Luận văn Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH PHAN THANH PHƯƠNG KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH KHÁNG SINH CỦA CÁC CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN HUYỆN CẦN GIỜ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Chuyên ngành : Vi sinh vật Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. TRẦN THỊ THANH TS. TRẦN THANH THỦY Thành phố Hồ Chí Minh – 2007 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Trong suốt quá trình phát triển của nhân loại, loài người luôn phải đấu tranh vượt qua mọi trở ngại, thách thức khác nhau. Bệnh tật chính là một trong số các trở ngại đó và rất nhiều bệnh có nguyên nhân do vi sinh vật (VSV) gây ra. Từ rất xa xưa trong lịch sử, bằng con đường tìm tòi, khám phá và tích lũy kinh nghiệm thực tiễn, con người đã phát hiện và ứng dụng hiệu quả nhiều nguồn dược liệu vào mục đích điều trị y học. Với sự phát triển của VSV học, với bước ngoặt lịch sử là phát minh vĩ đại của Alexander Fleming (1928) đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra chất kháng sinh và ứng dụng chất kháng sinh vào điều trị cho con người. Chất kháng sinh (CKS) không những trở thành thần dược cứu sống con người mà còn được ứng dụng rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm và bảo vệ môi trường. Để phòng chống nấm hại cây trồng , trong nền nông nghiệp hiện đại, người ta càng sử dụng nhiều CKS có nguồn gốc VSV để thay thế dần các hóa chất đã sử dụng vốn rất độc đối với con người và môi trường. Vì vậy, việc thay thế thuốc trừ sâu hóa học bằng các chế phẩm sinh học là một giải pháp an toàn và hiệu quả, khắc phục được nhược điểm của nông dược trong bảo vệ thực vật và sức khỏe cộng đồng. Ở nước ta cũng như các nước đang phát triển việc lạm dụng thuốc KS, việc các VK gây bệnh ở người đang kháng nhiều loại KS thông thường, ngày càng xuất hiện nhiều chủng VSV kháng thuốc nên việc điều trị bằng kháng sinh trở nên rất khó khăn cho các thầy thuốc lâm sàng.Việc tìm kiếm CKS mới nhất là các CKS có nguồn gốc từ thiên nhiên, do các VSV tiết ra chống lại các VSV gây bệnh đã lờn thuốc đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, đó là một việc làm vô cùng cấp thiết và quan trọng. Trong quá trình tìm kiếm ấy con ngươi luôn quan tâm đến nhóm VSV sinh CKS ở các hệ sinh thái đặc biệt, trong đó có nấm sợi RNM. Các nhà khoa học tin rằng với môi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của chúng cũng khác hơn so với với các sinh vật trên đất liền. Vì vậy các sản phẩm trao đổi chất có tính chất khác lạ, trong đó sẽ có các CKS mới. Tuy nhiên sự hiểu biết về VSV ở RNM còn rất hạn chế và là lãnh vực còn bỏ ngỏ. Nấm sợi là một đại diện quan trọng của hệ VSV RNM. Tìm hiểu về nấm sợi có khả năng sinh KS, vai trò của chúng trong hệ sinh thái RNM là việc làm rất cần thiết. Đặc biệt đối với nấm sợi sinh KS thì việc nghiên cứu tìm ra chất kháng sinh mới đang là đề tài hấp dẫn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học thuộc các lãnh vực khác nhau vì chất kháng sinh đã vuợt ra khỏi phạm vi y học. So với y học việc sử dụng chất kháng sinh sinh ra từ nấm sợi trong bảo vệ thực vật, bảo quản thực phẩm..v..v.. còn hạn chế. Để góp phần nghiên cứu, tìm hiểu về giá trị tài nguyên từ nấm sợi ở RNM và tiềm năng của chúng trong thực tiễn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh”. 2. Lược sử vấn đề nghiên cứu - Chưa có tác giả nào nghiên cứu "Nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ TPHCM có khả năng sinh kháng sinh". - Có một số đề tài nghiên cứu có liên quan về nấm sợi ở RNM như: + “ Tổng kết kết quả nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của nhóm nấm sợi phân lập từ một số RNM ở hai tỉnh Nam Định và Thái Bình” của tác giả Mai Thị Hằng (2002) + “ Khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm sợi phân lập từ một số khu RNM Nam Định và Thái Bình” của tác giả Mai Thị Hằng, Lê Thanh Huyền (2002). +“ Khảo sát khả năng ký sinh gây bệnh côn trùng và tiềm năng kiểm soát sinh học của nấm RNM Nam Định của tác giả Mai Thị Hằng, Nguyễn Vĩnh Hà (2002). 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh kháng sinh có thể sử dụng vào ức chế VSV gây bệnh ở người, cây trồng. 4. Đối tượng nghiên cứu - Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM huyện Cần giờ có hoạt tính kháng sinh. - Các VSV kiểm định nhận từ viện Pasteur, Viện khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Miền Nam, khoa Nông học Đại học Nông Lâm TPHCM, khoa xét nghiệm Bệnh viện Bình Dân. - Sâu tơ nhận từ công ty Vipesco; tằm nhận từ công ty Dâu tằm tơ, Bảo lộc. 5. Phạm vi nghiên cứu Các chủng nấm sợi sinh kháng sinh có nguồn gốc từ RNM. 6. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng kháng sinh từ RNM huyện Cần Giờ. - Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản của các chủng nấm sợi tuyển chọn (đặc điểm sinh học và phân loại) - Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn trong phòng và chống bệnh, sâu hại cho cây trồng 7. Phương pháp nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi bằng phương pháp vi sinh. - Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản, phân loại các chủng nấm sợi bằng phương pháp hóa sinh. - Xử lý số liệu thu thập bằng phương pháp sử dụng toán học thống kê đơn giản. 8. Dự kiến cấu trúc luận văn Gồm: - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu. - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. - Chương 3: Kết quả và bàn luận. - Kết luận và kiến nghị. Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 5 năm 2006 đến tháng 7 năm 2007. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nấm sợi và khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi 1.1.1. Đặc điểm của nấm sợi [6]. Nấm sợi là những vi sinh vật có nhân chuẩn thuộc nhóm vi nấm, được phân bố khắp nơi như đất, nước, không khí, sản phẩm từ sinh vật, bản thân các sinh vật kể cả con người. Nấm sợi sống kí sinh ở động, thực vật hoặc hoại sinh trên chất hữu cơ từ xác động, thực vật, chúng là loài hô hấp hiếu khí bắt buộc, không chứa diệp lục tố, không có khả năng quang hợp [13]. Nấm sợi là VSV ưa mát (Psychrotroph), có nhiệt độ tối ưu khoảng 250C, nhưng cũng có thể thích nghi với 00C. Nấm sợi sống trong môi trường có pH hơi axít đến trung tính (pH 3- 6). Mặc dù sự sinh trưởng của nấm sợi không cần ánh sáng nhưng ánh sáng lại có tác dụng hình thành bào tử, tổng hợp sắc tố [8]. 1.1.1.1. Hình tháí, cấu tạo [54]. Nấm sợi có cấu tạo sợi, phân nhánh hoặc không phân nhánh, có vách ngăn ngang hoặc không có vách ngăn ngang. Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể lưu động. Về chiều dài chúng có sự sinh trưởng vô hạn (nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1- 30µm thông thường là 5-10 µm). Sợi nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn, vừa dài ra không ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một môi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm, sau 3-5 ngày có thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Tùy theo môi trường cơ chất mà hệ sợi nấm sẽ phát triển thành các dạng khác nhau. Vào giai đoạn cuối của sự phát triển, khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hiện tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao nhưng lại ít gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp. Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm. Hình 1.1.Sự phát triển của hệ sợi nấm [55]. Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc. Hình 1.3. Các loại sợi nấm [54] Hình 1.3. Các loại sợi nấm [54]. Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoăn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng có tác dụng tiết xuất các chất nào đó. Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen, hạt volutin, các giọt mỡ [51]. Nấm sợi chỉ mọc tốt trong môi trường có nhiều không khí, vì thế chúng phát triển trên bề mặt cơ chất (khuẩn ty khí sinh) tạo thành lớp hình sợi, lớp mạng nhện hay lớp sợi bông. Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút chất dinh dưỡng (khuẩn ty cơ chất). Bên trong khuẩn ty có một nhân, hai nhân hay nhiều nhân [9]. Vách ngăn Thành TB Sợi nấm có vách ngăn Sợi nấm không vách ngăn Nhân Nhân TBC TBC Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm, sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường có màu nên cả khuẩn lạc thường có màu [54]. Nấm sợi có cấu tạo của một tế bào có nhân thực, gồm ba thành phần cơ bản của cơ thể sống: thành tế bào, nguyên sinh chất, nhân. Màng tế bào có cấu tạo bởi cellulose hoặc các chất gần giống cellulose. Màng có cấu trúc đặc trưng từng loài. Không có diệp lục nên nấm sợi không có khả năng quang hợp. Trong tế bào nấm còn có các cơ quan như ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), thể ribôxôm (ribosome), bào nang (vesicle), thể Golgi sinh (Golgi body, Golgi apparatus, dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể Vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitôxôm đường kính 40 -70nm (chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5- 8 nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome). Hình 1.4. Cấu trúc sợi nấm [54]. Không bào Sợi nấm Vùng kéo dài Thể Golgi Màng Tế bào Thành Tế bào A. Nucleic Ti thể Màng nhân 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa. Nấm sợi là những sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, thuộc loại hoại sinh. Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau nấm sợi thường có những nhu cầu không giống nhau về các nguồn thức ăn cacbon. Chúng có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat, amino acid đến amonia. Sự thích hợp của một nguồn gốc thức ăn cacbon nào đó có thể được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác nhau như mức độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa số lượng bào tử, mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hóa. Sự sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm thường không phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất. Hầu hết các loại nấm sợi có thể đồng hóa trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ đường...[12]. Các loài nấm sợi khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn nitơ, chúng sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ lẫn vô cơ. Nhiều loài nấm sợi (thuộc các chi Aspergillus, Penicillium) có khả năng khử nitrat hóa. Một số loài như Aspergillus flavus, Trichoderma lignorum, Myrothecium verrucaria….. có khả năng đồng hóa trực tiếp nitơ phân tử [12]. Các nguyên tố vi lượng có liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh học trong tế bào nấm sợi. Các loại nấm sợi có quan hệ rất khác đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng. Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm sợi có thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống [12]. Ngoài các chất dinh dưỡng nấm sợi cũng như tất cả các sinh vật khác còn có nhu cầu về nước cho các họat động sinh lý, sinh hóa của tế bào. Liên quan đến lượng nước còn có độ ẩm. Các yếu tố này ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng (độ ẩm không khí không thấp hơn 60 %). Khả năng hấp thụ hay thoát nước của nấm đều liên quan với nhiệt độ môi trường, khoảng từ 15- 300C, tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 300C, tùy loài [12]. Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi rõ rệt là pH, bình thường chúng tăng trưởng ở pH = 6. Môi trường kiềm hoặc acid, thì nấm sợi không hoặc tăng trưởng rất yếu [12]. Riêng các loài Trichoderma thường xuất hiện ở đất ưa axít, phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và chúng có thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu ở đó có một lượng lớn CO2 và bicacbonat [22]. 1.1.1.3. Phương thức sinh sản. Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử mọc ra từ sợi nấm và sau đó là hệ sợi nấm. Bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính. Chúng khác nhau về hình dạng và cách phát sinh. * Sinh sản vô tính: Có 3 loại bào tử vô tính: + Bào tử động (zoospores) + Bào tử kín (sporangiospore) + Bào tử trần (conidi): loại bào tử phát sinh bằng con đường ngoại sinh hay nội sinh, khi chín được giải phóng ra ngoài. Bào tử trần có thể có hoặc không có vách ngăn ngang (Aspergillus spp, Penicillium spp..), có một vách ngăn ngang (Trichothecium spp…) có từ hai vách ngăn trở lên (Fusarium spp..), có vách ngăn ngang lẫn vách ngăn dọc xen kẽ hay nối tiếp nhau (Alternaria spp…) Hình dạng bào tử hình trứng, cầu, hạt chanh [51]. * Sinh sản sinh dưỡng: sinh sản bằng khuẩn ty hoặc bằng hạch nấm, đây cũng là hình thức sinh sản vô tính. * Sinh sản hữu tính: + Phương pháp đẳng giao, dị giao, noãn giao. + Bào tử tiếp hợp (zygospores) + Bào tử túi (ascospores) + Bào tử đảm (basidiosppores) Phương thức sống của nấm sợi: dị dưỡng, phần lớn hoại sinh, một số sống ký sinh trên người, động thực vật, còn một số khác thì sống cộng sinh. Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [54]. a b Hình 1.6. Dạng bào tử kín Hình 1.7. Dạng bào tử trần của nấm sợi.(a-b) 1.1.1.4. Phân loại nấm sợi. Vi nấm là thuật ngữ dùng để chỉ tất cả các loại nấm hiển vi (nấm men và nấm sợi) không sinh quả thể lớn (mũ nấm).Việc phân loại vi nấm nói chung và nấm sợi nói riêng vẫn đang ở thời kì phân loại học hình thái dựa vào các đặc điểm hình thái nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý sinh hóa và phương thức sinh sản. Các phương pháp sinh hóa và sinh học phân tử được sử dụng ít trong phân loại vi nấm. Nhà nấm học Italia P. A. Saccardo (1845-1920) đã chỉnh lý các nghiên cứu về nấm và biên soạn bằng tiếng La Tinh 25 tập Kỷ yếu nấm. Các thành tựu nghiên cứu đã được tổng kết khá đầy đủ trong 5 tập sách Giới nấm (The Fungi) của G. C. Ainsworth và cộng sự (Vol 1, 2.3.4A.4B. New York and London: Academic Press, 1963-1973). Năm 1995 đã tái bản lần thứ 8 cuốn Từ điển về nấm (Dictionary of the Fungi) của Ainsworth và Bisby. Nấm được chia thành 4 ngành (Division, Phylum): - Ngành Chytridiomycota - Ngành Zygomycota - Ngành Ascomycota - Ngành Basidiomycota. Các loài nấm không tìm thấy (đúng ra là chưa tìm thấy) dạng sinh sản hữu tính được xếp chung vào nhóm Nấm bất toàn – Fungi imperfecti. Theo hệ thống phân loại của Saccardo (1880,1886) thì các nấm này được xếp thành một lớp- Lớp Deuteromycetes. Khi phát hiện thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì người ta đổi tên loài và xếp sang các lớp khác. Ví dụ nấm lúa von trước kia được gọi là Fusarium moniliforme, nhưng sau khi tìm thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì lại chuyển thành loài Gibberella fujikuroi. Các Nấm bất toàn hiện được xếp trong các nhóm conidial Ascomycetes hay conidial Basidiomycetes. Nấm bất toàn (Deuteromycota), nấm đảm (Basidiomycetes), nấm túi (Ascomycetes) được xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J.Carlile et al, 2001). Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm.[55] Khóa phân loại đến lớp (Robert A.Samson, 1984) : 1. Lớp nấm túi (Ascomycetses): bào tử sinh ra trong túi bào tử. 2. Lớp nấm tiếp hợp (Zygomycetes) bào tử kín sinh ra trong các nang bào tử kín, hệ sợi không có hoặc có ít vách ngăn. 3. Lớp nấm bất toàn (Deuteromycetes) : sợi nấm có vách ngăn, bào tử trần. Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm: - Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá). - Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata [16]. - Nhóm Agonomycetes : gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. 4. Lớp nấm đảm (Bacidiomycetes) : sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính số ít bằng bào tử trần, chủ yếu bằng bào tử đảm [54]. Người ta cho rằng trong tự nhiên có khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu loài nấm nhưng mới định tên được khoảng 10 000 chi và 70 000 loài, Trung Quốc đã điều tra được 40 000 loài. Riêng các loài nấm thuộc Nấm bất toàn ở nước ta hiện mới chỉ phát hiện được 338 loài thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc Trung tâm Công nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội hiện đang hợp tác với Viện NITE (Nhật Bản) điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm ở Việt Nam và có nhiều khả năng tìm thấy những loài mới trong quá trình nghiên cứu [54]. Hiện tồn tại nhiều hệ thống phân loại nấm không thống nhất với nhau, có nhiều khóa phân loại đã được sử dụng như: Saccardo P A (1880- 1886), Barron G.L (1968) Barnett H.L và cộng tác viên (1972), Ainsworth G C (1973), V.Arx (1981), Bùi Xuân Đồng (1984), Alexopoulos & Mins (1996), Nguyễn Lân Dũng (2000), Đặng Hồng Miên (1999), Nguyễn Đức Lượng (2003), Persoon ex Gray (1801). Sự phân loại vi nấm đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic clasifications) và đã bắt đầu dựa vào sự phát triển của sinh học phân tử. Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khóa phân loại: Nguyễn Lân Dũng (2000)(trong tài liệu này có khóa phân loại của Saccardo P A (cải tiến), Barnett H.L và cộng tác viên (1972)), Bùi Xuân Đồng (1984), Nguyễn Đức Lượng (2003), Đặng Hồng Miên (1999). 1.1.2. Chất kháng sinh từ nấm sợi. 1.1.2.1. Những đặc điểm cơ bản về chất kháng sinh. * Chất kháng sinh được hiểu là chất hóa học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến nhất là từ vi sinh vật) với đặc tính là ở ngay nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc các vi sinh vật gây bệnh hay các tế bào ung thư (ở nồng độ thấp: 10-3- 10-2 / g /ml) mà vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị [4]. * Có giả thiết cho rằng chất kháng sinh là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên hoặc cạnh tranh môi trường dinh dưỡng. Cũng có giả thiết lại cho rằng chất kháng sinh chỉ là sản phẩm thải trong quá trình trao đổi chất của tế bào[5]. Thường các CKS không có chức năng rõ rệt đối với tế bào sản sinh ra chúng. Sự mất khả năng hình thành CKS không làm mất khả năng sinh trưởng. * Bản chất của chất kháng sinh : CKS là nhóm chất rất đa dạng về mặt hóa học, trọng lượng phân tử biến động trong khoảng 150 - 5000 Dalton. Trong một số kháng sinh chỉ chứa cacbon (C), hiđrô (H) hoặc thường chứa C, H, O, N, một số khác còn có S, P, halogen. Trong phân tử kháng sinh thường chứa các nhóm chức như: hydroxyl (-OH), cacboxyl (-COOH), cacbonyl (-CO), các nhóm định chức chứa nitơ..đồng thời có cấu trúc đặc trưng của chất hữu cơ (mạch béo, vòng béo, vòng thơm, polipeptit, dị vòng cacbonhydrat..). Cho đến nay, CKS đều ở thể rắn, có cấu tạo hóa học rất khác nhau [41], gồm các nhóm sau:  Nhóm - lactam: chứa hệ thống vòng - lactam, dị vòng phức tạp. Như Penicillin, Monolactam, Cephalosporin và hàng loạt nấm khác cũng sản sinh ra CKS chứa hệ thống vòng này.  Nhóm aminoglucoside: chứa nhiều các đường amin nối với các đường amin khác bởi liên kết glucoside, như streptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin..  Nhóm teracylin: có cấu tạo hóa học vòng naphthalen, gồm clotetraxyclin, oxytetraxyclin, tetraxyclin..có phổ kháng khuẩn lớn.  Nhóm macrolit: chứa vòng laton lớn nối với aminosacaroza và nhóm polyen, tiểu biểu là erythromycin.  Nhóm polipeptit: có cấu tạo gồm các axít amin [41]. * Tùy theo mục đích và phương pháp nghiên cứu, các nhà nghiên cứu đã phân loại CKS theo nguyên tắc sau: - Phân loại theo nguồn gốc sinh học của chủng sinh ra chất kháng sinh. - Phân loại theo phổ kháng sinh. - Phân loại theo cơ chế tác dụng hay cơ chế sinh tổng hợp ra CKS đó. - Phân loại theo cấu tạo hóa học. * Cơ chế tác động của kháng sinh lên vi sinh vật [54]. Cơ chế tác động của CKS phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng độ chế phẩm, cấu trúc hiển vi của tế bào VSV và điều kiện biểu hiện của chúng. Khác với các chất độc, CKS có tác dụng đặc hiệu, tính đặc hiệu đó gắn kiền với cơ chế tác động. Cơ chế tác động của CKS có thể được chia thành các nhóm cơ bản sau: - Ức chế quá trình tổng hợp của thành tế bào (vỏ) của vi khuẩn. Các nhóm KS gồm có penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá trình tổng hợp thành tế bào nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp xuất thẩm thấu. - Ức chế chức năng họat động của màng tế bào. Các nhóm kháng sinh gồm có: colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion bị thoát ra ngoài. - Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. CKS thuộc nhóm này gồm nhiều chất như streptomyxin, erythromixin, tetraxilin, cloramphenicol... gây cản trở tổng hợp prôtêin. Tác động của một số loại CKS này như sau: Nhóm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác. Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Nhóm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. - Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic. Các CKS có thể gắn vào axít nuclêic (AND, ARN) tạo thành phức phân tử bất hoạt, ngăn cản sự sao chép của các axít này. Nhóm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thông tin) . Nhóm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA -gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA không thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đôi của DNA. Nhóm sulfamide có cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nuclêic [54]. CKS nhóm này thì rất độc không những đối với VSV mà còn độc cho người và các VSV khác [11]. 1.1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh. Trong quá trình sống, cơ thể vi sinh vật thường xuyên trao đổi chất với môi trường ngoài tạo ra các sản phẩm trao đổi chất khác nhau. - Sản phẩm trao đổi chất sơ cấp là những sản phẩm cần thiết cho sự sống của tế bào, chúng là những vật chất tham gia xây dựng tế bào như các axít amin, vitamin, nuclêôtic. - Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp là những sản phẩm về mặt hóa học là những hợp chất có cấu tạo cực kỳ phức tạp, chúng không có chức năng rõ ràng trong trao đổi chất của tế bào như chất kháng sinh, giberelin, độc tố nấm, các polysacarit. * Quá trình tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố trong đó có thành phần môi trường (nguồn cacbon, nitơ, nguyên tố vi lượng, phương pháp nuôi cấy, tuổi giống, độ thông khí…) và điều kiện nuôi cấy. Vì vậy khi nuôi cấy chúng ta tìm điều kiện tối ưu cho các yếu tố trên để hiệu suất tổng hợp chất kháng sinh cao nhất. - Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc của nguồn thức ăn. Tùy thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp như các loại đường đơn như glucose, manitol, các loại đường kép như saccarose, lactose, cũng có thể là các loại đường đa như tinh bột hoặc các chất có thành phần không xác định như rỉ đường….Có nhiều chủng nấm sợi có hoạt tính cellulaza cao nên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là CMC [11]. - Nguồn nitơ và nồng độ ni tơ trong môi trường nuôi cấy cũng ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ chuyển hóa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh. Quá trình sinh tổng hợp CKS ở nấm sợi thường cần cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ trong môi trường. - Vai trò của phốt phát vô cơ cũng là một trong những yếu tố điều chỉnh sự tổng hợp CKS. Nồng độ phốt phát thích hợp cho sinh tổng hợp CKS không quá 10mg/ml. Nồng độ phốt phát ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axít nuclêic trong tế bào, làm kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS. Ngoài ra sự dư thừa phốtphát cũng ức chế tổng hợp các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp CKS. - Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường nằm trong khoảng từ 28- 30 0C. Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc đáng kể vào pH môi trường, pH thích hợp cho việc tổng hợp CKS là trung tính, môi trường hơi ngả về axít, pH axít hay kiềm đều ức chế quá trình tổng hợp CKS. - Ngoài ra chất lượng bào tử của giống, tuổi, khả năng đồng đều về mặt di truyền, hoạt tính trao đổi chất cũng ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp CKS 1.1.2.3. Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi. Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Bệnh truyền nhiễm trước đây trong một thời gian dài đã là mối đe dọa rất lớn đối với con người và các VSV khác. Do vậy việc tìm kiếm thuốc chữa bệnh cho con người, từ lâu đã là mơ ước của nhiều nhà khoa học nói riêng và của nhân loại nói chung. Và đã có nhiều CKS đã được phát hiện từ nấm sợi như: - Penicillin: Chất kháng sinh penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928, trong khi làm vệ sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp pêtri nuôi Staphylococcus bị niễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện hiện tượng vòng vô khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm. Khi ông cấy nấm mốc trên thử nghiệm lại trên một số loài vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiện tượng tương tự xảy ra. Từ đó ông kết luận là nấm mốc đã tiết ra môi trường một chất nhất định làm tan vi khuẩn và ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh này (1929). Công trình khoa học của Fleming ngay lập tức thu hút được sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới, trong đó có các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931). Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nổ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên [4]. Mãi đến năm 1945 , ông mới được nhận giải thưởng Nobel. Năm 1938, ở Oxford, Ernst Boris Chain và Norman Heatley đưa Penicillium vào sản xuất thử. Và chỉ sau hai năm đã tinh chế một lượng lớn penicillin, đủ để thử nghiệm trên chuột thí ngiệm và kết quả điều trị đã thành công mỹ mãn, ngày 25/05/1940 [26]. Năm 1940, Dorothy Hodgkin xác định được cấu trúc phân tử của Penicillium [26]. Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium chrysogesrum có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium notatum tìm ra trước đó. Năm 1946 – 1950, hàng loạt chất kháng sinh đã được phát hiện, hàng loạt nhà máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủ yếu là Penicillin, khẳng định giá trị to lớn của Penicillin sử dụng trong chữa bệnh. Kể từ đó một kỷ nguyên mới trong y học- kỷ nguyên chất kháng sinh ra đời. Tiếp theo Penicillin hàng loạt chất kháng sinh đã được tìm kiếm và phát hiện. -Cephalosporin: Năm 1948, Brotzu chiết từ chủng nấm mốc thuộc giống Cephalosporium sp có khả năng chống được cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-) đặc biệt là Vibriocholerac. Ngày nay người ta phát hiện nhiều loài nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn khác nhau có khả năng tổng hợp cephalosporin[2]. Tuy nhiên hoạt tính của Cephalosporin thì kém hơn hoạt tính của Penicillin. - Griseofulvin: Năm 1959, Oxford và đồng sự phát hiện do chiết được từ một số loài nấm mốc thuộc giống Penicilium (Pen.urticae, Pen.nigricans, Pen.raistrichi..). Griseofulvin không có hoạt tính chống vi khuẩn nhưng có khả năng chống nấm khá mạnh nên dùng để chữa bệnh nấm cho người và gia súc. Năm 1959, các nhà khoa học Anh, Mỹ đã tách được vòng penicillin, mở đầu cho hàng loạt các loại kháng sinh tổng hợp [26]. Năm 1960, người ta đã bắt đầu tổng hợp được Griseofulvin bằng con đường nhân tạo. - Kháng sinh được chiết suất từ nấm sợi như Citrinin (P.citrinum), Fumagilin (A.fumigatus), Nidulin (A.nidulans), Humicolin (A.humicola), Viridin (T.viride)… Có nhiều công trình nghiên cứu Trichoderma, đã xác định nó có khả năng chữa bệnh. Trong đó chú ý nhiều là loài Trichoderma viride, phân tán khắp nơi trong đất. - Glytoxin là chất kháng sinh từ giống Trichoderma viride, ngoài ra người ta còn phát hiện ở Aspergillus fumgitus, một vài loài penicilium. Glytoxin không bền vững và bị phân hủy nhanh trong ánh sáng. Phổ kháng sinh của nó chống các vi khuẩn gram dương và các nấm gây bệnh. Trong kết quả thực nghiệm glytoxin không thể hiện hiệu quả chống nhiễm trùng lao của chuột, không ngăn cản sự phát triển của u ác tính. Hoạt tính kháng sinh của glytoxin liên quan với sự có mặt trong phân tử là nhóm chứa lưu huỳnh. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hổ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã tạo điều kiện thuận lợi cho lãnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao. Các phương pháp hiện đại về kỹ thuật di truyền, công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần đã nâng cao khả năng sinh tổng hợp CKS trong thời gian ngắn. Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như AND tái tổ hợp, kỹ thuật tách dòng gen và biểu thị sự tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những đem lại kết quả to lớn trong việc phát triển chủng, giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các chất kháng sinh. Kỹ thuật enzym bất động được coi là một trong những phương hướng nghiên cứu, sản xuất CKS trong những năm cuối thế kỉ 20 và đầu thế kỉ 21. Ngày nay, tuy đã có hàng ngàn CKS mới được phát hiện nhưng các nhà nghiên cứu trên thế giới vẫn đang chạy đua trong việc tìm tòi và tổng hợp CKS mới, đặc biệt là CKS chống virút và chống ung thư. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và sản xuất CKS bắt đầu từ năm 1949 do giáo sư bác sĩ Đặng Văn Ngữ tiến hành với các chủng Penicillium và thu được dịch lọc penicillin (sử dụng trong điều trị vết thương cho các bệnh binh). Sau kháng chiến 9 năm, công trình được tiếp tục nghiên cứu ở trường ĐH Y Dược, Hà Nội. Cho đến nay nghiên cứu CKS đã được quan tâm của nhiều nhà khoa học đầu ngành, thuộc viện Công nghệ sinh học – Trung tâm khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, trường Đai học khoa học tự nhiên. Trường Đai học Sư Phạm I Hà Nội đã có nhiều công trình nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng, Nguyễn Thành Đạt về nấm sợi và vai trò đối kháng của chúng trong hệ sinh thái RNM. Tác giả Vũ Thị Đoan Chính là người đầu tiên ở Việt Nam đã sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần để nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh. Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng những nghiên cứu về CKS của chúng ta còn hạn chế so với thế giới. 1.1.2.4. Lược sử quá trình nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi ở rừng ngập mặn. Nấm trên đất liền đã được hệ thống hóa từ lâu, nhưng sự nghiên cứu về nấm ở rừng ngập mặn mới chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ những năm 1950 và ban đầu rất ít. Cho đến nay các nhà nghiên cứu nấm đã thành lập hội nghiên cứu nấm toàn cầu trong đó có các nấm ở rừng ngập mặn. Người ta nhận ra rằng sinh cảnh rừng ngập mặn là môi trường lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nhất là nấm sợi. - 1955-1956 hai loài nấm đầu tiên được phát hiện ở rừng ngập mặn: Phialophloraphoma litoralis Linder (ngành phụ Deuteromycotina) và Gnomonia longiostris Cribb (ngành phụ Ascomycotina) từ thân cây Avicennia marina var.resinifera do Cribb và cộng tác viên phân lập và phân loại [16]. - 1971- 1975 Jones và Hughes đã xuất bản tài liệu về phương pháp nghiên cứu nấm biển[46]. - Năm 1979 Kohlmeyer và cộng tác viên đã đưa ra danh sách 42 loài vi nấm rừng ngập mặn, trong đó có 23 loài thuộc ngành phụ Ascomycotina, 17 loài thuộc ngành phụ Deuteromycotia và 2 loài thuộc ngành phụ Basidiomycotina [46]. - Năm 1987, Hyde và cộng tác viên công bố phát hiện 89 loài nấm từ cây Rhizophora mucronata lanak (Ấn độ) có gần 300 chủng nấm từ lá cây, chủ yếu là nấm ký sinh. - Năm 1988, Subramanian tìm ra 55 giống nấm sợi kí sinh trên lá R.apiculata và R.mucrolata [46]. - Năm 1994, Newell S.Y, đã phân lập được các loài nấm nhày (lớp Oomycetes) ưa mặn, có khả năng phân hủy mạnh xác thực vật ở rừng ngập mặn. - Năm 1997, Tadayoshi và cộng tác viên, đã tìm thấy nấm sợi thuộc chi Trichoderma (ở thân cây), Oomycetes (có nhiều ở lá rụng) [16]. Hầu hết các nhà nghiên cứu dừng lại ở sự phân lập, phân loại và sự phân bố của chúng ở trong các rừng ngập mặn ở trong các khu vực địa lý khác nhau. Với số lượng nấm được phát hiện khá nhiều nhưng các nhà nghiên cứu chưa đi sâu vào nghiên cứu vai trò của chúng trong quá trình phân hủy xác thực vật. Một số ít nghiên cứu về sự phân bố của loài nấm phụ thuộc vào vị trí đại lý, độ màu, độ pH, vi sinh vật, độ mặn của nước biển chảy vào rừng. Các chất có hoạt tính sinh học do VSV rừng ngập mặn sinh ra đang có ít nhà khoa học nghiên cứu, chủ yếu nghiên cứu về enzym phân giải ligno- xenluloza. Trong những năm gần đây, người ta đã phát hiện ra nấm biển, nấm ở rừng ngập mặn là nguồn vi sinh vật có tiềm năng sinh kháng sinh mới chống các vi sinh vật nhờn kháng sinh, hay các tế bào gây ung thư. Ở môi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của chúng sẽ có gì đó khác hơn với con đường trao đổi chất của sinh vật đất liền. Vì vậy rất có thể có các sản phẩm trao đổi chất có tính chất gì đó hơi khác lạ, trong đó có cả chất kháng sinh mới [16]. Từ các nấm Halocyphina villosa, Kupa và cộng sự (1981) đã thu được chất kháng sinh có tên Siccayene, có hoạt tính kháng khuẩn cao. Năm 1999, từ thân cây gỗ rừng ngập mặn, Darfenner và cộng sự đã phân lập được nấm Hypoxylon croceum M 97- 25 sinh ra chất chống nấm mạnh: sordarin và hyposordarin [46]. Năm 2001, từ Zofiella marina thu được kháng sinh zofimatin có cấu trúc tương tự sordarin nhưng lại có khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gram âm và gram dương. Chất himaninide A, B, C, D có khả năng diệt vi khuẩn và nấm rất mạnh. Các lòai của chi Geronema Sing phân lập từ các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới sinh ra chất geronemins (A,B,C,D), ức chế quá trình tổng hợp các đại phân tử trong tế bào. Chất herical và dẫn xuất của nó thu được từ Hypoxylum ramosum cũng có khả năng ức chế mạnh các loại tế bào. Các chất này đang được nghiên cứu về khả năng diệt các tế bào ung thư như tế bào Hella S 3 (ung thư biểu mô, ung thư vùng cổ), tế bào L 1210 (ung thư máu), tế bào KB (ung thư miệng, vòm họng…) [16]. Các nấm sợi tồn tại trong hệ sinh thái RNM đã có tài liệu công bố về khả năng diệt côn trùng của tác giả Nguyễn Vĩnh Hà (2002) [16], chủng P.farinosus NT 33. Đây là lãnh vực còn bỏ ngỏ mà chúng ta cần nghiên cứu để làm giàu thêm bộ sưu tầm vi nấm diệt sâu hại và sử dụng chúng để kiểm soát quần thể côn trùng gây hại, ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Ngoài ra còn có các công trình nghiên cứu về vấn đề nấm sợi ở RNM của các tác giả Lê Thanh Huyền, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thị Hiên dưới sự hướng dẫn của TS Mai Thị Hằng (2002). 1.1.3. Ứng dụng của nấm sợi và các CKS từ nấm sợi. 1.1.3.1. Ứng dụng KS từ nấm sợi trong điều trị bệnh truyền nhiễm và hiện tượng lờn thuốc của vi sinh vật gây bệnh. Từ khi Penicillin được sản xuất để đưa vào điều trị, sự phát triển của kỹ nghệ kháng sinh đã giúp cho thầy thuốc những công cụ hữu hiệu trong việc kiểm soát và khống chế các bệnh nhiễm khuẩn. Việc sản xuất CKS, sử dụng CKS trong trị liệu cùng với thời gian, nhiều chế phẩm bán tổng hợp và tổng hợp ra đời. Song song với sự kiện này, con người cũng biết đến hiện tượng lờn thuốc mà bản chất là sự phát triển tính đề kháng kháng sinh của tác nhân gây bệnh. Tỉ lệ đề kháng của vi khuẩn và số thuốc bị đề kháng đang ngày càng gia tăng. Hiện nay, ngoài các vi khuẩn Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Enterococcus đã kháng thuốc [Levy, 1998], chúng ta còn phải chú ý những trường hợp nhiễm khuẩn do S. aureus kháng Methicillin thuộc nhóm Penicillins ức chế được -lactamase, và những chủng vi khuẩn đường ruột kháng các Cephalosporins phổ rộng. Ở các bệnh viện, chủng phân lập nhiều nhất từ bệnh phẩm là Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Enterobacter spp., và Staphylococcus aureus. Quá trình theo dõi mức độ đề kháng của các tác nhân trên trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hô hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhằm báo động về hiện trạng kháng thuốc ở bệnh viện và cung cấp vài thông tin có thể hữu dụng cho việc trị liệu kháng sinh [56]. * P. aeruginosa- trực khuẩn mủ xanh gây bệnh nghiêm trong ở các vết mổ, viêm niệu đạo, viêm phổi, viêm tai ở người đi bơi, màng não mủ đã đề kháng với hầu hết các lọai kháng sinh. Khi kiểm nghiệm trên bệnh nhân và trong in vitro P. aeruginosa đã đề kháng hàng lọat kháng sinh như mezlocillin, ceftazidin, netilmicin, aztreonam, mipenem, mezopenen, gentamycin, tobramycin, amikacin, ciproffloxacin, levofloxaxin và cả các kháng sinh thế hệ mới như cephalosporin, floruoquinol. Hai loại kháng sinh có thể dùng để điều trị là azlocillin và ceftazedime [60]. * S.aureus gây ngộ độc thực phẩm, gây các bệnh đường tai, mũi, họng. Điều trị nhiễm trùng do S.aureus thường dùng các penicillin kháng -lactamase như nafcillin. S.aureus có các prôtêin gắn penicillin được coi là các S.aureus kháng methicillin, thuốc được chọn trong trường hợp này là vancomycin. Vancomycin là loại thuốc độc gây nhiều phản ứng phụ cho cơ thể. Gần đây một số chủng trong loài này đã kháng cả vancomycin [56]. Candida albicans là tác nhân gây nhiều bệnh đặc biệt, đặc biệt là niêm mạc miệng, lưỡi, dạ dày, hành tá tràng, đường ruột, niệu đạo, sinh dục. Hiện nay 25 % bệnh tai mũi, họng do Candida albicans trở nên không kiểm soát nổi do đã đề kháng với các kháng sinh chống nấm hiện có như nystatin, amphotericin B, vaclotrimazole, 5-fluorocytosine. Đối với các bệnh nhân AIDS thì nhiễm Candida albicans là vấn đề nan giải nhất [16]. Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis nổi kinh hoàng của loài người từ những thế kỷ trước tưởng đã vĩnh viễn bị chặn lại từ khi phát hiện ra steptomycin. Nhưng nó đang trở lại và là nổi lo không của riêng ai, đe dọa tính mạng toàn nhân loại đặc biệt là các bệnh nhân AIDS vì M. tuberculosis đã đề kháng được nhiều loại kháng sinh hiện có. Các kháng sinh được dùng trong chữa lao hiệu quả là streptomycin, muối Para- amino của salicylic acid (PAS) và ionicotinic acid Hydrazide (INH). Tổ hợp các chất streptomycin, PAS, INH là tổ hợp chống lao hiệu quả nhất mà nhân loại có trong nhiều năm qua (từ năm 1945), nay cũng đã giảm hiệu quả. Nhờ dày công nghiên cứu, trước sự tấn công của vi trùng, các nhà bác học đã tìm ra ngày càng nhiều kháng sinh hữu hiệu hơn, tiêu diệt được nhiều loại vi trùng lờn thuốc. Tuy nhiên, một kháng sinh mới được sử dụng thì trong một thời gian ngắn thì lại có một số vi trùng coi thường. Cephalosporidines thế hệ thứ 3, thứ 4, Aminoglycosides, Quinolones các thế hệ mới đều đã bị lờn từ 25 đến 50%. Kháng sinh được dùng trong thú y cũng tương tự như trong y học. Vì vậy, nhiều biện pháp đang được nghiên cứu để chống lại sự lờn thuốc của các vi sinh vật gây bệnh. Một trong số các biện pháp hữu hiệu là tìm các kháng sinh mới từ các loài VSV trong thiên nhiên. Từ RNM người ta đã thu được một số kháng sinh mới, có khả năng chống các VSV gây bệnh đã lờn các loại kháng sinh hiện có (Isaka M, Suyanrnsestakorn C, Tanticharoen M, Kongsaeree P, Thebtaranonth Y, 2002). Vì vậy việc tìm kiếm các kháng sinh từ các vi sinh vật rừng ngập mặn đang được thế giới hết sức quan tâm[60]. Ngày nay, các nhà khoa học đang quay lại nhóm VSV đầu tiên sinh ra chất kháng sinh- đó là nấm sợi nói riêng và nấm nói chung, hy vọng tìm được giải pháp hữu hiệu chống các VSV lờn thuốc. Đối tượng hấp dẫn lại chính là nấm trong RNM và nấm biển [60], vì các nhà nghiên cứu tin rằng trong các môi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của VSV sẽ khác hơn các VSV trên cạn, nên sẽ có các chất trao đổi khác hơn trong đó có thể có các hoạt chất quý kể cả chất kháng sinh [60]. 1.1.3.2.Sử dụng kháng sinh và nấm sợi trong phòng chống nấm bệnh hại cây trồng. Trong thời gian gần đây nhiều chất kháng sinh còn được sử dụng có hiệu quả trong đấu tranh kiểm soát sinh học. Trong bảo vệ thực vật, người ta tăng cường phương pháp bảo vệ thực vật bằng phương pháp sinh học. Trong số các “Biện pháp đấu tranh sinh học” trong bảo vệ thực vật theo Cook và Baker (1853) là sử dụng một hay nhiều VSV để kiềm chế bệnh thực vật [41]. Chất kháng sinh và dịch lên men các chủng KSđược dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất. Nhìn chung so với y học, việc sử dụng KS trong bảo vệ thực vật còn mới mẻ. Tuy nhiên nhờ những thành tựu của khoa học sinh học hiện đại và xu hướng phát triển tất yếu của công nghệ sản xuất kháng sinh hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng của kháng sinh trong nền nông nghiệp hiện đại. Kháng sinh diệt nấm sử dụng trong nông nghiệp có hiệu quả cao như strobilurin phân lập từ Strobilurus tenacellus (Anke, et al, 1977) [60]. Người ta sử dụng chất kháng sinh để kiểm soát dịch bệnh do VSV gây ra cho cây trồng. CKS có tác dụng nhanh , dễ phân hủy lại có tác dụng chọn lọc cao. Dịch lên men của một số chủng sinh chất kháng sinh không chỉ chống bệnh cho cây mà còn dùng để xử lí hạt giống tiêu diệt mầm bệnh, có thể kích thích cây sinh trưởng và tăng số lượng vi sinh vật có ích cho vùng rễ [41]. Hằng năm trên thế giới cũng như ở nước ta bệnh cây đã làm thiệt hai rất lớn đến nền nông nghiệp, khoảng 537 triệu tấn nông sản. Các bệnh do vi khuẩn như bệnh bạc lá, loét cam, bạc lá lúa, héo xanh cà chua [5]. Các bệnh do nấm gây ra như bệnh thối cổ rễ ở cây bông và cỏ đinh lăng, bệnh đạo ôn ở lúa, bệnh khô vằn hại lúa…trong đó có 13/ 45 bệnh hại lúa do nấm gây ra, có 26 / 34 bệnh ở ngô do nấm gây ra [18]. Các chế phẩm từ nấm Trichoderma (Trichoderma harzianu, Trichoderma viride, Glyocladium..) cũng được sử dụng phòng trừ nhiều loài vi sinh vật gây bệnh như Rhizoctonia, Fusarium, Aspergillus, Pseudomonas….gây bệnh lở cổ rễ, thối gốc rễ, héo rũ ở nhiều loài cây trồng khác nhau.[5]. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp chất dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây [59]. Trong thực tế sản xuất nhiều nước đã áp dụng phương pháp bón vào đất các loại vi sinh vật đối kháng để tiêu diệt các loại vi sinh vật gây bệnh cho cây. Những vi sinh vật đối kháng này hoàn toàn không gây hại cho cây trồng. Những ứng dụng của nấm Trichoderma trong đấu tranh sinh học với các nấm gây bệnh ở cây trồng đã đạt được những thành tựu tốt đẹp ở các nước châu Âu, Liên xô…Công trình nghiên cứu của Wells và cộng sự (1972) đã thông báo ở điều kiện ngoài đồng ruộng Tri. harzianum đã ngăn chặn được bệnh do nấm Sclerotium rolfsii. Backman, Redriguer- Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm Tri. herzianum ngăn chặn bệnh do nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Pythium spp bảo vệ cây họ đậu và củ cải tránh được bệnh chết ẻo. Theo Emxep V.T (1989) cho biết nấm Trichoderma không chỉ tiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh cho cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển các vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển cây trồng. Các vi sinh vật đối kháng không chỉ ức chế các vi sinh vật gây bệnh ở vùng rễ mà những chất kháng sinh do chúng tiết ra (Trichodermin, Glitoxin) có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. Vì vậy một số chủng nấm Trichoderma theo các nhà khoa học các nước thì hoàn toàn có thể sử dụng trong đấu tranh sinh học [44]. Các chủng nấm sợi như Trichoderma ssp trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp nguồn phân bón an toàn hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được các ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên. Ở New Zealand, người ta còn trộn nhiều chủng Trichoderma khác nhau để kiểm soát bệnh trên cây nho và các cây dạng quả hạch. Ở Mỹ người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi trồng trọt [35]. Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma ssp đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật [35]. Các chủng nấm sợi có khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh thực vật rất hiệu quả, trong đó phải kể đến chủng Trichoderma harzianum T 22 có hoạt tính mạnh, thích hợp với đa số loại đất và cây trồng. Một số chủng bảo vệ thực vật khi cộng sinh ở vùng rễ. Các nấm Trichoderma có thể kìm hãm nấm gây bệnh cây thông qua các cơ chế tiết kháng sinh, men đặc trưng và có thể kí sinh trên các nấm gây bệnh cho cây. Hiên tượng kí sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cho cây được gọi là hiện tượng “giao thoa sợi nấm”. Trước tiên sợi nấm của Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh, xuyên qua sợi nấm gây bệnh, làm thủng màng ngoài của sợi nấm, gây nên sự phân hủy các chất nguyên sinh của nấm gây bệnh [33]. Nấm Aspergillus niger đối kháng với các nấm Fusarium solani, Rhizoctonia solania, Alternaria alternata. Nấm Aureobasidium pollulans và Sporobolomyces roseus đối kháng với nấm Septoria nodorum. Nấm Cercospora kikuchii đối kháng với nấm Diaporthe phaseolorum var.sojae. Các kết quả nghiến cứu của trường Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu lúa Đồng Bằng sông Cứu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện sinh học Nhiệt đới đã cho thấy vai trò của nấm sợi đối với cây trồng. Như nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Fusarium solani (gây bệnh thối rễ) . Hoặc để phòng trừ bệnh thối gốc chảy mũ trên cây bưởi (do nấm Phytopthora sp.gây ra) thì dùng một kg nấm Trichoderma harzianum trộn đều với 40 kg phân chuồng , rồi rải xung quanh cây từ 3- 5 (kg thùy theo cây lớn nhỏ)[22]. Dùng các chủng nấm Trichoderma xử lí đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm sợi với phân chuồng hoai mục trước khi bón ruộng 5- 10 ngày, rồi rải lên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp [35]. Hiện nay các chủng Trichoderma ssp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thương mại như: GlioGard- một chế phẩm với thành phần chính là Trichoderma virens ngăn chặn sự úng thối của cây con. Chế phẩm Trichodex với Trichoderma harzianum là thành phần chính kết hợp với Trichoderma polysporum trong việc sản xuất Binabt được dùng chữa trị các vết thương đã bị nhiễm trùng ở cây trồng. Ở Việt Nam, các bệnh do nấm, vi khuẩn, virút đã gây tổn thất lớn cho cây trồng. Việc dùng thuốc hóa học đã mang lại hiệu quả tốt, làm giảm đáng kể sự thất thu sản lượng cây trồng. Tuy nhiên, việc dùng thuốc hóa học cũng gây nên hậu quả năng nề cho sức khỏe của người tiêu dùng. Nhiều hóa chất còn tồn lưu trong sản phẩm là nguyên nhân gây ung thư cho người sử dụng [4]. Việc sử dụng nấm sợi có khả năng sinh kháng sinh để bảo vệ cây trồng là biện pháp an toàn và hiệu quả, làm tăng năng suất cây trồng, giữ được phẩm chất nông sản [41]. Có các công trình nghiên cứu của các sinh viên khoa sinh trường Đại học Sư Phạm, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội về các nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn ở Việt Nam có các hoạt tính đối kháng với các nấm gây bệnh cho cây trống và các côn trùng gây hại cây trồng, nghiên cứu đặc điểm của nấm sợi Trichoderma, nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của nấm sợi, khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm sợi, khảo sát khả năng kí sinh gây bệnh côn trùng và tiềm năng kiểm soát sinh học của nấm RNM…v..v…Theo công trình nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng, các chủng nấm sợi phân lập được từ rùng ngập mặn ở một số vùng Nam Định, Thái Bình còn thể hiện họat tính diệt sâu tơ mạnh trong đó có chủng P.farinosus NT 33, thể hiện hoạt tính đối kháng cao với các loại vi sinh vật có hại cho cây trồng [22]. 1.1.3.3.Sử dụng kháng sinh và nấm sợi trong phòng chống côn trùng gây hại cây trồng [16],[19]. Các bệnh gây hại do côn trùng gây ra cho cây trồng luôn là vấn đề lớn đối với các nước nông nghiệp. Hàng năm, côn trùng hại cây trồng đã làm giảm 14 % tổng sản lượng của các ngành nông, lâm nghiệp nước ta. Côn trùng làm giảm năng suất, chất lượng cây trồng. Việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu hóa học để diệt các loại côn trùng gây hại tuy hiệu quả nhanh và cao nhưng lại rất độc hại cho môi trường. Việc sử dụng thuốc hóa học bừa bãi, không đúng liều là một tác nhân chọn lọc làm xảy ra hiện tượng lờn thuốc ở côn trùng có hại. Thuốc hóa học còn tiêu diệt các sinh vật khác, kể cả các loài có lợi. Việc lạm dụng thuốc hóa học còn ảnh hưởng tới sức khỏe con người, làm ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái. Ngày nay, các biện pháp kiểm soát sinh học các loại côn trùng gây hại có hiệu quả và an toàn cho môi trường đang được quan tâm. Tuy biện pháp này có tác dụng chậm hơn song không gây ô nhiễm môi trường, không ảnh hưởng tới các sinh vật khác. Và có nhiều loài VSV được sử dụng trong kiểm soát sinh học như vi khuẩn, nấm sợi, virút . Năm 1815 lần đầu tiên Agostino Bassi (Italia) đã mô tả tỉ mỉ về nấm trắng Muscardin (B.bassian) gây bệnh trên tằm và đưa ra biện pháp ngăn ngừa. Các loài nấm sợi được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lãnh vực phòng trừ sinh học như Beauveria bassiana (Blas), Paecilomyces fumosoroseus thuộc lớp nấm bất toàn, do tính gây bệnh cao ở nhiều loài côn trùng. Vào những năm 70 của thế kỷ 20, Liên xô (cũ) là nước có số lượng công trình nghiên cứu ứng dụng nấm diệt côn trùng lớn nhất thế giới. Ở Úc thử nghiệm diệt sâu hại mía, diệt loài mối Coptotemes bằng M .anisopliae. Ở Trung Quốc người ta sử dụng nấm P.farinosus, B. bassiana, M.anisopliae phòng trừ Dendrolimus tabulaeformis. Các nước Bắc Âu cũng sử dụng nấm sợi trong phòng trừ côn trùng có hại. Ở Việt Nam, vào những năm 70 của thế kỷ 20 cũng có những công trình nghiên cứu về nấm diệt côn trùng và ứng dụng sản xuất chế phẩm diệt côn trùng. 1.2. Giới thiệu sơ lược về rừng ngập mặn huyện Cần giờ thành phố Hồ Chí Minh [24], [25], [42]. 1.2.1. Đặc điểm chung của rừng ngập mặn. RNM là các vùng sình lầy cát ngập triều ven biển ở các khu vực thuộc kinh độ ôn hòa trung bình và cao là rừng ngập mặn (mangrove) trong các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới. Đất ngập nước có rừng ven biển là phức hệ thảm thực vật cây gỗ, đất than bùn bở rời và hầu như không có nền đáy, có khả năng thích nghi cả hai phương diện: ngập lụt và độ mặn. Tầm quan trọng của đầm lầy rừng ngập mặn trong vận chuyển chất hữu cơ đến chuỗi thức ăn ven biển vùng bên cạnh, đến sự ổn định vật lý đối với bờ biển như chống xói mòn, sạt lở, bảo vệ các vùng nội địa khỏi sự phá hoại của gió bão và sóng biển, có tác dụng như những bồn chứa các chất dinh dưỡng và cacbon[24]. Chức năng quang trọng của hệ sinh thái rừng ngập mặn là sức sản xuất sơ cấp thuần và sức sản xuất sơ cấp thô [24]. 1.2.2.Đặc điểm của RNM huyện Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh: 1.2.2.1.Điều kiện tự nhiên sinh thái của rừng ngập mặn Cần Giờ Rừng Sác Cần Giờ là vùng rừng ngập mặn của thành phố Hồ Chí Minh. Trước đây, vốn là khu rừng nguyên sinh xuất hiện theo lịch sử của quá trình hình thành bãi bồi vùng cửa sông ven biển với các loài cây phổ biến như Đước (Rhizophora apiculata), Đưng (Rhizophora mucronata), Dà (Ceriops spp), Vẹt (Bruguiera spp).v.v..Theo các tài liệu cũ, một số vết tích gốc cây được phát hiện trong quá trình đào kênh mương, đào móng làm nhà người dân đã phát hiện rừng ở đây đã từng phát triển khá tốt với những cây to, lớn có chiều cao 20- 25 m, đường kính từ 35- 40 cm hoặc cao hơn. Hình1.8. Cảnh quan nơi lấy mẫu nghiên cứu của RNM Cần Giờ. Hàng trăm năm qua miền đất ngập triều ven biển này đã trải qua nhiều thay đổi. Các khu rừng ngập mặn trù phú xưa kia đã bị hũy diệt hoàn toàn, đặc biệt là các đợt rải chất khai quang trong chiến tranh (1965- 1970). Sau 23 năm tích cực gây trồng và bảo vệ (từ năm 1978 đến 2002) rừng đã dần được phục hồi với thành phần loài cây phong phú, đa dạng cũng như các quần xã thực vật tiêu biểu và đặc trưng. Năm 2000 tổ chức UNESCO đã công nhận rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển của thế giới, đầu tiên của Việt Nam [25]. 1.2.2.2.Vị trí địa lý [42]. Rừng ngập mặn Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai- Sài gòn đổ ra biển Đông ở cửa Xoài Rạp, Đồng Tranh và vịnh Gành Rái. Rừng Sác nằm ở điạ bàn huyện Cần Giờ, là cửa ngõ Đông Nam của Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 30 km và nó được hình thành do bồi tụ phù sa của hệ thống các sông lớn (Soài Rạp, Lòng Tàu) trước khi ra biển Đông. Diện tích tự nhiên: 71.361 ha trong đó diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha [25]. 1.2.2.3.Thổ nhưỡng, khí hậu, độ mặn [42], [25]. - Rừng ngập mặn Cần Giờ phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích sét, phèn hóa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên không có khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, có chứa lượng cao lưu huỳnh ở dạng khử không có lợi cho nông nghiệp và một lượng muối (NaCl) cao. - Khí hậu rừng mang đặc tính nóng ẩm và chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với 2 mùa: mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 10), mùa khô (từ tháng 11 đến tháng 4). - Lượng mưa trung bình từ 1.300 mm – 1.400 mm hàng năm (thấp nhất khu vực) - Qua các số liệu đo độ mặn từ năm 1977 đến năm 2000, cho thấy độ mặn lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém. - Vào tháng 4 nước mặn xâm nhập sâu hơn vào trong đất liền, do đó độ mặn của nước trong rừng được nâng cao lên. Còn vào tháng 9, 10 nước ngọt từ sông đẩy lùi nước mặn ra biển làm hạ bớt độ mặn. - Từ khi thủy điện Tri An hoạt động, thì độ mặn đã giảm từ 9 0/00 xuống 4 0/00 và tại Tam Thôn Hiệp độ mặn chỉ đạt 18 0/00 . Độ mặn 24 - 30 0/00 mùa khô. - Ngược lại vào mùa mưa, độ mặn lại tăng hơn so với trước do lượng nước xả của hồ Trị An giảm đi [25]. 1.2.2.4. Các giá trị chủ yếu của rừng ngập mặn Cần Giờ [25],[19]. Vùng ven biển Cần Giờ có các sinh cảnh tự nhiên và sinh cảnh nhân tạo. Sinh cảnh có giá trị đa dạng sinh học cao nhất là các bãi bồi và RNM tự nhiên ít bị tác động. Thực vật ưu thế trong RNM thuộc về loài Trang (Kandelia candel), Bần, Sú, Đước Đôi (Rhizophorz apiculata), Mắn Trắng (Avicennia alba)…và khoảng 30 loài cây ngập mặn khác là môi trường sống của nhiều loài nấm sợi. Nhờ có chủ trương bảo tồn, trồng lại RNM làm cho các loài cây được phục hồi sau chiến tranh tạo điều kiện cho các loài vi sinh vật trong đất, tảo phù du sinh sôi phát triển, tham gia vào chu trình tuần hoàn vật chất của hệ sinh thái rừng ngập mặn, bổ sung tính đa dạng sinh học của vùng đất ẩm, ngập triều ven biển này. Các loại tảo là nguồn thức ăn cho các loài thủy sản ở cửa sông, vùng triều. Các loài vi khuẩn, sinh vật đáy, nấm sợi, nấm men…giử vai trò quan trọng trong việc phân hủy các chất hữu cơ rơi rụng, xác bả các loài động vật rừng chết, khoáng hóa cung cấp chất dinh dưỡng cho các loài tảo phù du, ấu trùng tôm cua, cá …trong rừng và cả ven biển. Một điều rất quan trọng là ngay ở cả Cần Giờ có các chủng nấm sợi như Penicilium, Asperillus, Cladosporium, Canninghamela có khả năng phân giải đến 50- 70 % lượng dầu DO (Phan Nguyên Hồng và cộng sự 2004), tạo enzym ngoại bào có khả năng phân giải cellulose hoặc có khả năng sinh các loại kháng sinh. Đây là nguồn gen quí giá chưa được khai thác đặc biệt là nấm sợi sinh kháng sinh. Với độ che phủ cao chính là lá phổi xanh của thành phố. Đây là vùng xử lý khí độc, điều tiết nhiệt độ, độ ẩm, ngăn gió bảo. Ngoài ra RNM Cần Giờ là khu vực quan trọng đối với ngư nghiệp, khai thác hải sản ở các bãi bồi ngập triều, nơi kiếm ăn và sinh sản của nhiều loài cá , tôm cua, đồng thời chúng đóng vai trò quan trọng đối với việc duy trì năng suất các sản phẩm của biển vùng ven bờ. RNM Cần Giờ còn có tiềm năng lớn về du lịch sinh thái. Chính các yếu tố tự nhiên đã tạo ra nét riêng biệt môi trường sinh thái của Cần Giờ và quyết định đến sự phân bố tài nguyên tại đây. Tóm lại: Hệ sinh thái RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ nguồn gen quý hiếm do đặc trưng của vùng đất không ổn định, độ ẩm cao, sự dao động của thủy triều ra vào thường xuyên, làm VSV ở đây có nguồn gen dễ biến đổi để thích nghi với môi trường. Đây là hệ sinh thái có năng suất sinh học cao nhất trong hệ sinh thái, nơi hôi tụ của sự đa dạng về sinh vật đất liền lẫn sinh vật biển. Nấm sợi được phân bố khắp nơi ở RNM. Chúng ta có thể thấy rõ vai trò to lớn của các nhóm nấm sợi trong rừng ngập mặn cũng giống như trong bất kỳ hệ sinh thái nào khác, nó không những tham gia vào vòng tuần hoàn vật chất, khép kín chu trình sinh địa hóa mà còn là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu giữ cân bằng sinh thái. Nấm sợi có khả năng sinh kháng sinh là nguồn gen quí hiếm đặc thù cho hệ sinh thái rừng ngập mặn có ý nghĩa sinh thái và công nghệ sinh học. Đây là nguồn tài nguyên quí giá của đất nước. Vì vậy việc đầu tư tìm hiểu khai thác, lưu giữ và bảo tồn chúng là việc làm hết sức cần thiết và cấp bách. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu Vị trí lấy mẫu nghiên cứu trên bảng đồ huyện Cần Giờ TP HCM Ghi chú: : Vị trí lấy mẫu Hình 2.1. Vị trí lấy mẫu trên bảng đồ huyện Cần Giờ TPHCM [53]. - Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM ở các xã An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp, Long Hòa, Bình Khánh, khu Lâm Viên Cần Giờ thuộc huyện Cần giờ, thành phố Hồ Chí Minh. - Thời gian lấy mẫu vào tháng 7,8,9 (1 lần / tháng - mùa mưa). - Các vi sinh vật kiểm định gồm: + Bacillus subtilis ATCC 6633 nhận từ PTN vi sinh Đại học Khoa học Tự Nhiên TPHCM. + Escherichia coli ATCC 15224 nhận từ phòng xét nghiệm vi sinh Bệnh viện Bình Dân. + Candida albicans, Staphylococcus aureus 290 P, Pseudomonas aeroginosa nhận từ phòng vi sinh của Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh. + VK được phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân tại bệnh viện Bình Dân, gồm E.coli, Pseu.aeroginosa, Enterobacter (1), (2) các chủng này được phân lập từ 2 bệnh nhân khác nhau và kháng với các loại kháng sinh khác nhau( xem phụ lục). - Các nấm gây bệnh cây trồng: Nhận từ Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, TPHCM: + Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ và chết vàng ở cây (phân lập từ cây chè). + Rhizoctonia sp gây bệnh khô vằn (phân lập từ cây bồ ngót). + Sclerotium sp gây bệnh thối thân (phân lập từ cây thuốc lá). Nhận từ phòng Bệnh cây trồng của khoa Nông học- Đại học Nông Lâm TPHCM: + Curvularia sp gây bệnh đen hạt ở lúa (phân lập từ cây lúa). + Phythophthora gây bệnh thối thân (phân lập từ cây dứa). + Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn (phân lập từ cây lúa). - Các dạng côn trùng dùng thử nghiệm: + Ấu trùng dâu tằm tuổi ba nhận từ công ty Dâu tằm tơ – huyện Bảo Lộc, Tỉnh Lâm Đồng. + Sâu tơ (rau cải ) tuổi ba nhận từ Viện nghiên cứu của Công ty cổ phần Thuốc sát trùng Việt Nam- VIPESCO, Quận Gò vấp, TPHCM. 2.1.2. Hóa chất - Các loại đường chuẩn: glucoza, fructoza, saccaroza, galactoza, (Trung Quốc), rĩ đường (Việt Nam). - Các loại hóa chất khác: KH2 PO4, K2 HPO4, MgSO4.7 H2O, MgSO4, FeSO4.7 H2O, NaCl, KNO3,(NH4 )2SO4, NH4NO3, NaNO3, NaNO2, FeSO4, HCl, Na(OH),HgCl2, KCl, Na2HPO4 (Trung Quốc). Dầu DO (Việt Nam). - Tinh bột tan, peptôn, CMC, TCA (Trung Quốc), cao nấm men (Mỹ), cao thịt (Đức), thạch (công ty đồ hộp Hạ Long), bột đậu nành (Việt Nam). - Thuốc thử: lugol, HgCl2. - Thuốc nhuộm: lactophenol. - Chất kháng sinh: Chloramphenycol (Ấn Độ). 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ - Nồi hấp cao áp Autoclave (Đài Loan). - Tủ sấy Memmert (Đức). - Kính hiển vi quang học, máy chụp hình kỹ thuật số Olympus 5.1 (Nhật). - Máy đo pH Pometer KL-009(II) (Trung Quốc) - Máy li tâm (Rotina, Đức). - Kính lúp soi nổi. - Tủ cấy vô trùng (Việt Nam). - Tủ lạnh (National- Nhật). - Tủ giử mẫu (Sanyo- Nhật). - Máy giập mẫu. - Máy lắc (Gerhardt- Đức). - Cân điện (Sartorius -Đức). - Thiết bị đo độ mặn của nước biển. 2.1.4.Các môi trường đã sử dụng khi nghiên cứu 2.1.4.1. Môi trường phân lập, nuôi cấy và giữ giống nấm sợi - MT 1: Môi trường Czapek- Dox (nuôi cấy, giữ giống nấm sợi kiểm định) [8]. Glucôza 20,0g; NaNO3 3,5g; KH2 PO4 1,5g; MgSO4.7 H2O 0,5g; KCl 0,5g; FeSO4.7 H2O 0,1g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0; ( thêm 0,5g chloramphenicol khi phân lập) - MT 2: Môi trường Glucose Yeast Extract Agar (môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm sợi RNM- môi trường YEA) [46]. Glucôza 20,0g Cao nấm men 4,0g Thạch 20,0g Nước biển 1000ml, pH 5,5 – 6,0. - MT 3: Môi trường D (môi trường nuôi cấy nấm sợi RNM) [46]. Glucôza 10,0g; Peptôn 2,0g; KH2 PO4 5,0g; MgSO4.7 H2O 0,5g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0 2.1.4.2.Môi trường phân loại nấm sợi: - MT 4:Môi trường Potato Glucose Aga r(môi trường PGA- môi trường nuôi cấy nấm sợi gây bệnh ở cây trồng) [8]. Khoai tây 250,0g Glucôza 20,0g Thạch 15,0g (nếu làm môi trường đặc) Nước cất 1000ml. - Cách chế dịch khoai tây: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 250g, thái nhỏ, thêm 500ml nước, đun sôi, nhỏ lửa trong 30 phút, lọc lấy dịch trong. - MT 5:Môi trường Malt Extract Agar (môi trường MEA- môi trường phân loại nấm sợi) Glucôza 20,0g; Peptôn 1,0g; Malt Extract 20,0g; Thạch 20,0g; Nước biển 1000 ml, pH = 5,5 - 6 - Môi trường YEA ( môi trường 2.1.4.1) Nếu thử hoạt tính kháng sinh thì thay nước biển bằng nước cất 2.1.4.3. Môi trường nuôi cấy và giữ giống nấm men kiểm định [8]. -MT 6: Môi trường Hanxen . Glucôza 50,0g; Peptôn 10,0g; KH2 PO4 3,0g; MgSO4.7 H2O 2,0g; Thạch 20,0g; Nước cất 1000 ml, pH 5,5 – 6,0 2.1.4.4.Môi trường MPA nuôi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định [16]. - MT 7: Môi trường MPA. Peptôn 5,0g; NaCl 5,0g; Cao thịt 5,0g; Thạch 20,0g, Nước cất 1000ml; pH= 7,5. 2.1.4.5. Môi trường thử họat tính enzym ngoại bào [8], [46]. a. Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp cấy chấm điểm: Dùng [MT1] để thử hoạt tính enzym ngoại bào như: xenlulaza, prôteaza, amilaza dùng các cơ chất tương ứng là CMC, casein, tinh bột thay đường glucose với hàm lượng tương đương. b. Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp đục lỗ: Dùng [MT 2, MT 3] để thử hoạt tính enzym ngoại bào, thành phần môi trường tương tự nhưng không có agar. MT8:Môi trường khoáng (phát hiện khả năng phân giải dầu) [19]. KH2 PO4 0,3g; MgSO4 0,4g; KNO3 3,0g; Na2 HPO4 0,7g; Nước biển 1000 ml, pH 5,5 – 6,0; dầu DO hoặc dầu thô 5 % Lưu ý: Các môi trường trên trước khi đem sử dụng đều được thanh trùng ở 1atm trong 30 phút. 2.2.Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương phápVSV 2.2.1.1.Phương pháp lấy mẫu [19]. Các mẫu được thu ngẫu nhiên khi thủy triều vừa rút tại các rừng già cách biển 2 km.Các điểm lấy mẫu cách nhau 200 m. Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5-10 cm, thân cây tươi, thân cây mục, lá tươi trên cành, lá mục trên mặt đất. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ có độ mặn từ 12 - 18 0 / 00, nhiệt độ trung bình khoảng 25- 280C, độ ẩm 79- 87 %, pH dao động trong khoảng 4- 4,5. Mẫu bao gồm:lá vàng vừa rụng , lá rụng bị mục, thân cành chết khô còn trên cây, thân cành chết đang bị phân giải trên mặt bùn, đất bề mặt. Cách lấy: Dùng dao kéo vô trùng, cắt khoảng 50g mẫu cho vào túi nilon vô trùng bọc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu , ngày tháng , bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về phòng thí nghiệm và giữ ở tủ giống 40 C .Các mẫu được phân lập ngay không giữ quá 48h. 2.2.1.2.Phương pháp phân lập [9], [46]. Lấy mẫu trực tiếp và pha loãng mẫu theo F.Uyenco (1988) a.Lấy mẫu và pha loãng mẫu. Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ . Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230vòng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ phần dịch hơi đục chảy ra bên ngòai. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha loãng 10-1. Lắc đều, rồi hút 1ml dd 10 -1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta đựợc dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha lõang liên tiếp như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. b- Cấy mẫu Nhỏ 0,1ml dung dịch ở mỗi nồng độ lên dĩa chứa môi trường. Dùng que trang trải lên khắp mặt thạch. Sau đó sử dụng que trang đó trải tiếp 2 đĩa tiếp theo. c- Ủ mẫu Úp đĩa pêtri xuống, dùng báo gói lại, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Chọn khuẩn lạc riêng lẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng. d- Làm thuần Lấy 1 mẫu khuẩn lạc trong ống thạch nghiêng, hòa vào nước biển vô trùng, trải lên đĩa lần 2, nếu thuần nhất 1 khuẩn lạc đồng đều, màu sắc giống nhau, soi dưới kính hiển vi đều có 1 dạng tế bào thì đã thuần, ta cấy sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản ngắn hạn và nghiên cứu các đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa . 2.2.2. Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi. 2.2.2.1.Quan sát đại thể nấm sợi. -Phương pháp nuôi cấy tạo khuẩn lạc khổng lồ: - Cho vào ống thạch nghiêng (đã cấy chủng nấm sợi thuần khiết) 5ml nước biển vô trùng, tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa đĩa pêtri. Quan sát sự hình thành và phát triển của khuẩn lạc hằng ngày theo các đặc điểm sau. + Đo kích thước khuẩn lạc. + Quan sát hình dạng khuẩn lạc, màu sắc mặt phải, mặt trái của KL, màu sắc của môi trường, dạng mép KL, chất tiết trên bề mặt KL, mùi… 2.2.2.2.Quan sát vi thể nấm sợi [9], [10]. Phuơng pháp làm phòng ẩm nuôi cấy nấm để quan sát của J.T.Dunean. - Chuẩn bị môi trường thích hợp ( PDA, MEA, YEA) đổ 1 lớp thật mỏng khoảng 1mm trên bề mặt các đĩa petri. Khi thạch đã đông hoàn toàn thì dùng dao vô trùng cắt thành từng mẩu hình vuông, diện tích 1cm2 . - Chuẩn bị các đĩa pêtri sạch, phiến kính , lá kính, bông thấm nước (hoặc giấy thấm) nước cất, tất cả đều được vô trùng (sấy ở nhiệt độ 1600C, trong 1 giờ). - Đặt 1 khối thạch lên phiến kính. Cấy 1 ít bào tử lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lá kính lại và cho vào hộp pêtri có sẳn giấy thấm (bông) vô trùng được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp pêtri này trong tủ ấm 3-4 ngày. - Sau 3- 4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên 1 phiến kính sạch có bề mặt thuốc nhuộm. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta đựơc tiêu bản thứ 2. Quan sát dưới vật kính 40, 100 các đặc điểm: + Giá bào tử, các thể bọng, thể bình. + Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Màu sắc, kính thước bào tử, có gai hay không có gai. Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đaị 400- 1000 lần. 2.2.3.Các phương pháp hóa sinh. 2.2.3.1. Kiểm tra họat tính enzym ngoại bào của nấm sợi [9]. Bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch. a. Nguyên tắc. Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm sợi phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh khuẩn lạc. b. Thực hiện.  Phương pháp cấy chấm điểm - Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các môi trường thích hợp (MT 1 với cơ chất tương ứng). - Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp pêtri) lên môi trường thử họat tính tương ứng. - Giữ các hộp pêtri này trong tủ ấm 280 C300 C, trong 3 4 ngày.  Phương pháp đục lỗ trên môi trường thạch: - Thu dịch nuôi cấy: dùng que cấy vô trùng, lấy một vòng nấm sợi nghiên cứu vào bình tam giác chứa 50 ml môi trường lỏng ( MT 2, MT 3 không có thạch) vô trùng. Nuôi cấy trên máy lắc (160 vòng/phút) trong 4 ngày ở nhiệt độ 250C280C. Ly tâm 20 ml dịch nuôi cấy ở 3000 vòng/ phút, trong 20 phút. Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng, bổ sung 0, 04% NaN3 để khử trùng. Dịch ly tâm có thể giữ trong 1 tháng trong tủ lạnh sâu ở -200C. - Dùng khoan nút chai vô trùng (d= 8 mm) khoan các lỗ thạch trên môi trường nghiên cứu tương ứng trong các hộp pêtri (MT 1) với cơ chất tương ứng. - Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml dịch enzym vào các lỗ khoan trên các môi trường thử hoạt tính tương ứng.Giữ các hộp pêtri vào tủ lạnh ở 4 0C trong vòng 2 – 4 giờ. Sau đó chuyển sang giữ trong tủ ấm ở 280C300C, trong vòng 24 giờ. c. Kiểm tra kết quả: Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng: + Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10 % HgCl2 lên bề mặt môi trường nuôi cấy, nếu nấm sợi sinh ra prôteaza sẽ có 1 vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ) do các phân tử prôtêin bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tử prôtêin chưa bị phân giải có màu trắng đục. + Kiểm tra hoạt tính amilaza: nhỏ dung dịch thuốc thử KI + I 2 (dung dịch lugol loãng) lên bề mặt môi trường nuôi cấy nấm sợi. Nếu nấm sợi có enzym amilaza sẽ tạo vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ). + Kiểm tra hoạt tính xenlulaza bằng thuốc thử dung dịch lugol loãng hoặc cônggo đỏ 1 %. Đổ thuốc thử lên bề mặt môi trường nuôi cấy nấm sợi. Nếu nấm sợi có hoạt tính xenlulaza sẽ tạo 1 vòng trong suốt xung quanh khuẩn lạc (cấy chấm điểm) hoặc xung quanh lỗ khoan có chứa dịch enzym (phương pháp đục lỗ). Vùng xenluloza chưa bị phân giải sẽ có màu đỏ đậm với thuốc thử cônggo 1% và màu tím hồng nhạt với thuốc thử là dung dịch lugol loãng. d. Đánh giá khả năng tạo enzym . - Hoạt tính enzym = (D- d), mm với D = đường kính vòng phân giải, d = .đường kính khuẩn lạc (lỗ thạch). - (D-d)  25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20 mm: hoạt tính mạnh (D-d)  10  19,5: hoạt tính trung bình; (D-d)  10 mm: hoạt tính yếu 2.2.3.2. Kiểm tra khả năng sinh chất kháng sinh của nấm sợi [9]. a.Nguyên tắc Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành CKS thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. b.Tiến hành thí nghiệm:  Phương pháp khối thạch Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các môi trường thích hợp ( MT 2) không dùng nước biển mà thay bằng nước cất. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có vi sinh vật cần thử họat tính kháng sinh. Đặt các khối thạch vào đĩa pêtri có môi trường ( MT7) đã cấy các vi sinh vật kiểm định  Phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch - Cách thu dịch kháng sinh tương tự thu dịch enzym. Sau đó điểu chỉnh pH của dịch kháng sinh về pH trung tính (6  7). Các vi sinh vật kiểm định được cấy truyền từ ống giống sang môi trường nước cất vô trùng. - Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 ml môi trường lỏng có chứa vi sinh vật kiểm định nhỏ vào hộp pêtri có chứa môi trường dinh dưỡng tương ứng (MT 7). Dùng que trang vô trùng dàn đều giọt dịch vi sinh vật kiểm định trên bề mặt môi trường thạch. - Dùng khoan nút chai vô trùng dùng d=8mm, khoan các lỗ trên môi trường có chứa vi sinh vật kiểm định . - Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 ml dịch chiết kháng sinh nghiên cứu vào các lỗ khoan. c. Kiểm tra kết quả: - Hoạt tính kháng sinh = (D- d), mm -Với D = đường kính vòng phân giải, d = đường kính khuẩn lạc (lỗ thạch) (D-d)  25 mm: hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20 mm: hoạt tính mạnh (D-d)  10  19,5: hoạt tính trung bình; (D-d)  10 mm: hoạt tính yếu 2.2.3.3.Thử khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ [19]. a. Nguyên tắc Mức độ phát triển của nấm sợi thể hiện khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, nitơ khác nhau . b. Tiến hành thí nghiệm Để xác định ảnh hưởng của nguồn Cacbon tới sự sinh trưởng của nấm sợi nghiên cứu chúng tôi sử dụng MT 1 trong nước biển, glucose lần lượt được thay bằng các nguồn hydrat cacbon: lactose, sucrose, maltose, galactose, rỉ đường.Trọng lượng các chất thay thế được lấy đúng bằng hàm lượng cacbon trong MT 1. Để xác định ảnh hưởng của nguồn nitơ (dùng MT 1). Nguồn NaNO3 lần lượt được thay thế bằng các nguồn Nitơ khác: bột đậu, cao thịt, NH4NO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4 )2SO4. Mẫu đối chứng được nuôi ở môi trường MT 1. Cấy chấm điểm các nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt môi trường tương ứng, sau đó để trong tủ ấm trong 3 ngày. c. Kết quả: Đánh giá khả năng sử dụng nguồn cacbon, nitơ bằng mức độ phát triển của các khuẩn lạc bằng cách đo đường kính của các khuẩn lạc. 2.2.3.4. Kiểm tra khả năng chịu mặn [19]. a.Nguyên tắc Mỗi loài nấm sợi thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể hiện hoạt tính kháng sinh khác nhau. b. Tiến hành thí nghiệm - Chuẩn bị môi trường YEA (MT 2) , có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%; 3%; 5%; 7%; 10%; 20 %. - Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các môi trường nghiên cứu có nồng độ muối khác nhau. - Nuôi trong tủ ấm 4 ngày. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2 với từng nồng độ muối môi trường ban đầu. c. Kết quả. - Dựa vào thời gian hình thành khuẩn lạc và đường kính khuẩn lạc của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giả khả năng chịu mặn. Mẫu đối chứng nuôi trên môi trường không NaCl. - Kiểm tra vòng vô khuẩn (khi thử hoạt tính KS) 2.2.3.5.Thử khả năng phân giải dầu [19]. a. Nguyên tắc Dựa vào khả năng sinh trưởng của nấm sợi để xác định khả năng phân giải dầu. b. Tiến hành TN Cấy nấm sợi trong bình tam giác 100ml có chứa 50ml môi trường khoáng (MT 8). Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng trong 15 ngày. c. Đánh giá khả năng phân giải dầu bằng cách: Đo sinh khối khô của nấm sợi Quan sát xem nấm sợi có khả năng phát triển tốt trên MT có dầu hay không Quan sát mức độ mất các giọt dầu và ngửi thấy giảm mùi dầu. 2.2.3.6.Xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi Sử dụng môi trường (MT 1) thanh trùng rồi cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu. Sau đó ủ trong tủ ấm. Mỗi ngày đo đường kính khuẩn lạc vào cùng thời điểm (sau 24 giờ cấy) để biết tốc độ sinh trưởng của nó. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2 từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7. 2.2.3.7.Xác định ảnh hưởng của pH đến sinh trưởng và hoạt tính kháng của các chủng nấm sợi nghiên cứu. Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT 2) nước cất, điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 1 M hoặc HCl 1 M để có giá trị pH khác nhau từ 3,0 đến 9,0. Thanh trùng môi trường rồi cấy chấm điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 3- 4 ngày. Đánh giá mức độ sinh trưởng của nấm sợi dựa vào độ lớn của khuẩn lạc. Thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2 2.2.4. Thử họat tính đối kháng với các chủng nấm sợi gây bệnh cho cây trồng [15]: Nuôi các chủng nấm nghiên cứu trong môi trường dịch thể (MT 2), sau 4 ngày lấy dịch nuôi cấy đem ly tâm 3000 vòng/ phút, trong 20 phút. Loại bỏ sinh khối, phần dịch ly tâm cho vào các bình vô trùng ta được dịch chiết kháng sinh thô. Đổ môi trường (MT 4) vào đĩa pêtri, để nguội, sau đó đục lổ. Cấy nấm gây bệnh thành 2 chấm đối xứng qua lổ thạch và cách lổ thạch 2 cm. Nhỏ dịch chiết kháng sinh thô vào lổ thạch. Để đĩa pêtri này vào tủ lạnh từ 3 đến 5 giờ cho CKS khuếch tán. Sau đó để ở nhiệt độ phòng, quan sát kết quả sau 3- 5 ngày. 2.2.5.Thử khả năng diệt côn trùng của các chủng nấm sợi rừng ngập mặn.[16] Nguyên tắc: khả năng diệt sâu của các chủng nấm sợi RNM được đánh giá thông qua tỉ lệ sâu tơ, tằm chết và LD50 . Phương pháp: a-Gây nhiễm trực tiếp bào tử thuần khiết của các chủng nấm sợi RNM với tằm và sâu tơ tuổi ba: - Đếm 40 tằm hoặc sâu tơ tuổi ba để vào đĩa pêtri đã khử trùng. - Dùng que cấy vô trùng gạt các bào tử nấm thuần khiết từ ống giống (tương đương 0, 25g) lên tằm trong đĩa pêtri thí nghiệm, ghi ký hiệu tên chủng nấm lên hộp pêtri. - Đối chứng: tằm để nguyên không nhiễm nấm. - Sau khoảng 4 giờ bổ sung đồng đều một lượng lá dâu tươi (4g / 40 con). b-Gây nhiễm bằng dịch nuôi cấy: Nuôi các chủng nghiên cứu vào môi trường MT 3 dịch thể trong 3  5 ngày ở nhiệt độ phòng (280C 300C). Chiết dịch lọc, ly tâm 3000 vòng/ phút, trong 20 phút. Sau đó phun 3 ml dịch nuôi cấy lên mỗi đĩa pêtri chứa 40 cá thể sâu tơ (tằm) Đánh giá: - Theo dõi sâu, tằm chết trong vòng 15 ngày. - Số sâu, tằm chết ≥ 70%: mạnh ≥ 60 %: khá mạnh ≥ 50 %: trung bình.  40%: yếu. 2.2.6.Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của chất kháng sinh. Dịch chiết kháng sinh thô được đặt trong tủ sấy ở 600C; 800C;1000C; 1150C; 1210C kéo dài trong 10, 30, 60 phút rồi xác định họat tính kháng sinh bằng phương pháp đục lỗ. 2.2.7.Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng [9], [39]. Dầu khóang parafin lỏng hay vaselin trung tính, không chứa sản phẩm độc đối với vi sinh vật, hấp vô trùng ở 1210C trong 2 giờ, để nguội. Chuẩn bị các ống giống đã cấy, ở nhiệt độ phòng và thời gian thích hợp. Đổ lớp dầu khóang đã vô trùng lên bề mặt môi trường có VSV phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm. Hàn kính ống nghiệm bằng parafin rồi đem bảo quản ở nhiệt độ lạnh 40C. 2.2.8.Phương pháp xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản n 1 i 1 X X N   Trong đó X1: giá trị từng lần lặp thí nghiệm N : số lần lặp lại. i : số lần đo X: giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN. 3.1. Kết quả phân lập các chủng nấm sợi từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ. Mục đích của việc phân lập các chủng nấm sợi từ các mẫu khác nhau nhằm làm sáng tỏ một phần về quần thể nấm sợi, sự phân bố và các hoạt động sinh lý, sinh hoá cũng như vai trò của chúng trong khu hệ sinh thái RNM, tuyển chọn các chủng có nguồn gen quí để có thể nghiên cứu ứng dụng vào thực tế. Từ các mẫu thân, cành khô, lá tươi, lá mục, đất mặt, đất sâu thu nhận được sau 3 lần lấy mẫu tại RNM Cần giờ, trong khoảng thời gian từ tháng 6 đến tháng 9 năm 2006, sử dụng môi trường MT 1, với phương pháp đã trình bày ở phần 2.2.1; 2.2.2 chúng tôi đã phân lập được 312 chủng nấm sợi khác nhau. Trong đó có: - 34 chủng lấy từ lá vàng và 62 chủng lấy từ lá phân hủy. - 63 chủng phân lập từ thân mục và 39 chủng từ thân khô ở rừng cây già. - 93 chủng phân lập từ đất mặt và 21 chủng từ đất sâu. Từ kết quả trên cho thấy nấm sợi có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Trong đất bề mặt có số lượng các chủng nhiều nhất. Vì đa số nấm sợi là các sinh vật hiếu khí, cho nên lớp đất bề mặt rất thích hợp với chúng. Số lượng nấm sợi ở các mẫu thân và lá mục nhiều hơn ở thân, lá tươi, điều đó có thể chứng minh khả năng phân giải các cơ chất này kèm theo sự tăng sinh khối của các loài nấm trên các cơ chất đó. Trong thân, cành mục có nấm sợi chứng tỏ chúng có vai trò phân giải xác thực vật RNM. Chúng đã sử dụng các chất hữu cơ chủ yếu từ xác các loài thực vật, một ít xác động vật làm nguồn cung cấp chất dinh dưỡng. Sự phân giải này đã góp phần làm giảm sự ô nhiễm môi trường, tham gia vòng tuần hoàn vật chất của lưới thức ăn. Chính sự hiện diện của nấm sợi đã nâng cao hiệu suất sinh thái của hệ sinh thái rừng ngập mặn [19]. Các chủng phân lập được tiến hành sơ tuyển để chọn những chủng nấm sợi có khả năng sinh KS. 3.2. Khảo sát khả năng sinh các chất kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ. Từ 312 chủng đã phân lập, chúng tôi tiến hành xác định hoạt tính kháng sinh với các VSV kiểm định G+ (B. subtilis), G- (E. coli) theo phương pháp 2.2.3.2. Kết quả được trình bày theo bảng 3.1 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ ở các vị trí lấy mẫu Hoạt tính KS (D-d, mm) Hoạt tính KS (D-d, mm) STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẩu STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu 1 L1 11 11 21 L16.3 9 14 2 L’1 17 17 22 L24 14 3 L1.3 3 23 L15.5 12 4 L’1.3 2 24 L15.3 12 12 5 L3.3 8 25 L30.1 20 6 L4.1 4 26 L32.2 29 7 L4.2 10 14 27 L32.1 24 8 L5.1 13 28 L33.1 11 14 9 L5.3 14 12 29 L34 12 10 L’5.3 12 30 L’34 5 11 L’6.1 10 31 L35 17 12 L6.2 7 9 32 L36 13 13 L13 23 33 L37 14 14 L12 9 34 L38 15.5 15 L’12 13 14 35 L28 16.5 11 16 L14 7 36 L28.1 20 17 L14.2 9 37 L 41 13 19 18 L14.3 9 38 L41.1 12 19 L15.2 12 39 L41.3 15 20 L16.2 20 18 20 Lá vàng ở RNM 40 L41.4 12 41 L41.5 24 9 42 L41.9 18 22 Lá mục ở RNM Hoạt tính KS (D-d, mm) Hoạt tính KS (D-d, mm) STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu 43 Đ’ 30 32 18 63 Đ29 22 6 44 Đ 9 22 64 Đ24.1 5 45 Đ’9 22 65 Đ 30 25 8 46 Đ 9.1 12 66 Đ32 21 47 Đ’ 9.2 24 67 Đ33 17 48 Đ 2.1 24 4 68 Đ33.1 25 8 49 Đ’2 9 69 Đ’34.1 12 9 50 Đ 3 21 5 70 Đ’34.3 7 51 Đ’5 32 71 Đ34.2 28 17 52 Đ 7 12 72 Đ34.4 16 53 Đ’ 8.1 20 73 Đ28 20 Đất mặt ở RNM 54 Đ 8 6 74 D 1 14 - 55 Đ10.2 21 75 D6 4 - 56 Đ10.2 21 76 Đ’ 9.2 16 - 57 Đ 12 3 77 Đ’ 9.4 28 - 58 Đ 17 6 78 Đ30.1 14 - 5 Đất sâu ở RNM 59 Đ19 9 31 Đất mặt ở RNM 60 Đ’19 7 61 Đ14.3 8 62 Đ22 11 Hoạt tính KS (D-d, mm) Hoạt tính KS (D-d, mm) STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu 79 T’ 12 9 99 ĐB 12 9 80 T1 16 19 100 ĐB1 6 - 81 T’1.1 12 19 101 ĐB 3 10 14 82 T’1 30 19 102 ĐB 4 11 - 83 T1.1 10 103 ĐB 5 11 - 84 T1.2 25 24 104 ĐB 7 4 - 85 T4.1 3 105 Đ’ 0 5 - 86 T4.2 15.5 106 Đ 12 3 - 87 T4.4 6 107 Đ31 13 9 9 Đất mặt có nước ra vô 88 T4.6 8 89 T 5.1 12 90 T5.4 13 91 T7.1 25 15 92 T8.1 12 93 T11.1 10 94 T11.7 11 23 95 T12 15 96 Tc 1 18 97 T c3 12 98 Ct 10 20 Thân cây khô ở rừng cây già Hoạt tính KS (D-d, mm) Hoạt tính KS (D-d, mm) STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẩu STT Kí hiệu Chủng B.subtillis E.coli Tồng số chủng Vị trí lấy mẫu 108 C 1b 5 128 C18.1 14 7 109 C 3 8 129 C’18 29 110 C 1b 5 130 C18a 12 9 111 C1.3 8 131 C18b 21 112 C5 10 132 C19 8 8 113 C11.1 29 133 C 34 8 114 C11.3 26 8 134 C’34 17 Thân cây mục ở RNM 115 C11.4 27 116 C10 18 117 C13 26 5 118 C’13 16 6 119 C13.2 15 120 C15 12 7 121 C15.1 29 6 122 C15.1a 14 123 C16a 18 124 C16b 6 125 C16.1 24 27 Thân cây mục ở RNM 126 C17 6 127 C18 21 Ghi chú : D = đường kính vòng vô khuẩn, d = 8mm đường kính khối thạch Để có cái nhìn tổng quan hơn, từ bảng 3.1 chúng tôi thống kê lại thành bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả thống kê họat tính kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM. Họat tính kháng sinh (D - d, mm) Mức độ họat tính STT VSV kiểm định Số chủng phân lập được Yếu Trung bình Mạnh Rất mạnh Tổng số chủng có hoạt tính KS 1 B.subtilis 312 35 63 20 16 134 2 E.coli 312 18 19 2 0 39 Ghi chú: D-d  25mm: hoạt tính rất mạnh; D-d  20mm: họat tính mạnh, D- d  10  19,5mm: họat tính trung bình; D- d  10mm: hoạt tính yếu. Qua bảng 3.1 và 3.2 cho thấy: Hoạt tính đối kháng của nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ với các VSV kiểm định ở các mức độ mạnh yếu khác nhau. Có 134 / 312 chủng nấm sợi RNM (chiếm 42,9%) có khả năng chống lại các VK gram dương, trong đó có 16 / 134 chủng (chiếm 11,9%) thể hiện hoạt tính rất mạnh. Có 39/ 312 chủng nấm sợi RNM (chiếm 12,5%) có khả năng kháng lại các VK gram âm, trong đó có 2 chủng (chiếm 0,5 %) thể hiện họat tính mạnh. Có 39/312 chủng (chiếm 12,5%) có khả năng kháng cả VK gram dương lẫn VK gram âm. Các chủng nấm sợi phân lập từ RNM có tiềm năng sinh chất kháng sinh cao, đặt biệt là kháng sinh kháng Bacillus subtilis, một lọai trực khuẩn cỏ khô. Hoạt tính kháng sinh đã giúp các chủng nấm sợi thích nghi và có thể đấu tranh sinh học để tồn tại trong RNM. Các chủng nấm sợi này sẽ được tiếp tục nghiên cứu, nhằm tìm ra các chủng có ý nghĩa thực tiễn đối với cây trồng nói riêng và ở RNM nói chung. Khi so kết quả trên với kết quả nghiên cứu của Nguyễn Vĩnh Hà (2002)[16] nhận thấy các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ có khả năng kháng với các VK G (+) mạnh hơn với VK G (-). Qua bảng 3.1 cho thấy trong 134 chủng nấm sợi có hoạt tính kháng sinh phân lập từ RNM chúng tôi nhận thấy có 49/134 chủng (chiếm 36,5 %) ở thân cây mục và lá mục; 31/ 134 chủng (chiếm 23%) ở lớp đất bề mặt, 20/ 134 chủng (chiếm 15%) ở thân cây khô ở rừng già; 20/ 134 chủng (chiếm 15%) ở lá vàng, 9/134 chủng (chiếm 6,7 %) ở đất mặt có nước ra vô; 5/ 134 chủng (chiếm 3,7%) ở lớp đất sâu từ 5- 10 cm. Chúng tôi nhận thấy các chủng nấm sợi có hoạt tính KS có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Đặc biệt nấm sợi sinh KS có ở lớp đất mặt, lá mục, thân cây mục nhiều hơn ở lá và cành cây tươi, điều đó có thể chứng minh khả năng phân giải các cơ chất này kèm theo sự tăng sinh khối của các loài nấm trên các cơ chất đó. Các nấm sợi phân lập từ cành, thân, lá tươi là các nấm kí sinh nội bào, chúng sử dụng chất dinh dưỡng của tế bào chủ khi sống mà không gây ảnh hưởng gì. Ở đất bùn nơi không có thân, lá rụng thì số lượng nấm rất ít, có thể là do các lá cây và thân cây ngoài chức năng là chất dinh dưỡng của nấm sợi, chúng còn là các giá thể vững chắc giúp nấm không bị sóng triều rửa trôi ra biển cả. Cũng có thể là vì đa số nấm sợi là các sinh vật hiếu khí, cho nên lớp đất bề mặt thích hơp cho chúng hơn. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Mai Thị Hằng (2002). [19]. a b Hình 3.1. Hoạt tính đối kháng (với VKKĐ B.subtilis, E.coli ) của chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ– chủng Đ’9.2(a), C11.1(b). a b Hình 3.2. Hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập C15.1(a); L15.5(b) 3.3. Tuyển chọn những chủng nấm sợi có hoạt tính kháng sinh cao. Trong 134 / 312 chủng nấm sợi (chiếm 42, 9%) có khả năng sinh KS (bảng 3.1), chúng tôi chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh cao để tiếp tục nghiên cứu. Dùng phương pháp 2.2.3.2. lập lại thí nghiệm chúng tôi đã tuyển được 10 chủng có hoạt tính kháng sinh cao, ổn định. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Chủng nấm sợi có khả năng sinh kháng sinh cao. Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) STT Chủng nghiên cứu B.subtilis E.coli 1 T 1.2 25 24 2 T’1 30 19 3 T7.1 25 17 4 C11.4 27 - 5 C 15.1 29 6 6 Đ 33.1 25 8 7 Đ 34.2 28 17 8 Đ’30 32 18 9 Đ 30 25 8 10 L41.5 24 9 Ghi chú : D = đường kính vòng vô khuẩn, d = 8 mm đường kính khối thạch. Qua bảng 3.3 cho thấy kết quả khảo sát khả năng sinh KS của các chủng tuyển chọn này có hoạt tính sinh kháng sinh tương đối ổn định so với ban đầu thử hoạt tính. a b c d Hình 3.3. Hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định của các chủng Đ 33.1(a); C 15.1(b), T 1.2(c), C11.4 (d). Qua bước tuyển chọn sơ bộ, để khẳng định lại hoạt tính kháng sinh và xác định thêm về phổ kháng khuẩn các chủng nấm đã tuyển chọn, chúng tôi đặt thí nghiệm xác định hoạt tính kháng sinh khi mở rộng số VSV kiểm định như nấm men C.albicans, S.aureus, P.aeroginosa (gây bệnh ở người). Kết quả thử hoạt tính kháng sinh ghi ở bảng 3.4 sau: Bảng 3.4. Hoạt tính kháng sinh của các chủng nấm sợi tuyển chọn với các vi sinh vật kiểm định Hoạt tính KS với các VSV kiểm định (D- d, mm) STT Kí hiệu chủng C.albicans B.subtilis S. aureus E.coli P. aeroginosa 1 T 1.2 20.3 24,5 - 23,0 - 2 T’1 - 31,0 23,0 20,0 20,3 3 T7.1 - 26.0 25,3 18, 7 24,5 4 C11.4 - 27,0 - - - 5 C 15.1 - 28.5 - - - 6 Đ 33.1 - 26,0 - 8,0 - 7 Đ 34.2 - 28,0 - 15,0 - 8 Đ’30 - 31,0 - 20.3 - 9 Đ 30 + 23,0 - 8,0 19.3 10 L41.5 - 22,5 - 9,0 - Chú thích: - : không kháng, + kháng ( giá trị vòng phân giải thấp) Qua bảng 3.4 cho thấy chỉ có 1 chủng ức chế nấm men, 10 chủng ức chế vi khuẩn gram dương, 8 chủng ức chế vi khuẩn gram âm. Trong đó có 1 chủng ức chế cả nấm men, VK gram dương lẫn VK gram âm (chiếm 10%) đó là chủng T 1.2 có phổ kháng sinh khá rộng. Có 3 chủng (chiếm 30%) kháng vừa VK gram dương lẫn VK gram âm như các chủng T’1; T7.1; Đ 30. Có thể thấy nấm sợi ở RNM có tiềm năng sinh CKS cao. Các chủng nấm sợi này được tiếp tục nghiên cứu, nhằm tìm ra các kháng sinh có ý nghĩa thực tiễn. a b c d Hình 3.4. Họat tính đối kháng với VSVKĐ của các chủng nấm sợi Đ 33.1(a); Đ 34.2(b) )(VKKĐ B.subtilis); C15.1 (c); T 1.2(d)(VKKĐ E.coli). 3.4. Khảo sát phổ kháng với VSV gây bệnh. 3.4.1. Khảo sát khả năng chống các vi khuẩn gây bệnh đã kháng một số chất kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập được. Các chủng nấm sợi RNM được tuyển chọn trên có khả năng sinh kháng sinh kháng với các VSV gây bệnh ở người như C.albicans (bệnh đường sinh dục của nữ), S. aureus (ngộ độc thực phẩm), P.aeroginosa (viêm phế quản, viêm tai giữa). Để tìm ra hướng ứng dụng trong y học từ các chủng nấm sợi phân lập được, chúng tôi thử khảo sát hoạt tính kháng sinh với các vi khuẩn gây bệnh ở người đã lờn các kháng sinh theo phương pháp như trên. Đặc biệt 5 VKKĐ này được phân lập từ bệnh phẩm của 5 bệnh nhân khác nhau, đã kháng hầu hết các kháng sinh (xem bảng phụ lục). Theo thông tin của phòng xét nghiệm vi sinh, bệnh viện Bình Dân, TPHCM cho biết: Chủng E.coli *(gây bệnh tiêu chảy và một số bệnh cơ hội ở người), chủng này đã kháng 10 / 16 loại kháng sinh. P. aeruginosa (1) kháng 13/16 loại kháng sinh; còn P. aeruginosa (2) kháng 14 /16 loại kháng sinh. Entobacter (gây nhiễm trùng đường tiết niệu), Entobacter (1) kháng 14 loại kháng sinh và Entobacter (2) kháng 12 loại kháng sinh. Kết quả khảo sát khả năng kháng các vi khuẩn đã lờn thuốc nói trên của các chủng nấm sợi nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.5 Bảng 3.5. Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi với các vi sinh vật kháng thuốc. Hoạt tính kháng sinh với các VSV kiểm định (D- d, mm) STT Chủng nghiên cứu E.coli * P. aeruginosa (1) P. aeruginosa (2) Entobacter (1) Entobacter (2) 1 T 1.2 23 - - 20 21 2 T’1 16 15 15.5 22 22 3 T7.1 16 18 18.5 20 19 4 C11.4 - 19 19 - - 5 C 15.1 19 15 14 16 - 6 Đ 33.1 16 - - 14 14 7 Đ 34.2 16 - - - - 8 Đ’30 10 - - - - 9 Đ 30 15 - - - - 10 L41.5 10 - - - - Qua bảng 3.5 chúng tôi thấy: có 9 / 10 chủng kháng với VK E.coli *, có 4 / 10 chủng chủng có khả năng kháng P.aeruginosa, có 5 / 10 chủng kháng với Enterobacter (1), có 4 / 10 chủng kháng với Enterobacter (2). Trong đó có: - Chủng T’1 và T 7.1 có khả năng kháng 5 / 5 chủng VK gây bệnh lờn kháng sinh. - Chủng T 1.2 và Đ 33.1 có khả năng kháng 3 / 5 chủng VK gây bệnh lờn kháng sinh. Có thể thấy nấm sợi phân lập từ RNM có tiềm năng sinh CKS. Đặc biệt là kháng sinh chống Enterobacter (VK gây nhiễm trùng đường tiết niệu), Pseudomonas aeruginosa (VK gây nhiễm trùng cơ hội). Tất cả các vi khuẩn này đã lờn đa kháng sinh ở bệnh viện và gây các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho người. Sự thay đổi độ mẫn cảm đối với kháng sinh của các chủng do các nguyên nhân gây nên do ô nhiễm môi trường, do sử dụng kháng sinh không hợp lý trong cộng đồng..v.v..[19] Các VSV kháng thuốc có chứa các yếu tố kháng thuốc tiềm ẩn, các yếu tố này có bản chất plasmid. Khi VSV sống trong môi trường có kháng sinh, các plasmid kháng thuốc của chúng sẽ được hoạt hóa, tự sao chép tổng hợp ra vô số plasmid mới. Chính hoạt tính của plasmid này sẽ làm tăng sức đề kháng cho tế bào chủ, vì vậy chúng có thể tồn tại trong môi trường có kháng sinh. Việc sử dụng kháng sinh một cách tùy tiện ở người đã vô tình tạo ưu thế phát triển cạnh tranh cho các VSV kháng thuốc và kích thích các chủng kháng thuốc này tạo ra vô số các plasmid mới. Chúng gây ra sự biến đổi bất lợi không mong muốn về bản chất hệ vi sinh trong cơ thể bệnh nhân, dẫn tới làm thay đổi hoàn toàn bản chất hệ vi sinh trong cơ thể theo chiều hướng có hại cho sức khỏe của con người. Để khắc phục hiện tượng kháng thuốc của VSV gây bệnh thì giải pháp là sử dụng các kháng sinh mới [8]. Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả năng kháng các các vi khuẩn đã kháng các kháng sinh thậm chí là các kháng sinh thuộc thế hệ mới (imipenem, tazobactam..) mở cho ta một hy vọng từ các chủng nấm sợi nói trên có thể có chủng sinh tổng hợp được chất kháng sinh mới giúp ích cho việc điều trị bệnh trong tương lai. Các chủng nấm sợi này sẽ được bảo quản để tiếp tục nghiên cứu tiếp theo. a b c d Hình 3.5. Hoạt tính đối kháng với Enterobacter của các chủngT 1.2(a), Đ 33.1(b ) và kháng E.coli của chủng T 1.2 (c); T7.1(d). 3.4.2. Khảo sát khả năng kháng một số nấm gây bệnh ở cây trồng của các chủng nấm sợi phân lập được. Đồng thời với việc tìm hiểu khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh ở người chúng tôi tiến hành khảo sát hoạt tính đối kháng với các nấm gây bệnh ở thực vật của các chủng nấm nghiên cứu. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.6 Bảng 3.6. Khảo sát khả năng kháng các nấm gây bệnh cây trồng của các chủng nấm sợi nghiên cứu Hoạt tính đối kháng của các chủng phân lập với nấm gây bệnh cây trồng Curvularia sp (lúa) F. oxysporum (chè) Phythoph thora (dứa) Sclerotium sp (thuốc lá) Pyricularia oryzae (lúa) Rhizoctonia sp (bồ ngót) S T T Chủng nghiên cứu 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 T 1.2 + + + + + + 2 T’1 + + + 3 T7.1 + + + 4 C11.4 + + T 1.2 5 C 15.1 + 6 Đ 33.1 + + + 7 Đ 34.2 + + 8 Đ’30 9 Đ 30 + 1 0 L41.5 + Ghi chú: Cột 1: kháng với nấm gây bệnh bằng cách tạo vòng vô khuẩn. Cột 2: kháng với nấm gây bệnh bằng cách cạnh tranh; + : kháng với nấm gây bệnh. a b c d e Hình 3.6. Hoạt tính đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng a. Hình thái KL Fusarium oxysporum b. Chủng Đ 33.1 ức chế sự phát triển của F. oxysporum c. Chủng T’1 ức chế sự phát triển của F. oxysporum d. Chủng T 1.2 ức chế sự phát triển của F. oxysporum e. Chủng T7.1 ức chế sự phát triển của F. oxysporum a b c Hình 3.7. Hoạt tính đối kháng với các nấm gây bệnh cây trồng (tạo vòng vô khuẩn) a. Hình thái KL Rhizoctonia sp b. Chủng Đ33.1 ức chế sự phát triển của nấm Rhizoctonia sp c. Chủng T7.1 ức chế sự phát triển của nấm Rhizoctonia sp. Qua bảng kết quả 3.6, chúng tôi nhận thấy các chủng nấm sợi được tuyển chọn trên là nhóm nấm sợi có khả năng sinh ra các chất kháng sinh mạnh, chống các nấm gây hại ở cây trồng. Chủng T 1.2 kháng với 6 chủng nấm gây bệnh ở cây trồng theo phương thức cạnh tranh. Chủng T’1, T 7.1, Đ 33.1 kháng với 3 chủng nấm gây bệnh ở cây trồng. Có 7 /10 chủng nấm nghiên cứu kháng với F.oxysporium (gây bệnh trên thực vật). Chủng T’1, Đ 33.1 kháng với nấm gây bệnh bằng cách tạo vòng vô khuẩn. Đây là những chủng có tiềm năng ứng dụng trong việc phòng chống các bệnh để bảo vệ cây trồng. Các chủng các hoạt tính đối kháng mạnh còn được dùng trực tiếp làm tác nhân sinh học kiểm soát các loại bệnh thực vật do các VSV gây nên. Các vi sinh vật sinh kháng sinh không những có vai trò to lớn trong công nghệ hóa dược liệu mà còn có vai trò to lớn trong các hệ sinh thái. Chúng ức chế sự sinh trưởng của các loài sinh vật khác trong đó có các loài vi sinh vật gây bệnh cho động thực vật và người. Chúng là những tác nhân tham gia làm sạch sự ô nhiễm do VSV RNM, đặc biệt là VSV gây bệnh cho người và động vật như Pseudomonas aeruginosa, C. anbicans , các loại nấm gây bệnh cho thực vật như Fusarium oxysporium,Curvularia oryza, Sclerotium sp, Rhizoctonia sp…góp phần bảo vệ và nâng cao năng suất cây ở hệ sinh thái RNM. Từ các chủng có khả năng sinh kháng sinh cao đã được tuyển chọn, tiến hành khảo sát phổ kháng khuẩn, kháng các vi sinh vật gây bệnh lờn thuốc, kháng các nấm gây bệnh ở người và cây trồng, kết quả tuyển chọn được 4 chủng, ghi lại thành bảng 3.7. Bảng 3.7. Khả năng đối kháng của các chủng tuyển chọn. Khả năng đối kháng với STT Ký hiệu chủng C.albicans VK G + VK G- VK kháng thuốc Nấm gây bệnh cho cây trồng 1 T 1.2 +   3/5 chủng 6 / 6 chủng 2 T’1 -   5/5 chủng 3 / 6 chủng 3 T 7.1 -   5/5 chủng 3 / 6 chủng 4 Đ 33.1 -   3/5 chủng 3 / 6 chủng Ghi chú: + khả năng kháng , - không kháng. Qua bảng 3.7 cho thấy các chủng được tuyển chọn có hoạt tính KS phổ rộng, kháng được với nhiều loài VSV kiểm định. Chủng T1.2 có khả năng kháng được tất cả VSV kiểm định kể cả các nấm gây bệnh ở người và cây trồng. Chủng T’1, T7.1, Đ33.1 vừa có khả năng kháng VK G+, vừa có khả năng kháng VK G- và các nấm gây bệnh cho cây trồng. Đây là cơ sở để chúng tôi chọn 4 chủng này nghiên cứu sâu hơn ứng dụng vào thực tiễn. Để giúp cho những nghiên cứu sâu hơn về 4 chủng nấm tuyển chọn nói trên cũng như giúp cho việc ứng dụng vào thực tiễn, chúng tôi tiến hành định danh và khảo sát các đặc điểm sinh học của chúng. 3.5. Các đặc điểm sinh học và phân loại của các chủng nấm sợi đã tuyển chọn. 3.5.1.Đặc điểm hình thái, phân loại. Các chủng nấm nghiên cứu được cấy trên các môi trường khác nhau MT1, MT 2, MT 4 thành một hoặc ba điểm, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 3  4 ngày. Quan sát sự phát triển của khuẩn lạc Để quan sát đại thể chúng tôi làm KL khổng lồ, quan sát vi thể chúng tôi làm phòng ẩm. Quan sát bào tử, cuống sinh bào tử, hệ sợi nấm dựa vào các tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (2000) Ainsworth G.C (1973), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Bùi Xuân Đồng (2004), Saccardo P.A (cải tiến), Persoon ex Gray (1801) để định dạnh đến chi. Chúng tôi gửi chủng nghiên cứu sang Công ty cổ phần Giám định và Khử trùng FCC định danh đến loài theo phương pháp quan sát hình thái đại thể và vi thể. Dựa vào các khóa phân loại theo TK.A Revision of the genus trichoderma by MA .Rifai; Persoon ex Gray (1921),TK. The Genus Aspergillus – Kenneth B- Raper; TK. Manual of the penicillia by Kenneth B-Raper and Charles Thom để định danh tên giống (xem phụ lục) 3.5.1.a. Đặc điểm đại thể và vi thể của các chủng nấm sợi T1.2 Chủng T 1.2 có tốc độ sinh trưởng nhanh, kích thước khuẩn lạc đạt 10 cm trong 7 ngày, có màu sắc thay đổi tùy theo MT nuôi cấy. Khuẩn lạc lúc non có màu trắng đục, sau già chuyển màu xanh từ xanh lục nhạt đến xanh lục đậm, dạng bông xồm, kết cụm, mép khuẩn lạc hình tia, không xuất hiện giọt tiết. Mặt trái khuẩn lạc không tiết sắc tố. Hệ sợi có vách ngăn, trong suốt, không có tế bào màng dày.Cuống sinh bào tử thì phân nhánh nhiều, 2- 3 lần.. Các nhánh tạo thành các góc rộng với giá hoặc với các nhánh mang chúng. Các nhánh tận cùng ngắn mang ở đỉnh các thể bình. Thể bình hình chai, phình to ở giữa , sau đó thon nhỏ đến đỉnh. Bào tử hình oval, cầu, xuất phát từ đầu trên thể bình, không màu, tập hợp thành các khối tròn ở miệng thể bình, không nhày. Q