an toàn về mặt sinh học, sử dụng và bảo quản dể dàng không cần giữ lạnh. 1.4 Gen LTB (labile enterotoxin-B) Nói tới văcxin thực vật thì không thể không nói tới một gen quan trọng thích hợp với việc biểu hiện protein và có khả năng kích thích sinh miễn dịch Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 trong thực vật, đó là gen LTB. Gen LTB là tiểu đơn vị liên kết nội độc tố không bền nhiệt của E.Coli một loại vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở nhiều quốc gia đang phát triển do hệ thống y tế cộng đồng còn thô sơ, điều kiện vệ sinh kém, nguồn nước uống chưa đảm bảo. Cấu trúc của LT bao gồm 1 tiểu đơn vị A (LTA) và 5 tiểu đơn vị B (LTB) tạo thành một pentamer dạng vòng. LTB là một chất có khả năng sinh miễn dịch ở niêm mạc ruột và một số nghiên cứu trên động vật mô hình và một thử nghiệm trên người cho thấy LTB tái tổ hợp có thể kích thích các đáp ứng miễn dịch niêm mạc. Vì thế, LTB là một ứng viên kháng nguyên đầy hứa hẹn trong sản xuất văcxin thực vật. Bên cạnh đó, LTB còn đề kháng tốt với sự thủy phân protein ở dạ dày và duy trì được một cấu trúc bậc 4 pentamer của nó trong môi trường pH thấp bằng 2.0. Đây là bằng chứng bổ sung cho LTB như là một ứng viên kháng nguyên được dùng cho văcxin sản xuất trong thực vật [22] [23] [24]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật Giống thuốc lá SNN (Nicotiana tabaccum L.) do Viện Nghiên cứu Di truyền thực vật IPK, Gatersleben (CHLB Đức) cung cấp, được trồng trong điều kiện tự nhiên. 2.1.2. Vật liệu sinh học phân tử 2.1.2.1. Mồi Tên mồi Trình tự mồi Chức năng Hãng sản xuất 5’_27aa AGCTTTGTGCCAATGGTGATTAATCT GTTTATCTCCTCTTCCAACAACAATA Dùng để tổng hợp đoạn gen 27aa Bioneer 3’_27aa GATATGGAACCACCATTCGGAGATTC ATATATTGTTGTTGGAAGAGGAGAT 5’_LTB GGATCCGATATGGAACCACCA Dùng để tổng hợp gen LTB Bioneer 3’_LTB GCGGCCGCGTTCTCCATGCTGATG Bảng 1: Mồi nhân gen 27 aa và gen LTB 2.1.2.2. Plasmid Vector Kháng sinh chọn lọc Vai trò Nguồn gốc pBT Amp, Carbe Tách dòng và đọc trình tự Phòng CNTBTV, Viện CNSH, Việt Nam pTRA Amp Cung cấp đoạn biểu hiện cmyc và KDEL trong cây Gatersleben, Đức Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 pCB301 Kana Cung cấp promoter 35S và terminator thích hợp cho chuyển gen thực vật Gatersleben, Đức pET 21a(+) Amp Biểu hiện protein trong E.Coli Novagen, Mỹ pBT_LTB Kana Mang đoạn LTB Phòng CNTBTV, Viện CNSH, Việt Nam pPNT289_Gus Spec Mang gen Gus Phòng CNTBTV, Viện CNSH, Việt Nam Bảng 2: Các loại plasmid dùng trong thí nghiệm 2.1.2.3 Các chủng vi sinh vật và các nguyên liệu dùng trong thí nghiệm - E.Coli DH5α [end A1 recA1 hsdR17 supE44gypA96 thi-1relA1lac U169(Ø80 lacZM15)] được sử dụng trong các thí nghiệm nhân dòng các plasmid. - E.Coli BL21 [E omp hsd SB(rBmB)gal dcm (DE3) plysS(Caml)] sử dụng cho nghiên cứu biểu hiện protein tái tổ hợp. - Chủng A. Tumefaciens CV58C1 mang plasmid pGV 2260 được sử dụng làm trung gian truyền các cấu trúc chuyển gen vào thực vật . 2.1.2.4 Các loại máy móc Các loại máy sử dụng tại phòng Công nghệ tế bào Thực vật và Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen (Viện Công nghệ Sinh học) bao gồm: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Tên máy Hãng sản xuất Máy ly tâm eppendorf Mikro Máy ly tâm lượng lớn Sorwall LEGENND LT (Mỹ) Máy điện di ADN Hoefl (Mỹ) Máy điện di protein Bio Rad (Mỹ) Máy đo pH Memmerl (Đức) Máy lắc Metler (Thuỵ Sĩ) Máy ổn nhiệt OSI (Pháp) Máy PCR MJ Reasach (Mỹ) Bảng 3: Máy móc dùng trong thí nghiệm 2.1.3 Hoá chất Tên hoá chất Hãng sản xuất Bộ hoá chất dùng cho phản ứng PCR BioLabs, Fermentas (Mỹ) Các enzyme cắt hạn chế, enzyme T4ligase, RNase, Marker 1Kb, Marker 100bp, Prestained protein ladder BioLabs, Fermentas (Mỹ) EDTA, SDS, MgCl2, TEMED, APS, BSA, HEPES, MES, X-Gluc Sigma (Mỹ) Bộ kit thôi gel và tinh sạch DNA Bioneer Comassie Blue stainning solution Fermentas Các loại kháng sinh Amp, Kana, Carbe, Rifa Duchefa (Hà Lan) Bảng 4: Hóa chất dùng trong thí nghiệm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.1.4 Các môi trƣờng nuôi cấy và các dung dịch Môi truờng nuôi cấy vi khuẩn LB, YEB được chuẩn bị dựa theo phương pháp Sambrook (1989). Một số loại môi trường đặc biệt khác được chuẩn bị theo công thức ở phần phụ lục. 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Nhân đoạn 27 aa và LTB bằng PCR Hình 2.1. Sơ đồ quá trình gắn nối đoạn gen 27 aa với gen LTB Phương pháp PCR được sử dụng để nhân những đoạn gen mong muốn với cặp mồi đặc hiệu. Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa trên trình tự protein vỏ của JEV đã công bố trên ngân hàng gen và trình tự đoạn LTB do TS. Lê Văn Sơn (Viện Công nghệ Sinh học, Việt Nam) cung cấp. Mồi 3’_27aa được gắn thêm 10 nucleotide đầu 5’ thuộc trình tự đoạn LTB và mồi 5’_LTB gắn thêm 10 nucleotide đầu 3’ thuộc trình tự đoạn 27aa. Việc bổ sung thêm này tạo vị trí kéo dài cho phản ứng PCR ghép nối hai đoạn 27aa và LTB. Các sản phẩm Mồi 5’_27aa và 3’_27aa PCR 27aa PCR LTB Plasmid chứa LTB PCR nối 27aa và LTB pBT Lai Cắt bằng enzyme BamHI và NotI 27aa_LTB 27aa_LTB/BamHI/NotI pBT_27aa_LTB Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 PCR tạo thành được điện di trên gel agarose 1% trong đệm 1X TAE, nhuộm gel trong dung dịch Ethidium bromide và thôi gel bằng bộ Kit của Qiagen. Thành phần PCR (thể tích 50µl) và chu trình nhiệt nhân đoạn 27aa với 35 chu kỳ như sau: 10X buffer: 5µl dNTP (10mM): 4µl MgCl2 (15mM): 3µl 5’_27aa(10pM): 2µl 3’_27aa(10pM): 2µl Taq polymerase (5unit/µl): 0,5µl H2O: 33,5 µl Thành phần PCR (thể tích 50µl) và chu trình nhiệt nhân đoạn LTB với 35 chu kỳ như sau: pBT_LTB (1:10): 1 µl 10X buffer: 5µl dNTP (10mM): 4µl MgCl2 (15mM): 3µl 5’_LTB(10pM): 2µl 3’_LTB(10pM): 2µl Taq polymerase (5unit/µl): 0,5µl H2O: 33,5 µl Thành phần PCR (thể tích 50µl) ghép nối đoạn 27aa và LTB gồm: Sản phẩm PCR 27aa: 1 µl Sản phẩm PCR LTB: 1 µl 10X buffer: 5µl dNTP (10mM): 4µl MgCl2 (15mM): 3µl Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 5’_27aa(10pM): 2µl 3’_LTB(10pM): 2µl Taq polymerase (5unit/µl): 0,5µl H2O: 33,5 µl Phản ứng ghép nối được tiến hành với chu trình nhiệt tương tự như phản ứng nhân đoạn gen LTB. 2.2.2 Phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc (colony PCR) Phương pháp colony PCR cho phép phát hiện nhanh khuẩn lạc mang plasmid tái tổ hợp mong muốn. Phương pháp này dựa trên nguyên tắc PCR, chỉ khác là mẫu DNA được thay bằng plasmid giải phóng từ khuẩn lạc. Ở nhiệt độ cao (94oC-95oC), màng tế bào bị phá vỡ, giải phóng plasmid tái tổ hợp. Plasmid này sẽ làm khuôn tổng hợp cho phản ứng PCR. Tuy nhiên phương pháp này có đôi chút hạn chế là có trường hợp sản phẩm biến nạp còn dính một lượng nhỏ plasmid tái tổ hợp, sẽ làm cho kết quả không còn chính xác như mong đợi. 2.2.3 Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli Hình 2.2. Sơ đồ thí nghiệm thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli pET21(a+) Lai Biến nạp 27aa_LTB/BamHI/NotI BamHI NotI pET21(a+)_ 27aa_LTB Chủng E.coli DH5α Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Sản phẩm PCR nối 2 đoạn 27aa và LTB là 27aa_LTB được dòng hóa trong vector pBT. Các dòng plasmid tái tổ hợp pBT_27aa_LTB được cắt kiểm tra bằng enzyme giới hạn BamHI. Dòng dương tính được xác định trình tự DNA và so sánh với trình tự đã có bằng phương pháp MegAlign ClusterW (DNAStar). Tiếp đó, vector tách dòng pBT mang đoạn 27aa_LTB được cắt bằng enzyme BamHI và NotI để thu lấy đoạn gen mong muốn, sau đó gắn vào vector pET21a (+) đã được xử lí cùng enzyme. Sản phẩm gắn kết được biến nạp vào chủng E.coli DH5α, chọn các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pET21_27aa_LTB bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn BamHI và NotI. 2.2.4. Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli Vector pET21_27aa_LTB được biến nạp vào tế bào biểu hiện E.Coli BL21 để tiến hành kiểm tra khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp. Sau khi nuôi cấy một khuẩn lạc E.coli BL21 mang vector tái tổ hợp qua đêm trong môi trường LB lỏng có bổ sung 50mg/l Amp tại nhiệt độ 37oC, dịch huyền phù được chuyển sang môi trường mới với tỉ lệ 1/20. Nuôi cấy tế bào biểu hiện ở nhiệt độ 37oC cho tới khi dịch huyền phù có OD600nm ~0,4-0,5 thì tiến hành cảm ứng. Nhiệt độ biểu hiện protein tái tổ hợp vẫn tương tự như nhiệt độ nuôi cấy. Chất cảm ứng với hệ biểu hiện pET21a (+) là IPTG với nồng độ cuối cùng là 1mM. Sản phẩm biểu hiện được thu mỗi giờ từ trong vòng 4h. Kết quả của sản phẩm được kiểm tra bằng điện di trên gel SDS- polyacrylamide 12,5%. 2.2.5. Thiết kế vector pCB_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vật Sản phẩm vector pBT tái tổ hợp chứa đoạn 27aa_LTB được cắt bằng enzyme BamHI và NotI để thu lấy đoạn gen mong muốn, sau đó gắn vào vector pTRA đã được xử lí cùng enzyme. Sản phẩm gắn kết được biến nạp vào chủng E.coli DH5α, chọn các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 pTRA_27aa_LTB bằng phương pháp cắt enzyme giới hạn BamHI/NotI. Đoạn gen này được gắn vào vector pTRA với mục đích là để gắn thêm vào đoạn gen 27aa_LTB đoạn cmyc và KDEL có trong vector pTRA. Sau đó các dòng vector tái tổ hợp pTRA_27aa_LTB dương tính được cắt bằng HindIII và lai với vector pCB301 cũng đã được xử lí HindIII. Sản phẩm tạo thành cũng được nhân lên trong tế bào E.coli DH5α và kiểm tra bằng cắt enzyme HindIII. Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong cây thuốc lá Sản phẩm cuối cùng là vector chuyển gen thực vật pCB_27aa_LTB, dưới sự điều khiển của promoter biểu hiện ở tất cả các mô thực vật CaMV 35S. 2.2.6. Biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vật Vector tái tổ hợp pCB_27aa_LTB được biến nạp vào A. Tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Phương pháp này dựa trên cơ sở là sự tạo ra các pTRA Lai Cắt bằng enzyme HindIII 27aa_LTB/BamHI/NotI BamHI NotI pTRA_ 27aa_LTB_cmyc_KDEL 27aa_LTB_cmyc_KDEL/HindIII HindIII HindIII pCB pCB_35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL Lai Chủng DH5α mang cấu trúc biểu hiện (35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL) Biến nạp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 lỗ trên màng tế bào khi có tác dụng của các điện cực lớn, làm cho các phân tử DNA đi vào tế bào theo điện trường. Tế bào khả biến A. tumefaciens CV58C1 sau khi tan đá thêm 1µl plasmid pCB_27aa_LTB và để trong đá 10 phút. Sau đó tiến hành xung điện ở mức 2,5µF, 400Ω, 25kV. Dịch khuẩn được nuôi phục hồi trong 300µl môi trường LB lỏng ở 28oC trong 2 ngày, sau đó cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung Rifa (50mg/l) và Kana (50mg/l). Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 5’_27aa và 3’_LTB được sử dụng để kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp trong các dòng tế bào A. tumefaciens sống sót trên môi trường chọn lọc. Đoạn peptit kháng nguyên của virut VNNB được biểu hiện tạm thời trên tế bào thực vật bằng phương pháp Agro-inflitration. Đầu tiên lấy một khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pCB_27aa_LTB nuôi trong 5ml LB lỏng có bổ sung Rifa (50mg/l) và Kana (50mg/l) ở 28oC. Sau đó dòng tế bào được cấy chuyển với tỉ lệ 1/50 sang môi trường LB lỏng mới có bổ sung kháng sinh tương tự trên và 10µl AS (100mM) và 1ml MES(1M), tiếp tục nuôi lắc qua đêm ở 28oC. Ly tâm 3000 rpm/ 30 phút tại 4oC thu dịch tế bào, sau đó rửa lại tế bào với nước cất vô trùng. Tế bào A. tumefaciens cuối cùng được hòa tan trong dung dịch có chứa: AS, MgCl2, MES với nồng độ cuối cùng tương ứng là 100µM, 10Mm và 10mM. Dịch huyền phù được giữ khoảng 2h ở nhiệt độ phòng trước khi tiêm vào mặt dưới các lá cây thuốc lá 5 tuần tuổi. Mẫu thí nghiệm được thu sau khi tiêm 2 và 4 ngày. Mẫu thu được bảo quản ở tủ - 84 oC. Song song, chúng tôi cũng tiến hành biểu hiện tạm thời gen Gus nhằm làm đối chứng cho quá trình Agro-infiltration. 2.2.7. Kiểm tra biểu hiện của protein tái tổ hợp Biểu hiện của đoạn peptit kháng nguyên trong E.coli được kiểm tra bằng điện di trên gel SDS-polyacrylamide 12,5%. 1ml của dịch tế bào cảm ứng thu được được ly tâm thu cặn rồi hoà tan trong 50µl 2X Lamli buffer và biến tính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 ở nhiệt độ khoảng 95oC trong 10 phút. Sản phẩm điện di trên gel SDS-PAGE 12,5% (Sambrock,1989) trong vòng 2h ở hiệu điện thế 120V, nhuộm bản gel bằng cách lắc nhẹ 40 vòng trong dung dịch Coomassie Blue (Fermentas) trong 30 phút. Rửa bản gel trong dung dịch rửa khoảng 1 giờ và quan sát biểu hiện các băng protein. Biểu hiện của gen Gus được kiểm tra bằng nhuộm trong dung dịch X- gluc. Hai ngày sau khi tiêm cấu trúc pPTN289_Gus, lá thuốc lá (đường kính 2cm) được ngâm qua đêm trong 500 µl dịch X-Gluc (1mM) ở 37oC. Rửa cồn 70% nhằm loại diệp lục và quan sát màu sắc của các mẫu lá. Biểu hiện của đoạn peptit kháng nguyên trong tế bào thực vật được kiểm tra bằng phương pháp lai miễn dịch Western blot (Sambrock,1989). Mẫu lá được nghiền trong 100 µl dung dịch 2X Lameli buffer, ly tâm 13000rpm/5phút thu dịch protein và biến tính ở nhiệt độ khoảng 95oC trong 10 phút. Sản phẩm điện di trên gel SDS-PAGE 12,5% (Sambrock,1989) trong vòng 2h ở hiệu điện thế 120V. Protein được chuyển sang màng Nitrocellulose nhờ hệ thống chuyển màng của Bio-Rad. Màng được ủ trong dung dịch blocking buffer là 5% sữa tách bơ trong dung dịch đệm PBST (0.1% Tween) trong 2h ở nhiệt độ phòng. Sau khi rửa màng 3 lần bằng PBST, màng được ủ với kháng thể đặc hiệu kháng cmyc (1:50, trong blocking buffer) trong 3h ở nhiệt độ phòng. Kháng thể này được cung cấp bởi Viện Di truyền Thực vật, IPK Gatersleben (Đức). Sau khi rửa, màng được ủ tiếp với kháng thể cộng hợp enzyme peroxidase kháng IgG chuột (1:2000, GE Healtheare) trong 1h. Màng được bổ sung dung dịch chứa cơ chất cho peroxidase ECL (GE Healtheare) sau khi đã được rửa lại ba lần bằng PBST trong 3 phút. Kết quả được hiện trên phim X-ray. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Nhân đoạn gen 27 aa Để nghiên cứu khả năng biểu hiện của đoạn gen 27 aa trước hết chúng tôi tiến hành phản ứng nhân đoạn gen này. Đoạn gen 27 aa được nhân lên trong phản ứng PCR với thành phần và chu trình nhiệt được mô tả ở phần phương pháp nghiên cứu. Một điều đặc biệt là để tăng cường biểu hiện của đoạn peptide kháng nguyên nằm trên protein vỏ của virus viêm não Nhật Bản, chúng tôi đã tiến hành thay đổi thành phần một vài bộ ba mã hóa cho đoạn peptide 27 aa này nhằm mục đích biểu hiện tốt hơn ở trên thực vật. Cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen 27aa bao gồm toàn bộ 81 nucleotide của đoạn peptide kháng nguyên. Kết quả PCR đoạn gen 27 aa được thể hiện trên hình 3.1. Hình 3.1: Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen 27aa 27aa: đoạn gen 27aa M: Marker 100bp Trên hình 3.1 cho thấy sản phẩm PCR gen 27 aa xuất hiện duy nhất một băng với kích thước ~ 90bp, đây cũng chính là kích thước của đoạn gen 27 aa trên lý thuyết. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã tiến hành phản ứng nhân đoạn gen 27 aa thành công. 200 100 bp 27aa M ~ 90bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 3.2 Nhân gen LTB và nối với gen 27 aa Để kết hợp với đoạn gen 27 aa trong quá trình nghiên cứu biểu hiện, đoạn gen LTB cũng được nhân lên bằng phản ứng PCR. Trên khuôn là plasmid chứa đoạn LTB, đoạn gen LTB được nhân lên bằng phản ứng PCR với cặp mồi 5’_LTB và 3’_LTB. Kết quả PCR gen LTB được thể hiện trên hình 3.2. Kết quả PCR gen LTB ở giếng số 1 cho thấy một băng rõ nét duy nhất. So sánh với kích thước Marker 1Kb thì đoạn gen được nhân lên có kích thước ~ 300bp, trên lý thuyết đoạn gen LTB cũng có kích thước tương ứng với đoạn gen này. Điều này thể hiện đã nhân bản thành công đoạn gen LTB từ plasmid chứa gen LTB. Với đoạn gen 27 aa và gen LTB đã nhân bản thành công, chúng tôi tiếp tục nối hai đoạn gen này bằng phản ứng PCR. Với việc gắn thêm 10 nucleotide của trình tự đoạn LTB vào mồi 3’_27aa và 10 nucleotide của trình tự đoạn gen 27 aa vào mồi 5’_LTB chúng tôi hy vọng sẽ nối được hai đoạn gen này với nhau. Phản ứng PCR này thực hiện theo chu trình nhiệt giống phản ứng nhân đoạn gen LTB và thành phần được mô tả ở phần phương pháp nhiên cứu. Kết quả được thể hiện trên hình 3.2. Hình 3.2. Điện di sản phẩm PCR nhân đoạn LTB và ghép nối 27aa_LTB M: Marker 1kb 1: đoạn LTB 2: ghép nối 27aa và LTB Giếng số 2 là sản phẩm ghép nối đoạn gen 27 aa với gen LTB. So sánh kích thước này với kích thước của đoạn LTB và với Marker 1kb cho thấy rằng 1 M 2 ~300 bp ~390 bp 250 500 bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 sản phẩm PCR nối này có kích thước ~ 390bp. Và đây cũng chính là kích thước được tính theo lý thuyết của đoạn gen nối. Như vậy phản ứng nối đoạn gen 27 aa và đoạn gen LTB thành công. Sản phẩm nối 27aa_LTB được gắn vào vector pBT và biến nạp vào tế bào khả biến E.Coli DH5α. Sau quá trình chọn lọc và nuôi khuẩn, plasmid từ những mẫu khuẩn đã nuôi được tách và cắt plasmid bằng enzyme cắt hạn chế BamHI để kiểm tra sự có mặt của đoạn 27aa_LTB. Kết quả của phản ứng cắt được thể hiện trên hình 3.3 Hình 3.3. Điện di sản phẩm cắt plasmid pBT_27aa_LTB A: Sơ đồ vector pBT B: Điện di sản phẩm cắt plasmid pBT_27aa_LTB M: Marker 1kb 1: đối chứng âm vector pBT 2, 3, 4: các dòng plasmid tái tổ hợp Đối với plasmid được nhân dòng thành công thì theo lý thuyết sau khi cắt sẽ tạo ra hai băng: một băng có kích thước 2700bp tương ứng với băng của vector pBT và một băng có kích thước ~390bp là sản phẩm nối 27aa_LTB. Trên hình 3.3 mẫu plasmid số 2 xuất hiện hai băng có kích thước khoảng 2700bp và 390bp, điều này thể hiện đúng như tính toán. Các mẫu plasmid ở giếng số 3 và 4 chỉ có một băng khoảng 2700bp, chứng tỏ đoạn gen nối chưa được gắn vào vector để nhân dòng. Giếng số 1 là đối chứng âm chỉ ~2700bp ~390bp M 1 2 3 4 B A B Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 có vector pBT nên chỉ có một băng khoảng 2700bp, điều này cho thấy đây là kết quả hợp lý. Như vậy chỉ có plasmid số 2 là được nhân dòng thành công. Để có thêm cơ sở khẳng định đoạn gen nối 27aa_LTB này được nhân dòng trong vector pBT, chúng tôi đã xác định trình tự dòng plasmid số 2. Kết quả đọc trình tự plasmid 2 (pBT_27aa_LTB_M13F) và so sánh với trình tự gốc (Doan 27aa_LTB(chuan)) bằng phương pháp MegAlign ClusterW (DNAStar) được thể hiện trên hình 3.4. Hình 3.4: Kết quả so sánh trình tự đoạn 27 aa_LTB với trình tự gốc lần Trình tự được đọc có một số điểm sai khác giữa trình tự đoạn 27aa_LTB so với trình tự gốc. Những đoạn có trình tự giống nhau được thể hiện bằng trình tự có nền màu xanh ở cả hai dòng. Trình tự khác nhau được thể hiện bằng nền trắng. Từ kết quả trình tự này chúng tôi chưa thể khẳng định đoạn được gắn vào vector pBT có phải là đoạn 27aa_LTB hay không. Do vậy chúng tôi tiếp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 tục đọc trình tự đoạn 27aa_LTB này lại một lần nữa. Dựa trên kết quả so sánh trình tự lần này vẫn có một số nucleotide của gen chưa chính xác so với trình tự gốc. Tỉ lệ số trình tự nucleotid sai khác 7%. Đây có thể là do sản phẩm PCR từ bước nhân gen 27 aa cho tới khi PCR nối đoạn 27 aa với LTB không đạt kết quả chính xác tuyệt đối như mong muốn. Qúa trình thôi gen các sản phẩm PCR (do có bước soi dưới tia cực tím) cũng có thể làm mất đi một số nucleotid trên gen và điều này làm cho trình tự không được đúng như mong muốn. Tuy nhiên từ hai lần đọc trình tự trên chúng tôi thấy sự có mặt đoạn LTB và một phần trình tự đoạn 27aa trong trình tự đó. Do vậy, chúng tôi vẫn tiến hành các thí nghiệm tiếp theo để xem khả năng biểu hiện protein của sản phẩm này. Để có nguyên liệu thiết kế vector biểu hiện cả ở thực vật và E.coli thì đoạn gen nối 27aa_LTB phải chứa hai đầu là hai điểm cắt của BamHI và NotI. Plasmid pBT_27aa_LTB được cắt bằng enzyme cắt hạn chế BamHI và NotI để tạo ra đoạn 27aa_LTB ở hai đầu chứa hai điểm cắt của BamHI và NotI (27aa_LTB/BamHI/NotI). 3.3 Thiết kế vector biểu hiện gen 27 aa_LTB trong E.Coli Để thiết kế vector biểu hiện trong E.Coli chúng tôi lựa chọn hệ thống biểu hiện của vector pET21(a+). Đây là loại vector được thiết kế thích hợp cho việc hiểu hiện gen trong E.coli. Protein được tổng hợp dưới sự điều khiển của promoter T7. Một thành phần quan trọng trong vector pET21(a+) là có một đoạn trình tự mã hoá cho 6 histidine tích điện âm, còn được gọi là đuôi His- tag. Đuôi này được gắn vào đầu C của protein ngoại lai, nhờ đó tạo điều kiện thuận lợi cho việc tinh sạch protein sau này. Chúng tôi gắn đoạn 27aa_LTB/BamHI/NotI vào vector pET21(a+) được mở vòng bằng BamHI và NotI. Sản phẩm được nhân dòng trong E.coli DH5α. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 Plasmid từ những khuẩn lạc trắng được chọn và cắt kiểm tra với enzyme BamHI và NotI. Kết quả sản phẩm cắt được thể hiện trên hình 3.5B. Hình 3.5. Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB A: Sơ đồ cấu trúc biểu hiện đoạn 27aa_LTB trong E.Coli B: Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB bằng BamHI/NotI M: Marker 1kb 1, 2: Các dòng plasmid tái tổ hợp 3: Đối chứng âm vector pET21(a+) Plasmid tái tổ hợp được cắt sẽ tạo ra hai băng, một băng là vector pET21(a+) có kích thước khoảng 5400bp và một băng khoảng 390bp là kích thước của đoạn 27aa_LTB. Trên hình 3.5 cho thấy các dòng số 1 và 2 sau khi được cắt tạo ra hai băng trong đó một băng ~5400bp và một băng ~390bp. Điều này chứng tỏ chúng tôi đã gắn được đoạn gen 27aa_LTB vào vector pET21(a+) và nhân dòng trong E.coli DH5α. Plasmid tách từ dòng số 2 được lựa chọn để biến nạp tiếp theo vào chủng biểu hiện E.coli BL21. A 17bp 1079bp 390bp BamHI NotI T7 promoter LacI 27aa LTB His-tag M 2 3 bp ~5400 bp 1 pET21_27aa_LTB B ~390bp 500 250 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 3.4 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli BL21 3.4.1 Biến nạp vector tái tổ hợp vào chủng vi khuẩn E.coli BL21 Chủng vi khuẩn E.coli BL21 được xem là phù hợp cho việc biểu hiện protein ngoại lai với vector biểu hiện pET21(a+). Plasmid tái tổ hợp pET_27aa_LTB được biến nạp vào chủng E.coli BL21 bằng phương pháp sốc nhiệt. Khuẩn lạc được chọn lọc trên môi trường chứa kháng sinh Amp. Chúng tôi chọn một khuẩn lạc trên đĩa chỉ chứa chủng E.coli BL21 để làm đối chứng âm và 3 dòng khuẩn trên đĩa được biến nạp vector tái tổ hợp. Sau khi tách plasmid và cắt bằng hai enzym là BamHI và enzym XhoI thu được kết quả trên hình 3.6. Hình 3.6: Điện di sản phẩm cắt plasmid pET21_27aa_LTB tách từ E.coli BL21 1: Đối chứng âm vector pET21(a+) 2, 3, 4: Các dòng plasmid tái tổ hợp M: Marker 1kb Tương tự như plasmid khi biến nạp vào E.coli DH5α, plasmid biến nạp thành công vào E.coli BL21 khi cắt cũng sẽ tạo ra hai băng ~5400bp và ~390bp. Kết quả trên hình 3.6 cho thấy ở dòng đối chứng âm (giếng số1) không chứa đoạn 27aa_LTB. Ở các dòng số 2, 3, 4 thì chỉ có dòng số 2 và dòng số 3 là xuất hiện đúng các băng cần tìm. Điều này cho thấy chúng tôi đã 250 6000 500 1 2 3 4 M bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 biến nạp thành công vector pET21_27aa_LTB vào trong chủng biểu hiện E.coli BL21. Đây là bước để tạo cơ sở cho việc biểu hiện gen tiếp theo. 3.4.2 Biểu hiện gen 27aa_LTB trong E.coli BL21 Các dòng E.coli BL21 mang vector tái tổ hợp được biểu hiện theo quy trình được mô tả ở phần phương pháp. Trong quá trình biểu hiện protein có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng biểu hiện ở tế bào E.coli. Tuy nhiên, các yếu tố như nồng độ IPTG, nhiệt độ lúc nuôi cấy cảm ứng và thời gian cảm ứng là quan trọng hơn cả. Chúng tôi chọn thử nồng độ IPTG khi cảm ứng là 1mM ở nhiệt độ 37oC để biểu hiện. Ngoài điều kiện về nồng độ IPTG và nhiệt độ cảm ứng thì sự biểu hiện protein còn phụ thuộc lớn vào thời gian cảm ứng. Thời gian cảm ứng được chọn thử ở các thời điểm 0h, 1h, 2h, 3h, 4h. Để có thể nhận định điều này rõ ràng hơn, chúng tôi nuôi lượng lớn và cảm ứng IPTG sau 0h và 4h như trên. Sản phẩm biểu hiện cũng được điện di tương tự như trên. Kết quả trên hình 3.7 cho thấy sản phẩm protein được biểu hiện khi cảm ứng IPTG sau 4h hiện một băng đậm nét hơn hẳn so với băng đối chứng 0h. Hình 3.7. Điện di sản phẩm biểu hiện protein ở E.coli BL21 M 1 2 ~16,5KDa 14,4 18,4 KDa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 M: Marker 1: E.Coli BL21 cảm ứng IPTG sau 0 giờ 2: E.Coli BL21(pET21_21aa_LTB) cảm ứng IPTG sau 4 giờ Đây có thể là băng protein được biểu hiện do cũng có kích thước ~16,5 KDa tương đương với kích thước của đoạn 27aa_LTB được tính trên lý thuyết so với băng đối chứng không có băng này. Tuy nhiên để khẳng định đoạn protein trên có đúng là được biểu hiện hay không và tiến tới là tinh sạch protein thì trong thời gian tới chúng tôi tiến hành lai miễn dịch với kháng thể đơn dòng đặc hiệu với 6 histidine bằng phương pháp western blot. 3.5. Biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong thực vật 3.5.1 Thiết kế vector biểu hiện gen 27aa_LTB trong thực vật Nhằm tăng cường biểu hiện trong tế bào thực vật, đoạn peptit kháng nguyên được gắn thêm trình tự KDEL, có chức năng dẫn truyền các bản mã sao tái tổ hợp vào hệ lưới nội chất. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng tiến hành gắn bổ sung cmyc vào peptide kháng nguyên. Mục đích là tạo ra đoạn tag thuận tiện cho việc phát hiện protein tái tổ hợp bằng phương pháp lai miễn dịch sau này. Vector pTRA mang đoạn KDEL và cmyc được cắt mở vòng bằng BamHI/NotI và lai với đoạn 27aa_LTB đã được cắt từ vector pBT cũng bằng enzyme trên. Để kiểm tra các plasmid tái tổ hợp chính là dòng pTRA_27aa_LTB_cmyc_KDEL mong muốn, plasmid được tách từ những khuẩn lạc sống sót trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc và cắt bằng enzyme giới hạn HindIII. Theo tính toán lý thuyết, HindIII sẽ cắt plasmid tái tổ hợp thành hai đoạn như sau: đoạn 1 dài 1100bp gồm đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL, đoạn 2 dài 2600bp là phần còn lại của vector pTRA. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Hình 3.8. Điện di sản phẩm cắt plasmid pTRA_27aa_LTB bằng HindIII 1 Đối chứng âm vector pTRA M: Marker 1kb. 2, 3: Sản phẩm cắt các dòng plasmid tái tổ hợp Độ lớn của hai đoạn cmyc và KDEL khi gắn với đoạn gen 27aa_LTB có kích thước 1100bp. Trên hình 3.10 các dòng plasmid ở giếng số 2, 3 đều có hai băng, một băng 2600 và một băng 1100bp, đây là dòng plasmid tái tổ hợp có chứa đoạn gen 27aa_LTB. Điều này cho thấy đã gắn được đoạn 27aa_LTB vào vector pTRA. Đồng nghĩa với việc đoạn 27aa_LTB được gắn thêm đoạn cmyc_KDEL trong cấu trúc vector biểu hiện đang thiết kế. Plasmid dòng số 2 mang gen biểu hiện 27aa_LTB được nuôi lượng lớn để phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.5.2 Lai đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL với vector chuyển gen pCB301 Trong vector pCB301 có chứa promoter 35S CaMV, đây là loại promoter mạnh, thích hợp để biểu hiện gen ngoại lai trong thực vật. Vì vậy chúng tôi chọn promoter này để phục vụ cho biểu hiện gen trong cây thuốc lá. Sơ đồ cấu trúc vector biểu hiện đầy đủ được thể hiện trên hình 3.11A. Để tạo vector nhị thể có khả năng biểu hiện trong tế bào thực vật, đoạn 27aa_LTB_cmyc_KDEL được cắt từ vector pTRA bằng HindIII và lai với vector pCB301 cũng được cắt bằng HindIII có khử photphatase hai đầu cắt C ~1100 bp ~2600 bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 nhằm hạn chế khả năng gắn trở lại của vector sau cắt. Sau khi được nhân lên trong E.coli DH5α, plasmid của các dòng khuẩn lạc sống sót trên môi trường chọn lọc được cắt bằng HindIII. Theo như tính toán trên lý thuyết thì vector tái tổ hợp pCB_27aa_LTB mang cấu trúc biểu hiện cmyc và KDEL sau khi cắt bằng HindIII sẽ tạo ra hai băng có kích thước lần lượt là 5400bp và 1100bp tương ứng với kích thước của vector pCB và đoạn gen được gắn vào vector đã được gắn với cmyc và KDEL. Trên hình 3.11B là kết quả điện di sản phẩm cắt vector pCB_27aa_LTB bằng HindIII. Nhận thấy tại giếng số 1 và số 2 đều có hai băng với kích thước 5400bp và 1100bp, điều này thể hiện đúng với những tính toán trên lý thuyết. Hình 3.9. Điện di sản phẩm cắt plasmid pCB_27aa_LTB bằng HindIII A: Sơ đồ cấu trúc biểu hiện đoạn 27aa_LTB trong tế bào thực vật B: Điện di sản phẩm cắt plasmid pCB_27aa_LTB bằng HindIII (1),(2): các dòng plasmid tái tổ hợp (M): Marker 1kb (3): Đối chứng âm vector pCB301 700bp 390bp AA HindIII NotI BamHI BamHI HindIII 27aa LTB cmyc KDEL 35S 1 2 M 3 ~5400 bp ~1100 bp pCB_35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL BA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Từ đây cấu trúc biểu hiện của vector đã được gắn thêm promoter 35S và hình thành một vector mang cấu trúc biểu hiện đầy đủ. Từ các kết quả trên cho thấy chúng tôi đã thiết kế được vector pCB301 mang cấu trúc biểu hiện 35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL (pCB301_35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL). 3.5.3 Biến nạp vào A. tumefaciens Vector pCB301 mang cấu trúc biểu hiện 35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL được biến nạp vào tế bào khả biến chủng A. tumefaciens bằng phương pháp xung điện. Các khuẩn lạc sống sót trên môi trường kháng sinh chọn lọc cho vi khuẩn và vector tái tổ hợp (Rifa và Kana) được chọn ngẫu nhiên để thực hiện phản ứng PCR colony. Kết quả PCR với cặp mồi đặc hiệu được thể hiện với 3 dòng khuẩn được thể hiện trên hình 3.10. Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR colony M : Marker 1kb 1 : Đối chứng (+) đoạn 27aa_LTB 2, 3, 4 : Sản phẩm PCR các dòng khuẩn được chọn trên đĩa Kết quả điện di cho thấy dòng số 3 và 4 nhân được đoạn gen khoảng 390bp tương đương với băng trên đối chứng (+), điều này cho thấy rằng có đoạn 27aa_LTB trong phản ứng. Nhưng đây cũng có thể do sản phẩm biến nạp còn lưu lại một lượng nhỏ plasmid chứa đoạn gen 27aa_LTB. Do vậy để có thêm cơ sở khẳng định những dòng PCR dương tính trên chứa vector biểu ~390bp M 1 2 3 4 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 hiện thì từ những dòng này chúng tôi tiến hành tách plasmid và PCR plasmid với cặp mồi đặc hiệu để kiểm tra thêm một lần nữa. Hình 3.11 cho thấy các mẫu plasmid số 1 và 2 được PCR đều xuất hiện băng có kích thước ~390bp tương đương với đối chứng (+) ở giếng số 3, điều này chứng tỏ sự có mặt của đoạn 27aa_LTB trong plasmid đã tách. Hình 3.11. Kết quả PCR từ plasmid các dòng A. tumefaciens M: Marker 1, 2 : Sản phẩm PCR từ plasmid tách từ A. tumefaciens 3: Đối chứng (+)27aa_LTB Từ kết quả trên vector mang cấu trúc biểu hiện đã vào được A. tumefaciens. Chủng A. tumefaciens mang vector biểu hiện pCB_35S_27aa_LTB_cmyc_KDEL này sẽ được chuyển vào cây để tiến hành biểu hiện gen. 3.5.4 Biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong cây thuốc lá Từ dòng A. tumefaciens mang vector tái tổ hợp, chúng tôi tiến hành biểu hiện tạm thời gen 27aa_LTB trong cây thuốc lá SNN theo sơ đồ sau: M M 1 2 3 ~390bp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Hình 3.12. Sơ đồ ảnh các bước Agro- infiltration 1. Cấy vạch chủng A.tumefaciens mang vector tái tổ hợp 2. Nuôi khuẩn lượng nhỏ(5ml) 3. Nuôi khuẩn lượng lớn (50ml) 4. Dịch khuẩn và dịch huyền phù khi OD~1 .Cây thuốc lá SNN 5. Tiêm dịch huyền phù vào lá thuốc lá Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Để nhận biết được hiệu quả của phương pháp Agro-infiltration ra sao thì biểu hiện gen Gus trong vector pPNT289_Gus biểu hiện song song với gen 27aa_LTB. Gen Gus mã hoá enzyme β-glucuronidase có khả năng phân huỷ cơ chất glucuronidase thành sản phẩm tạo màu xanh lam dễ nhận biết. Sau hai ngày, thu mẫu lá được tiêm A. tumefaciens mang gen Gus được nhuộm bởi X- Gluc đã xuất hiện những đốm màu xanh lam đặc trưng, chứng tỏ sự có mặt của gen Gus trong lá thuốc lá (hình 3.13). Hình 3.13. Mẫu lá tiêm gen Gus được nhuộm bởi X-Gluc Kết quả biểu hiện tạm thời của gen Gus trên đã thể hiện phương pháp Agro-inflitration trong lại hiệu quả tốt trong việc biểu hiện tạm thời gen. Do vậy sự biểu hiện tạm thời đoạn 27aa_LTB cũng được tiến hành bằng một phương pháp hiệu quả nhất định. Trong thời gian tới chúng tôi sẽ tiếp tục kiểm tra sự biểu hiện tạm thời của peptit kháng nguyên 27aa và LTB trong cây thuốc lá này. . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu như trên chúng tôi rút ra được kết luận như sau: 1. Nhân được đoạn 27aa từ virut VNNB, đoạn LTB từ plasmid chứa LTB và ghép nối 2 đoạn 2. Thiết kế vector pET21_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên 27 aa và LTB trong E.coli 3. Thiết kế vector pCB_27aa_LTB biểu hiện đoạn peptit kháng nguyên 27 aa và LTB trong thực vật 4. Biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 KIẾN NGHỊ 1. Tiếp tục biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào thực vật 2. Tinh sạch protein tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và thực vật 3. Thử khả năng gây miễn dịch của protein tái tổ hợp Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Đặng Thị Hương (2007), Biểu hiện các kháng nguyên tái tổ hợp PREM và E của virut viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis virus) trong E.Coli và thực vật. Luận văn thạc sĩ. Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội. 2. Huỳnh Phương Liên và cộng sự (2006), Nghiên cứu thay thế chủng Nakayama bằng Beijing-1 trong sản xuất văcxin viêm não Nhật Bản, Đề tài cấp nhà nước của Viện vệ sinh dịch tễ trung ương. 3. Lê Đức Hinh, Nguyễn Chương (2001), Viêm não Nhật Bản, Thần kinh học trẻ em, Nhà xuất bản Y học, trang 177-190. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 4. Buxchen-Osmond C (2003), “Flaviviridae. In: ICTVdB - The Universal Virus Database, version 3. ICTVdB Management, The Earth Institute, Biosphere 2 Center, Columbia University, Oracle, AZ, USA” 5. Buescher EL, Scherer WF (1959), “Ecologic studies of Japanese encephalitis virus in Japan. IX. Epidemiologic correlations and conclusions”, Am. J. Trop pp.19-22. 6. Burke DS, Leake CJ (1998), “Japanese Encephalitis ” Boca Raton, FL: CRC Press, pp.126. 7. Burke DS, Monath TP (2001), “Flaviviruses”. In: Knipe DM, Howley PM, eds. Fields'virology. 4th ed. Vol. 1. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, pp.1043-1126 8. Chambers TJ, Hahn CS, Galler R, Rice CM (1990), Flavivirus genome organisation, expression and replication. Annu Rev Microbiol 44,pp.649–688 9. Chen Y, Maguire T, Hileman RE, Fromm JR, Esko JD, Linhardt RJ, Marks RM (1997), “Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulphate” Nat Med 3, pp. 866–871 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 10. F.-F.Ge, Y.-F.Qiu, Y.- W.Yang, and P.-Y.Chen(2006), “An hsp70 fusion protein vaccine potentiat es the immune res onse against Japanese encephalitis virus”, Virology, pp 125-135 11. Field trial of innactivate JE Beijing vaccine in Japan. WHO working group on Japanese encephalitis vaccines. Osaka. 12. Gorman BM, Leer JR, Filippich C, et al. “Plaquing and neutralization of arboviruses in the PS-EK line of cells” Aust J Med Technol 1975; 6: 65-71. 13. Hanna JN, Ritchie SA, Phillips DA, et al (1996) “An outbreak of JE in the Torres Strait”, Australia 1995. Med. J. Aust, pp. 256–260 14. Hase T, Dubois DR, Summers PL (1990) “Comparative study of mouse brains infected with Japanese encephalitis virus by intracerebral or intraperitoneal inoculation” Int J Exp Path, pp, 857-869. 15. Hase T, Summers PL, Cohen WH (1989) “A comparative study of entry modes into C6/36 cells by Semliki Forest and Japanese encephalitis viruses”. Arch Virol. pp. 101-104. 16. Hase T, Summers PL, Dubois DR (1990) “Ultra structure changes of mouse brain neurons infected with Japanese encephalitis virus”. Int J Exp Pathol. pp. 493–505. 17. Hayashi M “Encephalitis epidemica Japonica”. Allg Z Psychiat. 95:55–58 18. Heinz FX, Allison SL (2001) “The machinery for flavivirus fusion with host cell membranes”. Curr Opin Microbiol 4.pp. 450–455. 19. Hennessy S, Liu Z, Tsai TF, Liu HL, Wu TX., Yu HJ, Liu QM, et al(1996) “Effectiveness of live-attenuated Japanese encephalitis vaccine (SA14-14-2): a casecontrol study”. Lancet 347.pp. 1583-1586. 20. Hiroyama T. “Epidemiology of Japanese encephalitis 1962”. (in Japanese) Sai Ching Iga Ku. pp.1272-1280. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 21. Morb. Mortal.Wkly (1993), “Inactivated Japanese encephalitis virus vaccine. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices”, pp.1–14. 22. Kang TJ, Han SC, Jang MO, Kang KH, Jang YS, Yang MS (2004) “Enhanced expression of B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin in tobacco by optimization of coding sequence”. Appl Biochem Biotechnol .pp.175-187. 23. Kang TJ, Loc NH, Jang MO, Jang YS, Kim YS, Seo JE, Yang MS (2003). “Expression of the B subunit of E. coli heat-labile enterotoxin in the chloroplasts of plants and its characterization”. Transgenic Res, pp. 683-691. 24. Kim TG, Kim MY, Kim BG, Kang TJ, Kim YS, Jang YS (2007), “Synthesis and assembly of Escherichia coli heat-labile enterotoxin B subunit in transgenic lettuce (Lactuca sativa L.)”. Protein Expr Purif , pp. 22-27 25. Kitano T, Suzuki K, and Yamaguchi T (1974), Morphological, Chemical, and Biological Characterization of Japanese Encephalitis Virus Virion and Its Hemagglutinin. J. Virol, pp. 631-639. 26. Konishi E, Pincus S, Fonseca BA, Shope RE, Paoletti E, and Mason PW (1991), “Comparison of protective immunity elicited by recombinant vaccinia viruses that synthesize E or NS1 of Japanese encephalitis virus”. Virol, pp. 401-410. 27. Konishi E, Pincus S, Paoletti E, Shope RE, Burrage T and Mason PW (1992), “Mice immunized with a subviral particle containing Japanese encephalitis virus prM/M and E proteins are protected from lethal JEV infection” Virol, pp.714-720. 28. Lin CW and Wu SC (2003), “A functional epitope determinant on Domain III of the Japanese encephalitis virus envelope protein interacted with neutralizing-antibody combining sites”. J Virol, pp. 2600-2606. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 29. Mandl CW, Heinz FX, Kunz C (1988), “Sequence of the structural proteins of tickborne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses”. Virol, pp.197-205. 30. McAda PC, Manson PW, Schmaljohm CS, et al (1987), “Partial sequence of the Japanese encephalitis virus genome”. Virol, pp. 348-360. 31. McMinn PC (1997) “The molecular basic of virulence of the encephalitogenic flaviviruses” J. Gen. Virol, pp. 2711-2722. 32. Miyake M (1964), “The pathology of Japanese encephalitis”. WHO Bull 30, pp. 153–160. 33. Monath TP, Tsai TF(2002) “Flaviviruses”. In: Richman DD, Whitley RJ, Hayden FG, eds. Clinical virology. 2nd ed. Washington, D.C: ASM Press, 2002, pp.1097-1151. 34. Murphy FA (1980), “Togavirus morphology and morphogenesis” In: Schlesinger RW,eds. The Togaviruses: Biology, Structure, Replication. New York, pp. 241–316. 35. Porterfield, J S (1980), “Antigenic characteristics and classification of Togaviridae”, See Ref, pp.13-46. 36. Pyke AT, Williams DT, Nisbet DJ, van den Hurk AF, Taylor CT, et al (2001), ”The appearance of a second genotype of Japanese encephalitis virus in the Australasian region”. Am J TropMed Hyg, pp. 747–753. 37. Rey FA, Heinz FX, Mandl C, Kunz C, Harrison C, (1995), “The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution”. Nature 375, pp.291–298. 38. Rice CM, Lindenbach BD, (2001), “Flaviviridae: the viruses and their replication”, pp.991-1042. In D. M. Knipe and P. M. Howley (ed.), Fields virology, 4th ed., vol. I.Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48 39. Rice CM, Strauss EG and Strauss JH (1986), “Structure of the Flavivirus genome” In The Togaviridae and Flaviviridae, pp. 279-326. 40. Russell PK, Brandt WA, Dalrymple JM (1980), “Chemical and antigenic structure of flaviviruses” In: Schlesinger RW, ed. The togaviruses. New York: Academic Press, pp. 503–29. 41. Russell PK, Brandt WE, Dalrymple JM, (1980), “Chemical and antigenic structure of flaviviruses”. In: Schlesinger RW, eds. The Togaviruses: Biology, Structure Replication, pp.503–52. 42. Solomon T, Dung NM, Kneen R, Gainsborough M, Vaughn DW, Khanh VT (2000), “Japanese encephalitis”, J Neurol Neurosurg Psychiatry 68, pp. 405–415. 43. Stadler K, Allison SL, Schalich J, Heinz FX, (1997), “Proteolytic activation of tickborne encephalitis virus by furin”. J Virol 71, pp. 8475– 8481. 44. Sumiyoshi H, Mori C, Fuke I, Morita K, Kuhara S, Kondou J, Kikuchi Y,Nagamatu H. and Igarashi A, (1987), “Complete nucleotide sequence of the Japanese encephalitis virus genome RNA”. Virol. 161, pp.497-510. 45. Thisyakora U, Thisyakora C, Wilda H, (1995), “Japanese encephalitis and international travel”. J. Travel. Med. 2, pp.37-40. 46. Thongcharoen P, (1989), ”Japanese encephalitis-virus encephalitis: an overview”. Southeast Asian J Trop Med Public Health. 20, pp. 59–73. 47. Tiroumourougane SV, Raghava P, Srinivasan S (2002), “Japanese viral encephalitis” Postgrad Med J. 78, pp. 205–215. 48. Trent DW, Naeve CW (1980), “Biochemistry and replication". In: Monath T, ed. St.Louis Encephalitis. Washington, DC: American Public Health Association, pp.159–199. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49 49. Trent DW, Naeve CW, (1980), “Biochemistry and replication”. See Ref. 108a, pp.159-199. 50. Tsai TF, Chang GW, Yu YX (1999), “Japanese encephalitis vaccines” In Plotkin SA and Orenstein WA, eds., Vaccines - 3rd edition, WB Saunders, Inc., Philadelphia, PA, pp. 672-710. 51. Tsai TF, Yu YX, Jia LL, Putvatana R, Zhang R, Wang S, Halstead SB (1998), “Immunogenicity of live attenuated SA 14-14-2 Japanese encephalitis vaccine a comparison of 1- and 3- months immunization schedules”. J Infect Dis,117(1), pp.221-224. 52. Vaughn DW, Hoke CH (1992), “The epidemiology of Japanese encephalitis: prospects for prevention” Epidemiol Rev 14,pp. 197–221. 53. Wengler G, Wengler G (1989), “Cellassociated West Nile flavivirus is covered with E+pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release”. J. Virol. 63,pp.21- 26