Luận văn Khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu và kiểm tra định tính lipid của vi tảo tetraselmis

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT MÔI TRƯỜNG TĂNG TRƯỞNG TỐI ƯU VÀ KIỂM TRA ĐỊNH TÍNH LIPID CỦA VI TẢO TETRASELMIS Ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Sinh viên thực hiện : CAO HOÀNG SƠN Giáo viên hướng dẫn : ThS. LÊ THỊ MỸ PHƯỚC Niên khóa : 2004 - 2009 TP. HỒ CHÍ MINH, 08/2010 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, em xin gởi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể các thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học, các thầy cô trong khoa Khoa Học Ứng Dụng trường ĐH Tôn Đức Thắng, đã tận tình dạy dỗ giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập tại trường. Em xin gửi đến cô, ThS. Lê Thị Mỹ Phước , lời cảm ơn sâu sắc nhất. Cô đã truyền đạt cho em những kiến thức, hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn anh Trương Huy Hoàng, người đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo trong suốt quá trình thực hiện luận văn Chân thành cảm ơn Các anh chị trong phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học - Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã tận tình góp ý, chỉ bảo và tạo điều kiện thuận lợi cho em từ khi mới vào phòng cho đến lúc hoàn thành luận văn. Con xin cảm ơn ba mẹ, cảm ơn dì Minh cùng đại gia đình đã là nguồn động viên tinh thần lớn giúp con vượt qua giai đoạn khó khăn này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: Các bạn lớp 08SH và các em lớp 09SH đã quan tâm, ủng hộ, hỗ trợ và đóng góp ý kiến trong quá trình thực hiện luận văn. Chân thành cảm ơn bạn Lê Ngọc Tuấn đã đồng hành cùng tôi trong suốt thời gian qua! Mặc dù đã nỗ lực, cố gắng hoàn thiện đề tài nhưng không tránh khỏi những sai sót. Rất mong sẽ nhận được những lời góp ý từ quý thầy cô, các anh chị và các bạn để đề tài được hoàn chỉnh hơn. Xin chân thành cảm ơn! Tp. Hồ Chí Minh, tháng 08 năm 2010 Cao Hoàng Sơn Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp i MỤC LỤC Trang Mục lục ........................................................................................................................... i Danh mục bảng .................................................................................................................... v Danh mục hình..................................................................................................................... vi Danh mục biểu đồ .............................................................................................................. vii CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................. 1 1.2. Mục tiêu đề tài...................................................................................... 2 CHƯƠNG 2 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về tảo ................................................................................ 3 2.1.1. Các dạng cấu trúc cơ thể. ............................................................................. 3 2.1.1.1. Cấu trúc đơn giản............................................................................................ 3 2.1.1.2. Cấu trúc amíp.................................................................................................. 4 2.1.1.3. Cấu trúc palmella ............................................................................................ 4 2.1.1.4. Cấu trúc hạt ..................................................................................................... 4 2.1.1.5. Cấu trúc dạng sợi ............................................................................................ 4 2.1.1.6. Cấu trúc dạng bản ........................................................................................... 5 2.1.1.7. Cấu trúc ống (siphon) ..................................................................................... 5 2.1. 2. Thành phần cấu tạo. ..................................................................................... 5 2.1.2.1. Màng tế bào .................................................................................................... 5 2.1.2.2. Chất nguyên sinh ............................................................................................ 6 2.1.2.3. Thể màu và chất dự trữ ................................................................................... 6 2.1.2.4. Không bào....................................................................................................... 6 2.1.2.5. Roi .................................................................................................................. 7 2.1.2.6. Điểm mắt. ...................................................................................................... 7 2.1.3 Sinh sản ......................................................................................................... 7 2.1.3.1 Sinh sản sinh dưỡng. ....................................................................................... 7 2.1.3.2. Sinh sản vô tính .............................................................................................. 8 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp ii 2.1.3.3. Sinh sản hữu tính ........................................................................................... 8 2.1.4. Dinh dưỡng ở tảo .......................................................................................... 10 2.1.4.1. Dinh dưỡng carbon ......................................................................................... 11 2.1.4.2. Dinh dưỡng nitơ .............................................................................................. 13 2.1.4.3. Dinh dưỡng phốt pho ...................................................................................... 16 2.1.4.4. Dinh dưỡng vi lượng ...................................................................................... 16 2.1.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố ngoại cảnh đến sinh trưởng và phát triển của tảo ............................................................................................................... 17 2.1.5.1. Ánh sáng ......................................................................................................... 17 2.1.5.2. Nhiệt độ ......................................................................................................... 18 2.1.5.3. Độ mặn ........................................................................................................... 18 2.1.5.4. Ảnh hưởng của pH. ......................................................................................... 19 2.1.6. Phân bố .......................................................................................................... 20 2.2. Giới thiệu chung về tảo Tetraselmis ........................................................... 21 2.2.1. Vị trí phân loại ................................................................................................ 21 2.2.2. Đặc điểm sinh học ......................................................................................... 21 2.3. Sơ lược về công nghệ sản xuất đại trà vi tảo .............................................. 24 2.3.1. Lịch sử nghiên cứu ......................................................................................... 24 2.3.2. Các kiểu bể nuôi trồng tảo .............................................................................. 25 2.3.2.1. Hệ thống bể nông (shallowponds) ................................................................. 26 2.3.2.2. Hệ thống bể dài (Rayceways) ........................................................................ 26 2.3.2.3. Hệ thống nghiêng (cascade) .......................................................................... 27 2.3.2.4. Hệ thống bể phản ứng quang sinh dạng ống ................................................. 27 2.3.2.5. Hệ thống bể lên men ...................................................................................... 28 2.3.3. Tách sinh khối .............................................................................................. 28 2.3.3.1. Phương pháp li tâm ........................................................................................ 28 2.3.3.2. Phương pháp lọc ............................................................................................. 29 2.3.3.3 Phương pháp tạo bông .................................................................................... 29 2.3.4. Sấy sinh khối ................................................................................................. 30 2.3.4.1. Phương pháp sấy phun .................................................................................... 30 2.3.4.2. Sấy mặt trời..................................................................................................... 31 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp iii 2.3.4.3. Phương pháp sấy đông khô ............................................................................. 31 2.4. Sơ lược về nhiên liệu sinh học ...................................................................... 31 2.4.1. Định nghĩa ..................................................................................................... 31 2.4.2. Phân loại nhiên liệu sinh học ....................................................................... 31 2.4.3. Biodiesel ......................................................................................................... 32 2.4.3.1. Biodiesel là gì? ............................................................................................... 32 2.4.3.2. Lịch sử phát triển của Biodiesel ..................................................................... 32 2.4.3.3. Ưu và nhược điểm của Biodiesel .................................................................... 33 2.4.3.4 Những nguồn nguyên liệu để sản xuất Biodiesel ở Việt Nam ....................... 35 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. VẬT LIỆU VÀ MÔI TRƯỜNG .................................................................. 36 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 36 3.1.2. Địa điểm thí nghiệm .................................................................................... 36 3.1.3. Hóa chất ......................................................................................................... 36 3.1.4. Thiết bị ........................................................................................................... 36 3.1.5. Môi trường .................................................................................................... 37 3.1.5.1. Môi trường F/2 ............................................................................................... 37 3.1.5.2. Môi trường Walne .......................................................................................... 38 3.1.5.3. Môi trường Walne TM ................................................................................... 40 3.1.5.4. Môi trường TT3 .............................................................................................. 41 3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 41 3.2.1. Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm ................................................................ 41 3.2.2. Bố trí thí nghiệm ........................................................................................... 41 3.2.2.1. Thí nghiệm 1 ................................................................................................... 41 3.2.2.2. Thí nghiệm 2 ................................................................................................... 45 3.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu ............................................................. 45 3.3.1. Xác định mật độ tế bào................................................................................. 45 3.3.2. Xác định độ mặn ........................................................................................... 46 3.3.3. Phương pháp định tính lipid........................................................................ 47 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1.................................................................................................. 49 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp iv 4.1.1. Phương trình đường tuyến tính giữa mật độ và độ hấp thu ..................... 49 4.1.2. Tăng trưởng của tảo tetraselmis trên các môi trường thử nghiệm .......... 50 4.1.3. So sánh tăng trưởng của tảo tetraselmis trên 4 môi trường ..................... 54 4.1.4. Thảo luận ...................................................................................................... 55 4.2. Thí nghiệm 2: Kiểm tra định tính lipid ...................................................... 56 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết Luận ....................................................................................................... 58 Đề nghị ........................................................................................................... 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt .......................................................................................... 60 Tài liệu tiếng anh .......................................................................................... 60 Tài liệu Internet ............................................................................................ 60 PHỤ LỤC Phụ lục .......................................................................................................... 62 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp v DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2.1. Danh mục một số nguyên tố cần cho sinh trưởng của tảo .............................. 11 Bảng 2.2 Một số phương pháp sấy sinh khối tảo ........................................................... 30 Bảng 3.1 Thành phần dinh dưỡng của môi trường F/2 .................................................. 37 Bảng 3.2 Thành phần khóang vi lượng đậm đặc của môi trường F/2 ............................ 37 Bảng 3.3 Thành phần vitamin đậm đặc của môi trường F/2 .......................................... 38 Bảng 3.4 Thành phần khoáng vi lượng đậm đặc của môi trường Walne....................... 38 Bảng 3.5 Thành phần vitamin đậm đặc môi trường Walne ........................................... 39 Bảng 3.6 Thành phần dinh dưỡng đậm đặc môi trường Walne ..................................... 39 Bảng 3.7 Thành phần dinh dưỡng môi trường Walne ................................................... 40 Bảng 3.8 Thành phần dinh dưỡng môi trường Walne TM ............................................ 40 Bảng 3.9 Thành phần môi trường TT3 .......................................................................... 41 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp vi DANH MỤC HÌNH Trang Hình 2.1. Cấu trúc mônát dạng đơn bào ......................................................................... 4 Hình 2.1. Cấu trúc dạng hạt ............................................................................................ 4 Hình 2.3 Tảo Chaetophora ............................................................................................. 5 Hình 2.4. Tảo Bryopsis ................................................................................................... 5 Hình 2.5 Sinh sản hữu tính ở Dunaliella ....................................................................... 8 Hình 2.6. Tế bào tảo Tetraselmis dưới vật kính dầu ...................................................... 21 Hình 2.7 Quy trình công nghệ sản xuất đại trà vi tảo .................................................... 25 Hình 2.8. Hệ thống bể dài (rayceways) .......................................................................... 26 Hình 2.9. Mô hình bể nghiêng kiểu shetlik .................................................................... 27 Hình 2.10 Mô hình bể phản ứng quang sinh dạng ống .................................................... 27 Hình 2.11. Mô hình sản xuất tảo sạch vi khuẩn trong hệ thống kín ................................. 28 Hình 3.1 Địa điểm thí nghiệm ....................................................................................... 42 Hình 3.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ................................................................................ 44 Hình 3.3. Nhuộm mẫu tảo với Nile Blue A .................................................................... 45 Hình 3.4. Buồng đếm hồng cầu ..................................................................................... 45 Hình 3.5. Máy đo OD ..................................................................................................... 46 Hình 3.6. Tỷ trọng kế...................................................................................................... 46 Hình 3.7. Công thức Nile Blue A ................................................................................... 47 Hình 3.8. Sơ đồ quang học của máy phân tích hùynh quang ......................................... 47 Hình 4.1 Tetraselmis sau 1 tuần nuôi ............................................................................ 55 Hình 4.2. Định tính lipid trong tetraselmis ..................................................................... 57 Hình 4.3. Mẫu đối chứng ................................................................................................ 57 Hình 4.4. Quy trình sản xuất Biodiesel từ tảo ................................................................ 61 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 4.1 Đường tuyến tính giữa độ hấp thu ánh sáng và mật độ của tảo Tetraselmis .................................................................................... 49 Biểu đồ 4.2 Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên môi trường F/2 ...................... 50 Biểu đồ 4.3 Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên môi trường TT3 .................... 51 Biểu đồ 4.4 Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên môi trường Walne ................. 52 Biểu đồ 4.5 Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên môi trường Walne TM .................................................................................................. 53 Biểu đồ 4.6 Đường cong tăng trưởng của Tetraselmis trên 4 môi trường ......................... 54 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 1 CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Tetraselmis hay còn gọi là platymonas, được biết đến đầu tiên là loài vi tảo biển dùng làm thức ăn có chất lượng cao cho ấu trùng các loài nhuyễn thể như trai, sò, ngao, hàu,…Ngày nay, tảo Tetraselmis được biết đến như là nguồn lipid tự nhiên, với hàm lượng lipid khá lớn, rất thuận lợi để sản xuất nhiên liệu sinh học. Trong bối cảnh hiện nay, cùng với sự phát triển như vũ bão của quá trình công nghiệp hóa là sự khai thác quá mức những nguồn tài nguyên thiên nhiên, đặc biệt là nguồn nhiên liệu hóa thạch, điều đó đã khiến cho nguồn năng lượng truyền thống (dầu mỏ, than đá, khí thiên nhiên) ngày càng cạn kiệt. Cụ thể theo thông tin của EU (tháng 1/2007), tiêu thụ năng lượng toàn cầu sẽ tăng lên gấp đôi từ 10 tỉ tấn quy ra dầu / năm thành 22 tỉ tấn quy ra dầu / năm đến năm 2050. Giáo sư Nghê Duy Đấu, viện sĩ công trình đại học Thanh Hoa (Bắc Kinh) cho biết theo bộ năng lượng Mỹ và ủy ban năng lượng thế giới dự báo nguồn năng lượng hóa thạch không còn nhiều: dầu mỏ còn 39 năm, khí thiên nhiên 60 năm, than đá 111 năm. Theo Trung tâm năng lượng ASEAN nhu cầu tiêu thụ năng lượng của khu vực này năm 2002 là 280 triệu tấn và tăng lên 583 triệu tấn vào năm 2020. Indonesia là nước có nguồn năng lượng hóa thạch lớn nhất trong các nước ASEAN, tuy nhiên hiện nay dầu mỏ dự trữ của họ chỉ còn trong khoảng 25 năm, khí đốt 60 năm và than đá 150 năm. Trước tình hình đó, thì nhiên liệu sinh học được xem như một dạng năng lượng mới đầy tiềm năng bởi khả năng tái tạo của nó và hơn hết đây là nguồn năng lượng “sạch”, không độc hại và dễ dàng phân hủy trong tự nhiên. Có nhiều dạng nhiên liệu sinh học khác nhau, trong đó, tảo nổi lên như một nguyên liệu có triển vọng nhất để sản xuất nhiên liệu sinh học nhờ những đặc điểm nổi bật sau: - Tảo không cạnh tranh với đất trồng cho thực vật - Vòng đời ngắn, năng suất cao, khả năng chuyển hóa cao - Thích hợp với quy mô công nghiệp. - Tảo có thể tồn tại ở bất cứ nơi nào có đủ ánh sáng, kể cả vùng hoang hóa, nước mặn, nước thải, lại có khả năng làm sạch môi trường nước thải. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 2 - Tảo có hàm lượng dầu cao, dùng vi tảo có lợi hơn các loại cây lấy dầu khác do năng suất dầu cao gấp 19 – 23 lần trên cùng một diện tích đất trồng. - Phần sinh khối sau khi chiết lấy dầu là nguồn lợi kinh tế rất lớn. Vì vậy, việc tìm ra môi trường giúp nhân nhanh sinh khối tảo Tetraselmis để sản xuất đại trà là rất cần thiết và đề tài “khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu và kiểm tra định tính lipid của vi tảo Tetraselmis” được tiến hành. Đây là một phần của đề tài trọng điểm ĐHQG của phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học do cô Ths. Lê Thị Mỹ Phước làm chủ nhiệm. 1.2. Mục tiêu đề tài - khảo sát một số môi trường giúp tăng sinh sinh khối tảo tetraselmis. Nhằm xác định môi trường tốt nhất để nuôi trồng tảo tetraselmis phục vụ công tác giữ giống, nghiên cứu loài tảo này trong phòng thí nghiệm và dần tiến xa hơn đến việc nuôi trồng đại trà với quy mô lớn. - Xác định định tính lượng lipid có trong tảo tetraselmis. Nhằm tạo tiền đề cho các đề tài kế tiếp trong việc tạo stress giúp tăng lượng lipid, phục vụ cho đề tài nghiên cứu cấp nhà nước về chiết xuất dầu từ tảo để sản xuất nhiên liệu sinh học (bio diesel). CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 3 CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu chung về tảo Tảo (algae) là một nhóm sinh vật thuộc vào giới thực vật, rất đa dạng, khó định nghĩa một cách thật chính xác. Tảo là những thực vật bậc thấp, nghĩa là những thực vật bào tử, có tản (cơ thể chưa phân thành thân, lá, rễ) tế bào của chúng chứa diệp lục và sống chủ yếu ở trong nước. Tảo có cấu trúc hết sức đa dạng, bao gồm những dạng đơn bào, tập đoàn và đa bào với những loài kích thước lớn và có cấu tạo khác nhau , ví dụ một số lớn tảo nâu (Phaeophycota)có thể đạt kích thước tương đương với một cây nhỏ. Tuy là những sinh vật tương đối đơn giản nhưng ngay trong những tế bào nhỏ nhất cũng có thể thấy sự thể hiện hoàn hảo ở cấp độ tế bào. Khả năng sinh sản và cấu tạo cơ quan sinh sản rất sai khác. Màu sắc của tảo cũng không giống nhau, bởi vì ngoài diệp lục, tảo còn mang nhiều loại chất màu và che khuất diệp lục. Những tảo đang tồn tại không phải là nhóm cơ thể đồng đều, thống nhất về cơ thể và nguồn gốc. Hiện nay tảo được xác nhận là tập hợp của một số ngành thực vật đặc biệt, độc lập về nguồn gốc và tiến hóa. Mỗi một ngành tảo trong hệ thống phân loại tương ứng với ngành vi khuẩn hay ngành nấm. Như vậy, từ “tảo” có ý nghĩa sinh học lớn, bao gồm các thực vật bậc thấp có diệp lục, sống chủ yếu ở trong nước. [3] 2.1.1. Các dạng cấu trúc cơ thể Cơ thể của tảo rất đa dạng, khác nhau về hình thái và kích thước. chỉ ở tảo nâu và tảo hồng, cơ quan dinh dưỡng của chúng có cấu trúc phức tạp , còn các ngành tảo khác cơ thể của chúng rất đơn giản. Trong quá trình của chủng loại phát sinh luôn luôn có sự lặp lại của những dạng cấu trúc đơn giản, chỉ rõ sự tiến hóa của tảo đi từ đơn giản đến phức tạp. 2.1.1.1. Cấu trúc đơn giản (mônat) (từ chữ la tinh monas có nghĩa là đơn độc) Có đặc điểm ở chỗ tế bào có roi. Phần lớn tế bào thường có hai roi (ít khi 1 hay 4 hay nhiều hơn) nên có khả năng di chuyển. tế baò có hình trái xoan thuôn, hình quả lê hay gần như tròn, các dạng khác ít hơn. Tảo có thể là đơn bào hay tập đoàn, được cấu thành từ một số hay nhiều tế bào hầu như giống nhau về hình dạng và chức phận. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 4 cấu trúc monas này quan sát thấy trong suốt cả quá trình dinh dưỡng của những tảo đơn giản , còn ở những tảo có tổ chức cao hơn thường chỉ có ở những giai đoạn sinh sản vô tính (như động bào tử) hay sinh sản hữu tính (giao tử). [3] 2.1.1.2. Cấu trúc amip Một số tảo đơn giản có cấu trúc dạng amip, chúng thiếu màng tế bào cứng, không có roi và chuyển động bằng các chân giả có hình dạng khác nhau (dầy và ngắn hoặc mảnh dài) giống như amip. Kiểu cấu trúc này chỉ có ở một số ít tảo có tính vĩnh viễn hay tạm thời. nhiều nhà tảo học cho rằng cấu trúc amip mang tính chất thứ sinh, phát triển từ dạng monas. Điều đó hoàn toàn có thể chấp nhận được đối với hàng loạt dạng sống hiện nay. Tuy nhiên có điều là ở những giai đoạn sớm nhất của sự hình thành chất sống ở trên trái đất thì cấu trúc amip là dạng có trước, còn dạng monas được phát triển muộn hơn từ dạng amip ban đầu, sau này tạo nên roi, điểm mắt và một số có khả năng chuyển động nhanh hơn. [3] 2.1.1.3. Cấu trúc Palmella Cấu trúc palmella là sự liên kết của một số hay nhiều tế bào được bao bởi một bao nhầy chung, không có sự phụ thuộc giữa cái nọ và cái kia. Cấu trúc này cũng như cấu trúc ở trên có thể ổn định mãi hay tạm thời trong chu trình phát triển của tảo. [3] 2.1.1.4.Cấu trúc hạt (Từ chữ la tinh coccos có nghĩa là hạt) là những tế bào không chuyển động, có hình dạng khác nhau, đơn độc hay liên kết trong tập đoàn có hình dạng khác nhau (không phải là dạng sợi) phân bố rộng rãi. [3] 2.1.1.5. Cấu trúc dạng sợi Phân bố rất rộng rãi, đặc trưng bởi đặc điểm các tế bào (không chuyển động) liên kết thành sợi, có cấu tạo từ một hay một số dãy tế bào, đơn trục hay phân nhánh. Tế bào hình sợi phần lớn giống nhau hay đôi khi một số (ở gốc hay ở ngọn) tế bào có hình dạng và cấu tạo riêng biệt. Hình 2.1. cấu trúc mônat dạng đơn bào Vi tảo Phacotus [15] Hình 2.2. Cấu trúc dạng hạt Vi tảo Asterococcus [15] Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 5 Nhiều tảo dạng sợi có cấu trúc sợi nằm ngang trên bề mặt giá thể và từ đó tỏa ra các sợi thẳng đứng (gọi là cấu trúc dị sợi: heterotrichales:heteros – khác, trichos – lông). [3] 2.1.1.6. Cấu trúc dạng bản Gồm những tảo có dạng bản hình lá rộng hay hẹp. chúng được hình thành từ cấu trúc dạng sợi trong cá thể phát sinh của chúng. ở đây các tế bào phân chia theo chiều ngang và chiều dọc, kết quả tạo nên dạng bản. nhiều tảo nâu và tảo hồng ở biển có cấu trúc này. Tản dạng bản có chiều dày gồm hai lớp tế bào đôi khi hình thành dạng ống. [3] 2.1.1.7. Cấu trúc ống (siphon) Thường gặp ở một số tảo mà cơ thể dinh dưỡng của chúng chỉ là một tế bào khổng lồ có kích thước tới hàng chục centimet, chứa một lượng lớn nhân và không có vách ngăn thành các tế bào riêng rẽ. Cấu tạo tế bào. [3] 2.1.2. Thành phần cấu tạo ở đa số tảo (trừ tảo lam và tảo có cấu trúc monas) tế bào của chúng ở giai đoạn trưởng thành có cấu tạo giống như các thực vật khác.[3] 2.1.2.1. Màng tế bào Tế bào có màng bằng pectin và xenluloza. Đa số tảo có màng tế bào nguyên vẹn, tuy nhiên ở một số ngành (tảo silic, tảo vàng) màng có cấu tạo từ hai mảnh vỏ, bề mặt màng có những cấu trúc khác nhau. Nhiều loài thuộc các nhóm phân loại khác nhau, màng được che phủ bằng một lớp chất nhầy mang tính ổn định hay chỉ có trong một thời kỳ nhất định của chu trình sống. chất nhầy hình thành bằng con đường thay đổi hình dạng lớp bề ngoài của màng hay là thoát ra từ chất nguyên sinh qua các lỗ đặc biệt trên màng. Vai trò sinh học của chất nhầy rất đa dạng. chúng có tác dụng bảo vệ màng của tế bào khỏi bị ảnh hưởng Hình 2.3. Tảo Chaetophora [15] Hình 2.4. Tảo Bryopsis [15] Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 6 của sự khô hạn hoặc những tác động cơ học. thành phần hóa học của chất nhầy chủ yếu là nước và chất hữu cơ: polysaccarit, homosaccarit và heterosaccarit. Ngoài lớp chất nhầy kể trên, ở một số tảo, màng có thể có những thay đổi khác. Đôi khi màng bị cutin hóa (đặc biệt ở tế bào nghỉ), lớp ngoài của màng được ba o phủ bởi lớp cuticun, giống với chất suberin. ở một số tảo, lớp mặt của tế bào được phủ đá vôi (CaCO3) và có khi bởi lớp ô xít sắt. màng tế bào tảo silic và tảo vàng ánh thường nhiễm chất silic (SiO2.nH2O). [3] 2.1.2.2. Chất nguyên sinh Chất nguyên sinh phủ kín tế bào hay là ở đa số loài nó phân bố thành lớp nằm sát màng, phần lớn tế bào có một hoặc hai không bào lớn hoặc nhiều không bào nhỏ hơn với dịch tế bào nối với chất nguyên sinh. Tế bào thường có một hoặc nhiều nhân trong chất nguyên sinh có những bản chứa chất diệp lục và các chất màu khác mà ở tảo được gọi là thể màu (chromatophore). [3] 2.1.2.3. Thể màu và chất dự trữ Thể màu có hình dạng khác nhau như dạng bản, băng xoắn, hình sao, hình mạng lưới, hình đĩa, hình hạt. thể màu ổn định với những chi riêng rẽ hay với nhóm phân loại lớn, tăng số lượng bằng cách phân chia. Trong thể màu có các thể đặc biệt gọi là hạch tạo bột hay pyrenoid thường chỉ thấy ở đa số tảo và rêu Anthoceros. Đó là những thể protein hình cầu hay hình có góc, xung quanh sắp xếp các hạt tinh bột hay hydratcacbon. Chất dự trữ của hầu hết tảo lục là tinh bột dạng hạt xếp xung quanh perynoid hay không trực tiếp trên thể màu, còn ở tảo khác là hydratcacbon và mỡ. [3] 2.1.2.4. Không bào Đối với tảo có cấu trúc monas, trong tế bào của chúng chứa đầy chất nguyên sinh và chứa không bào với dịch tế bào. Với các loài sống ở nước ngọt, trong chất nguyên sinh ở phần cuối tế bào chứa một hay một vài không bào co bóp, mở ra và bóp lại theo nhịp điệu. chúng làm nhiệm vụ thải ra ngoài tế bào các sản phẩm không cần thiết của quá trình trao đổi chất. đồng thời chúng cũng làm chức phận điều chỉnh sự thẩm thấu đưa ra khỏi tế bào phần nước thừa do ở môi trường nước ngọt, lượng muối thấp nên tế bào phải hấp thu một lượng nước lớn. [3] Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 7 2.1.2.5. Roi Tảo có cấu trúc monas còn có đặc điểm đặc trưng là mang roi và có điểm mắt màu đỏ. Roi thường có 1 - 2, ít khi là 4 hay nhiều hơn, xuất phát từ phần gốc phía trước của tế bào. Dọc theo trục của roi có sợi đàn hồi bao quanh bằng chất nguyên sinh. Roi là một bó 11 sợi với 2 sợi ở giữa và 9 sợi ở xung quanh. Roi được xuất phát từ thể gốc dạng hạt nằm trong chất nguyên sinh, ở nhiều loài, hạt gốc này có liên hệ với nhân tế bào bằng sợi. trong phần lớn trường hợp roi đều hướng về phía trước theo sự chuyển động của tế bào. Tuy nhiên, ở tảo giáp peridinium, sự chuyển động của roi phức tạp hơn. Chúng uốn theo hình sóng theo hướng từ đầu roi tự do tới gốc roi làm cho tế bào chuyển động quay tròn. [3] 2.1.2.6. Điểm mắt Ta thường thấy ở đầu cùng tế bào của đa số tảo có cấu trúc monas một chấm đỏ gọi là điểm mắt (stigma). Màu đỏ hay nâu của điểm mắt liên quan tới chất màu ataxantin. Điểm mắt gồm hai phần: phần không màu và phần cò màu. Phần không màu có dạng lồi ở hai đầu, phần có màu có dạng hình chén và phần lõm hướng vào phần không màu, bao gồm nhiều hạt nhỏ có màu. Điểm mắt là cơ quan thụ cảm với kích thích của ánh sáng, trong đó, phần không màu giữ vai trò là một thấu kính tập trung ánh sáng. [3] 2.1.3. Sinh sản Tảo cũng rất đa dạng trong sinh sản. nhìn chung, tảo có ba phương thức sinh sản: sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính, nhiều tảo còn có sự xen kẽ thế hệ. Một đặc điểm phân biệt tảo với các thực vật không có hoa khác là tảo thiếu một thành đa bào quanh túi bào tử (ngoại trừ túi tinh ở Charophyceae) [3] 2.1.3.1. Sinh sản sinh dưỡng Sinh sản sinh dưỡng của tảo thực hiện bằng những phần riêng rẽ (đa bào hay đơn bào) của cơ thể, thường không chuyên hóa về chức phận sinh sản. Tảo đơn bào sinh sản bằng cách phân chia tế bào. Tảo tập đoàn phân tách thành các tập đoàn nhỏ hay hình thành tập đoàn mới bên trong tế bào mẹ (Volvocales, Protococcales). Sinh sản sinh dưỡng của tảo dạng sợi bằng sự tách sợi ra thành các đoạn hay bằng đoạn đứt Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 8 ngẫu nhiên của sợi. một số ít tảo tạo thành cơ quan chuyên hóa của sinh sản sinh dưỡng như hình thành chồi ở Chara. [1], [3] 2.1.3.2. Sinh sản vô tính Sinh sản vô tính là hình thức sinh sản phổ biến của tảo thực hiện bằng sự hình thành các bào tử chuyên hóa. Ở đa số tảo, bào tử này chuyển động, có cấu trúc monas, không có màng tế bào và gọi là động bào tử, phần lớn ít có sai khác nhau, đôi khi có sai khác chút ít so với tế bào sinh dưỡng. Động bào tử bơi lội một thời gian ngắn, tạo vỏ bọc và nẩy mầm thành cơ thể mới. Ở hàng loạt tảo, bào tử của sinh sản vô tính không chuyển động và được gọi là bào tử bất động (aplanospore). Tùy theo từng trường hợp mà có những tên gọi khác nhau. [1], [3] 2.1.3.3. Sinh sản hữu tính Hình 2.5. Sinh sản hữu tính ở Dunaliella Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 9 Sinh sản hữu tính của tảo thực hiện bằng những tế bào chuyên hóa, đó là các giao tử (gamet) kèm theo quá trình hữu tính. Với tảo chưa tiến hóa (volvocales) quá trình hữu tính tiến hành bằng sự kết hợp toàn vẹn của cả cơ thể (hologamy – toàn giao). Đại đa số tảo, quá trình hữu tính gồm có sự tiếp hợp của cả hai tế bào sinh sản hữu tính trần (gọi tên chung là giao tử) thành một tế bào gọi là hợp tử (zygote). Hợp tử này (cũng như ở toàn giao) tiến hành sự tiếp hợp chất nguyên sinh của hai giao tử và kết hợp nhân. Hợp tử bao phủ bởi màng, thường rất dầy và nhanh chóng nẩy mầm (ở nhiều tảo biển) hay là chuyển sang trạng thái nghỉ (chủ yếu ở tảo nước ngọt), sau đó nẩy mầm thành động bào tử, hay trực tiếp thành một cây mới. Nếu như hai giao tử kết hợp giống nhau về hình dạng và kích thước, ta gọi là đẳng giao tử (isogamet), còn quá trình hữu tính gọi là đẳng giao (isogamy). Nếu như trong hai giao tử có một giao tử lớn hơn giao tử còn lại, ta gọi là dị giao tử (heterogamet) và quá tình hữu tính gọi là dị giao (heterogamy). Giao tử lớn hơn được gọi là giao tử cái, còn giao tử nhỏ hơn gọi là giao tử đực. Tế bào, trong đó hình thành đẳng hay dị giao tử gọi là túi giao tử (gametangium). Nếu như các giao tử kết hợp được phát triển trên một cá thể, tản như vậy được gọi là đồng tản (homothalle). Nếu như các giao tử kết hợp được hình thành trên các cá thể khác nhau, tản như vậy được gọi là dị tản (heterothalle). Hình thức sinh sản hữu tính cao nhất ở tảo là noãn giao (oogamy). Trong trường hợp này, giao tử nhỏ chuyển động được gọi là tinh trùng (spermatozoid). Tinh trùng thụ tinh với noãn cầu (oogone) không chuyển động và có kích thước lớn hơn. Tế bào tảo, trong đó hình thành tinh trùng gọi là túi tinh (antheridium) còn tế bào chứa noãn cầu (một hay rất ít khi một vài) gọi là túi noãn (oogonium), ở tảo hồng gọi là carpogone. Ngoài ra, ở tảo còn có quá trình sinh sản hữu tính đ ặc biệt theo lối tiếp hợp (zygonamy). Hai tế bào liên kết với nhau bằng những mấu lồi, không có vách ngăn và kết hợp chất nguyên sinh, không có roi và không có sự phân hóa bên ngoài thành các giao tử đực và cái. Sự kết hợp nhân trong quá trình sinh sản hữu tính làm tăng gấp đôi số lượng nhiễm sắc thể trong hợp tử. Số lượng nhiễm sắc thể gấp đôi lên gọi là lưỡng bội (diploid), số lượng nhiễm sắc thể nhỏ hơn hai lần gọi là đơn bội (haploid). Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 10 Sự chuyển nhiễm sắc thể từ lưỡng bội sang đơn bội ở thực vật bậc cao tiến hành trong thời gian phân chia sinh sản trước khi hình thành bào tử. Còn ở thực vật bậc thấp và ở tảo, sự phân chia giảm nhiễm tiến hành trong các thời gian khác nhau của chu trình sinh sản của chúng. Ở mỗi loài có sự luân phiên chính xác của thể bào tử (sporophyte) và thể giao tử (gametophyte) với sự phân chia giảm nhiễm tiến hành như ở thực vật bậc cao, trước khi hình thành bào tử ra thể bào tử (sporophyte) và từ bào tử phát triển ra thể giao tử (gametophyte). Ở rất nhiều tảo, sự phân chia nhân lần đầu tiên trong hợp tử được giảm nhiễm và tất cả chu trình sống của tảo tiến hành trong giai đoạn đơn bội. hợp tử chỉ là đơn bội và rất khó coi hợp tử là thế hệ. những tảo như vậy không có sự luân phiên thế hệ mà chỉ có sự luân phiên giai đoạn nhân. Khi đời sống của tảo tiến hành trong pha lưỡng bội (diploid) và pha đơn bội (haploid) chỉ có ở giao tử, trước khi hình thành giao tử có sự giảm nhiễm Đa số tảo là sinh vật quang dưỡng, tất cả đều có chlorophyll a và có sản phẩm cuối cùng là carbonhydrat và protein tương tự như những thực vật bậc cao hơn. Vì vậy, nhiều tảo là sinh vật thí nghiệm lý tưởng nhờ vào kích thước nhỏ của chúng và dễ thao tác trong môi trường lỏng. Chúng có thể được nghiên cứu dưới những điều kiện được kiểm soát trong phòng thí nghiệm. [3] 2.1.4. Dinh dưỡng ở tảo Phương thức dinh dưỡng của vi tảo được phân thành hai loại chính: tự dưỡng (autotrophy) và dị dưỡng (heterotrophy). Dạng trung gian của hai hình thức trên là tạp dưỡng (mixotrophy). ở dạng tạp dưỡng, quang hợp vẫn là quá trình cơ bản để tạo chất hữu cơ nhưng trong một số trường hợp, tảo sử dụng được các hợp chất hữu cơ có sẵn. cần lưu ý là thuộc phương thức dị dưỡng ở tảo còn tồn tại dạng khuyết dưỡng (auxotrophy): để sinh trưởng bình thường, tế bào tảo cần một lượng rất nhỏ chất hữu cơ quan trọng, ví dụ: vitamin. Sau đây là bảng khái quát về nhu cầu dinh dưỡng của tảo: Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 11 Bảng 2.1. Danh mục một số nguyên tố cần cho sinh trưởng của tảo (S.Aaronson, 1973) Nguyên tố Các hợp chất Nồng độ trong 1L môi trường C CO2, HCO3-, CO3, các chất hữu cơ gr O O2, H2O, các chất hữu cơ gr H H2O, H2S, các chất hữu cơ gr N N2, NH4 +, NO3-, NO2-, acid amin, purin, pyrimydin, urea gr Na Muối vô cơ NaCl, Na2SO4, Na3PO4 gr K Muối vô cơ KCl, K2SO4, K3PO4 gr Ca Muối vô cơ CaCO3, Ca2+ gr P Muối vô cơ Na hoặc K phốt phát, … gr S Muối vô cơ MgSO4.7H2O, acid amin gr Mg Muối của CO32+, SO42-, Cl-, … gr Cl Muối của Na+, K+, Ca2+, NH4+, gr Fe FeCl3, Fe(NH4)2SO4, xitrat Fe mg Zn Muối của SO42-, Cl- mg Mn Muối của SO42-, Cl- mg Br Muối của Na+, K+, Ca2+, NH4+ mg Si Na2SiO3.9H2O mg B H3BO3 mg Mo Molypdat Na+ hoặc NH4+ mg V Na3VO4.16H2O mg Sr Muối của SO42-, Cl- mg Cu Muối của SO42-, Cl- mg Li Muối của SO42-, Cl- mg Al Muối của SO42-, Cl- mg Co Muối của SO42-, Cl-, vitamin B12 mg I Muối của Na+, K+, Ca2+, NH4+ mg Se Na2SeO3 mg Các môi trường dinh dưỡng dùng cho nuôi trồng tảo phải dựa theo nhu cầu dinh dưỡng của từng loài. Mặc dù vậy, việc xác định chính xác nồng độ của từng yếu tố dinh dưỡng cho một loài nào đó là rất khó khăn vì nồng độ dinh dưỡng tối ưu phụ thuộc rất nhiều vào mật độ quần thể, ánh sáng, nhiệt độ và pH môi trường. [1] 2.1.4.1. Dinh dưỡng carbon - carbon vô cơ Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 12 Trong môi trường nước, carbon vô cơ có thể ở dạng H2CO3, CO2, HCO3-, CO32- , phụ thuộc vào giá trị pH (xem hình). Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng CO2 là dạng duy nhất được tảo trực tiếp sử dụng trong quá trình quang hợp như enzyme RubPase carbon dưới dạng HCO3- xâm nhập vào tế bào tảo nhờ chuyển vận tích cực hoặc nhờ tác động của cacboanhydrase (CA) phân hủy HCO3- thành CO2 và H2O. Enzyme CA xúc tác phản ứng thuận nghịch: Cho nên enzyme này là tác nhân điều khiển nồng độ CO 2, H+, HCO3- và CO32- trong tế bào. Có thể tóm tắt vai trò được giả thiết của CA như sau: - vận chuyển CO2 đến lục lạp và trung tâm cacboxyl hóa. - Cung cấp chất nền cho RiDP- carboxylase thông qua tăng cường quá trình cố định CO2 khi tăng ái lực của enzyme cacboxyl hóa đối với CO2. - Giúp CO2 vượt qua màng lục lạp (giảm trở ngại khuếch tán) - Là bơm carbonat. Trong nuôi trồng đại trà vi tảo, giá tr ị pH cần được giữ ở mức tối ưu cho từng loài và hạn chế tối đa việc mất mát carbon. Điều này được thực hiện nhờ đưa thêm vào môi trường CO2 hoặc NaHCO3. Nếu tất cả HCO3- và CO2- đều chuyển sang dạng CO2 và OH- thì pH môi trường có thể đạt tới giá trị 14 tr ong khi pH = 10 – 12 đã ức chế sinh trưởng của tảo. Trong điều kiện pH môi trường cao như vậy thì carbon vô cơ hầu như không được tảo sử dụng. Hiện tại công đoạn bổ sung CO 2 cho nuôi trồng đại trà tảo đang được các nhà khoa học tiếp tục cải tiến nhằm giảm tối đa mất mát CO2 ra ngoài không khí. [1] - Carbon hữu cơ Ngoài nguồn carbon vô cơ, trong quá trình sinh trưởng, tảo có khả năng đồng hóa cả carbon hữu cơ dưới dạng acetat, đường saccharose, glucose, fructose, galactose, fumarat, malat, ethanol, butyrat, … phương thức dinh dưỡng carbon hữu cơ trong trường hợp này rất đa dạng và phụ thuộc vào từng loài tảo cũng như điều kiện sống cụ thể. Nghiên cứu phương thức dinh dưỡng carbon hữu cơ được tiến hành nhiều đối với CO2 + H2O H2CO3 H + + HCO3- Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 13 tảo chlorella và Scenedesmus. Một ví dụ điển hình của dinh dưỡng carbon hữu cơ là nguồn acid acetic được cung cấp thường xuyên cho tảo Chlorella sản xuất tại Đài Loan. Trong trường hợp này acid acetic vừa là nguồn carbon vừa là yếu tố điều chỉnh pH của môi trường nuôi trồng.[1] 2.1.4.2. Dinh dưỡng nitơ Nitơ chiếm từ 1- 10 % trọng lượng khô tế bào tảo. Khả năng cố định N2 chỉ có ở tảo prokaryotae, trong khi hầu hết tảo có thể sử dụng nitơ dưới dạng NO3 - và NH4+ Khi a môn được sử dụng như một nguồn nitơ duy nhất cho tảo thì pH môi trường sẽ giảm nhanh gây ra một số hiệu ứng phụ ảnh hưởng tới sinh trưởng của tảo. Nitrit cũng được một số tảo dùng nhưng chỉ với nồng độ rất thấp khoảng 1mM. Nhiều vi tảo sử dụng các hợp chất nitơ như amid, urê, glutamin, asparagin, các acid amin như glyxin, serin, alanin, acid glutamic, acid aspatic.[1] - Cố định nitơ Một số tảo lam có khả năng cố định nitơ khí quyển. quá trình N2 bị khử thành NH4+ được xúc tác bởi enzyme nitrogenase. Phản ứng theo phương trình sau: Có thể đơn cử một số loài cố định ni tơ phân tử từ ngành tảo lam như: - Nhóm Chroococcacean có các chi Aphanothese, Gloeothece, Synechococcus. - Nhóm Pleurocapsalean có các chi Dernoocarpa, Xenococcus, Myxosarcina, Chroococcidiopsis, Pleurocapsa. - Nhóm các vi tảo dạng sợi không có tế bào dị hình như Oscil latoria, Pseudoanabaena, Lyngbya, Plectonema, Phormidium. - Nhóm các vi tảo dạng sợi có tế bào dị hình như Anabaena, Anabaenopsis, Aulosira, Calotrix, Cylindrispermum, Fischerella, Nostoc, Tolypothrix. Thống kê trên cho thấy: - không phải tất cả các loài thuộc Cyanobacteria cố định nitơ. - Cố định ni tơ ở Cyanobacteria được tiến hành trong các cơ thể đơn bào, dạng sợi, có hoặc không có tế bào dị hình.[1] N2 + 6H+ + 6e- + 12Mg ATP 2NH3 + 12 MgADP +12Pi Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 14 - Đồng hóa nitrat và nitrit Ni tơ được hấp thụ dưới dạng oxy hóa như NO 3 - và NO2- cần phải được khử trước khi tham gia vào phản ứng với các chất hữu cơ. Những nghiên cứu mới đây cho thấy ở thực vật và tảo, có hai loại enzyme xúc tác cho phản ứng khử hoàn toàn nitrat thành amôn: Người ta phát hiện được hai dạng nitrate reductase (NR) ở tảo. - dạng thứ nhất tìm thấy trong tảo nhân thực và khá giống với NR của thực vật bậc cao. Enzyme này xúc tác phản ứng: ++−+− ++→++ HPNADNOHHPNADNO )()( 23 Dạng NR được làm sạch này chứa Mo-hem và flavo adenin dinucleotide. Dạng thứ hai của NR có trong tảo lam dưới dạng liên kết với cấu trúc hạt mang chlorophyll. Phân tử lượng khoảng 7500 có Mo, flavin hoặc cytochrom. Enzyme này sử dụng ferredoxin dạng khử như một chất cho điện tử, chứ không phải pyridine nucleotid. NR này xúc tác phản ứng: OHFDNOHFdNO OXred 223 2222 ++→++ −+− Enzyme nitrite reductase (NiR) khử nitrite thành a môn mà không giải phóng chất trung gian nào: OHFdNHHFdNO OXred 242 2686 ++→++ ++− Phân tử lượng của NiR khoảng 60.000 – 70.000. Nói chung enzyme này rất giống với NiR ở thực vật bậc cao. [1] - Đồng hóa amôn Nhiều loài tảo sử dụng amôn làm nguồn nitơ. Nếu trong môi trường đồng thời có amôn và nitrat thì tảo sẽ sử dụng hết amôn sau đó mới dùng nitrat. Các tế bào tảo nuôi trong môi trường thiếu ni tơ là công cụ rất lý tưởng để nghiên cứu hấp thu và NO3- + 2e- + Nitrate reductase NO2 - + 6e- + Nitrite reductase NH4+ Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 15 đồng hóa nitơ amôn. Quá trình đồng hóa amôn kéo theo việc tiêu tốn carbohydrat dự trữ trong tế bào và amôn được chuyển sang dạng các chất hữu cơ chứa nitơ. Đơn cử một vài enzyme tham gia quá trình đồng hóa amôn ở tảo: - Glutamin dehydrogenase (GDH) OHGlutamicAcidGDHHHPNADNHGlutaricAcid 23 )( +→++++− +α - Glutamin synthase (GS) PiADPGlutaGSATPNHGlutamicAcid ++→+++ min3 - Glutamate synthase (GOGAT): GlutaricAcidGOGATHGlutaricAcidGluta 2]2[min →++−+ α Trong nhiều loài, Cyanobacteria, con đường GS/GOGAT là con đường chính đồng hóa +4NH . Một con đường khác đồng hóa +4NH ở tảo này là sử dụng enzyme Carbamyl phosphatesylthase. Sản phẩm của phản ứng xitrulin và arginin. [1] - Đồng hóa urê Urê là nguồn ni tơ tốt cho nhiều loài tảo. Thông thường u rê sẽ bị thủy phân trước khi được tảo sử dụng. Có 3 enzyme xúc tác quá trình biến đổi u rê thành NH3 - Urease xúc tác phản ứng thủy phân đơn giản: 3222 2)( NHCONHCOOH +→+ - Urea amidolyase xúc tác phản ứng sau: PiADPNHCOOHATPNHCO +++→++ 3222 2)( - Urea carboxylase xúc tác phản ứng hình thành allophanat: OHPiADPAllophanatATPHCONHCO 232 )( +++→++ − Sau đó enzyme allophanate lyase xúc tác phản ứng thủy phân allophanat thành NH3: 3322 2NHHCOCOOHAlophanat ++→+ − Có giả thiết cho rằng, những loài tảo sử dụng u rê thì chỉ chứa hoặc urease hoặc ualase. Tảo thuộc Chlorophyceae có uala se trong khi các vi tảo khác có enzyme urease. Ngoài dạng ni tơ vô cơ đã trình bày trên, nhiều tảo với phương thức tạp dưỡng Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 16 hoặc dị dưỡng có khả năng sử dụng acid amin và các nguồn ni tơ hữu cơ khác để duy trì sinh trưởng. [1] 2.1.4.3. Dinh dưỡng phốt pho Phốt pho (P) là một trong những nguyên tố chính trong thành phần của tảo. P có vai trò chính trong đa số các quá trình xảy ra ở tế bào, đặc biệt là quá trình truyền năng lượng và tổng hợp acid nucleic. Vai trò của P đới với trao đổi chất ở tảo là vấn đề được quan tâm nhiều do nó thường là yếu tố giới hạn sinh trưởng trong tự nhiên. Mặc dù nồng độ P hữu cơ trong nước tự nhiên thường vượt quá lượng P vô cơ (Pi), nhưng tảo lại sử dụng Pi là chủ yếu. Phốt pho hữu cơ thường được thủy phân bởi các enzyme ngoại bào như phosphoesterase, phosphatase để chuyển sang dạng Pi dễ hấp thu. Nói chung, việc hấp thu P ở tảo được kích thích bởi ánh sáng, nồng độ phốt phát trong môi trường, pH, Na +, K+ hoặc Mg2+. Tảo sử dụng một trong ba quá trình sau đây để chuyển hóa orthophosphate sang dạng hữu cơ có năng lượng cao: - Phosphoryl hóa mức cơ chất - Phosphoryl hóa oxy hóa - Phosphoryl hóa quang hóa. Phản ứng phosphoryl hóa được biểu diễn tổng quát như sau: Trong hai quá trình đầu tiên, năng lượng được lấy từ việc oxy hóa c ác cơ chất hô hấp hoặc từ hệ thống truyền điện tử của ty thể. Quá trình thứ ba là quá trình điển hình đối với thực vật, năng lượng lấy từ nguồn ánh sáng mặt trời. ATP đóng vai trò trung tâm trong trao đổi chất của cơ thể sống vì nó cung cấp năng lượng cho quá trình cố định CO 2, hấp thu và chuyển vận ion, hình thành acid nucleic … Pi thường tồn tại trong tảo dưới dạng polyphosphate. Đây là dạng chốt phát dự trữ chính cho tế bào. [1] 2.1.4.4. Dinh dưỡng vi lượng Các vi lượng được coi là không thay thế đối với sinh trưởng của tảo là Fe, Mn, Cu, Zn, Mo và Cl. ADP + Pi + Năng lượng ATP Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 17 Những vi lượng khác đóng vai trò quan trọng đối với một số nhóm tảo là Co, B, V, Si, I. Fe tham gia quá trình đồng hóa ni tơ vì ferredoxin là chất cho điện tử trong hoạt động của nitrate reductase và nitrite reductase. Fe rất quan trọng đối với quá trình quang hợp vì tác động đến sinh tổng hợp chlorophyll a, C-phycocyanin và cytocrom. Mn và Cu là các yếu tố quan trọng trong hệ truyền điện tử quang hợp và cần cho tất cả các loài tảo. Các nguyên tố này cũng tham gia vào hoạt động tế bào với tư cách là thành phần hoặc cofactor của enzyme. B cần cho một số tảo lam và tảo silic, trong khi Mo tham gia quá trình cố định ni tơ và là thành phần của nitrat reductase. Vanadi là thành phần không thể thiếu đối với sinh trưởng của một số tảo lục và tảo biển. Coban hoặc vitamin B12 chứa Co cần cho sinh trưởng của một số loài tảo. Silic có trong thành tế bào của nhiều loài tảo, đặc biệt là tảo silic… Ngoài ra, còn một số loài tảo có phương thức dinh dưỡng khuyết dưỡng (auxotroph) đối với một số vitamin như B12, B1, Biotin.[1] 2.1.5. Ảnh hưởng của một số yếu tố ngoại cảnh đến sinh trưởng và phát triển của tảo 2.1.5.1. Ánh sáng - Hiện tượng quang ức chế (mất hoat tính quang hóa) Sinh trưởng của tảo bị ức chế dưới điều kiện ch iếu sáng mạnh là hiện tượng quan sát dễ dàng trong phòng thí nghiệm cũng như ngoài tự nhiên. Mức độ quang ức chế phụ thuôc vào cường độ sáng và chất lượng phổ của ánh sáng. Mặt khác, ánh sáng có cường độ cao cũng ức chế hô hấp của các tế bào đang quang hợp mạnh.[1] - sự thích ứng sáng – tối Sự thích ứng sáng – tối ở tảo đơn bào được đặc trưng bởi sự thay đổi hàm lượng sắc tố nội bào. Sự thích nghi màu của một số tảo lam được thay đổi bằng sự thay đổi sinh tổng hợp phycobiliprotein và carotenoid. Ví dụ: tế bào lyngbia plectonema, phormidium sp, sinh trưởng dưới ánh sáng có hàm lượng carotenoid tăng gấp đôi do tăng hàm lượng β - Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 18 caroten và zeaxanthin so với hiệu quả nuôi trồng dưới ánh sáng trắng trong cùng điều kiện thí nghiệm.[1] - Ánh sáng và vận động của tảo Có 4 kiểu vận động được ghi nhận: vận động nhờ roi, vận động kiểu amip, vận động do co thắt tích cực va trượt. Ánh sáng là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng tới vận động của hầu hết các loài tảo chuyển động được. Tảo lam có khả năng nổi hoặc chìm để phản ứng với cường độ sáng nhờ có không bào không khí: khi bị chiếu sáng với cường độ cao, không bào khí xẹp xuống dẫn đến tỉ trọng của tế bào so với nước tăng lên và tảo chìm xuống. Người ta cũng xác nhận tảo Oscillatoria điều chỉnh việc chìm nổi dưới tác động của ít nhất 3 yếu tố: chế độ sáng, CO2 và chế độ dinh dưỡng. [1] 2.1.5.2. Nhiệt độ Ảnh hưởng của nhiệt độ có thể giải thích thông qua hai yếu tố: - Nhiệt độ tác động lên cấu trúc tế bào - Nhiệt độ ảnh hưởng lên tốc độ phản ứng trao đổi chất. Trong điều kiện sản xuất đại trà vi tảo, nhiệt độ đóng vai trò rất quan trọng. Chính vì vậy, việc chọn các chủng tảo chịu nhiệt có ý nghĩa lớn đến năng suất tảo. Mặt khác, nhiệt độ thấp cũng ảnh hưởng xấu tới sinh trưởng của tảo. Ví dụ: Ono và Murata đã giả thiết cơ chế tác động của nhiệt độ thấp ở tảo Anacystis nidulans là do phân rã của lớp lipid kép của màng nguyên sinh chất dẫn đến việc thẩm thấu các ion và các chất hòa tan phân tử lượng thấp ra môi trường. Điều này dẫn tới việc làm giảm hoạt tính sinh lý của chính tế bào. [1] 2.1.5.3. Độ mặn Phổ chịu muối của tảo rất rộng. Một số loài chỉ có thể chịu được nồng độ vài mM, trong khi một số khác có thể sống ở điều kiện muối bão hòa. Để có thể tồn tại trong điều kiện bị sốc muối, tế bào cần có thêm năng lượng để tổng hợp các chất điều hòa thẩm thấu (osmotica), duy trì cân bằng nội môi. Sau đây là một số cơ chế thích nghi với nồng độ muối cao của tảo. - Sản sinh glycerol Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 19 Đây là phản ứng đặc trưng ở tảo Dunaliella. Glycerol là chất điều hòa thẩm thấu và hàm lượng tăng tỉ lệ thuận với tăng nồng độ muối NaCl trong môi trường. - Sản sinh sucrose và prolin Tảo Chlorella emersonii có khả năng thích ứng với nồng độ muối 50 – 150 mM NaCl nhờ sản sinh Prolin. Điều đặc biệt là Prolin tích lũy trong trường hợp này không phải bắt nguồn từ thủy phân protein, vì sự hình thành của Prolin ngoài sáng bị ngừng ngay khi xử lý DCMU – chất ức chế quang hợp, và cả khi đưa tế bào vào tối. - TÍch lũy β - caroten Để phản ứng với nồng độ NaCl cao, thiếu đạm và nhiệt độ cao, tảo Dunaliella bardawil tích lũy cả glycerol và β - caroten. Hàm lượng β - carotentrong trường hợp này có thể tăng lên tới 8 % trọng lượng khô. Chính vì vậy, vi tảo Dunaliella đã được sử dụng như một đối tượng sản xuất đại trà để thu β - caroten. Hiện tại, Australia là nước có sản phẩm β - caroten thương mại thu từ việc sản xuất đại trà vi tảo Dunaliella. - Ảnh hưởng của độ mặn NaCl lên quang hợp và hô hấp Cần lưu ý rằng không phải tất cả các thay đổi xảy ra ở tế bào tảo khi bị ảnh hưởng của nồng độ NaCl cao chỉ liên quan tới cơ chế điều hòa áp suất thẩm thấu. Độ mặn cao ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt tính quang hợp và hô hấp của tế bào tảo đã được chứng minh ở nhiều loài tảo như: Anacystis nidulans, Dunaliella salina, Spirulina platensis… Người ta cho rằng, giai đoạn tế bào tảo thích ứng với độ mặn cao có thể tách thành hai bước kế tiếp: - Lúc đầu cường độ quan hợp giảm nhưng không có liên quan với hoạt tính hô hấp. -Sau giai đoạn thích nghi, cường độ quang hợp giảm đi kèm với việc tăng nhanh cường độ hô hấp. Vai trò của tăng hô hấp trong trường hợp này là để cân bằng nồng độ Na+, K+ và tổng hợp các chất tham gia điều hòa áp suất thẩm thấu. [1] 2.1.5.4. Ảnh hưởng của pH Nhiều quá trình sinh học bị tác động bởi gía trị pH. Tác động này được quan sát rõ nhất tại các thủy vực có mật độ quần thể sinh vật cao như ao phú dưỡng, ao nuôi Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 20 thủy sản. tỉ lệ hàm lượng CO2, CO32- và HCO32- trong môi trường dinh dưỡng xác định giá trị pH, mỗi loài tảo lại sinh trưởng tối ưu trong môi trường có giá trị pH nhất định. Giá trị pH ảnh hưởng tới: - Khả năng phân ly muối và phức chất và như vậy gián tiếp gây độc và tác động ức chế sinh trưởng của tảo. - Tính hòa tan của các muối kim loại. - Hàm lượng độc tố trong một số tảo. Ví dụ tảo độc Microcystis aeruginosa sẽ chứa hàm lượng độc tố cao hơn khi pH của môi trường giảm thấp hơn giá trị tối ưu. Những điều nêu trên khẳng định tầm quan trọng của giá trị pH đối với sản xuất đại trà vi tảo. [1] 2.1.6. Phân bố Tảo sống trong nước, trôi nổi tự do trong lớp nước ở trên, có trong thành phần của sinh vật phù du (plankton), những dạng khác có trong thành phần của sinh vật đáy (benthos), sống bám vào đáy hay các giá thể khác ở dưới nước hay nằm tự do ở dưới đáy. Nhiều tảo sống ở chỗ khô, trên thân cây, trên đất. Hàng loạt tảo sống ở trong nước, nhưng có thể sống cả ở trong đất hay chỗ khô. Tảo có mặt ở khắp mọi nơi, xuất hiện ở mọi môi trường sống trên trái đất, từ vùng sa mạc nóng và lạnh khắc nghiệt đến vùng đất đá băng tuyết và mọi thủy vực. chúng là những sinh vật sản xuất sơ cấp, đóng vai trò chính trong chuỗi thức ăn ở các hệ thủy vực. Tuy nhiên, chúng là “những sinh vật phiền toái” trong các hệ thống cung cấp nước cho đô thị và trong các thủy vực dễ bị phú dưỡng. Chúng là những sinh vật gây nên hiện tượng nở hoa ở nước (water bloom) gây ô nhiễm môi trường thủy vực và ảnh hưởng đến nghề nuôi trồng thủy sản. Đặc biệt một số tảo còn sinh ra độc tố gây ra tác hại cho con người thông qua dây chuyền thức ăn. Nghiên cứu giá trị của tảo, người ta đã nhận thấy một số tảo là nguồn thực phẩm có giá trị cho con người. Các chiết xuất hóa học của nhiều loài tảo được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và nhiều ngành công nghiệp khác. Trong tương lai, công dụng của tảo sẽ được nghiên cứu phát triển mạnh trong lĩnh vực năng lượng và sản xuất thực phẩm. [1] Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 21 2.2. Giới thiệu chung về tảo Tetraselmis Tetraselmis hay còn gọi là platymonas, là loại vi tao biển được nuôi trồng đ ại trà để làm thức ăn cho động vật thủy sinh. Kích thước trung bình khoảng 10µm x 20µm, chuyển động nhờ 4 roi. Lần đầu tiên được nuôi trồng đại trà năm 1980. Tetraselmis là nguồn thức ăn có chất lượng cao cho ấu trùng các loại nhuyễn thể như: trai, sò, ngao, hàu… Ngày nay, tetraselmis được biết đến là loài tảo có hàm lượng lipid cao, có triển vọng trong ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học (bio diesel). 2.2.1. Vị trí phân loại [11] Tetraselmis Nhóm : Eukaryota Giới : Viridiplantae Ngành : Chlorophyta Lớp : Chlorophyceae Bộ : Volvocales Họ : Chlamydomonaceae Chi : Tetraselmis 2.2.2. Đặc điểm sinh học - Ngành tảo lục – Chlorophyta Đây là ngành lớn nhất của tảo, hiện đã phát hiện được khoảng 20.000 loài. Hình thái cơ thể có tất cả các dạng (trừ dạng amip) : như monas, hạt, tập đoàn, palmella, đa bào dạng sợi, dạng bản, dạng ống và dạng cây. Tảo lục phân bố rộng khắp từ nước ngọt nghèo dinh dưỡng đến nước lợ và nước biển. một số bộ chỉ sống ở biển, một số sống trên vật ẩm hay sống ngay dưới mặt đất. việt nam đã phát hiện được hơn 1000 loài. Hình 2.6. Tế bào tảo Tetraselmis dưới vật kính dầu Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 22 Hầu hết các tế bào có một nhân, nhưng nhiều nhân cũng có ở một vài bộ (như caulerpales), một số chi của bộ Chlorococcales (như Hydrodictyon). Có vách tế bào, trừ polyblepharidaceae và một số tế bào sinh sản vận động của nhóm khác, nguyên sinh chất bao quanh bởi màng sinh chất. nhiều trường hợp, tế bào ở tình trạng đang già trong nuôi cấy cạn kiệt ni-tơ thì vách tế bào của chúng dày lên nhiều. nhiều cơ thể, vách tế bào có hai lớp rõ rệt dưới kính hiển vi quang học: một lớp cứng hơn ở bên trong và lớp vỏ bên ngoài, chúng có thể xếp thành tầng. các lớp này bao quanh tế bào chất, trước đây đã tưởng là bao gồm toàn các polysaccharid, nay đã khám phá ra chứa từ 10 – 69 % protein. Ngược lại, Lorch và weber (1972) báo cáo chỉ có 0.32% trọng lượng vách tế bào ở pleorotaenium là ni tơ, 1,7 % lipid và phần còn lại chứa glucose, galactose, xylose, arabinose và các acid glucuronic và galacturonic. Nhiều phân tích hóa sinh vách tế bào tảo lục đã chỉ ra một số có xenluloza, một số lại không có (như chlamydomonas, acetabularia và briopsis). Các polyme này xuất hiện như các sợi dính với nhau thành khối không phải là sợi, khối này (ở một số trường hợp) tạo ra hemi xenluloza. Tảo có màu xanh thuần khiết do diệp lục tố a, b chiếm đa số, (trừ một số sống ở nơi ẩm có màu vàng do chứa nhiều dầu và hematocrom). Ngoài diệp lục còn có µ, β và γ caroten và vài xanthophyll. Một số như chlorococcum và spongiochloris cùng với các caroten nguyên sinh có trong suốt hoạt động sinh trưởng của tế bào chúng có thể bị mất các diệp lục và phát triển các caroten thứ cấp như echinenon, canthaxanthin và astacen. Sự biến đổi tương tự về sắc tố có thể xảy ra ở hộp tử và bào xác của những loài nhất định và trở thành đỏ. Một số (như zygnema ericetorum ) ngoài sắc tố quang hợp còn chứa các sắc tố không bào đỏ thẫm, đó có thể là hợp chất sắt – tanin. Sản phẩm đồng hóa là tinh bột, ít khi là dầu. sắc tố tập trung trong cơ quan quang hợp thể màu. Thể màu ở tảo lục có hình thái rất đa dạng và thường là đặc điểm quan trọng cho định loại. Trong thể màu có các vùng khác biệt gọi là hạch tạo bột, đây có thể là địa điểm cho sự hình thành tinh bột, một hoặc nhiều hạt tinh bột hình thành trong thể màu áp gần bề mặt hạch tạo bột. nhiều loài (như scenedesmus) mọi sự tăng trưởng của tinh bột trong thể màu đều liên đới với hạch tạo bột. Tuy nhiên, Vai trò của hạch tạo bột trong hình thành tinh bột là không rõ vì nhiều loài hoàn toàn không có hạch tạo bột mà tinh bột vẫn được hình thành (như ở microspora). Khi tế bào phân đôi thì hạch tạo bột cũng được phân đôi theo thể màu và chia về cho hai tế bào con. Trong Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 23 trường hợp tế bào phân chia nhanh và thành nhiều tế bào con, thì hạch tạo bột thường biến mất trước khi tế bào mẹ phân chia và lại xuất hiện lại ở tế bào con sau đó. Ngoài hạch tạo bột, trên thể màu của các tảo lục dạng monas và hầu hết các tế bào sinh sản vận động của các tảo lục không phải dạng monas có chứa bào quan sắc tố (đặc biệt là điểm mắt đỏ), chúng được xem là cơ quan cảm nhận ánh sáng. Tuy nhiên, những thể đột biến của chlamydomonas không có điểm mắt nhưng vẫn có khả năng theo sáng, tuy có đạt tới chậm hơn dạng hoang dại có điểm mắt. Roi của các tế bào vận động ở tảo lục thường là bằng nhau về độ dài và nhẵn. một số cơ thể như ở chlamydomonas reinhardtii, trên dọc roi có các lông mảnh, trong khi ở các chi khác như pyramimonas, prasinocladus và trichosarcina bề mặt roi phủ các vẩy nhỏ. Tế bào tảo lục còn chứa các nội bào quan khác giống các sinh vật có nhân khác như golgi, ty lạp thể, lưới nội chất. Nhi ều loài tế bào chất lấp đầy tế bào (chlamy domonas, chlorococcum), trong khi một số khác (spirogira) một không bào lớn chiếm phần lớn khoang tế bào. Những tế bào này chuyển động chứa không bào co bóp trong tế bào chất không màu của chúng, loại không bào này không có ở loài sống ở biển, chúng làm nhiệm vụ điều hòa áp suất thẩm thấu. Sinh sản ở tảo lục rất đa dạng, có thể gặp phổ biến cả ba hình thức sinh sản là sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính. Sinh sản vô tính có tất cả các kiểu đẳng giao, dị giao, toàn giao, tiếp hợp, noãn giao với túi noãn và túi tinh đơn bào hoặc đa bào. Chu trình sống cũng gặp các kiểu không có giao thế hệ, chỉ đơn bội (trừ hợp tử), gọi là kiểu “H”, “d” (Haplobiontic – chu trình sống chỉ có một kiểu cơ thể và diploid – kiểu khác là hợp tử lưỡng bội) hoặc chỉ lưỡng bội (trừ giao tử ), gọi là kiểu “H”, “h” (H có nghĩa như trường hợp trên và haploid – kiểu khác là giao tử đơn bội) và kiểu giao thế thế hệ đồng hình (Di , h + d) và giao thế thế hệ dị hình (D h , h + d), cả hai kiểu này trong chu trình sống có hai kiểu cơ thể haploid và diploid. [2] - Bộ Volvocales Tảo sống đơn độc hay tập đoàn. Trừ họ Polyblepharidaceae và một loài khác nữa còn đều có màng sinh chất. dinh dưỡng tự dưỡng nhờ quang hợp thể màu có nhiều hình dạng tùy loài, trên chúng ít nhất là một hạch tạo bột. Tế bào có 1,2,4, hoặc 8 roi, chủ yếu là dạng hai roi, roi có cấu trúc điển hình gồm 9 đôi sợi ngoại biên và một đôi ở trung tâm. Điểm mắt nằm trên thể màu. Tế bào có một nhân. Không có không bào Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 24 trung tâm nhưng có một hay nhiều không bào co bóp (trừ loài sống ở nước mặn). Sinh sản vô tính bằng phân chia nguyên nhiễm tế bào bố mẹ diễn ra khá nhanh tạo nên 2,4,8 hoặc nhiều tế bào con trong tế bào mẹ ở loài có màng tế bào, ở những loài không có màng tế bào thì sự phân chia tế bào diễn ra ngay khi tế bào đang chuyển động như Dunaliella, những loài có màng thì hầu hết chuyển sang bất động trong quá trình phân chia. Volvocaceae thì hình thành tập đoàn sinh trưởng bằng phân đôi của tất cả (pandorina) hoặc một số volvox tế bào của tập đoàn hình thành tập đoàn phôi thai rồi giải phóng ra khỏi tập đoàn mẹ, lớn lên do tăng kích thước tế bào chứ không phải phân chia thêm. Sinh sản hữu tính là đẳng giao, dị giao hay noãn giao tùy thuộc loài. Cả ba kiểu trên xảy ra trong những loài sinh sản hữu tính của chlamydomonas, trong khi mỗi kiểu lại đặc trưng cho vài chi của vollvocales. Có thể tất cả có chu trình sống kiểu H, h. Họ Chlamydomonadaceae Cơ thể cũng là đơn bào nhưng khác với họ Polyblepharidaceae bởi tế bào có vách. Chúng khác biệt về di truyền bởi số lượng roi và hình dạng tế bào. [2] - Chi Tetaselmis (Carteria) Có 4 roi, có sự khác biệt về cấu tạo của hạch tạo bột. Sinh sản vô tính bằng cách phân chia tế bào và giải phóng ra hai, bốn hoặc tám sản phẩm vận động. [2],[11] 2.3. Sơ lược về công nghệ sản xuất đại trà vi tảo 2.3.1. Lịch sử nghiên cứu Lịch sử nuôi trồng đại trà vi tảo khá ngắn, bắt đầu từ những thử nghiệm đầu những năm 1950, ngày nay, sản lượng tảo khô hàng năm trên thế giới sản xuất là khoảng hơn 9000 tấn. Sản xuất đại trà tảo Scenedesmus bắt đầu vào những năm 1960 ở Tiệp Khắc, Đức, Israel, Italia và một số nước Đông Âu. Trong khi đó, vi tảo lam Spirulina được nuôi trồng đại trà tại Mehico, Mỹ, Đài Loan, Israel, Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ và Việt Nam. Sản xuất sinh khối Dunaliella – nguồn β – caroten bắt đầu sản xuất trên diện rộng tại Israel và triển khai mạnh ở Australia. Porphyridium – một loài tảo đỏ, giàu polysaccharid và acid arachidonic được nuôi trồng đại trà tại Pháp. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 25 2.3.2. Các kiểu bể nuôi trồng tảo Việc phát triển công nghệ nuôi trồng vi tảo, đòi hỏi phải giải quyết hàng loạt các vấn đề về sinh học của chủng tảo được chọn, các thông số hóa lý của môi trường, dinh dưỡng, thủy động lực học, các kỹ thuật khuấy, bổ sung CO2, tách, lọc, sấy sinh khối … Điều này liên quan mật thiết tới việc áp dụng các hệ thống nuôi trồng khác nhau. Có thể nuôi trồng công nghiệp vi tảo theo phương pháp quảng canh hoặc thâm canh, trong hệ thống kín hoặc hở, với tảo sạch vi khuẩn hoặc không. Rất khó đánh giá được phương pháp nào là ưu việt nhất vì việc chọn hệ thống sản xuất phụ thuộc phần lớn vào các loài tảo và sản phẩm cần khai thác. Người ta dùng phương pháp nuôi CO2 hoặc HCO3- Khoáng chất Nước Ánh sáng Nhiệt độ (20-40oC) Tảo giống Guồng Lọc Li tâm cô bớt nước Sấy Đóng gói tảo khô Chế biến hoặc sử dụng trực tiếp Thu hồi chất khoáng còn lại Môi trường Hình 2.7. Quy trình công nghệ sản xuất đại trà vi tảo [1] Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 26 quảng canh để sản xuất sinh khối tảo Chlorella, Spirulina, và Scenedesmus với mục đích nhận protein đơn bào và thức ăn bổ dưỡng, sản xuất Dunaliella để nhận β – caroten. Phương pháp nuôi trồng này là đơn giản và rẻ nhất nhưng phải ứng dụng với môi trường nuôi có chọn lọc. Ví dụ Dunaliella salina sinh trưởng trong môi trường có nồng độ muối tới hơn 20% trong khi tảo Spirulina platensis chịu được pH cao hơn 9. Khi tiến hành thiết kế bể nuôi tảo, người ta phải cân nhắc tới một số yếu tố sau: - Độ sâu tối ưu của dịch tảo có tính tới mức độ ánh sáng mặt trời xuyên xuống - Tốc độ khuấy phù hợp với nhu cầu năng lượng. khuấy sục môi trường nhằm khử các không gian chết trong bể và giữ tế bào luôn ở dạng huyền phù mà không làm ảnh hưởng tới hoạt tính sinh lý của tảo. - Vật liệu xây dựng bể. Hệ thống nuôi trồng đại tà vi tảo được chia thành 5 loại (Borowitzka, 1991) [1] 2.3.2.1. Hệ thống bể nông (shallow ponds) Ưu điểm là vốn đầu tư xây dựng và kinh phí vận hành thấp. nhược điểm cơ bản của hệ thống là năng suất thấp và khả năng sản xuất không ổn định, độ tin cậy thấp. Hệ thống đòi hỏi diện tích đất lớn. Một số ao nông, diện tích rộng hiện nay đang được dùng như dạng ao ổn định để xử lý nước thải. Trong hệ thống này, sinh khối tảo chỉ được coi như sản phẩm thứ cấp [1] 2.3.2.2 Hệ thống bể dài (Rayceways) Là dạng bể thông dụng, ngoài trời và dùng cho nuôi quảng canh. Hệ thống được đưa vào sử dụng trong những năm 1960. Thông thường hai đầu bể được vuốt tròn để giản trở lực khi dòng huyền phù vận động tuần hoàn. Lúc đầu, nhiều dạng thiết kế sử dụng bơm đẩy tạo vận tốc của dòng chảy lên tới 30 cm/s. Trong những năm 1970, dạng guồng (paddlewheel) đã được đưa vào sử dụng khá hiệu quả vì tiêu tốn năng lượng ít hơn. Đôi khi người ta sử dụng phương pháp thổi khí nhờ máy nén khí để tạo dóng chảy. Các bể có thể có thành chung để giảm chi phí xây dựng. Hình 2.8. Hệ thống bể dài (rayceways) Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 27 Điển hình của dạng bể nảy là dùng cho sản xuất tảo Spirulina tại nhiều nơi trên thế giới, trong đó có Việt Nam. Tại Bình Thuận, dạng bể này được ứng dụng với hệ thống bơm khuấy trục vít Savonius chạy bằng năng lượng gió. Cần lưu ý thêm là hệ thống cần đầu tư tương đối cao và co chi phí vận hành lớn nếu muốn có sinh khối chất lượng cao. Ưu điểm là năng suất sinh khối chấp nhận được và hệ thống có tính ổn định cao. [1] 2.3.2.3. Hệ thống nghiêng (Cascade) Trong trường hợp này, dung dịch huyền phù được vận chuyển trên bề mặt bể nghiêng 30 và tuần hoàn nhờ bơm đặt ở phần thấp nhất. Kiểu bể này do Shetlik (Tiệp Khắc cũ) thiết kế và ứng dụng thành công tại Bungari với quy mô gần 5000 m2 để sản xuất tảo lục thuộc chi Chlorella và Scenedesmus. Dung dịch tảo vận hành trên bề mặt nghiêng và phải vượt qua nhiều thanh chắn nhỏ, nằm ngang để tối ưu hóa cho việc trao đổi khí và ánh sáng. Mật độ tảo có thể đạt tới 3gr/lít. Ưu điểm cơ bản của hệ thống là năng suất sinh khối cao và khá ổn định. Tuy vậy, hệ thống chỉ giới hạn cho việc nuôi trồng vi tảo lục và đòi hỏi chi phí đầu tư ban đầu cũng như vận hành cao. [1] 2.3.2.4. Hệ thống bể phản ứng quang sinh dạng ống (tubular photobioreactor) Các bể này được thiết kế thành công nhất tại Anh và Pháp. Đây là dạng hệ thống kín. Về cơ bản, hệ thống bể bao gồm: Một bể phản ứng dạng ống được thiết kế bằng vật liệu cho ánh sáng xuyên qua Hình 2.9. Mô hình bể nghiêng kiếu shetlik [1] Hình 2.10. Mô hình bể phản ứng quang sinh dạng ống Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 28 Một tháp bổ sung CO2 Thiết bị bơm tạo dòng tuần hoàn của dịch huyền phù tảo. Ưu điểm chính của hệ thống này là giảm bốc hơi nước và giảm khả năng bị lây nhiễm tảo khác. Nhược điểm của hệ thống là đầu tư cao, không tận dụng được triệt để ánh sáng tự nhiên và có nguy cơ bị đốt nóng vào mùa hè.Mặc dù có một số ưu điểm quan trọng, hệ thống này cần hoàn thiện một số khâu sau: Chọn loại bơm sao cho không làm thương tổn tới tế bào tảo Nồng độ O2 cao trong bể kín sẽ ức chế quang hợp của tảo. Chọn phương pháp để giảm chi phí vận hành tháp bổ sung CO2 Ví dụ điển hình của hệ thống này là cơ sở sản xuất porphyridium tại Caradache, Pháp [1] 2.3.2.5. Hệ thống bể lên men Đây cũng là bể kín cần đầu tư ban đầu và kinh phí vận hành lớn. Về nguyên tắc, hệ thống giống như các bể lên men vi sinh vật nhưng phải được trang bị thêm thiết bị chiếu sáng cho tảo quang hợp. Nhiều nước sử dụng hệ thống này kèm theo thiết bi điều chỉnh tự động các thông số môi trường thông qua một máy vi tính. Vi tảo nuôi trồng trong hệ thống này là sạch thuần khiết. [1] 2.3.3. Tách sinh khối Thu hoạch tảo là thao tác ảnh hưởng lớn đến giá thành sản xuất. cho đến nay, nhiều phương pháp thu sinh khối đã được ứng dụng như li tâm, kết lắng hóa học, kết lắng bằng điện trường, tự kết lắng, lọc trọng trường, lọc chân không … [1] 2.3.3.1. phương pháp ly tâm Có thể dùng để thu hoạch vi tảo dạng sợi hoặc đơn bào. Phương pháp ly tâm có ưu điểm chính là đơn giản và không phải sử dụng hóa chất bổ sung. Tuy vậy, chi phí Hình 2.11. Mô hình sản xuất tảo sạch vi khuẩn trong hệ thống kín [1] Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 29 năng lượng của phương pháp thu hoạch này là khá lớn (khoảng 1kwh/m3) khiến việc sử dụng nó chỉ khả thi trong những cơ sở sản xuất cho ra các sản phẩm chất lượng cao. [1] 2.3.3.2. Phương pháp lọc Là phương pháp khả thi cho thu hoạch nhiều loài tảo khác nhau. Vật liệu dùng cho lọc cơ học là cát mịn, sợi cellulose … tốc độ lọc chậm và màng lọc hay bị bít tắc do chính sinh khối tảo và vi sinh vật khiến phương pháp này cần lượng nước khá lớn để rửa thường xuyên. Trong các phương pháp lọc khác nhau thì lọc nén áp suất có triển vọng hơn cả do tốc độ nhanh và khả thi cho sản xuất lớn vì giá thành không quá cao. Nhiều màng lọc đặc biệt vận hành theo kiểu màng rung, màng xoay, màng nghiêng và màng vi lỗ đã được thử nghiệm để tách sinh khối tảo khỏi môi trường. Phương pháp có ưu điểm là tốc độ nhanh và sinh khối rất sạch. Nhược điểm chính của phương pháp này là màng hay bị bít tắc và sơi tảo bị gãy sẽ có nguy cơ làm tăng thêm các chất hữu cơ trong môi trường. Những năm gần đây, một số cơ sở sản xuất tảo sử dụng thiết bị của hãng Waco (Canada) để tách Spirulina khỏi pha lỏng. Thiết bị kết hợp kỹ thuật chân không với màng lọc rung. Tuy vậy, một số tế bào tảo bị phá hủy khi qua thiết bị sẽ làm ảnh hưởng xấu tới chất lượng dịch hoàn lưu. Những tảo đơn bào (Dunaliella, Chlorella, Scenedesmus …) thường đòi hỏi thu hoạch bằng ly tâm, lọc hoặc bằng phương pháp tạo bông. [1] 2.3.3.3. Phương pháp tạo bông - Tự kết lắng : Hiện tượng tự kết lắng xảy ra khi pH tăng; khi tế bào lắng xuống cùng với Ca2+, Mg2+ và muối phosphate hoặc carbonat. Mặt khác, đây cũng là hậu quả của sự tương tác giữa tảo và vi khuẩn hoặc giữa tảo và các polyme hữu cơ trong môi trường. Ví dụ: tảo Scenedesmus sinh trưởng tối ưu trong pH trung tính sẽ dễ dàng bị kết lắng khi ta đưa pH lên 8.5 Kết lắng bằng các chất hóa học: Những chất được coi là gây hiệu ứng tạo bông tốt đối với vi tảo là sunphat nhôm, Ca(OH)2, sunphat sắt, clorua sắt và một số polyme khác. Yếu điểm của phương Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 30 pháp này là sinh khối tảo sau khi thu hoạch sẽ chứa một lượng hóa chất không mong muốn và bản thân phương pháp sẽ làm ô nhiễm môi trường nuôi trồng nếu sau thu hoạch môi trường được hoàn lưu. [1] 2.3.4. Sấy sinh khối Sau khi tách tảo khỏi môi trường và cô đặc sơ bộ, phải tiến hành ngay việc sấy để giữ sinh khối khỏi bị vi sinh vật hủy hoại. Trong sản xuất tảo hiện nay, người ta sử dụng nhiều phương pháp sấy. Bảng 2.2. Một số phương pháp sấy sinh khối tảo [1] Phương pháp Ưu và nhược điểm Đối tượng Ưu điểm Nhược điểm Sấy tiếp xúc (sấy hình trống) Nhanh, hiệu quả Giá thành cao Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Phơi nắng Đầu tư thấp Chậm, phụ thuộc thời tiết Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Sấy mặt trời sử dụng hiệu ứng lồng kính Hiệu quả hơn phương pháp 2 Phụ thuộc thời tiết Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Sấy phun khô Nhanh, hiệu quả Chi phí cao Chlorella, Scenedesmus, Spirulina, Dunaliella Cô chân không Hiệu quả Vốn đầu tư lớn Spirulina Sấy đông cô Đảm bảo chất lượng Chậm, chi phí cao Chlorella, Scenedesmus, Spirulina Việc sấy sinh khối chiếm tỉ lệ chi phí khá cao của quá trình sản xuất tảo. Các phương pháp sấy được đề xuất phụ thuộc nguồn vốn đầu tư, nhu cầu năng lượng và có ảnh hưởng rõ rệt đến chất lượng sản phẩm, đặc biệt đối với tảo lục có thành tế bào rất chắc. [1] 2.3.4.1 Phương pháp sấy phun: Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 31 Cho sản phẩm bột rất đồng đều nhưng chi phí cao. Việc bổ sung một số chất chống ô xy hóa vào dịch tảo trước khi sấy phun có thể giữ nguyên chất lượng sắc tố và vitamin của sinh khối. Tuy vậy, khả năng tiêu hóa của tảo lục sấy phun khô chỉ đạt 50% so với 80% khi tảo này được sấy tiếp xúc. Tuy nhiên phương pháp sấy tiếp xúc làm biến tính protein so với sấy phun. [1] 2.3.4.2 Sấy mặt trời: Đây là phương pháp sấy rẻ nhất. Tính toán cho thấy để làm khô lớp sinh khối tảo dày 0.75 cm cần ít nhất 1 ngày. Vì tốc độ sấy khô rất chậm và phụ thuộc thời tiết nên phương pháp tỏ ra không hiệu quả khi áp dụng cho sản xuất lớn. [1] 2.3.4.3. Phương pháp sấy đông khô Phương pháp này tỏ ra hiệu quả trong việc ổn định thành phần sinh hóa của tảo nhưng không có triển vọng được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ sản xuất đại trà vi tảo.[1] 2.4. Sơ lược về nhiên liệu sinh học 2.4.1. Định nghĩa Thuật ngữ nhiên liệu sinh học (biofuels) bao gồm các nguồn năng lượng được sản xuất từ nhiều loại sản phẩm nông nghiệp khác nhau như thân, cành, vỏ, quả, cây, các sản phẩm dư thừa khi chế biến nông, lâm sản, gỗ củi, phân gia súc, nước thải và bã phế thải hữu cơ công nghiệp, rác thải... 2.4.2. Phân loại nhiên liệu sinh học Hiện có 3 dạng năng lượng sinh học chủ yếu là ethanol sinh học, khí sinh học và diesel sinh học. - Cồn sinh học (bioethanol) là cồn được chế biến thông qua quá trình lên men các sản phẩm hữu cơ như tinh bột, cellulose, lignocellulose. Việc sản xuất cồn sinh học từ các nguồn tinh bột hoặc các cây thực phẩm được cho là không bền vững do ảnh hưởng tới an ninh lương thực. Việc sản xuất cồn sinh học từ sinh khối và sinh khối phế thải nông nghiệp không ảnh hưởng đến an ninh lương thực là hướng đi nhiều triển vọng. Tuy nhiên, tại thời điểm hiện tại (2010) công nghệ sản xuất cồn sinh học từ các nguồn lignocellulose chỉ đạt được hiệu suất thấp và giá thành còn cao. Theo ước tính, sau khoảng 7 – 10 năm, công nghệ này sẽ được hoàn thiện, đáp ứng được nhu cầu sản xuất và thương mại. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 32 - Khí sinh học (Biogas): được tạo ra sau quá trình ủ lên men các vật liệu hữu cơ. Sản phẩm tạo thành ở dạng khí (methane và đồng đẳng khác) có thể dùng làm nhiên liệu đốt cháy thay cho gas từ sản phẩm dầu mỏ. Sản xuất khí sinh học đã được phát triển từ khá lâu và có nhiều mô hình triển khai rộng rãi. - Diesel sinh học (Biodiesel): được dẫn xuất từ các loại dầu sinh học (thường được thực hiện thông qua quá trình tranester hóa bằng cách cho phản ứng với các loại rượu phổ biến nhất là methanol. Diesel sinh học có thể sử dụng thay thế cho diesel. 2.4.3. Biodiesel 2.4.3.1. Biodiesel là gì ? Biodiesel hay diesel sinh họ c là một loại nhiên liệu có tính chất giống với dầu diesel nhưng không phải được sản xuất từ dầu mỏ mà từ dầu thực vật hay mỡ động vật. Theo tiêu chuẩn ASTM thì Biodiesel được định nghĩa: “là các mono alkyl Ester của các acid mạch dài có nguồn gốc từ các lipit có thể tái tạo lại như:dầu thực vật, mỡ động vật, được sử dụng làm nhiên liệu cho động cơ diesel”. Bản chất của Biodiesel là sản phẩm ester hóa giữa methanol hoặc ethanol và acid béo tự do trong dầu thực vật hoặc mỡ động vật. Tùy thuộc vào loại dầu và loại rượu sử dụng mà alkyl ester có tên khác nhau: - Nếu đi từ dầu cây đậu nành (soybean) và Methanol thì ta thu được SME (soy methyl Esters). Đây là loại Esters thông dụng nhất được sử dụng tại Mỹ. - Nếu đi từ dầu cây cải dầu (rapeseed) và Methanol thì ta thu được RME (rapeseed methyl Esters). Đây là loại Esters thông dụng nhất được sử dụng ở châu Âu. 2.4.3.2. Lịch sử phát triển của Biodiesel Biodiesel bắt đầu được sản xuất khoảng giữa năm 1800, trong thời điểm đó người ta chuyển hóa dầu thực vật để thu Glycerol ứng dụng làm xà phòng và thu được các phụ phẩm là methyl hoặc ethyl Ester gọi chung là Biodiessel. Ngày 10/08/1893 lần đầu tiên Rudolf Diesel đã sử dụng Biodiesel do ông sáng chế để chạy máy. Năm 1912, ông đã dự báo: “Hiện nay, việc dùng dầu thực vật cho nhiên liệu động cơ có thể không quan trọng, nhưng trong tương lai, những loại dầu như thế chắc chắn sẽ có giá trị không thua gì các sản phẩm nhiên liệu từ dầu mỏ và than đá”. Trong bối cảnh nguồn tài nguyên dầu mỏ đang cạn kiệt và những tác động xấu lên môi trường của việc sử dụng nhiên liệu, nhiên liệu tái sinh sạch trong đó có Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 33 Biodiesel đang ngày càng khẳng định vị trí là nguồn nhiên liệu thay thế khả thi. Để tưởng nhớ nguời đã có công đầu tiên đoán được giá trị to lớn của Biodiesel, Nation Board Biodiesel đã quyết định lấy ngày 10 tháng 8 hằng năm bắt đầu từ năm 2002 làm ngày Diesel sinh học Quốc tế (International Biodiesel Day). - Năm 1900 tại Hội chợ thế giới tổ chức tại Pari, Diesel đã biểu diễn động cơ dùng dầu biodiesel chế biến từ dầu Phụng (lạc). - Trong những năm của thập kỷ 90, Pháp đã triển khai sản xuất Biodiesel từ dầu hạt cải. Và được dùng ở dạng B5 (5% Biodiesel với 95% Diesel) và B30 (30% Biodiesel trộn với 70% Diesel). 2.4.3.3. Ưu và nhược điểm của Biodiesel - Ưu điểm: + Về mặt môi trường Giảm lượng phát thải khí CO2, do đó giảm được lượng khí thải gây ra hiệu ứng nhà kính. Không có hoặc chứa rật ít các hợp chất của lưu huỳnh (nhỏ hơn 0.001% so với đến 0.2% trong dầu Diesel) Hàm lượng các hợp chất khác trong khói thải như: CO, SOx, HC chưa cháy, bồ hóng giảm đáng kể. Không chứa HC thơm nên không gây ung thư Có khả năng tự phân hủy và không độc (phân hủy nhanh hơn Diesel 4 lần, phân hủy từ 85% đến 88% trong nước sau 28 ngày) Giảm ô nhiễm môi trường nước và đất Giảm tiêu dùng các sản phẩm dầu mỏ + Về mặt kỹ thuật Có chỉ số cetan cao hơn diesel. Biodiesel rất linh động, có thể trộn với diesel theo bất kỳ tỉ lệ nào. Biodiesel có điểm chớp cháy cao hơn Diesel, đốt cháy hoàn toàn, an toàn trong tồn chứa và sử dụng. Có tính bôi trơn tốt. Ngày nay, để hạn chế lượng SOx thải ra không khí, người ta hạn chế tối đa lượng S trong dầu Diesel. Nhưng, chính những hợp chất lưu huỳnh lại Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 34 là những tác nhân giúp giảm ma sát của dầu Diesel. Do vậy, dầu Diesel có tính bôi trơn không tốt, đòi hỏi phải sử dụng thêm các chất phụ gia để tăng tính bôi trơn. Trong thành phần của biodiesel, có chứa Oxi, cũng có tác dụng giảm ma sát giống S. Do có tính năng tương tự dầu Diesel, nên nhìn chung, khi sử dụng Biodiesel không cần cải thiện bất kỳ chi tiết nào của động cơ (riêng đối với hệ thống ống dẫn, bồn chứa làm bằng nhựa, ta phải thay bằng vật liệu kim loại). + Về mặt kinh tế Sử dụng nhiên liệu Biodiesel ngoài vấn đề giải quyết ô nhiễm môi trường, nó còn thúc đẩy ngành nông nghiệp phát triển, tận dụng tiềm năng sẵn có của ngành nông nghiệp như dầu phế thải, mỡ động vật và các loại dầu khác ít có giá trị sử dụng trong thực phẩm. Đồng thời, đa dạng hóa nền nông nghiệp và tăng thu nhập ở vùng nông thôn. Hạn chế nhập khẩu nhiên liệu Diesel - Nhược điểm Bên cạnh lợi ích của phát triển nhiên liệu sinh học, còn có không ít nguy cơ về môi trường, kinh tế và xã hội. Đây là hai mặt của một quá trình phát triển. Vấn đề là thúc đẩy lợi ích của nhiên liệu sinh học và hạn chế những nguy cơ. + Vấn đề lương thực: Việc sử dụng đất để trồng cây nguyên liệu sản xuất nhiên liệu sinh học có thể ảnh hưởng đến nguồn cung cấp lương thực hoặc làm tăng giá lương thực, đặc biệt đối với các nước đang phát triển. Khi người nông dân thấy trồng cây nguyên liệu (như mía đường, cọ...) có lợi hơn trồng lúa, ngô, khoai, sắn, họ sẽ thôi cấy lúa, chuyển sang trồng mía, cọ để cung cấp cho các nhà máy và làm cho sản lượng lương thực giảm. + Ô nhiễm và cạn kiệt nguồn tài nguyên nước: Nhiều loại cây nguyên liệu đòi hỏi rất nhiều nước trong quá trình sinh trưởng, vì vậy nếu trồng với số lượng quá lớn, diện tích quá rộng sẽ làm cạn kiệt các nguồn nước trong khu vực. Ngoài ra, việc sử dụng tràn lan vinhoto, một chất được dùng để bón và tưới khi trồng mía đường cũng có thể gây ô nhiễm sông ngòi, kênh rạch và làm cho các loài thuỷ sinh không thể tồn tại. Năm 2003, người ta đã ghi nhận được một trường hợp bội nhiễm vihoto xảy ra tại Sao Paolo khiến cá chết hàng loạt trên suốt 95 dặm sông Rio Grande của Braxin. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 35 + Về mặt kỹ thuật Biodiesel cung cấp năng lượng thấp hơn Diesel thông thường, vì vậy, nếu tỉ lệ Biodiesel cao, thì động cơ sẽ yếu hơn hoặc phải dùng nhiều nhiên liệu hơn mới đạt được công suất như khi dùng Diesel thông thường. Biodiesel Oxi hóa nhanh hơn do đặc điểm thành phần hóa học, do đó khó có thể tích trữ loại nhiên liệu này lâu, đòi hỏi phải có thêm chất phụ gia. Nhược điểm lớn nhất về mặt kỹ thuật là Biodiesel nguyên chất dễ bị đóng băng hoặc đặc lại trong thời thiết lạnh. 2.4.3.4. Những nguồn nguyên liệu để sản xuất Biodiesel ở Việt Nam Ở nước ta, Biodiesel có thể được sản xuất từ một trong những nguồn sau: - Dầu mỡ thải đã qua sử dụng: gồm các phế phẩm dầu mỡ đi từ các nhà máy chế biến dầu mỡ, dầu mỡ đã qua sử dụng được thu hồi sau quá trình rán, nấu từ các cơ sở chế biến thức ăn. - Rỉ đường, ngũ cốc, vừng, lạc, dừa, mỡ cá Basa… - Cây Jatropha có nguồn gốc từ Trung M ỹ, di thực sang châu Phi, Ấn Độ và Nam Mỹ. Cây chịu được hạn, trồng ở đất khô cằn, có nhiều loại. Nước ta có thể tận dụng 9 triệu ha đất hoang hóa dọc ven các đường quốc lộ để trồng loại cây này. - Vi tảo: một nguồn nguyên liệu triển vọng do sự phát triển đơn giản, vòng đời ngắn, năng suất cao, hệ số sử dụng năng lượng ánh sáng cao, thành phần sinh hóa dễ được điều khiển tùy điều kiện nuôi cấy và nhờ kĩ thuật di truyền, nuôi trồng đơn giản, thích hợp với quy mô công nghiệp. [1] CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 36 CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu và môi trường 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu Giống tảo Tetraselmis được phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học, khoa sinh học, đại học Khoa Học Tự Nhiên cung cấp. 3.1.2. Địa điểm thí nghiệm Phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học, khoa sinh học, Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh Kiểm tra định tính dầu tảo tại viện Sinh Học Nhiệt Đới tp. HCM 3.1.3. Hóa chất - Cồn 960, Cồn 700 - Thuốc nhuộm Nile Blue 1% - Acid Acetic 8% - Nước cất - Nước biển tự nhiên - NaNO3 - NaH2PO4 - Na2SiO3.9H2O - FeCl3.6H2O - Na2EDTA.2H2O - CuSO4.5H2O - Na2MoO4.2H2O - ZnSO4.7H2O - CoCl2.6H2O - MnCl2.4H2O - ZnCl2 - (NH4)6Mo7O24.4H2O - H3BO3 - NaCl - Vitamin B12 - Biotin - Vitamin B1 3.1.4. Thiết bị - Nồi hấp khử trùng - Tủ cấy vô trùng - que cấy - đèn cồn - tủ sấy - Kính hiển vi huỳnh quang - Kính hiển vi quang học - Cân phân tích - chai nước biển 0.25l, 0.5L - Bình thủy tinh 1.5L - Bơm sục khí - Bình nhựa trong 10L Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 37 3.1.5. Môi trường 3.1.5.1. Môi trường F/2 (Guillard and Ryther 1962, Guillard 1975) [9] Để chuẩn bị môi trường F/2 để nuôi vi tảo biển, bắt đầu với 950 ml nước biển tự nhiên, bổ sung các thành phần theo bảng, bổ sung NaCl để đạt độ mặn theo yêu cầu. Định mức bằng nước biển đến 1000ml. Hấp khử trùng. Bảng 3.1. Thành phần dinh dưỡng của môi trường F/2 Thành phần Dung dịch gốc (stock) Hàm lượng NaNO3 75 g/L dH2O 1 mL NaH2PO4 .H2O 5 g/L dH2O 1 mL Na2SiO3 .9H2O 30 g/L dH2O 1 mL Dung dịch vi lượng (Bảng dưới) 1 mL Dung dịch vitamin (Bảng dưới) 0.5 mL - Dung dịch khoáng vi lượng môi trường F/2 Để chuẩn bị dung dịch khoáng vi lượng của môi trường F/2, bắt đầu với 950 ml nước cất, bổ sung các thành phần khoáng theo bảng, định mức đến 1000 ml bằng nước cất. Bảng 3.2. Thành phần khoáng vi lượng đậm đặc của môi trường F/2 Thành phần Dung dịch gốc (stock) (g/L H2O) Hàm lượng FeCl3.6H2O --- 3.15 g Na2EDTA.2H2O --- 4.36 g CuSO4 .5H2O 9.8 1 mL Na2MoO4 .2H2O 6.3 1 mL ZnSO4 .7H2O 22.0 1 mL Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 38 CoCl2 .6H2O 10.0 1 mL MnCl2 .4H2O 180.0 1 mL - Dung dịch vitamin của môi trường F/2 Chuẩn bị dung dịch vitamin cho môi trường F/2 , bắt đầu với 950ml nước cất vô trùng, bổ sung các loại vitamin theo hàm lượng của bảng, định mức đến 1000ml , bảo quản trong tủ lạnh hoặc tủ đá. Bảng 3.3. Thành phần vitamin đậm đặc của môi trường F/2 Thành phần Dung dịch gốc (stock) (g/L H2O) Hàm lượng Thiamine HCl (vit. B1) --- 200 mg Biotin (vit. H) 0.1 10 mL Cyanocobalamin (vit. B12) 1.0 1 mL 3.1.5.2. Môi trường Walne (Walne PR, 1970) [16] - Dung dịch stock khoáng vi lượng môi trường Walne Bảng 3.4. Thành phần khoáng vi lượng đậm đặc môi trường Walne STT Thành phần Hàm lượng (g/ 100ml) 1 ZnCl2 2.1 2 CoCl2.6H2O 2.0 3 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.9 4 CuSO4 .5H2O 2.0 Hòa tan lần lượt các muối vào 90ml nước cất, định mức đến 100ml. Do trong thành phần dung dịch có ZnCl2, làm đục môi trường, nên khi pha xong, ta nhỏ vào vài giọt acid HCl loãng để làm trong. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 39 - Dung dịch stock vitamin môi trường Walne. [16] Bảng 3.5. Thành phần vitamin đậm đặc môi trường Walne STT Thành phần Hàm lượng (pha cho 100ml) 1 Vitamin B12 10.0 mg 2 Vitamin B1 10.0 mg 3 Vitamin H (Biotin) 200.0 µg Pha các vitamin vào 90ml nước cất vô trùng, sau đó định mức đến 100ml. Do Vitamin dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao nên dụng cụ phải được hấp khử trùng trước và thao tác trong môi trường vô trùng. - Dung dịch stock dinh dưỡng môi trường Walne [16] Bảng 3.6. Thành phần dinh dưỡng đậm đặc môi trường Walne STT Thành phần Hàm lượng (Pha cho 1000ml) 1 FeCl3.6H2O 1.3 2 MnCl2 .4H2O 0.36 3 H3BO3 33.6 4 Na2EDTA.2H2O 45.0 5 NaH2PO4 .H2O 20.0 6 NaNO3 100.0 7 Khoáng Vi lượng 1ml Pha lần lượt các chất dinh dưỡng vào 950ml nước cất, sau đó định mức thành 1000ml. Hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút. - Môi trường Walne Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 40 Bảng 3.7. Thành phần dinh dưỡng môi trường Walne [16] STT Thành phần Hàm lượng (ml/L) 1 Dung dịch dinh dưỡng 1 ml 2 Dung dịch vitamin 0.1 ml Pha môi trường Walne trong 1000ml nước biển đã hấp khử trùng. 3.1.5.3. Môi trường Walne thương mại (Walne TM): Cải tiến từ môi trường Walne, do công ty TNHH Công nghệ Hải Dương, tp. HCM sản xuất, được pha chế sẵn ở dạng hợp chất tinh thể. Bảng 3.8. Thành phần dinh dưỡng môi trường Walne TM STT Thành phần Hàm lượng (mg/L) 1 KNO3 9.366 2 NaH2PO4 .H2O 0.936 3 Na2SiO3 0.936 4 H3BO3 1.5735 5 Na2EDTA.2H2O 2.1075 6 FeCl3.6H2O 0.06 7 MnCl2 .4H2O 0.0165 8 ZnCl2 0.0048 9 CoCl2.6H2O 0.00465 10 (NH4)6Mo7O24.4H2O 0.00225 11 CoSO4.5H2O 0.0045 12 Vitamin B1 0.0375 13 Vitamin B12 0.00225 Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 41 3.1.5.4. Môi trường TT3 Môi trường đang được sử dụng tại trung tâm thủy sản 3 – Nha Trang. Bảng 3.9. Thành phần môi trường TT3 STT Thành phần Hàm lượng (mg/L) 1 KNO3 70 2 KH2PO4 6 3 Na2SiO3 5 4 EDTA 5 5 Acid citric C6H8O7.H2O 7 6 FeCl3.6H2O 2 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Chuẩn bị các dụng cụ thí nghiệm - Nguồn nước Nguồn nước biển sử dụng cho nuôi cấy và giữ giống được lấy ở bãi sau biển Vũng Tàu. Nước biển được lọc qua giấy lọc, sau đó cho 200ml vào các bình nước biển thể tích 500ml. bổ sung khoáng và dinh dưỡng và hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 20 phút. - Vệ sinh dụng cụ nuôi ống nghiệm, bình nuôi cấy, bình giữ giống, pipet, đầu típ, xilanh, môi trường (trừ vitamin) đều được hấp khử trùng ở 1210C, 1atm trong 20 phút. 3.2.2. Bố trí thí nghiệm 3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu. Thí nghiệm được tiến hành trong bình nước biển 500ml với 4 môi trường nuôi: F/2, Walne, Walne TM, TT3 với 3 lần lặp lại. Tổng cộng số bình thí nghiệm là 12. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 42 Điều kiện thí nghiệm Ban đầu, quy trình khảo sát được tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm (nhiệt độ ổn định khoảng 280C, chiếu sáng bằng ánh sáng đèn neon). Tuy nhiên, đây là điều kiện áp dụng cho quá trình giữ giống, ức chế quá trình sinh trưởng của tảo. nên trong 2 tuần đầu, mật độ tảo không đủ để thực hiện quá trình nhân giống phục vụ thí nghiệm.Buộc phải chuyển toàn bộ thí nghiệm ra điều kiện tư nhiên. - Độ mặn: 10% - Mật độ ban đầu: 230.000 tb/ml - Cường độ sáng: khoảng 10.000 – 60.000 lux (có lưới che nắng). Chiếu sáng tự nhiên bằng ánh sáng mặt trời. - Chu kỳ chiếu sáng: tự nhiên - Nhiệt độ: ngoài trời, biên độ giao động nhiệt độ từ 280C – 350C, chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm khoảng 70C – 100C. Mục đích: chọn được môi trường phù hợp cho tăng sinh của tảo Tetraselmis phục vụ cho công tác nghiên cứu và nuôi trồng đại trà. Tiến hành thí nghiệm: - Nhân giống: giống ban đầu được cung cấp bởi phòng thí nghiệm chuyển hóa sinh học (khoảng 10ml) được chuyển toàn bộ vào 100ml môi trường F/2 đã hấp khử trùng. Tiến hành nuôi ở điều kiện tự nhiên trong 5 ngày, mật độ đạt được khoảng 230.000 tb/ml. Chuyển 20ml dịch nuôi vào 180ml môi trường F/2, tiếp tục nuôi trong 5 ngày. Sau đó, chuyển toàn bộ 200ml dịch nuôi này vào bình chứa 800ml môi trường F/2. như vậy, lượng giống sau 15 ngày nuôi cấy đã đủ cho công tác lưu giữ giống và tiến hành thí nghiệm. - Làm thuần: Hình 3.1. Địa điểm thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 43 Từ bình giống 1L, hút ra 200 ml chia đều cho 4 bình có chứa 50ml các môi trường: F/2, TT3, Walne, Walne TM. Tiến hành nuôi trong thời gian 7 ngày, như vậy, ta có 4 bình môi trường khác nhau (mỗi bình 100ml) để tiến hành thí nghiệm khảo sát môi trường tối ưu. Mục đích của giai đoạn làm thuần này là giúp tảo thích nghi với điều kiện môi trường mới, tránh stress do thay đổi môi trường đột ngột. - Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi Chuẩn bị 4 lô thí nghiệm, mỗi lô là một môi trường khác nhau gồm 3 bình, mỗi bình 200ml. Chuyển 20ml dịch nuôi đã làm thuần vào các môi trường tương ứng. Tiến hành nuôi ở điều kiện tự nhiên - Chỉ tiêu theo dõi: Mật độ tế bào, được theo dõi thông qua chỉ số độ hấp thu ánh sáng (OD) của dịch nuôi. Ghi nhận 2 ngày môt lần. Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 44 Hình 3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 Môi trường F/2 Môi trường TT3 Môi trường Walne Môi trường Walne TM Lưu giữ giống gốc Nhân giống cấp I Làm thuần 20ml Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 45 3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Định tính lipid trong tảo Thí nghiệm này được thực hiện tại viện sinh học nhiệt đới tp. HCM Tiến hành thí nghiệm: Sau thí nghiệm 1, ta chọn được môi trường tăng trưởng tối ưu cho tảo Tetraselmis, lấy mẫu dịch nuôi trong môi trường này để kiểm tra định tính lipid. Lắc đều dịch nuôi cấy, dùng pipet vô trùng hút 1ml vào eppendort 1.5ml Thao tác trên ngọn lửa đèn cồn, dùng que cấy vòng chuyển vài giọt dịch nuôi cấy lên lam kính. Cố định mẫu bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa (chú ý không để quá nóng sẽ làm vỡ hoặc teo tế bào) Nhuộm bằng thuốc nhuộm Nile blue A Quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Hình 3.3. Nhuộm mẫu tảo với Nile Blue A A. Nhuộm Nile Blue B. Sau khi rửa với acid acetic 3.3. Phương pháp xác định các chỉ tiêu 3.3.1. Xác định mật độ tế bào - Mẫu tảo được lấy 2 ngày một lần, một lần trong ngày vào lúc 10 giờ sáng - Lượng mẫu lấy mỗi lần: 4-6 ml A B Hình 3.4. Buồng đếm hồng cầu Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 46 - Mật độ tế bào được xác định bằng hai phương pháp: + Buồng đếm hồng cầu hiệu Hirschmann của Đức Diện tích 1mm2, độ sâu 0.1mm + Độ hấp thu ánh sáng của dung dịch tảo được xác định trên máy quang phổ tử ngoại khả kiến (Spectrophotometer) CECIL – CE 1011. Trên cơ sở đo độ hấp thu ánh sáng (OD) của các dung dịch mẫu với mật độ tảo khác nhau, xác lập phương trình hồi quy tuyến tính giữa độ hấp thu ánh sáng và mật độ tảo (với bước sóng 660 nm). Từ đó có thể xác định nhanh mật độ của tảo thông qua đo OD. 3.3.2. Xác định độ mặn. Độ mặn của nước biển được xác định bằng tỷ trong kế của Trung Quốc trước khi bố trí thí nghiệm nhằm xác định và bổ sung NaCl cho đạt theo yêu cầu. Hình 3.6. Tỷ trọng kế Hình 3.5. Máy đo OD A. nhìn ngang B. Nhìn từ trên xuống A B Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 47 3.3.3. Phương pháp định tính Lipid Định tính lipid bằng phương pháp phổ huỳnh quang nhờ thuốc nhuộm Nile blue. Công thức phân tử: C20H20C1N30 Hình 3.7. Công thức Nile Blue A A. Công thức hóa học B. Công thức không gian Nguyên tắc: Nile blue là thuốc nhuộm huỳnh quang dùng để phân biệt chất béo trung tính từ các acid béo. Thuốc nhuộm này sẽ kết hợp với giọt dầu trong tế bào và phát xạ huỳnh quang màu cam đậm khi được kích thích bằng phổ huỳnh quang màu lục. Thiết bị phân tích huỳnh quang Sơ đồ quang học Hình 3.8. Sơ đồ quang học của máy phân tích huỳnh quang Bộ đơn sắc Mẫu đo Bộ đơn sắc Ghi tín hiệu 1 Nguồn sáng 2 3 4 5 Detector A B Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 48 Phương pháp nhuộm Nile blue A - Mẫu tảo được cố định trên lam kính bằng cách hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn - Nhuộm Nile blue 1%, để 5 phút. - Rửa nhẹ với dung dịch acid acetic 8% - Rửa lại với nước cất - Để trong tối 10 phút. CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 49 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ & BIỆN LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: khảo sát môi trường tăng trưởng tối ưu Tảo Tetraselmis được nuôi tro ng 16 ngày, trên 4 môi trường: F/2, Walne, Walne TM, TT3. Giá trị độ hấp thu mật độ quang (OD) được ghi nhận sau 2 ngày nuôi và 2 ngày một lần, kết quả thu được như sau: 4.1.1. Phương trình đường tuyến tính giữa mật độ và độ hấp thu (OD) của môi trường F/2. OD Số lượng tế bào trên buồng đếm hồng cầu Số tb trung bình trong buồng đếm Mật độ tb trong 1ml Lần 1 Lần 2 Lần 3 0.101 14 9 15 12.7 127.000 0.202 16 13 19 16 160.000 0.303 23 26 19 22.7 227.000 0.401 29 28 31 29.3 293.000 0.505 37 42 31 36.7 367.000 Biểu đồ 4.1. Đường tuyến tính giữa độ hấp thu ánh sáng và mật độ của tảo Tetraselmis y = 608793x + 50701 R2 = 0.9855 0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 OD M ật đ ộ (tế b ào /m l) Luận văn tốt nghiệp đại học khóa 08 SVTH: Cao Hoàng Sơn Ngành công nghệ sinh học nông nghiệp 50 4.1.2.Tăng trưởng của tảo Tetraselmis trên các môi trường thử nghiệ