Luận văn Lý thuyết về sự oxi hóa dầu mỡ thực phẩm

PHAÀN I: LYÙ THUYEÁT VEÀ SÖÏ OXI HOÙA DAÀU MÔÕ THÖÏC PHAÅM SÖÏ OXI HOÙA DAÀU [8] Caùc daïng oxy Ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu laø khaû naêng choáng laïi söï oxi hoùa suoát trong quaù trình saûn xuaát vaø baûo quaûn. Khaû naêng choáng laïi söï oxi hoùa ñöôïc dieãn taû nhö khoaûng thôøi gian caàn thieát ñeå ñaït ñeán ñieåm tôùi haïn cuûa söï oxi hoùa duø cho coù söï thay ñoåi veà caûm quan hoaëc bieán ñoåi ñoät ngoät trong quaù trình oxi hoùa hay khoâng. Ñoä beàn cuûa daàu laø moät giaù trò quan troïng ñeå xaùc ñònh chaát löôïng cuõng nhö khaû naêng baûo quaûn daàu. söï oxi hoùa daàu laøm sinh ra caùc hôïp chaát laï cuõng nhö phaù huûy caùc acid beùo thieát yeáu coù trong daàu. Söï oxi hoùa daàu xaûy ra theo hai cô cheá: töï oxi hoùa vaø söï oxi hoùa quang hoïc. Caû hai loaïi oxy ñeàu coù theå phaûn öùng vôùi daàu. Oxy khí quyeån ôû traïng thaùi tam boäi 3O2, coøn moät daïng khaùc laø oxy ñôn boäi daïng singlet 1O2. 3O2 phaûn öùng vôùi caùc goác töï do vaø laø nguyeân nhaân cuûa söï töï oxi hoùa. Tính chaát hoùa hoïc cuûa 3O2 ñeå coù theå phaûn öùng goác lipid coù theå giaûi thích theo orbital phaân töû (hình 1). 3O2 ôû traïng thaùi neàn, vôùi 2 electron khoâng caëp ñoâi trong orbital 2pp. 3O2 coù moment töø tính coá ñònh vôùi 3 möùc traïng thaùi naêng löôïng döôùi töø tröôøng. Vì vaäy, 3O2 ñöôïc goïi laø traïng thaùi tam boäi. 3O2 laø moät goác vôùi 2 orbital khoâng caëp ñoâi trong phaân töû. Noù coù theå phaûn öùng vôùi caùc hôïp chaát coù goác töï do trong ñieàu kieän bình thöôøng theo nguyeân taéc trao ñoåi spin. Söï oxi hoùa quang hoïc chæ xaûy ra trong ñieàu kieän coù aùnh saùng, chaát nhaïy aùnh saùng vaø oxy daïng ñôn boäi 1O2. Caáu hình electron lôùp 2pp cuûa 1O2 nhö hình 2õ. Vì moät orbital trong lôùp 2pp ñöôïc caëp ñoâi, coøn orbital coøn laïi hoaøn toaøn troáng neân 1O2 coù moät möùc naêng löôïng döôùi töø tröôøng vaø noù coù aùi löïc ñieän töû. 1O2 phaûn öùng deã daøng vôùi caùc hôïp chaát coù maät ñoä ñieän töû cao nhö caùc lieân keát ñoâi cuûa acid beùo khoâng baõo. 1O2 coù möùc naêng löôïng 93,6 kJ, treân möùc naêng löôïng cô baûn cuûa 3O2. Trong dung moâi, 1O2 bò voâ hoaït do naêng löôïng cuûa noù bò vaän chuyeån vaøo dung moâi. Thôøi gian toàn taïi cuûa noù trong dung moâi nöôùc, hexane, carbon tetrachloride laàn löôït laø 2, 17, 700 µs (Merkel 1972; Kearn 1975) Hình 1: Caáu hình orbital phaân töû cuûa oxy tam boäi 3O2 Hình 2: Caáu hình ñieän töû cuûa orbital phaân töû lôùp 2pp trong 1O2 Cô cheá oxi hoùa daàu Söï töï oxi hoùa daàu Söï töï oxi hoùa daàu xaûy ra theo 3 böôùc: khôûi maïch, phaùt trieån maïch vaø keát thuùc maïch Khôûi maïch RH ® R·+H· Phaùt trieån maïch R·+3O2 ® ROO· ROO·+RH ® ROOH+R· Keát thuùc maïch ROO·+ROO· ® ROOR + 3O2 ROO·+R· ® ROOR R· + R· ® RR (R : lipid alkyl) Khôûi maïch oxy hoùa baäc 2 ROOH ® RO· + ·OH 2ROOH ® ROO· + RO· + H2O Khôûi maïch oxy hoùa baäc 2 döôùi xuùc taùc kim loaïi Mn+ + ROOH ® RO· + -OH + M(n+1)+ M(n+1)++ ROOH ® ROO· + H+ M(n)+ Söï töï oxi hoùa daàu caàn acid beùo hay acylglycerol ôû daïng goác töï do. Caùc acid beùo vaø acylglycerol thì ôû traïng thaùi ñôn boäi khoâng goác töï do neân khoù coù theå phaûn öùng vôùi 3O2. Khi acid beùo hoaëc acylglycerol maát ñi moät nguyeân töû hydro noù seõ taïo thaønh caùc goác töï do trong böôùc khôûi maïch. Nhieät ñoä, aùnh saùng vaø kim loaïi xuùc taùc coù theå thuùc ñaåy phaûn öùng naøy xaûy ra nhanh hôn. Naêng löôïng caàn thieát ñeå loaïi boû moät nguyeân töû hydro ra khoûi phaân töû acid beùo hoaëc acylglycerol tuøy thuoäc vaøo vò trí cuûa nguyeân töû hydro. Caùc nguyeân töû hydro gaàn lieân keát ñoâi, ñaët bieät laø caùc nguyeân töû H gaàn keà hai lieân keát ñoâi raát deã loaïi ñi. Naêng löôïng ñeå loaïi boû nguyeân töû H ôû vò trí C-8, C-11, C-14 cuûa acid linoleic laàn löôït laø 75, 50, 75 kCal/mol (Min vaø Boff, 2002). Caùc goác alkyl (R·) phaûn öùng vôùi 3O2 ñeå hình thaønh goác peroxy(ROO·). Phaûn öùng giöõa alkyl vaø 3O2 xaûy ra raát nhanh trong ñieàu kieän khí quyeån. Do ñoù, noàng ñoä cuûa lipid alkyl raát thaáp so vôùi goác peroxy. Goác peroxy haáp thu ñieän töû töø caùc phaân töû lipid khaùc vaø phaûn öùng vôùi ñieän töû naøy ñeå taïo thaønh hydroperoxide (ROOR) vaø moät goác peroxy khaùc. Nhöõng phaûn öùng naøy xuùc taùc cho caùc phaûn öùng khaùc vaø söï töï oxi hoùa lipid ñöôïc goïi laø phaûn öùng maïch goác töï do. Toác ñoä hình thaønh peroxy vaø hydroperoxide chæ phuï thuoäc vaøo nhieät ñoä vaø oxy. Khi caùc goác töï do phaûn öùng vôùi nhau, caùc saûn phaåm khoâng goác töï do seõ taïo thaønh vaø phaûn öùng keát thuùc. Hình 3: Söï hình thaønh hydroperoxide trong söï töï oxi hoùa cuûa acid linoleic Hydroperide laø saûn phaåm baäc 1 cuûa söï oxi hoùa daàu . Chaát naøy beàn ôû nhieät ñoä phoøng vaø khi khoâng coù maët cuûa kim loaïi xuùc taùc. Tuy nhieân, khi coù maët kim loaïi vaø ôû nhieät ñoä cao, noù bò phaân huûy thaønh caùc goác alkoxy ñeå sau ñoù hình thaønh neân aldehyde, ketone, acid, ester, alcolhol vaø caùc hydro carbon maïch ngaén. Con ñöôøng phaân huûy hydroperoxide laø beõ gaõy lieân keát giöõa oxy-oxy ñeå taïo ra goác alkoxy vaø goác hydroxy. Naêng löôïng hoaït hoùa ñeå beõ gaõy lieân keát naøy laø 46 kcal/mol, thaáp hôn naêng löôïng caàn thieát ñeå beõ gaõy lieân keát oxy-hydro. Sau ñoù, alkoxy seõ traûi qua söï phaân chia b hoùa cuûa lieân keát C-C ñeå taïo ra caùc hôïp chaát oxo vaø goác alkyl khoâng no. Sau khi taùi saép xeáp ñieän töû, theâm goác hydroxy hay vaän chuyeån hydro, saûn phaåm oxy hoùa baäc hai cuoái cuøng laø aldehyde, ketone, alcolhol vaø hydro carbon maïch ngaén. Hình 4: Cô cheá phaân huûy hydroperoxide ñeå taïo thaønh saûn phaåm oxi hoùa baäc 2 Thôøi gian caàn thieát ñeå hình thaønh saûn phaåm baäc hai tuøy thuoäc vaøo loaïi daàu. Caùc saûn phaåm oxi hoùa baäc hai hình thaønh ngay laäp töùc sau khi hydroperoxide hình thaønh ñoái vôùi daàu olive vaø daàu boâng. Tuy nhieân, daàu höôùng döông vaø daàu rum, saûn phaåm oxi hoùa baäc hai chæ taïo thaønh khi noàng ñoä hydroperoxide laø ñaùng keå. Söï oxi hoùa quang hoïc. Söï oxi hoùa daàu coù theå ñöôïc thuùc ñaåy bôûi aùnh saùng, ñaëc bieät laø khi coù maët cuûa chaát nhaïy aùnh saùng nhö chlorophyll. Caùc chaát nhaïy aùnh saùng(Sen), ôû traïng thaùi ñôn boäi, haáp thu aùnh saùng raát nhanh vaø chuùng trôû neân cöïc kyø hoaït ñoäng. Caùc chaát daïng hoaït ñoäng naøy coù theå quay trôû veà traïng thaùi neàn baèng caùc phaùt ra aùnh saùng hay chuyeån ñoåi noäi naêng (hình 5). Söï phaùt huyønh quang vaø nhieät laø keát quaû cuûa hai quaù trình töông öùng ñoù. Hình 5: Traïng thaùi hoaït ñoäng vaø voâ hoaït cuûa chaát nhaïy aùnh saùng Caùc chaát nhaïy aùnh saùng daïng tam boäi (3Sen*) coù theå nhaän ñieän töû töø taùc chaát ñeå hình thaønh neân caùc goác (loaïi I-hình 6). Caùc chaát nhaïy quang hoïc daïng triplet naøy cuõng phaûn öùng vôùi ñeå hình thaønh neân anion superoxide. Caùc anion superoxide naøy seõ bò phaân huûy cho ra hydroperoxide vaø hydroperoxide naøy phaûn öùng vôùi superoxide ñeå cho ra oxy ñôn boäi 1O2, trong söï hieän hieän cuûa kim loaïi nhö saét vaø ñoàng. O−2· + O−2· + 2H+ ® H2O2 + O2 H2O2 + O−2· ® HO· + OH− + Naêng löôïng kích thích cuûa 3Sen* coù theå ñöôïc vaän chuyeån leân treân 3O2 gaàn keà ñeå hình thaønh neân 1O2 vaø chaát nhaïy aùnh saùng naøy seõ quay trôû veà traïng thaùi neàn, daïng ñôn boäi 1Sen (loaïi II). Moät phaân töû 1Sen* coù theå saûn sinh 105 phaân töû 1O2 tröôùc khi bò voâ hoaït. Toác ñoä cuûa phaûn öùng loaïi I vaø loaïi II phuï thuoäc vaøo loaïi chaát nhaïy aùnh saùng, taùc chaát vaø phuï thuoäc vaøo noàng ñoä cuûa taùc chaát vaø oxi. Caùc chaát ñaõ bò oxi hoùa nhö phenol, amine hay nhöõng chaát coù tính khöû nhö quinon thöôøng phaûn öùng theo loaïi I. Trong khi ñoù, caùc chaát chöa bò oxi hoùa hay bò khöû nhö olefin, diene, caùc hôïp chaát thôm thöôøng phaûn öùng theo loaïi II. Söï oxi hoùa cuûa chaát nhaïy aùnh saùng laø nguyeân nhaân gaây ra söï oxi hoùa daàu theo söï khôûi maïch cuûa oxy ñôn boäi 1O2. 1O2 coù theå phaûn öùng hoùa hoïc vôùi caùc phaân töû khaùc hay vaän chuyeån naêng löôïng vaøo chuùng. Khi 1O2 phaûn öùng vôùi caùc acid khoâng baõo hoøa, phaàn lôùn caùc hydroperoxide ñöôïc hình thaønh theo phaûn öùng ene (hình 7). 1O2 coù theå phaûn öùng vôùi caùc lieân keát ñoâi coù maät ñoä ñieän töû cao maø khoâng caàn coù söï hình thaønh caùc goác alkyl vaø hình thaønh caùc hydroperoxide taïi caùc lieân keát ñoâi ñoù. Khi hydroperoxide ñöôïc hình thaønh, coù söï di chuyeån lieân keát ñoâi vaø hình thaønh caùc acid beùo daïng trans. Hydroperoxide, ñöôïc hình thaønh töø 1O2, bò phaân huûy theo cô cheá gioáng nhö hydroperoxide bò phaân huûy trong söï töï oxi hoùa. Hình 6: Phaûn öùng cuûa chaát nhaïy aùnh saùng vôùi taùc chaát Hình 7: Söï hình thaønh allyl hydroxide töø acid oleic bôûi phaûn öùng ene CAÙC YEÁU TOÁ AÛNH HÖÔÛNG SÖÏ OXI HOÙA DAÀU [8] Söï oxi hoùa lipid chòu aûnh höôûng bôûi thaønh phaàn acid beùo, quaù trình xöû lyù daàu, naêng löôïng nhieät hay aùnh saùng, noàng ñoä vaø loaïi oxy, acid beùo töï do, mono- vaø diacylglycerol, kim loaïi, peroxide, caùc hôïp chaát bò oxi hoùa nhieät ñoäng, chaát maøu vaø chaát choáng oxi hoùa. Thaønh phaàn acid beùo töï do trong daàu Daàu caøng ít baõo hoøa thì caøng deã bò oxi hoùa hôn daàu baõo hoøa nhieàu hôn. Khi möùc ñoä khoâng baõo hoøa gia taêng, caû toác ñoä oâi hoùa vaø soá löôïng saûn phaåm oxi hoùa cô baûn sau thôøi gian khôûi maïch seõ taêng leân. Daàu naønh, daàu höôùng döông, daàu rum (IV>130) baûo quaûn trong boùng toái coù khoaûng thôøi gian khôûi maïch ngaén ñaùng keå so vôùi daàu döøa vaø daàu coï (IV<20). Daàu coù chöùa nhieàu acid oleic hoaëc stearic hoaëc daàu ñöôïc hydrogen hoùa thöôøng coù ñoä beàn oxi hoùa cao. Toác ñoä töï oxi hoùa daàu phuï thuoäc ñaùng keå vaøo söï hình thaønh caùc acid beùo vaø caùc goác alkyl acylglycerol. Maëc khaùc, toác ñoä hình thaønh caùc goác naøy phuï thuoäc vaøo loaïi acid beùo hay aculglycerol. Toác ñoä töï oxi hoùa töông ñoái cuûa acid oleic, linoleic, linolenic theo tæ leä1:40-50:100 döïa treân söï haáp thu oxi (Min and Bradley 1992) Söï khaùc bieät trong toác ñoä oxi hoùa daïng 1O2 giöõa caùc acid beùo thì thaáp hôn so vôùi toác ñoä töï oxi hoùa. Toác ñoä phaûn öùng giöõa 1O2 vôùi acid stearic, oleic, linoleic, linolenic laàn löôït laø 1,2.104; 5,3.104; 7,3.104; 10.104 M-1s-1 (Vever Bizet, 1989). Daàu naønh phaûn öùng vôùi 1O2 vôùi toác ñoä 1,4.105 M-1s-1 trong methylene chloride ôû 20oC (Lee vaø Min, 1991). Loaïi acid beùo khoâng baõo hoøa, caùc dien lieân hôïp hoaëc khoâng lieân hôïp, triene coù ít aûnh höôûng ñeán toác ñoä phaûn öùng giöõa lipid vaø 1O2. Quaù trình xöû lyù daàu Phöông phaùp xöû lyù daàu coù aûnh höôûng ñeán ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu. Ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu naønh giaûm daàn theo quaù trình xöû lyù taåy muøi, taùch saùp, tinh luyeän vaø taåy maøu. Ñoái vôùi daàu boâng trích ly baèng hexane, thôøi gian khôûi maïch ôû 90oC laø 10,5±1,9h thaáp hôn so vôùi daàu vöøng laø 8,1±0,7h. Ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu thu ñöôïc töø quaû oùc choù trích ly baèng phöông phaùp chaát loûng sieâu tôùi haïn giaûm ñi ñaùng keå so vôùi phöông phaùp eùp. Quaù trình rang haït rum vaø haït vöøng laøm taêng ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu do coù söï hình thaønh caùc saûn phaåm Maillard. Caùc chaát naøy ñoùng vai troø nhö nhöõng chaát choáng oxi hoùa töï nhieân. Nhieät ñoä vaø aùnh saùng Söï töï oxi hoùa daàu vaø söï phaân huûy hydroperoxide taêng leân khi nhieät ñoä taêng. Söï hình thaønh caùc saûn phaåm töï oxi hoùa trong giai ñoaïn khôûi maïch giaûm xuoáng ôû nhieät ñoä thaáp. Noàng ñoä hydroperoxide taêng leân cho ñeán böôùc phaùt trieån maïch. Toác ñoä phaân huûy hydroperoxide cuûa daàu caù trích ôû 50oC trong toái thì cao hôn toác ñoä hình thaønh hydroperoxide. Nhieät ñoä ít aûnh höôûng ñeán söï oxi hoùa 1O2 do naêng löôïng hoaït hoùa thaáp (töø 0-6 kcal/mol). Yeáu toá aûnh höôûng nhieàu hôn laø aùnh saùng. Aùnh saùng coù böôùc soùng caøng ngaén caøng aûnh höôûng söï oâi hoùa daàu. Khi nhieät ñoä gia taêng thì aûnh höôûng cuûa aùnh saùng ñoái vôùi söï oâi hoùa lipid giaûm. Oxy Söï oxi hoùa daàu coù theå xaûy ra khi coù söï tieáp xuùc giöõa daàu, oxy vaø chaát xuùc taùc. Noàng ñoä vaø loaïi oxy cuõng aûnh höôûng ñeán söï oxi hoùa daàu. Noàng ñoä oxy trong daàu phuï thuoäc vaøo aùp suaát rieâng phaàn treân maët thoaùng cuûa noù. Khi löôïng oxi trong daàu caøng nhieàu thì söï oxi hoùa caøng nhieàu. Oxi hoøa tan trong daàu nhieàu hôn trong nöôùc vaø trong daàu thoâ nhieàu hôn trong daàu tinh luyeän. Aûnh höôûng cuûa noàng ñoä oxy ñeán söï oxi hoùa daàu taêng ôû nhieät ñoä cao vaø coù söï hieän dieän cuûa loaïi. Toác ñoä oxi hoùa daàu thì khoâng phuï thuoäc vaøo noàng ñoä oxi khi noàng ñoä oxi naøy cao. Khi noàng ñoä oxy giaûm xuoáng, toác ñoä oxi hoùa lipid phuï thuoäc vaøo noàng ñoä oxi nhöng khoâng phuï thuoäc vaøo noàng ñoä lipid. Khi haøm löôïng oxi treân maët thoaùng daàu treân 4-5% thì toác ñoä töï oxi hoùa cuûa daàu seõ khoâng phuï thuoäc vaøo noàng ñoä oxi maø phuï thuoäc tröïc tieáp vaøo noàng ñoä lipid. Ngöôïc laïi, khi haøm löôïng oxi treân maët thoaùng daàu thaáp hôn 4%, toác ñoä töï oxi hoùa daàu phuï thuoäc vaøo haøm löôïng oxi vaø khoâng phuï thuoäc vaøo noàng ñoä lipid. Söï oxi hoùa daàu boâng ôû 50oC trong toái ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp ñoä haáp thu oxy vaø chæ soá peroxide seõ caøng lôùn khi noàng ñoä oxy treân maët thoaùng ít nhaát laø 0,5%, coøn khi haøm löôïng oxi nhieàu hôn 1% thì söï oxi hoùa daàu giaûm. Oxi vaø daàu coù theå deã phaûn öùng vôùi nhau hôn khi löôïng daàu maãu ít hoaëc tyû leä giöõa dieän tích beà maët/ theå tích(S/V) chöùa daàu lôùn. Khi tyû leä S/V taêng vaø vôùi haøm löôïng oxi thaáp, toác ñoä oxi hoùa daàu ít phuï thuoäc vaøo haøm löôïng oxi. Beà maët cuûa vaät chöùa daàu coù theå ñoùng vai troø nhö chaát xuùc taùc khöû. Söï töông taùc giöõa nhieät ñoä vaø noàng ñoä oxi aûnh höôûng ñeán söï taïo thaønh caùc hôïp chaát bay hôi trong daàu boâng ôû ñieàu kieän trong toái. Söï taïo thaønh 2-pentenal vaø 1-pentene-3-one coù theå xaûy ra ôû 50oC nhöng ôû 35oC thì khoâng coù. Toác ñoä phaûn öùng giöõa daàu vaø oxy tuøy thuoäc vaøo loaïi oxy. Toác ñoä phaûn öùng cuûa oxy singlet 1O2 thì cao hôn so vôùi 3O2 bôûi vì 1O2 coù theå phaûn öùng tröïc tieáp vôùi lipid. 3O2 chæ phaûn öùng vôùi lipid ôû traïng thaùi goác töï do. Linoleate phaûn öùng vôùi 1O2 nhanh hôn 1430 laàn so vôùi 3O2. Caùc thaønh phaàn phuï hieän dieän trong daàu Thaønh phaàn chính cuûa daàu laø TAG, ngoaøi ra coøn coù caùc thaønh phaàn phuï khaùc nhö acid beùo töï do, mono-vaø diacylglyceride, kim loaïi, phospholipd, peroxide, chlorophyll, carotenoid, hôïp chaát phenolic vaø tocopherol. Moät vaøi trong soá chuùng laøm taêng toác ñoä oxi hoùa, moät soá ñoùng vai troø nhö nhöõng chaát choáng oxi hoùa. Acid beùo töï do(FFA), nomo-vaø diacylglyceride Daàu thoâ chöùa nhieàu caùc acid beùo töï do vaø quaù trình tinh luyeän daàu laøm giaûm haøm löôïng caùc acid beùo töï do naøy. Daàu naønh thoâ chöùa khoaûng 0,7% acid beùo töï do, coøn trong daàu tinh luyeän chæ chöùa khoaûng 0,02% FFA. Daàu vöøng thoâ chöùa 0,72% FFA nhöng sau khi taåy maøu chæ coøn khoaûng 0,56% FFA (Kim vaø Choe, 2005). Caùc acid beùo töï do deã bò oxi hoùa hôn caùc acid beùo ñöôïc ester hoùa. Caùc acid beùo ñoùng vai troø nhö nhöõng chaát kích thích söï oxi hoùa daàu. Chuùng coù nhöõng nhoùm chöùc öa nöôùc vaø öa daàu. Caùc nhoùm carbonyl cuûa FFA thöôøng hoøa tan keùm trong daàu vì theá caùc FFA coù khung höôùng taäp trung ôû treân beà maët. Ñieàu naøy laø nguyeân nhaân laøm giaûm öùng suaát beà maët cuûa daàu vaø keát quaû laø laøm taêng toác ñoä khuyeách taùn cuûa oxi vaøo daàu, thuùc ñaåy söï oxi hoùa daàu. Thoâng thöôøng, mono- vaø diacylglyceride coù haøm löôïng töø 0,07 -0,11 vaø 1,05 – 1,2% KL daàu naønh. Chuùng ñoùng vai troø nhö nhöõng chaát hoã trôï söï oxi hoùa daàu. Chuùng cuõng laøm giaûm öùng suaát beà maët daàu vaø do ñoù laøm taêng toác ñoä oxi hoùa daàu. Kim loaïi Daàu thoâ chöùa caùc kim loaïi chuyeån tieáp nhö saét vaø ñoàng. Kim loaïi laøm taêng söï oxi hoùa daàu do chuùng laøm giaûm naêng löôïng hoaït hoùa trong böôùc khôûi maïch cuûa söï töï oxi hoùa xuoáng khoaûng 60-104 kJ/mol. Kim loaïi phaûn öùng tröïc tieáp vôùi lipid ñeå hình thaønh neân caùc goác alkyl lipid. Chuùng cuõng saûn sinh ra caùc loaïi oxi hoaït ñoäng nhö 1O2, goác hydroxy töø 3O2 vaø hydrogen peroxide. Goác alkyl lipid vaø oxy hoaït ñoäng thuùc ñaåy söï oxi hoùa daàu. Ñoàng thuùc ñaåy söï phaân huûy hydroperoxide nhanh gaáp 50 laàn so vôùi, coøn Fe2+ thì thuùc ñaåy söï phaân huûy naøy nhanh gaáp 100 laàn so vôùi Fe3+. Phaûn öùng giöõa kim loaïi vaø lipid xaûy ra theo sô ñoà sau: Fe3+ + RH ® Fe2+ + R− + H+ Fe2+ + 3O2 ® Fe3+ + O−2· O−2·+ O−2·+ 2H+ ® 1O2 + H2O2 H2O2 + O−2 HO· + OH− + 1O2 Fe2+ + H2O2 ® Fe3+ + OH− + HO· Kim loaïi cuõng thuùc ñaåy söï töï oxi hoùa lipid baèng caùch phaân huûy caùc hydroperoxide theo phaûn öùng sau: ROOH + Fe2+(Cu+) ® RO· + Fe3+(Cu2+) + OH− ROOH + Fe3+ (Cu2+) ® ROO· + Fe2+(Cu+) + H+ Fe2+ coù tính hoaït ñoäng cao hôn so vôùi Fe3+ trong söï phaân huûy hydroperoxide. Fe3+ cuõng gaây phaân huûy caùc hôïp chaát phenolic nhö acid caffeic trong daàu olive vaø laøm giaûm ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu naøy. Hoaït tính hoã trôï oxi hoùa cuûa saét coù theå bò ngaên chaën bôûi lactoferrin trong daàu caù hoaëc daàu naønh trong khoaûng nhieät ñoä töø 50-120oC. Lactoferrin coù theå keát hôïp vôùi saét laøm giaûm beà maët hoaït ñoäng cuûa saét. Vì theá söï oxi hoùa daàu giaûm xuoáng. Phospholipid Daàu thoâ coù chöùa phospholipid nhö phosphatidyl ethanolamine, phosphatidyl choline, phosphatidyl inositol, phsphatidyl serine vaø acid phosphatidic nhöng phaàn lôùn chuùng bò loaïi boû trong quaù trình tinh luyeän daàu. Phospholipid vöøa ñoùng vai troø laø chaát choáng oxi hoùa vöøa laø chaát hoã trôï söï oxi hoùa daàu tuøy thuoäc vaøo haøm löôïng phospholipid vaø kim loaïi xuùc taùc. Söï oxi hoùa cuûa docosahexaenoic acid giaûm xuoáng khi phoái troân noù vôùi daàu theo tyû leä 1:1. Cô cheá choáng oxi hoùa daàu cuûa phospholipid vaãn chöa ñöôïc giaûi thích cuï theå nhöng nhöõng nhoùm phaân cöïc ñoùng moät vai troø quan troïng, ñaëc bieät laø caùc phospholipid chöùa Nitô nhö phosphatidylcholine vaø phosphatidylethanolamine coù hieäu quaû choáng oxi hoùa döôùi moïi ñieàu kieän. Phospholipid laøm giaûm söï oxi hoùa baèng caùch coâ laäp kim loaïi. Noàng ñoä thích hôïp cho pohpholipid theå hieän hoaït tính choáng oxi hoùa laø 3-60 ppm. Phophospholipid boå sung vaøo daàu naønh vôùi noàng ñoä 5-10 ppm seõ laøm giaûm söï oâi hoùa daàu, coøn ôû noàng ñoä cao hôn noù seõ theå hieän vai troø nhö chaát hoã trôï söï oâi hoùa daàu. Theo Yoon[8], phospholipid chæ theå hieän hoaït tính choáng oxi hoùa khi coù söï hieän dieän cuûa saét baèng caùch coâ laäp saét. Trong daàu naønh tinh luyeän, khi haøm löôïng kim loaïi raát thaáp thì phospholipid laïi theå hieän vai troø laø chaát hoã trôï söï oâi hoùa. Cô cheá cuûa söï oâi hoùa domphospholipid laø do trong phospholipid coù caùc nhoùm öa nöôùc. Caùc nhoùm naøy laøm giaûm öùng suaát beà maët daàu nen laøm taêng toác ñoä khuyeách taùn oxi vaøo daàu. Vì theá, söï oxi hoùa daàu ñöôïc thuùc ñaåy nhanh hôn. Chlorophyll Chlorophyll thöôøng coù maët trong caùc loaïi daàu thöïc vaät. Daàu olive, daàu haït caûi, daàu naønh thoâ vaø daàu nanh tinh luyeän coù haøm löôïng chlorophyll laàn löôït laø 10 ppm; 5-35 ppm; 0,3 ppm; 0,08 ppm (Salvador 2001, Psomiadou vaø Tsimidou 2002). Chlorophyll vaø caùc saûn phaåm phaân huûy cuûa chuùng nhö pheophytins vaø pheophorbides ñoùng vai troø nhö nhöõng chaát laøm taêng ñoä nhaïy aùnh saùng ñeå sinh ra 1O2 trong söï coù maët cuûa aùnh saùng vaø oxy khí quyeån 3O2 vaø laøm taêng söï oâi hoùa daàu. Pheophytins vaøpheophorbide ñeàu coù ñoä nhaïy aùnh saùng cao hôn chlorophyll. Daàu naønh ñöôïc tinh saïch baèng coät saéc kyù silicagel seõ khoâng coù chöùa chlorophyll vaø daàu naøy khoâng sinh ra caùc saûn phaåm bay hôi (theo Lee vaø Min 1988). Coøn daàu naønh tinh luyeän ñöôïc boå sung chlorophyll seõ laøm taêng haøm löôïng chaát bay hôi ñaùng keå. Tuy nhieân, söï oâi hoùa do chlorophyll chæ xaûy ra trong ñieàu kieän coù aùnh saùng chieáu vaøo daàu, coøn trong toái thì khoâng. Ngöôïc laïi, trong ñieàu kieän boùng toái, chlorophyll laïi coù theå ñoùng troø laø chaát choáng oxi hoùa baèng caùch chuùng nhöôøng ñieän töû cho caùc goác töï do ñeå hình thaønh neân caùc goác beàn (theo Endo1985, Francis vaøIsabel 1992). Caùc hôïp chaát bò oxi hoùa nhieät ñoäng Quaù trình tinh luyeän daàu laøm saûn sinh ra hôïp chaát bò oxi hoùa nhö cyclic vaø noncyclic carbon-to-carbon- dimer, trimer, hydroxy dimer vaø dimer, trimer chöùa lieân keát carbon-oxy. Caùc hôïp chaát naøy laøm taêng toác ñoä oâi hoùa daàu ôû 55oC vaø toác ñoä oâi hoùa taêng khi haøm löôïng caùc chaát naøy taêng. Lipid hydroperoxide cuõng ñoùng vai troø nhö chaát hoã trôï söï oâi hoùa. Söï phaân huûy hydroperoxide laøm saûn sinh ra caùc chaát bò oxi hoùa nhieät ñoäng. Chính caùc chaát naøy coù taùc duïng nhö nhöõng chaát nhuõ hoùa laøm giaûm öùng suaát beà maët cuûa daàu vaø vì theá laøm taêng toác ñoä oxi hoùa daàu. Chaát choáng oxi hoùa Daàu thoâ chöùa caùc chaát choáng oxi hoùa töï nhieân nhö tocopherol, tocotrienol, carotenoid, hôïp chaát phenolic vaø sterol. Chaát choáng oxi hoùa laø nhöõng chaát laøm giaûm thôøi gian caûm öùng cuûa söï oxi hoùa hay laøm chaäm toác ñoä oxi hoùa. Caùc chaát choáng oxi hoùa saøng loïc caùc goác töï do nhö goác alkyl lipid, goác peroxy lipid, coâ laäp kim loaïi chuyeån tieáp, daäp taét caùc oxy singlet 1O2 vaø voâ hoaït caùc chaát laøm taêng ñoä nhaïy quang hoïc cho daàu. Chaát choáng oxi hoùa coù theå nhöôøng ñieän töû cho caùc goác töï do ñeå chuyeån chuùng thaønh caùc chaát khoâng goác töï do beàn. Caùc chaát choáng oxi hoùa theo kieåu naøy chính laø caùc monohydroxy hoaëc polyhydroxy phenolic. Baát kyø chaát naøo coù ñieän theá khöû nhoû hôn ñieän theá khöû cuûa goác töï do ñeàu coù theå nhöôøng ñieän töû cho goác töï do neáu phaûn öùng ñoäng hoïc thuaän lôïi. Ñieän theá khöû chuaån 1 ñieän töû cuûa alkoxy, peroxy vaø goác alkyl cuûa caùc acid beùo khoâng baõo hoøa laàn löôït laø 1600, 1000 vaø 600 mV. Ñieän theá chuaån cuûa caùc chaát choáng oxi hoùa thöôøng khoaûng 500mV hoaëc thaáp hôn. Vì theá, caùc chaát choáng oxi hoùa seõ phaûn öùng vôùi goác peroxy tröôùc khi caùc goác peroxy naøy kòp phaûn öùng vôùi caùc phaân töû lipid khaùc ñeå hình thaønh neân goác töï do. Baát kyø goác choáng oxi hoùa naøo ñöôïc taïo thaønh do söï keát hôïp giöõa chaát choáng oxi hoùa vaø lipid ñeàu coù naêng löôïng thaáp hôn peroxy do caáu truùc coäng höôûng cuûa noù. Hình 8: Söï beàn hoùa coäng höôûng cuûa moät chaát choáng oxi hoùa Caùc chaát taïo phöùc vôùi kim loaïi nhö acid phosphoric, acid citric, acid ascorbic vaø EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) laøm giaûm söï o xi hoùa daàu theo cuøng moät caùch thöùc nhö nhau. Chuùng coù theå chuyeån saét, ñoàng thaønh phöùc khoâng hoøa tan hoaëc gaây caûn trôû khoâng gian ñoái vôùi söï hình thaønh caùc phöùc kim loaïi-hydroperoxide. Hieäu quaû choáng oxi hoùa cuûa acid citric taêng khi haøm löôïng cuûa noù taêng vaø thöôøng caàn nhieàu hôn 150ppm acid citric ñeå voâ hoaït 1ppm kim loaïi. Moät vaøi chaát choáng oxi hoùa daäp taét caùc 1O2 hoaëc chaát nhaïy aùnh saùng. 1O2 ñöôïc daäp taét theo caû cô cheá vaät lyù vaø hoùa hoïc. Theo cô cheá vaät lyù, 1O2 bò chuyeån thaønh 3O2 bôûi söï vaän chuyeån naêng löôïng hay ñieän tích. Theo cô cheá hoùa hoïc, caùc chaát choáng oxi hoùa phaûn öùng vôùi 1O2 vaø taïo thaønh caùc chaát chaát oxi hoùa bò oxi hoùa. Tocopherol Tocopherol laø chaát choáng oxi hoùa quan troïng trong daàu. Daàu haït caûi, daàu höôùng döông vaø daàu nguõ coác co chöùa haøm löôïng cao tocopherol, coøn daàu coï thì chöùa ít hôn. Tuy nhieân trong daàu coï coù chöùa α-, γ -, δ-tocotrienol. Tocopherol caïnh tranh vôùi caùc acid beùo khoâng baõo hoøa vaø vôùi caùc goác peroxy. Goác peroxy phaûn öùng vôùi tocopherol nhanh hôn nhieàu(v=104 -109 M-1s-1) so vôùi lipid (v=10 -60M-1s-1). Moät pah6n töû tocopherol coù theå baûo veä 103-108 phaân töû acid beùo khoâng baõo hoøa khi chæ soá peroxide thaáp. Tocopherol coù theå chuyeån moät ñieän töû ôû vò trí hydroxy thöù 6 ôû voøng chroman cuûa noù sang goác peroxy vaø daäp taét goác peroxy naøy. Tocopherol(T) coù ñieän theá khöû khoaûng 500 mV nhöôøng ñieän töû cho goác peroxy(ROO·)(coù ñieän theá khöû laø 1000 mV) vaø hình thaønh neân hydroperoxide(ROOH) vaø goác tocopheroxy(T·). Goác tocopheroxy beàn hôn goác peroxy do caáu truùc coäng höôûng cuûa noù. Vì theá, söï oxi hoùa daàu giaûm xuoáng trong böôùc phaùt trieån maïch cuûa quaù trình töï oâi hoùa daàu. Goác tocophroxy coù theå phaûn öùng vôùi nhau hay vôùi caùc hôïp chaát khaùc tuøy thuoäc vaøo toác ñoä oxi hoùa daàu. Khi toác ñoä oxi hoùa daàu thaáp, tocopheroxy phaûn öùng vôùi nhau ñeå hình thaønh tocopheryl quinone. Khi toác ñoä oxi hoùa daàu cao, tocopheroxy phaûn öùng vôùi goác peroxy ñeå hình thaønh neân phöùc tocopherol-peroxy(T-OOR). Phöùc naøy coù theå bò thuûy phaân thaønh tocopheryl quinone vaø hydroperoxide. T + ROO·− ® T + ROOH T· + T· ® T + Tocopheryl quinone T· + ROO· ® [T − OOR] ® Tocopheryl quinone + ROOH Hieäu quaû choáng oxi hoùa cuûa tocopherol phuï thöôïc vaøo daïng ñoàng phaân vaø noàng ñoä söû duïng. Khaû naêng daäp taét goác töï do cao nhaát ôû d-tocopherol, tieáp theo laø γ -, β-, and α-tocopherol. Haøm löôïng tocopherol caàn thieát ñeå choáng oâi hoùa daàu tuøy thuoäc vaøo ñoä beàn oxi hoùa cuûa chuùng. Ñoä beàn oxi hoùa cuûa tocopherol caøng thaáp thì haøm löôïng tocopherol caàn duøng caøng thaáp. α-tocopherol coù ñoä beàn thaáp nhaát trong soá coù ñoàng phaân tocopherol, caàn duøng vôùi noàng ñoä 100 ppm thì theå hieän hoaït tính choáng oxi hoùa cao nhaát cuûa noù. Trong khi ñoù, γ- vaø d-tocopherol coù ñoä beàn oxi hoùa cao hôn, caàn noàng ñoä 250 vaø 500 ppm ñeå theå hieän hoaït tính choáng oxi hoùa cao nhaát. Tocopherol, ñaëc bieät laø α-tocopherol, ñoùng vai troø nhö chaát hoã trôï söï oxi hoùa khi noàng ñoä cuûa chuùng trong daàu cao. Khi noàng ñoä peroxy raát thaáp, caùc goác tocopheroxy loâi keùo ñieän töû töø lipid ñeå taïo thaønh tocopherol vaø goác alkyl lipid. Söï hình thaønh alkyl lipid seõ laøm taêng toác ñoä oâi hoùa daàu. Khaû naêng thuùc ñaåy söï oxi hoùa theå hieän cao nhaát ôû α-tocopherol, tieáp theo laø γ- vaø d-tocopherol. Giaù trò ngöôõng ñeå α-tocopherol theå hieän nhö chaát hoã trôï oxi hoùa trong daàu naønh laø 60-70 ppm. Khi trong daàu caøng ít α –tocopherol thì giaù trò ngöôõng naøy caøng thaáp. Khaû naêng gaây oxi hoùa cuûa α –tocopherol giaûm khi nhieät ñoä taêng, ngay caû ôû noàng ñoä cao. Acid ascorbic coù theå laøm giaûm caùc goác tocopheroxy theo sô ñoà sau: T· + RH ® T + R· R· + O2 ® ROO· T· + Asc ® T + Dehydroascorbic acid Ngoaøi ra, tocopherol coøn laøm giaûm söï oxi hoùa daàu do aùnh saùng theo cô cheá daäp taét 1O2. Khaû naêng daäp taét 1O2 tuøy thuoäc vaøo haøm löôïng vaø loaïi tocophetol. ÔÛ noàng ñoä 1.10-3M, hoaït tính trieät tieâu 1O2 giaûm theo thöù töï sau α-> γ ->δ- tocopherol. Tuy nhieân, ôû noàng ñoä 4.10-3M thì khoâng coù söï khaùc bieät. Tocopherol coù theå hình thaønh moät phöùc vaän chuyeån ñieän tích ([T+–O2]1) vôùi 1O2 baèng caùch cho 1O2 ñieän töû. Phöùc [T+–O2]1ôû traïng thaùi ñôn boäi seõ thoâng qua heä thoáng vaän chuyeån noäi phaân töû seõ hình thaønh neân phöùc ôû traïng thaùi tam boäi [T+–O2]3 vaø saûn phaåm chuyeån hoùa cuoái cuøng laø tocopherol vaø oxy daïng ít hoaït ñoäng hôn 3O2. Quaù trình naøy khoâng lieân quan ñeán caùc phaûn öùng hoùa hoïc neân quaù trình naøy goïi laø daäp taét vaät lyù: T + 1O2 ® [T+-1O2]1 ® [T+-1O2]3 ® T + 3O2 Hình 9: Söï oxi hoùa cuûa oxy ñôn boäi vôùi α-tocopherol Carotenoid b-carotene coù theå laøm giaûm söï oxi hoùa lipid baèng caùch loïc aùnh saùng, daäp taét 1O2, voâ hoaït chaát nhaïy aùnh saùng vaø loaïi boû caùc goác töï do. Theo Fakourelis, b-carotene coù theå laøm giaûm söï oxi hoùa daàu olive trong ñieàu kieän aùnh saùng ôû 25o baèng caùch loïc boû caùc caùc aùnh saùng coù böôùc soùng 400 vaø 500nm. Trong söï hieän dieän ñoàng thôøi cuûa chlorophyll, b-carotene laøm giaûm söï oxi hoùa daàu naønh baèng caùch daäp taét 1O2. Quaù trình daäp taét 1O2 xaûy ra theo cô cheá vaän chuyeån naêng löôïng töø 1O2 sang b-carotene maø khoâng coù hình thaønh caùc saûn phaåm oxi hoùa. Caùc carotenoid ôû traïng thaùi kích thích naøy seõ quay veà trang thaùi naêng löôïng cô baûn baèng caùch giaûi phoùng naêng löôïng döôùi daïng nhieät theo sô ñoà sau: 1O2 + 1Carotenoid ® 3O2 + 3Carotenoid· 3Carotenoid· ® Carotenoid + Heat Moät phaân töû b-carotene coù theå daäp taét 250-1000 phaân töû 1O2 vôùi toác ñoä 1,3.1010 M-1s-1. Quaù trình daäp taét 1O2 phuï thuoäc vaøo soá noái ñoâi lieân hôïp cuûa carotenoid. Caùc carotenoid coù ít nhaát 9 noái ñoâi lieân hôïp nhö β-carotene, lycopene, lutein laø nhöõng chaát daäp taét 1O2 hieäu quaû, trong khi ñoù phytoene, phytofluene, ζ-carotene thì khoâng coù hieäu quaû.Khaû naêng daäp taét 1O2 gia taêng khi soá noái ñoâi lieân hôïp cuûa carotenoid gia taêng. α-carotene vaø lycopene coù khaû naêng daäp taét 1O2 cao hôn so vôùi b-carotene. Carotenoid voâ hoaït caùc chaát nhaïy aùnh saùng baèng caùch haáp thu naêng löôïng töø chuùng. Caùc carotenoid hoaït hoùa naøy seõ quay trôû laïi traïng thaùi neàn baèng caùch phoùng thích naêng löôïng cuûa noù vaøo trong daàu. Theo Lee(2003), carotenoid coù ñieän theá khöû 1electron cao Eo’ =1060mV. Do ñoù, chuùng khoù coù theå nhöôøng ñieän töû cho alkyl (Eo’ =600 mV) hoaëc goác peroxy (Eo’ =770-1440 mV) cuûa caùc acid beùo khoâng baõo hoøa. Tuy nhieân, b-carotene coù theå nhöôøng ñieän töû cho goác hydroxy(Eo’ =2310 mV) vaø hình thaønh goác carotene. Goác carotene laø moät loaïi goác beàn do söï khoâng ñònh vò cuûa caùc electron khoâng caëp ñoâi thoâng qua heä thoáng caùc noái ñoâi lieân hôïp. Khi noàng ñoä oxy thaáp, goác carotene naøy coù theå phaûn öùng vôùi caùc goác khaùc nhö goác peroxy ñeå taïo thaønh saûn phaåm khoâng coøn goác töï do. Cô cheá nhö sau: Car + HO· ® Car· + H2O Car· + ROO· ® Car-OOR Goác peroxy coù theå phaûn öùng vôùi carotene ñeå taïo thaønh goác carotene-peroxy(ROO-Car), ñaëc bieät laø khi aùp suaát rieâng phaàn cuûa oxy cao hôn 150 mmHg. Goác carotene-peroxy seõ phaûn öùng vôùi 3O2 roài lipid ñeå taïo thaønh goác alkyl lipid, trong böôùc phaùt trieån maïch theo sô ñoà sau: ROO· + Car ® ROO − Car ROO – Car + 3O2 ® ROO − Car − OO· ROO − Car − OO· + R’H ® ROO − Car − OOH + R’· Caùc hôïp chaát phenolic khaùc Caùc hôïp chaát phenolic khaùc trong daàu cuõng coù hoaït tính choáng oxi hoùa. Daàu vöøng (IV =109) coù ñoä beàn oxi hoùa toát. Toác ñoä töï oxi hoùa cuûa daàu vöøng ôû 60oC thaáp hôn so vôùi daàu nguõ coác, daàu rum vaø daàu naønh. Daàu vöøng thu ñöôïc töø caùc haït vöøng ñaõ rang coù ñoä beàn oxi hoùa cao hôn so vôùi daàu thu ñöôïc töø caùc haït vöøng chöa rang. Ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu vöøng coù lieân quan ñeán söï hieän dieän cuûa lignan vaø tocopherol. Hôïp chaát lignan trong daàu vöøng bao goàm sesamin, sesamol, sesamolin, sesaminol, sesamolinol (Hình 10). Sesamin laø hôïp chaát lignan chöùa nhieàu hôn heát trong daàu vöøng chöa rang. Sasamol coù haøm löôïng thaáp trong daàu vöøng chöa rang nhöng trong daàu vöøng ñaõ rang, haøm löôïng cao hôn. Sesamol hình thaønh bôûi phaûn öùng thuûy phaân sesamolin suoát trong quaù trình tinh luyeän daàu. Sesamol ñöôïc chuyeån ñoåi thaønh sesamol dimer roài thaønh sesamol dimer quinone. Sesamol vaø sesaminol coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao hôn so vôùi sesamin. Sesamol ñoùng vai troø nhö chaát choáng oxi hoùa trong ñieàu kieän aùnh saùng cuõng nhö trong toái. Sesamol coù hoaït tính choáng oxi hoùa thaáp hôn α-tocopherol trong söï oxi hoùa quang hoïc bôûi chlorophyll, nhöng hoaït tính choáng oxi hoùa xaáp xæ d-tocopherol ôû cuøng noàng ñoä phaân töû. Cô cheá choáng oxi hoùa cuûa sesamol laø daäp taét caùc oxy ñôn boäi 1O2. Daàu vöøng cuõng chöùa caùc phytosterol nhö campesterol, stigmasterol, β-sitosterol, 4,5-avenasterol. Sitosterol vöøa ñoùng vai troø laø chaát hoã trôï söï oxi hoùa do laøm gia taêng ñoä hoøa tan oxy trong daàu, vöøa ñoùng vai troø laø chaát choáng oxi hoùa yeáu baèng caùch caïnh tranh söï oxi hoùa vôùi lipid. Daàu olive raát beàn oxi hoùa. Caùc hôïp chaát phenolic chính trong daàu bao goàm tyrosol (4-hydroxyphenylethanol), hydroxytyrosol (3,4-dihydroxyphenylethanol), hydroxybenzoic acid, oleuropein, caffeic acid, vanillic acid, p-coumaric acid, daãn xuaát cuûa tyrosol vaø hydroxytyrosol. Caùc hôïp chaát phenolic naøy ñoùng vai troø nhö nhöõng chaát choáng oxi hoùa trong böôùc khôûi maïch cuûa söï töï oxi hoùa baèng caùch daäp taét goác töï do vaø coâ laäp kim loaïi xuùc taùc. Hydroxutyrosol laø chaát choáng oxi hoùa chính trong daàu olive. Caùc o-diphenol nhö acid caffeic bò oxi hoùa thaønh quinone vaø trôû neân khoâng hieäu quaû trong vieäc coâ laäp saét. Tuy nhieân, hydroxytyrosol, tyrosol, acid vanillic, acid p-coumaric khoâng bò oxi hoùa bôûi saét. Hình 10: Caùc acid phenolic hieän dieän trong daàu PHAÀN II: LYÙ THUYEÁT VEÀ CAÙC CHAÁT CHOÁNG OXI HOÙA CÔ CHEÁ CHOÁNG OXI HOÙA [14] ÖÙc cheá söï taïo thaønh caùc nhoùm chaát chöùa oxi hoaït ñoäng, trieät tieâu caùc goác töï do baèng caùch coâ laäp caùc ion kim loaïi, giaûm hydroperoxide vaø hydrogen peroxide hoaëc baèng caùch keát hôïp superoxide vaø 1O2 Choïn loïc caùc goác töï do: baét giöõa caùc goác töï do, öùc cheá phaûn öùng oxi hoùa ban ñaàu cuõng nhö phaù vôõ chuoãi phaûn öùng daây chuyeàn. Polyphenol cuõng laø moät nhoùm caùc chaát choáng oxi hoùa choïn loïc goác töï do quan troïng Nhoùm chaát öa nöôùc: Vitamin C, uric acid, bilirubin, albumin Nhoùm chaát öa beùo: Vitamin E, ubiquinol, carotenoid, flavonoid Thöùc aên laø nguoàn cung caáp chaát choáng oxi hoùa töï nhieân raát quan troïng. Chuùng ta coù theå thu caùc chaát choáng oxi hoùa töï nhieân töø traùi caây, thaûo döôïc vaø gia vò… Baûng 1: Baûng phaân loaïi vaø cô cheá hoaït ñoäng cuûa chaát choáng oxi hoùa [14] Phaân loaïi chaát choáng oxi hoùa Cô cheá hoaït tính choáng oxi hoùa Ví duï veà chaát choáng oxi hoùa Caùc chaát choáng oxi hoùa ñuùng nghóa Voâ hoaït caùc goác lipid töï do Hôïp chaát phenolic Chaát laøm beàn hydroperoxide Ngaên chaën söï phaân huûy hydroperoxide thaønh caùc goác töï do Hôïp chaát phenolic Chaát hoã trôï Taêng hoaït tính cho chaát choáng oxi hoùa chính Acid citric, acid ascorbic Chaát coâ laäp kim loaïi Lieân keát kim loaïi naëng thaønh nhöõng hôïp chaát khoâng hoaït ñoäng Acid phosphoric, hôïp chaát Maillard, acid citric Chaát daäp taét oxy ñôn boäi, 1O2 Chuyeån 1O2®3O2 Carotenoid Chaát laøm giaûm hydroperoxide Giaûm löôïng hydroperoxide theo caùch khoâng taïo goác töï do Protein, amino acid CAÙC CHAÁT CHOÁNG OXI HOÙA TÖÏ NHIEÂN [1,9] Hieän nay coù raát nhieàu chaát choáng oxi hoùa töø thöùc aên, laø thaønh phaàn bioactive cuûa thöùc aên. Moät soá chaát choáng oxi hoùa truyeàn thoáng ñaõ ñöôïc bieát ñeán nhö vitamin E vaø viatmin C. Beân caïnh ñoù, moät soá chaát choáng oxi hoùa coù nguoàn goác thöïc vaät nhö flavonoid ñaõ ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong nhöõng naêm gaàn ñaây, ñaëc bieät laø ubiquitous. Nhoùm caùc polyphenol coù hoaït tính choáng oxi hoùa bao goàm vitamin A, vitamin E, coenzyme Q, vitamin C, flavonoid… Caáu truùc cô baûn Hieäu quaû choáng oxi hoùa cuûa caùc chaát choáng oxi hoùa töï nhieân phuï thuoäc vaøo hydro cuûa nhoùm polyphenol trong phaûn öùng vôùi goác töï do, ñoä beàn cuûa cuûa goác choáng oxi hoùa taïo thaønh trong phaûn öùng goác töï do, nhoùm chöùc trong caáu truùc phaân töû. Thaønh phaàn cuûa caùc nhoùm chöùc trong phaân töû cuûa caùc chaát choáng oxi hoùa töï nhieân raát quan troïng vì lieân quan ñeán söï tham gia phaûn öùng goác töï do cuûa caùc chaát naøy. Khaû naêng nhöôøng oxi cuûa nhoùm chöùc methyl, ethyl, tertiary butyl ôû vò trí -ortho vaø -para so vôùi nhoùm hydroxyl seõ laøm taêng hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa polyphenol. Neáu coù theâm moät nhoùm hydro ôû caùc vò trí naøy thì taùc duïng cuõng töông töï. Nhoùm chöùc ôû vò trí ortho, ví duï nhö 1,2-dihydroxybenzene coù khuynh höôùng taïo lieân keát hydro noäi phaân töû trong phaûn öùng goác töï do, seõ laøm beàn goác phenoxy. Hình 11: Lieân keát hydro noäi phaân töû cuûa moät phenol Nhoùm methoxy (-OCH3) ôû vò trí ortho so vôùi nhoùm hydroxy coù theå laøm yeáu hoaït tính choáng oxi hoùa do khoâng taïo ñöôïc lieân keát hydro noäi phaân töû. Caùc chaát choáng oxi hoùa töï nhieân coù theå taïo phöùc vôùi ion kim loaïi. Phöùc kim loaïi laøm beàn daïng oxi hoùa cuûa ion kim loaïi, laøm maát khaû naêng xuùc taùc phaûn öùng oxi hoùa khöû cuûa caùc ion naøy. Caáu taïo vaø cô cheá hoaït ñoäng cuûa moät vaøi chaát choáng oxi hoùa Chaát choáng oxi hoùa toång hôïp Hình 12: Caáu taïo phaân töû cuûa moät vaøi chaát choáng oxi hoùa toång hôïp Caùc chaát choáng oxi hoùa toång hôïp phoå bieán nhaát laø caùc hôïp chaát phenolic nhö butylated hydroxyanisol (BHA)14, butylated hydroxy-toluene (BHT)15, tertiary butylhydroquinone (TBHQ)16, vaø caùc ester cuûa acid gallic nhö propyl gallate (PG)17. Caùc chaát naøy luoân ñöôïc thay theá bôûi caùc alkyl ñeå caûi thieän ñoä beàn cuûa noù trong daàu môõ. Haøm löôïng cao nhaát cho pheùp söû duïng laø 0,02% (200ppm) KL daàu môõ. Ñoái vôùi daàu thöïc vaät, caùc chaát choáng oxi hoùa toång hôïp thöôøng duøng nhaát laø BHA, BHT, TBHQ. Caùc chaát naøy beàn ôû nhieät ñoä cao vaø vì theá thöôøng duøng ñeå laøm beàn daàu khi chieân hay nöôùng. Gallate thöôøng ít duøng vì noù coù khuynh höôùng hình thaønh caùc haït ñen vôùi ion saét vaø khoâng beàn nhieät. Cô cheá choáng oxi hoùa chính cuûa caùc chaát naøy laø baét giöõ caùc goác töï do trong daàu Hieän nay, do phaùp hieän ñoäc tính cuûa chuùng neân nhöõng chaát naøy ngaøy caøng ít söû duïng vaø ñöôïc thay theá bôûi caùc chaát choáng oxi hoùa coù nguoàn goác töï nhieân. Chaát choáng oxi hoùa töï nhieân Thaønh phaàn caùc nhoùm chöùc, vò trí caùc nhoùm chöùc trong phaân töû chaát choáng oxi hoùa coù lieân quan tröïc tieáp ñeán hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc chaát naøy. Phaàn ñaàu ñaõ trình baøy hoaït ñoäng cuûa moät vaøi chaát choáng oxi hoùa coù saün trong daàu môõ. Ñoù laø tocopherol, tocotrienol, carotenoid….Vì vaäy, phaàn sau ñaây chæ ñeà caëp ñeán caùc chaát choáng oxi trích ly töø thöïc vaät, coù khaû naêng boå sung vaøo daàu môõ nhaèm muïc ñích taêng khaû naêng baûo quaûn daàu môõ. Phenolic acid Caùc phenolic acid nhö p-hydroxybenzoic34, 3,4-dihydroxybenzoic35, vanillic36, syringic37, p-coumaric38, caffeic39, ferulic40, sinapic41, chlorogenic42, rosmarinic43 acid laø nhöõng chaát phoå bieán nhaát trong giôùi thöïc vaät. Chuùng laø caùc ester cuûa acid höõu cô hoaëc glucoside. Vò trí vaø möùc ñoä hydroxyl hoùa laø cô sôû ñeå xaùc ñònh hoaït tính choáng oxi hoùa. Caùc monophenol thì coù hoaït tính thaáp hôn polyphenol nhö trihydrobenoic acid (nhö acid gallic) coù khaû naêng choáng oxi hoùa maïnh hôn 3,4-dihydroxybenzoic acid (protocachuic acid). Hieäu quaû öùc cheá cuûa monophenol gia taêng ñaùng keå baèng caùch thay theá moät hay hai nhoùm methoxy. Söï keát hôïp cuûa 2 phenolic seõ gia taêng hieäu quaû choáng oxi hoùa. Daïng ester cuûa phenolic ít hoaït tính hôn daïng phenolic nhö ester cuûa acid caffeic thì hoaït tính thaáp hôn acid caffeic, chlorogenic acid thì hoaït tính thaáp hôn acid caffeic. Söï taïo thaønh lieân keát hydro noäi phaân töû ôû caffeic acid laøm taêng khaû naêng choáng oxi hoùa so vôùi frulic acid vaø p-coumaric acid. Nhoùm methoxy ôû vò trí ortho cuûa acid frulic laøm cho goác phenoxy beàn hôn, do ñoù acid ferulic coù hoaït tính choáng oxi hoùa maïnh hôn acid p-coumaric. Söï töông taùc giöõa caùc nhoùm chöùc trong phaân töû coù theå laøm thay ñoåi hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc chaát. Nhoùm chöùc allylic ñöôïc cho raèng coù khaû naêng laøm beàn goác phenoxy. Do ñoù, caùc daãn xuaát cuûa cinnamic acid coù hoaït tính choáng oxi hoùa maïnh hôn so vôùi nhoùm daãn xuaát cuûa acid benzoic. Hình 13: Caáu taïo phaân töû cuûa moät vaøi acid phenolic Flavonoid Flavonoid laø moät nhoùm lôùn cuûa caùc phenolic töï nhieân. Chuùng ñöôïc ñaët tröng bôûi maïch carbon C6-C3-C6. Caáu truùc cô baûn cuûa nhöõng hôïp chaát naøy bao goàm 2 voøng thôm ñöôïc lieân keát bôûi moät maïch 3 carbon. Flavanoid bao goàm flavone, flavonol, isoflavone, flavonone vaø chalcone, trong ñoù, flavone vaø flavonol laø phoå bieán nhaát. Hình 14: Caáu taïo phaân töû cuûa moät vaøi flavonoid Cô cheá choáng oxi hoùa cuûa flavonoid theo caùc caùch sau: loaïi boû goác töï do ( caùc anion superoxide, goác peroxy vaø goác hydroxyl), trieät tieâu oxy ñôn boäi 1O2, coâ laäp kim loaïi vaø öùc cheá enzyme lipoxygenase. Flavonoid coù nhöõng nhoùm hydroxyl ñoùng vai troø nhö nhöõng chaát trieät tieâu goác töï do. Caùc nhoùm chöùc hydroxyl trong voøng B laø nhöõng vò trí ngaên chaën söï oxi hoùa cô baûn nhaát. Cuõng nhö trong caùc hôïp chaát phenolic khaùc, vò trí vaø soá löôïng caùc nhoùm hydroxy aûnh höôûng ñeán hoaït tính cuûa flavonoid. Möùc ñoä nhöôøng ñieän töû tuøy thuoäc vaøo hai nhoùm hydroxy ôû vò trí ortho treân voøng B. Khi coù theâm moät nhoùm –OH ôû vò trí 5’ cuõng laøm taêng hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa flavonoid. Ví duï: Myricetin coù 3 nhoùm –OH neân hoaït ñoäng hôn so vôùi quercetin(2 nhoùm –OH) vaø hesperitin(1 nhoùm –OH) -OH ôû C3(alglycone) taêng khaû naêng choáng oxi hoùa hôn so daïng glycosilate. Nhoùm –OH treân voøng A, ôû vò trí 5,7 hoaëc 7,8 taêng hoaït tính choáng oxi hoùa. Flavonoid coù nhoùm -OH ôû vò trí ortho treân voøng B hoaëc coù nhoùm –OH ñeàu coù theå keát hôïp maïnh vôùi caùc goác töï do. Khaû naêng taïo phöùc vôùi ion kim loaïi cuûa flavonoid caàn phaûi coù caáu truùc 3’,4’-dihydroxy, quan troïng hôn laø C4 quinone caø C3 hoaëc C5-OH. Hình 15: Cô cheá coâ laäp kim loaïi cuûa flavonoid Isoflavone laø hôïp chaát coù caáu truùc flavonoid tìm thaáy nhieàu ôû hoï Leguminoseae. Genistein vaø 7-b-glucoside, genistein laø caùc isoflavone coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao. Nhoùm –OH ôû C4’ laøm isoflavone coù hoaït tính choáng oxi hoùa. Khi coù theâm nhoùm –OH ôû C5, hoaït tính choáng oxi hoùa taêng leân ñaùng keå. Hình 16: Caáu truùc cuûa caùc isoflavone töø hoï Leguminoseae Anthocyanin vaø anthocyanidin laø saûn phaåm chuyeån hoùa cuûa flavonone. Khaû naêng taïo phöùc vôùi ion kim loaïi do caùc nhoùm –OH ôû C3’ vaø C4’ treân voøng b. Khaû naêng phaûn öùng vôùi caùc goác töï do cuûa anthocyanidin cuõng phuï thuoäc vaøo caáu truùc –OH ôû vò trí ortho. Khaùc vôùi flavonoid, khi theâm –OH vaøo vò trí C5’ khoâng laøm taêng hoaït tính cuûa anthocyanidin. Daïng ngöng tuï cuûa anthocyanidin taïo thaønh proanthocyanidin polymer( nhö tanin ngöng tuï) coù hoaït tính choáng oxi hoùa maïnh do coù chöùa nhieàu nhoùm –OH. Tannin thuûy phaân chöùa caùc lieân keát glucose vôùi acid gallic vaø/hoaëc hexahydroxydiphenic acid qua caùc caàu ester. Lieân keát naøy coù theå bò phaù vôõ trong ñieàu kieän kieàm hoaëc acid taïo thaønh glucose vaø caùc tieåu phaân phenolic. Do ñoù, tannin cuõng coù taùc duïng choáng oxi hoùa döôùi moät soá ñieàu kieän nhaát ñònh. Hình 17: Caáu truùc phaân töû cuûa moät vaøi anthocyanidin vaø anthocyanin ñöôïc phaân laäp töø thöïc vaät CAÙC LOAØI THÖÏC VAÄT COÙ CHÖÙA CHAÁT CHOÁNG OXI HOÙA Caùc chaát choáng oxi hoùa töø rau quaû Rau quaû bao goàm caùc loaïi thaân vaø cuû(carot, khoai taây, cuû caûi ñöôøng…), rau aên laù(caûi baép, caûi boâng..), laù traø, haønh, toûi, tieâu, caø chua… ñaõ ñöôïc duøng nhö nhöõng chaát choáng oxi hoùa töï nhieân trong nhieàu lónh vöïc. Pratt vaø Watt[14], nhaän ra raèng laù haønh coù tieàm naêng choáng oxi hoùa cao gaáp hai laàn so vôùi voû khoai taây, ôùt xanh vaø cao gaáp 4 laàn khaû naêng choáng oxi hoùa cuûa caø chua cho acid linoleic. Cuõng phöông phaùp treân, Gazzani [14] ñaõ cho thaáy raèng phaàn lôùn dòch trích rau quaû laïi hoã trôï quaù trình oxi hoùa luùc ñaàu môùi trích ly. Söï hoã trôï quaù trình oxi hoùa cao ôû thöïc vaät cuû, caø chua, ôùt ñoû. Ñoái vôùi carrot, rau caàn taây, toûi, naám, zucchini vaø ñaëc bieät laø dòch trích cuû, hoaït tính choáng oxi hoùa gia taêng khi ñun soâi vaø hoaït tính hoã trôï söï oxi hoùa giaûm xuoáng. Ñieàu naøy laø bôûi ôû nhieät ñoä cao, peroxidase bò voâ hoaït neân hoaït tính tieàn oxi hoùa môùi phaùt huy taùc duïng. Kahkonen ñaõ nghieân cöùu hieäu quaû dòch trích thöïc vaät ñoái vôùi söï oxi hoùa methyl linoleate tinh khieát ôû noàng ñoä 5000 ppm treân khoái löôïng chaát khoâ thöïc vaät. Hoaït tính choáng oxi hoùa theo traät töï sau: ñaäu, rau aên (kieàm haõm 37%) > döa chuoät, laù ñaäu (35%)> ñaäu (28%) > haønh (11%) > carrot (10%). Trong khi ñoù, hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa dòch trích töø voû cuû caûi ñöôøng, voû khoai taây raát cao, leân ñeán 86-99%. Baèng phöông phaùp ORAC, Cao et al [9] ñaõ thu ñöôïc keát quaû nhö sau veà hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa thöïc vaät: caûi xoaên(caûi xuùp)> toûi > rau bina > caûi baép bruxel > choài linh laêng > boâng caûi xanh >cuû caûi ñöôøng > ôùt ñoû > haønh > haït nguõ coác > eggplant > suùp lô > khoai taây >khoai taây ngoït > caûi baép > laù rau dieáp > xô ñaäu > carrot > bí vaøng > rau dieáp laïnh > caàn taây> döa leo. Keát quaû theo phöông phaùp FRAP cho caùc dòch trích thöïc vaät nhö sau: ñaäu, toûi, haønh, maêng taây, cuû caûi ñöôøng, khoai taây and boâng caûi xanh coù hieäu quaû cao trong vieäc kìm haõm söï oxi hoùa cuûa Lipid tyû troïng thaáp(LDL) va lipid tyû troïng raát thaáp(RLDL). Keát quaû thu ñöôïc döïa treân nhöõng hôïp nhöõng hôïp chaát choáng oxi hoùa coù saün trong dòch trích thöïc vaät maø khoâng coù söï phaân laäp töøng chaát rieâng. Ñoù laø caùc hôïp chaát: acid phenolic, tocopherol, carotenoid, acid ascorbic. Caùc thöïc vaät hoï thaân cuû Carrot coù hoaït tính choáng oxi hoùa thaáp hôn so vôùi caùc loaïi rau quaû khaùc. Dòch trích töø laù vaø voû carrot coù hoaït tính choáng oxi hoùa ôû 40oC, trong khi dòch carrot töôi khoâng coù hoaït tính naøy. Ñun soâi carrot trong 30 phuùt seõ caûi thieän ñaùng keå hoaït tính choáng oxi hoùa trong quaù trình oxi hoùa acid linoleic vaø b-carotene. Khoai taây(Solanum tuberosum) laø moät nguoàn choáng oxi hoùa toát nhö acid ascorbic, a-tocopherol vaø hôïp chaát phenolic. Theo Lugasi, dòch trích khoai taây trong ethanol chöùng toû khaû naêng nhaän ñieän töû ñaùng keå baèng caùch duøng diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) vaø laøm giaûm phaûn öùng Fe3+®Fe2+. Ñaëc bieät, voû khoai taây coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao. Caùc hôïp chaát coù hoaït tính phaân laâp ñöôïc töø khoai taây, ñaëc bieät laø trong voû, laø daãn xuaát cuûa acid cafeic nhö chlorogenic acid, caffeoylquinic acid. Nhöõng hôïp chaát naøy laø nguyeân nhaân cuûa phaûn öùng hoùa naâu do enzyme vaø ñoùng vai troø nhö chaát choáng oxi hoùa trong khoai taây ngoït. Dòch trích töø khoai taây ngoït coù hoaït tính choáng oxi hoùa. Dòch trích töø khoai taây tím coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao hôn khoai taây traéng vaø loaïi vaøng. Nguyeân nhaân cuûa söï khaùc bieät naøy laø do coù söï hieän dieän cuûa anthocyanin nhö pelargonidin-3-rutinoside-5-glucoside, peonidin glycoside trong khoai taây tím. Voû cuû caûi ñöôøng(Bate vulgaris L vaø Beta vulgaris esculeta) cuõng coù hoaït tính choáng oxi hoùa töông töï khoai taây. Thöïc vaät hoï caûi baép Ñaây laø moät nhoùm lôùn chöùa nhieàu hôïp chaát coù hoaït tính sinh hoc nhö glucosinolate vaø caùc saûn phaåm breakdown. Theo Plumb [14], dòch trích töø caûi boâng xanh(Brassica learacea L cv Italica L), caûi baép Brussels(B olearacea L Gemmifera), caûi baép ñoû (B olearacea L cv Rubra), caûi baép traéng (B olearacea L cv Alba ) vaø suùp lô (B olearacea L cv Botrytis) coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao ñoái vôùi quaù trình peroxide hoùa lipid. Tuy nhieân cô cheá choáng oxi hoùa trong thöïc vaät hoï caûi khoâng lieân quan ñeán haøm löôïng glucosilate maø laø do caùc hôïp chaát hydroxylate polyphenol vaø polyphenol. Ngöôïc laïi, caûi baép, suùp lô, caûi Brussel laïi hoã trôï quaù trình oxi hoùa ñoái vôùi söï peroxide hoùa lipid, do coù chöùa cytochrome ñaëc bieät, P450s. Caûi xoaên (B olearacea L cv Acephala), caûi baép Brussels vaø caûi boâng xanh coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao hôn suùp lô vaø caùc loaïi caûi baép khaùc. Caûi baép traéng coù khaû naêng kóm haõm söï oxi hoùa caëp ñoâi cuûa b-carotene vaø acid linoleic hôn 80%. Neáu caûi boâng xanh ñöôïc ñun soâi trong 5 phuùt thì khaû naêng kìm haõm naøleân ñeán 96%. Hình 18: Caáu truùc phaân töû cuûa caùc acid phenolic coù trong caûi baép Haønh (Allium cepa vaø Allium fistulosum L.) Hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa laù haønh vaø cuû haønh ñöôïc nghieân cöùu theo moâ hình choáng oxi hoùa lipid vaø phöông phaùp saøng loïc goác töï do (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl; DPPH). Haønh ñoû vaø haønh vaøng coù khaû naêng choáng oxi hoùa methyl linolate keùm nhöng hoaït tính choáng oxi hoùa LDL laïi cao. Hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa haønh theo phöông phaùp ORAC(xem muïc V) keùm 4 laàn so vôùi toûi (Allium sativum L). Theo Yin[14], söï hieän dieän cuûa laù haønh, cuû haønh, laù toûi, cuû toûi, haønh taây, laù heï ñaõ kìm haõm ñaùng keå söï oxi hoùa lipid trong heä thoáng liposome phosphatidylcholine. Allicin laø chaát choáng oxi hoùa trong laù toûi. Nhöõng loaïi rau giaøu anthocyanin, nhö cuû haønh ñoû, coù hoaït tính choáng oxi hoùa maïnh trong heä thoáng b-carotene vaø acid linoleic. Traø(Camellia sinesis) Traø ñöôïc saûn xuaát ôû 3 daïng: traø xanh, traø oolong(leân men moät phaàn) vaø traø ñen(traø len men). Hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc dòch trích trong nöôùc giaûm theo thöù töï sau: traø oolong>traø xanh>traø ñen. Dòch trích trong ethanol cuûa traø xanh, traø ñoû, traø vaøng coù hoaït tính choáng oxi hoùa maïnh cho daàu canola so vôùi BHT. Trong khi ñoù, traø oolong chæ coù hoaït tính trung bình vì coù söï phaân huûy moät phaàn caùc polyphenol töï nhieân trong quaù trình baùn leân men. Dòch trích trong ethanol töø traø ñen, traø xanh ñaäm, traø ginseng thì haàu nhö khoâng coù khaû naêng choáng oxi hoùa daàu canola do caùc polyphenol töï nhieân ñaõ bò phaân huûy hoaøn toaøn. Zandi[14] cho raèng dòch trích trong ethanol töø caùc laù traø giaø coù hieäu quaû trong vieäc laøm chaäm laïi söï oxi hoùa daàu haït caûi ôû 60oC vôùi haøm löôïng laø 0,02-0,25%. Laù traø giaø, thöôøng bò boû ñi trong saûn xuaát traø, coù theå laø moät nguoàn thu chaát choáng oxi hoùa höõu ích. Coù 3 nhoùm polyphenol chính trong traø: catechin, theaflavin, theabrubigin. Catechin vaø theaflavin bao goàm (-)-epicatechin (EC), (-)-epicatechin gallate (ECG)44, (-)-epigallocatechin (EGC)45, (-)-epigallocatechingallate (EGCG)46, theaflavin (TF)47, theaflavin monogallate A(TF-1A)48, theaflavin monogallate B (TF-1B)49, theaflavin digallate50. Caáu truùc hoùa hoùa hoïc cuûa theabrubigin vaãn chöa hieåu bieát ñaåy ñuû. Catechin laø moät thaønh phaàn lôùn trong traø vôùi haøm löôïng EGCG cao. Khaû naêng choáng oxi hoùa cuûa traø töông quan vôùi toång haøm löôïng phenolic chöùa trong noù. Koketsu [14], ñaõ chieân mì sôïi trong môõ heo, coù boå sung theâm polyphenol töø traø xanh. Khi ñoù, ñoä beàn oxi hoùa cuûa mì töông öùng vôùi haøm löôïng polyphenol trong môõ heo. Boät catechin töø traø thoâ ñaõ laøm giaûm söï hình thaønh peroxide trong môõ heo ôû 100oC, hieäu quaû cao hôn khi duøng a-tocopherol hoaëc BHA. Dòch trích töø traø xanh choáng laïi söï oxi hoùa lipid hieäu quaû hôn nhieàu so vôùi dòch trích töø hoa hoàng trong daàu canola, môõ heo vaø môõ gaø ôû 100oC. Hình 19: Caáu truùc phaân töû cuûa caùc polyphenol chính trong traø Catechin trong traø xanh (EGCG, ECG, EGC, EC) coù khaû naêng kìm haõm toát quaù trình oxi hoùa superoxide, lipoxygenase vaø lipid. Tuy nhieân, theaflavin ít hieäu quaû trong vieâc kìm haõm quaù trình peroxide hoùa lipid. Hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc chaát phuï thuoäc vaøo heä thoáng lipid, kim loaïi xuùc taùc, nhieät ñoä, noàng ñoä chaát choáng oxi hoùa, giai ñoaïn cuûa quaù trình oxi hoùa vaø phöông phaùp ñaùnh giaù söï oxi hoùa lipid. Trong heä thoáng b-caroten-linoleate, ECG coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao nhaát, coøn EGC laø yeáu nhaát. Trong moâ hình oxi hoùa lipoprotein, traät töï nhö sau: EGCG > EGC > ECG > catechin. Huang [14] ñaõ so saùnh hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa catechin so vôùi propyL gallate(PG) vaø acid gallic. Trong söï oxi hoùa daàu nguõ coác ôû 50oC, toác ñoä hình thaønh hydroperoxide giaûm theo thöù töï sau: GA > ECG > EGCG > EGC. Trong heä nhuõ töông nöôùc trong daàu, polyphenol hoaït ñoäng nhö chaát tieàn oxi hoùa, coøn thöù töï kìm haõm hydroperoxide trong licithin liposome laø: EGCG > EC» PG > catechin » ECG > EGC » GA. Kinh giới (Origanum vulgare L) Kinh giôùi thöôøng ñöôïc söû duïng nhö moät loaïi gia vò hoaëc rau aên töôi raát phoå bieán nhieàu nôi treân theá giôùi. Ngoaøi khaû naêng choáng oxi hoùa, noù coøn theâm khaû naêng choáng vi sinh vaät. Abdalla vaø Roozen [14] cho raèng, khi trích ly baèng acetone, hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa noù trong daàu höôùng döông hieäu quaû hôn trong heä nhuõ töông 20% daàu trong nöôùc ôû ñieàu kieän 60oC trong toái. Caùc loaøi kinh giôùi vaø hoï haøng cuûa chuùng bao goàm Origanum onites, Satureja thymbra, Coridothymus capitatus, Origanum dictamnus… Phaân ñoaïn coù theå hoøa tan tron nöôùc cuûa dòch trích kinh giôùi trong methanol ñöôïc tinh saïch baèng coät polyamide chöùa 5 hôïp chaát phaân cöïc laø acid rosmarinic, acid caffeic, protocatechuic61, glucoside cuûa protocatechuic acid62 vaø moät daãn xuaát cuûa acid romarinic, 2-caffeoyloxy-3-[2-(4-hydroxybenzyl)-4,5-dihydroxy]- phenylpropionic acid63. Phaân ñoaïn tan trong diethyl ether töø dòch trích trong ethanol goàm 4 flavonoid laø apigenin64, eriodictyol65, dihydroquercetin66 vaø dihydrokaemferol67. Trong dòch trích baèng dung moâi hexane coù chöùa α-, b-, g-, d-tocopherol. Tinh daàu thu ñöôïc töø kinh giôùi chöùa carvacrol vaø thymol. Theo Lagouri et al [9], hieäu quaû choáng oxi hoùa cuûa kinh giôùi coù lieân quan ñeán söï hieän dieän cuûa caùc ñoàng phaân naøy. Nhieàu taùc giaû cho raèng maëc duø hai thaønh phaàn naøy coù cô cheá choáng oxi hoùa khaùc nhau nhöng hieäu quaû choáng oxi hoùa cuûa chuùng laø nhö nhau ñoái vôùi söï töï oâi hoùa cuûa môõ heo ôû 37oC. Tuy nhieân, thymol laø chaát choáng oxi hoùa toát hôn trong triacylglycerol cuûa daàu höôùng döông (TGSO) so vôùi trong triacylglycerol cuûa môõ heo(TGL). Hình 20: Caùc polyphenol chính trong kinh giôùi Caây huùng taây(coû xaï höông) (Thymus vulgaris L) Huùng taây thöôøng duøng nhö moät loaïi thaûo döôïc ñeå trò beänh ho vaø nhö moät gia vò ñeå taåy muøi hoaëc taïo muøi trong thöïc phaåm. Hai monoterpene cô baûn trong huùng laø thymol vaø carvacrol. Hai hôïp chaát naøy laø thaønh phaàn chính cuûa tinh daàu huùng. Ngoaøi ra, p-cumene-2,3-diol trong huùng cuõng coù khaû naêng choáng söï peroxide cuûa daàu môõ. Khi trích ly trong moâi tröôøng acid yeáu roài tinh saïch baèng coät saéc kyù, ngöôøi ta ñaõ tìm thaáy 5 biphenyl-dimer cuûa thymol vaø carvacrol 71-75 vaø caùc flavonoid methoxylate 76-78 . Biphenyl coøn laø nhöõng chaát taåy muøi hieäu quaû. Hình 21: Caùc polyphenol chính trong caây huùng taây Huùng cay (Satureja hortensis L) Rau huùng ñöôïc söû duïng raát roäng raõi trong thöïc phaåm. Yanishlieva vaø Marinova[14] ñaõ duøng dòch trích rau huùng trong ethanol ñeå baûo quaûn daàu höôùng döông ôû 100oC. Keát quaû laø chuùng coù khaû naêng choáng oxi hoùa cao. Ñoái vôùi môõ heo, khaû naêng choáng oxi hoùa cuûa dòch trích töø rau huùng coù hieäu quaû hôn ôû nhieät ñoä phoøng hôn laø ôû 100oC. Theâm 0,1-0,5 dòch trích trong ethanol vaøo daàu höôùng döông ñaõ kieàm haõm söï oxi hoùa vaø söï thay ñoåi nhieät ñoäng suoát trong quaù trình chieân daàu. Tuy nhieân, chlorophyll trong rau huùng ñöôïc xem laø moät chaát taêng ñoä nhaïy quang hoïc ñoái vôùi quaù trình oxi hoùa daàu. Caùc hôïp chaát choáng oxi hoùa phaân laäp ñöôïc töø rau huùng laø acid rosmarinic, carnosol acid carnosic, carvacrol vaø thymol. Chuùng laø nhöõng thaønh phaàn trong tinh daàu cuûa rau huùng. Göøng(Zingiber officinale) vaø ngheä (Curcuma domestica) Trong göøng (Zingiber officinale) coù chöùa hôn 30 chaát coù hoaït tính choáng oxi hoùa. Chuùng ñöôïc phaân loaïi vaøo 2 nhoùm laø caùc hôïp chaát gingerol vaø diarylheptaoid72-79. Trong soá caùc chaát ñoù, caùc chaát gaây cay, gingerol79, shogaol80, zingerone81 theå hieän khaû naêng choáng oxi hoùa cao nhaát. Trong ngheä, curcumin93 vaø dehydroxylate curcumin93-102 laø hai chaát coù hoaït tính choáng oxi hoùa tieàm naêng. Curcumin haïn cheá söï oxi hoùa methyl linoleate trong heä nhuõ töông höõu cô ñoàng nhaát. Curcumin coù theå keát hôïp vôùi caùc goác töï do ñeå taïo dimer trong böôùc khôûi maïch cuûa tieán trình oxi hoùa lipid. Masuda vaø Jioe [14] cho raèng hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa cassmunin A-C maïnh hôncurcumin bôûi nhöõng hôïp chaát naøy coøn coù tính khaùng vieâm. Jitoe ñaõ nghieân cöùu moái quan heä giöõa hoaït tính choáng oxi hoùa vaø haøm löôïng curcumioid cuûa caùc dòch trích acetone trong heä thoáng acid linoleic-ethanol. Keát quaû cho thaáy, hoaït tính choáng oxi hoùa thu ñöôïc cao hôn so vôùi hoaït tính choáng oxi hoùa lyù thuyeát suy ra töø haøm löôïng curcumioid. Dòch trích göøng töôi coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao hôn so vôùi dòch trích ñaõ baûo quaûn moät thôøi gian. Hình 22: Caùc hôïp chaáât choáng oxi hoùa chính trong göøng Hình 23: Caùc hôïp chaát choáng oxi hoùa chính trong ngheä Cau (Semen Arecae) Hình 24: Caáu truùc phaân töû cuûa arecolin Trong haït cau coù 15% catechin vaø polyleucoanthocyanidin,13-14% daàu beùo vôùi caùc thaønh phaàn chính laø laurin, myristin, olein. Hoaït tính alcaloid (0,15-0,67%) ôû daïng keát hôïp vôùi tanin. Acaloid chính laø arecolin (0,07-0,5%) vaø nhöõng alcaliod phuï laø arecaidin(arecain), guvacin, guvacolin, arecolidin vaø isoguvacin. Maéc côõ (Mimosa pudica L.) Caây maéc côõ moïc hoang ôû nhieàu nôi. Thaønh phaàn choáng oxi hoùa coù baûn chaát laø alcaloid. Caùc loaïi thaûo döôïc vaø gia vò khaùc. Tieâu ñen (Piper nigrum L) taùc duïng maïnh trong vieäc laøm giaûm söï oxi hoùa cuûa thòt boø nöôùng. Caùc chaát choáng oxi hoùa trong tieâu laø caùc glycoside cuûa flavonoid kaemeferol, rhamnetin, quercetin vaø caùc phenolic amide103-107. ÔÙt xanh (Capsicum frutescence L) vaø ôùt ñoû( C. annum L) coù chöùa caùc chaát choáng oxi hoùa laø capsaicin108, capsaicinol109. Acid gallic vaø eugenol110 laø hai chaát coù hoaït tính choáng oxi hoùa chính trong cuû haønh (Eugenia caryophyllata). Isoeugenol111, hieám gaëp trong töï nhieân, coù hoaït tính choáng oxi hoùa raát cao so vôùi eugenol trong söï oxi hoùa cuûa methyl oleate, môõ heo vaø daàu höôùng döông. Khaû naêng chöõa beänh cuûa nhaân saâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) moät phaàn lieân quan ñeán khaû naêng choáng oxi hoùa maïnh cuûa chuùng. Dòch trích nhaân saâm trong hexane choáng oxi hoùa raát maïnh môõ heo caû ôû 100o vaø 180oC. Caùc chaát choáng oxi hoùa chính trong nhaân saâm laø tanshinone I112, dihydrotanshinone I113, tanshinone IIB114, methylene tanshinquinone115, cryptotanshinone116, danshenxinkun B117, miltirone I118, rosmariquinone, dehydrorosmariquinon119. Tashen quinone coù khaû naêng baét caùc goác lipid töï do ñeå hình thaønh caùc goác beàn. Do ñoù, chuùng coù theå ngaên chaën quaù trình töï oxi hoùa lipid. Dòch trích töø cam thaûo cuõng coù khaû naêng choáng oxi hoùa cao. Người chaâu Aâu thöôøng khai thaùc loaøi cam thảo Glycyrrhiza glabra L. Nước ta dùng chủ yếu loaøi cam thảo nam (Scoparia dulcis L) vaø cam thảo bắc (Radix Glycyrrhizae). Thaønh phaàn choáng oxi hoùa chính trong cam thaûo baéc vaø chaâu Aâu laø saponin (glycyrrhizin) vaø flavonoid (liquiritin), coøn trong cam thaûo nam laø amelin-coù baûn chaát laø moät alcaloid. Hình 25: Caáu truùc cuûa chaát choáng oxi hoùa trong caùc loaøi gia vò Hình 26: Caùc chaát choáng oxi hoùa chính trong nhaân saâm Baûng 2: Baûng toång hôïp caùc chaát choáng oxi hoùa ñieån hình töø caùc loaïi thöïc vaät khaùc nhau Loaøi Teân khoa hoïc Chaát vaø loaïi chaát choáng oxi hoùa Caûi xanhb B olearacea Hôïp chaát phenolic Cam thaûob Glycyrrhiza glabra Flavonoids, licorice phenolics Cam thaûo baécc,d Glycyrrhiza uralensis Fisch; Glycyrrhiza inflata Bat Saponin (glycyrrhizin), flavonoid (liquiritin) Cam thaûo namc,d Scoparia dulcis L Alcaloid (amelin) Caua,c,d Areca catechu L. Tanin, catechin, 70% trong hạt non, 15-20% trong hạt giaø; alcaloid 0,5%: arecolin, arecaidin, guvacin, guvacolin. Cỏ mực Eclipta alba (L.) hassk. Alcaloid : ecliptin, nicotin vaø coumarin lacton laø wedelolacton. Daønh daønha,d Gardenia jasminoides Ellis Glycoside coù phaàn genin laø daãn chaát diterpen coù maøu vaøng Haønh laùb,d Allium fistulosum L. Allyl propyl disulfit, diallyl disulfit vaø hợp chất chứa sulfur. Haønh cuûb,d Allium cepa L. Eugenol, gallates Khoai taâyb Solanum tuberosum Daãn xuaát acid caffeic, acid chlorogenic Kinh giôùib (thuốc) Origanum vulgare; Origanum syriacum Daãn xuaát cuûa acid phenolic, flavonoid, tocopherol Kinh giới (rau)d Elsholtzia Cristata Caùc ceton của elsholtzia Hoaøng lieâna,d Coptis chinensis Franch; Coptis diltoidea C.Y cheng et Hisiao. Hoaøng ñaènga,d Radix et caulis fibraurea, Fibraurea tinctoria Lour. Alcaloid : Palmatin, jatrorrhizin, columbamin, berberin Huùng cayb,d Satureja hortensis L Carvacrol, thymol Huùng chanhd Coleus amboinicus Lour. Carvacrol Huùng taâyb Thymus vulgaris Thymol, carvacrol, p-cumene- 2,3-diol, biphenyl, flavonoid Göøngb,d Zingiber officinale Rosc. Hôïp chaát gingerol, diarylheptanoid Laù oåic Psidium guajava L Sitosterol, Quereetin, Guaijaverin, Leucocyanidin vaø Avicularin; Eugenol Maéc côõc Mimosa pudica L., Alcaloid Ngheä ñoûb,d Curcuma zedoaria Rosc.; Curcuma aromatica Salisb. α-pinen, D-camphen, cineol, D-camphor, D-borneol, sesquiterpen alcol, zingiberen Ngheävaøngb,d Curcuma domestica Curcumin, turmeron, dehydrotumeron, α, γ-alantolactone; curcumen, cineol. ÔÙt ñoûb Capsicum annum Capsaicin ÔÙt xanhb Capsicum frutescence Capsaicin, capsaicinol Riềng Alpinia galanga Willd. cineol, methyl cinnamat; caùc flavon: galangin, alpinin; kaempferid 3 - dioxy 4 - methoxy flavon Tía toâd Perilla frutescens L. Perillaldehyd (4- isopropenyl 1-cyclohexen- 7-al), limonen, α-pinen vaø dihydrocumin Thaïch hoäcc Dendrobium nobile Lindl; Dendrobium candidum wall Alcaloit : Dendrobium (C16H25O2N), dendrobine, dendranime, nobilonine, dendroxine, dendrin, 6-hydroxydendroxine Toûi tad Allium sativum L. Allicin, hôïp chaát diallyl disulfit, allyl propyl disulfit vaø moät soá hôïp chaát chöùa sulfur khaùc. Tỏ tây Allium porrum L. Traø xanhb Camelia sinensis Catechin Traø ñenb Camelia assamica Theaflavin, thearubigin Traàu khoângd Piper betle L. Eugenol, carvacrol, chavicol, allylcatechol, chavibetol, cineol, estragol, methyl, eugenol, p-cymen, caryophyllen, cadinen; tanin Nguoàn: aTs. Phạm Thanh Kỳ,”Dược liệu học”, Nhaøø xuaát bản Y học, 2007. bJan Pokorny,”Antioxidant in food”, CRC Press, 2001. c d PHÖÔNG PHAÙP TRÍCH LY CHAÁT CHOÁNG OXI HOÙA TÖØ THÖÏC VAÄT Taát caû caùc phöông phaùp trích ly chaát choáng oxi hoùa hieän nay ñeàu söû duïng dung moâi ñeå trích ly. Tuy nhieân, tuøy thuoäc vaøo ñieàu kieän trích ly vaø thieát bò söû duïng maø phaân bieät caùc phöông phaùp trích ly vôùi nhau. Sau ñaây laø 3 phöông phaùp duøng phoå bieán nhaát. Trích ly ôû nhieät ñoä thöôøng Ñaây laø phöông phaùp trích ly coå ñieån nhaát. Caùc loaïi thöïc vaät thöôøng ñöôïc saáy khoâ hoaëc phôi trong boùng raâm ñeán ñoä aåm thaáp nhaát roài ñem ñi nghieàn. Boät nghieàn thu ñöôïc seõ ñem hoøa tan trong dung moâi thích hôïp roài ñem ñi uû trong boùng toái. Thôøi gian trích ly baèng phöông phaùp naøy thöôøng raát daøi, trung bình laø 3 ngaøy, coù khi leân ñeán 7 ngaøy. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp trích ly naøy laø baûo toaøn ñöôïc hoaït tính choáng oxi hoùa trong dòch trích, ñaëc bieät laø caùc thaønh phaàn maãn caûm vôùi nhieät ñoä. Phöông phaùp naøy thöôøng duøng ñeå trích ly caùc thaønh phaàn töø thaûo döôïc, duøng vaøo muïc ñích y hoïc. Trích ly baèng nhieät Phöông phaùp naøy töông töï nhö treân nhöng quaù trình trích ly ñöôïc taêng toác baèng caùch gia nhieät. Nhieät ñoä trích ly baèng phöông phaùp naøy thöôøng khoaûng 37-50oC, tuøy thuoäc vaøo ñoä beàn nhieät cuûa chaát choáng oxi hoùa. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø thôøi gian trích ly ngaén, trung bình töø 3-6h. Tuy nhieân, moät soá chaát choáng oxi hoùa nhaïy caûm vôùi nhieät seõ bò phaân huûy. Phöông phaùp naøy coù theå duøng ñeå trích ly caùc chaát choáng oxi hoùa boå sung vaøo saûn phaåm thöïc phaåm. Vôùi ñoái töôïng laø saûn phaåm thöïc phaåm, yeâu caàu ñaët ra laø chaát choáng oxi hoùa cho vaøo phaûi beàn vaø oån ñònh trong thôøi gian daøi. Vì theá, trích ly baèng nhieät, tuy coù phaù huûy moät soá chaát nhaïy caûm nhieät nhöng nhöõng chaát choáng oxi hoùa thu ñöôïc seõ beàn nhieät hôn, oån ñònh hôn vaø thích hôïp ñeå boå sung vaøo thöïc phaåm. Coù nhieàu caùch trích ly baèng nhieät. Coù theå trích ly trong beå ñieàu nhieät, trích ly baèng heä thoáng Sophlet hay keát hôïp ñaùnh sieâu aâm vaø gia nhieät. Tuy nhieân, trích ly baèng beå ñieàu nhieät vaãn laø phoå bieán hôn heát do phöông phaùp naøy coù theå kieåm soaùt ñöôïc nhieät ñoä deã daøng. Trích ly ôû aùp suaát cao, nhieät ñoä thaáp Ñaây laø ñieàu kieän trích ly vôùi dung moâi söû duïng laø chaát loûng sieâu tôùi haïn. Chaát loûng thöôøng duøng laø CO2 sieâu tôùi haïn. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp naøy laø hieäu suaát trích ly cao, khoâng caàn phaûi tinh saïch dung moâi ra khoûi dòch trích vì tính ñoäc haïi cuûa noù thaáp. Phöông phaùp naøy hieän nay chæ duøng vaøo muïc ñích nghieân cöùu hôn laø öùng duïng vaøo saûn xuaát bôûi chi phí vaän haønh cao vaø thieát bò phöùc taïp. CAÙC PHÖÔNG PHAÙP XAÙC ÑÒNH HOAÏT TÍNH CHOÁNG OXI CUÛA CAÙC DÒCH TRÍCH TÖØ THÖÏC VAÄT Phöông phaùp xaùc ñònh tröïc tieáp hoaït tính choáng oxi hoùa Phöông phaùp TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity): Xaùc ñònh hoaït tính choáng oxi hoùa so vôùi khaû naêng choáng oxi hoùa cuûa Trolox. Phöông phaùp DPPH(Scavenging ability towards DPPH radicals): Khaû naêng khöû goác töï do DPPH Phöông phaùp ORAC(oxygen radical absorbance capacity): xaùc ñònh khaû haáp thuï goác töï do chöùa oxy hoaït ñoäng. Phương pháp TRAP (total radical-trapping antioxidant potential): Khaû naêng choáng oxi hoùa baèng caùch baãy caùc goác töï do. Phương pháp FRAP (ferric reducing-antioxidant power): löïc choáng oxi hoùa baèng phöông phaùp khöû saét. Phöông phaùp TEAC Cation ABTS+[2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate)(ABTS)] laø moät goác töï do beàn. Ñaây laø moät chaát phaùt quang maøu xanh, ñöôïc ñaëc tröng ôû ñoä haáp thu 734 nm. Khi cho chaát choáng oxi hoùa vaøo dung dòch chöùa ABTS+, caùc chaát choáng oxi hoùa seõ khöû ion naøy thaønh ABTS. Ño ñoä giaûm ñoä haáp thu cuûa dung dòch ôû böôùc soùng 734nm ñeå xaùc ñònh hoaït tính cuûa chaát choáng oxi hoùa trong söï so saùnh vôùi chaát chuaån Trolox[6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid]. Trong moâi tröôøng kali persulfate, goác ABTS+ coù theå beàn 2 ngaøy ôû nhieät ñoä phoøng trong toái. Phöông phaùp DPPH 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) laø moät goác töï do beàn, coù maøu tía vaø coù ñoä haáp thu cöïc ñaïi ôû böôùc soùng 517 nm. Khi coù maët chaát choáng oxi hoùa, noù seõ bò khöû thaønh 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazine(DPPH-H), coù maøu vaøng. Ño ñoä giaûm ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 517nm ñeå xaùc ñònh khaû naêng khöû goác DPPH cuûa chaát choáng oxi hoùa. Hình 27: Phaûn öùng giöõa DPPH vaø moät chaát choáng oxi hoùa Hoaït tính saøng loïc goác töï do ñöôïc tính theo phöông trình sau: Hoaït tính khöû goác töï do DPPH(%) = » Acontrol(0 phuùt) = ñoä haáp thu cuûa maãu ñoái chöùng ngay sau khi pha cheá. Acontrol(30 phuùt) = ñoä haáp thu cuûa maãu ñoái chöùng sau 30 phuùt uû. Asample(30 phuùt) = ñoä haáp thu cuûa maãu thí nghieäm sau 30 phuùt uû. Ablank(30 phuùt) = ñoä haáp thu cuûa maãu traéng sau 30 phuùt uû. Löôïng maãu caàn thieát ñeå phaûn öùng vôùi moät nöûa löôïng DPPH(hay ñoä haáp thu 50%) ñöôïc goïi laø löôïng töông ñoái Trolox phaûn öùng. Khi ñoù, hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa maãu coù theå dieãn taû baèng thuaät ngöõ laø soá micromole baèng Trolox/100g maãu hay ñôn vò Trolox/100g hay TE/100g. (TE: trolox equivalent) hay IC50. Phöông phaùp ORAC Phöông phaùp naøy ño möùc ñoä phaân huûy do bò oxi hoùa cuûa fluorescein khi coù söï hieän dieän cuûa goác peroxy. Phaûn öùng trong ñieàu kieän naøy ñöôïc so saùnh vôùi phaûn öùng trong söï hieän dieän cuûa chaát chuaån Trolox(hay vitamin E) vaø trong hieän dieän cuûa maãu chöùa chaát choáng oxi hoùa caàn xaùc ñònh hoaït tính. Khi fluorescein bò oxi hoùa, cöôøng ñoä phaùt huyønh quang seõ giaûm ñi. Tieán haønh ño ñoä giaûm cöôøng ñoä phaùt quang naøy lieân tuïc trong 35 phuùt sau khi theâm chaát oxi hoùa vaøo. Khi coù maët chaát choáng oxi hoùa, söï phaân raõ fluorescein seõ chaäm hôn. Xaây döïng ñöôøng cong bieåu dieãn söï phuï thuoäc ñoä giaûm phaùt huyønh quang theo thôøi gian vaø vuøng döôùi ñöôøng cong duøng ñeå tính toaùn. Keát quaû tính toaùn laø mmol Trolox/g maãu. Öu ñieåm cuûa phöông phaùp ORAC laø xaùc ñònh ñöôïc coù hoaëc khoâng coù söï treã pha trong maãu chöùa caùc chaát choáng oxi hoùa. Ñaây laø moät ñieàu raát thuaän lôïi khi ño caùc maãu thöïc phaåm chöùa caû nhöõng hôïp chaát choáng oxi hoùa coù toác ñoä phaûn öùng khaùc nhau nhieàu. Hình 28 : Ñoà thò moâ taû ñoä giaûm phaùt huyønh quang theo thôøi gian Phöông phaùp TRAP Phöông phaùp TRAP söû duïng goác peroxyl ñöôïc taïo thaønh töø 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH). Khi cho AAPH vaøo moâi tröôøng plasma, caùc chaát khöû seõ bò oxi hoùa. Quaù trình oxi hoùa naøy ñöôïc ño ñaït thoâng qua haøm löôïng oxi tieâu thuï baèng moät ñieän cöïc. Khi coù maët chaát choáng oxi hoùa trong moâi tröôøng plasma, quaù trình oxi hoùa seõ xaûy ra chaäm hôn. Giaù trò TRAP cuûa maãu thí nghieäm ñöôïc tính toaùn döïa vaøo ñoä daøi pha lag cuûa maãu so vôùi ñoä daøi pha lag cuûa maãu traéng vaø ñoä daøi pha lag cuûa chaát chuaån laø dung dòch Trolox. Keát quaû tính toaùn laø mmol Trolox/kg maãu raén hoaëc mmol Trolox/L maãu loûng. Phöông phaùp FRAP Nguyeân taéc xaùc ñònh hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa phöông phaùp naøy laø döïa treân khaû naêng cuûa caùc chaát choáng oxi hoaù trong vieäc khöû phöùc Fe3+-TPTZ [2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)] (maøu tía) thaønh phöùc Fe2+-TPTZ (maøu xanh) ôû pH thaáp. Khi ñoù, ñoä taêng cöôøng ñoä maøu xanh tyû leä vôùi haøm löôïng chaát choáng oxi hoùa coù trong nguyeân lieäu. Möùc ñoä taêng cöôøng ñoä maøu naøy ñöôïc ño ôû böôùc soùng 593nm trong söï so saùnh vôùi chaát chuaån laø dung dòch FeSO4 hay BHT (Butylated Hydroxy Toluene). Khi cho phöùc Fe3+-TPTZ vaøo moâi tröôøng chöùa chaát choáng oxi hoùa, caùc chaát choáng oxi hoùa seõ nhöôøng ñieän töû cho phöùc naøy vaø sinh ra Fe2+-TPTZ. Keát quaû tính toaùn laø mmol Fe2+/ g chaát khoâ. Do ñoù, khi keát quaû tính toaùn ra lôùn thì chuùng ta coù theå suy ñoaùn raèng trong moâi tröôøng phaûn öùng ñoù, soá löôïng caùc phaân töû coù theå nhöôøng ñieän töû laø cao. Tuy nhieân, ñieàu naøy khoâng hoaøn toaøn ñuùng vì moät phaân töû chaát choáng oxi hoùa coù theå khöû nhieàu phöùc Fe3+-TPTZ cuøng luùc. Ñaây laø moät haïn cheá cuûa phöông phaùp FRAP. Lipid assay Phöông phaùp naøy ñaùnh giaù söï khaùc bieät trong toác ñoä oxi hoùa acid linoleic bôûi goác ABAP trong moái quan heä vôùi chaát chuaån laø tocopherol. Tröôùc vaø trong suoát quaù trình xaûy ra phaûn öùng, nhieät ñoä cuûa hoãõn hôïp{[70 µL of linoleic acid (2,3 mmol/L)]; 100 mL ñeäm phosphate 0,05M (Natri phosphate hoøa tan trong nöôùc; 2.88 g SDS; pH 7.4)} ñöôïc ñieàu chænh vaø duy trì ôû 40oC. Laáy 2µl cuûa dung dòch naøy cho vaøo 0,01 ml ABAP(0,04M). Sau 2-5 phuùt phaûn öùng, laáy 0,02 ml dòch trích ly cho vaøo hoãn hôïp naøy. Ño ñoä haáp thu cuûa hoãn hôïp ôû 236nm. Xaây döïng ñöôøng chuaån laø tocopherol. Phöông phaùp xaùc ñònh giaùn tieáp hoaït tính choáng oxi hoùa Ñaùnh giaù khaû naêng choáng oxi hoùa cuûa caùc thöïc vaät thoâng qua khaû naêng choáng oxi hoùa cuûa chuùng cho daàu môõ. Phöông phaùp caân khoái löôïng Trong giai ñoaïn ñaàu tieân cuûa quaù trình oxi hoùa, khoái löôïng daàu taêng lieân tuïc do phaûn öùng giöõa caùc acid beùo vaø oxy ñeå hình thaønh neân hydroperoxide. Vì theá, coù theå ñaùnh giaù söï oxi hoùa daàu baèng caùch caân khoái löôïng cuûa noù. Chæ soá peroxide (PV) Chæ soá peroxide vaãn laø moät phöông phaùp ño tröïc tieáp söï phaân huûy daàu do oxi hoùa. Maëc duø caùc hydroperoxide bò phaân huûy thaønh moät hoãn hôïp caùc saûn phaåm bay hôi laãn khoâng bay hôi vaø chuùng cuõng coù theå phaûn öùng vôùi nhau ñeå hình thaønh neân caùc endoperoxide, chæ soá PV vaãn laø moät phöông phaùp raát höõu ích. Tuy nhieân, phöông phaùp naøy caàn keát hôïp vôùi caùc phöông phaùp khaùc ñeå cung caáp nhieàu thoâng tin hôn cho tieán trình oxi hoùa daàu. Phöông phaùp truyeàn thoáng ñeå xaùc ñònh chæ soá peroxide laø phöông phaùp chuaån ñoä. Khi coù maët KI, hydroperoxide seõ oxi hoùa iodide thaønh iod töï do. Ñònh phaân iod taïo thaønh baèng thiosulphate ñeå xaùc ñònh haøm löôïng hydroperoxide. Chæ soá peroxide khoâng ñöôïc duøng nhö moät phöông phaùp ñeå ñaùnh giaù söï phaân huûy daàu ôû nhieät ñoä chieân. Bôûi vì ôû khoaûng 150oC, caùc hydroperoxde seõ bò phaân huûy. Chæ soá PV coù theå duøng ñeå ñaùnh giaù söï oxi hoùa cuûa daàu ôû ñieàu kieän baûo quaûn laïnh sau khi chieân. Chæ soá dien lieân hôïp Söï hình thaønh hydroperoxide töø caùc acid beùo khoâng baõo hoøa seõ daãn ñeán söï hình thaønh caùc caáu truùc pentadien lieân hôïp. Caùc caáu truùc naøy coù cöïc ñaïi haáp thu ôû böôùc soùng 233-234nm. Ño quang phoå UV ñeå xaùc ñònh haøm löôïng hyroperoxide. Moät soá saûn phaåm taïo ra khi phaân huûy hydroperoxide nhö 9-hydroxyoctadeca-10,12-dienoic acid vaø13-hydroxyoctadeca-9,11-dienoic acid cuõng cöïc ñaïi haáp thu ôû böôùc soùng naøy. Vì theá, keát quaû xaùc ñònh hydoperoxide keùm chính xaùc hôn phöông phaùp PV. Chæ soá para-anisidine Para-anisidine seõ phaûn öùng vôùi aldehyde ñeå taïo thaønh moät saûn phaåm coù cöïc ñaïi haáp thu ôû böôùc soùng 350nm. Chæ soá p-anisidine ñöôïc ñònh nghóa laø ñoä haáp thu cuûa dung dòch töø phaûn öùng cuûa1g chaát beùo trong 100mL isooctane vôùi p-anisidine(0,25% trong acid acetic baêng). Saûn phaåm hình thaønh bôûi phaûn öùng giöõa p-anisidine vaø aldehyde khoâng baõo hoøa(2-alkenal) haáp thu maïnh taïi böôùc soùng naøy neân phaûn aùnh ñöôïc söï oxi hoùa. Maëc duø phöông phaùp naøy khoâng phaân bieät caùc saûn phaåm bay hôi hay khoâng bay hôi nhöng phaûn öùng giöõa aldehyde bay hôi khoâng baõo hoøa xaûy ra nhieàu hôn so vôùi aldehyde bay hôi baõo hoøa. Vì vaäy, chæ soá p-anisidine ñöôïc duøng ñeå ñaùnh giaù söï hình thaønh caùc saûn phaåm baäc 2. Chæ soá acid thiobarbituric(TBA) Malonaldehyde coù theå hình thaønh töø caùc acid beùo töï do coù ít nhaát 3 lieân keát ñoâi. Noàng ñoä cuûa malonaldehyde coù theå ñöôïc tính toaùn thoâng qua phaûn öùng cuûa noù vôùi acid thiobarbituric. Phaûn öùng giöõa hai chaát naøy cho ra moät saûn phaåm maøu ñoû, coù cöïc ñaïi haáp thu ôû böôùc soùng 532-535nm. Tuy nhieân, phaûn öùng naøy khoâng ñaëc hieäu. Thiobarbituric coù theå phaûn öùng vôùi caùc thaønh phaàn khaùc nhö 2,4-Alkadienal (2,4-decadienal), protein, saûn phaåm Maillard. PHAÀN III: NỘI DUNG VÀ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU NOÄI DUNG NGHIEÂN CÖÙU Khaûo saùt hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc loaøi thöïc vaät. Muïc tieâu trong phaàn nghieân cöùu laø laø tìm phöông phaùp trích ly thích hôïp ñeå thu ñöôïc dòch trích coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao. Sau ñoù, tieán haønh khaûo saùt caùc loaïi thöïc vaät coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao baèng phöông phaùp FRAP. Ñoàng thôøi cuõng xaùc ñònh haøm löôïng polyphenol trong dòch trích baèng phöông phaùp Folin-Ciocalteau nhaèm tìm hieåu moái töông quan giöõa hoaït tính choáng oxi hoùa vaø haøm löôïng polyphenol trong caùc dòch trích. Toái öu quaù trình trích ly loaøi thöïc vaät coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao nhaát. Sau khi tìm ra nguyeân lieäu coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao nhaát, tieán haønh thí nghieäm ñeå tìm ñieàu kieän trích ly toái öu cho nguyeân lieäu naøy. Khaûo saùt khaû naêng baûo quaûn daàu cuûa loaïi thöïc vaät coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao treân. Sau khi ñaõ tìm ñieàu kieäân trích ly toái öu. Tieán haønh trích ly theo ñieàu kieän toái öu naøy. Kieåm tra laïi hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa dòch trích trong ñieàu kieän naøy. Tieán haønh coâ quay dòch trích vaø cho vaøo daàu vôùi haøm löôïng thích hôïp. Tieán haønh khaûo saùt ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu ôû nhieät ñoä 55oC. Ñaây laø ñieàu kieän thí nghieäm gia toác cho daàu nhaèm ruùt ngaén thôøi gian thí nghieäm. ÔÛ ñieàu kieän naøy, caùc saûn phaåm oxi hoùa baäc 1 hình thaønh laø chuû yeáu neân duøng chæ soá peroxide ñeå xaùc ñònh ñoä beàn oxi hoùa cuûa daàu. Muïc ñích cuûa nghieân cöùu naøy laø ñaùnh giaù ñoä beàn oxi hoùa daàu khi coù chaát choáng oxi hoùa töï nhieân ôû nhieät ñoä thöôøng, töùc ôû ñieàu kieän baûo quaûn daàu. PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Nguyeân lieäu Nguyeân lieäu söû duïng ñeå phaân tích hoaït tính chaát choáng oxi hoùa bao goàm caû nguyeân lieäu töôi vaø nguyeân lieäu khoâ. Caùc nguyeân lieäu töôi bao goàm cau, caàn taây, caàn taøu, caàn ñöôùc, kinh giôùi, huùng, göøng, ngheä, rieàng, rau ngoã, tía toâ, traàu khoâng, thì laø, ngoø gai, ngoø rí ñöôïc mua ôû chôï taïi Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Traø töôi laø loaïi laù traø giaø, ñöôïc mua töø sieâu thò. Ñaây laø loaïi laù traø giaø maø ngöôøi daân thöôøng mua veà ñeå naáu laáy nöôùc uoáng. Laù oåi vaø maéc côõ ñöôïc thu haùi ngoaøi töï nhieân. Caùc nguyeân lieäu khoâ duøng phaân tích cuõng ñöôïc thu töø nhieàu nguoàn khaùc nhau. Laù traø, laù oåi, maéc côõ, göøng, töø daïng töôi treân ñöôïc saáy ôû 500C ñeán ñoä aåm khoâng ñoåi baèng thieát bò saáy ñoái löu. Caùc nguyeân lieäu khoâng coù saün ôû daïng töôi nhö daønh daønh, thaïch hoïc, hoaøng ñaèng, hoaøng lieân, kinh giôùi, cam thaûo, cau ñeàu ñöôïc mua ôû tieäm thuoác baéc. Phöông phaùp xaùc ñònh ñoä aåm trong nguyeân lieäu (%W) Muïc ñích cuûa phöông phaùp Ño ñoä aåm trong taát caû caùc nguyeân lieäu thí nghieäm nhaèm xaùc ñònh hoaït tính choáng oxi hoùa vaø haøm löôïng polyphenol toång trong caùc maãu khoâ(khoâ tuyeät ñoái) töø caùc maãu thoâ ban ñaàu. Khi ñoù, vieäc so saùnh keát quaû giöõa caùc maãu coù yù nghóa hôn. Nguyeân taéc Döôùi taùc duïng cuûa nhieät ñoä, nöôùc trong nguyeân lieäu bay hôi daàn cho ñeán khi ñaït ñoä aåm khoâng ñoåi. Döïa vaøo söï cheânh leäch khoái löôïng cuûa nguyeân lieäu tröôùc vaø sau khi taùch aåm ñeå xaùc ñònh haøm löôïng aåm trong nguyeân lieäu. Caùch ño aåm Duøng thieát bò saáy hoàng ngoaïi töï ñoäng. Saáy ñóa caân ñeán ñoä aåm khoâng ñoåi roài cho khoaûng 1,5 g maãu vaøo ñóa saáy. Khôûi ñoäng cheá ñoä saáy, quaù trình ño aåm baét ñaàu cho ñeán khi giaù trò aåm hieån thò khoâng thay ñoåi nöõa laø quaù trình ño aåm keát thuùc. Giaù trò hieån thò cuoái cuøng treân maùy laø ñoä aåm trong nguyeân lieäu. Ñôn vò aåm % (KL aåm/ KL maãu ño) Tieán haønh ño aåm maãu laëp laïi 3 laàn, keát quaû cuoái cuøng laø giaù trò trung bình cuûa 3 laàn ño aåm. Phöông phaùp trích ly caùc chaát choáng oxi hoùa töø thöïc vaät Ñoái vôùi nguyeân lieäu töôi Caân chính xaùc 0,5g nguyeân lieäu töôi nhö göøng, haønh, traø, rau kinh giôùi … cho vaøo coái söù nghieàn naùt, roài theâm vaøo ñoù 10ml ethanol. Hoøa tan ñeàu roài nhanh choùng cho vaøo erlen 50ml. Tieán haønh thí nghieäm baèng 2 phöông phaùp khaùc nhau: trích noùng trong beå ñieàu nhieät ôû 40oC, trích ly baèng phöông phaùp uû nhieät ñoä thöôøng trong 3 ngaøy. Sau thôøi gian treân, ño hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc dòch trích vaø haøm löôïng polyphenol toång ñeå tìm ra phöông phaùp trích ly thích hôïp. Tieán haønh trích ly taát caû caùc maãu thöïc vaät töôi theo phöông phaùp naøy. Ñoái vôùi nguyeân lieäu khoâ Caùc loaïi thaûo döôïc nhö daønh daønh, thaïch hoïc, hoaèng ñaèng….ñöôïc ñem ñi nghieàn baèng maùy xay tieâu ñeán ñoä mòn cao nhaát coù theå ñaït ñöôïc. Sau ñoù, caân chính xaùc 0,5g caùc nguyeân lieäu khoâ nhö daønh daønh, cau, hoaøng ñaèng… cho vaøo erlen 50 roài duøng pipette huùt 20 ml ethanol cho vaøo ñoù. Duøng maøng plastic boïc kín mieäng erlen roài ñem trích ly theo hai phöông phaùp nhö treân. Sau thôøi gian treân, ño hoaït tính chaát choáng oxi hoùa vaø haøm löôïng polyphenol toång trong dòch trích. Ñoái vôùi caùc maãu töôi, sau khi xaùc ñònh hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa chuùng, choïn ra caùc nguyeân lieäu coù hoaït tính cao, tieán haønh saáy chuùng ôû 50oC baèng thieát bò saáy ñoái löu ñeán ñoä aåm khoâng ñoåi roài ñem ñi nghieàn thaønh boät mòn. Laáy boät nghieàn naøy ñem trích ly nhö caùc maãu khoâ khaùc. Phöông phaùp xaùc ñònh hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc dòch trích töø thöïc vaät Pha cheá hoùa chaát Chuaån bò hoùa chaát 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) FeSO4.7H2O FeCl3.6H2O CH3COONa, CH3COOH Pha cheá hoùa chaát Dung dòch ñeäm acetate: 300 mM, pH=3,6 1,886 g CH3COONa 16 ml dung dòch acid acetic 99,5% Ñònh möùc ñeán 1 lít baèng nöôùc caát Kieåm tra pH, baûo quaûn laïnh Dung dòch HCl loaõng: 40 mM 3,38 ml dung dòch HCl ñaäm ñaëc 37% (11,8 N) Ñònh möùc ñeán 1 lít baèng nöôùc caát Baûo quaûn ôû nhieät ñoä phoøng TPTZ(2,4,6-tri[2-pyridyl]-s-triazine): 10 mM 0,031 g TPTZ trong 10 ml dung dòch HCl 40mM Dung dòch naøy ñöôïc chuaån bò haøng ngaøy. FeCl3: 20mM 0,0415 g FeCl3.6H2O Hoøa tan trong 10 ml nöôùc caát Dung dòch chuaån Chuaån bò dung dòch 1 mM 0,278 g FeSO4.7H2O trong 1 lít nöôùc caát Töø dung dòch chuaån 1mM naøy, pha loaõng 5 laàn duøng ñeå xaây döïng ñöôøng chuaån Chuaån bò taùc nhaân FRAP 200 ml ñeäm acetate 20 ml TPTZ 20 ml FeCl3 ml nöôùc caát Chuaån bò haøng ngaøy, baûo quaûn laïnh khi chöa söû duïng. Caùch thöùc tieán haønh Sau thôøi gian trích ly, ñem caùc dòch trích ñi ly taâm laïnh ôû 4000 voøng trong thôøi gian 15 phuùt. Muïc ñích cuûa ly taâm laïnh laø taêng cöôøng khaû naêng keát laéng cuûa caùc taïp chaát vaø giaûm ñoä bay hôi cho dung moâi ñeå keát quaû ño ñaït ñöôïc chính xaùc. Sau khi ly taâm, duøng micripipette huùt 1ml dòch trích cho vaøo oáng nghieäm, tieán haønh pha loaõng dòch trích trong nöôùc ñeán noàng ñoä thích hôïp. Sau khi pha loaõng, duøng micropipette huùt 1ml dòch trích cho vaøo oáng nghieäm, theâm vaøo ñoù 2 ml taùc nhaân FRAP + 2ml nöôùc caát. Ñeå hoãn hôïp phaûn öùng trong 1h roài ñem ñi ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 593nm. Chuaån bò maãu traéng: maãu traéng chæ chöùa 2ml taùc nhaân FRAP + 3ml nöôùc caát. Chuaån bò maãu ñoái chöùng(control): maãu ñoái chöùng ñöôïc chuaån bò nhö maãu thí nghieäm nhöng thay 1ml maãu thí nghieäm baèng 1ml dung moâi. Chuù yù raèng, neáu dòch trích pha loaõng trong nöôùc bao nhieâu laàn thì dung moâi cuõng phaûi pha loaõng trong nöôùc baáy nhieâu laàn, nghóa laø heä soá pha loaõng cuûa dung moâi phaûi baèng heä soá pha loaõng cuûa dòch trích. Ñoái vôùi caùc dòch trích trong dung moâi diethyl ether laø quaù trình chuaån bò khaùc ñi moät ít. Dòch trích naøy ñöôïc pha loaõng trong diethyl ether ñeán noàng ñoä thích hôïp roài huùt 1ml dòch trích naøy cho vaøo oáng nghieäm, theâm vaøo 2ml taùc nhaân FRAP, laéc maïnh, roài theâm vaøo 2ml dung moâi diethyl ether. Ñeå hoãn hôïp phaûn öùng trong 1h roài ñem ñi ño quang phoå. Maãu ñoái chöùng goàm 1ml diethyl ether + 2ml taùc nhaân FRAP + 2ml nöôùc caát. Baûng 3: Phöông phaùp laáy maãu ño quang phoå ôû böôùc soùng l = 593nm. STT Maãu traéng 1 2 3 4 5 6 Maãu 1 Maãu 2 Maãu ñoái chöùng Vchuaån(ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Vmaãu(ml) 1 1 Vdung moâi(ml) 1 VH2O(ml) 3 2,9 2,8 2,6 2,4 2,2 2 2 2 2 VFRAP(ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 OD (593 nm) Coâng thöùc tính Töø keát quaû ño dung dòch chuaån, döïng ñöôøng chuaån Fe2+ y= f(x) vôùi y laø maät ñoä quang, x laø noàng ñoä Fe2+ (mmol Fe2+/L). Tính ñoä leäch chuaån R2 cuûa ñöôøng chuaån. Döïa vaøo ñöôøng chuaån, tính noàng ñoä Fe2+ trong maãu ño quang hoïc M (mmol Fe2+/L). Hoaït tính choáng oxi hoùa trong nguyeân lieäu ñöôïc tính nhö sau: AA: hoaït tính choáng oxi hoùa trong nguyeân lieäu (mmol Fe2+/g chaát khoâ) M: noàng ñoä Fe2+ trong maãu ño quang hoïc = hoaït tính choáng oxi hoùa trong maãu ño quang hoïc (mmol Fe2+/L) f: heä soá pha loaõng V: theå tích dung moâi duøng trích ly chaát choáng oxi hoùa (ml) m: khoái löôïng maãu ñem trích ly (g) W: ñoä aåm maãu (%). Chuù yù: Khi trích ly, khoâng theå naøo toaøn boä caùc chaát choáng oxi ñeàu ñi vaøo dung moâi. Vì theá, coâng thöùc treân khoâng xaùc ñònh giaù trò thöïc söï hoaït tính choáng oxi hoùa trong nguyeân lieäu maø chæ laø gaàn ñuùng. Phöông phaùp xaùc ñònh haøm löôïng polyphenol toång trong caùc dòch trích töø thöïc vaät Hoùa chaát Thuoác thöû Folin-Ciocalteau (pha loaõng 10 laàn) Natri carbonate(Na2CO3) 7,5% Chaát chuaån: gallic acid noàng ñoä 35 µg/L. Caùch tieán haønh Laáy 1 mL dòch trích sau ly taâm cho vaøo oáng nghieäm, theâm vaøo 2,5ml taùc nhaân Folin-Ciocalteau. Sau 4 phuùt, theâm vaøo 2ml dung dòch Natri Carbonate 7,5%. Laéc ñeàu roài ñeå yeân cho hoãn hôïp phaûn öùng trong 60 phuùt. Sau thôøi gian naøy, laáy maãu ño quang phoå ôû böôùc soùng 760nm. Neáu keát quaû vöôït chuaån thì pha loaõng maãu trong nöôùc ñeán noàng ñoä thích hôïp. Chuaån bò dung dòch chuaån: dung dòch chuaån laø acid gallic coù caùc noàng ñoä trong daõy töø 0-35 µg/L. Chuaån bò maãu traéng: maãu traéng chöùa 1 ml nöôùc caát + 2,5ml thuoác thöû Foiln + 2ml Na2CO3 7,5%. Chuaån bò maãu ñoái chöùng(control): maãu ñoái chöùng ñöôïc chuaån bò töông töï nhö maãu thí nghieäm nhöng thay 1ml dòch trích baèng 1ml dung moâi. Chuù yù raèng, neáu dòch trích pha loaõng trong nöôùc bao nhieâu laàn thì dung moâi cuõng phaûi pha loaõng trong nöôùc baáy nhieâu laàn, nghóa laø heä soá pha loaõng cuûa dung moâi phaûi baèng heä soá pha loaõng cuûa dòch trích. Taát caû caùc maãu ñeàu ñöôïc ño ôû böôùc soùng 760nm. Baûng 4: Phöông phaùp laáy maãu ño quang phoå ôû böôùc soùng l =760 nm STT Maãu traéng 1 2 3 4 5 6 Maãu 1 Maãu 2 Maãu ñoái chöùng Acid gallic(ml) 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Vmaãu(ml) 1 1 Vdung moâi(ml) 1 VH2O(ml) 1 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 Folin(ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Na2CO3(ml) 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 OD(760 nm) Coâng thöùc tính Töø keát quaû ño dung dòch chuaån, döïng ñöôøng chuaån acid gallic y= f(x) vôùi y laø maät ñoä quang, x laø noàng ñoä chaát chuaån (µg acid gallic /L). Tính ñoä leäch chuaån R2 cuûa ñöôøng chuaån. Döïa vaøo ñöôøng chuaån, tính noàng ñoä acid gallic trong maãu ño quang hoïc M (µg acid gallic /L). Haøm löôïng polyphenol trong nguyeân lieäu ñöôïc tính nhö sau: PP: haøm löôïng polyphenol toång trong nguyeân lieäu (µg acid gallic/g chaát khoâ) M: haøm löôïng polyphenol trong maãu ño quang hoïc (µg acid gallic /L) f: heä soá pha loaõng V: theå tích dung moâi duøng trích ly polyphenol (ml) m: khoái löôïng maãu ñem trích ly (g) W: ñoä aåm maãu (%). Phöông phaùp khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình trích ly cuûa dòch trích coù hoaït tính choáng oxi hoùa cao nhaát Coáđñònh taát caû caùc yeáu toá, ngoaïi tröø yeáu toá muoán khaû saùt vaø tieán haønh khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa yeáu toá naøy ñeán hoaït tính choáng oxi hoùa trong dòch trích. Töø keát quaû thu ñöôïc, tieán haønh phaân tích phöông sai(ANOVA) ñeå ñaùnh giaù söï khaùc bieät giöõa caùc giaù trò thu ñöôïc. Sau ñoù, tieán haønh khaûo saùt caùc yeáu toá coøn laïi nhö treân. Duøng phaàn meàm Excel ñeå tieán haønh toái öu hoùa quaù trình trích ly chaát choáng oxi hoùa theo phöông phaùp ñöôøng doác nhaát. Phöông phaùp thu nhaän môõ caù basa Nguyeân lieäu ñeå thu môõ caù basa laø töø öùc caù. Caù töôi ñöôïc chaët nhoû roài xay nhuyeãn. Laáy phaàn xay nhuyeãn naøy cho vaøo loø vi soùng ôû 95oC trong 7 phuùt. Cho thòt caù naøy vaøo oáng ly taâm roài ñem ly taâm ôû 3500 voøng trong 15 phuùt, thu laáy phaàn môõ caù phía treân. Phaàn môõ caù thu ñöôïc naøy chính laø nguyeân lieäu ñeå thöïc hieän quaù trình nghieân cöùu tieáp theo. Phöông phaùp boå sung chaát choáng oxi hoùa vaøo dòch trích Caân chính xaùc 5g boät traø, cho vaøo erlen 250, theâm vaøo 100 ml methanol. Tieán haønh trích ly theo ñieàu kieän toái öu thu ñöôïc. Tieán haønh ly taâm hoãn hôïp naøy ñeå thu ñöôïc phaàn dòch trích phía treân. Tieán haønh phaân tích haøm löôïng chaát choáng oxi hoùa vaø polyphenol toång cuûa dòch trích naøy. Ñem toaøn boä phaàn dòch trích cho vaøo bình coâ quay roài ñem coâ quay ñeán gaàn caïn hoaøn toaøn. Laáy maãu ñeå xaùc ñònh haøm löôïng chaát choáng xi hoùa, polyphenol toång ñeå tính toaùn tìm ra löôïng thích hôïp cho vaøo daàu. Cho vaøo moãi becher (loaïi 100ml) 50 ml môõ caù basa. Duøng micropipette huùt phaàn dòch trích sau khi coâ quay cho vaøo daàu ôû noàng ñoä laàn löôït laø 400; 800;1200; 1600 ppm chaát choáng oxi hoùa. Moãi noàng ñoä seõ coù 2 maãu gioáng nhau. Chuaån bò theâm 2 maãu ñoái chöùng laø môõ caù chöùa BHT noàng ñoä 200 ppm vaø 2 maãu traéng laø môõ caù basa. Cho theâm dung moâi vaøo caùc maãu daàu theo nguyeân taéc theå tích dung moâi cho vaøo caùc maãu daàu ñeàu baèng nhau, keå caû maãu traéng. Sau ñoù, taát caû caùc maãu daàu ñöôïc suïc khí Nitô roài duøng maøng plastic boïc kín mieäng becher laïi. Ñem caùc maãu naøy ñi khuaáy töø ôû khoaûng 55-600C trong thôøi gian 15 phuùt vôùi toác ñoä 300 voøng/phuùt ñeå hoøa tan hoaøn toaøn chaát choáng oxi hoùa cuøng dung moâi vaøo daàu. Sau khi khuaáy töø xong, laáy töøng maãu ñem phaân tích chæ soá acid vaø peroxide ban ñaàu roài ñem taát caû caùc maãu cho vaøo tuû aám ôû 55oC. Thôøi gian uû naøy keùo daøi 8 ngaøy. Moãi ngaøy ñeàu laáy maãu ño chæ soá acid vaø chæ soá peroxide. Caùch xaùc ñònh chæ soá acid vaø peroxide nhö beân döôùi. Phöông phaùp xaùc ñònh ñoä beàn oxi hoùa cuûa môõ caù basa sau khi boå sung chaát choáng oxi hoùa töï nhieân. Phöông phaùp xaùc ñònh chæ soá acid [3] Nguyeân taéc Trung hoøa löôïng acid beùo töï do coù trong chaát beùo baèng dung dòch KOH, phaûn öùng xaûy ra: RCOOH + KOH ® RCOOK + H2O Hoùa chaát Diethyl ether, ethanol 99,5o Dung dòch KOH 0,05N vaø KOH 0,01N trong röôïu. Phenolphtalein 1% trong röôïu Caùc tieán haønh Laáy vaøo erlen khoâ saïch chính xaùc 2g môõ caù basa. Theâm vaøo 20 ml hoãn hôïp diethyl ether-ethanol(1:1) ñeå hoøa tan chaát beùo. Chuaån ñoä hoãn hôïp baèng dung dòch KOH 0,05N vôùi 2-3 gioït phenolphatalein cho ñeán khi dung dòch coù maøu hoàng beàn trong 30 giaây. Coâng thöùc tính V: theå tích dung dòch KOH duøng ñònh phaân, ml T: heä soá hieäu chænh noàng ñoä KOH söû duïng m: khoái löôïng maãu thí nghieäm, g 2,8055: soá mg KOH coù trong 1ml KOH 0,05N Phöông phaùp xaùc ñònh chæ soá peroxide [3] Nguyeân taéc Caùc peroxide hình thaønh trong quaù trình oâi hoùa chaát beùo, trong moâi tröôøng acid coù khaû naêng phaûn öùng vôùi KI giaûi phoùng Iot theo phaûn öùng sau: Ñònh phaân iode taïo thaønh baèng dung dòch Natri thiosulfate 2Na2S2O3 + I2 ® 2NaI + Na2S4O6 Chæ soá peroxide ñöôïc tính baèng soá mili-ñöông löôïng thisulfate keát hôïp vôùi löôïng iode ñöôïc giaûi phoùng. Hoùa chaát Cloroform, acid acetic, dung dòch hoà tinh boät 1% Dung dòch Na2S2O3 0,002N vaø Na2S2O3 0,01N, ñöôïc pha töø oáng chuaån. KI baõo hoøa, ñöôïc chuaån bò môùi haøng ngaøy. Caùch tieán haønh Caân vaøo erlen coù nuùt nhaùm chính xaùc 2 g chaát beùo, them vaøo ñoù 15 ml hoãn hôïp cloroform-acid acetic (1:2). Theâm vaøo 1ml KI baõo hoøa. Ñaäy kín ngay. Laéc maïnh trong 1 phuùt vaø ñeå yeân trong 3 phuùt trong toái. Theâm 25 ml nöôùc caát, laéc maïnh, theâm 5 gioït hoà tinh boät laøm chaát chæ thò. Chuaån ñoä iode taïo thaønh baèng Na2S2O3 0,002N (khi PV12meq/kg), ñeán khi maát maøu tím ñaëc tröng cuûa iode. Tieán haønh ñoàng thôøi thí nghieäm kieåm chöùng, thay chaát beùo baèng 5ml nöôùc caát. Neáu keát quaû thí nghieäm vöôït quaù 0,1ml dung dòch Na2S2O3 0,01N thì ñoåi hoùa chaát do khoâng tinh khieát. Coâng thöùc tính PoV- chæ soá peroxide, meq/kg V1- soá ml Na2S2O3 0,002N duøng ñònh phaân maãu thí nghieäm V2- soá ml Na2S2O3 0,002N duøng ñònh phaân maãu kieåm chöùng T- heä soá hieäu chænh noàng ñoä Na2S2O3, T=1 do pha töø oáng chuaån N-noàng ñoä ñöông löôïng gam Na2S2O3 m-khoái löôïng maãu thí nghieäm, g PHAÀN IV: KEÁT QUAÛ THÍ NGHIEÄM VAØ BAØN LUAÄN KEÁT QUAÛ THÍ NGHIEÄM Keát quaû xaây döïng ñöôøng chuaån Ñöôøng chuaån xaùc ñònh haøm löôïng chaát choáng oxi hoùa Noàng ñoä chaát chuaån(mM) 0,004 0,008 0,016 0,024 0,032 0,04 Ñoä haáp thu 0,071 0,170 0,359 0,529 0,725 0,916 Phöông trình hoài quy y= 22,60x Hình 29: Ñöôøng chuaån FeSO4 Ñöôøng chuaån xaùc ñònh haøm löôïng polyphenol toång Noàng ñoä chaát chuaån(µg/L) 0,933 1,867 2,8 3,733 4,667 Ñoä haáp thu 0,134 0,305 0,5 0,633 0,791 Phöông trình hoài quy y=0,192x Hình 30: Ñöôøøng chuaån acid gallic Nồng độ (µg/L) Khaûo saùt phöông phaùp trích ly vaø hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa moät soá thöïc vaät. Baûng 5: Hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc maãu thöïc vaät töôi thu ñöôïc baèng phöông phaùp trích noùng ôû 40oC, trong 4h. Thöïc vaät Teân khoa hoïc Ñoä aåm maãu (%) Hoaït tính choáng oxi hoùa (mmol Fe2+/g maãu khoâ) Haøm löôïng polyphenol toång (µg acid gallic/g maãu khoâ) Cau tươi Areca catechu L. 82,55 1,136 28,057 Caûi boù xoâi (Spinach) Spinacia oleracea L. 82,31 0,092 5,357 Caàn nöôùc Oepanthe stolonifera DC. 87,83 0,098 5,373 Caàn taøu Apium graveolens L. 88,45 0,073 3,629 Coû möïc Eclipta alba (L.) hassk 89,19 0,191 20,783 Huùng cay Metha arvensis 88 0,042 2,786 Kinh giôùi Elsholtzia ciliata (thunb.) Hyland 87,3 0,0825 4,171 Göøng Zingiber officinale Rosc. 90 0,072 3,610 Laù oåi Psidium guajava L. 86 1,169 20,364 Maéc côõ Mimosa pudica L. 85 0,190 12,734 Ngoø gai Eryngium foetidum 89,1 0,027 2,537 Ngoø rí Coriandrum sativum L. 89,1 0,026 2,323 Ngheä vaøng Curcuma longa L.; Curcuma domestica Val. 97,01 0,034 2,864 Ngheä ñoû Curcuma zedoaria Rosc.; Curcuma aromatica Salisb 85,08 0,031 2,801 Rau om (Rau ngoã) Limnophila aromatica 91,17 0,087 7,524 Rieàng Alpinia offcinarum Hace 86 0,011 6,642 Tía toâ Perilla frutescens L. 89,15 0,027 1,785 Thì laø Anethum graveolens L. 80 0,043 2,429 Traø töôi Camelia sinensis 78,54 1,134 17,278 Traàu khoâng Piper betle L. 77,18 0,126 8,096 Baûng 6: Hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc maãu thöïc vaät töôi thu ñöôïc baèng phöông phaùp uû ôû nhieät ñoä thöôøng, trong 3 ngaøy. Thöïc vaät Teân khoa hoïc Ñoä aåm maãu (%) Hoaït tính choáng oxi hoùa (mmol Fe2+/g maãu khoâ) Haøm löôïng polyphenol toång (µg acid gallic/g maãu khoâ) Cau tươi Areca catechu L. 82,55 1,032 25,429 Caûi boù xoâi (Spinach) Spinacia oleracea L. 82,31 0,0805 5,306 Caàn nöôùc Oepanthe stolonifera DC. 87,83 0,0865 5,339 Caàn taøu Apium graveolens L. 88,45 0,051 2,025 Huùng cay Metha arvensis 88 0,031 2,542 Kinh giôùi Elsholtzia ciliata (thunb.) Hyland 87,3 0,067 4,225 Göøng Zingiber officinale Rosc. 90 0,064 2,875 Laù oåi Psidium guajava L. 86 1,109 20,021 Ngoø gai Eryngium foetidum 89,1 0,0345 2,7835 Ngoø rí Coriandrum sativum L. 89,1 0,0215 2,297 Rau om Limnophila aromatica 91,17 0,08 6,0285 Tía toâ Perilla frutescens L. 89,15 0,038 2,012 Thì laø Anethum graveolens L. 80 0,0365 2,2935 Traø töôi Camelia sinensis 78,54 1,334 19,513 Baûng 7: Hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc maãu thöïc vaät khoâ thu ñöôïc baèng phöông phaùp trích noùng ôû 40oC, trong 4h. Thöïc vaät Teân khoa hoïc Ñoä aåm maãu (%) Hoaït tính choáng oxi hoùa (mmol Fe2+/g maãu khoâ) Haøm löôïng polyphenol toång (µg acid gallic/g maãu khoâ) Cam thaûo baéc Glycyrrhiza uralensis Fisch; Glycyrrhiza inflata Bat 12,86 0,025 2,424 Cau Areca catechu L. 13,76 0,398 18,974 Daønh daønh Semen Gardeniae 10,82 0,023 1,168 Göøng Zingiber officinale Rosc. 15,77 0,057 2,603 Hoaøng ñaèng Radix et caulis fibraurea, Fibraurea tinctoria lour. 12,04 0,017 0,819 Hoaøng lieân Coptis chinensis Franch; Coptis diltoidea C.Y cheng et Hisiao. 7,67 0,009 0,429 Kinh giôùi nuùi Herba seu Flos Schizonepetae 13,42 0,009 0,533 Laù oåi Psidium guajava L. 13,07 0,294 6,17 Maéc côõ Mimosa pudica L. 11,28 0,019 2,224 Thaïch hoäc Dendrobium nobile Lindl; Dendrobium candidum wall 13,53 0,014558 1,407 Traø saáy khoâ Camelia sinensis 7,698 0,302 8,421 Baûng 8: Hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc maãu thöïc vaät khoâ thu ñöôïc baèng phöông phaùp uû ôû nhieät ñoä thöôøng, trong 3 ngaøy. Thöïc vaät Teân khoa hoïc Ñoä aåm maãu (%) Hoaït tính choáng oxi hoùa (mmol Fe2+/g maãu khoâ) Haøm löôïng polyphenol toång (µg acid gallic/g maãu khoâ) Cam thaûo baéc Glycyrrhiza uralensis Fisch; Glycyrrhiza inflata Bat 12,86 0,026 2,725 Cau Areca catechu L. 13,76 0,332 17,0525 Daønh daønh Semen Gardeniae 10,82 0,028 1,2645 Göøng Zingiber officinale Rosc. 15,77 0,0505 2,5195 Hoaøng ñaèng Radix et caulis fibraurea, Fibraurea tinctoria lour. 12,04 0,0155 0,8625 Hoaøng lieân Coptis chinensis Franch; Coptis diltoidea C.Y cheng et Hisiao. 7,67 0,01 0,6365 Kinh giôùi Elsholtzia ciliata (thunb.) Hyland 13,42 0,0045 0,5555 Laù oåi Psidium guajava L. 13,07 0,304 6,17 Maéc côõ Mimosa pudica L. 11,28 0,016 2,473 Thaïch hoäc Dendrobium nobile Lindl; Dendrobium candidum wall 13,53 0,0205 1,1205 Traø saáy khoâ Camelia sinensis 7,698 0,314 10,037 Keát quaû khaûo saùt hoaït tính choáng oxi hoùa vaø polyphenol toång cuûa caùc maãu töôi ñöôïc theå hieän ôû baûng 5 vaø baûng 6. Trong baûng 5, hoaït tính choáng oxi hoùa cao nhaát ôû maãu cau, tieáp theo laø traø, laù oåi, coû möïc, maéc côõ vaø traàu khoâng. Caùc maãu coøn laïi hoaït tính choáng oxi hoùa thaáp hôn. Trong baûng 6, hoaït tính choáng oxi hoùa cao nhaát vaãn laø caùc maãu cau, traø, laù oåi, coû möïc, maéc côõ, traàu khoâng. Caùc maãu coøn laïi hoaït tính choáng oxi hoùa raát thaáp nhö baûng 5. Caùc maãu töôi trích ly noùng ñeàu coù hoaït tính choáng oxi hoùa vaø haøm löôïng polyphenol toång cao hôn so vôùi trích ly baèng phöông phaùp uû nhieät ñoä thöôøng, ngoaïi tröø maãu tía toâ. Tía toâ trích ly noùng hoaït tính thaáp hôn maãu uû, ñieàu naøy coù theå do söï khoâng beàn nhieät cuûa caùc hôïp chaát choáng oxi hoùa trong ñoù. Maëc duø coù söï khaùc bieät giöõa hai phöông phaùp trích ly nhöng söï khaùc bieät naøy khoâng nhieàu laém. Keát quaû khaûo saùt hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa moät vaøi maãu khoâ ñöôïc theå hieän ôû baûng 7 vaø baûng 8. Hoaït tính choáng oxi hoùa vaø haøm löôïng polyphenol toång vaãn cao nhaát laø ôû caùc maãu cau, traø, laù oåi, göøng. Caùc maãu coøn laïi hoaït tính choáng oxi hoùa thaáp hôn nhieàu. Töø keát quaû khaûo saùt phöông phaùp trích ly cho thaáy, trích ly baèng phöông phaùp noùng trong beå ñieàu nhieät trong 4h thì hoaït tính choáng oxi hoùa vaø haøm löôïng polyphenol coù cao hôn so vôùi trích ly baèng phöông phaùp uû trong toái ôû nhieät ñoä thöôøng trong 3 ngaøy. Nhö vaäy, trích ly ôû 40oC trong 4 h, caùc chaát coù hoaït tính choáng oxi hoùa khoâng bò phaù huûy. Ngoaøi ra, ñeå trích ly baèng phöông phaùp uû nhieät ñoä thöôøng coù hieäu quaû thì thôøi gian trích ly coù theå phaûi daøi hôn. Theo caùc taøi lieäu nhö [8], [10] thì thôøi gian uû caàn thieát ñeå quaù trình trích ly ñaït hieäu suaát cao coù theå leân ñeán 7-14 ngaøy. So saùnh keát quaû giöõa baûng 5 vôùi baûng 7 vaø baûng 8, ñoái vôùi caùc maãu thöïc vaät nhö cau, göøng, maéc côõ, traø, sau khi saáy ôû 50oC ñeán ñoä aåm khoâng ñoåi thì hoaït tính choáng oxi hoùa cuûa caùc maãu naøy giaûm ñi so vôùi caùc maãu töôi. Trong ñoù, maãu maéc côõ hoaït tính suy giaûm nhieàu nhaát, khoaûng 10 laàn. Caùc maãu nhö traø, cau, laù oåi giaûm khoaûng 3 laàn. Ñaëc bieät, maãu göøng hoaït tính choáng oxi hoùa giaûm khoâng lôùn laém, ñieàu naøy coù theå do caùc thaønh phaàn choáng oxi hoùa trong göøng coù khaû naêng beàn nhieät ôû 50oC. Nhìn chung, söï suy giaûm hoaït tính choáng oxi hoùa laø do caùc nguyeân lieäu khoâ ñaõ traûi qua quaù trình xöû lyù nhieät nhö phôi naéng hoaëc saáy neân caùc chaát choáng oxi hoùa keùm beàn nhieät seõ