Luận văn Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống aspergillus, trichoderma và ứng dụng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ------------------------ Lê Thị Huệ KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI THUỘC GIỐNG ASPERGILLUS, TRICHODERMA VÀ ỨNG DỤNG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU Thành phố Hồ Chí Minh - 2010 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 DANH MỤC VIẾT TẮT CPE chế phẩm enzyme CT Canh trường DNS 3,5-dinitrosalicylic axit MT Mơi trường OD Mật độ quang ∆OD Hiệu số giữa mật độ quang của mẫu thử thật và thử khơng UI Đơn vị hoạt độ enzyme (tính theo đơn vị quốc tế) PTHQ Phương trình hồi qui TB Giá trị trung bình topt Nhiệt độ tối ưu pHopt pH tối ưu Luận văn thạc sĩ Cao học K18 MỞ ĐẦU Vi sinh vật là nhĩm sinh vật cĩ số lượng nhiều nhất và cĩ khả năng chuyển hĩa vật chất trong thiên nhiên mạnh nhất. Hiện nay người ta khai thác nhiều enzyme từ vi sinh vật và được ứng dụng rất nhiều trong đời sống, sản xuất. So với nguồn khai thác enzyme từ động vật và thực vật, nguồn enzyme từ vi sinh vật cĩ nhiều ưu điểm như hoạt tính enzyme cao, thời gian tổng hợp enzyme từ vi sinh vật rất ngắn (chỉ vài ngày), nguyên liệu sản xuất rẻ tiền, cĩ thể sản xuất hồn tồn theo qui mơ cơng nghiệp. Nhiều enzyme được khai thác từ vi sinh vật được tập trung nghiên cứu và cĩ nhiều ứng dụng trong thời gian qua như protease, amylase, cellulase, pectinase … Những năm sau này người ta đang chú ý nhiều hơn về một loại enzyme khác nữa là chitinase, đây là enzyme thủy phân chitin. Chitin là một polymer sinh học cĩ thể so sánh với các polysaccharide như cellulose, keratin. Chitin phân bố rất rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tế bào của nấm và là bộ xương ngồi của tơm cua và cơn trùng. Đây là một polymer cĩ trọng lượng phân tử cao, khơng tan trong nước, chứa các đơn phân là N-acetyl-glucosamine liên kết bởi liên kết 1,4-β. Chitin cĩ nhiều cơng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học và cơng nghiệp… Những enzyme cĩ liên quan đến chuyển hĩa và phân giải chitin đang được nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây. Chitin bị phân giải bởi hệ enzyme cĩ tên gọi chung là chitinase. Enzyme này được sản xuất bởi các tổ chức sống dưới tế bào để phục vụ nhu cầu chức năng sinh lý của chúng. Sự phân giải chitin dưới tác động enzyme phụ thuộc vào các yếu tố hĩa lý (tỉ lệ giữa cơ chất và enzyme, pH, nhiệt độ…). Trong các nguồn thu nhận chitinase thì chitinase từ vi sinh vật là nguồn quan trọng. Những nguồn sinh vật để thu nhận enzyme chitinase đáng kể là các chủng vi khuẩn thuộc các chi Enterobacter và Streptomyces, các chủng nấm sợi thuộc các chi Asperillus, Penicillium, và Trichoderma, và một số động vật nguyên sinh. Những năm gần đây cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu tập trung vào enzyme chitinase do tiềm năng ứng dụng to lớn của enzyme này trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh), sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N-acetyl glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, ứng dụng trong y học, trong việc kiểm sốt nấm kí sinh trên cây trồng…v.v… Vì những ứng dụng rộng rãi của chitinase như trên, mục đích đề tài chúng tơi nhằm nghiên cứu sinh tổng hợp chitinase nhằm thu nhận chế phẩm chitinase từ một số chủng nấm sợi và bước đầu khảo sát một số ứng dụng của enzyme này. Chúng tơi thực hiện đề tài: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của một số chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma và ứng dụng. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Mục tiêu đề tài: Lựa chọn chủng nấm sợi cĩ khả năng tổng hợp chitinase cao, thu nhận chế phẩm chitinase từ canh trường và bước đầu nghiên cứu một số ứng dụng của chitinase. Nhiệm vụ của đề tài - Khảo sát khả năng sinh tổng hợp chitinase của một vài chủng nấm sợi thuộc giống Aspergillus, Trichoderma. Chọn chủng nấm sợi để nghiên cứu tiếp. - Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm sợi đã chọn và tối ưu hĩa bằng phương pháp qui hoạch thực nghiệm. - Thu nhận chế phẩm chitinase. - Khảo sát các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase: nhiệt độ, pH, nồng độ cơ chất, thời gian thủy phân cơ chất. - Bước đầu thử nghiệm ứng dụng nấm sợi sinh enzyme chitinase hoặc chế phẩm chitinase. Thời gian và địa điểm nghiên cứu đề tài Thời gian : từ tháng 8/2009 – 7/2010 Địa điểm : Đề tài được thực hiện tại Phịng Thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HỆ ENZYME CHITINASE TỪ NẤM SỢI 1.1.1. Khái quát về enzyme 1.1.1.1. Cấu trúc [1, 23] Enzyme là một loại phân tử protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia xúc tác cho các phản ứng sinh học. Enzyme cĩ phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 dalton, được cấu tạo từ các L-acid amin liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzyme. Enzyme gồm hai nhĩm: nhĩm enzyme một cấu tử gồm những enzyme cĩ thành phần hĩa học duy nhất là protein; nhĩm enzyme hai cấu tử gồm những enzyme cĩ hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzyme cĩ vai trị xúc tác, phần thứ hai phi protein là coenzyme là những chất hữu cơ đặc hiệu cĩ vai trị thúc đẩy quá trình xúc tác. Ngồi ra cĩ một số kim loại như Zn, Cu, Mn, Fe ... đĩng vai trị liên kết enzyme và cơ chất trong quá trình xúc tác phản ứng, liên kết giữa apoenzyme và coenzyme, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử. 1.1.1.2. Cơ chế hoạt động [16, 23] Trung tâm hoạt động của enzyme (E) cĩ cấu trúc khơng gian tương ứng với cơ chất mà chúng xúc tác, phản ứng hình thành trong quá trình enzyme tiếp xúc với cơ chất như “chìa khĩa-ổ khĩa“ tạo phức hợp enzyme-cơ chất. Quá trình tác động của enzyme vào cơ chất để tạo sản phẩm trải qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Enzyme (E) tương tác với cơ chất (S) nhờ những liên kết tạo phức E-S Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzyme (E), cơ chất sẽ bị thay đổi cấu hình khơng gian và mức độ bền vững các liên kết, liên kết bị phá vỡ tạo sản phẩm. Giai đoạn 3: Enzyme tách ra, được giải phĩng nguyên vẹn. Sản phẩm (P) tạo thành. Sơ đồ cơ chế tác động enzyme: E + S  E-S  E + P 1.1.1.3. Phân loại enzyme [16, 23] Cĩ nhiều cách phân loại enzyme, ở đây chúng tơi đề cập đến cách phân loại dựa vào kiểu xúc tác của enzyme. Tại Hội nghị Sinh Hĩa học năm 1961 họp tại Moscow đã đề ra một bảng phân loại mới, trong đĩ enzyme được chia ra làm 6 lớp chính: - Oxydoreductase (lớp enzyme oxy hĩa hồn nguyên sinh học) Luận văn thạc sĩ Cao học K18 - Transferase (lớp enzyme vận chuyển) - Hydrolase (lớp enzyme thủy phân) - Liase (lớp enzyme phân giải chất khơng theo con đường thủy phân) - Ligase hay Syntetase (lớp enzyme tổng hợp chất) - Isomerase hay Mutase (lớp enzyme đồng phân hĩa) 1.1.2. Enzyme chitinase [32] 1.1.2.1. Cấu trúc Chitinase [Poly- Beta- 1- 4 – (2-acetalmido-2-deoxy) - D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhĩm enzyme thủy phân (hydrolase), là enzyme thủy phân chitin thành chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết 1,4 glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N- acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Mã số của enzyme chitinase là EC 3.2.1.14. 3 → Hydrolase 2 → Glycosylase 1 → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase cịn cĩ các tên gọi khác (tùy theo xuất xứ enzyme) là chitodextrinase, β-poly-N- acetyl glucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus) ... Căn cứ vào hệ thống phân loại enzyme, chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18 và Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20.  Họ Glycohydrolase 18 Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, được tìm thấy ở hầu hết các lồi thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là enzyme chitinase, ngồi ra cịn cĩ các enzyme khác như chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 cĩ cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn trịn, chúng hoạt động thơng qua một cơ chế kiểm sốt mà trong đĩ các đoạn β polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β anomer. [32] Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 được tổng hợp từ các giống như Aeromonas hydrophila, Bacillus circularis, Trichoderma harzianum, Aphanocladium album, Serratia marcescens… Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Hình 1.1. Cấu trúc khơng gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 [68]  Họ Glycohydrolase 19 Họ này gồm hơn 130 chi, thường thấy chủ yếu ở thực vật, ngồi ra cịn cĩ ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng cĩ cấu trúc hình cầu với một vịng xoắn và hoạt động thơng qua cơ chế nghịch chuyển. Họ Glycohydrolase 19 bao gồm những chitinase thuộc nhĩm I, II,IV. Hình 1.2. Cấu trúc khơng gian của chitinase thuộc họ Glycohydrolase 19 [68]  Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và người. Ngồi ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, người ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhĩm: Nhĩm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử cĩ đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thơng qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein cĩ vai trị quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhưng khơng cần cho hoạt động xúc tác. Nhĩm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ cĩ tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, cĩ trình tự amino acid tương tự chitinase ở nhĩm I. Chitinase nhĩm II cĩ ở thực vật, nấm, và vi khuẩn. Nhĩm III: trình tự amino acid hồn tồn khác với chitinase nhĩm I và II Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Nhĩm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu cĩ ở lá cây hai lá mầm, 41-47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tương tự như chitinase nhĩm I, phân tử cũng cĩ đoạn giàu cystein nhưng kích thước phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhĩm I. Nhĩm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, người ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) cĩ thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hĩa ở thực vật bậc cao. 1.1.2.2. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase [11] Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin 1-4-- chitobiosidase, N-acetyl- - D-glucosaminidase (exochitinase) và chitobiase. Endochitinase là enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn olygosaccharides, đã được nghiên cứu từ dịch chiết mơi trường nuơi cấy nấm Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M1 = 36kDa, pI1 = 5,3 (± 0,2) và M2 = 40kDa, pI2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 7,8). Chitin 1,4- - chitobiosidase là enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose, cụ thể enzyme này được thu từ Trichoderma harzianum (M = 36kDa, pI = 4,4 ± 0,2). N-acetyl –  - D - glucosaminidase (exochitinase) là enzyme phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các monomer N-acetyl-D-glucosamine. Chitobiase là enzyme phân cắt chitobiose thành hai đơn phân N-acetyl-D-glucosamine. Hình 1.3. Vị trí phân cắt enzyme chitinase [69] Endochitinase phân cắt ngẫu nhiên trong nội mạch của chitin và chitooligomer, sản phẩm tạo thành là một hỗn hợp các polymer cĩ trọng lượng phân tử khác nhau, nhưng chiếm đa số là các diacetylchitobiose (GlcNAc)2 do hoạt tính endochitinase khơng thể phân cắt thêm được nữa. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Hình 1.4. Cơ chế hoạt động của enzyme chitinase ở Trichoderma [11] Chitin 1,4-chitobiosidase phân cắt chitin và chitooligomer ở mức trùng hợp lớn hơn hay bằng 3 [(GlcNAc)n với n ≥ 3] từ đầu khơng khử và chỉ phĩng thích diacetylchitobiose (GlcNAc)2. β –N- acetyl hexosaminidase phân cắt các chitooligomer hay chitin một cách liên tục từ đầu khơng khử và chỉ phĩng thích các đơn phân N-acetyl glucosamine (GlcNAc). Ngồi ra, để khảo sát kiểu phân cắt, người ta sử dụng N-acetyl-chito-oligosaccharide làm cơ chất. Các oligsaccharide thường được thủy phân bên trong trên một vài vị trí xác định hoặc một cách ngẫu nhiên. Một số enyme chitinase cĩ khả năng thủy phân trisaccharid, một số khác thì khơng. Cĩ hai dạng chitinase thủy phân pentasaccharide: một phân cắt bên trong tạo disaccharid và trisaccharid; một phân cắt bên ngồi tạo các monosaccharid và tetrasaccharid. Tĩm lại chitinase thực chất là enzyme cắt ngẫu nhiên. Endochitinase, chitobiosidase và β –N- acetylhexosaminidase cĩ thể hoạt động trên cơ chất là dịch huyền phù chitin, vách tế bào nấm, chitooligomer và hoạt động kém hơn trên chitin thơ thu từ vỏ tơm. Chitin và vách tế bào nấm chứa chitin là những cơ chất thích hợp cho endochitinase hơn là chitobiosidase và -N-acetylhexosaminidase. Chitooligomer (GluNAc)3 và cao hơn nữa là sợi chitin đều là cơ chất của cả 3 loại enzyme trên nhưng -N-acetylhexosaminidase thì hoạt động chậm hơn trong việc làm giảm độ đục của huyền phù chitin. (GlcNAc)2 là cơ chất tốt nhất của -N- acetylhexosaminidase nhưng khơng là cơ chất của endochitinase hay chitobiosidase. Chính vì thế cĩ thể sử dụng để phân biệt hoạt tính giữa endochitinase, chitobiosidase và -N- acetylhexosaminidase. Sản phẩm sau cùng của sự phân cắt là N-acetyl glucosamine. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.1.2.3. Các đặc tính cơ bản của hệ enzyme chitinase [11] * Trọng lượng phân tử Enzyme chitinase tìm thấy ở thực vật bậc cao và tảo biển cĩ trọng lượng phân tử khoảng 30kDa (kilodalton). Ở các lồi thân mềm, chân đốt, động vật cĩ xương (cá, lưỡng cư, thú), một số chitinase cĩ trọng lượng phân tử khoảng 40-90 kDa hoặc cao hơn cả là khoảng 120kDa. Trọng lượng phân tử của enzyme chitinase thu nhận từ nấm và vi khuẩn cĩ khoảng biến đổi rộng, từ 30 đến 120 kDa. * Điểm đẳng điện, hằng số Michaelis Enzyme chitinase cĩ giá trị điểm đẳng điện pI thay đổi rộng, từ 3- 10 ở thực vật bậc cao và tảo; pI từ 4,7-9,3 ở cơn trùng, giáp xác, thân mềm và cá; pI từ 3,5 – 8,8 ở vi sinh vật. Hằng số Michaelis : 0,010 – 0,011 (g/100ml) * Ảnh hưởng của nhiệt độ [32, 62] Theo nhiều nghiên cứu, chitinase hoạt động ở giới hạn nhiệt độ từ 20 – 500C (Frandberg và Schnure, 1994; Huang và cộng sự, 1996; Bhushan và Hoondal, 1998; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự, 2001). Nhìn chung nhiệt độ tối ưu cho hệ enzyme chitinase ở vi sinh vật hoạt động là 400C, ngoại trừ chitinase của Aspergillus niger hoạt động trên cơ chất là glycol chitin cĩ nhiệt độ tối thích là 50OC (Jeuniaux, 1963). Tuy nhiên, tùy theo nguồn gốc thu nhận mà các enzyme chitinase cĩ thể cĩ những giá trị nhiệt độ tối thích khác nhau. Các enzyme chitinase thực vật thuộc nhĩm III và chitinase từ Bacillus licheniformis phân lập ở suối nước nĩng cho thấy khả năng chịu đựng nhiệt độ cao đến 800C. Bendt và cộng sự (2001) phát hiện hoạt tính thủy phân chitin mạnh nhất của chitinase từ Vibrio sp. Từ 30-450C và chitinase chịu nhiệt từ chủng Bacillus sp. BG-11 hoạt tính cao nhất ở 40-600C. Lorito (1998) đã khảo sát hoạt tính enzyme chitinase từ chủng Trichoderma harzianum Rifai nhận thấy enzyme này cĩ khả năng hoạt động trong khoảng nhiệt độ rộng từ 25-600C, nhiệt độ tối ưu là 400C. * Ảnh hưởng của pH [32] Giá trị pH tối thích (pHop) của hệ enzyme chitinase từ 4-9 đối với các enzyme chitinase ở thực vật bậc cao và tảo; hệ enzyme chitinase ở động vật là 4,8- 7,5 và ở vi sinh vật là 3,5- 8,0. Theo các nhà khoa học, pHop của enzyme chitinase cĩ thể cĩ sự phụ thuộc vào cơ chất được sử dụng. Đa số các enzyme chitinase đã được nghiên cứu cĩ pHop khoảng 5,0 khi cơ chất là glucol chitin nằm trong khoảng pH kiềm yếu. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Các nghiên cứu đã chứng tỏ rằng chitinase hoạt động được trong khoảng pH từ 4,0-8,5 (Morrisey và cộng sự, 1976; Wiwat và cộng sự, 1999; Bendt và cộng sự, 2001). Chitinase của nấm hoạt tính cao nhất ở pH = 5, trong khi ở vi khuẩn pH tối thích là 8,0. Theo Bhushan và Hoondal (1998), hoạt tính của chitinase từ Bacillus sp. BG-11 cao nhất ở pH = 8,5. 1.1.2.4. Các nguồn thu nhận enzyme chitinase [11, 27] Enzyme chitinase hiện diện ở hầu hết các sinh vật. Enzyme chitinase được tìm thấy trong vi khuẩn như Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhĩm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng hợp enzyme chitinase nhằm phân giải chitin trong mơi trường nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sự sinh trưởng và phát triển. Chitinase cũng được tạo ra bởi các lồi nấm sợi thuộc các chi Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia ... và cả ở các nấm lớn như Lycoperdon, Coprinus ... Enzyme chitinase được thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các nấm kí sinh gây bệnh cho cây trồng. Những thực vật bậc cao cĩ khả năng tạo chitinase như thuốc lá (Nicotiana sp.), cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) ... và đặc biệt một số lồi tảo biển cũng là nguồn cung cấp enzyme chitinase. Từ một số động vật nguyên sinh, từ các mơ và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hĩa của nhiều lồi động vật khơng xương như ruột khoang, giun trịn, thân mềm, chân đốt ... cĩ thể thu nhận được enzyme chitinase. Đối với động vật cĩ xương sống, enzyme chitinase được tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các lồi cá, lưỡng cư, bị sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những lồi chim, thú ăn sâu bọ. Ngồi ra, enzyme chitinase cịn được thu nhận từ dịch biểu bì của giun trịn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các lồi chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Enzyme chitinase giúp cơn trùng tiêu hĩa màng ngồi (cuticun) của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác. 1.1.3. Chitin (cơ chất của chitinase) 1.1.3.1. Lịch sử nghiên cứu chitin [55] Chitin được mơ tả lần đầu tiên bởi Braconnot vào năm 1811, khi nghiên cứu lồi nấm Agaricus volvaceus và một vài lồi nấm khác xử lý với dung dịch kiềm, ơng thu được sản phẩm và đặt tên là chitin (chitin cĩ nguồn gốc từ Hy Lạp là “tunnic” nghĩa là lớp vỏ bọc). Hai năm sau Odier bắt đầu chú ý đến bản chất, cấu trúc của chitin. Năm 1843, Lassaige chứng minh rằng trong chitin cĩ sự cĩ mặt của nitrogen. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.1.3.2. Chitin trong tự nhiên [30, 56, 57] Chitin là một polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, là một polyme sinh học được tổng hợp với số lượng lớn từ sinh vật. Lượng chitin được sản xuất hàng năm trên thế giới chỉ đứng sau cellulose, chúng được tạo ra trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất. Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong giới động vật, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng trong lớp vỏ của một số động vật khơng xương sống như cơn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun trịn. Trong giới thực vật, chitin cĩ ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae. Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể, đĩ là cấu trúc gồm nhiều phân tử được nối với nhau bằng các liên kết hydro tạo thành một hệ thống sợi. Trong tự nhiên, chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do mà gần như luơn luơn liên kết dưới dạng phức hợp chitin- protein. Điều này dẫn đến sự đề kháng với các hĩa chất và các enzyme thủy phân, gây nhiều khĩ khăn cho việc chiết tách, tinh chế chúng. Tùy thuộc vào các đặc tính cơ thể và sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một lồi cĩ thể thấy sự thay đổi về lượng và chất của chitin. Trong động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tơm, cua ghẹ, mai mực, hàm lượng chitin chiếm khá cao từ 14-35% so với trọng lượng khơ. Vì vậy vỏ tơm, cua ghẹ, mai mực là nguồn nguyên liệu chính để sản xuất chitin và các sản phẩm từ chúng. Chitin được tìm thấy từ nhiều nguồn khác nhau với hàm lượng khác nhau [45,51] Bọ cánh cứng 37% Nhện 38% Bị cạp 30% Sâu 20-38% Nấm 5-20% Tơm 33% Cua 70% Mực 3-20% Mặc dù chúng được phổ biến rộng rãi nhưng cho đến nay nguồn thu nhận chính của chitin là từ vỏ cua và tơm. Trong cơng nghệ chế biến, do chitin tồn tại ở dạng phức hợp với một số chất như: CaCO3, protein, lipid, các chất hữu cơ … nên việc tách chiết cịn khĩ khăn vì phải đảm bảo cả hai yếu tố cùng một lúc là vừa loại hết tạp chất đồng thời khơng làm biến đổi tính chất của chitin. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.1.3.3. Cấu trúc phân tử và tính chất của chitin  Cấu trúc phân tử [57, 58] Qua nghiên cứu về sự thủy phân chitin bằng enzyme hay HCl đậm đặc thì người ta thấy rằng chitin là một polymer được tạo thành từ các đơn vị N-acetyl-β-D-Glucosamine liên kết với nhau bởi liên kết 1-4 glucoside. Hình 1.5. Cấu trúc chitin [61] Chitin cĩ cấu trúc lạp thể gồm 3 dạng như : α, β và γ, sự khác nhau này thể hiện ở sự sắp xếp các chuỗi. Các chuỗi α–chitin xếp xuơi, ngược xen kẽ nhau, tuy nhiên, chúng cĩ một cặp xếp cùng chiều, ở chuỗi β – chitin các chuỗi sắp xếp theo một chiều nhất định, cịn ở chuỗi γ – chitin cĩ các cặp chuỗi xếp cùng chiều so le với một chuỗi ngược chiều trong cấu trúc. Hình 1.6. Cấu trúc của alpha-chitin [61]  Tính chất của chitin [27, 31] Chitin ở thể rắn, cĩ cấu trúc bền vững nhờ các liên kết hydro trong và giữa các mạch. Chitin khơng tan trong nước, trong dung dịch acid và kiềm lỗng, trong cồn và trong các dung mơi thơng thường. Nĩ chỉ tan được trong một số acid vơ cơ đặc (HCl, H2SO4, H3PO4…). Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme của nấm sợi trên mơi trường lên men bán rắn [14, 35, 36] 1.1.4.1 Thành phần mơi trường nuơi cấy nấm sợi sinh chitinase [4, 11, 29]  Nguồn dinh dưỡng cacbon Nấm sợi cĩ khả năng đồng hĩa nhiều nguồn cacbon khác nhau, trong đĩ nguồn cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đĩ glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình chuyển hĩa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff. Do chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng nên trong mơi trường nuơi cấy nấm sợi sinh chitinase, cần cĩ nguồn chitin là chất cảm ứng và là nguồn cacbon nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase. Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzyme chitinase là chitin (cĩ thể dạng huyền phù, dạng bột hay dạng thơ) và các dẫn xuất của chitin. Nghiên cứu của Jesús de la Cruz và cộng sự (1922) chỉ ra rằng Trichoderma harzianum chỉ tạo ra chitinase khi cĩ nguồn cacbon từ chitin chứ khơng từ nguồn khác như cellulose hay chitosan.  Nguồn dinh dưỡng nitơ Nguồn nitrogen cĩ ý nghĩa lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi. Theo Kapat và cộng sự (1996), khi loại ure ra khỏi mơi trường nuơi cấy sẽ làm tăng khả năng tổng hợp chitinase. Takashi và cộng sự (2002) nghiên cứu khả năng sinh chitinase từ nấm sợi Aspergillus sp. đã chỉ ra rằng hoạt tính chitinase cao khi sử dụng nguồn nitơ từ (NH4)2SO4. Theo Nampoothiri và cộng sự (2003), khi bổ sung 2,0% (w/w) cao nấm men vào mơi trường nuơi cấy bán rắn thì khả năng tạo chitinase ở Trichoderma harzianum tăng đáng kể. Tuy nhiên, theo Kovacs và cộng sự (2003), trong nuơi cấy bán rắn, nguồn nitrogen bổ sung vào mơi trường cám gạo-chitin khơng ảnh hưởng đến khả năng tạo chitinase. Suresh và Chandrasekharan (1999) cũng ghi nhận sự gia tăng sản lượng enzyme này khi mơi trường nuơi cấy Trichoderma harzianum được cung cấp muối amonium phosphat và cao nấm men. N. N. Nawani và B. P. Kapadnis trong quá trình nghiên cứu tối ưu hĩa bằng phương pháp thiết kế thí nghiệm dựa trên tốn thống kê cho thấy đối với Streptomyces sp. NK 1057 khi cung cấp nguồn nitơ từ cả hai nguồn là cao nấm men và (NH4)2SO4 thì sản lượng chitinase tăng từ 4 – 10% so với dùng riêng lẻ các nguồn này. [33]  Nguồn dinh dưỡng khống Các chất khống như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu ... cĩ vai trị quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hĩa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia thành phần cấu tạo protein, enzyme, điều hịa pH mơi trường nuơi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme nĩi chung, chitinase nĩi riêng. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.1.4.2. Yếu tố mơi trường ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme chitinase của nấm sợi - Ảnh hưởng của độ ẩm Độ ẩm cĩ ý nghĩa trong nuơi cấy bán rắn. Theo Matsumoto và cộng sự (2001), với độ ẩm 75%, chủng Verticillium lecanii ATCC 26854 sinh chitinase cĩ hoạt tính cao nhất. Đối với Trichoderma harzianum, hoạt tính chitinase cao nhất ở độ ẩm mơi trường là 65% (Nampoothiri và cộng sự, 2003). Takashi và cộng sự (2002) chỉ ra rằng nấm sợi Aspergillus sp. tổng hợp chitinase cĩ hoạt tính cao ở điều kiện độ ẩm mơi trường 57%. - Ảnh hưởng của pH Giá trị pH mơi trường ban đầu ảnh hưởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng nấm sợi. Tùy thuộc vào từng lồi, từng chủng mà pH mơi trường ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase cĩ hoạt tính cao nhất ở điều kiện pH = 5-6 (Takashi và cộng sự, 2002). Nhiều nghiên cứu trên Trichoderma harzianum chỉ ra rằng pH thích hợp cho nấm này sinh trưởng tạo chitinase cĩ hoạt tính cao khoảng pH = 4-6 (Nguyễn Thị Hồng Thương và các đồng tác giả, 2003). - Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzyme của nấm sợi. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 28-320C, tối đa dưới 500C. Nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp cĩ thể kìm hãm sự sinh trưởng, thậm chí cĩ thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzyme sẽ bị ức chế. Aspergillus sp. tổng hợp chitinase cĩ hoạt tính cao nhất ở điều kiện nhiệt độ 370C (Takashi và cộng sự, 2002) - Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng Chitinase cĩ thể là enzyme cảm ứng hoặc enzyme cấu trúc. Tuy nhiên trong các mơi trường nuơi cấy vi sinh vật người ta đều bổ sung thêm cơ chất chitin nhằm tăng khả năng tạo chitinase. Nhìn chung sự hiện diện của chitin trong mơi trường nuơi cấy hữu ích cho việc tạo chitinase (Monreal và Reese, 1969; Ulhoa và Peberdy, 1993). Trong số các cơ chất, chitin huyền phù cĩ khả năng kích thích tạo chitinase cao nhất (Bhushan, 2000; Nampoothiri và cộng sự, 2003). Trong hầu hết các trường hợp, khi nồng độ chitin khoảng 1-1,5% là vi sinh vật cĩ khả năng tạo chitinase (Felse và Panda, 2000). Năm 2003, Binod và cộng sự đã sử dụng nhiều cơ chất khác nhau (như vách tế bào nấm, vỏ tơm, cua ...) để tạo chitinase từ nấm sợi nuơi cấy trên mơi trường bán rắn. Việc tận dụng phế liệu này vừa đem lại hiệu quả kinh tế, vừa gĩp phần giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường. Nghiên cứu của Đinh Minh Hiệp và các đồng tác giả (2003) chỉ ra rằng hệ enzym chitinase của Trichoderma sp. cĩ thể được cảm ứng bởi vách tế bào vi nấm (Curvularia oryzae, Phytophthora Luận văn thạc sĩ Cao học K18 primulae), vách tế bào nấm lớn (Schizophyllum commune, Trametes versicolor) hoặc chitin vỏ tơm, trong đĩ vách tế bào nấm cảm ứng quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của Trichoderma tốt hơn chitin vỏ tơm. 1.1.5. Những ứng dụng của enzyme chitinase [30, 33] 1.1.5.1. Ứng dụng trong việc thu nhận tế bào trần (thể nguyên sinh) Thể nguyên sinh của tế bào nấm đã được sử dụng như một cơng cụ thí nghiệm cĩ hiệu quả trong việc nghiên cứu quá trình hình thành thành tế bào, quá trình tổng hợp enzyme, quá trình bài tiết chất cũng như việc cải tiến các chủng nấm ứng dụng trong cơng nghệ sinh học. Do trong thành tế bào nấm cĩ chứa chitin, hệ enzyme thủy phân chitin là một trong những nhân tố cĩ thể sử dụng để phá vỡ thành tế bào, tạo tế bào trần từ tế bào nấm. Dahiya và cộng sự (2005) đã mơ tả hiệu quả của enzyme chitinase thu nhận từ chủng Enterobacter sp. NRG 4 trong việc tạo tế bào trần từ nấm Trichoderma reesei, Aspergilllus niger, Pleutotus florida ... Mizuno và cộng sự (1997) tách tế bào trần từ Schizophyllum commune bằng cách sử dụng dịch lọc mơi trường nuơi Bacillus circulans KH – 304. Phức hợp enzyme từ Bacillus circulans WL – 12 với hoạt tính chitinase cao đã rất hiệu quả trong việc thu nhận tế bào trần từ Phaffia rhozyme (Johnson và cộng sự, 1979). 1.1.5.2. Ứng dụng trong việc sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetyl glucosamine Chitooligosaccharides, glucosamine và N- acetyl glucosamine là chất cĩ tiềm năng rộng lớn trong y dược. Chitooligosaccharides cĩ lợi ích tiềm năng đối với sản xuất thuốc cho người. Ví dụ, chitohexaose và chitoheptaose được phát hiện cĩ tính kháng các khối u. Chitinase thu nhận từ Vibrio alginolyticus đã được sử dụng để sản xuất chitopentaose và chitotriose từ cơ chất chitin huyền phù (Murao và cộng sự, 1992). Sự kết hợp giữa các enzyme thủy phân chitin cần thiết để thu nhận những oligomer cĩ chiều dài chuỗi mong muốn. Ví dụ, để tạo chitooligosaccharides cần tỉ lệ endochitinase, tỉ lệ thấp N-acetyl glucosamindase và exochitinase; trong khi để tạo N- acetyl glucosamine thì cần tỉ lệ cao exochitinase và N-acetyl glucosamindase. (Aloise và cộng sự, 1996) nhận thấy khi ủ enzyme chitinase với tetramer hoặc pentamer thu nhận từ Nocardia oritentalis thì thấy cĩ sự hình thành các hexamer. Sashiwa và cộng sự (2002) đã sản xuất N- acetyl glucosamine từ α-chitin bằng cách sử dụng dịch enzym thơ từ Aeromonas hydrophila H-2330. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.1.5.3. Ứng dụng trong việc nghiên cứu thuốc trừ sâu sinh học Chitin cĩ mặt trong lớp vỏ ngồi và ống tiêu hĩa của cơn trùng. Villagomez-Castro và Lopez-Romero (1996) đã chỉ ra rằng các sự sự kiện thuộc về hình thái học ở nấm luơn cĩ sự tham gia của enzyme chitinase. Allosamidin, một chất ức chế mạnh của enzyme chitinase, được nhận thấy cĩ khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của các lồi như ve bét, ấu trùng nhặng sau khi chúng ăn vào (Sakuda và cộng sự, 1987). 1.1.5.4. Ứng dụng trong việc ước tính sinh khối nấm Các nhà nghiên cứu đã mơ tả một loại phương pháp khác để ước tính lượng nấm cĩ trong đất. Kỹ thuật bao gồm việc quan sát dưới kính hiển vi và ly trích những chất chỉ thị đặc trưng cho nấm như glucosamine ergosterol. Cĩ sự liên quan chặt chẽ giữa hoạt tính của chitinase và lượng nấm cĩ trong đất. Sự liên quan như thế khơng thấy xuất hiện với vi khuẩn và xạ khuẩn. Chính vì thế, chitinase trở thành yếu tố chỉ thị thích hợp cho mức sinh trưởng của nấm trong đất (Miller và cộng sự,1998). Tương tự, chitinase và protein gắn kết với chitin cĩ thể được sử dụng để dự báo sự lây nhiễm nấm trên con người (Laine và Lo, 1996). 1.1.5.5. Ứng dụng trong việc kiểm sốt muỗi Chitinase đĩng vai trị quan trọng đối với hình thái nấm men, cơn trùng. Kuranda và Robbins (1991) chỉ ra vai trị của chitinase trong sự phân chia tế bào trong suất quá trình sinh trưởng của nấm men Sacharomyces cerevisiae. Người ta chỉ ra rằng ấu trùng muỗi Aedes aegypti cĩ thể bị giết trong vịng 48 giờ với sự tác động của chế phẩm thơ từ nấm Myrothecium verrucaria. Nấm gây bệnh cơn trùng như Beauveria bassiana cĩ thể gây nhiễm trứng của muỗi Aedes aegypti. Điều này mở ra tiềm năng trong việc sản xuất chất kiểm sốt cơn trùng truyền bệnh như muỗi. 1.1.5.6. Ứng dụng trong y học Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên cứu sử dụng enzyme chitinase trong việc chẩn đốn các bệnh truyền nhiễm do nấm gây ra. Chitin hiện diện trong vách hầu hết các nấm gây bệnh, ít nhất là một giai đoạn trong chu trình sống của nấm. Hay ở nấm men thì chitin hiện diện trong những vết chồi. Do đĩ cĩ thể dùng phương pháp nhuộm chitin đặc hiệu cho nấm, tạo cơ sở xây dựng một phương pháp chẩn đốn nhanh các lồi nấm gây bệnh. Các nhà khao học đã đề xuất một phương pháp chẩn đốn bệnh truyền nhiễm do nấm bằng cách sử dụng chitinase đã được phân lập tạo dịng từ Vibrio parahemolyticus (đặt tên chitinase VP1), enzyme này kết hợp chặt chẽ với chitin và cĩ thể Luận văn thạc sĩ Cao học K18 sử dụng như một mẫu dị trong việc chẩn đốn với độ nhạy cao để nhận diện một cách đặc hiệu các vách tế bào nấm hay những vết chồi nấm men trong những lát cắt mẫu mơ bệnh. [32] Ngồi ra, chitinase cĩ tiềm năng trong việc sản xuất các loại kem hay thuốc bơi ngồi da chứa chất chống nấm bệnh thường xảy ra các nước vùng nhiệt đới bởi khả năng phân hủy vách tế bào vi nấm của chúng. 1.1.5.7. Ứng dụng trong việc kiểm sốt nấm gây bệnh trên cây trồng Nhiều lồi cơn trùng và nấm mốc cĩ hại cho cây trồng và vật nuơi do gây ra nhiều loại dịch bệnh, ảnh hưởng trực tiếp đến sản xuất nơng nghiệp. Vì chitin khơng phải là thành phần phổ biến ở thực vật và động vật cĩ xương nên người ta sử dụng các tác nhân kìm hãm sự sinh tổng hợp chitin trong các nấm và cơn trùng như 1-(2,6-dichlorobenzoyl)-3-(3,4-dichlorophenol), nikkomycin, polyoxin D ...Khi áp dụng trên cây cảnh, cây lương thực và trên động vật, những tác nhân trên chứng tỏ cĩ nhiều ưu thế trong việc tiêu diệt nấm mốc, cơn trùng cĩ hại mà khơng gây hại đáng kể cho thực vật hoặc động vật cĩ xương sống. Theo Hirohi Ihui, enzyme chitinase luơn cĩ mặt trong cơ thể thực vật mặc dù trong cây khơng chứa chitin. Chitinase và β-1,3-glucanase được tạo ra trong mơ thực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của bệnh. Chitinase sản xuất bởi Enterobacter sp. NRG4 cĩ hoạt tính cao đối với Fusarium moniliforme, Aspergillus niger, Mucor rouxii và Rhizopus nigricans (Dahiya và cộng sự, 2005). Bhushan và Hoodal (1998) nghiên cứu về tính tương thích của những chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp. BG-11 với thuốc diệt cơn trùng và thuốc diệt nấm thường được sử dụng. Chitinase từ Bacillus cereus YQ308 ức chế sự phát triển của nấm bệnh thực vật như Fusarium oxyporum, F. Solani, Penicillium ultimum (Change và cộng sự, 2003). CHIT42, CHIT40 và CHIT72 từ Trichoderma harzianum P1 và Trichoderma virens 41 cĩ thể tác động trên sự nảy mầm và sự kéo dài của sợi nấm của nhiều nấm gây bệnh thực vật như Fusarium spp., Alternaria spp., Ustilago avenae, ... khi chúng được ủ với dịch enzyme. 1.1.5.8. Ứng dụng trong sản xuất protein đơn bào Chất thải rắn từ quá trình chế biến tơm chứa chủ yếu là chitin, CaCO3 và protein. Revah- Moiseev và Carrod (1981) đã đề nghị sử dụng loại chất thải này để chuyển đổi bằng phương pháp sinh học chitin thành protein đơn bào nhờ sử dụng enzyme thủy phân chitin. Họ sử dụng enzyme chitinase thu nhận từ Saccharomyces marcescens để thủy phân chitin và Pichia Kudriavazevii để sản xuất protein đơn bào (với 45% protein và 8-11% acid nucleic). Những nấm thường được dùng Luận văn thạc sĩ Cao học K18 để sản xuất protein đơn bào là Hansenula polymorpha, Candida tropicalis, Sacharomyces cerevisiae và Myrothecium verrucaria. Vyas và Deshpande (1991) đã dùng enzyme thủy phân chitin thu nhận từ Myrothecium verrucaria và dùng Sacharomyces cerevisiae để sản xuất protein đơn bào từ chất thải chứa chitin. Tổng hàm lượng protein thu được là 61%, với tỉ lệ rất thấp acid nucleic (3,1%). Các nghiên cứu chỉ ra rằng Sacharomyces cerevisiae là chủng tốt nhất để sản xuất protein đơn bào (60% protein và chỉ 1-3% acid nucleic). 1.2. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NGHIÊN CỨU 1.2.1. Các chủng thuộc chi nấm Aspergillus [7,8, 60] 1.2.1.1. Vị trí phân loại Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Eurotiomycetes Bộ: Eurotiales Họ: Trichocomaceae Giống: Aspergillus 1.2.1.2. Đặc điểm hình thái Sợi nấm cĩ vách ngăn, phân nhánh, khơng màu, màu nhạt, một số trường hợp trở nên nâu hay màu sẫm khác ở một vùng nhất định của khuẩn lạc. Aspergillus niger khi nuơi cấy trên mơi trường thạch-khoai tây-dextrose ở 250C cho khuẩn lạc ban đầu màu trắng, sau nhanh chĩng chuyển sang màu đen với việc tạo vơ số bào tử đính, mặt trái khuẩn lạc màu hơi vàng nhạt và khi trưởng thành cĩ thể tạo đường rãnh phĩng xạ trên bề mặt thạch. Aspergillus awamori khi nuơi cấy trên mơi trường Czapek cho khuẩn lạc đạt kích thước 4,5- 5,0cm sau 7 ngày ở nhiệt độ 250C, cịn trên mơi trường MEA (cao malt) cho kích thước khuẩn lạc lớn hơn. Khuẩn lạc cĩ màu nâu nhạt, dần chuyển sang đậm. Hệ sợi trắng dần ngả vàng sậm. Cuống mang bào tử bụi phồng lên ở ngọn, các chuổi bào tử bụi từ đầu phồng mọc tỏa khắp mọi hướng. Bào tử trần khơng cĩ vách ngăn, khác nhau về hình dạng, kích thước, màu sắc ... ở các lồi khác nhau. Theo Bùi Xuân Đồng, Aspergillus niger cĩ bào tử đính trưởng thành hình cầu, phần lớn 4,0- 5,0µm, xù xì khơng đều với những gờ rõ và gai khơng sắp xếp thành vạch kẻ dọc theo chiều dài. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Aspergillus awamori cĩ bơng mau chĩng chuyển màu nâu hơi đỏ, mặt trái khuẩn lạc màu tương tự, cuống bào tử đính phần lớn phát triển dài 1,0-1,5mm, bào tử đính phần lớn đường kính 4,0 đến 4,5 µm. A B Hình 1.7. Hình thái nấm Aspergillus niger [62, 63] (A): bào tử, (B): Khuẩn lạc trên mơi trường PGA Hình 1.8. Hình thái nấm Aspergillus awamori [63] (A): Khuẩn lạc trên MT Czapek; (B): Khuẩn lạc trên MT MEA (C), (D), (E): hình thái bào tử 1.2.1.3. Đặc điểm sinh lý, hĩa sinh Nấm Aspergillus cĩ mặt khắp nơi trong tự nhiên, chúng phân bố rộng và dễ thích nghi vì chúng cĩ thể hình thành khuẩn lạc trên nhiều nguồn cơ chất khác nhau. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Nghiên cứu của Andrea Astoreca và cộng sự cho thấy nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của Aspergillus niger, Aspergillus awamori khoảng 25 - 300C. Theo Takashi và cộng sự (2002), nhiệt độ thích hợp để Aspergillus sp. tổng hợp chitinase cĩ hoạt tính cao nhất là 370C. Wainwright và cộng sự đã chỉ ra rằng, pH thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm Aspergillus awamori là khoảng 5.0-7.0. Độ pH quá acid (khoảng 2-3) sẽ ngăn cản sự tạo thành bào tử, dẫn đến hệ sợi bị phân tán khi nuơi cấy chìm. Đã cĩ nhiều nghiên cứu tìm hiểu về enzyme của nấm Aspergillus niger, gồm amylase, amyloglucosidase, cellulase, lactase, invertase, pectinase ... Ngồi ra chitinase của nấm này cũng được đề cập đến trong Hội nghị Quốc tế về Aspergillus tại Nertheland vào tháng 3 năm 2010 [60]. Vấn đề độc tố của Aspergillus niger cũng được đề cập đến, phần lớn chúng khơng cĩ hại, nhưng một số cĩ thể tạo độc tố gây hại đến động vật và con người. Sự an tồn của Aspergillus niger được đề cập đến trong nhiều bài báo của các tác giả Schuster và cộng sự (2002), Van Dijck và cộng sự (2003), Blumenthal (2004), Olemspka-Beer và cộng sự (2006) [41]. Theo thơng tin tĩm tắt từ những bài báo của các tác giả này, khoảng 3-10% các chủng Aspergillus niger cĩ khả năng sinh ra độc tố trong những điều kiện nuơi cấy xác định như ochratoxin A. 1.2.2. Trichoderma harzianum [5, 12, 54] 1.2.2.1. Vị trí phân loại Trichoderma là một trong những nhĩm vi nấm gây nhiều khĩ khăn trong phân loại do các đặc điểm cần thiết cho việc phân loại vẫn cịn chưa được biết đầy đủ. Theo Rifai (1969), Barnett và Hunter (1972), Trichoderma thuộc lớp nấm, nấm bất tồn Deuteromycetes (Fungi imperfect), chúng được phân loại như sau: Giới: Nấm Nghành: Ascomycota Lớp: Deuteromycetes Bộ: Moniliales Họ: Moniliceae Giống: Trichoderma Một số tài liệu phân loại giống Trichoderma thuộc họ Moniliacae, bộ Moniliales, lớp nấm, nấm bất tồn (Fungi imperfecti). Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.2.2.2. Đặc điểm hình thái [62, 63] Khuẩn lạc Trichoderma harzianum ban đầu cĩ màu lục trắng, sau dần dần chuyển sang màu lục sẫm, mặt dưới khuẩn lạc khơng màu. Bào tử áo hình cầu, nhẵn, khơng màu, đường kính 6-12 m, ở giữa sợi nấm hoặc đính ở các nhánh. Giá bào tử trần ngăn vách, phân nhánh 2-3 lần, đường kính 4 - 5 m, dài tới 250 m. Thể bình cĩ kích thước 3-4 x 5-7m, thường thành 2-5 cái ở đỉnh nhánh tận cùng, ở dọc các nhánh thường đơn độc. Thể bình ở giữa thường dài tới 17 m và cĩ đường kính nhỏ hơn, phần rộng nhất khoảng 2-3 m. Bào tử trần hình gần cầu, hình trứng, phần gốc hơi bẹt, nhẵn, màu lục nhạt, khơng vách ngăn, kích thước 2-3 x 3-3,5 m, nhày ở thể bình. Hình 1.9. Hình thái bào tử và khuẩn lạc của Trichoderma harzianum [64] 1.2.2.3. Đặc điểm sinh lý, hĩa sinh Trichoderma harzianum được tìm thấy ở những vùng ấm áp. Theo nghiên cứu của Domsch và cộng sự (1980), nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng, phát triển của Trichoderma harzianum vào khoảng 30C, tối đa khoảng 36C. Trichoderma harzianum cũng cĩ thể phát triển ở nhiệt độ khoảng 5C, nhưng sinh trưởng rất chậm và yếu . Trichoderma harzianum tổng hợp enzyme chitinase và các chất kháng sinh (Trichodermin, glyotosin…).Vấn đề độc tố của Trichoderma harzianum chưa được biết đến. 1.3. SƠ LƯỢC CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 1.3.1. Trên thế giới So với các enzyme khác như protease, amylase, pectinase ... thì hệ enzyme chitinase được nghiên cứu chậm hơn và các cơng trình nghiên cứu về chúng cịn hạn chế. Đối tượng được nghiên cứu sớm nhất và khá nhiều là xạ khuẩn Streptomyces (L.R. Berger và D.M. Renolds, 1958; R. Grupta, R. K. Saxena, P. Chatuvedi và J. S. Windi, 1995). Những nghiên cứu trên đối tượng này nhằm thu nhận chitinase ứng dụng chủ yếu vào việc phá vỡ vách tế bào nấm. Năm 1978, P.A. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Carroad và R. A. Tom cĩ cơng trình nghiên cứu việc sử dụng phương pháp sinh học trong xử lý chất thải chứa chitin, và tiếp đĩ là nghiên cứu của I. G. Cosio, R. A. Fisher, P. A (1982) đề cập đến quá trình sản xuất enzyme nhằm xử lý chất thải chứa chitin. Về sau, trong những năm 1989, việc thu nhận chitinase được tiếp tục nghiên cứu trên các đối tượng khác như Serratia liquefaciens (S. Joshi, Kozlowski), Myrothecium verrucaria (P. Vyas và M. V. Deshpand) và vẫn chủ yếu tìm hiểu ứng dụng của chitinase trong việc phá vỡ vách tế bào nấm. Những năm gần đây, chitinase được nghiên cứu nhiều trên đối tượng nấm sợi Trichoderma. Năm 1991, C. J. Ulhoa, J. F. Peberdy nghiên cứu sự điều hịa quá trình sinh tổng hợp chitinase của Trichoderma harzianum. Năm 1999, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu tối ưu hĩa quá trình sinh tổng hợp chitinase từ Trichoderma hazianum. Năm 2000, P. A. Felse và T. Panda nghiên cứu quá trình nuơi cấy chìm thu nhận chitinase từ Trichoderma harzianum trong bể lắc. Năm 2003, Ashok Pandey và cộng sự nghiên cứu tối ưu hĩa quá trình tổng hợp chitinase cĩ tính kháng nấm từ Trichoderma harzianum nuơi cấy trên mơi trường bán rắn. Dường như Trichoderma là chi nấm đến nay được phát hiện cĩ hoạt tính chitinase khá cao, ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực, đặc biệt trong bảo vệ thực vật. Đối với chi nấm Aspergillus cũng đã cĩ một số cơng trình nghiên cứu về khả năng sinh chitinase của chúng trên mơi trường bán rắn (Nopakarn Rattanakit và cộng sự, 2002). Những chủng thuộc chi nấm này được nghiên cứu thu nhận chitinase là Aspergillus carneus (A. A. Sherief, 1990); A. Fumigatus (Jin-Ian Xia và Jing Xiong, 2009). A. A. Shubakow và P. S. Kucheryavykh (2003) đã nghiên cứu nuơi cấy nhiều chủng nấm khác nhau trong đĩ cĩ các chủng thuộc các chi nấm Aspergillus và Trichoderma... Tuy nhiên những nghiên cứu về chitinase từ nấm sợi phần lớn thực hiện trên mơi trường nuơi cấy lỏng. Vi khuẩn cũng là một đối tượng được nghiên cứu về việc sinh tổng hợp chitinase. Năm 1998, B. Bhushan, G. S. Hoondal nghiên cứu enzyme chitinase chịu nhiệt từ Bacillus sp G-1. Và gần đây nhất, năm 2009, S. M. Akhir và cộng sự nghiên cứu tối ưu hĩa mơi trường nuơi cấy thu nhận enzyme chitinase từ Bacillus licheniformis bằng phương pháp nghiên cứu bề mặt đáp ứng (RSM). Ưu điểm của chitinase thu nhận từ vi khuẩn này là tính bền nhiệt của chúng. Trên đối tượng thực vật, cũng cĩ một vài nghiên cứu thu nhận chitinase. Năm 2004, Isabela S. Santos và cộng sự cĩ cơng trình nghiên cứu về chitinase thu nhận trên đối tượng thực vật (hạt cây Adenanthera pavonina L.), cây họ đậu Phaseolumungo. Kết quả cho thấy chitinase từ hạt cây Adenanthera pavonina L. là loại enzyme bền nhiệt. Tác giả Wen-Chi Hou, Yaw-Huei Lin, Ying- Chou Chen (1998) nghiên cứu thu nhận chitinase chiết rút từ lá khoai lang. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.3.2. Trong nước Nhìn chung những nghiên cứu về enzyme chitinase trong nước cịn rất hạn chế cho dù tiềm năng ứng dụng rộng rãi của enzyme này là khơng thể phủ nhận. Năm 2001, tác giả Đinh Minh Hiệp cĩ cơng trình nghiên cứu đặc tính của enzyme chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius và một số ứng dụng trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và y dược. Năm 2003, các tác giả Nguyễn Thị Hồng Thương, Đinh Minh Hiệp, Đồng Thị Thanh Thu cĩ cơng trình nghiên cứu khảo sát một số yếu tố tác động lên quá trình sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của các chủng nấm mốc Trichodrema sp. Năm 2004, tác giả Tơ Duy Khương thực hiện đề tài khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp. và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh. Năm 2008, tác giả Nguyễn Đình Nga và cộng sự khảo sát khả năng tác động lên nấm Candida albicans của enzyme chitinase thu nhận từ thực vật và từ nấm Trichoderma. Trên đối tượng thực vật, năm 2008, tác giả Đặng Trung Thành đã nghiên cứu quá trình thu nhận enzyme chitinase từ cây khoai lang Ipomoea batatas, thu enzyme chitinase cĩ hoạt tính khá cao (hoạt độ đạt 192 UI/ml) Nhìn chung, những nghiên cứu về chitinase trong nước chưa nhiều, chủ yếu vẫn trên nấm Trichoderma, ứng dụng chủ yếu mới đề cập đến trong lĩnh vực bảo vệ thực vật và khởi đầu trong lĩnh vực y dược. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 2.1.1 Giống vi sinh vật Các chủng nấm sợi Aspergillus niger và Aspergillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma harzianum do phịng thí nghiệm, bộ mơn Sinh hĩa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh và bộ mơn Vi sinh, trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp. 2.1.2 Các mơi trường sử dụng trong thí nghiệm 2.1.2.1. Mơi trường nuơi cấy và giữ giống nấm sợi MT 1: Cao nấm men agar – Yeast Extract Agar (YEA) [1, 12] Cao nấm men 4g Agar 20g Glucose 20g Nước 1000ml pH = 5,5 – 6,0 Khử trùng 1atm/30 phút MT 2: Thạch khoai tây Dextrose (PDA) [6, 10, 26] Nước chiết khoai tây 200ml Agar 20g Glucose 20g Nước 1000ml pH = 5,5 – 6,0 Khử trùng 1atm/30 phút MT 3: Malt Extract Agar (YEA) [11,26] Cao Malt 20g Pepton 1g Agar 20g Glucose 20g Nước 1000ml pH = 5,5 – 6,0 Khử trùng 1atm/30 phút 2.1.2.2. Mơi trường cảm ứng tổng hợp enzym chitinase [12, 13, 29] Luận văn thạc sĩ Cao học K18 MT 4: NaNO3 3,5g K2HPO4 1,5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4.7H2O 0,01g Bột chitin 10g Agar 20g Nước 1000ml pH = 6,5 Khử trùng 1atm/30phút 2.1.2.3. Mơi trường bán rắn khảo sát khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme thủy phân chitinase từ các chủng nấm sợi [12,15, 34, 36] MT 5: Trấu 50g Cám 40g Đường vàng 4g (NH4)2HPO4 0,1g Urê 2,2g CaCl2 0,1g KCl 0,05g MgSO4.7H20 0,05g HCl 0,05g Bột chitin 10g Nước 60% MT 6: Trấu 50g Cám 40g Cao nấm men 1g (NH4)2SO4 0,1g CaCl2 0,1g KCl 0,05g MgSO4.H20 0,05g Bột chitin 10g Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Nước 60% * Thay thế bột chitin bằng nguyên liệu giàu chitin khác (bột vỏ tơm, bột vỏ cua) để nghiên cứu ảnh hưởng cơ chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của chủng nấm sợi chọn nghiên cứu. 2.2 DỤNG CỤ THIẾT BỊ HĨA CHẤT 2.2.1 Dụng cụ - Thước đo khuẩn lạc. - Bình tam giác các kích cỡ khác nhau (250ml, 500ml, 1000ml). - Ống nghiệm 5ml, 10ml. - Đĩa petri. - Pipetman các loại. - Buồng đếm hồng cầu. - Đèn cồn, diêm quẹt, que cấy, giấy lọc, giấy báo cũ, bơng khơng thấm nước, bơng thấm nước, đũa khuấy, phễu, ống đong, vải lọc … - Nồi nấu mơi trường, lị điện. 2.2.2 Thiết bị - Nồi hấp vơ trùng. - Tủ cấy vơ trùng. - Tủ sấy 300C – 1800C. - Tủ ấm. - Máy đo pH. - Máy li tâm. - Cân phân tích điện tử. - Máy chụp ảnh kỹ thuật số. - Máy nghiền mẫu. - Máy đo độ ẩm. - Máy đo quang phổ UV / Visible Spectrophometre ... - Tủ lạnh. 2.2.3 Hĩa chất và vật liệu Glucose, cao nấm men, chitin, agar, cồn, nước cất, khoai tây, trấu, cám; NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4, Urê, CaCl2, HCl, NaH2PO4, Na2HPO4, Luận văn thạc sĩ Cao học K18 N-acetyl-β-D-Glucosamine, Lugol, thuốc thử DNS, và các hĩa chất khác sử dụng trong từng phương pháp sẽ nêu cụ thể. 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống nấm sợi [1, 6, 12] Thực hiện: Chuẩn bị mơi trường PGA, cho vào các ống nghiệm, đem hấp khử trùng, lấy ra để nguội tạo mơi trường thạch nghiêng. Thực hiện trong buồng cấy: cấy bào tử chủng nấm nghiên cứu lên bề mặt thạch trong ống nghiệm. Để ống vừa cấy chuyền ở nhiệt độ phịng (28 – 300C) trong thời gian 7 ngày, sau đĩ đem vào tủ giữ giống 40C. Sau 2 tháng cấy chuyền một lần. 2.3.2 Phương pháp xác định sơ bộ khả năng tổng hợp enzyme chitinase bằng cách đo đường kính vịng phân giải [1, 12, 22] Nguyên tắc: khi nuơi cấy trong mơi trường thạch cĩ bổ sung chitin, nấm sợi sinh enzyme chitinase phân giải chitin thành các dạng cĩ cấu trúc mạch ngắn hơn và N-acetyl- D- glucosamine. Các dạng này khơng cho phản ứng màu với thuốc thử Lugol, do đĩ sau khi nhỏ thuốc thử Lugol, độ lớn của phần mơi trường trong suốt phản ánh khả năng sinh tổng hợp chitinase của nấm sợi. Phương pháp này chỉ định tính enzyme, chỉ đánh giá sơ bộ khả năng tổng hợp chitinase chứ chưa xác định chính xác hoạt độ chitinase. Thực hiện: Chuẩn bị mơi trường cảm ứng tổng hợp enzyme chitinase (MT 4), hấp khử trùng ở 121OC trong 30 phút. Dùng các đĩa petri vơ trùng (sấy ở 1600C trong 120 phút) cĩ kích thước bằng nhau, cho 20ml mơi trường từ ống nghiệm vào đĩa, để nguội, sau 1-2 ngày kiểm tra sự tạp nhiễm. Cấy chấm điểm chủng nấm sợi nghiên cứu vào đĩa, cĩ thể chấm một điểm giữa hoặc 3 điểm trên đĩa petri. Ủ ở nhiệt độ phịng (28-300C) trong 2-3 ngày. Cho thuốc thử Lugol vào, để 5 phút rồi đo đường kính vịng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc. Nếu D – d ≥ 25mm : hoạt tính enzyme mạnh D – d ≥ 20mm : hoạt tính enzyme khá mạnh D – d ≥ 15mm : hoạt tính enzyme trung bình D – d ≤ 10mm : hoạt tính enzyme yếu Từ đĩ chọn chủng cĩ tạo hệ enzyme thủy phân chitinase từ khá trở lên tiếp tục nghiên cứu tối ưu hĩa. Cách pha dung dịch Lugol Iod 2,5g KI 5g Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Nước 1000ml 2.3.3 Phương pháp nuơi cấy nấm sợi trên mơi trường bán rắn thu enzyme chitinase [12, 34] Nguyên tắc: Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng cĩ sẵn trong mơi trường để sinh trưởng, tổng hợp một lượng lớn enzyme ngoại bào lẫn trong mơi trường, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzyme thơ từ canh trường. Thực hiện: Cân 10 gam mơi trường bán rắn nuơi cấy nấm sợi thu enzyme chitinase (MT 5) vào các bình tam giác 250 ml, hấp khử trùng ở 1210C trong 30 phút, sau đĩ để nguội. Dùng giống trong ống thạch nghiêng, cho 10ml nước cất vơ trùng vào mỗi ống, dùng que cấy cà đều bề mặt lấy hết bào tử tạo dạng huyền phù.Tiến hành đếm bào tử bằng buồng đếm hống cầu. Cho 2ml huyền phù bào tử vào mỗi bình tam giác chứa mơi trường đã chuẩn bị (mật độ bào tử là 105 đến 106 bào tử/1 gam mơi trường). Nuơi ở nhiệt độ phịng. Canh trường nuơi cấy được thu nhận sau từng khoảng thời gian, điều kiện nhiệt độ, pH nhất định theo mục đích nghiên cứu cụ thể. 2.3.4 Phương pháp tách chiết dịch enzyme thơ và thu nhận chế phẩm enzyme từ canh trường nuơi cấy [1, 12, 15] Nguyên tắc: Dựa trên khả năng hịa tan trong nước của các enzyme, dùng nước cất hịa tan tạo dịch enzyme, sau đĩ dùng các tác nhân kết tủa khác nhau để kết tủa enzyme. Kết tủa enzyme được sấy ở nhiệt độ dưới 400C, tạo sản phẩm enzyme dạng bột khơ. Thực hiện: Sau khi nuơi cấy trong các điều kiện mơi trường cụ thể, cho vào mỗi bình tam giác (chứa 10 gam mơi trường) 80ml nước cất. Lắc trong 1 giờ, tốc độ 200 vịng/ phút, lọc qua vải, thu dịch lọc. Đem dịch lọc li tâm 5000 vịng/phút trong 10 phút, thu dịch nổi, ta được dịch enzym thơ. Để thu được chế phẩm enzyme (CPE) dạng bột khơ, sử dụng tác nhân tủa là Etanol 960 với tỉ lệ 1/3 – 1/4 (dung dịch Enzyme/Etanol) để kết tủa enzyme, ly tâm thu tủa enzyme, sấy nhiệt độ dưới 400C được sản phẩm (CPE). 2.3.5 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương pháp so màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) [11,12]  Định nghĩa Phương pháp so màu là phương pháp phân tích dựa trên việc so sánh cường độ màu của dung dịch nghiên cứu với cường độ màu của dung dịch tiêu chuẩn cĩ nồng độ xác định. Dùng phương pháp so màu chủ yếu để xác định lượng nhỏ các chất, phương pháp này cho phép tiết kiệm thời gian cùng kết quả chính xác cao so với các phương pháp khác. Luận văn thạc sĩ Cao học K18  Nguyên tắc + đường khử → + đường oxi hĩa 3,5-dinitrosalicylic acid 3-amino-5-nitrosalicylate Khi enzyme phân hủy chitin tác dụng với cơ chất là chitin huyền phù, sản phẩm tạo thành là N-acetyl-β-D-Glucosamine được hiện màu với thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalisylic acid) và đem đo mật độ quang ở bước sĩng 535nm.  Hĩa chất * Dung dịch đệm phosphat 0,2M, pH 6,5 - Dung dịch NaH2PO4 0,2M: cân 31,2g NaH2PO4.2H2O hịa tan và thêm nước cất đến 1000ml. - Dung dịch Na2HPO4 0,2M: cân 71,6g Na2HPO4.12H2O hịa tan và thêm nước cất đến 1000ml. * Thuốc thử DNS - Dung dịch A: hịa tan 300g muối Na-K tartrat kép vào trong 500ml nước cất. - Dung dịch B: hịa tan 10g 3,5-dinitrosalicylic acid vào 200ml dung dịch NaOH 2N. - Thuốc thử DNS dùng trong phản ứng: trộn dung dịch A với dung dịch B, thêm nước cất cho đủ 1 lít. Chỉ pha dung dịch DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, bảo quản trong chai nâu và tránh khơng khí.  Chuẩn bị dịch huyền phù chitin 1% Do chitin khơng hịa tan trong nước nên để tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitinase cần huyền phù hĩa chitin: Lấy 5 gam chitin hịa tan trong 50ml HCl đậm đặc. Khuấy đều trong vịng 3 phút ở 40C. Sau đĩ cho nước cất lạnh 5C từ từ tới 500ml, chitin sẽ tạo huyền phù màu trắng sữa. Huyền phù sẽ được lọc qua giấy lọc hoặc ly tâm (3500 vịng/phút trong 7 phút). Rửa nước cất nhiều lần để pH đạt trung tính, bảo quản huyền phù ở tủ lạnh (2-6C).  Dựng đường chuẩn N-acetyl-β-D-Glucosamine Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn Glucosamine Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ N-acetyl-β-D- Glucosamine 10µmol/ml chuẩn (µmol/ml) 0 1 2 3 4 5 6 7 Thể tích dung dịch N-acetyl-β- D-Glucosamine (ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 Thể tích nước cất (ml) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 DNS (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 Lắc đều, đun sơi 5 phút H2O (ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 Lắc đều, để yên 5 phút, đo OD ở bước sĩng 535 nm Chuẩn bị dung dịch N-acetyl-β-D-Glucosamine chuẩn 10µmol/ml: cân chính xác 0,0221g N- acetyl-β-D-Glucosamine, cho nước cất vào đủ 10ml. Dựng đường chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ N-acetyl-β-D-Glucosamine và giá trị OD.  Xác định hoạt độ enzyme chitinase Nguyên tắc: hoạt độ enzyme chitinase được xác định đựa trên phương pháp định lượng glucosamine trong quá trình phân giải chitin. Lượng glucosamine tạo ra được xác định theo phương pháp Elson- Morgan. Tiến hành  Đối với enzyme làm thí nghiệm Chọn các ống nghiệm cĩ cùng kích cỡ, cùng độ dày. Cho vào ống nghiệm hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml huyền phù chitin 1% và 1ml dịch enzyme chitinase. Hỗn hợp này được ủ ở 50C trong vịng 60 phút. Ngừng phản ứng bằng 1ml NaOH 1N và đun sơi cách thủy trong 5 phút. Ly tâm 4000 vịng/phút trong 5 phút hoặc lọc, thu dịch nổi. Cho 1ml dịch nổi và 1ml DNS 1%, lắc đều, đun sơi cách thủy trong 5 phút, làm lạnh nhanh trong bồn làm lạnh. Thêm 5ml nước cất, lắc đều và đo OD với bước sĩng 535nm.  Đối với dịch enzyme làm đối chứng Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Cho 1ml dịch enzyme vào ống nghiệm, nhỏ 1ml NaOH 1N, sau đĩ cho thêm 1ml dịch huyền phù chitin 1% vào, tiếp tục làm theo các bước tương tự như trên.  Cách tính [16] Một đơn vị hoạt tính enzyme chitinase (đvht) là lượng enzyme cần thiết để giải phĩng 1g N-acetyl-β-D-Glucosamine (NAG) từ chitin huyền phù trong thời gian 1 phút ở nhiệt độ phản ứng (500C). Tổng hoạt tính (đvht) = t Vna .. Hoạt tính chung (đvht/g.CP.E ) = mtv vna .. '.. Trong đĩ a: hàm lượng glucosamine (g /ml) trong dịch thí nghiệm đã pha lỗng n: hệ số pha lỗng V: thể tích dịch mơi trường nuối cấy (ml) v’: thể tích dịch enzyme ban đầu (ml) v : thể tích enzyme thí nghiệm (ml) t : thời gian phản ứng (phút) m : khối lượng enzyme (g) 2.3.6 Phương pháp khảo sát sự biến thiên hoạt độ của hệ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo các điều kiện nuơi cấy khác nhau (nhiệt độ, thời gian, chất cảm ứng) khi nuơi cấy trên mơi trường bán rắn [12, 23] Nguyên tắc Yếu tố mơi trường ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi như thời gian nuơi cấy, nhiệt độ mơi trường nuơi, loại cơ chất cảm ứng ... Khảo sát các yếu tố trên nhằm chọn ra điều kiện tối ưu để nuơi cấy chủng nấm sợi nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase cĩ hoạt độ cao nhất. 2.3.6.1. Xác định thời gian thích hợp để thu nhận chitinase cĩ hoạt độ cao nhất ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy (mục 2.3.3). Cấy các chủng nấm sợi. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Thu dịch chiết enzyme (mục 2.3.4) tại các thời điểm nuơi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ. Xác định sự biến thiên hoạt độ enzyme (mục 2.3.5) chitinase theo thời gian nuơi cấy các chủng nấm sợi nghiên cứu. 2.3.6.2. Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ mơi trường nuơi đối với đối với khả năng sinh tổng hợp chitinase ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Sử dụng Mơi trường 5 (mục 2.1.2), nuơi cấy trong thời gian tối ưu đã khảo sát ở trên ở các nhiệt độ mơi trường 20OC, 25OC, 30OC, 35OC, 40OC, 450C. Tiến hành thu dịch chiết enzyme, tiến hành xác định hoạt độ enzyme (theo mục 2.3.5) 2.3.6.3. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng (chitin) đến khả năng sinh tổng hợp chitinase của các chủng nấm sợi Sử dụng Mơi trường 5 (mục 2.1.2), lần lượt bổ sung chitin ở các nồng độ 0,0%, 5%, 10%, 15%, 20%. Nuơi cấy ở nhiệt độ và thời gian tối ưu đã khảo sát ở mục 2.3.6.1 và 2.3.6.2. Tiến hành thu dịch chiết enzyme, xác định hoạt độ chitinase. 2.3.6.4. Khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng đến khả năng sinh tổng hợp chitinase ở các chủng nấm sợi nghiên cứu Sử dụng Mơi trường 4 (mục 2.1.2), trong đĩ sử dụng thay thế lần lượt bột chitin, bột vỏ tơm, bột vỏ cua (tương ứng lượng chitin là 10%). Nuơi cấy trong thời gian và nhiệt độ tối ưu đã khảo sát ở trên, thu dịch enzyme thơ, tiến hành xác định hoạt độ enzyme (theo mục 2.3.5) 2.3.7 Phương pháp tối ưu điều kiện mơi trường nuơi cấy nấm sợi bằng qui hoạch thực nghiệm [2] Để xác định điều kiện tối ưu cho quá trình nuơi cấy chủng nấm sợi chọn thu chế phẩm enzyme chitinase, chúng tơi dùng thực nghiệm yếu tố tồn phần. Từ các kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng riêng lẻ từng yếu tố, chúng tơi chọn 3 yếu tố là thời gian nuơi cấy, nhiệt độ mơi trường nuơi cấy và nồng độ chitin trong mơi trường nuơi cấy để nghiên cứu tối ưu hĩa theo phương pháp qui hoạch thực nghiệm. - Lập ma trận đầy đủ với số thí nghiệm N = 23 = 8. Vì khơng làm thí nghiệm song song nên để xác định phương sai tái hiện, chúng tơi làm 3 thí nghiệm ở tâm (mức cơ sở). Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Bảng 2.2. Ma trận qui hoạch thực nghiệm STT thí nghiệm x1 x2 x3 y 1 + + + y1 2 + + - y2 3 + - + y3 4 + - - y4 5 - + + y5 6 - + - y6 7 - - + y7 8 - - - y8 9 0 0 0 y0(1) 10 0 0 0 y0(2) 11 0 0 0 y0(3) - Dùng PTHQ tuyến tính dạng: ŷ = b0 + b1x1 + b2x2 + b3x3 + b12x1x2 + b13x1x3 + b23x2x3 + b123x1x2x3 trong đĩ ŷ: hoạt độ chitinase theo phương trình hồi qui (PTHQ) - Tính b0, b1, b2, b3 ... bj - các hệ số của phương trình hồi qui bằng cơng thức:    N i ijij yxN b 1 1 N yxx b N i iilj jl   1 )( - Kiểm định tính ý nghĩa của các hệ số PTHQ theo tiêu chuẩn Student + Giá trị trung bình của thơng số tối ưu hĩa (hoạt độ chitinase) của 3 thí nghiệm tại tâm: ŷ0 = 3 3 1 )0(u uy + Phương sai tái hiện: Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1 )( 1 2 0)0( 2      n yy s n u u th với n: số thí nghiệm tại tâm (ở đây n=3)  sth + Sai số tính cho bi: N s s thbi  + Tính các giá trị t: tj = | |bj sbj với tlt: p=0,05; bậc tự do f = n-1 = 2 → t(0,05;2)= 4,3 (Tra bảng Student) Hệ số cĩ ý nghĩa phải thỏa mãn điều kiện tj > tlt - Kiểm định sự tương thích của PTHQ theo tiêu chuẩn Fisher + Flt: giá trị chuẩn Fisher ở mức p = 0,05; f1 = N-l; f2 = n-1; trong đĩ N=8, l: số hệ số cĩ ý nghĩa, n = 3. + Ftn: 2 2 th du tn s sF  với lN yy s i du     2 2 )ˆ( PTHQ thu được tương thích với thực nghiệm khi Ftn < Flt Từ PTHQ, nhận xét ảnh hưởng các yếu tố lên quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng nấm sợi chọn nghiên cứu. Sau đĩ tiến hành tối ưu hĩa thực nghiệm bằng phương pháp đường dốc nhất, bắt đầu từ điểm khơng, là mức cơ sở. Từ kết quả thu được chọn điều kiện mơi trường nuơi cấy thích hợp cho chủng nấm sợi chọn nghiên cứu sinh trưởng và tạo chitinase cĩ hoạt tính cao nhất. 2.3.8 Phương pháp nghiên cứu các điều kiện hoạt động tối ưu của chế phẩm chitinase thu nhận từ một số chủng nấm sợi nghiên cứu 2.3.8.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng xúc tác của chế phẩm enzyme chitinase Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hịa tan trong 10ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ ủ 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C. Từ đĩ vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của sản phẩm tạo thành (glucosamine) theo nhiệt độ, tìm ra nhiệt độ hoạt động tối ưu của chế phẩm enzyme. 2.3.8.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đối với khả năng xúc tác của chế phẩm enzyme chitinase pH = 3,0 – 4,0: sử dụng đệm citrate Luận văn thạc sĩ Cao học K18 pH = 4,5 – 5,5: sử dụng đệm acetate pH = 6,0 – 9,0: sử dụng đệm phosphate Cân mỗi 0,1g chế phẩm enzyme, hịa tan trong 5ml dung dịch đệm ở các pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong điều kiện nhiệt độ ủ tối ưu đã xác định ở mục 2.3.7a. Từ đĩ vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên của lượng sản phẩm tạo thành (glucosamine) theo pH, tìm ra pH tối ưu của hoạt động chế phẩm. 2.3.8.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian phản ứng lên sản phẩm tạo thành của chế phẩm enzym chitinase Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hịa tan trong 10ml nước cất. Tiến hành phản ứng với chitin huyền phù trong các điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu (mục 2.3.7a, b); thời gian phản ứng thay đổi từ 10 phút đến 90 phút, mỗi lần cách nhau 10 phút. Từ đĩ vẽ đồ thị biễu diễn sự biến thiên hàm lượng glucosamine tạo ra theo thời gian phản ứng, tìm ra thời gian phản ứng tối ưu của chế phẩm enzyme chitinase. 2.3.9 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng bước đầu của chế phẩm chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi được chọn 2.3.9.1 Ứng dụng bước đầu trong diệt cơn trùng sâu hại Chọn các đối tượng sâu khác nhau, xử lý dung dịch chế phẩm enzyme ở các nồng độ 0%, 1%, 2%. Theo dõi tỉ lệ sâu chết qua các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút, 150 phút. Lặp lại thí nghiệm 3 lần, thống kê số liệu. Đánh giá khả năng diệt cơn trùng, sâu hại của chế phẩm enzyme. 2.3.9.2 Ứng dụng bước đầu trong sản xuất glucosamine Cân 0,2g chế phẩm enzyme, hịa tan trong 10ml dung dịch đệm cĩ pH tối ưu đã xác định ở mục 2.3.8.2. Sử dụng cơ chất chitin dạng bột 10% và chitin huyền phù 1%, tiến hành phản ứng enzyme trong nhiệt độ tối ưu, thời gian 70 phút. Xác định hàm lượng glucosamine tạo thành, đánh giá hiệu suất tạo glucosamine. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT SƠ BỘ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI Chúng tơi tiến hành khảo sát sơ bộ (phương pháp định tính) khả năng tổng hợp chitinase của một số chủng nấm sợi gồm Trichoderma harzianum, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus sp. (hình 3.1) qua việc xác định đường kính vịng phân giải (theo phương pháp đã giới thiệu ở mục 2.3.4). kết quả biểu thị ở bảng 3.1 và hình 3.2. Hình 3.1. Các chủng nấm được chọn nghiên cứu Th2: Trichoderma harzianum As: Aspergillus sp. AA: Aspergillus awamori AN: Aspergillus niger Bảng 3.1. Đường kính vịng trịn phân giải Chủng nấm Đường kính trung bình vịng enzyme phân giải D – d (mm) Aspergillus niger 19,8 20.9 19.7 20,13 Aspergillus awamori 24.6 24.5 24.8 24,60 Aspergillus sp. 21.6 21.3 21.2 21,36 Trichoderma harzianum 21,2 20,5 22,7 21,46 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Kết quả cho thấy cả bốn chủng chọn nghiên cứu đều cĩ khả năng phân giải chitin, trong đĩ chủng Aspergillus niger cĩ khả năng tổng hợp enzyme chitinase thấp nhất. Từ đĩ chúng tơi chọn ba chủng Aspergillus awamori, Aspergillus sp., Trichoderma harzianum tiếp tục nghiên cứu. Hình 3.2. Vịng phân giải enzyme chitinase của các chủng nấm sợi nghiên cứu 3.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CÁC YẾU TỐ ĐẾN QUÁ TRÌNH SINH TỔNG HỢP ENZYME CHITINASE CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI NUƠI CẤY TRÊN MƠI TRƯỜNG BÁN RẮN 3.2.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian nuơi cấy Thí nghiệm tiến hành với mục đích xác định thời gian nuơi cấy thích hợp để thu enzym chitinase cĩ hoạt độ cao nhất. Quá trình nuơi cấy các chủng tiến hành theo mục 2.3.3 nhằm thu nhận canh trường, tiến hành khảo sát hoạt độ hệ enzyme thủy phân của canh trường tại các thời điểm nuơi cấy 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 giờ, 72 giờ, 84 giờ, 96 giờ, 108 giờ với điều kiện nuơi cấy là: nhiệt độ 300C, 10 gam mơi trường/bình tam giác 250ml. Pha lỗng dịch chiết enzyme 10 lần (hệ số pha lỗng n=1) trước khi đem xác định hoạt độ chitinase theo mục 2.3.5. Kết quả thu được trình bày ở bảng 3.3 và đồ thị 3.1  Nhận xét: Asp. awamori Asp. niger T. harzianum Aspergillus. sp. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Từ kết quả khảo sát, chúng tơi nhận thấy hệ enzyme chitinase của canh trường đối với chủng nấm sợi Aspergillus awamori cĩ hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuơi cấy là 36 giờ, chitinase của Aspergillus sp. cĩ hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuơi cấy là 72 giờ và Trichoderma harzianum cĩ hoạt độ cao nhất ở khoảng thời gian nuối cấy là 60 giờ. Trong cả ba chủng thì Aspergillus awamori tổng hợp chitinase cĩ hoạt độ cao nhất trên mơi trường nuơi cấy thí nghiệm, hoạt độ đạt 1,02 UI/gCT, ngồi ra thời gian thu nhận enzyme đạt hoạt độ cao ngắn (36 giờ), đây là ưu điểm cần chú ý đến vì sẽ nâng cao hiệu suất thu nhận enzyme nhờ tiết kiệm thời gian nuơi. Bảng 3.2. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo thời gian nuơi cấy Chủng Thời gian nuơi cấy (giờ) ∆OD‹535nm› Lượng Glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Aspergillus awamori 24 0,035 10,179 0,51 36 0,069 20,358 1,02 48 0,064 18,792 0,94 60 0,049 14,486 0,72 72 0,028 8,124 0,41 84 0,018 5,383 0,27 96 0,013 3,915 0,20 108 0,007 2,153 0,11 Aspergillus sp. 24 0,018 5,383 0,27 36 0,029 8,515 0,43 48 0,038 11,158 0,56 60 0,048 14,192 0,71 72 0,059 17,226 0,86 84 0,048 14,094 0,70 96 0,035 10,375 0,52 108 0,014 4,013 0,20 Trichoderma harzianum 24 0,012 3,426 0,17 36 0,024 7,145 0,36 48 0,043 12,626 0,63 60 0,061 18,009 0,90 72 0,056 16,541 0,83 84 0,048 13,996 0,70 96 0,040 11,647 0,58 108 0,028 8,124 0,41 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.02 0.860.90 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 24 36 48 60 72 84 96 108 Thời gian (giờ) H oạ t đ ộ c hi tin as e (U I/g C T) A. awamori Aspergillus sp. T.harzianum Đồ thị 3.1. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường theo thời gian nuơi cấy 3.2.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ mơi trường nuơi cấy Từ kết quả thu được ở mục 3.2.1, chúng tơi chọn thời gian nuơi cấy đối với chủng Aspergillus awamori là 36 giờ, chủng Aspergillus sp. là 72 giờ và Trichoderma harzianum là 60 giờ để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với khả năng sinh tổng hợp enzyme chitinase của các chủng. Chuẩn bị mơi trường nuơi cấy (MT5) như phương pháp trình bày ở mục 2.3.3. Các bình tam giác nuơi cấy được đặt ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau là 200C, 250C, 300C, 350C, 400C, 450C, 500C. Tùy từng chủng chúng tơi tiến hành thu nhận dịch enzyme thơ từ canh trường nuơi cấy tại thời điểm thời gian tối ưu nêu trên, tiến hành xác định hoạt độ enzyme chitinase trong dịch enzyme thơ. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.3 và đồ thị 3.2. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Bảng 3.3. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo nhiệt độ mơi trường nuơi cấy Chủng Nhiệt độ (0C) ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µG/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Aspergillus awamori 20 0,013 3,719 0,19 25 0,044 13,017 0,65 30 0,069 20,162 1,01 35 0,078 22,805 1,14 40 0,055 16,149 0,81 45 0,023 6,753 0,34 50 0,005 1,370 0,07 Aspergillus sp. 20 0,019 5,677 0,28 25 0,047 13,898 0,69 30 0,057 16,835 0,84 35 0,061 18,009 0,90 40 0,066 19,281 0,96 45 0,048 14,094 0,70 50 0,032 9,396 0,47 Trichoderma harzianum 20 0,015 4,502 0,23 25 0,040 11,843 0,59 30 0,064 18,890 0,94 35 0,057 16,639 0,83 40 0,039 11,549 0,58 45 0,025 7,439 0,37 50 0,012 3,426 0,17 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.14 0.96 0.94 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 20 25 30 35 40 45 50 Nhiệt độ (độ C) H oạ t đ ộ c hi tin as e (U I/g C T) A. awamori Aspergillus. sp. T. harzianum Đồ thị 3.2. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo nhiệt độ nuơi cấy  Nhận xét: Khi nhiệt độ tăng dần trong khoảng 250C đến 350C, hoạt độ chitinase của các chủng nấm sợi cũng tăng, trong đĩ chủng Aspergilllus awamori đạt hoạt độ chitinase cao nhất (1,14UI/gCT) tại khoảng nhiệt độ 350C, nhưng cao hơn nhiệt độ này, tại khoảng nhiệt độ 400C, hoạt độ chitinase giảm đáng kể. Trong khi đĩ, chủng Aspergillus sp. thể hiện cĩ khả năng chịu nhiệt, theo dõi quá trình sinh trưởng của nấm ở các khoảng nhiệt độ biến thiên ở trên, chúng tơi nhận thấy hệ sợi nấm phát triển tốt bám chặt cơ chất, tuy nhiên hoạt độ chitinase cao nhất tại nhiệt độ nuơi 400C là 0,96UI/gCT, thấp hơn so với Aspergilllus awamori. So sánh với nghiên cứu của Jin-Ian Xia và Jing Xiong (2009) trên nấm Aspergillus fumigatus thì nhiệt độ tối ưu cho nấm này sinh chitinase hoạt độ cao nhất (0,118UI/ml) là 550C. Tác giả Phakapob Setthakaset và cộng sự (2008) thu nhận chitin từ Aspergillus sp thì ở nhiệt độ tối ưu là 450C, hoạt độ chitinase cao nhất đạt 3,1UI/ml. Đối với Trichoderma harzianum, hoạt độ chitinase cao nhất ở khoảng nhiệt độ 300C, đạt 0,94UI/gCT, thấp nhất trong ba chủng nghiên cứu. 3.2.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ chitin trong mơi trường nuơi cấy Chúng tơi tiến hành thí nghiệm với mục đích xác định hàm lượng chitin trong mơi trường nuơi cấy thích hợp để thu enzyme chitinase cĩ hoạt độ cao nhất. Quá trình nuơi cấy các chủng tiến hành theo mục 2.3.2 nhằm thu nhận canh trường tại thời điểm tối ưu tương ứng, tiến hành khảo sát Luận văn thạc sĩ Cao học K18 hoạt độ hệ enzyme thủy phân với các hàm lượng khác nhau của chitin trong mơi trường nuơi cấy là 0,0%, 5%; 10%; 15%; 20% với 10 gam mơi trường/bình tam giác 250ml. Pha lỗng dịch chiết enzyme 10 lần (hệ số pha lỗng n=1) trước khi đem xác định hoạt độ chitinase theo mục 2.3.5. Kết quả thể hiện ở bảng 3.4 và đồ thị 3.3.  Nhận xét: Khi khơng cĩ mặt chitin trong mơi trường nuơi cấy, các chủng nấm sợi vẫn sinh tổng hợp chitinase nhưng hoạt độ thấp, sản lượng khơng đáng kể. Điều này thể hiện chitinase vừa là enzyme cấu trúc, vừa là enzyme cảm ứng. Khi bổ sung bột chitin vào mơi trường bán rắn, chitin là chất cảm ứng kích thích nấm sợi sản sinh nhiều chitinase. Theo kết quả thí nghiệm, chúng tơi nhận thấy, ở nồng độ chitin trên mơi trường bán rắn là 10 – 15% hoạt độ chitinase đạt giá trị cao nhất, vượt qua nồng độ chitin 15%, hoạt độ enzyme chitinase cĩ xu hướng giảm. Trong các chủng nấm sợi nghiên cứu, Aspergillus awamori vẫn thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase cĩ hoạt tính cao, đạt 1,16UI/gCT ở nồng độ chitin là 15%, từ nồng độ chitin 10% đến 15%, hoạt độ chitinase tăng khơng đáng kể. Chủng Aspergillus sp. thể hiện nhu cầu chất cảm ứng chitin khơng cao, vượt qua tỉ lệ chitin bổ sung vào mơi trường nuơi 10% thì hoạt độ enzyme giảm. Cịn ở nấm sợi Trichoderma harzianum, khi mơi trường khơng cĩ chitin thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase cao hơn hẳn hai chủng nấm cịn lại. Tuy nhiên khi nồng độ chitin tăng, hoạt độ enzyme tăng đáng kể và đạt giá trị cao nhất ở nồng độ chitin trong mơi trường bán rắn là 1,04UI/gCT, vẫn thấp hơn so với Aspergillus awamori. Bảng 3.4. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase của các chủng nấm sợi theo hàm lượng chitin trong mơi trường nuơi cấy Chủng Hàm lượng chitin (%) ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Aspergillus awamori 0 0,016 4,796 0,24 5 0,026 7,732 0,39 10 0,078 22,805 1,14 15 0,079 23,196 1,16 20 0,043 12,724 0,64 Aspergillus sp. 00 0,013 3,915 0,20 5 0,038 11,158 0,56 10 0,067 19,673 0,98 15 0,066 19,281 0,96 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 20 0,049 14,388 0,72 Trichoderma harzianum 0 0,027 8,026 0,40 5 0,052 15,171 0,76 10 0,065 19,086 0,95 15 0,071 20,847 1,04 20 0,054 15,856 0,79 1.16 0.98 1.04 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 0 5 10 15 20 Hàm lượng chitin (%) H oạ t đ ộ c hi tin as e (U I/g C T) A.awamori Aspergillus sp. T. harzianum Đồ thị 3.3. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường các chủng nấm sợi theo hàm lượng chất cảm ứng (chitin) trong mơi trường nuơi cấy 3.2.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng chất cảm ứng lên khả năng sinh tổng hợp chitinase của chủng Aspergillus awamori Từ kết quả thu được, chúng tơi nhận thấy Aspergillus awamori thể hiện khả năng sinh tổng hợp chitinase cĩ hoạt độ cao nhất trong ba chủng nghiên cứu, thời gian nuơi cấy ngắn (36 giờ). Do đĩ, chúng tơi quyết định chọn chủng Asprgillus awamori để nghiên cứu tiếp tục nhằm thu nhận enzyme. Trước hết, chúng tơi khảo sát chất cảm ứng phù hợp để chủng này sinh tổng hợp chitinase cĩ hoạt độ cao nhất, chất cảm ứng được sử dụng gồm: bột chitin, bột vỏ tơm và bột vỏ cua, với hàm lượng chitin 16%, từ đĩ suy ra lượng chất cảm ứng cần bổ sung (phụ lục 2). Kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.5 và đồ thị 3.4. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Bảng 3.5. Sự biến thiên hoạt độ enzyme chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori theo loại chất cảm ứng Chủng Chất cảm ứng ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Hoạt độ chitinase (UI/gCT) Aspergillus awamori Bột chitin 0,079 23,196 1,16 Bột vỏ tơm 0,057 16,639 0,83 Bột vỏ cua 0,055 16,052 0,80 Chủng Aspergillus awamori 0.83 0.80 1.16 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 Bột chitin Bột vỏ tơm Bột vỏ cua Loại chất cảm ứng Ho ạt độ c hi tin as e (U I/g CT ) Biểu đồ 3.1. Sự biến thiên hoạt độ chitinase của canh trường Asp. awamori theo loại chất cảm ứng bổ sung  Nhận xét Hoạt độ chitinase cao nhất (1,16UI/gCT) khi sử dụng chất cảm ứng là bột chitin. Như vậy, chất chitin dạng bột là chất cảm ứng tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp hệ enzyme chitinase của Aspergillus awamori. Điều này cĩ thể giải thích do trong vỏ của tơm cua cịn chứa nhiều khống, ảnh hưởng đến hoạt động sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi.  Thảo luận Từ các kết quả thu được, cĩ thể thấy hoạt độ enzyme chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori cao nhất, ngồi ra thời gian nuơi cấy chủng này ngắn, thuận lợi cho việc thu nhận enzyme, do đĩ chúng tơi chọn chủng này nghiên cứu tối ưu bằng qui hoạch thực nghiệm Luận văn thạc sĩ Cao học K18 3.3 KẾT QUẢ QUI HOẠCH THỰC NGHIỆM NHẰM TỐI ƯU HĨA ĐIỀU KIỆN MƠI TRƯỜNG NUƠI CẤY ẢNH HƯỞNG KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA ASPERGILLUS AWAMORI Từ kết quả trên, chúng tơi tiến hành làm quy hoạch thực nghiệm, chọn các yếu tố ảnh hưởng với các giới hạn và miền khảo sát như ở bảng 3.6 Bảng 3.6. Các mức và khoảng biến thiên Yếu tố Các mức Khoảng biến thiên Mức dưới (-) Tâm (0) Mức trên (+) X1 : thời gian (giờ) 30 36 42 6 X2 : nhiệt độ (độ C) 30 35 40 5 X3 : nồng độ chitin (%) 10 15 20 5 Thiết lập ma trận thí nghiệm, ma trận mở rộng sau khi đưa thêm cột biến ảo x0 = +1 và các hệ số tương tác. Thu được kết quả như bảng 3.7. Bảng 3.7. Ma trận mở rộng và kết quả quy hoạch thực nghiệm các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt độ enzyme chitinase của canh trường Asp. awamori Các yếu tố theo tỉ lệ xích tự nhiên Các yếu tố trong hệ mã hĩa STT thí nghiệm Z1 Z2 Z3 x1 x2 x3 y 1 42 40 20 + + + 1,64 2 42 40 10 + + - 0,67 3 42 30 20 + - + 1,20 4 42 30 10 + - - 0,20 5 30 40 20 - + + 0,58 6 30 40 10 - + - 0,10 7 30 30 20 - - + 1,27 8 30 30 10 - - - 0,92 9 36 35 10 0 0 0 1,31 10 36 35 10 0 0 0 1,34 11 36 35 10 0 0 0 1,31 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Ghi chú: Z1: Thời gian nuơi cấy (giờ) Z2: Nhiệt độ mơi trường nuơi cấy (0C) Z3: Hàm lượng chitin trong mơi trường nuơi cấy (%) x1, x2, x3: biến số mã hĩa của biến thực Z1,Z2, Z3 (-): mức dưới; (0): tâm; (+): mức trên. y là hoạt độ enzyme chitinase thu được sau đo OD535. Phương trình biểu diễn mối quan hệ cĩ dạng y = f (x1, x2, x3) Hàm mục tiêu cĩ dạng: ŷ=b0+b1x1+b2x2+b3x3+b12x1x2+b13x1x3+b23x2x3+b123x1x2x3 trong đĩ b0, b1,b2, b3, b12, b13, b23, b123 là các hệ số của phương trình hồi qui. ŷ là hoạt độ enzyme chitinase ước tính. Các hệ số trong PTHQ được xác định theo cơng thức mục 2.3.7. Kết quả tính được: b0 0,82 b1 0,11 b2 -0,08 b3 0,35 b12 0,30 b13 0,14 b23 0,01 b123 -0,02 Hệ số cĩ ý nghĩa phải thỏa mãn điều kiện: tj > tlt tlt tính theo cơng thức ở mục 2.3.7 t0 147,60 t1 18,92 t2 13,64 t3 62,91 t12 54,33 t13 25,74 t23 2,42 t123 -3,52 So sánh các hệ số tj với tlí thuyết ta thấy các hệ số của phương trình đều cĩ nghĩa, ngoại trừ hệ số t 23 và t123. Như vậy, sau khi giải bài tốn quy hoạch thực nghiệm và tính các hệ số phương trình hồi quy, ý nghĩa của các hệ số được kiểm tra theo tiêu chuẩn Student với p = 0,05, số bậc tự do f = 3-1 = 2, chúng tơi thu được phương trình hồi quy Luận văn thạc sĩ Cao học K18 ŷ=0.82 + 0.11x1 - 0.08x2 + 0.35x3 + 0.30x1x2+0.14x1x3 Kiểm tra sự tương thích phương trình hồi quy với thực nghiệm theo tiêu chuẩn Fisher với Ftính = 6,19; F0.95(5;1;2) = 19,296. Do Ftính < F0.95(5;1;2) nên phương trình hồi quy thu được tương thích với thực nghiệm. Từ PTHQ thu được, ta thấy muốn tăng giá trị của thơng số tối ưu hĩa cần tăng giá trị x1 (thời gian) và x3 (hàm lượng chitin), giảm giá trị x2 (nhiệt độ). Từ đĩ chúng tơi tiến hành tối ưu hĩa quá trình khảo sát hàm mục tiêu bằng phương pháp leo dốc (phương pháp Box-Wilson). Đối với thời gian nuơi, chúng tơi chọn bước nhảy là 2 giờ, đối với nhiệt độ, chúng tơi chọn bước nhảy (giảm dần) là 1, cịn đối với hàm lượng chitin, chúng tơi chọn bước nhảy là 2 (tăng dần). Tiến hành bố trí thí nghiệm và kết quả thu được như bảng 3.8. Bảng 3.8. Kết quả nuơi cấy Aspergillus awamori theo kế hoạch leo dốc STT TN Z1 Z2 Z3 y 1 36 35 10 1,15 2 38 34 12 1,38 3 40 33 14 1,42 4 42 32 16 1,69 5 44 31 18 1,41 6 46 30 20 1,23 7 48 29 22 1,19 Kết quả cho thấy, điều kiện nuơi cấy trên mơi trường bán rắn thích hợp cho Aspergillus awamori sinh trưởng và tạo chitinase là chất cảm ứng là chitin, thời gian nuơi cấy 42 giờ, nhiệt độ mơi trường nuơi cấy là 320C, hàm lượng chitin trong mơi trường là khoảng 16%, ta tiếp tục nuơi cấy đồng loạt để thu enzyme chitinase. 3.4 THU NHẬN ENZYME CHITINASE 3.4.1 Nuơi Aspergillus awamori trên mơi trường bán rắn Khối lượng mơi trường vào bình tam giác lớn, khoảng 50-60gMT/bình (hoặc cĩ thể sử dụng bịch nilon chịu nhiệt). Nuơi cấy ở điều kiện nhiệt độ 320C, bổ sung lượng chitin vào mơi trường là 16%, sau 42 giờ thu chế phẩm. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Hình 3.3. Nuơi Asp. awamori trên mơi trường bán rắn trong bình tam giác 1000ml để thu nhận enzyme  Nhận xét Trong ngày đầu tiên (sau 24 giờ) thì sự xuất hiện sợi nấm mốc chưa thấy rõ, sau đĩ xuất hiện những sợi trắng mờ mọc lan ra, chủ yếu là ở bề mặt, càng sâu vào trong mơi trường thì càng ít. Sau đĩ sợi nấm lan ra mạnh, bám chặt cơ chất, thấy rõ màu trắng hơi đục của hệ sợi trên mơi trường. Sau khoảng 36 giờ trở đi thì thấy rõ bào tử màu nâu xuất hiện khắp trên bề mặt mơi trường. 3.4.2 Thu nhận chế phẩm enzyme chitinase Sau 42 giờ nuơi cấy trong bình tam giác 1000ml, ta tiến hành trích ly enzyme bằng nước cất với tỷ lệ mơi trường/nước là ¼. Dịch chứa enzyme này sẽ được ly tâm lạnh để loại bỏ bào tử và tơ nấm, ta sẽ thu được dịch enzyme thơ gồm cĩ chitinase, nước và các chất hịa tan khác. Dịch trích ly enzyme Dịch enzyme sau ly tâm Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Hình 3.4. Dịch chiết enzyme chitinase Chọn ethanol làm tác nhân kết tủa trong thời gian 12 giờ. Ly tâm để thu tủa, đem sấy ở nhiệt độ thấp (dưới 300C) cho đến khơ, lượng chế phẩm enzyme chitinase bán tinh sạch dạng bột khơ được đĩng gĩi và đem bảo quản trong tủ lạnh. Hình 3.5. Dịch enzyme khi tủa bằng cồn Bảng 3.9. Kết quả thu nhận chế phẩm enzyme chitinase dạng bột khi nuơi cấy Aspergillus awamori trên mơi trường bán rắn Lần thí nghiệm Canh trường (gam) CPE (gam) Hoạt độ (UI/gCPE) 1 80 0,7 102,39 2 80 1,0 101,67 3 80 0,9 100,95 Trung bình 80 0,86 101,67 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Hình 3.6. Tủa enzyme thu được sau khi ly tâm (trái) và sau khi sấy khơ (phải) Hình 3.7. Chế phẩm enzyme bán tinh sạch đem bảo quản trong tủ lạnh 3.5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN HOẠT ĐỘNG XÚC TÁC CỦA CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THU NHẬN TỪ ASPERGILLUS AWAMORI 3.5.1 Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzyme chitinase Sau khi tiến hành thí nghiệm như mục 2.3.8, xác định lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase, kết quả thể hiện trên bảng 3.10 và đồ thị 3.5. Bảng 3.10. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành dưới tác động chế phẩm chitinase Asp.awamori theo nhiệt độ phản ứng Chủng Nhiệt độ phản ứng (0C) ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Aspergillus awamori 30 0,101 29,558 40 0,115 33,767 50 0,125 36,801 60 0,061 17,813 70 0,032 9,494 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 80 0,008 2,447 36.801 0 10 20 30 40 30 40 50 60 70 80 Nhiệt độ phản ứng (độ C) Lư ợn g gl uc os am in e (m ic ro ga m /m l) A. awamori Đồ thị 3.4. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành dưới tác động chế phẩm chitinase Asp. awamori theo nhiệt độ phản ứng  Nhận xét: Từ kết quả khảo sát trên, chúng tơi nhận thấy nhiệt độ thích hợp cho chitinase của chủng Aspergillus awamori trong phản ứng thủy phân dao động từ 300C – 500C và nhiệt độ tối ưu là 500C. 3.5.2 Kết quả xác định pH thích hợp cho hoạt động của enzyme Sau khi chuẩn bị dung dịch đệm ở các pH khác nhau từ 3,0 đến 9,0 (xem phụ lục), chúng tơi hịa tan 0,1 gam chế phẩm trong 5 ml mỗi dung dịch đệm. Đem ủ với chitin huyền phù ở nhiệt độ tối thích ở mục 3.5.1 trong thời gian 60 phút. Kết quả xác định lượng glucosamine tạo thành thể hiện ở bảng 3.11 và đồ thị 3.6. Bảng 3.11. Sự biến thiên hoạt lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase Asp. awamori ở các pH khác nhau Chủng Giá trị pH ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Aspergillus awamori 3,0 0,097 28,384 3,5 0,088 25,741 4,0 0,157 46,197 4,5 0,118 34,746 5,0 0,130 38,073 5,5 0,100 29,265 6,0 0,073 21,533 6,5 0,066 19,252 Luận văn thạc sĩ Cao học K18 7,0 0,036 10,668 46.197 0 10 20 30 40 50 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 pH Lư ợn g G lu co sa m in e (m ic ro ga m /m l) Asp. Awamori Đồ thị 3.5. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase Asp. awamori ở các pH khác nhau  Nhận xét Từ kết quả khảo sát trên, chúng tơi nhận thấy pH thích hợp cho chitinase của chủng Aspergillus awamori trong phản ứng thủy phân dao động từ 3,0 – 5,0 và pH tối ưu là 4,0. 3.5.3 Kết quả khảo sát thời gian phản ứng lên lượng sản phẩm tạo thành Sau khi tiến hành thí nghiệm thủy phân chitin bằng CPE chitinase ở các thời gian khác nhau (mục 2.3.8.3) và tiến hành xác định lượng glucosamine tạo thành, chúng tơi thu được kết quả như bảng 3.12 và đồ thị 3.7. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Bảng 3.12. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase Asp. Awamori theo thời gian phản ứng Chủng Thời gian phản ứng (phút) ∆OD‹535nm› Lượng glucosamine tạo thành (µg/ml) Aspergillus awamori 10 0,036 10,473 20 0,073 21,533 30 0,118 34,746 40 0,148 43,554 50 0,164 48,252 60 0,170 49,818 70 0,169 49,721 80 0,169 49,525 90 0,168 49,427 49.818 0 10 20 30 40 50 60 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Thời gian phản ứng (phút) Lư ợn g G lu co sa m in e (m ic ro g/ m l) Đồ thị 3.6. Sự biến thiên lượng glucosamine tạo thành sau khi thủy phân bởi chế phẩm chitinase Asp. awamori theo thời gian phản ứng  Nhận xét Từ kết quả khảo sát trên, chúng tơi nhận thấy trong giai đoạn đầu lượng glucosamine tạo ra tỉ lệ thuận với thời gian phản ứng, tại thời gian 60 phút đạt đạt lượng glucosamine là 49,818µg/ml. Tuy nhiên từ khoảng thời gian 70 phút trở lên, lượng glucosamine tạo ra hầu như khơng tăng. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 3.6 KẾT QUẢ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG CHẾ PHẨM ENZYME CHITINASE THU NHẬN TỪ ASPERGILLUS AWAMORI 3.6.1 Ứng dụng bước đầu trong phịng trừ sâu Chúng tơi chọn hai loại sâu khác nhau để thử nghiệm khả năng phân giải chitin của chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus awamori. Loại sâu chúng tơi chọn gồm sâu gạo (tên khoa học là Zoophobas mario) là loại sâu được dùng làm thức ăn cho chim cảnh trên thị trường; loại sâu thứ hai chúng tơi thử nghiệm là sâu trên lá cây lạc tiên (cịn gọi là cây Chùm bao hay dây nhãn lồng Passiflora foetida). Mục đích sử dụng các loại sâu này nhằm bước đầu đánh giá tác động của chitinase lên sâu hại, đối tượng cĩ lớp vỏ chitin bao bọc. Cho số lượng sâu 20 con/đĩa petri (đối với sâu 1) và 10 con/đĩa petri (đối với sâu 2), đĩa đối chứng chỉ cho lượng nước cất tương đương lượng dung dịch chế phẩm sử dụng thí nghiệm (1ml/đĩa petri). Cho mỗi đĩa thí nghiệm 1ml dịch CPE chitiase nồng độ 1% và 2%. Theo dõi số lượng sâu chết qua các mốc thời gian 30 phút, 60 phút, 90 phút và 120 phút. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, tính giá trị trung bình. So sánh kết quả với mẫu đối chứng, đánh giá sơ bộ khả năng diệt sâu của CPE. A-SÂU 1: Sâu gạo B-SÂU 2: Sâu cây lạc tiên C-Mẫu sâu 2 làm thí nghiệm D-Thí nghiệm đối chứng trên sâu 1 A B C D Luận văn thạc sĩ Cao học K18 E-Xử lý sâu 1 với dung dịch CPE 1% F-Xử lý sâu 1 với dung dịch CPE 2% G-Thí nghiệm trên sâu 2 H-Thí nghiệm đối chứng trên sâu 2 Hình 3.8. Thử nghiệm tác dụng CPE chitinase Asp. Awamori trên sâu Bảng 3.13. Sự biến thiên hoạt độ dịch chiết enzyme chitinase thu nhận từ chủng Asp. awamori theo thời gian phản ứng Loại sâu Nồng độ CPE (%) Thời gian tác động (phút) Tỉ lệ trung bình sâu chết (%) SÂU 1 0% 90 13,3 1% 90 78,3 2% 90 85,0 SÂU 2 0% 90 5,4 1% 90 70,0 2% 90 93,3  Nhận xét Qua bảng số liệu trích dẫn 3.13, chúng tơi nhận thấy CPE chitinase thu nhận từ Aspergillus awamori thể hiện khả năng tác động khá mạnh lên lớp vỏ chitin của sâu hại, cơn trùng. Sau cùng E F G H Luận văn thạc sĩ Cao học K18 khoảng thời gian 90 phút, trung bình cĩ khoảng trên 70% sâu chết khi xử lý dung dịch chế phẩm nồng độ 1% và trên 85% sâu chết khi xử lý dung dịch chế phẩm 2%, cao hơn nhiều so với tỉ lệ chết của thí nghiệm đối chứng (khoảng 5-13%). từ đĩ mở ra hướng ứng dụng sâu hơn của CPE chitinase thu nhận từ nấm Aspergillus awamori trong sản xuất thuốc trừ sâu sinh học 3.6.2 Ứng dụng bước đầu trong sản xuất glucosamine Chúng tơi sử dụng hai loại nguyên liệu khác nhau là chitin dạng bột và chitin huyền phù để thử nghiệm ứng dụng bước đầu chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ nấm sợi Aspergillus awamori trong sản xuất glucosamine. Điều kiện hoạt động chế phẩm là điều kiện tối ưu đã thu được từ kết quả nghiên cứu ở mục 3.5 (pH = 4, nhiệt độ ủ là 500C, thời gian thủy phân là 70 phút), nồng độ CPE là 0,2%, bột chitin là 1,6g/10ml (16%) nước cất, chitin huyền phù 1%. Tỉ lệ dung dịch CPE và nguyên liệu là 1 : 1. Kết quả thu nhận được thể hiện trên bảng 3.13 Bảng 3.14. Hàm lượng glucosamine thu được từ phản ứng thủy phân chitin bằng CPE chitinase thu nhận từ chủng Aspergillus awamori Nguyên liệu ∆OD Lượng glucosamine (µg/ml) Hiệu suất Chitin dạng bột 0,041 11,79 Thấp Chitin huyền phù 0,123 35,55 Trung bình  Nhận xét Số liệu bảng 3.13 chỉ ra rằng, hiệu suất thủy phân chitin của chitinase ở nồng độ CPE 2%, nhiệt độ phản ứng 500C và thời gian phản ứng 70 phút cho hàm lượng glucosamin đạt 10,81µg/ml từ nguyên liệu chitin dạng bột và 35,55 µg/ml khi sử dụng nguyên liệu là chitin dạng huyền phù. Hiệu suất thủy phân của CPE thấp nhưng nguồn enzyme chitinase từ nấm sợi dễ thu nhận, chi phí thấp, cũng đáng để nghiên cứu sử dụng. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Trong quá trình làm thí nghiệm chúng tơi rút ra một số kết luận sau: - Đã nghiên cứu điều kiện mơi trường tối ưu cho sự sinh tổng hợp chitinase của ba chủng nấm sợi là: Aspergillus awamori: nhiệt độ thích hợp nhất là 350C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 36-40 giờ. Aspergillus sp.: nhiệt độ thích hợp nhất là 400C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 72 giờ. Trichoderma harzianum: nhiệt độ thích hợp nhất: 300C; thời gian thu enzyme tốt nhất là 60 giờ. - Chitin là chất cảm ứng tốt để nuơi cấy nấm sợi nhằm thu nhận chitinase - Đã tiến hành qui hoạch thực nghiệm, phương trình hồi qui thu được tương thích với thực nghiệm: ŷ=0.82 + 0.11x1 - 0.08x2 + 0.35x3 + 0.30x1x2+0.14x1x3 Từ đĩ suy ra điều kiện tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp chitinase của chủng Aspergillus awamori là thời gian nuơi cấy 42 giờ, nhiệt độ nuơi là 320C, lượng chitin bổ sung thích hợp là 16%. - Đã nghiên cứu điều kiện tối ưu cho hoạt động của chế phẩm enzyme chitinase thu nhận từ chủng nấm sợi Aspergillus awamori là nhiệt độ 500C, pH = 4,0. - Đã bước đầu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm enzyme thu nhận từ Aspergillus awamori trong diệt trừ sâu hại và sản xuất glucosamine. 4.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp chitinase của một số chủng nấm mốc khác. - Tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng rộng rãi enzyme này trong lĩnh vực sản xuất thuốc trừ sâu sinh học. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]. Khưu Phương Yến Anh (2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzyme cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Sư phạm TP Hồ Chí Minh. [2]. Nguyễn Cảnh, Quy hoạch thực nghiệm. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [3]. Tạ Kim Chỉnh (1996), Tuyển chọn một số chủng vi nấm diệt cơn trùng gây hại ở Việt Nam và khả năng ứng dụng. Luận án Phĩ Tiến sĩ Khoa học Sinh học, Viện Cơng nghệ Sinh học. [4]. Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm của vi nấm. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [5]. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), Vi sinh vật học. NXB Giáo dục. [6]. Nguyễn Lân Dũng và các tác giả khác (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập 2, tập 3). NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [7]. Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [8]. Bùi Xuân Đồng (1982), Nhĩm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam (tập1). NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. [9]. Bùi Xuân Đồng (1997), Vi nấm dùng trong cơng nghệ sinh học. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [10]. Đinh Minh Hiệp (2004), Nghiên cứu quy trình tách chiết và ứng dụng nguồn enzyme chitinase từ nấm mật (coprinus fimentarius). Báo cáo tổng kết nghiệm thu, Sở khoa học và cơng nghệ TP. HCM, tr153-160. [11]. Đinh Minh Hiệp (2007), Hệ chitinase của Trichoderma và vai trị trong kiểm sốt sinh học. Báo cáo chuyên đề nghiên cứu sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh. [12]. Trương Phước Thiên Hồng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ các loại đất khác nhau thuộc khu vực Miền Đơng Nam Bộ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 [13]. Tơ Duy Khương (2004), Khảo sát sự sinh tổng hợp chitinase ở Trichoderma spp và khả năng đối kháng với một số nấm gây bệnh thực vật. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh. [14]. Nguyễn Đức Lượng (2004), Cơng nghệ vi sinh (tập 2). NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [15]. Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết (2006), Thí nghiệm cơng nghệ sinh học (tập 2- thí nghiệm vi sinh vật học). NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [16]. Nguyễn Đức Lượng và các tác giả (2004), Cơng nghệ enzym. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [17]. Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên mơi trường lên men bán rắn. Luận văn Thạc sĩ sinh học, Trường Đại Học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh. [18]. Trần Thị Thanh (2000), Cơng nghệ vi sinh. NXB Giáo dục. [19]. Đặng Trung Thành (2008), Bước đầu nghiên cứu thu nhận enzym chitinase trong cây khoai lang (Ipomoea batatas) tại Khánh Hịa. Tạp chí Khoa học – Cơng nghệ Thủy sản – số 03/2008. [20]. Đồng Thị Thanh Thu (2008), Sinh hĩa ứng dụng. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. [21]. Trần Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng, (1990-1995). Kết quả nghiên cứu bước đầu về nấm Trichoderma, Tuyển tập các cơng trình nghiên cứu bảo vệ thực vật, tr 202- 210. [22]. Trần Thanh Thủy (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học. NXB Giáo dục. [23]. Lê Ngọc Tú và các tác giả khác (1982), Enzym vi sinh vật (tập 1, tập 2). NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [24]. Nguyễn Văn Tuân (2009), Tuyển chọn, nuơi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp Endo-β-1,4-Glucanase và đánh giá tính chất lý hĩa của Endo-β-1,4-Glucanase. Luận văn Thạc sĩ khoa học Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Thái Nguyên. [25]. Nguyễn Minh Tuyển (2004), Quy hoạch thực nghiệm. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh [26]. A. Kapat, T. Panda, S.K. Rakshit (1996), Parameters optimization of chitin hydrolysis by Trichoderma harzianum chitinase under assay conditions. Bioprocess Engineering 14, p.275-279. [27]. A. A. Shubakov and P. S. Kucheryavykh (2004), Chitinolytic Activity of Filamentous Fungi. Applied Biochemistry and Microbiology Vol. 40 No. 5, p.445-447. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 [28]. Azaliza Safarida Wasli, madihah Md. Salleh, Suraini Abd-Aziz, Osman Hassan and Nor Muhammad Mahadi (2009), Medium Optimization for Chitinase Production from Trichoderma virens using Central Composite Design. Biotechnology and Bioprocess Engineering Vol. 14, No 6, p. 781-787. [29]. Brinda Mahadevan and Don L. Crawford (1997), Properties of the chitinase of the antifugal biocontrol agent Streptomyces lydicus WYEC108. Enzyme and Microbial Technology 20, p.489-493. [30]. Crispinus A. Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride. The Journal of Genaral anh Applied Microbiology Vol 47 No 2, p.53-61. [31]. Daizo Koga (2005), Application of Chitinase in Agriculture. Journal of Metals, Materials anh Minerals Vol. 15 No. 1, p.33-36. [32]. Jennifer L. Guthrie, Sagal Khalif, Alan J. Castle (2005), An improved method for detection anh quantification of chitinase activities. Canadian Journal of Microbiology Vol. 51 Iss. 6, p.491-495. [33]. Maria Swiontek-Brzezinska, Elzbieta Lalke-Porczyk, Wojciech Donderski (2007), Chitinolytic activity of bacteria and fungi isolated from shrimp exoskeletons. International Journal of Oceanography and Hydrobiology Vol. XXXVI, No.3, p.101-111. [34]. Neetu Dahiya, Rupinder Tewari, Gurinder Singh Hoodal (2006), Biotechnological aspects of chitinolytic enzymes: a review. Applied Microbiology Biotechnology, p.773-782. [35]. N.N. Nawani, B.P. Kapadnis (2005), Optimization of chitinase production using statistics based experimental designs. Process Biochemistry 40, p.651-660. [36]. Nopakarn Rattanakit, Abhinya Plikomol, Shigekazu Yano, Mamoru Wakayama, and TakashiTachiki (2002), Ultilization of Shrimp Shellfish Waste as a Substrate for Solid-State Cultivation of Aspergillus sp. S1-13: Evaluation of a Culture Based on Chitinase Formation Which is Necessary for Chitin-Assimilation. Journal of Bioscience and Bioengineering Vol. 93, No. 6, p. 550-556. [37]. P. Arthur Felse, T. Panda (1999), Self-directing optimization of parameters for extracellular chitinase production by Trichoderma harzianum in batch mode. Process Biochemistry 34, p.563-566. [38]. Reetarani S.Patil, Vandana ghormade, mukund V. Deshpande (1999), chitinolitic enzymes an exploration. [39]. Sahai and Manocha, (1993), Chitinase of fungi and plants their in morphogenesis and host parasite interattion. FEMS microbiol rev 11, p 317-338. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 [40]. S.M. Akhir, S. Abd-Aziz, M.M. Salleh, R.A. Rahman, R.M. Ilias and M.A. Hassan (2009), Medium Optimisation of Chitinase Enzyme Production from Shrimp Waste Using Bacillus licheniformis TH-1 by Responnse Surface Methods. Biotechnology 8 (1), p. 120-1205. [41]. Takuya Koseki, Shinji Furuse, Kimio Iwano, Hiroshi Sakai and Hiroshi Matsuzawa (1997), An Aspergillus awamori acetylesterase: purification of the enzym, and cloning and sequencing of the gene.Bio chem. J. 326, p.485-490. [42]. Zofia Olempska-Beer (2008), Asparaginase from Aspergillus niger expressed in A. Niger. Chemical and Technical Assessment. Internet [43]. www.coe.drexel.edu/.../researchfocus.html [44]. [45]. [46]. [47]. [48]. . [49]. [50]. [51]. [52]. [53]. [54]. [55]. [56]. [57]. [58]. [59]. [60]. [61]. [62]. [63]. [64]. [65]. Luận văn thạc sĩ Cao học K18 [66]. [67]. [68]. [69]. center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.1. PHỤ LỤC 1.2. PHỤ LỤC 1 - LẬP ĐƯỜNG CHUẨN GLUCOSAMINE Bảng P.1. Đường chuẩn Glucosamine cĩ nồng độ từ 0-70µg/ml Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ Glucosamine (µg/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 OD535nm 0,115 0,148 0,165 0,216 0,561 0,297 0,325 0,340 ∆OD 0,000 0,033 0,054 0,101 0,146 0,182 0,210 0,225 1.3. 1.4. y = 0.0344x - 0.0359 R2 = 0.9873 0.00 0.10 0.20 0.30 0 10 20 30 40 50 60 70 Nồng độ Glucosamine (micromol/ml) D el ta O D <5 35 nm > Đồ THị P.1-ĐƯờNG CHUẩN GLUCOSAMINE BIểU DIễN MốI TƯƠNG QUAN GIữA ∆OD VÀ HÀM LƯợNG GLUCOSAMINE Luận văn thạc sĩ Cao học K18 1.5. PHỤ LỤC 2 - THU NHẬN CHITIN TỪ VỎ TƠM Khối lượng vỏ tơm ban đầu là 100 gam, xay nhỏ và tiến hành thu nhận chitin theo các bước ở 2.4.5. Cân khối lượng chitin, xác định tỉ lệ chitin cĩ trong vỏ tơm. Bảng P.2- Khối lượng chitin thu được từ vỏ tơm Số lần thí nghiệm Khối lượng chitin thu được (g/100g nguyên liệu) 1 18,65 2 19,25 2 18,95 Trung bình 18,95 Hình P.2. Chitin từ vỏ tơm  Nhận xét kết quả Khối lượng chitin thu được là 18,95/100 g vỏ tơm, tỷ lệ này cĩ thể thấp hơn thực tế (khoảng 30%) do kỹ thuật tách chiết cịn