Luận văn Khảo sát một số đặc tính azospirillum sp. và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH NGUYEÃN THANH ÑAØO KHAÛO SAÙT MOÄT SOÁ ÑAËC TÍNH AZOSPIRILLUM SP. VAØ AÛNH HÖÔÛNG CUÛA CHUÙNG TREÂN VAØI DAÏNG CAÂY TROÀNG NGAÉN NGAØY LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC TP. HOÀ CHÍ MINH – 2005 LÔØI CAÛM ÔN Toâi xin baøy toû loøng bieát ôn chaân thaønh vaø saâu saéc ñeán : TS. Trònh Thò Hoàng, ngöôøi ñaõ taän tình höôùng daãn, giuùp ñôõ vaø taïo moïi ñieàu kieän toát nhaát cho toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Quyù thaày coâ Khoa Sinh noùi chung vaø Boä moân Vi sinh noùi rieâng cuûa Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Tp. Hoà Chí Minh ñaõ cung caáp cho toâi nhöõng kieán thöùc quyù baùu trong suoát khoùa hoïc vaø giuùp ñôõ nhieät tình trong suoát quaù trình toâi thöïc hieän luaän vaên. Quyù thaày coâ vaø caùc baïn trong Boä moân Vi sinh, Sinh lyù Thöïc vaät, Sinh hoùa, Sinh hoïc Phaân töû Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân vaø Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp mieàn Nam ñaõ hoã trôï, ñoäng vieân vaø giuùp ñôõ toâi trong suoát quaù trình thöïc nghieäm. Gia ñình oâng Voõ Vaên Giuùp vaø oâng Nguyeãn Ngoïc Yeân ñaõ hoã trôï vaø giuùp ñôõ toâi thöïc hieän caùc thí nghieäm thöïc tieãn. Sôû Giaùo duïc vaø Ñaøo taïo tænh An Giang, Ban Giaùm hieäu Tröôøng Trung hoïc Phoå thoâng Nguyeãn Khuyeán ñaõ taïo moïi ñieàu kieän thuaän lôïi cho toâi trong suoát khoùa hoïc. Vaø thaät haïnh phuùc bieát bao khi trong cuoäc soáng, trong lao ñoäng vaø hoïc taäp luoân coù söï chaêm soùc, ñoäng vieân, giuùp ñôõ cuûa ngöôøi thaân, baïn beø. Toâi luoân bieát ôn vì nhöõng taám chaân tình ñoù vaø göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh ñeán nhöõng ngöôøi thaân yeâu cuûa toâi – gia ñình vaø baïn beø trong suoát thôøi gian qua. Nguyeãn Thanh Ñaøo MUÏC LUÏC Trang Lôøi caûm ôn Muïc luïc Danh muïc caùc kyù hieäu, caùc chöõ vieár taét Danh muïc caùc baûng Danh muïc caùc hình Danh muïc caùc ñoà thò MÔÛ ÑAÀU ....................................................................................................... 1 Chöông 1 – TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU.............................................................. 3 1.1 Vai troø cuûa ñaïm vaø taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ............ 4 1.1.1 Ñaïm trong caây vaø vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng cuûa caây troàng ............................................................................................... 4 1.1.1.1 Tyû leä ñaïm vaø caùc daïng ñaïm trong caây.............................. 4 1.1.1.2 Vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng caây troàng ..................... 4 1.1.2 Taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm .................................. 7 1.1.2.1 Coá ñònh ñaïm hoùa hoïc ......................................................... 7 1.1.2.2 Coá ñònh ñaïm sinh hoïc......................................................... 9 1.2 Vi sinh vaät coá ñònh ñaïm vaø cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc ........................................................................................................... 10 1.2.1 Caùc loaøi vi sinh vaät coá ñònh ñaïm ................................................... 10 1.2.1.1 Vi khuaån coá ñònh nitô soáng töï do....................................... 10 1.2.1.2 Vi khuaån coá ñònh nitô coäng sinh ........................................ 10 1.2.1.3 Vi khuaån coá ñònh nitô soáng treân reã hay trong reã moät soá loaøi coû nhieät ñôùi............................................................ 11 1.2.1.4 Ñaïm do vi sinh vaät coá ñònh ñöôïc ....................................... 11 1.2.2 Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ................................................. 11 1.3 Vi khuaån Azospirillum ............................................................................. 14 1.3.1 Ñaëc tính hình thaùi ........................................................................... 14 1.3.2 Söï phaân boá cuûa Azospirillum trong ñaát.......................................... 17 1.3.3 AÛnh höôûng cuûa Azospirillum ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa thöïc vaät ................................................................................... 18 1.3.3.1 AÛnh höôûng nhieãm khuaån ñeán söï phaùt trieån boä reã ............. 18 1.3.3.2 Söï hình thaønh khuaån laïc Azospirillum ôû reã ....................... 19 1.3.4 Caùc cô cheá hoaït ñoäng cuûa Azospirillum giuùp taêng tröôûng thöïc vaät ................................................................................................... 21 1.3.4.1 Söï coá ñònh nitô khoâng khí cuûa Azospirillum...................... 21 1.3.4.2 AÛnh höôûng cuûa hormon ngoaïi tieát Azospirillum leân sinh tröôûng vaø phaùt trieån ôû thöïc vaät.................................. 22 1.3.4.3 Azospirillum kích thích söï haáp thu caùc chaát dinh döôõng khoaùng cuûa thöïc vaät .......................................................... 23 1.3.4.4 Quan heä giöõa nitratreductase cuûa caây chuû vaø vi khuaån Azospirillum ....................................................................... 24 1.4 Phaân vi sinh vaät ........................................................................................ 24 1.4.1 Ñònh nghóa .................................................................................... 24 1.4.2 Phaân loaïi ...................................................................................... 25 1.4.3 Muïc tieâu cuûa vieäc söû duïng phaân vi sinh vaät ............................... 26 1.4.4 Quy trình chung ñeå saûn xuaát phaân vi sinh vaät töø vi khuaån ........ 26 1.4.5 Phaân vi sinh töø Azospirillum ......................................................... 30 Chöông 2 - VAÄT LIEÄU-NOÄI DUNG-PHÖÔNG PHAÙP ................................. 34 2.1 Vaät lieäu ..................................................................................................... 35 2.1.1 Thieát bò vaø duïng cuï......................................................................... 35 2.1.2 Hoùa chaát vaø moâi tröôøng.................................................................. 35 2.1.3 Vaät lieäu thí nghieäm......................................................................... 39 2.2 Noäi dung vaø phöông phaùp nghieân cöùu ................................................... 40 2.2.1 Phaân laäp .......................................................................................... 40 2.2.2 Tuyeån choïn chuûng Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát .................................................................................... 41 2.2.3 Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng ñöôïc choïn ....................................................................................... 43 2.2.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån .......................... 46 2.2.4.1 Chuaån bò ............................................................................. 46 2.2.4.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån treân caây maï trong oáng nghieäm, caây luùa trong chaäu vaø caây luùa ngoaøi ruoäng.................................................................. 47 2.2.5 Taïo cheá phaåm “phaân vi sinh” ....................................................... 52 2.2.5.1 Chuaån bò ............................................................................. 52 2.2.5.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân caây luùa trong chaäu vaø rau caûi ngaén ngaøy ......................... 54 Chöông 3 – KEÁT QUAÛ-THAÛO LUAÄN ............................................................ 57 3.1 Phaân laäp ................................................................................................... 58 3.2 Tuyeån choïn chuûng Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát ..................................................................................................... 61 3.2.1 Khaû naêng coá ñònh ñaïm cuûa 5 chuûng A1 , A2 , A3 , A4 vaø A5 ......... 61 3.2.2 Khaû naêng sinh IAA cuûa 5 chuûng A1 , A2 , A3 , A4 vaø A5 ............... 62 3.3 Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng A2 vaø A3.............................................................................................................. 65 3.3.1 Ñaëc ñieåm hình thaùi ......................................................................... 65 3.3.2 Ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa............................................................ 66 3.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån..................................... 69 3.4.1 Thôøi gian thích hôïp nhieãm dòch nuoâi caáy vi khuaån ñaït hieäu quaû ................................................................................................. 69 3.4.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån treân caây maï trong oáng nghieäm, caây luùa trong chaäu vaø caây luùa ngoaøi ruoäng.... 71 3.4.2.1. Caây maï trong oáng nghieäm ............................................... 71 3.4.2.2. Caây luùa trong chaäu .......................................................... 76 3.4.2.3. Caây luùa ngoaøi ruoäng ......................................................... 78 3.5 Taïo cheá phaåm “phaân vi sinh”.................................................................. 88 3.5.1 Chuaån bò ........................................................................................ 88 3.5.1.1. Dòch nuoâi caáy vi khuaån .................................................88 3.5.1.2. Cheá phaåm “phaân vi sinh” .................................................. 95 3.5.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân caây luùa trong chaäu vaø rau caûi ngaén ngaøy ............................................. 97 3.5.2.1 Luùa trong chaäu.................................................................... 97 3.5.2.2 Caûi thìa................................................................................ 99 KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ......................................................................... 106 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Trang Baûng 3.1. Ñaëc ñieåm khuaån laïc cuûa 5 chuûng treân moâi tröôøng NFb raén coù boå sung congo ñoû sau 5 ngaøy nuoâi caáy ............................................. 60 Baûng 3.2. Haøm löôïng ñaïm cuûa 5 chuûng trong moâi tröôøng Dobereiner dòch theå 61 Baûng 3.3. Haøm löôïng IAA trong dòch nuoâi caáy (μg/ ml) theo thôøi gian ........... 64 Baûng 3.4. Chieàu cao trung bình caây luùa (mm) sau 7 ngaøy theo thôøi gian ngaâm haït................................................................................................ 70 Baûng 3.5. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây maï sau 7 ngaøy caáy trong oáng nghieäm cuûa chuûng A2 ...................................................................................................73 Baûng 3.6. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây maï sau 7 ngaøy caáy trong oáng nghieäm cuûa chuûng A3 ...................................................................................................74 Baûng 3.7. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây luùa trong chaäu .......................... 77 Baûng 3.8. Chieàu cao trung bình caây luùa ngoaøi ruoäng (cm) cuûa chuûng A2 .......... 80 Baûng 3.9. Chieàu cao trung bình caây luùa ngoaøi ruoäng (cm) cuûa chuûng A3.81 Baûng 3.10. Soá nhaùnh trung bình cuûa caây luùa ngoaøi ruoäng (nhaùnh/caây) vaøo thôøi ñieåm 45 ngaøy cuûa chuûng A2 vaø A3 ...........................................83 Baûng 3.11. AÛnh höôûng A2 treân chæ tieâu caây luùa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ........ 85 Baûng 3.12. AÛnh höôûng A3 treân chæ tieâu caây luùa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ........ 86 Baûng 3.13. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A2 theo thôøi gian ................. 88 Baûng 3.14. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A3 theo thôøi gian ................. 89 Baûng 3.15. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm .............................................................................. 91 Baûng 3.16. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm 93 Baûng 3.17. Maät ñoä teá baøo A2 vaø A3 trong 1 gram cheá phaåm theo thôøi gian vôùi söï thay ñoåi ñoä aåm 95 Baûng 3.18. AÛnh höôûng cuûa NH3 leân söï gia taêng soá löôïng teá baøo ....................... 96 Baûng 3.19. Söï bieán ñoåi maät ñoä teá baøo A2 vaø A3 theo thôøi gian 96 Baûng 3.20. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây luùa trong chaäu .........................98 Baûng 3.21. Soá laù trung bình cuûa caây caûi thìa (laù/caây) ....................................... 100 Baûng 3.22. Chieàu cao trung bình cuûa caây caûi thìa (cm/caây) 102 Baûng 3.23. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây caûi thìa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ................................................................................................104 DANH MUÏC CAÙC HÌNH Trang Hình 3.1. Phaân laäp Azospirillum töø ñaát vuøng reã luùa ........................................... 58 Hình 3.2. Hình daïng khuaån laïc cuûa caùc chuûng sau 5 ngaøy nuoâi caáy treân moâi tröôøng NFb raén coù boå sung congo ñoû ........................................... 59 Hình 3.3. Ñònh tính IAA cuûa caùc chuûng thoâng qua thuoác thöû Salkowski ......... 62 Hình 3.4. Phaûn öùng maøu IAA vôùi thuoác thöû Salkowski cuûa caùc chuûng nuoâi caáy 5 ngaøy ................................................................................... 65 Hình 3.5. Khaû naêng söû duïng nguoàn carbon treân moâi tröôøng dòch theå - NFb cuûa chuûng A2 vaø A3 ...................................................................... 67 Hình 3.6. Khaû naêng söû duïng nguoàn carbon treân moâi tröôøng dòch theå Andrade cuûa chuûng A2 vaø A3 ............................................................... 68 Hình 3.7. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån (caây maï 7 ngaøy tuoåi treân moâi tröôøng MS) ........................................................................................... 72 Hình 3.8. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo chæ thò maøu bromothymol blue ...................................................... 92 Hình 3.9. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo chæ thò maøu bromothymol blue 94 DANH MUÏC CAÙC ÑOÀ THÒ Trang Ñoà thò 3.1. Ñöôøng töông quan tuyeán tính giöõa haøm löôïng IAA chuaån vaø OD530nm ............................................................................................... 63 Ñoà thò 3.2. Haøm löôïng IAA trong dòch nuoâi caáy (μg/ml) theo thôøi gian ........... 64 Ñoà thò 3.3. Hieäu quaû cuûa thôøi gian ngaâm haït maàm thoâng qua chieàu cao caây (mm) sau 7 ngaøy troàng luùa trong oáng nghieäm............................. 71 Ñoà thò 3.4. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån treân chieàu cao caây luùa ngoaøi ruoäng (cm/caây) cuûa chuûng A2 vaø A3..………………………………..79 Ñoà thò 3.5. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån ñeán khaû naêng phaân nhaùnh cuûa caây luùa ngoaøi ruoäng (nhaùnh/caây) vaøo thôøi ñieåm 45 ngaøy cuûa chuûng A2 vaø A3……….. .......................................................................... 82 Ñoà thò 3.6. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A2 theo thôøi gian ................. 89 Ñoà thò 3.7. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A3 theo thôøi gian ................. 90 Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm .............................................................................. 91 Ñoà thò 3.9. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm .. ............ ………………………………………………93 Ñoà thò 3.10. AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” ñeán soá löôïng laù caûi thìa .................................................................................................... 101 Ñoà thò 3.11. AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân chieàu cao caây caûi thìa (cm/caây) ............................................................................... 103 DANH MUÏC CAÙC KYÙ HIEÄU, CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT A2 : Chuûng Azospirillum 2 A3 : Chuûng Azospirillum 3 CFU (colony forming unit) : Maät ñoä teá baøo CP : Cheá phaåm CV% (Coefficient of Variation) : heä soá ño löôøng chính xaùc cuûa thí nghieäm ÑC : Ñoái chöùng IAA : Indole-3-acetic acid LSD (Least significant difference test) traéc nghieäm phaân haïng caùc loâ thí nghieäm MT1 : Moâi tröôøng voâ ñaïm NFb MT2 : Moâi tröôøng voâ ñaïm NFb raén coù boå sung congo ñoû MT3 : Moâi tröôøng Dobereiner vaø coäng söï MT4 : Moâi tröôøng Andrade MT5 : Moâi tröôøng nuoâi caáy thöû khaû naêng khöû nitrate MT6 : Moâi tröôøng MS MS : Murashige & Skoog N : Ñaïm NFb : nitrogen-fixing broth OD (Optical Density) : Maät ñoä quang PL : Phaân loaïi a, b, c, … trong xöû lyù thoáng keâ TN : Thí nghieäm 1 MÔÛ ÑAÀU Ñoàng Baèng Soâng Cöûu Long laø nôi cung caáp gaïo lôùn nhaát nöôùc, goùp phaàn xuaát khaåu gaïo ra theá giôùi. Theá nhöng haøng naêm luõ luït keùo veà ñaõ gaây thieät haïi veà ngöôøi cuõng nhö muøa maøng. Nhaèm chaêm lo ñôøi soáng cho ngöôøi daân vuøng luõ ñoàng thôøi vaãn ñaùp öùng ñuû gaïo cho nhu caàu tieâu duøng vaø xuaát khaåu, chính quyeàn khu vöïc chæ ñaïo bao ñeâ moät soá vuøng ngaäp luõ. An Giang cuõng khoâng thuoäc ngoaïi leä. Töø ñoù, ñaát khoâng coøn ñoä maøu môõ do phuø sa mang laïi. Chính vì vaäy, ñeå ñaùp öùng nhu caàu dinh döôõng cho caây troàng, ñaát phaûi thöôøng xuyeân ñöôïc boùn phaân. Vieäc söû duïng phaân boùn hoùa hoïc lieân tuïc laøm cho ñaát bò baïc maøu vaø chua, vai troø cuûa vi sinh vaät ñaát giaûm, chaát löôïng noâng saûn keùm thaäm chí gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Trong khi ñoù, phaân vi sinh vaät laø loaïi saûn phaåm chöùa moät hoaëc nhieàu chuûng vi sinh vaät soáng, coù ích ñaõ ñöôïc tuyeån choïn maø hoaït ñoäng cuûa chuùng taïo neân trong ñaát troàng caùc chaát dinh döôõng hay caùc chaát coù hoaït tính kích thích sinh tröôûng, taïo ñieàu kieän naâng cao naêng suaát hoaëc chaát löôïng noâng saûn, taêng ñoä maøu môõ cho ñaát. Caùc chuûng vi sinh vaät naøy khoâng aûnh höôûng xaáu ñeán ngöôøi, vaät nuoâi, moâi tröôøng sinh thaùi vaø chaát löôïng noâng saûn. Hieän nay ngöôøi ta ñaõ nghieân cöùu saûn xuaát phaân vi sinh vaät bao goàm phaân boùn vi sinh vaät coá ñònh ñaïm, phaân boùn vi sinh phaân giaûi caùc hôïp chaát phospho khoù tan, phaân boùn vi sinh vaät phaân giaûi cellulose, phaân boùn vi sinh vaät quang hôïp. Caùc loaïi phaân ñaïm vi sinh hieän nay ñeàu ñöôïc saûn xuaát töø caùc loaïi vi khuaån coá ñònh ñaïm nhö Azotobacter vaø Azospirillum. Caùc vi khuaån naøy phaân boá nhieàu trong ñaát vaø quanh vuøng reã. Ngoaøi khaû naêng coá ñònh ñaïm chuùng coù theå tieát ra moät soá hoaït chaát coù taùc duïng kích thích sinh tröôûng ôû thöïc vaät ñöa vaøo moâi tröôøng ñaát. Ñaùng chuù yù laø khaû naêng coá ñònh ñaïm cuûa Azospirillum ñöôïc Beijerinck phaùt hieän 2 töø naêm 1922, nhöng vai troø cuûa noù trong hoaït ñoäng coá ñònh ñaïm vuøng reã caây hoøa thaûo chæ ñöôïc bieát ñeán vaøo nhöõng naêm ñaàu cuûa thaäp nieân 70 nhôø vieäc tìm ra nôi cö truù cuûa chuùng. Khi ñaùnh giaù nhöõng döõ lieäu thu thaäp khaép theá giôùi hôn 30 naêm qua ôû ñoàng ruoäng thöû nghieäm nhieãm Azospirillum treân caùc ñoái töôïng caây troàng khaùc nhau, ngöôøi ta keát luaän raèng caùc vi khuaån naøy coù khaû naêng laøm taêng naêng suaát treân nhöõng loaïi ñaát troàng khaùc nhau vaø ôû nhöõng vuøng khí haäu khaùc nhau. ÔÛ Vieät Nam, trong thôøi gian qua, ngöôøi ta ñaõ ñeà caäp tôùi söï toàn taïi, phaân laäp, xaùc ñònh ñaëc ñieåm cuûa Azospirillum trong ñaát vaø reã luùa khu vöïc ngoaïi thaønh Haø Noäi vaø nghieân cöùu khaû naêng coá ñònh nitô cuûa moät soá chuûng Azospirillum sp. trong ñieàu kieän hoäi sinh vôùi maàm luùa [8]. Ñöôïc söï ñoäng vieân vaø giuùp ñôõ nhieät tình cuûa TS. Trònh Thò Hoàng, toâi ñaõ coù cô hoäi thöïc hieän ñeà taøi naøy vôùi loøng mong moûi ñoùng goùp phaàn naøo cho coâng cuoäc xaây döïng queâ höông An Giang giaøu ñeïp. Noäi dung cuûa ñeà taøi bao goàm : - Phaân laäp vaø tuyeån choïn Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát. - Tìm hieåu moät soá ñaëc tính sinh lyù, sinh hoùa. - Böôùc ñaàu taïo cheá phaåm “phaân vi sinh” baèng caùch coá ñònh treân chaát mang laø than buøn. - Sô boä öùng duïng cheá phaåâm “phaân vi sinh” treân caây troàng ngaén ngaøy (luùa nöôùc vaø caûi thìa) trong phoøng thí nghieäm vaø ngoaøi thöïc tieãn vôùi quy moâ nhoû. 3 CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 4 1.1. Vai troø cuûa ñaïm vaø taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm 1.1.1. Ñaïm trong caây vaø vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng cuûa caây troàng 1.1.1.1. Tyû leä ñaïm vaø caùc daïng ñaïm trong caây Tyû leä ñaïm trong caây bieåu hieän töø 1 - 6% troïng löôïng chaát khoâ. Tyû leä ñaïm trong boä phaän non cao hôn boä phaän giaø. Trong thôøi kyø hình thaønh quaû, ñaïm taäp trung chuû yeáu ôû caùc cô quan sinh saûn. Trong caây, ñaïm chuû yeáu coù trong thaønh phaàn protein vaø chieám 15 - 17%. Trong ñieàu kieän bình thöôøng, ngöôøi ta tính ñöôïc haøm löôïng protein thoâ trong caây thoâng qua ñònh löôïng nitô toång soá. Ñaïm trong caây coøn toàn taïi döôùi daïng hôïp chaát ñaïm höõu cô hoøa tan (caùc amin vaø amid). Moät löôïng raát nhoû ñaïm vaø trong ñieàu kieän dinh döôõng ñaïm khoâng bình thöôøng, ñaïm toàn taïi trong caây döôùi daïng NH4+ vaø NO3-. Tyû leä giöõa ñaïm höõu cô hoøa tan vaø ñaïm voâ cô theå hieän tình traïng toång hôïp höõu cô trong caây. Thöôøng khi thieáu glucid hoaëc thieáu caùc ñieàu kieän caàn thieát cho vieäc khöû nitrate, cho quaù trình amin hoùa thì tyû leä treân giaûm xuoáng. Ñaïm voâ cô trong caây toàn taïi chuû yeáu döôùi daïng NO3- vì söï tích tröõ löôïng NH4+ nhieàu laøm cho caây deã bò ngoä ñoäc. 1.1.1.2. Vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng caây troàng Ñaïm laø yeáu toá quan troïng haøng ñaàu ñoái vôùi cô theå soáng vì noù laø thaønh phaàn cô baûn cuûa protein - chaát cô baûn bieåu hieän söï soáng. Ñaïm naèm trong nhieàu hôïp chaát cô baûn caàn thieát cho söï phaùt trieån cuûa caây nhö dieäp luïc vaø caùc enzyme, caùc base A,T,G,X - thaønh phaàn cô baûn cuûa caùc nucleic acid, trong caùc DNA vaø RNA cuûa teá baøo - nôi cö truù cuûa caùc thoâng tin di truyeàn, ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc toång hôïp protein. Do vaäy ñaïm laø yeáu toá cô baûn cuûa quaù trình ñoàng hoùa carbon, kích thích söï phaùt trieån cuûa boä reã vaø kích thích vieäc huùt caùc yeáu toá dinh döôõng khaùc. 5 Caây troàng ñöôïc boùn ñuû ñaïm bieåu hieän ôû laù coù maøu xanh thaãm, sinh tröôûng khoûe maïnh, choài buùp phaùt trieån nhanh, naêng suaát cao. Boùn thöøa ñaïm, laù coù maøu xanh toái, thaân meàm, tyû leä nöôùc cao neân deã bò saâu beänh. Tình hình loáp ñoå cuûa caùc gioáng luùa thaân daøi cuõng laø haäu quaû cuûa vieäc boùn thöøa ñaïm. Ngoaøi ra, boùn thöøa ñaïm sinh tröôûng cuûa caây bò keùo daøi, chín muoän, chaát löôïng noâng saûn keùm, nitrate bò keùo xuoáng laøm oâ nhieãm maïch nöôùc ngaàm. Caây thieáu ñaïm, laù coù maøu vaøng, sinh tröôûng vaø phaùt trieån keùm, coøi coïc coù khi bò thui choät thaäm chí ruùt ngaén chu kyø soáng, naêng suaát thaáp. y Taùc duïng cuûa ñaïm ñoái vôùi caây luùa [10] Ñaïm laø yeáu toá dinh döôõng chuû yeáu, noù coù aûnh höôûng nhieàu ñeán thu hoaïch vì chæ khi ñuû ñaïm caùc chaát khaùc môùi phaùt huy taùc duïng. Ñaïm keát hôïp vôùi caùc chaát ñöôøng, boät ôû laù taïo ra amino acid roài töø ñoù hình thaønh neân caùc loaïi protein caàn thieát cho ñôøi soáng caây luùa. Ñaïm laø moät thaønh phaàn caáu taïo cuûa chaát dieäp luïc thuùc ñaåy quaù trình quang hôïp. Neáu thieáu ñaïm, trong caây seõ coù nhieàu ñaïm töï do, caây luùa seõ coù söùc soáng yeáu deã bò saâu beänh phaù haïi. Caây luùa huùt ñaïm ôû hai daïng : amoân (NH4+) vaø nitrate (NO3-). Trong ruoäng ngaäp nöôùc luùa huùt amoân nhieàu hôn, coøn trong ruoäng caïn nöôùc luùa huùt nitrate nhieàu hôn. Ñaïm amoân huùt vaøo reã coù theå keát hôïp ngay vôùi caùc loaïi acid höõu cô ôû ñoù taïo thaønh caùc daïng amino acid vaø seõ ñöôïc chuyeån leân laù ñeå toång hôïp protein. Caùc gioáng luùa Indica thaân cao huùt ñaïm ít hôn so vôùi gioáng luùa Japonica thaân thaáp. Yeâu caàu veà ñaïm cuûa caây luùa thay ñoåi trong quaù trình sinh tröôûng cuûa noù. Luùa caàn ñaïm nhieàu trong thôøi kyø ñeû nhaùnh, nhaát laø khi ñeû roä vaø giaûm daàn khi luùa ñöùng caùi thoâi ñeû nhaùnh. Luùa cuõng caàn nhieàu ñaïm trong thôøi kyø phaân hoùa ñoøng vaø phaùt trieån ñoøng thaønh boâng, thôøi kyø hình thaønh caùc boä phaän sinh saûn. Caùc gioáng 6 luùa thaân cao thöôøng coù hai ñænh cao veà nhu caàu ñaïm ñoù laø luùc ñeû nhaùnh vaø luùc saép troå boâng. Coøn caùc gioáng luùa thaân thaáp thì thöôøng coù nhu caàu veà ñaïm taêng ñeàu suoát thôøi kyø ñeû nhaùnh ñeán luùc troå boâng, chæ sau khi troå nhu caàu veà ñaïm môùi giaûm xuoáng. Vì vaäy trong kyõ thuaät boùn phaân caàn cung caáp ñuû ñaïm cho luùa ñeû nhaùnh vaø laøm ñoøng, nhöng neáu thöøa ñaïm cuõng khoâng toát vì luùa thöøa ñaïm deã bò loáp ñoå, giaûm söùc choáng chòu vôùi saâu beänh vaø caùc ñieàu kieän khoâng thuaän lôïi khaùc. Keát hôïp boùn phaân höõu cô vôùi phaân ñaïm seõ deã thoûa maõn caùc yeâu caàu veà ñaïm. Boùn phaân ñaïm vieân moät laàn sau khi caáy cuõng seõ cung caáp, ñieàu hoøa ñaïm cho caây trong suoát thôøi gian sinh tröôûng maø khoâng daãn ñeán hieän töôïng thöøa ñaïm taïm thôøi roài laïi thieáu ñaïm nhö hieän töôïng boùn vaõi nhieàu laàn. y Taùc duïng cuûa ñaïm ñoái vôùi rau [25] Caây troàng haáp thu moät löôïng lôùn ñaïm töø ñaát thoâng qua heä thoáng reã. Ñoái vôùi döôõng chaát NH4+, khi caây troàng haáp thu vöôït troäi NO3-, daãn ñeán söï phoùng thích H+ töø reã vaø seõ taïo acid hoùa moâi tröôøng beân ngoaøi. Ngöôïc laïi, ñoái vôùi döôõng chaát NO3-, khi caây troàng huùt NH4+ troäi hôn seõ laøm cho moâi tröôøng kieàm hôn. Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy caây troàng haáp thu NH4+ nhanh hôn NO3- trong giai ñoaïn sinh tröôûng sinh döôõng, trong khi caây haáp thu NO3- nhieàu hôn NH4+ khi caây ôû giai ñoaïn sinh tröôûng sinh thöïc. Khi NH3 töï do tích luõy trong caây vôùi löôïng lôùn seõ gaây ngoä ñoäc cho caây neân khi ñöôïc huùt vaøo thöôøng bò ñoàng hoùa ngay baèng nhieàu caùch. Tröôùc heát NH3 ñöôïc ñoàng hoùa baèng con ñöôøng amin hoùa tröïc tieáp caùc cetoacid ñeå taïo thaønh caùc amino acid nhö : amin hoùa α-cetoglutaric ñeå taïo thaønh glutamic acid, amin hoùa oxaloacetic acid ñeå taïo thaønh aspatic acid, amoniac cuõng coù theå keát hôïp ngay vôùi pyruvic acid ñeå taïo thaønh alanin … Caùc loaïi amino acid tham gia vaøo caùc quaù trình ñoàng hoùa sô caáp amoniac nhö α-cetoglutaric acid, 7 Mo Cu,Fe,Mn Cu,Fe,Mn Mg,Mn pyruvic acid, fumaric acid … ñeàu laø nhöõng acid ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình chuyeån hoùa glucid. Khaùc vôùi amoân, nitrate khoâng gaây ngoä ñoäc cho caây neân coù theå tích tuï moät löôïng khaù lôùn trong caây, chính söï tích tuï nitrate naøy neân khi söû duïng rau laøm thöùc aên seõ aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán söùc khoûe con ngöôøi. Dinh döôõng nitrate cuõng laøm taêng haøm löôïng protein vaø caùc amid. Vì vaäy ngöôøi ta cho raèng nitrate vaøo trong caây chòu söï chuyeån hoùa raát maïnh. Quaù trình chuyeån hoùa nitrate ôû trong caây tröôùc heát daãn ñeán söï taïo thaønh NH3. Thöïc chaát quaù trình chuyeån hoùa naøy laø moät quaù trình khöû : HNO3 HNO2 (HNO)2 HN2OH NH3 Nitrate coù theå bò khöû hoaøn toaøn ôû reã thaønh daïng amoân, laø daïng ñaïm tham gia tröïc tieáp trong quaù trình taïo amino acid. Neáu boùn nhieàu ñaïm maø thieáu laân hay khoâng boùn laân, kali caân ñoái, ñaëc bieät laø thieáu nguyeân toá vi löôïng Mo thì quaù trình khöû nitrate seõ bò chaäm laïi vaø daãn ñeán tình traïng toàn dö nitrate trong caây. Löôïng nitrate toàn dö trong caây coøn do boùn cho caây caän ngaøy thu hoaïch laøm haøm löôïng nitrate khoâng ñuû thôøi gian ñeå khöû thaønh amoân, taïo thaønh amino acid vaø protid coù ích cho caây. 1.1.2. Taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm 1.1.2.1. Coá ñònh ñaïm hoùa hoïc Trong khoâng khí, phaân töû nitô thöôøng toàn taïi ôû traïng thaùi lieân keát hai nguyeân töû nitô laïi vôùi nhau nhôø noái ba beàn vöõng (N≡N). Naêng löôïng caàn cho söï phaù vôõ lieân keát naøy khoaûng 225kcal neân caây troàng (cuõng nhö caùc loaøi ñoäng vaät) khoâng coù khaû naêng ñoàng hoùa nguoàn nitô naøy. Vì vaäy vieäc nghieân cöùu phaù vôõ caùc lieân keát naøy ñeå taïo ra daïng nitô deã haáp thu ñoái vôùi caây xanh laø heát söùc caàn thieát [3]. 8 Naêm 1905 laàn ñaàu tieân con ngöôøi tìm ñöôïc phöông phaùp phaù vôõ vaø lieân keát vôùi CaC2 ñeå taïo ra moät daïng phaân ñaïm hoùa hoïc ñaàu tieân laø CaCN2. Muoán thöïc hieän phaûn öùng ngöôøi ta duy trì moät nhieät ñoä cao töø 1000 – 1100oC : Ít laâu sau caùc nhaø khoa hoïc Nauy laïi tìm ñöôïc caùch lieân keát N2 vôùi O2 ñeå taïo thaønh moät daïng phaân ñaïm hoùa hoïc khaùc (nitrate) phaûn öùng naøy cuõng ñoøi hoûi nhieät ñoä cao ñeán 4000oC : Naêm 1908 nhaø khoa hoïc Ñöùc Ga-be ñaõ tìm ñöôïc phöông phaùp lieân keát N2 vôùi H2 ñeå taïo thaønh NH3. Phaûn öùng naøy khoâng nhöõng ñoøi hoûi nhieät ñoä cao (600oC), aùp suaát cao (1000atm) maø coøn ñoøi hoûi coù maët moät soá chaát xuùc taùc ñaét tieàn (Os, Ru). Töø ñoù ñeán nay ngaønh coâng nghieäp hoùa hoïc ñaõ coù nhöõng tieán boä raát lôùn. Ngöôøi ta saûn xuaát roäng raõi nhieàu loaïi phaân ñaïm hoùa hoïc khaùc nhau vôùi saûn löôïng ngaøy caøng taêng. Neáu nhö naêm 1913 toaøn theá giôùi saûn xuaát ñöôïc 0,51 trieäu taán phaân ñaïm thì ñeán naêm 1964 con soá naøy ñaõ taêng leân 29 laàn (14,5 trieäu taán) trong khi ñoù phaân kali chæ taêng 8,4 laàn, phaân phospho taêng coù 5,8 laàn [3]. Duø sao thì phaân ñaïm hoùa hoïc treân toaøn theá giôùi cuõng buø ñaép ñöôïc moät phaàn nhoû soá löôïng ñaïm trong ñaát bò laáy ñi haøng naêm. Coù moät thoáng keâ cho bieát haøng naêm caùc saûn phaåm noâng nghieäp treân theá giôùi laáy ñi khoûi ñaát khoaûng 100 - 110 trieäu taán ñaïm, con soá naøy vöôït ñeán baûy laàn so vôùi phaân ñaïm hoùa hoïc saûn xuaát ra ôû caùc nöôùc goäp laïi haøng naêm. Phaân ñaïm coù taùc duïng raát lôùn ñeán muøa maøng, ví duï : boùn 1kg ñaïm thu hoaïch theâm ñöôïc khoaûng 10 -20kg thoùc, 15 - 20kg ngoâ hoaëc 15 - 40kg coû khoâ (G.Colarva P.Greenland, 1963). 1000oC CaC2 + N2 CaCN2 + C H2O N2 + O2 4000oC 2NO O2 NO2 O2 HNO3 9 Khoù khaên chuû yeáu laøm caûn trôû vieäc môû roäng nhanh choùng hôn nöõa vieäc saûn xuaát phaân ñaïm hoùa hoïc laø vì ñieàu kieän ñeå phaù vôõ caùc lieân keát trong phaân töû nitô khoâng phaûi laø ñôn giaûn (caàn nhieät ñoä cao, aùp suaát cao, chaát xuùc taùc ñaét tieàn). 1.1.2.2. Coá ñònh ñaïm sinh hoïc Töông töï nhö quaù trình coá ñònh ñaïm hoùa hoïc, quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc cuõng laø quaù trình phaù vôõ caùc lieân keát trong phaân töû nitô khoâng khí ñeå taïo thaønh caùc daïng nitô deã haáp thu cho caây troàng. Nhöng ôû quaù trình naøy vieäc phaù vôõ caùc lieân keát cuûa phaân töû nitô xaûy ra ôû ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng. Chính vì vaäy maø vai troø cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc coù yù nghóa heát söùc lôùn lao ñoái vôùi noâng nghieäp, nhaát laø ñoái vôùi caùc nöôùc coù neàn coâng nghieäp phaân ñaïm chöa phaùt trieån. Quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc laø moät giai ñoaïn cuûa chu trình tuaàn hoaøn nitô trong töï nhieân, ñöôïc thöïc hieän bôûi caùc nhoùm vi sinh vaät nhö laø: vi khuaån, taûo lam, xaï khuaån. Caùc loaïi vi sinh vaät naøy coù theå soáng ñoäc laäp nhö nhöõng vi sinh vaät soáng töï do hoaëc coù theå quan heä ôû nhöõng möùc ñoä khaùc nhau vôùi vi khuaån, thöïc vaät vaø ñoäng vaät khaùc. Moái quan heä naøy thay ñoåi töø quan heä hoäi sinh keát hôïp ñeán quan heä coäng sinh baét buoäc. Trong ñoù thöïc vaät chuû laø vi sinh vaät quan heä treân möùc ñoä phaân töû vaø chöùc naêng sinh lyù chung. Trung taâm cuûa caû heä thoáng naøy laø vi khuaån Procaryote coá ñònh ñaïm chöùa phöùc hôïp enzyme nitrogenase (ñaûm nhieäm söï chuyeån hoùa N2 thaønh NH3) . Chæ vaøi loaøi Procaryote xaùc ñònh môùi coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. Thöïc vaät (ngoaïi tröø caùc loaïi taûo vaø caùc thöïc vaät coäng sinh) khoâng coù khaû naêng coá ñònh ñaïm maø chæ coù nhöõng loaøi Procaryote soáng chung vôùi thöïc vaät môùi coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. Quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc haøng naêm cung caáp cho ñaát töø 100 - 180 trieäu taán ñaïm vaø ñoùng goùp 65% löôïng nitô ñöôïc söû duïng trong noâng nghieäp 10 (Burris vaø Robert, 1993). Phaàn lôùn löôïng nitô naøy ñöôïc taïo ra qua quaù trình coá ñònh ñaïm coäng sinh, khoâng coäng sinh vaø coá ñònh ñaïm keát hôïp. 1.2. Vi sinh vaät coá ñònh ñaïm vaø cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc 1.2.1. Caùc loaøi vi sinh vaät coá ñònh ñaïm [3] 1.2.1.1. Vi khuaån coá ñònh nitô soáng töï do Töø naêm 1893 Winogradski ñaõ phaân laäp ñöôïc vi khuaån kò khí coá ñònh nitô Clostridium pasteurianum vaø tieáp ñoù naêm 1901 Beijerink phaân laäp ñöôïc 2 loaøi vi khuaån hieáu khí coá ñònh nitô laø Azotobacter chroococum vaø A. agilis. Cho ñeán nay ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän ñöôïc raát nhieàu loaøi vi khuaån coá ñònh nitô soáng töï do. Chuùng coù theå laø hieáu khí (Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia, Derxia), kò khí khoâng baét buoäc (Aerobacter, Klebsiella, Bacillus polymyxa, B. macerrans), kò khí baét buoäc (nhieàu loaøi Clostridium, Desulphovibri, Dsulphotomaculum...). Moät soá loaøi vi khuaån lam (nhö Aulosia fertilissima, Tolipothrix tenuis, Nostoc sp.) cuõng coù khaû naêng coá ñònh nitô. 1.2.1.2. Vi khuaån coá ñònh nitô coäng sinh Naêm 1866, H.Hellriegel vaø Hwilfath phaùt hieän ra khaû naêng coá ñònh nitô cuûa caùc caây hoï Ñaäu. Naêm 1888, M.W.Beijerinck phaân laäp ñöôïc nhöõng vi khuaån noát saàn ñaàu tieân töø reã caùc caây hoï Ñaäu. Naêm 1889, B.Frank ñaët teân cho vi khuaån noát saàn laø Rhizobium. Trong nhieàu naêm qua ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän thaáy moät soá loaøi vi sinh vaät coá ñònh nitô coù khaû naêng coäng sinh vôùi raát nhieàu loaïi caây khoâng thuoäc hoï ñaäu. Caùc caây naøy thuoäc veà caùc chi thöïc vaät khaùc nhau. Caùc vi sinh vaät naøy thuoäc caùc nhoùm nhö xaï khuaån (Frankia), vi khuaån, vi khuaån lam. 11 1.2.1.3. Vi khuaån coá ñònh nitô soáng treân reã hay trong reã moät soá loaøi coû nhieät ñôùi Gaàn ñaây, nhieàu nghieân cöùu cho bieát coù moät soá vi khuaån coá ñònh nitô soáng treân boä reã hay trong vuøng reã (Rhizosphere) cuûa moät soá loaøi coû nhieät ñôùi (Parker, 1957 ; Moore, 1963 ; Dobereiner, 1966 ; Rinaudo, 1970 ; Yoshida, 1971 ; Dobereiner, 1975, 1980 ; Bohlool, 1981 ; Hill, 1981...) [4]. Ngoaøi khaû naêng coá ñònh ñaïm, chuùng coù theå tieát ra moâi tröôøng ñaát moät soá hoaït chaát coù taùc duïng kích thích sinh tröôûng ôû thöïc vaät [8]. Caùc loaøi vi khuaån ñöôïc phaùt hieän goàm coù: Azotobacter, Beijerinckia, Dexia, vaø moät soá vi khuaån hình xoaén laø Azospirillum [4]. 1.2.1.4. Ñaïm do vi sinh vaät coá ñònh ñöôïc Ñoái vôùi vi khuaån noát saàn coäng sinh vôùi caây boä ñaäu löôïng ñaïm coá ñònh ñöôïc phuï thuoäc vaøo loaøi, vaøo caây chuû, bieán ñoäng trong khoaûng 30 - 50 kg/ha/naêm (ñoái vôùi caây Phaseolus Vulgaris) [4]. Toång soá ñaïm haøng naêm do vi khuaån coäng sinh caây boä ñaäu coá ñònh ñöôïc vaøo khoaûng 50 - 600kg/ha/naêm [11]. Ñoái vôùi moät soá loaøi vi khuaån coäng sinh vôùi caây khoâng thuoäc boä ñaäu nhö Azospirillum coäng sinh vôùi coû Pangola coá ñònh haøng naêm töø 5 - 30kg ñaïm/ha. Caùc vi sinh vaät soáng töï do trong ñaát (Azotobacter, Clostridium, Bluegreenalgae...) cuõng cung caáp haøng naêm cho moãi hecta ñaát khoaûng 5 - 20kg ñaïm. Gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi taûo lam coù theå cung caáp moãi hecta ñeán 50kg ñaïm [19]. 1.2.2. Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ñöôïc Winogradski vaø veà sau ñöôïc nhieàu taùc giaû nghieân cöùu, nhöng cho tôùi nay vaãn coøn coù choã chöa giaûi quyeát ñöôïc hoaøn toaøn. Caùi khoù nhaát luùc ñaàu gaëp phaûi laø phaân töû nitô coù söùc “trô” raát cao, löïc “ì” cuûa noù laø do hai nguyeân töû nitô (N≡N) ñöôïc lieân keát vôùi nhau baèng 3 moái lieân keát beàn vöõng. Trong coâng nghieäp phaân ñaïm muoán phaù vôõ caùc lieân keát naøy ñeå taïo ra 12 caùc daïng ñaïm cho caây haáp thu ñöôïc caàn phaûi duøng nhieät ñoä cao, aùp suaát cao. Theo tính toaùn, muoán toång hôïp ra moät taán NH3 töø N2 vaø H2 caàn naêng löôïng töông ñöông vôùi naêng löôïng sinh ra do ñoát chaùy 5 taán than ñaù. Trong khi ñoù, ôû teá baøo vi sinh vaät, quaù trình phaù caùc löïc “ì” dieãn ra ôû nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng, ñoù laø vì teá baøo vi sinh vaät coù heä enzyme nitrogenase. ÔÛ vi khuaån ñaõ bieát khaù roõ baûn ñoà gen nif [3], [22]. Chính heä enzyme naøy ñaõ xuùc taùc laøm cho nitô cuûa khí quyeån lieân keát vôùi hydro sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát noäi baøo. Ñaây laø moät öu ñieåm cuûa saûn xuaát phaân vi sinh. Luùc ñaàu khi ngöôøi ta chöa bieát raèng chæ ôû ñieàu kieän aùp suaát khí nitô raát cao (1051atm) thì N2 môùi coù khaû naêng keát hôïp vôùi nöôùc, neân löu haønh giaû thuyeát “lieân keát thuyû phaân” ñeå giaûi thích söï bieán ñoåi N2 thaønh hydroxylamin hoaëc nitrite amon: Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ñöôïc toùm taét baèng sô ñoà 1.1 : N2 + 2H2O NH4NO2 N2 + 3H2O NH2OH + NH(OH)2 NH=NH +2H H2N – NH2 +2H 2NH3 -H2O +H2O +H2O 2H N≡N ½ O2 4H NO2 (HNO)22NH2OH Con ñöôøng khöû Con ñöôøng Oxy hoùa 13 Giaû thuyeát khaùc cho raèng trong teá baøo Azotobacter ñaõ thöïc hieän moät phaûn öùng, maø N2 ñöôïc khöû baèng hydro hoaït tính ñeå bieán thaønh NH3. Giaû thuyeát naøy döïa treân cô sôû khi nuoâi caáy vi sinh vaät coá ñònh ñaïm ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän NH3 trong moâi tröôøng. Coù hai con ñöôøng chuû yeáu (con ñöôøng oxy hoaù vaø con ñöôøng khöû) bieán nitô phaân töû thaønh NH3 (Kretovich V.P.1964; 1971). Trong thöïc nghieäm, ngöôøi ta phaùt hieän nhöõng hôïp chaát loaïi khöû trong moâi tröôøng nuoâi caáy vaø trong dòch chieát voâ baøo cuûa vi khuaån coá ñònh ñaïm nhö phaùt hieän NH3 ñaùnh daáu khi duøng N18 vaø N15, thaáy hydroxylamin (NH2OH) ôû Azotobacter vinelandii, nhôø phöông phaùp ñoàng vò phoùng xaï, phaùt hieän thaáy hydrazin vaø hai hôïp chaát naøy coù theå keát hôïp vôùi caùc ketoaxit ñeå thaønh caùc amino acid (Bem den A.A, 1966). Trong moâi tröôøng coù vi sinh vaät coá ñònh ñaïm theá oxy hoaù khöû ôû möùc thaáp, hieäu suaát naêng löôïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ôû ñieàu kieän kî khí cao hôn ôû ñieàu kieän hieáu khí. Taát caû nhöõng ñieàu ñoù cho pheùp chuùng ta keát luaän raèng con ñöôøng khöû N2 thaønh NH3 ôû vi sinh vaät coá ñònh ñaïm coù nhieàu cô sôû vöõng chaéc hôn. Quaù trình coá ñònh nitô phaân töû laø moät quaù trình khöû lieân tuïc N2, saûn phaåm ñaàu tieân coù theå thu ñöôïc laø NH3 neáu coâng nhaän trong quaù trình naøy coù söï vaän chuyeån 2 ñieän töû thì coù theå döï ñoaùn saûn phaåm cuûa quaù trình naøy laø diimit vaø hydrazin. Nitrogenase laø toå hôïp nhieàu enzyme chöùa saét khoâng lieân keát vôùi caùc nhoùm -hem vaø nhoùm -SH, noù khoâng chæ khöû nitô phaân töû maø coøn khöû acetylen N2 N≡N ATP 2[H] HN=NH diimit ATP 22[H] ATP 2[H] H2N – NH2 hydrazin 2NH3 NH3 14 (HC≡CH). Khaû naêng khöû acetylen thaáy ôû noát saàn caây hoï Ñaäu vaø ôû nhöõng vi sinh vaät coá ñònh nitô kò khí soáng töï do trong ñaát. Dòch voâ baøo Clostridium coù khaû naêng coá ñònh nitô phaân töû, laïi coù khaû naêng khöû acetylen khi coù ATP, feredoxin vaø ion Mg+. Ñieàu ñoù, moät maët môû ra trieån voïng môùi nghieân cöùu quaù trình coá ñònh nitô phaân töû vaø caùc thaønh phaàn cuûa noù, maët khaùc cho pheùp phaùt hieän nhöõng saûn phaåm trung gian cuûa caùc khaâu coá ñònh nitô. 1.3. Vi khuaån Azospirillum 1.3.1. Ñaëc tính hình thaùi Azospirillum ñöôïc phaân laäp laàn ñaàu tieân vaøo naêm 1925 töø ñaát pha caùt ngheøo nitô ôû Haø Lan. Sau ñoù vi khuaån naøy cuõng ñöôïc phaân laäp töø nhieàu nguoàn khaùc nhau : ñaát vaø reã cuûa nhieàu loaøi coû nhieät ñôùi [17]. Hoäi nghò quoác teá laàn thöù nhaát veà coá ñònh nitô naêm 1974 taïi Phaàn lan Dobereiner vaø Day laø nhöõng taùc giaû ñaàu tieân ñaõ thoâng baùo veà söï hoäi sinh giöõa Azospirillum vôùi reã caùc caây Hoøa thaûo vaø nhöõng caây khaùc troàng ôû vuøng nhieät ñôùi. Töø ñoù ñeán nay ñaõ coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu veà vaán ñeà naøy, trong ñoù coù nhieàu thoâng tin veà khaû naêng taêng naêng suaát caùc caây Hoøa thaûo do nhieãm Azospirillum [1]. Azospirillum thuoäc nhoùm vi khuaån dò döôõng carbon, vi hieáu khí, teá baøo hình que hôi cong, kích thöôùc teá baøo (0,9 -1,2μm), teá baøo di ñoäng nhôø tieân mao ñôn ôû moät ñaàu, trong teá baøo coù nhöõng chuoãi haït poly-β-hydroxybutyrate (PHB) [23]. Trong moâi tröôøng dòch theå teá baøo coù moät tieân mao ñôn ôû cöïc coøn khi nuoâi moät vaøi loaøi treân moâi tröôøng raén ôû 30oC coù theâm vaøi tieân mao moïc ra beân caïnh tieân mao ñôn [23]. Caùc khuaån laïc cuûa Azospirillum taïo maøu hoàng nhaït hay maøu hoàng ñaäm treân moâi tröôøng thaïch khoai taây [11], [23]. Nhieät ñoä toái öu caùc loaøi Azospirillum vaøo khoaûng 34 - 37oC. Moät vaøi chuûng phaùt trieån toát ôû pH 7, moät vaøi 15 chuûng khaùc thì phaùt trieån toát treân moâi tröôøng acid. Chuùng coá ñònh nitô trong khoâng khí trong ñieàu kieän vi hieáu khí. Vaøi chuûng coù theå khöû NO3- thaønh NO2- hoaëc N2O vaø N2 [23]. Nguoàn carbon ñöôïc haàu heát caùc loaøi söû duïng thöôøng laø caùc muoái cuûa acid höõu cô nhö malate, lactate, succinate, pyruvate, moät vaøi carbon hydrate cuõng ñöôïc söû duïng laøm nguoàn carbon chính. Moät vaøi chuûng caàn biotin. Caùc loaøi naøy coù theå soáng töï do trong ñaát hoaëc soáng coäng sinh vôùi reã cuûa caùc loaïi nguõ coác, coû… nhöng khoâng taïo noát saàn [23]. Moâi tröôøng phaân laäp Azospirillum laø moâi tröôøng voâ ñaïm (NFb). Trong moâi tröôøng NFb baùn loûng caùc teá baøo cuûa Azospirillum taïo daïng ñóa sinh tröôûng sau 48- 96 giôø, daïng ñóa naøy vaän ñoäng tôùi saùt beà maët moâi tröôøng vaø sau ñoù lan toaû ra. Ñoù laø phaûn öùng vi hieáu khí. Coøn treân moâi tröôøng NFb raén caùc khuaån laïc cuûa Azospirillum thöôøng laø troøn, khoâ, ñuïc, rìa trôn hoaëc nhaên. Treân moâi tröôøng NFb boå sung theâm congo ñoû raát deã phaùt hieän caùc khuaån laïc Azospirillum vì chuùng coù ñaëc ñieåm laø baét maøu vôùi congo ñoû trong khi ñoù khuaån laïc cuûa caùc loaøi vi khuaån coá ñònh ñaïm khaùc khoâng baét maøu vôùi congo ñoû [10]. Ngöôøi ta ñaõ phaân laäp vaø ñònh danh ñöôïc 5 loaøi ñoù laø: A.lipoferum, A.brasilense (Tarrand et al., 1978), A.amazonense (Magalhas et al., 1983), A.hapraeferans (Reinhold et al., 1987), A.irakense (Khammas et al., 1989) [23], [29]. Gaàn ñaây nhaát ñaõ phaân laäp theâm ñöôïc 2 loaøi ñoù laø : A.largomobile (Ben Dekhil et al., 1997) sau ñoù loaøi naøy ñöôïc ñaët laïi teân laø : A.lagimobile (Sly and Stackebrandt, 1999) vaø A.dobereinerae [21], [23]. 16 Baûng 1.1. Caùc ñaëc ñieåm phaân loaïi cuûa caùc loaøi Azospirillum [23] Ghi chuù : + : hôn 90% caùc chuûng döông tính Ñaëc ñieåm Az os pi ri llu m am az on en se Az os pi ri llu m br as ile ns e Az os pi ri llu m ha lo pr ae fe re ns Az os pi ri llu m ir ak en se Az os pi ri llu m lip of er um - Beà roäng teá baøo (µm) 0,8-1,0 1,0 -1,2 0,7-1,4 0,6-0,9 1,0 -1,5 - Söï saép xeáp cuûa tieân mao treân teá baøo trong moâi tröôøng dòch theå + Moät ñeán ba tieân mao ôû moät hoaëc hai cöïc. - - - - - + Tieân mao ñôn cöïc + + + + + - Vaøi tieân mao moïc ra hai beân khi phaùt trieån treân moâi tröôøng agar - + + + - Nhieät ñoä toái öu (tp) 35oC 37oC 41oC 30-33oC 37oC -Sinh tröôûng trong moâi tröôøng baùn loûng voâ ñaïm chöùa nguoàn C duy nhaát + Glucose + - - + + Sucrose + - - - - Khöû NO3- ñeán NO2- ± + + d + NO2- ñeán N2 O - ± + - ± - Khoaûng pH toái öu 5,7-6,5 6,0 -7,3 6,8 - 8,0 5,5 – 8,5 5,7 - 6,8 - Thuyû phaân Pectin - - - + - 17 − : hôn 90% caùc chuûng aâm tính ± : ña soá caùc chuûng döông tính, vaøi chuûng aâm tính d : 11 - 89 % caùc chuûng döông tính 1.3.2. Söï phaân boá cuûa Azospirillum trong ñaát Nhoùm Azospirillum coù bieân ñoä sinh thaùi roäng, chuùng phaân boá haàu heát trong caùc loaïi ñaát : töø caùc vuøng ñaát noâng nghieäp cho ñeán caùc vuøng ñaát hoang hoaù ngheøo chaát dinh döôõng, soá löôïng cuûa Azospirillum trong ñaát noâng nghieäp thöôøng cao hôn ñaát hoang hoaù [9]. Trong ñaát noâng nghieäp thì nhöõng vuøng ñaát chuyeân canh troàng luùa coù soá löôïng Azospirillum cao hôn nhöõng vuøng ñaát luaân canh luùa maøu raát nhieàu [9]. ÔÛ nöôùc ta theo keát quaû nghieân cöùu cuûa moät vaøi taùc giaû, thì soá löôïng Azospirillum ôû trong ñaát troàng luùa ñoàng baèng soâng Hoàng laø khaù cao. Nhìn chung maät ñoä teá baøo Azospirillum trong caùc chaân ñaát laø töø vaøi chuïc ñeán vaøi vaïn teá baøo/gam ñaát khoâ, trong ñaát khoâng ngaäp nöôùc thì soá löôïng Azospirillum thaáp nhaát [9]. Cuøng ñieàu kieän ngaäp nöôùc nhö nhau soá löôïng Azospirillum trong ñaát canh taùc lôùn hôn ñaát hoang, phaân boùn höõu cô laø yeáu toá daãn ñeán söï cheânh leäch soá löôïng Azospirillum giöõa ñaát canh taùc vaø ñaát hoang. Theo Charyulu vaø Rao (1980), vaøo giai ñoaïn phaân röõa thaân luùa, soá löôïng Azospirillum taêng leân khaù cao so vôùi bình thöôøng [9]. Trong ñaát chuyeân canh luùa söï bieán ñoäng soá löôïng Azospirillum khoâng theå hieän roõ nhö ôû ñaát luaân canh luùa muøa. Ñieàu ñoù noùi leân vai troø cuûa ñaát ngaäp nöôùc ñoái vôùi söï khu truù cuûa Azospirillum [9]. Ñieàu ñaùng chuù yù laø soá löôïng Azospirillum ôû vuøng reã luùa luoân lôùn hôn nhieàu so vôùi soá löôïng trong ñaát, söï cheânh leäch naøy coù theå ñaït tôùi vaøi traêm laàn. Maät ñoä vi 18 khuaån cao ôû reã theå hieän moái töông quan hoäi sinh khaù chaët cheõ giöõa nhoùm vi khuaån naøy vaø reã caây luùa nöôùc [9]. 1.3.3. AÛnh höôûng cuûa Azospirillum ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa thöïc vaät [17] Trong quaù trình nhieãm khuaån Azospirillum vaøo reã coù theå taïo ra nhöõng thay ñoåi quan troïng caùc chæ soá sinh tröôûng ôû thöïc vaät nhö : taêng troïng löôïng khoâ, taêng haøm löôïng nitô trong thaân vaø haït, taêng ñeû nhaùnh, taêng soá löôïng boâng, thôøi haïn laøm ñoøng vaø ra hoa ngaén hôn, troïng löôïng haït cao hôn ñoái chöùng... Tuy nhieân, nhöõng thay ñoåi veà sinh tröôûng vaø phaùt trieån do xöû lyù vi khuaån khoù quan saùt taïi ñoàng ruoäng, do ñoù, chæ coù thoáng keâ moät caùch kyõ löôõng môùi coù theå nhaän thaáy ñöôïc söï gia taêng saûn löôïng sau thu hoaïch do nhieãm khuaån. Cô cheá taùc ñoäng cuûa vi khuaån Azospirillum sau khi nhieãm vaøo reã cho ñeán nay vaãn laø ñieàu bí aån, coù leõ vì theá maø nhöõng keát quaû thöïc nghieäm thu ñöôïc caû treân ñoàng ruoäng laãn trong phoøng thí nghieäm ñeàu coù bieân ñoä dao ñoäng raát lôùn. Möùc taêng tröôûng ôû thöïc vaät do nhieãm Azospirillum trong ñieàu kieän ñoàng ruoäng thöôøng naèm trong giôùi haïn töø 10 ñeán 30%. Cho ñeán nay ñaõ coù nhöõng taøi lieäu ñaùnh giaù toång hôïp keát quaû xöû lyù nhieãm khuaån Azospirillum ñeán naêng suaát cuûa luùa mì ôû caùc thí nghieäm ñoàng ruoäng nhö sau : taêng saûn trung bình do nhieãm khuaån laø 60% so vôùi ñoái chöùng trong ñoù taêng saûn ôû luùa troàng vuï heø laø 75% coøn troàng vuï ñoâng laø 50%. Thí nghieäm xöû lyù vi khuaån ñoái vôùi nhieàu loaïi caây rau quaû khaùc cuõng cho saûn löôïng taêng töø 70 - 75% so vôùi ñoái chöùng. 1.3.3.1. AÛnh höôûng nhieãm khuaån ñeán söï phaùt trieån boä reã AÛnh höôûng deã thaáy nhaát do nhieãm khuaån Azospirillum laø söï bieán ñoåi hình thaùi boä reã [30]. Tuy nhieân, söï bieán ñoäng ñoù laïi lieân quan tröïc tieáp ñeán maät ñoä vi khuaån khi xöû lyù : neáu xöû lyù vi khuaån cao hôn maät ñoä toái thích thì chuùng seõ kìm haõm söï phaùt trieån chieàu daøi reã, trong khi ôû noàng ñoä thaáp hôn hieäu quaû taùc ñoäng 19 cuûa vi khuaån ñoái vôùi reã khoâng roõ reät. Maät ñoä vi khuaån nhieãm vaøo maï vaø haït gioáng cuûa nhieàu loaïi caây rau quaû vaø caây coâng nghieäp khoaûng 105 - 106teá baøo/ml, cho baép laø 107teá baøo/ml, vaø cho caø chua invitro laø hôn 108teá baøo/ml. Thoâng thöôøng, maät ñoä 108 - 1010teá baøo/ml öùc cheá reã phaùt trieån keùo daøi. Tuy nhieân, maät ñoä vi khuaån neâu treân khoâng cho pheùp khaúng ñònh laø caàn nhieãm bao nhieâu vi khuaån Azospirillum cho moät haït hay moät caây ñeå nhaän phaûn öùng taêng saûn döông tính. Ñoái vôùi luùa nöôùc, maät ñoä vi khuaån trong dung dòch xöû lyù 106teá baøo/ml coù aûnh höôûng döông tính ñeán chieàu cao vaø troïng löôïng khoâ caây maï [17]. AÛnh höôûng döông tính do nhieãm khuaån coøn theå hieän qua caùc chæ soá phaùt trieån reã, keå caû söï taêng tröôûng chieàu daøi, ñaëc bieät laø taïi vuøng sinh tröôûng cuûa reã, taêng soá löôïng vaø chieàu daøi cuûa reã phuï vaø do ñoù laøm taêng theå tích reã, taêng troïng löôïng reã, laøm xuaát hieän sôùm vaø taêng soá löôïng caùc loâng huùt, taêng dieän tích tieáp xuùc cuûa caùc loâng reã, thay ñoåi söï saép xeáp caùc teá baøo choùp reã [17]. Caét ngang reã cuûa caây baép vaø caâp luùa mì bò nhieãm khuaån thaáy caùc teá baøo ôû nhöõng reã naøy saép xeáp moät caùch baát bình thöôøng, ôû lôùp ngoaøi vuøng voû. Ñaëc bieät laø caùc hoaït ñoäng cuûa nhöõng enzyme oxy hoaù, lipid vaø caùc chaát baàn thu ñöôïc ôû nhöõng reã nhieãm thaáp hôn reã khoâng nhieãm [27]. Theo moät soá nghieân cöùu thì haøm löôïng caùc chaát : NO3-, K+ vaø H2PO4- trong caùc reã nhieãm khuaån cao hôn trong caùc reã khoâng nhieãm khuaån [27]. 1.3.3.2. Söï hình thaønh khuaån laïc Azospirillum ôû reã Söï phaân boá cuûa Azospirillum treân beà maët reã vaø caùc hoaït ñoäng xaâm nhieãm vaøo reã cuûa caây luùa mì vaø caây baép thì cuõng gioáng nhö nhöõng vi khuaån khaùc. Trong suoát ba ngaøy ñaàu, caùc khuaån laïc taäp trung chuû yeáu ôû vuøng ñaàu non cuûa loâng reã. Vaøi chuûng Azospirillum xaâm nhieãm vaøo vaøi loaïi caây troàng nhö luùa mì, luùa mieán, baép... Söï xaâm nhieãm ñoù laøm thay ñoåi hình thaùi reã [27]. 20 Azospirillum coù theå baùm treân beà maët reã hoaëc xaâm nhaäp vaøo beân trong reã ñeå hình thaønh caùc taäp ñoaøn vôùi voâ soá hôïp phaàn laø caùc teá baøo ñôn. Caùc khuaån laïc naøy aån vaøo phía trong lôùp nhaày ôû maët reã. Caû reã ñaõ cheát laãn reã coøn soáng ñeàu bò vi khuaån xaâm nhieãm. Trong reã, Azospirillum hình thaønh caùc khuaån laïc ôû gian baøo [17]. ÔÛ caùc loaïi nguõ coác khuaån laïc thöôøng thaáy ôû maët reã, ít thaáy ôû vuøng loâng huùt. Trong khi ñoù ôû luùa nöôùc thì ngöôïc laïi. Khaûo saùt baèng kính hieån vi ñieän töû, ôû reã cuûa moät vaøi loaøi thöïc vaät, thaáy khi baùm vaøo reã Azospirillum töï lieân keát vôùi nhau thaønh nhöõng taäp ñoaøn vi khuaån vaø ñöôïc moät maïng löôùi do caùc sôïi polymer coù baûn chaát protein bao boïc. Naêng löôïng phuïc vuï cho söï chuyeån hoaù naøy chuû yeáu phuï thuoäc vaøo caùc hoaït ñoäng chuyeån hoaù cuûa baûn thaân vi khuaån, vaø söï baùm dính naøy heát söùc loûng leûo. Do ñoù, chæ caàn röûa nheï nhaøng ñaõ coù theå giaûi phoùng phaàn lôùn vi khuaån Azospirillum khoûi reã [17]. Söï baùm dính thöôøng xaûy ra raát nhanh trong voøng vaøi phuùt ñaàu vaø maët reã seõ baõo hoaø vi khuaån sau chöøng hai giôø keå töø khi tieáp caän. Tuy nhieân, cho ñeán nay vaãn chöa khaùm phaù ra cô cheá Azospirillum töï baùm vaøo maët reã. Coù theå caùc yeáu toá hoaù hoïc, dinh döôõng, moâi tröôøng vaø sinh lyù seõ kích thích hoaëc kìm haõm Azospirillum baùm vaøo reã. Söï lieân keát qua lecithin ñöôïc coi nhö laø moät cô cheá baùm dính vaø agglutinin ñöôïc coi nhö laø phöông tieän baùm dính vaøo maët reã [17]. Baèng kyõ thuaät hieån vi ñoâi khi cuõng ñaõ phaùt hieän thaáy khuaån laïc coù trong gian baøo cuûa caùc teá baøo moâ choùp reã. Tuy nhieân, ôû coû Kallar thöôøng chæ thaáy söï hieän dieän daøy ñaëc teá baøo Azospirillum treân maët reã, caùc quaàn theå Azospirillum beân trong reã chöa bao giôø thaáy ñöôïc [17]. Neáu nhö vi khuaån Azospirillum hieän dieän trong gian baøo thì caâu hoûi ñöôïc ñaët ra laø baèng caùch naøo Azospirillum xaâm nhaäp vaøo beân trong ñöôïc ? Coù caùc khaû naêng : 21 + Vi khuaån thaâm nhaäp vaøo beân trong qua caùc moâ reã bò toån thöông, nôi reã phuï töø reã caùi moïc ra. + Vi khuaån thaâm nhaäp vaøo beân trong qua caùc loâng huùt ñaõ cheát hoaëc qua nhöõng choã toån thöông cô hoïc thöôøng gaëp trong quaù trình sinh tröôûng cuûa caây. + Vi khuaån duøng enzyme pectinase hoaø tan pectin vaø do ñoù môû loái thaâm nhaäp vaøo beân trong. 1.3.4. Caùc cô cheá hoaït ñoäng cuûa Azospirillum giuùp taêng tröôûng thöïc vaät Cô cheá hoaït ñoäng giuùp taêng tröôûng thöïc vaät cuûa Azospirillum cho ñeán nay vaãn chöa xaùc laäp, nhöng theo moät soá taùc giaû coù ba nguyeân nhaân chính laøm cho caùc chuûng Azospirillum coäng sinh vôùi caây troàng laøm taêng naêng suaát [1]. + Söï hình thaønh vaø chuyeån vaøo caây löôïng nitô coá ñònh bôûi vi khuaån (Renie, 1980). + Vi khuaån tieát ra caùc hormon thöïc vaät (Tieân vaø coäng söï, 1979). + Söï kích thích ñöa caùc chaát dinh döôõng vaøo caây (Lin vaø coäng söï, 1985). Moät vaøi nghieân cöùu cuûa moät soá taùc giaû, thì caùc chuûng Azospirillum ngoaøi khaû naêng coá ñònh nitô, coøn coù khaû naêng sinh ra chaát kích thích sinh reã ñoù laø indole -3- acetic acid (IAA). Caây maï coù xöû lyù Azospirillum ra reã nhieàu hôn vaø cao hôn ñoái chöùng, chöùng toû hormon thöïc vaät ñaõ phaùt huy taùc duïng toát. Maøu xanh ñaäm hôn vaø laù to baûn hôn theå hieän nitô ñöôïc söû duïng nhieàu hôn ôû nhöõng caây thí nghieäm [1]. Ngoaøi ra thì Azospirillum coù theå taêng hoaït tính nitratereductase ôû reã vaø do ñoù caây khoâng tích luõy nhieàu nitrate trong reã [17]. 1.3.4.1. Söï coá ñònh nitô khoâng khí cuûa Azospirillum Taát caû caùc chuûng Azospirillum phaân laäp ñöôïc ñeàu coù khaû naêng coá ñònh ñaïm khaù hieäu quaû, khi soáng töï do cuõng nhö khi toàn taïi trong quan heä toå hôïp vôùi thöïc vaät. Khaû naêng coá ñònh nitô khoâng khí ñöôïc ñaùnh giaù baèng phaûn öùng khöû 22 acetylen, ñaõ phaùt hieän thaáy söï gia taêng nitô toång soá ôû thaân vaø haït do nhieãm Azospirillum.Vì theá ñaõ coi coá ñònh nitô nhö laø cô cheá chuû yeáu vaø ñaàu tieân cuûa caùc hoaït ñoäng kích thích taêng tröôûng thöïc vaät cuûa Azospirillum. Maëc daàu söï coá ñònh nitô khoâng khí ñöôïc dieãn taû baèng phaûn öùng khöû acetylen, nhöng chính xaùc hôn caû laø nhöõng daãn lieäu thu ñöôïc khi söû duïng kyõ thuaät haáp thu vaø pha loaõng 15N ñaõ xaùc ñònh ñöôïc söï gia taêng hoaït tính nitrogenase ôû reã nhieãm khuaån, keát quaû ñoù phuø hôïp vôùi söï gia taêng toång löôïng nitô ôû caây chuû nhieãm khuaån. Keát quaû nhieãm Azospirillum vaøo luùa mì vaø baép cho thaáy trong toaøn boä löôïng nitô cuûa caây thì chæ coù 18% laø do coá ñònh töø khoâng khí, vaø trong toaøn boä löôïng nitô coá ñònh caây chuû haáp thu ñöôïc chöøng 5% maø thoâi. Tuy nhieân, chæ moät löôïng nhoû nhö theá cuõng ñuû ñeå lyù giaûi cho söï gia taêng haøm löôïng nitô toång soá ôû caây chuû vaø do ñoù löôïng nitô cuûa phaân boùn duø coù cao ñeán möùc öùc cheá hoaït tính nitrogenase cuõng khoâng aûnh höôûng ñeán taêng saûn döông tính ôû caây chuû khi ñöôïc nhieãm khuaån [17]. 1.3.4.2. Aûnh höôûng cuûa hormon ngoaïi tieát Azospirillum leân sinh tröôûng vaø phaùt trieån ôû thöïc vaät [17] Trong quaù trình sinh tröôûng nhieàu loaøi Azospirillum saûn sinh ra caùc hormon ngoaïi tieát coù taùc duïng ñieàu hoøa sinh tröôûng ôû thöïc vaät nhö indole-3-pyruvic acid vaø indole-3-acetaldehyde laø IAA ôû A.lipoferum. Coù baèng chöùng cho söï toàn taïi con ñöôøng taïo IAM ôû A.brasilense, ñoù laø söï hieän dieän cuûa indole-3-ethanol, indole-3- methanol (IM) vaø indole-3-lactate (ILA) trong moâi tröôøng nuoâi caáy A.brasilense. Hieäu quaû cuûa hormon ngoaïi tieát ñeán caây troàng hoaøn toaøn phuï thuoäc vaøo noàng ñoä söû duïng. Noàng ñoä söû duïng quaù thaáp thì ít coù hieäu quaû. Noàng ñoä thaáp (khoaûng vaøi ppm ñeán vaøi chuïc ppm) seõ gaây hieäu quaû kích thích sinh tröôûng (taêng chieàu cao, taêng sinh khoái). Noàng ñoä söû duïng ôû möùc cao (haøng nghìn ppm) seõ gaây öùc cheá sinh tröôûng. Noàng ñoä raát cao (treân chuïc nghìn ppm) seõ gaây neân söï huûy dieät boä phaän cuûa toaøn caây [18]. 23 Caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät cuõng aûnh höôûng maïnh ñeán khaû naêng khöû acetylen cuûa Azospirillum. Baèng chöùng cho thaáy khi xöû lyù caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng (caû toång hôïp nhaân taïo laãn taùch chieát töø dòch nuoâi caáy vi khuaån), hình thaùi vaø söï phaùt trieån cuûa reã ñöôïc khoâi phuïc hoaøn toaøn gioáng nhö khi xöû lyù Azospirillum. Cuï theå laø taïo ra nhöõng thay ñoåi veà chieàu daøi reã, reã taïo ra nhieàu loâng huùt hôn, taêng toác ñoä phaân baøo vaø bieät hoùa moâ taïo vuøng sinh tröôûng cuûa reã. Caùc chuûng cha meï Azospirillum vaø caùc theå ñoät bieán taïo IAA ngoaïi tieát trong dòch nuoâi caáy aûnh höôûng maïnh ñeán phaùt trieån hình thaùi cuûa reã, trong khi caùc theå ñoät bieán maát khaû naêng taïo IAA ngoaïi tieát thì khoâng coù khaû naêng laøm thay ñoåi hình thaùi cuûa reã. Nhieãm Azospirillum ñaõ caûi thieän söï caân baèng hormon ôû caùc caù theå luùa mì ñoät bieán maát khaû naêng taïo hormon. Gaàn ñaây phaùt hieän ñöôïc moät löôïng ñaùng keå IAA vaø IBA ôû reã ngoâ do nhieãm Azospirillum, trong khi ôû reã ngoâ khoâng nhieãm thì hoaøn toaøn khoâng coù. 1.3.4.3. Azospirillum kích thích söï haáp thu caùc chaát dinh döôõng khoaùng cuûa thöïc vaät [17] Ngoaøi söï taêng hoaëc giaûm caùc chæ soá sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa reã, vi khuaån Azospirillum coøn aûnh höôûng ñeán thay ñoåi caùc chæ soá veà laù. Söï thay ñoåi coù lieân quan tröïc tieáp ñeán söï haáp thu NO3-, NH4+, PO43-, K+, Rb+ vaø Fe2+. Ñoù laø nguyeân nhaân cuûa söï gia taêng haøm löôïng chaát khoâ do tích luõy khoaùng chaát ôû thaân vaø laù. Ngöôøi ta cho raèng vieäc taêng cöôøng khoaùng chaát ñöôïc coi laø nguyeân nhaân taêng theå tích vaø troïng löôïng khoâ cuûa reã [24]. Thöïc vaäy, nhieãm khuaån Azospirillum laøm cho löôïng ion trong ñaát taêng leân vaø do ñoù giuùp caây khaéc phuïc ñöôïc tình traïng ngheøo chaát dinh döôõng. Chính ñieàu ñoù giaûi thích vì sao khi xöû lyù Azospirillum nif- caây vaãn haáp thu raát hieäu quaû nitô maëc duø trong ñaát coù raát ít. Chính vì theá, duø löôïng nitô boùn vaøo ñaát coù thaáp hôn nhu caàu vaãn ñaûm baûo ñöôïc saûn löôïng thu hoaïch oån ñònh. Vaøi nghieân cöùu ñaõ chöùng minh raèng hoaït tính tieáp nhaän proton 24 lieân quan tröïc tieáp ñeán söï caân baèng ion ôû reã. Xöû lyù Azospirillum ñaõ laøm cho hoaït tính thu nhaän proton ôû reã luùa mì taêng leân moät caùch roõ reät. Nhieãm khuaån Azospirillum coøn caûi thieän ñöôïc cheá ñoä nöôùc ôû caây. Caùc caây cao löông ñöôïc nhieãm khuaån chòu haïn toát hôn do tích luõy ñöôïc nhieàu nöôùc ôû laù. Tieàm naêng giöõ nöôùc taêng cao hôn ñoàng thôøi nhieät ñoä taùn laù cuõng thaáp hôn so vôùi caây ñoái chöùng khoâng nhieãm Azospirillum. 1.3.4.4. Quan heä giöõa nitratereductase cuûa caây chuû vaø vi khuaån Azospirillum [17] Hieän nay coù nhieàu giaû thuyeát cho raèng nitratereductase (NR) cuûa vi khuaån laø nguyeân nhaân khôûi ñaàu taïo neân söï tích luõy nhieàu nitô ôû caây chuû do nhieãm Azospirillum : cho nhieãm Azospirillum NR+ vaøo reã caây laøm cho hoaït tính cuûa enzyme naøy ôû laù giaûm haún vaø ngöôïc laïi, nhieãm Azospirillum NR- laøm cho hoaït tính cuûa enzyme naøy ôû laù taêng hôn so vôùi nhoùm Azospirillum NR+. Keát quaû thöû nghieäm xöû lyù Azospirillum brasilense sp 245 boá meï NR+ vaø theå ñoät bieán cuûa noù laø NR- ñaõ xaùc nhaän theå ñoät bieán coù hieäu öùng taêng saûn ít hôn raát nhieàu so vôùi chuûng boá meï NR+. Ñieàu ñoù cuõng chöùng toû coá ñònh nitô khoâng phaûi laø cô cheá duy nhaát giuùp cho caây taêng saûn bôûi vì caû chuûng boá meï laãn chuûng ñoät bieán ñeàu coù khaû naêng coá ñònh nitô khoâng khí. Coù leõ chuûng boá meï giuùp caây troàng khöû nitrate ngay reã vaø do ñoù giaûm ñöôïc söï chuyeån nitrate leân laù. Trong khi chuûng ñoät bieán NR- khoâng coù khaû naêng laøm ñöôïc ñieàu ñoù neân nitrate tieáp tuïc ñöôïc di chuyeån leân laù. 1.4 Phaân vi sinh vaät [7] 1.4.1 Ñònh nghóa Phaân vi sinh vaät laø loaïi saûn phaåm chöùa moät hoaëc nhieàu chuûng vi sinh vaät soáng, coù ích ñaõ ñöôïc tuyeån choïn maø hoaït ñoäng cuûa chuùng taïo neân trong ñaát troàng caùc chaát dinh döôõng hay caùc chaát coù hoaït tính kích thích sinh tröôûng, taïo ñieàu kieän naâng cao naêng suaát hoaëc chaát löôïng noâng saûn, taêng ñoä maøu môõ cho ñaát. Caùc 25 chuûng vi sinh vaät naøy khoâng aûnh höôûng xaáu ñeán ngöôøi, vaät nuoâi, moâi tröôøng sinh thaùi vaø chaát löôïng noâng saûn (Theo “Quy ñònh taïm thôøi veà chaát löôïng phaân boùn vi sinh vaät cho caây troàng” ban haønh keøm theo quyeát ñònh soá 161/QÑ-TÑC ngaøy 04- 03-1995 cuûa Boä Khoa hoïc Coâng ngheä vaø Moâi tröôøng). Phaân vi sinh vaät goàm hai thaønh phaàn : thaønh phaàn hoaït ñoäng vaø chaát mang. Thaønh phaàn hoaït ñoäng laø sinh khoái caùc loaïi vi sinh vaät coù ích, taïo neân taùc duïng cuûa loaïi phaân naøy vôùi caây troàng vaø ñaát ñai. Thaønh phaàn chính naøy khoâng theå nhìn thaáy baèng maét thöôøng. Coøn chaát mang laø vaät lieäu duøng ñeå coá ñònh vi sinh vaät. Chuùng taïo neân hình thaùi cuûa saûn phaåm, deã nhaän thaáy vaø phaân bieät ñöôïc, nhöng chæ ñoùng vai troø nhö nhöõng chieác xe taûi chuyeân chôû sinh khoái vi sinh vaät töø nôi saûn xuaát ñeán nôi aùp duïng. 1.4.2 Phaân loaïi Coù nhieàu caùch phaân loaïi phaân vi sinh vaät. Theo chöùc naêng söû duïng ngöôøi ta coù theå coù caùc loaïi sau : - Phaân boùn vi sinh vaät coá ñònh ñaïm : teân thöông phaåm laø phaân ñaïm vi sinh. - Phaân boùn vi sinh vaät phaân giaûi caùc hôïp chaát phospho khoù tan : teân thöông phaåm laø phaân laân vi sinh. - Phaân boùn vi sinh vaät phaân giaûi cellulose. - Phaân boùn vi sinh vaät quang hôïp. Caùc loaïi phaân naøy chæ mang tính lyù thuyeát vì treân thöïc teá haàu heát caùc loaïi phaân vi sinh ñeàu söû duïng moät hoãn hôïp nhieàu loaïi vi sinh vaät coù nhieàu chöùc naêng khaùc nhau. Cheá phaåm phaân vi sinh thöôøng duøng caùc loaïi chaát mang nhö : than buøn, ñaát vôùi buïi xô döøa hay boät ñaäu naønh, troän ñaát vôùi than cuûi, vermiculite, muøn cöa bò phaân huûy, phaân troän traáu, muøn voû caø pheâ… Caùc chaát mang coù theå haáp khöû truøng hay khoâng töø ñoù ngöôøi ta coù theå chia thaønh hai loaïi : 26 - Phaân boùn vi sinh vaät treân neàn chaát mang thanh truøng. - Phaân boùn vi sinh vaät treân neàn chaát mang khoâng thanh truøng. 1.4.3 Muïc tieâu cuûa vieäc söû duïng phaân vi sinh vaät Vieäc söû duïng caùc loaïi phaân vi sinh vaät trong noâng, laâm nghieäp ñeàu höôùng tôùi caùc muïc tieâu sau : - Giaûm nhu caàu söû duïng caùc hoùa chaát toång hôïp duøng trong troàng troït, ñaëc bieät laø caùc loaïi phaân boùn voâ cô vaø caùc loaïi thuoác baûo veä thöïc vaät, taïo ñieàu kieän chuyeån neàn noâng nghieäp hoùa hoïc sang neàn noâng nghieäp höõu cô. - Naâng cao chaát löôïng moâi tröôøng vaø baûo veä caùc nguoàn lôïi töï nhieân cuûa heä sinh thaùi. - Naâng cao khaû naêng söû duïng caùc nguoàn lôïi coù saün trong thieân nhieân, cuûa caùc loaïi pheá phuï phaåm noâng nghieäp saün coù trong töøng ñòa phöông. - Baûo ñaûm chaát löôïng vaø ñoä an toaøn cuûa caùc loaïi noâng saûn. 1.4.4 Quy trình chung ñeå saûn xuaát phaân vi sinh vaät töø vi khuaån Caùc loaïi phaân ñaïm vi sinh hieän nay ñeàu ñöôïc saûn xuaát töø caùc loaïi vi khuaån coá ñònh ñaïm. Quaù trình saûn xuaát cheá phaåm phaân vi sinh vaät haàu heát ñeàu ñöôïc thöïc hieän theo caùc böôùc cô baûn sau : Š Giöõ gioáng vaø nhaân gioáng vi khuaån Gioáng vi khuaån coù yù nghóa voâ cuøng quan troïng trong caû quaù trình saûn xuaát. Caùc chuûng vi khuaån duøng ñeå saûn xuaát ñeàu coù nhöõng ñaëc tính höõu ích nhö : khaû naêng coá ñònh ñaïm, söùc caïnh tranh, deã nuoâi caáy ñeå thu sinh khoái… Quaù trình giöõ gioáng ñoøi hoûi phaûi ñaûm baûo duy trì ñoä thuaàn khieát veà caùc ñaëc tính treân. Thöôøng ngöôøi ta giöõ caùc chuûng vi khuaån naøy ôû daïng ñoâng khoâ. Vieäc nhaân gioáng vi khuaån thöïc hieän baèng caùc bieän phaùp khaùc nhau, nhöng ñeàu döïa treân nguyeân taéc taêng sinh khoái vi khuaån ñeå cung caáp cho saûn xuaát (leân men thu sinh khoái). Bieän phaùp nhaân gioáng phoå bieán hieän nay laø caáy trong bình 27 noùn dung tích 200 - 300ml ñaët leân caùc thieát bò laéc coù taàn soá 100 - 300dao ñoäng/phuùt ñeå cung caáp khoâng khí cho vi khuaån phaùt trieån. Phaàn lôùn caùc quaù trình saûn xuaát ñeàu söû duïng moâi tröôøng thu sinh khoái ñeå nhaân gioáng. Š Moâi tröôøng nhaân sinh khoái trong quaù trình saûn xuaát phaân vi sinh Moâi tröôøng saûn xuaát phaûi bao goàm ñaày ñuû caùc chaát dinh döôõng toái öu nhaát cho söï phaùt trieån cuûa vi khuaån trong quaù trình taïo sinh khoái nhö : nguoàn carbon, nitô, pH, caùc nguyeân toá vi löôïng, caùc chaát kích thích sinh tröôûng … Moãi loaïi vi khuaån yeâu caàu moät nguoàn dinh döôõng khaùc nhau. Do vaäy phaûi caên cöù vaøo caùc ñaëc tính sinh lyù cuûa chuùng maø thaønh laäp moâi tröôøng nhaân sinh khoái ñeå saûn xuaát cho thích hôïp vaø coù giaù thaønh thaáp. Moät ñaëc ñieåm ñaùng löu yù laø caùc vi khuaån coá ñònh ñaïm coù ít nhieàu bò aûnh höôûng trong quaù trình nuoâi caáy treân moâi tröôøng toång hôïp. Caùc chaát ñaïm voâ cô ñaåy maïnh quaù trình phaùt trieån cuûa vi khuaån taïo neân moät löôïng sinh khoái phuø hôïp vôùi yeâu caàu saûn xuaát nhöng khaû naêng hình thaønh noát saàn vaø hoaït tính khöû acetylen cuûa chuùng ít nhieàu bò giaûm. Coøn trong caùc moâi tröôøng khoâng coù ñaïm haàu heát caùc vi khuaån naøy phaùt trieån yeáu. Ñieàu naøy trong thöïc teá thöôøng xaûy ra, khi tieán haønh nhieãm cheá phaåm ñaïm vi sinh thì löôïng phaân boùn cho caây ñaõ ñöôïc thay theá, nhöng laïi cho keát quaû aâm tính, maø söï taêng saûn do nhieãm cheá phaåm coù khi xaûy ra trong ñieàu kieän löôïng phaân ñaïm ñöôïc boùn raát cao ñeán möùc coù theå aûnh höôûng xaáu ñeán soá löôïng vi khuaån trong vuøng reã. pH vaø söï ñieàu chænh pH tröôùc khi nuoâi caáy vi khuaån cuõng aûnh höôûng nhieàu ñeán quaù trình taïo sinh khoái. Trong quaù trình thu sinh khoái Azospirillum ñeå saûn xuaát phaân vi sinh coá ñònh ñaïm treân moâi tröôøng acid höõu cô, dòch nuoâi caáy trôû neân kieàm ôû cuoái quaù trình. Khi pH≥ 9, loaïi vi khuaån naøy seõ khoâng coù khaû naêng toàn taïi. Do ñoù, trong quaù trình nuoâi caáy caàn boå sung ñeäm pH giuùp cho quaù trình ñaït hieäu quaû toát hôn. 28 Š Thanh truøng moâi tröôøng nhaân sinh khoái Quaù trình naøy nhaèm loaïi boû heát caùc vi sinh vaät laï, khoâng coù lôïi tröôùc khi caáy gioáng vi khuaån coá ñònh ñaïm ñeå leân men thu sinh khoái. Vieäc thanh truøng ñöôïc thöïc hieän baèng hôi nöôùc coù aùp suaát 1atm/30 phuùt. Trong nuoâi caáy quy moâ lôùn hoaëc nuoâi caáy treân moâi tröôøng raén, thôøi gian thanh truøng moâi tröôøng saûn xuaát daøi hôn vaø phuï thuoäc vaøo moâi tröôøng saûn xuaát. Š Nhaân sinh khoái Ngöôøi ta coù theå söû duïng maùy laéc coù taàn soá dao ñoäng khoaûng 100 - 500dao ñoäng/phuùt ñeå thu sinh khoái vi khuaån trong caùc bình thuûy tinh nhoû (250 - 500ml) chöùa moâi tröôøng leân men. Ngöôøi ta söû duïng caùc thieát bò leân men, suïc khí qua moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån ñeå thu sinh khoái cuûa chuùng. Phöông phaùp naøy cho naêng suaát cao hôn, tieát kieäm naêng löôïng, söû duïng nhaân coâng nhieàu hôn bieän phaùp treân, nhöng yeâu caàu trình ñoä thao taùc thaønh thuïc, cheá ñoä coâng ngheä ñöôïc daøy coâng nghieân cöùu vaø thöïc hieän nghieâm tuùc, phuø hôïp vôùi töøng loaïi vi khuaån. Neáu khoâng, loaïi hình nuoâi caáy naøy raát deã bò nhieãm caùc vi sinh vaät laï laøm aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa vi sinh vaät coá ñònh ñaïm. Ngoaøi ra, coøn coù phöông phaùp nhaân sinh khoái trong moâi tröôøng raén. ÔÛ phöông phaùp naøy ñoøi hoûi thaønh phaàn, kích thöôùc caùc phaàn töû cuûa moâi tröôøng thích hôïp, taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho quaù trình phaùt trieån cuûa vi khuaån. Loaïi hình leân men naøy tuy ñôn giaûn, coù thôøi gian taøng tröõ cheá phaåm laâu, nhaát laø nhöõng loaïi moâi tröôøng ñaõ ñöôïc thanh truøng nhöng raát toán coâng lao ñoäng vaø dieän tích nhaø xöôûng, saûn phaåm cho chaát löôïng khoâng ñoàng ñeàu vaø yeâu caàu moät löôïng gioáng ban ñaàu khaù lôùn. Š Chaát mang 29 Chaát mang laø nhöõng chaát laøm nhieäm vuï duy trì söï soáng cuûa vi khuaån coá ñònh ñaïm trong thôøi gian taøng tröõ, vaän chuyeån chuùng ñeán nôi aùp duïng. Chuùng laø thaønh phaàn quan troïng ñeå taïo neân caùc loaïi phaân vi sinh khaùc nhau. Chaát mang ñöôïc troän theâm dòch vi khuaån ñaõ ñöôïc leân men ñaït yeâu caàu ñeå taïo ra saûn phaåm laø phaân vi sinh vaät. Coù nhieàu loaïi chaát mang khaùc nhau tuyø thuoäc vaøo ñieàu kieän cuûa töøng ñòa phöông. Nhöng chuùng ñeàu phaûi coù ñaày ñuû caùc yeáu toá sau : - Coù ñoä haáp thuï cao, deã cheá bieán. - Khoâng ñoäc ñoái vôùi vi sinh vaät duøng ñeå cheá taïo phaân vi sinh vaät. - Deã thanh truøng. - Coù saün ôû ñòa phöông vaø coù giaù thaønh reû. Š Taïo vaø ñoùng goùi saûn phaåm Sau khi hoaøn thaønh giai ñoaïn nhaân sinh khoái (ñoái vôùi bieän phaùp thu sinh khoái treân neàn chaát mang khoâng thanh truøng) caùc saûn phaåm leân men ñöôïc neùn thaønh daïng vieân, daïng boät, … (ñoái vôùi bieän phaùp thu sinh khoái treân moâi tröôøng raén coù thanh truøng) chuyeån moät caùch voâ truøng sang caùc tuùi ñöïng saûn phaåm ; hoaëc troän dòch leân men vaøo chaát mang (trong ñieàu kieän voâ truøng), ñeå leân men hoãn hôïp trong thôøi gian ngaén, sau ñoù ñoùng goùi saûn phaåm. Tuøy theo ñieàu kieän nuoâi caáy khaùc nhau maø ta söû duïng phöông thöùc ñoùng goùi khaùc nhau. Tuy nhieân caàn phaûi thöïc hieän giai ñoaïn naøy moät caùch nghieâm ngaët ñeå baûo ñaûm chaát löôïng saûn phaåm. Š Baûo quaûn saûn phaåm Trong ñieàu kieän nöôùc ta, phaân vi sinh raát khoù baûo quaûn trong ñieàu kieän töï nhieân. Nhieät ñoä cao laøm cho ñoä soáng soùt cuûa vi khuaån giaûm xuoáng. Vôùi nhieät ñoä moâi tröôøng töø 25 - 35oC phaân vi sinh chæ coù thôøi haïn baûo quaûn trong khoaûng 3 - 4 thaùng. Vieäc baûo quaûn caùc loaïi phaân naøy trong caùc kho laïnh ñang laø vaán ñeà ñaët ra 30 tröôùc caùc nhaø nghieân cöùu vaø nhöõng ngöôøi saûn xuaát vì khi maät ñoä vi khuaån giaûm xuoáng 103 - 104 teá baøo/g phaân thì caùc loaïi phaân naøy khoâng coøn giaù trò söû duïng. Quy trình chung ñeå saûn xuaát phaân vi sinh töø vi khuaån Moâi tröôøng saûn xuaát Gioáng vi khuaån Thanh truøng Nhaân gioáng caáp 1 Caáy gioáng Chaát mang Leân men thu sinh khoái vi khuaån Thanh truøng Phoái troän, taïo saûn phaåm Söû duïng Kieåm tra Baûo quaûn 1.4.5 Phaân vi sinh töø Azospirillum Muïc tieâu quan troïng nhaát trong nghieân cöùu Azospirillum laø tìm caùch öùng duïng cheá phaåm thöông maïi chöùa noù trong troàng troït (ñoái vôùi caùc nöôùc ñang phaùt trieån vaø phaùt trieån). Coù raát ít caùc coâng trình nghieân cöùu ñeà caäp ñeán caùc kyõ thuaät troàng troït, ñieån hình laø vieäc söû duïng noâng döôïc coù aûnh höôûng gì ñeán vieäc nhieãm khuaån Azospirillum vaøo caây troàng hay khoâng. 31 Sau khi xaùc ñònh ñöôïc toå hôïp “vi khuaån – thöïc vaät” coù trieån voïng nhaát thì vieäc öùng duïng trong saûn xuaát coù thu ñöôïc keát quaû döông tính hay khoâng caàn phaûi laøm saùng toû ngay moät soá khía caïnh : vi khuaån coù tieáp caän ñöôïc vôùi reã hay khoâng khi heä reã quaù lôùn chieám moät khoâng gian ñaùng keå trong ñaát ; thôøi ñieåm chính xaùc maø caây caàn ñöôïc nhieãm vi khuaån, kyõ thuaät nhieãm vi khuaån phaûi thöïc duïng, kinh teá vaø deã thöïc hieän, saûn phaåm söû duïng phaûi coù maät ñoä gioáng ñuû ñeå caïnh tranh trong töï nhieân vaø coù söùc soáng laâu beàn [17]. Caùc cheá phaåm ñöôïc taïo ra phaûi ñaùp öùng caùc yeâu caàu : khoâ, ña daïng, ñôn giaûn söû duïng, ñoàng nhaát, bò phaân giaûi sinh hoïc do caùc vi sinh vaät ñaát, khoâng gaây ñoäc, vi khuaån phaûi khoâng taïp nhieãm, giaûi phoùng chaäm, toàn taïi ñöôïc trong moät thôøi gian daøi vaø coù theå tieán haønh saûn xuaát ôû quy moâ lôùn [17]. à Cheá phaåm Rizolu [1] Quy trình saûn xuaát cheá phaåm do Nguyeãn Thò Phöông Chi, Nguyeãn Ngoïc Duõng, Haø Thò Hoàng Thanh ñeà xuaát 1995. Caáy dòch nuoâi vi khuaån Azospirillum vaøo moâi tröôøng xoáp than buøn vôùi tyû leä 1 : 80 (ml/g). Sau 7 ngaøy nuoâi uû, cheá phaåm ñaït 109teá baøo/gram, coù theå baûo quaûn 6 thaùng ôû nhieät ñoä phoøng. Phöông phaùp söû duïng cheá phaåm : söû duïng 45g/saøo maï caáy. Xöû lyù qua 2 böôùc : troän vaøo maàm luùa ngay tröôùc khi gieo vaø hoà vaøo reã maï tröôùc khi caáy. à Cheá phaåm Azogin [7] Ñeå saûn xuaát cheá phaåm naøy ngöôøi ta söû duïng moâi tröôøng Dobereiner caûi tieán. Moâi tröôøng ñöôïc phaân vaøo bình noùn coù dung tích töø 250 - 500 ml ôû möùc 1/3 theå tích bình. Thanh truøng baèng hôi nöôùc ôû aùp suaát 1 atm/30 phuùt. Löôïng gioáng caáy vaøo chieám 1 - 5% theå tích moâi tröôøng. Sau 48 - 72giôø nuoâi caáy treân maùy laéc coù taàn soá 120 - 200voøng/phuùt hoaëc trong caùc thuøng leân men ñöôïc caáp 1 - 2lít khoâng khí cho moãi lít moâi tröôøng, nhieät ñoä nuoâi caáy 30 - 47oC, maät ñoä vi khuaån coù theå ñaït 109 - 1010teá baøo/ml. caùc chuûng vi khuaån khaùc nhau ñöôïc nuoâi caáy rieâng leû 32 roài chuyeån moät caùch voâ truøng vaøo chung moät boàn chöùa. Töø ñaây chuùng tieâm vaøo caùc chaát mang ñaõ ñöôïc thanh truøng tröôùc ñeå taïo saûn phaåm. Moãi hecta gieo troàng söû duïng 500 - 800gram saûn phaåm. Chaát mang ñöôïc söû duïng trong quy trình naøy laø than buøn troän vôùi chaát höõu cô theo tyû leä 1 : 1, nghieàn mòn qua raây 0,1mm, caùc tuùi chaát mang ñöôïc thanh truøng tia γ vôùi lieàu chieáu xaï – 45 KGY. à Giaûi phaùp höõu ích HI0131 [7] Ñaây laø moät quy trình saûn xuaát cheá phaåm ñaïm sinh hoïc töø Azospirillum lipoferum. Quy trình naøy ñöôïc goïi laø giaûi phaùp höõu ích, vì noù ít tieâu toán ñieän naêng, khoâng ñoøi hoûi chi phí ñaàu tö lôùn, thích hôïp ñeå saûn xuaát phaân vi sinh vôùi quy moâ gia ñình, ôû caùc vuøng saâu, vuøng xa, vuøng nuùi. ÔÛ quy trình naøy, caùc chuûng vi khuaån thuoäc Azospirillum lipoferum ñöôïc baûo quaûn trong nhöõng loï thuûy tinh ñaëc bieät ñeå coù theå baûo quaûn ñöôïc trong ñieàu kieän bình thöôøng moät thôøi gian daøi (khoaûng 12 thaùng). Moâi tröôøng nhaân sinh khoái ñöôïc phaân vaøo caùc chai thuûy tinh daân duïng nhö chai bia, chai nöôùc ngoït... Löôïng moâi tröôøng chieám khoaûng 2/3 theå tích moãi chai. Thanh truøng nhöõng chai naøy baèng noài aùp suaát daân duïng trong khoaûng thôøi gian 60phuùt keå töø luùc soâi. Sau khi thanh truøng, ñeå nguoäi, caáy gioáng vi khuaån Azospirillum vaø ñeå vaøo nôi thoaùng maùt trong nhaø. Sau 24giôø laáy ra laéc maïnh ñeå troän ñeàu moâi tröôøng nuoâi caáy. Tieáp tuïc ñeå vaøo choã cuõ 24 - 48giôø sau ta thu ñöôïc dòch sinh khoái vi khuaån coù maät ñoä 108 - 109teá baøo/ml. Dòch naøy coù theå baûo quaûn ñöôïc trong ñieàu kieän bình thöôøng ñöôïc 20 - 30ngaøy sau. Coù theå duøng dòch sinh khoái vi khuaån treân ñeå troän vaøo maàm maï tröôùc khi gieo, hoà reã maï tröôùc khi caáy hoaëc troän vôùi hoãn hôïp ñaát boät - phaân chuoàng hoai (tyû leä 1 : 1) hoaëc hoãn hôïp than buøn-phaân höõu cô (tyû leä 1 : 1) ñeå taïo ra cheá phaåm phaân vi sinh vaät coá ñònh ñaïm töông töï nhö Azogin. Cheá phaåm Rizolu ñaõ ñöôïc thöû nghieäm laàn ñaàu vaøo vuï muøa 1991 taïi caùnh ñoàng thí nghieäm cuûa Vieän Khoa hoïc kyõ thuaät VN - An Khaùnh (Hoaøi Ñöùc, Haø 33 Taây) vaø moät soá vuøng khaùc ôû ngoaïi thaønh Haø Noäi ñaõ thu ñöôïc nhöõng keát quaû böôùc ñaàu raát khaû quan : maï ñöôïc xöû lyù Rizolu coù chieàu cao hôn ñoái chöùng khoaûng 0,5 - 1,5cm, maøu xanh ñaäm hôn, cöùng caây hôn, laù to baûn hôn, boä reã phaùt trieån toát hôn... Vuï muøa 1992 coù moät soá nôi ñaõ söû duïng ñaïi traø cheá phaåm Rizolu ñeàu coù cuøng nhaän xeùt nhö caùc nôi thí nghieäm vuï muøa 1991. Keát quaû aûnh höôûng cuûa Rizolu leân luùa ôû thôøi kyø baét ñaàu laøm ñoøng thu ñöôïc ôû vuï muøa 1992 cho thaáy luùa ñöôïc nhieãm Rizolu ñeû nhaùnh taêng hôn khoaûng 9 - 20% so vôùi ñoái chöùng. Ñoàng thôøi chieàu cao caây cuõng taêng khoaûng 8%. Vuï muøa xuaân 1993 caùc tyû leä naøy taêng keùm hôn so vôùi vuï muøa, do nhieät ñoä khoâng khí trong thôøi gian naøy thaáp (15 - 20oC) thaáp hôn nhieàu so vôùi nhieät ñoä vuï muøa (25 -32oC) neân taùc duïng Azospirillum khoâng bieåu hieän maïnh nhö ôû vuï muøa 1992. Nhöõng keát quaû veà nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa cheá phaåm Rizolu leân luùa giai ñoaïn thu hoaïch cuõng ñaõ thu ñöôïc nhö sau : soá löôïng boâng treân moãi khoùm cuûa maãu thí nghieäm vaø ñoái chöùng cheânh leäch nhau khoâng ñaùng keå, coù nhöõng maãu baèng nhau. Toång soá haït leùp giaûm ñi ôû nhöõng caây coù nhieãm Rizolu so vôùi nhöõng caây khoâng nhieãm laø nhöõng yeáu toá ñoùng goùp ñaùng keå taïo neân söï taêng naêng suaát haït. Haït cuûa nhöõng caây ñöôïc nhieãm cheá phaåm thöôøng saùng maøu hôn, maûy hôn. Nhieãm Azospirillum laøm kích thích söï naûy maàm sôùm, taêng ñeû nhaùnh vaø taêng ñoä chaéc cuûa haït cuøng vôùi naêng suaát haït taêng, troïng löôïng khoâ cuûa caây vaø reã cuõng taêng. Nhöõng nôi söû duïng cheá phaåm treân dieän roäng hôn cuõng cho nhaän xeùt toát veà hình thaùi maï vaø naêng suaát luùa taêng töø 5 - 25%. Tuøy theo gioáng luùa khaùc nhau, ñoàng ñaát khaùc nhau maø naêng suaát taêng theo tyû leä khaùc nhau khi nhieãm cheá phaåm Rizolu. 34 CHÖÔNG 2 VAÄT LIEÄU-NOÄI DUNG VAØ PHÖÔNG PHAÙP 35 2.1. VAÄT LIEÄU 2.1.1. Thieát bò vaø duïng cuï Ngoaøi caùc thieát bò vaø duïng cuï caàn thieát cuûa Phoøng Thí nghieäm Vi sinh coøn caàn caùc thieát bò vaø duïng cuï chuyeân duïng sau : - Maùy ly taâm (Hettich Zentrifugen – Mikro22R). - Maùy quang phoå (Thermo - Biomate3). - Boä chöng caát ñaïm cuûa haõng Gerhardt goàm ba boä phaän. + Coâng phaù maãu (Kjeldatherm). + Chöng caát (Vapodest). + Boä huùt (Turbosog). - Lux keá (Tes 1330). - Maùy ño ñoä aåm (Denver instrument - IR200). 2.1.2. Hoùa chaát vaø moâi tröôøng Hoùa chaát Thuoác nhuoäm tieân mao : thuoác nhuoäm Nishizawa Kaghen [2]. Caùc hoùa chaát söû duïng trong phöông phaùp Kjeldahl [13]. Thuoác thöû söï hieän dieän nitrite trong moâi tröôøng : thuoác thöû tinh boät – iode. Thuoác thöû khaû naêng sinh toång hôïp IAA : thuoác thöû Salkowski [26]. Moâi tröôøng - Moâi tröôøng phaân laäp vaø laøm thuaàn ∗ Moâi tröôøng voâ ñaïm NFb (nitrogen - fixing broth) (MT1) [21] Thaønh phaàn moâi tröôøng (g/l) D,L malic acid 5,0 K2HPO4 0,5 MgSO4.7H2O 0,2 CaCl2 0,02 36 NaCl 0,1 Bromothymol blue (0.5%) trong KOH 0.2M 2ml Dung dòch vitamin(1) 1ml Dung dòch khoaùng vi löôïng(2) 2ml 1,64% dung dòch FeEDTA 4ml KOH 4,5 Agar 0,0175 - 0,5% pH 6,5 (1)Trong 100ml, dung dòch vitamin chöùa : Biotin 10mg Pyridoxol-HCl 20mg Hoaø tan trong chaäu nöôùc 100oC (2) Trong 1lít, dung dòch khoaùng vi löôïng chöùa : CuSO4.5H2O 40mg ZnSO4.7H2O 0,12g H3BO3 1,4g Na2MoO4 1,0g MnSO4.H2O 1,175g ∗ Moâi tröôøng NFb raén coù boå sung congo ñoû (MT2) Moâi tröôøng naøy coù thaønh phaàn cô baûn laø moâi tröôøng ñaëc (15g agar/l) NFb coù boå sung 15ml dung dòch ñoû congo 0,25% vaø cao naám men 50mg/lít moâi tröôøng. - Moâi tröôøng nuoâi caáy Moâi tröôøng Dobereiner vaø coäng söï (1976) (g/l) (MT3) [7] Acid malic 5,0 KH2PO4 0,4 MgSO4.7H2O 0,2 37 NaCl 0,1 CaCl2 .7H2O 0,02 FeCl3.6H2O 0,01 Na2MoO4 0,002 Bromothymol blue (0,5%) 2ml KOH 4,0 Agar 1,75 pH 6,8 - Moâi tröôøng voâ ñaïm thöû khaû naêng söû duïng nguoàn carbon [23] Moâi tröôøng baùn loûng NFb thay acid malic baèng caùc hôïp chaát laøm nguoàn carbon : glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin. - Moâi tröôøng dòch theå thöû khaû naêng söû duïng nguoàn carbon Moâi tröôøng Andrade (MT4) [2] Dung dòch chæ thò maøu : hoøa 0,5g fuchsin acid vaøo 100ml nöôùc caát, theâm 16,4ml NaOH 1N, khöû truøng 5phuùt ôû 110oC. Moâi tröôøng cô baûn (g/l) Pepton 10 NaCl 5 Ñöôøng 5 pH 7,6 Dung dòch ñöôøng, moâi tröôøng cô baûn vaø dung dòch chæ thò maøu ñöôïc khöû truøng rieâng bieät. Moãi bình ñöïng 100ml moâi tröôøng cô baûn, sau khi khöû truøng boå sung theâm 1ml dung dòch chæ thò maøu vaø 0,5g nguoàn ñöôøng. Phaân phoái moâi tröôøng vaøo caùc oáng nghieäm voâ truøng, moãi oáng 3 - 5ml (trong coù chöùa oáng Durham). Moâi tröôøng tröôùc khi caáy coù maøu vaøng coû saùng (gaàn nhö trong suoát). Neáu coù maøu hoàng nhaït thì phaûi ñieàu chænh laïi baèng NaOH voâ truøng. 38 - Moâi tröôøng nuoâi caáy thöû khaû naêng khöû nitrate (MT5) Söû duïng moâi tröôøng cao thòt – pepton boå sung 0,2% KNO3 [5] Moâi tröôøng cao thòt – pepton (g/l) Cao thòt 3 Pepton 10 NaCl 5 pH 6,0 - Moâi tröôøng nuoâi caáy khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH vaø nhieät ñoä ñeán söï sinh tröôûng cuûa Azospirillum : Moâi tröôøng Dobereiner - Moâi tröôøng troàng luùa trong oáng nghieäm Moâi tröôøng MS (Murashige & Skoog) (MT6) [14] Khoaùng ña löôïng Haøm löôïng sau cuøng (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 Khoaùng vi löôïng Haøm löôïng sau cuøng (mg/l) H3BO3 6,2 MnSO4.4H2O 22,3 ZnSO4.4H2O 8,6 KI 0,83 NaMoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Fe-EDTA Haøm löôïng sau cuøng (mg/l) 39 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Vitamin MS Haøm löôïng sau cuøng (mg/l) Glysin 2 Thiamin HCl 0,1 Acid nicotinic 0,5 Pyrodoxin 0,5 Agar 7 - 8g/l pH 5,8 2.1.3. Vaät lieäu thí nghieäm Œ Gioáng Gioáng vi khuaån Azospirillum ñöôïc phaân laäp töø ñaát troàng luùa ôû An Giang. Gioáng luùa söû duïng trong caùc thí nghieäm laø gioáng OM4495. Gioáng caûi thìa do coâng ty TNHH-TMSX-Haït gioáng Höng Noâng-Soá 49-Bình Taây-P1-Q6-TPHCM cung caáp. Œ Ñaát Luùa trong chaäu vaø ngoaøi ruoäng ñöôïc troàng treân ñaát ñeâ bao thuoäc huyeän Chôï Môùi, tænh An Giang. Ñaát troàng rau thuoäc loaïi ñaát xaùm baïc maøu, thaønh phaàn cô giôùi nheï, caùt nhieàu thuoäc quaän Taân Bình, Tp Hoà Chí Minh. Œ Than buøn Than buøn duøng trong nghieân cöùu ñöôïc khai thaùc ôû huyeän Tri Toân, tænh An Giang. 2.2. Noäi dung vaø phöông phaùp nghieân cöùu 2.2.1. Phaân laäp Moâi tröôøng söû duïng ñeå phaân laäp laø moâi tröôøng NFb baùn loûng (MT1). Taát caû caùc loaøi cuûa vi khuaån Azospirillum ñeàu coù theå phaùt trieån treân moâi tröôøng MT1 40 vaø khi phaùt trieån chuùng hình thaønh moät lôùp vaùng moûng phía döôùi beà maët moâi tröôøng. Moâi tröôøng NFb raén (MT2) duøng ñeå nhaän dieän khuaån laïc cuûa Azospirillum treân ñóa petri : Azospirillum seõ taïo khuaån laïc ñoû töôi hoaëc ñoû ñaäm do chuùng coù khaû naêng haáp thu congo ñoû, trong khi ñoù caùc vi sinh vaät ñaát khaùc khoâng coù khaû naêng haáp thu congo ñoû neân khuaån laïc khoâng coù maøu ñoû. Tieán trình phaân laäp [21] : Nghieàn ñaát vuøng reã, hoøa vôùi nöôùc caát voâ truøng. OÁng nghieäm nhoû (khoaûng 10ml) chöùa 5ml NFb baùn loûng voâ ñaïm cho nhieãm vôùi huyeàn phuø ñaát vuøng reã. Sau khi uû 30oC 3 ngaøy, coù söï hình thaønh vaùng moûng. Söû duïng lôùp vaùng naøy ñeå phaân laäp baèng caùch traûi dòch vi khuaån treân moâi tröôøng NFb raén (MT2). UÛ 3 ngaøy nhaän thaáy treân moâi tröôøng xuaát hieän 2 daïng khuaån laïc coù maøu saéc khaùc nhau : traéng vaø ñoû. Nhöõng khuaån laïc maøu ñoû coù theå laø khuaån laïc cuûa vi khuaån Azospirillum. Thuaàn khieát gioáng Caùc daïng khuaån laïc maøu ñoû vöøa phaân laäp seõ tieáp tuïc ñöôïc laøm thuaàn : Huyeàn phuø teá baøo vi khuaån trong nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng vaø traûi dòch pha loaõng leân ñóa petri moâi tröôøng, uû ôû 30oC trong 3 ngaøy. Sau khi uû, choïn caùc khuaån laïc ñoû ñaëc tröng vaø tieáp tuïc caáy ria treân moâi tröôøng ñeán khi bieåu hieän moät daïng khuaån laïc ñoàng nhaát. Ñeå xaùc ñònh gioáng thuaàn khieát khi tieán haønh quan saùt döôùi kính hieån vi qua hình daïng cuûa vi khuaån vaø nhuoäm Gram. Choïn khuaån laïc töø gioáng thuaàn khieát, caáy ria treân oáng thaïch nghieâng chöùa moâi tröôøng Dobereiner, uû ôû 30oC. Sau 3 ngaøy khi khuaån laïc phaùt trieån ñaày oáng thaïch, ñem caát giöõ trong tuû laïnh 10oC ñeå söû duïng cho nhöõng thí nghieäm tieáp theo. Ñoàng thôøi tieán haønh giöõ gioáng baèng caùch caáy truyeàn gioáng trong thaïch nghieâng 41 ñònh kyø moãi thaùng moät laàn hoaëc baûo quaûn gioáng trong dung dòch glycerine 40% (phöông phaùp laïnh ñoâng). 2.2.2. Tuyeån choïn chuûng Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát ™ Khaû naêng coá ñònh ñaïm vi khuaån Xaùc ñònh khaû naêng coá ñònh ñaïm cuûa caùc chuûng vi khuaån baèng phöông phaùp ñònh löôïng ñaïm toång soá - Kjeldahl. Chuûng vi khuaån ñöôïc nuoâi caáy trong caùc bình coù chöùa 100ml moâi tröôøng voâ ñaïm - Dobereiner. Sau 7 ngaøy laáy dòch nuoâi caáy voâ cô hoùa vaø xaùc ñònh ñaïm toång soá. Löôïng ñaïm xaùc ñònh ñöôïc chính laø löôïng ñaïm do vi khuaån coá ñònh ñöôïc sau 7 ngaøy nuoâi caáy. ™ Khaû naêng sinh IAA cuûa vi khuaån IAA hay coøn goïi laø β-indole acetic acid hay indole-3-acetic acid thuoäc nhoùm auxin. Tryptophan laø moät amino acid coù theå bò oxy hoùa bôûi moät soá vi sinh vaät coù heä enzyme tryptophanase taïo neân saûn phaåm chöùa goác indole. Saûn phaåm trung gian chính cuûa phaûn öùng oxy hoùa tryptophan laø indole pyruvic acid - IPA. Phaân töû naøy sau ñoù bò bieán ñoåi theo höôùng loaïi boû nhoùm amin thaønh indole hoaëc theo höôùng loaïi nhoùm carboxyl thaønh skatol. Tryptophanase xuùc taùc phaûn öùng loaïi nhoùm amin thaønh indole. Döïa vaøo ñaëc ñieåm tryptophan laø tieàn chaát ñeå toång hôïp neân IAA, ngöôøi ta ñaõ ñöa ra nhieàu phöông phaùp nhaèm xaùc ñònh söï hieän dieän cuõng nhö haøm löôïng IAA ñöôïc toång hôïp. Chuùng toâi choïn phöông phaùp hoùa hoïc ñeå phaùt hieän IAA thoâng qua thuoác thöû Salkowski (IAA cho maøu hoàng nhaït vôùi FeCl3). y Ñònh tính 42 Vi khuaån ñöôïc caáy treân moâi tröôøng Dobereiner raén coù boå sung 0,01% tryptophan. Ñaët giaáy loïc voâ truøng leân treân veát caáy. UÛ ôû 30oC. Sau 3 ngaøy, laáy giaáy loïc ra ñaët leân giaáy loïc khaùc ñaõ baõo hoøa trong thuoác thöû Salkowski. Thaønh phaàn thuoác thöû Salkowski : FeCl3 0,5M 15ml H2SO4 98% 300ml Nöôùc caát 500ml Thuoác thöû sau khi pha xong caàn baûo quaûn trong bình maøu toái. Xem keát quaû sau 30phuùt. Vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp IAA seõ hieän maøu hoàng vôùi thuoác thöû. Ñoái chöùng 1 : giaáy loïc ñaët treân ñóa moâi tröôøng khoâng coù vi khuaån, ñoái chöùng 2 : IAA chuaån noàng ñoä 1000ppm. y Ñònh löôïng - Döïng ñoà thò chuaån Caân chính xaùc 25000μg IAA chuaån hoøa tan vôùi 100ml nöôùc caát ñöôïc dung dòch coù noàng ñoä 250μg/l (dung dòch ban ñaàu). Laáy 1 - 13ml dòch ban ñaàu cho vaøo bình ñònh möùc 100. Laàn löôït caùc bình ñöôïc boå sung nöôùc caát ñeán 100ml. Nhö vaäy caùc bình chöùa dung dòch coù noàng ñoä thay ñoåi töø 2,5μg/ml ñeán 32,5μg/ml. ÔÛ moãi noàng ñoä laáy 2ml vaø theâm vaøo ñoù 8ml thuoác thöû Salkowski (dòch ñoái chöùng laø 2ml nöôùc caát vaø 8 ml thuoác thöû). So maøu ôû böôùc soùng 530nm. Ñoïc chæ soá OD vaø döïng ñöôøng chuaån. - Ñònh löôïng IAA trong dòch nuoâi caáy vi khuaån Caáy vi sinh vaät treân moâi tröôøng Dobereiner coù boå sung 0,01% tryptophan, laéc lieân tuïc 120voøng/phuùt ôû 30oC. Qua moãi ngaøy ñem dòch ly taâm 3500voøng/phuùt trong 20phuùt ñeå thu laáy dòch trong. Laáy 2ml dòch trong cho vaøo 8ml thuoác thöû Salkowski (dòch ñoái chöùng laø 2ml nöôùc caát vaø 8ml thuoác thöû Salkowski), so maøu treân maùy quang phoå ôû böôùc soùng 530nm (IAA cho maøu hoàng nhaït vôùi FeCl3). Ñoái 43 chieáu vaøo ñoà thò chuaån ñeå xaùc ñònh löôïng IAA sinh ra trong quaù trình nuoâi caáy. Haøm löôïng IAA tính theo ñôn vò μgIAA/ml. 2.2.3. Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng ñöôïc choïn ™ Ñaëc ñieåm hình thaùi: y Quan saùt ñaïi theå Chuaån bò caùc ñóa petri chöùa moâi tröôøng Dobereiner coù ñoä daøy 5mm. Sau khi laøm khoâ beà maët thaïch caáy vi khuaån. Nuoâi caáy ôû 30oC. Quan saùt khuaån laïc sau 5 ngaøy. y Quan saùt vi theå à Hình daïng : Caáy vi khuaån töø moâi tröôøng thaïch nghieâng (moâi tröôøng Dobereiner) vaøo oáng nghieäm chöùa 5ml moâi tröôøng Dobereiner baùn loûng. Nuoâi caáy treân maùy laéc vôùi toác ñoä 130voøng/phuùt ôû nhieät ñoä 30oC. Quan saùt hình daïng vaø ño kích thöôùc teá baøo vi khuaån sau 24giôø nuoâi caáy döôùi kính hieån vi thoâng qua tieâu baûn nhuoäm ñôn. à Nhuoäm Gram Döïa vaøo khaû naêng baét maøu vôùi caùc thuoác nhuoäm tím keát tinh vaø iode, taát caû caùc vi khuaån ñöôïc chia thaønh 2 nhoùm lôùn. Nhoùm giöõ ñöôïc phöùc chaát taïo thaønh giöõa tím keát tinh vaø iode khi xöû lyù baèng alcool laø nhöõng vi khuaån Gram döông, nhoùm khoâng coù khaû naêng giöõ ñöôïc phöùc chaát naøy vaø bò maát maøu khi xöû lyù baèng alcool laø nhöõng vi khuaån Gram aâm. Duøng que caáy laáy moät ít nöôùc caát voâ truøng ñaët leân phieán kính. Töø moâi tröôøng ñaëc duøng que caáy khöû truøng ñeå nguoäi, laáy vi khuaån Gram döông - Staphylococcus, laøm huyeàn troïc vi truøng vaøo gioït nöôùc treân phieán kính, baét ñaàu ôû bìa gioït nöôùc ñeå coù huyeàn troïc vöøa ñuû ñaäm ñaëc. Duøng que caáy laáy vi khuaån ñang 44 khaûo saùt hoøa troän vaøo vi khuaån trong gioït nöôùc treân phieán kính. Daøn moûng thaønh veát boâi. Coá ñònh nheï treân ngoïn löûa. Tieán haønh nhuoäm tieâu baûn. à Khaû naêng di ñoäng Vi khuaån ñöôïc nuoâi caáy treân moâi tröôøng dòch theå 18giôø. Hoøa dòch vi khuaån vaøo oáng nöôùc muoái sinh lyù voâ truøng. Sau 30phuùt laøm tieâu baûn gioït treo ñeå xem khaû naêng di ñoäng cuûa vi khuaån. Tieán haønh nhuoäm tieân mao theo phöông phaùp Nishizawa Kaghen [2] ñeå xaùc ñònh vi khuaån ñôn mao hay ña mao. ™ Ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa y Quan heä vôùi oxy : Chuaån bò caùc oáng nghieäm chöùa 10ml moâi tröôøng Dobereiner thaïch ñöùng. Duøng que caáy thaúng caáy thaúng töø treân maët thaïch vaøo oáng moâi tröôøng ngaäp ñeán 2/3 oáng. UÛ 30oC. Sau 72giôø ñoïc keát quaû : vi khuaån hieáu khí baét buoäc chæ phaùt trieån treân beà maët, vi khuaån kî khí baét buoäc chæ phaùt trieån doïc theo ñöôøng caáy, vi khuaån hieáu khí tuøy yù thì phaùt trieån treân beà maët laãn doïc theo ñöôøng caáy. y Khaû naêng söû duïng moät soá nguoàn carbon Khaû naêng ñoàng hoùa vaø leân men caùc nguoàn thöùc aên carbon ôû caùc loaïi vi khuaån khaùc nhau laø khoâng gioáng nhau. Ngöôøi ta coi ñoù laø moät trong nhöõng ñaëc tính quan troïng ñöôïc söû duïng khi ñònh danh vi khuaån. Cô sôû cuûa quaù trình naøy laø nuoâi caáy vi khuaån treân caùc moâi tröôøng chöùa nguoàn carbon khaùc nhau, xaùc ñònh söï phaùt trieån cuûa vi khuaån qua söï ñoåi maøu cuûa moâi tröôøng vôùi söï hieän dieän cuûa chaát chæ thò maøu. à Khaû naêng söû duïng nguoàn carbon treân moâi tröôøng voâ ñaïm Caáy vi khuaån vaøo moâi tröôøng dòch theå voâ ñaïm - NFb vôùi D,L- malat ñöôïc thay baèng glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin. Sau 48giôø nuoâi caáy quan saùt söï ñoåi maøu cuûa chæ thò pH - Bromothymol blue trong moâi tröôøng vaø tieán haønh ño trò soá maät ñoä quang. Vi khuaån phaùt trieån laøm acid hoùa moâi tröôøng 45 (pH<6), moâi tröôøng seõ chuyeån töø maøu xanh laù caây sang vaøng. Ngöôïc laïi, vi khuaån phaùt trieån laøm kieàm hoùa moâi tröôøng (pH>7,6), moâi tröôøng seõ chuyeån töø maøu xanh laù caây sang maøu xanh döông. à Khaû naêng söû duïng nguoàn carbon treân moâi tröôøng dòch theå Andrade Caáy vi khuaån vaøo moâi tröôøng dòch theå Andrade vôùi caùc loaïi ñöôøng ñöôïc thay ñoåi laø glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin. Quan saùt söï ñoåi maøu cuûa chæ thò fuchsin acid boå sung vaøo moâi tröôøng sau 48giôø nuoâi caáy. Neáu vi khuaån coù khaû naêng phaùt trieån treân moâi tröôøng naøy seõ laøm moâi tröôøng chuyeån töø maøu vaøng sang maøu hoàng do coù söï acid hoùa moâi tröôøng laøm ñoåi maøu cuûa chaát chæ thò. y Khaû naêng khöû nitrate Vieäc khöû nitrate thaønh nitrite xaûy ra ôû caùc vi sinh vaät saûn sinh enzyme nitratereductase vaø söû duïng nitrate ñeå laøm nguoàn thöùc aên nitô. Ñoâi khi coù tröôøng hôïp khöû nitrate ñeán nitrogen phaân töû. Khaû naêng khöû nitrate ñöôïc thaáy roõ trong moâi tröôøng cao thòt – pepton boå sung 0,2% KNO3 (MT5). Trong moâi tröôøng cao thòt - pepton vôùi 0,2% KNO3, neáu vi khuaån coù khaû naêng khöû nitrate thaønh nitrite thì chuùng seõ laøm ñuïc moâi tröôøng. Nitrite seõ ñöôïc phaùt hieän baèng phaûn öùng tinh boät - iode vôùi nitrite (phaûn öùng taïo maøu xanh lam). Neáu vi khuaån coù khaû naêng khöû nitrate tôùi nitô phaân töû thì seõ laøm ñuïc moâi tröôøng vaø coù boït khí trong oáng Durham. Phaân boá moâi tröôøng MT5 vaøo caùc oáng nghieäm coù chöùa caùc oáng Durham, haáp khöû truøng 1atm/15 phuùt. Caáy vi khuaån nghieân cöùu vaøo moâi tröôøng. Nuoâi caáy 4 ngaøy. Quan saùt khaû naêng khöû nitrate thaønh nitrite. Neáu phaûn öùng vôùi tinh boät - iode, tieáp tuïc theo doõi ñeán 8 ngaøy xem vi khuaån coù khöû nitrite ñeán nitrogen phaân töû. 46 2.2.4. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån 2.2.4.1. Chuaån bò y Khöû truøng vaø uû haït luùa Choïn haït luùa ñeàu nhau, chaéc, khoâng veát moác. Ngaâm haït trong nöôùc maùy 24giôø. Röûa baèng nöôùc maùy nhieàu laàn. Röûa baèng xaø phoøng loaõng. Röûa laïi baèng nöôùc maùy nhieàu laàn. Lau haït baèng boâng goøn thaám nöôùc. Röûa laïi baèng nöôùc maùy. Sau ñoù thöïc hieän trong ñieàu kieän voâ truøng : röûa saïch baèng nöôùc caát voâ truøng 2 laàn. Khöû maãu baèng alcool 70o, laéc 3 - 5phuùt, loaïi boû coàn. Khöû maãu tieáp baèng Javel pha loaõng vôùi nöôùc caát voâ truøng theo tyû leä (1 : 1), theâm 2 - 3 gioït Tween 80, laéc lieân tuïc trong 30phuùt. Röûa laïi baèng nöôùc caát voâ truøng cho ñeán khi saïch maãu. Cho haït vaøo phoøng aåm (ñóa petri chöùa giaáy thaám voâ truøng ñöôïc taåm öôùt baèng nöôùc caát voâ truøng). UÛ ôû 30oC ñeán khi haït naûy maàm khoaûng 1cm (khoaûng 3 ngaøy). y Chuaån bò dòch nuoâi caáy vi khuaån Caáy dòch vi khuaån ñaõ ñöôïc hoaït hoùa 24giôø vaøo moâi tröôøng Dobereiner, uû 30oC. 48giôø thu dòch sinh khoái. Ñoàng thôøi xaùc ñònh maät ñoä teá baøo trong dòch nuoâi caáy baèng phöông phaùp ñeám khuaån laïc treân moâi tröôøng Dobereiner thaïch ñóa theo coâng thöùc : Mi (CFU/ml) = Ai * Di / V Ghi chuù : Mi : maät ñoä teá baøo trong 1 ml dòch nuoâi caáy Ai : soá khuaån laïc trung bình treân ñóa Di : ñoä pha loaõng V : dung tích huyeàn phuø teá baøo cho vaøo moãi ñóa (ml) y Khaûo saùt thôøi gian thích hôïp nhieãm dòch nuoâi caáy vi khuaån ñaït hieäu quaû 47 Duøng 10ml dòch nuoâi caáy vi khuaån uû cho 30 haït luùa naûy maàm. Ñoái chöùng laø haït ñöôïc ngaâm trong moâi tröôøng MT3. Taïi caùc thôøi ñieåm 0, 3, 6, 9, 12giôø caáy caùc haït luùa ñöôïc uû vaøo moâi tröôøng MS vaø nuoâi vôùi ñieàu kieän aùnh saùng 2000lux, nhieät ñoä 25oC. Sau 7 ngaøy tieán haønh ño chieàu cao caây maï ôû caùc loâ thí nghieäm. 2.2.4.2. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån treân caây maï trong oáng nghieäm, caây luùa trong chaäu vaø caây luùa ngoaøi ruoäng : y Caây maï trong oáng nghieäm Muïc ñích cuûa thí nghieäm trong oáng nghieäm nhaèm khaûo saùt aûnh höôûng cuûa vi khuaån treân caây maï. Caáy vi khuaån vaøo moâi tröôøng MT3, uû 30oC. Ñoàng thôøi khöû truøng vaø uû haït luùa. Sau 2 ngaøy, khi coù reã vaø thaân maàm, vi khuaån ñöôïc 48giôø, tieán haønh ñeám soá löôïng teá baøo tröôùc khi cho haït maàm nhieãm dòch vi khuaån. Sau khi ngaâm ñöôïc 3giôø (thôøi gian thích hôïp ñeå nhieãm dòch vi khuaån ñaït hieäu quaû), caáy haït maàm vaøo oáng nghieäm chöùa moâi tröôøng MS. Kích thöôùc oáng nghieäm : φ25 Löôïng moâi tröôøng trong moãi oáng nghieäm : 15ml Gioáng luùa : OM4495 Maät ñoä : 1 caây/ oáng nghieäm (15 caây/1 loâ) Ñòa ñieåm thí nghieäm : tuû löôùi ôû Phoøng Thí nghieäm Vi sinh tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân ñöôïc trang bò heä thoáng ñeøn neon chieáu saùng 18giôø/ ngaøy, ñoä chieáu saùng 2000lux, nhieät ñoä 25oC. Thí nghieäm coù 5 loâ. Caùc loâ thí nghieäm : ‚ Loâ 1 : moâi tröôøng MS voâ ñaïm, haït maàm khoâng nhieãm vi khuaån. ‚ Loâ 2 : moâi tröôøng MS voâ ñaïm, haït maàm nhieãm vi khuaån. 48 ‚ Loâ 3 : moâi tröôøng MS ¼ ñaïm, haït maàm nhieãm vi khuaån. ‚ Loâ 4 : moâi tröôøng MS ½ ñaïm, haït maàm nhieãm vi khuaån. ‚ Loâ 5 : moâi tröôøng MS nguyeân ñaïm, haït maàm khoâng nhieãm vi khuaån. à Chæ tieâu theo doõi : - Chieàu daøi laù (mm) - Troïng löôïng khoâ caây maï (mg) - Chieàu daøi reã (mm) - Toång soá reã - Haøm löôïng ñaïm toång soá (mg N / 1kg maãu) baèng phöông phaùp Kjeldahl. à Xöû lyù soá lieäu : phaàn meàm EXCEL 2003 vaø MSTATC. Soá lieäu laø trung bình coäng cuûa 15 caây, 3 laàn laëp laïi. y Caây luùa trong chaäu Muïc ñích cuûa thí nghieäm trong chaäu laø trieån khai roäng caùc thí nghieäm trong oáng nghieäm trong ñieàu kieän töï nhieân coù taùc ñoäng nhieàu yeáu toá veà ñaát ñai vaø thôøi tieát, ñoàng thôøi theo doõi ñöôïc caùc giai ñoaïn sau thôøi kyø caây maï. Chuùng toâi tieán haønh phaân laäp maãu ñaát tröôùc vaø sau khi gieo troàng ñeå xaùc ñònh söï hieän dieän chuûng khaûo saùt toàn taïi trong ñaát. Caáy vi khuaån vaøo moâi tröôøng MT3, uû 30oC. Ñoàng thôøi khöû truøng vaø uû haït luùa. Sau 2 ngaøy, khi coù reã vaø thaân maàm, vi khuaån ñöôïc 48giôø tuoåi, tieán haønh ñeám soá löôïng teá baøo tröôùc khi cho haït maàm nhieãm dòch nuoâi caáy vi khuaån. Sau khi ngaâm ñöôïc 3giôø (thôøi gian thích hôïp ñeå nhieãm dòch nuoâi caáy vi khuaån ñaït hieäu quaû), caáy haït maàm vaøo chaäu ñaát ñaët ôû vöôøn tröôøng. Chaäu ñaát : hình truï ñöùng, ñaùy hình troøn, ñöôøng kính ñaùy 30cm, chieàu cao 20cm. Löôïng ñaát trong moãi chaäu : 15kg ; Chieàu cao coät ñaát : 17cm Gioáng luùa : OM4495 Maät ñoä :3 caây/chaäu (30 caây/1 loâ thí nghieäm) 49 Ñòa ñieåm thí nghieäm : Vöôøn Thí nghieäm Khoa Sinh Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm TpHCM. Ngaøy gieo: 15 thaùng 11 naêm 2004. Thí nghieäm ñöôïc theo doõi ñeán luùc thu hoaïch . Thí nghieäm coù 2 loâ. Caùc loâ thí nghieäm : ‚ Loâ 1 : ñaát ñöôïc boùn ½ ñaïm, haït maàm khoâng nhieãm vi khuaån. ‚ Loâ 2 : ñaát ñöôïc boùn ½ ñaïm, haït maàm nhieãm vi khuaån. à Chæ tieâu theo doõi : - Chieàu daøi laù (cm) - Troïng löôïng haït chaéc (g) - Tyû leä ñeû nhaùnh (nhaùnh) - Troïng löôïng haït leùp (g) - Soá boâng (boâng) - Soá löôïng haït chaéc (haït) - Soá löôïng haït leùp (haït) à Xöû lyù soá lieäu : phaàn meàm EXCEL 2003 vaø MSTATC. Soá lieäu laø trung bình coäng cuûa 30 caây, 3 laàn laëp laïi. y Caây luùa ngoaøi ruoäng Keát quaû cuûa thí nghieäm trong chaäu cho chuùng ta bieát ñöôïc raèng vi khuaån coù aûnh höôûng leân caây maï,