Luận văn Khảo sát đặc điểm sinh học một số nhóm nấm sợi từ rừng ngập mặn Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Võ Thị Bích Viên KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ NHÓM NẤM SỢI TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ TP. HỒ CHÍ MINH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Chuyên ngành : Vi Sinh Vật Mã số: 60 42 40 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. TRẦN THANH THUỶ Thành phố Hồ Chí Minh - 2009 MỞ ĐẦU Nấm sợi hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm. Trong tự nhiên, nấm sợi phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn. Ngoài ra, có rất nhiều loài nấm sợi được sử dụng rộng rải trong CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước chấm…), trong CN enzim (sản xuất amilaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối nấm sợi để phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng nấm sợi để xử lý ô nhiễm MT. [4] Bên cạnh đó còn có nhiều loài nấm sợi ký sinh trên người, ĐV, TV gây ra nhiều bệnh khá nguy hiểm. Nhiều nấm sợi sinh ra các độc tố nấm có thể gây ra bệnh ung thư và nhiều bệnh khác. Nấm mốc còn có thể phát triển, sinh axít và làm mờ các vật liệu vô cơ (thấu kính ở ống nhòm, kính hiển vi và một số dụng cụ quang học khác) Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ nấm sợi đồng thời hạn chế các tác hại do nấm sợi gây ra, con người đã tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến nấm sợi. Trước đây, các nhà nghiên cứu thường tập trung tìm hiểu nấm sợi phân bố ở đất liền. Những năm gần đây, con người mới nhận thấy hết được tầm quan trọng của hệ sinh thái RNM - HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST. Với điều kiện sinh thái của RNM con người có thể nghiên cứu khả năng chịu đựng và phục hồi của các tổ hợp gen. Có thể tìm ra được các chủng nấm sợi có hệ gen bền vững mang nhiều đặc tính có lợi cho con người. Nhiều loài thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân bố rộng rải trên rất nhiều loại cơ chất tự nhiên, phổ biến khắp nơi trên trái đất. Theo E. Kister, M. Morelet (2000) thì ước tính số lượng loài hiện biết của chi Penicillium là khoảng 233 loài, chi Aspergillus khoảng 185 loài.[52] Sự phong phú và đa dạng trong thành phần loài của chúng sẽ mang lại những lợi ích sinh thái và kinh tế vô cùng to lớn. Bên cạnh đó là những tác hại không nhỏ, cùng với những khó khăn trong công tác phân loại, hệ thống hai chi nấm này. Trong hệ sinh thái RNM Cần Giờ chi Aspergillus và Penicillium có vai trò rất quan trọng, tham gia vào phân huỷ nhanh xác TV, ĐV, góp phần khép kín chu trình vật chất nhờ có khả năng sinh ra các enzim như cellulaza, proteaza, amilaza, kitinaza để phân giải các hợp chất hữu cơ trong MT. Ngoài ra, nấm sợi còn có khả năng phân giải các hợp chất hydrocacbon giúp bảo vệ MT, nấm sợi còn có khả năng sinh ra KS... Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về phân loại, ứng dụng của chi Aspergillus và Penicillium khá nhiều và chỉ tập trung trên đất liền. Rất hiếm có nghiên cứu về hai chi này trên biển hay RNM. Cho đến nay, chưa có một công trình khoa học chính thức có hệ thống về VSV, đặc biệt khu hệ nấm sợi ở RNM Việt Nam nói chung, RNM Cần Giờ nói riêng. Để góp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt là khu hệ nấm sợi chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát đặc điểm sinh học một số nhóm nấm sợi từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh”.Thực tế, số nhóm nấm sợi ở RNM Cần Giờ là rất lớn, nên trong phạm vi đề tài này chúng tôi chỉ tập trung khảo sát ở hai chi Aspergillus và Penicillium. Mục tiêu của đề tài nhằm tìm hiểu tính đa dạng và vai trò của một số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium ở RNM Cần Giờ Tp. Hồ Chí Minh Nhiệm vụ của đề tài + Phân lập các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ . + Phân loại các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium. + Khảo sát một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi phân lập được. + Từ các chủng phân lập được tuyển chọn ra các chủng có các đặc điểm nổi bật. Bước đầu nhận xét sơ bộ về đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium. Đề tài được tiến hành từ tháng 9 năm 2008 đến tháng 7 năm 2009 tại phòng thí nghiệm Sinh hoá – Vi sinh, khoa Sinh, Trường Đại học Sư phạm Tp. Hồ Chí Minh. PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Rừng ngập mặn Cần Giờ Rừng ngập mặn (RNM) là một trong những HST quan trọng của hệ thống đất ngập nước. RNM là một HST đặc biệt với những điều kiện sinh thái đặc trưng là khí hậu nóng, đất mặn ngập nước quanh năm, hoặc có thuỷ triều lên xuống, thường xuyên thiếu khí và oxy khi ngập nước, đất chưa ổn định. Với MT đó, một quần hợp TV không họ hàng với nhau nhưng có những đặc tính sinh lý giống nhau, thích nghi sinh thái giống nhau tạo nên một kiểu rừng được gọi là RNM. Ở miền Nam, Việt Nam RNM còn được gọi là Rừng sát, tiếng Anh gọi là Mangrove. Danh từ Mangrove rất thông dụng trên thế giới. Trên thế giới, RNM thường gặp ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở Việt Nam, RNM đã từng bao phủ diện tích khoảng 400,000 ha vào năm 1943 (Maurand, 1943). Tuy nhiên, do nhiều nguyên nhân khác nhau như chiến tranh, chuyển đổi mục đích sử dụng, đốn củi, đã làm cho diện tích RNM ngày càng thu hẹp. Hơn 60 năm qua, trên 80% diện tích RNM bị tàn phá hoặc suy giảm chất lượng (worldbank, 2003). Đặc biệt trong những năm 1995 trở lại đây, RNM bị thu hẹp một cách nhanh chóng nguyên nhân do con người đã phá RNM để nuôi tôm.[10] Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh: RNM Cần Giờ giới hạn bởi các đoạn sông, rạch, tắc: sông Soài Rạp, sông Vàm Sát- rạch Đôn- tắc An Nghĩa- sông Lòng tàu, tắc Rổi- sông Đồng Tranh- tắc Nước Hội- sông Thị Vải- sông Gò Gia- sông Cái Mép và biển Đông, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đông sang Tây dài 30km. Thổ nhưỡng phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá và quá trình nhiễm mặn. Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm và chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa mưa nắng rõ rệt. Lượng mưa: thấp nhất TP. Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng 6 và tháng 9. [35] - Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt trong ngày từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C. [35] - Độ ẩm không khí: cao hơn các nơi khác trong TP. Hồ Chí Minh, mùa mưa độ ẩm từ 79 – 83%, mùa khô độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4. [36] - Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn và hai lần nước ròng trong ngày. Các tháng có đỉnh triều cực đại là tháng 10 và tháng 11, đỉnh triều thấp nhất là tháng 4 và tháng 5. [36] - Độ mặn: trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực có thể lên đến 18% [13], lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém, nước mặn xâm nhập sâu vào tháng 4 và bị đẩy xa vào tháng 9 và tháng 10. * Khu hệ thực vật Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng sú, ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng, v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa v.v…; các vườn cây ăn trái. [34] * Khu hệ động vật Theo khảo sát sơ bộ của dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999, kết quả: + Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài hữu nhũ. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)… [34] + Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau. [35] Phân vùng khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó: vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha. [35] * Khu hệ VSV - Vi khuẩn VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong HST này. Số lượng VK trong RNM chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát. [34] Nhiều loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển. - Nấm Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng. Phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích thước lớn. Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác lá TV (Fell và cộng sự 1975). Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai MT trở lên. [33] Ở Ấn Độ, muời loài nấm được phân lập từ lá RNM của Pichavaram là Aspergillus flavus, A. ochraceus, Alternaria alternata, A. tenuissima, Rhizopus nigricans, Penicillum funiculosum, P. expansum, Humicola fuscoatra, Mucor racemosa và Fusarium oxysporum. Aspergillus và Penicillium chiếm số lượng rất nhiều trong tất cả các lá RNM tiếp theo là các lọai Alternaria alternata và Rhizopus nigricans (Sivakumar and Kathiresan, 1990). Số nấm đếm được trên lá mục RNM nhiều hơn trên lá tươi. [41] Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn có các loài nấm ký sinh và hoại sinh như: Ascomycetes, Bacidiomycetes và Deuteromycetes. Người ta đã tìm thấy 6 chi nấm có mặt trên lá cây Đước đỏ (R. mangle): Cladosporium, Pestalotia, Alternaria, Zygosporium, Penicillium và Aureobacidium. [34] Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho các cây chủ như: Pestalotia, Phyllosticta, Cladosporium, Nigrospora và Cercospora. Hầu hết các loài nấm trên đất liền đều có trên lá cây ngập mặn, còn các loài nấm biển thì có trên rễ hoặc phần gỗ ngâm trong nước mặn. Khi cây chết thì gỗ phân huỷ tạo điều kiện thuận lợi cho các loại nấm phân huỷ phát triển. Các mẫu gỗ để ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân huỷ cao hơn những vùng chỉ ngập khi triều cao. [34] Nấm trong đất RNM có thể phân ra các loại nấm ở trong đất và loại nấm sống trên các mảnh vụn lá trên mặt đất. Cả hai loại này đều phụ thuộc vào lượng chất hữu cơ có trên bề mặt và trong đất. Một vài loài, đặc biệt là Aspergillus candidus cho thấy khả năng tạo ra các hợp chất phosphate tan từ các chất phosphorus không tan cho các SV khác sử dụng. Vì vậy, những nấm này đóng vai trò tạo chất dinh dưỡng trong HST (Prabhakaran et al., 1987). [41] Đối với lá cây ngập mặn thì nấm là SV phân huỷ đầu tiên, nhờ khả năng phân giải cellulose và lignin. Đa số các loại nấm được phân lập trên lá, gỗ và cây con thường là nấm hoại sinh góp phần phân huỷ xác TV. Chúng cũng góp phần phân huỷ cỏ biển, bùn và đầm lầy mặn. [46] Nấm đóng một vai trò rất quan trọng trong HST. Cùng với VK, nấm là SV phân hủy chính ở hầu hết các HST. Bởi vậy, nấm sợi có vai trò quan trọng các chu trình sinh địa hóa ở nhiều lưới thức ăn. Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy những vật chất hữu cơ thành những phân tử vô cơ, rồi sau đó những chất này sẽ được đồng hóa ở TV hay những SV khác. [46] Bản thân nấm sợi RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài ĐV nhỏ và ấu trùng của một số loài (Odum, 1980; Alongi, 1989). Tuy nhiên, các hoạt động sống của nấm sợi RNM lại làm giảm lượng oxi trong đất, bùn RNM do quá trình hô hấp, gây bệnh cho động thực vật hoặc thải vào MT một số chất độc như amoniac, sunfuahidrô…[13]. VSV ở RNM ngoài VK và nấm sợi còn có nấm men, xạ khuẩn… chúng đóng vai trò hết sức quan trọng đối với chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Có vai trò bảo vệ MT sinh thái RNM nói riêng và MT sinh thái nói chung, cũng như vai trò to lớn trong mối quan hệ sinh học giữa các loài SV. Từ đó, đóng góp vào việc giữ cân bằng cho HST đặc biệt này.  Vai trò của RNM đối với nền kinh tế Một số loài TV ở RNM có thể xếp vào nhóm công dụng chủ yếu: 30 loài cây cho gỗ, than, củi, 14 loài cây cho tannin, 24 loài cây làm phân xanh, 21 loài cây dùng làm thuốc, 9 loài cây chủ thả kiến cánh đỏ, 21 loài cây cho mật nuôi ong, 1 loài cây cho nhựa để sản xuất nước giải khát. [2] Ngoài ra, RNM còn có nguồn tài nguyên ĐV phong phú như 9 loài lưỡng cư, 22 loài bò sát, 67 loài chim, 21 loài thú… SV ở nước phong phú gồm 64 loài cá thuộc 35 họ, 25 loài tôm, 66 loài TV phiêu sinh, 26 loài ĐV phiêu sinh và 22 loài ĐV đáy. [2] Trong hệ sinh thái RNM, các loài động thực vật, VSV trong đất và MT tự nhiên được liên kết với nhau thông qua quá trình trao đổi và đồng hóa năng lượng. Các quá trình nội tại như cố định năng lượng, tích lũy sinh khối, phân hủy vật chất hữu cơ và chu trình dinh dưỡng chịu ảnh hưởng mạnh mẽ bởi các nhân tố bên ngoài gồm nước, thủy triều, nhiệt độ và lượng mưa. RNM phát triển tốt nhất ở nước có nồng độ muối 15 - 25‰. [2]  Vai trò của RNM đối với MT Bên cạnh các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở và quá trình xâm thực bờ biển. RNM cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển, là nơi sinh sản hoặc ươm nuôi của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,… Mặt khác, RNM còn có tác dụng làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sóng khi triều cường. Hạn chế tác hại của sóng thần và bão lớn, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ nước ngầm. RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, làm sạch MT nước khi có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất.[4][18] 1.2 Sơ lược về nấm sợi 1.2.1 Phân loại của nấm sợi Nấm phân bố trên toàn thế giới và phát triển ở nhiều dạng MT sống khác nhau, kể cả sa mạc. Đa phần nấm sống ở trên cạn, nhưng một số loài lại chỉ tìm thấy ở MT nước. Nấm và VK là những SV phân huỷ chính, có vai trò quan trọng đối với các HST trên cạn. Dựa theo tỉ lệ giữa số loài nấm với số loài TV ở trong cùng một MT, người ta ước tính giới Nấm có khoảng 1,5 triệu loài. [38] Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống của giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota và Eumycota. Eumycota bao gồm 5 ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina, Ascomycotina và Basidiomycotina [49] Ngành phụ Deuteromycotina được chia theo 3 lớp: [50] + Khuẩn ty không phát triển hoặc phát triển yếu; dạng cơ thể giống như nấm men và có sự nảy chồi: Blastomycetes + Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục hoặc sinh BT trên cuống, không có sự tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT: Hyphomycetes + Khuẩn ty thật, BT tập trung trong túi BT hoặc trên cụm cuống BT: Coelomycetes Lớp Hyphomycetes được chia thành 3 bộ: Moniliales, Melanconiales và Sphaeropsidales. Có thể tóm tắt phần phân loại nấm ở sơ đồ 1 (xem phần phụ lục 12) Theo C. J. Alexopoulos (2002), nấm có 3 phần trong giới nấm, giới Stramenopila (một giới mới bao gồm các SV có cấu trúc lông roi được tách ra từ protista) và giới Protista. Giới nấm có 4 ngành: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota. Phần của nấm trong giới Stramenopila có 3 ngành: Oomycota, Hyphochytriomycota, Labryrinthulomycota. Bốn ngành khác của nấm được xem như là các SV nguyên sinh trong giới protista: Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota, Myxomycota. Lý do của sự phân chia này là từ những bằng chứng mới của các nghiên cứu về rRNA và hoá sinh học. Các bằng chứng chứng minh sự tồn tại của 3 nhóm nấm khác nhau. Gần đây, sau khi hệ thống phân loại giới xuất hiện, giới nấm được tái cấu trúc và sắp xếp lại. Tất cả các phần trong các giới khác nhau được tập hợp lại chỉ trong một giới nấm. Các nhà nấm học phân chia giới này thành hai phần: nấm giả, bao gồm 7 ngành: Oomycota, Hyphochytridiomycota, Labyrinthulomycota, Plasmodiophoromycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota và Myxomycota và nấm thật là những phần còn lại. [49] 1.2.2 Hình thái và cấu tạo chung của nấm sợi Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể chuyển động. Có đường kính 1-30µm (thông thường là 5-10 µm). Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón không tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần ngọn của sợi nấm. Phần này chất nguyên sinh không có nhân và chứa ít cơ quan tử. Tiếp đến là phần tăng trưởng chứa nhiều nhân, nhiều cơ quan tử và nhiều enzim. Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và phân nhánh của sợi nấm. Dưới nữa là phần thành cứng - phần thành thục của sợi nấm. Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm (xem hình 1a). [4] [50] Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, trong nhân có hạch nhân (nucleolus). Trong tế bào nấm còn có ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle) , thể golgi [4], các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitô đường kính 40-70nm(chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome) (xem hình 1b). [50] Ribosome của nấm thuộc loại 80S (S là đơn vị hệ số lắng Svedberg) có đường kính khoảng 20-25nm, gồm 2 tiểu phần: tiểu phần lớn 60S và tiểu phần nhỏ 40S [51] Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL. Vì BT của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường có màu. Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn. Ngược lại, các nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách ngăn (xem hình 2). Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có thể gọi là đơn bào. Ở các nấm không vách ngăn thì vách ngăn vẫn có thể hình thành khi cơ thể sinh sản, tại các bộ phận bị thương tổn sợi nấm cũng có thể hình thành vách ngăn. Đó là loại vách ngăn liền, không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ cơ thể. [5] Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đa bào. Mỗi tế bào có 1 nhân hoặc nhiều nhân. Tuy nhiên, sợi nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều tế bào. Vách ngăn ngang được hình thành từ thành tế bào. Lúc đầu là một gờ nhỏ hình khuyên sao đó tiến dần vào trong và lấp kín lại. Tuy nhiên, vách ngăn thường có một hay nhiều lỗ thủng. Các lỗ có kích thước bằng nhau hay có một lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều lỗ nhỏ ở xung quanh. Hình 1.2: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không có vách ngăn (a) Cấu tạo của phần ngọn sợi nấm [51] Hình 1.1: Cấu tạo phần ngọn và cấu trúc của sợi nấm (b) Cấu trúc của sợi nấm [51] Vách tế bào Màng tế bào Nhân Thể golgi Không bào Ti thể Luới nội chất Nhân Ngoài những đặc điểm chung thì nấm sợi RNM còn có những đặc trưng riêng đáng được quan tâm và cần có nhiều công trình nghiên cứu hơn nữa trên những đối tượng này bởi các lý do sau: Ở MT sống khắc nghiệt, kiểu trao đổi chất của chúng sẽ khác biệt hơn so với các nấm ở đất liền. Do đó, các sản phẩm trao đổi chất, đặc biệt là chất KS cũng mang tính chất khác lạ hơn [14]. Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của nấm sợi RNM. Do đó, phần lớn các nấm sợi RNM đều có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm giúp chúng thích ứng với điều kiện sống. Điển hình là khả năng sinh nhiều loại enzim, nhất là các ezim ngoại bào có chức năng phân giải xác động thực vật là thành phần hữu cơ chính của RNM, các chất KS và các độc tố giúp làm tăng khả năng ĐK của nấm sợi trong quá trình cạnh tranh ở MT sống. Gần đây, người ta phát hiện ra nấm biển và nấm sợi RNM là nguồn VSV có tiềm năng sinh các chất KS mới, chống lại các VSV nhờn thuốc. Sống trong MT biến động, MT chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền, ô nhiễm do tràn dầu…đã tạo cho các nấm sợi RNM có những cơ chế phản ứng lại với những tác động này, bằng khả năng phân giải những chất thải độc hại nhờ sinh tổng hợp được hệ enzim phân giải. RNM là một HST chịu nhiều tác động của gió bão. Sau những tác động trên, vấn đề ô nhiễm là điều không thể tránh khỏi, nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh [13]. Nhờ có những đặc tính sinh học đáng quí như khả năng sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại. Từ đó, có thể cải thiện MT sống cũng như giúp con người nâng cao khả năng điều trị bệnh tật. Đa số các nấm sợi RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ muối từ 2% - 20%. Thậm chí, một số nấm sợi RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30% [13]. Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM. Nấm sợi ở RNM có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu về nấm sợi RNM còn rất khiêm tốn, chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của chúng, 1.2.4 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM trên thế giới và Việt Nam Hiện nay, có khoảng 800 – 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995; Jones, 1995), trong khi đó có một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu biết của loài người về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu HST này còn quá ít và chưa đầy đủ (Agate A.D., Subramania, C.V và Anuci, V.1998). Sự nghiên cứu về nấm RNM mới chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950. Theo cơ sở dữ liệu (chưa đầy đủ) của mạng nấm RNM toàn cầu có thể thấy nhiều nước đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hoá các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ. Cụ thể: Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông: 170 loài, Đài Loan: 7 loài, Trung Quốc: 2 loài, Singapore: 116 loài, Nhật: 26 loài, Úc: 67 loài, Mỹ: 18 loài, Malaysia: 164 loài, Indonesia: 7 loài, Thái Lan: 83 loài, Brasil: 48 loài, Mexico: 94 loài, Kuwait: 14 loài, Đức: 4 loài. Qua đó, có thể thấy phân loại nấm biển RNM còn rất ít và chưa đáp ứng đủ yêu cầu cấp bách cho sự tiến bộ của ngành VSV học. [51] Năm 1988, Agate A.D., Subramania C.V và Vanuci M., đã nêu ra tám lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV học RNM cần các nhà khoa học giải quyết. Trong đó, có lĩnh vực phân loại và hệ thống hoá cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới. Năm 1979, Kohlmeyer là người đầu tiên đánh giá vai trò quan trọng của các nấm đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Đã nhận dạng được 43 loài nấm bậc cao, bao gồm 23 loài Ascomycetes, 17 loài Deuteromycetes và 3 loài Basidiomycetes. Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới. Trong đó, bao gồm 87 loài Ascomycetes, 31 loài Deuteromycetes và 2 loài Basidiomycetes. Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra một số lượng lớn loài mới, thậm chí là chi mới. Bộ sưu tập nấm RNM ở Macau và Hồng Kông tìm được 45 loài mới, 28 loài trong số mới này tìm được ở Macau và 21 loài được tìm thấy ở Hồng Kông (Vrijmoed et al., 1994) Năm 1990, Sivakumar và Kathiresan đã phân lập được 10 loài nấm từ bề mặt lá của 7 loài cây ngập mặn. Trong số đó, loài chiếm ưu thế trên bề mặt lá là các loài Alternaria alternate, Rhizopus nigricans, Aspergillus spp.[41] Một số nấm sợi còn có hoạt tính diệt côn trùng mạnh, có thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm diệt côn trùng một cách an toàn. Đây là một nguồn gen quí, rất có giá trị đối với sinh học và y học (theo Mai Thị Hằng và cộng sự). [11] Theo nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) đã phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi có hoạt tính cellulaza cao, có khả năng đường hoá giấy in, giấy báo cũ, chuyển hoá nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho cây trồng. Với đặc tính này nấm sợi góp phần phân giải xác TV ở RNM Cần Giờ. [1] Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thanh Thuý (2007) đã tuyển chọn được các chủng nấm sợi có khả năng phân giải dầu, góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu, xử lý ô nhiễm MT dầu ngày nay.[30] Nấm sợi RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống với việc phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng [13]. Bên cạnh vai trò làm sạch MT sống nói chung, nấm sợi RNM còn có vai trò làm sạch MT sinh vật với chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái. Ngoài ra, nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) đã tuyển chọn được các chủng có hoạt tính ĐK với VSV gây bệnh, hoạt tính phân giải phốt phát khó tan, lại thêm hoạt tính chịu mặn. Điều này, có ý nghĩa hết sức quan trọng trong chu trình photpho của RNM Cần Giờ. [27] 1.3 Đặc điểm của Aspergillus 1.3.1 Vị trí phân loại của chi Aspergillus trong các hệ thống phân loại nấm - Năm 1729 P. A. Micheli lần đầu tiên mô tả chi Aspergillus (Maren. A. Klich, 2002). - Năm 1900, Lindau lại xếp Aspergillus vào trật tự: Lớp (Class) : Fungi imperfect Bộ (Order): Hyphomycetes Họ (Family): Mucedinaceae Họ phụ (Subfamily): Aspergillaceae Chi (Genus): Aspergillus - Năm 1950, Bessey đã xếp Aspergillus vào hai lớp khác nhau: Lớp 1 (Class): Ascomycetes Lớp 2 (Class): Ascomycetes Bộ (Order): Aspergillaces Bộ (Order): Moniliales (Hyphomycetes) Họ (Family): Aspergillaceae Họ (Family): Moniliaceae Chi (Genus): Eurotium Chi (Genus): Aspergillus - Năm 1962, Alexopoulos trong cuốn “Introductory Mycology” đã xếp Aspergillus vào hai lớp: Ascomycetes (khi người ta tìm thấy hình thức sinh sản của nó) và vào Form class: Deuteromycetes (ở trường hợp ngược lại) Lớp (Class) : Ascomycetes Lớp (Class) : Deuteromycetes Dưới lớp (Subclass) : Euroascomycetidae Bộ (Order) : Moniliales (series: Plectomycetes ) Họ (Family) : Moniliaceae Bộ (Order): Eurotiales Chi (Genus) : Aspergillus Họ (Family) : Eurotiaceae Chi (Genus) : Eurotium, Sartorya, Emerycella (hình thức vô tính Aspergillus ) - Năm 1973, Ainsworth đã xếp Aspergillus thuộc tổ chi Phialoconidiae lớp Hyphomycetes, ngành phụ nấm bất toàn Deuteromycotina. [51] - Năm 1977, Bùi Xuân Đồng căn cứ vào đặc điểm hình thái phát sinh BTT của Deuteromycota đã xếp chi Aspergillus vào tổ chi Phialocolidiae, lớp phụ Euhiphomycetidae, lớp Hyphomycetes, ngành phụ Nấm bất toàn (Deuteromycotina) (Bùi Xuân Đồng, 2001 ) - Năm 2000, Robert K Noyd, lại xếp Aspergillus thuộc họ Monilaceae, bộ Moniliales, lớp Hyphomycetes, ngành Deuteromycota. [50] 1.3.2 Hình thái của Aspegillus Chi Aspergillus Micheli ex Fries đặc trưng bởi những đặc điểm sau: Hệ sợi nấm gồm các sợi vách ngăn, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất định của KL. Sinh sản vô tính bằng BTT (conidia). Hình thái cơ quan sinh BTT là một đặc điểm chủ yếu đặc trưng dùng trong phân loại chi này. Đặc điểm của cơ quan sinh BTT: Bộ máy mang BTT phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của sợi nấm (tế bào chân – foot cell). Gíá BTT phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm, gần thẳng gốc với trục của tế bào chân và thường ở trên mặt cơ chất (Hình1.3). Giá BTT không có nhánh, không có hoặc có ít vách ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy ( Hình 1.4k), hình quả bầu (Hình 1.4b ,d, g), hình bàn trang (phần đỉnh bọng giá thẳng-Hình 1.4a, c, e) hình nửa cầu (Hình 1.4l, m…) hoặc hình cầu (Hình 1.4q), bọng này mang các thể bình. Các thể bình này hoặc song song và hợp thành cụm ở phần đỉnh bọng, hoặc xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt bọng. [6] A B C D E F Hình 1.3: Hệ bào tử trần của chi Aspergillus A- Bọng; B- Bộ cuống đính BT đầu tiên; C- Bộ cuống đính BT thứ hai; D- Bào tử trần; E- Sợi cuống; F- Tế bào gốc ( Nguyễn Đức Lượng- Thí nghiệm VSV học) a b c d e g h i l m n p qo k Hình 1.4: Bọng đỉnh giá mang thể bình hoặc mang cả cuống thể bình và thể bình ở một số loài thuộc chi Aspergillus Mich. Ex Fr. [6] a- A. conicus Blochw; b- A. clavatus Desm; c- A. nidulans (Eid); d- A. fumigatus Fres; e- A. sersicolor (Vuill); g- A.malinus Lindt; h- A.sydowi (Bain.et Sart) Thom et Church; i- A.niveus Blochw; k- A.vảaans Wehm; l- A.glaucus Link; ; m- A.citrispóu Hohn; n- A.terreus Thom; o- luchuensis Inui; p- A. ustus (Bain) Thom et Church, q- A.sulphureus (Fres) Thon et Church ( M.A.Litimov 1967) Thể bình hoặc chỉ có một tầng hoặc hai tầng. Trong trường hợp sau, mỗi thể bình cấp một (cũng gọi là cuống thể bình, metula) mang một cụm gồm hai hoặc ba (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp hai (gọi là thể bình) ở phần đỉnh. Các BTT được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng góc (BT ở ngay miệng thể bình là BT non nhất, càng xa miệng thể bình càng già), không phân nhánh. [6] BTT không vách ngăn, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài (nhẵn, có gai, có nốt sần) tuỳ từng loài. Tất cả các chuỗi BTT tạo thành từ các thể bình của một bọng đỉnh giá hợp thành khối BTT đỉnh bọng – bông nấm (conidial head). Khối BTT đỉnh bọng có thể có các dạng hình cột (các chuỗi BTT song song, sát nhau), hình cầu hoặc hình tia toả tròn. Một số loài có BT túi (ascosporum) trong các thể quả kín (cleitothecium). [6] 1.3.3 Các chất có hoạt tính sinh học của Aspegillus Nhiều loài thuộc chi Aspergillus phân bố rộng rải trên các cơ chất tự nhiên, trong các sản phẩm công nông nghệp, ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên thế giới. Một số loài, đặc biệt là A. oryzae đã được dùng rộng rãi trong công nghệ lên men truyền thống để chế biến thực phẩm ở nhiều nước châu Á như Việt Nam (làm tương), Trung Quốc, Nhật Bản, Indonexia, Philipin… Hiện nay, công nghệ sinh học sử dụng một số loài thuộc chi Aspergillus chủ yếu là các loài A. niger, A. oryzae trong CN sản xuất enzym (amylaza, glucoamylaza, pectinaza, proteaza, cellulaza), trong CN chế biến thực phẩm, CN sản xuất acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic. [6] Nhiều loài thuộc chi nấm này có hoạt tính biến đổi sinh học, một số loài tạo thành độc tố (mycotoxin), đặc biệt đáng chú ý là các loài tạo thành các độc tố gây ung thư gan như các loài A. flavus, A. parasiticus tạo thành aflatoxin, A. versicolor tạo thành sterigmatocystin. [6] Ở Việt Nam, một số chế phẩm enzim như các chế phẩm glucoamylaza từ A . awamori, từ A. niger. Nghiên cứu chọn lọc các chủng thuộc các loài A. awamori, A. niger, A. oryzae có hoạt tính amylaza và glucoamylaza để phân giải tinh bột sắn. Nghiên cứu thu nhận và sử dụng proteaza từ A. oryzae trong sản xuất nước chấm, để khử lông da súc vật. Thu nhận và sử dụng pectinaza, amylaza từ A. niger để xử lý dược liệu nguồn gốc từ TV. Nghiên cứu sử dụng một số chủng thuộc loài A. niger để nâng cao chất lượng thức ăn chăn nuôi. Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp acid citric của một số chủng lựa chọn của loài A. niger. Nghiên cứu lựa chọn được chủng A. niger TH3-19K của Nhật Bản có hoạt tính glucoamylaza cao dùng để phân huỷ tinh bột sống. Nghiên cứu hoạt tính phân giải phosphat khó tan và cellulose của A. japonicus, khả năng phân giải cellulose của một chủng ưu nhiệt thuộc loài A. unilateralis. Nghiên cứu hệ vi nấm ĐK với các VK kháng KS ở Việt Nam, trong đó có 14 loài thuộc chi Aspergillus có hoạt tính này. [6] Như vậy, các nhóm loài được nghiên cứu trong công nghệ sinh học chủ yếu là nhóm loài A. fumigatus, A. flavus, A. niger. [6] 1.4 Đặc điểm của Penicillium 1.4.1 Vị trí phân loại của Penicillium trong các hệ thống phân loại nấm Chi Penicillium do Link mô tả đầu tiên năm 1809 với 3 loài: P. camdidum, P. expansum và P. glaucum. Vị trí phân loại của Penicillium được thay đổi theo tiến trình lịch sử như sau: - Theo hệ thống phân loại hình thái của Saccardo, năm 1886 : Lớp: Nấm bất toàn (Deuteromycetes) Bộ : Moniliales. Họ: Moniliaceae. Chi: Penicilium. - Theo Fischer (1897): Lớp (Class): Ascomycetes Bộ (Order): Plectasciales Họ (Family): Penicilliaceae Chi (Genus): Penicillium - Năm 1953 Hughes xếp Penicillium vào tổ chi VI (Section VI), nhóm Hyphomycetes trong hệ thống phân loại nhóm Hyphomycetes. [6] - Năm 1972, 1977 Bùi Xuân Đồng xếp Pencillium theo hệ thống sau: Ngành (Division): Mycota Ngành phụ (Sub-Division): Deuteromycotina Lớp (Class): Hyphomycetes Lớp phụ (Sub-Class): Euhyphomycetidae Tổ chi (Section): Phialoconidiae Chi (Genus): Penicillim [6] -Theo hệ thống phân loại của G. C Ainsworth, năm 1973: Ngành (Phylum): Eumycota (Eumycetes) Ngành phụ (Subdivision): Deuteromycotina Lớp (Class): Hyphomycetes Bộ (Order): Moniliales Họ (Family): Moniliaceae Chi (Genus): Penicillium [46] - Gần đây nhất, Robert K Noyd (2000) lại xếp Penicillium vào trật tự như sau: Ngành (Division): Deuteromycota Lớp (Class): Hyphomycetes Bộ (Order): Moniliales Họ (Family): Moniliaceae Chi (Genus) :Penicillium 1.4.2 Hình thái của chi Penicillium Chi Penicillium được đặc trưng bởi các đặc điểm sau: Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu sẫm. [6] [19] KL màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám, xám, đôi khi màu vàng, đỏ, tím hoặc trắng. Mặt trái KL không màu hoặc có màu sắc khác nhau, MT thạch nuôi cấy không màu hoặc có màu do có mặt của các sắc tố hoà tan tương ứng. KL có hoặc không có vết khứa xuyên tâm hay đồng tâm, có hoặc không có các giọt tiết. [6] Sinh sản vô tính bằng BTT với cấu tạo như sau: * Bộ máy mang BTT ( còn gọi là chổi – penicillus) hoặc chỉ gồm một giá BTT với một vòng thể bình ở đỉnh giá (cấu tạo một vòng, monoverticillate – hình 5a), hoặc gồm giá BBT với hai đến nhiều cuống thể bình (metulae) ở phần ngọn giá, trên đỉnh của mỗi cuống thể bình đó có các thể bình (cấu tạo hai vòng, biverticillate). [6] * Trường hợp các giá BTT mang một hoặc nhiều nhánh (branch) ở phần ngọn giá, sau đó các nhánh mang các cuống thể bình và các cuống thể bình lại mang các thể bình cũng được coi là cấu tạo hai vòng. (Hình 1.5b) Khi các cuống thể bình xếp đều đặn và sát nhau trên ngọn giá, cấu tạo hai vòng đó được gọi là cấu tạo hai vòng đối xứng, trường hợp các cuống thể bình xếp không đều trên phần ngọn giá hoặc có nhánh, cấu tạo này được gọi là cấu tạo hai vòng không đối xứng. [6] * Trường hợp giá BTT mang nhiều nhánh và các nhánh này cùng với các cuống thể bình, các thể bình xếp đều đặn và sát nhau, bộ máy mang BTT có cấu tạo nhiều vòng (polyverticillate). Giá BTT có thể phát triển từ các sợi nấm nằm sát cơ chất, sát mặt MT thạch nuôi cấy (các sợi nền), khi đó thường có chiều dài đều nhau, và KL có dạng mặt nhung. Giá BTT có thể là nhánh của các sợi nấm khí sinh, KL trong trường hợp này có dạng len hoặc xốp bông (lanate, floccose). Trường hợp Nhaùnh Hình 1.5: Chi Penicillium Link ex Pries. Các thành phần của chổi [7] (a) (b) các giá BTT là các nhánh của các bó sợi hoặc bản thân chúng tụ họp lại với nhau thành các bó giá, KL đặc trưng bởi sự có mặt của các bó sợi (funiculose) hoặc của các bó giá (fasciculase). [6] * Tế bào sinh BTT của các loài thuộc chi Penicillium là các thể bình. Thể bình ở nhiều loài của chi nấm này có phần đỉnh ngắn và thon nhỏ dần, phần đỉnh này thường có đường kính vào khoảng một phần ba đường kính của phần thân. Một số loài thuộc nhóm loài Biverticillata-Symmertrica có thể bình hình mũi dáo (thể bình có hình mũi dài và thon nhỏ dần) (Hình 1.6). [6] * BTT của các loài thuộc chi Penicillium thuộc típ phialoconidi (típ cơ bản euconidi), không có vách ngăn, hình cầu, gần cầu, hình trứng, elip, đôi khi hình trụ. Khi riêng rẽ, các BTT không màu hoặc màu nhạt, khi tụ họp thành đám thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám. Các BTT này tạo thành chuỗi dài trên miệng thể bình. [6] * BTT cũng như giá BTT, các nhánh, các cuống thể bình, các thể bình tuỳ từng loại có mặt ngoài nhăn, ráp, có gai hoặc sần sùi, gồ ghề.(Hình 5,6) Một số ít loài tạo thành hạch nấm (sclerotium). Hạch nấm cấu tạo bởi các tế bào có vách dày, có thể rất cứng hoặc mềm, hình cầu, gần cầu, không màu hoặc có màu sắc khác nhau, đơn độc hoặc thành cụm. Một số loài có BT túi (ascosporum). Thể quả túi là những thể quả kín (cleisthothecium), có vỏ thể quả cứng hoặc mềm, có hoặc không có các sợi nấm bao quanh, thể sinh túi cuộn xoắn hoặc thẳng, túi BT (ascus) đơn độc hoặc thành chuỗi, BT túi không ngăn vách, có hoặc không có rãnh và gờ quĩ đạo. [6] 1.4.3 Các chất có hoạt tính sinh học của Penicillium Nhiều loài thuộc chi Penicillium được dùng trong công nghệ KS. Trong CN sản xuất KS hiện nay, một số chủng đã xử lý đột biến của P. chrysogenum có thể dùng để sản xuất penicillin tự nhiên (penicillin G, penicillin V…) và axit 6- aminopenycillamic (dùng để sản xuất các penicillin bán tổng hợp như ampicillin, oxacillin…).[6] Hình 1.6: Chi Penicillium Link ex Fries. Các kiểu thể bình. a- Thể bình có phần cổ rộng ở P. expansum Link và nhiều loài, b- Thể bình có phần cổ hẹp ở P. janthinellum Biourge và các loài lân cận, c- Thể bình hình mác ở P. funicolusum Thom và một số loài thuộc nhóm loài Biverticillata-Symmetrica (Raper và Thom, 1949) a b c Ngoài ra một số loài khác thuộc chi Pencillium được dùng trong CN chế biến thực phẩm như CN sản xuất phomat (P. roqueforti). Nhiều loài cũng đã được nghiên cứu khà năng tạo thành các axit hữu cơ, về các hoạt tính enzim và một số sản phẩm trao đổi chất khác. [6] Trong chi Penicillium cần lưu ý môt số loài có khả năng tạo thành mycotoxin, đặc biệt các mycotoxin có khả năng gây ung thư gan như các loài P.islandicum tạo thành độc tố islandotoxin và luteoskyrin, loài P.urticae tạo thành patulin… [6] Aspergillus và Penicillium có vai trò to lớn trong thiên nhiên cũng như đối với đời sống con người. Việc nghiên cứu về hai chi này góp phần đánh giá sự đa dạng về về thành phần loài và số lượng loài. Đồng thời, góp phần quan trọng trong việc xác định các loài có khả năng sinh các chất sinh học quý như KS, enzim và các chất hoạt tính sinh học khác. PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Nguyên liệu Các mẫu lá vàng, lá mục, cành khô, cành mục, đất, đất sâu từ các xã Lý Nhơn, An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp, Long Hoà, thuộc Huyện Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Các VSVKĐ gồm: Escherichia coli, Bacillus subtilis do viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh cung cấp. 2.1.2 Hoá chất - Glucose, NaNO3, KCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, (Trung Quốc). - Yeast extract (Mỹ), CMC (Nhật), Malt extract (Đức), pepton (Anh), casein, Agar ( Việt Nam). - Thuốc thử: lugol, HgCl2. - Thuốc nhuộm: Lactophenol - Chất KS: Cloramphenycol (Ấn Độ) 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu đề tài là những thiết bị chuyên dùng trong thí nghiệm vi sinh. - Nồi hấp cao áp Huxley (Đài Loan) - Tủ sấy Memmert (Đức) - Kính hiển vi quang học, máy chụp hình kỷ thuật số Olympus 5.1 (Nhật) - Máy đo pH Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc) - Kính lúp soi nổi (Nhật Bản) - Tủ cấy vô trùng (Việt nam) - Tủ lạnh (National - Nhật) - Tủ giữ mẫu (Sanyo - Nhật). - Máy lắc (Gerhardt - Đức) - Cân phân tích ( Sartorius - Đức) - Máy GPF – định vị vệ tinh toàn cầu (Nhật) 2.1.4 Các môi trường đã sử dụng MT1: Glucose Yeast Agar (YEA): Dùng để phân lập, nuôi cấy và giữ giống nấm sợi. Glucose 20g Cao nấm men 4g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 5,5 – 6,0. MT2: MT Czapek – Dox: Nuôi cấy, giữ giống nấm sợi, thử hoạt tính enzym ngoại bào (amilaza, proteaza, xenlulaza) [10] Glucose 20g KH2PO4 1,5g NaNO3 3,5g KCl 0,5g MgSO4.7H2O 0,5g FeSO4.7H2O 0,1g (vết) Agar 20g Nước biển 1000ml, pH=6,5-7 Để thử hoạt tính enzym amilaza, cellulaza ta dùng các cơ chất tương ứng là tinh bột, CMC thay đường glucose với hàm lượng tương đương 10g. Riêng hoạt tính enzym proteaza thì môi trường trên thay 3,5g NaNO3 bởi 10g casein MT3: Meat peptone agar (MPA): Dùng để nuôi cấy giữ giống VSVKĐ [10] Pepton 5g NaCl 5g Cao thịt 5g Agar 20g Nước cất 1000ml, pH = 7,5 MT4: Malt Extract Agar (MEA): Dùng để phân loại nấm sợi. Khi nuôi nấm sợi để thử hoạt tính KS thì MT này sẽ thay nước biển bởi nước cất với lượng tương đương. Malt Extract 20g Pepton 1g Glucose 20g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 5,6 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Các phương pháp vi sinh vật 2.2.1.1 Phương pháp lấy mẫu Chúng tôi phân lập các chủng nấm sợi từ các mẫu lá vàng trên cành (Ký hiệu là L), lá mục (LM), cành khô (CK), cành mục (CM), đất mặt (Đ), đất sâu 5 – 10cm (ĐS) từ RNM Cần Giờ. Tiến hành thu mẫu 3 đợt vào tháng 9, tháng 12 năm 2008 và tháng 3 năm 2009 tại 4 xã Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp huyện Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Cách lấy: Dùng dao kéo vô trùng cắt khoảng 10 g mẫu cho vào túi nilon vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm, ngày tháng lấy mẫu. Các mẫu được bảo quản lạnh và phân lập ngay không quá 24 giờ.[6] [37] 2.2.1.2 Phân lập nấm sợi theo phương pháp pha loãng mẫu (theo F. Uyenco (1988)) a. Nguyên tắc Tách rời các BT nấm sợi. Nuôi cấy các BT trên MT dinh dưỡng đặc trưng để cho KL riêng rẽ, cách biệt nhau. Cấy chuyền một hoặc vài lần có thể thuần khiết được chủng nấm sợi. b. Tiến hành Cân 10g đất, lá, thân (đã nghiền nhỏ) cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển. Sau đó đưa vào máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút, thu được dịch lọc có độ pha loãng 10-1. Lắc đều rồi hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10- 5, 10-6. Nhỏ 0,1ml (2giọt) dung dịch ở mỗi nồng độ lên hộp petri có chứa môi trường (MT2). Dùng que trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục sang đĩa MT 2 và 3. Sau đó, ủ các đĩa ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Tách các KL riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cuối cùng, cấy giống sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của nấm sợi.[32] [43] c. Yêu cầu Các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết. 2.2.1.3 Giữ giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng a. Nguyên tắc: Bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của giống. Tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. b. Tiến hành Cho một lượng dầu khoáng (như paraffin lỏng hay vazơlin) vào ống eppendofy, khử trùng bằng cách hấp ở 1210C trong 30 phút, để nguội. Nấm sợi cần bảo quản được nuôi cấy từ 3 đến 5 ngày. Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng BT cho vào ống eppendofy, đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống và bảo quản ở điều kiện lạnh.[32] 2.2.1.4 Quan sát hình thái nấm sợi * Quan sát đại thể nấm sợi Nấm sợi sau khi cấy chuyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau: - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng. - Dùng que cấy lấy một ít BT từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2, 3 hộp. Lưu ý không để điểm chấm loang trên mặt thạch. - Ủ ấm trong 1 tuần lễ để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát. Dùng kính lúp ba chiều soi mô tả các đặc điểm: + Hình dạng, kích thước KL. + Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố nấm sợi tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL. + Giọt nước đọng, mùi, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL …[5] * Quan sát vi thể nấm sợi bằng phương pháp làm phòng ẩm nuôi cấy nấm của J.T.Dunean. Chuẩn bị MT thích hợp (MEA, YEA), đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. Khi thạch đã đông thì dùng dao vô trùng cắt từng mẫu hình vuông, diện tích 1cm2. Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông (hoặc giấy thấm) nước vô trùng. Đặt khối thạch lên phiến kính. Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lá kính lại và cho vào hộp petri có sẵn bông (hoặc giấy thấm) được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày, ở 270C. Sau 3-4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản để quan sát hình thái nấm sợi. Quan sát dưới vật kính 40, 100 các đặc điểm: + Giá BTT, thể bình và cuống thể bình. + Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Màu sắc, hình dạng BT, có gai hay không có gai. Chụp hình trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 – 1000 lần.[5] [6] 2.2.1.5 Kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch [5] [32] a. Nguyên tắc Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, còn phần cơ chất bị nấm sợi phân huỷ sẽ không tạo màu mà tạo vòng trong suốt quanh KL. b. Thực hiện * Phương pháp cấy chấm điểm Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp. Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi đã nghiên cứu (ba điểm trong một hộp petri) lên MT thử hoạt tính tương ứng (MT2). Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 280C – 300C, trong 4-5 ngày. c. Kiểm tra kết quả Kiểm tra hoạt tính enzym bằng thuốc thử tương ứng: + Kiểm tra hoạt tính proteaza: đổ dung dịch thuốc thử 10% HgCl2 lên bề mặt MT nuôi cấy, nếu nấm sợi sinh ra proteaza sẽ có một vòng trong suốt quanh KL (cấy chấm điểm) do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng kết tủa với HgCl2. Các phân tử protein chưa bị phân giải có màu trắng đục. + Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase. Cả hai loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch: * Nếu nấm sợi có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt. * Nếu nấm sợi có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL. Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm. d. Đánh giá khả năng tạo enzym Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d). (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh (D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu 2.2.1.6 Kiểm tra khả năng ĐK của nấm sợi bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch. [5] a. Nguyên tắc Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất ĐK thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSVKĐ và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. b. Tiến hành thí nghiệm * Phương pháp khối thạch Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thích hợp (MT4), không dùng nước biển mà dùng nước cất thay thế. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có chủng nấm sợi cần thử hoạt tính ĐK. Đặt các khối thạch vào đĩa petri có MT đã cấy VSV kiểm định. c. Kiểm tra kết quả Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d). (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh (D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu 2.2.1.7 Kiểm tra khả năng chịu mặn của nấm sợi [6] a. Nguyên tắc Mỗi loài nấm sợi thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể hiện các hoạt tính khác nhau. b. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị MT YEA (MT1), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%. Cấy 3 điểm các chủng nấm sợi nghiên cứu lên bề mặt các MT nghiên cứu có các nồng độ muối khác nhau. Nuôi trong tủ ấm 3 ngày, ở 280 – 300C. Mẫu đối chứng nuôi trên MT không NaCl. c. Kết quả Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng nấm sợi nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh trưởng. Thử hoạt tính enzim ngoại bào theo phương pháp 2.2.1.5 và hoạt tính ĐK theo phương pháp 2.2.1.6 ứng với từng nồng độ muối. 2.2 Phương pháp toán học Xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản - Phương pháp tính giá trị trung bình  : Giá trị trung bình n lần thí nghiệm. Xi : Giá trị lần thí nghiệm thứ i n : Số lần lặp lại thí nghiệm - Phương pháp tính khoảng ước lượng Trong đó: tα tra bảng phân phối student với n –1 bậc tự do và mức 0,1 ở bảng hai phía. Sn+2(X) là phương sai mẫu. Sn+2(X) = 1/(n-1)∑ (Xi - )2 a =  ± tα S + 2n (X) √n PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Quá trình lấy mẫu được tiến hành ở 4 xã: Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp thuộc Huyện Cần Giờ. Các vị trí lấy mẫu được thể hiện trên bản đồ hình 3.1 Hình 3.1: Bản đồ xác định các vị trí lấy mẫu đợt 1 - Chúng tôi dùng máy GPF định vị vệ tinh toàn cầu để xác định toạ độ của 4 xã như sau: * Tam Thôn Hiệp: 10035’17.14’’N 106049’26.54’’E * An Thới Đông: 10034’34.65’’N 106049’20.53’’E * Lý Nhơn 10033’34.45’’N 106049’18.13’’E * Long Hoà 10029’37.11’’N 106052’07.45’’E Qua 3 đợt lấy mẫu chúng tôi phân lập được 476 chủng nấm sợi. Trong đó, đợt 1 phân lập được 129 chủng (chiếm 27,10%) , đợt 2 được 191 chủng (40,13%), đợt 3 được 156 chủng (32,77%). Sau đó, chúng tôi tiếp tục phân loại để tuyển chọn các chủng nấm sợi thuộc hai chi Aspergillus và Penicillium. Dựa vào đặc điểm khoá phân loại đến chi của các tác giả Robert A. Samson, Allen S. Heekstra, Jens C. Frisvad (2004) và Bùi Xuân Đồng (năm 2000). Chúng tôi xếp các chủng vi nấm có đặc điểm như trong bảng 3.1 vào hai chi Aspergillus và Penicillium. Bảng 3.1: Các đặc điểm phân loại tương ứng để xác định các chủng vi nấm đến chi Aspergillus và chi Penicillium [6] Một số đặc điểm chi Aspergillus Một số đặc điểm chi Penicillium - Khuẩn lạc màu lục xám, xanh xám, xám, luc, lục vàng, lục nâu, nâu đen, trắng, vàng. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt. - Bộ máy mang BTT không nhánh - Giá BTT phát triển từ tế bào chân, không có hoặc có ít vách ngăn. - Bọng hình chuỳ, hình elíp, hình nữa cầu hoặc hình cầu. - Thể bình một tầng hoặc hai tầng. - BTT không có vách ngăn, mặt ngoài nhẵn hoặc có gai, hoăc có nốt sần. - Khuẩn lạc màu lục, vàng lục, xanh lục, lục xám đôi khi có màu vàng, đỏ tím hoặc trắng. - Mặt trái KL không màu hoặc có màu sắc khác nhau. - KL có hoặc không có vết khía xuyên tâm hay đồng tâm, có hoặc không có các giọt tiết. - KL có mặt dạng nhung hoặc mặt dạng len hoặc xốp bông. - Sợi nấm ngăn vách, phân nhánh, không màu hoặc màu nhạt, đôi khi màu sẫm. - Bộ máy mang BTT hoặc không nhánh hoặc có nhánh. - Giá BTT với một vòng thể bình hoặc với hai đến nhiều cuống thể bình ở phần ngọn giá. - Thể bình có phần đỉnh ngắn và thon nhỏ dần. - BTT không có vách, hình cầu, gần cầu, hình trứng, elíp đôi khi hình trụ, không màu hoặc màu nhạt; mặt ngoài nhẵn, ráp, có gai hoặc sần sùi. 3.1 Kết quả phân lập các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium Từ 476 chủng nấm sợi chúng tôi tiến hành phân loại và tuyển chọn được 266 chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium. Trong đó có 98 chủng (chiếm 36,84%) Aspergillus và 168 chủng (chiếm 63,16%) Penicillium. Vì số lượng chủng lớn nên chúng tôi xếp thành nhóm các chủng có chung màu sắc và hình thái KL. 3.1.1 Kết quả phân lập đợt 1 Đợt 1 chúng tôi phân lập và tuyển chọn được 77 chủng nấm sợi. Trong đó, có 32/77 chủng (chiếm 41,56%) Aspergillus và 45/77 chủng (chiếm 58,44%) Penicillium. Đặc điểm các chủng nấm sợi được thể hiện ở bảng 3.2 và bảng 3.3 Bảng 3.2: Đặc điểm các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus (đợt1) Tổng số chủng Ký hiệu chủng Đặc điểm 7 L3A, L9A, CM15A, CM21A, CK3A, Đ8A, Đ10A - KL màu xanh lá mạ ở phần mang BT, phần mép hệ sợi màu trắng. Mặt dưới KL màu vàng nhạt. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, màu nhạt. Giá BTT có bọng hình chuỳ, BTT hình cầu màu lục. 7 L4A, LM5A, LM16A, CK4A, Đ25A, Đ29A, ĐS3A - KL màu lục vàng, mép hình tia. Hệ sợi mọc thưa thớt. Mặt dưới không màu. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, không màu. Bọng đỉnh giá hình cầu, chỉ mang thể bình. Các thể bình xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ mặt bọng. BTT hình cầu, ráp, màu Hình 3.2: Cấu tạo đại thể và vi thể của chủng LM15A Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Khuẩn ty và cuống sinh bào tử, d- Giá bào tử trần và bào tử trần. a b c d lục. 10 L5A, L6A, L8A, LM8A, LM10A, LM15A, Đ1A, Đ2A, Đ3A, ĐS1A - KL màu lục vàng, mặt sợi mọc dày. Mặt dưới màu nâu nhạt. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm màu lục. Giá BTT ráp, bọng đỉnh giá hình gần cầu mang thể bình. BTT hình cầu, màu lục, gồ ghề. 3 CM2A, CM26A, CK2A - KL màu trắng, mép xẻ thuỳ, mặt dạng bông xốp, mặt dưới màu trắng. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn. Bọng đỉnh giá nhỏ, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu màu rêu nhạt. 5 LM2A, LM9A, CM3A, Đ9A, Đ28A - KL có màu nâu đen, hệ sợi màu trắng, mặt dạng xốp. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm không màu, phân nhánh, có vách ngăn. Giá BTT nhẵn. Bọng đỉnh giá hình cầu, thể bình một tầng, BTT hình cầu, gồ ghề, màu nâu. (Ghi chú: Hình cấu tạo đại thể và vi thể của các chủng được trình bày ở phu lục 2) Bảng 3.3: Đặc điểm các chủng nấm sợi thuộc chi Penicillium (đợt1) STT Ký hiệu chủng Đặc điểm 3 LM1P, CK6P, CM19P - KL màu trắng ngà, mặt dạng nhung, mặt dưới không màu. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình, BTT hình cầu, màu luc nhạt. 7 LM20P, LM25P, CK1P, CK5P, CM38P, Đ4P, Đ6P - KL màu lục xám, vùng trung tâm màu nâu, mặt dạng nhung, mặt dưới màu vàng nhạt. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, sợi không màu. Cuống mang BTT phân nhánh, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu màu lục, xù xì. 13 L1P, L2P, LM18P, LM22P, CK3P, CM1P, CM4P, CM5P, CM23P, Đ11P, Đ18P, Đ20P, CK7P - KL màu lục, mép màu trắng, mặt dạng nhung có nhiều vòng tròn đồng tâm. Mặt dưới màu nâu. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm màu lục. Giá BTT phân nhánh hoặc không phân nhánh, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu, gồ ghề, màu lục nhat. 11 LM21P, LM23P, CM22P, CM29P, Đ12P, Đ19P, Đ22P, Đ27P, ĐS2P, ĐS6P, ĐS10P. - KL màu lục, mặt dạng nhung có vết khứa, mép màu trắng. Mặt dưới màu vàng nhạt. Không sinh sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá mang BTT có cuống thể bình và thể bình. BTT mọc thành cột song song, hình cầu, gồ ghề, màu lục. 2 LM24P, CK8P KL màu lục xám, mép màu trắng xốp bông ít. Mặt dạng nhung, mặt dưới màu trắng xám. Không tiết sắc tố. Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT có nhánh, thể bình một tầng, BTT hình cầu, màu xanh lục,gồ ghề. 4 CM27P, CM30P, CM32P, ĐS7P - KL màu vàng lục, mép màu trắng. Mặt dạng nhung, xốp ít, có các vòng tròn đồng tâm. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi có vách, phân nhánh, không màu. Giá BTT không phân nhánh, mang thể bình. BTT hình cầu, màu lục nhạt 3 CM41P, ĐS9P, L7P - KL màu vàng nhạt ở vùng trung tâm, mép hinh tia do hệ sợi mảnh. Mặt dạng nhung, xốp ít. Mặt dưới màu vàng nhạt. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình êlíp, màu lục. 2 ĐS13P, ĐS11P - KL màu lục xám, vùng trung tâm màu vàng nhạt, mép màu trắng. Mặt dạng xốp bông ít. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình cầu, màu lục. (Ghi chú: Hình cấu tạo đại thể và vi thể của các chủng được trình bày ở phu lục 3) Theo kết quả thu được chúng tôi nhận thấy KL của các chủng thuộc Aspergillus chủ yếu có màu lục vàng, màu xanh lá mạ, màu nâu đen. Penicillium KL màu lục, lục xám chiếm số lượng nhiều. Sau khi mô tả đặc điểm phân loại các chủng nấm sợi đến chi, chúng tôi tiến hành xác đinh sự phân bố các chủng nấm sợi đã phân lập được. Sự phân bố các chủng thuộc Aspergillus và Penicillium được tóm tắt ở bảng 3.4 Bảng 3.4: Sự phân bố các chủng nấm sợi thuộc Aspergillus và Penicillium (Đợt 1) Long Hoà Lý Nhơn An Thới Đông Tam Thôn Hiệp Tổng cộng Nguồn phân lập A P A P A P A P A P Lá 1 1 2 0 2 1 1 1 6 3 Lá mục 3 3 1 3 2 1 1 3 7 10 Cành khô 1 1 1 2 0 1 1 1 3 5 Cành mục 2 5 1 3 1 3 1 1 5 12 Hình 3.3: Cấu tạo đại thể và vi thể của chủng CM5P Ký hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL , c- Khuẩn ty, d- Giá bào tử trần và bào tử trần a b c d Đất mặt 3 3 2 3 3 2 1 1 9 9 Đất sâu 0 1 0 2 1 2 1 1 2 6 Tổng số chủng 10 14 7 13 9 10 6 8 32 45 (Ký hiệu: A : Aspergillus; P : Penicillium) Từ bảng 3.4 bước đầu cho thấy các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Chúng tập trung nhiều nhất ở lớp đất mặt (23,38%) tiếp đến cành mục (22,08%), lá mục (22,08%), lá vàng (11,69%), đất sâu (10,39%) và cành khô (10,39%). Tuy nhiên, có sự khác nhau không nhiều giữa số chủng nấm sợi của hai chi ở lá mục, cành mục và đất mặt. Mặt khác, số chủng thuộc chi Aspergillus và Penicillium phân bố nhiều nhất ở xã Long Hoà (24/77 chủng, chiếm 31,17%), tiếp đến là xã Lý Nhơn (20/77 chủng – 25,97 %), xã An Thới Đông (19/77 chủng – 24,68 %) và xã Tam Thôn Hiệp (14/77 chủng – 18,18 %). Tổng số chủng thuộc Penicillium (45/77) nhiều hơn so với Aspergillus (32/77). Sở dĩ thu được kết quả như vậy là do điều kiện lấy mẫu của đợt 1 vào mùa mưa (tháng 9), làm cho độ mặn của MT giảm (< 1,5 %), độ ẩm không khí cao (79 – 83%) đã ảnh hưởng đến kết quả phân lập. Ở đất mặt, số lượng chủng nhiều nhất là do lớp đất mặt có nguồn thức ăn dồi dào từ xác lá, thân cành, ĐV, giáp xác… đang bị phân huỷ và lượng phù sa do các con sông mang đến. Tổng số chủng nấm sợi ở xã Long Hoà cao nhất là nhờ xã có địa hình cao ít bị ngập nước vào mùa mưa, kết quả này phù hợp với khảo sát của tác giả Quách Văn Toàn Em. [10] Sự phân bố các chủng nấm sợi phân lập từ bốn xã Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp còn được thể hiện ở biểu đồ 3.1. 3.1.2 Kết quả phân lập đợt 2 Biểu đồ 3.1: Sự phân bố các chủng thuộc chi Aspergillus và Penicillium (đợt 1) (Ghi chú vị trí: 1 – Long Hoà 2- Lý Nhơn 3- An Thới Đông 4- Tam Thôn Hiệp) Tiến hành phân lập và tuyển chọn ở đợt 2 chúng tôi thu được 102 chủng nấm sợi, gồm 38/102 (chiếm 37,25% ) chủng thuộc Aspergillus và 64/102 (62,75%) chủng thuộc Penicillium. Kết quả phân lập được trình bày ở bảng 3.5 và bảng 3.6 Bảng 3.5: Đặc điểm các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus phân lập đợt 2 Tổng số chủng Ký hiệu chủng Đặc điểm 7 L17A, L10A, CK14A, CM46A, CM61A, Đ34A, ĐS25A - KL màu xanh lá mạ ở phần mang BT, phần mép hệ sợi màu trắng. Mặt dưới KL màu vàng nhạt. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, màu nhạt. Giá BTT có bọng hình chuỳ, BTT hình cầu màu lục. 7 LM35A, L12A, L34A, LM42A, CM60A, CM49A, ĐS26A - KL màu lục vàng, mép hình tia. Hệ sợi mọc thưa thớt. Mặt dưới không màu. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, không màu. Giá BTT có bọng đỉnh giá hình cầu, chỉ mang thể bình. Các thể bình xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ mặt bọng. BTT hình cầu, ráp, màu lục. 5 CM47A, L15A, LM27A, LM36A, CM57A - KL màu lục vàng, mặt sợi mọc dày. Mặt dưới màu nâu nhạt. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm màu lục. Giá BTT có bọng đỉnh giá hình gần cầu mang thể bình. BTT hình cầu, màu lục, gồ ghề. 6 Đ45A, LM27A, LM41A, LM52A, CM52A, ĐS27A, - KL có màu nâu đen, hệ sợi màu trắng, mặt dạng xốp. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm không màu, có vách ngăn. Giá BTT nhẵn. Bọng đỉnh giá hình cầu, thể bình một tầng, BTT hình cầu, gồ ghề, màu nâu. 3 Đ53A Đ59A, ĐS24A - KL màu vàng, mép màu trắng, vùng trung tâm dạng xốp bông. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Bọng đỉnh giá hình gần cầu, BTT màu lục. 7 Đ62A, L28A, LM26A, CK12A, CK13A, CM45A, Đ33A - KL màu lục vàng, mặt sợi mọc dày. Mặt dưới không màu. Không sinh giọt tiết. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm màu lục. Giá BTT ráp, bọng đỉnh giá hình gần cầu mang thể bình. BTT hình cầu, màu lục, gồ ghề. 3 L21A, LM60A, CK15A - KL màu vàng lục, mép xẻ thuỳ ít, mặt dạng xốp bông ít, mặt dưới màu vàng nâu. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, màu nhạt. Bọng đỉnh giá hình gần cầu hơi thon dài mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình cầu, có gai. (Ghi chú: Hình cấu tạo của các chủng nấm sợi được trình bày ở phần phụ lục 4) Bảng 3.6: Đặc điểm các chủng nấm sợi thuộc chi Penicillium phân lập đợt 2 STT Ký hiệu chủng Đặc điểm 5 L24P, L14P, LM56P, CM58P, ĐS28P - KL màu lục vàng nhạt, mặt dạng mịn như nhung. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT phân nhánh mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình êlíp, màu lục. 4 LM39P, L31P, CM48P, Đ43P - KL màu vàng nhạt, mặt dạng nhung có vòng tròn đồng tâm. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình cầu, màu lục. 5 LM48P, L32P, CK23P, CM50P, ĐS21P - KL màu trắng, mặt dạng nhung, mỏng. Mặt dưới màu trắng. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang thể bình. BTT hình cầu, màu lục nhạt. 4 LM49P, LM31P, Đ32P, Đ60P - KL màu xám lục, mép màu trắng. Mặt dạng bông xốp nhẹ có các vòng tròn đồng tâm. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình, BTT hình cầu, màu lục. 2 CK11P, CM51P - KL màu tím hồng, mặt dạng bông xốp có các Hình 3.4: Cấu tạo đại thể và vi thể của chủng L17A Ký hiệu: a- Mặt trước KL, b- Mặt sau KL, c- Khuẩn ty d- Giá bào tử trần và bào tử trần a b c d vòng tròn đồng tâm. Mặt dưới không màu. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang thể bình. BTT hình êlíp, màu lục. 5 LM61P, L19P, CK20P, Đ35P, Đ38P - KL màu vàng lục, mép hình tia. Mặt dạng nhung, có nhiều vòng tròn đồng tâm. Mặt dưới màu vàng nhạt. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT phân nhánh hoặc không phân nhánh. BTT hình cầu, màu lục. 2 ĐS19P, Đ54P - KL màu lục, mặt dạng bông. Mặt dưới màu nâu nhạt. Không sinh sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình cầu, màu lục. 4 ĐS22P, CM44P, Đ56P, ĐS32P - KL màu trắng, mép nhẵn, mặt dạng nhung. Mặt dưới màu trắng. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình cầu, màu lục. 5 ĐS35P, LM53P, Đ42P, Đ52P, Đ57P - KL màu vàng lục, mép nhẵn. Mặt dưới màu nâu nhạt. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT phân nhánh hoặc không phân nhánh. BTT hình cầu, màu lục. 5 Đ39P, L33P, CK16P, Đ40P, Đ51P - KL màu lục, mép màu trắng, mặt dạng nhung có nhiều vòng tròn đồng tâm. Mặt dưới màu nâu. Không sinh giọt tiết. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm màu lục. Giá BTT phân nhánh hoặc không phân nhánh, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu, gồ ghề, màu lục nhat. 6 L11P, LM38P, Đ36P, Đ44P, Đ50P, Đ58P - KL màu vàng lục, mép màu trắng. Mặt dạng nhung, xốp ít, có các vòng tròn đồng tâm. Không có sắc tố. - Hệ sợi có vách, phân nhánh, không màu. Giá BTT không phân nhánh, mang thể bình. BTT hình cầu, màu lục nhạt 6 CM56P, L13.P, LM47.P, CM55P, Đ46P, Đ48P - KL màu lục, mép màu trắng, nhẵn. Mặt dạng nhung, không có vết khứa, mặt dưới không màu. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, màu lục. Giá BTT mang thể bình, BTT hình cầu màu luc nhạt. 6 CK17P, LM40P, LM51P, CM53P, Đ47P,CM62P - KL màu lục, mặt dạng nhung có vết khứa, mép màu trắng. Mặt dưới màu vàng nhạt. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình. BTT mọc thành cột song song, hình cầu, gồ ghề, màu lục. 4 CM54P, LM44P, LM55P, Đ49P - KL màu lục xám, mặt dạng nhung gờ lên, mặt dưới màu vàng nhạt. Không có giọt tiết. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT phân nhánh hoặc không phân nhánh, BTT hình cầu màu lục. 1 Đ37P - KL màu trắng, mép hình tia. Mặt có các vòng tròn đồng tâm, mặt dưới màu trắng. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT phân nhánh mang thể bình. BTT hình cầu màu lục. (Ghi chú: Hình cấu tạo của các chủng nấm sợi được trình bày ở phần phụ lục 5) Kết quả đợt 2 chúng tôi nhận thấy các chủng thuộc chi Aspergillus KL chủ yếu màu vàng lục và màu xanh lá mạ. Chi Penicillium KL màu lục, vàng lục, lục xám chiếm số lượng nhiều. Sau khi phân loại đến chi các chủng nấm sợi phân lập được, chúng tôi tiến hành khảo sát sự phân bố các chủng nấm sợi (bảng 3.7). Bảng 3.7: Sự phân bố các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium (đợt 2) Long Hoà Lý Nhơn An Thới Đông Tam Thôn Hiệp Tổng cộng Nguồn phân lập A P A P A P A P A P Lá 1 2 3 2 1 1 2 3 7 8 Lá mục 2 2 2 5 2 2 2 3 8 12 Hình 3.5 : Cấu tạo đại thể và vi thể của chủng L24P Ký hiệu: a- Mặt trước KL, b- Mặt sau KL, c- Khuẩn ty, d- Giá bào tử trần và bào tử trần. dc ba Cành khô 1 1 1 1 1 1 1 2 4 5 Cành mục 1 3 2 4 3 2 2 1 8 10 Đất mặt 1 6 2 5 2 6 1 6 6 23 Đất sâu 1 1 2 1 1 2 1 2 5 6 Tổng số chủng 7 15 12 18 10 14 9 17 38 64 (Ký hiệu: A: Aspergillus, P: Penicillium) Tương tự đợt 1, ở đợt 2 chúng tôi nhận thấy các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Chúng tập trung nhiều nhất ở lớp đất mặt (28,43%), tiếp đến lá mục (19,61%), cành mục (17,65%), lá vàng (14,71%), đất sâu (10,78%) và cành khô (8,82%). Tuy nhiên, so với đợt 1 thì ở đợt 2 có tổng số chủng nấm sợi của hai chi ở lớp đất mặt (28,43%) nhiều hơn cành mục (17,65%) và lá mục (19,61%). Số chủng thuộc chi Penicillium (62,75%) vẫn nhiều hơn so với Aspergillus (37,25%). Tổng số chủng ở đợt 2 (102 chủng) nhiều hơn so với đợt 1(77 chủng). Sự phân bố các chủng nấm sợi ở các xã có sự thay đổi so với đợt 1, tổng số chủng nấm sợi thu được ở xã Lý Nhơn cao nhất với 30/102 chủng (chiếm 29,41%), tiếp đến xã Tam Thôn Hiệp có 26/102 chủng (25,49%), xã An Thới Đông có 24/102 chủng (23,53%) và xã Long Hoà với 22/102 chủng (21,57%). Có được kết quả như trên là do đợt 2 lấy mẫu vào thời điểm giao mùa mưa - khô (tháng12) nhiệt độ và độ mặn (2 - 3%) cao hơn đợt 1, lượng mưa thấp hơn đợt 1 (tháng 9) nên lớp đất mặt thoáng khí đã tạo điều kiện thuận lợi cho các chủng nấm sợi sinh trưởng và phát triển. Mặt khác, lớp đất mặt có nhiều nguồn dinh dưỡng nên có số lượng chủng nấm sợi nhiều nhất. Sở dĩ, xã Lý Nhơn có tổng số chủng cao nhất là do địa hình của xã có độ cao vừa phải (không cao như xã Long Hoà, không trũng như xã An Thới Đông) nên dễ giữ nước và ít bị ngập úng, kết quả này phù hợp với kết quả khảo sát của Quách Văn Toàn Em.[10] Sự phân bố các chủng nấm sợi theo khu vực còn được thể hiện ở biểu đồ 3.2 3.1.3 Kết quả phân lập đợt 3 Biểu đồ 3.2: Sự phân bố các chủng thuộc chi Aspergillus và Penicillium (đợt 2) (Chú thích vị trí: 1- Long Hoà, 2- Lý Nhơn, 3- An Thới Đông, 4- Tam Thôn Hiệp) Tiến hành phân lập và tuyển chọn ở đợt 3 chúng tôi thu được 87 chủng nấm sợi, gồm 28/87 chủng (chiếm 32,18%) thuộc chi Aspergillus và 59/87 chủng (chiếm 67,82%) thuộc chi Penicillium. Đặc điểm của các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium được trình bày ở bảng 3.8 và 3.9 Bảng 3.8: Đặc điểm các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus phân lập (đợt 3) Tổng số chủng Ký hiệu các chủng Đặc điểm chính 7 L36A, LM78A, CK34A, CK37A, CM69A, Đ63A Đ76A - KL màu lục vàng, mép hình tia. Hệ sợi mọc thưa thớt. Mặt dưới không màu. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, không màu. Giá BTT ráp, bọng đỉnh giá hình cầu, chỉ mang thể bình. Các thể bình xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ mặt bọng. BTT hình cầu, ráp, màu lục. 1 L42A - KL màu lục xám, mép màu trắng xẻ thuỳ. Mặt dạng mượt nhung. Mặt dưới không màu. Không sinh giọt tiết. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn. Giá BTT nhẵn, bọng đỉnh giá nhỏ, mang thể bình ở phần nữa bọng trên. BTT hình cầu, màu lục. 7 LM64A, LM66A, CK25A, CM63A, CM68A, ĐS39A, ĐS46A - KL màu xanh lá mạ ở phần mang BT, phần mép hệ sợi màu trắng. Mặt dưới KL màu vàng nhạt. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, màu nhạt. Giá BTT có bọng hình chuỳ, ráp, BTT hình cầu màu lục. 5 L52A, LM67A, CM71A, CM72A, ĐS37A - KL có màu đen, hệ sợi màu trắng, mặt dạng xốp. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, không màu. Giá BTT nhẵn. Bọng đỉnh giá hình cầu, thể bình một tầng, BTT hình cầu, gồ ghề, màu nâu. 1 CK31A - KL màu vàng lục, mép xẻ thuỳ ít, mặt dạng xốp bông ít, mặt dưới màu vàng nâu. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, màu nhạt. Bọng đỉnh giá hình gần cầu hơi thon dài mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình cầu, có gai. a b c d Hi ̀nh 3.6: Cấu tạo đại thể và vi thể của chủng L52A Ký hiệu: a- Mặt trước KL, b- Mặt sau KL, c- Khuẩn ty, d- Bọng đỉnh giá và bào tử trần 6 Đ83A, L49A, CM70A, Đ68A, Đ84A, Đ85A - KL màu lục vàng, mặt sợi mọc dày. Mặt dưới không màu. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm màu lục. Giá BTT ráp, bọng đỉnh giá hình gần cầu mang thể bình. BTT hình cầu, màu lục, gồ ghề. 1 ĐS45A - KL màu trắng, mép xẻ thuỳ, mặt dạng bông xốp dày, mặt dưới màu trắng. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn. Bọng đỉnh giá nhỏ, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu, màu rêu nhạt. (Ghi chú : Hình cấu tạo của các chủng nấm sợi được trình bày ở phần phụ lục 6) Bảng 3.9: Đặc điểm các chủng nấm sợi thuộc chi Penicillium phân lập đợt 3 Tổng số chủng Ký hiệu chủng Đặc điểm 2 L37P, ĐS45P - KL màu lục xám, mặt dạng bông xốp, có vết khứa xuyên tâm. Mặt dưới màu đen xám, có khứa. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách, phân nhánh, màu nhạt. Giá BTT không phân nhánh, mang cuống thể bình và thể bình, BTT hình elíp, màu lục. 5 L39P, LM68P, L46P, Đ67P, ĐS44P - KL màu lục xám, vùng trung tâm màu nâu. Mặt dạng nhung, có khứa, mép màu trắng, nhẵn. Mặt dưới KL màu vàng lục, có các vòng tròn đồng tâm. Không tiết sắc tố. - Sợi phân nhánh và có vách ngăn ngang. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình, BTT hình cầu, màu luc. 10 L40P, L45P, LM69P, CK36P, CM76P, CM82P Đ66P, Đ79P, ĐS40P, ĐS42P - KL màu xám lục, viền trắng, mép nhẵn. Mặt dạng nhung, có các vòng màu xám. Mặt dưới vàng nhạt có các vòng màu nhạt. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình, BTT hình cầu, màu lục nhạt. 2 L43P, LM75P - KL màu trắng, hệ sợi rất mảnh, mặt dưới không màu. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT phân nhánh mang cuống thể bình và thể bình, BTT hình cầu, màu luc. 13 CM66P, L50P, LM63P, LM70P, LM76P, CK29P, CK33P, CK46P, CM77P, CM79P, Đ65P, Đ70P, Đ78P - KL màu lục, mép màu trắng, nhẵn. Mặt KL dạng nhung, mặt dưới không màu. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, màu lục. Giá BTT mang thể bình, BTT hình cầu màu lục nhạt. 4 LM73P, LM65P, Đ82P, LM71P - KL màu xanh xám, mép nhẵn, mặt dạng xốp bông, mặt dưới màu vàng nhạt. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Bộ máy mang BTT không phân nhánh, cuống mang chổi có vách ngăn, thể bình một tầng, BTT hình cầu xếp thành các chuỗi phân ly. 2 LM74P, L41P - KL màu trắng đục, mép nhẵn Mặt KL dạng nhung, mặt dưới màu trắng đục. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT nhánh, mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình cầu màu lục nhạt. 2 LM77P, CK26P - KL màu lục xám, mép màu trắng xốp bông ít. Mặt dạng nhung, mặt dưới màu trắng xám. Không sinh giọt tiết. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT có nhánh, thể bình một tầng, BTT hình cầu, màu xanh lục, gồ ghề. 9 CM81P, Đ75P, LM80P, CK30P, CK32P, CK44P, Đ69P, Đ72P, ĐS43P - KL có màu trắng, khi già màu vàng nâu, hệ sợi rất mảnh, mép xẻ thuỳ ít. Mặt dạng nhung có các vòng tròn đồng tâm. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, màu lục. Giá BTT ráp, mang cuống thể bình và thể bình. BTT hình cầu, màu lục 2 CM75P, Đ73P - KL màu tím hồng, mép màu trắng, mặt dạng xốp bông có nhiều vòng tròn đồng tâm. Mặt dưới màu vàng nhạt ở vùng trung tâm. Không tiết sắc tố. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn. Sợi nấm màu lục. Giá BTT không phân nhánh. BTT hình elíp, màu lục. 4 CM80P, Đ74P, Đ81P, ĐS38P - KL màu lục, mép màu trắng, mặt dạng nhung. Mặt dưới màu nâu. Không sinh giọt tiết. - Hệ sợi phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm màu lục. Giá BTT phân nhánh hoặc không phân nhánh, thể bình hình lọ thót cổ, BTT hình cầu, gồ ghề, màu lục nhat. 2 Đ77P, Đ64P - KL màu lục xám, mặt dạng nhung gờ lên, mặt dưới màu vàng nhạt. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT phân nhánh, thể bình một tầng, BTT hình cầu màu lục. 1 Đ80P - KL màu trắng xám, mặt dạng nhung, mép hình tia. Mặt dưới màu trắng. Không tiết sắc tố. - Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh. Giá BTT mang cuống thể bình và thể bình, BTT hình cầu, màu lục. 1 ĐS36P KL màu trắng, mặt dạng nhung, mép hình tia toả tròn. Mặt dưới màu trắng. Không sinh giọt tiết. Sợi nấm có vách ngăn, phân nhánh, màu nhạt. Giá BTT mang thể bình hình miệng hẹp, BTT hình cầu, gồ ghề, màu lục. (Ghi chú: Hình cấu tạo của các chủng nấm sợi được trình bày ở phần phụ lục 7) Hình 3.7: Cấu tạo đại thể và vi thể của chủng CM75PKý hiệu: a- mặt trước KL, b- mặt sau KL c- Giá bào tử trần d- Khuẩn ty và bào tử trần a b c d Kết quả phân lập từ đợt 3 chúng tôi nhận thấy KL các chủng thuộc chi Aspergillus chủ yếu màu lục vàng, màu xanh lá mạ, màu đen. Các chủng thuộc chi Penicillium có KL chủ yếu màu lục, lục xám, vàng nâu. Sự phân bố các chủng nấm sợi trên cơ chất được thể hiện ở bảng 3.10 Bảng 3.10: Sự phân bố các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium Long Hoà Lý Nhơn An Thới Đông Tam Thôn Hiệp Tổng cộng Nguồn phân lập A P A P A P A P A P Lá 1 2 1 2 1 3 1 1 4 8 Lá mục 1 2 1 2 1 3 1 5 4 12 Cành khô 1 2 1 2 1 2 1 2 4 8 Cành mục 1 2 1 1 2 3 2 2 6 8 Đất mặt 2 5 2 5 2 4 1 2 7 16 Đất sâu 0 1 1 1 1 2 1 3 3 7 Tổng số chủng 6 14 7 13 8 17 7 15 28 59 (Chú thích: A: Aspergillus; P: Penicillium) Kết quả thu được ở đợt 3 chúng tôi nhận thấy tổng số chủng nấm sợi thu được (87 chủng) nhiều hơn đợt 1 (77 chủng) nhưng lại ít hơn đợt 2 (102 chủng). Số chủng nấm sợi có ở đất mặt là cao nhất (chiếm 26,44%), tiếp đến lá mục (18,39%), cành mục (16,09%), lá vàng (15,38%), cành khô (15,38%) và đất sâu (11,49%). Số chủng thuộc chi Penicillium (67,82%) vẫn cao hơn so với số chủng thuộc chi Aspergillus (32,18%). Ngoài ra, chúng tôi còn nhận thấy sự phân bố các chủng nấm sợi ở các xã có sự thay đổi so với đợt 1 và đợt 2, tổng số chủng nấm sợi phân bố ở xã An Thới Đông (28,73%) cao nhất tiếp đến là xã Tam Thôn Hiệp (25,29%), hai xã Long Hoà (22,99%) và xã Lý Nhơn (22,99%) là tương đương nhau. Chúng tôi lấy mẫu đợt 3 vào mùa khô (tháng 3) nên lượng mưa và độ ẩm không khí (74-77%) giảm, nhiệt độ và độ mặn (>4%) tăng hơn so với đợt 1 và đợt 2. Có thể điều này đã ảnh hưởng đến sự phân bố số lượng chủng nấm sợi trong cơ chất. Xã An Thới Đông và xã Tam Thôn Hiệp có số lượng chủng cao là do hai xã có địa hình trũng hơn, nên dễ giữ nước ở mùa khô giúp độ ẩm trong không khí cao hơn và nhiệt độ thấp hơn so với hai xã còn lại, tạo điều kiện thích hợp cho nấm sợi sinh trưởng và phát triển. Sự phân bố các chủng nấm sợi theo vị trí các xã ở đợt 3 được thể hiện ở biểu đồ 3.3 * Tổng kết chung cả ba đợt lấy mẫu Bảng 3.11: Sự phân bố các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium ở 3 đợt Lá Lá mục Cành khô Cành mục Đất Đất sâu TC A P A P A P A P A P A P A P Đợt1 6 3 7 10 3 5 5 12 9 9 2 6 32 45 Đợt2 7 8 8 12 4 5 8 10 6 23 5 6 38 64 Đợt3 4 8 4 12 4 8 6 8 7 16 3 7 28 59 TC 17 19 19 34 11 18 19 30 22 48 10 19 98 168 (Chú thích: A: Aspergillus, P: Penicillium, TC: Tổng cộng) Khảo sát sự phân bố của các chủng nấm sợi thuộc Aspergillus và Penicillium qua ba đợt (bảng 3.11) chúng tôi nhận thấy tổng số chủng thu được ở đợt 2 cao nhất với 102/266 chủng (chiếm 38,34%), tiếp đến là đợt 3 với 87/266 chủng (32,71%), thấp nhất là đợt 1 với 77/266 chủng (28,95%). Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy sự phân bố các chủng nấm sợi ở các vị trí lấy mẫu có thay đổi theo mùa. Cụ thể là vào mùa mưa (đợt 1) tổng số chủng thu được ở xã Long Hoà (31,17%) và xã Lý Nhơn (25,97%) cao hơn so với xã An Thới Đông (24,68%) và xã Tam Thôn Hiệp (22,08%). Ngược lại, đến mùa khô (đợt 3) tổng số chủng nấm sợi thu được ở xã An Thới Đông (28,74%) và xã Tam Thôn Hiệp (25,79%) lại cao hơn xã Long Hoà (22,99%) và Lý Nhơn (22,99%). Đến khi lấy mẫu vào thời điểm giao mùa (đợt 2) thì tổng số chủng thu được ở xã Lý Nhơn cao nhất (29,41%), thấp nhất là xã Long Hoà (21,57%). Sở dĩ, có được kết quả như trên là do đợt 1 lấy mẫu vào mùa mưa tập trung ở Cần Giờ (tháng 9). Lượng mưa lớn cùng với chế độ ngập triều tạo MT yếm khí gây bất lợi cho sự sinh trưởng của nấm sợi. Nấm sợi là dạng hiếu khí nên khi bị ngập triều làm thiếu không khí đã hạn chế sự phát triển của nấm Biểu đồ 3.3: Sự phân bố các chủng thuộc chi Aspergillus và Penicillium (đợt 3) (Chú thích vị trí: 1- Long Hoà, 2- Lý Nhơn, 3- An Thới Đông, 4- Tam Thôn Hiệp) sợi. Đợt 3 lấy mẫu vào mùa khô (tháng 3), với độ ẩm không khí thấp (74 – 77%), nhiệt độ MT (35 ± 50C) và độ mặn ( ≥ 4%) cao đã hạn chế sự sinh trưởng của nấm sợi. Đợt 2 lấy mẫu vào thời điểm giao mùa giữa mùa mưa và mùa khô. Đây là thời điểm có điều kiện sinh thái thích hợp (hạn chế bị ngập úng như đợt 1, hạn chế sự xâm thực của nước biển như đợt 3) cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. Sự phân bố của các chủng nấm sợi thay đổi theo mùa ở các vị trí lấy mẫu. Theo chúng tôi, độ trũng của địa hình giảm dần từ xã Long Hoà đến xã Lý Nhơn, xã An Thới Đông và xã Tam Thôn Hiệp. Cho nên, mùa mưa thì xã Tam Thôn Hiệp và An Thới Đông bị ngập úng nặng, đến mùa khô xã Long Hoà và Lý Nhơn bị xâm thực nước biển nặng. Do đó, kết quả phân bố các chủng nấm sợi ở các xã theo mùa là hoàn toàn phù hợp. Mặt khác, chúng tôi nhận thấy ở cả ba đợt các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium có mặt trong mọi cơ chất của RNM. Chúng tập trung nhiều nhất ở lớp đất mặt (26,32%), tiếp đến lá mục (19,93%), cành mục (18,42%), lá vàng (13,53%), cành khô (10,90%) và đất sâu (10,90%). (Bảng 3.11 và biểu đồ 3.4) Có thể, lớp đất mặt có nguồn thức ăn dồi dào từ xác lá, thân cành, động vật, giáp xác… đang bị phân huỷ cùng với lượng phù sa màu mỡ. Ngoài ra, thuỷ triều lên xuống hàng ngày nên lớp đất mặt luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các chủng nấm sợi sinh trưởng, phát triển. Ở lớp đất sâu số chủng nấm sợi ít hơn đất mặt vì nấm sợi là VSV hiếu khí nên lớp đất mặt là nơi có đủ nguồn oxi thích hợp cho nấm sợi sinh sống. Phần lớn nấm sợi đang thời kỳ phát triển sinh enzim thuỷ phân mạnh các chất hữu cơ phân huỷ, nên số lượng chủng trên cơ chất lá mục và cành mục cao hơn trên cơ chất lá vàng và cành khô. Ngoài ra, ở cả ba đợt chúng tôi đều nhận thấy tổng số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus (36,84%) thấp hơn so với Penicillium (63,16%). Kết quả này phù hợp với thực tế. Theo E. Kister, M. Morelet (2000) thì số loài hiện biết của chi Penicillium (khoảng 223 loài) cao hơn so với chi Aspergillus (khoảng 185 loài) [53] Biểu đồ 3.4: Sự phân bố các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium ở cả 3 đợt Chú thích cơ chất: 1: Lá vàng, 2: Lá mục, 3: Cành khô, 4: cành mục, 5: Đất mặt, 6: Đất sâu Vậy qua ba đợt khảo sát chúng tôi nhận thấy sự phân bố các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium thay đổi theo mùa và tuỳ theo vị trí lấy mẫu. Để tìm hiểu vai trò của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ, chúng tôi tiến hành khảo sát một số đặc điểm sinh học của các chủng phân lập được. 3.2 Khảo sát một số đặc tính sinh học của các chủng thuộc chi Aspergillus và Penicillium 3.2.1 Khảo sát khả năng sinh các enzym ngoại bào 3.2.1.1 Kết quả đợt 1 Từ 77 chủng phân lập được chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng sinh các enzym ngoại bào như amylaza, proteaza, cellulaza theo phương pháp 2.2.2.1 đã trình bày ở phần trước và thu được kết quả theo bảng 3.11 Bảng 3.12: Khả năng sinh các enzym ngoại bào (đợt 1) Hoạt tính enzim (D – d) mm Hoạt tính enzim (D – d) mm STT Ký hiệu chủng Amylase Protease Cellulase STT Ký hiệu chủng Amylase Protease Cellulase 1 L1P 5 0 5 40 CM15A 2 4 7 2 L2P 11 11 0 41 CM17P 1 0 18 3 L3A 10 2 0 42 CM19P 4 3 7 4 L4A 3 2 0 43 CM21A 18 0 17 5 L5A 8 0 13 44 CM22P 5 2 15 6 L6A 12 12 11 45 CM23P 6 0 6 7 L7P 12 6 9 46 CM26A 2 4 16 8 L8A 7 5 13 47 CM29P 3 0 12 9 L9A 7 2 13 48 CM30P 2 6 16 10 LM1P 0 2 15 49 CM32P 1 0 17 11 LM2A 6 3 6 50 CM38P 0 1 6 12 LM5A 0 4 13 51 CM41P 10 4 17 13 LM8A 5 0 23 52 Đ1A 0 0 11 14 LM9A 5 4 10 53 Đ2A 8 21 7 15 LM10A 6 2 20 54 Đ3A 2 12 3 16 LM11P 5 3 11 55 Đ4P 1 12 0 17 LM14P 5 4 11 56 Đ6P 0 17 6 18 LM15A 5 3 22 57 Đ8A 4 2 0 19 LM16A 0 4 4 58 Đ9A 5 3 0 20 LM18P 7 2 15 59 Đ10A 3 0 3 21 LM20P 8 6 11 60 Đ11P 15 6 0 22 LM21P 5 5 10 61 Đ16P 0 14 0 23 LM22P 6 4 8 62 Đ18P 1 11 3 24 LM23P 7 7 12 63 Đ19P 1 2 5 25 LM24P 0 5 2 64 Đ20P 3 4 0 26 LM25P 16 5 9 65 Đ22P 3 7 0 27 CK1P 3 8 3 66 Đ25A 0 4 5 28 CK2A 0 12 6 67 Đ27P 0 0 2 29 CK3A 1 7 0 68 Đ28A 8 1 0 30 CK4A 5 6 10 69 Đ29A 0 0 10 31 CK5P 1 0 4 70 ĐS1A 0 7 0 32 CK6P 16 2 10 71 ĐS2P 6 4 0 33 CK7P 4 10 2 72 ĐS3A 4 2 9 34 CK8P 2 11 4 73 ĐS6P 0 16 0 35 CM1P 4 0 6 74 ĐS7P 8 5 8 36 CM2A 12 6 9 75 ĐS9P 7 8 0 37 CM3A 0 0 8 76 ĐS10P 15 5 3 38 CM4P 5 3 12 77 ĐS11P 4 4 5 39 CM5P 10 11 23 Từ bảng 3.11 chúng tôi nhận thấy trong 77 chủng phân lập được đều có khả năng sinh enzim ngoại bào. Trong đó, có 62/77 chủng (chiếm 80,52%) có hoạt tính amylaza, 62/77 chủng (chiếm 80,52%) có hoạt tính proteaza, 61/77 chủng (chiếm 79,22%) có hoạt tính cellulaza. Số chủng có hoạt tính cellulaza mạnh (D – d) là 4 chủng (5,19%) nhiều hơn so với proteaza là 1 chủng (1,3%). Amylaza không có chủng có hoạt tính mạnh. Các chủng có hoạt tính enzim ngoại bào mạnh chủ yếu thuộc chi Aspergillus. Theo chúng tôi, do mùa mưa lượng cellulose có ở xác TV nhiều, đây là nguồn cơ chất dồi dào thúc đẩy hoạt động của enzim cellulaza nấm sợi. Có thể tóm tắt bảng 3.11 như sau: Không có hoạt tính Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh Enzym SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) Amylaza 15/77 19,48 50/77 64,94 12/77 15,58 0 0 Proteaza 15/77 19,48 50/77 64,94 11/77 14,29 1/77 1,30 Cellulaza 16/77 20,78 31/77 40,26 26/77 33,77 4/77 5,19 (Chú thích : SL: Số lượng, TL: tỷ lệ) 3.2.1.2 Kết quả đợt 2 Khảo sát khả năng sinh các enzim ngoại bào của các chủng nấm sợi ở đợt 2 chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.13 Bảng 3.13: Khả năng sinh các enzym ngoại bào (đợt 2) Hoạt tính enzim (D – d) mm Hoạt tính enzim (D – d) mm STT Ký hiệu chủng Amylaza Proteaza Cellulaza STT Ký hiệu chủng Amylaza Proteaza Cellulaza 1 L10A 17 0 15 52 CM50P 5 6 0 2 L11P 11 0 1 53 CM51P 10 5 6 3 L12A 7 20 5 54 CM52A 18 10 12 4 L13P 14 8 6 55 CM53P 5 0 4 5 L14P 14 5 5 56 CM54P 0 2 6 6 L15A 22 10 8 57 CM55P 0 7 3 7 L17A 19 14 12 58 CM56P 5 5 8 8 L19P 0 4 4 59 CM57A 10 10 14 9 L21A 14 0 7 60 CM58P 0 7 8 10 L24P 6 4 20 61 CM60A 19 12 8 11 L28A 0 4 1 62 CM61A 9 8 5 12 L31P 15 20 7 63 CM62P 7 2 4 13 L32P 5 13 3 64 Đ32P 12 8 15 14 L33P 0 6 7 65 Đ33A 18 0 10 15 L34A 2 10 7 66 Đ34A 19 16 11 16 LM26A 13 16 10 67 Đ35P 4 0 8 17 LM27A 12 0 4 68 Đ36P 0 17 9 18 LM31P 15 7 11 69 Đ37P 15 7 11 19 LM35A 19 16 4 70 Đ38P 12 5 11 20 LM36A 10 6 3 71 Đ39P 12 7 0 21 LM38P 3 2 4 72 Đ40P 9 18 0 22 LM39P 17 13 9 73 Đ42P 9 0 5 23 LM40P 10 6 8 74 Đ43P 5 4 4 24 LM41A 9 8 7 75 Đ44P 10 0 4 25 LM42A 7 0 5 76 Đ45A 24 10 0 26 LM44P 17 6 3 77 Đ46P 19 4 5 27 LM47P 12 0 5 78 Đ47P 17 2 5 28 LM48P 13 0 15 79 Đ48P 18 9 17 29 LM49P 16 15 8 80 Đ49P 16 4 4 30 LM51P 18 22 12 81 Đ50P 15 2 7 31 LM52A 3 6 6 82 Đ51P 16 11 0 32 LM53P 8 5 24 83 Đ52P 14 8 5 33 LM55P 9 7 12 84 Đ53A 13 5 0 34 LM56P 0 4 17 85 Đ54P 14 10 4 35 LM60A 5 5 5 86 Đ56P 9 0 0 36 LM61P 6 12 20 87 Đ57P 4 4 6 37 CK11P 16 19 0 88 Đ58P 0 6 4 38 CK12A 17 15 5 89 Đ59A 4 10 17 39 CK13A 16 0 0 90 Đ60P 7 4 0 40 CK14A 13 0 1 91 Đ62A 3 20 5 41 CK15A 12 0 6 92 ĐS19P 0 4 5 42 CK16P 7 20 16 93 ĐS21P 10 2 0 43 CK17P 15 0 9 94 ĐS22P 0 20 6 44 CK20P 17 5 7 95 ĐS24A 7 0 17 45 CK23P 15 11 16 96 ĐS25A 3 20 17 46 CM44P 2 18 0 97 ĐS26A 16 5 15 47 CM45A 18 15 12 98 ĐS27A 0 7 11 48 CM46A 17 0 6 99 ĐS28P 7 10 12 49 CM47A 25 17 14 100 ĐS32P 17 0 4 50 CM48P 10 11 12 101 ĐS33A 0 7 5 51 CM49A 17 10 13 102 ĐS35P 13 12 14 Từ bảng 3.13 chúng tôi nhận thấy trong 102 chủng phân lập được đều có khả năng sinh enzim ngoại bào. Trong đó, có 89/102 chủng (chiếm 87,25%) có hoạt tính amylaza, 82/102 chủng (80,39%) có hoạt tính proteaza, 90/102 chủng (88,24%) có hoạt tính cellulaza. Số chủng có hoạt tính proteaza mạnh (D – d ≥ 20mm) là 7 chủng (6,86%) nhiều hơn so với cellulaza là 3 chủng (2,95%). Số chủng có hoạt tính amylaza mạnh là 2 chủng (1,96%), có hoạt tính amylaza rất mạnh (D –d) ≥ 25mm) là 1 chủng (0,98%). Theo chúng tôi, tại thời điểm này lượng cơ chất tinh bột, protid và cellulose của enzim amylaza, proteaza và cellulaza nhiều đã thúc đẩy hoạt động của các loại enzim này. Mặt khác, độ mặn ở mùa này khoảng 2 – 3% thích hợp cho các enzim ngoại bào hoạt động. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của tác giả Khưu Phương Yến Anh (2007) [1]. Bảng 3.13 có thể tóm tắt như sau: Không có hoạt tính Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh Hoạt tính rất mạnh Enzym SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) Amylaza 13 12,75 30 29,41 56 54,90 2 1,96 1 0,98 Proteaza 20 19,61 46 45,10 29 28,43 7 6,86 0 0 Cellulaza 12 11,76 58 56,86 29 28,43 3 2,95 0 0 3.2.1.3 Kết quả đợt 3 Khảo sát khả năng sinh các enzim amylaza, proteaza và cellulaza của các chủng nấm sợi ở đợt 3 chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.14 Bảng 3.14: Khả năng sinh các enzym ngoại bào (đợt 3) Hoạt tính enzim (D – d) mm Hoạt tính enzim (D – d) mm STT Ký hiệu chủng Amylaza Proteaza Cellulaza STT Ký hiệu chủng Amylaza Proteaza Cellulaza 1 L36A 5 4 11 45 CM70A 6 5 7 2 L37P 2 5 12 46 CM71A 0 5 1 3 L39P 12 5 14 47 CM72A 0 14 1 4 L40P 5 0 3 48 CM75P 0 0 4 5 L41P 0 4 5 49 CM76P 5 0 16 6 L42A 5 4 5 50 CM77P 0 3 0 7 L43P 5 4 5 51 CM79P 10 0 10 8 L45P 0 7 9 52 CM80P 0 2 4 9 L46P 4 6 10 53 CM81P 0 2 2 10 L49A 5 3 6 54 CM82P 8 1 8 11 L50P 6 4 3 55 Đ63A 5 2 7 12 L52A 5 0 5 56 Đ64P 2 6 12 13 LM63P 3 4 9 57 Đ65P 6 8 6 14 LM64A 6 5 11 58 Đ66P 3 0 3 15 LM65P 0 5 11 59 Đ67P 3 5 4 16 LM66A 5 2 8 60 Đ68A 3 2 7 17 LM67A 0 4 9 61 Đ69P 6 3 11 18 LM68P 1 7 4 62 Đ70P 4 5 4 19 LM69P 8 5 5 63 Đ71A 0 2 2 20 LM70P 0 0 3 64 Đ72P 2 3 2 21 LM71P 0 3 10 65 Đ73P 8 8 7 22 LM73P 3 4 10 66 Đ74P 10 2 7 23 LM74P 0 0 2 67 Đ75P 3 8 12 24 LM75P 0 18 5 68 Đ76A 4 5 10 25 LM76P 4 5 18 69 Đ77P 7 3 14 26 LM77P 2 4 0 70 Đ78P 17 11 15 27 LM78A 5 4 7 71 Đ79P 0 10 12 28 LM80P 4 13 11 72 Đ80P 0 13 4 29 CK25A 4 4 6 73 Đ81P 4 5 8 30 CK26P 4 2 6 74 Đ82P 7 5 10 31 CK29P 5 0 10 75 Đ83A 5 6 16 32 CK30P 10 4 4 76 Đ84A 5 4 7 33 CK31A 0 5 10 77 Đ85A 4 2 7 34 CK32P 5 8 10 78 ĐS36P 2 3 3 35 CK33P 4 15 18 79 ĐS37A 0 1 0 36 CK34A 4 4 10 80 ĐS38P 10 12 18 37 CK36P 2 13 10 81 ĐS39A 5 2 8 38 CK37A 5 3 8 82 ĐS40P 0 6 8 39 CK44P 3 11 10 83 ĐS42P 0 2 5 40 CK46P 2 8 10 84 ĐS43P 4 5 10 41 CM63A 4 4 7 85 ĐS44P 2 0 13 42 CM66P 4 5 1 86 ĐS45P 0 5 5 43 CM68A 5 5 7 87 ĐS46A 4 3 8 44 CM69A 4 5 10 Ở đợt 3 chúng tôi nhận thấy trong 87 chủng phân lập được đều có khả năng sinh enzim ngoại bào. Trong đó, số chủng có hoạt tính cellulaza (84 chủng -96,55%) là cao nhất, tiếp đến là proteaza (77 chủng - 88,51%) và amylaza (65 chủng - 74,71%). Các enzim ngoại bào này không có chủng có hoạt tính mạnh. Theo chúng tôi, đợt 3 lấy mẫu vào mùa khô (tháng 3), điều kiện sinh thái (độ mặn > 4%, độ ẩm 74 – 77%,) có thể đã hạn chế hoạt động của các enzim, nên hoạt tính của các enzim ngoại bào ở đợt 3 thấp hơn so với đợt 1 và đợt 2. Có thể tóm tắt bảng 3.14 như sau: Không có hoạt tính Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Enzim SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) Amylaza 22 25,29 59 67,82 6 6,89 Proteaza 10 11,49 67 77,02 10 11,49 Cellulaza 3 3,45 51 58,62 33 37,93 (Ghi chú: SL: Số lượng, TL: Tỷ lệ) * Tổng kết khảo sát khả năng sinh enzim ngoại bào ở 3 đợt Khảo sát hoạt tính của các enzim ngoại bào qua 3 đợt chúng tôi nhận thấy tổng số chủng có hoạt tính enzim ngoại bào mạnh (D –d ≥ 20mm) ở đợt 2 cao nhất (13/102 chủng), tiếp đến đợt 1 (5/77 chủng), đợt 3 không có chủng mạnh. Điều này chứng tỏ số chủng có hoạt tính enzim ngoại bào mạnh có sự thay đổi theo mùa. Tổng hợp chung cả 3 đợt chúng tôi nhận thấy một số đặc điểm sau: Bảng 3.15 : Khả năng sinh enzim ngoại bào của các chủng nấm sợi ở 3 đợt (Ghi chú: SL: Số lượng, TL: Tỷ lệ) * Tổng số chủng có hoạt tính enzim cellulaza cao hơn so với enzim proteaza và amylaza. Đồng thời, giá trị trung bình của hoạt tính enzim cellulaza cao nhất, tiếp đến là enzim amylaza, thấp nhất là enzim proteaza. (Bảng 3.15 và 3.16 ). Vì ở RNM lượng cơ chất chủ yếu là cellulose từ xác TV, đã cung cấp một lượng lớn thức ăn cho các VSV có ở nơi này. Ngoài ra, TV ở RNM rất phát triển, chúng quang hợp để tổng hợp một lượng lớn tinh bột cung cấp cơ chất để enzim amylaza hoạt động. Mặt khác, RNM còn có xác ĐV, giáp xác là nguồn cơ chất cho các enzim ngoại bào khác như proteaza, kitinaza… Không có hoạt tính Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh Hoạt tính rất mạnh Enzim ngoại bào SL TL SL TL SL TL SL TL SL TL Amylaza 50 18,80 139 52,26 74 27,82 2 0,75 1 0,38 Proteaza 45 16,92 163 61,28 50 18,80 8 3,01 0 0 Cellulaza 31 11,65 140 52,63 88 33,08 7 2,63 0 0 Bảng 3.16 : Giá trị trung bình về khả năng sinh enzim của các chủng nấm sợi ở 3 đợt Tổng số chủng sinh enzim Enzim ngoại bào Giá trị trung bình Số lượng Tỷ lệ (%) Amylaza 8,20 ± 0,37 214 80,45 Proteaza 7,02 ± 0,33 221 83,08 Cellulaza 8,64 ± 0,31 235 88,35 * Khả năng sinh enzim ngoại bào của các chủng nấm sợi thay đổi tùy theo loại cơ chất. Giá trị trung bình về khả năng sinh amylaza cao nhất ở lá vàng, tiếp đến ở đất mặt, lá mục và cành mục, thấp nhất ở đất sâu và cành khô. Vì trong cơ chất lá vàng có nhiều tinh bột do lá cây quang hợp. Hoạt tính proteaza có nhiều ở cơ chất cành khô, đất mặt và lá vàng, thấp nhất ở cơ chất lá mục, cành mục và đất sâu. Vì ở đất mặt có chứa xác ĐV và lượng phù sa màu mỡ cung cấp nguồn cơ chất protid dồi dào cho proteaza hoạt động. Trong khi đó, khả năng sinh cellulaza của các chủng nấm sợi có nhiều ở cơ chất lá mục, cành mục và đất sâu, thấp nhất ở đất mặt, lá vàng và cành khô. Vì lá mục và cành mục có nhiều cellulose là nguồn cơ chất của cellulaza (Xem bảng 3.17). Khi so sánh với kết quả khảo sát ban đầu của tác giả Khưu Phương Yến Anh đã phân lập được 10 chủng có hoạt tính cellulaza mạnh. Các chủng này chủ yếu phân lập từ đất mặt, cành khô và cành mục ở RNM. Vậy qua khảo sát cả 3 đợt chúng tôi nhận thấy khả năng sinh enzim ngoại bào của các chủng nấm sợi thay đổi theo mùa, tùy theo loại cơ chất và có sự khác nhau giữa các chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium. Bảng 3.17: Giá trị trung bình về khả năng sinh enzim ngoại bào của các chủng nấm sợi theo cơ chất Tổng số chủng Enzim Cơ chất Giá trị trung bình Số lượng Tỷ lệ (%) Lá vàng 8,88 ± 0,93 31 11,65 Lá mục 8,12 ± 0,73 43 16,17 Cành khô 7,69 ± 1,11 27 10,15 Cành mục 8,11 ± 0,10 38 14,29 Đất mặt 8,40 ± 0,77 57 21,43 Amylaza Đất sâu 7,56 ± 1,08 19 7,14 Lá vàng 7,01 ± 0,90 29 10,90 Lá mục 6,43 ± 0,47 47 17,67 Cành khô 8,78 ± 1,08 23 8,6 Cành mục 6,49 ± 0,73 37 13,91 Proteaza Đất mặt 7,12 ± 0,63 60 22,56 Đất sâu 6,87 ± 1,07 25 9,40 Lá vàng 7,88 ± 0,77 33 12,41 Lá mục 9,75 ± 0,76 53 19,92 Cành khô 8,15 ± 0,82 26 9,77 Cành mục 9,24 ± 0,77 46 17,29 Đất mặt 7,56 ± 0,56 54 20,30 Cellulaza Đất sâu 9,10 ± 0,98 23 8,65 3.2.2. Khảo sát khả năng ĐK với VSVKĐ của các chủng nấm sợi phân lập được Sau khi khảo sát khả năng sinh enzim chúng tôi tiếp tục khảo sát khả năng ĐK với các VSVKĐ VK G+ (B. subtillis), VK G- (E.coli) 3.2.2.1 Kết quả đợt 1 Khảo sát khả năng ĐK với các VSVKĐ ở đợt 1 chúng tôi thu được kết quả ở bảng 3.18 Bảng 3.18: Khả năng ĐK với các VSVKĐ của các chủng nấm sợi (đợt 1) Ký hiệu chủng Hoạt tính đối kháng (D –d) mm Hoạt tính đối kháng (D – d) mm STT B.subtillis E.coli STT Ký hiệu chủng B.subtillis E.coli 1 L1P 12 12 40 CM15A 10 0 2 L2P 9 0 41 CM17P 15 0 3 L3A 7 0 42 CM19P 9 0 4 L4A 11 15 43 CM21A 0 0 5 L5A 1 0 44 CM22P 19 20 6 L6A 10 0 45 CM23P 0 0 7 L7P 17 18 46 CM26A 7 4 8 L8A 7 0 47 CM29P 23 19 9 L9A 0 0 48 CM30P 23 20 10 LM1P 0 0 49 CM32P 23 23 11 LM2A 3 0 50 CM38P 9 8 12 LM5A 5 0 51 CM41P 14 0 13 LM8A 0 0 52 Đ1A 13 0 14 LM9A 19 16 53 Đ2A 11 0 15 LM10A 11 0 54 Đ3A 11 15 16 LM11P 16 0 55 Đ4P 9 0 17 LM14P 21 22 56 Đ6P 12 11 18 LM15A 6 5 57 Đ8A 14 0 19 LM16A 10 0 58 Đ9A 14 2 20 LM18P 17 18 59 Đ10A 12 11 21 LM20P 4 5 60 Đ11P 9 0 22 LM21P 23 16 61 Đ16P 9 0 23 LM22P 7 9 62 Đ18P 19 0 24 LM23P 5 8 63 Đ19P 16 0 25 LM24P 9 10 64 Đ20P 14 0 26 LM25P 11 12 65 Đ22P 15 0 27 CK1P 22 20 66 Đ25A 13 0 28 CK2A 14 12 67 Đ27P 13 0 29 CK3A 11 0 68 Đ28A 14 0 30 CK4A 15 0 69 Đ29A 11 0 31 CK5P 19 17 70 ĐS1A 12 0 32 CK6P 13 13 71 ĐS2P 12 0 33 CK7P 0 0 72 ĐS3A 0 0 34 CK8P 15 16 73 ĐS6P 15 12 35 CM1P 16 3 74 ĐS7P 11 0 36 CM2A 0 0 75 ĐS9P 11 12 37 CM3A 12 13 76 ĐS10P 11 0 38 CM4P 22 22 77 ĐS11P 15 15 39 CM5P 0 0 Kết quả thu được ở đợt 1, tổng số chủng có khả năng ĐK với VSVKĐ là 68/77 chủng ( 88,31%). Trong đó, số chủng có khả năng ĐK với B.subtillis là 68/77 chủng ( 88,31%), với E.coli là 44/77 chủng (42,86%), khả năng ĐK với cả B.subtillis và E.coli là 44/77 chủng (42,86%). Số chủng có khả năng ĐK với VSVKĐ mạnh (D – d ≥ 20mm) là 8 chủng (10,39%). Trong đó, số chủng có khả năng ĐK với cả B.subtillis và E.coli mạnh là 5/77 chủng (6,49%), số chủng chỉ có khả năng ĐK với B. subtillis mạnh là 2 chủng (2,6%), số chủng chỉ có khả năng ĐK với E. coli mạnh là 2 chủng (2,6%). Theo chúng tôi, thời gian lấy mẫu đợt 1 đúng vào mùa mưa (tháng 9) làm cho độ mặn của MT thấp (< 1,5%) đã tác động đến khả năng ĐK của nấm sợi. Có thể tóm tắt bảng 3.18 như sau: Không có hoạt tính Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh Vi sinh vật kiểm định SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) B.subtillis 9 11,69 17 22,08 44 57,14 7 9,09 E.coli 44 57,14 8 10,39 19 24,68 6 7,79 (Ghi chú: SL: Số lượng, TL: Tỷ lệ) 3.2.2.2 Kết quả đợt 2 Ở đợt 2 kết quả về khả năng ĐK với VSVKĐ được trình bày ở bảng 3.19 Bảng 3.19: Khả năng ĐK với VSVKĐ của các chủng nấm sợi (đợt 2) Hoạt tính đối kháng (D – d) mm Hoạt tính đối kháng (D – d) mm STT Ký hiệu chủng B.subtillis E.coli STT Ký hiệu chủng B.subtilis E.coli 1 L10A 4 0 52 CM50P 8 0 2 L11P 0 0 53 CM51P 12 0 3 L12A 5 0 54 CM52A 14 0 4 L13P 13 0 55 CM53P 3 0 5 L14P 13 0 56 CM54P 9 0 6 L15A 3 0 57 CM55P 0 0 7 L17A 4 0 58 CM56P 0 0 8 L19P 10 0 59 CM57A 4 0 9 L21A 0 0 60 CM58P 4 0 10 L24P 6 0 61 CM60A 0 0 11 L28A 3 0 62 CM61A 3 0 12 L31P 7 0 63 CM62P 7 0 13 L32P 5 0 64 Đ32P 4 0 14 L33P 7 0 65 Đ33A 5 0 15 L34A 10 0 66 Đ34A 6 0 16 LM26A 2 0 67 Đ35P 10 0 17 LM27A 6 7 68 Đ36P 18 0 18 LM31P 4 0 69 Đ37P 12 0 19 LM35A 4 0 70 Đ38P 0 0 20 LM36A 4 0 71 Đ39P 2 0 21 LM38P 6 8 72 Đ40P 6 0 22 LM39P 20 0 73 Đ42P 3 0 23 LM40P 0 0 74 Đ43P 6 0 24 LM41A 5 0 75 Đ44P 0 0 25 LM42A 6 0 76 Đ45A 4 0 26 LM44P 10 0 77 Đ46P 5 0 27 LM47P 0 0 78 Đ47P 7 0 28 LM48P 19 0 79 Đ48P 5 0 29 LM49P 28 0 80 Đ49P 7 0 30 LM51P 0 0 81 Đ50P 8 0 31 LM52A 9 0 82 Đ51P 0 0 32 LM53P 9 0 83 Đ52P 0 0 33 LM55P 9 0 84 Đ53A 4 0 34 LM56P 5 0 85 Đ54P 5 0 35 LM60A 7 0 86 Đ56P 1 0 36 LM61P 12 0 87 Đ57P 0 0 37 CK11P 4 0 88 Đ58P 8 0 38 CK12A 4 0 89 Đ59A 6 0 39 CK13A 0 0 90 Đ60P 14 0 40 CK14A 12 7 91 Đ62A 7 0 41 CK15A 0 0 92 ĐS19P 21 5 42 CK16P 14 0 93 ĐS21P 7 0 43 CK17P 10 0 94 ĐS22P 2 0 44 CK20P 11 0 95 ĐS24A 5 0 45 CK23P 12 0 96 ĐS25A 5 0 46 CM44P 10 0 97 ĐS26A 7 0 47 CM45A 0 0 98 ĐS27A 5 0 48 CM46A 4 0 99 ĐS28P 5 0 49 CM47A 4 0 100 ĐS32P 0 0 50 CM48P 12 0 101 ĐS33A 7 0 51 CM49A 4 0 102 ĐS35P 22 0 Ở đợt 2 tổng số chủng có khả năng ĐK với VSVKĐ là 85/102 chủng (83,33%). Trong đó, số chủng có khả năng ĐK với B.subtillis là 85/102 chủng (83,33%), với E.coli là 4/102 chủng (3,92%), khả năng ĐK với cả B.subtillis và E.coli là 4/102 chủng (3,92%). Số chủng có khả năng ĐK với B. subtillis mạnh (D – d ≥ 20 mm) là 3 chủng (2,94%), rất mạnh (D – d ≥ 25mm) là 1 chủng (0,98%). Số chủng ĐK với E. coli mạnh là không có. Như vậy, ở đợt 2 số chủng nấm sợi chủ yếu có khả năng ĐK với B. subtillis và số chủng có khả năng ĐK mạnh với VSVKĐ ít hơn so với đợt 1. Các chủng có khả năng ĐK mạnh đều thuộc Penicillium. Theo chúng tôi, đợt 2 lấy mẫu vào thời điểm giao mùa mưa – khô, lượng mưa ít hơn nên độ mặn (2 – 3%) cao hơn đợt 1. Điều này có thể ảnh hưởng đến khả năng ĐK của các chủng nấm sợi. Có thể tóm tắt bảng 3.19 như sau: Không có hoạt tính Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh Hoạt tính rất mạnh Vi sinh vật kiểm định SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) B.subtillis 17 16,67 61 59,80 20 19,61 3 2,94 1 0,98 E.coli 98 96,08 4 3,92 0 0 0 0 0 0 3.2.2.3 Kết quả đợt 3 Kết quả khảo sát khả năng ĐK với các VSVKĐ ở đợt 3 được trình bày ở bảng 3.20 Bảng 3.20: Khả năng ĐK với VSVKĐ của các chủng nấm sợi (đợt 3) Hoạt tính đối kháng (D – d)mm Hoạt tính đối kháng (D – d)mm STT Ký hiệu chủng B.subtillis E.coli STT Ký hiệu chủng B.subtillis E.coli 1 L36A 5 0 45 CM70A 4 0 2 L37P 0 0 46 CM71A 0 0 3 L39P 0 0 47 CM72A 7 0 4 L40P 3 0 48 CM75P 6 0 5 L41P 5 0 49 CM76P 15 0 6 L42A 5 0 50 CM77P 5 0 7 L43P 17 0 51 CM79P 7 0 8 L45P 5 0 52 CM80P 13 0 9 L46P 3 0 53 CM81P 9 0 10 L49A 7 0 54 CM82P 10 0 11 L50P 4 0 55 Đ63A 1 0 12 L52A 6 0 56 Đ64P 2 0 13 LM63P 3 0 57 Đ65P 12 0 14 LM64A 0 0 58 Đ66P 11 0 15 LM65P 0 0 59 Đ67P 4 0 16 LM66A 4 0 60 Đ68A 0 0 17 LM67A 3 0 61 Đ69P 1 0 18 LM68P 0 0 62 Đ70P 9 0 19 LM69P 13 0 63 Đ71A 0 0 20 LM70P 11 0 64 Đ72P 5 0 21 LM71P 2 0 65 Đ73P 17 0 22 LM73P 3 0 66 Đ74P 10 0 23 LM74P 5 0 67 Đ75P 15 0 24 LM75P 4 0 68 Đ76A 5 0 25 LM76P 10 0 69 Đ77P 3 0 26 LM77P 6 0 70 Đ78P 5 0 27 LM78A 4 0 71 Đ79P 18 0 28 LM80P 6 0 72 Đ80P 4 0 29 CK25A 2 0 73 Đ81P 0 0 30 CK26P 13 0 74 Đ82P 7 0 31 CK29P 12 0 75 Đ83A 10 0 32 CK30P 7 0 76 Đ84A 4 0 33 CK31A 0 0 77 Đ85A 0 0 34 CK32P 11 0 78 ĐS31P 5 0 35 CK33P 0 0 79 ĐS37A 0 0 36 CK34A 7 0 80 ĐS38P 10 0 37 CK36P 14 0 81 ĐS39A