Luận văn Khảo sát ảnh hưởng của vi khuẩn methylobacterium sp. lên sự phát sinh cơ quan ở cây lúa (ozyra sativa l) nuôi cấy in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** CHU LÝ HẢI ANH KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUƠI CẤY IN VITRO Luận văn kỹ sƣ Chuyên Ngành: Cơng nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP.HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUƠI CẤY IN VITRO Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành:Cơng nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. BÙI VĂN LỆ CHU LÝ HẢI ANH ThS. KIỀU PHƢƠNG NAM Khĩa: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY STUDYING EFFECT OF METHYLOBACTERIUM SP. ON MORPHOGENESIS OF IN VITRO RICE (Ozyra sativa L) Engineer Thesis Major: Biotechnology Research adviser Researcher BÙI VĂN LỆ, PROF, PhD CHU LÝ HẢI ANH KIỀU PHƢƠNG NAM, MSc Term: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 iv MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ MỞ ĐẦU …………………………………………………………………….. 1 TỔNG QUAN………………………………………………………………... 3 2.1 Giới thiệu về cây lúa…………………………………………………….. 3 2.1.1 Vị trí phân loại……………………………………………………. 3 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố…………………………………………….. 4 2.1.3 Đặc điểm hình thái………………………………………………… 5 2.1.4 Đặc điểm hạt lúa…………………………………………………... 6 2.2 Ứng dụng phƣơng pháp nuơi cấy mơ trong cải tiến giống lúa………... 7 2.3 Phƣơng pháp nuơi cấy mơ, tế bào in vitro………………………………10 2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan)……………………………..10 2.3.2 Sự tạo mơ sẹo từ cơ quan………………………………………….11 2.3.3 Ảnh hƣởng của một số mơi trƣờng và điều kiện nuơi cấy trên sự nuơi cấy tế bào…………………………………………………………….13 2.3.3.1 Mơi trƣờng nuơi cấy………………………………………13 2.3.3.2 Các nhân tố vật lý…………………………………………13 2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hịa tăng trƣởng thực vật……14 2.4 Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển thực vật………………….14 2.5 Đặc điểm của chi Methylobacterium……………………………………..15 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại…………………………………….15 2.5.2 Đặc điểm sinh thái………………………………………………….17 2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hĩa……………………………...18 v 2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp………………..19 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật……………………………………..19 2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin………………………….23 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP……………………………………………24 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………….24 3.2 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………….24 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………24 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu………………………27 3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuơi cấy………………………………….....27 3.3.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn………………………….....27 3.3.5 Mơi trƣờng nuơi cấy………………………………………………..28 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………28 3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mơ sẹo)……………………………………...28 3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn…………………………………………….30 3.3.3 Nội dung thí nghiệm…………………………………………………30 3.3.3.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………...30 3.3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20…………………...31 3.3.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20………………………………..31 3.3.3.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mơ sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………32 3.3.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………...33 3.3.3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20………………………………33 3.3.3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20………………………………...34 vi 3.3.3.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mơ sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………..34 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………………36 4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………………36 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………38 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….43 4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mơ sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………………………….45 4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20………………………………………………………………….47 4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….50 4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………53 4.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mơ sẹo của giống lúa VĐ20……………………………………………………………..55 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………………..58 5.1 Kết luận……………………………………………………………………...58 5.2 Đề nghị……………………………………………………………………….59 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC vii CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : Dichlorophenoxy-acetic acid Aux : Auxin BAP : 6-Benzylamino-purin Cs : Cộng sự Cyt : Cytokinin MS : Murashige-Skoog MMS : Methanol mineral salts NAA : α-naphthalene acetic acid viii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mơ sẹo (cm) sau 4 tuần nuơi cấy………………………………………………………………………......36 Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mơ sẹo……………………………………………………………………………….38 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mơ sẹo……………………………………………………………………………….40 Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh và số rễ hình thành…43 Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa…………….45 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến đƣờng kính mơ sẹo…………………47 Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh chồi và số chồi hình thành từ mơ sẹo…………………………………………………………………………50 Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lế tái sinh rễ và số rễ trên mẫu…...53 Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên sự tăng sinh mơ sẹo sau 4 tuần nuơi cấy………………………………………………………………………………..55 ix DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Vi khuẩn cĩ sắc tố hồng ngoại nhiễm vào mơi trƣờng nuơi cây: A: Saintpaulia ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp. [8]………………………………….2 Hình 2.1: Oryza sativa L………………………………………………………....6 Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa……………………………………………………….7 Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp qua kính hiển vi điện tử (B)…………………………………………………….17 Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuơi cấy trên mơi trƣờng thạch LB (A) vào mơi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [36]...18 Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của lồi cây thuốc lá chuyển gen ipt trên mơi trƣờng MS khơng bổ sung hormone sau một tháng nuơi cấy. (a): khơng bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): cĩ bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays[21]……….20 Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bĩc vỏ trấu, (b) hạt bĩc vỏ trấu……..24 Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên mơi trƣờng tạo sẹo……………………….29 Hình 4.1: Mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuơi cấy (1.1)……………………………………………………………..37 Hình 4.2: Các mơ sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuơi cấy…………………….38 Hình 4.3: Mơ sẹo tái sinh chồi trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuơi cấy………………………………………………………42 Hình 4.4: Các mẫu mơ tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần nuơi cấy………42 Hình 4.5: Mơ sẹo tái sinh rễ trên mơi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần nuơi cấy…………………………………………………………………………44 Hình 4.6: Các mẫu mơ tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuơi cấy…………45 Hình 4.7: Sự tạo mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) cĩ bổ sung 1ml dung dịch khuẩn, (b) khơng cĩ bổ sung khuẩn sau 2 tuần nuơi cấy……….47 Hình 4.8: Sự tăng sinh mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP và 0,5mg/l NAA: (a) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (b) khơng bổ sung khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy…………………………………………………………………………49 x Hình 4.9: Sự tăng sinh mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (5.4)…………………49 Hình 4.10: Sự tái sinh chồi trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (6.2)………………………..52 Hình 4.11: Sự tái sinh chồi trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (6.4)………………………..52 Hình 4.12: Sự tái sinh rễ trên mơi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 0,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (7.2)………………………………………..54 Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên mơi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (7.4)………………………………………..55 Hình 4.14: Sự tăng sinh mơ sẹo ở thí nghiệm 8 trên mơi trƣờng MS khơng bổ sung hormone: (a) khơng cĩ bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (c) bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy………………………………………………………………………..57 xi DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng của chủng 1019……………………………...26 Đồ thị 4.1: Kích thƣớc mơ sẹo sau 4 tuần nuơi cấy ở các nghiệm thức khác nhau36 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……..39 Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……………………………………………………………………………….40 Đồ thị 4.4: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần……………………………………………………………………………….43 Đồ thị 4.5: Tỷ lệ tạo mơ sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần…………..46 Đồ thị 4.6: Kích thƣớc mơ sẹo ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian…….48 Đồ thị 4.7: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian……..50 Đồ thị 4.8: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian………………………………………………………………………………..51 Đồ thị 4.9: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần…………………………………………………………………...53 Đồ thị 4.10: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thƣớc mơ sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 4 tuần………………………………………………………...56 xii TĨM TẮT CHU LÝ HẢI ANH, Đại học Nơng Lâm TPHCM. Tháng 8/2006. “ KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN CÂY LÚA (Oryza sativa L.) NUƠI CẤY IN VITRO”. Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Văn Lệ ThS. Kiều Phƣơng Nam Đề tài đƣợc thực hiện tại trại thực nghiệm – khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên trên đối tƣợng là giống lúa VĐ20 và chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. 1019. Tiến hành nhân sẹo, tạo chồi, tạo rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20 bằng phƣơng pháp nuơi cấy in vitro, sau đĩ khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng phát sinh cơ quan của mơ sẹo bằng cách bổ sung những nồng độ khuẩn khác nhau vào mơi trƣờng nuơi cấy với 34 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu nhƣ tỷ lệ tái sinh, số chồi trên mẫu, số rễ trên mẫu, đƣờng kính mơ sẹo. Những kết quả thu đƣợc: - Chủng 1019 cĩ tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mơ sẹo. Chứng tỏ chủng khuẩn cĩ tác động đến quá trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hĩa của tế bào mơ sẹo, ảnh hƣởng đến sự phát sinh hình thái của sẹo. - Chủng 1019 cĩ ảnh hƣởng đến quá trình phát sinh hình thái của giống lúa VĐ20, chiều hƣớng phát sinh cơ quan tuỳ thuộc vào bản chất của mơ cấy và lồi thực vật. - Nồng độ khuẩn cao sẽ ức chế hồn tồn mơ sẹo, khơng thấy đƣợc sự phát sinh cơ quan từ mơ sẹo. xiii Em xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Phĩ Giáo sư- Tiến sĩ Bùi Văn Lệ. Ngƣời đã gợi ý đề tài, luơn giúp đỡ và tận tình hƣớng dẫn em trong suốt thời gian làm khố luận. Thạc sĩ Kiều Phương Nam, đồng hƣớng dẫn, thầy đã tận tình hƣờng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi để em hồn thành khố luận này. Tiến sĩ Trần Thị Dung, cơ đã giảng dạy và truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm quý giá trong suốt thời gian theo học ở trƣờng. Tiến sĩ Từ Bích Thủy, cơ đã truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm làm việc, trình bày khĩa luận và đĩng gĩp những ý kiến quý báu cho khĩa luận này. xiv Em xin chân thành cảm ơn Tồn thể quí thầy cơ trong bộ mơn Cơng nghệ sinh học. Trường Đại học Nơng Lâm TPHCM. Những người đã giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức quý giá trong thời gian học tập tại trường. Tồn thể quí thầy cơ trong bộ mơn Sinh học. Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TPHCM. Những người đã tạo điều kiện thuận lợi và đĩng gĩp nhiều ý kiến trong suốt quá trình thực hiện khĩa luận này. Tập thể các bạn sinh viên khĩa DH02SH, Trường Đại học Nơng Lâm TPHCM, và các bạn thân đã giúp đỡ và động viên tơi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khố luận này. Các anh, chị và các bạn sinh viên khoa Cơng nghệ sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TPHCM, đã giúp đỡ và động viên em trong thời gian thực hiện khĩa luận. Con xin tỏ lịng thành kính và biết ơn Ba, Mẹ. Người đã sinh thành và dưỡng dục con. Con xin tỏ lịng thành kính và biết ơn Bà ngoại, Bà nội. Người đã hết lịng thương yêu, dạy dỗ để con cĩ được ngày hơm nay. Con xin tỏ lịng biết ơn Cơ, Dì, Dượng đã thương yêu và động viên con. 1 GIỚI THIỆU Lúa là cây lƣơng thực quan trọng, là nhu cầu khơng thể thiếu đối với con ngƣời, đặc biệt ở các nƣớc Châu Á. Do đĩ, việc nghiên cứu, cải tiến và tạo ra các giống lúa cĩ phẩm chất tốt, khả năng chống chịu cao là vấn đề quan tâm của nhiều nhà khoa học. Cơng nghệ nuơi cấy mơ thực vật hiện nay đang phát triển rất mạnh mẽ và ngày càng mang lại hiệu quả kinh tế cao. Cơng nghệ này giúp tạo ra một số lƣợng lớn cây trồng đồng nhất, duy trì các tính trạng tốt, tạo cây sạch bệnh… Việc nâng cao năng suất lúa bằng cách phối hợp giữa phƣơng pháp thơng thƣờng và cơng nghệ sinh học là chiến lƣợc đƣợc nhiều quốc gia quan tâm. Tuy nhiên, một trở ngại cần quan tâm trong nuơi cấy mơ thực vật là hiện tƣợng nhiễm nấm, khuẩn sẽ ảnh hƣởng khơng tốt đến sự sinh trƣởng và phát triển của các mơ thực vật. Nhƣng điều đĩ khơng cĩ nghĩa là tất cả các lồi nấm, khuẩn nhiễm trong mơi trƣờng nuơi cấy đều cĩ hại. Ngồi ra chính điều kiện vơ trùng trong quá trình nuơi cấy đã loại bỏ các mối tƣơng tác cĩ ích giữa thực vật và vi sinh vật. Theo một số nghiên cứu, sự hiện diện của một số lồi nhƣ Bacillus spp. [5], Methylobacterium sp. [46], [47] .. trong mơi trƣờng nuơi cấy khơng những khơng làm chết mơ thực vật mà ngƣợc lại dƣờng nhƣ cịn kích thích sự sinh trƣởng của cây. 2 A B C Hình 1: Vi khuẩn cĩ sắc tố hồng ngoại nhiễm vào mơi trƣờng nuơi cây: A: Saintpaulia ionantha; B: Paulonia fortunei; C: Pacciflora sp. [9] Đã cĩ nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành trên cây lúa (Oryza sativa L) và kết quả cho thấy vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao của cây mạ trong điều kiện in vitro …Vì vậy chúng tơi thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở CÂY LÚA (Oryza sativa L) NUƠI CẤY IN VITRO”. Mục đích Tìm hiểu ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự phát sinh cơ quan cây lúa: mơ sẹo, chồi, rễ. Yêu cầu Xác định nồng độ kích thích tố thích hợp đến khả năng tạo mơ sẹo, nhân sẹo, tạo chồi, nhân chồi, tạo rễ ở cây lúa bằng phƣơng pháp nuơi cấy in vitro. Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên khả năng tạo mơ sẹo, tạo chồi, tạo rễ ở cây lúa. So sánh ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. với ảnh hƣởng của các kích thích tố lên sự phát sinh cơ quan. 3 TỔNG QUAN 2.1. Giới thiệu về cây lúa Lúa là cây lƣơng thực chính cho nhiều ngƣời và đồng thời lúa gạo cũng tham gia vào các hoạt động kinh tế quan trọng nhất trên thế giới. Châu Á là nơi sản xuất 90% tổng sản lƣợng và cũng là nơi tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất. Khoảng 85% sản lƣợng gạo, 72% lúa mì và 19% ngơ đƣợc con ngƣời tiêu thụ trực tiếp [38]. Lúa gạo cung cấp 21% năng lƣợng và 15% protein cho lồi ngƣời [30]. Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu gạo hàng đầu trên thế giới. Năm 2001 các nƣớc xuất khẩu gạo chính (tính theo triệu tấn) bao gồm: Thái Lan (6,4), Việt Nam (4,0), Trung Quốc (3,0), Mỹ (2,8) (USDA, 2001). 14 năm qua, cây lúa đặc biệt là ở ĐBSCL đã đĩng gĩp cho đất nƣớc gần 8 tỷ USD trị giá xuất khẩu và đã gĩp phần to lớn cho cơng cuộc đổi mới ở Việt Nam cĩ kết quả. Tuy sản xuất với số lƣợng nhiều, nhƣng chất lƣợng và giá gạo xuất khẩu của Việt Nam thƣờng thấp hơn so với một số nƣớc nhƣ Thái Lan, Mỹ, Úc, đặc biệt cĩ sự chênh lệch lớn ở loại gạo đặc sản và gạo cao cấp [8]. 2.1.1 Vị trí phân loại Lớp: Monocotyledonae Họ: Poaceae Giống: Oryza Lồi: Oryza sativa L. 4 Lúa O. sativa cĩ 2n = 24 nhiễm sắc thể, thƣờng đƣợc phân biệt làm 3 nhĩm: Lúa Indica: thƣờng trồng ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, cĩ thân cao, dễ đổ ngã, nhiều chồi, lá ít xanh và cong và kháng đƣợc nhiều sâu bệnh nhiệt đới. Hạt gạo dài hoặc trung bình, cĩ nhiều tinh bột. Năng suất kém hơn lúa Japonica. Lúa Japonica: thƣờng đƣợc trồng ở những vùng ơn đới hoặc những nơi cĩ độ cao trên 1000 m (trên mặt biển), cĩ thân ngắn, chống đổ ngã, lá xanh đậm, thẳng đứng, ít chồi, hạt gạo thƣờng trịn, ngắn hoặc trung bình, dẻo khi nấu vì ít chất tinh bột. Lúa Japonica cĩ năng suất cao. Lúa Javanica (bulu) hay lúa Japonica nhiệt đới đƣợc trồng ở Indonexia, cĩ đặc tính ở giữa hai loại lúa Japonica và Indica. Hình thức gần giống nhƣ lúa Japonica, cĩ lá rộng với nhiều lơng và ít chồi. Thân cứng, chắc và ít cảm quang. Hạt lúa thƣờng cĩ đuơi [7]. 2.1.2 Nguồn gốc và phân bố Cây lúa đƣợc canh tác từ vĩ tuyến 400 phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 530 của bắc bán cầu, và đƣợc trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nƣớc biển cho đến độ cao 2000m trên mặt biển. Trên thế giới cĩ 20 lồi lúa hoang và 2 lồi canh tác. Cây lúa hiện đƣợc canh tác đại trà để cung cấp lƣơng thực cho con ngƣời trên thế giới là Oryza sativa L. ở châu Á, cĩ năng suất cao và đƣợc ƣa chuộng. Lồi lúa Oryza glaberrima Steud. đƣợc canh tác ít hơn ở Tây châu Phi, cĩ năng suất và chỉ số thu hoạch thấp hơn O.sativa. Các cuộc nghiên cứu trên đất gạch bằng trấu trong các thành phố danh tiếng đổ nát ở Ấn Độ và trong vùng sơng Cửu Long nhƣ Myanma, Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam phát hiện rằng cây lúa trồng ở Đơng Dƣơng do phát triển theo 2 ngả: từ Lào theo sơng Cửu Long đi xuống phƣơng nam cĩ đặc tính cây lúa Japonica nhiệt đới, một ngả khác từ Ấn Độ qua vịnh Bengal đến bờ biển Đơng Dƣơng, với đặc tính của cây lúa Indica. Vì vậy, Việt Nam với khí hậu nhiệt đới nằm trong vùng đa dạng sinh thái của thảo mộc gồm cả cây lúa Indica và Japonica nhiệt đới [7]. 5 2.1.3 Đặc điểm hình thái O. sativa là cây thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, cĩ thời gian sinh trƣởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng vá các điều kiện sinh thái và kéo dài trong khoảng từ 75-250 ngày. Cây mọc thẳng đứng hay mọc nghiêng rồi bị dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất cao hay nƣớc ngập chân hoặc một phần thân hay trong nƣớc sâu 2-4m. Thân cao từ 70-150cm, một số giống lúa nổi cĩ thân cao 2-3m, hay 5-6m (lúa nổi ở Bangladesh). Đốt thân nhẵn và cách nhau bởi những dĩng dài, ngắn khác nhau. Phiến lá thẳng hình đều, đầu lá nhọn, bề mặt phiến lá và mép lá đều ráp. Bẹ lá cĩ thìa lìa, lá dìa hình mũi mác hay chẻ đơi, các đầu chẻ đều nhọn. Lúa thƣờng tạo ra thành nhiều nhánh (dảnh lúa: tillers), bao gồm cọng và lá cĩ hoặc khơng cĩ bơng (panical). Nhánh bậc 1 xuất hiện từ những đốt gần thân chính và nhánh bậc hai, bậc ba xuất hiện từ những nhánh bậc một này. Lá mọc liên tiếp trên thân bao gồm bẹ lá bao lấy thân và phiến lá. Cổ lá nối giữa phiến lá và bẹ lá cĩ một lƣỡi bẹ và 2 thìa lìa từ cổ lá. Bơng mọc trên đốt trên cùng của thân từ bên trong lá cờ và mang nhiều hoa trong một bơng con. Cụm hoa là một chùm thƣa, thẳng, hẹp, đầu hơi cong xuống, dài 15-30cm hoặc dài hơn. Hoa nhỏ hình thuơn dài, mày hoa thuơn dài hình mũi mác, hoa màu hồng vàng hay màu tím, cĩ hoa lƣỡng tính, tự thụ phấn. Hoa cĩ 6 nhị đực mảnh, bao phấn dài, bầu hoa cĩ vịi, nhụy ngắn và hai đầu nhụy cĩ lơng tơ [28]. Về cơ bản, lúa là cây thích nghi với điều kiện cĩ nƣớc. Ba giai đoạn chính trong quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây lúa theo viện nghiên cứu quốc tế IRRI là: - Nẩy mầm và sinh trƣởng sinh dƣỡng - Giai đoạn phát triển cơ quan sinh sản - Giai đoạn hạt chín [28] 6 Hình 2.1: Oryza sativa L. 2.1.4 Đặc điểm hạt lúa Cơ cấu hạt lúa là quả dĩnh nhỏ gồm cĩ:  Vỏ trấu gồm trấu trên và trấu dƣới.  Cám gồm biểu bì, quả bì và chủng bì (nucellus). Màu sắc hạt gạo do lớp chủng bì.  Phơi nhũ gồm cĩ lớp aleuron và phơi nhũ tích tụ tinh bột.  Mầm cây gồm cĩ phơi (mầm) lá, phơi rễ và trụ phơi giữa ở phần dƣới của hạt. Hạt lúa là nỗn sào thụ tinh đã chín, cĩ hai mày trấu nhỏ trên và dƣới, hai vỏ trấu trên và dƣới, cuống trấu ở phần dƣới của hạt và đuơi ở chĩt hạt (ngắn hoặc dài). Một hạt lúa cĩ trọng lƣợng từ 12 – 44 mg ở 0% ẩm độ. 7 Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa Theo IRRI, hạt gạo đƣợc phân loại theo chiều dài của hạt gạo nhƣ sau: rất dài: > 7,50 mm, dài: 6,61 – 7,50 mm, trung bình: 5,51 – 6,60 mm, và ngắn: < 5,50 mm. Theo Ủy ban thực phẩm Codex (1990), sự xếp hạng gạo theo tỉ lệ bề dài – đối với – bề rộng nhƣ sau: hạt dài: 3,1, hạt trung bình: 2,1 – 3,0, và hạt ngắn: 2,0 [38]. 2.2. Ứng dụng phƣơng pháp nuơi cấy mơ trong cải tiến giống lúa Các tiến bộ mới đây về kỹ thuật sinh học đặc biệt là nuơi cấy mơ, tế bào và sinh học phân tử đã mở ra những hƣớng mới cho việc cải tiến cây lúa cĩ năng suất cao và ổn định, tạo ra cơ hội tốt để hồn thiện các mục tiêu chọn giống mà trƣớc đây chúng ta khơng thể làm đƣợc. Phƣơng pháp nuơi cấy mơ, tế bào thực vật là phƣơng pháp nhân giống lý tƣởng khơng chỉ do địi hỏi ít diện tích, nhanh mà cịn 8 giữ nguyên đƣợc tính ƣu việt của giống ban đầu. Trong quá trình nghiên cứu cơ sở di truyền của sự biến đổi các tế bào thực vật nuơi cấy, ngƣời ta thấy rằng cơng nghệ nuơi cấy tế bào cho chúng ta lợi thế quan trọng làm thay đổi giống cây trồng theo hƣớng cĩ lợi [4]. Bên cạnh đĩ nuơi cấy in vitro gĩp phần quan trọng trong việc tạo ra các vật liệu cần thiết nhƣ chồi, phơi mầm… cho các phƣơng pháp chọn lọc giống, phƣơng pháp chuyển nạp gen trên lúa và các đối tƣợng thực vật khác. * Nuơi cấy túi phấn Nuơi cấy túi phấn để phát triển các dịng đồng hợp tử hay dịng đơn bội kép. Sự tái sinh cây trồng từ túi phấn chỉ giới hạn trong kiểu gen japonica, nĩ cĩ nhƣợc điểm là khá năng trồng cây lai rất thấp nhất là đối với các giống lúa indica. Cho đến nay kỹ thuật này chỉ mới thành cơng để cái tiến các giống lúa japonica ở Trung Quốc, Hàn Quốc [57]. * Cứu sống phơi mầm Cứu sống phơi mầm để tạo ra con lai đặc biệt: các lồi hoang dại là nguồn phong phú của các gen hữu ích. Phơi mầm 10 ngày tuổi đƣợc tách ra và cấy vào mơi trƣờng, tiếp tục hồi giao với giống lúa trồng để cĩ con lai vừa nhận đƣợc gen cần thiết của lúa hoang và dạng hình cải tiến của lúa trồng. Kỹ thuật này thành cơng trong việc khai thác nguồn gen kháng rầy nâu, rầy lƣng trắng trong tổ hợp lai giữa O. officinalis và O. sativa [42]. * Khai thác biến dị tế bào soma và chọn lọc các đột biến cĩ ích trong nuơi cấy mơ tế bào Tính chất biến dị này đã đƣợc biết với các đột biến nhƣ đặc tính kháng bệnh, kháng mặn, kháng độ độc nhơm, đặc tính chiều cao và thời gian sinh trƣởng. Trên lúa, Oono (1981, 1983) đã ghi nhận sự biến dị của một số đặc tính con lai trong nuơi cấy mơ, quan sát dịng R2 cĩ 52% biểu hiện dạng hình mới [51], [52], [58] . Schaeffer và cs (1984) đã tìm thấy biến dị đối với đặc tính dạng hạt, hàm lƣợng protein, chiều cao, số chồi khi nuơi cấy túi phấn của giống Calrose 76 [56]. Nguồn biến dị đƣợc kích thích bởi kỹ thuật nuơi cấy mơ của con lai cần đƣợc nhấn mạnh 9 đặc biệt về cách du nhập các gen trong những genome khác nhau mà trong đĩ khơng cĩ tính chất tƣơng đồng của nhiễm thể. * Khai thác biến dị phơi (somatic embryogenesis) Nuơi cấy tế bào phơi đang trở nên quan trọng đối với việc tạo ra một tần suất cao của sự tái sinh từ tế bào, từ hạt phấn, từ tế bào trần cũng nhƣ các tế bào chuyển nạp. Ngƣời ta tạo ra hạt tổng hợp (synthetic seeds) bằng cách nuơi cấy tế bào phơi, sau đĩ bảo quản phơi trƣởng thành trong túi (encapsulation) để làm vật liểu giống cây trồng. Đối với lúa nghiên cứu hạt tổng hợp vẫn cịn rất mới mẻ, cần nghiên cứu sâu hơn invitro để phát triển các phơi somatic cĩ thể nảy mầm thành cây. Kỹ thuật hạt giống tổng hợp trên cây lúa cĩ tiềm năng rất lớn để khai thác ƣu thế lai, vì nĩ giúp cho việc nhân giống, cũng nhƣ phát triển các cây lai cĩ ƣu thế mạnh đƣợc sớm đƣa ra sản xuất rộng rãi [2]. * Kỹ thuật chuyển nạp gen và sản xuất cây lúa transgenic Các tiến bộ gần đây trong nuơi cấy mơ và sinh học phân tử đã mở ra những hƣớng mới trong thu nhập các gen lạ vào cây trồng. Gen lạ đƣợc lắp ghép thành cơng ở nhiều lồi cây trồng thơng qua vi khuẩn Agrobacterium cũng nhƣ phƣơng pháp chuyển nạp DNA trực tiếp [61]. Cĩ 2 cách để đƣa vật liệu di truyền ngoại lai ở dạng từng gen riêng biệt vào tế bào thực vật: (1) Chuyển gen qua vector: các plasmid cĩ thể đƣợc dùng làm vector để chuyển các vật liệu di truyền vào tế bào thực vật. Các plasmid này gọi là Ti và Ri. (2) Truyền trực tiếp DNA - phƣơng pháp vi tiêm - biến nạp bằng xung điện - biến nạp do mở lỗ bằng điện - biolistics Nghiên cứu sản xuất cây lúa transgenic đã đƣợc báo cáo [45] . Nhiều đặc tính cây lúa cĩ thể đƣợc cải tiến bằng phƣơng pháp du nhập các gen mới. Đề án hợp 10 tác giữa IRRI và PGS (Plant Genetic System) Bỉ, nhằm thực hiện tách gen Bt (từ Bacillus thurigiensis) dịng cĩ độc tính đối với sâu cuốn lá và sâu đục thân - đồng thời chuyển gen này vào cây lúa. Chuyển nạp gen giữa các tế bào trần đã áp dụng thành cơng trên giống Tepei Boro (Bangladesh) và IR43 [37]: cả hai phƣơng pháp lai tế bào trần và bắn gen đều đƣợc sử dụng, những cây đƣợc chuyển nạp đều cĩ hai gen của bacteria. 2.3. Phƣơng pháp nuơi cấy mơ, tế bào in vitro 2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan) Mơi trƣờng và chất điều hịa sinh trƣởng thực vật thích hợp cho sự phân chia tế bào để tế bào tăng sinh nhanh chĩng thì khơng thể cảm ứng cho sự phát sinh hình thái (tạo chồi, rễ). Tuy nhiên, trong nuơi cấy mơ thực vật, sự phát sinh cơ quan xảy ra khi mơ sẹo đƣợc nuơi lâu trong mơi trƣờng, nhƣng cĩ thể sự phát sinh hình thái này bị ức chế nếu mơ sẹo cấy chuyền liên tục. Trong trƣờng hợp khác, mơ sẹo hình thành từ mẫu cấy trong mơi trƣờng tạo mơ sẹo, sau đĩ chuyển sang mơi trƣờng khác cĩ thành phần dƣỡng chất và chất điều hịa sinh trƣởng thực vật thay đổi thì sự phát sinh cơ quan (chồi, rễ) sẽ xảy ra. Sự phát sinh cơ quan từ mơ sẹo tƣơng tự nhƣ sự phát sinh cơ quan trực tiếp từ mẫu cấy. Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật thì tế bào mơ sẹo lại đƣợc cảm ứng để phân hĩa tạo cơ quan [13]. Tái sinh cây từ mơ sẹo lúa: khi đƣờng kính mơ sẹo đạt 0,5-1mm, mơ sẹo sẽ đƣợc cấy chuyền sang mơi trƣờng tái sinh. Nếu các mơ sẹo cịn non (0,5mm hay nhỏ hơn) mà đã cấy chuyền sang mơi trƣờng tái sinh thì sẽ bị chết nhiều và cho số chồi xanh ít. Mơ sẹo càng già thì khả năng tái sinh càng kém. Vì vậy nên chọn những mơ sẹo trung bình và đang tăng trƣởng tốt để cấy chuyền. Kích thƣớc mơ sẹo tăng khá nhanh, sau vài tuần, trên một số mơ sẹo xuất hiện những điểm xanh, từ những điểm xanh này sẽ hình thành chồi và phát triển thành cây [13]. 11 2.3.2 Sự tạo mơ sẹo từ mơ hay cơ quan Kỹ thuật tạo mơ sẹo đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920, đầu những năm 1930, và là một trong những phƣơng pháp đầu tiên của kỹ thuật nuơi cấy mơ trong nhiều năm [59]. Trong phƣơng pháp này, mơ sẹo ở những điều kiện mơi trƣờng thích hợp cĩ thể tái sinh cơ quan theo chiều hƣớng mà ta mong muốn, tạo ra những vật liệu sử dụng trong các phƣơng pháp sinh học khác nhƣ: chuyển gen, chọn lọc dịng soma, tạo giống cây sạch bệnh… Mơ sẹo (callus) là một khối tế bào khơng cĩ tổ chức, cĩ đặc tính phân chia mạnh, hình thành từ các mơ hoặc cơ quan đã phân hĩa dƣới các điều kiện đặc biệt: cĩ vết thƣơng, xử lý các chất điều hịa tăng trƣởng nhƣ 2,4- D trong tối… Các tế bào thuộc các mơ hoặc các cơ quan này, trừ tế bào của mơ phân sinh, phải chịu một sự phản phân hĩa trƣớc lần đầu tiên. Sự phản phân hĩa cĩ vai trị rất quan trọng, nĩ cho phép một tế bào đã trƣởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hĩa). Sự trẻ hĩa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phơi soma trong điều kiện thích hợp [54]. * Vai trị của loại cơ quan, tuổi cơ quan và ánh sáng trong sự tạo mơ sẹo Khả năng tạo mơ sẹo của mơ và cơ quan phụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lý, sinh hĩa và kiểu gen [59]. Sự tăng sinh của mơ sẹo là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật ngoại sinh áp dụng trong mơi trƣờng nuơi cấy [13]. - Các mơ và các cơ quan cĩ thể đƣợc sử dụng làm vật liệu tạo mơ sẹo nhƣ: rễ, thân, lá, củ, chồi hoa, túi phấn, phơi hợp tử chƣa trƣởng thành, phơi hợp tử trƣởng thành…Tuy nhiên, với mỗi loại mơ hay cơ quan, thƣờng phải sử dụng các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật với loại và nồng độ khác nhau tuỳ theo mức độ nhạy cảm của các tế bào trong mơ hay cơ quan đĩ. - Những mảnh cơ quan đã trƣởng thành thƣờng khơng cĩ khả năng tạo mới cơ quan, cũng khơng cĩ khả năng tạo mơ sẹo. Ngƣợc lại, cây non 12 (cịn nguyên vẹn hay cắt đoạn) hay những mảnh thân cịn rất non của cây trƣởng thành cĩ thể tạo mơ sẹo trên mơi trƣờng cĩ chất điều hịa sinh trƣởng thực vật, đặc biệt là auxin. - Tùy theo loại mẫu cấy, ánh sáng cần hoặc khơng cần trong suốt thời gian tạo mơ sẹo [54]. Trong đa số trƣờng hợp, sự tạo mơ sẹo trong tối thƣờng tốt hơn ngồi sáng, đặc biệt là đối với mẫu cấy lá nhƣ tạo mơ sẹo từ lá khoai tây; ngƣợc lại, sự tạo mơ sẹo từ lá cây thuốc lá Nicotiana tabacum; mơ củ khoai tây… xảy ra trong điều kiện chiếu sáng. - Vai trị của auxin trong tăng trƣởng mơ sẹo: mơ sẹo sau khi hình thành nếu đƣợc tiếp tục duy trì trong mơi trƣờng cĩ auxin thì mơ sẹo sẽ tăng sinh nhanh, nhƣng nếu chuyển sang một mơi trƣờng cĩ đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng nhƣng khơng cĩ sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của mơ sẹo xảy ra rất chậm. Tốc độ tăng trƣởng của mơ sẹo phụ thuộc vào thành phần cũng nhƣ nồng độ của auxin. - Vai trị của các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật trong phát sinh hình thái mơ sẹo: hình thái của mơ sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng nhƣ nồng độ của các chất điều hịa sinh trƣởng thực vật hiện diện trong mơi trƣờng nuơi cấy. Nếu giữ nguyên nồng độ và loại auxin nhƣng thay đổi thành phần và nồng độ cytokinin thì hình thái mơ sẹo thay đổi. Trong đa số trƣờng hợp, sự hiện diện của BAP trong mơi trƣờng nuơi cấy kích thích sự tạo mơ sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu và cĩ khả năng sinh phơi; mơ sẹo trên mơi trƣờng cĩ kinetin cĩ dạng bở và thƣờng khơng cĩ khả năng sinh phơi. Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mơ sẹo dạng bở nhƣng khi giảm nồng độ auxin thì mơ sẹo cĩ dạng nốt và chắc [13]. 13 2.3.3 Ảnh hƣởng của một số mơi trƣờng và điều kiện nuơi cấy trên sự nuơi cấy tế bào 2.3.3.1 Mơi trƣờng nuơi cấy Tiềm năng tạo sẹo của một số lồi thực vật đƣợc xác định bởi sự tƣơng tác giữa trạng thái sinh lý của vật liệu nuơi cấy và mơi trƣờng nuơi cấy [15], [49]. Vì vậy, việc chọn đúng mơi trƣờng nuơi cấy thích hợp cho từng đối tƣợng nuơi cấy rất cấn thiết trong cơng tác nuơi cấy mơ và tế bào thực vật [6]. Các mơi trƣờng cơ bản đƣợc sử dụng trong nuơi cấy mơ lúa thƣờng là: MS (Murashige và Skoog); N6 (Chu và csv). Đây là các mơi trƣờng đƣợc đánh giá là giàu dinh dƣỡng và cĩ thành phần khống cân bằng [6]. Thơng thƣờng cĩ sự đồng nhất giữa mơi trƣờng cảm ứng tạo sẹo và mơi trƣờng thích hợp cho sự tăng trƣởng của mơ sẹo; tuy nhiên, trong một số trƣờng hợp cĩ sự khác nhau của nồng độ chất điều hịa tăng trƣởng thực vật ở cả hai mơi trƣờng này [25]. 2.3.3.2 Các nhân tố vật lý Ánh sáng: Nhu cầu ánh sáng cho sự hình thành và tăng trƣởng của mơ sẹo tuỳ thuộc vào lồi thực vật. Ở một số lồi, mơ sẹo thƣờng đƣợc cảm ứng và tăng trƣởng trong điều kiện tối tuy nhiên một số lồi sự cảm ứng và tăng trƣởng của mơ sẹo địi hỏi điều kiện ánh sáng hoặc quang kỳ thích hợp [55]. Hiệu ứng ánh sáng với chiều hƣớng tăng trƣởng và biệt hĩa tế bào trong nuối cấy tế bào in vitro khơng chỉ phụ thuộc vào kiểu gen của vật liệu nuơi cấy mà cịn phụ thuộc vào bƣớc sĩng, cƣờng độ, thời gian chiếu sáng và giai đoạn tăng trƣởng của tế bào nuơi cấy [33]. Nhiệt độ: Hầu hết các mơ và tế bào đều tăng trƣởng tốt ở điều kiện nhiệt độ khoảng 26-30oC [43]. Tuy nhiên, hiệu ứng nhiệt độ cũng thay đổi tùy lồi thực vật Phaseolus 28 o C, Brassica 15 o C [20]; Oryza sativa 24-32 o C [33]. 14 2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hồ tăng trƣởng thực vật Chất điều hịa tăng trưởng thực vật là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ tổng quát những hợp chất hữu cơ cĩ tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đĩ của thực vật ở nồng độ rất thấp. Chúng khơng phải là chất dinh dƣỡng hay là nguyên tố khống cần thiết cho sự tăng trƣởng của thực vật [11]. Kích thích tố thực vật (phytohormone) là thuật ngữ đƣợc dùng để chỉ những hợp chất thiên nhiên do thực vật tạo ra với hàm lƣợng rất thấp từ vị trí sản xuất di chuyển đến vị trí hoạt động: ở đây, chúng tác động làm biến đổi một quá trình sinh lý nào đĩ của thực vật [11]. Để cĩ hoạt tính, các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật phải cố định trên một thể nhận chuyên biệt của tế bào đích, thể nhận này cĩ thể thay đổi theo mơ đích, nên một chất điều hịa tăng trƣởng thực vật cĩ hiệu ứng khác nhau trên những mơ đích khác nhau. Nhìn chung, hoạt động của các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật phụ thuộc vào các yếu tố sau: - Bản chất và nồng độ của các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật. - Sự cân bằng giữa các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật trong mơ đích. - Loại mơ đích và trạng thái sinh lý của mơ đích [3] 2.4. Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển của thực vật Giữa thực vật và vi sinh vật cĩ mối quan hệ mật thiết với nhau, bên cạnh một số vi sinh vật cĩ hại thì một số khác cĩ lợi cho cây trồng giúp cây dễ hấp thu, cĩ khả năng tổng hợp các hormone tăng trƣởng thực vật và các chất tạo tính kháng với các tác nhân gây bệnh. Dựa vào những đặc điểm cĩ lợi đĩ ngƣời ta áp dụng các kỹ thuật sinh học tạo ra các loại phân bĩn, thuốc trừ sâu sinh học thay thế cho phân bĩn, thuốc trừ sâu hĩa học gây độc cho ngƣời và động vật. Ví dụ nhƣ: - Azobacterin là loại vi khuẩn cố định đạm, cĩ khả năng cung cấp một lƣợng lớn chất auxin, giberelin do đĩ để tăng năng suất cây trồng trong đĩ cĩ cây lúa, ngƣời ta sản xuất hàng loạt các vi khuẩn này để sản xuất phân bĩn cho đất màu mỡ gọi là phân sinh học Azotobacterin [4]. 15 - Nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều thực vật và là chủng nấm cĩ lợi, khi xử lý trên ruộng lúa thì khơng những gia tăng năng suất lúa mà cịn gia tăng khả năng kháng bệnh của cây lúa [10]. - Baculovirus gây nhiễm cho hơn 600 lồi cơn trùng khác nhau, vấn đề quan trọng là nĩ khơng gây nhiễm cho ngƣời, động vật và cả thực vật. Baculovirus cĩ tiềm năng nhƣ là tác nhân kiểm sốt sinh học đối với vật làm hại cơn trùng. Song thị trƣờng áp dụng cịn nhiều hạn chế, do đĩ địi hỏi phải cĩ nhiều hiểu biết hơn nữa để kiểm sốt sự biểu hiện gene của Baculovirus hy vọng mang đến nhiều lợi ích cho sản xuất vaccin và thuốc trừ sâu sinh học [4]. * Trong nuơi cấy mơ tế bào, điều kiện vơ trùng phải đƣợc đảm bảo tuyệt đối, và chíng điều kiện vơ trùng đã loại bỏ các mối tƣơng tác cĩ ích giữa thực vật và vi sinh vật. Cĩ rất nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành nhằm mục tiêu chọn lọc những chủng vi khuẩn cĩ tác động tốt tới sự phát triển của cây in vitro, cải thiện phẩm chất, phát triển khả năng trong chọn lọc giống cây trồng. Một vài nghiên cứu gần đây đã đề cập đến tác động của vi khuẩn Methylobacterrium sp. lên nhiều loại cây trồng. 2.5. Đặc điểm của chi Methylobacterium 2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại Chi Methylobacterium bao gồm nhiều lồi vi khuẩn cĩ sắc tố hồng dinh dƣỡng methyl tùy ý (pink- pigmented facultative methlotrophs, PPFM) [24], [53]. Chúng cĩ khả năng sử dụng các hợp chất chỉ chứa một nguyên tử carbon nhƣ formaldehyde, methanol hay các hợp chất chứa nhiều nguyên tử carbon làm nguồn cung cấp năng lƣợng và carbon cho quá trình sinh trƣởng [44]. Đa số các lồi đều cĩ khả năng phát triển trên mơi trƣờng nutrient agar, một số lồi cĩ khả năng tăng trƣởng trên mơi trƣờng cĩ bổ sung methylamine và chỉ cĩ một lồi cĩ khả năng sử dụng methan [34]. Lồi Methylobacterium đƣợc phân lập và mơ tả lần đầu tiên vào năm 1913 do Bassalik phân lập từ giun đất và đƣợc đặt tên là Bacillus extorquens. Mặc dù vi 16 khuẩn PPFM hiện diện rất phổ biến trong đất hay trên các sinh vật nhƣng trong một thời gian dài các vi khuẩn này khơng đƣợc phân lập và nghiên cứu nhiều. Vào những năm 1960, 1970 khi nghiên cứu tập trung vào con đƣờng đồng hĩa các hợp chất một cacbon thì nhĩm vi khuẩn dinh dƣỡng methyl đƣợc phân lập và nghiên cứu, trong đĩ tập trung vào các phƣơng thức biến dƣỡng năng lƣợng và những ứng dụng của nhĩm vi khuẩn này [34]. Năm 1974, Patt và các cộng sự phân lập đƣợc lồi vi khuẩn PPFM đầu tiên cĩ khả năng sử dụng methan. Lồi này sắp xếp vào một chi mới là Methylobacterium với tên lồi là Methylobacterium organophilum. Năm 1982, Green và Bousfield nhận thấy chủng Methylobacterium organophilum cĩ nhiều đặc điểm rất giống các lồi vi khuẩn PPFM đã đƣợc cơng bố trƣớc đây. Khi so sánh 140 đặc điểm sinh lý, sinh hĩa và hình thái của 149 chủng vi khuẩn PPFM với lịai M. organophilum cho thấy chúng tƣơng đồng hơn 70%. Do vậy, Green và Bousfield đã đề nghị sắp xếp các lồi vi khuẩn PPFM vào chi Methylobacterium [34]. Từ năm 1992 đến năm 2005 đã cĩ thêm 15 lồi Methylobacterium sp. mới phân lập và đặt tên. Trong đĩ, các lồi mới đƣợc xác định nhờ vào các đặc điểm sinh lý, sinh hĩa khác biệt và sự tƣơng đồng của trình tự rRNA giữa các lồi khác nhau [29], [48], [62]. Vị trí phân loại chi Mehtylobacterium trong giới vi sinh vật nhƣ sau: Giới: Bacteria Ngành: Proteobacterium Lớp: Alphaproteobacteria Bộ: Rhizobiales Họ: Methylobacteriaceae 17 2.5.2 Đặc điểm sinh thái Vi khuẩn Methylobacterium phân bố rộng rãi trong tự nhiên, chúng hiện diện trong nhiều mơi trƣờng khác nhau bao gồm: đất, đất bùn ao hồ, nƣớc sạch, nƣớc mƣa, khơng khí, bề mặt lá cây, nốt sần ở rễ thực vật, các loại hạt giống…[23], [29]. PPFM phân bố rộng rãi trên nhiều lồi cây, chúng đƣợc phân lập từ hơn 100 lồi thực vật từ địa tiền, rêu cho đến các lồi cây hạt trần và cây hạt kín [26]. Vi khuẩn PPFM là những vi khuẩn hiếu khí hồn tồn, do vậy các vi khuẩn này thƣờng đƣợc phân lập từ bất kỳ mơi trƣờng nƣớc sạch nào cĩ chứa oxy hịa tan. Ngồi ra, vi khuẩn PPFM cịn cĩ khả năng kháng với ion Cl- nên chúng vẫn hiện diện trong nƣớc sạch dùng trong sinh hoạt [32], [33]. Vi khuẩn PPFM thƣờng lan truyền qua khơng khí và cĩ khả năng thực hiện nhiều quá trình trao đổi chất khác nhau, trong một số điều kiện thuận lợi nhất định vi khuẩn PPFM cĩ khả năng lên men tạo ra các sản phẩm khác nhau. Do vậy, các vi khuẩn PPFM đang đƣợc sử dụng các sản phẩm cĩ giá trị sinh học, chẳng hạn nhƣ các hợp chất polyme sinh học [27], [34]. Hình 2.3: Methylobacterium sp. trên cây rêu (A), hình dạng tế bào vi khuẩn chụp qua kính hiển vi điện tử (B) [36] 18 2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hố Hầu hết các lồi vi khuẩn Methylobacterium sp. thƣờng cĩ hình que (0,8-1,0 x 1,0-0,8 μM). Vi khuẩn thƣờng nằm ở dạng tế bào đơn hay đơi hay đơi khi kết lại theo dạng hoa hồng (rosettes) [9]. Hình 2.4: Methylobacterium sp. chủng BJ001 nuơi cấy trên mơi trƣờng thạch LB (A) vào mơi trƣờng dịch thể LB (B) chụp qua kính hiển vi điện tử quét [22] Đa số các chủng đều cĩ khả năng di động nhờ một tiêm mao ở cực hay gần cực, tuy nhiên một vài lồi lại khơng cĩ khả năng di động. Đa số các lồi vi khuẩn Methylobacterium sp. là vi khuẩn Gram âm, một số cĩ Gram biến đổi. Vi khuẩn thƣờng tăng trƣởng chậm, khuẩn lạc thƣờng cĩ màu hồng đậm hay đỏ cam sáng, một số chủng khơng tăng trƣởng đƣợc trên mơi trƣờng nutrient agar. Sắc tố hồng của vi khuẩn khơng tan trong nƣớc, khơng phát sáng huỳnh quang và là hợp chất carotenoid, hấp thu bƣớc sĩng cực đại ở 473, 499 và 532 nm [29], [34]. Ở mơi trƣờng lỏng nuơi cấy tĩnh vi khuẩn tạo thành một lớp màng mỏng trên bề mặt, điều này cho thấy hầu hết các chủng là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Oxidase dƣơng tính yếu, catalase dƣơng tính hay âm tính tuỳ thuộc vào lồi vi khuẩn. Methylobacterium sp. là những vi khuẩn hố dị dƣỡng, cĩ khả năng sử dụng tùy ý các hợp chất methyl. Do vậy, tất cả các lồi đều cĩ khả năng tăng trƣởng trên mơi trƣờng cĩ bổ sung formaldehyde (ở nồng độ thấp), formate và methanol, một vài lồi cĩ khả năng sử dụng các hợp chất methylamine, chỉ cĩ một 19 lồi duy nhất là M. organophilum cĩ khả năng sử dụng methane làm nguồn cung cấp carbon và năng lƣợng [29], [34]. Nhiệt độ thích hợp dao động từ 25 đến 30oC, một số lồi vẫn cĩ thể sinh trƣởng ở nhiệt độ 37oC hay 51oC. Đa số các lồi đều tăng trƣởng ở pH trung tính, một số lồi phát triển ở pH=4, pH=10. Hầu hết các lồi đều nhạy cảm với các hợp chất kháng sinh nhƣ: kanamycin, gentamycin, streptomycin và tetracylin, trong đĩ chất kháng sinh tetracylin cĩ hoạt tính ức chế mạnh đối với vi khuẩn Methylobacterium sp. [34]. 2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp. 2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật Giữa cây và vi khuẩn cĩ quan hệ tƣơng hỗ, một số vi khuẩn cĩ lợi cho cây trồng vì chúng tham gia vào các chu trình sinh địa hố, cung cấp cho cây các chất dinh dƣỡng cần thiết. Vi khuẩn dinh dƣỡng methyl chiếm tỷ lệ lớn trong hệ vi sinh vùng lá của nhiều lồi cây. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc gây nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trƣờng nuơi cấy invitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật [39], [40]. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm vi khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn so với đối chứng (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh), ngay cả trên mơi trƣờng khơng cĩ vitamine [35]. 20 Hình 2.5: Sự tái sinh chồi của lồi cây thuốc lá chuyển gen ipt trên mơi trƣờng MS khơng bổ sung hormone sau một tháng nuơi cấy. (a): khơng bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays. (b): cĩ bổ sung vi khuẩn Methylovorus mays [39] Theo Maliti (2000), so với các vi khuẩn liên kết với thực vật khác thì vi khuẩn Methylobacterium sp. là lồi tồn tại lâu dài và chiếm tỉ lệ lớn nhất khi bề mặt lá đƣợc rửa sạch [46]. Holland và cộng sự (1994) đã đề cập đến việc khử trùng thơng thƣờng trong khâu chuẩn bị nuơi cấy mơ khơng loại trừ đƣợc Methylobacterium sp., dù đã xử lý với hypochlorite và cồn nhƣng các mơ sẹo phát sinh từ mẫu cấy này vẫn cĩ nguy cơ bị nhiễm PPFM [35]. Đây là nhĩm vi khuẩn rất phong phú và khơng gây bệnh thực vật. PPFM chiếm tỷ lệ lớn và cĩ mật độ từ 10 4 đến 107 đơn vị khuẩn lạc (cfu) trên mỗi gram trọng lƣợng tƣơi của mơ thực vật [35]. Chúng lây nhiễm qua hạt [26], ở hạt đậu nành khơ mật độ là 105 cfu/gram [35]. Tuy PPFM khơng tăng trƣởng nhanh nhƣ các vi khuẩn vùng lá khác trên mơi trƣờng giàu dinh dƣỡng nhƣng chúng vẫn cĩ khả năng cạnh tranh tạo khuẩn lạc trên lá. Một số tác giả cho rằng dinh dƣỡng methyl tuỳ ý ở PPFM là một phần lý do duy trì mối quan hệ giữa chúng với thực vật. Bằng cách sử dụng nguồn thức ăn khác thƣờng là methanol, PPFM cĩ thể loại bỏ chất độc này khỏi mơ thực vật 21 và cĩ đƣợc chỗ cƣ ngụ trong lá (mơi trƣờng chỉ thích hợp với một vài lồi vi khuẩn) [44], [50]. Bên cạnh tính phổ biến và tồn tại lâu dài, cịn nhiều bằng chứng cho thấy mặc dù PPFM thu nhận chất dinh dƣỡng từ cây chủ nhƣng khơng phải là mối quan hệ một chiều. Các vi khuẩn này sử dụng nguồn carbon và khống chất từ cây, đồng thời tham gia vào các quá trình sinh hố và chuyển hố quan trọng ở cây chủ. Methylobacterium sp. nổi bật vì nhiều đặc tính quan trọng nhƣ khả năng tổng hợp amino acid, PHB (Poly- -Hydrobutyrate); tổng hợp carotenoid, tăng cƣờng tạo hƣơng vị ở dâu tây; tăng khả năng nảy mầm của hạt; khả năng phân hủy các hợp chất 2,4,6-trinitrotoluene, nitramine…; khả năng phân hủy và chuyển hĩa một số cơ chất khơng cần thiết ở thực vật thành sản phẩm cĩ giá trị [35]. Chủng PPFM đầu tiên đƣợc Basile và cộng sự (1969) phát hiện kích thích sinh trƣởng ở cây địa tiền (Scapania nemorosa) trong điều kiện in vitro [9]. Kalyaeva và cộng sự (2000, 2003) phát hiện việc nhiễm vi khuẩn Methylovorus mays và Methylomonas methanica vào mơi trƣờng nuơi cấy in vitro tạo mối liên kết bền vững giữa vi khuẩn và mơ thực vật. Thuốc lá, cây lanh và khoai tây khi nhiễm khuẩn tăng trƣởng mạnh hơn (số chồi tăng, rễ phát triển mạnh) [39], [40]. Năm 1994, Holland và cộng sự cơng bố về khả năng tƣơng tác của vi khuẩn Methylobacterium sp. và cây đậu nành trong việc chuyển hố nickel [35]. Cây lúa (Oryza sativa) cũng là một loại cây cĩ mối quan hệ mật thiết với các vi khuẩn PPFM. Nhiều nhà nghiên cứu cũng đã chứng tỏ vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ tác động tích cực lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây lúa cả trong điều kiện in vitro lẫn in vivo. Maliti (2000) nghiên cứu, đánh giá ảnh hƣởng của một số chủng Methylobacterium sp. đối với sự tăng trƣởng và phát triển của cây lúa ở 3 mức độ: nuơi cấy mơ, cây con trong điều kiện in vitro và cây trƣởng thành trong mơi trƣờng nhà kính. Kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng 22 làm gia tăng tỷ lệ nảy mầm của hạt, tăng trọng lƣợng tƣơi, chiều cao cây mạ trong điều kiện in vitro [46]. Năm 2004, Madhaiyan và cộng sự cũng đã tiến hành các thí nghiệm gây nhiễm PPFM lên hạt lúa hay phun lên lá và kết quả cho thấy: vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ hoạt tính kích thích tăng trƣởng, gia tăng khả năng đẻ nhánh của lúa gĩp phần gia tăng năng suất lúa từ 22,1 đến 24,1%. Ngồi ra, các vi khuẩn Methylobacterium sp. cịn cĩ vai trị ức chế các chủng vi khuẩn gây bệnh trên cây lúa, gĩp phần làm giảm tỷ lệ cây bệnh từ 17,8-23,7%. Cơng trình của Madhaiyan và cộng sự (2004) cũng đã chứng tỏ mối tƣơng quan giữa khả năng kháng bệnh của cây lúa khi xử lý với vi khuẩn Methylobactreium sp. và sự gia tăng polyphenol oxidase trong cây [47]. Qua các kết quả khảo sát về ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobactreium sp. lên sự hình thành mơ sẹo ở cây thuốc lá và cây cúc cho thấy: vi khuẩn cĩ ảnh hƣởng khác nhau lên quá trình hình thành mơ sẹo ở các loại mơ hay các loại cây nuơi cấy. Đối với Chrysanthenum sp. vi khuẩn hạn chế sự hình thành mơ sẹo nhƣng kích thích sự hình thành phơi ở các mơ sẹo này, trong khi đĩ ở Nicotiana tabacum vi khuẩn lại ức chế quá trình hình thành mơ sẹo ở mơ phiến lá và mơ lĩng thân. Nhƣ vậy, vi khuẩn Methylobacterium sp. cĩ khả năng tác động lên quá trình biệt hĩa cơ quan ở thực vật. Ngồi vai trị tác động của vi khuẩn thì bản chất của mơ và lồi thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ quan của nuơi cấy invitro. Bên cạnh đĩ các kết quả thí nghiệm cịn cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium sp. cịn cĩ khả năng tăng cƣờng quá trình hình thành rễ ở P. fortunei và Chrysanthemum sp., so với đối chứng ở nghiệm thức cĩ bổ sung vi khuẩn mẫu cấy thành lập rễ sớm hơn, nhiều hơn [9]. Ngồi PPFM, cịn cĩ những nghiên cứu sử dụng các lồi vi khuẩn cĩ lợi khác nhƣ khảo sát sự tăng trƣởng và phát triển của cây hoa Cúc, cây hoa Bi Bi và cây Địa Lan cĩ sự hiện diện của Bacillus spp. trong nuơi cấy in vitro [5] cho kết quả: tuỳ theo từng loại cây mà Bacillus spp. cĩ tác dụng khác nhau nhƣ tăng chiều cao, số lƣợng rễ, trọng lƣợng tƣơi. Vi khuẩn Methanotropic cĩ ảnh hƣởng đến sự 23 hình thành callus của hạt lúa mì, gia tăng sự tạo rễ, đồng thời gia tăng sự tái sinh cây [40]. Với sự hiện diện của vi khuẩn Methylovorus mays trên mơi trƣờng nuơi cấy làm tăng khả năng tái sinh chồi của cây thuốc lá chuyển gen ipt [39]. Từ những kết quả này chứng tỏ giữa thực vật và vi sinh vật cĩ mối quan hệ tƣơng hỗ cĩ lợi tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển và tăng trƣởng của thực vật trong điều kiện in vitro và in vivo. 2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin Khơng chỉ cĩ thực vật mà vi sinh vật cũng cĩ thể tổng hợp auxin và cytokinin, đối với các vi khuẩn cĩ lợi và vi khuẩn tƣơng tác với thực vật thì đây cĩ thể là nguyên nhân kích thích cây phát triển. Omer và cộng sự (2004) đã khảo sát sự hiện diện của IAA trong mơi trƣờng chứa dịch nổi của PPFM bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp kết hợp với phân tích phổ NMR (Nuclear Mangnetic Radiation: cộng hƣởng từ hạt nhân) đã chứng tỏ vi khuẩn PPFM cĩ khả năng tổng hợp hormone thực vật là IAA [50]. Holland và cộng sự (1994) kiểm tra mối quan hệ giữa PPFM, cytokinin và sự phát triển của thực vật đã cho thấy PPFM cĩ ảnh hƣởng đến lƣợng cytokinin cĩ trong mơ tế bào thực vật [35]. 24 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thời gian : từ tháng 3/2006 đến tháng 7/2006 Địa điểm : phịng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Thí nghiệm đƣợc thực hiện trên giống lúa VĐ20 đƣợc cung cấp từ Cơng ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam. * Đặc tính nơng học Giống lúa VĐ 20: là giống lúa cao sản ngắn ngày, thời gian sinh trƣởng 95- 100 ngày, cây cao 85- 90 cm, năng suất 6- 8 tấn/ ha. Dạng hình khá, bơng to, ít lép, chín sớm, nhiễm bệnh vàng lá, chịu phèn trung bình. Hạt gạo thon dài, khơng bạc bụng, cơm thơm dẻo (Cơng ty cổ phần giống cây trồng Miền Nam). (a) (b) Hình 3.1: Giống lúa VĐ20: (a) hạt chƣa bĩc vỏ trấu, (b) hạt bĩc vỏ trấu 25 Chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. 1019 do phịng thí nghiệm sinh học phân tử - khoa Sinh học - trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên phân lập cung cấp. * Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hĩa của chủng 1019 [9] Đặc điểm hình thái, sinh lý Chủng 1019 là những vi khuẩn cĩ màu hồng, hình que ngắn, cĩ khả năng di động, Gram âm, nhiệt độ tăng trƣởng thích hợp từ 25-35oC Đặc điểm Chủng 1019 Màu sắc khuẩn lạc trên MMS Hồng nhạt Đƣờng kính khuẩn lạc 2-3 mm Hình dạng khuẩn lạc Trịn, lồi, nhầy, cĩ viền trắng bên ngồi Kích thƣớc tế bào 2-4 x 4-6 m Khả năng di động Cĩ Gram - pH thích hợp 5,8 ± 1 Nhiệt độ 25-35oC Hình dạng tế bào Dấu phẩy, phình to ở hai đầu Trong giới hạn nồng độ các chất điều hịa tăng trƣởng thực vật thƣờng sử dụng trong mơi trƣờng nuơi cấy mơ tế bào thực vật, thì nồng độ các chất điều hồ tăng trƣởng thực vật khơng ảnh hƣởng tới sự phát triển của chủng 1019, do vậy việc bổ sung hormone vào mơi trƣờng nuơi cấy thực vật sẽ khơng ảnh hƣởng đến sự tăng trƣởng của vi khuẩn. Chủng 1019 tăng trƣởng tối đa sau 30 giờ nuơi cấy do đĩ thời gian thích hợp để thu nhận sinh khối tế bào là từ 12 đến 32 giờ sau nuơi cấy. 26 7,5 8 8,5 9 9,5 10 10,5 11 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 h lo g (N /m l) Đồ thị 3: Đƣờng cong tăng trƣởng của chủng 1019 Đặc điểm sinh hĩa Chủng cĩ hoạt tính catalase dƣơng tính và hoạt tính oxidase yếu. Hợp chất Chủng 1019 Methylamine - Trimethylamine + Acetate + Citrate + L-Glutamate + D-Glucose + D-Xylose, L-arabinose + Fructose + Betaine + Tartrate + Serbacate + 27 Ethanol + Nutrient agar + Lactose + Sucrose + Chủng 1019 cĩ khả năng tổng hợp cytokinin và một lƣợng thấp auxin trên mơi trƣờng nuơi cấy mơ thƣc vật. 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu Thiết bị : tủ cấy vơ trùng, nồi hấp (autoclave), máy đo pH, cân phân tích, phịng nuơi cây… Dụng cụ : pince, kéo, dao cấy, chai nƣớc biển, bình tam giác, đĩa petri, đèn cồn… 3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuơi cấy Mẫu cấy : các hạt lúa giống VĐ20 Điều kiện nuơi cấy : mơi trƣờng trƣớc khi cấy đƣợc hấp khử trùng ở 121oC, áp suất 1atm trong thời gian 20 phút. Phịng nuơi cấy: - Cƣờng độ ánh sáng 2000 lux - Nhiệt độ : 27 ± 2oC - Ẩm độ 70%- 80% - Thời gian chiếu sáng : 16h/ngày 3.2.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn Chủng 1019 đƣợc giữ trong glycerol 10%, sau đĩ phân lập trên mơi trƣờng MMS + 1% methanol. 28 3.2.5 Mơi trƣờng nuơi cấy Mơi trƣờng nuơi cấy là mơi trƣờng cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962) (Phụ lục 1). Mơi trƣờng phân lập và làm thuần chủng 1019 là mơi trƣờng MMS (methanol mineral salts) (Phụ lục 2): Mơi trƣờng MMS đƣợc thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút, sau đĩ để nguội và bổ sung methanol vào mơi trƣờng với thể tích từ 0,1 đến 0,2%, mơi trƣờng rắn cĩ bổ sung agar 20g/l trƣớc khi hấp. Hầu hết các chủng PPFM đều khơng cần vitamine hay các nhân tố tăng trƣởng khác trong quá trình tăng sinh. Mơi trƣờng giữ giống chủng 1019 là mơi trƣờng Glycerol-Pepton Agar (Phụ lục 3). * Các mơi trường đều được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 20 phút. Các thành phần khác: - Đƣờng: 20g/l - Agar: 7g/l pH mơi trƣờng trƣớc khi hấp: 5,7 – 5,8 Các chất kích thích sinh trƣởng: - BAP (6- benzylamino purine) - NAA (α- naphthaleneacetic acid) 3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mơ sẹo) Các hạt lúa giống VĐ 20 sau khi khử trùng đƣợc cấy vào mơi trƣờng MS + 2 mg/l 2,4- D để tạo mơ sẹo [16]. 29 Khử trùng mẫu: Hạt lúa bĩc vỏ trấu Rửa xà bơng trong 5-10 phút Rửa sạch bằng nƣớc máy mang vơ tủ cấy Tráng bằng nƣớc cất vơ trùng Lắc cồn 70o trong 1 phút Lắc Javel (1 Javel:3 H2O) xấp mặt hạt đổ Javel Rửa bằng nƣớc cất vơ trùng 3 lần Gấp vào cấy Các mẫu cấy đƣợc đặt trong tối, nhiệt độ 27 ± 2oC, ẩm độ 72%. Theo dõi sự hình thành và phát triển của mơ sẹo sau 2, 3 tuần, sau đĩ sử dụng mơ sẹo làm vật liệu thí nghiệm. 30 Hình 3.2: Hạt lúa đã khử trùng trên mơi trƣờng tạo sẹo 3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn Nhân sinh khối vi khuẩn: vi khuẩn đƣợc cấy vào mơi trƣờng MMS (sử dụng phƣơng pháp đo OD để đạt mật độ 1010 tế bào/ml), lắc ở 37oC sau 87 giờ, sử dụng để bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm. 3.3.3 Nội dung thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí hồn tồn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại, tổng số mẫu ở mỗi nghiệm thức là 30 mẫu. * Xử lý số liệu: Phân tích thống kê: số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm MSTATC, sau đĩ dựa vào giá trị Prob trong bảng ANOVA để quyết định nên trắc nghiệm phân hạng hay khơng. Nếu cĩ, dùng trắc nghiệm LSD hoặc trắc nghiệm Ducan, ở mức độ tin cậy 0,01 để đánh giá kết quả thí nghiệm. 3.3.3.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: xác định lại nồng độ 2,4-D tốt nhất cho khả năng nhân sẹo ở giống lúa VĐ20. Theo Đồn Thị Phƣơng Thùy [6] cĩ sự khác nhau giữa nồng độ auxin thích hợp cho sự hình thành mơ sẹo và nồng độ auxin thích hợp cho sự tăng trƣởng mơ sẹo của các giống lúa khác nhau, ở thí nghiệm này thay đổi nồng độ 2,4-D để xác định lại nồng độ auxin thích hợp cho khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20. Mơi trƣờng nền (MTN): khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 1mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP, bổ sung nồng độ 2,4-D [6]. Mẫu cấy: mơ sẹo cĩ diện tích bằng nhau. NT1: MTN + 0 mg/l 2,4-D NT2: MTN + 1 mg/l 2,4-D 31 NT3: MTN + 2 mg/l 2,4-D NT4: MTN + 3 mg/l 2,4-D Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. 3.3.3.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ BAP/NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo. Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + bổ sung nồng độ BAP/NAA. Mẫu cấy: mơ sẹo NT1: MTN + 1 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA NT2: MTN + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA NT3: MTN + 1 mg/l BAP + 1mg/l NAA NT4: MTN + 2 mg/l BAP + 0,1 mg/l NAA NT5: MTN + 2 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA NT6: MTN + 2 mg/l BAP + 1mg/l NAA Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tạo chồi từ mơ sẹo, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: tỷ lệ mẫu tái sinh (%) = (số mẫu tái sinh / số mẫu cấy)*100 số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu 3.3.3.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: xác định nồng độ NAA tốt nhất lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo. 32 Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA. Mẫu cấy: mơ sẹo NT1: MTN + 0,5 mg/l NAA NT2: MTN + 1 mg/l NAA NT3: MTN + 1,5 mg/l NAA NT4: MTN + 2 mg/l NAA Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu: tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100 số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu 3.3.3.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mơ sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tạo mơ sẹo của giống lúa VĐ20. Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 2mg/l 2,4-D. Mẫu cấy: hạt lúa đã khử Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. 33 3.3.3.5 Thí nghiệm 5: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: Khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo. Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng + 0,5 mg/l BAP + 1 mg/l NAA, bổ sung nồng độ 2,4-D thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 1) Mẫu cấy: mơ sẹo cĩ diện tích bằng nhau. Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. 3.3.3.6 Thí nghiệm 6: “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo. Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ BAP/ NAA thích hợp (kết quả từ thí nghiệm 2) Mẫu cấy: mơ sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn 34 NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: tỷ lệ nảy chồi(%) = (số cây nảy chồi / tổng số cây)*100 số chồi trên mẫu = tổng số chồi / mẫu 3.3.3.7 Thí nghiệm 7 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo. Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng, bổ sung nồng độ NAA thich hợp (kết quả từ thí nghiệm 4) Mẫu cấy: mơ sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo ở các nồng độ nhiễm khuẩn khác nhau. Các chỉ tiêu: tỷ lệ ra rễ (%) = (số mẫu ra rễ / tổng số mẫu)*100 số rễ trên mẫu = tổng số rễ / mẫu 3.3.3.8 Thí nghiệm 8 : “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mơ sẹo của giống lúa VĐ 20” Mục tiêu thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh mơ sẹo của giống lúa VĐ20. 35 Mơi trƣờng nền: khống MS + 7g agar + 20g đƣờng. Mẫu cấy: mơ sẹo Cách thực hiện: mẫu đƣợc cấy vào chai nƣớc biển + bổ sung vào mơi trƣờng thí nghiệm với các nghiệm thức bổ sung 0; 0,5; 1; 1,5 ml dung dịch vi khuẩn. NT1: MTN + 0 ml dung dịch vi khuẩn + dung dịch tăng sinh MMS NT2: MTN + 0,5 ml dung dịch vi khuẩn NT3: MTN + 1 ml dung dịch vi khuẩn NT4: MTN + 1,5 ml dung dịch vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: theo dõi sự phát triển mơ sẹo sau khi cho nhiễm khuẩn ở các nồng độ khác nhau, 7 ngày theo dõi 1 lần. Các chỉ tiêu: theo dõi sự thay đổi trạng thái và kết cấu mơ sẹo: kích thƣớc, hình dạng, màu sắc. 36 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: “ Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mơ sẹo (cm) sau 4 tuần nuơi cấy Nghiệm thức 2,4-D (mg/l) BAP (mg/l) NAA (mg/l) Kích thƣớc mơ sẹo (cm) sau 4 tuần 1.1 0 0,5 1 0,91 c 1.2 1 0,5 1 0,63 a 1.3 2 0,5 1 0,78 b 1.4 3 0,5 1 0,71 ab * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 0,91 0,63 0,78 0,71 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 ,9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 Nghiệm thức cm Đồ thị 4.1: Kích thƣớc mơ sẹo sau 4 tuần nuơi cấy ở các nghiệm thức khác nhau 37 Sau 4 tuần nuơi cấy, theo bảng 4.1 cho thấy nghiệm thức (1.1) cĩ kích thƣớc mơ sẹo lớn nhất và cĩ sự khác biệt rõ rệt so với các nghiệm thức cịn lại. Sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Bên cạnh đĩ các mẫu mơ sẹo của nghiệm thức (1.1) cĩ mơ phát triển tốt, xốp, mơ sẹo sinh phơi và cĩ xuất hiện chồi, cịn các mẫu mơ sẹo của các nghiệm thức cịn lại tuy cĩ phát triển về kích thƣớc nhƣng mơ sẹo chuyển sang màu vàng nâu và cứng, ít cĩ khả năng tái sinh cây. Theo tác giả Đồn Thị Phƣơng Thuỳ [6], các dịng lúa khác nhau cĩ các đặc tính di truyền khác nhau vì vậy nhu cầu chất điều hịa tăng trƣởng thực vật cho sự hình thành và tăng trƣởng mơ sẹo là khác nhau. Cĩ lẽ, nồng độ auxin ngoại sinh trong nghiệm thức (1.1) là thích hợp, khơng cần bổ sung thêm 2,4-D vào mơi trƣờng, mơ sẹo của giống lúa VĐ20 vẫn tăng trƣởng và phát triển tốt hơn so với các nghiệm thức khác. Qua bảng 4.1, nghiệm thức (1.1) cho kết quả tốt nhất, do đĩ nghiệm thức này đƣợc chọn sử dụng cho thí nghiệm 4. Hình 4.1: Mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 0,5mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuơi cấy (1.1) 1 cm 38 Hình 4.2: Các mơ sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuơi cấy 4.2 Thí nghiệm 2: “ Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mơ sẹo Nghiệm thức BAP (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) 2 tuần 3 tuần 2.1 1 0,1 41,66 ab 58,33 ab 2.2 1 0,5 50 ab 66,66 ab 2.3 1 1 58,33 ab 58,33 ab 2.4 2 0,1 33,33 a 33,33 a 2.5 2 0,5 33,33 a 50,33 ab 2.6 2 1 66,66 b 75 b * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 1 cm (1.1) (1.2) (1.3) (1.4) 39 0 10 20 30 40 50 60 70 80 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Nghiệm thức Tỷ lệ (%) tuần 2 tuần 3 Đồ thị 4.2: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian Nhìn chung tỷ lệ tái sinh chồi khá cao. Theo kết quả thống kê, tỷ lệ tái sinh chồi của các nghiệm thức đều tăng chỉ cĩ ở 2 nghiệm thức (2.3) và (2.4) là khơng tăng, và nghiệm thức (2.6) cĩ tỷ lệ tái sinh cao nhất. Sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê (P>0,05). Từ kết quả bảng cho thấy, tỷ lệ nồng độ giữa BAP và NAA quá cao sẽ gây ức chế sự tái sinh chồi, nhƣ nghiệm thức (2.4) mơ sẹo khơng những tái sinh chồi ít mà một số mẫu bị đen khơng phát triển, do đĩ việc kết hợp thích hợp tỷ lệ nồng độ BAP và NAA sẽ giúp mơ sẹo tái sinh tốt. 40 Bảng 4.3: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến số chồi hình thành từ mơ sẹo Nghiệm thức BAP (mg/l) NAA (mg/l) Số chồi trên mẫu 2 tuần 3 tuần 2.1 1 0,1 1.16 ab 1,33 ab 2.2 1 0,5 1,75 ab 2,08 b 2.3 1 1 1,91 b 2,41 b 2.4 2 0,1 0,66 a 0,66 a 2.5 2 0,5 1,66 ab 2,16 b 2.6 2 1 1,91 b 2,5 b * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 Nghiệm thức Số ch ồi tuần 2 tuần 3 Đồ thị 4.3: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian 41 Số chồi hình thành ở mỗi nghiệm thức đều tăng theo thời gian. chỉ cĩ nghiệm thức (2.4) số chồi hình thành rất ít và khơng tăng (2,66). Ở nghiệm thức (2.3) mặc dù tỷ lệ tái sinh ở tuần thứ 3 khơng tăng so với tuần thứ 2 (bảng 4.2), nhƣng số chồi lại tăng rõ rệt, cĩ thể ở tỷ lệ nồng độ này ức chế sự tái sinh chồi nhƣng khơng ảnh hƣởng đến sự hình thành và phát triển của mẫu đã tái sinh. Sau 3 tuần, ở các nghiệm thức (2.2); (2.3); (2.5), (2.6) số chồi hình thành cĩ sự khác biệt so với các nghiệm thức cịn lại và so với tuần thứ 2. Sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Tỷ lệ Cyt/Aux cĩ ảnh hƣởng rất quan trọng, nĩ quyết định chiều hƣớng phát sinh hình thái của mơ nuơi cấy [6], do đĩ với tỷ lệ Cyt/Aux trong mơi trƣờng thích hợp sẽ kích thích sự tạo chồi của mơ sẹo. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trƣớc đây: hoạt động của một chất điều hồ tăng trƣởng phụ thuộc vào: - Sự cân bằng giữa các chất điều hồ tăng trƣởng thực vật trong mơ đích. - Loại mơ đích và trạng thái sinh lý của mơ đích. [3] Qua 2 bảng 4.2 và 4.3 cho thấy nghiệm thức (2.6) cho tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi hình thành cao nhất nên ta sẽ sử dụng kết quả nghiệm thức này cho thí nghiệm 6. 42 Hình 4.3: Mơ sẹo tái sinh chồi trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l NAA sau 5 tuần nuơi cấy Hình 4.4: Các mẫu mơ tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần nuơi cấy 1 cm (2.1) (2.2) (2.3) (2.5) (2.4) (2.6) 1 cm 43 4.3 Thí nghiệm 3: “ Ảnh hƣởng của nồng độ NAA lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.4: Ảnh hƣởng của nồng độ NAA đến tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ hình thành Nghiệm thức NAA (mg/l) Tỷ lệ tái sinh rễ (%) sau 2 tuần Số rễ trên mẫu sau 2 tuần 3.1 0,5 58,33 a 2,08 a 3.2 1 91,66 a 4,16 a 3.3 1,5 83,33 a 4,25 a 3.4 2 83,33 a 2,66 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 0 20 40 60 80 100 3.1 3.2 3.3 3.4 Nghiệm thức tỷ lệ (% ) 0 1 2 3 4 5 số rễ tỷ lệ rễ số rễ Đồ thị 4.4: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần 44 Theo bảng 4.4 cho thấy tỷ lệ tái sinh rễ rất cao, 3 nghiệm thức (3.2), (3.3), (3.4) cĩ sự khác biệt rõ ràng so với nghiệm thức (3.1), sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P>0,05). Nhƣ vậy nồng độ NAA cao sẽ kích thích sự tái sinh rễ tốt hơn. Ở nghiệm thức (3.4) cĩ tỷ lệ tái sinh rễ rất cao (83.33%) nhƣng số rễ trên mẫu lại thấp, cĩ thể ở nồng độ này kích thích sự tái sinh rễ từ mơ sẹo nhƣng lại hạn chế sự phát triển rễ từ mẫu tái sinh. Sau 4 tuần nuơi cấy ở 3 nghiệm thức (3.1), (3.2), (3.3), một số mơ sẹo xuất hiện chồi, cịn nghiệm thức (3.4) khơng cĩ chồi xuất hiện, cĩ thể do nồng độ NAA cao đã ức chế sự tạo chồi của mơ sẹo. Hai nghiệm thức (3.2), (3.3) đều cĩ tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ trên mẫu cao, khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê, nhƣng ở nghiệm thức (3.3) rễ phát triển nhiều và tốt hơn. Nên ta chọn kết quả của nghiệm thức (3.3) sử dụng cho thí nghiệm 7. Hình 4.5: Mơ sẹo tái sinh rễ trên mơi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần nuơi cấy 1 cm 45 Hình 4.6: Các mẫu mơ tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuơi cấy 4.4 Thí nghiệm 4: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên mơ sẹo của giống lúa VĐ 20” Bảng 4.5: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tạo sẹo của hạt lúa Nghiệm thức Vml dung dịch vi khuẩn Tỷ lệ tạo sẹo (%) 4.1 0 85,33 b 4.2 0,5 79,33 b 4.3 1 84,66 b 4.4 1,5 62,33 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 1 cm (3.1) (3.2) (3.3) (3.4) 46 85,33 79,33 84,66 62,33 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 4.1 4.2 4.3 4.4 Nghiệm thức tỷ lệ( % ) Đồ thị 4.5: Tỷ lệ tạo mơ sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần Nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức cĩ bổ sung vi khuẩn (4.2), (4.3) khơng cĩ sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê sinh học. Trong nghiệm thức cĩ bổ sung vi khuẩn cĩ lẽ nồng độ hormone do chủng 1019 tổng hợp khơng ảnh hƣởng nhiều đến tỷ lệ cân bằng Cyt/Aux trong mơi trƣờng nuơi cấy nên quá trình tạo mơ sẹo vẫn xảy ra, tuy nhiên tùy vào nồng độ khuẩn bổ sung mà cho tỷ lệ khác nhau. Nghiệm thức (4.2) cho tỷ lệ cao nhất và thấp nhất là nghiệm thức (4.4). Vì vậy, chủng 1019 khơng cĩ ảnh hƣởng đến khả năng tạo mơ sẹo của giống lúa VĐ20 so với đối chứng trên mơi trƣờng: MS + 2mg/l 2,4-D, và nồng độ khuẩn thích hợp cho mội trƣờng tạo sẹo trong các nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn là 1ml. Theo tác giả [9], Methylobacterium sp. hạn chế sự hình thành mơ sẹo ở Chrysanthemum sp. và ức chế sự hình thành mơ sẹo ở mơ phiến lá, lĩng thân ở Nicotiana tabacum; nhƣ vậy vi khuẩn cĩ ảnh hƣởng khác nhau lên quá trình hình thành mơ sẹo ở các loại mơ hay các lồi nuơi cấy khác nhau. 47 (a) (b) Hình 4.7: Sự tạo mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) cĩ bổ sung 1ml dung dịch khuẩn, (b) khơng cĩ bổ sung khuẩn sau 2 tuần nuơi cấy 4.5 Thí nghiệm 5: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng nhân sẹo của giống lúa VĐ20” Dựa vào kết quả thí nghiệm 1, mẫu đối chứng: mơi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l NAA và 1 mg/l BAP. Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến đƣờng kính mơ sẹo Nghiệm thức V dung dịch khuẩn (ml) Đƣờng kính mơ sẹo (cm) 3 tuần 4 tuần 5.1(Đ/chứng) 0 0,53b 0,66c 5.2 0,5 0,27 a 0,31 b 5.3 1 0,25 a 0,26 a 5.4 1,5 0,25 a 0,25 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 48 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 3 tuần 4 tuần kí ch th ướ c( cm ) 5.1(đ/c) 5.2 5.3 5.4 Đồ thị 4.6: Kích thƣớc mơ sẹo ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian Qua bảng 4.6, ta thấy cĩ sự khác biệt rõ rệt giữa nghiệm thức đối chứng với các nghiệm thức bổ sung khuẩn. Sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Trong các nghiệm thức đối chứng, sự phát triển của mơ sẹo tỷ lệ nghịch với thể tích dung dịch khuẩn bổ sung vào mơi trƣờng nuơi cấy, nồng độ khuẩn càng cao càng ức chế sự phát triển của mơ sẹo. Ở nghiệm thức (5.2) mơ sẹo cĩ gia tăng về kích thƣớc nhƣng khơng đáng kể, bên cạnh đĩ một số mơ sẹo cĩ sự xuất hiện chồi và rễ nhƣng khơng nhiều. Mặc dù, chủng 1019 khơng ảnh hƣởng đến sự hình thành mơ sẹo của giống lúa VĐ20 nhƣng nồng độ hormone mà khuẩn tổng hợp lại ảnh hƣởng đến nồng độ auxin cĩ trong mơi trƣờng tăng sinh ức chế mơ sẹo tăng trƣởng và phát triển so với mẫu đối chứng. Đối với sự tăng sinh mơ sẹo của giống lúa VĐ20, mơi trƣờng tốt nhất là mơi trƣờng đối chứng khơng bổ sung khuẩn (1mg/l BAP + 0,5mg/l NAA). 49 Hình 4.8: Sự tăng sinh mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP và 0,5mg/l NAA: (a) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (b) khơng bổ sung khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy Hình 4.9: Sự tăng sinh mơ sẹo trên mơi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (5.4) 1 cm (5.1) (5.2) (b) (a) 1 cm 50 4.6 Thí nghiệm 6: “Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20” Dựa vào kết quả thí nghiệm 2, mẫu đối chứng: mơi trƣờng MS bổ sung 2 mg/l BAP và 1mg/l NAA. Bảng 4.7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi hình thành từ mơ sẹo Nghiệm thức V dung dịch khuẩn (ml) Tỷ lệ tái sinh chồi (%) Số chồi trên mẫu 2 tuần 3 tuần 2 tuần 3 tuần 6.1(Đ/C) 0 66,66c 75c 1,66b 2,5c 6.2 0,5 16,66 b 41,66 b 0,25 a 0,58 b 6.3 1 0 a 0 a 0 a 0 a 6.4 1,5 0 a 0 a 0 a 0 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 66,66 75 16,66 41,66 0 00 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 3 tuần 4 tuần tỷ lệ (% ) 6.1(đ/c) 6.2 6.3 6.4 Đồ thị 4.7: Tỷ lệ tái sinh chồi ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian 51 1,66 0,25 0,58 0 00 0 2,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3 tuần 4 tuần Số ch ồi 6.1(đ/c) 6.2 6.3 6.4 Đồ thị 4.8: Số chồi hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau theo thời gian Theo kết quả cĩ sự khác biệt rõ rệt giữa nghiệm thức đối chứng với các nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn ở tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi hình thành từ mơ sẹo. Sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Tỷ lệ tái sinh và số chồi hình thành ở các nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn là rất thấp, ở nồng độ khuẩn cao (6.3), (6.4) khơng cĩ khả năng tái sinh chồi từ mơ sẹo. Nhƣ vậy, trên mơi trƣờng thích hợp cho mơ sẹo tái sinh chồi, chủng 1019 bổ sung vào mơi trƣờng đã làm thay đổi tỷ lệ các chất điều hồ tăng trƣởng thực vật, làm thay đổi chiều hƣớng biệt hĩa của mơ, ức chế sự tái sinh và hình thành chồi của mơ. Tuy nhiên đối với Nicotiana tabacum và Saintpaulia ionantha thì chủng 1019 lại cho kết quả ngƣợc lại, ở nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn cho tỷ lệ tái sinh chồi và số chồi hình thành cao hơn đối chứng, chứng tỏ ngồi vai trị tác động của Methylobacterium sp. thì bản chất của mơ và lồi thực vật cũng quyết định đến khả năng và chiều hƣớng phát sinh cơ quan trong nuơi cấy in vitro [9]. Đối với sự tái sinh chồi từ mơ sẹo của giống lúa VĐ20, mơi trƣờng tốt nhất là mơi trƣờng đối chứng khơng bổ sung khuẩn (2mg/l BAP + 1mg/l NAA). 52 Hình 4.10: Sự tái sinh chồi trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (6.2). Hình 4.11: Sự tái sinh chồi trên mơi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (6.4) 1 cm 1 cm 53 4.7 Thí nghiệm 7: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo” Dựa vào kết quả thí nghiệm 3, mẫu đối chứng: mơi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA. Bảng 4.8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 đến tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ trên mẫu Nghiệm thức V dung dịch khuẩn (ml) Tỷ lệ tái sinh rễ (%) sau 2 tuần Số rễ trên mẫu sau 2 tuần 7.1 (Đ/C) 0 83,33b 4b 7.2 0,5 91,66 b 6,33 c 7.3 1 16,66 a 1 a 7.4 1,5 0 a 0 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 0 20 40 60 80 100 7.1(đ/c) 7.2 7.3 7.4 Nghiệm thức tỷ lệ (% ) 0 1 2 3 4 5 6 7 số rễ tỷ lệ rễ số rễ Đồ thị 4.9: Tỷ lệ rễ tái sinh và số rễ hình thành trên mẫu ở các nghiệm thức khác nhau sau 2 tuần 54 Qua bảng 4.8 cho thấy sự khác biệt giữa nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn (7.2) với nghiệm thức đối chứng và nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn (7.3), (7.4), sự khác biệt này cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học (P<0,05). Nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn (7.2) cĩ tỷ lệ tái sinh rễ và số rễ hình thành từ mẫu tái sinh rất cao (91.66%), chứng tỏ rằng chủng 1019 cĩ tác động tích cực đến khả năng tái sinh và phát triển rễ của mơ sẹo. Tuy nhiên khi tăng thể tích khuẩn bổ sung vào mơi trƣờng nuơi cấy thì các tác động này giảm hẳn, cĩ thể do nồng độ khuẩn quá cao ảnh hƣởng khơng tốt đến khả năng tái sinh và phát triển của mơ sẹo. Theo các nghiên cứu của M. Maliti (2000), một số chủng Methylobacterium cĩ khả năng kích thích sự phát triển rễ cũng nhƣ kích thích sự sinh trƣởng rễ ở cây lúa nuơi cấy in vitro, điều này chứng tỏ Methylobacterium cĩ tác động tích cực đến chiều hƣớng biệt hố rễ của lúa [46]. Bên cạnh đĩ, theo tác giả [9] Methylobacterium sp. cịn tăng cƣờng quá trình thành lập rễ ở P. fortunei và Chrysanthemum sp.. Đối với khả năng tái sinh rễ từ mơ sẹo, trong các nghiệm thức bổ sung khuẩn thì nghiệm thức (7.2) là mơi trƣờng tốt nhất. Hình 4.12: Sự tái sinh rễ trên mơi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 0,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (7.2) 1 cm 55 Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên mơi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy (7.4) 4.8 Thí nghiệm 8: “ Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mơ sẹo của giống lúa VĐ20” Bảng 4.9: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên sự tăng sinh mơ sẹo sau 4 tuần nuơi cấy Nghiệm thức Vml dung dịch khuẩn Số chồi trên mẫu Số rễ trên mẫu Đƣờng kính mơ sẹo (cm) 8.1(Đ/C) 0 1,08c 5,41 b 0,71 b 8.2 0,5 0,83 b 5,5 b 0,68 b 8.3 1 0 a 6.25 c 0,75 b 8.4 1,5 0 a 0,35 a 0,33 a * Ghi chú: Trong cùng một cột, các giá trị trung bình cĩ kí tự theo sau giống nhau khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê (P>0,05). 1 cm 56 0 1 2 3 4 5 6 7 8.1 8.2 8.3 8.4 Nghiệm thức 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 kí ch th ướ c( cm ) số chồi số rễ kích thước sẹo Đồ thị 4.10: Số chồi, số rễ hình thành trên mẫu, kích thƣớc mơ sẹo ở các nghiệm thức khác nhau sau 4 tuần Qua bảng 4.9 cho thấy cĩ sự khác biệt rõ rệt về mặt thống kê sinh học (P<0,05) giữa các nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn với nghiệm thức đối chứng và giữa các nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn với nhau. Số chồi trên mẫu ở nghiệm thức bổ sung là nhiều nhất, nghiệm thức (8.2) cũng cĩ chồi hình thành nhƣng số lƣợng rất ít, các nghiệm thức cịn lại mẫu khơng tái sinh chồi, nhƣ vậy chủng 1019 ức chế sự tái sinh chồi từ mơ sẹo. Nhƣng bên cạnh đĩ, khuẩn lại kích thích sự tạo rễ ở nghiệm thức (8.3), số rễ hình thành ở nghiệm thức này nhiều hơn so với nghiệm thức đối chứng (sự khác biệt này khơng cĩ ý nghĩa về mặt thống kê sinh học, P>0,05), tuy nhiên rễ ở nghiệm thức đối chứng mọc dài và chắc hơn so với rễ cúa các nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn. Ở thí nghiệm 4, giữa các nghiệm thức cĩ sự khác biệt rõ ràng về sự phát triển kích thƣớc mơ sẹo, nhƣng ở thí nghiệm này khơng cĩ sự khác biệt về mặt thống kê sinh học giữa các nghiệm thức. Do đĩ, cĩ thể trên mơi trƣờng nuơi cấy khơng cĩ bổ sung các chất sinh trƣởng thƣc vật thì chủng 1019 khơng ảnh hƣởng đến sự phát triển mơ sẹo. Các mơ sẹo ở nghiệm thức 57 đối chứng ở dạng chắc, màu nâu vàng, cĩ khả năng tái sinh, cịn các mẫu mơ sẹo ở các nghiệm thức cĩ bổ sung khuẩn cĩ dạng xốp. Nhƣ vậy tuy khơng ảnh hƣởng đến kích thƣớc của mơ sẹo nhƣng Methylobacterium sp. ảnh hƣởng đến quá trình trao đổi chất, làm thay đổi trạng thái, cấu trúc của mơ sẹo. (a) (b) (c) (d) Hình 4.14: Sự tăng sinh mơ sẹo ở thí nghiệm 8 trên mơi trƣờng MS khơng bổ sung hormone: (a) khơng cĩ bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (c) bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuơi cấy. 1 cm 1 cm 1 cm 1 cm 58 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Từ các kết quả trên, chúng tơi cĩ một số kết luận nhƣ sau: - Chủng 1019 cĩ tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mơ sẹo. Chứng tỏ chủng khuẩn cĩ tác động đến quá trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hĩa của tế bào mơ sẹo, ảnh hƣởng đến sự phát sinh cơ quan của sẹo. Tuy khơng cĩ sự khác biệt rõ với đối chứng nhƣng chứng tỏ khuẩn cĩ khả năng tổng hợp một lƣợng cytokinin cho sự phát triển rễ của mơ sẹo, ảnh hƣởng đến tỷ lệ auxin/cytokinin cĩ trong mơi trƣờng dẫn đến sự thay đổi của mẫu so với đối chứng. - Chủng 1019 cĩ ảnh hƣởng đến quá trình phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20 , chiều hƣớng phát sinh cơ quan tuỳ thuộc vào bản chất của mơ cấy và lồi thực vật. - Nồng độ khuẩn cao sẽ ức chế hồn tồn mơ sẹo, khơng thấy đƣợc sự phát sinh cơ quan từ mơ sẹo. Nhƣ vậy, chủng 1019 cĩ khả năng ảnh hƣởng đến chiều hƣớng phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20, nhƣng khuẩn chỉ cĩ khả năng kích thích sự tái sinh rễ từ mơ sẹo nhƣng lại ức chế khả năng tái sinh chồi- sự tái sinh chồi là chiều hƣớng biệt hố quan trọng nhất, đƣợc áp dụng nhiều trong các phƣơng pháp chọn lọc giống, phƣơng pháp chuyển gen… trên cây lúa. Do đĩ ta cĩ thể kết luận rằng chủng 1019 khơng cĩ tác động tích cực lên sự phát sinh cơ quan của cây lúa. Tuy nhiên từ những kết quả mà các tác giả [9], [46] đã đạt đƣợc bằng việc sử dụng vi khuẩn Methylobacterium sp. trên thực vật, chúng ta cĩ thể tin tƣởng rằng Methylobacterium sp. sẽ là một lồi vi sinh vật tiềm năng tạo ra các cây giống in vitro cĩ phẩm chất tốt, gĩp phần làm tăng hiệu quả trong sản xuất nơng nghiệp. 59 5.2 Đề nghị Trong phạm vi đề tài này, do thời gian tiến hành cĩ hạn chúng tơi chỉ đạt đƣợc một số kết quả nhất định về sự phát sinh cơ quan của giống lúa VĐ20 dƣới sự tác động của Methylobacterium sp. trong điều kiện nuơi cấy in vitro, chƣa khảo sát đƣợc khả năng sống sĩt cũng nhƣ phát triển của các mẫu nhiễm khuẩn tái sinh trong giai đoạn vƣờn ƣơm để xác định rõ hơn nữa ảnh hƣởng của Methylobacterium sp. lên giống lúa này. Vì thế chúng tơi cĩ những đề nghị để củng cố thêm kết quả mà đề tài đạt đƣợc và hƣớng phát triển trong tƣơng lai: - Khảo sát ảnh hƣởng của Methylobacterium sp. lên sự tăng trƣởng của giống lúa VĐ20 trong giai đoạn vƣờn ƣơm. - Khảo sát ảnh hƣởng của các chủng Methylobacterium khác lên các giống lúa khác nhau để xác định chính xác hơn khả năng ảnh hƣởng của khuẩn lên cây lúa. - Bên cạnh đĩ khảo sát ảnh hƣởng của các chủng Methylobacterium khác nhau lên các đối tƣợng thực vật khác nhau để xác định chủng mạnh nhất và đối tƣợng mà khuẩn cĩ tác động tốt nhất. - Phân tích xác định rõ khả năng tổng hợp và hàm lƣợng các vitamine, enzyme, chất kích thích tăng trƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. để tìm hiểu rõ cơ chế tƣơng tác giữa vi khuẩn với thực vật. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Bùi Bá Bổng và Nguyễn Duy Bảy, 1997. Nghiên cứu biến dị soma trên giống lúa Một Bụi và Khao Dawk Mali 105. Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học Viện lúa Đồng bằng sơng Cửu Long. 2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 1995. Ứng dụng cơng nghệ sinh học trong cải tiến giống lúa (Giáo trình cao học nơng nghiệp). NXB Nơng nghiệp. 3. Bùi Trang Việt, 2000. Sinh lý thƣc vật đại cƣơng. Phần II: Phát triển. NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 4. Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tĩ (Biên soạn), 2006. Ứng dụng cơng nghệ trong sản xuất lúa. NXB Lao động Hà Nội. 5. Dƣơng Tấn Nhựt, Lê Thị Châu, Nguyễn Thị Thu Vân, Dƣơng Ngọc Hiệp, Phạm Thành Hổ, Phạm Thi Lệ Hà. Ảnh hƣởng của Bacillus spp. lên sự sinh trƣởng và phát triển của cây nuơi cấy in vitro. Hội nghị CNSH tồn quốc, Hà Nội, 2003. NXB Khoa học và Kỹ thuật. 6. Đồn Thị Phƣơng Thuỳ, 2001. Tìm hiểu một số đặc tính hình thái và sinh lý của mơ sẹo và dịch treo tế bào các dịng lúa Nàng Hƣơng, Trắng Hồ Bình và Bằng Ngọc (Oryza sativa L). Khĩa luận cử nhân khoa học. Đại học Khoa học Tự nhiên. 7. Đỗ Khắc Thịnh, 2003. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố canh tác và yếu tố mơi trƣờng đối với năng suất và phẩm chất lúa thơm ở đồng bằng sơng Cửu Long. Luận án Tiến sĩ Nơng Nghiệp, Đại học Nơng Lâm TPHCM. 8. Hiệp hội Lƣơng thực Việt Nam, 2003. Báo cáo Hội nghị tổng kết hoạt động năm 2002 và phƣơng hƣớng năm 2003. TPHCM, Việt Nam. 61 9. Kiều Phƣơng Nam, 2005. Phân lập, định danh và khảo sát sự tác động vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự phát sinh hình thái ở thực vật. Luận văn thạc sĩ sinh học. Đại học Quốc gia TPHCM. Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên. 10. Lƣu Hồng Mẫn và cộng sự, 2005. Quản lý rơm rạ trong ruộng lúa. 11. Mai Trần Ngọc Tiếng và Bùi Trang Việt, 1991. Giáo trình sinh lý thực vật. Tủ sách Đại học Tổng hợp TPHCM. 12. Nguyễn Vũ Hà Châu, 2005. Nhân giống invitro cây họ Zinnia (Zinnia elegans) và cây hoa Viola (Viola sp.). Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Nơng học. Đại học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 13. Nguyễn Đức Lƣợng (chủ biên)- Lê Thị Thủy Tiên, 2002. Cơng nghệ tế bào. NXB Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh 14. Nguyễn Đức Lƣợng. Cơng nghệ sinh học. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh. 15. Nguyễn Hữu Tâm, 1997. Khảo sát sự tạo mơ sẹo và bƣớc đầu thu nhận dịch treo tế bào cĩ khả năng sinh phơi từ hột lúa (Oryza sativa L.). Luận văn Thạc sĩ khoa học Sinh học. Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên. Đại học Quốc gia TPHCM. 16. Nguyễn Đức Thành, 2000. Nuơi cấy mơ tế bào thực vật – Nghiên cứu và ứng dụng. Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội. 17. Nguyễn Văn Uyển, 1993. Nuơi cấy mơ thực vật phục vụ cơng tác giống cây trồng. NXB Nơng Nghiệp TPHCM. 18. Phạm Hồng Hộ, 1972. Sinh học thực vật. Bộ giáo dục và Trung tâm học liệu. 19. Phạm Hồng Hộ, 1972. Thực vật chúng. NXB Giáo dục. 20. Trần Văn Minh, 1994. Nuơi cấy mơ, tế bào thực vật (plant cell and tissue culture). Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Cơng nghệ Quốc gia, Viện Sinh học nhiệt đới. 62 21. Trần Thị Bích Trinh, 2000. Sự tạo mơ sẹo và dịch treo tế bào ở dịng lúa Bằng Ngọc (Oryza sativa L.). Khố luận cử nhân khoa Sinh học Trƣờng Đại học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM. Tài liệu nƣớc ngồi 22. Abdoulaye Sy, Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., De Lajudie P., Prin Y., Neyra M., Gillis M., Boivin-Masson C., Dreyfus B., 2001. Methylotropic Methylobacterium bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes. Journal of Bacteriology. Vol. 183, No. 1, pp. 214- 220. 23. Anesti V., McDonald I. R., Ramaswamy M., Wade W. G., Kelly D. P., Wood A. P., 2005. Isolation and molecular detection of Methylotropic bacteria occurring in the human mouth. Enviromental Microbiology, Vil. 7, No. 8, pp. 1227-1238. 24. Austin B. and M. Goodfellow, 1979. “Pseudomonas mesophilica, a new species of pink bacteria isolated from leaf surfaces”. Int. J. Syst. Bacteriol. 25. Collin H. A and Edwards S., 1998. Plant tissue culture. Bios Scientific Publishers. 26. Corpe W.A and D.V Basile, 1982. “Methanol- utilizing bacteria associated with green plants”. Dev. Indust. Microbiol. 27. De Marco P., Pacheco C.C., Figueiredo A.R., Moradas-Ferreria P., 2004. “Novel pollutant-resistant methylotropic bacteria for use in bioremadiation”. FEMS Microbiology Letters, Vol. 234, pp. 75-80 28. Department of health and ageing office of the gene technology regulator, 2005. The biology and ecology of rice (O. sativa) in Australia. 29. Doronina N.V., Trotsenko Y.A, Kuzentsov B.B., Tourova T.P., Salkinoja- Salonen M.S., 2002. “Methylobacterium suomiense sp. nov. and Methylobacterium lusitanum sp. nov., aerobic, pink-pigmented, 63 facultatively methylotropic bacteria”. International Journal of Systemmatic and Evolutionary Microbiology, Vol. 52, pp. 773-776. 30. Eggum B. O., 1989. The nutrient value of rice in comparison with other cereals. In: Chemical aspects of grain quality. Manila, Philippine, IRRI, p. 83-90. 31. Gallego V., García T.M., Ventosa A., 2005. “Methylobacterium hispanicum nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from drinking water”. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp. 281-287. 32. Gallego V., García T.M., Ventosa A., 2005. “Methylobacterium hispanicum nov. and Methylobacterium aquaticum sp. nov., isolated from an aquatic enviroment” International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, Vol.55, pp. 281-287. 33. George E. F., 1993. Plant propagation by tissue culture. Part I: In practice. Exegetic limited. 34. Green P.N, 1992. “The Genus Methylobacterium”, pp. 2342-2345. In Ballows A., Tiper H.G., Dworkin M., Harder V.,Schleifer K.H (ed.) The Prokaryote, 2 nd ed., Springer-Verlag, Berlin. 35. Holland M.A., Polacco J.C., 1994. “PPFMs and other covert contaminants: is there more to plant physiology than just plant?”. Plant Physiology, Vol. 45, pp. 197-209. 36. Hornschuh M., Grotha R., Kutschera U., 2002. Epiphytic bacteria associated with the bryophyte Funaria hygrometrica: effects of Methylobacterium strains on protonema development. Plant biol (Stuttg) Vol. 4, pp. 682-687. 37. IRRI, 1994. Filling the world rice bowl. IRRI 1993-1994. Philippines Ishii, T., D. S. Brar, D. S. Multami and G. S Khush, 1994. Molecular tagging of genes for hph resistance and earliness introgressed from O. australiensis into cultivated rice, O.sativa. Canada Journal of Genome 37: 217-221. 64 38. IRRI, 2002. IRRI rice almanac, Third edition, Manila, Philippine, IRRI. P. 253. 39. Kalyaeva M. A., Zacharchenko N. S., Doronina N. V., Rukavtsova E. B., Ivanova E. G., Alekseeva V. V., Trotsenko Yu. A., Bur’yanov Ya. I., 2000. “Plant growth and morphogenesis in vitro is promoted by associative methylotropic bacteria”. Russian Journal of Plant Physiology, Vol. 48, No. 4, pp. 514-517. Translated from Fiziologiya Rastenii, Vol. 48, No. 4, pp. 596-599. 40. Kalyaeva M. A., Ivanova E. G., Doronina N. V., Zakharchenko N. S., Trotsenko Yu. A., Burryanov Ya. I., 2003. “Stimulation of wheat morphogenesis in vitro by Methanotropic bacteria”. Doklady Biological Sciences, Vol. 388, pp. 76-78. Translated from Doklady Akademii Nauk, Vol. 388, pp. 847-849. 41. Kim. K. K., 1986. Status of Korea biotechnology. In: Worshop biotechnology. Crop improvement: Potentionals and limatins. IRRI. Manila Philippines. 42. Khush. G. S and K. K. Jena, 1987. Gus fusion: β-glucunoridase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J.6: 3901-3907. 43. Kruse P. F, 1973. Tissue culture; Methods and application. Academic Press. p. 44. Lidstrom M.E., Chistoserdova L., 2001. “Plant in pink: cytokinin production by Methylobacterium”. Journal of bacteriology, Vol. 184, No. 7, pp. 1818. 45. Luo Z. and R. W, 1988. A simple method for the transformation of rice via the pollen tube pathaway. Plant Mol. Biol. Rept. 6: 165-174. 46. Maliti, Charles Mysyoki, 2000. “Physiological and biochemical effects of Methylobacterium sp. strains and foliar-applied methanol on growth and 65 development of rice Oryza sativa L”. Ph. D. thesis, The city University of New York, USA. 47. M.Maihaidan, S.Poonguhali, M.Senthilkumar, S.Seshadri, H.Chung, J.Yang, S.Sundaram and T.Sa,2004. “Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L)” by Methylobacterium spp. Bot. Bull. Acad. Sin. 48. McDonald I.R., Doronina N.V., Trotsenko Y.A., McAnulla C. and Murrel J. C., 2001. “Hyphomicrobium chloromethanicum sp. nov. and Methylobacterium chloromethanicum sp. nov, chloromethane-utilizing bacteria isolate from a polluted enviroment”. International Journal of Systemmatic and Evolutionary Microbiology, Vol. 51, pp. 119-122. 49. Narayanaswamy S. , 1994. “Plant cell and tissue culture”. Published by Tata McGraw – Hill Publishing Company Limited New Delhi. 50. Omer Z.S., Tombolini R., Gerhardson B., 2004. “Plant colonization by pink-pigmented faculative methylotrophic bacteria (PPFMs)”. FEMS Microbiology Ecology, Vol. 47, pp. 319-326. 51. Oono, K., 1981. Invitro methods applied to rice. P. 273-298 In: Plant Tissue culture. T. A thorpe (ed). Academic Press, New York. 52. Oono, K., 1983. Genetic variability in rice plants regenerated from cell culture. P. 95-104 in: Cell and Tissue culture technique for Cereal Crop Improvement IRRI. Manila-Philippines. 53. Patt T.E, G.C Cole and R.S Hanson, 1976. “Methylobacterium, a new genus of facultatively methylotropic bacteria”. Int. J. Syst. Bacteriol. 54. Pierik R. L. M, 1987. In vitro culture of higher plants. Martius Nijhoff Publishers, Dordecht, Netherlands. 55. Razdan M. K, 1993. An Introduction to Plant Tissue Culture. Raju Primlani for Oxford and IBH publishing Co. Pvt. Ltd. 66 56. Schaeffer, G. W. F Tescharpe and P. B. Cregan, 1984. Variation for improved protein and yield from rice anther culture. Theor. Appl. Genet 67: 383-389. 57. Shen. J., P. C. Ni and P. B. Cregan, 1981. Studied on rice varities to blast. Sci. Agric. Sin (3): 10-15. 58. Suenaga. K., R. Terada, T. Izawa and H. Fujimoto, 1989. Fertile transgenic rice plants regenerated from transformed protoplasts Nature 338: 274-276. 59. Torres K.C, 1989. Tissue culture technique for horticultural crops. Chapman and Hall. New York- London, America. 60. Toriyama. K., Y. Arioto, H. Uchimiya and K. Hinata, 1988. Transgenic rice plants after direct gene transfer into protoplasts. Biotechnology 6: 1072- 1074. 61. Uchimiya. H. T. Handa and D. S. Brar, 1989. Transgenic plants J. Biotechmology 12: 1-20. 62. Wood A.P., Kelly D.P., McDonald I.R, Jordan S.L., Morgan T.D., Khan S., Murrel J.C., Borodina E., 1998. “A novel pink-pigmented facultative methylotroph Methylobacterium thiocyanatum sp. nov., capable of growth on thiocyanate or cyanate as sole nitrogen sources”. Arch Microbiol, Vol. 169, pp. 148-158. 67 PHỤ LỤC Phụ lục 1 Mơi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) Khống đa lƣợng NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 Hàm lƣợng (mg/l) 1650 1900 440 370 170 Khống vi lƣợng H3BO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.4H2O KI Na2MoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Hàm lƣợng (mg/l) 6,2 22,3 8,6 0,83 0,25 0,025 0,025 Fe- EDTA FeSO4.7H2O NaEDTA Hàm lƣợng (mg/l) 27,8 37,3 Vitamin Morel Glycin Myo – Inositol Thiamin Pyridoxin Acid nicotine Hàm lƣợng (mg/l) 2 100 0,1 0,5 0,5 68 Phụ lục 2 Mơi trƣờng MMS (methanol mineral salts) Thành phần K2HPO4 KH2PO4 CaCl2.6H2O MgSO4.7H2O NaCl FeCl3.6H2O (NH4)2SO4 CuSO4.5H2O MnSO4.5H2O Na2MOO4.2H2O H2BO3 ZnSO4.7H2O CoCl2.6H2O Hàm lƣợng (mg/l) 1200 620 50 20 10 1 0,0005 0,005 0,01 0,01 0,01 0,07 0,005 Phụ lục 3 Mơi trƣờng Glycerol-Pepton Agar Thành phần mơi trƣờng Glycerol-Pepton Agar Agar 15g Glycerol 10g Peptone 10g Nƣớc cất vừa đủ 1000ml pH 7,0 69 Phụ lục 4 Phụ lục 4.1: Thí nghiệm 1 Analysis of Variance for ANH.kty - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- COVARIATES ANH.bdx .0563055 1 .0563055 27.378 .0034 MAIN EFFECTS A:ANH.dot .0007884 2 .0003942 .192 .8314 B:ANH.nt .0467431 3 .0155810 7.576 .0262 RESIDUAL .0102831 5 .0020566 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) .7163932 11 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for ANH.kty -------------------------------------------------------------------------------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean -------------------------------------------------------------------------------- GRAND MEAN 12 .7614583 .0130914 .7277950 .7951217 A:ANH.dot d1 4 .7668478 .0254613 .7013762 .8323194 d2 4 .7500000 .0226749 .6916934 .8083066 d3 4 .7675272 .0254613 .7020556 .8329988 B:ANH.nt t0 3 .9144248 .0507119 .7840236 1.0448260 t1 3 .6382473 .0299184 .5613147 .7151798 t2 3 .7805480 .0282532 .7078975 .8531985 t3 3 .7126132 .0319654 .6304170 .7948094 -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for ANH.kty by ANH.nt -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95 Percent Duncan Level Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- t1 3 .6382473 X t3 3 .7126132 XX t2 3 .7805480 X t0 3 .9144248 X -------------------------------------------------------------------------------- contrast difference t0 - t1 0.27618 * t0 - t2 0.13388 * 70 t0 - t3 0.20181 * t1 - t2 -0.14230 * t1 - t3 -0.07437 t2 - t3 0.06793 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Phụ lục 4.2: Thí nghiệm 2 * Tỷ lệ tái sinh chồi sau 2 tuần nuơi cấy Analysis of Variance for ANH1.tyle - Type III Sums of Squares -------------------------------------------------------------------------------- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level -------------------------------------------------------------------------------- MAIN EFFECTS A:ANH1.dot 902.7778 2 451.38889 1.857 .2061 B:ANH1.nt 2777.7778 5 555.55556 2.286 .1246 RESIDUAL 2430.5556 10 243.05556 -------------------------------------------------------------------------------- TOTAL (CORRECTED) 6111.1111 17 -------------------------------------------------------------------------------- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for ANH1.tyle -------------------------------------------------------------------------------- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean -------------------------------------------------------------------------------- GRAND MEAN 18 47.222222 3.6746546 39.032398 55.412047 A:ANH1.dot d1 6 54.166667 6.3646885 39.981475 68.351859 d2 6 50.000000 6.3646885 35.814808 64.185192 d3 6 37.500000 6.3646885 23.314808 51.685192 B:ANH1.nt t1 3 41.666667 9.0010287 21.605776 61.727557 t2 3 50.000000 9.0010287 29.939109 70.060891 t3 3 58.333333 9.0010287 38.272443 78.394224 t4 3 33.333333 9.0010287 13.272443 53.394224 t5 3 33.333333 9.0010287 13.272443 53.394224 t6 3 66.666667 9.0010287 46.605776 86.727557 -------------------------------------------------------------------------------- Multiple range analysis for ANH1