Tài liệu Luận văn Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó: BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
ĐỖ HOÀNG KHIÊM
MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY
TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG
HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ
Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY
TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG
HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ
Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN ĐỖ HOÀNG
KHIÊM
BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Khóa: 2002-2006
KS. NGUYỄN VĂN ÚT
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***
FACTORS EFFECT ON THE RESULT OF
CULTURE OF OVIDUCTAL EPITHELIAL CELLS
AND DOG SPERM CAPACITATION
Graduat...
58 trang |
Chia sẻ: hunglv | Lượt xem: 1063 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem trước 20 trang mẫu tài liệu Luận văn Một số yếu tố ảnh hưởng kết quả nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó, để tải tài liệu gốc về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
ĐỖ HOÀNG KHIÊM
MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY
TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG
HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ
Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***
MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY
TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG
HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ
Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học
Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN ĐỖ HOÀNG
KHIÊM
BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH Khóa: 2002-2006
KS. NGUYỄN VĂN ÚT
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 09/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
***000***
FACTORS EFFECT ON THE RESULT OF
CULTURE OF OVIDUCTAL EPITHELIAL CELLS
AND DOG SPERM CAPACITATION
Graduation thesis
Major: Biotechnology
Professor: Student:
A.Professor. Dr. TRAN THI DAN DO HOANG KHIEM
Veterinarian. QUACH TUYET ANH Term: 2002 - 2006
Engineer. NGUYEN VAN UT
Ho Chi Minh City
09/2006
iv
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành gởi lời cảm ơn sâu sắc đến:
Ban giám hiệu trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt quá trình học tại trƣờng.
Cô Trần Thị Dân đã hết lòng hƣớng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập tốt
nghiệp, một tấm gƣơng lao động, một phong cách làm việc cần đƣợc noi theo.
Thầy Đinh Xuân Phát, cô Quách Tuyết Anh và thầy Nguyễn Văn Út đã
truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm sống và làm việc, tận tình giúp đỡ và chỉ dẫn
cho tôi trong suốt quá trình thực tập.
Thầy Trần Ngọc Hùng đã truyền đạt cho tôi những kinh nghiệm về quá trình
thực tập tốt nghiệp.
Thầy Nguyễn Văn Thuận và thầy Nguyễn Thanh Bình đã truyền đạt những
kinh nghiệm nghiên cứu thực tế cho tôi.
Gia đình Bác Sáu, gia đình chị Hạnh và gia đình anh Phƣớc đã tạo điều kiện
thuận lợi để tôi hoàn thành đề tài này.
Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 và những ngƣời bạn thân đã chia sẽ
những vui buồn cũng nhƣ hỗ trợ tôi trong quá trình thực tập tốt nghiệp.
Thủ Đức, ngày 15-08-06
Đỗ Hoàng Khiêm
v
TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Đỗ Hoàng Khiêm, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “MỘT
SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG KẾT QUẢ NUÔI CẤY TẾ BÀO BIỂU MÔ ỐNG DẨN
TRỨNG VÀ PHẢN ỨNG HOẠT HÓA TINH TRÙNG CHÓ”
Hƣớng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN
2. BSTY. QUÁCH TUYẾT ANH
3. KSCNSH. NGUYỄN VĂN ÚT
Đề tài đƣợc tiến hành từ ngày 06/02/2006 đến 06/07/06 tại trƣờng Đại Học Nông
Lâm TP. Hồ Chí Minh.
Ngày nay, kỹ thuật thụ tinh in vitro ngày càng đƣợc hoàn thiện và có tiềm năng
lớn trong việc ứng dụng nhân giống nhanh ở những thú cao sản hoặc thú quý hiếm. Để
tiếp cận kỹ thuật này chúng tôi tiến hành nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng và xác
định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản đến phản ứng hoạt hóa tinh trùng nhằm hoàn
thiện dần các công đoạn trong việc nâng cao tỉ lệ chó quý hiếm đƣợc tạo ra từ kỹ thuật
thụ tinh in vitro. Kết quả đạt đƣợc nhƣ sau:
1. Thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng nhanh hơn với phƣơng pháp vuốt và nuôi
cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo.
2. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính
(lamelle) cho tỉ lệ thành công 28,6% (tỉ lệ đĩa xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”) trong
khi phƣơng pháp không sử dụng lá kính cho kết quả thất bại.
3. Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh trùng.
Chất lƣợng của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa ở mốc thời gian bảo quản 0
giờ là tốt nhất, với hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động
trung bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03).
vi
MỤC LỤC
NỘI DUNG TRANG
Bìa 1 .................................................................................................................................i
Bìa 2 ............................................................................................................................... ii
Lời cảm tạ ..................................................................................................................... iii
Tóm tắt khóa luận ..........................................................................................................iv
Mục lục ........................................................................................................................... v
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii
Danh sách các bảng .................................................................................................... viii
Danh sách các hình ........................................................................................................ix
PHẦN I. MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu ................................................................................................................... 1
1.3. Yêu cầu .................................................................................................................... 2
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng ....................................................................... 3
2.1.1. Cấu tạo ............................................................................................................ 3
2.1.2. Chức năng ....................................................................................................... 4
2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng ............................................. 4
2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng ............. 4
2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể .................................... 4
2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào .............................................................. 6
2.3.1. Bề mặt chai cấy ............................................................................................... 6
2.3.2. Các đặt tính vật lý ........................................................................................... 6
2.3.2.1. pH .......................................................................................................... 6
2.3.2.2. Dung dịch đệm ...................................................................................... 7
2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu .................................................................................. 7
2.3.2.4. Nhiệt độ ................................................................................................. 7
2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí ........................................................................ 7
2.3.2.6. Độ nhớt ................................................................................................... 8
2.3.3. Tủ cấy .............................................................................................................. 8
2.3.4. Kháng sinh ...................................................................................................... 8
2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào ........................................................................ 8
2.4.1. Nguồn nhiễm ................................................................................................... 8
2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật ...................................................... 8
2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác ....................................................................... 9
2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào ................................................. 9
2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng ............................................................. 10
2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp ............................................................................................. 10
2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp ........................................................................................... 11
2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue .................. 11
2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng .................... 11
2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi ........ 11
2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó ........................ 12
2.9. Tinh trùng .............................................................................................................. 13
2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng ............................................................ 13
vii
2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng ................................................................................... 14
2.9.3. Đặc tính của tinh trùng .................................................................................. 15
2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong dƣờng sinh dục cái ..................................... 16
2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó ................................................ 17
2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng .......................................... 17
2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó ............................................... 19
2.11. Hoạt hóa tinh trùng .............................................................................................. 20
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 23
3.1. Nội dung ................................................................................................................ 23
3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện ............................................................................ 23
3.3. Vật liệu .................................................................................................................. 23
3.3.1. Nguồn mẫu .................................................................................................... 23
3.3.2. Dụng cụ và thiết bị ........................................................................................ 23
3.3.3. Hoá chất ........................................................................................................ 24
3.4. Phƣơng pháp .......................................................................................................... 25
3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng .................................................. 25
3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ ......................................................... 25
3.4.1.2. Xử lí ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm ............................................ 25
3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ................................................ 26
3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng ............................................... 28
3.4.1.5. Nhuộm tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng trypan blue ...................... 29
3.4.2. Chuẩn bị tinh trùng cho quá trình thụ tinh in vitro ...................................... 30
3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm ............ 30
3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng ............................................................................... 30
3.5. Xử lí số liệu ........................................................................................................... 34
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 35
4.1. Thí nghiệm 1: thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng ........................................ ..35
4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng ................ ..35
4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa ............. 37
4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng.................................................................................. 37
4.3.2. Nồng độ của tinh trùng ................................................................................. 38
4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................................. 39
4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome .......................................... 40
4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng .............................................................. 41
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 44
5.1. Kết luận .................................................................................................................. 44
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 45
PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 47
viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AR: acrosome reaction
BOEC: bovine oviductal epithelial cells
BSA: bovine serum albumin
DNA: deoxyribonucleic acid
DNP: deoxyribonucleoprotein
ECS: estrous cow serum
EGF: epidermal growth factor
ELISA: enzyme linked immunosorbent assay
ET: embryo stransfer
FBS: phosphate buffered saline
FCS: fetal calf serum
FGF: fibroblast growth factor
HSA: human serum albumin
IGF: insulin – like growth factor
IVC: in vitro culture
IVF: in vitro fertilization
IVM: in vitro maturation
M II: metaphase II
PCR: polymerase chain reaction
PDGF: platelet – derived growth factor
RNA: ribonucleic acid
ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG TRANG
Bảng 2.1 Giá trị pH......................................................................................................... 7
Bảng 2.2 Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES ...................................................... 9
Bảng 2.3 Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó của Iguer và Verstegen ............... 19
Bảng 2.4 Công thức pha chế 4 môi trƣờng ................................................................... 20
Bảng 4.1 Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy ................. 35
Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng ................................................................... 37
Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng .......................................................................... 38
Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ...................................................... 39
Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome ............... 40
Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................ 42
x
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
HÌNH TRANG
Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi tên) sau 3 ngày nuôi cấy ................................... 36
Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế bào chết (trong vòng tròn) ............................... 36
Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm trƣớc phản ứng hoạt hóa ......................................... 41
Hình 4.4 Tinh trùng đƣợc nhuộm sau phản ứng hoạt hóa ............................................ 41
Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng ........................................................................ 43
BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng ................................................................. 37
Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng ................................................................ 38
Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình ................................................................ 39
Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome ............................ 40
Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ............................................. 42
1
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển, mức sống nhân dân tăng dần thì đời sống tinh thần
đƣợc chú trọng hơn. Mỗi ngƣời đều cần đƣợc giải trí, bầu bạn, tâm sự và hơn hết là
cần đƣợc bảo vệ tính mạng cũng nhƣ tài sản. Để đáp ứng nhu cầu này, chó là loài vật
đƣợc ƣa chuộng hàng đầu do bởi tính trung thành, sự thông minh, lòng can đảm… Cho
nên chó ngày càng gắn bó và giữ một vị trí nhất định trong mỗi gia đình.
Khi cuộc sống gia đình đƣợc sung túc, mức tiêu khiển giải trí của con ngƣời đòi
hỏi sâu sắc hơn. Từ đó, chó đƣợc ƣa thích trong nhà phải là chó đẹp, quý, lạ mắt,
thƣờng là chó nhập và có giá thành cao. Do đó, tiềm năng của thị trƣờng này ở nƣớc ta
còn rất lớn. Tuy nhiên, những loại chó này thƣờng bị giới hạn về mặt sinh sản hay
nhân giống. Để giải quyết tốt những vấn đề này, tiềm năng của kĩ thuật thụ tinh in
vitro tỏ ra tối ƣu bởi vì kĩ thuật này có những ƣu điểm sau (Hoàng Kim Giao, 2003):
- Khai thác đƣợc nhiều nhất tiềm năng sinh sản của con cái, nhất là ở những
động vật quý hiếm có nguy cơ bị tiêu diệt và những gia súc cái cao sản.
- Góp phần tham gia vào quá trình chọn lọc, nhân giống và lai tạo giống
nhanh để đạt đƣợc những tính trạng mong muốn và năng suất cao.
- Đánh giá nhanh khả năng thụ tinh của những con đực giống.
- Cung cấp số lƣợng lớn phôi với giá thành hạ cho các nhà nghiên cứu và khai
thác tế bào mầm.
Hiện nay tỉ lệ phôi thai chó đƣợc tạo ra từ quá trình nuôi trứng chín in vitro
(IVM), thụ tinh in vitro (IVF), nuôi cấy phôi (IVC) và chuyển cấy phôi (ET) vẫn còn
khá thấp (Farstad, 2000).
Vì vậy, để tiếp cận kĩ thuật thụ tinh in vitro và đáp ứng nhu cầu của xã hội về
những giống chó đƣợc ƣa chuộng, đề tài “Một số yếu tố ảnh hƣởng kết quả nuôi cấy tế
bào biểu mô ống dẫn trứng và phản ứng hoạt hóa tinh trùng chó” đƣợc thực hiện.
1.2. Mục tiêu
Chuẩn bị môi trƣờng nuôi cấy phôi và hoàn thiện khả năng thụ tinh của tinh
trùng, góp phần tăng khả năng thành công trong thụ tinh in vitro trên loài chó.
2
1.3. Yêu cầu
- Thiết lập quy trình nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng.
- Bố trí thí nghiệm để đánh giá ảnh hƣởng của thời gian bảo quản tinh pha chế lên
khả năng hoạt hóa tinh trùng.
3
PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Cấu tạo và chức năng ống dẫn trứng
2.1.1. Cấu tạo
Ống dẫn trứng đƣợc chia thành 4 đoạn (Trịnh Bình và ctv, 2004): đoạn tiếp giáp
sừng tử cung; đoạn eo; đoạn bóng phình to và đoạn loa có hình phễu, mở vào khoang
bụng, có những tua ít nhiều chụp lên mặt buồng trứng.
Thành ống dẫn trứng, từ trong ra ngoài, gồm ba tầng mô (Trịnh Hữu Hằng và
Đỗ Công Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004): tầng niêm mạc, tầng cơ và tầng vỏ
ngoài.
- Tầng niêm mạc gồm biểu mô và lớp đệm.
Biểu mô đƣợc cấu tạo bởi bốn loại tế bào: tế bào có lông, tế bào không có
lông, tế bào đáy và tế bào trung gian.
Tế bào có lông: hình trụ, bào tƣơng sáng, đôi khi có hạt ở vùng chung
quanh nhân. Nhân hình trứng, kém bắt màu. Mặt tự do của tế bào có những lông dài
cắm vào thể đáy và chuyển động một chiều về phía tử cung. Bào tƣơng chứa ty thể, bộ
Golgi, lƣới nội bào và những hạt glycogen.
Tế bào không có lông: hình trụ, ít bào tƣơng. Nhân hình cầu hay hình
trứng, bắt màu đậm. Mặt tự do của tế bào có những vi nhung mao và những chỗ lõm
siêu vi. Bào tƣơng chứa bộ Golgi, ty thể, lƣới nội bào và những hạt chế tiết. Những tế
bào không lông là những tế bào chế tiết. Sản phẩm chế tiết của chúng rất cần thiết cho
noãn và tinh trùng đã lọt vào trong ống dẫn trứng.
Tế bào đáy: nhỏ, nằm rải rác, có bào tƣơng sáng, ít bào quan, nhân bắt
màu mạnh. Chức năng còn chƣa rõ ràng.
Tế bào trung gian: nằm chen vào giữa những tế bào có lông và tế bào chế
tiết. Nhân cũng bắt màu mạnh.
Lớp đệm ngăn cách với biểu mô ở màng đáy, có những chỗ lồi, đẩy biểu mô
lên và tạo thành những nếp nhăn của niêm mạc. Lớp đệm là một mô liên kết chứa
nhiều mạch máu và mạch bạch huyết. Trong lớp đệm có những tế bào hình thoi nhƣ
những nguyên bào sợi, một số tế bào lympho và bạch cầu đơn nhân nằm trong một
lƣới sợi. Những tế bào hình thoi có tiềm năng phát triển giống nhƣ những tế bào ở lớp
đệm của nội mạc tử cung.
4
- Tầng cơ gồm hai lớp cơ trơn: lớp trong có các bó sợi cơ xếp theo hƣớng vòng; ở
lớp ngoài, các bó sợi xếp theo hƣớng dọc.
- Tầng vỏ ngoài: là một mô liên kết chứa mạch máu, dây thần kinh.
2.1.2. Chức năng
2.1.2.1. Chức năng vận chuyển noãn và tinh trùng
- Ống dẫn trứng là cơ quan tiếp nhận noãn đã đƣợc phóng thích từ buồng trứng
rồi vận chuyển về phía tử cung. Sự vận chuyển noãn trong lòng ống dẫn trứng đƣợc
tiến hành nhờ ba yếu tố:
+ Sự co bóp tầng cơ ống dẫn trứng là chủ yếu (Trịnh Hữu Hằng và Đỗ Công
Huỳnh, 2001; Trịnh Bình và ctv, 2004).
+ Nhu động của các lông nhung theo hƣớng về phía tử. Estrogen có tác dụng
gây ra sự biệt hóa của tế bào có lông, còn progesterone có tác dụng tăng cƣờng sự
chuyển động của các lông.
+ Sự lôi cuốn noãn theo dòng nƣớc màng bụng. Nhờ hệ thống mạch bạch
huyết phong phú trong lớp đệm nên ống dẫn trứng là cơ quan hấp thụ nƣớc màng bụng
(Trịnh Bình và ctv, 2004).
- Sự vận chuyển tinh trùng trong ống dẫn trứng theo hƣớng ngƣợc lại sự vận
chuyển noãn, chủ yếu là nhờ sự co bóp của tầng cơ ống dẫn trứng.
2.1.2.2. Vai trò của sản phẩm chế tiết từ tế bào biểu mô ống dẫn trứng
Những sản phẩm của các tế bào chế tiết nằm trong biểu mô ống dẫn trứng đóng
vai trò quan trọng. Chúng tạo ra một môi trƣờng thuận lợi cho sự sống và sự chuyển
động của tinh trùng, làm cho tinh trùng đạt đƣợc khả năng gây thụ tinh cho noãn.
Chúng còn chứa những chất dinh dƣỡng rất cần thiết cho sự sống và phát triển của
noãn đã thụ tinh tới giai đoạn phôi nang, khiến cho phôi nang có thể làm tổ trong nội
mạc tử cung.
2.2. Một số đặc điểm sinh học khi nuôi cấy tế bào ngoài cơ thể
- Nhiều phòng thí nghiệm sử dụng những loại tế bào bình thƣờng khác nhau để
nuôi cấy duy trì. Kết quả cho thấy mối liên quan nghịch giữa tuổi của mô cấy và vòng
đời sinh sản của tế bào. Ví dụ, tế bào gốc có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào biệt
hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trƣởng dài hơn tế bào gốc cơ thể trƣởng thành
(Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
5
- Tế bào đƣợc xem nhƣ đạt đến điểm cuối của vòng đời tái sản nếu mật độ tế bào
giảm còn phân nửa mật độ nuôi cấy ban đầu. Vòng đời tái sản có liên quan nghịch với
áp lực oxy xung quanh và có liên quan trực tiếp với mật độ nuôi cấy ban đầu (trích dẫn
từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
- Nhiều nghiên cứu gần đây đã đặt ra câu hỏi: khả năng tái sản có giới hạn của tế
bào trong nuôi cấy gắn liền với đặc tính của tế bào hay điều kiện nhân tạo do môi
trƣờng nuôi cấy. Điều kiện nuôi cấy có gây ra sự bất tử của tế bào hay không thì vẫn
chƣa đƣợc xác minh (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Tuy nhiên, ngƣời ta đã tạo
nên các dòng tế bào “bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trƣởng liên tục trong môi
trƣờng nuôi cấy chuyền. Đó là những tế bào ung thƣ của cơ thể hoặc tế bào đƣợc làm
chuyển dạng “ung thƣ hóa” với những biến đổi di truyền. Ví dụ, tế bào HeLa đƣợc thu
nhận từ mô ung thƣ cổ dạ con, tế bào Namalwa là tế bào ung thƣ limphoma của chị
Namalwa (Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
Có hai kiểu chết tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005):
+ Chết chƣơng trình: tế bào chết do thay đổi môi trƣờng sống, là quá trình phụ
thuộc ATP. Hình dạng tế bào nhăn nhúm, nhân vỡ, xuất hiện các thể tự hủy. Trong cơ
thể tế bào chết chƣơng trình sẽ đƣợc thực bào. Trong hệ thống nuôi cấy tế bào, tế bào
chết chƣơng trình thƣờng xảy ra dƣới những điều kiện khác nhau:
Những dòng tế bào phụ thuộc yếu tố tăng trƣởng, tế bào chết chƣơng
trình do mất đi yếu tố tăng trƣởng.
Những dòng tế bào kết thúc sự biệt hóa khi nuôi cấy ngoài cơ thể, kết
thúc vòng đời tái sản.
Điều kiện nuôi cấy thay đổi hoặc nuôi cấy tế bào đã đạt mật độ cao.
Tế bào tiếp xúc với tác nhân gây độc tế bào.
+ Hoại tử tế bào: tế bào phồng to, nhiễm sắc thể “lên bông”, gây ly giải tế bào
trực tiếp, hoại tử tế bào nhanh chóng. Tế bào nuôi cấy ngoài cơ thể chết do quá trình
hoại tử, khi nhuộm trypan tế bào bắt màu xanh.
Sự sinh trƣởng của tế bào in vitro thƣờng trải qua 3 pha (Nguyễn Nhƣ Hiền,
2005):
+ Pha chậm (lag phase): là giai đoạn từ khi tế bào đƣợc cho vào môi trƣờng
đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Đây là khoảng thời gian tế bào thích nghi với môi
6
trƣờng mới (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005). Thời gian này dài hay ngắn tùy
thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô đƣợc trích tế bào.
+ Pha tiến triển (exponential growth): là giai đoạn tế bào phân chia liên tục,
tăng nhanh số lƣợng tế bào trong khoảng thời gian 15-25 giờ với số lƣợng tế bào đạt 1-
2.10
6
/cm
3
, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ. Độ dài của pha này phụ thuộc dinh
dƣỡng, tốc độ phát triển, mật độ mà sự tái sản tế bào bị ức chế. Ở pha này, tốc độ phát
triển tế bào cao nhất (90% – 100%), tế bào đồng nhất và khả năng tái sản cao (trích
dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
+ Pha dừng (stationary phase): là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số
lƣợng tế bào không thay đổi, tức là giai đoạn mà môi trƣờng dinh dƣỡng nghèo dần và
bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại. Bắt đầu xuất hiện sự tự hoại tế
bào: nhân bị đứt chẻ, trên bề mặt tế bào tạo thành các mảnh khối (blebs).
2.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến nuôi cấy tế bào
2.3.1. Bề mặt chai cấy
Sự bám dính và phát triển tế bào có thể cải thiện bằng nhiều cách: dùng chai cấy
tái sử dụng tráng phủ một lớp collagen, fibronectin, gelatin… Gelatin thƣờng đƣợc
phủ lên bề mặt đĩa nhựa vì có lợi cho sự nuôi cấy tế bào cơ và tế bào biểu mô màng
trong (Freshney, 1987).
Độ sâu của môi trƣờng: tốt nhất từ 2 – 5 mm ( 0,2 – 0,5 ml/cm2), độ sâu của môi
trƣờng ảnh hƣởng đến khả năng thấm nhập của oxy xuyên qua môi trƣờng đến tế bào
(trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
2.3.2. Các đặc tính vật lý
2.3.2.1. pH
Hầu hết các dòng tế bào phát triển ở pH 7,4. pH tối ƣu để phát triển thay đổi rất
ít ở những dòng tế bào khác nhau. Phenol red đƣợc bổ sung vào môi trƣờng làm chất
chỉ thị pH (Freshney, 1987). Nếu môi trƣờng chuyển dần từ đỏ sang vàng cam là tế
bào phát triển tốt, nếu từ đỏ chuyển sang vàng nhạt là môi trƣờng bị nhiễm khuẩn
(Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005).
7
Bảng 2.1. Giá trị pH và màu sắc môi trƣờng (nguồn: Freshney, 1987)
* dùng phenol red
2.3.2.2. Dung dịch đệm
Đệm bicarbonate vẫn đƣợc sử dụng nhiều hơn các dung dịch đệm khác bởi vì ít
độc, giá rẻ và thuận lợi cho quá trình trao đổi chất mặc dù khả năng đệm kém ở pH
sinh lý. Hepes có khả năng đệm hiệu quả hơn ở pH từ 7,2 – 7,6 và thƣờng đƣợc sử
dụng ở nồng độ 10 hoặc 20 mM (Freshney, 1987).
2.3.2.3. Áp suất thẩm thấu
Áp suất thẩm thấu của môi trƣờng ảnh hƣởng đến tế bào nuôi cấy. Ở những loài
khác nhau thì áp suất thẩm thấu của huyết tƣơng khác nhau. Ví dụ: ở ngƣời khoảng
290 mOsm/kg, ở chuột khoảng 310 mOsm/kg. Trong thực nghiệm, thƣờng điều chỉnh
trong khoảng từ 260 – 320 mOsm/kg (Freshney, 1987).
2.3.2.4. Nhiệt độ (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005)
- Nhiệt độ giảm sẽ làm giảm sự phát triển nhƣng không làm giảm khả năng sống
của tế bào, trừ khi thời gian hạ nhiệt độ kéo dài hơn 3 ngày.
- Nhiệt độ gia tăng sẽ làm tăng sự phát triển nhƣng sẽ làm giảm khả năng sống
của tế bào.
- Nhiệt độ cũng ảnh hƣởng đến pH. Ở nhiệt độ thấp, CO2 hòa tan tăng nên làm
thay đổi sự ion hóa.
2.3.2.5. Áp lực bề mặt và bọt khí
Áp lực bề mặt của môi trƣờng hỗ trợ sự bám dính của tế bào vào đáy bình nuôi
cấy nhƣng ít đƣợc ứng dụng. Nuôi cấy ở điều kiện 5% CO2 sẽ tạo bọt khí mà bọt khí
có liên quan đến lƣợng protein thoái hóa và nguy cơ nhiễm khuẩn (Freshney, 1987).
pH Màu*
6,5
7,0
7,4
7,6
7,8
Vàng
Cam
Đỏ
Hồng nhạt
Tím
8
2.3.2.6. Độ nhớt
Độ nhớt của môi trƣờng đƣợc quyết định chủ yếu bởi huyết thanh và một phần do
sự phát triển của tế bào. Tăng độ nhớt của môi trƣờng với carboxy methyl cellulose
hoặc polyvinyl pyrolidone sẽ làm giảm sự hƣ hại của tế bào trong lúc khuấy và xử lí
trypsin (Freshney, 1987).
2.3.3. Tủ cấy
Số lần mở, sự rung lắc của tủ cấy ảnh hƣởng đến sự phát triển và sự phân bố của
tế bào (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
2.3.4. Kháng sinh
- Kháng sinh đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để làm giảm khả năng
nhiễm khuẩn. Tuy nhiên với kỹ thuật thao tác vô trùng có thể không cần sử dụng
kháng sinh vì có một số bất lợi nhƣ sau (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005):
+ Tạo điều kiện thuận lợi cho sự đề kháng kháng sinh của vi sinh vật.
+ Che dấu sự nhiễm khuẩn tiềm ẩn ở mức độ thấp và nhiễm Mycoplasma.
+ Ảnh hƣởng tế bào động vật hữu nhũ.
+ Tạo tâm lý chủ quan trong việc thực hiện kỹ thuật vô trùng.
+ Nhiễm nấm khó đƣợc kiểm soát.
- Nồng độ kháng sinh thƣờng sử dụng (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005):
+ Streptomycine: 100 µg/ml
+ Penicilline: 100 UI/ml
+ Gentamycine S: 250 µg/ml
2.4. Vấn đề nhiễm trong nuôi cấy tế bào
2.4.1. Nguồn nhiễm (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005)
Không khí ẩm của tủ nuôi cấy là nguồn nhiễm chính và nhiễm có thể xảy ra ở bất
cứ giai đoạn nào, thao tác nào.
Tác nhân gây nhiễm: vi trùng, nấm men, nấm mốc, Mycoplasma, protozoa…
Theo dõi nhiễm: bằng mắt dƣới kính hiển vi.
2.4.2. Hình ảnh đặc trƣng của nhiễm vi sinh vật (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền,
2005)
- Thay đổi pH đột ngột dẫn đến thay đổi màu sắc của chỉ thị màu trong môi
trƣờng. pH giảm rõ trong trƣờng hợp nhiễm trùng. Khi nhiễm nấm men, pH thay đổi ít,
trừ khi nhiễm nấm men nhiều. Tăng pH khi nhiễm nấm sợi.
9
- Đục môi trƣờng hoặc cặn ở đáy.
- Dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 100 lần, giữa những tế bào có những hạt
lấp lánh là môi trƣờng đã bị nhiễm khuẩn, hình tròn có những nụ nhỏ là nấm men.
- Nấm sợi: nhiều sợi mảnh, có thể thấy đám đậm độ của bào tử.
- Nhiễm Mycoplasma: có những dấu hiệu hủy hoại tế bào. Xác định Mycoplasma
bằng kỹ thuật nhuộm huỳnh quang, PCR, ELISA…
2.4.3. Yêu cầu đối với ngƣời thao tác (trích dẫn từ Phan Kim Ngọc, 2002)
- Mang găng tay khi thao tác.
- Sử dụng áo blouse, khẩu trang và nón che kín tóc.
- Hạn chế việc mang vật dụng cá nhân khi thao tác vô trùng.
- Trƣớc khi vào phòng thí nghiệm: vệ sinh cá nhân tốt, rửa sạch tay bằng xà
phòng, sát trùng bằng javel và cồn, chuẩn bị đầy đủ các dụng cụ, môi trƣờng cần sử
dụng trong suốt thời gian làm việc, khử trùng phòng và tủ cấy bằng tia UV.
- Sau khi làm việc trong phòng thí nghiệm: dọn vệ sinh tủ cấy và phòng, sắp xếp
các dụng cụ và thiết bị gọn gàng đúng qui định, các dụng cụ đã sử dụng cần đƣợc rửa
sạch và sấy khô tại khu vực rửa dụng cụ, tắt các thiết bị không cần sử dụng, rửa sạch
tay bằng xà phòng và sát trùng bằng javel và cồn.
- Tất cả các mẫu vật, hóa chất dƣ thừa phải đƣợc mang ra khỏi khu vực thao tác
và đƣợc xử lý cẩn thận.
2.5. Thành phần chính của môi trƣờng nuôi cấy tế bào (Freshney, 1987)
- Dung dịch đệm: sự lựa chọn dung dịch đệm phụ thuộc vào nồng độ CO2 (bảng
2.2), dung dịch tách mô, lớp đơn tế bào.
Bảng 2.2. Mối quan hệ giữa HCO3-, CO2 và HEPES (nguồn: Freshney, 1987)
Pha khí Pha lỏng
CO2 HCO3
- HEPES
Không khí
2%
5%
4 mM
8 mM
24 mM
10 mM
20 mM
50 mM
- Acid amin: nồng độ acid amin quyết định khả năng duy trì nồng độ tế bào tối
đa, ảnh hƣởng đến sự sống còn và tỉ lệ phát triển của tế bào.
10
- Vitamin: thông thƣờng chỉ bổ sung vitamin nhóm B vào môi trƣờng nuôi cấy vì
những vitamin khác đã có đủ trong huyết thanh. Việc thêm vitamin vào môi trƣờng
nuôi cấy chứa nồng độ huyết thanh thấp là cần thiết.
- Muối: K+, Na+, Mg2+, Ca2+, SO4
2-
, Cl
-
, PO4
3-
, HCO3
-… là thành phần chính tạo
áp lực thẩm thấu môi trƣờng. Nồng độ muối NaHCO3 phụ thuộc vào nồng độ CO2
trong pha khí.
- Glucose: đƣợc bổ sung vào trong hầu hết các môi trƣờng nuôi cấy tế bào, đóng
vai trò là nguồn năng lƣợng chính.
- Chất hữu cơ: gồm nucleosides, những chất trung gian trong chu trình acid citric,
pyruvate và lipid. Sự bổ sung những chất này cần thiết cho quá trình tạo dòng hoặc
duy trì dòng tế bào đặc biệt.
- Hormon và các yếu tố tăng trƣởng: gồm insulin, hydrocortisone, PDGF, EGF,
FGF, IGF… Insulin giúp hấp thu glucose, acid amin và ảnh hƣởng đến sự phân bào.
IGF gắn đặc hiệu với thụ thể của insulin trên bề mặt của tế bào và có tác dụng tƣơng tự
insulin. Hydrocortisone làm tăng sự bám dính, thúc đẩy tăng sinh tế bào (Guner và ctv,
1977; McLean và ctv, 1986), ngăn cản sự phân bào (Freshney và ctv, 1980) và tăng sự
biệt hóa tế bào.
- Huyết thanh: đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy để cung cấp hormon, yếu
tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, acid amin, vitamin, chất khoáng, chất ức chế,
ketoacid, glucose và một số chất dinh dƣỡng khác.
2.6. Các quy trình nuôi cấy tế bào thông dụng
2.6.1. Nuôi cấy sơ cấp
Theo Phan Kim Ngọc (2002), nuôi cấy sơ cấp là giai đoạn nuôi cấy đầu tiên
những tế bào đƣợc tách ra từ mô hay cơ quan. Các tế bào thu đƣợc trong lần nuôi cấy
này gọi là tế bào sơ cấp. Các tế bào sơ cấp thƣờng không thuần nhất vì là hậu duệ của
nhiều tế bào ban đầu khác nhau.
Nuôi cấy sơ cấp gồm 2 phƣơng pháp: nuôi cấy tế bào từ mảnh mô và nuôi cấy
tế bào sau tách mô bằng enzyme (trích dẫn từ Nhan Ngọc Hiền, 2005).
- Nuôi cấy tế bào từ mảnh mô là phƣơng pháp nuôi cấy những mảnh mô đã
đƣợc cắt nhỏ (1 mm3), trên môi trƣờng thể tích nhỏ với nồng độ huyết thanh cao. Áp
lực bề mặt giúp mảnh mô tƣơng đối cố định, tạo điều kiện thuận lợi cho tế bào bám
dính vào bề mặt đáy đĩa và phát triển. Phƣơng pháp này không sử dụng enzyme
11
trypsin nên hạn chế đƣợc nguy cơ tổn thƣơng tế bào, nhƣng tế bào phát triển chậm. Vì
vậy, phƣơng pháp này thích hợp cho nuôi cấy các loại tế bào dễ bị tổn thƣơng và tránh
đƣợc nguy cơ mất tế bào.
- Nuôi cấy tế bào sau tách mô bằng enzyme là phƣơng pháp nuôi cấy những tế
bào đã đƣợc tách riêng lẻ nhờ phản ứng của enzyme (trypsin, collagenase,…). Phƣơng
pháp này tách đƣợc số lƣợng lớn tế bào trong thời gian ngắn trƣớc khi nuôi cấy nhƣng
tế bào dễ bị tổn thƣơng và đòi hỏi khối lƣợng mô nhiều hơn phƣơng pháp nuôi cấy tế
bào từ mảnh mô. Nồng độ tế bào trƣớc và sau nuôi cấy đƣợc xác định và số lƣợng đặc
trƣng cho từng loại tế bào nuôi cấy. Enzyme trypsin thƣờng đƣợc sử dụng trong
phƣơng pháp nuôi cấy này với 2 dạng là trypsin ấm và trypsin lạnh. Trypsin ấm mặc
dù làm tổn thƣơng tế bào nhiều hơn nhƣng tách tế bào nhanh hơn nên đƣợc ƣa chuộng
hơn phƣơng pháp trypsin lạnh. Có thể hạn chế tác động của trypsin làm tổn thƣơng tế
bào bằng cách nhũ tƣơng hóa cặn sau khi tách tế bào trong môi trƣờng có bổ sung
huyết thanh, lƣu trữ tạm trong điều kiện lạnh hoặc làm tăng độ nhớt của môi trƣờng.
2.6.2. Nuôi cấy thứ cấp
Theo Phan Kim Ngọc (2002), sau khi tế bào nuôi cấy sơ cấp đã phân chia đầy
đủ (tế bào một lớp đạt 80% bề mặt giá thể), ngƣời ta xử lý chúng với trypsin hoặc
trypsin - EDTA để tách rời các tế bào. Một phần trong số tế bào đó đƣợc dùng để nhân
số lƣợng tế bào lên trong lần nuôi cấy tiếp theo đƣợc gọi là nuôi cấy chuyền hay nuôi
cấy thứ cấp.
2.7. Xác định tế bào sống và chết bằng phƣơng pháp nhuộm trypan blue
Theo Nigel Jenkins 1999, trypan blue thƣờng đƣợc thêm vào huyễn dịch tế bào
trƣớc khi đếm. Chất nhuộm này thâm nhập vào màng của những tế bào không còn khả
năng tồn tại hoặc phát triển, những tế bào này bắt màu xanh. Vì vậy có thể phân biệt
đƣợc chúng với những tế bào còn sống (không bắt màu với chất nhuộm này). Dung
dịch trypan blue có nồng độ 2%, đƣợc pha trong PBS (phosphate – buffered saline).
Dung dịch trypan blue thƣờng đƣợc thêm vào huyễn dịch tế bào với tỉ lệ 1:1, thời gian
2 phút ở nhiệt độ phòng.
2.8. Một số công trình ứng dụng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng
2.8.1. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bò và đồng nuôi cấy với phôi
Năm 1992, Xu và ctv đã thành công trong việc tạo phôi bò in vitro bằng
phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa phôi bò và tế bào biểu mô ống dẫn trứng của bò
12
(bovine oviductal epithelial cells, BOEC). BOEC này đƣợc nuôi cấy theo phƣơng pháp
nuôi cấy tế bào từ mảnh mô, những mảnh BOEC đƣợc tách bằng cách dùng 2 kẹp vuốt
mạnh ống dẫn trứng. Sau một đêm nuôi cấy BOEC trong môi trƣờng nuôi cấy, hình
ảnh những mảnh BOEC trông giống nhƣ cấu trúc hình sâu (worm-like). Bởi vì trong
mảnh BOEC có một số tế bào chết và tế bào sống đƣợc thấy rất rõ khi quan sát dƣới
kính hiển vi, thêm vào đó là sự xuất hiện và chuyển động của những lông rung của
BOEC. Đến ngày nuôi cấy thứ ba một số BOEC có khả năng hình thành lớp đơn
(monolayer) trông giống nhƣ cấu trúc bóng nƣớc (vesicle-like). Sự tồn tại của BOEC
đƣợc xác định qua sự chuyển động của lông rung, lông rung này vẫn đƣợc thấy đến
ngày nuôi cấy thứ 10. Một số tế bào bắt đầu bám vào đáy đĩa vào ngày thứ tƣ hoặc thứ
năm. Nhƣng chúng không hình thành lớp đơn phân tử (tạo vesicle-like), thậm chí đến
ngày thứ 10. Những tế bào và những “bóng nƣớc” (vesicle-like) tồn tại đến 7 tuần nuôi
cấy.
2.8.2. Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với trứng chó
Năm 2002, Luisa Bogliolo và ctv đã thành công trong việc làm tăng tỉ lệ chín
của trứng chó in vitro bằng phƣơng pháp đồng nuôi cấy giữa trứng và tế bào biểu mô
ống dẫn trứng của chó. Những tế bào biểu mô này đƣợc tách bằng cách dùng dao cạo
trên bề mặt trong của ống dẫn trứng và chúng đƣợc tạo huyễn dịch trong môi trƣờng
nuôi cấy chín trứng với nồng độ xấp xỉ 104 tế bào/ml. Sau 48 giờ đồng nuôi cấy, tỉ lệ
phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII mà không đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô là
4%. Khi đồng nuôi cấy với tế bào biểu mô của đoạn loa và đoạn bóng của ống dẫn
trứng, tỉ lệ phần trăm trứng chín đến giai đoạn MII tƣơng ứng là 15,6% và 16,7%.
2.9. Tinh trùng
2.9.1. Sơ lƣợc quá trình sản sinh tinh trùng
Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), sự sản sinh tinh trùng xảy
ra khi bắt đầu thành thục tính dục. Đó là quá trình biệt hóa tế bào, bắt đầu từ tế bào
mầm đến khi sản sinh ra các tinh trùng. Theo Phan Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy
(2001), quá trình này có thể chia làm 3 giai đoạn: giai đoạn tạo tế bào mầm (giao tử),
biệt hóa chức năng để thụ tinh (phân bào giảm nhiễm) và biệt hóa về cấu trúc để có
khả năng di chuyển chủ động.
- Sự tạo giao tử: trong giai đoạn đầu của bào thai, các tế bào mầm di chuyển
đến tuyến sinh dục đang phát triển. Trong trƣờng hợp sinh tinh, các tế bào này vào
13
trong ống tinh của tinh hoàn. Những tế bào mầm này chƣa trƣởng thành gọi là tinh
nguyên bào, sẽ phát triển bằng cách phân bào nguyên nhiễm. Tinh nguyên bào nằm
dọc bờ ngoài của ống tinh, gần với các tế bào đệm (tế bào Sertoli). Các tế bào Sertoli
tồn tại trong suốt cuộc đời tính dục và số lƣợng của chúng là nhân tố hạn chế việc sản
sinh tinh trùng. Trƣớc tuổi thành thục tính dục, các tinh nguyên bào không hoạt động.
Từ tuổi thành thục sinh dục trở đi, tinh nguyên bào phân chia liên tục bằng quá trình
phân bào nguyên nhiễm tạo nên nhiều tế bào và cung cấp liên tục các tế bào mới (tinh
trùng).
- Sự biệt hóa về chức năng: một vài tế bào dừng phân chia và biệt hóa thành tế
bào tinh trùng nguyên thủy. Mỗi tế bào tinh trùng nguyên thủy trải qua quá trình phân
bào giảm nhiễm. Phân chia giảm nhiễm đầu tiên tạo ra 2 tế bào tinh trùng thứ cấp, khi
quá trình phân chia giảm nhiễm thứ 2 hoàn thành tạo nên 4 tiền tinh trùng đơn bội. Sự
sinh tinh nhạy cảm với điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là sự thay đổi về nhiệt độ. Nhiệt
độ thích hợp là khoảng 2 độ dƣới nhiệt độ cơ thể.
- Sự biệt hóa về cấu trúc: các tiền tinh trùng biệt hóa thành tinh trùng trƣởng
thành. Quá trình biệt hóa này gọi là hiện tƣợng sinh tinh. Các tiền tinh trùng dài ra
phát triển thành đuôi nối với nhau và kết nối với lớp dƣới của tế bào Sertoli qua các
cầu nối bào tƣơng. Các tế bào Sertoli giữ vai trò dinh dƣỡng, nuôi các tiền tinh trùng
(tinh tử) cho đến khi thành tinh trùng (Nguyễn Tƣờng Anh, 2002). Chỉ sau khi sự biệt
hóa hoàn chỉnh, các tinh trùng mới đƣợc giải phóng vào ống tinh. Cuối cùng tinh trùng
vào mào tinh (mào tinh là những ống tinh cuộn lại, nằm sát tinh hoàn) và tiếp tục
trƣởng thành trong một khoảng thời gian nhất định. Độ dài thời gian của quá trình sinh
tinh trùng là ổn định cho mỗi loài.
2.9.2. Cấu tạo của tinh trùng
Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), nhƣ những tế bào khác,
tinh trùng cũng đƣợc bao bọc bởi màng tế bào và cũng có các cấu trúc bên trong
(nhân, ty thể…). Cấu tạo gồm 3 phần (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phần đầu
chứa vật chất di truyền, phần cổ và đuôi có liên quan đến chức năng vận động. Đầu
mang acrosome nổi rõ và đƣợc nối chặt với phần cổ, do đó hiện tƣợng mất đầu trên
tinh trùng chó xảy ra với tần số thấp hơn so với ngựa và các loài nhai lại. Tinh trùng
chó có hình dạng đặc thù khác biệt so với các loài khác. Nó có dạng sợi dài, đƣờng
kính của đầu hơi nhỏ, còn đuôi thì khá dài, chiều dài toàn bộ khoảng 50 - 60 µm.
14
- Đầu tinh trùng: dài khoảng 5,6 µm, có 2 phần gồm nhân và thể chóp
acrosome. Trong nhân chứa chromatin đậm đặc, đó là DNA liên kết với 1 protein, đặc
biệt là những phân tử DNP (deoxyribonucleoprotein) xếp song song và gắn rất chặt
chẽ với nhau làm cho cấu trúc của nhân gần nhƣ cấu trúc của tinh thể. Nhân chiếm
65% thể tích của đầu tinh trùng. Số nhiễm sắc thể trong tinh trùng là đơn bội, không có
RNA. Phần trƣớc đƣợc bao bọc bằng một acrosome, có hình dạng nhƣ 1 cái túi mỏng
gồm 2 lớp màng bọc sát vào nhân. Trong acrosome có chứa các enzyme thủy phân
nhƣ: hyaluronidase, phosphatase acid, esterase và các hydrolase acid. Chúng có liên
quan đến quá trình xâm nhập của tinh trùng qua màng trứng vào bên trong để thụ tinh.
- Cổ tinh trùng: là phần rất ngắn, dài 1 µm, hơi co lại và cắm vào hõm ở đáy
phía sau của nhân. Tế bào chất ở cổ có chứa 2 trung tử: trung tử gần nằm sát nhân,
trung tử xa nằm xa nhân hơn và từ đó bắt nguồn của 9 cặp sợi trục kéo dài đến tận đuôi
tinh trùng.
- Đuôi tinh trùng: dài khoảng 49,26 - 50,26 µm, đƣợc bao bọc bằng 1 màng
chung và đƣợc chia thành 3 phần: đoạn giữa, đoạn chính và chót đuôi. Đoạn giữa nằm
từ cổ đến vòng nhẫn Jensen, có tiết diện lớn hơn đoạn chính và chót đuôi. Lõi của
đoạn giữa và toàn bộ chiều dài của đuôi là một tập hợp bó trục. Tập hợp này gồm 9
cặp vi ống ngoài xếp đồng tâm xung quanh 2 vi ống đơn ở trung tâm và chúng đƣợc
bao quanh bằng 9 sợi chắc, dày. Bó trục và những sợi ƣa áp suất của đoạn giữa đƣợc
phủ bên ngoài bằng những ty thể. Bọc ty thể chứa các enzyme oxy hóa và
oxyphosphoryl hóa. Trong đoạn giữa cũng có nhiều chất dự trữ năng lƣợng:
phospholipid, lecithin, plasmalogen… Vì vậy, ty thể đƣợc xem nhƣ nguồn phát sinh
năng lƣợng cần thiết cho hoạt động của tinh trùng. Đoạn chính là đoạn dài nhất của
đuôi tinh trùng, bắt đầu từ vòng nhẫn Jensen kéo dài đến chỗ tiếp giáp với chót đuôi.
Khác với đoạn giữa, đoạn này không có bọc ty thể. Một vỏ bọc gồm những sợi chắc
phủ bên ngoài đoạn chính và đoạn giữa có vai trò duy trì khả năng ổn định cho các yếu
tố co rút của đuôi. Chót đuôi là phần tận cùng, ngắn nhất của đuôi. Nó chỉ gồm những
sợi của bó trục trung tâm và đƣợc bao bọc bằng màng tế bào.
2.9.3. Đặc tính của tinh trùng
Theo Trịnh Bỉnh Duy (2001), trong ống sinh tinh, tinh trùng có thể sống vài
tuần nhƣng khi đƣợc phóng ra ngoài, đời sống tối đa chỉ từ 24 - 48 giờ. Khi trữ ở nhiệt
độ thấp, chuyển hóa giảm nên thời gian sống của tinh trùng kéo dài hơn.
15
Theo Trần Tiến Dũng (2002), tinh trùng có 5 đặc tính: tính chuyển động về phía
trƣớc, tính lội ngƣợc dòng nƣớc, tính tiếp xúc với vật lạ, tính tiếp xúc với hoá chất và
tính tiếp xúc với điện. Tinh trùng sống thì luôn luôn chuyển động. Đuôi ngoằn ngoèo
uốn khúc chuyển động gây một xung động để tự tiến tới trƣớc. Ngoài ra, tinh trùng có
đầu giống hình quả lê nên tự nó chuyển động xung quanh trục của thân nó. Sự rung
động của đuôi kết hợp với sự xoay quanh của trục giữa làm cho tinh trùng vận động
tiến thẳng tới trƣớc. Tốc độ tiến thẳng của tinh trùng phụ thuộc vào các điều kiện nội
tại và ngoại cảnh nhƣ: niêm dịch ở đƣờng sinh dục cái tiết ra nhiều hay ít, phƣơng thức
phóng tinh của con đực và độ co bóp của sừng tử cung, ống dẫn trứng. Tinh trùng
chuyển động nhờ đuôi lái nên nó có thể chuyển động ngƣợc dòng nƣớc và cũng có xu
hƣớng lội ngƣợc dòng nƣớc, ngƣợc với trọng lực của giọt tinh dịch. Đối với một vật lạ,
tinh trùng có đặc tính vây xung quanh vật lạ ấy. Do đó tinh trùng vào đến ống dẫn
trứng, gặp tế bào trứng thì tinh trùng tập trung xung quanh tế bào trứng và tìm nơi lõm
của tế bào trứng để đi vào. Ống dẫn trứng tiết ra chất hóa học, kích thích tinh trùng
hƣng phấn, làm tinh trùng tập trung lại và tiến đến tế bào trứng. Chất hóa học này gọi
là chất fertilizin. Ngoài ra trong ống dẫn trứng hay tử cung có một điện thế mà bản
thân tinh trùng cũng mang điện nên cũng có điện thế, đặc tính của dòng điện chạy từ
cao đến thấp cho nên tinh trùng lội có phƣơng hƣớng nhất định.
2.9.4. Sự vận chuyển tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái
Sự vận chuyển của tinh trùng trong đƣờng sinh dục cái đƣợc ghi nhận gồm 3
giai đoạn (theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997): vận chuyển nhanh,
thành lập các ổ chứa và phóng thích chậm, kéo dài. Ngay sau khi đƣợc phóng thích,
tinh trùng di chuyển nhanh chóng nhờ vào khả năng hoạt động của chúng cũng nhƣ
nhờ có hoạt động co rút tăng lên của lớp cơ tử cung và màng treo ống dẫn trứng. Thời
gian của giai đoạn vận chuyển nhanh này kéo dài khoảng 2 – 10 phút. Khi di chuyển,
tinh trùng đƣợc tách khỏi tinh thanh và hoà vào dịch tiết của đƣờng sinh dục cái. Phần
lớn tinh trùng đƣợc giữ lại trong những nếp màng nhầy phức tạp của các hốc trong cổ
tử cung, thiết lập những ổ chứa tinh trùng. Ở loài chó, ổ chứa tinh trùng khu trú trong
các tuyến nội mạc tử cung. Sau khi đã thiết lập đủ các ổ chứa tinh trùng trong đƣờng
sinh dục, tinh trùng đƣợc phóng thích liên tiếp trong thời gian dài. Sự phóng thích
chậm rãi này đảm bảo cho tinh trùng có khả năng liên tục tiến vào ống dẫn trứng để
thụ tinh trứng. Tốc độ và kiểu hoạt động của tinh trùng đƣợc thay đổi khi tinh trùng
16
vận chuyển qua các bộ phận khác nhau của đƣờng sinh dục cái. Sự tăng hoạt hóa của
hoạt động tinh trùng xảy ra chủ yếu trong ống dẫn trứng vào lúc sắp rụng trứng, đƣợc
kích thích nhờ dịch của đoạn eo và đoạn bóng của ống dẫn trứng. Trong tử cung và
dịch ống dẫn trứng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn so với trong tinh dịch nguyên.
Trong quá trình vận chuyển, một số tinh trùng bị thực bào và bị thất thoát vào trong
xoang bụng.
Trong thời gian lƣu trú lại nhiều giờ trong đƣờng sinh dục cái, màng tinh trùng
trải qua những thay đổi quan trọng nhƣ: những protein cố định trên bề mặt màng sinh
chất bằng những mối nối không đồng hóa trị đều đƣợc nới lỏng (theo Villaroya và
Scholler, 1987); một số protein cấu trúc (hoặc protein từ dịch hoàn phụ và đƣợc gắn
vào màng) bị giảm khối lƣợng phân tử (Esbenshade và Clegg, 1980); các protein có
thể di chuyển và phân bố lại một cách cục bộ, hình thành nên những diện tích nhỏ
thiếu vắng các protein, là giai đoạn cần thiết cho sự phối hợp áp vào nhau của màng
sinh chất và màng ngoài acrosome; cuối cùng là sự thất thoát cholesterol của màng
sinh chất và màng ngoài acrosome. Sự phân bố lại các protein của màng sinh chất
quanh acrosome và những thay đổi trong thành phần các lipid này có khả năng làm
rách acrosome.
2.10. Môi trƣờng pha loãng – bảo quản tinh trùng chó
2.10.1. Các yếu tố ảnh hƣởng sự tồn tại của tinh trùng
- Vai trò của nƣớc cất: trong môi trƣờng pha loãng tinh dịch, các chỉ tiêu của
nƣớc cất nhƣ khả năng tích ion, tổng vật chất khô, tổng lƣợng vi khuẩn… sẽ ảnh
hƣởng rất lớn đến sức sống của tinh trùng (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005).
Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), tinh dịch heo đƣợc pha loãng
trong môi trƣờng bảo quản với nƣớc cất khử ion, thẩm thấu ngƣợc và tiệt trùng bằng
tia cực tím, đã cho kết quả bảo tồn trên 5 ngày; ngoài ra, hoạt lực và sức sống tinh
trùng tốt hơn so với dùng nƣớc cất thƣờng và nƣớc cất khử ion.
- Chất điện giải và không điện giải trong môi trƣờng: theo Nguyễn Tấn Anh và
Nguyễn Quốc Đạt (1997), chất không điện giải (nhƣ các loại đƣờng) có tác dụng làm
giảm độ dẫn điện của môi trƣờng, “bảo vệ” cho tinh trùng tránh đƣợc hiện tƣợng mất
điện tích trên bề mặt tinh trùng. Nhờ đó, ngăn ngừa đƣợc hiện tƣợng tụ dính của tinh
trùng, giúp cho tinh trùng duy trì sức sống thuận lợi hơn. Ngoài ra, chất không điện
giải còn giữ vai trò chất khử, ngăn ngừa đƣợc sự oxy hóa của oxygen. Khi pha loãng
17
bằng những dung dịch đƣờng thì hạn chế sự sinh sản của các vi khuẩn gây mủ và tăng
độ nhớt của môi trƣờng. Chất điện giải là các cation hóa trị 2 (Ca, Mg, St, Ba) làm cho
tinh trùng tụ dính lại và cation hóa trị 3, 4 ( Al, Fe, Ta) làm cho tinh dịch đông lại, tinh
trùng chết nhanh chóng. Ngƣợc lại, các anion có mối tƣơng quan thuận: anion hóa trị 2
tác động lên tinh trùng tốt hơn so với anion hoá trị 1, còn anion hoá trị 3 lại càng tốt
hơn.
- Tác động của pH (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): tinh dịch chó có pH
hơi toan tính biến động từ 6,5 – 6,8. Ở pH này, sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế
nên thời gian sống lâu hơn. Nếu môi trƣờng hơi kiềm pH từ 7,0 – 7,5 (theo Nguyễn
Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997) thì sức hoạt động của tinh trùng đƣợc tăng
cƣờng nên thời gian sống ít hơn. Để môi trƣờng có khả năng duy trì một cách ổn định
pH ở mức thích hợp, ngƣời ta thƣờng đƣa vào môi trƣờng những chất có năng lực đệm
nhƣ: bicarbonate, citrate, phosphate…
- Áp suất thẩm thấu (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005): phụ thuộc vào nồng
độ hòa tan của các phân tử và các ion trong môi trƣờng. Theo Iguer và Verstegen
(2001) áp suất thẩm thấu của tinh dịch chó dao động từ 290 – 460 mOsm.
- Theo Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt (1997), vai trò của chất kháng
sinh trong môi trƣờng pha loãng tinh trùng là hạn chế tác hại của vi khuẩn. Theo
Hoàng Tích Huyền và ctv (2001), kháng sinh penicillin thuộc nhóm β-lactam tạo phức
“nhầm” với transpeptidase (phức bền và không phục hồi). Sự tạo phức này làm vi
khuẩn không tạo đƣợc vách. Vì vách vi khuẩn Gr + (và một phần của vi khuẩn Gr -) là
mạng lƣới dày đặc các peptidoglycan nối với nhau, mà xúc tác cho sự nối
peptidoglycan là các enzyme transpeptidase và carboxypeptidase. Nhƣ vậy, penicillin
có tác dụng tốt đối với vi khuẩn Gr+. Streptomycin và gentamycin thuộc nhóm
amynoglycosid, diệt vi khuẩn bằng cách ức chế tổng hợp vi khuẩn ở mức ribosome.
Streptomycin gắn vào tiểu phần 30S của ribosome và một số aminoglycosid khác có
thể tác động lên cả tiểu phần 50S. Aminoglycosid có phổ tác dụng rộng, chủ yếu trên
vi khuẩn Gr- và có tác dụng vừa phải đối với tụ cầu. Theo Nguyễn Tấn Anh và
Nguyễn Quốc Đạt (1997), streptomycin có độc tính cao hơn penicillin nên
streptomycin có một phần nào đó gây tác hại đến sức sống của tinh trùng. Trong việc
bảo quản tinh dịch chó hiện nay các tác giả vẫn thƣờng sử dụng kết hợp 2 kháng sinh
là penicillin và streptomycin (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Vì penicillin cản
18
trở tạo vách vi khuẩn, tạo điều kiện để streptomycin dễ thấm qua màng và vào tác
động lên ribosome của vi khuẩn (Hoàng Tích Huyền và ctv, 2001).
- Vai trò của lòng đỏ trứng: theo Milônanôp (1962), lòng đỏ trứng có lƣợng
anion nhiều nên lòng đỏ trứng thƣờng có pH toan tính từ 6 – 6,7. Ông còn nhận định,
khi cho citrate natri vào môi trƣờng có lòng đỏ trứng gà sẽ làm tăng độ nhớt của môi
trƣờng giúp cho tinh trùng ít bị dao động trong quá trình vận chuyển và tránh sốc khi
hạ nhiệt độ. Ngoài ra, lòng đỏ trứng còn có năng lực đệm tốt vì hàm lƣợng PO4
3-
rất
cao. Lòng đỏ trứng chứa 32% lipid, 16,6% protein, 1% glucid có tác dụng cung cấp
dƣỡng chất cho tinh trùng, ngăn ngừa tinh trùng tiêu thụ lipid của bản thân vì trong
quá trình sống tiềm sinh tinh trùng vẫn sử dụng lipid trong nguyên sinh chất (trích dẫn
từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Iguer và Verstegen (2001) đã làm thí nghiệm chứng
minh vai trò của lòng đỏ trứng trong việc bảo quản tinh dịch chó. Tinh dịch chó đƣợc
bảo quản đến thời điểm hoạt lực còn 50% trong 3 môi trƣờng: Biladyl, Green extender,
Fresh – phos với thời gian tƣơng ứng: 3,2±1; 2,9±2,5; 2,3±0,5 ngày và bổ sung 20%
lòng đỏ trứng vào 3 môi trƣờng: Biladyl, Green extender, Fresh – phos với thời gian
tƣơng ứng: 8,5±0,2; 4,5±1,1; 5,2±0,4 ngày.
2.10.2. Một số môi trƣờng bảo quản tinh trùng chó
- Iguer và Verstegen (2001) khảo sát khả năng bảo quản của 4 môi trƣờng: Tris
– glucose, Tris – fructose, EDTA và Tris – BES (bảng 2.3). Kết quả về thời gian sống
và còn khả năng thụ tinh giảm dần theo thứ tự nhƣ sau: Tris – glucose, Tris – Fructose,
EDTA, Tris – BES tƣơng ứng: 13±1; 9,7±0,6; 4±0,6; 3,6±1,1 ngày. Trong môi trƣờng
Tris – glucose, ông vẫn thấy tinh trùng sống tới ngày thứ 16 sau khi bảo quản.
19
Bảng 2.3. Công thức môi trƣờng bảo quản tinh chó
(nguồn: Iguer và Verstegen, 2001)
Thành phần môi trƣờng Tris –
glucose
Tris –
fructose
EDTA Tris –
BES
Nhiệt độ bảo quản (OC) 0 – 4 0 – 4 0 – 4 0 – 4
EDTA (g) 0,37
Tris (g) 3,025 3,025 0,43
Glucose (g) 1,25 6 0,59
Fructose (g) 1,25
Bicarbonate Na (g) 0,12
Citrate Na (g) 1,7 1,7
Nƣớc cất (ml) 100 100 100 100
BES (g) 1,49
Lactose (g) 3,4
Penicillin (mg/100ml) 100 100 100 100
Streptomycin (mg/100ml) 100 100 100 100
Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20
pH 6,82 6,84 6,81 6,84
Áp suất thẩm thấu (mOsm) 381 364 464 310
- Thái Thị Mỹ Hạnh (2005) khảo sát khả năng bảo quản của 4 loại môi trƣờng
tris – glucose, glycine, tris – BES và EDTA (bảng 2.4). Kết quả về thời gian
sống còn khả năng thụ tinh (t5) giảm dần theo thứ tự nhƣ sau: Tris –
glucose, Glycine, Tris – BES, EDTA tƣơng ứng với thời gian 65,24; 61,97;
25,46; 19,96 giờ.
20
Bảng 2.4. Công thức pha chế 4 môi trƣờng bảo quản tinh chó
(nguồn: Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005)
Thành phần môi trƣờng Tris –
Glucose
Glycine Tris –
BES
EDTA
Glycine (g) 0,93
EDTA (g) 0,37
Tris (g) 3,025 0,43
Glucose (g) 1,25 1,25 0,59 6
Bicarbonate Na (g) 0,12
Citrate Na.1H2O (g) 1,7 1,45
Nƣớc cất 2 lần (ml) 100 100 100 100
BES (g) 1,49
Lactose (g) 3,4
Penicillin (mg) 100 100 100 100
Streptomycin (mg) 100 100 100 100
Lòng đỏ trứng (ml) 20 20 20 20
pH 6,82 6,8 6,81 6,81
Áp suất thẩm thấu
(mOsm)
381 - 310 464
2.11. Hoạt hóa tinh trùng
Hoạt hóa tinh trùng (sperm capacitation): là quá trình biến đổi đầu tiên của tinh
trùng trong quá trình vận chuyển từ tử cung đến ống dẫn trứng. Quá trình này làm cho
tinh trùng có khả năng phóng thích enzyme hyaluronidase, một enzyme làm phân hủy
sự liên kết của các tế bào hạt (cumulus cell) bao quanh tế bào trứng, để tinh trùng có
thể tiếp cận và kết hợp với màng trong suốt của trứng (zona pellucida). Vì vậy trong
kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) tinh trùng phải đƣợc hoạt hóa (capacitation)
trƣớc khi cho kết hợp với trứng đã chín (matured oocyte) (trích dẫn từ Nguyễn Văn
Thuận, 2005).
Theo Farstad (2000), môi trƣờng Tyrode cải tiến (Sperm - TALP) thƣờng đƣợc
sử dụng trong quá trình hoạt hóa in vitro của tinh trùng bò, chó và cáo.
21
Các yêu cầu của quá trình hoạt hóa tinh trùng trong ống nghiệm (trích dẫn từ
Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003): do tinh thanh ngăn cản phản ứng hoạt hoá và có chứa
một số chất ức chế hoạt động của tinh trùng nên cần đƣợc loại bỏ. Trong môi trƣờng
hoạt hóa, cần có sự hiện diện các thụ quan của cholesterol, có thể là huyết thanh hoặc
albumin huyết thanh bò hoặc ngƣời (BSA hoặc HSA), sẽ thực hiện chức năng làm mất
ổn định màng tinh trùng. Huyết thanh có hiệu quả hơn vì có các lipoprotein có khả
năng thu hồi cholesterol tốt hơn albumin. Dịch nang trứng cũng là một thụ quan có
hiệu quả cho việc thu nhận cholesterol.
Sirivaidyapong và ctv (1999) cho rằng nồng độ Ca2+ cao trong môi trƣờng
Sperm- TALP-1 sẽ làm tăng tỷ lệ tinh trùng chó có phản ứng acrosome (AR) còn sống
và di chuyển trong suốt quá trình hoạt hóa ở 37OC. Bởi vì nồng độ Ca2+ trong môi
trƣờng cao sẽ xâm nhập nhanh chóng vào bên trong tế bào (tinh trùng) làm nồng độ
Ca
2+
bên trong tế bào tăng đến mức có thể hoạt hóa phản ứng acrosome. Ông chứng
minh bằng cách thêm EDTA vào môi trƣờng thì phản ứng acrosome của tinh trùng chó
không xảy ra. Ngƣợc lại nồng độ Mg2+ có thể ức chế phản ứng acrosome của tinh
trùng.
Phản ứng hoạt hoá tinh trùng có tính chất thuận nghịch. Các tinh trùng hoạt hoá
có thể trở nên bất hoạt khi cho tinh dịch vào. Hai phƣơng pháp thông dụng nhất dùng
trong thụ tinh trong ống nghiệm (IVF) để hoạt hoá tinh trùng là phƣơng pháp “bơi lên”
(swim-up) và phƣơng pháp Percoll. Tỉ lệ thụ tinh của các tinh trùng phân tách từ hai
phƣơng pháp này là nhƣ nhau, khi các tinh trùng lấy ra theo 2 phƣơng pháp này đều
bình thƣờng nhƣ nhau. Một điều quan trọng khi xử lí mẫu tinh dịch trƣớc khi đƣa vào
thụ tinh trong ống nghiệm là tinh dịch cần phải đƣợc rửa sạch hoàn toàn để cho các
yếu tố ức chế tinh trùng không thể hoạt động đƣợc (trích dẫn từ Phan Trƣờng Duyệt và
Phan Khanh Vy, 2001).
Phƣơng pháp “bơi lên” là phƣơng pháp phổ biến để tách tinh trùng ra khỏi tinh
dịch, đƣợc sử dụng từ những năm 1970 đến nay. Nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa
vào sự di động của tinh trùng trong môi trƣờng. Phƣơng pháp này thích hợp cho mẫu
tinh trùng có mật độ cao và di động tốt nhƣng không phù hợp cho mẫu tinh có khả
năng di chuyển kém (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Farstad và ctv (1993)
đã thành công trong việc tạo phôi in vitro trên loài cáo xanh (Alopex lagopus), trong
quá trình hoạt hóa tinh trùng, Farstad đã sử dụng phƣơng pháp “bơi lên” này.
22
Năm 2001, Younglai và ctv đã so sánh tác động làm hƣ hại DNA tinh trùng
ngƣời của phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng và phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp.
Phƣơng pháp “bơi lên” thông thƣờng là phƣơng pháp “bơi lên” mà mẫu tinh dịch ban
đầu đƣợc rửa bằng cách ly tâm. Phƣơng pháp “bơi lên” trực tiếp là phƣơng pháp “bơi
lên” mà mẫu tinh dịch ban đầu đƣợc đƣa trực tiếp vào quá trình “bơi lên” hay không
trải qua bƣớc ly tâm để rửa. Tỉ lệ tinh trùng có DNA bị hƣ hại sau khi hoạt hoá bằng 2
phƣơng pháp “bơi lên” này đƣợc so sánh với mẫu tinh dịch ban đầu. Kết quả: sự hƣ
hại DNA đều bé hơn 5% trong hầu hết các mẫu và không có sự thay đổi ý nghĩa nào
trong mẫu DNA đƣợc quan sát giữa 2 phƣơng pháp “bơi lên” này.
23
PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Nội dung nghiên cứu
- Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng:
+ Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp vuốt và phƣơng
pháp cạo.
+ So sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng, bao gồm
phƣơng pháp sử dụng lá kính (lamell) và phƣơng pháp không sử dụng lá kính.
+ Nhuộm xác định tỉ lệ tế bào sống và chết sau khi nuôi cấy.
- Xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa đến chất
lƣợng tinh trùng:
+ Bảo quản các mẫu tinh dịch trong môi trƣờng Tris-glucose.
+ Hoạt hóa tinh trùng bằng phƣơng pháp bơi lên.
+ Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá tinh trùng trƣớc và sau hoạt hóa ở các thời
điểm bảo quản.
3.2. Thời gian và địa điểm thực hiện
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 06-02-2006 đến ngày 06-07-2006 tại trƣờng Đại
Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.3. Vật liệu
3.3.1. Nguồn mẫu
Ống dẫn trứng chó đƣợc thu thập tại lò mổ anh Phƣớc, quận Thủ Đức, Tp. Hồ
Chí Minh.
Mẫu tinh chó đƣợc thu tại nhà bác Sáu và nhà chị Hạnh.
3.3.2. Dụng cụ và thiết bị
Eppendorf
Ống nhựa (falcon) 15 ml
Dao
Kéo
Găng tay
Khay
Lọ cồn
Đầu lọc 0,2 µm
24
Dây đồng mảnh
Kẹp
Ống tiêm 1 ml và kim 26 G
Đĩa nuôi cấy 35mm
Nhiệt kế
Bình cách nhiệt
Pipette Pasteur
Micropipette
Buồng đếm hồng cầu
Que thuỷ tinh
Phiến kính, lá kính
Các loại ống đông có chia độ
Kính hiển vi
Máy li tâm
Cân (độ chính xác 0,001)
pH kế (độ chính xác 0,01)
Tủ sấy dụng cụ
Nồi hấp
Tủ cấy
Tủ ấm CO2
Tủ bảo ôn ở nhiệt độ 0-10
0
C
Kính hiển vi soi ngƣợc
3.3.3. Hoá chất
NaCl
NaOH
HCl
Nigrosin-eosin
Dầu xem kính
Thuốc nhuộm Kovács (1992)
Môi trƣờng Tris-glucose
Môi trƣờng Sperm-TALP-1 theo Sirivaiddyapong và ctv (1999)
Môi trƣờng TCM 199
25
Môi trƣờng PBS
Môi trƣờng Hepes – 199
Dầu khoáng
Huyết thanh
Lòng đỏ trứng
Penicillin
Streptomycin
Gentamycin
Kanamycin
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.1. Nuôi cấy mô tế bào biểu mô ống dẫn trứng
3.4.1.1. Thu thập ống dẫn trứng tại lò mổ (Xu và ctv, 1992)
- Chọn những chó cái đang giai đoạn lên giống. Hiên tƣợng lên giống đƣợc chuẩn
đoán lâm sàng với những đặc điểm nhƣ: âm hộ sƣng lên và có dịch tiết; không có sự
xuất hiện của thể vàng trên bề mặt buồng trứng.
- Gây chết nhƣng không trụng nƣớc sôi và thui nóng chó.
- Dùng dao mổ từ rốn trở xuống 5 cm.
- Dùng 2 ngón tay kéo thận ra.
- Dùng kéo cắt màng treo của bao buồng trứng gắn vào thận và cắt sừng tử cung.
- Thu nhận phức hợp gồm bao buồng trứng và 1 phần sừng tử cung.
- Trữ 250 C trong môi trƣờng PBS đƣợc bổ sung FCS 2%, penicilin 100 IU/ml và
streptomycin 100 µg/ml.
- Vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
3.4.1.2. Xử lý ống dẫn trứng tại phòng thí nghiệm (Xu và ctv, 1992)
- Dùng kéo tách ống dẫn trứng từ phức hợp gồm bao buồng trứng và một phần
sừng tử cung.
- Tách mô liên kết, tua viền của ống dẫn trứng.
- Rửa ống dẫn trứng trong môi trƣờng Hepes-199 đƣợc bổ sung ECS 10%,
penicilin 100 IU/ml và streptomycin 100 µg/ml.
26
3.4.1.3. Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng
Thí nghiệm 1: so sánh 2 phƣơng pháp thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng.
Chỉ tiêu quan sát là thời gian thu thập tế bào và khả năng gây nhiễm vi sinh vật của
mỗi phƣơng pháp. Sự nhiễm vi sinh vật đƣợc đánh giá thông qua sự đổi màu của môi
trƣờng nuôi cấy.
a/ Thu thập tế bào biểu mô bằng phƣơng pháp vuốt (squeeze) (Xu và ctv, 1992)
Dùng dây đồng mảnh luồn vào trong ống dẫn trứng
Ống dẫn trứng đã đƣợc rửa trong môi trƣờng Hespes – 199
Lộn ngƣợc bề mặt trong của ống dẫn trứng
Dùng 2 kẹp vuốt để tách những mảnh biểu mô
Cho những mảnh biểu mô này vào đĩa petri loại 35 mm chứa 3 ml
môi trƣờng Hepes - 199
Dùng ống tiêm 1 ml gắn kim 26 G hút và đẩy vài lần
Tạo huyễn dịch với những mảnh tế bào nhỏ hơn
Li tâm huyễn dịch (240 vòng/phút, 2 phút)
Giữ cặn
Thêm 4 ml môi trƣờng Hepes – 199, trộn đều
Li tâm lần 2 (240 vòng/phút, 2 phút)
Thu nhận tế bào biểu mô ở dạng mảnh nhỏ
Loại bỏ dịch nổi
Loại bỏ dịch nổi
27
b/ Phân lập tế bào biểu mô bằng phƣơng pháp cạo (scrape) (Bogliolo và ctv, 2002)
Giữ cặn
Thêm 4 ml môi trƣờng Hepes-199, trộn đều
Li tâm lần 2 (240 vòng/phút, 2 phút)
Thu nhận tế bào biểu mô (ở dạng mảnh nhỏ)
Loại bỏ dịch nổi
Loại bỏ dịch nổi
Cố định ống dẫn trứng lên các đầu ngón tay
Ống dẫn trứng đã đƣợc rửa trong môi trƣờng Hespes – 199
Dùng kéo cắt dọc ống dẫn trứng
Mở bề mặt trong của ống dẫn trứng
Cho những mảnh biểu mô này vào đĩa petri loại 35 mm
chứa 3 ml môi trƣờng Hepes – 199
Dùng ống tiêm 1 ml gắn kim 26 G hút và đẩy vài lần
Tạo huyễn dịch với những mảnh tế bào nhỏ hơn
Li tâm huyễn dịch (240 vòng/phút, 2 phút)
Dùng dao cạo nhẹ nhàng để tách những mảnh biểu mô
28
3.4.1.4. Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng
Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng. Tế
bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc nuôi cấy ở dạng mảnh (Xu và ctv, 1992). Do đó
những tế bào này khó bám vào đáy đĩa nuôi cấy để đƣợc cố định. Để giải quyết nhƣợc
điểm này, phƣơng pháp sử dụng lá kính cố định những tế bào này đƣợc đặt ra và đƣợc
so sánh với phƣơng pháp không sử dụng là kính. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu
hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Chỉ tiêu khảo sát là sự xuất hiện cấu trúc “bóng
nƣớc” (vesicle – like).
a/ Nuôi cấy tế bào bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính
- Hút 5 µl huyễn dịch tế bào biểu mô ống dẫn trứng cho vào đĩa petri loại 35
mm, đƣợc phủ gelatin 1%.
- Đánh dấu vị trí bơm tế bào vào đĩa.
- Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37
o
C, ẩm độ cao) trong 5 phút.
- Dùng lá kính đƣợc cắt 1/4 đậy lên vị trí vừa đánh dấu.
- Bơm nhẹ nhàng 3 ml môi trƣờng TCM – 199 đƣợc bổ sung ECS 10% lên bề
mặt lá kính.
- Ghi kí hiệu trên đĩa.
- Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37
o
C, ẩm độ cao).
- Quan sát tế bào biểu mô dƣới kính hiển vi soi ngƣợc mỗi ngày 1 lần.
b/ Nuôi cấy tế bào bằng phƣơng pháp không sử dụng lá kính
- Hút 5 µl huyễn dịch tế bào biểu mô ống dẫn trứng cho vào đĩa petri (loại 35
mm, đƣợc phủ gelatin 1%) chứa 3 ml môi trƣờng TCM-199 đƣợc bổ sung ECS 10%.
- Ghi kí hiệu trên đĩa.
- Đặt đĩa này vào tủ CO2 (5% CO2, 37
o
C, ẩm độ cao).
- Quan sát tế bào biểu mô dƣới kính hiển vi soi ngƣợc mỗi ngày 1 lần.
29
3.4.1.5. Nhuộm xác định tế bào chết và tế bào sống bằng trypan blue (Nigel
Jenkins, 1999; Nhan Ngọc Hiền, 2005)
Ghi chú: Quy trình này dùng để nhuộm những tế bào biểu mô ống dẫn trứng đƣợc
nuôi cấy bằng phƣơng pháp “sử dụng lá kính”.
Công thức tính tỉ lệ tế bào nuôi cấy còn sống tại thời điểm nhuộm:
% tế bào sống = (số tế bào sống đếm đƣợc / tổng số tế bào đếm đƣợc)*100%
Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 2 phút) (bằng môi trƣờng PBS)
Giữ cặn và tạo huyền phù
Loại bỏ dịch nổi
Loại bỏ dịch nổi
Hòa tan dung dịch trypan blue 2% với tỉ lệ 1:1 (2 phút, nhiệt độ phòng)
Cho hỗn hợp này vào buồng đếm hồng cầu
Quan sát, đếm tế bào sống (màu trắng) và tế bào chết (màu xanh)
Hút bỏ 2 ml môi trƣờng bề mặt và dùng kẹp gấp lá kính ra
Đĩa tế bào sau một thời gian nuôi cấy
Hút 0,5 ml huyễn dịch tế bào vào 0,5 ml môi trƣờng PBS, trộn đều
Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 2 phút)
Quan sát và lắc nhẹ đĩa đến khi tế bào vừa đƣợc tách (3-4 phút)
Trung hoà trypsin bằng 1 ml môi trƣờng TCM-199 đƣợc bổ sung ECS 10%
Giữ cặn, thêm 1 ml trypsin, trộn đều
30
3.4.2. Hoạt hóa tinh trùng
Thí nghiệm 3: xác định ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa
tinh trùng đến chất lƣợng tinh trùng. Thí nghiệm gồm 2 yếu tố (thời gian bảo quản và
phản ứng hoạt hóa tinh trùng). Chỉ tiêu quan sát bao gồm các chỉ tiêu đánh giá tình
trạng tinh trùng nhƣ: hoạt lực, nồng độ, độ kỳ hình, tình trạng sống còn acrosome và
cƣờng độ hoạt động của tinh trùng.
3.4.2.1. Thu nhận và vận chuyển mẫu tinh trùng về phòng thí nghiệm (Thái
Thị Mỹ Hạnh, 2005)
- Thu nhận tinh dịch pha 2 vì pha này có nồng độ tinh trùng cao, ít tinh thanh.
- Dùng pipette (1000 µl) hút mẫu tinh vào ống falcon (15 ml, đƣợc gói giấy bạc).
- Thêm môi trƣờng tris – glucose vào ống falcon này với tỉ lệ 1:1, trộn đều một
cách nhẹ nhàng.
- Chia nhỏ mẫu tinh đã pha loãng vào đầy từng ống eppendorf (1,5 ml), nhằm
tránh sóng lắc trong quá trình vận chuyển.
- Trữ những eppendorf này vào bình đá (0 – 40C).
- vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
3.4.2.2. Hoạt hóa tinh trùng
Với mẫu tinh đã đƣợc pha loãng trong môi trƣờng tris – glucose, chia 3 nhóm và
đƣợc khảo sát ở 3 thời điểm tƣơng ứng là 0 giờ, 24 giờ và 48 giờ. Mỗi nhóm đƣợc chia
làm 2 phần: phần A có thể tích là 0,5 ml và phần B có thể tích là 1 ml. Phần A đƣợc
dùng đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng trƣớc khi hoạt hóa. Phần B đƣợc đƣa vào quy
trình hoạt hóa tinh trùng và đƣợc đánh giá ngay sau khi hoạt hoá.
31
Tinh trùng đƣợc hoạt hóa theo quy trình sau (Younglai và ctv, 2001; Phan
Trƣờng Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001):
Các chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng tinh trùng đƣợc thực hiện theo phƣơng pháp sau
(Thái Thi Mỹ Hạnh, 2005)
a/ Đánh giá hoạt lực (A)
Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch
khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40.
Dùng pipette hút 1 ml dịch nổi ở phần trên cùng vào eppendorf 1,5 ml
Đánh giá các chỉ tiêu của tinh trùng
Sau 1 giờ, dựng thẳng ống falcon (nhẹ nhàng, chậm rải)
Giữ yên ống falcon 5 phút
Li tâm 2 lần (240 vòng/phút, 5 phút) (dùng môi trƣờng Sperm – TALP – 1)
Mẫu tinh dịch pha loãng trong môi trƣờng Tris – glucose (1 ml)
Thu phần đáy
Thêm 1 ml môi trƣờng Sperm – TALP – 1
Bơm nhẹ nhàng 1 ml hỗn hợp này vào đáy của ống falcon chứa
4 ml môi trƣờng Sperm – TALP – 1
Đặt ống falcon vào tủ CO2 (5% CO2, 37
o
C, ẩm độ cao)
theo một gốc xiên 300 so với mặt phẳng ngang.
Trộn đều (nhẹ nhàng)
loại bỏ dịch nổi
32
Nhằm phản ánh hoạt động tối ƣu của tinh trùng, đặt tinh trùng ở 37OC khi
kiểm tra hoạt lực. Có 3 loại vận động đƣợc quan sát: vận động tiến thẳng, vận động
vòng quanh và vận động lắc lƣ. Đánh giá hoạt lực của tinh trùng dựa trên tỉ lệ tinh
trùng tiến thẳng và cho điểm từ 0 - 1.
b/ Đánh giá nồng độ tinh trùng (C)
Tiến hành:
+ Dùng lá kính đặt lên buồng đếm hồng cầu.
+ Pha loãng tinh bằng ống pha loãng hồng cầu, trong dung dịch NaCl
3%, với độ pha loãng 200 lần.
+ Lắc nhẹ ống pha loãng theo vòng số 8 khoảng 4 – 5 lần.
+ Loại bỏ 4 – 5 giọt tinh pha loãng ở đầu ống mao dẫn của ống pha
loãng.
+ Nhỏ 0,5 – 1 giọt tinh pha loãng vào buồng đếm hồng cầu.
+ Đếm đầu tinh trùng ở vật kính 40 trong 80 ô nhỏ, đƣợc đại diện bởi 5
ô lớn (4 ô ở 4 góc và 1 ô ở chính giữa).
Số lƣợng tinh trùng trong 1 ml tinh dịch pha loãng với môi trƣờng Tris –
glucose đƣợc tính theo công thức:
C = n * b * 50.000
Trong đó:
C : Nồng độ tinh trùng trong 1 ml tinh dịch pha loãng với
môi trƣờng tris – glucose
n : Số lƣợng tinh trùng đếm đƣợc trong 5 ô lớn
b : Hệ số pha loãng
c/ Đánh giá kỳ hình (K)
Tiến hành:
+ Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô.
+ Thêm 1 giọt dung dịch NaCl 1%, trộn đều.
+ Thêm 1 giọt dung dịch nigrosin – eosin, trộn đều.
+ Dùng cạnh một phiến kính khác phết nhẹ hỗn hợp này để dàn mỏng
tinh trùng trên mặt phiến kính.
+ Đếm tổng số 200 tinh trùng ở vật kính 40 và tính tỉ lệ kỳ hình.
33
Tinh trùng kỳ hình là những tinh trùng có hình dạng khác thƣờng: đầu có
bƣớu, đầu to, đầu nhỏ, 2 – 3 đầu, thân phình to ra, đuôi cong hình móc câu, búi tóc…
Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình đƣợc tính theo công thức:
%K = (Tổng số tinh trùng kỳ hình / Tổng số đếm đƣợc) * 100%
d/ Đánh giá tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome (SC)
Sử dụng kỹ thuật nhuộm của Kovács (1992):
+ Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch khô.
+ Thêm 1 giọt dung dịch NaCl 1%, trộn đều.
+ Thêm 1 giọt dung dịch trypan blue, trộn đều.
+ Dùng cạnh một phiến kính khác phết nhẹ hỗn hợp này để dàn mỏng
tinh trùng trên mặt phiến kính.
+ Để khô tự nhiên (2 – 5 phút).
+ Đặt phiến kính đã khô này vào dung dịch hãm màu, 2 phút.
+ Rửa sạch dƣới vòi nƣớc máy, rửa lại bằng nƣớc cất 2 lần.
+ Nhúng ngập phiến kính đã khô vào dung dịch nhuộm, 4 giờ, 370C.
+ Rửa sạch dƣới vòi nƣớc máy, ngâm trong nƣớc cất 2 phút.
+ Để khô tự nhiên (2 – 5 phút).
+ Đậy lá kính, nhỏ một giọt dầu xem kính, đếm tổng số 200 tinh trùng
ở vật kính 100 và tính tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên acrosome.
Khi quan sát tinh trùng chó, thấy phần đầu tinh trùng bắt màu hồng mịn
đều là tinh trùng còn acrosome và phần sau đầu tinh trùng có màu trắng là tinh trùng
còn sống. Tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome đƣợc tính theo công thức:
% SC = (Tổng số tinh trùng sống còn acrosome / Tổng số đếm đƣợc) * 100%
e/ Đánh giá cƣờng độ hoạt động của tinh trùng (CĐ)
Chỉ tiêu này đƣợc ghi nhận thêm để phản ánh đầy đủ hơn hoạt động của
tinh trùng.
Tiến hành: dùng đũa thủy tinh lấy một giọt tinh đặt lên phiến kính sạch
khô, đậy lá kính lên mẫu tinh này và xem ở vật kính 10 và 40.
Đánh giá cƣờng độ hoạt động của tinh trùng dựa trên tốc độ vận động của
tinh trùng đƣợc quan sát, ƣớc lƣợng trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40. Cƣờng độ
hoạt động của tinh trùng tại thời điểm 0 giờ đƣợc ghi nhận là 1 (cƣờng độ gốc). Tùy
vào sự tăng hay giảm cƣờng độ hoạt động của tinh trùng ở thời điểm bảo quản 0, 24,
34
48 giờ hay trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa, cƣờng độ hoạt động của tinh trùng đƣợc
tính bằng công thức:
CD = số lần tăng hoặc giảm cƣờng độ hoạt động so với cƣờng độ gốc
3.5. Xử lí số liệu
Số liệu đƣợc xử lý bằng trắc nghiệm F và chi – square trên phần mềm
Statgraphics 7.0.
35
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: so sánh hai phƣơng pháp thu thập tế bào biểu mô ống dẫn
trứng
Tế bào biểu mô ống dẫn trứng của chó đƣợc thu thập 7 lần với tổng số là 14 đĩa
(2 – 3 ống dẫn trứng/đĩa): 7 đĩa đƣợc thu thập bằng phƣơng pháp vuốt và 7 đĩa đƣợc
thu thập bằng phƣơng pháp cạo. Cả hai phƣơng pháp này đều thu thập đƣợc tế bào
biểu mô ống dẫn trứng dƣới dạng mảnh mô nhƣ Xu và ctv (1992) đã mô tả.
Số đĩa bị nhiễm vi sinh vật đƣợc thu nhận từ phƣơng pháp vuốt ít hơn phƣơng
pháp cạo, tƣơng ứng là 0% và 14,3% (một đĩa có môi trƣờng chuyển sang màu vàng).
Do kích thƣớc ống dẫn trứng của chó rất nhỏ (đƣờng kính 0,5 – 0,8 mm), gây trở ngại
thao tác trong phƣơng pháp cạo nhƣ dễ cạo phạm vào lớp đệm của tầng niêm mạc và
lớp cơ trơn của tầng cơ nên khi thao tác cạo đòi hỏi phải đặt mẫu lên các đầu ngón tay
để làm điểm tựa và phải đặt cận mắt (sát cửa tủ cấy) làm tăng khả năng nhiễm vi sinh
vật. Ngoài ra, trong phƣơng pháp vuốt, tiến hành vuốt theo chiều dọc của ống dẫn
trứng, còn phƣơng pháp cạo chỉ cạo cục bộ từng phần của ống dẫn trứng nên thời gian
thực hiện của thao tác vuốt nhanh hơn thao tác cạo, tƣơng ứng là 30 giây và 60 giây.
Tế bào biểu mô ống dẫn trứng ở ngoài môi trƣờng dinh dƣỡng càng lâu thì càng bất lợi
cho khả năng tồn tại của tế bào. Vì vậy phƣơng pháp vuốt cho khả năng thu thập tế
bào biểu mô ống dẫn trứng tốt hơn phƣơng pháp cạo.
4.2. Thí nghiệm 2: so sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào ống dẫn trứng
Sau khi thu nhận tế bào biểu mô ống dẫn trứng, nuôi cấy theo 2 phƣơng pháp: sử
dụng lá kính (lamelle) và không sử dụng lá kính. Kết quả xuất hiện cấu trúc “bóng
nƣớc” (vesicle - like) đƣợc trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1. Sự xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” của 2 phƣơng pháp nuôi cấy
Phƣơng pháp
Số đĩa có
xuất hiện
“bóng nƣớc”
Số đĩa không
có xuất hiện
“bóng nƣớc”
Tỉ lệ % đĩa
có xuất hiện
“bóng nƣớc”
p
Sử dụng lá kính 2 5 28,6
0,0021
Không sử dụng lá kính 0 7 0
36
Bảng 4.1 cho thấy phƣơng pháp
nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng sử
dụng lá kính và phƣơng pháp không sử
dụng lá kính có sự khác biệt rất ý nghĩa
(p < 0,01) khi xét chỉ tiêu có hay không
có sự xuất hiện của cấu trúc “bóng nƣớc”
mà Xu và ctv (1992) đã mô tả. Cấu trúc
“bóng nƣớc” bắt đầu xuất hiện vào ngày
thứ 3 nuôi cấy (hình 4.1) giống nhƣ kết
quả mà Xu và ctv (1992) đã ghi nhận.
Nhƣ vậy, tỉ lệ đĩa nuôi cấy đạt chỉ tiêu đánh giá của phƣơng pháp có sử dụng lá
kính (28,6%) cao hơn phƣơng pháp không sử dụng lá kính (0%). Những mảnh tế bào
biểu mô đƣợc lá kính cố định sẽ giảm dao động trong quá trình di chuyển và quan sát
đĩa dƣới kính hiển vi, do đó lá kính có thể đóng vai trò nhƣ một giá đỡ tế bào. Hơn
nữa, trọng lực lá kính sẽ tạo áp lực bề mặt giúp một số tế bào tiếp xúc với đĩa có khả
năng bám tốt hơn.
Để chứng minh cho sự tồn tại của tế
bào ống dẫn trứng chó gắn liền với sự
xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc”, đĩa có
xuất hiện cấu trúc “bóng nƣớc” đƣợc
nhuộm trypan blue vào ngày thứ 14 nuôi
cấy. Kết quả nhuộm cho thấy: bên cạnh
những tế bào chết trong đĩa vẫn còn
những tế bào có khả năng tồn tại (hình
4.2) và tỉ lệ tế bào sống trung bình là
44%.
Hình 4.2 Tế bào sống (mũi tên) và tế
bào chết (trong vòng tròn) (x 200)
Hình 4.1 Cấu trúc “bóng nƣớc” (mũi
tên) sau 3 ngày nuôi cấy (x 400)
37
4.3. Thí nghiệm 3: ảnh hƣởng của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa lên
chất lƣợng tinh trùng
4.3.1. Hoạt lực của tinh trùng
Hoạt lực của tinh trùng dƣới tác động bởi 2 yếu tố: thời gian bảo quản và phản
ứng hoạt hoá đƣợc trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2 Thay đổi hoạt lực của tinh trùng
Thời gian
bảo quản
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Phản ứng
hoạt hóa
Trƣớc hoạt
hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Hoạt lực 0,72 ± 0,08 0,78 ± 0,08 0,65 ± 0,06 0,75 ± 0,06 0,53 ± 0,05 0,77 ± 0,05
n 6
PTG 0,0017
PPƢ 0,0000
PTG - PƢ 0,0057
Ghi chú:
n: số lần lập lại
PTG: xác suất sai lầm của yếu tố thời gian bảo quản
PPƢ: xác suất sai lầm của yếu tố phản ứng hoạt hóa
PTG – PƢ: xác suất sai lầm của sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo
quản và phản ứng hoạt hóa tinh trùng
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Thời gian bảo quản
Ho
ạt
Lự
c
Trước hoạt hoá
Sau hoạt hoá
Biểu đồ 4.1 So sánh hoạt lực của tinh trùng
Kết quả bảng 4.2 cho thấy hoạt lực của tinh trùng ở các mốc thời gian bảo quản
(0 giờ, 24 giờ và 48 giờ) có khác biệt rất ý nghĩa (PTG < 0,01). Hoạt lực của tinh trùng
38
giảm dần theo thời gian bảo quản, kết quả này phù hợp với ghi nhận của Thái Thị Mỹ
Hạnh (2005).
Hoạt lực của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa cũng có sự khác biệt rất
cao (PPƢ < 0,001). Hoạt lực của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa cao hơn trƣớc khi
hoạt hóa, kết quả này phù hợp với báo cáo của Younglai và ctv (2001). Tinh trùng thu
đƣợc sau quá trình hoạt hóa là những tinh trùng có khả năng bơi lội tốt (Phan Trƣờng
Duyệt và Phan Khanh Vy, 2001). Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và
phản ứng hoạt hóa rất có ý nghĩa (PTG – PƢ < 0,01). Nhƣ vậy, yếu tố thời gian bảo quản
có ảnh hƣởng đến hoạt lực của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa.
4.3.2. Nồng độ của tinh trùng
Nồng độ tinh trùng cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản và
phản ứng hoạt hóa. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3 Thay đổi nồng độ tinh trùng
Thời gian
bảo quản
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Phản ứng
hoạt hóa
Trƣớc hoạt
hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Nồng độ
(x 10
6
/ml)
130 ± 36,68 9,83 ± 2,91 130 ± 36,68 2,77 ± 1,30 130 ± 36,88 1,58 ± 0,87
n 6
PTG 0,2323
PPƢ 0,0000
PTG – PƢ 0,2323
0
20
40
60
80
100
120
140
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Thời gian bảo quản
Nồ
ng
độ
(x
10
00
00
0/m
l)
Trước hoạt hóa
Sau hoạt hóa
Biểu đồ 4.2 So sánh nồng độ của tinh trùng
39
Kết quả bảng 4.3 cho thấy nồng độ của tinh trùng thay đổi không có ý nghĩa (PTG
> 0,05) giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ). Ngƣợc lại, nồng độ
của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa có khác biệt rất cao (PPƢ < 0,001). Nồng
độ của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa thấp hơn trƣớc phản ứng, kết quả này phù hợp
với kết quả của Younglai và ctv (2001). Sự tƣơng tác giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản
và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05). Nhƣ vậy, bảo quản trong 48
giờ không ảnh hƣởng đến nồng độ của tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa.
4.3.3. Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình
Tỉ lệ tinh trùng kỳ hình cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời gian bảo quản
và phản ứng hoạt hóa, kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng kỳ hình
Thời gian
bảo quản
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Phản ứng
hoạt hóa
Trƣớc hoạt
hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Kỳ hình
(%)
16,08 ± 3,11 6,18 ± 0,78 16,08 ± 3,11 6,93 ± 2,07 16,08 ± 3,11 6,18 ± 1,63
n 6
PTG 0,9118
PPƢ 0,0000
PTG – PƢ 0,9118
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Thời gian bảo quản
Kỳ
h
ìn
h
(%
) Trước hoạt hóa
Sau hoạt hóa
Biểu đồ 4.3 So sánh tỉ lệ tinh trùng kỳ hình
Bảng 4.4 cho thấy tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thay đổi không ý nghĩa (PTG > 0,05)
giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ). Ngƣợc lại, tỉ lệ tinh trùng
40
kỳ hình sau phản ứng hoạt hóa đã giảm rất ý nghĩa (PPƢ < 0,001) so với trƣớc phản
ứng, kết quả này phù hợp với báo cáo của Younglai và ctv (2001). Tinh trùng kỳ hình
thƣờng có khả năng bơi lội kém hoặc không có khả năng bơi lội nên phần tinh trùng
thu đƣợc sau quá trình hoạt hóa ít có tinh trùng kỳ hình. Tƣơng tự trƣờng hợp thụ tinh
in vivo, trong tử cung và dịch ống dẫn trứng tỉ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn so với
trong tinh dịch nguyên (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997). Sự tƣơng tác
giữa 2 yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ >
0,05). Nhƣ vậy, thời gian bảo quản không ảnh hƣởng đến tỉ lệ kỳ hình của tinh trùng
thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa.
4.3.4. Tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome
Tỉ lệ tinh trùng sống còn nguyên acrosome cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động
của thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa, đƣợc trình bày ở bảng 4.5.
Bảng 4.5 Sự biến thiên của tỉ lệ tinh trùng sống, còn nguyên vẹn acrosome
Thời gian
bảo quản
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Phản ứng
hoạt hóa
Trƣớc hoạt
hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Sống còn
acrosome
(%)
80,75 ± 3,82 36,38 ± 8,48 74,33 ± 4,89 26,38 ± 3,80 67,42 ± 5,02 27,8 ± 5,28
n 6
PTG 0,0001
PPƢ 0,0000
PTG - PƢ 0,1879
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Thời gian bảo quản
Số
ng
cò
n
ac
ro
so
m
e (
%
)
Trước hoạt hóa
Sau hoạt hóa
Biểu đồ 4.4 So sánh tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrosome
41
Bảng 4.5 cho thấy tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên vẹn acrosome giảm dần
theo thời gian bảo quản (PTG < 0,001). Kết quả này phù hợp với kết luận của Thái Thị
Mỹ Hạnh (2005). Ngoài ra, tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên vẹn acrosome sau phản
ứng hoạt hóa thấp hơn trƣớc phản ứng (PPƢ < 0,001)(hình 4.3 và hình 4.4). Nồng độ
Ca
2+
cao trong môi trƣờng Sperm – TALP – 1 sẽ làm tăng phản ứng acrosome của tinh
trùng (Sirivaidyapong và ctv, 1999). Thêm vào đó, sự hiện diện của thụ quan
cholesterol (BSA) làm mất sự ổn định màng tinh trùng (trích dẫn từ Huỳnh Thị Lệ
Duyên, 2003). Hai nguyên nhân này có lẽ liên quan đến dẫn liệu của Nguyễn Tấn Anh
và Nguyễn Quốc Đạt (1997); theo tác giả sự phân bố lại các protein của màng sinh
chất quanh acrosome và những thay đổi trong thành phần các lipid của màng sinh chất
và màng ngoài acrosome có khả năng làm rách màng acrosome. Do đó sau khi hoạt
hóa, tinh trùng có thể bị rách màng acrosome (hình 4.4). Điều này có lẽ trở thành cở sở
cho việc phóng thích enzyme hyaluronidase để phân hủy sự liên kết của các tế bào hạt
(cumulus cell) bao quanh tế bào trứng trong quá trình thụ tinh. Sự tƣơng tác giữa 2
yếu tố thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa không có ý nghĩa (PTG – PƢ > 0,05).
Nhƣ vậy, bảo quản trong 48 giờ không ảnh hƣởng đến tỉ lệ sống và còn nguyên vẹn
acrosome của tinh trùng sau phản ứng hoạt hóa.
Hình 4.3 Tinh trùng đƣợc nhuộm Hình 4.4 Tinh trùng nhuộm (x 1000)
trƣớc phản ứng hoạt hóa (x 1000) sau phản ứng hoạt hóa có màng
acrosome không đồng nhất (mũi tên)
4.3.5. Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng
Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng cũng đƣợc khảo sát trƣớc tác động của thời
gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 4.6.
42
Bảng 4.6 Sự thay đổi cƣờng độ hoạt động của tinh trùng
Thời gian
bảo quản
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Phản ứng
hoạt hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc hoạt
hóa
Sau hoạt
hóa
Trƣớc
hoạt hóa
Sau hoạt
hóa
Cƣờng độ
hoạt động
1 ± 0,00 6,33 ± 1,03 0,94 ± 0,02 4,4 ± 0,81 0,88 ± 0,03 2,95 ± 0,51
n 6
PTG 0,0000
PPƢ 0,0000
PTG - PƢ 0,0000
0
1
2
4
5
6
7
0 giờ 24 giờ 48 giờ
Thời gian bảo quản
Cư
ờn
g
độ
Trước hoạt hóa
Sau hoạt hóa
Biểu đồ 4.5 So sánh cƣờng độ hoạt động của tinh trùng
Kết quả bảng 4.6 cho thấy cƣờng độ hoạt động của tinh trùng thay đổi rất ý nghĩa
(PTG < 0,001)giữa các mốc thời gian bảo quản (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ) . Cƣờng độ
hoạt động của tinh trùng cao nhất ở mốc thời gian là 0 giờ và giảm dần theo thời gian
bảo quản. Có lẽ tinh trùng đã tiêu tốn năng lƣợng khá nhiều cho việc di chuyển trong
môi trƣờng bảo quản. Tinh trùng có đặc tính luôn chuyển động về phía trƣớc (Trần
Tiến Dũng, 2002).
Cƣờng độ hoạt động của tinh trùng trƣớc và sau phản ứng hoạt hóa cũng thay đổi
rất ý nghĩa(PPƢ < 0,001). Sau phản ứng hoạt hóa cƣờng độ hoạt động của tinh trùng
đƣợc cải thiện. Trong môi trƣờng Tris – glucose, sự hiện diện của lòng đỏ trứng và
citrate natri làm tăng độ nhớt của môi trƣờng nên làm hạn chế hoạt động của tinh trùng
(trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005). Do đó cƣờng độ hoạt động của tinh trùng
trong môi trƣờng Tris – glucose thấp hơn trong tinh nguyên và trong môi trƣờng
43
Sperm – TALP – 1. Ngoài ra pH của môi trƣờng Tris – glucose hơi toan tính (6,82)
nên sức hoạt động của tinh trùng bị ức chế (trích dẫn từ Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005).
Ngƣợc lại pH của môi trƣờng Sperm – TALP – 1 hơi kiềm tính (7,21) thì sức hoạt
động của tinh trùng đƣợc tăng cƣờng (Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997).
Sự tƣơng tác giữa thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa rất ý nghĩa (PTG – PƢ <
0,001). Nhƣ vậy, thời gian bảo quản có ảnh hƣởng đến cƣờng độ hoạt động của tinh
trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt hóa.
Tóm lại, thí nghiệm 3 cho thấy chất lƣợng tinh trùng thu đƣợc sau phản ứng hoạt
hóa ở mốc thời gian khảo sát 0 giờ là tốt nhất. Tinh trùng đƣợc hoạt hóa ngay sau khi
pha loãng có hoạt lực trung bình cao nhất (0,78 ± 0,08) và cƣờng độ hoạt động trung
bình cũng cao nhất (6,33 ± 1,03). Do đó, khi thụ tinh in vitro nên chọn tinh trùng đƣợc
hoạt hóa ngay sau khi pha loãng. Tuy nhiên, để kết luận đƣợc chính xác hơn, cần chọn
cả 3 mẫu tinh trùng đƣợc hoạt hóa ở các mốc thời gian bảo quản 0 giờ, 24 giờ và 48
giờ tiến hành thụ tinh in vitro. Tỉ lệ phôi 2 tế bào đƣợc tạo ra từ quá trình thụ tinh này
là chỉ tiêu quyết định trong việc đánh giá chất lƣợng tinh trùng sau khi hoạt hóa ở các
mốc thời gian bảo quản khác nhau (0 giờ, 24 giờ và 48 giờ).
Trong quá trình khảo sát 5 chỉ tiêu nêu trên, một đặc điểm khác của tinh trùng
cũng đƣợc quan sát. Tinh trùng có đặc tính tiếp xúc với vật lạ (Trần Tiến Dũng, 2002).
Do đó trƣớc khi hoạt hóa, tinh trùng chỉ tiếp xúc với vật lạ (nếu có) mà không tiếp xúc
với nhau. Tuy nhiên, sau khi hoạt hóa thì tinh trùng thƣờng hay tiếp xúc lẫn nhau (hình
4.5). Các cation hóa trị 2 trong môi trƣờng
Sperm – TALP – 1 (Ca2+ với nồng độ cao,
Mg
2+) làm mất điện tích bề mặt tinh trùng
nên tinh trùng tụ dính lại (Nguyễn Tấn
Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997). Những
tinh trùng trƣớc phản ứng hoạt hóa không
tụ dính với nhau, có lẽ do bề mặt của
chúng có cùng điện tích.
Hình 4.5 Hiện tƣợng tụ dính tinh trùng (x 400)
44
PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Thu thập tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp vuốt xảy ra ngắn hơn
và nuôi cấy ít bị nhiễm hơn phƣơng pháp cạo.
- Nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng bằng phƣơng pháp sử dụng lá kính
(lamelle) cho tỉ lệ thành công là 28,6%, cao hơn so với phƣơng pháp không sử dụng lá
kính (0%).
- Thời gian bảo quản và phản ứng hoạt hóa có ảnh hƣởng đến chất lƣợng tinh
trùng. Chất lƣợng của tinh trùng hoạt hóa ngay sau khi pha loãng là tốt nhất.
5.2. Đề nghị
- Tiến hành thêm nhiều thí nghiệm để nâng cao tỉ lệ thành công khi nuôi cấy tế
bào biểu mô ống dẫn trứng.
- Thụ tinh in vitro đối với tinh trùng vừa đƣợc bảo quản và hoạt hóa.
- Đồng nuôi cấy tế bào biểu mô ống dẫn trứng với noãn và phôi, nhằm nâng cao tỉ
lệ trứng chín và làm tăng chất lƣợng của phôi đƣợc nuôi cấy trong điều kiện in vitro.
45
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Tấn Anh và Nguyễn Quốc Đạt, 1997. Thụ tinh nhân tạo gia súc gia
cầm. Nxb Nông Nghiệp Tp. Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Tƣờng Anh, 2002. Sự đa dạng, sự sinh sản và phát triển của động
vật. Nxb Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh.
3. Trịnh Bình, Phạm Phan Dịch, Đỗ Kính, 2004. Mô học. Nxb Y Học, Hà Nội.
4. Trần Tiến Dũng, Dƣơng Đình Long, Nguyễn Văn Thanh, 2002. Sinh sản gia
súc. Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội.
5. Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kĩ thuật thụ tinh in vitro và PCR xác
định giới tính trên heo. Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí
Minh.
6. Phan Trƣờng Duyệt, Phan Khanh Vy, 2001. Thụ tinh trong ống nghiệm. Nxb
Y Học, Hà Nội.
7. Thái Thị Mỹ Hạnh, 2005. Khảo sát khả năng khai thác tinh trên chó và khả
năng bảo quản của một số môi trường pha chế tinh. Luận văn thạc sĩ, Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
8. Hoàng Kim Giao, 2003. Công nghệ cấy truyền phôi ở gia súc. Nxb Khoa Học
và Kĩ Thuật, Hà Nội.
9. Trịnh Hữu Hằng, Đỗ Công Huỳnh, 2001. Sinh lí học người và động vật. Nxb
Khoa Học và Kỹ Thuật, Hà Nội.
10. Nhan Ngọc Hiền, 2005. Xây dựng quy trình nuôi cấy nguyên bào sợi phù hợp
điều kiện Việt Nam. Đề tài nghiên cứu khoa học, trung tâm đào tạo bồi dƣỡng cán
bộ y tế Tp. Hồ Chí Minh.
11. Nguyễn Nhƣ Hiền, 2005. Sinh học phân tử và tế bào – cơ sở khoa học của
công nghệ sinh học. Nxb Giáo Dục.
12. Hoàng Tích Huyền, Đào Văn Phan, Nguyễn Trọng Thông, 2001. Dược lí
học. Nxb Y Học Hà Nội.
13. Phan Kim Ngọc, 2002. Giáo trình thực tập cơ sở công nghệ sinh học động
vật. Nxb Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh.
14. Nguyễn Văn Thuận, 2005. Tài liệu giảng dạy môn công nghệ sinh học trong
chăn nuôi. Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
46
TIẾNG ANH
15. Bogliolo L., Zedda T. M., Ledda S., Leoni G., Naitana S., Pau S., 2002.
Influence of co-culture with oviductal epithelial cells on in vitro maturation of
canine oocytes. Preprod. Nutr. Dev 42: 265-273.
16. Farstad W., 2000. Current state in biotechnology in canine and feline
reproduction. Animal Reproduction Science 60: 375-387.
17. Farstad W., 2000. Assisted reproductive technology in canid species.
Therigenology 53: 175-186.
18. Fartad W., Hyttel P., Grondahl C., Krongenes A., Mondain-Monval M. and
Hafne A.L., 1993. Fertilization in vitro of oocytes matured in vivo in the blue fox
(Alopex lagopus). Journals of Reproductive & Fertility 47: 219-226.
19. Freshney I. R., 1987. Culture of animal cells – a manual of basic technique.
Alan R. Liss, Inc., New York.
20. Iguer-ouada M. and Verstegen J.P., 2001. Long-term preservation of chilled
canine semen: effect of commercial and laboratory prepared extenders.
Theriogenology 55: 671-684.
21. Jenkins N., 1999. Animal cell Biotechnology methods and protocols. Humana
Press, Inc. Totowa, New Jersey.
22. Sirivaidyapong S., Cheng F. P., Marks A., Voorhout W. F., Bevers M. M.
and Colenbrander B., 2000. Effect of sperm on the acrosome reaction in canine
sperm. Theriogenology 53: 789-802.
23. Xu K. P., Yadav B. R., Rorie R. W., Plante, Betteridge K. J. và King W. A.,
1992. Development and viability of bovine embryos derived oocytes matured and
fertilized in vitro and co-cultured with bovine oviducal epithelial cells. J. Reprod.
Fert 94: 33-43.
24. Younglai E.V., Holt D., Brown P., Jurisicova A. and Casper R.F., 2001.
Sperm swim-up techniques and DNA fragmentation. Human Reproduction 16 (9):
1950-1953.
47
PHỤ LỤC
1. So sánh 2 phƣơng pháp nuôi cấy tế bào biểu mô ông dẫn trứng
Summary Statistics for Contingency Tables (Page 1)
--------------------------------------------------------------------------------
Chi-square D.F. Significance
---------------------------------------------------------------------
11.6667 1 6.36300E-4
9.45000 1 2.11149E-3 with Yates correction
With rows With columns
Statistic Symmetric dependent dependent
---------------------------------------------------------------------
Lambda 0.22222 0.00000 0.28571
Uncertainty Coeff. 0.20119 0.27061 0.16011
Somer's D 0.38356 0.28571 0.58333
2. Khảo sát hoạt lực tinh trùng
Analysis of Variance for XULITK.HL - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:XULITK.THOI_GIAN .0600000 2 .0300000 7.941 .0017
B:XULITK.HOAT_HOA .1600000 1 .1600000 42.353 .0000
INTERACTIONS
AB .0466667 2 .0233333 6.176 .0057
RESIDUAL .1133333 30 .0037778
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) .3800000 35
--------------------------------------------------------------------------------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
3. Khảo sát nồng độ tinh trùng
Trắc nghiệm về sự đồng nhất của các biến lƣợng:
Chi-Square Goodness-of-Fit Test
----------------------------------------
Observed Expected
Frequency Frequency Chi-Square
----------------------------------------
1345 677 660
8 677 660
1345 677 660
2 677 674
1360 677 689
1 677 675
----------------------------------------
Chi-square = 4018.62 with 5 d.f.
Sig. level = 0
Chuyển đổi số liệu sang căn bậc hai của số liệu và trắc nghiệm về sự đồng
nhất các biến lƣợng của số liệu mới:
Chi-Square Goodness-of-Fit Test
----------------------------------------
Observed Expected
Frequency Frequency Chi-Square
----------------------------------------
7 5.3 .501
4 5.3 .501
----------------------------------------
Chi-square = 1.00194 with 1 d.f.
Sig. level = 0.316841
48
Kết quả phân tích biến lƣợng cho số liệu đã chuyển đổi:
Analysis of Variance for XULITK.ND4 - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:XULITK.TG 5.60527 2 2.80264 1.536 .2323
B:XULITK.HH 751.94102 1 751.94102 412.056 .0000
INTERACTIONS
AB 5.6052716 2 2.8026358 1.536 .2323
RESIDUAL 52.920717 29 1.8248523
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 811.66562 34
--------------------------------------------------------------------------------
1 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error
4. Khảo sát tỉ lệ tinh trùng kỳ hình
Analysis of Variance for XULITK.KH - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:XULITK.THOI_GIAN 1.12500 2 .56250 .093 .9118
B:XULITK.HOAT_HOA 838.10250 1 838.10250 138.001 .0000
INTERACTIONS
AB 1.1250000 2 .5625000 .093 .9118
RESIDUAL 182.19500 30 6.0731667
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 1022.5475 35
--------------------------------------------------------------------------------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
5. Khảo sát tỉ lệ tinh trùng sống và còn nguyên acrrosome
Analysis of Variance for XULITK.SC - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:XULITK.THOI_GIAN 780.097 2 390.049 13.158 .0001
B:XULITK.HOAT_HOA 17406.404 1 17406.404 587.199 .0000
INTERACTIONS
AB 104.84722 2 52.423611 1.768 .1879
RESIDUAL 889.29333 30 29.643111
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 19180.642 35
--------------------------------------------------------------------------------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
6. Khảo sát cƣờng độ hoạt động của tinh trùng
Analysis of Variance for XULITK.CD - Type III Sums of Squares
--------------------------------------------------------------------------------
Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level
--------------------------------------------------------------------------------
MAIN EFFECTS
A:XULITK.THOI_GIAN 18.49181 2 9.24590 27.951 .0000
B:XULITK.HOAT_HOA 117.90340 1 117.90340 356.428 .0000
INTERACTIONS
AB 16.123472 2 8.0617361 24.371 .0000
RESIDUAL 9.9237500 30 .3307917
--------------------------------------------------------------------------------
TOTAL (CORRECTED) 162.44243 35
--------------------------------------------------------------------------------
0 missing values have been excluded.
All F-ratios are based on the residual mean square error.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- DO HOANG KHIEM - 02126048.pdf