Tài liệu Luận văn Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của người trong vi khuẩn echerichia coli: ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------------------------------------------
HOÀNG PHÚ HIỆP
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI
TRONG VI KHUẨN Echerichia coli
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên – 2008
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------------------------------------------
HOÀNG PHÚ HIỆP
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI
TRONG VI KHUẨN Echerichia coli
Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số : 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS. LÊ THỊ THU HIỀN
Thái Nguyên - 2008
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
Bảng viết tắt ............................................................................................................. 1
Danh mục các hình ................................................................................................... 2
Mở đầu .............................
65 trang |
Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1298 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Luận văn Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của người trong vi khuẩn echerichia coli, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------------------------------------------
HOÀNG PHÚ HIỆP
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI
TRONG VI KHUẨN Echerichia coli
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên – 2008
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
--------------------------------------------
HOÀNG PHÚ HIỆP
NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
CHẤT HOẠT HÓA PLASMINOGEN MÔ CỦA NGƯỜI
TRONG VI KHUẨN Echerichia coli
Chuyên ngành : Di truyền học
Mã số : 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
TS. LÊ THỊ THU HIỀN
Thái Nguyên - 2008
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
Bảng viết tắt ............................................................................................................. 1
Danh mục các hình ................................................................................................... 2
Mở đầu .................................................................................................................... 3
Chương 1: Tổng quan tài liệu ............................................................................... 5
1.1. Bệnh tim mạch ............................................................................................. 5
1.2. Chất hoạt hóa plasminogen.......................................................................... 5
1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô người ......................................................... 9
1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm
tan máu đông ............................................................................................. 12
1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô
người ......................................................................................................... 14
1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ............................................................... 18
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu ................................................ 19
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................ 19
2.1.1. Vật liệu ..................................................................................................... 19
2.1.2. Hóa chất .................................................................................................... 20
2.1.3. Thiết bị ...................................................................................................... 20
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 20
2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose .................................................................. 20
2.2.2. Điện di protein trên gel polyacrylamide ................................................... 21
2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain
Reaction - PCR) ........................................................................................ 22
2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế ............................................................ 23
2.2.5. Ghép nối DNA .......................................................................................... 23
2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng
phương pháp sốc nhiệt .............................................................................. 24
2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli ............................................................ 24
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli ............................................. 24
2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid ...................................................... 25
2.2.8. Xác định trình tự gen ................................................................................ 26
2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli ................................................... 27
Chương 3: Kết quả và thảo luận ........................................................................... 28
3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA................................. 28
3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR ............................... 28
3.1.2. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và
pET21a(+) ..................................................................................................... 30
3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hóa h-tPA bằng enzyme
hạn chế .......................................................................................................... 30
3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế ..................... 31
3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hóa h-tPA vào vector pGEX6p1 và
pET21a(+) ..................................................................................................... 32
3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hóa h-tPA ................. 32
3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phương
pháp sốc nhiệt ................................................................................................ 32
3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá
h-tPA ............................................................................................................. 33
3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hóa h-tPA ............................... 37
3.2. Biểu hiện gen ............................................................................................... 43
3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp ........................................................... 43
3.2.2. Kiểm tra protein bằng phương pháp điện di trên SDS-PAGE ................. 43
Kết luận và đề nghị ................................................................................................ 47
Tài liệu tham khảo ................................................................................................. 48
Phụ lục ..................................................................................................................... 54
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1
BẢNG VIẾT TẮT
Amp Ampicillin kb Kilo base
Bp Cặp bazơ (Base pair) LB Luria – Bertani
CIAP
Calf Intestinal Alkaline
Phosphatase
P
Vùng serine protease (Serine
protease)
ddNTP
Dideoxynucleoside
triphosphate
PA
Chất hoạt hóa plasmingen
(Plasminogen activator)
DNA Deoxyribonucleic acid PAI
Chất ức chế chất hoạt hóa
plasminogen (Plasminogen
activator inhibitor)
dNTP
Deoxynucleoside
triphosphate
PCR
Phản ứng dây chuyền
polymerase (Polymerase Chain
Reaction)
E. coli Escherichia coli rDNA
DNA tái tổ hợp (Recombinant
DNA)
EDTA
Ethylene Diamine Tetra-
acetic Acid
RNA Ribonucleic acid
EGF
Vùng nhân tố sinh trưởng
biểu bì (Epidermal growth
factor region)
RNase Ribonuclease
EtBr Ethidium bromide scuPA
Chất hoạt hóa urokinase sợi đơn
(single chain urokinase - type
plasminogen activator)
F Vùng “ngón tay” (Finger) SDS Sodium Dodecyl Sulphate
GST Glutathione S-transferase SK Streptokiase
h- tPA
Chất hoạt hóa plasminogen
mô người (Human tissue
plasminogen activator)
TAE Tris-acetate- EDTA
IPTG Isopropyl b-D thiogalactoside tPA
Chất hoạt hóa plasminogen mô
(Tissue - type plasminogen
activator)
K1 Vùng Kringle 1 uPA
Chất hoạt hóa urokinase
(Urokinase - type plasminogen
activator)
K2 Vùng Kringle 2 v/p Vòng/ phút
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Tên hình Trang
1.1 Cấu trúc của tPA và uPA 7
1.2 Các vùng của tPA 10
1.3 Cấu trúc h-tPA 11
1.4 Quá trình phân hủy huyết khối 13
1.5 Con đường phân giải tơ máu (Fibrin) 13
2.1 Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1 19
3.1 Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA 30
3.2
Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện
bằng enzyme hạn chế
32
3.3
Chọn dòng pGEX6p1
mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA)
34
3.4
Chọn dòng pET21a(+)
mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA)
35
3.5
Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA
bằng enzyme hạn chế
36
3.6
Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA
bằng kỹ thuật PCR
37
3.7
So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h-
tPA và pET21a(+)/h-tPA với NM_000930
42
3.8 Kiểm tra kiểm tra protein h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA p3 44
3.9 Kiểm tra protein h-tPA trong pET21a(+)/h-tPA p1 45
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Formatted: Font: Bold
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Bắt đầu từ những năm đầu thập niên 1970, các thành tựu về sinh học phân tử
và kỹ thuật di truyền giúp chúng ta có thể hiểu rõ bản chất phân tử của các bệnh
xuất hiện trên động vật, thực vật và đặc biệt là trên người. Giáo sư Paul Berg thuộc
trường đại học Stanford (Hoa Kỳ), người được nhận giải Nobel hóa học năm 1980,
là người đầu tiên tạo ra DNA tái tổ hợp (recombinant DNA- rDNA) vào năm 1972.
Kể từ đó đến nay, công nghệ rDNA và những ứng dụng trong ngành công nghiệp
dược phẩm đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của các công ty công nghệ sinh học
và các dược phẩm tạo ra nhờ công nghệ rDNA (dược phẩm sinh học) nhằm phục vụ
và bảo vệ sức khỏe con người [44]. Trong lĩnh vực nghiên cứu tạo các loại dược
phẩm làm tan các cục máu đông để điều trị huyết khối và các rối loạn huyết khối tắc
mạch, cuối những năm 1980, thông qua công nghệ rDNA, các nhà khoa học đã
nghiên cứu và tạo ra một số loại dược phẩm sinh học là các protein tái tổ hợp có khả
năng làm tan các cục máu đông “đặc hiệu”. Một trong những protein đó, chất hoạt
hóa plasminogen mô của người (human tissue plasminogen activator- h-tPA) đã
được nhiều nhóm tác giả trên thế giới nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y
dược. DNA bổ sung (complementary DNA- cDNA) của gen mã hóa h-tPA đã được
phân lập, tạo dòng, biểu hiện ở nhiều loại tế bào như tế bào trứng chuột đồng
(Chinese hamster ovary- CHO), tế bào thận chuột chưa trưởng thành... và sản xuất
dưới dạng dược phẩm tái tổ hợp [39].
Ở Việt Nam, nghiên cứu tạo các dược phẩm bằng công nghệ sinh học đang
bắt đầu được tiếp cận. Việc nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa chất hoạt hóa
plasminogen mô trong vi khuẩn Escherichia coli tiến tới sản xuất dược phẩm sinh
học phục vụ bảo vệ sức khỏe con người có ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao. Xuất
phát từ các lý do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã
hóa chất hoạt hóa plasminogen mô của ngƣời trong vi khuẩn Escherichia coli”.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4
2. Mục tiêu nghiên cứu
Sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử và công nghệ rDNA để thiết kế vector
và biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli nhằm tiến tới sản xuất protein
h-tPA tái tổ hợp có giá trị sử dụng trong y dược.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo dòng gen mã hóa h-tPA trong các vector biểu hiện thích hợp.
- Biểu hiện gen mã hóa h-tPA trong vi khuẩn E. coli.
4. Những điểm mới của đề tài
Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở khoa học để tiếp tục nghiên cứu nhằm
tiến tới ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô của người - một dược
phẩm công nghệ sinh học có giá trị hoàn toàn chưa được nghiên cứu và sản xuất ở
nước ta.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh tim mạch
Bệnh tim mạch là các bệnh liên quan đến những rối loạn ảnh hưởng tới tim
và các mạch máu bao gồm bệnh mạch vành, bệnh mạch máu não, bệnh mạch máu
ngoại biên và tăng huyết áp. Bệnh tim mạch là nguyên nhân hàng đầu gây tử vong
trên thế giới. Mỗi năm, bệnh tim mạch là nguyên nhân gây tử vong cho 17,5 triệu
người và dự đoán sẽ có khoảng 25 triệu người bị bệnh tim mạch tử vong vào năm
2020. Bệnh tim mạch cũng được dự đoán sẽ là nguyên nhân lớn nhất gây tàn phế
cho người vào năm 2020. Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cứ mỗi 2 giây có 1
người chết vì bệnh tim mạch. Cứ mỗi 5 giây thì có 1 trường hợp nhồi máu cơ tim và
mỗi 6 giây thì có một trường hợp đột quỵ. Hiện có đến 300 yếu tố nguy cơ kết hợp
với bệnh mạch vành và đột quỵ sẽ dẫn đến bệnh tim mạch [60].
Một trong những nguyên nhân sinh lý quan trọng dẫn tới các bệnh tim mạch
là do thành mạch bị tổn thương, dẫn tới hình thành huyết khối bên trong mạch máu.
Do vậy, điều trị huyết khối là một trong những phương pháp hiệu quả giúp làm
giảm nguy cơ tử vong và các biến chứng ở các bệnh nhân mắc bệnh tim mạch, đặc
biệt là ở các bệnh nhân đột quỵ và nghẽn mạch máu.
Trong phác đồ điều trị huyết khối và bệnh tim mạch, chất hoạt hóa
plasminogen (plasminogen activator, PA) đóng vai trò quan trọng và được xem là
thuốc điều trị có hiệu quả cao. Chất hoạt hóa plasmminogen có vai trò biến đổi
plasminogen thành plasmin- là chất phân hủy huyết khối (thrombolytic). Plasmin
sau đó sẽ hòa tan dần fibrin và fibrinogen từ đó làm tan huyết khối. Bằng công nghệ
gen, các PA đã được nghiên cứu và đưa vào sản xuất nhằm tạo ra thuốc đặc hiệu
trong điều trị huyết khối và bệnh tim mạch. Tuy nhiên, do quy trình sản xuất phức
tạp nên giá thành của sản phẩm này khá cao.
1.2. Chất hoạt hóa plasminogen
Chất hoạt hóa plasminogen có tác dụng quan trọng trong quá trình làm tan
khối máu đông. Chất hoạt hóa plasminogen là nhóm enzyme duy nhất chuyển chất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6
xúc tác plasminogen từ dạng bất hoạt sang dạng hoạt động - plasmin. Vì đặc tính
này, một vài loại plasminogen khác nhau đã được sử dụng nhằm điều trị các chứng
bệnh tim mạch. Chất hoạt hóa plasminogen gồm bốn nhóm chính. Một nhóm là chất
hoạt hóa plasminogen urokinase (urokinase- type plasminogen activator, uPA). Chất
này có liên quan đến kháng thể urokinase và không kết hợp với tơ máu. Bởi vậy
chất hoạt hóa này được cho rằng có thể có liên quan đến hoạt hóa plasminogen
trong pha lỏng của huyết thanh. Loại thứ hai là chất hoạt hóa plasminogen mô
(tissue-type plasminogen activator, tPA), có khả năng tương tác với kháng thể chất
hoạt hóa mô và kết hợp với tơ máu. Loại thứ ba là streptokinase (SK). SK hoạt hóa
plasminogen bằng cơ chế trực tiếp. Cuối cùng là enzyme phân hủy tơ máu
(fibrinolysis) được giải phóng nhanh khi huyết tương bị tổn thương và giải phóng
một số chất hoạt hóa vào thành mạch [18], [47].
Chất hoạt hóa plasminogen urokinase là sản phẩm chính của thận, tồn tại
dưới dạng phân tử chất hoạt hóa urokinase sợi đơn (single chain urokinase - type
plasminogen activator - scuPA) không hoạt động. Chất hoạt hóa plasminogen
urokinase được phân lập có hai dạng: dạng có trọng lượng phân tử cao (khối lượng
54,7kDa) và dạng có trọng lượng phân tử thấp (khối lượng 31,5kDa) [18]. Chúng có
hai chức năng: chức năng chính là tham gia trong phân giải protein mô liên kết và
chức năng thứ hai được biết đến với vai trò điều khiển của tPA như chất hoạt động
sinh lý trong máu [30]. Sự hoạt hóa của scuPA do sự phân hủy xung quanh bởi
plasmin trong cấu trúc hai sợi dẫn tới việc tăng hoạt tính của plasminogen lên.
Thông qua quá trình này, một số lượng nhỏ của plasmin có thể xúc tác sản phẩm
uPA hoạt động, ảnh hưởng tới hình dạng của nhiều plasmin. Chất hoạt hóa
plasminogen urokinase có thể chỉ hoạt hóa plasminogen với sự có mặt của fibrin.
Tuy nhiên, nó sẽ không kết hợp với fibrin và sẽ không phân hủy fibrin. Trong huyết
tương người, nồng độ kháng thể uPA từ 2 đến 7ng/ml. Giá trị cao nhất thường được
tìm thấy trong bệnh nhân gan mãn tính và ung thư gan [9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7
Gen mã hóa tPA và protein này đã được nhiều nhóm tác giả trên thế giới
nghiên cứu và đưa vào ứng dụng trong y- dược [31], [40]. Những nghiên cứu gần
đây cho thấy tPA còn đóng vai trò quan trọng trong hệ thống thần kinh [49], [56]. Ở
người và các động vật khác, tPA đóng vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hủy
fibrin [53], [54]. Đối với các trường hợp mắc bệnh huyết khối, sau khi tPA được
đưa vào cơ thể, dưới tác dụng của tPA, plasmin sẽ được tạo ra chủ yếu tại vị trí hình
thành huyết khối, nên tránh được tình trạng phân hủy ở những vùng khác trong cơ
thể, tuy nhiên hoạt tính chọn lọc này chỉ là tương đối [21].
Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminogen ngoại sinh có khối lượng
47kDa. Hiện nay, Streptokinase được thu chủ yếu từ nuôi cấy vi khuẩn Streptococci
B-hemolytic. Streptokinase có chức năng tương tự với plasminogen ở người. Chức
năng chính là phụ thêm vào thay đổi cấu trúc trong phân tử plasminogen, làm trung
tâm hoạt động của phân tử plasminogen này hoạt động để hoạt hóa phân tử
plasminogen thứ hai bằng cách cắt phân tử plasminogen thứ hai tại vị trí Agr560-
Hình 1.1. Cấu trúc của tPA và uPA [9]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8
Val561. Tiếp theo, plasminogen trong hỗn hợp Streptokinase- plasminogen sẽ được
chuyển thành plasmin, cuối cùng, hỗn hợp tách nhau hình thành dạng Streptokinase
và plasmin tự do. Cả hai loại của hỗn hợp Streptokinase đều ảnh hưởng ngang nhau
tới sự hoạt hóa của plasminogen:
Streptokinase + plasminogen → Streptokinase-plasminogen
Streptokinase- plasminogen + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin
Streptokinase- plasmin + plasminogen → streptokinase- plasmin + plasmin
Streptokinase là một chất hoạt hóa plasminigen không đặc hiệu. Việc dùng
Streptokinase dẫn tới tình trạng phân hủy hệ thống. Một tác dụng không mong
muốn của việc dùng Streptokinase là gây cảm ứng việc đáp ứng của chất trợ đông
thông qua việc tăng giải phóng thrombin. Mặc dù đáp ứng trợ đông xảy ra với tất cả
các thuốc tan huyết khối, nhưng các số liệu in vitro cho thấy tác dụng này lớn nhất
với Streptokinase.
Tương ứng với các nhóm hoạt hóa plasminogen, hiện nay trên thị trường có 5
loại thuốc tan huyết khối được phép lưu hành: Alteplase tương ứng với chất hoạt hóa
plasminogen mô, có nguồn gốc từ DNA tái tổ hợp do hãng Genentech sản xuất [8];
Streptase tương ứng với streptokinase có nguồn gốc từ cầu khuẩn tan máu beta được sản
xuất bởi hãng Aventis Pharma; Urokinase biết đến với tên là Abbokinase được sản
xuất bởi hãng ImaRx Therapeutics, urokinase có nguồn gốc từ chất chiết tế bào thận
người; phức chất hoạt hóa Streptokinase plasminogen anisoylat hóa (APSAC); và
Tenecteplase, một dạng biến đổi của chất hóa hóa plasminogen mô người gắn với fibrin
và làm biến đổi plasminogen thành plasmin. Tất cả các dạng thuốc này được dùng để
điều trị nhồi máu cơ tim, huyết khối tĩnh mạch sâu, nghẽn mạch phổi, tái thông mạch.
Tuy nhiên, tùy từng trường hợp, các loại thuốc khác nhau được sử dụng để điều trị
một cách hiệu quả và ít tốn kém nhất. Ví dụ, Streptase là thuốc rẻ nhất nhưng chỉ
được dùng cho những trường hợp đặc biệt vì nhiều lý do như thiếu tính đặc hiệu với
sợi huyết, hiệu quả thấp, thời gian dùng thuốc kéo dài... Còn Alteplase được sử
dụng nhiều hơn trong điều trị nghẽn động mạch phổi lớn.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9
1.3. Chất hoạt hóa plasminogen mô ngƣời
Chất hoạt hóa plasminogen mô người là dạng chủ yếu của dạng hoạt động
nội sinh của plasminogen trong máu. Nó được tạo ra dưới dạng phân tử sợi đơn ở tế
bào thành mạch trong và được giữ trong huyết tương một cách liên tục hoặc giải
thoát một cách nhanh chóng bằng phản ứng kích thích của chất cảm ứng của tế bào
thành mạch máu [39]. Dạng hoạt động plasminogen được sử dụng làm tan huyết
khối về phương diện lâm sàng cho các quá trình điều trị tắc mạch phổi và chứng
nhồi máu cơ tim [9], [27], [46]. Không giống như nhiều protease serine khác, h-tPA
hoạt động dưới dạng sợi đơn, đặc biệt khi có mặt của fibrin hoặc fibrinogen.
Ở người, gen mã hóa h-tPA là một gen đơn bản có vị trí ở 8p12 nằm trên
nhiễm sắc thể số 8 [20]. Ở chuột, gen này cũng nằm trên nhiễm sắc thể số 8 và có vị
trí 24p22. Cấu trúc và chức năng của gen mã hóa cho h-tPA được xác định bằng kết
hợp nhân bản invitro của DNA hồng cầu từ những cá thể riêng biệt và phân lập
được các dòng từ thư viện gen người. Những dòng này được xác định bằng bản đồ
enzyme hạn chế, lai Southern blot và giải trình tự DNA [13], [23]. Kết quả xác định
và phân tích trình tự gen cho thấy, gen mã hóa chất hoạt hóa plasminogen có chiều
dài 36.594bp, bao gồm 32.720bp từ vị trí khởi đầu đến vị trí đuôi polyadenyl, có
thêm khoảng 353 và 344 bp của hai đầu 5’ và 3’, mười ba intron xen giữa mười bốn
exon, kích thước trung bình của các exon là 914bp, trong khi của intron từ 111 đến
14.257bp [20], [37 ], [41].
Thành phần base và tần suất dinucleotide trong mRNA của gen như sau:
A:26,4%; C:23,6%; G:25,3% và T:24,8% và trong trình tự ngược: A:24,8%;
C:26,3%; G:22,1% và T:26,9%. Trình tự cặp nucleotide như sau: AA(7,5%),
AC(5,2%), AG(8,1%), AT(5,6%), CA(7,7%), CC(6,8%), CG(1,9%), CT(7,3%),
GA(6,8%), GC(5,8%), GG(7,6%), GT(5,1%), TA(4,3%), TC(5,8%), TG(7,7%) và
TT(6,9%) [20].
Các kết quả phân tích cho thấy cấu trúc protein h-tPA bao gồm 5 vùng thuộc
hai chuỗi: chuỗi nặng của h-tPA (hay còn gọi chuỗi A, có khối lượng 39.000 kDa)
được xác định ở đầu amino, còn chuỗi nhẹ (hay còn gọi chuỗi B, khối lượng 33.000
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10
kDa) ở đầu carboxyl. Trong đó, chuỗi nặng chứa ba vùng: vùng “ngón tay” (F -
vùng finger ) gồm 47 amino acid từ vị trí acid amin thứ 4 - 50, người ta cũng thấy
cấu trúc tương tự trong fibronectin; vùng nhân tố sinh trưởng biểu bì (epidermal
growth factor region - EGF) từ amino acid có vị trí 51 - 87; vùng thứ ba bao gồm
hai cấu trúc kringle, vùng kringle 1 (K1 - kringle one region) từ amino acid 88 -
176, vùng kringle 2 (K2 - kingle two region) từ vị trí amino acid 177 đến 262. Các
cấu trúc đó cũng được tìm thấy trong prothrombin, plasminogen, urokinase và nhân
tố XII [14], [19], [20], [23], [38], [45], [52]. Chuỗi nhẹ của h-tPA, chứa vị trí tâm
hoạt động (gồm năm exon được ngăn cách bởi bốn intron), vùng serine protease (P -
serine protease domain) có vị trí từ amino acid 267 đến 527 và tương đồng với
chuỗi xúc tác của enzyme phân hủy protein serine khác [38], [45].
Các vùng này có thể nằm kế tiếp nhau hoặc được ngăn cách với nhau bởi các
vùng nối ngắn. Các vùng này góp phần tạo nên các đặc tính sinh học đặc hiệu của cả
phân tử. Vùng F đóng vai trò chủ yếu tạo nên tính ái lực cao với tơ máu. Hoạt tính này
thể hiện tính đặc hiệu cao của h-tPA trong quá trình phân giải các khối máu đông giàu
tơ máu. Vùng EGF thể hiện hoạt tính gắn h-tPA với bề mặt tế bào, chức năng này được
Hình1.2. Các vùng của tPA
Formatted: Font: 13 pt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11
bảo thủ trong rất nhiều protein tPA ở động vật có vú. Vùng EGF chứa 6 cysteine, đây
là thành phần tạo nên cầu disulfide trong domain. Vùng kringle trong protease serine
rất quan trọng trong mối tương tác protein-protein trong quá trình hoạt hóa
plasminogen và phân giải tơ máu, hoặc quá trình chuyển đổi prothrombin-thrombin.
Vùng kringle 2 của h-tPA cũng liên quan chặt chẽ với quá trình gắn tơ máu và có khả
năng kích thích hoạt tính h-tPA đối với fibrin nên có vai trò quan trọng trong sự kết
hợp giữa h-tPA và tơ máu [16], [55]. Vùng kringle 1 không được xem như có liên quan
đến trong đặc tính kết hợp với tơ máu của h-tPA mặc dù trình tự amino acid của kringle
1 và kringle 2 có tính tương đồng cao [52]. Vùng P đảm nhiệm chức năng phân cắt
plasminogen bằng enzyme để tạo ra plasmin [37].
Protein h-tPA được tổng hợp và tồn tại trong tế bào màng trong mạch dưới
dạng chuỗi polypeptide sợi đơn, tuy nhiên h-tPA trưởng thành là một sợi đơn
glycoprotein có 530 amino acid; 32 amino acid trình tự đầu sẽ được cắt khỏi h-tPA
Hình 1.3. Cấu trúc h-tPA [38]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12
trước khi h-tPA được đưa ra bên ngoài tế bào. Plasmin, kallikrein huyết tương, hoặc
nhân tố Xa hoạt hóa h-tPA bằng cách cắt h-tPA ở vị trí Arg 275- Ile 276 thành hai
sợi (A và B), hai sợi này liên kết với nhau bởi cầu disulfide [15], [20], [28], [34],
[45], [52].
Trong tự nhiên, h-tPA tồn tại ở dạng sợi đơn. Dạng hai sợi đã quan sát được
trong nuôi cấy tế bào ung thư tế bào hắc tố ở người. Nghiên cứu cho thấy h-tPA
dạng một sợi hoạt động có hiệu quả hơn dạng hai sợi. Điện di trên SDS (sodium
dodecyl sulfate) cho thấy, h-tPA dạng một sợi được chuyển thành dạng hai sợi trong
quá trình phân giải huyết khối [45]. Theo Berg, khi bị glycosyl hóa ở vị trí Asn- 184
sẽ gây ức chế trung gian đối với plasmin để chuyển h-tPA từ phân tử dạng sợi đơn
sang dạng sợi đôi, và khi glycosyl hóa ở vị trí Asn- 117 và/hoặc Asn- 448 sẽ làm
giảm kích thích hoạt hóa của h-tPA kết hợp với tơ máu và hoạt động phân giải
huyết khối [11].
1.4. Vai trò của chất hoạt hóa plasminogen mô trong quá trình làm tan máu
đông
Sự đông máu là một quá trình phức tạp qua đó hạn chế quá trình mất máu của cơ
thể. Khi thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che
phủ bởi huyết khối chứa tiểu cầu và sợi huyết. Cơ chế đông máu được bảo thủ khá bền
vững trong tiến hóa; ở lớp thú, hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần: tế bào (tiểu
cầu) và protein (các yếu tố đông máu). Phản ứng đông máu được kích hoạt ngay sau
chấn thương làm tổn hại đến nội mạc mạch máu. Tiểu cầu lập tức tạo nút chặn cầm máu
tại vết thương; đây chính là quá trình cầm máu ban đầu. Quá trình cầm máu thứ phát diễn
ra đồng thời; các yếu tố đông máu trong huyết tương đáp ứng trong một chuỗi phản ứng
để tạo các sợi huyết có vai trò củng cố nút chặn tiểu cầu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13
Thành phần quan trọng nhất trong hệ thống phân giải tơ máu là glycoprotein
plasminogen, là chất do gan sinh ra và có mặt trong huyết tương và có mặt hầu hết ở
ngoài thành mạch. Plasminogen là dạng tiền enzyme (zymogen), là chất có vùng dễ
phân chia, dưới tác dụng của chất hoạt hóa plasminogen sẽ được chuyển đổi thành
dạng hoạt động và là dạng phân giải protein, plasmin. Mục tiêu đầu tiên của plasmin
là tơ máu, nhưng plasmin có thể làm giảm một vài thành phần của hỗn hợp ngoài
thành mạch và chuyển một số tiền hormone và tiền cytokine thành dạng hoạt động
của chúng. Plasmin thường liên quan đến sự di căn của bệnh ung thư. Sự phát sinh
của plasmin xảy ra trước tiên trên bề mặt tơ máu, thường có điểm kết hợp cho
plasminogen và yếu tố cơ bản hoạt hóa của nó trong máu, tPA [59].
Quá trình làm giảm
và phân hủy tơ máu sẽ
được cân bằng trong quá
trình sửa chữa thành mạch
máu bị tổn thương. Tế bào
thành mạch máu bị tổn
thương sẽ giải phóng chất
hoạt hoá plasminogen
(tPA, uPA), hoạt hóa hệ
Hình 1.4. Quá trình phân hủy huyết khối [9]
Hình1.5. Con đƣờng phân giải tơ máu (Fibrin) [58]
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14
thống phân giải tơ máu. Chất hoạt hóa plasminogen cắt plasminogen tạo thành
plasmin, là chất phân hủy huyết khối.
Nguyên tắc phân hủy tơ máu: bản thân quá trình phân hủy tơ máu được điều
hòa bởi các chất ức chế chất hoạt hoá plasminogen (plasminogen activator
inhibitors - PAIs) và chất ức chế plasmin (α2-antiplasmin), đây là những chất làm
chậm quá trình phân giải tơ máu. PAI-1, một chất quan trọng của PAI, làm cho tPA
và uPA không hoạt động và được giải thoát khỏi tế bào thành mạch và hoạt hóa tiểu
cầu. Chất ức chế tiền plasmin là α2-antiplasmin, rất nhanh giải phóng plasmin tự do
không hoạt hóa thoát khỏi huyết khối. Một vài α2- antiplasmin thường liên kết với
nhân tố XIIIa với tơ máu trong quá trình hình thành cục máu đông, nó có thể ngăn
ngừa quá mức plasmin hoạt động trong cục máu. Cả tPA và uPA đều nhanh chóng
được phân hủy bởi thận, một bộ phận của ngăn ngừa phân hủy huyết khối quá mức.
1.5. Nghiên cứu ứng dụng sản xuất chất hoạt hóa plasminogen mô ngƣời
Như đã trình bày, chất hoạt hóa plasminogen mô người đã được thương mại
hóa với tên gọi là Alteplase do hãng Genentech sản xuất. Đây là thuốc làm tan
huyết khối đặc hiệu (nghĩa là chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn với tơ
máu) [43], [44]. Dược phẩm này đã được Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược
phẩm Hoa Kỳ (Food and Drug Administration - FDA) công nhận như là một dạng
thuốc chữa bệnh đột quỵ vào năm 1996. Về phương diện lâm sàng, h-tPA được xem
là thuốc tan huyết khối đặc hiệu (chúng kết hợp chọn lọc với plasminogen đã gắn
với tơ máu) và được lựa chọn để điều trị nhồi máu cơ tim, tắc mạch phổi, đột quỵ,
tắc động mạch ngoại biên và các bệnh khác liên quan đến tan huyết khối [36], [40].
Trong những năm từ cuối 1990 đến đầu năm 2000, tỷ lệ bệnh nhân bị đột quỵ được
điều trị bằng h-tPA chỉ chiếm 2%. Khoảng 9 năm trở lại đây, tỷ lệ bệnh nhân mắc
bệnh tim mạch và bị đột quỵ được điều trị bằng h-tPA tăng lên đáng kể, chiếm
khoảng 10- 20%.
Thuốc này có ưu điểm là không có tác dụng phụ, không gây chảy máu hệ
thống và hiện đang thuộc loại có doanh thu rất cao trên thị trường. Từ năm 1998
đến năm 2003, doanh thu mỗi năm đạt khoảng 200 triệu USD. Dự kiến, tới năm
2010 doanh thu đạt được lên tới 600 USD [22], [58].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15
Trong những nghiên cứu ứng dụng đầu tiên về h-tPA, các tế bào u nuôi cấy
được sử dụng làm nguồn sản sinh h-tPA cho các mục đích trị bệnh [26]. Tuy nhiên,
các ứng dụng lâm sàng đòi hỏi quy trình sản xuất protein thích hợp với sản lượng và
độ tinh sạch cao. Vì vậy, nghiên cứu tạo h-tPA tái tổ hợp sử dụng các tế bào động
vật có vú cũng được triển khai. Các tế bào buồng trứng của chuột đồng Trung Quốc
(Chinese hamster ovary - CHO) đã được chuyển gen h-tPA để tổng hợp protein h-
tPA tái tổ hợp [17]. Các sản phẩm DNA tái tổ hợp tạo ra từ hệ thống lên men môi
trường nuôi cấy tế bào động vật có vú cũng được thu nhận và làm sạch. Những nỗ
lực xây dựng quy trình đơn giản tạo h-tPA tái tổ hợp hiệu quả với giá thành hạ từ vi
sinh vật, đặc biệt là từ vi khuẩn, và cụ thể hơn là từ E. coli, rất được quan tâm
nghiên cứu [23], [40].
Vi khuẩn E. coli: Gen mã hóa h-tPA đã được nghiên cứu và biểu hiện trên vi
khuẩn E. coli từ những năm 1983 [23], [40]. Trong nghiên cứu của Pennica và đồng
tác giả (đtg), lượng h-tPA thu được chỉ đạt khoảng 50- 80 µg/l dịch nuôi, tương
đương với 1500- 2400 phân tử h-tPA có hoạt tính/ tế bào [40]. Đến năm 1998, sau khi
tinh sạch, hàm lượng protein h-tPA thu được vào khoảng 180 µg/l dịch nuôi [42].
Gần đây, Zhu và đtg đã biểu hiện thành công protein h-tPA trong vi khuẩn E. coli với
hàm lượng protein h-tPA chiếm 30% tổng số protein của vi khuẩn [57].
Nấm men: Để khắc phục những nhược điểm của vi khuẩn nói chung và E.
coli nói riêng, người ta cũng có thể dùng hệ thống biểu hiện là các sinh vật nhân
chuẩn bậc thấp làm vật chủ tách dòng, như nấm men (ví dụ, Saccharomyces
cerevisiae, Hansenulla polymorpha, Pichia pastoris) hay tảo. Ưu điểm của nấm
men là chúng có thể tiến hành rất nhiều dạng biến đổi (cấu trúc) protein và giống
như vi khuẩn, chúng có tốc độ sinh sản tương đối nhanh, nhu cầu dinh dưỡng khá
đơn giản, không sản sinh nội độc tố và có khả năng thích ứng cao với sản xuất quy
mô lớn. S. cerevisiae là nấm men được sử dụng rộng rãi nhất nhằm sản xuất các
protein tái tổ hợp. Hiện nay, nấm P. pastoris cũng được sử dụng rộng rãi, hơn 120
protein tái tổ hợp đã được biểu hiện ở tế bào chủ này trong đó rất nhiều gen có
nguồn gốc từ người và động vật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16
Chất hoạt hóa plasminogen mô người là một trong những protein động vật
được tổng hợp trên nấm Aspergillus nidulans [51], S. cerevisiae [35] và Aspergillus
niger. Đối với nấm A. niger, hàm lượng h-tPA được tổng hợp khoảng 0,07mg/g
sinh khối và tăng lên 1,9mg khi bổ sung peptone. Chất hoạt hóa plasminogen mô
người được tạo ra trong A. niger bị cắt thành dạng hai sợi có trọng lượng phân tử
giống với dạng h-tPA hai sợi của khối u người, dạng hai sợi này thường xuất hiện
sau 16h nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, thông thường chỉ dưới 1% sản phẩm h-tPA tạo
ra trong A. niger có hoạt tính, và dạng h-tPA hoạt hoá không bị mất khỏi dịch trong
suốt quá trình nuôi cấy. Dạng h-tPA hoạt hoá không xuất hiện bề mặt trong giai
đoạn tĩnh của bể nuôi cấy, có thể do quá trình tổng hợp không đúng hoặc do quá
trình phân hủy protein đã xảy ra ở vùng phân hủy protein của protein h-tPA.
Tế bào động vật có vú: Do yêu cầu đa số các sản phẩm protein tái tổ hợp
cần sự biến đổi về cấu trúc nên các tế bào prokaryote không đáp ứng được. Các tế
bào eukaryote bậc thấp như nấm men hay tế bào côn trùng cũng không đáp ứng
được đối với các quá trình biến đổi tương tự ở động vật có vú như phân giải protein,
liên kết các tiểu đơn vị hoặc nhiều phản ứng kết hợp khác nhau như glycosylation,
methylation, carboxylation, amidation, hình thành các cầu nối disulfide hoặc
phosphoryl hóa các gốc amino acid, cho nên hệ thống tế bào động vật có vú như tế
bào trứng chuột đồng Trung Quốc (Chinese hamster ovary - CHO) và tế bào thận
chuột chưa trưởng thành (baby hamster kidney - BHK) thường được lựa chọn để
sản xuất các protein trị liệu cho người. Khoảng 60% protein tái tổ hợp dùng làm
dược phẩm được sản xuất từ các hệ thống tế bào vật chủ này.
Tuy nhiên, việc sử dụng tế bào động vật làm tế bào chủ có một số nhược điểm
như: Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật, vì
thế, sản lượng của chúng khá thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong
một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn. Các tế bào động vật được bao
bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày chắc thường
thấy ở vi sinh vật hoặc tế bào thực vật và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và vỡ.
Trong khi đó nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách
đầy đủ, và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17
Do vậy giá thành sản xuất các sản phẩm sử dụng các hệ thống này khá cao. Sự lựa
chọn hệ thống biểu hiện trên có thể ảnh hưởng đến đặc tính, chất lượng và giá thành
của sản phẩm cuối cùng [12].
Động - thực vật biến đổi gen: Hiện nay, động vật và thực vật biến đổi
gen cũng được đưa vào ứng dụng để sản xuất các protein trị liệu [24], [25],
[32], [50]. Động vật biến đổi gen được thiết kế sao cho có thể tiết protein vào
các dịch thể dễ thu nhận như sữa (bò, cừu, dê...). Người ta đã tính toán và thấy
rằng sử dụng các động vật biến đổi gen để tổng hợp các protein trị liệu tái tổ
hợp sẽ có thể rẻ hơn bốn đến năm lần so với sử dụng các tế bào động vật có vú
nuôi cấy. Bên cạnh đó, thực vật, đặc biệt là ngô, cũng đã được nghiên cứu về
khả năng sản xuất các protein tái tổ hợp. Từ năm 1990, protein tái tổ hợp được
sản xuất từ cây thuốc lá và khoai tây chuyển gen để phục vụ cho y- dược đã bắt
đầu được thương mại hóa. Mười lăm năm tiếp theo, các loại DNA tái tổ hợp
được chuyển vào thực vật để thu nhận protein chữa bệnh như kháng sinh, sản
phẩm máu, cytokine, hormone sinh trưởng, enzyme tái tổ hợp, vaccine người và
động vật… [33]. Thực vật có nhiều ưu điểm hơn so với động vật trong việc tạo
ra các protein tái tổ hợp. Giống như nấm men, thực vật có khả năng tự thực
hiện nhiều khâu để tạo ra các protein phức tạp với chi phí cho trồng trọt khá
thấp. Sử dụng thực vật biến đổi gen không phát sinh các tranh cãi về đạo đức,
cũng như có thể tránh được các nguy cơ liên quan đến các virus, động vật, các
chất độc vi khuẩn. Tuy nhiên, hệ thống biểu hiện là thực vật biến đổi gen vẫn
còn một vài hạn chế. Thứ nhất, sản lượng protein tái tổ hợp do hệ thống biểu
hiện này sinh ra còn tương đối thấp. Thứ hai, tác dụng trị liệu của cùng một sản
phẩm protein có nguồn gốc thực vật và động vật là khác nhau. Ví dụ, nhiều
protein của người thường bị glycosyl hóa, nghĩa là sau khi được tạo ra, các
protein thường được gắn thêm một số gốc đường đặc trưng để giúp chúng kiểm
soát hoạt động chức năng một cách bình thường. Các nhà nghiên cứu đã thao
tác để vượt qua được hàng rào này bằng cách tạo ra các thực vật biến đổi gen
có thể tiến hành quá trình glycosyl hóa protein. Các thực vật biến đổi gen này
mang các gen của người mã hóa cho các enzyme xúc tác quá trình gắn các phân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18
tử đường vào protein. Một nhóm nghiên cứu ở Hà Lan đã tiến hành biến đổi vật
chất di truyền của một cây thuốc lá và sau đó lai cây thuốc lá biến đổi gen này
với một cây được thiết kế để sinh ra một loại kháng thể của chuột. Kết quả là
kháng thể này cũng có dạng glycosyl hóa, rất giống với kháng thể sinh ra bởi
chuột hơn bất kỳ kháng thể thực vật nào được sinh ra trước đó. Có thể thấy rõ
rằng, khoa học hiện đại có vai trò rất to lớn trong việc hoàn thiện các hệ thống
biểu hiện protein tái tổ hợp.
1.6. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, hướng nghiên cứu gen/ protein có giá trị sử dụng trong y dược,
tiến tới biểu hiện sản xuất protein tái tổ hợp là rất cần thiết và mới được tiếp cận
nghiên cứu ở nước ta trong thời gian gần đây. Một số phòng thí nghiệm đã tiến hành
phân lập, xác định trình tự một số gen từ các nguồn sinh vật khác nhau, trong đó có
cả gen người để nghiên cứu ứng dụng sản xuất dược phẩm công nghệ sinh học.
Trong đó, Viện Công nghệ sinh học đã thành công trong nghiên cứu tổng hợp
Trihobakin, protein tái tổ hợp có nguồn gốc thực vật có khả năng ức chế các dòng tế
bào ung thư cũng như thành công trong việc tinh chế protein bất hoạt ribosome
(RIP) phân lập từ cây mướp đắng [2], [3]. Cũng tại Viện Công nghệ sinh học, gen
mã hóa interleukin-2 của người, tác nhân điều biến miễn dịch, được sử dụng trong
điều trị ung thư, HIV, các bệnh nhiễm trùng, dị ứng đã được tách dòng và biểu hiện
[5], [6]; iterleukin-2 của người rh-LL2MM bị đột biến cũng được biểu hiện thành
công [4]. Ngoài ra, các nhà khoa học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại
học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh cũng đã triểu khai tạo dòng biểu hiện mini-
proinsulin của người trong E. coli [7]. Bên cạnh đó, các nghiên cứu tạo vaccine tái
tổ hợp cũng được quan tâm nghiên cứu ở nhiều phòng thí nghiệm [1]. Tuy nhiên,
cho đến nay chưa có một công bố nào về nghiên cứu sản xuất h-tPA tái tổ hợp ở
nước ta, vì vậy đề tài này sẽ làm tiền đề cho quá trình nghiên cứu và sản xuất chất
hoạt hóa plasminogen tái tổ hợp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị
2.1.1. Vật liệu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vật liệu ban đầu là cDNA mã hóa
h-tPA đã được chọn dòng trong vector pUC18 (pUC18/ h-tPA) trong nghiên cứu
trước đây [10].
Vector biểu hiện gồm hai loại: pET21a(+) được mua từ Hãng Novagen (Mỹ)
và pGEX6p1 được mua từ Hãng Pharmacia.
Bản đồ hai vector được trình bày trong hình 2.1:
Hình 2.1. Bản đồ vector pET21a(+) và pGEX6p1
Chủng E.coli DH5α được mua từ Hãng Invitrogen (Mỹ) và chủng E.coli
BL21(DE3) pLysS Competent Cells từ Hãng Promega (Mỹ).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt mua từ nhiều hãng khác
nhau. Danh sách các hóa chất cần thiết, các dung dịch sử dụng và trình tự mồi được
trình bày tương ứng ở các Bảng 1, 3 và 4 trong phần Phụ lục.
2.1.3. Các thiết bị
Các thiết bị được sử dụng thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ
Gen và phòng Công nghệ ADN Ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam được mua từ nhiều hãng khác nhau. Các thiết bị
thường sử dụng được liệt kê ở Bảng 2 phần Phụ lục.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Điện di DNA trên gel agarose
Mục đích: Điện di giúp phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau,
từ đó xác định được sự có mặt các đoạn DNA quan tâm.
Nguyên tắc: Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên đặc tính tích điện của
hầu hết các phân tử. Các phân tử ở dạng ion khác nhau về mức độ ion hóa, kích
thước phân tử có thể tách riêng biệt theo khả năng di động trong trường điện từ về
hai cực âm (-) và dương (+). Các phân tử DNA có khối lượng và điện tích khác nhau
được tách ra khi di chuyển từ cực âm sang cực dương của máy điện di trong một điện
trường có điện thế và cường độ thích hợp.
Hóa chất điện di: agarose 0,8- 1,5% (phụ thuộc vào kích thước phân tử
DNA. Ở đây, chúng tôi sử dụng agarose nồng độ 0,8% bởi nồng độ này phù hợp với
kích thước của đoạn gen), dung dịch đệm TAE 1X.
Quy trình điện di:
- Chuẩn bị gel agarose: hòa tan 0,8 gram agarose vào 100ml dung dịch TAE
1X, đun sôi cho dung dịch tan hoàn toàn. Để nhiệt độ xuống khoảng 50- 60oC, đổ
dung dịch agarose vào khay gel điện di có cài sẵn lược thích hợp. Sau 30- 60 phút,
khi gel đã đông cứng, gỡ lược ra và đặt vào bể điện di, đổ đệm TAE 1X ngập cách
mặt gel từ 1- 2 mm [48].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21
- Mẫu DNA được trộn với 3- 5l đệm tra mẫu và được tra vào các giếng trên
gel. Chạy điện di với hiệu điện thế 100V, 60- 80mA trong khoảng 30 phút.
- Bản gel được lấy ra khỏi khuôn và ngâm 5 phút trong dung dịch EtBr nồng
độ 0,5g/ml, sau đó rửa sạch bằng nước.
- Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio- Rad với tia UV có bước sóng 320nm.
2.2.2. Điện di protein trên gel polyacyamide
Nguyên tắc: Các tiểu phần protein được xác định dựa vào tốc độ di chuyển
khác nhau của các tiểu phần protein trong trường điện. Ở một số điều kiện nhất
định, protein ở dạng ion và có mức độ ion hóa khác nhau, nên có thể tách riêng biệt
chúng theo khả năng di động trong trường điện từ về hai cực âm (-) và dương (+).
Kết quả nhận được phổ các vạch protein khác nhau. Phương pháp điện di là một
phương pháp nghiên cứu sinh hóa thông dụng và rất tiện lợi. Phương pháp điện di
protein thường được tiến hành trên chất mang ở dạng gel là lưới polymer. Lưới
polymer làm chậm tốc độ di chuyển các phân tử protein theo khối lượng, kích
thước, độ mang điện của chúng.
Phương pháp điện di protein trên gen polyacrylamit có chứa SDS được tiến
hành theo phương pháp của Laemmli [29]. Thành phần gel được trình bày ở Bảng
11 phần Phụ lục. Quy trình điện di như sau:
- Pha mẫu với Protein Sample Buffer 4X và biến tính mẫu ở 95oC trong 5
phút. Dùng 10 l mẫu tra vào từng giếng và tiến hành điện di trên gel
polyacrylamide 10% gồm gel cô 4% và gen tách 10%.
- Đổ dung dịch chạy (Running buffer) SDS- Page 1x và chạy điện di: Chạy
ở hiệu điện thế 110V trong 2- 3 giờ. Theo dõi đến khi thấy màu dung dịch đệm mẫu
bắt đầu thoát ra ngoài dung dịch đệm chạy thì kết thúc.
- Bản gel được nhuộm trong dung dịch nhuộm (Comasive Brilliant Blue
R250) trong khoảng từ 30 phút đến 1 giờ.
- Tẩy gel bằng cách ngâm bản gel đã nhuộm vào dung dịch tẩy (acid acetic
7%, metanol 20%) đến khi bản gel màu trắng thì kết thúc quá trình tẩy. Thời gian
tẩy khoảng 30 phút. Sau đó gel được bảo quản và chụp ảnh.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22
2.2.3. Phản ứng dây chuyền polymerase (Polymerase Chain Reaction-
PCR)
Phương pháp PCR nhằm mục đích khuyếch đại in vitro một đoạn DNA khi
biết trình tự hai đầu. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là nhờ sự xúc tác của enzyme
DNA polymerase chịu nhiệt để khuyếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in
vitro trong môi trường có các dNTP và cặp mồi đặc hiệu [48].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 2 cặp mồi là Cặp 1: h-tPA-NdeI
F2, h-tPA-XhoI R3; Cặp 2: h-tPA-BamHI F2, h-tPA-XhoI R4.
Các thành phần của PCR: đoạn DNA khuôn (cDNA mã hóa h-tPA được tạo
dòng trong vector pUC18), hai cặp mồi đặc hiệu có chiều dài 15- 30 nucleotide, bốn
loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), DNA polymerase.
PCR bao gồm các giai đoạn:
– Giai đoạn biến tính: DNA được biến tính ở nhiệt độ khoảng 94oC- 95oC trong thời
gian một vài phút, khi đó các liên kết hydro bị đứt và sợi DNA dạng sợi kép thành
hai sợi đơn;
– Giai đoạn gắn mồi: Ở nhiệt độ từ 40oC- 65oC trong khoảng 30 giây đến 1 phút,
hai đoạn mồi chuyên biệt sẽ bắt cặp với sợi DNA khuôn theo nguyên tắc bổ sung ở
hai đầu đoạn DNA cần nhân. Nhiệt độ của bước gắn mồi tùy thuộc vào từng loại
mồi cụ thể, được tính toán dựa trên nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi;
– Giai đoạn kéo dài chuỗi: nhiệt độ phản ứng được nâng lên 70oC- 80oC (trung bình
khoảng 720C) trong khoảng thời gian thích hợp (tùy thuộc chiều dài đoạn DNA cần
tổng hợp), enzyme Taq polymerase hoạt động và quá trình tổng hợp DNA diễn ra;
Quy trình phản ứng được thực hiện trên máy PCR GeneAmp PCR System
9700 với thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng 5 phần Phụ lục, chu trình
nhiệt phản ứng như sau:
Chu trình nhiệt trên máy GenAmp PCR System 9700 như sau:
94
o
C 94
o
C 60
o
C 72
o
C 72
o
C 4
o
C
3’ 30’’ 30’’ 1’30’’ x30ck 10’
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose
0,8%, sau đó được tinh sạch DNA theo kit Wizard SV Gel and Clean-Up System.
2.2.4. Xử lý DNA bằng enzyme hạn chế
Nguyên tắc: Enzyme hạn chế là một nuclease nội bào có khả năng nhận biết
các đoạn DNA với các trình tự nucleotide nhất định, bám vào đoạn DNA đó và cắt
cả hai sợi của phân tử DNA. Enzyme hạn chế cắt DNA hình thành hai dạng đầu: tạo
đầu bằng và tạo đầu dính.
Đối với sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành cắt bằng hai cặp enzyme
BamHI/XhoI và NdeI/XhoI. Vector pET21a(+) được xử lý bằng NdeI/XhoI và
pGEX6p1 được cắt bằng BamHI/XhoI. Thành phần phản ứng được trình bày ở Bảng
6 phần Phụ lục. Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích
hợp (thường ở 370C, 2 giờ). Sản phẩm phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel
agarose 0,8%;
Sau khi cắt bằng enzyme hạn chế, các vector được xử lý với phosphatase để
loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’ nhằm giảm quá trình nối lại của vector. Thành
phần phản ứng được trình bày ở Bảng 7 phần Phụ lục. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong
1h sau đó tiếp tục ủ ở 75oC trong 15 phút để loại CIP [48].
2.2.5. Ghép nối DNA
Nguyên tắc: Đoạn cDNA và vector được xử lý bằng cùng một loại enzyme
hạn chế tạo đầu bổ sung, các đầu này có trình tự bắt cặp với nhau. Dưới tác dụng của
enzyme T4 DNA ligase, đoạn DNA quan tâm sẽ được gắn vào vector. Thành phần
phản ứng ghép nối được trình bày ở Bảng 8 Phần Phụ lục.
Hỗn hợp phản ứng được trộn đều và ủ 14- 24 giờ, ở 16oC. Sản phẩm phản ứng
được biến nạp vào E. coli và chọn lọc trên môi trường LB có bổ sung Ampicillin
(Amp), nồng độ 50µg/ml [48].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24
2.2.6. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng
pháp sốc nhiệt
Tùy từng mục đích khác nhau mà chúng tôi chuẩn bị các chủng vi khuẩn
khác nhau. Chủng tế bào dùng tạo dòng là vi khuẩn E. coli chủng DH5α. Để biểu
hiện, chúng tôi sử dụng vi khuẩn E. coli chủng BL21. Quy trình chuẩn bị và biến
nạp đối với hai chủng là tương tự nhau [48].
2.2.6.1. Chuẩn bị tế bào khả biến E. coli
- Chủng vi khuẩn lấy từ ống giữ chủng được cấy ria trên môi trường LB đặc và
nuôi qua đêm ở 37oC; Ngày hôm sau lấy 1 khuẩn lạc rời từ đĩa cấy ria, nuôi lắc
200vòng/phút (v/p) ở 37oC trong môi trường LB lỏng từ 1- 2h; Ngày tiếp theo cấy
trải dịch nuôi ra đĩa chứa môi trường LB đặc. Nuôi qua đêm ở 37oC;
- Chọn 1 khuẩn lạc từ đĩa, cấy chuyển vào 1,5 ml môi trường LB lỏng, nuôi
qua đêm ở 37oC;
- Cấy chuyển 200l dịch nuôi sang 30 ml LB lỏng. Nuôi lắc trong 3h ở 37oC;
- Chuyển dịch nuôi sang ống ly tâm. Giữ lạnh trên đá trong 10 phút;
- Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút, ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi; sau đó bổ sung 15 ml
dung dịch CaCl2 0,1M. Làm tan hết tủa tế bào trong dung dịch CaCl2. Ủ trên đá
trong 40 phút;
- Ly tâm 4200 v/p trong 10 phút ở 4oC. Đổ bỏ dịch nổi; bổ sung 1,5 ml dung
dịch CaCl2 0,1 M. Ly tâm nhẹ để hòa tan tủa tế bào vào dung dịch CaCl2;
- Chia ra các ống eppendorf và bổ sung 20 l glycerol 100%. Búng nhẹ để trộn
đều các thành phần với nhau (thao tác trong box). Giữ tế bào khả biến ở -80oC [48].
2.2.6.2. Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E. coli
- Tế bào khả biến E. coli được giữ trên đá khoảng 30 phút, sau đó bổ sung 5l
của sản phẩm ghép nối vào ống tế bào khả biến (khoảng 100l). Giữ trong đá
khoảng 15 phút;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25
- Sốc nhiệt ở 42oC trong 70 giây, sau đó chuyển ngay sang bình đá và giữ
trong đá 5 phút;
- Bổ sung 300l môi trường LB lỏng;
- Nuôi lắc 200 v/p ở 37oC trong 1giờ;
- Cấy trải hết dịch tế bào trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung Amp
(50g/ml), nuôi ở 37oC qua đêm [48].
2.2.7. Tách chiết và tinh sạch DNA plasmid
Nguyên tắc: Tách chiết plasmid dựa trên hai nguyên ngắc cơ bản là DNA
nhiễm sắc thể của E. coli có kích thước lớn hơn rất nhiều so với DNA plasmid; do
trọng lượng, kích thước khác nhau giữa các dạng DNA E. coli mà hầu hết DNA
plasmid tách ra dưới dạng vòng đóng [48].
Hóa chất tách chiết DNA plasmid gồm: Sol I, Sol II, Sol III, dung dịch loại
protein (hỗn hợp chloroform: isoamylalcohol = 24:1), dung dịch TE 0,01M, pH 8,0.
Quy trình tách chiết DNA plasmid của E. coli
- Nuôi cấy lắc qua đêm tế bào E. coli trong 1,7ml môi trường LB (có kháng
sinh Amp nồng độ 50g/ml) ở 370C, 200 v/p; Ngày hôm sau, ly tâm dịch nuôi cấy
trên ở 6.000 v/p, 7 phút; loại bỏ dịch;
- Hoà cặn tế bào vi khuẩn trong 150l dung dịch I để lạnh, voltex làm tan cặn
tế bào, sau đó giữ trong đá 5 phút;
- Bổ sung 150l dung dịch II, đảo đầu ống Eppendorf nhẹ nhàng và giữ trên đá
10 phút;
- Thêm 150l dung dịch III để lạnh, đảo nhẹ và ủ trong đá từ 3 – 5 phút;
- Thêm 500 l dung dịch chloroform: isoamyl alcohol (tỷ lệ thể tích 24:1).
Đảo đều hỗn hợp;
- Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Chiết và chuyển pha lỏng ở phía trên
sang một ống eppendorf mới; Thêm 50 l CH3COONa 3 M (pH 5,2) và 1 ml cồn
100 %. Đảo đều và giữ lạnh ở -200C trong 3 giờ;
- Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC để thu tủa DNA;
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26
- Rửa cặn bằng 0,2ml cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút, làm khô và
hoà cặn trong 40l TE 0,01M, giữ ở -20oC; Sau đó đổ bỏ cồn. Làm khô tủa bằng
máy SpeedVac trong 5 phút;
- Hòa tan tủa DNA trong 50 l nước chứa RNase (0,01 mg/ml). Bảo quản
DNA ở -20oC; Kiểm tra DNA bằng gel agarose 0,8 %.
Các dòng mang vector tái tổ hợp sau khi được xác định sẽ được kiểm tra
bằng enzyme hạn chế và PCR kiểm tra. Thành phần cắt kiểm tra được nêu ở Bảng 9
phần Phụ lục. Hỗn hợp được ủ ở 37oC trong 2h. Thành phần và chu trình nhiệt của
phản ứng PCR kiểm tra giống với quá trình nhân gen. Sản phẩm cắt và PCR kiểm
tra được điện di trên gel agarose 0,8%.
2.2.8. Xác định trình tự gen
Trình tự gen được xác định trên máy xác định trình tự tự động ABI PRISM
3100 Genetic Analyzer kết hợp với sử dụng bộ kit BigDye Terminator v3.1 Cycle
Sequencing.
Thành phần hỗn hợp sử dụng trong xác định trình tự DNA bao gồm cả
dNTPs và ddNTPs, là các nucleotide được đánh dấu bằng các chất phát huỳnh
quang khác nhau. Mồi đọc trình tự đối với vector pET21a(+) là cặp mồi T7, đối với
vector pGEX6p1 là cặp mồi PEXF/PEXR. Phản ứng gắn các nucleotide đánh dấu
vào sợi DNA tổng hợp trên sợi khuôn được tiến hành trên máy PCR. Quá trình tổng
hợp kéo dài chuỗi sẽ không tiếp tục diễn ra khi ddNTP được lắp vào, kết quả là tạo
ra một bộ các đoạn có chiều dài hơn kém nhau một nucleotide. Sau đó sản phẩm
PCR được điện di trên gel có độ phân giải cao, cho phép phân biệt được các sợi đơn
hơn kém nhau một nucleotide [48].
Thành phần PCR xác định trình tự được trình bày ở Bảng 10 phần Phụ lục.
Chu trình nhiệt trên máy GenAmp PCR System 9700 như sau:
96
o
C 96
o
C 50
o
C 60°C 4oC
1’ 10’’ 5’’ x25ck 4’ ∞
- Tiếp đó, sản phẩm PCR được tinh sạch bằng phương pháp tủa cồn/EDTA:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27
- Bổ sung 4l EDTA 125mM có pH 8,0 và 60l cồn 100%. Đảo nhẹ hỗn hợp
và để ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút ở 4oC. Loại
bỏ cồn.
- Rửa tủa bằng 60l cồn 70%, ly tâm 12.000 v/p trong 10 phút và làm khô.
- Bổ sung 10l Hi–DiTM Formamide và biến tính ở 95oC trong 5 phút. Các
mẫu được cho vào các giếng của khay đựng mẫu. Điện di trong ống vi mao quản 80
cm x 50 m chứa POP- 4TM.
Dữ liệu được xử lý bằng phần mềm ABI PRISM 3100 Data Collection
v2.0, Seqscape v2.5 và BioEdit v7.0.5.
2.2.9. Biểu hiện protein trong vi khuẩn E. coli
Sau khi plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa h-tPA được biến nạp thành
công vào tế bào biểu hiện E.coli chủng BL21, protein tái tổ hợp được tiến hành biểu
hiện và kiểm tra theo các bước sau:
- Chọn một khuẩn lạc (E. coli BL21) nuôi lắc ở 200 v/p trong 5ml LB lỏng có
bổ sung Amp (100g/ml) ở 37oC qua đêm;
- Ngày tiếp theo, hút 2ml dịch vi khuẩn trên vào 100 ml LB lỏng có bổ sung Amp
(100g/ml). Tiếp tục nuôi lắc ở 200 v/p ở 37oC đến OD600= 0,6- 0,8;
- Cảm ứng biểu hiện protein bằng IPTG nồng độ 1mM. (Tỷ lệ 100 l IPTG cho
100ml dịch nuôi). Để tế bào tiếp tục sinh trưởng trong 3h;
Kiểm tra biểu hiện: hút 1ml dung dịch nuôi cấy sang ống eppendoft mới. Ly
tâm thu tế bào và bổ sung 100 µl loading dye. Voltex phá tế bào, biến tính protein
trong 5 phút ở 95oC;
- Dùng 10l mẫu để điện di SDS-PAGE cùng với thang chuẩn protein và mẫu
đối chứng âm là dịch phá màng của E.coli BL21 và dịch phá màng E.coli BL21chứa
vector rỗng được cảm ứng IPTG;
- Phần dịch nuôi cấy còn lại được ly tâm thu tế bào. Giữ tế bào ở -20oC chờ
bước tinh chế protein.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Thiết kế vector biểu hiện mang cDNA mã hóa h-tPA
3.1.1. Nhân đoạn cDNA mã hoá h-tPA bằng kỹ thuật PCR
Gen mã hóa h-tPA sử dụng trong nghiên cứu đã được tạo dòng trong vector
pUC18. Để kiểm tra cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành xác định trình tự
cDNA mã hóa h-tPA trong vector pUC18 sử dụng cặp mồi M13, sau đó trình tự này
được phân tích và so sánh với trình tự NM000930 trên Ngân hàng Gen Quốc Tế. Kết
quả phân tích và so sánh cho thấy, trình tự cDNA trong vector pUC18 có độ tương
đồng tới 99% với trình tự so sánh, các điểm đột biến giữa h-tPA với trình tự
NM000930 không làm thay đổi trình tự acid amin. Trình tự bao gồm đầy đủ các thành
phần cần thiết cho biểu hiện gen như mã mở đầu, mã kết thúc, đúng khung đọc...
Sau khi xác định trình tự cDNA mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành PCR
với hai cặp mồi đặc hiệu và khuôn là vector pUC18 tái tổ hợp để tạo dòng cDNA
này trong vector biểu. Hai cặp mồi đã được chúng tôi thiết kế mang các trình tự
nhận biết của enzyme hạn chế để sử dụng cho các quá trình ghép nối gen và kiểm
tra sản phẩm. Việc thiết kế thêm trình tự nhận biết của các enzyme hạn chế vào mồi
tuân theo một số nguyên tắc như trình tự nhận biết chỉ có một vị trí trong vùng gắn
đa vị của vector và không có mặt trong gen cần tạo dòng; số nucleotide phía ngoài
trình tự nhận biết từ 3- 6 nucleotide nhằm bảo vệ các trình tự này và giúp các
enzyme cắt tốt hơn. Trong nghiên cứu này, đối với vector pGEX6p1 chúng tôi sử
dụng hai enzyme là BamHI và XhoI, vì chúng có mặt trong vùng cắt gắn đa vị của
vector biểu hiện pGEX6p1; đối với vector pET21a(+), chúng tôi đã sử dụng hai
enzyme NdeI và XhoI. Các enzyme này đều không có điểm cắt trên cDNA mã hoá
h-tPA. Trình tự hai cặp mồi như sau:
Cặp 1:
htPA-NdeI F2: 5’-GTG AAG CAC ATA TGG ATG CAA TGA AGA GAG G-3’
htPA-XhoI R3: 5’-GTG GTG CTC GAG CGG TCG CAT GTT GTC-3’
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29
Cặp 2:
htPA-BamHI F2: 5’-ATT CCG TGG ATC CAC CAT GGA TGC AAT GAG G-3’
htPA-XhoI R4: 5’-GTG GTG CTC GAG TCA CGG TCG CAT GTT GTC-3’
Kỹ thuật PCR là phương pháp được sử dụng nhằm nhân một đoạn DNA nằm
giữa hai vùng đã biết trình tự. Hai đoạn oligonucleotide được sử dụng như mồi cho
một loạt phản ứng tổng hợp được xúc tác bởi enzyme DNA polymerase. Các đoạn
oligonucleotide có trình tự khác nhau và bổ sung cho trình tự nằm ở hai đầu của
trình tự DNA mẫu được nhân lên. DNA mẫu bị biến tính bởi nhiệt độ trong sự có
mặt của hai đoạn oligonucleotide và bốn loại dNTPs. Hỗn hợp phản ứng sau đó
được hạ xuống tới nhiệt độ cho phép mồi oligonucleotide bám vào trình tự đích, tiếp
theo mồi được kéo dài bởi DNA polymerase. Số chu kỳ được nhắc lại nhiều lần từ
25 đến 35 chu kỳ. Bởi vì sản phẩm của một vòng của quá trình nhân là mẫu cho quá
trình tiếp theo, mỗi chu kỳ cho hai sản phẩm DNA nên số lượng sản phẩm là phản
ứng mũ một đoạn đôi DNA được xác định bởi đầu cuối 5’ của đoạn mồi
oligonucleotide và chiều dài được xác định bởi khoảng cách giữa hai mồi. Hai cặp
mồi này có thể được thiết kế theo yêu cầu của nghiên cứu. Việc nhân gen bằng PCR
từ vector dễ hơn so với nhân gen từ hệ gen nên thường thu được lượng sản phẩm
lớn, đặc hiệu do số điểm bám của mồi trên vector tái tổ hợp ít, tỷ lệ bám mồi cao...
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu, chúng tôi đã tiến hành phản ứng nhân cDNA mã
hóa h-tPA. Thành phần và chu trình nhiệt được trình bày ở phần 2.2.3. Sản phẩm
PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả điện di được thể
hiện ở hình 3.1.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30
Hình 3.1. Sản phẩm PCR nhân cDNA mã hóa h-tPA
M: Marker 1kb
1: Sản phẩm PCR h-tPA với cặp mồi 1
2: Sản phẩm PCR h-tPA với cặp mồi 2
Kết quả điện di đồ cho thấy, sản phẩm PCR thu được có kích thước phân tử
khoảng 1,7kb, kích thước này phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết. Băng
chính đều sáng, đậm, rõ nét và sẽ được tinh sạch trước khi sử dụng để tiến hành
ghép nối gen.
3.1.2. Ghép nối cDNA mã hoá h-tPA vào vector pGEX6p1 và pET21a(+)
3.1.2.1. Xử lý sản phẩm PCR cDNA mã hoá h-tPA bằng enzyme
hạn chế
Sau khi thu được sản phẩm PCR, chúng tôi đã tiến hành chiết và làm sạch
sản phẩm qua cột theo kit Wizard® SV Gel and Clean- Up System. Hệ thống này
dựa trên khả năng kết hợp của DNA với màng silica trong sự có mặt của hỗn hợp
muối, hệ thống màng có thể kết hợp với 40µg DNA và cho phép thu hồi sản phẩm
PCR trong 15 phút. Quá trình tinh sạch này giúp loại bỏ khỏi sản phẩm PCR các
thành phần không mong muốn như các đoạn DNA vệ tinh, các NTPs... Sau khi tinh
sạch, hai mẫu sản phẩm PCR được xử lý bằng hai cặp enzyme hạn chế tương ứng là
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31
NdeI/XhoI và BamHI/XhoI. Thành phần và quá trình xử lý được trình bày ở mục
2.2.4. Phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
3.1.2.2. Xử lý vector pGEX6p1 và pET21a(+) bằng enzyme hạn chế
Sau khi nghiên cứu tài liệu và điều kiện vật chất phòng thí nghiệm, chúng tôi đã
tiến hành biểu hiện protein h-tPA trên vi khuẩn E. coli chủng BL21 với hai vector biểu
hiện là pET21a(+) và pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA. Vector pET21a(+) là vector
mạnh để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp trong E. coli. Gen đích được tạo dòng
trong plasmid pET21a(+) được điều khiển bởi tín hiệu dịch mã tốt của phage T7, biểu
hiện dưới sự tổng hợp của T7 RNA polymerase trong tế bào chủ. Vector pET21a(+) là
vector mang trình tự T7 ở đầu N và trình tự đuôi His ở đầu C. Vector này mang chỉ thị
chọn lọc là gen kháng kháng sinh (kháng Amp và Kanamycin). Vùng tạo dòng/ biểu hiện
được điều khiển bởi T7 polymerase. Trình tự này được xác định, giải trình tự khi sử dụng
mồi đầu T7. Hệ thống biểu hiện này được cảm ứng bởi IPTG hoặc lactose trong quá trình
nuôi cấy.
Vector pGEX6p1 điều khiển tổng hợp protein ngoại lại bởi promoter tac,
promoter này được cảm ứng bởi isopropyl b-D thiogalactoside (IPTG). Vector pGEX6p1
được thiết kết gồm có một gen lacIq, sản phẩm gen lacIq là protein ức chế kết hợp với
vùng operator trên promoter tac, làm ngăn cản quá trình biểu hiện cho tới khi cảm ứng
bởi IPTG, qua đó điều khiển quá trình biểu hiện của gen được thêm vào. Đầu 3’ vùng đa
nối có chứa đoạn gen mã hoá Glutathione S- Transferase - GST, đây là một protein giúp
quá trình tinh sạch protein tái tổ hợp dễ hơn. Ngoài ra, vector pGEX6p1 có một số ưu
điểm như: mức độ biểu hiện cao, điều kiện tinh sạch protein đơn giản, ảnh hưởng của
kháng nguyên và chức năng của protein là nhỏ nhất.
Quá trình cắt mở vòng hai vector cũng sử dụng hai cặp enzyme là NdeI/XhoI và
BamHI/XhoI tương tự như đối với sản phẩm PCR. Thành phần và quá trình xử lý đối với
vector pET21a(+) và pGEX6p1 được trình bày ở phần 2.2.4. Sau khi cắt với enzyme,
vector được xử lý với phosphatase để loại nhóm phosphate ra khỏi đầu 5’, làm giảm quá
trình tự nối của vector. Phản ứng được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32
Hình 3.2. Kết quả xử lý cDNA mã hóa h-tPA và các vector biểu hiện
bằng enzyme hạn chế
Kết quả điện di trên hình 3.2 cho thấy sản phẩm cắt tương đối sạch và đủ
điều kiện tiến hành phản ứng ghép nối.
3.1.2.3. Ghép nối cDNA mã hoá h-tPA vào vector pGEX6p1 và
pET21a(+)
Chúng tôi đã tiến hành ghép nối cDNA mã hóa h-tPA với các vector
pET21a(+) và pGEX6p1 tạo các vector tái tổ hợp mang gen mã hoá h-tPA. Do cả
sản phẩm PCR và vector đều đã được xử lý bằng hai enzyme tương ứng nên dưới
tác dụng của enzyme T4 ligase, sản phẩm PCR và vector có thể nối lại với nhau tạo
vector tái tổ hợp. Thành phần và phản ứng ghép nối giữa vector và sản phẩm PCR
đã trình bày ở phần 2.2.5. Phản ứng ghép nối được tiến hành ở 16oC, qua đêm.
3.1.3. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA
3.1.3.1. Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli bằng phƣơng pháp
sốc nhiệt
Sản phẩm lai giữa vector và sản phẩm PCR được biến nạp vào tế bào E. coli
chủng DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt trong 70 giây ở 42oC. Các tế bào này sau
đó được nuôi cấy trên môi trường LB đặc có bổ sung Amp (50g/ ml) ở 37°C qua
M: Marker 1kb
1: Vector pGEX6p1/BamHI+XhoI
2: Vector pET21a(+)/NdeI+XhoI
3: cDNA h-tPA/NdeI+XhoI
4: cDNA h-tPA/BamHI+XhoI
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33
đêm. Kết quả, chúng tôi đã thu được rất nhiều khuẩn lạc, là các dòng tế bào vi khuẩn
khác nhau. Do trong môi trường có chất kháng sinh nên chỉ có những khuẩn lạc nào
mang vector mới mọc được, các dòng tế bào vi khuẩn này gồm 2 loại tế bào khác
nhau: tế bào mang vector nhưng không mang đoạn chèn và tế bào mang vector và
đoạn chèn. Vì vậy để xác định dòng tế bào nào mang vector tái tổ hợp, chúng tôi đã
tiến hành sàng lọc thông qua tách chiết plasmid, xử lý bằng enzyme hạn chế, PCR
và xác định trình tự.
3.1.3.2. Chọn dòng pGEX6p1 và pET21a(+) chứa cDNA mã hoá h-tPA
Tách chiết DNA plasmid
Plasmid được tách chiết nhằm xác định vector nào mang đoạn chèn và vector
nào không mang đoạn chèn. Phương pháp tách plasmid được trình bày ở mục 2.2.7.
Để tách chiết DNA plasmid, một số khuẩn lạc được nuôi cấy trong môi trường LB
lỏng có bổ sung Amp ở 37oC từ 12- 14h. Phương pháp tách chiết plasmid gồm 3 bước
chính: thu nhận và phân giải tế bào, làm sạch plasmid và kết tủa DNA. Dung dịch I (sol I)
có tác dụng rửa sạch tế bào, dung dịch II (sol II) có chứa SDS và NaOH có tác dụng phá
màng tế bào và ức chế hoạt động của nuclease, không cho chúng phân giải DNA do Mg2+
(một nhân tố cần thiết cho hoạt động của các nuclease) bị liên kết với EDTA, khi cho tiếp
dung dịch III (sol III) có chứa axetate và axetic acid thì pH môi trường chuyển thành acid
yếu gần với điểm đẳng điện của DNA, vì vậy, DNA plasmid dễ bị kết tủa bằng cồn và dễ
dàng tách được nhờ ly tâm. Do trong tế bào vi khuẩn có chứa hai dạng DNA là DNA
nhiễm sắc thể và DNA plasmid nên việc tách và tinh sạch DNA plasmid là rất quan trọng,
DNA plasmid được tách riêng dựa trên sự khống chế thời gian xử lý các dụng dịch I, II, III.
Do DNA nhiễm sắc thể có kích thước phân tử lớn và liên kết chặt chẽ với protein nên
khoảng thời gian ngắn giữa các lần thêm dung dịch không kịp thoát ra ngoài.
DNA plasmid thu được sau khi tách chiết từ tế bào vi khuẩn thường tồn tại ở
3 dạng: dạng siêu xoắn được tạo ra do liên kết hydro giữa một số phần của phân tử
DNA plasmid hay do lực hút tĩnh điện giữa các phần của phân tử với nhau, dạng
vòng mở do bị đứt gãy một mạch đơn của chuỗi DNA mạch kép và dạng mạch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34
thẳng khi cả hai mạch DNA dều bị đứt gãy. Dạng siêu xoắn có cấu trúc không gian
gọn nên khi điện di chúng thường chạy nhanh nhất, tiếp đến là mạch thẳng và cuối
cùng là mạch vòng. DNA sau đó được hoà tan trong dung dịch RNase 0,01mg/ml
nhằm loại bỏ RNA và được điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%.
Theo lý thuyết khi một DNA plasmid mang gen ngoại lai, chúng sẽ có kích
thước bằng tổng kích thước của plasmid và kích thước của gen ngoại lai. Do vậy
trong điện di đồ, chúng sẽ chạy chậm hơn (thấp hơn) so với đối chứng âm (các
plasmid chưa mở vòng), dựa vào đó chúng ta có thể kết luận sơ bộ được những
plasmid này có kích thước lớn hơn và có thể chúng mang gen ngoại lai.
Hình 3.3. Chọn dòng pGEX6p1 mang cDNA mã hóa h-tPA (pGEX6p1/h-tPA)
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35
ĐC: Đối chứng âm
1- 7: DNA plasmid của các dòng pGEX6p1
Kết quả điện di cho thấy ở tất cả các đường chạy đều xuất hiện 2 băng chạy
trước rõ nét hơn, điều đó chứng tỏ lượng DNA plasmid của chúng tôi thu được tồn
tại ở dạng siêu xoắn nhiều hơn dạng thẳng. Hình 3.3 cho thấy, đối với các dòng
mang vector pGEX6p1, dòng 1 và 3 (ký hiệu pGEX/htPA p1 và pGEX/htPA p3) là
hai dòng có kích thước lớn hơn các dòng khác và lớn hơn so với đối chứng âm; do
vậy rất có thể các dòng này mang cDNA mã hóa h-tPA.
Đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có thể mang
cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3).
Formatted: Centered
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36
Hình 3.4. Chọn dòng pET21a(+) mang cDNA mã hóa h-tPA (pET21a(+)/h-tPA)
ĐC: Đối chứng âm (vector pET21a(+) không mang h-tPA)
1- 5: DNA plasmid của các dòng pET21a(+)
Tương tự, đối với các dòng mang vector pET21a(+), các dòng 1,2,3 có kích
thước lớn hơn các dòng khác và đối chứng âm; do vậy rất có thể các dòng này mang
cDNA mã hóa h-tPA (ký hiệu: pET/htPA p1, pET/htPA p2, pET/htPA p3).
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Formatted: Space After: 0 pt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37
Để chứng minh chính xác xem đoạn xen vào plasmid có phải là đoạn gen mã
hoá h- tPA hay không, chúng tôi đã tiếp tục kiểm tra bằng enzyme hạn chế, tiến
hành PCR và giải trình tự.
Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng xử lý
enzyme hạn chế
Hai cặp enzyme NdeI/XhoI và BamHI/XhoI đã được sử dụng để tạo đầu bổ
sung cho vector và đoạn chèn nên để kiểm tra, chúng tôi cũng sử dụng hai cặp
enzyme này nhằm kiểm tra các dòng được chọn có mang đoạn chèn hay không.
Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm xử lý enzyme của plasmid tái tổ hợp bao gồm
hai đoạn gen, một đoạn có kích thước tương ứng với vector gốc (vector mở vòng)
và một đoạn có kích thước tương ứng với đoạn chèn (cDNA mã hóa h-tPA). Thành
phần và quy trình phản ứng được tiến hành như trình bày ở mục 2.2.4. Các sản
phẩm xử lý enzyme được điện di trên gel agarose 0,8%.
Hình 3.5. Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA
bằng enzyme hạn chế
Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, sau khi xử lý các vector tái tổ hợp bằng hai
cặp enzyme tương ứng, chúng tôi thu được hai băng có kích thước khác nhau; đối
M: Marker 1kb
1: pGEX/htPA p1
2: pGEX/htPA p3
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Formatted: Space After: 0 pt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38
với vector pGEX6p1, chúng tôi thu được một băng có kích thước khoảng 5kb
(tương ứng với kích thước của vector pGEX6p1 khi xử lý bằng hai enzyme BamHI/
XhoI) và một băng có kích thước 1,7kb (tương ứng với kích thước cDNA mã hoá h-
tPA). Đối với vector pET21a(+), chúng tôi cũng thu được một băng có kích thước
khoảng 5,5kb (tương ứng với kích thước vector pET21a(+)) và một băng có kích
thước khoảng 1,7kb (tương ứng với kích thước cDNA mã hoá h-tPA). Như vậy,
chúng tôi sơ bộ kết luận là đã chọn được một số dòng plasmid tái tổ hợp mang đoạn
gen phù hợp với kích thước của sản phẩm PCR h-tPA.
Kiểm tra vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA bằng kỹ thuật PCR
Để khẳng định lại các dòng plasmid tái tổ hợp đã được chọn có mang đúng
đoạn gen mã hóa h-tPA, chúng tôi đã tiến hành PCR với việc sử dụng các plasmid
được chọn làm khuôn để nhân đoạn h-tPA với các cặp mồi đặc hiệu. DNA mẫu để
chạy PCR là pGEX/htPA p3 và pET/htPA p1. Kết quả kiểm tra các vector tái tổ hợp
bằng kỹ thuật PCR được trình bày trên hình 3.6.
Hình 3.6. Kiểm tra các vector tái tổ hợp mang cDNA mã hóa h-tPA
bằng kỹ thuật PCR
M: Marker 1kb
1: PCR sử dụng khuôn là pET/htPA p1
2: PCR sử dụng khuôn là pGEX/htPA p3
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39
Kết quả điện di cho thấy, sản phẩm PCR của các dòng mang kiểm tra này
đều xuất hiện băng với kích thước khoảng 1,7 kb, đúng với kích thước cDNA mã
hóa cho h-tPA. Như vậy, các dòng được chọn làm khuôn trong thí nghiệm PCR đều
có mang cDNA mã hóa h-tPA. Các dòng này đã được chúng tôi tinh sạch phục vụ
cho xác định trình tự.
3.1.4. Xác định và phân tích trình tự cDNA mã hoá h-tPA
Mặc dù đã được xác định trình tự trong vector tạo dòng pUC18, tuy nhiên,
khi nhân lại cDNA này bằng enzyme Taq DNA polymerase có khả năng phát sinh
các điểm đột biến. Vì vậy, sau khi chọn được các dòng mang cDNA mã hoá h-tPA,
trước khi tiến hành biểu hiện, chúng tôi đã tinh sạch và một lần nữa xác định trình
tự cả hai chiều đoạn cDNA bằng hai cặp mồi: cặp mồi T7 đối với vector pET21a(+)
và cặp mồi PEXF/PEXR đối với vector pGEX6p1 trên máy xác định trình tự tự
động. Trình tự DNA sau đó được xử lý trên các phần mềm: BioEdit, Sequencing
analysis 7.0. Sau khi sử lý số liệu, chúng tôi đã thu được đoạn gen có kích thước
khoảng 1700bp. Phổ trình tự của các dòng plasmid đều rõ ràng, không có tín hiệu
nhiễu. Kết quả phân tích và so sánh với các trình tự đã công bố trên Ngân hàng Gen
Quốc tế như sau:
10 20 30 40 50 60
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 atggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtt
MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGlyAlaValPheVal
pET21a(+) ............................................................
MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGlyAlaValPheVal
pGEX6p1 ............................................................
MetAspAlaMetLysArgGlyLeuCysCysValLeuLeuLeuCysGlyAlaValPheVal
70 80 90 100 110 120
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 tcgcccagccaggaaatccatgcccgattcagaagaggagccagatcttaccaagtgatc
SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSerTyrGlnValIle
pET21a(+) ............................................................
SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSerTyrGlnValIle
pGEX6p1 ............................................................
SerProSerGlnGluIleHisAlaArgPheArgArgGlyAlaArgSerTyrGlnValIle
130 140 150 160 170 180
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 tgcagagatgaaaaaacgcagatgatataccagcaacatcagtcatggctgcgccctgtg
CysArgAspGluLysThrGlnMetIleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgProVal
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40
pET21a(+) ............................................................
CysArgAspGluLysThrGlnMetIleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgProVal
pGEX6p1 ............................................................
CysArgAspGluLysThrGlnMetIleTyrGlnGlnHisGlnSerTrpLeuArgProVal
190 200 210 220 230 240
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ctcagaagcaaccgggtggaatattgctggtgcaacagtggcagggcacagtgccactca
LeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHisSer
pET21a(+) ............................................................
LeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHisSer
pGEX6p1 ............................................................
LeuArgSerAsnArgValGluTyrCysTrpCysAsnSerGlyArgAlaGlnCysHisSer
250 260 270 280 290 300
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 gtgcctgtcaaaagttgcagcgagccaaggtgtttcaacgggggcacctgccagcaggcc
ValProValLysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGlnAla
pET21a(+) ............................................................
ValProValLysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGlnAla
pGEX6p1 ............................................................
ValProValLysSerCysSerGluProArgCysPheAsnGlyGlyThrCysGlnGlnAla
310 320 330 340 350 360
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ctgtacttctcagatttcgtgtgccagtgccccgaaggatttgctgggaagtgctgtgaa
LeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCysGlu
pET21a(+) ............................................................
LeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCysGlu
pGEX6p1 ............................................................
LeuTyrPheSerAspPheValCysGlnCysProGluGlyPheAlaGlyLysCysCysGlu
370 380 390 400 410 420
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 atagataccagggccacgtgctacgaggaccagggcatcagctacaggggcacgtggagc
IleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlyIleSerTyrArgGlyThrTrpSer
pET21a(+) ............................................................
IleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlyIleSerTyrArgGlyThrTrpSer
pGEX6p1 ............................................................
IleAspThrArgAlaThrCysTyrGluAspGlnGlyIleSerTyrArgGlyThrTrpSer
430 440 450 460 470 480
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 acagcggagagtggcgccgagtgcaccaactggaacagcagcgcgttggcccagaagccc
ThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLysPro
pET21a(+) ............................................................
ThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLysPro
pGEX6p1 ............................................................
ThrAlaGluSerGlyAlaGluCysThrAsnTrpAsnSerSerAlaLeuAlaGlnLysPro
490 500 510 520 530 540
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 tacagcgggcggaggccagacgccatcaggctgggcctggggaaccacaactactgcaga
TyrSerGlyArgArgProAspAlaIleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCysArg
pET21a(+) ....................T.......................................
TyrSerGlyArgArgProAspAlaIleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCysArg
pGEX6p1 ....................T.......................................
TyrSerGlyArgArgProAspAlaIleArgLeuGlyLeuGlyAsnHisAsnTyrCysArg
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41
550 560 570 580 590 600
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 aacccagatcgagactcaaagccctggtgctacgtctttaaggcggggaagtacagctca
AsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSerSer
pET21a(+) ............................................................
AsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSerSer
pGEX6p1 ............................................................
AsnProAspArgAspSerLysProTrpCysTyrValPheLysAlaGlyLysTyrSerSer
610 620 630 640 650 660
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 gagttctgcagcacccctgcctgctctgagggaaacagtgactgctactttgggaatggg
GluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGly
pET21a(+) ............................................................
GluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGly
pGEX6p1 ............................................................
GluPheCysSerThrProAlaCysSerGluGlyAsnSerAspCysTyrPheGlyAsnGly
670 680 690 700 710 720
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 tcagcctaccgtggcacgcacagcctcaccgagtcgggtgcctcctgcctcccgtggaat
SerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsn
pET21a(+) ............................................................
SerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsn
pGEX6p1 ............................................................
SerAlaTyrArgGlyThrHisSerLeuThrGluSerGlyAlaSerCysLeuProTrpAsn
730 740 750 760 770 780
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 tccatgatcctgataggcaaggtttacacagcacagaaccccagtgcccaggcactgggc
SerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGly
pET21a(+) ............................................................
SerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGly
pGEX6p1 ............................................................
SerMetIleLeuIleGlyLysValTyrThrAlaGlnAsnProSerAlaGlnAlaLeuGly
790 800 810 820 830 840
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ctgggcaaacataattactgccggaatcctgatggggatgccaagccctggtgccacgtg
LeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisVal
pET21a(+) ............................................................
LeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisVal
pGEX6p1 ............................................................
LeuGlyLysHisAsnTyrCysArgAsnProAspGlyAspAlaLysProTrpCysHisVal
850 860 870 880 890 900
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ctgaagaaccgcaggctgacgtgggagtactgtgatgtgccctcctgctccacctgcggc
LeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGly
pET21a(+) ............................................................
LeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGly
pGEX6p1 ............................................................
LeuLysAsnArgArgLeuThrTrpGluTyrCysAspValProSerCysSerThrCysGly
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42
910 920 930 940 950 960
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ctgagacagtacagccagcctcagtttcgcatcaaaggagggctcttcgccgacatcgcc
LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAla
pET21a(+) ............................................................
LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAla
pGEX6p1 ............................................................
LeuArgGlnTyrSerGlnProGlnPheArgIleLysGlyGlyLeuPheAlaAspIleAla
970 980 990 1000 1010 1020
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 tcccacccctggcaggctgccatctttgccaagcacaggaggtcgcccggagagcggttc
SerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPhe
pET21a(+) ............................................................
SerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPhe
pGEX6p1 ............................................................
SerHisProTrpGlnAlaAlaIlePheAlaLysHisArgArgSerProGlyGluArgPhe
1030 1040 1050 1060 1070 1080
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ctgtgcgggggcatactcatcagctcctgctggattctctctgccgcccactgcttccag
LeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGln
pET21a(+) ............................................................
LeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGln
pGEX6p1 ............................................................
LeuCysGlyGlyIleLeuIleSerSerCysTrpIleLeuSerAlaAlaHisCysPheGln
1090 1100 1110 1120 1130 1140
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 gagaggtttccgccccaccacctgacggtgatcttgggcagaacataccgggtggtccct
GluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValPro
pET21a(+) ............................................................
GluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValPro
pGEX6p1 ............................................................
GluArgPheProProHisHisLeuThrValIleLeuGlyArgThrTyrArgValValPro
1150 1160 1170 1180 1190 1200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ggcgaggaggagcagaaatttgaagtcgaaaaatacattgtccataaggaattcgatgat
GlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAsp
pET21a(+) ............................................................
GlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAsp
pGEX6p1 ............................................................
GlyGluGluGluGlnLysPheGluValGluLysTyrIleValHisLysGluPheAspAsp
1210 1220 1230 1240 1250 1260
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 gacacttacgacaatgacattgcgctgctgcagctgaaatcggattcgtcccgctgtgcc
AspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAla
pET21a(+) ............................................................
AspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAla
pGEX6p1 ............................................................
AspThrTyrAspAsnAspIleAlaLeuLeuGlnLeuLysSerAspSerSerArgCysAla
1270 1280 1290 1300 1310 1320
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 caggagagcagcgtggtccgcactgtgtgccttcccccggcggacctgcagctgccggac
GlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAsp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43
pET21a(+) ............................................................
GlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAsp
pGEX6p1 ............................................................
GlnGluSerSerValValArgThrValCysLeuProProAlaAspLeuGlnLeuProAsp
1330 1340 1350 1360 1370 1380
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 tggacggagtgtgagctctccggctacggcaagcatgaggccttgtctcctttctattcg
TrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSer
pET21a(+) ............................................................
TrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSer
pGEX6p1 ............................................................
TrpThrGluCysGluLeuSerGlyTyrGlyLysHisGluAlaLeuSerProPheTyrSer
1390 1400 1410 1420 1430 1440
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 gagcggctgaaggaggctcatgtcagactgtacccatccagccgctgcacatcacaacat
GluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHis
pET21a(+) ............................................................
GluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHis
pGEX6p1 ............................................................
GluArgLeuLysGluAlaHisValArgLeuTyrProSerSerArgCysThrSerGlnHis
1450 1460 1470 1480 1490 1500
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ttacttaacagaacagtcaccgacaacatgctgtgtgctggagacactcggagcggcggg
LeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGly
pET21a(+) ............................................................
LeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGly
pGEX6p1 ............................................................
LeuLeuAsnArgThrValThrAspAsnMetLeuCysAlaGlyAspThrArgSerGlyGly
1510 1520 1530 1540 1550 1560
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 ccccaggcaaacttgcacgacgcctgccagggcgattcgggaggccccctggtgtgtctg
ProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeu
pET21a(+) ............................................................
ProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeu
pGEX6p1 ............................................................
ProGlnAlaAsnLeuHisAspAlaCysGlnGlyAspSerGlyGlyProLeuValCysLeu
1570 1580 1590 1600 1610 1620
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 aacgatggccgcatgactttggtgggcatcatcagctggggcctgggctgtggacagaag
AsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLys
pET21a(+) ............................................................
AsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLys
pGEX6p1 ............................................................
AsnAspGlyArgMetThrLeuValGlyIleIleSerTrpGlyLeuGlyCysGlyGlnLys
1630 1640 1650 1660 1670 1680
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NM_000930 gatgtcccgggtgtgtacaccaaggttaccaactacctagactggattcgtgacaacatg
AspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMet
pET21a(+) ............................................................
AspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMet
pGEX6p1 ............................................................
AspValProGlyValTyrThrLysValThrAsnTyrLeuAspTrpIleArgAspAsnMet
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44
....|....
NM_000930 cgaccgtga
ArgProEnd
pET21a(+) ......---
ArgPro
pGEX6p1 .........
ArgProEnd
Hình 3.7. So sánh trình tự nucleotide của h-tPA trong pGEX6p1/h-tPA và
pET21a(+)/h-tPA với NM_000930
Từ kết quả so sánh trên, chúng tôi nhận thấy trình tự cDNA mã hóa h-tPA
được tạo dòng trong hai vector biểu hiện hoàn toàn không thay đổi so với trình tự
cDNA đã xác định được trong vector tạo dòng pUC18. So với NM_000930, trình tự
cDNA của chúng tôi không có sự thay đổi nào đáng kể, chỉ có một sai khác nằm ở
vị trí 499 của cDNA mã hóa h-tPA. Ở trình tự NM_000930, vị trí 499 nucleotitde
này là C được thay thế bằng nucleotide T trong trình tự chúng tôi đang nghiên cứu
biểu hiện. Tuy nhiên trình tự này không làm thay đổi trình tự acid amin, vì vậy
không ảnh hưởng tới cấu trúc và chức năng của protein. Ở vector pET21a(+), không
có trình tự kết thúc do chúng tôi thiết kế mồi PCR nhằm gắn đuôi His vào giúp quá
trình tinh sạch protein h-tPA sau này được dễ hơn.
3.2. Biểu hiện gen
3.2.1. Tổng hợp protein h-tPA tái tổ hợp
Trong nghiên cứu này, sau khi thu được các dòng plasmid mang gen cDNA
mã hoá h-tPA, để biểu hiện trong vi khuẩn E. coli, chúng tôi đã tiến hành biến nạp
hai vector tái tổ hợp (pET21a(+) và pGEX6p1) mang gen mã hoá h-tPA vào tế bào
vi khuẩn E. coli chủng BL21(DE3) plysS. Các dòng tế bào này sau đó được cấy
chuyển và tiếp tục nuôi lắc 200 v/p trong môi trường LB lỏng có bổ sung Amp ở
37
oC cho tới khi OD= 0,6 thì tiến hành cảm ứng IPTG 0,1mM. Đối với vector biểu
hiện pGEX6p1, theo tính toán lý thuyết, protein h-tPA tái tổ hợp có khối lượng
phân tử khoảng 95kDa (bằng tổng khối lượng của protein h-tPA (70 kDa) và đoạn
GST (26,4 kDa)); còn đối với vector biểu hiện pET21a(+), khối lượng phân tử
protein tái tổ hợp thu được khoảng 72kDa.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45
Sau mỗi giờ từ khi cảm ứng IPTG chúng tôi đã tiến hành thu 1ml dịch tế bào
nhằm kiểm tra độ biểu hiện của tế bào. Kết thúc thí nghiệm, chúng tôi thu được dịch
tế bào có chứa protein tái tổ hợp. Để kiểm tra kết quả biểu hiện chúng tôi đã tiến
hành điện di protein trên gel polyacrylamide 10%.
3.2.2. Kiểm tra protein bằng phƣơng pháp điện di trên SDS-PAGE
Đối với vector biểu hiện pGEX6p1 mang h-tPA, kết quả phân tích SDS-
PAGE cho thấy các mẫu thí nghiệm đã xuất hiện một băng protein mới có kích
thước khoảng 95kDa so với các mẫu đối chứng. Đây rất có thể là dạng protein dung
hợp giữa h-tPA (72kDa) với đuôi GST (26,4kDa) của vector pGEX6p1.
Mẫu đối chứng âm chúng tôi sử dụng là dịch phá màng của tế bào BL21 có
chứa vector pGEX6p1 gốc (giếng 5) và dịch phá màng của E.coli BL21 không
mang vector (giếng 7) có cảm ứng IPTG. Các mẫu đối chứng âm này cũng xuất
hiện băng nhưng kích thước nhỏ và không rõ nét. Có thể ở những mẫu này, tế bào
chủ có tổng hợp một số protein có cùng kích thước nhưng hàm lượng thấp. Ở giếng
5 xuất hiện băng đậm có kích thước 26,4kDa, đây là băng GST đã được tổng hợp
tuy nhiên do plasmid không mang gen cDNA mã hóa h-tPA nên trong quá trình
tổng hợp protein, h-tPA không được tổng hợp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46
Hình 3.8. Điện di kiểm tra protein h-tPA trong pGEX/h-tPA p3
M: Marker
1, 2, 3, 4: Mẫu thu được sau 0h, 1h, 2h, 3h cảm ứng IPTG
5: Dòng tế bào mang vector pGEX6p1
6: Mẫu thu được sau 3h cảm ứng IPTG
7: Dòng tế bào không mang vector
Để xác định được thời điểm tại đó lượng protein được tổng hợp là cao nhất,
chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm trong 3h sau khi cảm ứng. Sau khoảng thời gian
0h, 1h, 2h, 3h chúng tôi đã tiến hành thu mẫu. Kết quả cho thấy kích thước và độ
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47
đậm của băng này tăng theo thời gian sau khi cảm ứng IPTG và đậm nhất tại thời
điểm 3h sau cảm ứng.
Kết quả này cho thấy dòng tế bào E.coli BL21 có mang plasmid pGEX6p1
tái tổ hợp có khả năng tổng hợp protein dung hợp GST-htPA. Tuy nhiên hàm lượng
protein tái tổ hợp còn thấp so với tổng lượng protein được tổng hợp.
Song song với thí nghiệm biểu hiện h-tPA trong vector pGEX6p1, chúng tôi
cũng tiến hành biểu hiện protein h-tPA trong vector pET21a(+) trên tế bào chủ
E.coli BL21.
Sau khi thu được dịch protein, chúng tôi đã điện di trên gel polyacrylamide
10% với thang protein chuẩn và các đối chứng âm. Các đối chứng âm ở đây cũng là
dịch phá màng tế bào E. coli BL21 không mang vector và có mang vector
pET21a(+) đều được cảm ứng IPTG.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 48
Hình 3.9. Điện di protein h-tPA trong pET21/h-tPA p1
M: Marker
1: Dòng tế bào BL21
2: Dòng tế bào BL21 mang vector pET21a(+) gốc
3, 4, 5, 6: Mẫu thu được sau 0h, 1h, 2h, 3h cảm ứng IPTG
Sau khi thu được dịch protein, chúng tôi đã điện di trên gel polyacrylamide
10% với thang protein chuẩn và các đối chứng âm. Các đối chứng âm ở đây cũng là
Formatted: Font: 13 pt, Do not check spelling
or grammar
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 49
dịch phá màng tế bào E. coli BL21 không mang vector và có mang vector
pET21a(+) đều được cảm ứng IPTG.
Kết quả điện di cho thấy không có sự khác biệt nhiều về số lượng và độ đậm
nhạt băng giữa các dòng E.coli BL21 mang vector pET21a(+)/h-tPAvới các đối
chứng âm (giếng 1 và giếng 2).
Ở vị trí 72kDa có xuất hiện băng nhưng giữa các mẫu điện di là giống nhau.
Nếu h-tPA không được biểu hiện thì băng 72kDa này là protein có cùng khối lượng
của tế bào E.coli được tổng hợp. Nếu gen h-tPA được tổng hợp thì hàm lượng
protein được tổng hợp là rất thấp so với tổng lượng protein của tế bào chủ.
Để có những kết luận chính xác về quá trình biểu hiện của cDNA mã hóa h-
tPA, cần có những nghiên cứu khác như: lai Western Blot, hay kỹ thuật Elisa...
nhằm khẳng định protein h-tPA được tổng hợp. Mặt khác, các điều kiện thí nghiệm
khác cũng cần được nghiên cứu tối ưu để quá trình biểu hiện cho lượng protein h-
tPA là lớn nhất và tiến tới ứng dụng quy trình biểu hiện.
Cũng cần nhấn mạnh rằng, mặc dù hệ thống biểu hiện gen của sinh vật bậc
cao trên đối tượng vi khuẩn E. coli bên cạnh nhiều ưu điểm như: môi trường nuôi
cấy rẻ; dễ điều khiển quá trình biểu hiện; hàm lượng protein thu được lớn (đến 30%
tổng protein tế bào).... còn tồn tại một vài nhược điểm. Đây là một quá trình phức
tạp và khó thực hiện do hệ thống này chỉ biểu hiện tốt đối với protein có kích thước
nhỏ hơn 80 acid amin, đối với các protein có kích thước lớn thì hệ thống biểu hiện
E.coli có thể tổng hợp được protein nhưng protein này có thể không cuộn xoắn; bộ
ba mã hóa ở E.coli có sự khác biệt nhiều với bộ ba mã hóa ở sinh vật bậc cao; các
quá trình cải biến sau dịch mã thường không có; khả năng biểu hiện một protein
đơn lẻ không tốt..... Đối với h-tPA, đã có nhiều công trình công bố biểu hiện được
trên E. coli nhưng hàm lượng protein thu được chưa cao. Vì vậy, việc nghiên cứu
biểu hiện trên các đối tượng khác như nấm men, tế bào côn trùng, tế bào động vật
cũng được quan tâm ở nhiều phòng thí nghiệm.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 50
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Kết luận
1. Đã tạo được hai vector biểu hiện pGEX6p1 và pET21a(+) mang cDNA mã
hóa h-tPA có kích thước khoảng 1,7kb.
2. Đã xác định trình tự nucleotide của cDNA mã hóa h-tPA. So sánh trình tự
nucleotide của cDNA mã hóa h-tPA với trình tự gen trên Ngân hàng Gen
Quốc tế, mã số NM_000930 cho thấy độ tương đồng đạt 99%. So với
NM_000930, trình tự cDNA nghiên cứu không có sự thay đổi nào đáng kể,
chỉ có một sai khác nằm ở vị trí 499 của cDNA mã hóa h-tPA. Ở trình tự
NM_000930, vị trí 499 nucleotitde này là C được thay thế bằng nucleotide T.
Tuy nhiên, sự khác biệt này không làm thay đổi trình tự acid amin, vì vậy
không ảnh hưởng tới cấu trúc và chức năng của protein.
3. Đã tiến hành biểu hiện cDNA mã hóa h-tPA trên hai vector pGEX6p1 và
pET21a(+) và thu được protein h-tPA khi biểu hiện trong vector pGEX6p1.
Đề nghị
- Tiếp tục nghiên cứu biểu hiện cDNA mã hóa h-tPA trong vector
pET21a(+) trên vi khuẩn E.coli chủng BL21.
- Tối ưu hoá quá trình biểu hiện đối với cDNA mã hóa h-tPA trong
pGEX6p1 nhằm thu được hàm lượng protein lớn nhất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Lê Trần Bình, Cao Huyền Trang (2005), “Nghiên cứu và phát triển sản xuất
vaccine ăn được trong thực vật”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 133- 142.
2. Nguyễn Đình Cường, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Lương Thị Thu
Hường, Trần Thị Phương Liên, Nguyễn Huy Hoàng, Phan Văn Chi, Nông
Văn Hải (2003), “Biểu hiện gen mã hóa protein bất hoạt ribosome của cây
mướp đắng ở vi khuẩn Escherichia coli”, Tạp chí Công nghệ Sinh học,
1(4), tr. 451- 460.
3. Nguyễn Thúy Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu, Phan Văn Chi (2003), “Khả
năng ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro của Trichobakin tái tổ
hợp”, Y học Việt Nam, 284(5), tr. 26- 30.
4. Đặng Trần Hoàng, Vũ Minh Đức, Phùng Thu Nguyệt, Trương Nam Hải
(2005), “Biểu hiện gen interleukin- 2 của người rh-LL2LL bị đột biến tại
các điểm glycosyl hóa và gốc cysteine 125 trong Escherichia coli”, Tạp chí
Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 149- 154.
5. Bùi Thị Huyền, Đặng Thành Nam, Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Hoàng
Quốc Trường, Phan Văn Chi (2005), “Biểu hiện và xác định interleukin- 2 của
người”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 143- 148.
6. Nguyễn Nam Long, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi (2005), “Tách dòng gen mã
hóa interleukin- 2 của người”, Y học Việt Nam, 310(5), tr. 26- 30.
7. Chu Kỳ Nam, Hoàng Văn Quốc Chương, Trần Linh Thước (2005), “Tạo dòng
và biểu hiện mini-proinsulin của người tái tổ hợp trong Escherichia coli”,
Tạp chí Công nghệ Sinh học, 3(2), tr. 155- 160.
8. Phạm Thiệp, Vũ Ngọc Thúy, Nguyễn Hữu Lộc (1992), “Thuốc, biệt dược và
cách sử dụng”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 52
Tiếng Anh
9. Axelsson F. (1995), “Plasminogen”, Product monograph.
10. Becker C., Nong V.H., Bäumlein H., Le T.X., Farouk A., Will H., Bassüner
R. (1993), “Synthesis and accumulation of human tissue-type plasminogen
activator (h-tPA) in transgenic tobaco seeds”, Seed storage compounds 35,
pp. 326- 331.
11. Berg D.T., Burck P.J., Grinnell B.W. (1993), “Kringle glycosylation in a
modified human tissue plasminogen activator improves functional
properties”, Blood 81(5), pp. 1312- 1322.
12. Bhopale G.M., Nanda R.K. (2005), “Recombinant DNA expression products
for human therapeutic use”, Curr. Scie. 89(4), pp. 614- 622.
13. Booyse F.M., Scheinbuks J., Lin P.H., Traylor M., Bruce R. (1988), “Isolation
and interrelationships of the multiple molecular tissue-type and urokinase-
type plasminogen activator forms produced by cultured human umbilical
vein endothelial cells”, J. Biol. Chem. 263(29), pp. 15129- 15138.
14. Bulleid N.J., Bassel- Duby R.S., Freedman R.B., Sambrook J.F., Gething
M.H. (1992), “Cell-free synthesis of enzymically active tissue-type
plasminogen activator”, Biochem. J. 286, pp. 275- 280.
15. Burck P.J., Berg D.H., Warrick M.W., Berg D.T., Walls J.D., Jaskunas S.R.,
Crisel R.M., Weigel B., Vlahos C.J., McClure D.B., Grinnell B.W. (1990),
“Characterization of a modified human tissue plasminogen activator
comprising a kringle-2 and a protease domain”, J. Biol. Chem. 265(9), pp.
5170- 5177.
16. Carlie V.C., Veerman H., Pannekoek H. (1989), “Identification of the
domains of tissue-type plasminogen activator involved in the augmented
binding to fibrin after limited digestion with plasmin”, J. Biol. Chem.
264(21), pp. 12604- 12610.
17. Cartwright T. (1992), “Production of t-PA from animal cell culture”, Animal.
Cell Biotechnol. 5, pp. 218- 245.
18. Castellio F.J. (1983), “Plasminogen activator”, BioScience 33(11), pp. 647- 650.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 53
19. Collen D., Lunen R. (2004), “Tissue- type plasminogen activator: a historical
perspective and personal account”, J. Thromb. Haemost 2, pp. 541- 546.
20. Degeng S.J.F., Rajput B., Reich E. (1986), “The human tissue plasminogen
activator gene”, J. Biol. Chem. 261(15), pp. 6972- 6985.
21. Demaerschalk B.M., Yip T.R. (2005), “Economic benefit of increasing
utilization of intravenous tissue plasminogen activator for acute ischemic
stroke in the United States”, Stroke 36, pp. 2500- 2503.
22. Demain A.L. (2005), “The Biopharmaceutical revolution”, TeknoScienze 22(11).
23. Edlund T., Ny T., Ranby M., Hedon L., Palms G., Holmgren E., Josephson
S. (1983), “Isolation of cDNA sequences coding for a part of human tissue
plasminogen activator”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, pp. 349- 352.
24. Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P. (2003), “The production of
recombinant pharmaceutical proteins in plants”, Nat. Rev. Genet. 4, pp.
794- 805.
25. Fischer R., Stoger E., Schillberg S., Christou P., Twyman R.M. (2004),
“Plant- based production of biopharmaceuticals”, Curr. Opin. Plant Biol. 7,
pp. 152- 158.
26. Griffiths J.B., Electricwala A. (1987), “Production of tissue plasminogen
activators from animal cells”, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 34, pp. 147- 166.
27. Hoffman J.R. (2005), “Tissue plasminogen activator (tPA) for acute
ischaemic stroke: Why so much has been made of so little”, Med. J. Aust.
179(7), pp. 333-334.
28. Kalyan K.S., Lee S.G., Wilhelm J., Fu K.F., Hum W.T., Rappaport R.,
Hartzell R.W., Urbano C., Hung P.P. (1988), “Structure-function analysis
with tissue-type plasminogen activator”, Biochem. J. 263 (8), pp. 3971-3378.
29. Laemmli U.K. (1970), “Cleavage of Structural Proteins during the Assembly
of the Head of Bacteriophage T4”, Nature 22, pp. 680- 685.
30. Leonardi A., Brun P., Sartori M.T., Cortivo R., DeDominicis C., Saggiorato
G., Abatangelo G., Secchi A.G. (2005), “Urokinase plasminogen activator,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 54
uPa receptor, and its inhibitor in Vernal keratoconjunctivitis”, Invest.
Ophthalmol. Vis. Sci. 46, pp. 1364- 1370.
31. Li Z.L., An J. (2002), “Cloning and identification of human tissue - type
plasminogen activator gene”, Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao 22(1), pp. 22- 24.
32. Ma J.K.C., Drake P.M.W., Christou P. (2003), “The production of
recombinant pharmaceutical protein in plant”, Nature 4, pp. 794- 805.
33. Ma J.K.C., Barros E., Bock R., Christou P., Dale P.J., Dix P.J., Fischer R.,
Irwin J., Mahoney R., Pezzotti M., Schillberg S., Sparrow P., Stoger E.,
Twyman R. M. (2005), “Molecular farming for new drugs and vaccines”,
EMBO rep. 6(7), pp
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- doc420.pdf