Luận văn Khảo sát các đặc điểm hóa sinh, hóa lý và phân tích chất lượng mùi thơm của gạo nàng thơm chợ đào bằng phương pháp spme – gc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH, HÓA LÝ VÀ PHÂN TÍCH CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM CỦA GẠO NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SPME – GC Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH, HÓA LÝ VÀ PHÂN TÍCH CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM CỦA GẠO NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SPME – GC Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TS. PHAN PHƢỚC HIỀN (NLU) NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG TS. FRÉDÉRIC GAY (CIRAD) KHÓA: 2002 - 2006 TS. CHRISTIAN METRES (CIRAD) Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY STUDYING THE PHYSICO-CHEMICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF THE NANG THOM CHO DAO RICE VARIETY; AS WELL AS ANALYZING ITS AROMATIC QUALITY UTILIZING THE SPME – GC METHOD Graduation Thesis Major: Biotechnology Research adviser Researcher PHAN PHƢỚC HIỀN (NLU), Ph.D NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG FRÉDÉRIC GAY (CIRAD) , Ph.D Term: 2002 - 2006 CHRISTIAN METRES (CIRAD), Ph.D HCMC, 06/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM HÓA LÝ – HÓA SINH VÀ PHÂN TÍCH CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM CỦA GẠO NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SPME - GC Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM HÓA LÝ – HÓA SINH VÀ PHÂN TÍCH CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM CỦA GẠO NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SPME - GC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN (NLU) NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG TS. FRÉDERÍC GAY (CIRAD) TS. CHRISTIAN MESTRES (CIRAD) Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cảm ơn: - Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập. - Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô khác đã luôn tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi. - TS. Phan Phƣớc Hiền (NLU), TS. Frédéric Gay (CIRAD) và TS. Christian Mestres (CIRAD đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp. - Cô Phùng Võ Cẩm Hồng cùng các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm. - Bạn Phạm Đình Chƣơng cùng toàn thể các bạn trong lớp CNSH28 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài. Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Chân thành cảm ơn. Tháng 09 năm 2006 Nguyễn Thị Thu Hƣơng TÓM TẮT NGUYỄN THỊ THU HƢƠNG, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2006. “KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH – HÓA LÝ VÀ PHÂN TÍCH CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM CỦA GẠO NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO BẰNG PHƢƠNG PHÁP SPME – GC”. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN (NLU) TS. FRÉDÉRIC GAY (CIRAD) TS. CHRISTIAN MESTRES (CIRAD) Nàng Thơm Chợ Đào là giống gạo thơm truyền thống nổi tiếng của khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Có nhiều ý kiến cho rằng loại gạo đƣợc gọi là Nàng Thơm Chợ Đào đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng hiện nay đã bị trộn lẫn với những giống gạo khác, hay thậm chí chúng hoàn toàn không chứa giống gạo Nàng Thơm Chợ Đào. Vì thế, chúng tôi tiến hành tiến hành khảo sát các đặc điểm hóa lý, hàm lƣợng protein, chiết xuất các hợp chất thơm trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào bằng phƣơng pháp SPME và phân tích hàm lƣợng hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trên GC để đánh giá độ thuần khiết của gạo Nàng Thơm Chợ Đào đang lƣu hành trên thị trƣờng. Những kết quả đạt đƣợc: Đặc điểm hóa lý – hóa sinh: Nàng Thơm Chợ Đào là loại gạo có dạng hạt mảnh, thuộc nhóm thon dài với chiều dài trung bình 6,10 mm; tỉ lệ dài/rộng 3,27. Diện tích bạc bụng: 35%. Tỉ lệ gạo nguyên so với chiều dài trung bình: 63,12%. Hàm lƣợng protein trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào đạt 7,27%. Phân tích chất lượng mùi thơm: Xác định đƣợc hợp chất thơm 2 –acetyl – 1 – pyrroline xuất hiện ở thời điểm 10,1 phút trong điều kiện phòng thí nghiệm. Kết luận đƣợc các loại gạo Nàng Thơm Chợ Đào đang lƣu hành trên thị trƣờng hiện nay không chứa thuần nhất gạo Nàng Thơm Chợ Đào mà có sự pha trộn với các loại gạo khác. Nhận thấy đƣợc vai trò của điều kiện môi trƣờng, điều kiện gieo trồng đối với tính thơm của gạo đặc sản. Gạo NTCD cho phẩm chất mùi thơm cao nhất khi đƣợc gieo trồng ở ấp Chợ Đào, đặc biệt là ở chân ruộng trung bình, đất chứa lƣợng acid nhẹ, và không cần tháo nƣớc trƣớc khi thu hoạch. ABSTRACT NGUYEN THI THU HUONG, Nong Lam Univeristy, HCMC. September, 2006. “Studying the physico-chemical and biochemical characteristics of the Nang Thom Cho Dao rice variety; as well as analyzing its aromatic quality utilizing the Solid Phase Micro Extraction (SPME) and Gas Chromatography (GC) methods” Board of research advisers: PHAN PHUOC HIEN (NLU), PhD FREDERIC GAY (CIRAD), PhD CHRISTIAN MESTRES (CIRAD), PhD Nang Thom Cho Dao, a traditional aromatic rice variety of Mekong Delta with high reputation in South Vietnam, especially on Ho Chi Minh City’s markets. Production of NTCD is restricted to a very small area in Can Duoc district (Long An province) whereas rice labeled NTCD is sold everywhere on HCMc’s markets and across the Mekong Delta with a price twice the price of ordinary rice. Recently, existing many opinions which believe that the NTCD circulated on HCMC market and across the Mekong Delta either gets mixed up with other rice varieties or sometimes does not at all content any NTCD; however, they are sold at the price as twice as the ordinary varieties. Therefore, evaluating the physiochemical characteristics and protein content of the NTCD is necessary. In this study, 2-acteyl-1-pyrroline, one of the most important elements of the rice aroma is analyzed using the SPME – GC methods in order to evaluate the grain aromatic quality in NTCD and confirm rice adulteration. Results obtained from the study: Biochemical and physiochemical characteristics: NTCD is a rice variety with slender grain which belongs to the tapering group with average length of 6,10 mm. Ratio of length/width: 3,27. Chalky areas: 35%. Ratio of the whole rice grain / average length: 63,12%. Protein content: 7,27%. Analysis of the aromatic quality: Identify the aromatic compound of 2 –acetyl – 1 – pyrroline at the 10,1th minute in laboratory condition. Conclude that the NTCD currently circulating on the market is counterfeit because they do not contain the homogeneous NTCD but get mixed up with other varieties instead. Realize the importance of the environment and growing condition to the aromatic characteristics of the NTCD. The most aromatic productivity occurs when it is cultured at Cho Dao hamlet, especially at average field elevation, the lightly acid content and undrained before harvest. MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn ............................................................................................................. iii Tóm tắt ................................................................................................................... iv Mục lục ................................................................................................................ viii Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... xii Danh sách các bảng ............................................................................................. xiii Danh sách các hình .............................................................................................. xiv Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xvi Danh sách các sơ đồ ............................................................................................ xvi 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................. 1 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU ........................................................................ 2 1.2.1. Mục đích .............................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................ 2 2. TỔNG QUAN .................................................................................................... 3 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HẠT LÚA – HẠT GẠO .................................. 3 2.1.1. Hệ thống phân loại cây lúa .................................................................. 3 2.1.2. Hạt lúa ................................................................................................. 3 2.1.3. Chất lƣợng hạt gạo .............................................................................. 4 2.1.3.1. Hình thức bên ngoài của hạt gạo ............................................. 4 2.1.3.2. Chất lƣợng xay xát .................................................................. 6 2.1.3.3. Hàm lƣợng protein .................................................................. 7 2.2. LÚA THƠM ĐẶC SẢN VIỆT NAM ......................................................... 7 2.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO .......................... 8 2.3.1. Nguồn gốc ........................................................................................... 8 2.3.2. Đặc điểm nông học .............................................................................. 8 2.3.3. Phẩm chất ............................................................................................ 9 2.3.4. Mùa vụ và chân đất phù hợp ............................................................. 10 2.4. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA SINH CHẤT THƠM CỦA LÚA GẠO ........... 11 2.4.1. Những hợp chất bay hơi có trong gạo thơm ...................................... 11 2.4.2. Hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline ......................................... 13 2.5. CÁC YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN GIEO TRỒNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM .................................................. 15 2.5.1. Nhiệt độ ............................................................................................. 15 2.5.2. Nơi gieo trồng ................................................................................... 16 2.5.3. Phân bón ............................................................................................ 16 2.5.4. Tập quán gieo trồng........................................................................... 17 2.5.5. Cách bảo quản và xay xát .................................................................. 17 2.6. PHƢƠNG PHÁP VI CHIẾT XUẤT TRÊN PHA RẮN (SPME) ................. 18 2.6.1. Nguyên tắc ......................................................................................... 18 2.6.2. Đặc điểm ........................................................................................... 18 2.6.3. Dụng cụ sử dụng cho kỹ thuật SPME ............................................... 19 2.6.4. Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật vi chiết xuất trên pha rắn ........... 21 2.6.5. Ứng dụng phƣơng pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline ................................................................................................ 21 2.7. SẮC KÝ KHÍ ................................................................................................ 22 2.7.1. Nguyên tắc ......................................................................................... 22 2.7.2. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí .................................................................... 23 2.7.2.1. Detector ................................................................................. 23 2.7.2.2. Cột mao quản ........................................................................ 25 2.8. SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ ................................................................. 25 2.9. PHƢƠNG PHÁP KJELDAHL...................................................................... 25 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..................................... 27 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH .................................................. 27 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ ...................................................... 27 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 28 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 28 3.4.1. Khảo sát đặc điểm hóa lý của gạo Nàng Thơm Chợ Đào ................. 28 3.4.1.1. Hình dạng hạt gạo ................................................................. 28 3.4.1.2. Xác định tỉ lệ bạc bụng ......................................................... 28 3.4.2. Phân tích hàm lƣợng protein tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl .... 29 3.4.3. Chiết xuất hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME........................................................................................................... 30 3.4.4. Định tính và định lƣợng hợp chất thơm 2 – AP trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào bằng GC và GC/MS ............................................................................. 31 3.4.4.1. Trên sắc ký khí ...................................................................... 31 3.4.4.2. Trên sắc ký khí ghép khối phổ .............................................. 32 3.4.5. Xác định hệ số phản hồi .................................................................... 32 3.4.5.1. Xác định hệ số phản hồi theo chất ngoại chuẩn collidine ..... 32 3.4.5.2. Xác định hệ số phản hồi theo nồng độ hợp chất thơm 2 – AP trong gạo thơm Giano ........................................................................ 33 3.4.6. Xác định nồng độ hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào .................................................................................. 33 3.4.7. Phƣơng pháp xử lý thống kê ............................................................. 33 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 34 4.1. HÌNH THỨC BÊN NGOÀI CỦA HẠT GẠO .............................................. 34 4.1.1. Hình dạng và kích thƣớc hạt gạo....................................................... 34 4.1.2. Độ bạc bụng ...................................................................................... 36 4.2. TỈ LỆ GẠO NGUYÊN .................................................................................. 38 4.3. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG PROTEIN ...................................................... 40 4.4. THIÉT LẬP PHƢƠNG PHÁP SPME – GC ................................................. 41 4.4.1. Xác định thời gian lƣu của chất chuẩn collidine ............................... 41 4.4.2. Định tính hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline.................................... 45 4.4.3. Xác định hệ số phản hồi của hợp chất 2 – AP................................... 49 4.4.3.1. Xác định hệ số phản hồi theo nồng độ chất chuẩn collidine . 49 4.4.3.2. Xác định hệ số phản hồi theo nồng độ 2 – AP trong gạo Giano .................................................................................................. 50 4.5. SO SÁNH HÀM LƢỢNG CHẤT THƠM TRONG GẠO NTCĐ THU THẬP TỪ CHỢ VÀ CÁC LOẠI GẠO THƠM ĐƢỢC BÁN Ở THỊ TRƢỜNG CHÂU ÂU ............................................................................................................ 51 4.6. SO SÁNH HÀM LƢỢNG 2 – AP TRONG MẪU GẠO NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO THU THẬP TỨ CHỢ VÀ TỪ RUỘNG ........................................... 52 4.7. ĐÁNH GIÁ CÁC YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HÀM LƢỢNG CHẤT THƠM 2 – AP TRONG GẠO NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO CHÍNH GỐC .......... 53 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 58 5.1 KẾT LUẬN .................................................................................................... 58 5.1.1. Tính chất hóa lý – hóa sinh của gạo Nàng Thơm Chợ Đào .............. 58 5.1.2. Hàm lƣợng hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào ............................................................................................ 58 5.2 ĐỀ NGHỊ ....................................................................................................... 58 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 60 7. PHỤ LỤC ........................................................................................................ 67 Phụ lục 1. Các hợp chất bay hơi có trong gạo thơm ............................................. 67 Phụ lục 2. Bảng thống kê mẫu gạo sử dụng trong phân tích ................................ 68 Phụ lục 3. Khống chế các yếu tố ảnh hƣởng ........................................................ 68 Phụ lục 4. Kết quả đo các chỉ tiêu hóa lý của gạo Nàng Thơm Chợ Đào ............ 71 Phụ lục 5. Sắc ký đồ GC phân tích các chất bay hơi trong gạo Basmati ............. 73 Phụ lục 6. Sắc ký đồ GC phân tích các chất bay hơi trong gạo Thái Lan ............ 73 Phụ lục 7. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP trong mẫu gạo M10 .. 73 Phụ lục 8. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP trong mẫu gạo SM14 74 Phụ lục 9. Nồng độ 2 – AP trung bình trong các mẫu gạo phân tích ................... 74 Phụ lục 10. Sơ đồ các yếu tố ảnh hƣởng đến hàm lƣợng 2 – AP trong gạo NTCĐ ................................................................................................................... 75 Phụ lục 11. Hàm lƣợng 2 – AP trong các mẫu gạo NTIAS ................................ 76 Phụ lục 12. Bảng ANOVA so sánh nồng độ 2 – AP giữa mẫu gạo thu thập từ chợ, mẫu gạo IAS và mẫu gạo VL ............................................................................... 77 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT SPME (Solid Phase Microextraction): vi chiết xuất trên pha rắn FID (Flame ionization detector): đầu dò ion hóa ngọn lửa. GC (Gas chromatography): sắc ký khí. GC/MS (Gas chromatography/mass spectrum): sắc ký khí ghép khối phổ. Ctv: cộng tác viên 2 – AP, AcPy: 2 – acetyl – 1 – pyrroline HPLC (High pressure liquid chromarography): sắc ký lỏng cao áp LC/MS (liquid chromarography/mass spectrum): sắc ký lỏng ghép khối phổ NTCĐ: gạo Nàng Thơm Chợ Đào RF (response factor): hệ số phản hồi DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1. Phân loại kích thƣớc hạt gạo .................................................................. 4 Bảng 2.2. Phân loại hình dạng hạt gạo ................................................................... 5 Bảng 2.3. Phân loại diện tích bạc bụng .................................................................. 6 Bảng 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến việc hình thành và lƣu giữ mùi thơm trong gạo thơm .............................................................................................................. 18 Bảng 3.1. Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm .............................. 27 Bảng 4.1. Kết quả thống kê so sánh các chỉ tiêu hình dạng và kích thƣớc hạt gạo của 2 loại mẫu chợ và IAS .................................................................................... 34 Bảng 4.2. Diện tích bạc bụng của mẫu IAS và chợ .............................................. 36 Bảng 4.3. Kết quả thống kê so sánh độ bạc bụng của mẫu gạo từ chợ và ruộng . 37 Bảng 4.4. Kết quả thống kê so sánh tỉ lệ gạo nguyên của các mẫu gạo thu thập từ ruộng và từ chợ ..................................................................................................... 38 Bảng 4.5. Hàm lƣợng protein trong gạo ............................................................... 40 Bảng 4.6. Kết quả phân tích thống kê hàm lƣợng protein trong gạo ................... 40 Bảng 4.7. Thời gian lƣu, diện tích và chiều cao của chuẩn collidine 0,001 mg/ml .................................................................................................................... 41 Bảng 4.8. Thời gian lƣu, diện tích, chiều cao của chất chuẩn collidine ở mỗi nồng độ .......................................................................................................................... 43 Bảng 4.9. Thời gian lƣu (phút) của hexanal, nonanal có trong mẫu gạo Thái Lan và Basmati chạy trên GC và GC/MS .................................................................... 48 Bảng 4.10. Hệ số phản hồi của chất chuẩn collidine ............................................ 49 Bảng 4.11. Nồng độ 2 – AP trong mẫu gạo thơm bán trên thị trƣờng ................. 50 Bảng 4.12. Nồng độ 2 – AP trung bình trong mẫu gạo thơm bán trên thị trƣờng 50 Bảng 4.13. Nồng độ hợp chất thơm 2 – AP trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào ..... 52 Bảng 4.14. Hàm lƣợng 2 – AP thu đƣợc khi chiết xuất bằng phƣơng pháp SPME .................................................................................................................... 53 Bảng 4.15. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tính thơm của gạo Nàng Thơm Chợ Đào 55 DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1. Hạt lúa..................................................................................................... 3 Hình 2.2.Phân loại kích thƣớc hạt gạo ................................................................... 5 Hình 2.3. Phân loại hình dạng hạt gạo.................................................................... 5 Hình 2.4. Cấu trúc hóa học của 2 – AP ................................................................ 13 Hình 2.5. Phổ đồ hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline ........................................... 13 Hình 2.6. Cấu tạo sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME ....................................... 19 Hình 2.7. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME ....................................................... 20 Hình 2.8. Các kỹ thuật chiết dùng trong phƣơng pháp SPME ............................. 21 Hình 2.9. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID ...................... 23 Hình 2.10. Sơ đồ cấu tạo hình học của detector ion hóa ngọn lửa ....................... 23 Hình 2.11. Cột mao quản ...................................................................................... 25 Hình 3.1. Hệ thống phân tích đạm tự động .......................................................... 30 Hình 3.2. Hệ thống máy nhiệt từ .......................................................................... 30 Hình 3.3. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME (DVB/CAR/PDMS) ..................... 31 Hình 3.4. Máy sắc ký khí ...................................................................................... 31 Hình 3.5. Máy sắc ký khí ghép khối phổ .............................................................. 32 Hình 4.1. Mẫu gạo M2 ......................................................................................... 35 Hình 4.2. Mẫu gạo IASM20B .............................................................................. 35 Hình 4.3. Mẫu gạo ở chợ có diện tích bạc bụng cao nhất (M11) ......................... 36 Hình 4.4. Mẫu gạo ở ruộng có diện tích bạc bụng cao nhất (IASM8) ................. 36 Hình 4.5. Mẫu gạo ở chợ có diện tích bạc bụng thấp nhất (M7) .......................... 37 Hình 4.6. Mẫu gạo ở ruộng có diện tích bạc bụng thấp nhất (IASM13) .............. 37 Hình 4.7. Mẫu gạo IASM4 ................................................................................... 38 Hình 4.8. Mẫu gạo IASM15 ................................................................................. 38 Hình 4.9. Sắc ký đồ GC phân tích thành phần hóa học của collidine (nồng độ 0,001mg/ml) ......................................................................................................... 42 Hình 4.10. Sắc ký đồ GC phân tích thành phần hóa học của collidine (nồng độ 0,002 mg/ml) ........................................................................................................ 43 Hình 4.11. Sắc ký đồ GC – MS phân tích các hợp chất bay hơi có trong mẫu gạo Thái Lan ................................................................................................................ 45 Hình 4.12. Kết quả tra cứu thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal và nonanal trong thƣ viện của máy GC/MS ..................................................................................... 46 Hình 4.13. Phổ đồ của hợp chất phân tách ở thời điểm 9,24 phút của mẫu gạo Basmati ................................................................................................................. 47 Hình 4.14. Phổ đồ của hợp chất phân tách ở thời điểm 9,22 phút của mẫu gạo Thái Lan ................................................................................................................ 47 Hình 4.15. Sắc ký đồ GC phân tích collidine (nồng độ 0,01 mg/ml) ................... 49 Hình 4.16. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP trong gạo thơm Giano .................................................................................................................... 50 Hình 4.17. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP trong mẫu gạo SM15 .................................................................................................................... 50 Hình 4.18. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP trong mẫu gạo VLS22 ................................................................................................................... 53 Hình 4.19. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP trong mẫu gạo DPI .. 54 DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ BIỂU ĐỒ TRANG Biểu đồ 4.1 Chiều dài hạt của mẫu thu thập từ chợ và từ ruộng .......................... 34 Biểu đồ 4.2 Tỉ lệ bạc bụng của mẫu gạo IAS và chợ ........................................... 36 Biểu đồ 4.3. Mối tƣơng quan giữa tỉ lệ hạt vỡ/chiều dài trung bình và tỉ lệ hạt vỡ/chiều dài tối đa ................................................................................................ 39 Biểu đồ 4.4. Mối tƣơng quan giữa chiều dài hạt gạo và tỉ lệ gạo nguyên ............ 39 Biểu đồ 4.5. So sánh hàm lƣợng protein giữa các mẫu gạo Nàng Thơm Chợ Đào40 Biểu đồ 4.6. Mối tƣơng quan giữa chiều cao và nồng độ của chuẩn collidine .... 43 Biểu đồ 4.7. Mối tƣơng quan giữa diện tích và nồng độ của chuẩn collidine ...... 43 DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 3.1. Qui trình phân tích hàm lƣợng protein trong gạo ............................... 29 Sơ đồ 3.2. Qui trình phân tích hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME .................................................................................................................... 30 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Theo thống kê nông nghiệp của FAO, các loại lƣơng thực truyền thống chủ yếu đƣợc sản xuất và tiêu thụ trên thế giới bao gồm 5 loại cụ thể: lúa gạo, lúa mì, ngô, kê, lúa mạch. Trong số các loại kể trên, lúa mì và lúa gạo (Oryza sativa L.) là hai loại lƣơng thực cơ bản dùng cho con ngƣời. Theo tính toán của FAO, đến năm 2001, sản lƣợng lúa gạo sản xuất ra trên toàn thế giới có thể duy trì sự sống cho 3.260 triệu ngƣời, chiếm trên 53% dân số thế giới [9]. Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu thế giới. Năm 2003, các nƣớc xuất khẩu gạo chính (tính theo triệu tấn) bao gồm: Thái Lan (8,0), Việt Nam (4,0), Mỹ (3,0) (FAO, 2005) [30]. Tuy sản xuất với số lƣợng nhiều, nhƣng chất lƣợng và giá gạo xuất khẩu của Việt Nam thƣờng thấp hơn so với một số nƣớc nhƣ Thái Lan, Mỹ, đặc biệt có sự chênh lệch lớn ở loại gạo đặc sản và gạo cao cấp. Từ cái nôi của nền văn minh lúa nƣớc xa xƣa, gạo đặc sản Việt Nam đã có những loại nổi tiếng nhƣ Tám thơm, Tám xoan, Dự hƣơng, Nếp cái hoa vàng…từng một thời phục vụ chủ yếu cho vua quan quí tộc. Nét nổi bật của gạo đặc sản quí hiếm là hạt cơm dẻo, mềm, vị đậm và ngon, tinh bột cao cấp amilopectin chiếm tới 80%, giá trị dinh dƣỡng cao, dễ hấp thụ, đặc biệt khi nấu, dƣới tác dụng của nhiệt độ, hơi bốc từ nồi cơm tỏa mùi thơm ngào ngạt, ngon lành khiến ngƣời ở xa 20 – 30 m cũng dễ nhận biết đƣợc thứ hƣơng thơm độc đáo, gợi cảm này [9]. Nàng Thơm Chợ Đào là giống gạo thơm truyền thống nổi tiếng của khu vực đồng bằng sông Cửu Long. Mặc dù giống lúa này chỉ đƣợc gieo trồng ở một vài ấp của huyện Cần Đƣớc (tỉnh Long An), nhƣng loại gạo đƣợc dán nhãn Nàng Thơm Chợ Đào lại đƣợc bán khắp nơi trên thị trƣờng thành phố Hồ Chí Minh và khu vực đồng bằng sông Cửu Long với giá đắt hơn nhiều so với những loại gạo thông thƣờng khác. Có nhiều ý kiến cho rằng loại gạo đƣợc gọi là Nàng Thơm Chợ Đào đang đƣợc lƣu hành trên thị trƣờng hiện nay đã bị trộn lẫn với những giống gạo khác, hay thậm chí chúng hoàn toàn không chứa giống gạo Nàng Thơm Chợ Đào. Xuất phát từ hiện trạng này, đƣợc sự phân công của bộ môn Công Nghệ Sinh Học, dƣới sự hƣớng dẫn của thầy TS. Phan Phƣớc Hiền (NLU), TS. Frédéric Gay (CIRAD), TS. Christian Metres (CIRAD), chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát các đặc điểm hóa lý – hóa sinh và phân tích chất lƣợng mùi thơm của gạo Nàng Thơm Chợ Đào bằng kỹ thuật SPME - GC”. 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU 1.2.1. Mục Đích Khảo sát các đặc điểm hóa lý – hóa sinh, so sánh chất lƣợng mùi thơm trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào thu thập từ ruộng của nông dân và mẫu gạo đang lƣu hành trên thị trƣờng thành phố Hồ Chí Minh bằng phƣơng pháp vi chiết xuất trên pha rắn (SPME) kết hợp với sắc ký khí (gas chromatography – GC). 1.2.2. Yêu Cầu  Khảo sát các tính chất hóa lý, hóa sinh của gạo Nàng Thơm Chợ Đào.  Thực hiện qui trình phân tích các chất tạo mùi thơm trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào bằng phƣơng pháp SPME – GC. Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ HẠT LÚA – HẠT GẠO 2.1.1. Hệ thống phân loại cây lúa [6] Lúa thuộc: Ngành Thực vật có hoa: Angiospermae Lớp một lá mầm: Monocotyledones Bộ Hòa thảo có hoa : Poales (Graminales) Họ Hòa thảo: Poaceae (Gramineae) Họ phụ Hòa thảo ƣa nƣớc: Pryzoideae Chi Lúa: Oryza Loài Lúa trồng: Oryza sativa Loài phụ:  Subsp: japonica: Loài phụ Nhật Bản  Subsp: indica: Loài phụ Ấn Độ  Subsp: javanica: Loài phụ Java 2.1.2. Hạt lúa [3] Là noãn sào thụ tinh đã chín, có hai mày trấu nhỏ trên và dƣới, hai vỏ trấu trên và dƣới, cuống trấu ở phần dƣới của hạt và đuôi ở chót hạt (ngắn hoặc dài). Một hạt lúa có trọng lƣợng từ 12 – 44 mg ở 0% ẩm độ. Cơ cấu hạt lúa là quả dĩnh nhỏ gồm có (hình 2.1): Vỏ trấu: gồm trấu trên và trấu dƣới. Cám gồm biểu bì, quả bì và chủng bì (nucellus). Màu sắc hạt gạo do lớp chủng bì. Phôi nhũ gồm có lớp aleurone và phôi nhũ tích tụ tinh bột. Mầm cây gồm có phôi (mầm) lá, phôi rễ và trụ phôi giữa ở phần dƣới của hạt. Hình 2.1. Hạt lúa [77] 2.1.3. Chất lƣợng hạt gạo Theo Juliano (1985) [37], chất lƣợng gạo ăn đƣợc đánh giá theo 4 nhóm chỉ tiêu Hình thức bên ngoài của hạt gạo: dạng hạt, màu sắc, độ trong, độ bóng. Chất lƣợng xay xát: tỉ lệ gạo trắng, gạo nguyên, tỉ lệ tấm. Chất lƣợng cơm: hàm lƣợng amylose, nhiệt độ hóa hồ, độ bền thể gel, độ nở cơm. Chất lƣợng dinh dƣỡng: hàm lƣợng protein, hàm lƣợng lipid, đƣờng. 2.1.3.1. Hình thức bên ngoài của hạt gạo Hình thức bên ngoài của hạt gạo là tiêu chuẩn quan trọng đối với ngƣời tiêu dùng. Do đó, kích thƣớc và dạng hạt là tiêu chí đầu tiên về chất lƣợng hạt gạo mà ngƣời trồng lúa quan tâm để phát triển giống lúa mới (Adair và ctv, 1966) [11]. Sở thích về kích thƣớc và dạng hạt khác nhau tùy theo nhóm ngƣời tiêu dùng. Gạo có dạng hạt dài hầu hết đƣợc ƣa chuộng ở tiểu lục địa India, nhƣng ở vùng Đông Nam Á, ngƣời dân lại thích loại gạo có chiều dài trung bình. Ở vùng ôn đới, những giống gạo hạt ngắn phổ biến hơn. Nhìn chung ở thị trƣờng quốc tế, giống gạo hạt dài đƣợc ƣa thích nhất [57]. Tỉ lệ dài rộng trong khoảng 2,5 đến 3,0 và chiều dài hạt gạo khoảng 6 mm đƣợc chấp nhận rộng rãi trên thị trƣờng quốc tế (Kaul, 1970) [38]. Các giống gạo khác nhau có thể đƣợc xếp vào những nhóm khác nhau dựa trên 2 đặc điểm: chiều dài và dạng hạt. Hình dạng của hạt gạo đƣợc xác định dựa trên tỉ lệ giữa chiều dài và bề ngang hạt gạo [57]. Có rất nhiều cách khác nhau để phân loại hình dạng và kích thƣớc hạt gạo. Bảng 2.1 và 2.2 là một trong những cách phân loại thƣờng đƣợc sử dụng. Bảng 2.1. Phân loại kích thƣớc hạt gạo Thƣớc chia độ Phân loại kích thƣớc Chiều dài hạt gạo (mm) 1 Rất dài ≥ 7,5 3 Dài Từ 6,61 đến 7,5 5 Trung bình Từ 5,51 đến 6,6 7 Ngắn ≤ 5,5 (Nguồn Cruz và Khush, 2000) [57] Bảng 2.2. Phân loại hình dạng hạt gạo Thƣớc chia độ Phân loại hình dạng Tỉ lệ chiều dài/chiều rộng 1 Hạt dài > 3 5 Hạt trung bình Từ 2,1 đến 3 9 Hạt ngắn ≤ 2 (Nguồn Cruz và Khush, 2000) [57] Hình 2.2. Phân loại kích thƣớc hạt gạo Hình 2.3. Phân loại hình dạng hạt gạo Hình thức bên ngoài còn đƣợc đánh giá bởi độ bạc bụng của hạt gạo. Một vài loại gạo thƣờng hay bị nứt ở vị trí “mắt” hay chỗ lõm của phôi khi xay xát. Những mẫu gạo này thƣờng có giá trị thấp trên thị trƣờng. Tƣơng tự, độ bạc bụng càng cao thì giá trị kinh tế càng thấp. Ngƣời tiêu dùng ƣa thích loại gạo có phần nội nhũ trong mờ, và sẵn sàng chi số tiền cao hơn để mua chúng, mặc dù vết bạc bụng sẽ mất đi sau khi nấu và hiện tƣợng bạc bụng này không ảnh hƣởng đến chất lƣợng cơm gạo [57]. Tuy nhiên độ bạc bụng làm giảm chất lƣợng xay xát và hình thức bên ngoài của hạt gạo [2]. Trong những vùng bị bạc bụng, số lƣợng hạt tinh bột ít hơn so với những vùng khác. Vì vậy, vùng bị bạc bụng sẽ không cứng bằng và những hạt bị bạc bụng sẽ dễ bị nứt hơn khi xay xát so với những hạt không bị bạc bụng [57]. Hạt gạo có xu hƣớng bị gãy tại điểm có vết đục, làm giảm tỉ lệ gạo nguyên, giảm giá trị thƣơng phẩm của lúa gạo. So với các hạt tinh bột ở phần trắng trong, các phần tinh bột ở phần bạc trắng đƣợc xếp đặt thƣa thớt và lỏng lẻo hơn và có những khoảng trống chứa không khí nên độ cứng thấp và dòn dễ gãy khi xay xát [2]. Del Rosario và ctv (1965) [27] cũng cho rằng những hạt bac bụng bị gãy vỡ nhiều là do cấu trúc không đồng nhất của các hạt tinh bột. Tỉ lệ bạc bụng đƣợc đánh giá dựa trên bảng 2.3. Bảng 2.3. Phân loại diện tích bạc bụng Thƣớc chia độ Diện tích bị bạc bụng (%) 0 0 1 ≤ 10 5 Từ 10 đến 20 9 ≥ 20 (Nguồn Cruz và Khush, 2000) [57] 2.1.3.2. Chất lƣợng xay xát Đối với chất lƣợng xay xát thì tỉ lệ gạo nguyên là chỉ tiêu quan trọng nhất. Theo Bhattacharya (1980) [15], hình dạng và kích thƣớc hạt có ảnh hƣởng đến chất lƣợng xay xát. Hạt gạo càng mảnh, dài và tỉ lệ bạc bụng càng cao thì tỉ lệ hạt nguyên càng thấp [2, 71]. Tỉ lệ gạo nguyên có quan hệ chặt chẽ đến độ cứng và độ bạc bụng của hạt. Cho đến nay di truyền về độ cứng của hạt vẫn chƣa đƣợc làm rõ (Chang và Somrith, 1979) [24]. Theo Khush và ctv (1979) [39], tỉ lệ gạo nguyên là tính trạng đƣợc kiểm soát bởi đa gen và chịu sự tác động lớn của các điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là nhiệt độ và độ ẩm của môi trƣờng trƣớc và sau thu hoạch. Cấu trúc và hƣớng sắp xếp các tế bào nội nhũ đã tạo ra những đƣờng chia tách ngang trong hạt (Srinivas và ctv, 1978) [59]. Những hạt đã khô nếu đột ngột hút ẩm cũng có thể tạo ra các vết rạn dọc trong hạt và tạo nên mảnh vỡ nhỏ khi xay xát (Bhattacharya, 1980) [15]. Khi bị ẩm trở lại, hạt càng khô bị vỡ càng nhiều. Tỉ lệ gạo nguyên thay đổi nhiều tùy theo bản chất giống và phụ thuộc nhiều vào điều kiện ngoại cảnh nhƣ nhiệt độ, độ ẩm khi lúa chín và điều kiện bảo quản phơi sấy sau thu hoạch (Lê Doãn Diên, 1990) [2]. Huysmans (1965) [35] cho rằng sự rạn nứt hạt thƣờng do nắng nóng, sự thay đổi nhanh của độ ẩm không khí, những bất thuận về môi trƣờng trong quá trình chín của hạt và thu hoạch trễ trong vụ nắng làm hạt có độ ẩm thấp. Tỉ lệ gạo nguyên cũng phụ thuộc vào hàm lƣợng protein trong hạt (Lê Doãn Diên, 1990) [2]. Các giống có hàm lƣợng protein dƣới 6% có tỉ lệ gạo vỡ rất lớn và ngƣợc lại (CFTRI, 1985) [23]. 2.1.3.3. Hàm lƣợng protein Có sự biến động lớn về thành phần protein giữa các giống lúa. Hàm lƣợng protein của tổng số 17.587 giống trong bộ sƣu tập của viện lúa IRRI với hàm lƣợng từ 4,3% đến 18,2%, bình quân là 9,5% (trích bởi Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [8]. Theo Gomez và De Datta (1975) [31], có sự tác động rất lớn của môi trƣờng đến sự hình thành và tích lũy protein của lúa gạo. Hàm lƣợng protein của gạo có xu hƣớng thấp khi bức xạ ánh sáng mạnh xảy ra ở giai đoạn phát triển của hạt. Vì vậy, trong điều kiện nhiệt đới, hàm lƣợng protein trong hạt thƣờng thấp trong mùa khô và cao hơn trong mùa mƣa. Nhiệt độ trong thời gian chín cũng ảnh hƣởng đến hàm lƣợng protein trong hạt nhƣng thay đổi tùy theo nhóm giống. Kỹ thuật canh tác cũng có những ảnh hƣởng lớn đến hàm lƣợng protein của gạo. Hàm lƣợng protein cao khi trồng thƣa hơn và có đầy đủ đạm cho cây lúa. Khi cung cấp thêm đạm, thƣờng làm tăng hàm lƣợng protein trong hạt và tăng hàm lƣợng protein cao nhất khi bón đạm ở giai đoạn trổ bông (De Datta và ctv, 1972) [26] . Hàm lƣợng protein hạt tăng lên khi có sự kiểm soát nƣớc hợp lý và làm cỏ kịp thời, có lẽ do hiệu quả sử dụng đạm cao hơn khi trong điều kiện kiểm soát đƣợc nƣớc tƣới và cỏ dại (trích bởi Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [8]. Krupp và ctv (1972) [41] cho biết năng suất và hàm lƣợng protein giảm khi sự khủng hoảng độ ẩm đất tăng, cho nên làm giảm sự hút đạm của rễ lúa. Hàm lƣợng protein bị ảnh hƣởng do thời điểm gặt lúa khác nhau, hàm lƣợng protein thấp khi gặt sớm và tăng lên tới đỉnh cao tại thời điểm 30 ngày sau khi trổ. Nhiều tác giả cho rằng có sự tƣơng quan nghịch giữa hàm lƣợng protein và năng suất hạt (Ericksson, 1968) [29]. Đối với hầu hết các giống lúa, nếu năng suất hạt tăng cao thì hàm lƣợng protein có xu thế giảm. Tuy vậy sự tƣơng quan này còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố môi trƣờng bên cạnh yếu tố di truyền. 2.2. LÚA THƠM ĐẶC SẢN VIỆT NAM Là một quốc gia nông nghiệp, với cái nôi là nền văn minh lúa nƣớc, lúa gạo Việt Nam từ ngàn xƣa đã có những loại nổi tiếng nhƣ Tám Thơm, Tám Xoan, Dự Hƣơng, Nàng Thơm Chợ Đào... Những chủng loại đó hiện nay vẫn đƣợc sự ƣa chuộng của thị trƣờng trong nƣớc và đã chiếm lĩnh đƣợc một phần thị trƣờng thế giới. Bên cạnh đó, cũng có nhiều giống lúa thơm đƣợc du nhập vào Việt Nam nhƣ Basmati 370, Basmati mutant (Ấn Độ), Khao Dawk Mali (Thái Lan), Jasmine 85 (Mỹ)…góp phần làm đa dạng thị trƣờng lúa gạo Việt Nam (Trần Văn Đạt, 2002) [3]. Các giống lúa thơm địa phƣơng có những đặc điểm chung là thời gian sinh trƣởng dài, phản ứng chặt với ánh sáng ngày ngắn, chỉ cấy đƣợc một vụ trong năm, mức thâm canh trung bình hoặc thấp, dễ nhiễm một số loại sâu bệnh và dễ đổ ngã. Các giống này có tính thích nghi cao trong những điều kiện nhất định, đặc biệt là điều kiện khó khăn: hạn, úng, mặn, phèn. Nhóm giống đặc sản có đặc tính quí là có phẩm chất tốt, gạo trắng, hạt thon dài, cơm dẻo, ngọt, thơm. Nhiều giống lúa mùa có tỉ lệ gạo trắng, cũng nhƣ tỉ lệ gạo nguyên cao hơn các giống lúa cao sản [8]. Mùi thơm của các giống lúa thơm thƣờng tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng nhƣ đất đai, khí hậu [3]. Hiện nay hầu hết các giống đã bị lẫn tạp nhiều, chất lƣợng cơm gạo, đặc biệt là độ thơm dẻo và năng suất bị giảm. Thƣơng hiệu gạo đặc sản của nƣớc ta trên thị trƣờng quốc tế chƣa có. Lâu nay, ngƣời dân sản xuất lúa thơm chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, vì chƣa có những qui trình kỹ thuật sản xuất lúa thơm đặc sản chính thức đƣợc phổ biến đến ngƣời nông dân [8]. 2.3. GIỚI THIỆU VỀ CÂY LÚA NÀNG THƠM CHỢ ĐÀO 2.3.1. Nguồn gốc [4] Xuất xứ lâu đời tại xã Mỹ Lệ, huyện Cần Đƣớc, tỉnh Long An. Giống đƣợc trồng ở một số nơi của tỉnh Long An, Tiền Giang và TP. Hồ Chí Minh. Tuy vậy, hƣơng vị sẽ bị giảm nếu đem trồng ở nơi khác xuất xứ của giống. 2.3.2. Đặc điểm nông học [4, 8] Chu kỳ sinh trƣởng: 170 – 185 ngày, thuộc nhóm mùa muộn, phản ứng chặt với chu kỳ ánh sáng. Chiều cao cây: 160 – 180 cm. Đẻ nhánh khá: 8 – 13 bông/khóm. Số hạt chắc/bông: 105 – 135. Trọng lƣợng 1000 hạt: 22 – 23 g. Năng suất bình quân: 3,0 – 4,0 tấn/ha. 2.3.3. Phẩm chất  Về dạng hạt [4, 8] Nàng Thơm Chợ Đào có 3 dạng chính: dạng đuôi cong (54,4%), dạng hạt thẳng (36,3%), và dạng trung gian (9,3%). Hạt gạo dài 6,7 - 7,0 mm; rộng 2,0 – 2,1 mm. Theo một số nhận xét của nông dân địa phƣơng, dạng hạt đuôi cong có ƣu thế về phẩm chất (mùi thơm), nhƣng dạng hạt thẳng có ƣu thế hơn về mặt năng suất. Ngay trên cùng một bông lúa, các hạt đuôi cong thƣờng tập trung ở nhiều ở hạt đầu gié bông, các hạt có dạng thẳng thƣờng tập trung ở giữa và cuối gié.  Về phẩm chất gạo [4, 8] Hầu hết nông dân và hàng xáo kinh doanh lúa gạo trong vùng (96,6%) đều cho rằng lúa Nàng Thơm Chợ Đào trồng tại Cần Đƣớc, đặc biệt chính gốc xã Mỹ Lệ, Cần Đƣớc, Long An có mùi thơm, độ dẻo và màu trắng tốt nhất. Cơm thơm bền, dẻo, kể cả sau khi nguội 12 giờ. Độ hóa hồ cấp 3 – 4. Kết quả điều tra cho thấy những năm có điều kiện thời tiết bất thuận, đặc biệt cuối vụ có đợt mƣa nhiều, độ thơm của cơm, gạo giảm mạnh, tính thơm còn bị ảnh hƣởng bởi điều kiện địa hình ruộng cao - thấp khác nhau, lúa thơm hơn ở những chân ruộng cao và giảm dần ở chân ruộng thấp.  Tỉ lệ gạo nguyên Tỉ lệ gạo nguyên là chỉ tiêu đƣợc các thƣơng gia đặc biệt chú ý vì nó không chỉ có ảnh hƣởng đến giá thành của gạo thành phẩm, mà còn phản ánh chất lƣợng của gạo xay chà. Theo Đỗ Khắc Thịnh (2003) [8], tỉ lệ gạo nguyên của gạo Nàng Thơm Chợ Đào biến động từ 41 – 53%. Trong cùng điều kiện thí nghiệm, các dòng chọn lọc có tỉ lệ gạo nguyên khác nhau, chủ yếu do tác động bởi yếu tố di truyền, hoặc do tƣơng tác giữa yếu tố di truyền và ngoại cảnh. Giống Nàng Thơm Chợ Đào có dạng thon dài và tỉ lệ đục giữa khá cao, vì vậy tỉ lệ gạo nguyên thuộc loại trung bình khá (45 – 50 %). Với tỉ lệ này, Nàng Thơm Chợ Đào cũng không thuộc loại ngoại lệ so với các nhận xét của các tác giả về sự tƣơng quan giữa dạng hạt và tỉ lệ gạo nguyên của cây lúa.  Tỉ lệ chiều dài/rộng của hạt [8] Gạo Nàng Thơm Chợ Đào thuộc nhóm thon dài, tỉ lệ này biến động từ 3,40 đến 3,94. Về mặt dạng hạt, giống Nàng Thơm Chợ Đào rất thích hợp cho thị trƣờng Đông Nam Á.  Độ đục hạt gạo Nàng Thơm Chợ Đào là loại gạo có đặc điểm: hạt gạo trong, một số hạt có vết đục giữa thân hạt gạo [4]. Theo Đỗ Khắc Thịnh (2003) [8], tỉ lệ bạc bụng biến động từ 0 đến 17%, dòng cho tỉ lệ bạc bụng cao nhất đạt 17%. Hiện tại chƣa có những nghiên cứu di truyền về đặc tính đục giữa của hạt gạo. Về độ bạc bụng, những yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình tổng hợp tích lũy chất khô ở hạt trong giai đoạn hạt vào chắc, làm mẩy cũng có ảnh hƣởng đến độ chặt, độ nén của các hạt tinh bột và sẽ gây ra bạc bụng ở gạo (Bangwaek và ctv, 1994) [13]. Với cùng một điều kiện môi trƣờng, nhƣng có sự khác nhau giữa các dòng chọn lọc về độ bạc bụng đáng kể thể hiện tác động của yếu tố di truyền hay hiệu quả của chọn lọc đối với độ bạc bụng của hạt [8]. Tập quán ngƣời dân Nam Bộ rất ƣa chuộng gạo Nàng Thơm, Nàng Hƣơng, Tài Nguyên có vết đục giữa. Ngƣời ta cho rằng loại gạo này cho cơm thơm hơn, mềm và xốp cơm hơn so với loại gạo hạt trong (Đỗ Khắc Thịnh, 2001) [7]. 2.3.4. Mùa vụ và chân đất phù hợp [4, 8] Trồng trong vụ mùa, thích hợp ở chân ruộng vàn hoặc thấp, rút nƣớc muộn trong tháng 12. Tính thơm bị ảnh hƣởng bởi điều kiện thời tiết. Những năm có điều kiện thời tiết bất thuận, đặc biệt cuối vụ có đợt mƣa nhiều, độ thơm của cơm, gạo giảm mạnh. Tính thơm còn bị ảnh hƣởng bởi điều kiện địa hình ruộng cao – thấp khác nhau. Lúa thơm hơn ở những chân ruộng cao, và giảm dần ở chân ruộng thấp. Nàng Thơm Chợ Đào đƣợc trồng chủ yếu ở các huyện ven biển thuộc phía Nam tỉnh Long An, tập trung tại Cần Đƣớc, Tân Trụ, Thủ Thừa. Hai huyện Cần Đƣớc và Tân Trụ nơi trồng nhiều lúa thơm trên các loại đất bị nhiễm phèn với tỉ lệ 40,4% và nhiễm mặn là 28,1%, nhiễm cả phèn và mặn là 14%. Về mặt địa hình, Cần Đƣớc và Tân Trụ có đất ruộng tƣơng đối bằng phẳng (63,1%), một số ruộng nghiêng (21,6%), có rất ít ruộng trũng và gò. Theo đánh giá của một số hộ điều tra tại Cần Đƣớc, đất đồng cao và đồng thấp cũng có sự khác nhau về mùi thơm của cơm gạo. Qua đánh giá thực tế, ruộng cao và thấp không chỉ khác nhau về địa hình mà còn khác nhau về lý hóa tính của đất đặc biệt về pH, hàm lƣợng Al3+, Fe 2+ , Fe 3+ . 2.4. NGHIÊN CỨU VỀ HÓA SINH CHẤT THƠM CỦA LÚA GẠO 2.4.1. Những hợp chất bay hơi có trong gạo thơm Nghiên cứu đầu tiên về gạo thơm đã đƣợc thực hiện bởi Yajima và ctv (1979) [72]. Họ đã xác định đƣợc 114 thành phần có trong gạo thơm, trong đó có 21 acid, 14 ester của các acid béo, 15 alcohol, 18 aldehyde, 17 ketone, 18 hydrocarbon và một vài hợp chất vòng khác nhƣ pyridine và furan. Khi so sánh gạo thông thƣờng với gạo thơm, Yajima đã rút ra kết luận: trong gạo thông thƣờng hàm lƣợng 4 – vinylphenol, 1 – hexanol và 1 – hexanal cao hơn so với gạo thơm, nhƣng lại có hàm lƣợng indole ít hơn. Hơn nữa, gạo thơm còn có 1 thành phần chƣa xác định đƣợc và α – pyrrolidone là những chất không đƣợc tìm thấy trong gạo thông thƣờng [72]. Những hợp chất bay hơi trong gạo đƣợc xác định bằng cách thu thập những chất bay hơi, phân tách bằng sắc ký và sau đó xác định những thành phần này bằng sắc ký khối phổ (GC/MS) [57]. Tsuzuki và ctv (1981) [66] và Buttery và ctv (1983b) [19] đã phân tích những thành phần bay hơi có trong cơm nấu từ gạo thơm. Kết quả là họ đã nhận biết đƣợc 114 chất (phụ lục 1). Tuy nhiên, theo đánh giá, không có thành phần bay hơi riêng lẻ nào đặc trƣng cho gạo thơm chƣa chế biến [16]. Năm 1988, Buttery và ctv [21] đã xác định đƣợc những thành phần chính tạo nên mùi thơm của gạo thơm hạt dài California là 2 – acetyl – 1 – pyrroline; (E,E) – deca – 2,4 – dienal; nonanal; hexanal; (E) –– non – 2 – enal; octanal; decanal; 4 – vinyl – guaiacol và 4 – vinylphenol. Buttery và ctv (1983a) [18] đã phân tích 2 – acetyl – 1 – pyrroline ở điều kiện áp suất hơi nƣớc đối với những giống gạo khác nhau. Thí nghiệm này chỉ thực hiện trên gạo đã chế biến chứ không thí nghiệm trên gạo thô, vì thế, Tsugita (1985 - 1986) [65] đã tỏ ý hoài nghi rằng có thể chất này đƣợc hình thành trong quá trình nấu nƣớng. Suvarnalatha và ctv (1994) [60] đã nuôi cấy mô sẹo giống lúa Basmati và so sánh những thành phần bay hơi từ những cây lúa đó với những thành phần bay hơi trong những cây lúa Basmati thông thƣờng và rút ra kết luận rằng những chất này là tƣơng tự nhau. Tuy nhiên, họ đã không tìm thấy 2 – AP trong mô sẹo hay trong cơm gạo. Có thể là do phƣơng pháp sử dụng chƣa đủ nhạy. Tiến hành so sánh những chất bay hơi có trong gạo thông thƣờng và gạo thơm, Widjaja và ctv (1996) [68] đã đã xác định đƣợc 70 chất và mô tả mùi thơm hầu hết những chất đó. Những chất bay hơi chính trong gạo thơm là các alkanal; alk – 2 – enal; alka(E) – 2,4 – dienal; 2 – pentylfuran; 2 – acetyl – 1 – pyrroline và 2 – phenylethanol. Những giống gạo thông thƣờng chứa nhiều n-hexanal, (E) – 2 – heptanal, 1 – octen – 3 – ol, n – nonanal, (E) – 2 – octenal, (E) – 2 - (E) – 4 – decadienal, 2 – pentylfuran, 4 – vinylguaiacol và 4 – vinylphenol hơn so với gạo thơm. Kim (1991) [40] đã xác định trong gạo thơm có 16 loại hydrocarbon, 15 alcohol. Lorieux và ctv (1996) [42] đã phân tích mẫu gạo của 2 giống lúa Azucena (thơm) và IR64 (không thơm), phân tích định lƣợng của 15 hợp chất chính liên quan đến 2 giống trên. Kết quả không tìm thấy chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong giống IR64. Xử lý thống kê cho thấy các chất sau có sự khác biệt giữa giống lúa thơm và không thơm: pentanol; 2 – acetyl – 1 – pyrroline; benzaldehyde; octanol; pentadecan – 2 – one; 6,10,14 – trimethylpentadecan – 2 – one và hexanol. Khi so sánh nồng độ các cấu tử bay hơi thu đƣợc trong quá trình chiết xuất gạo thơm, Petrov và ctv (1996) [46] đã xác định đƣợc 9 thành phần có sự khác biệt rõ rệt về nồng độ giữa loại gạo thơm và gạo thông thƣờng: pentanol; hexanol; 2 – acetyl – 1 – pyrroline; (E) – hept – 2 – enal; benzaldehyde; octanal; pentadecan – 2 – one; 6,10,14 – trimethylpentadecan – 2 – one và hexadecanol. Trong số 9 hợp chất trên, pentadecan – 2 – one thể hiện mối tƣơng quan nghịch với những hợp chất khác, và là thành phần đặc trƣng trong giống gạo thông thƣờng (IR64) còn 6 hợp chất góp phần tạo mùi thơm trong gạo thơm: hexanal, octanal, nonanal, (E) – non – 2 – enal, (E,E) – deca – 2,4 – dienal và 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Theo Paule C. M. và Powers J. J. (1989) [45], hàm lƣợng hexanol tƣơng quan nghịch với chất lƣợng mùi thơm trong gạo, trong khi đó, 2 – acetyl – 1 – pyrroline lại tƣơng quan thuận. Kết quả nghiên cứu này một lần nữa chứng minh kết luận của Buttery và ctv (1983a) [18] rằng 2 – acetyl – 1 – pyrroline là thành phần chính chịu trách nhiệm cho mùi thơm đặc trƣng trong gạo thơm là đúng đắn. Theo Widjaja và ctv (1996) [68], thành phần chính trong tất cả các loại gạo là hexanal. Khác biệt cơ bản giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng là gạo thông thƣờng chứa hàm lƣợng hexanal, heptanal; 6 – methyl – 5 – hepten – 2 – one; (E) – 2 – heptenal; 1 – octen – 3 – ol; nonanal; (E) – 2 – octenal và (E) – 2, (E) – 4 – decadienal nhiều hơn so với gạo thơm. Các thành phần hóa sinh góp phần tạo phát triển mùi thơm, nhƣng khả năng hình thành mùi thơm của cây còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền, môi trƣờng, dinh dƣỡng và điều kiện lƣu trữ (Simon và ctv, 1980; Paillard, 1981) [54, 44]. Do đó, sự khác biệt giữa mùi thơm trong gạo thơm và gạo thông thƣờng không thể chỉ dựa trên các thành phần hóa sinh (nhƣ acid béo, amino acid, đƣờng hay sắc tố) của mỗi giống [46]. Hiện nay có 2 quan điểm về thành phần chất thơm của lúa gạo. Quan điểm thứ nhất cho rằng chất thơm đƣợc tạo ra từ các hợp chất aldehyde (CHO) và keton (C=O) và các hợp chất với lƣu huỳnh (Ayano và Tsuzuki, 1976) [12]. Quan điểm thứ 2 cho rằng chất thơm lúa gạo, do vòng pyrrol kiểm soát tính thơm của chất 2-acetyl-1- pyrrolinr (Buttery và ctv, 1983a) [18]. 2.4.2. Hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline Hình 2.4. Cấu trúc hóa học của 2 – AP 2 – acetyl – 1 – pyrroline, một hợp chất thơm có mùi tƣơng tự nhƣ mùi bắp nổ, đƣợc đánh giá là một thành phần chất thơm quan trọng trong các giống gạo thơm do đặc tính giữ mùi lâu hơn so với các thành phần bay hơi khác trong gạo [18, 21]. Buttery và ctv (1983a) [18] đã chiết xuất 2 – AP và những hợp chất bay hơi khác từ gạo bằng cách sử dụng hệ thống Likens – Nickerson (SDE). Sản phẩm thu đƣợc đƣợc phân tích bằng GC/MS. Sau đó, họ đã định lƣợng 2 – AP bằng máy sắc ký khí với đầu dò FID [20]. Hình 2.5. Phổ đồ hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline (A: Tanchotikul and Hsieh, 1991; B: Varaporn và Sarath, 1993) [63, 67] Năm 1983, Buttery và ctv [18] đã nghiên cứu 7 giống lúa thơm. Trong số các thành phần xác định bằng phƣơng pháp sắc ký khí, hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline đã tìm thấy và có mùi tƣơng tự nhƣ mùi thơm của cơm. Ngƣỡng mùi thơm của chất này trong nƣớc là 0,1μg.L-1 và mùi thơm tích lũy tƣơng tự nhƣ loại bắp nổ (pop corn). Theo Buttery và ctv (1982, 1983a) [17, 18], 2 – acetyl – 1 – pyrroline là thành phần chính trong hỗn hợp các chất thơm có trong gạo thơm, góp phần cấu thành nên hƣơng thơm của gạo. Do đó, có thể cho rằng thành phần chính dùng để nhận biết sự khác biệt về mùi giữa gạo thông thƣờng và gạo thơm là 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Buttery và ctv (1983a) [18] nhận thấy rằng, các giống gạo thơm chứa 0,04 – 0,09 ppm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong khi các giống gạo thông thƣờng chứa lƣợng thấp hơn khoảng 10 lần (< 0,006 đến < 0,008 ppm). Họ đã công bố những chất thơm này chỉ đƣợc tìm thấy trong quá trình nấu nƣớng mà không đƣơc phát hiện trong gạo thô. Nhƣng theo Yoshihashi (2002) [74], hợp chất thơm 2 – AP không phải đƣợc hình thành trong quá trình nấu nƣớng hay do điều kiện bảo quản sau thu hoạch mà chúng đƣợc hình thành từ phần khí sinh của cây trong suốt thời gian gieo trồng. Năm 2003, Wornpongchai và ctv [69] đã tìm thấy 2 – AP trong gạo thô và các bộ phận khác của cây bằng phƣơng pháp chiết xuất không sử dụng nhiệt. Họ cho rằng, 2 – AP chính là một hợp chất thứ cấp hiện diện trong cây lúa đặc sản. Hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline đƣợc xác định là thành phần chính trong tinh dầu lá dứa. Theo Buttery và ctv (1983a) [18], trong lá dứa chứa khoảng 1 ppm 2 – acetyl – 1 – pyrroline, hàm lƣợng này cao gấp 100 lần so với những loại gạo thông thƣờng. Vì thế, ở một vài nƣớc châu Á, ngƣời dân thƣờng cho lá dứa vào trong quá trình nấu cơm đối với những loại gạo thông thƣờng để có đƣợc mùi thơm nhƣ gạo thơm [67]. Thí nghiệm phân tích của Trung tâm Nghiên cứu vùng của Bộ nông nghiệp Hoa Kỳ và IRRI (1982) (trích dẫn bởi Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [8] cũng cho kết quả về hàm lƣợng chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline của 8 giống lúa thơm và 2 giống lúa không thơm. Hàm lƣợng chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline của Khao Dawk Mali 105 và Basmati 370 là 0,07 và 0,06 ppm theo thứ tự, giống đối chứng Calrose là 0,006 ppm. Hussain và ctv (1987) [34] thực hiện so sánh mùi thơm giữa lúa thơm (Basmati) và lúa không thơm. Xác định hợp chất thơm dựa trên các peak pentadecan-2-one, hexanol, 2-pentylfurane với nồng độ cao ở lúa Basmati. Chất 2-acetyl-1-pyrroline không tìm thấy. Tuy vậy, hầu hết các nghiên cứu thực hiện sau năm 1983 (Buttery và ctv, 1983b, 1986, 1988; Paule và Powers, 1989; Lin và ctv, 1990; Tanchotikul và Hsieh, 1991) đã chứng tỏ tầm quan trọng của thành phần 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Hàm lƣợng của hợp chất này trong gạo dao động từ 6 – 90 µg/kg tùy theo chất lƣợng mùi thơm trong gạo thơm (Buttery và ctv 1983b) [19]. AcPy không chỉ đóng vai trò quan trọng trong gạo thơm mà còn đƣợc xem là thành phần chính trong vỏ và ruột bánh mì (Schieberle và Grosch, 1991 và 1991a), bắp nổ (Schieberle, 1991a), hạt kê (Seitz và ctv, 1993), bánh ngô (Karahadian và Johnson, 1993), lá dứa (Buttery và ctv, 1983a; Laksanalamai và Ilangantileke, 1993), mật cây đoan (Blank và ctv, 1989) và bia Đức (Schieberle, 1991b) (trích dẫn bởi Petrov, 1996) [46]. AcPy còn là thành phần chính đƣợc tổng hợp từ một vài dòng Bacillus cereus phân lập đƣợc từ việc lên men quả ca cao (Romanczyk và ctv, 1995) [50]. Theo Buttery và ctv (1983a) [18], 2 – acetyl – 1 – pyrroline có cùng nguồn gốc với 2 – acetyl – 1,4,5,6 – tetrahydropyridine là 1 thành phần chất thơm đã đƣợc Hunter và ctv (1969) tìm thấy trong bánh mì hay bánh nƣớng. Proline hay hydroxyproline cũng là tiền thân của 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Khi thay thế nhóm –COOH của hydroxyproline thành nhóm methyl keton bằng cách khử nƣớc và chuyển nối đôi sang vị trí số 1 sẽ tạo ra đƣợc 2 – AP. Còn theo Petrov và ctv (1996) [46], 2 – acetyl – 1 – pyrroline có nguồn gốc từ proline và ornithine. Sản phẩm của quá trình phân hủy Strecker là proline và 1- pyrroline (Yoshikawa và ctv, 1965) [76] sẽ phản ứng với những sản phẩm của quá trình phân hủy đƣờng tạo ra AcPy (Schieberle, 1989, 1990; Tressl và ctv, 1985) [52, 53, 64]. Mũi của ngƣời có thể phát hiện đƣợc chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline ở nồng độ 0,007ppm. Do đó, đánh giá bằng cảm quan, trong điều kiện nhất định và với những ngƣời có khứu giác bình thƣờng, kết quả có thể tin cậy đƣợc [8]. Theo Varaporn và Sarath (1993) [67], nồng độ 2 – AP trong gạo sẽ giảm đối với những gạo đƣợc lƣu trữ trong thời gian dài. 2.5. CÁC YẾU TỐ MÔI TRƢỜNG VÀ ĐIỀU KIỆN GIEO TRỒNG ẢNH HƢỞNG ĐẾN CHẤT LƢỢNG MÙI THƠM 2.5.1. Nhiệt độ Theo Sarkarung và ctv (2000) [51], thời tiết mát mẻ ở giai đoạn hạt chín sẽ làm tăng mùi thơm của lúa gạo. Nhiệt độ 200C – 270C trong giai đoạn trổ bông, chín sữa, chín sáp sẽ góp phần hình thành và tăng tính thơm của cơm gạo. Tuy vậy, nhiệt độ tối thích đối với các giống lúa không giống nhau. Cây lúa Basmati nếu đƣợc gieo trồng trong điều kiện nhiệt độ thấp (nhiệt độ ban ngày là 250C và ban đêm là 210C trong thời kỳ chín) sẽ có khả năng lƣu giữ mùi thơm lâu hơn (Juliano, 1972; Mann, 1987) [36, 43]. 2.5.2. Nơi gieo trồng Địa điểm gieo trồng ảnh hƣởng đến chất lƣợng mùi thơm của cơm gạo thông qua thành phần dinh dƣỡng đất cung cấp cho cây và tƣơng tác giữa các chất dinh dƣỡng bay hơi trong đất với các hợp chất thơm bay hơi có trong gạo. Theo Singh và ctv (1998) [56], có thể xảy ra sự khác biệt đáng kể về mùi thơm trong gạo đƣợc trồng trên 2 thửa ruộng kề nhau thậm chí ngay cả khi 2 ruộng trồng cùng một loại hạt giống. Theo ý kiến của ngƣời nông dân, gạo đƣợc trồng trên đất nhẹ và chân ruộng cao thuận lợi cho quá trình hình thành mùi thơm của lúa. Lúa có mùi thơm hơn khi trồng trên chân đất pha sét, có bờ bao và đƣợc cung cấp nƣớc đầy đủ (Singh và ctv, 1997) [55]. Tuy nhiên, gạo sẽ thơm hơn nếu độ ẩm của đất gieo trồng giảm trong thời kỳ hạt chín (theo Sarkarung và ctv, 2000) [51]. Yoshihashi và ctv (2004) [75] cho rằng hàm lƣợng 2 – acetyl – 1 – pyrroline không chỉ bị ảnh hƣởng bởi yếu tố di truyền mà còn chịu tác động của các điều kiện ngoại cảnh: điều kiện sinh thái, cách gieo trồng. Do các điều kiện sinh thái nhƣ nƣớc tƣới, chất dinh dƣỡng trong đất ở các vùng khác nhau thì khác nhau nên hàm lƣợng 2 – AP trong gạo thơm giữa các vùng sẽ có sự khác biệt. Hàm lƣợng 2 – AP ở những vùng chủ động tƣới tiêu thấp hơn so với vùng lúa nƣớc trời. 2.5.3. Phân bón Phân đạm Việc bón phân đạm sẽ tạo ảnh hƣởng bất lợi đối với chất lƣợng mùi thơm. Lƣợng phân đạm trong đất thấp sẽ gia tăng hàm lƣợng chất thơm trong hạt gạo (Suwanarit và ctv, 1996) [61]. Bón phân thúc làm tăng hàm lƣợng protein, nhƣng lại giảm mùi vị của cơm gạo. Bón phân đạm ở giai đoạn phân hóa đòng có thể không tạo nên sự thay đổi hàm lƣợng protein, nhƣng vẫn làm giảm mùi vị của cơm (Singh, 1997) [55]. Phân kali Phân kali có ảnh hƣởng tích cực đến chất lƣợng xay xát và hƣơng vị của cơm gạo. Nếu bón nhiều kali sẽ làm tăng mùi thơm và góp phần làm gạo sáng hơn, nhƣng độ mềm cơm giảm (Suwanrit và ctv, 1997b) [62]. Nguyên tố đa lƣợng S Việc bổ sung lƣu huỳnh vào đất thiếu lƣu huỳnh sẽ góp phần tăng chất lƣợng mùi thơm của cơm gạo. Tuy nhiên, nếu lạm dụng quá mức sẽ gây tác dụng ngƣợc đến mùi vị của cơm gạo (Singh và ctv, 2000) [57]. 2.5.4. Tập quán gieo trồng Các tập quán gieo trồng nhƣ phƣơng pháp chuẩn bị đất, cách gieo trồng, thời gian cấy và thời vụ thu hoạch có ảnh hƣởng lớn đến chất lƣợng và hàm lƣợng chất thơm của gạo thơm (Canellas và ctv, 1997) [22]. Theo Singh và ctv (1998) [56], gạo sẽ cho chất lƣợng mùi thơm cao hơn khi xạ thẳng. Bên cạnh đó, thời vụ thu hoạch cũng ảnh hƣởng đến tính thơm của gạo. Nếu thu hoạch muộn sẽ làm giảm mùi vị của cơm gạo. Nguyên nhân của ảnh hƣởng này là do hiện tƣợng thoái hóa hoặc thay đổi các thành phần trong hạt dƣới tác động của nhiệt độ, độ ẩm, côn trùng và vi sinh vật gây hại (Rahim và ctv, 1995) [48]. 2.5.5. Cách bảo quản và xay xát Ở hầu hết các quốc gia, gạo thƣờng đƣợc bảo quản và vận chuyển ở dạng chƣa xay xát. Theo Daniels và ctv (1997) [25], bảo quản gạo trong điều kiện ẩm ƣớt trƣớc khi đem phơi khô sẽ ảnh hƣởng xấu đến đặc tính và mùi vị của cơm gạo. Mặc dù chƣa có phƣơng pháp cụ thể nào để đánh giá ảnh hƣởng của việc xay xát đối với tính thơm của gạo đặc sản, nhƣng chắc chắn rằng việc xay xát có ảnh hƣởng mạnh mẽ đối với hàm lƣợng chất thơm. Theo các nông dân ở Tapovan (VP), chà xát gạo theo phƣơng pháp thủ công sẽ lƣu giữ đƣợc mùi thơm và chất lƣợng hạt gạo hơn so với việc sử dụng máy xay xát (Singh và ctv, 2000) [57]. Năm 2004, Wongpornchai và ctv [70] đã công bố cách xử lý sau thu hoạch tốt nhất là sấy hoặc phơi ở nhiệt độ 300C – 400C. Hơn nữa, thời gian lƣu trữ ngắn sẽ đảm bảo chất lƣợng mùi thơm tốt hơn so với bảo quản trong thời gian dài. Bảng 2.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến việc hình thành và lƣu giữ mùi thơm trong gạo thơm (nguồn Singh và ctv, 2000) [57] Các yêu tố góp phần gia tăng chất lƣợng mùi thơm Các yếu tố làm suy giảm chất lƣợng mùi thơm Thời tiết mát mẻ trong thời kỳ ra hoa và hạt chín Bón phân với liều lƣợng thích hợp Đất màu mỡ Gieo hạt trực tiếp Đất nhẹ, chân ruộng cao Nhiệt độ tăng cao trong thời kỳ ra hoa và hạt chín Phân bón chứa lƣợng urê quá cao Đất nghèo dinh dƣỡng Trồng lúa theo hình thức gieo xạ Đất nặng Độ ẩm trong đất thấp trong giai đoạn hạt chín Xay xát thủ công Thu hoạch muộn Sử dụng máy móc trong giai đoạn xay xát lúa 2.6. PHƢƠNG PHÁP VI CHIẾT XUẤT TRÊN PHA RẮN (SPME) 2.6.1. Nguyên tắc [33] SPME là 1 phƣơng pháp chiết xuất không cần sử dụng dung môi, đƣợc phát minh bởi Pawliszyn và cộng sự từ năm 1989. Phƣơng pháp này dựa trên cơ chế hấp phụ các chất hữu cơ cần phân tích từ pha nƣớc hoặc pha khí lên sợi silica đƣợc phủ các chất hấp phụ thích hợp nhƣ polydimethylsiloxan (PDMS), PDMS/DVB (divinyl benzen), polyacrylat…thông qua tác động phân chia giữa những chất đƣợc hấp phụ và hỗn hợp mẫu. Quá trình hấp phụ diễn ra khi nhúng sợi chiết vào mẫu lỏng hay khi phơi sợi chiết ra môi trƣờng phía trên mẫu lỏng hay rắn. Các hợp chất bám trên sợi silica sẽ đƣợc giải hấp phụ trực tiếp vào buồng hóa hơi của thiết bị sắc ký khí. 2.6.2. Đặc điểm [33] Kỹ thuật này kết hợp các giai đoạn chuẩn bị mẫu, chiết xuất, cô cạn mẫu thành 1 bƣớc đơn giản, không cần sử dụng dung môi. Các chất cần phân tích sẽ đƣợc chiết xuất và làm giàu trực tiếp vào sợi chiết. Phƣơng pháp này giúp tiết kiệm thời gian chuẩn bị mẫu và lƣợng dung môi sử dụng, và có thể cải thiện đƣợc giới hạn dò. Thuận lợi chính của phƣơng pháp là khả năng phân tích tốt, đơn giản, giá thành thấp. Sản phẩm thu đƣợc từ phƣơng pháp SPME tƣơng đối sạch và cô đặc, khả năng ứng dụng MS cao. Kỹ thuật SPME thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp với GC và GC/MS. Kỹ thuật này đã đƣợc áp dụng thành công trong việc phân tích nhiều thành phần khác nhau, đặc biệt, trong quá trình chiết xuất những thành phần hữu cơ bay hơi có trong những mẫu phân tích môi trƣờng, sinh học, thực phẩm, dƣợc phẩm. Sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME có thể đƣợc đƣa trực tiếp vào hệ thống HPLC và LC/MS để phân tích những thành phần bay hơi kém hay không bền nhiệt không thể thực hiện trên thiết bị GC hay GC/MS. Thời gian chiết xuất phụ thuộc vào các yếu tố: loại sợi chiết sử dụng, kích thƣớc mẫu, bề dày lớp polymer. Sử dụng sợi chiết có lớp polymer càng dày thì thời gian chiết xuất càng dài, nhƣng hệ số lặp lại càng cao. Thời gian chiết xuất không phụ thuộc nồng độ chất cần phân tích có trong mẫu. Thông thƣờng, lớp film có bề dày mỏng nhất ở mức độ có thể chấp nhận đƣợc thƣờng đƣợc sử dụng để giảm thời gian chiết xuất. 2.6.3. Dụng cụ sử dụng cho kỹ thuật SPME [33] Hình 2.6. Cấu tạo sợi chiết dùng trong kỹ thuật SPME Sợi chiết đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SPME là một đoạn sợi quang học có chứa silica biến tính, ngắn và mỏng (dài khoảng 1 cm, đƣờng kính ngoài cỡ 0,11 mm), đƣợc bao phủ bên ngoài bởi một lớp polyme mỏng (ví dụ polydimethylsiloxane) (hình 2.6). Sợi chiết này khá ổn định cả ở nhiệt độ cao và có cấu tạo hóa học tƣơng nhƣ phía bên trong của cột mao quản silica biến tính sử dụng trong phƣơng pháp sắc ký khí. Sợi chiết đƣợc gắn với một cần kim loại, tất cả đƣợc đặt trong ống kim loại bảo vệ. Để thuận tiện khi sử dụng, toàn bộ hệ sợi chiết và các bộ phận phụ trợ đƣợc bố trí theo kiểu xyranh (hình 2.7). Hình 2.7. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME Nhiều loại pha tĩnh tẩm cho sợi chiết đƣợc nghiên cứu với mục đích chiết các nhóm chất khác nhau. Giống nhƣ qui tắc khi lựa chọn cột sắc ký khí “các chất giống nhau dễ hòa tan trong nhau”, pha tĩnh tẩm sợi chiết cũng đƣợc lựa chọn trên cơ sở độ chọn lọc đối với các chất cần phân tích đã định và khả năng bay hơi của những chất này. Các pha tĩnh không phân cực (ví dụ: polymethylsiloxan) lƣu giữ hydrocacbon rất tốt. Ngƣợc lại, pha tĩnh phân cực (nhƣ polyacrylat và cacbowax) lại chiết đƣợc các hợp chất phân cực nhƣ phenol, acid cacboxylic rất hiệu quả. Ái lực của pha tĩnh đối với chất cần phân tích có tính chất quyết định trong việc lấy mẫu theo SPME vì cả nền mẫu và pha tĩnh đều cạnh tranh trong tƣơng tác với chất phân tích. Ví dụ, một pha tĩnh đƣợc lựa chọn để chiết các chất phân cực ra khỏi nƣớc phải có ái lực với chất phân tích mạnh hơn ái lực của nƣớc với chất đó thì mới có thể thực hiện đƣợc quá trình chiết theo yêu cầu. 2.6.4. Các bƣớc thực hiện trong kỹ thuật vi chiết xuất trên pha rắn [33] Kỹ thuật chiết SPME gồm 2 giai đoạn: (1) phân bố chất phân tích giữa mẫu và pha tĩnh của sợi chiết, (2) chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp từ pha tĩnh của sợi chiết và chuyển vào thiết bị phân tích. Hình 2.8. Các kỹ thuật chiết dùng trong phƣơng pháp SPME Để thực hiện quá trình chiết, mẫu nƣớc chứa chất hữu cơ hoặc mẫu rắn chứa chất hữu cơ dễ bay hơi cần phân tích đƣợc đặt trong lọ, đóng kín bằng nút có septum. Khi lấy mẫu, ống kim loại bảo vệ chứa sợi chiết SPME đâm xuyên qua septum, sau đó pittông sẽ đẩy sợi chiết lộ ra khỏi ống kim loại bảo vệ. Sợi chiết đƣợc nhúng vào mẫu lỏng hoặc nằm trong không gian hơi phía trên pha mẫu (headspace) (hình 2.8). Chất phân tích đƣợc chiết từ mẫu vào pha tĩnh của sợi chiết. Sau thời gian hấp phụ, sợi chiết đƣợc kéo vào trong lòng ống bảo vệ, rồi rút ra khỏi lọ đựng mẫu. Sau đó ống bảo vệ chứa sợi chiết đƣợc đƣa vào bộ phận bơm mẫu của sắc ký khí hoặc sắc ký lỏng cao áp, pittông lại đẩy sợi chiết ra khỏi ống bảo vệ. Lúc này, sợi chiết tiếp xúc với môi trƣờng nhiệt độ cao trong bộ phận bơm mẫu của GC, các chất phân tích đã làm giàu đƣợc giải hấp nhiệt và chuyển vào cột sắc ký khí. Trong HPLC, dung môi đƣợc sử dụng để giải hấp chất phân tích khỏi sợi chiết. Sau các quá trình giải hấp này, sợi chiết lại đƣợc kéo vào lòng ống bảo vệ và rút ra khỏi bộ phận bơm mẫu. 2.6.5. Ứng dụng phƣơng pháp SPME trong chiết xuất hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline [32] Grimm và ctv (2001) đã ứng dụng kỹ thuật SPME để khảo sát qui trình phân tích hàm lƣợng 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo thơm. Theo họ, lƣợng 2 – AP thu đƣợc sẽ tăng gấp đôi khi tăng nhiệt độ từ 60oC lên 85oC. Ngƣợc lại, hàm lƣợng chất chuẩn 2,4,6 – trimethylpyridine sẽ giảm khi nhiệt độ tăng. Không có sự khác biệt đáng kể về hàm lƣợng 2 – AP khi chiết xuất mẫu ở 80°C và 85°C, do đó, 80°C đƣợc xem là điểm nhiệt độ thích hợp cho quá trình chiết suất. Khoảng thời gian từ 10 – 15 phút đủ để thu nhận hầu hết các chất bay hơi, trong khi những thành phần ít bay hơi hơn nhƣ acid hữu cơ hay ester phải tốn hàng giờ mới có thể thu nhận đƣợc. Sau khi so sánh lƣợng 2 – AP thu đƣơc sau khoảng thời gian hấp phụ là 10, 15, 20 phút, họ đã rút ra kết luận thời gian chiết xuất mẫu phù hợp nhất là 15 phút. Kết quả nghiên cứu cho thấy, việc thêm nƣớc vào mẫu gạo sẽ giúp tăng hàm lƣợng 2 – AP thu nhận đƣợc, đồng thời giảm đƣợc yêu cầu phải nghiền mẫu, góp phần đơn giản hóa quá trình chuẩn bị mẫu. Lƣợng nƣớc cất tối ƣu sử dụng cho quá trình chiết suất là 200 µl. Để xác định lƣợng 2 – AP hấp thu, diện tích peak đƣợc chuyển thành khối lƣợng bằng cách dựng đƣờng chuẩn dựa trên chuẩn 2 – AP pha loãng trong CHCl3. Theo kết quả nghiên cứu của Casey và ctv (2001), hàm lƣợng 2 – AP trung bình thu đƣợc trong mẫu gạo Jasmine khi phân tích bằng phƣơng pháp SPME là 2,2 ng trong 0,75 g gạo, tƣơng đƣơng với 2,9 ppb. Phƣơng pháp SPME phù hợp cho việc so sánh mối tƣơng quan về nồng độ 2 – AP giữa các mẫu gạo khác nhau. Nhìn chung, trong tất cả các trƣờng hợp, phƣơng pháp SPME có thể phân biệt giữa gạo thơm và gạo thông thƣờng. Cấu tử 2 – AP đƣợc phân tách ở 5 phút 42 giây, và chỉ chiếm 1 lƣợng nhỏ trong tổng số các chất bay hơi, nhƣng lƣợng này đủ để chiếm ƣu thế trong thành phần chất thơm có trong cơm gạo. 2.7. SẮC KÝ KHÍ (Gas Chromatography - GC) [10] 2.7.1. Nguyên tắc Nguyên tắc của sắc ký khí là mỗi cấu phần trong gạo thơm sẽ bị hấp thụ trên pha tĩnh của cột phân tích khác nhau nên có thời gian lƣu khác nhau. Trên cơ sở khác nhau về thời gian lƣu này mà ngƣời ta có thể định tính và định lƣợng cấu tử cần nghiên cứu. 2.7.2. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí Hình 2.9. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí detector ion hóa ngọn lửa FID Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc ký khí là hệ thống cột tách và detector. Nhờ có khí mang, mẫu từ buồng bay hơi đƣợc dẫn vào cột tách nằm trong buồng điều nhiệt. Quá trình sắc ký xảy ra tại đây. Sau khi rời khỏi cột tách tại các thời điểm khác nhau, các cấu tử lần lƣợt đi vào detector, tại đó chúng đƣợc chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu này đƣợc khuếch đại rồi chuyển sang bộ ghi, tích phân kế hoặc máy vi tính. Các tín hiệu đƣợc xử lý ở đó rồi chuyển sang bộ phận in và lƣu kết quả . Trên sắc đồ nhận đƣợc, sẽ có các tín hiệu ứng với các cấu tử đƣợc tách gọi là peak. Thời gian lƣu của peak là đại lƣợng đặc trƣng (định tính) cho chất cần tách. Còn diện tích của peak là thƣớc đo định lƣợng cho từng chất trong hỗn hợp cần nghiên cứu. 2.7.2.1. Detector Hình 2.10. Sơ đồ cấu tạo hình học của detector ion hóa ngọn lửa Detector có nhiệm vụ chuyển hóa một đại lƣợng không điện (trong trƣờng hợp này là nồng độ của các chất đƣợc tách khỏi cột sắc ký) thành đại lƣợng điện. Ngày nay, đã có gần 30 loại detector khác nhau. Trong đó, 3 loại detector phổ biến nhất là: detector dẫn nhiệt (TCD), detector ion hóa ngọn lửa (FID) và detector cộng kết điện tử (ECD). Detector FID (hình 2.10) là một trong những detector có độ nhạy cao. Nguyên tắc làm việc của nó dựa trên sự biến đổi độ dẫn điện của ngọn lửa hydro đặt trong một điện trƣờng khi có chất hữu cơ cần tách chuyển qua. Nhờ nhiệt độ cao của ngọn lửa hydro, các chất hữu cơ từ cột tách đi vào detector bị bẻ gãy mạch, bị ion hóa nhờ có oxy của không khí để tạo thành các ion trái dấu tƣơng ứng. Các ion tạo thành đƣợc chuyển về các bản điện cực trái dấu nằm ở hai phía của ngọn lửa. Dòng ion đó đƣợc giảm áp trên một điện trở có trị số rất cao (108 – 1012 Ω) và độ giảm hiệu điện thế này đƣợc khuếch đại và ghi lại trên máy tự ghi. Số lƣợng ion tạo thành (chính là độ nhạy của detector) phụ thuộc vào các yếu tố sau: Cấu trúc hình học của detector Tỉ lệ thành phần hydro/không khí Nhiệt độ của ngọn lửa Cấu trúc của các phân tử mẫu cần xác định Các hợp chất hữu cơ đƣợc đốt cháy bằng ngọn lửa hydro – không khí tạo thành các ion. Khí mang từ cột sẽ đƣợc trộn trƣớc với hydro và đốt cháy bằng ngọn lửa ở buồng đốt. Một điện cực hình trụ đƣợc đặt cách vài milimet phía trên ngọn lửa để thu thập các ion sinh ra. Dòng ion này sẽ đƣợc đo bằng cách đặt một hiệu điện thế giữa đầu phun của ngọn lửa và điện cực hình trụ. Để hạn chế đến mức tối đa sự tái kết hợp của các ion, phải đặt điện thế chọn lọc vào vùng bão hòa (vùng mà khi tăng điện thế sẽ không làm tăng dòng ion). Các tín hiệu tạo thành sẽ đƣợc khuếch đại bằng bộ khuếch điện tử rồi qua bộ xử lý và ghi tín hiệu. Detector FID sử dụng thích hợp nhất đối với các hợp chất chứa cacbon. 2.7.2.2. Cột mao quản Sắc ký khí mao quản là một hình thái đặc biệt của phƣơng pháp sắc ký khí, đƣợc đặc trƣng bởi năng suất tách và hiệu suất phân giải rất cao. Sở dĩ nhƣ vậy là nhờ việc sử dụng các cột mao quản hở với chiều dài khá lớn (25m, 50m, 100m,...). Cột mao quản (hình 2.11) là loại cột tách với đƣờng kính nhỏ hơn 1mm và thành trong của cột đƣợc tẩm pha tĩnh. Nhờ cấu trúc đặc biệt này của cột mao quản, khí mang sẽ đƣa mẫu đi qua cột tách rất dài (do vậy năng suất rất cao) mà không gặp trở kháng gì lớn (về độ chênh lệch áp suất), các cấu tử sẽ tƣơng tác với pha tĩnh bám trên thành cột và đƣợc pha tĩnh lƣu giữ lại với mức độ khác nhau,… Hình 2.11. Cột mao quản 2.8. SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS) [10] Sắc ký khối phổ là một loại sắc ký đặc biệt, vì sau khi ra khỏi cột sắc ký, các cấu phần đƣợc lần lƣợt cho vào buồng MS để thực hiện việc ghi phổ của từng cấu phần. Nhờ một phần mềm, các phổ MS này đƣợc so sánh với các phổ MS chuẩn chứa trong thƣ viện của máy tính. Do đó để tăng độ chính xác cho sự dò tìm và so sánh, thƣ viện phổ khối lƣợng cần phải có nhiều phổ chuẩn. Độ tƣơng hợp giữa phổ MS của các cấu phần và phổ mẫu có tính tƣơng đối tùy thuộc phần mềm phụ trách việc so sánh, thƣờng thì độ tƣơng hợp càng lớn thì xác suất định danh càng cao. Kinh nghiệm về thành phần hóa học và kiến thức về phổ khối lƣợng có tính quyết định rất lớn đến độ chính xác của kết quả định danh. Đầu dò phổ khối lƣợng có độ nhạy cao, khoảng 10-6 – 10-9 g, do đó có thể xác định đƣợc những cấu phần có hàm lƣợng thấp mà các phƣơng pháp khác không thể thực hiện đƣợc. Sắc ký khối phổ có khả năng định danh cao, khả năng dò tìm nhanh, lƣợng mẫu sử dụng ít. 2.9. PHƢƠNG PHÁP KJELDAHL [5] Nguyên tắc Trƣớc tiên mẫu đƣợc vô cơ hóa bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra nhƣ sau: 2H2SO4 = 2H2O + 2SO2↑ + O2 Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hóa các nguyên tố khác. Các phân tử chứa nitơ dƣới tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. Ví dụ các protein bị thủy phân thành acid amin, carbon và hidro của acid amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitơ đƣợc giải phóng dƣới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dƣ tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch 2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4 Các nguyên tố P, K, Ca, Mg…chuyển thành dạng oxid: P2O5, K2O, CaO, MgO… Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH: (NH4)2SO4 + 2NaOH = NaSO4 + H2O + 2NH3 NH3 bay ra cùng với nƣớc sang bình hứng, bình hứng chứa H3BO3 2NH4OH + 4H3BO3 = (NH4)2B4O7 + 7H2O Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH  Thời gian: từ 4/2006 – 8/2006.  Địa điểm lấy mẫu: Bảng 3.1. Bảng thống kê số lƣợng mẫu lấy tại các địa điểm Địa Điểm Loại mẫu Số Lƣợng Mẫu Các chợ bán sỉ và lẻ trên địa bàn TP. HCM Mẫu gạo 12 Các siêu thị trên địa bàn TP. HCM Mẫu gạo 5 Viện khoa học nông nghiệp miền Nam (IAS) Mẫu lúa 31 Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long Mẫu lúa 15 Siêu thị Carrefour (Pháp) Mẫu gạo 3 Tổng cộng 66  Địa điểm tiến hành thí nghiệm: trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ  Vật liệu: gạo và lúa Nàng Thơm Chợ Đào.  Hóa chất sử dụng: Hóa chất dùng trong phân tích hàm lƣợng chất thơm: ethanol (Merck), acetone (Merck), methanol (Merck), 2,4,6-collidine (2,4,6-trimethyl pyridine) (Sigma). Hóa chất dùng trong phân tích protein: K2SO4, CuSO4, H2SO4 đđ, H3BO3 4%, chỉ thị màu, parafin, NaOH 32%, HCl 0,25N (Trung Quốc).  Dụng cụ và thiết bị: Tủ mát, Darling (Việt Nam). Tủ lạnh, Hitachi (Japan). Máy bóc vỏ trấu, khoa Cơ Khí Công Nghệ trƣờng đại học Nông Lâm. Cân điện tử BP 210S – Sartorius AG Gottingen (Đức). Máy sắc ký khí HP 6890 N (G1540N) – Agilent Technologies (Mỹ). Máy sắc ký khối phổ HP 6890 N (G1530N) – Agilent Technologies (Mỹ). Kim SPME (SupelcoTM SPME fiber holder) – Bellefonte, PA (Mỹ). Máy nhiệt từ, Ikamag (Đức). Máy Scan, Epson Perfection 1260. Bồn siêu âm Power sonic 510 – Hwashin Technology Co. (Hàn Quốc). Tủ sấy, Memmert (Đức). Hệ thống phân tích đạm tự động, Gerhardt (Đức). Kìm đóng nắp, Mỹ. Micropippet loại 10 – 100 μl, đầu típ 100 μl, cá từ, nắp nhôm. Lọ bi 10ml, Agilent (Mỹ). Bình tam giác 250 ml (Trung Quốc). 3.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU  Khảo sát đặc điểm hóa lý của gạo Nàng Thơm Chợ Đào.  Phân tích hàm lƣợng protein có trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào.  Xác định nồng độ chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo NTCĐ. 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các mẫu gạo và mẫu lúa sau khi thu thập về đƣợc trữ trong tủ mát 6oC cho đến khi tiến hành phân tích. Mẫu lúa đƣợc bóc vỏ trấu để dùng cho phân tích các thành phần chất thơm và đƣợc chà xát để xác định các đặc điểm hóa lý và hóa sinh. 3.4.1. Khảo sát đặc điểm hóa lý của gạo Nàng Thơm Chợ Đào (theo Singh và ctv, 2000) [57] 3.4.1.1. Hình dạng hạt gạo Chọn ngẫu nhiên 10 hạt gạo còn nguyên vẹn, đo kích thƣớc hạt gạo bằng phần mềm SigmaScan Pro5. Dựa trên kích thƣớc hạt gạo, xác định tỉ lệ dài/rộng của hạt gạo. Chọn ngẫu nhiên một lƣợng lớn hạt gạo (hạt còn nguyên và hạt bị gãy vỡ), đo kích thƣớc hạt gạo bằng phần mềm SigmaScan Pro5. Dựa trên kích thƣớc hạt gạo, xác định tỉ lệ gạo nguyên. 3.4.1.2. Xác định tỉ lệ bạc bụng Chọn ngẫu nhiên 25 hạt gạo còn nguyên vẹn, đo diện tích bạc bụng bằng phần mềm SigmaScan Pro5. Quá trình khảo sát các đặc điểm hóa lý đƣợc thực hiện 3 lần ở mỗi mẫu gạo. 3.4.2. Phân tích hàm lƣợng protein tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl Hình 3.1 Hệ thống phân tích đạm tự động Mẫu gạo Loại bỏ tạp, cho mẫu vào các túi giấy và sấy khô mẫu ở 80°C cho đến khi trọng lƣợng không đổi Vô cơ hóa mẫu: cân 0,5 g mẫu cho vào ống vô cơ hóa mẫu Thêm vào 5 g hỗn hợp xúc tác K2SO4 và CuSO4 (10:1) Dùng pipet hút 15 ml H2SO4 đậm đặc (d = 1,84) cho vào ống vô cơ hóa mẫu + 5 giọt parafin Lắp các ống vô cơ hóa mẫu có chứa mẫu, xúc tác và H2SO4 vào bộ đốt và chạy theo qui trình vô cơ hóa mẫu sau: - Bƣớc 1: 30°C  80°C trong 15 phút - Bƣớc 2: 80°C  120°C trong 10 phút - Bƣớc 3: 120°C  250°C trong 10 phút - Bƣớc 4: 250°C  400°C trong 2 giờ Thời gian làm mát: 15 phút Tắt bộ đốt mẫu và tiến hành chƣng cất mẫu: lắp ống vô cơ hóa mẫu vào bô chƣng cất, và lắp bình hứng chứa 20 ml H3BO3 4% + 1 giọt hỗn hợp chỉ thị thị màu. Khởi động máy cất, bổ sung thêm 50 ml nƣớc cất 2 lần và 80 ml NaOH 32%, khi NH3 đã đƣợc cất hoàn toàn, hạ bình hứng xuống, dùng tia nƣớc cất nhỏ tráng sạch acid dính đầu ống làm lạnh ... Sơ đồ 3.1. Qui trình phân tích hàm lƣợng protein trong gạo Trong đó: VHCl: thể tích HCl dùng để chuẩn độ (ml) Pmẫu: khối lƣợng mẫu dùng trong phân tích (g)  Thí nghiệm đƣợc lặp lại 2 lần. Hình 3.1. Hệ thống phân tích đạm tự động 3.4.3. Chiết xuất hợp chất bay hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [49, 47] Qui trình thực hiện Sơ đồ 3.2. Qui trình phân tích hợp chất bay Hình 3.2. Hệ thống máy nhiệt từ hơi trong gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME Thuyết minh qui trình Cân 1,5 ± 0,1g gạo (hoặc lúa đã bóc vỏ trấu) cho vào lọ bi 10 ml, thêm 200 μl nƣớc khử ion và cá từ vào lọ, đậy nắp. Cho vào bộ giữ nhiệt của máy khuấy từ đã đƣợc thiết lập ở nhiệt độ 80 0C, 250 vòng/phút trong 5 phút. Đây là giai đoạn ủ để các chất bay hơi trong gạo và phần không khí có trong lọ đạt đƣợc pha cân bằng trƣớc khi tiến hành chiết xuất. Sau 5 phút, nhúng sợi chiết vào lọ bi. Đây chính là giai đoạn chiết xuất các chất bay hơi có trong gạo. Giai đoạn hấp phụ này kéo dài trong 15 phút ở 800C. Trong giai đoạn này các chất bay hơi trong gạo sẽ đƣợc hấp phụ vào sợi chiết. Sau khi kết thúc giai đoạn chiết xuất, bơm mẫu vào máy GC để bắt đầu giai đoạn phân tích các cấu tử bay hơi có trong gạo. Hình 3.3. Dụng cụ thực hiện kỹ thuật SPME (DVB/CAR/PDMS) Cân 1,5 g gạo Ủ ở 800C trong 5 phút Nhúng sợi chiết vào lọ bi trong 15 phút ở 800C Bơm mẫu vào máy GC 3.4.4. Định tính và định lƣợng hợp chất thơm 2 – AP trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào bằng GC và GC/MS 2 – acetyl – 1 – pyrroline đƣợc định danh bằng hệ thống máy GC/MS và định lƣợng trên GC. Chƣơng trình nhiệt và các thông số thực nghiệm đƣợc điều chỉnh trên GC, các thông số này đƣợc tối ƣu hóa và áp dụng trên GC/MS. 3.4.4.1. Trên sắc ký khí (GC)  Inlet: bơm mẫu ở chế độ không chia dòng  Cột Model No: Agilent 19091J – 113 HP-5 5% Phenyl Methyl Siloxane, 30m x 320 μm x 0,5 μm Tốc độ dòng: 1,9ml/phút  Nhiệt độ lò: 40oC  Detector FID: 2500C Dòng H2: 30ml/phút Dòng không khí: 300ml/phút Dòng N2: 30ml/phút  Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ ban đầu 400C giữ trong 5 phút, tăng 30C/1 phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 300C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây. 3.4.4.2. Trên sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS)  Inlet: bơm mẫu ở chế độ không chia dòng  Cột Agilent 19091J – 413 HP-5, 0,25 mm x 30 m x 0,25 m.  Nhiệt độ lò: 40oC  Đầu dò MS: 250oC  Chƣơng trình nhiệt: nhiệt độ ban Hình 3.3 Máy sắc ký khí ghép khối ph Hình 3.5 s c í é i phổ Hình 3.4. Máy sắc ký khí đầu 400C giữ trong 5 phút, tăng 30C/1 phút cho đến khi đạt 1150C, tăng 300C/1 phút cho đến khi đạt 2200C, giữ ở 2200C trong 5 phút. Thời gian tổng cộng: 38 phút 30 giây. 3.4.5. Xác định hệ số phản hồi (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [49, 47] 3.4.5.1. Xác định hệ số phản hồi theo chất ngoại chuẩn collidine Do hợp chất 2 – AP rất khó tổng hợp, lại không bền nên không đƣợc sản xuất và bán trên thị trƣờng. Nếu muốn sử dụng hợp chất 2 – AP để dựng đƣờng chuẩn thì phải tự tổng hợp. Do điều kiện phòng thí nghiệm chƣa đủ để tổng hợp tại chỗ hợp chất 2 – AP nên chúng tôi đã sử dụng collidine nhƣ một chất ngoại chuẩn thay thế. Chuẩn bị 7 dung dịch collidine có nồng độ 0,01 mg/ml. Bơm lần lƣợt 1,2 μl mỗi dung dịch vào máy GC theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm (mục 3.4.4.1). Xác định hệ số phản hồi (RF) theo công thức: 3.4.5.2. Xác định hệ số phản hồi theo nồng độ hợp chất thơm 2 – AP trong gạo thơm Giano Để gia tăng độ tin cậy của hệ số phản hồi, chúng tôi tiến hành chiết xuất mẫu gạo thơm Giano theo qui trình phân tích gạo thơm (mục 3.4.3). Dựa trên diện tích peak thu đƣợc khi phân tách bằng GC, chúng tôi xác định hệ số phản hồi theo công thức: 3.4.6. Xác định nồng độ hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline trong gạo Nàng Thơm Chợ Đào Từ kết quả thu nhận khi phân tích sản phẩm chiết xuất trên GC, xác định hàm lƣợng 2 – AP thu đƣợc khi chiết xuất bằng phƣơng pháp SPME theo công thức (Buttery và ctv, 1986) [18]: Diện tích peak (pA*s) [2-AP] SPME (μg/kg) = Khối lƣợng gạo (kg) * hệ số phản hồi (pA*s/ μg) Diện tích peak collidine (pA*s) RF theo collidine (pA*s/μg) = [dd collidine] (μg/μl) * thể tích bơm (μl) Diện tích peak 2 – AP (pA*s) RF theo [2 – AP] (pA*s/μg) = [2 – AP] (μg/kg)Giano * Khối lƣợng gạo (kg) Xác định nồng độ 2 – AP có trong gạo theo công thức đề xuất của Bergman (2000) [21]: [2-AP] trong gạo (μg/kg) = [2-AP] SPME x 0,003 3.4.7. Phƣơng pháp xử lý thống kê Các số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphic 7.0 và Excel. Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. HÌNH THỨC BÊN NGOÀI CỦA HẠT GẠO 4.1.1. Hình dạng và kích thƣớc hạt gạo Bảng 4.1. Kết quả thống kê so sánh các chỉ tiêu hình dạng và kích thƣớc hạt gạo của mẫu chợ và mẫu IAS CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ MẪU Chợ IAS 10 hạt nguyên Chiều dài trung bình (mm) 6,24 * 6,10 * Chiều rộng trung bình (mm) 1,89 1,87 Tỉ lệ dài/rộng 3,31 3,27 Mẫu Chiều dài tối đa (mm) 7,13 * 6,77 * Chiều rộng tối đa (mm) 2,52 2,56 Chiều dài tối thiểu (mm) 2,38 * 1,80 * Chiều rộng tối thiểu (mm) 1,41 1,37 Chiều dài trung bình (mm) 5,55 * 4,83 * Chiều rộng trung bình (mm) 1,89 1,93 (Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất sai lầm P = 0,05) 6.10 6.24 6.77 7.13 1.80 2.38 4.83 5.55 0 1 2 3 4 5 6 7 8 IAS Chợ ch iều d ài (m m ) chiều dài trung bình 10 hạt chiều dài tối đa chiều dài tối thiểu chiều dài trung bình toàn mẫu Biểu đồ 4.1. Chiều dài hạt của mẫu gạo thu thập từ chợ và từ ruộng  Nhận xét: Kết quả nghiên cứu cho thấy chiều dài trung bình của các mẫu gạo thu thập từ chợ và siêu thị là 6,24 mm, tỉ lệ dài/rộng đạt 3,31 (bảng 4.1). Mẫu có chiều dài và tỉ lệ dài/rộng cao nhất là M2 (hình 4.1) (6,53 mm; 3,48) (phụ lục 4). Với chiều dài 6,24 mm và tỉ lệ dài/rộng 3,31, mẫu thu thập ở chợ đƣợc xếp vào loại gạo có chiều dài trung bình, thuộc nhóm gạo có dạng mảnh (theo Singh và ctv, 2000) [57]. Các mẫu gạo Nàng Thơm Chợ Đào thu thập từ ruộng đều thuộc nhóm thon dài, chiều dài hạt biến động từ 5,99 đến 6,18 mm, tỉ lệ dài/rộng dao động trong khoảng 3,18 – 3,37 (bảng 4.1). Mẫu có chiều dài hạt và tỉ lệ dài/rộng cao nhất là IASM20B (hình 4.2) (6,20 mm; 3,37, tƣơng ứng) (phụ lục 4). Bảng kết quả 4.1 cho thấy có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) giữa chiều dài của mẫu gạo thu thập từ chợ và từ ruộng. Chiều dài của các mẫu gạo thu thập từ các chợ và siêu thị lớn hơn so với mẫu gạo Nàng Thơm Chợ Đào thu thập từ ruộng. Do đó có thể nhận định các mẫu gạo thu thập từ chợ không phải thực sự là gạo Nàng Thơm Chợ Đào. Có thể có sự pha trộn theo tỉ lệ nhất định hoặc hoàn toàn không chứa giống gạo Nàng Thơm Chợ Đào. Mặt khác theo bảng 4.1, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) đối với các chỉ tiêu về chiều rộng hạt là do các giống gạo Việt Nam và phần lớn các giống gạo ở khu vực Đông Nam Á thuộc nhóm thon dài nên sự khác biệt về chiều rộng hạt gạo giữa các giống lúa không đáng kể. Nhìn chung, chiều dài và tỉ lệ dài/rộng của các mẫu gạo điều tra đều thấp hơn so với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác về kích thƣớc hạt của gạo NTCĐ (6,8 – 7,2 mm) (Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [8]. Với chiều dài hạt khoảng 6 mm và tỉ lệ dài/rộng > 3, các mẫu gạo điều tra đáp ứng đƣợc yêu cầu của thị trƣờng thế giới về hình dạng và kích thƣớc hạt gao (Kaul, 1970) [38]. Hình 4.1. Mẫu gạo M2 Hình 4.2. Mẫu gạo IASM20B 4.1.2. Độ bạc bụng Bảng 4.2. Diện tích bạc bụng của mẫu IAS và chợ Mẫu Diện tích bạc bụng (%) CV (%) Chợ 40 24 IAS 34,91 22 Độ bạc bụng của mẫu gạo chợ 60.00 12.44 10.89 16.67 0 1 5 9 Độ bạc bụng của mẫu gạo IAS 65.09 10.55 11.27 13.09 0 1 5 9 Biểu đồ 4.2. Tỉ lệ bạc bụng của mẫu gạo IAS và chợ  Nhận xét: Theo kết quả nghiên cứu, mẫu gạo thu thập từ chợ và siêu thị có diện tích bạc bụng cao nhất là M11 (60%), thấp nhất là M7 (16%) (hình 4.3 và 4.5) (phụ lục 4). Trong khi đó, diện tích bạc bụng cao nhất và thấp nhất của các mẫu gạo NTCĐ thu thập từ ruộng là IASM8 và IAM12 (48%), và IASM13 (20%), theo thứ tự (hình 4.4 và 4.6) (phụ lục 4). Các số liệu trong bảng 4.2 cho thấy diện tích bạc bụng của các mẫu gạo điều tra là khá lớn so với kết quả nghiên cứu của Đỗ Khắc Thịnh (tỉ lệ bạc bụng biến động từ 0 đến 17%) (Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [82]. Hình 4.3. Mẫu gạo ở chợ có diện tích Hình 4.4. Mẫu gạo ở ruộng có diện bạc bụng cao nhất (M11) tích bạc bụng cao nhất (IASM8) Hình 4.5. Mẫu gạo ở chợ có diện tích Hình 4.6. Mẫu gạo ở ruộng có diện bạc bụng thấp nhất (M7) tích bạc bụng thấp nhất (IASM13) Bảng 4.3. Kết quả thống kê so sánh độ bạc bụng của mẫu gạo từ chợ và ruộng Mẫu Diện tích bạc bụng 0 1 5 9 IAS 65,09 % 10,55 % 11,27 % 13,09 % * Chợ 60,00 % 12,44 % 10,89 % 16, 67 % * (Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất sai lầm P = 0,05)  Đánh giá mức độ bạc bụng theo bảng 2.3.  Nhận xét: Kết quả phân tích thống kê ở bảng 4.3 cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) về tỉ lệ bạc bụng ở 3 mức độ 0, 1 và 5. Tuy nhiên, đối với mức độ bạc bụng cấp 9 lại có sự khác biệt có ý nghĩa. Mẫu gạo NTCĐ thu thập từ ruộng có mức độ bạc bụng cấp 9 thấp hơn so với các mẫu gạo thu thập từ chợ. Mức độ bạc bụng của các mẫu gạo khảo sát chƣa đáp ứng đƣợc yêu cầu về độ bạc bụng gạo xuất khẩu của Thái Lan (gạo trong, cấp < 1,0) (trích bởi Đỗ Khắc Thịnh, 2003) [8]. Với tỉ lệ bạc bụng này, gạo NTCĐ của Việt Nam sẽ khó cạnh tranh thị trƣờng với các giống gạo thơm nổi tiếng của thế giới. Đây chính là một trong những nguyên nhân khiến cho sản lƣợng và giá gạo thơm xuất khẩu của Việt Nam thấp hơn so với các nƣớc khác nhƣ Thái Lan, Mỹ… 4.2. TỈ LỆ GẠO NGUYÊN Bảng 4.4. Kết quả thống kê so sánh tỉ lệ gạo nguyên của các mẫu gạo thu thập từ ruộng và từ chợ CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ MẪU Chợ IAS Phần trăm hạt vỡ/chiều dài trung bình của 10 hạt (%) 16,91* 36,88 * Tỉ lệ gạo nguyên (so với chiều dài trung bình) (%) 83,09 * 63,12 * Phần trăm hạt vỡ/chiều dài tối đa (%) 28,50 * 40,91 * Tỉ lệ gạo nguyên (so với chiều dài tối đa) (%) 71,50 * 59,09 * (Dấu * chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức xác suất sai lầm P = 0,05)  Nhận xét: Các mẫu điều tra thu thập từ chợ và siêu thị có tỉ lệ gạo nguyên tƣơng đối cao (83,09% (khi so với chiều dài trung bình) và 71,50% (khi so với chiều dài tối đa)) (bảng 4.4) so với kết quả nguyên cứu của Đỗ Khắc Thịnh (2002) (41 – 53%) [8]. Trong các mẫu điều tra từ ruộng của nông dân, tỉ lệ gạo nguyên biến động từ 30% đến 83%. Nhóm có tỉ lệ gạo nguyên cao theo thứ tự là IASM4 (hình 4.7) và IASM26 (83,87 và 80,77 %), nhóm thấp dƣới 45% là các mẫu IASM6, IASM23, IASM15 (hình 4.8) (42,86; 37,25 và 30,45 %) (phụ lục 4). Hình 4.7. Mẫu gạo IASM4 Hình 4.8. Mẫu gạo IASM15 Theo bảng kết quả thống kê 4.4, tỉ lệ gạo nguyên giữa các mẫu thu thập từ chợ và các mẫu gạo NTCĐ thu thập từ ruộng có sự khác biệt về mặt thống kê. Sự khác biệt này góp phần củng cố nhận định đã nêu lên ở mục 4.1.1., các mẫu gạo thu thập ở chợ không hoàn toàn là gạo NTCĐ, có sự pha trộn trong các mẫu gạo bán trên thị trƣờng. y = 0.8186x + 12.438 R2 = 0.7706 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Tỉ lệ hạt vỡ/chiều dài trung bình (%) Tỉ lệ h ạt vỡ /ch iề u dà i t ối đ a (% ) Biểu đồ 4.3. Mối tƣơng quan giữa tỉ lệ hạt vỡ/chiều dài trung bình và tỉ lệ hạt vỡ/chiều dài tối đa Biểu đồ 4.3 cho thấy có sự tƣơng quan chặt (R2 = 0,77), sự khác biệt không đáng kể về tỉ lệ gạo nguyên khi so sánh với chiều dài hạt trung bình và chiều dài hạt tối đa. y = -27.629x + 170.31 R 2 = 0.8923 0 10 20 30 40 50 6 7 80 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 chiều dài hạt (mm) tỉ lệ g ạo n gu yê n (% ) Biểu đồ 4.4. Mối tƣơng quan giữa chiều dài hạt gạo và tỉ lệ gạo nguyên Biểu đồ 4.4 cho thấy mối tƣơng quan nghịch giữa chiều dài hạt gạo và tỉ lệ gạo nguyên. Mối tƣơng quan này khá chặt (R2 = 0,8923). Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Yadav và Singh (1989) [71], tỉ lệ gạo nguyên tăng với sự giảm tỉ lệ dài/rộng của hạt. Từ kết quả nghiên cứu thu đƣợc, có thể kết luận: hình dạng và kích thƣớc hạt có ảnh hƣởng rất lớn đến chất lƣợng xay xát; hạt gạo càng mảnh, dài và tỉ lệ bạc bụng càng cao thì tỉ lệ hạt nguyên càng thấp. 4.3. PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG PROTEIN Bảng 4.5. Hàm lƣợng protein trong gạo Mẫu Hàm lƣợng protein (%) M1 6,65 SM12 6,39 SM14 6,99 IASM8 gạo 6,09 IASM8 lúa 6,34 IASM25 gạo 7,38 IASM25 lúa 8,45 VLS13 6,48 VLS22 7,72 Bảng 4.6. Kết quả phân tích thống kê hàm lƣợng protein trong gạo Mẫu Hàm lƣợng protein trung bình (%) CV % Gạo trắng 6,71 8 Gạo chƣa chà 7,55 14 Chợ 6,69 5 IAS và VL 7,27 13 6.71 7.55 6 6.3 6.6 6.9 7.2 7.5 7.8 hà m lư ợn g pr ot ei n (% ) gạo trắng gạo chưa chà 6.69 7.27 6.4 6.6 6.8 7 7.2 7.4 hà m lư ợn g pr ot ei n (% ) mẫu chợ mẫu ruộng Biểu đồ 4.5. So sánh hàm lƣợng protein giữa các mẫu gạo Nàng Thơm Chợ Đào  Nhận xét: Bảng kết quả 4.6 cho thấy không có sự khác biệt về phƣơng diện thống kê học khi so sánh hàm lƣợng protein giữa các mẫu gạo đã chà xát và mẫu gạo chỉ mới bóc vỏ trấu, giữa mẫu gạo thu thập ở chợ và các mẫu gạo NTCĐ chính gốc. Hàm lƣợng protein trung bình trong các mẫu gạo điều tra cao hơn so với kết quả nghiên cứu các dòng lúa NTCĐ triển vọng của TS. Đỗ Khắc Thịnh (6,29%) (2003). Tuy nhiên so với một số giống gạo thơm nổi tiếng thế giới nhƣ KDM 105 (7,32%), Taroari Basmati (Ấn Độ) (8,48%) (Phạm Đình Chƣơng, 2006) [74], thì hàm lƣợng protein trong gạo NTCĐ thuộc loại thấp. 4.4. THIÉT LẬP PHƢƠNG PHÁP SPME – GC 4.4.1. Xác định thời gian lƣu của chất chuẩn collidine Sau khi chiết xuất mẫu collidine 0,001 mg/ml theo qui trình tƣơng tự nhƣ qui trình phân tích các hợp chất bay hơi trong gạo (mục 3.4.3), chúng tôi tiến hành phân tích sản phẩm chiết xuất bằng máy GC theo chƣơng trình nhiệt đã đƣợc thiết lập ở phần 3.4.4.1. Bảng 4.7. Thời gian lƣu, diện tích và chiều cao của chuẩn collidine 0,001 mg/ml Lần chạy Thời gian lƣu (phút) Diện tích (pA*s) Chiều cao (pA) 1 13,811 357,60 36,00 2 13,803 321,89 27,77 3 13,878 316,36 38,89 Trung bình 13,830 331,95 34,22 CV (%) 0,24 5,51 13,77 Hình 4.9. Sắc ký đồ GC phân tích thành phần hóa học của collidine (nồng độ 0,001mg/ml)  Nhận xét: Dựa vào kết quả phân tích, chúng tôi xác định đƣợc thời gian lƣu của collidine là tại thời điểm 13,8 phút (hình 4.7). Thời gian lƣu này khác với kết quả nghiên cứu của các nhà nghiên cứu của viện nghiên cứu CIRAD (phút thứ 21,15) (theo Ringuet J., 2005 và Phan Phƣớc Hiền, 2005) [49, 47]. Nguyên nhân là do các điều kiện phân tích: chiều dài cột, độ tinh sạch của cột, độ tinh khiết của khí mang...giữa 2 phòng thí nghiệm khác nhau. Nhằm xác định độ tin cậy về sự xuất hiện của peak chuẩn collidine ở thời điểm 13,8 phút, chúng tôi tiến hành phân tích chuẩn collidine ở các nồng độ 0,002 mg/ml; 0,003 mg/ml, 0,004 mg/ml; 0,005 mg/ml; 0,006 mg/ml. Bảng 4.8. Thời gian lƣu, diện tích, chiều cao của chất chuẩn collidine ở mỗi nồng độ. Nồng độ (mg/ml) Thời gian lƣu (phút) Diện tích (pA*s) Chiều cao (pA) 0,001 13,830 331,950 34,222 0,002 13,832 490,467 49,514 0,003 13,824 545,521 63,412 0,004 13,811 654,932 74,165 0,005 13,796 724,596 89,665 0,006 13,798 862,111 93,311 Hình 4.10. Sắc ký đồ GC phân tích thành phần hóa học của collidine nồng độ 0,002 mg/ml y = 0.00008x - 0.00193 R 2 = 0.9815 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 20 40 60 80 100 chiều cao peak (pA) nồ ng đ ộ co lli di ne (m g/ m l) Biểu đồ 4.6. Mối tƣơng quan giữa chiều cao và nồng độ của chuẩn collidine. y = 0.00001x - 0.00248 R 2 = 0.98412 0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 .007 300 400 500 600 700 800 900 diện tích peak (pA*s) nồ ng đ ộ co lli di ne (m g/ m l) Biểu đồ 4.7. Mối tƣơng quan giữa diện tích và nồng độ của chuẩn collidine.  Nhận xét: Kết quả phân tích ở bảng 4.8 và biểu đồ 4.6, 4.7 cho thấy mối tƣơng quan chặt giữa nồng độ collidine và chiều cao, diện tích peak khi phân tích bằng GC. Từ đó có thể kết luận đƣợc, peak đại diện cho collidine sẽ xuất hiện ở thời điểm 13,8 phút khi phân tích bằng hệ thống GC với điều kiện phòng thí nghiệm (hình 4.10). 4.4.2. Định tính hợp chất 2 – acetyl – 1 – pyrroline Sau khi tiến hành kiểm tra và loại trừ đƣợc tất cả các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phân tích (phụ lục 3), chúng tôi thực hiện phân tích gạo thơm để xác định thời gian lƣu của hợp chất thơm 2 – acetyl – 1 – pyrroline. Tiến hành chiết xuất 2 mẫu gạo thơm Basmati và Thái Lan theo qui trình 3.4.3. Bơm mẫu vào máy GC/MS theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm bằng phƣơng pháp SPME (phần 3.4.4.2) để xác định peak đại diện cho hợp chất 2 – AP. Hình 4.11. Sắc ký đồ GC – MS phân tích các hợp chất bay hơi có trong mẫu gạo Thái Lan. Dựa vào kết quả hình 4.8, tiến hành xác định thời gian lƣu của 3 hợp chất đặc trƣng cho các giống gạo thơm: hexanal, nonanal, 2 – AP bằng thƣ viện có trong máy GC/MS. Hình 4.12. Kết quả tra cứu thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal và nonanal trong thƣ viện của máy GC/MS.  Nhận xét: Dựa vào các kết quả hình 4.12 chúng tôi xác định đƣợc thời gian lƣu của hexanal là 4,16 phút (độ tƣơng hợp: 91%); thời gian lƣu của nonanal là 18,45 (độ tƣơng hợp: 86%). Tuy nhiên, không xác định đƣợc 2 – AP, nguyên nhân là do sau khi qua buồng MS, hợp chất 2 – AP bị bắn phá thành nhiều mảnh có khối lƣợng khác nhau nhƣng tổng khối lƣợng của chúng vẫn là 111 (khối lƣợng phân tử của hợp chất 2 – AP). Dựa vào phổ đồ phân tích, chúng tôi xác định đƣợc hợp chất phân tách ở thời điểm 9,24 phút của mẫu gạo Basmati (hình 4.13) và 9,22 phút của mẫu gạo Thái Lan (hình 4.14) có phổ tƣơng tự nhƣ phổ của hợp chất 2-AP đã đƣợc Tanchotikul và Hsieh (1991), Varaporn và Sarath (1993) đã phát hiện [63, 67] (hình 2.5). Do đó, có thể kết luận hợp chất 2 – AP xuất hiện ở thời điểm 9,2 phút khi phân tích trên hệ thống GC/MS. Hình 4.13. Phổ đồ của hợp chất phân tách ở thời điểm 9,24 phút của gạo Basmati Hình 4.14. Phổ đồ của hợp chất phân tách ở thời điểm 9,22 phút của gạo Thái Lan Bảng 4.9. Thời gian lƣu (phút) của hexanal, nonanal có trong mẫu gạo Thái Lan và Basmati chạy trên GC và GC/MS. Hợp chất Mẫu gạo Thái Lan Mẫu gạo Basmati GC/MS GC GC/MS GC Hexanal 4,16 4,929 4,16 4,936 Nonanal 18,45 19,686 18,44 19,713  Nhận xét Dựa vào kết quả phân tích trên hệ thống GC và GC/MS của mẫu gạo Basmati và Thái Lan, chúng tôi xác định đƣợc thời điểm xuất hiện của 2 hợp chất hexanal và nonanal trên hệ thống GC lần lƣợt là 4,929 và 19,688 phút (Basmati) và 4,936 và 19,713 phút (Thái Lan). Kết quả nghiên cứu cho thấy có sự khác biệt về thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal, nonanal trong mẫu gạo khi phân tích tại Pháp và tại Việt Nam. Nguyên nhân là do có sự khác biệt về kích thƣớc cột và loại khí mang sử dụng trong phân tích. Theo kết quả xác định ở phần 4.4.1., peak của collidine xuất hiện ở thời điểm 13,8 phút. Do hợp chất thơm 2 – AP sẽ xuất hiện trƣớc peak của chất chuẩn collidine, nên có thể dự đoán rằng hợp chất 2 – AP sẽ xuất hiện vào khoảng từ 9 đến 13 phút. So sánh sự chênh lệch về thời gian lƣu của 2 hợp chất hexanal và nonanal khi phân tích trên 2 hệ thống GC và GC/MS, chúng tôi nhận thấy khoảng thời gian chênh lệch là 0,8 đến 1,2 phút. Nhƣ vậy, có thể nhận định peak của hợp chất thơm 2-AP sẽ xuất hiện trong khoảng thời điểm từ 10 đến 11 phút. Dựa vào sắc ký đồ GC phân tích 2 mẫu gạo thơm Basmati và Thái Lan (phụ lục 5, 6), chúng tôi kết luận đƣợc thời gian lƣu của hợp chất 2-AP khi phân tách bằng GC là 10,1 phút ở điều kiện phòng thí nghiệm. 4.4.3. Xác định hệ số phản hồi của hợp chất 2 – AP 4.4.3.1. Xác định hệ số phản hồi theo nồng độ chất chuẩn collidine Bảng 4.10. Hệ số phản hồi của chất chuẩn collidine Dung dịch collidine Diện tích peak (pA*s) Hệ số phản hồi (pA/μg) 1 40,47 3268 2 42,69 3447 3 60,39 4765 4 74,01 5840 5 86,27 6808 6 89,95 7099 7 118,30 9336 Trung bình 6000 Hình 4.15. Sắc ký đồ GC phân tích collidine (nồng độ 0,01 mg/ml)  Nhận xét Theo bảng 4.10, hệ số phản hồi của hợp chất 2 – AP theo nồng độ chất ngoại chuẩn collidine là 6000. Trong quá trình xác định hệ số phản hồi theo chất chuẩn collidine, đôi khi có hiện tƣợng xuất hiện peak đôi. Do đó khó có thể tin cậy hoàn toàn vào hệ số phản hồi thu đƣợc theo chất chuẩn collidine. Vì thế chúng tôi tiến hành xác định hệ số phản hồi theo nồng độ 2-AP trong gạo thơm Giano. 4.4.3.2. Xác định hệ số phản hồi theo nồng độ 2 – AP trong gạo Giano Hình 4.16. Sắc ký đồ GC phân tích hợp chất thơm 2 – AP trong gạo thơm Giano Phân tích hàm lƣợng 2-AP chiết xuất từ 1,5 g gạo Giano theo chƣơng trình nhiệt phân tích gạo thơm. Chúng tôi thu đƣợc dữ liệu về diện tích peak 2-AP là 80 pA*s. Theo kết quả nghiên cứu của viện nghiên cứu CIRAD, nồng độ 2 – AP trong gạo thơm Giano khi phân tích bằng phƣơng pháp SPME là 10 μg/kg (Ringuet, 2005) [49]. Do đó, chúng tôi xác định đƣợc hệ số phản hồi theo nồng độ 2-AP là 5300 pA/μg. Từ 2 hệ số phản hồi thu đƣợc, chúng tôi xác định đƣợc hệ số phản hồi trung bình cho hợp chất thơm 2-AP là 5650 pA/μg. 4.5. SO SÁNH HÀM LƢỢNG CHẤT THƠM TRONG GẠO NTCĐ THU THẬP TỪ CHỢ VÀ CÁC LOẠI GẠO THƠM ĐƢỢC BÁN Ở THỊ TRƢỜNG CHÂU