Luận văn Khảo sát khả năng ứng dụng của màng bc hấp phụ dịch nisin trong bảo quản lòng đỏ trứng vịt muối

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC ------------o0o------------ LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA MÀNG BC HẤP PHỤ DỊCH NISIN TRONG BẢO QUẢN LÒNG ĐỎ TRỨNG VỊT MUỐI SVTH: Đỗ Hương Thảo MSSV: 60502634 CBHD: Ths. Lâm Xuân Uyên Ts. Nguyễn Thúy Hưong Bộ môn: Công Nghệ Sinh Học TP. Hồ Chí Minh, 02/2010 MÔÛ ÑAÀU Nhöõng naêm gaàn ñaây tröùng vòt muoái laø moät trong nhöõng maët haøng noâng saûn xuaát khaåu coù öu theá caïnh tranh, ñaëc bieät löôïng haøng xuaát khaåu tröùng vòt muoái taêng leân vaøo caùc dòp trung thu haøng naêm. Do ñoù, vieäc ruùt ngaén thôøi gian saûn xuaát vaø keùo daøi thôøi gian baûo quaûn tröùng vòt muoái ñöôïc caùc nhaø nghieân cöùu trong nöôùc quan taâm. Hieän nay, nisin ñaõ ñöôïc söû duïng nhö moät hôïp chaát khaùng khuaån töø vi khuaån (bacteriocin), coù hoaït tính cao vaø an toaøn khi duøng trong thöïc phaåm ñöôïc Myõ vaø hôn 50 quoác gia coâng nhaän. Tuy nhieân, dòch bacteriocin bao boïc beà maët thöïc phaåm khoâng hieäu quaû, thôøi gian löu laïi treân thöïc phaåm ngaén. Ngoaøi ra, do bacteriocin coù baûn chaát laø protein neân deã bò enzyme protease thuûy phaân. Töø nhöõng ñaëc ñieåm treân caàn phaûi coù höôùng giaûi quyeát môùi ñeå coù theå coá ñònh ñöôïc dòch bacteriocin giuùp thôøi gian löu laïi laâu hôn, taêng ñöôïc thôøi gian baûo quaûn thöïc phaåm. Do ñoù, ñeà taøi: “Baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái baèng maøng BC haáp phuï nisin coù nguoàn goác töø Lactococcus lactis” höôùng ñeán nhöõng muïc tieâu vaø noäi dung sau: Muïc tieâu chính cuûa ñeà taøi: Khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch bacteriocin vaøo maøng moûng BC ÖÙng duïng maøng BC haáp phuï dòch bacteriocin ñeå baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái Noäi dung nghieân cöùu Taïo maøng BC Khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch bacteriocin vaøo maøng BC. ÖÙng duïng maøng BC haáp phuï dòch bacteriocin ñeå baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. CHÖÔNG 1: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU Bacteriocin Giôùi thieäu veà bacteriocin Bacteriocin laø nhöõng hôïp chaát coù baûn chaát protein do vi khuaån sinh toång hôïp vaø coù khaû naêng öùc cheá söï phaùt trieån cuûa vi khuaån khaùc coù lieân heä gaàn vôùi gioáng saûn xuaát. Bacteriocin ñöôïc toång hôïp bôûi vi khuaån Gram aâm vaø vi khuaån Gram döông vôùi nhöõng ñaëc ñieåm: Bacteriocin do vi khuaån Gram aâm toång hôïp: goàm nhieàu loaïi protein khaùc nhau veà kích thöôùc, nguoàn goác vi sinh vaät, kieåu taùc ñoäng vaø cô cheá mieãn dòch. Bacteriocin cuûa vi khuaån Gram aâm ñöôïc nghieân cöùu nhieàu nhaát laø Colicin do vi khuaån Escherichia coli toång hôïp. Khaû naêng öùc cheá cuûa bacteriocin do vi khuaån Gram aâm toång hôïp yeáu hôn bacteriocin do vi khuaån Gram döông. Bacteriocin do vi khuaån Gram döông toång hôïp: caùc bacteriocin naøy cuõng nhieàu nhö ôû vi khuaån Gram aâm. Chuùng khaùc vôùi bacteriocin cuûa vi khuaån Gram aâm ôû nhöõng ñieåm sau: vieäc taïo bacteriocin khoâng caàn thieát phaûi gaây cheát cho vi sinh vaät chuû vaø söï sinh toång hôïp bacteriocin cuûa vi khuaån Gram döông caàn nhieàu gen hôn ôû vi khuaån Gram aâm. Bacteriocin khaùc vôùi khaùng sinh ôû nhöõng ñieåm sau: Ñöôïc toång hôïp nhôø ribosome Teá baøo chuû mieãn dòch vôùi chuùng Phöông thöùc hoaït ñoäng khaùc bieät vôùi khaùng sinh Phoå khaùng khuaån heïp vì vaäy thöôøng chæ coù khaû naêng tieâu dieät nhöõng chuûng vi khuaån gaàn vôùi gioáng saûn xuaát. Coù raát nhieàu gioáng vi khuaån sinh toång hôïp bacteriocin, LAB ñöôïc quan taâm nhieàu do bacteriocin cuûa LAB coù phoå khaùng khuaån roäng. Phaân loaïi Bacteriocin do LAB saûn xuaát ñöôïc chia thaønh 4 lôùp: Lôùp I: (Lantibiotic) nhöõng phaân töû peptide nhoû (<5kDa), chòu nhieät, hoaït ñoäng treân caáu truùc maøng. Lantibiotic chöùa nhöõng acid amin hieám (lanthionine, 3 – methyllanthionine) vaø moät soá acid amin khöû nöôùc. Lantibiotic coù theå ñöôïc chia thaønh hai phaân lôùp döïa vaøo nhöõng ñaëc ñieåm caáu truùc vaø chöùc naêng: Lôùp Ia: laø nhöõng peptide tích ñieän döông, goàm từ 21-38 acid amin. Nhöõng peptide naøy hoaït ñoäng chuû yeáu do söï phaù vôõ traïng thaùi nguyeân veïn cuûa maøng teá baøo ñích. Coù theå chia Lantibiotic thaønh hai phaân nhoùm döïa treân kích thöôùc , ñieän tích vaø trình töï leader peptide. Lôùp Ib: laø nhöõng phaân töû peptide hình caàu, coù theå chöùa ñeán 19 acid amin. Hoaït ñoäng chuû yeáu cuûa chuùng laø phaù vôõ chöùc naêng của caùc enzyme nhö öùc cheá vieäc sinh toång hôïp vaùch teá baøo cuûa teá baøo ñích. Lantibiotic ñöôïc taïo thaønh ôû traïng thaùi baát hoaït vôùi trình töï leader ôû ñaàu N, trình töï naøy seõ bò caét ñi trong quaù trình tröôûng thaønh ñeå phoùng thích peptide hoaït hoùa. Lôùp II: laø nhöõng phaân töû bacteriocin nhoû (<10kDa) goàm nhöõng phaân töû peptide hoaït ñoäng ôû maøng teá baøo, khoâng chöùa lanthionine vaø beàn nhieät, gồm 30-60 acid amin. Bacteriocin lôùp II coù phoå khaùng khuaån heïp. Lôùp II coù theå chia thaønh 3 phaân lôùp: Lôùp IIa: raát ña daïng, ñieåm ñaëc tröng laø trình töï baûo toàn ôû ñaàu N vaø hoaït tính khaùng Listeria. Lôùp IIb: nhöõng bacteriocin lôùp naøy caàn coù söï keát hôïp cuûa hai peptide trong hoaït ñoäng ñeå coù hoaït tính khaùng khuaån hoaøn chænh. Trong haàu heát caùc tröôøng hôïp, caùc peptide rôøi cuõng bieåu hieän hoaït tính bacteriocin nhöng hoaït tính seõ cao hôn khi coù söï dieän cuûa peptide thöù hai. Lôùp IIc: bacteriocin phuï thuoäc nhaân toá sec-. Phaân töû bacteriocin lôùp IIc ñöôïc ñöa ra ngoaøi teá baøo xuyeân qua maøng teá baøo chaát baèng con ñöôøng tieát phuï thuoäc nhaân toá sec-. Bacteriocin lôùp IIa coù tieàm naêng öùng duïng trong quy moâ coâng nghieäp nhôø khaû naêng khaùng Listeria maïnh, thaäm chí chuùng coøn ñöôïc quan taâm nhieàu hôn caùc bacteriocin lôùp I (Nisin) do chuùng coù phoå khaùng khuaån khoâng roäng, khoâng tieâu dieät nhöõng chuûng khôûi ñoäng. Pediocin PA-1 laø moät ví duï ñieån hình vaø ñöôïc nghieân cöùu phoå bieán nhaát trong soá caùc bacteriocin lôùp IIa. Lôùp III: laø nhöõng phaân töû protein lôùn (>30kDa), beàn nhieät. Lôùp naøy goàm nhöõng enzyme ngoaïi baøo (hemolysin vaø muramidase) coù hoaït tính sinh lyù cuûa bacteriocin. Bacteriocin thuoäc lôùp III ñöôïc thu nhaän töø moät soá gioáng Lactobacillus. Lôùp IV: laø nhöõng bacteriocin phöùc hôïp, ngoaøi protein coøn coù theâm lipid vaø cacbohydrate. Hieän nay vaãn coøn nhieàu ñieàu chöa bieát veà caáu truùc cuõng nhö chöùc naêng cuûa bacteriocin thuoäc lôùp naøy vì chöa coù phaân töû naøo ñöôïc tinh saïch. Bacteriocin lớp IV laø keát quaû cuûa söï töông taùc ñaëc tính kî nöôùc vaø tích ñieän döông cuûa bacterocin vôùi caùc phaân töû khaùc trong dòch thoâ. Lôùp naøy bao goàm caû glycoprotein hoaëc lipoprotein. Ví dụ nhö leuconocin S vaø lactocin 27. Trong 4 lôùp treân thì bacteriocin cuûa lôùp I vaø lôùp II raát phong phuù vaø coù tieàm naêng thöông maïi. Trong caùc chuûng LAB thì Lactococcus lactis ñöôïc quan taâm nghieân cöùu raát nhieàu, moät soá chuûng Lc.lactis coù khaû naêng sinh toång hôïp bacteriocin. Bacteriocin do Lc.lactis goàm hai loaïi: lantibiotic vaø caùc bacteriocin kích thöôùc nhoû, beàn nhieät khoâng phaûi lantibiotic. Lactococcus coù khaû naêng sinh toång hôïp nisin – bacteriocin duy nhaát ñöôïc Toå chöùc noâng löông theá giôùi (FAO) vaø Toå chöùc y teá theá giôùi (WHO) chaáp nhaän cho pheùp söû duïng nhö moät chaát phuï gia thöïc phaåm. Nisin seõ phaù vôõ chöùc naêng vaän chuyeån cuûa maøng teá baøo vaø teá baøo chaát thoaùt ra ngoaøi, noù coù khaû naêng choáng caû vi khuaån Gram aâm laãn vi khuaån Gram döông, öùc cheá söï hình thaønh baøo töû. Nisin coù phoå khaùng khuaån roäng ñoái vôùi haàu heát caùc chuûng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, teá baøo dinh döôõng cuûa Bacillus spp. vaø Clostridium spp. cuõng nhö öùc cheá naûy choài cuûa baøo töû caùc loaøi Bacillus vaø Clostridoum [23]. Ngoaøi lantibiotic, Lc. lactis coøn coù khaû naêng sinh toång hôïp nhöõng phaân töû bacteriocin kích thöôùc nhoû vaø beàn nhieät, ñieån hình laø lactococin A,B vaø M. Lactococin coù phoå khaùng khuaån heïp hôn nisin, chuùng chæ coù theå öùc cheá nhöõng chuûng Lactococcus khaùc vôùi chuûng saûn xuaát. Nisin – Bacteriocin cuûa vi khuaån Lactococcus lactis Ñònh nghóa Nisin laø bacteriocin coù chöùa lantibiotic do Lc. lactis saûn xuaát vaø laø bacteriocin duy nhaát ñöôïc toå chöùc noâng löông theá giôùi (FAO) vaø toå chöùc y teá theá giôùi (WHO) chaáp nhaän cho pheùp söû duïng nhö moät chaát phuï gia thöïc phaåm. Chuûng saûn xuaát nisin ñaàu tieân ñöôïc tìm thaáy trong söõa bôûi Roger (1928), Whitehead (1933), Meanwel (1943) vaø Hirish (1944). Töø ñoù ngöôøi ta öôùc löôïng ñöôïc khoaûng 1/3 caùc chuûng Lc. lactis subsp. lactis coù khaû naêng saûn xuaát nisin. Nisin coù phoå khaùng khuaån roäng ñoái vôùi haàu heát caùc chuûng LAB, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, teá baøo dinh döôõng cuûa Bacillus spp. vaø Clostridium spp. cuõng nhö öùc cheá söï naûy choài cuûa baøo töû caùc loaøi Bacillus vaø Clostridium. Ñaëc ñieåm Tính chaát vaät lyù cuûa nisin Phaân töû löôïng cuûa moät phaân töû nisin laø 3,4 KDa. Phaân töû nisin coù tính phaân cöïc vôùi ñaàu N kî nöôùc vaø ñaàu C öa nöôùc. Tính tan cuûa nisin phuï thuoäc vaøo pH cuûa moâi tröôøng. Khi pH cuûa moâi tröôøng taêng tính tan cuûa nisin giaûm maïnh. ÔÛ ñieàu kieän trung tính vaø kieàm, nisin haàu nhö khoâng tan. Ñoä beàn cuûa nisin coù quan heä chaët cheõ vôùi tính tan. Ñoä beàn cuûa nisin khoâng chæ phuï thuoäc vaøo pH maø bò aûnh höôûng bôûi caùc yeáu toá khaùc: thaønh phaàn moâi tröôøng, nhieät ñoä, … Nisin bò baát hoaït bôûi a - chymotripsin, pancreatin vaø subtilopeptidase nhöng khoâng baát hoaït bôûi carboxypeptidase A, pepsin vaø tripsin. Tính chaát hoùa hoïc cuûa nisin Khaùc vôùi bacteriocin saûn xuaát töø LAB hay töø caùc loaøi vi khuaån khaùc, nisin coù phoå khaùng khuaån töông ñoái roäng. Nisin öùc cheá chuû yeáu vi khuaån Gram (+). Nisin öùc cheá teá baøo sinh döôõng vaø caû baøo töû vi khuaån. Hoaït tính sinh hoïc cuûa nisin phuï thuoäc vaøo pH cuûa moâi tröôøng. Hoaït tính sinh hoïc cuûa nisin giaûm khi pH moâi tröôøng taêng. Ñôn vò ño hoaït ñoä cuûa nisin laø IU (International unit), ñöôïc ñònh nghóa laø hoaït tính coù trong 1mg Nisaplin – nisin thöông maïi. 1g nisin tinh saïch chöùa 40 x 106 IU, hay noùi caùch khaùc, hoaït tính sinh hoïc cuûa 40 IU töông ñöông vôùi 1mg nisin tinh saïch. Moät vaøi ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa cuûa bacteriocin do LAB sinh toång hôïp Ñeå thöïc hieän hoaït tính gaây cheát, caùc bacteriocin thuoäc lôùp I vaø II phaûi thoûa maõn hai yeâu caàu: tích ñieän döông vaø kî nöôùc. Haàu heát caùc bacteriocin kích thöôùc nhoû hoaït ñoäng trong phaïm vi pH roäng töø 3-9. Thaäm chí acidocin B coù theå hoaït ñoäng ôû pH 11. ÔÛ ñieåm ñaúng ñieän cao cho pheùp chuùng töông taùc vôùi beà maët tích ñieän aâm cuûa teá baøo vi khuaån. Ñoái vôùi caùc bacteriocin coù phoå khaùng khuaån roäng, caùc hôïp chaát caàn theå nhaän seõ gaén phaàn kî nöôùc vaøo maøng vi khuaån. Söï lieân keát caùc phaân töû bacteriocin vôùi nhau seõ taïo thaønh nhöõng loã xuyeân maøng laøm maát gradient vaø gaây cheát teá baøo. Tính chòu nhieät cuõng laø nhöõng ñaëc ñieåm chính cuûa bacteriocin troïng löôïng thaáp. Caùc lieân keát monosulfit vaø disulfit trong phaân töû caøng nhieàu thì phaân töû peptide caøng oån ñònh. Haàu heát dòch noåi teá baøo cuûa chuûng sinh bacteriocin vaãn coøn hoaït tính khi xöû lyù nhieät hoaëc haáp khöû truøng baèng noài haáp aùp löïc. Tuy nhieân, moät vaøi loaïi bacteriocin taïo bôûi moät soá chuûng Lactobacillus nhö helveticin bò baát hoaït khi xöû lyù nhieät 60-100oC trong 10 - 15 phuùt. Quaù trình sinh toång hôïp taïo bacteriocin Cuïm gen sinh toång hôïp bacteriocin Söï sinh toång hôïp bacteriocin nhôø vaøo moät caáu truùc gen bao goàm boán gen khaùc nhau maõ hoùa chöùc naêng cô baûn cho vieäc saûn xuaát chaát khaùng khuaån ngoaïi baøo. Boán gen ñoù bao goàm: (1) Gen caáu truùc maõ hoùa caùc prebacteriocin (2) Gen mieãn dòch luoân luoân naèm keá gen bacteriocin vaø treân cuøng ñôn vò transcription. (3) Gen maõ hoùa ABC-transporter coù chöùc naêng vaän chuyeån bacteriocin ra ngoaøi. (4) Gen maõ hoùa moät protein phuï caàn thieát cho söï vaän chuyeån bacteriocin ra ngoaøi, coù vai troø nhaát ñònh nhöng ñeán nay chöa ñöôïc laøm roõ. Bacteriocin ñöôïc toång hôïp nhôø ribosome. Caùc gen maõ hoùa cho vieäc saûn xuaát vaø mieãn dòch bacteriocin thöôøng saép xeáp thaønh nhöõng cuïm gen operon. Heä thoáng lactococcin A coù hai operon ñöôïc tìm thaáy, trong khi ñoù ñoái vôùi heä thoáng pediocin PA-1 ñieàu khieån moät operon bao goàm caû boán gen tham gia ñeán vieäc saûn xuaát phaân töû bacteriocin chuû ñoäng. Ñoái vôùi nhöõng bacteriocin maïch thaúng khoâng traûi qua quaù trình bieán ñoåi (goàm plantaricin, carnobacteriocin vaø sakacin), chuùng coù nhöõng pepetide caûm öùng kích thích toång hôïp bacteriocin. Gen maõ hoùa caùc peptide naøy thöôøng ñònh vò treân cuøng moät cuïm. Caùc cuïm gen bacteriocin coù theå ñònh vò treân nhieãm saéc theå (subtilin vaø mersacidin), treân plasmid (divergicinA vaø sakicin A) hoaëc caùc gen nhaûy, transposon (nisin vaø lacticin 481). Caùc operon sinh toång hôïp lantibiotic thöôøng chöùa caùc gen maõ hoùa cho: prepeptide (Lan A), caùc enzyme thöïc hieän caùc phaûn öùng bieán ñoåi (Lan B,C/Lan M), caùc protease giuùp loaïi boû caùc trình töï leader peptide (LanP), heä thoáng ABC (ATP-binding cassette), protein vaän chuyeån peptide (Lan T), protein ñieàu hoøa (Lan R,K), protein lieân quan ñeán caùc trình töï baûo veä cuûa teá baøo chuû saûn xuaát bacteriocin (mieãn dòch) (Lan I, FEG). Söï ñieàu hoøa sinh toång hôïp bacteriocin lôùp II (lactococcin A, B, M pediocin PA-1 vaø plantaricin A) cuõng ñaõ ñöôïc nghieân cöùu. Caùc gen maõ hoùa cho vieäc sinh toång hôïp bacteriocin lôùp II coù nhieàu ñieåm töông ñoàng veà maët caáu truùc di truyeàn, chuùng goàm caùc gen caáu truùc maõ hoùa cho caùc phaân töû tieàn peptide, gen mieãn dòch, gen maõ hoùa proteinvaän chuyeån ABC vaø gen maõ hoùa cho protein phuï trôï. Trong moät soá tröôøng hôïp coù theå coù moät soá gen ñieàu hoøa. Caùc protein phuï trôï caàn thieát cho quaù trình tieát bacteriocin lôùp II ra moâi tröôøng Quaù trình sinh toång hôïp bacteiocin Haàu heát caùc bacteriocin ñöôïc toång hôïp döôùi daïng tieàn peptide baát hoaït coù mang moät trình töï leader peptide ôû ñaàu baùm vaø trình töï ôû ñaàu C cuûa propeptide. Trong tröôøng hôïp lantibiotic, caùc phaân töû serine, threonine vaø cysteine trong phaàn propeptide traûi qua nhöõng bieán ñoåi sau dòch maõ ñeå hình thaønh Lan/MeLan. Con ñöôøng sinh toång hôïp lantibiotic goàm nhöõng böôùc sau: Böôùc 1: Sinh toång hôïp phaân töû tieàn bacteriocin. Böôùc 2: Phaân töû tieàn bacteriocin bò bieán ñoåi bôûi Lan B, Lan C sau ñoù ñöôïc vaän chuyeån qua maøng bôûi heä thoáng vaän chuyeån ABC Lan T, ñoàng thôøi ñöôïc bieán ñoåi bôûi LanC ñeå phoùng thích phaân töû bacteriocin tröôûng thaønh. Tuy nhieân quaù trình caét trình töï leader peptide coù theå xaûy ra tröôùc, trong hoaëc sau böôùc xuaát baøo. Böôùc 3: Histidine protein kinase (HPK) caûm öùng söï hieän dieän cuûa bacteriocin vaø töï phosphoryl hoùa. Böôùc 4: Nhoùm phosphoryl hoùa (P) ñöôïc chuyeån qua nhaân toá ñaùp öùng ñieàu hoøa (response regulator – RR) Böôùc 5: Nhaân toá RR hoaït hoùa söï phieân maõ cuûa caùc gen ñöôïc ñieàu hoøa. Böôùc 6: Söï hieän dieän cuûa bacteriocin caûm öùng hoaït ñoäng töï mieãn cuûa teá baøo saûn xuaát. Söï töï mieãn ñöôïc ñieàu khieån bôûi caùc protein mieãn dòch, Lan I, protein vaän chuyeån ABC vaø Lan FEG. Hình 1.1. Sô ñoà quaù trình sinh toång hôïp lantibiotic [20]. Bacteriocin lôùp II ñöôïc toång hôïp ôû daïng phaân töû tieàn peptide chöùa moät trình töï leader baûo toàn ôû ñaàu N vaø moät vò trí glycerin keùp phuïc vuï cho vieäc phaân giaûi protein (ngoaïi tröø bacteriocin lôùp IIc, ñöôïc toång hôïp vôùi moät trình töï tín hieäu ôû ñaàu N, ñöôïc bieán ñoåi vaø tieát ra khoûi teá baøo). Khaùc vôùi lantibiotic, bacteriocin lôùp IIa khoâng traûi qua quaù trình bieán ñoåi sau dòch maõ. Sau khi hình thaønh, phaân töû tieàn peptide seõ ñöôïc bieán ñoåi ñeå loaïi boû leader peptide cuøng luùc vôùi vieäc xuaát khoûi teá baøo qua heä thoáng vaän chuyeån ABC vaø caùc protein phuï trôï cuûa noù. Trình töï leader peptide coù theå thöïc hieän moät soá chöùc naêng chuyeân bieät: Laø vò trí nhaän bieát cho caùc protein bieán ñoåi vaø vaän chuyeån tieàn peptide. Baûo veä teá baøo saûn xuaát traùnh khoûi taùc ñoäng cuûa bacteriocin khi coøn ôû beân trong teá baøo baèng caùch giöõ chuùng ôû traïng thaùi baát hoaït. Töông taùc vôùi vuøng propeptide ñeå ñaûm baûo caáu traïng thích hôïp caàn thieát cho söï töông taùc giöõa enzyme vaø cô chaát. Con ñöôøng sinh toång hôïp bacteriocin lôùp II: Böôùc 1: Sinh toång hôïp phaân töû tieàn bacteriocin vaø caùc tieàn peptide cuûa caùc nhaân toá caûm öùng (IF) Böôùc 2: Phaân töû tieàn bacteriocin vaø caùc tieàn nhaân toá IF ñöôïc bieán ñoåi vaø vaän chuyeån nhôø heä thoáng vaän chuyeån ABC, phoùng thích bacteriocin tröôûng thaønh vaø nhaân toá IF. Böôùc 3: Histidine protein kinase (HPK) caûm öùng söï hieän dieän cuûa IF vaø töï phosphoryl hoùa. Böôùc 4: Nhoùm phosphoryl hoùa (P) ñöôïc chuyeån qua nhaân toá ñaùp öùng ñieàu hoøa (response regulator – RR) Böôùc 5: Nhaân toá RR hoaït hoùa söï phieân maõ cuûa caùc gen ñöôïc ñieàu hoøa. Böôùc 6: Söï hieän dieän cuûa bacteriocin caûm öùng hoaït ñoäng cuûa caùc protein coù chöùc naêng töï mieãn cuûa teá baøo saûn xuaát [23]. Ñieàu hoøa sinh toång hôïp bacteriocin Quaù trình sinh toång hôïp bacteriocin ñöôïc ñieàu hoøa nhôø heä thoáng ñieàu hoøa hai thaønh phaàn. Heä thoáng ñieàu hoøa naøy chöùa hai protein phaùt tín hieäu: histidine protein kinase (HPK) lieân keát maøng vaø nhaân toá ñieàu hoøa ñaùp öùng trong teá baøo chaát (reponse regulator – RR). Trong quaù trình truyeàn taûi tín hieäu, HPK töï phosphoryl phaân töû histidine khi noù caûm öùng ñöôïc söï hieän dieän cuûa bacteriocin ôû noàng ñoä tôùi haïn trong moâi tröôøng. Sau ñoù nhoùm phosphoryl ñöôïc huyeån ñeán phaân töû aspartic acid ôû vuøng RR taïo ra söï thay ñoåi noäi phaân töû, taùc ñoäng ñeán nhaân toá ñieàu hoøa ñaùp öùng laøm hoaït hoùa quaù trình phieân maõ cuûa caùc gen ñöôïc ñieàu hoøa. Caùc gen ñieàu hoøa goàm: gen caáu truùc, gen xuaát baøo, gen mieãn dòch. Trong tröôøng hôïp nisin vaø subtilin, phaân töû bactreiocin ñoùng vai troø nhö moät tín hieäu ngoaïi baøo ñeå töï ñieàu hoøa quaù trình sinh toång hôïp cuûa chuùng theo con ñöôøng truyeàn taûi tín hieäu. Ngöôïc laïi haàu heát bacteriocin lôùp II saûn xuaát moät peptide gioáng bacteriocin nhöng khoâng coù hoaït tính khaùng khuaån vaø söû duïng noù nhö moät nhaân toá caûm öùng (IF) ñeå hoaït hoùa quaù trình phieân maõ cuûa caùc gen ñöôïc ñieàu hoøa. IF laø moät peptide nhoû, beàn nhieät, tích ñieän döông vaø kò nöôùc, ñöôïc toång hôïp döôùi daïng moät tieàn peptide vôùi moät trình töï leader glycine keùp. Heä thoáng vaän chuyeån seõ caét boû peptide leader cuûa IF cuøng luùc vôùi quaù trình xuaát baøo cuûa peptide tröôûng thaønh. IF ñöôïc tieát ra ñoùng vai troø nhö moät tín hieäu ngoaïi baøo vaø taùc ñoäng ñeán quaù trình phieân maõ cuûa caùc gen lieân quan ñeán vieäc saûn xuaát bacteriocin [23]. Cô cheá hoaït ñoäng cuûa bacteriocin Do coù söï khaùc nhau veà caáu truùc hoùa hoïc maø bacteriocin seõ coù caùch thöùc taùc ñoäng khaùc nhau vôùi caùc teá baøo soáng. Caùc bacteriocin coù theå taùc ñoäng leân söï sao cheùp, phieân maõ, dòch maõ, toång hôïp thaønh teá baøo. Tuy nhieân, haàu heát caùc bacteriocin hoaït ñoäng baèng caùch taïo keânh hay loã treân maøng laøm phaù huûy naêng löôïng höõu ích cuûa teá baøo soáng. Cô cheá taùc ñoäng cuûa nisin ñöôïc nghieân cöùu kyõ nhaát. Nisin thuoäc nhoùm Ia, tích ñieän döông, tích ñieän tónh ñieän vôùi maøng phospholipid tích ñieän aâm. Keát quaû taïo phaàn töông taùc kò nöôùc giöõa bacteriocin vôùi maøng teá baøo chaát cuûa teá baøo ñích. Lysine laø amino acid tích ñieän aâm coù lieân quan tôùi söï töông taùc tónh ñieän naøy. Söï töông taùc giöõa phaàn kò nöôùc cuûa nisin vaø maøng teá baøo ñích taïo nhöõng keânh ion khoâng ñaëc hieäu. Vieäc taïo caùc loã laøm giaûm söï hieän dieän cuûa caùc ion döông hoùa trò II nhö Mg2+, Ca2+. Bôûi vì chuùng trung hoøa ñieän tích aâm cuûa phospholipid, laøm giaûm söï linh ñoäng cuûa maøng. Caùc loã treân maøng taïo bôûi nisin laøm cho caùc ion K+, Mg2+, acid amin, acid glutamic vaø lysine vaø ATP thoaùt ra ngoaøi nhöng caùc protein lôùn trong teá baøo chaát khoâng qua ñöôïc, vì vaäy taïo theá maøng, laøm maát ñoäng löïc proton neân seõ gaây cheát teá baøo. Lipid II cuõng tham gia trong vieäc taïo thaønh caùc loã, lipid II ñoùng vai troø nhö nhöõng phaân töû caét cuït cho caùc lieân keát ñaëc hieäu vôùi maøng teá baøo vi khuaån. ÔÛ bacteriocin nhö mersacidin vaø actagardin thì cô cheá hoaït ñoäng cuûa chuùng laø taùc ñoäng leân söï toång hôïp cuûa thaønh teá baøo, caùc bacteriocin naøy ngaên caûn vieäc gaén caùc phaân töû glucose vaø D-alanine vaø thaønh teá baøo, söï toång hôïp DNA, RNA vaø protein xaûy ra moät caùch töï do. Caû hai bacteriocin naøy ñeàu öùc cheá söï sinh toång hôïp petidoglycan baèng caùch taïo phöùc hôïp vôùi tieàn chaát lipid II cuûa peptidoglycan gaén treân maøng. Nhìn chung, cô cheá hoaït ñoäng cuûa bacteriocin lôùp IIa cuõng gioáng nhö nisin. Ñaëc tính bacteriocin nhoùm naøy laø khaùng Listeria do söï hieän dieän cuûa trình töï YGNGV ôû vuøng ñaàu N. Giaû thieát hieän nay ñeå lyù giaûi cô cheá hoaït ñoäng cuûa nhoùm naøy laø lieân keát tónh ñieän cuûa bacteriocin vôùi maøng teá baøo ñích qua trung gian phaân töû receptor lieân keát treân maøng. Giaû thieát veà receptor ñaùp öùng cho söï nhaän dieän kieåu khaùng Listeria YGNGV ôû nhöõng peptide naøy. Ngöôøi ta cho raèng bacteriocin nhoùm IIa coù theå töï taïo loã xuyeân qua maøng teá baøo vì chuùng laø nhöõng bacteriocin cöïc nhoû vaø löôõng cöïc. Caùc bacteriocin lôùp phuï IIc theo khoùa phaân loaïi Klaenhammer ñöôïc chia thaønh hai nhoùm khaùc nhau döïa vaøo vieäc coù hay khoâng coù söï hieän dieän lieân keát disulfit beân trong phaân töû. Do ñoù, hoaït ñoäng cuûa hai nhoùm naøy hoaøn toaøn khaùc nhau. Caùc nghieân cöùu treân maøng ñöôïc tieán haønh vôùi lactococcin – bacteriocin thieáu phaàn L-cysteine vaø thaáy raèng ñaây laø protein hoaït ñoäng treân maøng. Cô cheá hoaït ñoäng chính laø söï taïo thaønh caùc loã treân maøng teá baøo. Phoå khaùng khuaån roäng cuûa nhöõng hôïp chaát naøy chöùng toû coù söï hieän dieän cuûa receptor bacteriocin lieân keát ñaëc hieäu treân maøng. Caùc acid amin tích ñieän aâm vaø tryptophan trong vuøng öa nöôùc coù theå thuaän lôïi cho caùc töông taùc khoâng ñaëc hieäu vôùi lôùp phospholipid tích ñieän aâm cuûa maøng teá baøo ñích laøm cho caùc loã xuyeân maøng oån ñònh hôn [12], [22]. Khaû naêng töï mieãn bacteiocin cuûa teá baøo chuû Hieän nay, coù hai heä thoáng töï mieãn lantibiotic cuûa teá baøo saûn xuaát ñaõ ñöôïc nhaän ñònh. Söï baûo veä naøy ñöôïc kieåm soaùt bôûi caùc protein mieãn dòch Lan I, protein vaän chuyeån ABC vaø Lan FEG. Hai heä thoáng naøy hoaït ñoäng hoã trôï laãn nhau baûo veä teá baøo saûn xuaát khoûi taùc ñoäng cuûa bacteriocin do chính chuùng sinh ra. Lan I baùm treân maët ngoaøi cuûa maøng teá baøo chaát vaø baûo veä teá baøo baèng caùch ngaên chaën söï taïo loã cuûa bacteriocin. Lan FEG hoaït ñoäng baèng vieäc vaän chuyeån caùc phaân töû bacteriocin ñaõ cheøn vaøo maøng ñeå ñem chuùng trôû veà moâi tröôøng ngoaïi baøo, nhôø vaäy Lan FEG giuùp ñôõ noàng ñoä bacteriocin beân trong teá baøo luoân ôû möùc thaáp hôn möùc tôùi haïn. Gen töï mieãn cuûa bacteriocin lôùp II thöôøng maõ hoùa cho moät loaïi protein lieân keát vôùi maøng teá baøo chaát. Quadri vaø cs (1995) ñaõ xaùc ñònh ña phaàn protein mieãn dòch CbiB2 cuûa carnobacteriocin B2 ñöôïc tìm thaáy beân trong teá baøo chaát vaø moät löôïng ít hôn keát hôïp vôùi maøng. Töông töï theo Abdel-Dayem vaø cs (1996) phaàn lôùn protein mieãn dòch MesI cuûa mesentericin Y105 toàn taïi trong teá baøo chaát vaø chæ moät löôïng nhoû ñöôïc phaùt hieän treân maøng teá baøo. Protein mieãn dòch laø nhöõng phaân töû tích ñieän döông, coù khoaûng 51-254 acid amin, cung caáp khaû naêng mieãn dòch ñoái vôùi bacteriocin. Söï töông taùc cuûa protein mieãn dòch vôùi maøng teá baøo giuùp baûo veä teá baøo saûn xuaát traùnh khoûi taùc ñoäng cuûa bacteriocin do chuùng saûn sinh ra [23]. ÖÙng duïng bacteriocin Ngaønh coâng nghieäp thöïc phaåm coù theå öùng duïng khaû naêng baûo quaûn saûn phaåm cuûa bacteriocin baèng vieäc söû duïng caùc gioáng vi sinh vaät saûn sinh bacteriocin trong quaù trình saûn xuaát hoaëc boå sung caùc cheá phaåm coù chöùa bacteriocin tröïc tieáp vaøo saûn phaåm . Nisin laø moät loaïi bacteriocin ñöôïc öùng duïng phoå bieán nhaát vaø laø lantibiotic duy nhaát ñang ñöôïc thöông maïi hoùa. Nisin treân thò tröôøng hieän nay coù moät loaïi daïng boät laø Nisaplin vaø moät loaïi coù thaønh phaàn laø 2,5% nisin keát hôïp vôùi 77,5% NaCl vaø boät söõa khoâng beùo (12% protein vaø 6% carbonhydrate) ñöôïc goïi laø Novasin. Ngoaøi ra, coøn coù moät loaïi bacteriocin ñöôïc thöông maïi hoùa nöõa laø ALTA 2431 (saûn phaåm töø pediocin PA – 1). ÖÙng duïng cuûa bacteriocin trong caùc saûn phaåm laøm töø söõa Moät öùng duïng chính cuûa nisin laø saûn xuaát phomai. Vieäc söû duïng nisin laáy töø Lactoccoci laø söï löïa choïn tuyeät vôøi cho vieäc öùng duïng nisin nhö moät thaønh phaàn phuï gia trong saûn xuaát phomai. Davies vaø cs (1997) ñaõ thöû nghieäm söû duïng nisin ñeå kieàm haõm söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån L. monocytogenes gaây beänh trong phomai. Keát quaû cho thaáy, vôùi maãu söû duïng nisin vôùi noàng ñoä 2,5 mg/l seõ kìm haõm söï phaùt trieån cuûa L. monocytogenes ñeán 8 tuaàn so vôùi maãu ñoái chöùng chæ vôùi 2 tuaàn ñaõ khoâng coøn an toaøn. Khi ño haøm löôïng nisin ban ñaàu vaø coøn laïi trong saûn phaåm cho thaáy nisin chæ maát ñi 10 – 32% sau 10 tuaàn baûo quaûn ôû 6 – 80C [20]. ÖÙng duïng cuûa bacteriocin trong caùc saûn phaåm thòt Pawar vaø cs (2000) ñaõ thöû nghieäm treân thòt traâu caét nhoû ñeå kieåm tra hoaït ñoäng cuûa nisin ñôn leû (ôû hoaït ñoä 400 vaø 800 IU/g) vaø keát hôïp nisin vôùi 2% sodium chloride ñeå choáng laïi söï phaùt trieån cuûa L. monocytogenes. Maãu thòt ñoái chöùng ñöôïc tieâm vaøo 103 CFU/g L. monocytogenes vaø ñöôïc baûo quaûn ôû 40C. Soá löôïng teá baøo L. monocytogenes trong maãu ñoái chöùng taêng töø 3 log10 ñeán 6,4 log CFU/g sau 16 ngaøy baûo quaûn. Tuy nhieân, nisin laïi taùc ñoäng moät caùch raát hieäu quaû ñeán söï phaùt trieån cuûa L. monocytogenes. Ngöôøi ta theâm vaøo nisin coù hoaït tính 400 IU/g ñeå laøm taêng pha lag cuûa L. monocytogenes, vaø nisin ôû hoaït tính 800IU/g ñaõ cho thaáy keát quaû soá löôïng teá baøo L. monocytogenes giaûm xuoáng chæ coøn 2,4-log CFU/g, thaáp hôn maãu ñoái chöùng sau 16 ngaøy baûo quaûn. Söï keát hôïp cuûa nisin vôùi 2% sodium chloride cuõng laøm taêng hieäu quaû baûo quaûn [31]. Laukovaù vaø cs (1999) ñaõ kieåm nghieäm söï hieäu quaû cuûa enterocin CCM 4231 trong vieäc kieåm soaùt L. monocytogenes nhieãm vaøo quaù trình saûn xuaát xuùc xích leân men. Vieäc theâm vaøo enterocin laøm giaûm moät caùch nhanh choùng soá löôïng teá baøo L. monocytogenes töø 108 CFU/ml xuoáng coøn 1.7-log10. Sau moät tuaàn cuûa quaù trình leân men, löôïng L. monocytogenes trong maãu ñoái chöùng (khoâng boå sung enterocin) taêng leân 107CFU/g, trong khi maãu thí nghieäm (coù boå sung enterocin) chæ coøn 104CFU/g, söï khaùc bieät naøy vaãn ñöôïc suy trì sau 2-3 tuaàn [26]. ÖÙng duïng bacteriocin trong caùc saûn phaåm thuûy saûn Ñeå keùo daøi thôøi gian baûo quaûn toâm bieån, ngöôøi ta thöôøng söû duïng sorbic vaø acid benzoic. Tuy nhieân, ñieàu naøy laïi ñaët ra nhieàu moái lo laéng cho ngöôøi tieâu duøng vì söï laïm duïng caùc chaát naøy. Do ñoù, Einarsson vaø Lauzon (1995) ñaõ nghieân cöùu öùng duïng bacteriocin vaøo baûo quaûn toâm bieån ñeå giaûi quyeát vaán ñeà naøy. Hoï ñaõ ñaùnh giaù tính hieäu quaû cuûa vieäc söû duïng nisin Z, carnocin UI49, vaø bavaricin A thoâ vaøo vieäc keùo daøi thôøi gian baûo quaûn cuûa toâm bieån. Keát quaû laø Carnocin UI49 khoâng coù khaû naêng keùo daøi thôøi gian so vôùi maãu ñoái chöùng sua 10 ngaøy baûo quaûn. Trong khi ñoù bavaricin A laïi coù khaû naêng taêng thôøi gian baûo quaûn leân 16 ngaøy vaø nisin Z taêng thôøi gian baûo quaûn leân ñeán 31 ngaøy. Tuy nhieân ñaây cuõng chæ laø nhöõng nghieân cöùu böôùc ñaàu vì thôøi gian baûo quaûn toâm bieån baèng muoái benzoate vaø sorbate laø 59 ngaøy. Do ñoù, caàn phaûi coù nhöõng nghieân cöùu saâu hôn ñeå tìm ra bieän phaùp hieäu quaû hôn [21]. Nykanen vaø cs (2000) ñaõ thöû nghieäm nisin vaø sodium lactate vaø keát hôïp caû hai treân thòt caù hoài xoâng khoùi. Nhöõng maãu caù hoài ñöôïc baûo quaûn ôû 80C trong 17 ngaøy vaø 30C trong 29 ngaøy. Caû nisin vaø sodium lactate ñeàu coù aûnh höôûng ñeán söï phaùt trieån cuûa L. monocytogenes trong caù xoâng khoùi, nhöng khi keát hôïp caû hai thì mang laïi hieäu quaû toát hôn. Söï keát hôïp cuûa nisin vaø sodium lactate laøm giaûm soá löôïng vi khuaån L. monocytogenes töø 3.3 xuoáng 1.8 log10 CFU/g trong voøng 16 ngaøy baûo quaûn ôû 80C. Haøm löôïng L. monocytogenes duy trì ôû möùc khoâng ñoåi (4.7 ñeán 4.9 log10 CFU/g) trong voøng 29 ngaøy khi baûo quaûn ôû 30C [30]. Cellulose vi khuaån Vi sinh vaät saûn sinh BC Caùc vi khuaån taïo maøng BC BC ñöôïc toång hôïp bôûi moät soá loaøi vi khuaån khaùc nhau. Con ñöôøng sinh toång hôïp vaø cô cheá ñieàu hoøa toång hôïp BC ôû caùc loaøi töông ñoái gioáng nhau, nhöng caáu truùc BC ôû moãi loaøi thì khaùc nhau. Coù caùc ñieåm khaùc bieät ñaùng keå veà thuoäc tính vaät lyù cuûa caùc saûn phaåm cellulose chuû yeáu laø chieàu daøi cuûa chuoãi glucan (ñöôïc ñaëc tröng bôûi möùc ñoä polymer hoùa), tính keát tinh vaø traïng thaùi keát tinh cuûa noù. Tuøy thuoäc vaøo moãi loaøi maø traïng thaùi keát tinh cuûa cellulose khaùc nhau, töø ñoù xaùc ñònh caùc tính chaát vaät lyù cuûa saûn phaåm nhö ñoä beàn, ñoä hoøa tan trong caùc dung moâi, tính chòu aûnh höôûng cuûa caùc taùc nhaân bieán tính [15,16]. Baûng 1.1. Caáu truùc maøng BC cuûa moät soá vi khuaån. Loaøi Caáu truùc cellulose Acetobacter Achromobacter Aerobacter Agrobacterium Alcaligenes Pseudomonas Rhizobium Sarcina Zoogloea Lôùp maøng ngoaïi baøo taïo thaønh caùc daûi Sôïi Sôïi Sôïi ngaén Sôïi Khoâng coù caáu truùc sôïi roõ raøng Sôïi ngaén Cellulose voâ ñònh hình Chöa xaùc ñònh [13]. Acetobacter xylinum (A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus), laø vi sinh vaät taïo cellulose höõu hieäu nhaát. Gaàn ñaây, noù ñöôïc xeáp vaøo gioáng môùi Gluconacetobacter bao goàm caùc loaøi laø G. xylinum, G. europaeus, G. oboediens vaø G. intermedius. . Vi khuaån Acetobacter xylinum Chuûng Acetobacter xylinum thuoäc nhoùm vi khuaån acetic. Theo khoùa phaân loaïi Bergey thì Acetobacter xylinum thuoäc lôùp Schizomycetes, boä Pseudomonadales, hoï Pseudomonadaceae. Ñaëc ñieåm hình thaùi A. xylinum laø vi khuaån hình que daøi khoaûng 2mm, ñöùng rieâng leû hoaëc xeáp thaønh chuoãi, khoâng di ñoäng. Laø vi khuaån Gram aâm, voû nhaày ñöôïc caáu taïo bôûi cellulose. A. xylinum thuoäc nhoùm vi khuaån hieáu khí baét buoäc, neân chuùng taêng tröôûng treân beà maët tieáp xuùc giöõa moâi tröôøng loûng vaø moâi tröôøng khoâng khí. Ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa Ñieàu kieän toái öu ñeå A. xylinum sinh tröôûng ôû pH = 4-4,5, nhieät ñoä töø 25-320C. Acid acetic laø saûn phaåm sinh ra trong quaù trình hoaït ñoäng cuûa A. xylinum . Nhöng khi löôïng acid tích luõy quaù cao thì seõ öùc cheá chuùng. A. xylinum haáp thuï ñöôøng glucose raát toát töø moâi tröôøng nuoâi caáy. Trong teá baøo vi khuaån, glucose seõ keát hôïp vôùi acid beùo taïo thaønh tieàn chaát naèm treân maøng teá baøo. Sau ñoù noù ñöôïc thoaùt ra ngoaøi teá baøo cuøng vôùi moät loaïi enzyme. Enzyme naøy coù theå polymer hoùa thaønh cellulose. A. xylinum coù theå söû duïng nhieàu nguoàn ñöôøng khaùc nhau vaø tuøy thuoäc vaøo nguoàn ñöôøng naøo ñöôïc söû duïng toát nhaát [16]. Baûng 1.2. Ñaëc ñieåm sinh hoùa cuûa A. xylinum . STT Ñaëc ñieåm sinh hoùa của A.xylinum Hieän töôïng Keát quaû 1 Oxy hoùa ethanol thaønh acid acetic Acid acetic taïo ra keát hôïp vôùi CaCO3 laøm voøng saùng roäng hôn vaø taïo lôùp caën, ñuïc roõ + 2 Catalase Suûi boït khí + 4 Chuyeån hoùa glucose thaønh acid Voøng saùng sung quanh khuaån laïc + 5 Chuyeån hoùa glycerol thaønh dihydroxyaceton Voøng CuO xuaát hieän xung quanh khuaån laïc + 6 Kieåm tra sinh saéc toá naâu Khoâng thaáy saéc toá naâu - 7 Kieåm tra toång hôïp cellulose Vaùng vi khuaån xuaát hieän maøu lam + [24]. Cellulose vi khuaån . Giôùi thieäu Celluose laø moät polymer sinh hoïc raát ña daïng treân theá giôùi, laø thaønh phaàn lôùn nhaát trong sinh khoái thöïc vaät. Beân caïnh polymer thöïc vaät coøn coù polymer ngoaïi baøo cuûa vi sinh vaät, chuùng laø saûn phaåm cuûa hoaït ñoäng bieán döôõng sô caáp ñöôïc duøng nhö moät lôùp aùo beân ngoaøi ñeå baûo veä teá baøo chuû, trong khi cellulose thöïc vaät ñoùng vai troø caáu truùc. Cellulose vi khuaån vaø cellulose thöïc vaät coù caáu truùc hoùa hoïc gioáng nhau nhöng tính chaát vaät lyù vaø hoùa hoïc khaùc nhau. . Caáu truùc maøng BC: Cellulose laø moät polymer khoâng phaân nhaùnh cuûa caùc lieân keát b-1,4 glucopyranose. Caùc nghieân cöùu cho thaáy BC coù caáu truùc hoùa hoïc gioáng vôùi caáu truùc cuûa cellulose thöïc vaät. Tuy nhieân, caáu truùc ña phaân töû vaø thuoäc tính cuûa cellulose vi khuaån khaùc vôùi cellulose thöïc vaät. Caùc chuoãi môùi sinh cuûa BC taäp hôïp laïi hình thaønh neân caùc sieâu sôïi coù ñoä roäng khoaûng 1.5nm. Caùc sieâu sôïi naøy laïi hình thaønh neân caùc vi sôïi (Jonas and Farab, 1998), sau ñoù chuùng ñöôïc boù laïi vaø hình thaønh neân caùc ribbon (Yamanaka vaø coäng söï, 2000). Kích thöôùc cuûa caùc ribbon laø 3-4 x 70-80 nm. Caùc BC khaùc nhau thöôøng coù ñoä polymer hoùa khaùc nhau thöôøng naèm trong khoaûng 2000 ñeán 6000, trong moät soá tröôøng hôïp leân ñeán 16000 – 20000. Trong khi ñoù möùc polymer hoùa trung bình cuûa thöïc vaät thöôøng naèm trong khoaûng 13000 – 14000 [15, 16]. Caáu truùc cuûa BC phuï thuoäc chaët cheõ vaøo ñieàu kieän nuoâi caáy. ÔÛ ñieàu kieän nuoâi caáy tónh, vi khuaån toång hôïp nhöõng mieáng cellulose treân beà maët nuoâi caáy tónh, taïi ranh giôùi giöõa beà maët dòch loûng vaø khoâng khí giaøu oxy. Caùc mieáng BC naøy ñöôïc goïi laø BC treân moâi tröôøng tónh (S-BC). Caùc sieâu sôïi cellulose lieân tuïc ñöôïc taïo ra töø nhöõng loã ñöôïc xeáp doïc treân beà maët cuûa teá baøo vi khuaån, keát laïi thaønh caùc vi sôïi, vaø bò ñaåy xuoáng saâu hôn trong moâi tröôøng dinh döôõng. Caùc daûi cellulose töø moâi tröôøng tónh taïo neân caùc maët phaúng song song, sôïi S-BC keùo daøi vaø choàng treân caùc sôïi khaùc theo chieàu ñan cheùo nhau khoâng coù toå chöùc, coù vai troø choáng ñôõ cho quaàn theå teá baøo Acetobacter xylinum. Caùc sôïi BC keá nhau ñöôïc taïo ra töø moâi tröôøng tónh noái vôùi nhau vaø beû nhaùnh ít hôn caùc sôïi BC ñöôïc taïo ra töø moâi tröôøng laéc (A-BC) [16]. Hình 1.2. Maøng BC hình thaønh trong moâi tröôøng nuoâi caáy tónh [14]. Hình 1.3. Caùc vieân BC hình thaønh trong moâi tröôøng khuaáy [14]. Hai daïng keát tinh phoå bieán cuûa cellulose trong töï nhieân laø I vaø II, ñöôïc phaân bieät bôûi caùc kyõ thuaät phaân tích baèng tia X, quang phoå vaø tia hoàng ngoaïi. Cellulose I ñöôïc chuyeån thaønh cellulose II, nhöng cellulose II thì khoâng theå chuyeån thaønh cellulose I. Cellulose I ñöôïc toång hôïp bôûi ña soá thöïc vaät A. xylinum ôû trong moâi tröôøng tónh. Caùc chuoãi b - 1,4 – glucan ôû cellulose I ñöôïc saép xeáp song song vôùi nhau theo moät truïc. Trong khi ñoù, caùc chuoãi b - 1,4 – glucan ôû cellulose II thì xeáp moät caùch ngaãu nhieân, haàu nhö khoâng song song vaø noái vôùi nhau bôûi moät soá löôïng lôùn caàu noái hydrogen, laøm cho cellulose II coù ñoä beàn veà nhieät. Raát ít teá baøo Eukaryota toång hôïp cellulose II. A. xylinum toång hôïp ñöôïc caû hai loaïi cellulose I vaø II. Trong phaân töû cellulose I coù söï xuaát hieän cuûa Ia vaø Ib, do ñöôïc caáu taïo bôûi glucose daïng a hay daïng b. Daïng b beàn veà nhieät ñoäng hôn. Gluose daïng a hay glucose daïng b laø hai daïng ñoàng phaân khoâng gian cuûa nhau. Hai daïng ñoàng phaân naøy chæ khaùc nhau ôû söï ñònh höôùng cuûa nhoùm hydroxyl. Gai daïng naøy coù ôû caùc cellulose coù nguoàn goác töø taûo, vi khuaån, thöïc vaät. BC coù daïng Ia nhieàu hôn cellulose thöïc vaät. S-BC coù nhieàu daïng Ia hôn A-BC. Söï khaùc nhau veà tæ leä Ia giöõa hai loaïi S-BC vaø A-BC laøm phoùng ñaïi caùc chæ soá keát tinh, chæ soá Ia tæ leä thuaän vôùi kích côõ keát tinh. A-BC coù chæ soá keát tinh thaáp hôn vaø kích côõ keát tinh nhoû hôn S-BC. . Tính chaát hoùa lyù cuûa maøng S-BC: Maøng S-BC coù theå taïo hình daïng phuø hôïp vôùi thieát bò phaûn öùng sinh hoïc. Hình daïng, kích thöôùc cuûa saûn phaåm BC raát ña daïng vaø coù theå chuû ñoäng taïo ra kích thöôùc mong muoán. S-BC coù tính chaát cô lyù beàn vaø oån ñònh. Ñoä chòu löïc cuûa BC khaù dai, gaàn baèng vôùi ñoä chòu löïc cuûa nhoâm. Tính chaát cô lyù beàn vaø oån ñònh giuùp BC coù theå chòu ñöôïc söï taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng nhö khuaáy troän hoaëc caùc aùp löïc. BC khoâng tan trong moâi tröôøng phaûn öùng. Giaù theå BC coù ñoä tröông nôû toát. Ñoä tröông nôû giuùp cho söï khueách taùn cuûa cô chaát, saûn phaåm. Moâi tröôøng trong vaø ngoaøi chaát mang khoâng coù söï khaùc bieät. BC ñaõ qua xöû lyù khoâng gaây taùc ñoäng ñeán chaát ñöôïc haáp phuï. Sau giai ñoaïn xöû lyù, BC chæ laø giaù theå trô veà maët hoùa hoïc, coù ñoä tröông nôû toát. Maøng BC coù theå taùi söû duïng nhieàu laàn trong öùng duïng laøm chaát mang, an toaøn cho moâi tröôøng soáng [15]. . Chöùc naêng sinh lyù cuûa cellulose ñoái vôùi Acetobacter xylinum Trong töï nhieân, phaàn lôùn vi khuaån toång hôïp polysaccharide ngoaïi baøo ñöôïc duøng nhö maøng bao voøng quanh teá baøo, maøng BC laø moät ví duï.Nhöõng teá baøo vi khuaån sinh toång hôïp cellulose ñöôïc baãy beân trong maïng löôùi polymer. Maïng löôùi naøy laø vaät choáng ñoõ cho quaàn theå vi sinh vaät luoân ôû beà maët tieáp giaùp giöõa moâi tröôøng loûng vaø khoâng khí. Heä thoáng löôùi polymer laøm cho caùc teá baøo coù theå baùm chaët treân beà maët moâi tröôøng vaø laøm teá baøo thu nhaän chaát dinh döôõng moät caùch deã daøng hôn so vôùi khi teá baøo ôû trong moâi tröôøng loûng khoâng coù maïng löôùi cellulose. Nhôø vaøo tính deûo vaø tính thaám nöôùc cuûa caùc lôùp cellulose maø teá baøo vi khuaån khaùng laïi nhöõng thay ñoåi baát lôïi trong moâi tröôøng soáng nhö giaûm löôïng nöôùc, thay ñoåi pH, xuaát hieän caùc chaát ñoäc vaø caùc vi sinh vaät gaây beänh. Caùc vi khuaån A.xyllinum coù theå taêng tröôûng vaø phaùt trieån beân trong lôùp voû bao. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn nhaän ra raèng cellulose baûo veä teá baøo vi khuaån döôùi taùc ñoäng cuûa tia UV, khoaûng 23% caùc teá baøo vi khuaån sinh acid acetic ñöôïc bao boïc bôûi maøng BC coù khaû naêng soáng soùt sau 1 giôø chieáu xaï tia UV. Vieäc loaïi boû lôùp maøng bao naøy seõ laøm giaûm bôùt khaû naêng soáng soùt cuûa chuùng, chæ coøn 3% [15]. . Con ñöôøng sinh toång hôïp BC. Sinh toång hôïp BC laø moät tieán trình bao goàm nhieàu böôùc ñöôïc ñieàu hoøa moät caùch chuyeân bieät vaø chính xaùc, lieân quan ñeán moät löôïng lôùn enzyme, caùc chaát xuùc taùc vaø protein ñieàu hoøa. Tieán trình naøy bao goàm söï sinh toång hôïp urdine diphosphoglucose (UDPGIc), tieàn chaát cuûa cellulose, tieáp ñeán laø söï polymer hoùa glucose vaøo moãi chuoãi b-1,4-glucan vaø söï keát hôïp caùc sôïi môùi vaøo daûi (ribbon), ñöôïc hình thaønh töø haøng traêm, thaäm chí haøng ngaøn sôïi cellulose rieâng leû. Trong quaù trình sinh toång hôïp cellulose vi khuaån, UDPGIc ñöôïc xem laø tieàn chaát cuûa cellulose. Ñaàu tieân glucose ñöôïc phosphoryl hoùa thaønh glucose-6-phosphate, phaûn öùng naøy ñöôïc xuùc taùc bôûi glucokinase, tieáp theo ñoù phaûn öùng isomer hoùa glucose-6-phosphate thaønh glucose-1-phosphate ñöôïc xuùc taùc bôûi enzyme phosphoglucomutase. Sau ñoù, enzyme UDPGIc pyrophosphorylase xuùc taùc phaûn öùng chuyeån glucose-1-phosphate thaønh UDP-glucose, tieàn chaát cuûa cellulose. Cuoái cuøng, UDP-glucose ñöôïc chuyeån thaønh cellulose nhôø xuùc taùc cuûa enzyme cellulose sythase [15, 16]. Hình 1.4. Con ñöôøng sinh toång hôïp cellulose cuûa vi khuaån Acetobacter xylinum [1]. Tröùng vòt muoái Qui trình saûn xuaát tröùng vòt muoái Tröùng vòt Röûa saïch Laøm raùo Phaân taùch Ngaâm Vôùt ra, röûa saïch Röûa laàn 1 baèng coàn Röûa laàn 2 baèng nöôùc muoái Loøng ñoû Saáy khoâ beà maët Bao goùi Saûn phaåm Loøng traéng Dung dòch muoái 12% T0C = 650C Thôøi gian: 24h T0C = 800C Thôøi gian: 10 - 15 phuùt Maøng BC haáp phuï nisin Sô ñoà 1.1. Quy trình saûn xuaát loøng ñoû tröùng vòt muoái [4]. Tieâu chuaån tröùng vòt muoái Saûn phaåm tröùng vòt muoái ñöôïc ñaùnh giaù theo tieâu chuaån 32TCN 30 – 67. Yeâu caàu kyõ thuaät Nguyeân lieäu chính vaø phuï: Tröùng: tröùng töôi coù hình baàu duïc, voû tröùng saïch khoâng dính baån, coù muøi hôi tanh cuûa tröùng. Chieàu cao buoàng khí khoâng quaù 9mm. maøng khoâng bò raùch. Loøng traéng, loøng ñoû coøn toát, chöa coù hieän töôïng gì hö hoûng. Muoái: muoái khoâ saïch, khoâng coù taïp chaát. Chæ tieâu vi sinh vaät: khoâng ñöôïc pheùp coù vi sinh vaät gaây beänh vaø khoâng coù hieän töôïng hö hoûng do vi sinh vaät gaây ra. Chæ tieâu hoùa lyù: theo caùc yeâu caàu ghi trong baûng 1 Baûng 1.3. Baûng chæ tieâu hoùa lyù. Teân chæ tieâu Yeâu caàu Loaïi 1 Loaïi 2 Khoái löôïng quaû khoâng thaáp hôn 55g 50g Haøm löôïng muoái aên (Natri clorua) tính theo % 4 - 7 [14]. Chæ tieâu caûm quan: theo caùc yeâu caàu ghi trong baûng 2 Baûng 1.4. Baûng chæ tieâu caûm quan Teân chæ tieâu Yeâu caàu Muøi vò Tröùng ñaõ luoäc chín coù muøi hôi ñaäm maën töï nhieân cuûa tröùng muoái. Khoâng ñöôïc coù muøi vò laï Loøng ñoû Loøng ñoû nguyeân veïn, hình caàu, coù maøu vaøng ñoû vaø raén, khoâng cho pheùp bò vöõa, bò aùm ñen, coù nhöõng tia maùu [14] Caùc nghieân cöùu trong vaø ngoaøi nöôùc veà öùng duïng bacteriocin vaø maøng BC haáp phuï bacteriocin ñeå baûo quaûn thöïc phaåm Caùc nghieân cöùu trong nöôùc Traàn Thò Töôûng An (2006), böôùc ñaàu nghieân cöùu söû duïng maøng moûng BC haáp phuï bacteriocin cuûa Lc. lactis ñeå baûo quaûn thòt sô cheá toái thieåu. Keát quaû coù theå baûo quaûn thòt töôi 3 ngaøy baèng maøng moûng BC haáp phuï dòch thoâ bacteriocin 200 AU/ml vaãn ñaûm baûo chaát löôïng thòt theo tieâu chuaån TCVN 7046 : 2002[1]. Nguyeãn Thò Myõ Leä (2009), ñaõ khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch bacteriocin vaøo maøng BC ñeå baûo quaûn möïc moät naéng. Keát quaû coù theå baûo quaûn möïc moát naéng 13 ngaøy baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin tinh saïch 200 IU/ml vaãn ñaûm baûo chaát löôïng möïc theo TCVN 5649:1992 vaø TCVN 5289:1992. Thôøi gian baûo quaûn möïc moät naéng ñöôïc keùo daøi theâm 8 ngaøy so vôùi maãu ñoái chöùng [7]. Caùc nghieân cöùu ngoaøi nöôùc Siragusa vaø cs (1999) ñaõ keát hôïp nisin vaøo trong maøng polyethylene duøng ñeå bao goùi chaân khoâng thòt boø töôi. Hoaït ñoäng cuûa nisin trong maøng bao giuùp choáng laïi Lactobacillus helveticus vaø B. thermosphacta ñöôïc caáy vaøo treân beà maët moâ cuûa thòt. Sau 20 ngaøy baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh thì maãu ñöôïc bao boïc baèng maøng coù chöùa nisin coù maät ñoä B. thermosphacta thaáp hôn maãu ñoái chöùng (khoâng coù nisin) [33]. Scannel vaø cs (2000) ñaõ tìm hieåu khaû naêng haáp phuï nisin vaø lacticicin 3147 vaøo maøng cellulose ñeå baûo quaûn phomai vaø thòt jambon. Ñaàu tieân, khi khaûo saùt khaû naêng haáp phuï cuûa hai bacteriocin noùi treân thì ngöôøi ta nhaän thaáy raèng lacticicin 3147 khoâng coù khaû naêng haáp phuï toát vaøo maøng, trong khi ñoù nisin laïi coù khaû naêng thaám vaøo maøng raát toát vaø coù theå oån ñònh trong voøng 3 thaùng trong ñieàu kieän baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh. Ngöôøi ta bao goùi phomai vaø thòt jambon baèng phöông phaùp MAP vaø baûo quaûn ôû nhieät ñoä tuû laïnh ñeà laøm maãu ñoái chöùng. Ñoái vôùi maãu thí nghieäm, ngöôøi ta thöïc hieän bao goùi vôùi maøng cellulose coù haáp phuï nisin. Söï keát hôïp nisin vôùi maøng cellulose ñaõ laøm giaûm soá löôïng L. innocula xuoáng coøn 1.5 log10 CFU/g sau 12 ngaøy baûo quaûn (trong khi soá löôïng ban ñaàu coù trong maãu laø 2 – 4 x105 CFU/g. Vaø soá löôïng teá baøo S. aureus 1.5 log10 CFU/g trong phomai vaø 2.8 log10 CFU/g trong phomai. Nghieân cöùu naøy caøng cho thaáy tính hieäu quaû trong vieäc keát hôïp bacteiocin trong maøng bao thöïc phaåm ñeà keùo daøi thôøi gian baûo quaûn [32]. Coma vaø cs (2001) ñaõ haáp phuï nisin vaøo trong maøng bao aên ñöôïc coù nguoàn goác töø cellulose ( maøng hydroxypropylmethylcellulose). Nhöõng khaûo saùt cho thaáy maøng coù theå choáng laïi söï phaùt trieån cuûa L. innocua vaø S. aureus, nhöng vieäc theâm vaøo chaát phuï gia ñeå taêng khaû naêng thaám nöôùc cuûa maøng laø stearic acid seõ laøm giaûm khaû naêng khaùng khuaån cuûa nisin. Nghieân cöùu naøy ñaõ ñaùnh daáu khaû naêng öùng duïng nisin keát hôïp maøng bao aên ñöôïc vaøo lónh vöïc thöïc phaåm [19]. Hudaa Neetoo vaø cs (2007) ñaõ nghieân cöùu tieàm naêng cuûa nisin keát hôïp vôùi maøng bao plastic söû duïng trong baûo quaûn caù hoài. Nghieân cöùu cho thaáy khi uû caù hoài vôùi maät ñoä ban ñaàu laø 5 x 102 CFU/cm2 Listeria monocytogene ñem uû trong maøng bao coù nisin vôùi hoaït tính 2000IU/cm2 vaø baûo quaûn ôû nhieät ñoä 100C hay 40C. Keát quaû cho thaáy, maãu uû vôùi nisin 2000IU/cm2 thì giaûm ñi 3,9 laàn so vôùi maãu ñoái chöùng (khoâng chöùa nisin) sau 56 ngaøy uû ôû 40C hay 49 ngaøy ôû 100C. Coøn maãu uû vôùi nisin 500IU/cm2 thì giaûm 0.5 ñeán 1,7 laàn sau 56 ngaøy uû ôû 40C hay 49 ngaøy ôû 100C [24]. Young-Min Kim vaø coäng söï (2000) ñaõ söû duïng hai loaïi bacteriocin laø nisin vaø lacticicin NK24 haáp phuï vaøo maøng coù maät ñoä polyethylene thaáp keát hôïp vôùi 2% polyamide. Caùc chaát phuï gia cuõng ñöôïc theâm vaøo nhö sodium chloride, citric acid vaø chaát hoaït ñoäng beà maët ñeå laøm taêng hieäu quaû cuûa vieäc haáp phuï vaø hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa bacteriocin treân maøng. Vi sinh vaät chæ thæ ñöôïc söû duïng laø Micrococcus flavus ATCC 10240. Keát quaû nghieân cöùu cho thaáy söï haáp phuï nisin vaøo maøng bao hieäu quaû hôn lacticicin NK24. Hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa maøng bao haáp phuï bacteriocin khoâng bò aûnh höôûng ñôn leû bôûi ñoä haáp phuï cuûa bacteriocin, vaø baûn chaát töï nhieân beân trong cuûa dung dòch choáng laïi vi khuaån laø nhaân toá quan troïng trong vieäc kieåm soaùt söï gia taêng cuûa vi sinh vaät. Söï keát hôïp cuûa sodium chloride, citric acid vaø chaát hoaït ñoäng beà maët khoâng laøm caûi thieän khaû naêng haáp phuï cuûa nisin vaøo maøng vaø hoaït ñoäng khaùng khuaån cuûa nisin treân maøng [35]. CHÖÔNG 2: VAÄT LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP Vaät lieäu Gioáng vi sinh vaät Vi khuaån gaây hö hoûng thöïc phaåm duøng laøm chuûng chæ thò cho hoaït tính khaùng khuaån cuûa bacteriocin: Bacillus subtilis (PTN), Bacillus cereus (PTN), Salmonella typhimurium SA – 1.06, Escherichia coli ATCC 2592. Vi khuaån Acetobacter xylinum BC16 duøng ñeå leân men thu nhaän maøng moûng BC ñöôïc cung caáp töø Boä söu taäp gioáng cuûa Boä moân Coâng ngheä Sinh hoïc, tröôøng Ñaïi hoïc Baùch Khoa Thaønh phoá Hoà Chí Minh. Moâi tröôøng nuoâi caáy MT 1: Moâi tröôøng giöõ gioáng Acetobacter xylinum Nöôùc döøa giaø 1lit Glucose 20g Diamoni phosphate 2g Amonium sulphate 8g Cao naám men 2g Agar 20g MT 2: Moâi tröôøng nhaân gioáng vaø leân men BC Nöôùc döøa giaø 1000ml Glucose 20g Diamoni phosphate 2g Amonium sulphate 8g Cao naám men 2g Acid acetic 5ml MT 3: Moâi tröôøng NB Pepton 10g Yeast extract 5g NaCl 5g Nöôùc caát 1000ml MT 4: Moâi tröôøng NA Pepton 10g Yeast extract 5g NaCl 5g Nöôùc caát 1000ml Agar 20g Vaät lieäu, hoùa chaát HCl, NaOH, thuoác nhuoäm xanh Methylene, thuoác nhuoäm Gram. Bacteriocin vôùi caùc noàng ñoä 100, 200, 300 vaø 500 IU/ml töø cheá phaåm Nisaplin coù nguoàn goác töø Lactococcus lactis. Thieát bò vaø duïng cuï Tuû caáy voâ truøng, tuû aám, tuû saáy, noài haáp tieät truøng, maùy laéc nhieät ñoä thaáp, maùy laéc troøn, loø viba, beáp ñieän, ñóa nhöïa. Thieát bò phaân tích: kính hieån vi, caân kyõ thuaät, caân phaân tích, pH keá. Duïng cuï thuûy tinh duøng trong phaân tích: erlen, becher, ñóa Petri, oáng nghieäm, bình ñònh möùc. Noäi dung thí nghieäm Caùc böôùc tieán haønh thí nghieäm ñöôïc theå hieän ôû sô ñoà 2.1 Nhieät ñoä Thôøi gian Cheá ñoä laéc Noàng ñoä bacteriocin Khaûo saùt caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình BC haáp phuï dòch nisin Maøng BC haáp phuï dòch nisin ôû ñieàu kieän toái öu Baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái Phöông phaùp A: Nhuùng tröùng vaøo nisin, bao beân ngoaøi 1 lôùp PE Phöông phaùp B: Boïc tröùng maøng BC haáp phuï dòch nisin, bao ngoaøi lôùp PE Ñaùnh giaù chaát löôïng saûn phaåm: Vi sinh Caûm quan Phöông phaùp ÑC1: Loøng ñoû tröùng vòt muoái bao beân ngoaøi 1 lôùp PE. Sô ñoà 2.1. Noäi dung caùc böôùc thí nghieäm cuûa ñeà taøi. Phöông phaùp thí nghieäm Khaûo saùt khaû naêng taïo maøng moûng BC baèng phöông phaùp leân men truyeàn thoáng. Maøng BC ñöôïc thu nhaän töø quaù trình leân men theo sô ñoà 2.2 Gioáng A.xylinum Nhaân gioáng caáp I Nhaân gioáng caáp II Caáy gioáng:10-20% gioáng Leân men tónh (1-2ngaøy) Thu nhaän BC thoâ Sô ñoà 2.2. Caùc böôùc leân men thu nhaän maøng BC [23]. Gioáng ñöôïc nhaân gioáng caáp 1 ôû ñieàu kieän nhieät ñoä thöôøng trong 24 giôø vôùi tyû leä gioáng laø 20%. Sau ñoù tieáp tuïc nhaân gioáng caáp 2 ôû ñieàu kieän nhieät ñoä phoøng trong voøng 48 giôø vôùi tyû leä gioáng 20%. Tieáp theo, gioáng ñöôïc leân men trong moâi tröôøng nhaân gioáng ñeå taïo maøng BC. Ñeå thu ñöôïc lôùp maøng coù beà daøy mong muoán, thí nghieäm ñöôïc thieát laäp nhö sau: gioáng vaø moâi tröôøng nhaân gioáng ñöôïc troän vôùi nhau, sau ñoù ñem ñoå dòch gioáng vaøo ñóa nhöïa coù kích thöôùc ñöôøng kính laø 10,5 cm vôùi theå tích dòch gioáng laø: 12ml, 14ml, 16ml, 18ml, 20ml. Phöông phaùp xöû lyù maøng BC tröôùc khi haáp phuï Maøng BC sau khi thu ñöôïc chöùa moät löôïng lôùn moâi tröôøng leân men vaø caùc saûn phaåm cuûa quaù trình trao ñoåi chaát (acid acetic,…). Muïc ñích cuûa ñeà taøi laø söû duïng maøng moûng BC ñeå haáp phuï nisin ñeå gia taêng thôøi gian baûo quaûn tröùng vòt muoái neân vieäc xöû lyù maøng BC phaûi ñaït nhöõng yeâu caàu sau: Coù tính chaát cô lyù beàn vöõng, ñoä tröông nôû oån ñònh, chòu ñöôïc caùc taùc ñoäng cuûa moâi tröôøng nhö khuaáy troän, aùp löïc, nhieät ñoä… Khoâng gaây taùc ñoäng ñoái vôùi chaát ñöôïc haáp phuï vaø thöïc phaåm ñöôïc bao boïc. BC sau khi leân men xong seõ ñöôïc xöû lyù theo sô ñoà Maøng BC thoâ Röûa vaø ngaâm nöôùc (24h) Ngaâm trong NaOH 3% (10h) Ngaâm trong HCl 5% (20phuùt) Röûa vaø ngaâm nöôùc (24h) Haáp tieät truøng (1210C, 15phuùt) Maøng BC Sô ñoà 2.3. Caùc böôùc xöû lyù maøng BC [24]. Ño beà daøy maøng BC Beà daøy maøng BC ñöôïc xaùc ñònh baèng thöôùc keïp vaø ñoàng hoà ño chieàu daøy. Ta ño ôû nhieàu vò trí khaùc nhau. Sau ñoù xaùc ñònh ñöôïc beà daøy baèng caùch tính toaùn caùc laàn ño. Thí nghieäm ñöôïc boá trí trong baûng Baûng 2.1. Caùch boá trí thí nghieäm ño beà daøy maøng Maãu d1 (mm) d2 (mm) d3 (mm) d4 (mm) dtb (mm) A1 Vò trí 1 Vò trí 2 Vò trí 3 Vò trí 4 A2 Vò trí 1 Vò trí 2 Vò trí 3 Vò trí 4 A3 Vò trí 1 Vò trí 2 Vò trí 3 Vò trí 4 A4 Vò trí 1 Vò trí 2 Vò trí 3 Vò trí 4 Xaùc ñònh hoaït tính cuûa nisin tröôùc khi haáp phuï Phöông phaùp gieáng khueách taùn laø phöông phaùp ñeå xaùc ñònh hoaït tính cuûa nisin tröôùc khi haáp phuï [24] Ñoå 15ml moâi tröôøng MT 3 vaøo ñóa Petri voâ truøng, ñeå thaïch ñoâng. Traûi 10ml dòch nuoâi caáy qua ñeâm chuûng chæ thò Bacillus cereus. Ñuïc loã coù ñöôøng kính 5mm treân thaïch. Nhoû 20ml dòch nisin vaøo loã thaïch, uû ôû 370C, 12 giôø. Quan saùt voøng khaùng khuaån xuaát hieän treân maët thaïch. Xaùc ñònh hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï dòch nisin Ñoå 15ml moâi tröôøng MT 3 vaøo ñóa Petri voâ truøng, ñeå thaïch ñoâng. Traûi 10ml dòch nuoâi caáy qua ñeâm chuûng chæ thò Bacillus cereus. Caét maøng maûng BC thaønh nhöõng mieáng nhoû coù kích thöôùc 1 x 1 cm, cho haáp phuï trong dòch nisin. Duøng maøng BC sau khi haáp phuï ñaët vaøo giöõa ñóa Petri ñaõ coù chuûng chæ thò, uû ôû 370C, 12 giôø. Quan saùt voøng khaùng khuaån. Xaùc ñònh thoâng soá toái öu cuûa quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng moûng BC Thöïc hieän quy hoaïch thöïc nghieäm toái öu hoùa toaøn phaàn 4 yeáu toá (24) Xaùc ñònh thoâng soá cuûa quaù trình: Thoâng soá ñaàu ra: haøm löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC (g), kyù hieäu laø yi. Thoâng soá ñaàu vaøo: caùc yeáu toá taùc ñoäng leân quaù trình haáp phuï dòch nisin ñöôïc kyù hieäu laø Zi. Caùc thoâng soá chính aûnh höôûng tôùi quaù trình haáp phuï dòch nisin laø: noàng ñoä nisin (x1), nhieät ñoä (x2), thôøi gian (x3), cheá ñoä laéc (voøng/phuùt). Xaùc ñònh möùc cô sôû vaø khoaûng bieán thieân yeáu toá ñaàu vaøo. Choïn khoaûng bieán thieân xi laøm 3 möùc: treân, döôùi vaø cô sôû. Caùc möùc naøy ñöôïc maõ hoùa nhö sau: möùc treân +1, möùc döôùi -1, möùc cô sôû 0 Baûng 2.2. Caùc möùc bieán thieân vaø caùc yeáu toá aûnh höôûng trong quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC Caùc möùc Caùc yeáu toá X1 X2 X3 X4 Möùc cô sôû (0) 200 20 30 150 Khoaûng bieán thieân (±1) 100 10 10 50 Möùc treân (+1) 300 30 40 200 Möùc döôùi (-1) 100 10 20 100 x1: noàng ñoä nisin (IU/ml); x2: nhieät ñoä (0C); x3: thôøi gian (phuùt); x4: cheá ñoä laéc (voøng/phuùt). Soá löôïng thí nghieäm ñöôïc xaùc ñònh theo coâng thöùc: Nk = 24 = 16 thí nghieäm. N: soá löôïng nghieäm thöùc; k: soá yeáu toá khaûo saùt. Xaây döïng phöông trình baäc nhaát ñeå xaùc ñònh aûnh höôûng cuûa 4 yeáu toá khaûo saùt tôùi quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC. Phöông trình hoài quy moâ taû thöïc nghieäm coù daïng: y= bo +b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 ….. Trong ñoù: b0, b1, b2, b3, …. laø caùc heä soá trong phöông trình hoài quy [3]. Thöïc hieän thí nghieäm leo doác Döïa vaøo keát quaû quy hoaïch thöïc nghieäm tieán haønh toái öu hoùa thöïc nghieäm ñöôïc thöïc hieän baèng phöông phaùp ñöôøng doác nhaát. Choïn böôùc chuyeån ñoäng cho caùc yeáu toá coù aûnh höôûng trong phöông trình hoài quy. Ñeå tìm ñöôïc caùc thoâng soá toái öu phaûi xaùc ñònh ñöôïc y cao nhaát, töông öùng caùc giaù trò x1, x2, x3, x4 cuûa caùc yeáu toá caàn tìm. Phöông phaùp xaùc ñònh theå tích nisin bò haáp phuï Choïn maøng BC coù khoái löôïng töông ñoái ñeàu nhau, ñem haáp phuï theo caùc thoâng soá thieát keá thí nghieäm qui hoaïch thöïc nghieäm. Caân khoái löôïng mieáng BC sau khi haáp phuï, hieäu soá giöõa khoái löôïng tröôùc vaø sau khi haáp phuï chính laø löôïng nisin haáp phuï vaøo. ÖÙng duïng baûo quaûn tröùng vòt muoái baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin Khaûo saùt khaû naêng öùng duïng maøng BC coù haáp phuï dòch nisin ôû cheá ñoä toái öu vöøa khaûo saùt vaø thöïc teá baûo quaûn tröùng vòt muoái ôû nhieät ñoä phoøng. Sau khi xaùc ñònh ñieàu kieän toái öu maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin, ta ñem maøng moûng haáp phuï nisin bao boïc tröùng vòt muoái, bao goùi maãu baèng maøng PE, baûo quaûn nhieät ñoä phoøng. Boá trí thí nghieäm: caùc maãu khaûo saùt ñöôïc trình baøy qua baûng 2.3 Baûng 2.3. Caùc maãu khaûo saùt phöông phaùp baûo quaûn tröùng vòt muoái. Maãu thí nghieäm Phöông phaùp baûo quaûn Tieán haønh thí nghieäm ÑC1(ñoái chöùng thí nghieäm) Ñoái chöùng theo thôøi gian baûo quaûn A Baûo quaûn baèng dòch nisin Nhuùng maãu tröùng vòt muoái qua dòch nisin 200IU/ml, bao beân ngoaøi moät lôùp PE B Baûo quaûn baèng maøng BC coù haáp phuï dòch nisin Boïc maãu tröùng vòt muoái baèng maøng BC coù haáp phuï dòch nisin 200IU/ml, bao beân ngoaøi moät lôùp PE. Caùc chæ tieâu theo doõi: tieán haønh kieåm tra ñaùnh giaù chaát löôïng cuûa caùc maãu thí nghieäm thoâng qua: Caùc chæ tieâu vi sinh (667/1998/ QÑ – BYT): toång soá vi khuaån hieáu khí, Coliform, E. coli, Salmonella. Tieán haønh ñaùnh giaù veà maët caûm quan cuûa caùc maãu theo tieâu chuaån 32TCN 30 – 67. CHÖÔNG 3: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN Taïo maøng moûng BC Khaûo saùt moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc cuûa chuûng Acetobacter xylinum Chuûng Acetobacter xylinum BC16 do phoøng thí nghieäm Boä moân Coâng ngheä sinh hoïc cung caáp ñöôïc kieåm tra moät soá ñaëc ñieåm sinh hoïc. Keát quaû thu ñöôïc nhö sau: Kieåm tra vi theå Gioáng Acetobacter xylinum ñöôïc nhuoäm Gram vaø quan saùt döôùi kính hieån vi, chuùng toâi nhaän thaáy: vi khuaån Acetobacter xylinum Gram aâm, coù daïng hình que, teá baøo ñöùng rieâng leû. Hình 3.1. Hình quan saùt vi theå gioáng Acetobacter xylinum qua kính hieån vi. Kieåm tra ñaïi theå Ñaëc ñieåm sinh tröôûng cuûa Acetobacter xylinum treân moâi tröôøng ñaëc: Acetobacter xylinum coù khuaån laïc hình troøn, nhaày, beà maët khuaån laïc trôn boùng, maøu traéng ñuïc. Hình 3.2. Khuaån laïc Acertobacter xylinum Ñaëc ñieåm sinh tröôûng cuûa Acetobacter xylinum treân moâi tröôøng loûng: Chuûng Acetobacter xylinum BC16 taïo moät lôùp maøng treân moâi tröôøng loûng sau moät ngaøy nuoâi caáy. Beà daøy lôùp maøng taêng daàn theo thôøi gian nuoâi caáy. Hình 3.3. Acetobacter xylinum treân moâi tröôøng loûng. Kieåm tra moät soá ñaëc ñieåm sinh hoùa ñaëc tröng Sau khi kieåm tra vi theå vaø ñaïi theå, chuùng toâi tieán haønh kieåm tra ñaëc ñieåm sinh hoùa cuûa Acetobacter xylinum. Keát quaû kieåm tra caùc ñaëc ñieåm sinh hoùa ñöôïc trình baøy trong baûng 3.1. Baûng 3.1 Keát quaû kieåm tra moät soá ñaëc ñieåm sinh hoùa STT Ñaëc ñieåm Hieän töôïng Keát quaû 1 Oxy hoùa ethanol thaønh acid acetic Moâi tröôøng maøu vaøng chuyeån thaønh maøu xanh luïc + 2 Catalase Suûi boïi khí + 4 Chuyeån hoùa glucose thaønh acid Voøng saùng xung quanh khuaån laïc + 5 Chuyeån hoùa glycerol thaønh dihydroxy acetone Voøng CuO xuaát hieän quanh khuaån laïc + 6 Kieåm tra khaû naêng sinh saéc toá naâu Khoâng coù saéc toá naâu - 7 Kieåm tra khaû naêng sinh toång hôïp cellulose Vaùng vi khuaån xuaát hieän maøu lam + Vôùi keát quaû nhö treân, gioáng Acetobacter xylinum ñaõ ñöôïc kieåm tra gioáng thuaàn. Gioáng naøy seõ ñöôïc söû duïng ñeå leân men taïo maøng BC cho caùc thí nghieäm tieáp theo. Keát quaû khaûo saùt beà daøy maøng BC. Maøng BC ñöôïc ño ôû 4 ñieåm coù ñoä daøy d1, d2, d3, d4 vaø beà daøy cuûa maøng ñöôïc tính trung bình vôùi kích thöôùc laø dtb. Maøng ñöôïc khaûo saùt ôû caùc theå tích 12ml, 14ml, 16ml, 18ml töông öùng vôùi caùc maãu A1, A2, A3, A4 vôùi keát quaû ñöôïc trình baøy trong baûng 3.2. Baûng 3.2. Beà daøy cuûa maøng BC Maãu d1 (mm) d2 (mm) d3 (mm) d4 (mm) dtb (mm) A1 0.08 0.07 0.09 0.08 0.08 A2 0.1 0.11 0.1 0.1 0.10 A3 0.12 0.12 0.11 0.13 0.12 A4 0.15 0.15 0.16 0.15 0.15 Döïa vaøo baûng 3.2 chuùng toâi coù nhaän xeùt: beà daøy cuûa maøng töông ñoái ñoàng ñeàu. Ñoä cheânh leäch beà daøy maøng raát nhoû (< 0.02 mm). ÔÛ phöông phaùp naøy, tæ leä giöõa beà maët chaát loûng vaø beà saâu chaát loûng lôùn neân löôïng oxy khueách taùn vaøo moâi tröôøng lôùn. Do ñoù, vi khuaån Acetobacter xylinum söû duïng heát moâi tröôøng taïo maøng coù hình daïng xaùc ñònh theo hình daïng chaát loûng chöùa trong ñóa nhöïa. Maøng vi khuaån phaùt trieån theo chieàu saâu ñeán ñaùy cuûa ñóa nhöïa roài phaùt trieån theo chieàu ngang taïo boä khung ñoàng ñeàu cho maøng neân maøng coù ñoä daøy töông ñoái ñeàu. Vôùi theå tích 12ml dòch gioáng vöøa ñuû ñeå traûi moät lôùp moûng dòch heát beà maët ñóa nhöïa, coù beà daøy 0.08mm, moûng vaø khoâng bò raùch döôùi taùc ñoäng cô hoïc trong quaù trình baûo quaûn vaø cho chaát löôïng caûm quan toát. Vôùi theå tích 14ml, 16ml, 18ml dòch gioáng, coù beà daøy hôi daøy, chòu ñöôïc löïc cô hoïc nhöng aûnh höôûng ñeán giaù trò caûm quaûn cuûa saûn phaåm khi bao goùi. Döïa vaøo keát quaû naøy, chuùng toâi choïn maøng coù beà daøy 0.08mm ñeå thöïc hieän caùc thí nghieäm tieáp theo. Khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch vaøo maøng moûng BC. Chuùng toâi khaûo saùt phaàn naøy nhaèm taïo ra maøng baûo quaûn thöïc phaåm. Cuï theå laø chuùng toâi öùng duïng trong baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. Keát quaû khaûo saùt thoâng soá toái öu cuûa quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC baèng phöông phaùp quy hoaïch thöïc nghieäm toaøn phaàn. Vôùi beà daøy maøng BC chuùng toâi ñaõ choïn, ñeå xaùc ñònh ñöôïc caùc thoâng soá toái öu trong quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC, chuùng toâi tieán haønh boá trí thí nghieäm baèng phöông phaùp quy hoaïch thöïc nghieäm toaøn phaàn vaø toái öu hoùa thöïc nghieäm ñöôøng doác nhaát. Cô sôû ñeå xaùc ñònh caùc möùc cô baûn (x) vaø khoaûng bieán thieân (Dx) cuûa caùc yeáu ñaàu vaøo: Baûng 3.3. Caùc yeáu toá quy hoaïch thöïc nghieäm Yeáu toá Bieán coù thöù nguyeân x Bieán khoâng coù thöù nguyeân Z Möùc cô baûn Dx Möùc cô baûn DZ 1. Noàng ñoä nisin (IU/ml) 200 100 0 1 2. Nhieät ñoä (0C) 20 10 0 1 3. Thôøi gian (phuùt) 30 10 0 1 4. Cheá ñoä laéc (voøng/phuùt) 150 50 0 1 Baûng 3.4. Moâ hình quy hoaïch thöïc nghieäm trong quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng STT X1 X2 X3 X4 Z1 Z2 Z3 Z4 Y 1 300 30 40 200 +1 +1 +1 +1 1.5949 2 300 30 20 200 +1 +1 -1 +1 0.9576 3 100 30 40 200 -1 +1 +1 +1 1.4848 4 100 30 20 200 -1 +1 -1 +1 1.3280 5 300 30 40 100 +1 +1 +1 -1 0.9165 6 300 30 20 100 +1 +1 -1 -1 1.4626 7 100 30 40 100 -1 +1 +1 -1 1.1064 8 100 30 20 100 -1 +1 -1 -1 1.3393 9 300 10 40 200 +1 -1 +1 +1 1.6971 10 300 10 20 200 +1 -1 -1 +1 1.2651 11 100 10 40 200 -1 -1 +1 +1 1.6989 12 100 10 20 200 -1 -1 -1 +1 1.1668 13 300 10 40 100 +1 -1 +1 -1 1.6992 14 300 10 20 100 +1 -1 -1 -1 0.8752 15 100 10 40 100 -1 -1 +1 -1 1.6998 16 100 10 20 100 -1 -1 -1 -1 1.1833 17 200 20 30 150 0 0 0 0 1.0368 18 200 20 30 150 0 0 0 0 1.1457 19 200 20 30 150 0 0 0 0 0.9539 20 200 20 30 150 0 0 0 0 1.0636 Sau khi tính toaùn, xaùc ñònh ñöôïc heä soá bj cuûa phöông trình hoài qui. Baûng 3.5 Heä soá cuûa phöông trình hoài qui Heä soá bj Giaù trò Sbj tj t0.1(3) Keát luaän b0 1.34 0.02 67.9 2.13 nhaän b1 -0.034 0.02 1.7 2.13 loaïi b2 -0.068 0.02 3.5 2.13 nhaän b3 0.145 0.02 7.3 2.13 nhaän b4 0.057 0.02 2.9 2.13 nhaän tj< t0,1(3): loaïi bj töông öùng khoûi phöông trình hoài quy. tj> t0,1(3): laáy bj töông öùng vaøo phöông trình hoài quy. Sau khi kieåm tra tính töông thích cuûa phöông trình vôùi thöïc nghieäm chuùng toâi xaây döïng ñöôïc phöông trình hoài quy töông thích vôùi thöïc nghieäm sau: y = 1.34 – 0.068x2 + 0.145x3 + 0.057x4 Theo phöông trình hoài qui tuyeán tính treân chuùng toâi nhaän thaáy: Caùc yeáu toá thôøi gian, nhieät ñoä, cheá ñoä laéc coù aûnh höôûng ñeán quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC, coøn yeáu toá noàng ñoä nisin khoâng aûnh höôûng. Töø moâ hình toaùn hoïc ta nhaän thaáy raèng caùc heä soá ñöùng tröôùc caùc bieán x3 vaø x4 coù daáu döông, nghóa laø caùc thoâng soá thôøi gian vaø cheá ñoä laéc tæ leä thuaän vôùi löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC. Vaø heä soá ñöùng tröôùc bieán x2 coù daáu aâm, nghóa laø thoâng soá nhieät ñoä tæ leä nghòch vôùi löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC. Do ñoù, ñeå taêng giaù trò cuûa thoâng soá toái öu hoùa caàn giaûm giaù trò x2 vaø taêng giaù trò x3 vaø x4. Khi thôøi gian caøng taêng thì löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC caøng taêng. Vì khi taêng thôøi gian haáp phuï, dòch nisin caøng coù nhieàu cô hoäi ñöôïc tieáp xuùc vôùi caùc loã treân maøng BC, daãn ñeán löôïng nisin ñöôïc haáp phuï vaøo trong maøng caøng nhieàu. Khi taêng cheá ñoä laéc cuûa quaù trình haáp phuï thì löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC caøng taêng. Vì khi cheá ñoä laéc taêng, taïo ra ñoäng löïc khueách taùn phaân töû nisin vaøo caùc loã nhoû cuûa maøng BC caøng taêng, daãn ñeán löôïng nisin haáp phuï vaøo trong maøng caøng nhieàu [11]. Ngöôïc laïi vôùi söï aûnh höôûng cuûa yeáu toá thôøi gian vaø cheá ñoä laéc, khi nhieät ñoä caøng giaûm thì löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC caøng taêng. Nguyeân nhaân daãn ñeán hieän töôïng naøy laø do quaù trình haáp phuï laø quaù trình toûa nhieät, do ñoù khi giaûm nhieät ñoä giaûm seõ taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho quaù trình haáp phuï, laøm cho löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng caøng nhieàu [2]. Nhaèm muïc ñích xaùc ñònh giaù trò toái öu cho quaù trình haáp phuï, chuùng toâi thöïc hieän thí nghieäm leo doác. Vôùi böôùc chuyeån ñoäng cuûa yeáu toá x4 laø laø d4: d4 = 10 voøng/phuùt. Treân cô sôû ñoù xaùc ñònh böôùc chuyeån ñoäng cuûa x2 vaø x3 ñöôïc trình baøy trong baûng sau. Baûng 3.6. Caùc yeáu toá trong thí nghieäm leo doác Caùc yeáu toá X2 X3 X4 Möùc cô sôû 20 30 150 Heä soá bj 0.068 0.145 0.057 Khoaûng bieán thieân 10 10 50 bjxDj 0.68 1.45 2.85 Böôùc dj 2.38 5.08 10 Böôùc laøm troøn 2 5 10 Döïa vaøo baûng tính toaùn ôû treân, chuùng toâi tính ñöôïc caùc böôùc chuyeån ñoäng cuûa x2 laø d2 = 2.50C vaø böôùc chuyeån ñoäng cuûa x3 laø d3 = 5 phuùt. Keát quaû thí nghieäm leo doác ñöôïc trình baøy ôû baûng. Baûng 3.7. Haøm löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC ôû thí nghieäm leo doác STT x2 (0C) x3 (phuùt) x4 (voøng/phuùt) y 1 17.5 35 160 0.7631 2 15 40 170 1.0032 3 12.5 45 180 1.4966 4 10 50 190 0.919 Qua baûng keát quaû thí nghieäm toái öu hoùa baèng phöông phaùp leo doác cho thaáy: löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC ôû thí nghieäm thöù 1, 2, 3 coù söï taêng daàn, ñeán thí nghieäm thöù 4 thì löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC coù xu höôùng giaûm roõ reät. Nguyeân nhaân laø do khi tieán haønh thí nghieäm leo doác, chuùng toâi ñaõ taêng yeáu toá cheá ñoä laéc. Khi cheá ñoä laéc taêng thì löôïng nisin haáp phuï vaøo maøng BC caøng taêng. Nhöng khi taêng ñeán moät giôùi haïn naøo ñoù seõ laøm xaûy ra hieän töôïng nhaû haáp phuï. Vì khi laéc quaù maïnh, dòch nisin ñaõ ñöôïc haáp phuï vaøo trong nhöõng loã nhoû cuûa maøng BC seõ bò vaêng ra ngoaøi, laøm löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC giaûm. Nhö vaäy, qua keát quaû naøy, chuùng toâi nhaän thaáy ôû thí nghieäm thöù 4 ñaõ xuaát hieän söï nhaû haáp phuï dòch nisin. Do ñoù chuùng toâi choïn löôïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC toái öu laø ôû ñieàu kieän thí nghieäm thöù 3, töùc ôû ñieàu kieän thôøi gian laø 45 phuùt, nhieät ñoä 12,50C vaø cheá ñoä laéc 180 voøng/phuùt. Keát quaû khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa dòch nisin Vôùi muïc ñích söû duïng dòch nisin haáp phuï vaøo maøng BC ñeå baûo quaûn tröùng vòt muoái, tröôùc tieân chuùng toâi ñaõ tieán haønh khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa dòch nisin ñoái vôùi moät soá chuûng chæ thò, ñaëc bieät laø nhöõng chuûng gaây hö hoûng vaø gaây beänh thöôøng tìm thaáy trong thöïc phaåm: Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Echerichia coli. Hình 3.4. Hoaït tính khaùng khuaån cuûa nisin ñoái vôùi Bacillus subtilis Hình 3.5. Hoaït tính khaùng khuaån cuûa nisin ñoái vôùi Bacillus cereus Hình 3.6. Hoaït tính khaùng khuaån cuûa nisin ñoái vôùi Echerichia coli Hình 3.7. Hoaït tính khaùng khuaån cuûa nisin ñoái vôùi Salmonella typhimurium Baûng 3.8. Khaû naêng khaùng vi sinh vaät gaây hö hoûng vaø gaây beänh thöôøng gaëp cuûa dòch nisin coù hoaït tính 500IU/ml. Chuûng vi khuaån chæ thò Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån (mm) Bacillus subtilis 39 Bacillus cereus 45 Echerichia coli 15 Salmonella typhimurium 15 Keát quaû ôû baûng 3.8 cho thaáy dòch nisin coù khaû naêng khaùng khuaån roäng, khoâng chæ öùc cheá moät soá vi khuaån Gram döông gaây hö hoûng thöïc phaåm nhö chuûng Bacillus, maø coøn öùc cheá moät soá vi khuaån Gram aâm gaây beänh nhö Salmonella typhimurium, Echerichia coli. Trong ñoù, nisin theå hieän hoaït tính khaùng khuaån maïnh nhaát ñoái vôùi Bacillus cereus, tieáp ñeán laø Bacillus subtilis. Ñoái vôùi hai loaøi vi khuaån Echerichia coli vaø Salmonella typhimurium, nisin theå hieän hoaït tính khaùng khuaån keùm hôn so vôùi chuûng Bacillus Keát quaû khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï dòch nisin Muïc tieâu cuûa ñeà taøi khoâng söû duïng dòch nisin tröïc tieáp ñeå baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái maø taïo maøng BC haáp phuï dòch nisin sau ñoù söû duïng ñem bao goùi baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. Keát quaû khaûo saùt khaû naêng haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC cho thaáy yeáu toá noàng ñoä nisin khoâng aûnh höôûng ñeán khaû naêng haáp phuï. Do ñoù, ñeå kieåm chöùng dòch nisin coù ñöôïc haáp phuï vaøo maøng BC, ñoä haáp phuï coù ñoàng ñeàu khoâng vaø tìm ra noàng ñoä nisin coù hieäu quaû nhaát trong vieäc baûo quaûn. Chuùng toâi tieán haønh thí nghieäm khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï dòch nisin ôû caùc noàng ñoä khaùc nhau treân chuûng vi khuaån chæ thò laø Bacillus cereus. Hình 3.8. Maøng BC haáp phuï nisin coù noàng ñoä 100IU/ml so saùnh vôùi dòch nisin coù noàng ñoä 500IU/ml. Hình 3.9. Maøng BC haáp phuï dòch nisin 200IU/ml so saùnh vôùi dòch nisin 500IU/ml. Hình 3.10. Maøng BC haáp phuï dòch nisin 300IU/ml so saùnh vôùi dòch nisin 500IU/ml. Hình 3.11. Maøng BC haáp phuï dòch nisin 500IU/ml so saùnh vôùi dòch nisin 500IU/ml. Baûng 3.9. Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån cuûa maøng BC sau khi haáp phuï so saùnh vôùi dòch nisin 500IU/ml Noàng ñoä nisin maøng BC haáp phuï (IU/ml) Ñöôõng kính voøng khaùng khuaån maøng BC haáp phuï nisin (mm) Ñöôøng kính voøng khaùng khuaån loã chöùa dòch nisin 500IU/ml (mm) 100 38.5 41 200 40 41 300 41 41 500 41 41 Döïa vaøo keát quaû khaûo saùt cuõng cho ta thaáy hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC haáp phuï dòch nisin noàng ñoä 100IU/ml laø thaáp nhaát, hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC haáp phuï dòch nisin noàng ñoä 200IU/ml gaàn baèng vôùi dòch nisin noàng ñoä 500IU/ml töï do. Vaø hoaït tính khaùng khuaån cuûa maøng BC haáp phuï nisin noàng ñoä 300IU/ml vaø 500IU/ml baèng hoaït tính khaùng khuaån cuûa dòch nisin 500IU/ml töï do. Chuùng toâi nhaän thaáy hoaït tính cuûa nisin ñöôïc haáp phuï vaøo maøng BC taêng daàn töø noàng ñoä thaáp ñeán noàng ñoä cao, vaø coù keát quaû gaàn baèng hoaït tính cuûa dòch nisin 500IU/ml töï do. Do ñoù, chuùng toâi coù theå keát luaän dòch nisin ñaõ ñöôïc haáp phuï vaøo trong maøng BC vaø coù ñoä haáp phuï khaù ñoàng ñeàu. Maët khaùc, nisin hieän nay ñaõ ñöôïc tinh saïch baèng nhieàu coâng ngheä khaùc nhau vaø ñöôïc thöông maïi hoùa nhöng giaù thaønh vaãn coøn cao, cuøng vôùi keát quaû qui hoaïch thöïc nghieäm yeáu toá noàng ñoä nisin khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng BC vaø keát quaû khaûo saùt khaû naêng khaùng khuaån cuûa maøng BC ñaõ haáp phuï dòch nisin. Ñeå tieát kieäm veà maët kinh teá, chuùng toâi choïn dòch nisin vôùi noàng ñoä 200IU/ml ñeå tieán haønh thí nghieäm baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. Keát quaû öùng duïng maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin ñeå baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái. An toaøn thöïc phaåm laø moät trong nhöõng yeáu toá caáu thaønh neân chaát löôïng thöïc phaåm. Trong quaù trình baûo quaûn thöïc phaåm, coù raát nhieàu phöông phaùp ñöôïc aùp duïng nhö laïnh ñoäng, söû duïng hoùa chaát, chaát khaùng sinh,… Moãi phöông phaùp ñeàu coù öu nhöôïc ñieåm rieâng, chuùng coù theå laøm thay ñoåi caáu truùc cuûa saûn phaåm, hoaëc toàn ñoïng nhieàu dö löôïng hoùa chaát coù theå aûnh höôûng ñeán söùc khoûe cuûa ngöôøi tieâu duøng. Moät khuynh höôùng môùi trong lónh vöïc naøy ñang thu huùt söï chuù yù cuûa nhieàu nhaø khoa hoïc laø söû duïng nisin laøm taùc nhaân sinh hoïc an toaøn trong baûo quaûn thöïc phaåm. Loøng ñoû tröùng vòt sau khi ngaâm nöôùc muoái ôû noàng ñoä 15%, vaãn coøn nhieàu chaát ñaïm vaø chaát beùo, ñoàng thôøi khoâng coù lôùp voû boïc tröùng baûo veä neân seõ laø moâi tröôøng thuaän lôïi cho vi sinh vaät phaùt trieån, ñaëc bieät laø naám moác daãn ñeán gaây hö hoûng tröùng ôû moâi tröôøng nhieät ñoä thöôøng hoaëc nhieät ñoä maùt. Do ñoù, trong khaûo saùt naøy chuùng toâi söû duïng maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin ñeå baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái ôû nhieät ñoä 50C. Dòch nisin tinh saïch 200IU/ml ñöôïc haáp phuï vaøo maøng BC thôøi gian 45 phuùt, nhieät ñoä 12,50C, cheá ñoä laéc 180 voøng/phuùt. Loøng ñoû tröùng vòt sau khi muoái ñöôïc chia laøm 3 maãu thí nghieäm vôùi caùc phöông phaùp baûo quaûn khaùc nhau (baûng 2.3). Keát quaû ñaùnh giaù chaát löôïng loøng ñoû tröùng vòt muoái sau 1 thaùng baûo quaûn ñöôïc theå hieän trong caùc baûng 3.10, 3.11. Baûng 3.10. Theo doõi chaát löôïng caûm quan cuûa caùc maãu theo thôøi gian baûo quaûn. Maãu Chæ tieâu caûm quan 1 tuaàn 2 tuaàn 3 tuaàn 4 tuaàn ÑC1 Maøu Ñaëc tröng Hôi nhaït maøu Nhaït maøu Nhaït maøu Muøi Ñaëc tröng Hôi keùm ñaëc tröng Keùm ñaëc tröng Keùm ñaëc tröng Traïng thaùi, caáu truùc Hôi cöùng, beà maët trôn laùng Cöùng, beà maët trôn laùng Cöùng, töôm daàu Cöùng, töôm daàu nhieàu A Maøu Ñaëc tröng Ñaëc tröng Ñaëc tröng Hôi nhaït maøu Muøi Ñaëc tröng Hôi keùm ñaëc tröng Keùm ñaëc tröng Keùm ñaëc tröng Caáu truùc Hôi cöùng, beà maët trôn laùng Hôi cöùng, beà maët trôn laùng Cöùng, töôm daàu Cöùng, töôm daàu nhieàu B Maøu Ñaëc tröng Ñaëc tröng Ñaëc tröng Ñaëc tröng Muøi Ñaëc tröng Hôi keùm ñaëc tröng Hôi keùm ñaëc tröng Keùm ñaëc tröng Caáu truùc Hôi cöùng, beà maët trôn laùng Hôi cöùng, beà maët trôn laùng Cöùng, beà maët trôn laùng Cöùng, beà maët trôn laùng Ban ñaàu Sau 30 ngaøy baûo quaûn Hình 3.12. Loøng ñoû tröùng vòt muoái baûo quaûn theo thôøi gian. Ban ñaàu Sau 30 ngaøy baûo quaûn Hình 3.13. Loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc xöû lyù baèng nisin ñeå baûo quaûn. Ban ñaàu Sau 30 ngaøy baûo quaûn Hình 3.14. Loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc boïc baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin. Xeùt veà maët caûm quan, döïa theo caùc yeâu caàu veà maët caûm quan theo tieâu chuaån 32TCN 30 – 67, chuùng toâi coù nhöõng nhaän xeùt nhö sau: Maãu ÑC1 sau 3 tuaàn baûo quaûn, maøu saéc, muøi vaø traïng thaùi caáu truùc khoâng coøn ñöôïc duy trì nhö ban ñaàu. Maãu bò töôm daàu nhieàu vaø nhaït maøu. Maãu A sau 3 tuaàn baûo quaûn, vaãn giöõ ñöôïc maøu ñaëc tröng nhöng coù daáu hieäu bò töôm daàu vaø coù muøi khoâng ñaëc tröng so vôùi luùc ban ñaàu. Maãu B sau 4 tuaàn baûo quaûn, vaãn giöõ ñöôïc maøu saéc, muøi vaø traïng thaùi caáu truùc ñaëc tröng so vôùi luùc ban ñaàu.Vì vaäy, döïa vaøo maët caûm quan thì maãu B ñöôïc choïn. Xeùt veà chæ tieâu toång soá vi sinh vaät hieáu khí, döïa theo chæ tieâu veà caùc saûn phaåm töø tröùng töôi cuûa Boä y teá (667/1998/ QÑ – BYT) Baûng 3.11. Theo doõi chæ tieâu toång soá vi khuaån hieáu khí theo thôøi gian. Maãu Thôøi gian ÑC1 (Cfu/g) A B 1 tuaàn 0,55 x102 0,35 x 102 0,35 x 102 2 tuaàn 7,42 x 102 2,44 x 102 2,5 x 102 3 tuaàn 1,21 x 103 4,35 x 102 4,16 x 102 4 tuaàn 6,55 x 102 5,98 x 102 Bieåu ñoà 3.1. Toång soá vi khuaån hieáu khí cuûa caùc maãu khaûo saùt theo thôøi gian. Chuùng toâi coù nhöõng nhaän xeùt nhö sau: Maãu ÑC1 coù toång soá vi khuaån hieáu khí cao hôn haún so vôùi nhöõng maãu khaùc vaø ñeán tuaàn thöù 3 thì ñaõ khoâng ñaït giôùi haïn cho pheùp. Do nhieät ñoä baûo quaûn ôû 50C chæ coù taùc duïng kìm haõm quaù trình sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät chöù khoâng coù taùc duïng tieâu dieät vi sinh vaät. Ngoaøi ra, trong loøng ñoû tröùng muoái vaãn coøn haøm löôïng chaát dinh döôõng töông ñoái lôùn vaø chæ ñöôïc boïc 1 lôùp PE neân raát thuaän lôïi cho vi sinh vaät phaùt trieån. Maãu A ñaõ ñöôïc xöû lyù baèng nisin neân coù toång soá vi khuaån hieáu khí thaáp hôn maãu ÑC1 raát nhieàu nhöng vaãn cao hôn maãu B. Vì nisin coù khaû naêng khaùng ñöôïc moät soá vi khuaån hieáu khí, do ñoù maãu A sau khi ñöôïc xöû lyù baèng nisin coù theå öùc cheá söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa nhieàu loaøi vi khuaån hieáu khí coù trong loøng ñoû tröùng vòt muoái. Tuy nhieân, taùc duïng khaùng khuaån cuûa nisin chæ coù giôùi haïn neân moät soá loaïi vi khuaån hieáu khí vaãn phaùt trieån ñöôïc trong loøng ñoû tröùng vòt muoái nhöng vaãn ñaït chæ tieâu theo 667/1998/ QÑ – BYT. Maãu B ñaõ ñöôïc boïc baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin coù toång soá vi khuaån hieáu khí thaáp nhaát trong ba maãu. Vì maãu B ñöôïc boïc baèng maøng BC neân ñaõ haïn cheá bôùt moät löôïng khoâng khí xung quanh loøng ñoû tröùng vòt muoái. Ñoàng thôøi do coù söï taùc ñoäng cuûa nisin ñaõ ñöôïc haáp phuï vaø phaân boá ñeàu trong maøng BC neân keát quaû laøm haïn cheá ñöôïc moät löôïng lôùn vi khuaån hieáu khí phaùt trieån trong loøng ñoû tröùng vòt muoái so vôùi hai maãu ñaàu tieân. Chuùng toâi keát hôïp caùc keát quaû khaûo saùt veà maët caûm quan vaø chæ tieâu vi sinh cuûa caùc maãu loøng ñoû tröùng vòt muoái baèng ba phöông phaùp khaùc nhau, chuùng toâi nhaän thaáy: Maãu ÑC1 bò loaïi do khoâng ñaït veà maët caûm quan vaø chæ tieâu vi sinh. Maãu A ñaït chæ tieâu vi sinh nhöng vaãn bò loaïi do khoâng ñaït veà maët caûm quan. Maãu B ñaït chæ tieâu vi sinh vaø ñaït veà maët caûm quan. Maãu B ñöôïc ñem ñi xaùc ñònh laïi chæ tieâu veà maët vi sinh taïi Dòch vuï Trung taâm phaân tích thí nghieäm (Soá 2, Nguyeãn Vaên Thuû, Q.1) ñeå ñaûm baûo tính khaùch quan cuûa keát quaû luaän vaên, keát quaû ñöôïc theå hieän trong baûng 3.12. Baûng 3.12. Keát quaû kieåm tra vi sinh cuûa maãu loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc boïc baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin 200 IU/ml. Teân chæ tieâu Cfu/g TSVKHK 5,72 x 102 Coliform 0 E. coli 0 Salmonella 0 Nhö vaäy, so vôùi tieâu chuaån vi sinh cuûa Boä y teá 667/1998/ QÑ – BYT maãu B laø maãu loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc boïc baèng maøng BC haáp phuï dòch nisin 200IU/ml laø maãu toái öu, thôøi gian baûo quaûn 1 thaùng, keùo daøi theâm 15 ngaøy so vôùi maãu ñoái chöùng. Keát quaû naøy cuõng phuø hôïp vôùi keát quaû nghieân cöùu cuûa Nguyeãn Thò Myõ Leä (2009): duøng maøng BC haáp phuï dòch nisin 200IU/ml baûo quaûn möïc moät naéng ñöôïc 13 ngaøy vaø Traàn Thò Töôûng An (2006): duøng maøng BC haáp phuï dòch thoâ nisin 200AU/ml baûo quaûn thòt sô cheá ñöôïc 3 ngaøy. So vôùi keát quaû cuûa Nguyeãn Thò Myõ Leä, keát quaû cuûa chuùng toâi coù thôøi gian baûo quaûn cao hôn vôùi cuøng noàng ñoä nisin. Nguyeân nhaân laø do saûn phaåm loøng ñoû tröùng vòt muoái coù noàng ñoä muoái töø 4 – 7% , cao hôn nhieàu so vôùi saûn phaåm möïc moät naéng (2 – 3%). Muoái aên coù tính saùt khuaån maïnh vì laøm giaûm hoaït ñoä cuûa nöôùc. Ngoaøi ra, muoái aên coøn coù khaû naêng thaåm thaáu cao laøm taêng ñieàu kieän khaéc nghieät ñoái vôùi söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa vi sinh vaät. Do ñoù, haøm löôïng muoái cao trong loøng ñoû tröùng vòt muoái cuõng goùp phaàn laøm keùo daøi thôøi gian baûo quaûn. So vôùi nghieân cöùu cuûa Traàn Thò Töôûng An (2006), keát quaû cuûa chuùng toâi cuõng cao hôn raát nhieàu. Ngoaøi nhöõng nguyeân nhaân vöøa neâu ôû treân, coøn coù moät lyù do nöõa ñoù laø dòch nisin chuùng toâi söû duïng laø nisin tinh khieát neân khaû naêng khaùng khuaån cuõng cao hôn. Caùc keát quaû phaân tích ôû treân cho thaáy, maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin coù taùc duïng vöøa laøm taêng giaù trò caûm quan vöøa caûi thieän ñöôïc chaát löôïng vi sinh cuûa saûn phaåm. CHÖÔNG 4: KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ Keát luaän Qua caùc thí nghieäm khaûo saùt chuùng toâi thu ñöôïc nhöõng keát quaû sau ñaây: Xaùc ñònh ñöôïc thoâng soá toái öu cuûa quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng moûng BC vôùi ñoä daøy 0.08mm nhaèm taïo ra maøng baûo quaûn thöïc phaåm: Noàng ñoä nisin khoâng aûnh höôûng ñeán quaù trình haáp phuï dòch nisin vaøo maøng moûng BC. Nhieät ñoä haáp phuï: 12,50C. Thôøi gian haáp phuï: 45 phuùt. Cheá ñoä laéc: 180 voøng/phuùt. ÖÙng duïng maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin coù noàng ñoä 200IU/ml baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái ñöôïc 1 thaùng maø vaãn ñaûm baûo caùc chæ tieâu veà maët caûm quan vaø vi sinh (tieâu chuaån 32TCN 30 – 67 vaø 667/1998/ QÑ – BYT). Ñeà nghò Tieáp tuïc theo doõi khaû naêng baûo quaûn loøng ñoû tröùng vòt muoái baèng maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin sau 1 thaùng. Nghieân cöùu öùng duïng maøng moûng BC keát hôïp vôùi nisin vaø moät soá nhaân toá khaùc ñeå keùo daøi thôøi gian baûo quaûn tröùng vòt muoái. Nghieân cöùu öùng duïng baûo quaûn loûng ñoû tröùng vòt muoái vôùi maøng moûng BC haáp phuï dòch nisin treân qui moâ lôùn hôn. Nghieân cöùu haáp phuï dòch nisin vaøo maøng Chitosan ñeå baûo quan loøng ñoû tröùng vòt muoái. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO TAØI LIEÄU THAM KHAÛO TIEÁNG VIEÄT [1]. Traàn Thò Töôûng An (2007), Coá ñònh teá baøo Lactococcus lactis treân moät soá chaát mang vaø öùng duïng leân men thu nhaän bacteriocin, Luaän vaên thaïc só, ÑHQG Tp.HCM. [2]. Nguyeãn Bin, Caùc quaù trình thieát bò trong coâng ngheä hoùa chaát vaø thöïc phaåm, Nhaø xuaát baûn khoa hoïc vaø kyõ thuaät. [3]. Nguyeãn Caûnh, Quy hoaïch thöïc nghieäm, Nhaø xuaát baûn ÑHQG Tp. Hoà Chí Minh, 2004. [4]. Nguyeãn Thò Hieàn, Leâ Huyønh My, Nghieân cöùu saûn xuaát loøng ñoû tröùng vòt muoái. Hoäi nghò khoa hoïc vaø Coâng ngheä laàn thöù 10. Phaân ban coâng ngheä thöïc phaåm – sinh hoïc. [5]. Nguyeãn Thuùy Höông (1998), Choïn doøng Acetobacter xylinum phaùt trieån nhanh vaø moät soá bieän phaùp caûi thieän saûn xuaát cellulose vi khuaån, Luaän vaên Thaïc só, Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc Töï nhieân, Tp. HCM. [6]. Nguyeãn Thuùy Höông (2006), Tuyeån choïn vaø caûi thieän caùc chuûng Acetobacter xylinum taïo cellulose vi khuaån ñeå saûn xuaát vaø öùng duïng ôû quy moâ pilot, Luaän aùn tieán só, ÑHQG Tp.HCM. [7].Nguyeãn Thò Myõ Leä (2009), Thöû nghieäm öùng duïng maøng BC haáp phuï dòch bacteriocin coù nguoàn goác töø Lactococcus lactis ñeå baûo quaûn möïc moät naéng, Luaän vaên thaïc só, ÑHQG Tp.HCM. [8]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2003), Vi sinh vaät hoïc, NXB ÑHQG Tp.HCM. [9]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2003), Thí nghieäm coâng ngheä sinh hoc, taäp 2, NXB ÑHQG Tp.HCM. [10]. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2003), Thí nghieäm vi sinh vaät, NXB ÑHQG Tp.HCM. [11]. Ñaøo Vaên Löôïng (2005), Nhieät ñoäng löïc hoùa hoïc, Nhaø xuaát baûn khoa hoïc vaø kyõ thuaät. [12]. Leâ Thò Hoàng Tuyeát (2004), Nghieân cöùu bacteriocin saûn xuaát bôûi Lactobacillus acidophilus NrrIB-2092, Luaän vaên thaïc só Sinh hoïc, ÑHQG TPHCM. [13]. Boä y teá (1998), Caùc tieâu chuaån veà chæ tieâu vi sinh trong caùc saûn phaåm laøm töø tröùng töôi. [14]. Boä ngoaïi thöông (1968), Caùc tieâu chuaån veà tröùng vòt muoái, Thö vieän trung taâm kyõ thuaät tieâu chuaån ño löôøng chaát löôïng. TAØI LIEÄU TIEÁNG ANH [15]. Alexander Steinbuchel, “ Polysacharide and polyamide in the food industry”,Vol. 1, 2005. [16]. Bielecki, S., Krystynowicz, A., Turkiewicz, M., Kalinowska, H. (Technical University of Lodz, Stefanowskiego, Poland), Bacterial Cellulose, p. 37-46, vol.3, 2005. [17]. Brown, R.M (1978), Biosynthesis of natuaral polymer systems with special reference to cellulose assembly and deposition. [18]. Brown, R.M (1999), Cellulose structure ang biosynthesis, Pure Appl. Chem, Vol. 71, No. 5, 765 – 775. [19]. Coma V, Sebti I, Pardon P, Deschamps A, Pichavant FH (2001). Antimicrobial edible packaging based on cellulose ethers, fatty acids and nisin incorporation to inhibit Listeria innocua and Staphylococcus aureus. Applied and enviromantal microbiology. [20]. Davies EA, Bevis HE, Delves Broughton J (1997). The use of bacteriocin, nisin, as a preservative in ricotta – type cheese to control the food – borne pathogen Listeria monocytogenes. Applied and enviromantal microbiology. [21]. Einarsson H, Lauzon HL (1995). Biopreservation of birined shrimp by bacteriocin from lactic – acid bacteria. Applied and enviromantal microbiology. [22]. Gert N. Moll, Wil N. Konings, Arnold J.M. Driesen (1999), “Bacteriocin mechanism of membrane insertion and pore formation”, Antonie van Leeuwehock, 76, 185 – 198. [23]. H.chen, D.G.Hoover, Bacteriocin and their food applications, Comprehensive reviews in food science and food safety. [24]. Hudaa Nettoo, Mu Ye, Haiquiang Chen (2007). Effectiveness and stability of plastic film coated with nisin for inhibition of Listeria monocytogenes. Journal of food protection. [25]. Kung – Ming Lai, Wen – Chung Ko and Tsu – Han Lai (1997), Effect of NaCl penetration rate on the granilation and oil – off of the yolk salted duck egg, Food Sci. Technol Int. Tokyo. [26]. Laukovaù A, Czikkova S, Laczkovaùs, Turek P (1999). Use of enterocin CCM 4231 to control Listeria monocytogenes in experimentally containinated dry fermented Honaùrd Salami. Applied and enviromantal microbiology. [27]. Martin Dworkin, “The prokarotes – A handbook on the Biology of Bacteria: symbiotic asscociations, biotechnology, applied microbiology”, p. 766-775, Vol.1, 2006. [28]. Murray M, Richard JA (1997). Comparative study of the antilisterial activity of nisin A and pediocin Actt in fresh ground pork stored aerobically at 50C. [29]. Nilsson L, Huss HH, Gran L (1997). Inhibition of Listeria monocytogenes on cold – smoked salmon by nisin and carbon dioxide atmosphere. Applied and enviromantal microbiology. [30]. Nykanen A, Weckman K, Lapvetelainen A (2000). Synengistic inhibition of Listeria monocytognenes on cold – smoked rainbow trout by nisin and sodium lactate. Applied and enviromantal microbiology. [31]. Pawar DD, Malik SVS, Bhilegaonkar KN, Barbuddbe SB (2000). Effect of nisin and its combination with sodium chloride on the survival of Listeria monocytogenes added to raw buffalo meat mince. Applied and enviromantal microbiology. [32]. Scannell AGM, Hill C, Ross RP, Marx S, Hartmeler W, Arendt EK (2000). Development of bioactive food packaging materials using immobillised bacteriocin Lacticin 3147 and Nisaplin ®. Int J Food Microbiol. [33]. Siragua GR, Cutter CN, Willett JL (1999). Incorporation of bacteriocin in plastic retains activity and inhibits surface growth of bacteria on meat. Food Microbiol. [34]. Suey – Ring Chi and Kuo – Hsuen Tseng (1998), Physico chemical properties of salted pickled yolks from duck and chicken egg, Journal of food science, volume 63, No.1. [35]. Young-Min Kim, Na-Kyoung Lee, Huyn-Dong Paik, Dong-Sun Lee (2000). Migration of bacteriocin from bacteriocin – coated film and its antimicrobial activity. Food science and Biotechnology, Vol.9, No.5, pp 325 – 329. [36]. Zottola EA, Yezzl TL, Ajao DB, Roberts RF (1994). Ultillization of cheddar cheese containing nisin as an antimicrobial agent in the other foods. Applied and enviromantal microbiology. PHUÏ LUÏC 1 QUY HOAÏCH THÖÏC NGHIEÄM Coâng thöùc tính heä soá phöông trình hoài qui: Phöông saùi taùi hieän: Vôùi n: Soá thí nghieäm taïi taâm. : giaù trò caùc thí nghieäm taïi taâm. : giaù trò trung bình cuûa Kieåm ñònh söï coù nghóa cuûa caùc heä soá hoài qui theo tieâu chuaån Student: Tra baûng tp(f) vôùi p = 0,1, f = n – 1 (vôùi n laø soá thí nghieäm taïi taâm)/ Caùc giaù trò tj > tp(f) ñöôïc xem laø coù nghóa. Caùc heä soá tj < tp(f) thì khoâng coù nghóa vaø loaïi khoûi phöông trình hoài quy. Nhaän phöông trình hoài quy vôùi caùc heä soá coù nghóa. Kieåm ñònh söï töông thích cuûa moâ hình vôùi thöïc nghieäm theo tieâu chuaån Fisher Vôùi N: soá thí nghieäm thöïc hieän khoâng phaûi ôû taâm. l: heä soá coù yù nghóa trong phöông trình hoài quy. Tra baûng vôùi p = 0,1, f1 = n, f2 = n-1 (n: laø soá thí nghieäm taïi taâm). Neáu F < Fp(f1,f2): phöông trình töông thích vôùi thöïc nghieäm. Neáu F > Fp(f1,f2): phöông trình khoâng töông thích vôùi thöïc nghieäm. Toái öu hoùa thöïc nghieäm theo phöông phaùp ñöôøng doác nhaát Sau khi laäp ñöôïc phöông trình hoài qui töông thích, xaùc ñònh chieáu höôùng cuûa caùc yeáu toá thu ñöôïc thoâng soá toái öu cao nhaát. Tieán haønh moät loaït caùc thí nghieäm leo doác theo böôùc chuyeån ñoäng môùi cuûa caùc yeáu toá. Toái öu hoùa theo ñöôøng doác nhaát baét ñaáu töø ñieåm khoâng laø möùc cô sôû. Choïn böôùc chuyeån ñoäng cuûa moät yeáu toá, ví duï xl laø Dl Caùc böôùc chuyeån ñoäng cuûa caùc yeáu toá xj khaùc ñöôïc tính nhö sau: Coâng thöùc Trong ñoù: : böôùc chuyeån ñoäng ñöôïc choïn cuûa yeáu toá l. : böôùc chuyeån ñoäng cuûa yeáu toá j. bj, bl: nhöõng heä soá hoài quy cuûa phöông trình töông öùng. Dj, Dl: khoaûng bieán thieân cuûa caùc yeáu toá töông öùng. Ghi nhaän keát quaû toát nhaát ôû caùc thí nghieäm leo doác. PHUÏ LUÏC 2 Chæ tieâu vi sinh theo tieâu chuaån 667/ 1998/ QÑ – BYT ñoái vôùi saûn phaåm töø tröùng. Chæ tieâu vi sinh Cfu/g TSVKHK 103 Coliforms 10 E. coli 0 S. aureus 3 Salmonella 0