Luận văn Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn e. coli dh5α

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  BÙI THỊ THANH TỊNH HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  HOÀN THIỆN QUY TRÌNH BIẾN NẠP ĐOẠN DNA VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN E. coli DH5α Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN BÙI THỊ THANH TỊNH NIÊN KHÓA: 2002-2006 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY,HCHC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY  COMPLETING PROTOCOL OF TRANSFORMATION DNA FRAGMENTS INTO E.coli DH5α BACTERIAL CELLS GRADUATION THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor Student Dr. LE ĐINH ĐON BUI THI THANH TINH TERM: 2002 - 2006 HCMC, 09/2006 i LỜI CẢM ƠN Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, anh chị và ngƣời thân luôn là chỗ dựa vững chắc về tinh thần và vật chất cho con. Em vô cùng biết ơn thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài. Em xin gửi lời cảm ơn đến: Ban giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập vừa qua. Ban giám đốc Trung tâm Phân Tích Hóa Sinh - Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp. Anh Nguyễn Văn Lẫm đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài Các anh, chị và các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105, 118 - khu Phƣợng Vỹ Trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi. Và cuối cùng là các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã luôn đồng hành, chia sẻ vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài. TP. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006 Bùi Thị Thanh Tịnh ii TÓM TẮT BÙI THỊ THANH TỊNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, “Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α”, đƣợc thƣc hiện tại Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh và Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Giáo viên hƣớng dẫn: thầy Lê Đình Đôn. Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 02 năm 2006 đến tháng 08 năm 2006 với các nội dung: Hoàn thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp theo phƣơng pháp sử dụng hoá chất. Hoàn thiện quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α.. Hoàn thiện quy trình chiết tách plasmid, phản ứng cắt plasmid để kiểm tra. Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ phản ứng PCR và plasmid sau khi cắt. Thiết lập phản ứng chèn đoạn DNA vào plasmid pBluescript. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: Thiết lập đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hoá chất, tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng. Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E. coli DH5α. Chiết tách plasmid không lẫn tạp theo quy trình của Sambrook và cộng sự có sửa đổi. iii MỤC LỤC Trang Lời cảm ơn ................................................................................................................... i Tóm tắt ........................................................................................................................ ii Mục lục ......................................................................................................................iii Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................ vii Danh sách các hình ................................................................................................... vii Danh sách các bảng ................................................................................................... ix PHẦN 1. MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1 1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu của đề tài................................................................................................ 2 1.3 Nội dung thực hiện ............................................................................................... 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3 2.1 Hiện tƣơng biến nạp ở vi khuẩn ........................................................................... 3 2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp ................................................................ 3 2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp ................................ 3 2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5 2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp ................................................................... 5 2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp .............................................................. 5 2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp ..................................................... 6 2.2.1 Khái niệm chung các vector ......................................................................... 6 2.2.2 Plasmid ......................................................................................................... 7 2.2.2.1 Cấu trúc ............................................................................................... 7 2.2.2.2 Tính chất của plasmid .......................................................................... 8 2.2.2.3 Phân loại plasmid ................................................................................ 8 2.2.3 Phage ............................................................................................................ 9 2.2.4 Chủng chủ E.coli .......................................................................................... 9 2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp ......................................................................... 10 2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) ..................................................................... 11 iv 2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn ........................................................................... 11 2.3.1.2 Tên gọi các RE .................................................................................. 11 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn .................................................................... 12 2.3.1.4 Các RE loại II .................................................................................... 12 2.3.2 Các enzym thông dụng khác ...................................................................... 15 2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) ........................................................ 15 2.3.2.2 Taq polymerase ................................................................................. 15 2.3.2.3 Terminal transferase .......................................................................... 15 2.3.2.4 Các DNase ......................................................................................... 15 2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa ......................................................... 16 2.3.3 Các enzym nối DNA .................................................................................. 16 2.3.3.1 E.coli DNA ligase .............................................................................. 16 2.3.3.2 T4 DNA ligase ................................................................................... 16 2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp .......................................................... 17 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 17 2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp ................................................................ 17 2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp ............................................................... 18 2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp ................... 18 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid ............................................................................ 19 2. 5 Điện di (Electrophoresis) ................................................................................... 19 2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc .................................. 20 2.6.1 Ngoài nƣớc ................................................................................................. 20 2.6.2 Trong nƣớc ................................................................................................. 21 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................. 22 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp ....................................... 22 3.2 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 22 3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α............................................................................... 22 3.2.2 pBluescript II SK(+/-) ................................................................................ 22 3.2.3 Đoạn DNA ................................................................................................. 23 3.3 Dụng cụ và hóa chất ........................................................................................... 23 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm .................................................................................... 23 v 3.3.2 Các thiết bị máy móc ................................................................................. 23 3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn ...................................................... 23 3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm ................................................... 24 3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm ...................................................... 24 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 25 3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ....................................... 25 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E.coli DH5α và kiểm tra .......................................................................... 26 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E.coli DH5α trên môi trƣờng LB ............................... 27 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp ............................................................................. 27 3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) ................................. 27 3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra ............................... 29 3.4.6.1 Chiết tách plasmid ............................................................................. 29 3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) ...................................... 32 3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose ..................................................... 32 3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR .................................. 33 3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA ............................................................. 33 3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel ........................................................ 33 3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX ................... 34 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR ............................... 35 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) ................................................ 36 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) ............ 37 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 38 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn .......................................... 38 4.2 Tách chiết DNA plasmid .................................................................................... 40 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid ........................................................................... 40 vi 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit ..................... 42 4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV ................................... 42 4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII ................................ 44 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA.................................................................................. 44 4.4.2 Tinh sạch plasmid ...................................................................................... 45 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp ................................................................................ 46 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp ............................................................................. 46 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................. 48 5.1 Kết luận ............................................................................................................... 48 5.2 Kiến nghị ............................................................................................................ 49 vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT bp base pair CFU Colony Form Unit DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 3’- Deoxyribonucleoside- 5’- triphosphate ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactoside MCS Multiple cloning Site OD Optical Density PCR Polymerase Chain Reaction RE Restriction Enzyme RNA Ribonucleic acid RFLP Restriction fragment length polymorphism SDS Sodium dodecyl sulfate TAE Tris Acetate EDTA Taq Thermus aquaticus Kb kilobase dATP deoxyadenosine triphosphate dGTP deoxyguanosine triphosphate dCTP deoxycytidine triphosphate dTTP deoxythymidine triphosphate Tris- HCL (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride UV Ultraviolet (light) X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D- glactopyranoside viii DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp .................................................................. 6 Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning ........................................................ 8 Hình 2.3 Hình thái của Escherichia coli ................................................................. 10 Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn ................................................................. 13 Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA ................................. 35 Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5 ............................ 38 Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5 .............................. 39 Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1) ............................ 41 Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2) ......................... 41 Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1% ................................................... 42 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1) ................................................................. 42 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2) ........................ 43 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% ................. 43 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% .................... 43 Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX ............................................. 45 Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX ....................................................... 45 Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1% ................................ 46 Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) .................................................................... 55 Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-) ......................................................... 56 ix DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) ......................... 23 Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. Coli ........................ 25 Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra ...................................................................... 26 1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Ngày nay với sự phát triển nhƣ vũ bão của khoa học công nghệ, đặc biệt trong đó công nghệ sinh học là lĩnh vực đã đạt đƣợc những thành quả quan trọng và hứa hẹn đem lại những lợi ích vô cùng to lớn trong tƣơng lai cho con ngƣời. Các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc chuyển gen để tăng năng suất cây trồng, tạo ra những giống mới có tính năng vƣợt trội. Tuy nhiên, việc nghiên cứu và phân tích ở mức phân tử DNA thƣờng gặp khó khăn lớn về số lƣợng và độ tinh sạch của DNA trong mẫu thí nghiệm. Để giải quyết vấn đề này, khi nghiên cứu trình tự của một đoạn DNA về sự hoạt động của gen, sự biểu hiện ra protein và cấu trúc của protein, ngƣời ta chú trọng tới việc phân lập và thu nhận đoạn DNA quan tâm và tiến hành tạo ra bản sao với số lƣợng lớn để tiến hành nghiên cứu. Mặc khác, bộ gen của sinh vật thì rất lớn và phức tạp mà trình tự gen chúng ta quan tâm thƣờng chỉ có một hay hai bản sao trong mỗi tế bào. Vì vậy chúng ta không thể sử dụng các phƣơng pháp sinh hoá thông thƣờng để phân lập gen mục tiêu trên bộ gen. Những vấn đề trên có thể đƣợc giải quyết khi ta sử dụng các cấu trúc DNA có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ để làm phƣơng tiện mang gen, biến nạp gen, tăng bản sao của gen, biểu hiện gen hay các thao tác khác trên gen. Các cấu trúc DNA dùng cho mục tiêu này gọi là vector. Việc biến nạp DNA tái tổ hợp vào một tế bào thích hợp sẽ cho phép vector có khả năng tồn tại ổn định và sao chép độc lập với bộ gen của tế bào. Tế bào có khả năng tiếp nhận vector tái tổ hợp gọi là tế bào chủ. Tế bào chủ thƣờng đƣợc chọn lọc và cải tạo để tạo thành các chủng chủ có kiểu gen và các đặc tính thuận lợi cho các thao tác trên gen. Chủng chủ mang vector tái tổ hợp gọi là dòng tái tổ hợp. Dòng tái tổ hợp đƣợc phân lập để lƣu trữ DNA tái tổ hợp hoặc dùng cho các thao tác trên gen. Toàn bộ quá trình trên gọi là tạo dòng DNA hay DNA cloning. Mục đích của tạo dòng nhằm thu đƣợc số lƣợng lớn và tinh khiết các trình tự DNA hay thu nhận một dòng tế bào có khả năng biểu hiện gen mục tiêu. Xuất phát từ những khó khăn trong thực tế nghiên cứu và trên nền tảng kiến thức về kĩ thuật di truyền đƣợc tiếp thu trong quá trình học tập, chúng tôi tiến hành 2 thực hiện đề tài “ Hoàn thiện quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” phát triển từ đề tài: “Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” do Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng đại học Nông Lâm TPHCM thực hiện. 1.2 Mục tiêu của đề tài Hoàn thiện quy trình chèn một đoạn DNA bất kỳ vào plasmid pBluescript và chuyển plasmid tái tổ hợp này vào tế bào kí chủ E. coli DH5α. 1.3 Nội dung thực hiện - Nuôi cấy tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. - Thiết lập qui trình chuẩn bị tế bào khả nạp sử dụng hóa chất. - Thiết lập phƣơng pháp biến nạp plasmid DNA chƣa tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α bằng hóa chất và sốc nhiệt. - Phƣơng pháp tách chiết plasmid chƣa tái tổ hợp bằng SDS-kiềm thể biến nạp, kết hợp với phản ứng cắt enzyme giới hạn để kiểm tra. - Chuẩn bị đoạn DNA để chèn. - Cắt và tinh sạch vector. - Phản ứng sữa chữa sai sót trên đoạn DNA từ sản phẩm PCR chèn, nhằm tạo ra đoạn DNA có đầu bằng. - Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid sau khi cắt bằng enzyme giới hạn - Phản ứng nối giữa vector và DNA chèn. - Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào. - Kiểm tra thể biến nạp trên môi trƣờng có chứa Ampicillin, X-gal, IPTG. 3 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiện tƣợng biến nạp ở vi khuẩn 2.1.1 Giới thiệu về hiện tƣợng biến nạp Biến nạp là phƣơng pháp đơn giản nhất hiện có để đƣa DNA tái tổ hợp vào trong tế bào. Trong trƣờng hợp các tế bào E. coli thì biến nạp có nghĩa là đƣa DNA plasmid vào trong tế bào. Biến nạp còn đƣợc sử dụng với nghĩa rộng hơn, cụ thể là đƣa bất kỳ DNA nào vào bất kỳ tế bào nào. Lần đầu tiên biến nạp ở vi khuẩn đƣợc Frederick Griffith mô tả vào năm 1928 trong thí nghiệm nổi tiếng của ông về cái gọi là “nguyên lí biến nạp”. Trên thực tế phát minh này về sau đã chứng minh rằng các gen đƣợc cấu thành từ DNA. Tuy nhiên không phải tất cả vi khuẩn đều biến nạp một cách dễ dàng. Để cho biến nạp ở E. coli có hiệu quả, các tế bào cần trở nên khả biến (competent). Để đạt đƣợc điều này, ngƣời ta ngâm các tế bào trong dung dịch calcium chloride lạnh đông đá, khi đó các tế bào trở nên khả biến theo một cách mà cho đến nay chƣa rõ nguyên nhân. Việc biến nạp các tế bào khả biến đƣợc thực hiện bằng cách trộn DNA plasmid với các tế bào, rồi ủ trong đá 20 đến 30 phút, sau đó tạo một sốc nhiệt ngắn (2 phút ở 420C), làm nhƣ vậy DNA sẽ chui vào tế bào. Các tế bào biến nạp thƣờng đƣợc ủ trong nƣớc thịt dinh dƣỡng ở 370C trong vòng 60 đến 90 phút để làm cho các plasmid ổn định và biểu hiện các tính trạng của chúng ra kiểu hình. Sau đó, các tế bào đƣợc đƣa lên môi trƣờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmid (Lê Đình Lƣơng, 2001). 2.1.2 Cơ sở sinh hóa và tế bào học của hiện tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp đòi hỏi sự thể hiện của gen mã hóa cho những thành phần mà DNA gắn vào, sau đó sẽ đƣợc hấp thụ. Trong tự nhiên, khi nồng độ các chất dinh dƣỡng hay nồng độ oxy giảm đến mức tối thiểu ảnh hƣởng đến sự sống của vi khuẩn, lúc này tế bào sẽ bị thay đổi về cấu trúc cũng nhƣ đặc tính sinh lý sinh hóa, màng tế bào bị biến tính dẫn đến sự hình thành các kênh vận chuyển dạng lỏng, DNA sẽ theo các kênh này đi vào nhờ việc tiếp xúc với màng và nhận đƣợc sự hỗ trợ của hệ thống vận chuyển bên trong tế bào. Hệ thống vận chuyển này đƣợc hình thành trên cơ sở enzym gây biến tính một số protein màng. Enzym ComC có bản chất là một peptidase phân cắt protein ComG 4 của màng tế bào làm cho nó không còn tính trọn vẹn của một protein màng, từ đó chúng đƣợc hoạt hoá. Có 7 protein cùng dạng với ComG, tất cả chúng đều có thể tạo ra cấu trúc cho phép DNA tiếp cận với ComEA. ComEA là thể nhận để DNA đi vào tế bào. ComEC có thể tạo ra kênh vận chuyển dạng dịch và qua đó DNA đi vào tế bào (Leendert W.Hamoen và cộng sự, 1998). ComFA là một dạng helycase có chức năng phối hợp với ComEA và ComEC để đƣa sợi DNA mạch đơn vào tế bào. Trong quá trình chuyển nạp sợi DNA mạch đôi bám vào đầu Carboxyl của ComEA và đƣợc phân ra thành những đoạn dƣới tác động của endonuclease (hiện nay đã xác định đó là NucA), phần đầu cuối mới đƣợc cắt ra này đƣợc đƣa tới ComEC và ComEA để chúng vận chuyển vào tế bào. Sự phiên mã của gen “late competence” mã hoá cho bộ máy gắn kết và hấp thụ DNA (ComC, ComE, ComF, ComG) cũng nhƣ các yếu tố cần cho sự tái tổ hợp (recA, addAB) đòi hỏi một yếu tố có khả năng kích hoạt sự phiên mã. ComK là yếu tố hoạt hoá sự phiên mã. ComK đƣợc điều chỉnh chính xác sự biểu hiện của nó. Sự biểu hiện của ComK đƣợc quy định bởi một mạng lƣới phức tạp bao gồm AbrB, ComA, sinR và MecAB. Trong các thí nghiệm thực hiện năm 1998, Leendert W.Hamoen và cộng sự đã chỉ ra rằng ComK nhận biết một vùng trình tự ngắn giàu A/T, đƣợc sắp xếp trong một khung đọc đặc trƣng và linh động dọc theo sợi xoắn DNA. Phân tích footfrinting các gốc hydroxyl của ComK bám vào addAB promoter cho phép họ kết luận rằng ComK bám vào vùng trình tự giàu A/T AAAAN5TTTT. ComK đƣợc điều hoà âm bởi sự bám vào của AbrB và CodY, đƣợc hoạt hoá dƣơng bởi AbrB, sinR, DegU. CodY là một GTP-binding protein nhạy cảm với nồng độ GTP nội bào nhƣ là một chỉ thị về dinh dƣỡng, nó điều hoà sự phiên mã ở phần đầu phare ổn định và sự phiên mã của gen quy định sự hình thành bào tử. Từ đó, cho phép tế bào thích nghi với những giới hạn về dinh dƣỡng. DegU giúp cho ComK bám chặt hơn vào ComK promoter, điều này đảm bảo sự phiên mã chính xác ngay cả khi nồng độ ComK thấp. 5 2.1.3 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp Tế bào vi khuẩn có thể cho DNA xâm nhập vào tế bào đƣợc là do trong một giai đoạn tăng trƣởng nào đó của tế bào, trên bề mặt của tế bào có hiện diện những điểm tiếp nhận đặc biệt gọi là nhân tố dung nạp (competent factor). Nhân tố này có khả năng tiếp nhận đoạn ngắn DNA từ môi trƣờng bên ngoài để đƣa vào bên trong tế bào vi khuẩn, nhờ đó xảy ra tái tổ hợp. Muốn thực hiện sự biến nạp cần phải có 2 điều kiện: (1) Phải có trong môi trƣờng các đoạn DNA, (2) Khả năng dung nạp DNA của vi khuẩn nhận. Không phải tất cả các vi khuẩn đều nhận DNA vào nhƣ nhau, mà cần phải sử dụng một số chất để tạo lỗ trên vách tế bào, giúp sự xâm nhập dễ dàng của DNA nhƣ: CaCl2 50mmol, LiCl. Quá trình biến nạp gồm 5 giai đoạn: - Sự tiếp xúc của DNA lạ với tế bào nhận - Sự xâm nhập của DNA vào tế bào nhận - Sự liên kết của DNA lạ với đoạn tƣơng đồng của nhiễm sắc thể tế bào nhận - Sự đồng hóa phân tử DNA lạ vào DNA của tế bào nhận nhờ tái tổ hợp - Sự nhân lên của nhiễm sắc thể có DNA biến nạp 2.1.4 Vai trò của hiện tƣợng biến nạp Hiện tƣợng biến nạp giúp các loài vi khuẩn có thêm các tính trạng mới dễ thích nghi với môi trƣờng sống. Đó là cơ sở của tiến hóa và đa dạng vi sinh vật. 2.1.5 Ứng dụng của hiện tƣợng biến nạp Biến nạp DNA vào vi khuẩn là bƣớc đầu trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Kỹ thuật tái tổ hợp cho phép chuyển một gen từ động vật, cây trồng vào vi khuẩn và ở đó một lƣợng lớn sản phẩm mong muốn của gen sẽ đƣợc tạo ra, sau đó kết hợp với các phƣơng pháp chiết xuất và tinh sạch để phục vụ cho mục đích của con ngƣời. Biến nạp gen vào vi khuẩn còn giúp thực hiện những nghiên cứu khác nhƣ đọc trình tự gen, kiểm tra đa dạng sinh học, hay bảo quản sự ổn định của đoạn gen đƣợc dễ dàng. 6 2.2 Các vector và chủng chủ dùng trong biến nạp 2.2.1 Khái niệm chung các vector Vector có bản chất là DNA, thƣờng dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mƣợn bộ máy tế bào của vi khuẩn để tạo ra nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu. Một vector cần có các đặc điểm tiêu chuẩn nhƣ sau: - Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không phụ thuộc sự sao chép bộ gen tế bào chủ. - Có những đặc tính cho phép phát hiện dễ dàng tế bào vi khuẩn có chứa chúng. Các đặc tính này thƣờng đƣợc mã hoá bởi các gen chọn lọc. Thông thƣờng là các gen kháng kháng sinh (ampicillin, tetracyline). Ngoài ra, gen chọn lọc cũng có thể là gen mã hóa cho enzyme (ví dụ β-galactosidase, luciferase) chuyển hóa cơ chất cho phép quan sát một cách dễ dàng (tạo màu hay phát sáng theo thứ tự). Hình 2.1 Cơ chế của hiện tƣợng biến nạp 7 - Mang những vị trí nhận biết duy nhất của một số enzym giới hạn. Các vị trí cắt giới hạn này có tác dụng mở rộng khả năng xây dựng vector tái tổ hợp từ vector ban đầu. - Có kích thƣớc càng nhỏ càng tốt để có thể thu nhận một lƣợng DNA tối đa. Hơn nữa, kích thƣớc vector càng nhỏ thì càng dễ xâm nhập vào tế bào vi khuẩn, càng đƣợc sao chép nhanh và hiệu quả. - Tồn tại đƣợc trong tế bào vi khuẩn qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn nhất cho tế bào chủ. - Các vector biểu hiện cần chứa thêm promoter thích hợp cho việc biểu hiện gen trong sinh vật chủ. Ngoài ra các vector này cũng cần mang các vector chọn lọc đặc biệt nhằm dễ dàng chọn lọc cá thể sinh vật chủ có mang vector tái tổ hợp. Các vector thƣờng sử dụng trong biến nạp là plasmid và phage 2.2.2 Plasmid Plasmid là phân tử DNA dạng vòng có kích thƣớc phân tử nhỏ, có trong vi khuẩn và vi sinh vật khác, có khả năng nhân bản độc lập với chromosome của tế bào ký chủ. Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thƣờng là gen mã hóa các chất có ích cho vi khuẩn. Ví dụ, plasmid mang gen Ampicillin hoặc Chloramphenocol sẽ giúp vi khuẩn chủ kháng lại và tồn tại trong môi trƣờng có kháng sinh này. Tính kháng với loại kháng sinh nào đó đƣợc xem nhƣ là một dấu hiệu chọn lọc, hay đặc điểm để nhận diện quan trọng giúp khẳng định sự hiện diện của gen ngoại lai. 2.2.2.1 Cấu trúc Cấu trúc plasmid bao gồm vùng ori (origin of replication) giúp quá trình nhân nhanh về số lƣợng nhƣng không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ. Những plasmid nhỏ có thể sử dụng DNA của tế bào kí chủ cho việc nhân bản của nó, nhƣng đối với các plasmid lớn, chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho quá trình tái bản của chính nó. Tuy nhiên một vài plasmid có thể gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy số lƣợng plasmid đƣợc nhân lên cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Những plasmid hợp nhất gọi là episome thƣờng ổn định qua nhiều chu kì phân chia tế bào, nhƣng trong một giai đọan nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do. 8 Vùng chèn DNA Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Nguồn tài liệu T.A. Brown, 1997). 2.2.2.2 Tính chất của plasmid - Plasmid có DNA là chu trình kín độc lập với tế bào vi khuẩn. - Plasmid mang một gen hay nhiều gen. - Plasmid có khả năng sống sót trên môi trƣờng có nồng độ một số chất hóa học ví dụ nhƣ ampicilin. - Khi plasmid mang gen kháng, ngƣời ta dùng chất kháng này nhƣ một marker chọn lọc. 2.2.2.3 Phân loại plasmid Phân loại plasmid đƣợc dựa vào những đặc tính cơ bản mã hóa bởi các gen của nó. Có 5 loại plasmid đƣợc định tính nhƣ sau: Loại 1: F plasmid (Fertility) chỉ mang tra gen, có khả nạng chuyển vị và tiếp hợp. Ví dụ F plasmid của E. coli. Loại 2: R plasmid (resistance) mang gen mã hóa các hợp chất kháng lại các chất kháng sinh giúp tế bào kí chủ tồn tại trong môi trƣờng sống. Ví dụ RP4 trong vi khuẩn Pseudomonas. Loại 3: Col plasmid tạo ra colicin gây chết vi khuẩn khác. Ví dụ ColE1 trong E. coli. Loại 4: Degradative plasmid giúp kí chủ tạo các chất sinh học có tính chất đặc biệt trong điều kiện nào đó, nhƣ toluen, salycylyc xit. Ví dụ TOL plasmid trong Pseudomonas putida. 9 Loại 5: Virulence plasmid xác định khả năng gây bệnh của vi khuẩn chủ. Ví dụ Ti plasmid trong Agrobacterium tumefaciens gây bệnh bƣớu trên cây hai lá mầm. Trong các thí nghiệm phân lập và biến nạp gen thƣờng sử dụng plasmid có ba đặc tính cơ bản sau: - Trọng lƣợng phân tử thấp. - Khả năng thăm dò các tính trạng chọn lọc trên tế bào chủ. - Có cloning site đủ cho một lƣợng lớn restriction enzyme. 2.2.3 Phage Là vật liệu di truyền của Bacteriophage, loại virus tấn công vi khuẩn. Khi tấn công DNA của phage đƣợc truyền vào ký chủ và ở đó nó trải qua quá trình nhân lên số lƣợng, ngƣời ta lợi dụng đặc tính này để thiết kế các vector mang DNA vào tế bào. Ngoài ra, còn có vector lai giữa plasmid và phage mà ở đó các chức năng của phage đƣợc biểu hiện và sử dụng theo một cách nào đó, gọi là phasmid. Các vector lai giữa plasmid và phage đƣợc hoàn thiện cho tới nay và đƣợc sử dụng rộng rãi cho các ứng dụng nhƣ giải trình tự DNA và sản xuất các mẫu dò để sử dụng trong các nghiên cứu về lai axit nucleic. Các vector này là những plasmid quan trọng, chúng chứa điểm khởi đầu sao chép f1 của phage M13, và có thể tiếp nhận các đoạn DNA có kích thƣớc tới 10kb (pEMBL9, pBluescript). 2.2.4 Chủng chủ E. coli E. coli là một vi khuẩm Gram âm, hình que dài khoảng 2.5µm, có roi (flagella) và bộ gen gồm 4639221 cặp base mã hóa ít nhất cho 4000 gen. E. coli là loài đƣợc chọn trong các phòng thí nghiệm về sinh học phân tử bởi vì dễ nuôi cấy, bộ gen đơn giản và đã đƣợc giải trình tự. Giống nhƣ tất cả các vi khuẩn Gram âm khác, E. coli không có màng nhân và nhiễm sắc thể là một phân tử sợi đôi dạng vòng rất lớn với những vị trí gắn màng và một vị trí khởi đầu sao chép (origin of replication). Các tế bào E. coli có thể hỗ trợ sự sao chép các plasmid DNA và chọn lọc các DNA plasmid tái tổ hợp thông qua gen kháng kháng sinh hay các phức hợp màu nhƣ Xgal-β galactosidase. 10 Hình 2.3 Hình thái của Escherichia coli Nhằm duy trì sự tồn tại của các vector bacteriophage trong tế bào chủ, thông thƣờng E. coli dùng để tạo dòng đƣợc cải tiến thành các chủng theo các hƣớng cơ bản sau: - Loại bỏ các hệ thống sửa đổi hạn chế (restriction modification) vì các hệ thống này sẽ can thiệp vào sự sao chép của DNA lạ trong tế bào vi khuẩn nhờ đó vi khuẩn sẽ phân giải DNA lạ theo nhƣ cách DNA bacteriophage bị phân giải do hệ thống phòng vệ tự nhiên. Do vậy các chủng E. coli dùng cho tạo dòng sẽ bị gây đột biến trong hệ thống sửa đổi hạn chế nội sinh (hsdR-) hay gây đột biến trong phức hợp mcrA/mcrB/mrr là phức hợp phân giải DNA lạ không đƣợc methyl hóa một cách chính xác. - Hệ thống tái tổ hợp DNA đƣợc sữa đổi để ngăn chặn sự tái tổ hợp. Gen recA của E. coli mã hóa cho một DNA-dependent-ATPase cần thiết cho sự tái tổ hợp ở E. coli. Các chủng chủ E. coli dùng để tạo dòng có đột biến recA- thƣờng không thực hiện đƣợc sự tái tổ hợp. - Thay đổi hoạt tính endonuclease nhằm làm tăng lƣợng plasmid tích lũy trong tế bào. Thông thƣờng ngƣời ta sẽ gây đột biến trên gen endA (endA) là gen mã hóa cho endonuclease I. Việc mất endonuclease này sẽ làm tăng sản lƣợng plasmid và cải biến chất lƣợng DNA đƣợc chiết tách bằng cách sử dụng các phƣơng pháp sinh hóa chuẩn. 2.3 Các ezyme dùng trong biến nạp Trong thí nghiệm biến nạp gen cần sử dụng enzym cắt giới hạn, enzym sửa chữa DNA, enzym gắn DNA biến nạp và vector. 11 2.3.1 Các enzym cắt giới hạn (RE) 2.3.1.1 Hiện tƣợng giới hạn Các thực khuẩn thể xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn và sinh sôi nhờ bộ máy sinh tổng hợp của vi khuẩn. Khi số lƣợng phage tăng lên đến hàng triệu bản sao, chúng sẽ phá vỡ tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong một số trƣờng hợp, tế bào vi khuẩn vẫn nguyên vẹn mà phage cũng không sinh sôi. Hiện tƣợng này có thể do một trong hai nguyên nhân là: - DNA phage gắn vào vi khuẩn dƣới dạng không hoạt động trong một thời gian dài hay ngắn - DNA phage bị một hệ thống bảo vệ của vi khuẩn tiêu diệt khi vừa mới xâm nhập, hệ thống bảo vệ này là các enzym cắt giới hạn. Đây chính là hiện tƣợng giới hạn. Khi nghiên cứu DNA phage bằng phƣơng pháp Southern blot, ngƣời ta thấy rằng DNA phage trích từ vi khuẩn bị phá vỡ có kích thƣớc nguyên vẹn trong khi DNA phage trích từ vi khuẩn không bị phá vỡ lại bị cắt thành những đọan nhỏ hơn kích thƣớc đã xác định. Tuy vậy, ngay trên những chủng kháng phage, vẫn có một số vi khuẩn bị phân hủy. Các phage do số ít vi khuẩn này phóng thích có khả năng phân hủy chủng vi khuẩn trƣớc kia còn kháng phage. Tất cả những hiện tƣợng nêu trên là kết quả của một hệ thống gồm hai enzym: Các enzym cắt giới hạn cắt DNA phage ở những vị trí chuyên biệt, luôn luôn tạo thành những đọan có kích thƣớc nhất định và Methylase là enzym chịu trách nhiệm gắn nhóm methyl vào A hay C ở vị trí cắt của các enzym cắt giới hạn. Khi A hay C đƣợc methyl hóa, enzym cắt giới hạn không còn nhận biết đƣợc vị trí cắt. DNA vi khuẩn không bị chính các enzym cắt giới hạn của chúng cắt là nhờ cơ chế này. Các enzym cắt giới hạn hợp thành hệ thống bảo vệ ở tế bào procaryote, chƣa có hệ thống nào tƣơng đƣơng đƣợc phát hiện ở eucaryote. 2.3.1.2 Tên gọi các RE Tên gọi thống nhất cho các RE đƣợc qui định nhƣ sau: - Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên giống vi khuẩn từ đó RE đƣợc li trích. - Hai chữ kế không viết hoa tƣơng ứng với loài của vi khuẩn nói trên. - Tiếp theo là chữ số la mã chỉ thứ tự RE đƣợc phát hiện (trong trƣờng hợp RE cùng đƣợc tìm thấy ở 1 loài vi khuẩn). 12 - Đôi khi còn có thêm một chữ viết hoa để chỉ chủng vi khuẩn sử dụng. Ví dụ: Escherichia coli Ry13 Giống Loài Chủng EcoRI: enzyme đầu tiên đƣợc tìm thấy ở E. coli EcoRV: enzyme thứ 5 đƣợc tìm thấy ở E. coli 2.3.1.3 Các loại ezyme giới hạn Enzym cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA mạch đôi một cách lặp lại ở những trình tự xác định. Dựa vào khả năng này ngƣời ta chia ra làm 3 loại enzym cắt giới hạn: Loại 1: Khi enzym nhận biết đƣợc trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân tử DNA đến cách đó khoảng 1000-5000 nucleotide và giải phóng độ khoảng vài chục nucleotide. Loại 2: Enzym nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí đó. Loại 3: Enzym nhận biết một trình tự và cắt DNA tại vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide. Trong các thí nghiệm ngƣời ta chỉ sử dụng các enzym cắt giới hạn loại II. 2.3.1.4 Các RE loại II Trình tự nhận biết: Mỗi enzym cắt giới hạn nhận biết một trình tự nocleotide đặc trƣng. Các trình tự này thƣờng bao gồm từ 4-8 nucleotide (thƣờng là 4 hay 6). Các RE khác nhau có cùng trình tự nhận biết gọi là isochizomers. Đối với một số RE, trình tự nhận biết không có tính chuyên biệt tuyệt đối – một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế bởi nucleotide khác. Ví dụ : NspI GGGC(A,T)C- vị trí cắt thứ tƣ có thể là C, A, hay T Bgly GCCNNNNNGGC – N là bất kì nucleotide nào. Đặc trƣng quan trọng nhất của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc palyndromic, nghĩa là hai mạch của trình tự hoàn toàn giống nhau khi chúng đƣợc đọc theo chiều 5’ 3’. Nhƣ vậy, vị trí cắt là giống nhau trên hai mạch. 13 Hình 2.4 Hiện tƣợng giới hạn ở vi khuẩn (a) DNA của phage bị phân huỷ trong tế bào vi khuẩn (b) DNA của vi khuẩn không đưôc nhận biết bởi enzym cắt Các kiểu cắt của RE loại 2 Cắt tạo đầu bằng (blunt-ends): Một số RE cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm. Sau khi cắt, hai đầu bằng sẽ không có khả năng tự kết hợp lại. Để nối chúng lại phải dùng enzym T4 ligase. HaeIII 5’ GG CC 3’ 3’ GG CC 3’ 5’ GG + CC 3’ 3’ CC GG 5’ Cắt đầu dính (cohesive ends): Ở một số RE, vị trí cắt lệch nhau trên hai mạch. Trong trƣờng hợp này, các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại, hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau khi đƣợc cắt bởi chung một RE sẽ có khả năng kết hợp thành một thông qua các đầu dính. EcoRI không cắt DNA đƣợc methyl hoá DNA đƣợc methyl hoá Enzym cắt giới hạn EcoRI Enzym cắt giới hạn EcoRI DNA không đƣợc methyl hoá DNA không đƣợc methyl hoá Phân cắt Đầu dính 14 EcoRI 5’ G AATT C 3’ 3’ C TTAA G 5’ 5’ G AATTC 3’ 3’ C TTAA G 5’ Một số qui tắc cần chú ý khi thiết lập một phản ứng thủy giải bởi RE Mỗi RE hoạt động tối ƣu trong những điều kiện phản ứng xác định, nhất là về mặt dung dịch đệm. Tốt nhất ta nên tuân thủ đúng các khuyên cáo của hãng sản xuất. Các dung dịch đệm dùng cho phản ứng RE thƣờng cơ bản khác nhau ở nồng độ NaCl. Do đó khi trong một phản ứng cần sử dụng nhiều RE: Nếu chúng hoạt động tốt trong cùng một dung dịch đệm thì có thể đƣợc sử dụng đồng thời. Nếu yêu cầu về dung dịch đệm khác nhau thì DNA phải đƣợc cắt bởi RE hoạt động trong dung dịch đệm có nồng độ NaCl thấp trƣớc, sau đó thêm NaCl để đạt nồng độ cao hơn cần cho RE kia hoạt động và tiếp tục phản ứng thủy giải. RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn đƣợc bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trƣớc khi cắt trở lại vào -200C. Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme. Ứng dụng Việc sử dụng các enzyme cắt giới hạn có ý nghĩa quyết định trong sự phát triển của sinh học phân tử eukaryote. Chúng cho phép cắt nhỏ bộ gen khổng lồ của các sinh vật eukaryote. Các enzyme cắt giới hạn chủ yếu đƣợc sử dụng trong phƣơng pháp tạo dòng với mục đích thu nhận một trình tự xác định với số lƣợng lớn. Ngoài ra, chúng còn đƣợc dùng vào việc lập bản đồ giới hạn (restriction map), vào việc phân tích so 15 sánh bộ gen ở các loài khác nhau thông qua kĩ thuật RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism – tính đa hình kích thƣớc của các trình tự). 2.3.2 Các enzym thông dụng khác 2.3.2.1 DNA polymerase I (DNA pol I) Bản sao của một chuỗi axit nucleic luôn luôn đƣợc tổng hợp, nhờ một enzyme sao chép, theo cách bổ sung, đối song, và theo hƣớng 5’P 3’OH. Các DNA polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ khuôn DNA đƣợc gọi là DNA polymerase tùy thuộc DNA. DNA polymerase không thể tự khởi đầu một chuỗi axit nucleic, để khởi đầu một chuỗi axit nucleic cần cho vào môi trƣờng phản ứng một mồi axit nucleic. DNA polymerase I (từ E. coli) là một chuỗi polypeptide duy nhất với ba hoạt động enzyme: DNA polymerase (tổng hợp) 5’ 3’, exonuclease (thủy giải), 3’ 5’ và exonuclease 5’ 3’. Enzym DNA fragment Klenow là enzym DNA polymerase I bị cắt bỏ tiểu đơn vị nhỏ (nhờ một protease), phần chịu trách nhiệm exonuclease 5’ 3’. Do đó, enzym Klenow có hai hoạt động: hoạt động tổng hợp DNA polymerase5’ 3’ và hoạt động thủy giải exonuclease 3’ 5’. 2.3.2.2 Taq polymerase Là một loại DNA polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ một vi khuẩn suối nƣớc nóng, Thermus aquaticus. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. 2.3.2.3 Terminal transferase Enzym này đƣợc ly trích từ tuyến ức của bê. Terminal transferase xúc tác phản ứng gắn các deoxynucleotide vào đầu 3’OH tự do của phân tử DNA. Sự gắn này mang tính ngẫu nhiên nên thành phần nucluetide của chuỗi polynucleotide mới hình thành hoàn toàn phụ thuộc nồng độ của 4 loại nucleotide có trong phản ứng. Enzym này đƣợc sử dụng khi cần thêm đuôi nucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA hay đánh dấu đầu 3’OH của các DNA trong phƣơng pháp xác định trình tự nucleic axit theo Maxam và Gilbert. 2.3.2.4 Các DNase Các DNase thƣờng đƣợc cô lập từ tuyến tụy bò, là các endonuclease có khả năng cắt một phân tử DNA sợi đơn hay kép theo cách ngẫu nhiên để cho một hỗn hợp 16 các oligonucleotide. Hoạt động của DNase thay đổi tuỳ theo sự hiện diện của Mn2+ hay Mg 2+. Khi có Mn2+, DNase tác động trên hai sợi DNA gần nhƣ ở cùng một nơi để cho những đầu thẳng (hay không quá 1-2 nucleotide). Khi có Mg2+, DNase tác động trên mỗi sợi DNA riêng lẻ. 2.3.2.5 Các enzym khử phosphoril hóa Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA. Ngƣời ta thƣờng khử phosphoril hoá vector vừa đƣợc mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại này thƣờng đƣợc sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch thẳng. Trong phản ứng của enzym này cần có sự hiện diện của ion Zn2+ nhƣ là yếu tố hoạt hoá. Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bằng cách thêm vào một lƣợng nhỏ proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril đƣợc tinh sạch lại bằng cách sử dụng phenol:chloroform (Simsek và cộng sự, 1973). 2.3.3 Các enzym nối DNA Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng bằng enzym cắt giới hạn liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hoá trị giữa gốc phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi liền kề. Sự hình thành liên kết này có thể đƣợc xúc tác bởi hai loại enzym là E. coli DNA ligase hay T4 DNA ligase. 2.3.3.1 E. coli DNA ligase Enzym đƣợc ly trích từ E. coli xúc tác nối hai đoạn DNA có đầu so le 5’ ACGG + TAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTA GCGGT 5’ E. coli DNA ligase 5’ ACGGTAATCGCCA 3’ 3’ TGCCATTAGCGGT 3’ 2.3.3.2 T4 DNA ligase Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. coli. Enzyme này có cùng chức năng với ligase trích từ E. coli nhƣng đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên là ligase đƣợc chuộng nhất trong sinh học phân tử. 17 2.4 Các phƣơng pháp sử dụng trong biến nạp 2.4.1 Chuẩn bị tế bào khả nạp Vi khuẩn là vật chủ lý tƣởng nhất cho việc đƣa DNA tái tổ hợp vào và biến chúng thành những nhà máy sản xuất ra những sản phẩm mà ta mong muốn. Những ƣu điểm cơ bản của vi khuẩn khi sử dụng chúng nhƣ những vật chủ để đƣa DNA tái tổ hợp vào nhƣ sau: - Vi khuẩn có khả năng biến nạp. Khả năng này đƣợc Federick Griffith đƣa ra từ năm 1928. Tuy nhiên khả năng này không phải tất cả vi khuẩn đều có mức độ nhƣ nhau. - Vi khuẩn là cơ thể đơn bào, chúng có khả năng sinh sản, phát triển và trao đổi chất rất mạnh. Do đó nếu đƣa DNA tái tổ hợp vào vi khuẩn và chúng có khả năng biểu hiện đựoc tính trạng hợp lí mà ta mong muốn thì chỉ trong thời gian rất ngắn ta có thể thu nhận một lƣợng vật chấ lớn khổng lồ. - Vi khuẩn phát triển mạnh trong các nồi lên men. Do đó ta hoàn toàn có khả năng tự động hóa, cơ giới hóa quá trình sản xuất. Từ những ƣu điểm nổi bật trên mà các nhà khoa học đã nghiên cứu và đƣa ra những phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp hợp lý và rất dễ thực hiện. 2.4.1.1 Phƣơng pháp hóa biến nạp Phƣơng pháp này có sự trợ giúp của CaCl2 kèm với làm sốc nhiệt để làm tăng khả năng biến nạp của vi khuẩn. Theo đó vi khuẩn chủ sẽ đƣợc trộn với DNA tái tổ hợp. Ngƣời ta cho vi khuẩn vào dung dịch CaCl2 lạnh và làm sốc nhiệt (nâng nhanh đến 420C trong 2 phút) sẽ làm tăng khả năng biến nạp lên nhiều lần. Đối với tế bào động vật ta có thể thực hiện phƣơng pháp biến nạp bằng cách hấp thụ DNA tái tổ hợp qua trung gian phosphate calcium. Đối với tế bào thực vật, ta cũng có khả năng tạo biến nạp. Tuy nhiên, việc đầu tiên là tạo tế bào trần (protoplast) thực vật bằng cách dùng enzyme cellulose phân hủy thành tế bào thực vật. Sau đó trộn tế bào trần này với DNA tái tổ hợp với sự có mặt của CaCl2 và polyethylenglycol. Tiếp theo ta lại nuôi tế bào trần trong môi trƣờng thích hợp để tái tạo lại thành tế bào nguyên thủy. Khi đó tế bào này mới phát triển thành cây trong những điều kiện tƣơng ứng. 18 2.4.1.2 Phƣơng pháp điện biến nạp Ta có thể sử dụng xung điện để tế bào thực vật hấp thụ DNA tái tổ hợp. Bằng phƣơng pháp này ta thu đƣợc hiệu quả biến nạp rất cao. 2.4.2 Phƣơng pháp chọn lọc thể biến nạp và plasmid tái tổ hợp Sau khi xâm nhập, plasmid tái bản và thể hiện gen kháng kháng sinh trong tế bào chủ. Điều này giúp tế bào chủ có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có kháng sinh. Do đó, khi trải E. coli biến nạp lên môi trƣờng chứa kháng sinh, chỉ tế bào nào đã thu nhận plasmid và biểu hiện gen kháng kháng sinh mới có thể sinh trƣởng. Các tế bào không tiếp nhận plasmid sẽ không sinh trƣởng đƣợc. Tuy vậy, kết quả của phản ứng nối giữa đoạn DNA và vector đã đƣợc mở vòng là một tổ hợp bao gồm nhiều kết quả nối, đó là vector-vector, vector-DNA chèn. Do vậy, có những thể biến nạp có khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng chứa kháng sinh nhƣng không mang gen mục tiêu. Việc sàng lọc các thể biến nạp mang gen mục tiêu đƣợc tiến hành theo nhiều phƣơng pháp. Phổ biến là các phƣơng pháp sau: - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp dựa trên việc quan sát màu xanh hay trắng của khuẩn lạc bằng α-complementation. - Xác định thể biến nạp có mang plasmid tái tổ hợp bằng phƣơng pháp lai (lai khuẩn lạc). - Xác định gen đích trên plasmid trong thể biến nạp bằng PCR (PCR khuẩn lạc). Thông thƣờng, để phân tích một dòng ngƣời ta dung hai phƣơng pháp là khảo sát plasmid tái tổ hợp bằng cách tạo bản đồ cắt giới hạn và giải trình tự toàn bộ đoạn gen đích. Nhiều plasmid vector (ví dụ họ pUC, pBluescript, pGEM và các plasmid có nguồn gốc từ các họ plasmid này) mang một đoạn ngắn của DNA E. coli chứa những trình tự điều hòa và mã hóa cho α-protein của β-galactosidase (đầu amin). Việc chèn vào đoạn này trình tự MCS chứa các vị trí cắt giới hạn duy nhất (vẫn duy trì khung đọc) sẽ tạo thêm vài amino axit trong α-protein mà không ảnh hƣởng tới chức năng của lacZ. Các vector loại này sẽ đƣợc sử dụng với các chủng chủ thể hiện phần đầu carboxyl của β-galactosidase. Hiện tƣợng α-complementation xảy ra khi hai protein bất hoạt của β-galactosidase E. coli (α, ω-protein ) kết hợp với nhau để tạo thành một enzym có chức năng. Các khuẩn lạc có α-complementation sẽ dễ dàng đƣợc phát hiện vì việc xuất hiện khuẩn lạc màu xanh trên môi trƣờng có chứa cơ chất tạo màu X-gal 19 (5-Bromo- 4- chloro-3-Indolyl –β-D-galactopyranoside). Hợp chất không màu X-gal bị phân cắt bởi β-galactosidase để cho galactose và một dẫn xuất của indoxyl. Dẫn xuất này, đến lƣợt nó bị oxy hóa trong không khí để tạo ra dẫn xuất dibromo-dichloro có màu xanh. Để có sự biểu hiện của β-galactosidase cần có chất kích hoạt là IPTG (đồng phân của galactose không bị nhận biết bởi β-galactosidase), đóng vai trò nhƣ là chất kích hoạt của gen lacZ. Khi chèn đoạn DNA vào trình tự MCS của các vector (ví dụ pBluescript) sẽ làm ngăn cản việc tạo thành α-protein đầu amin. Do đó, hiện tƣợng α-complementation không thể xảy ra. Vì vậy, khuẩn lạc do thể biến nạp hình thành có màu trắng. 2.4.3 Chiết tách DNA plasmid Với mong muốn thu nhận một số lƣợng lớn các bản sao plasmid, ngƣời ta sử dụng bộ máy di truyền của các tế bào chủ. Thông qua đó, plasmid đƣợc sao chép với số lƣợng lớn và tốc độ cực kì nhanh chóng theo tốc độ tăng trƣởng của tế bào chủ. Trƣớc hết, biến nạp plasmid vào tế bào chủ, sau đó nuôi cấy tế bào chủ trên môi trƣờng chọn lọc thích hợp thu nhận sinh khối tế bào. Quá trình tách chiết plasmid từ tế bào chủ là công đoạn cuối cùng nhằm thu nhận plasmid dƣới dạng tinh. Các quy trình tách chiết đều có các bƣớc chính là phá vỡ màng tế bào, biến tính DNA, tủa protein, cuối cùng là tủa DNA. Tuỳ theo từng phƣơng pháp cụ thể ngƣời ta sẽ sử dụng các tác nhân khác nhau trong từng công đoạn của quá trình tách chiết. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết plasmid từ tế bào chủ, chẳng hạn nhƣ: - Phƣơng pháp nhiệt độ cao - Phƣơng pháp Lythium - Phƣơng pháp SDS-kiềm 2. 5 Điện di (Electrophoresis) Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với ngƣời làm kỹ thuật di truyền, vì đó là cách chủ yếu làm cho các đoạn nucleic acid hiển thị trực tiếp. Phƣơng pháp này dựa trên một đặc tính của nucleic acid là ở pH trung tính chúng mang điện tích âm nhờ các nhóm phosphate nằm trên khung phosphodiester của các sợi nucleotide. Điều đó có nghĩa là các phân tử sẽ chạy về cực dƣơng khi đặt chúng vào điện trƣờng. Kỹ thuật này đƣợc tiến hành trên một dung dịch đệm gel có tác dụng phân tách các phân tử nucleic acid theo kích thƣớc. 20 Loại gel dùng trong điện di có tác dụng rất quan trọng đối với mức độ phân tách các phân tử, nó phụ thuộc vào cấu trúc và kích cỡ của các lỗ có trong gel. Có hai loại gel đƣợc sử dụng phổ biến là agarose và polyacryamid. Gel agarose là loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thƣờng dùng để phân tách những đoạn có kích thƣớc trong khoảng 0,5 – 20 kb. Gel đƣợc đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di đƣợc thực hiện theo phƣơng nằm ngang. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dƣới tia tử ngoại (UV) nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide (EtBr). Chất này có khả năng xen vào giữa các base của acid nucleic và dƣới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Gel polyacrylamide dùng để tách các đoạn có kích thƣớc nhỏ, tức là dƣới 1000 cặp base. Thao tác với gel polyacrylamide phức tạp hơn với gel agarose. Do đó, gel này chỉ đƣợc sử dụng cho những mục đích đặc hiệu. Các ứng dụng chủ yếu của loại gel này là: - Tinh sạch các oligonucleotide tổng hợp - Xác định trình tự DNA - Tách các đoạn DNA nhỏ có chiều dài dƣới 500 cặp base. Gel đổ giữa hai tấm thuỷ tinh và phƣơng của điện di là phƣơng thẳng đứng. Thực hiện nạp mẫu điện di Điện di đƣợc thực hiện bằng cách đƣa các mẫu nucleic acid đã đƣợc trộn đều với loading buffer bơm vào các giếng của miếng gel trong dung dịch đệm TAE 0,5X hoặc TBE 0,5X và đặt một điện áp vào đó. Trạng thái đó đƣợc duy trì cho đến khi vạch cuối của loading buffer chạy tới đầu cuối của gel. Sau đó, bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch ethidium bromide và xem dƣới UV. 2.6 Các nghiên cứu về biến nạp ở trong nƣớc và ngoài nƣớc 2.6.1 Ngoài nƣớc Cohen và cộng sự (1973), đã thành công khi biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn E. coli bằng phƣơng pháp Calcium chloride. Sambrook và cộng sự (1989), đƣa ra phƣơng pháp chuẩn bị tế bào E. coli khả nạp, biến nạp plasmid vào tế bào theo phƣơng pháp hóa chất và sốc nhiệt, sau đó ông đƣa ra công thức tính hệ số biến nạp N = A x10 n x OV/PV 21 N: hệ số biến nạp, tính bằng CFU/µg plasmid DNA A: số khuẩn lạc đếm đƣợc trên môi trƣờng chọn lọc n: hệ số pha loãng OV: thể tích ban đầu khi phục hồi (µl) OP: thể tích dịch vi khuẩn đƣợc trải trên đĩa (µl) Inoue và cộng sự(1990), đƣa ra công thức dung dịch TB sử dụng trong quá trình chuẩn bị tế bào khả nạp nhƣ sau: 10mM Pipes, 55mM MnCl2, 15mM CaCl2, 250mM KCl Zhiming Tu và cộng sự (2004), nghiên cứu cải thiện phƣơng pháp chuẩn bị tế bào khả nạp và nâng cao hệ số biến nạp plasmid sử dụng những chủng E. coli khác nhau. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy sử dụng tế bào ở đầu phage log ảnh hƣởng rất lớn đến sự thành công của việc chuẩn bị tế bào khả nạp. Giá trị OD600 thích hợp của dịch nuôi cấy khi chuẩn bị tế bào khả nạp với các chủng vi khuẩn nhƣ sau: XL-blue là từ 0.15-0.45, TG1 là từ 0.2-0.5, DH5α là từ 0.145-0.45. Nồng độ của CaCl2 sử dụng trong dung dịch TB tối ƣu là 75mM. Cũng trong nghiên cứu này Zhiming Tu cho thấy thời gian lƣu trữ tế bào khả nạp ở -20oC là 7 ngày, ở -70oC là 15 ngày. 2.6.2 Trong nƣớc Phạm Duy và Huỳnh Văn Thái, trƣờng Đại Học Nông Lâm TPHCM, đã thực hiện thành công đề tài : Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α” bƣớc đầu xây dựng đƣợc quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp, quy trình tách chiết plasmid, tiến hành phủ đầu bằng cho đoạn DNA từ sản phẩm PCR, thiết lập phản ứng nối cho đoạn DNA trên với plasmid, thực hiện phản ứng PCR trên plasmid đã chèn. 22 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện khoá luận tốt nghiệp Thời gian : Khoá luận đƣợc tiến hành từ ngày 14 tháng 02 năm 2006 đến ngày 14 tháng 08 năm 2006. Địa điểm : Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hoá Sinh, Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật-Trƣờng Đại học Nông lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Vi khuẩn E. coli DH5α Chủng vi khuẩn đã đột biến, có những thiếu hụt dùng để biến nạp và nhân nhanh số lƣợng bản sao plasmid hoặc cosmid. Kiểu gen : supE44 ∆lacU169(Ф80lacZ∆M15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1relA1. Đột biến Ф80lacZ∆M15 cho phép xảy ra hiện tƣợng α-complementation với tiểu phần mang đầu amino của β-galactosidase đƣợc mã hoá bởi plasmid họ pUC (Hanahan 1983 ; Bwnthesda Research Laboratories 1986) 3.2.2 pBluescript II SK(+/-) pBluescript phagemid (plasmid với vùng khởi đầu sao chép của phage) là vector nhân tạo, đƣợc thiết kế để sử dụng trong cloning và đọc trình tự. pBluescript chứa MCS với trình tự nhận biết của 21 enzym cắt giới hạn. Bên ngoài vùng MCS là T7, T3 RNA polymerase promoter, có thể sử dụng để tổng hợp RNA invitro. Trình tự của T7, T3 còn có thể sử dụng để thiết kế primer sử dụng cho phƣơng pháp đọc trình tự. pBluescript chứa trình tự mã hoá cho 131 amino axit của β-galactosidase. Việc phân biệt pBluescript II SK (+/-) hay pBluescript II KS (+/-) phụ thuộc vào cách sắp xếp thứ tự các trình tự nhận biết của các enzym cắt giới hạn trong vùng MCS so với trình tự của T7, T3 RNA polymerase promoter. Ở pBluescript II SK (+/-), trình tự của enzym Kpn I gần với T7 promoter, trình tự của enzym Sac I gần với T3 promoter và ngƣợc lại. 23 Sơ đồ 3.1 Vùng trình tự MCS của plasmid pBluescript II SK (+/-) 3.2.3 Đoạn DNA Hai đoạn DNA đƣợc chọn nghiên cứu trong khoá luận này là Đoạn DNA (900bp) của nấm Phytophthora trên cây địa lan Đoạn DNA (223bp) trong vùng Tef của nấm Trichorderma 3.3 Dụng cụ và hóa chất 3.3.1 Dụng cụ thí nghiệm Đĩa petri lớn, nhỏ Ống nghiệm lớn, nhỏ Eppendorf: 1.5ml, 200μl Pipet : 0.5-10 µl; 10 - 100 µl; 100 - 1000 µl Đầu tip : xanh, vàng, trắng Lọ thủy tinh đƣng hóa chất Đầu lọc hóa chất : 0.22μm, 0.45μm Bình tam giác : 100ml, 200ml, 500ml Que trang thủy tinh 3.3.2 Các thiết bị máy móc Tủ cấy vô trùng (micro flow) Bồn ổn nhiệt (water bath) Máy ly tâm (Mikio 22) Tủ định ôn Máy lắc vi khuẩn Tủ 40C, - 200C, - 800C Tủ sấy dụng cụ Thiết bị điện di (Bio - Rad) Máy chụp gel (Bio - Rad) Lò vi sóng (Microway) Nồi hấp (Autoclave - Tomy) 3.3.3 Các loại môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Môi trƣờng LB lỏng (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua ) Môi trƣờng LB lỏng có bổ sung kháng sinh (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, ampicillin) 24 Môi trƣờng LB agar (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar ) Môi trƣờng LB agar, kháng sinh ampicillin, X-gal, IPTG (bacto tryptone, bacto yeast extract, natri chlorua, agar. Ampicillin, X-gal, IPTG) 3.3.4 Các loại hóa chất dùng trong thí nghiệm Hóa chất để chuẩn bị tế bào khả nạp : CaCl2 100mM, glycerol 98%. Hóa chất biến nạp : Ampicillin 100μg/ml, X-gal 20mg/ml, IPTG 300mg/ml. Hóa chất ly trích plasmid Dung dịch I (50mM glucose, 25mM Tris-HCl, 10mM EDTA) Dung dịch II (0,2N NaOH, 1% SDS, nƣớc cất) Dung dịch III (5M Potassium acetate, glacial acetic acid, nƣớc cất) Phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1) Chloroform / isoamyl alcohol (24 :1) Isopropanol, Ethanol 70 %, TE 1X (pH = 8) Hóa chất điện di và nhuộm: Loading dye, TAE 0.5X, Ethdium bromide 3.3.5 Các loại enzym dùng trong thí nghiệm Tên enzyme Trình tự nhận biết Buffer Mã hàng Nhà sản xuất BamHI G /GATCC B (10X) Cat. No. 220 612 Roche EcoRV GAT/ATG B (10X) Cat. No. 667 145 Roche HindIII A/AGCTT B (10X) Cat. No. 656 313 Roche DNA T4 ligase NEbuffer 10X Product No. 70005Y usb DNA fragment Klenow T4 reaction buffer Code number M0210S BioLabs 25 3.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.4.1 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Vi khuẩn E. coli sau khi xử lí CaCl2 sẽ làm cho màng tế bào trở nên khả nạp giúp cho DNA xâm nhập tế bào E.coli dễ dàng hơn. Giai đoạn sốc nhiệt kế tiếp (420C trong 45 giây) để kích thích sự chuyển của phân tử plasmid vào trong tế bào. Môi trƣờng dƣỡng chất đƣợc thêm vào sau đó cho phép tế bào hồi phục và plasmid tiến hành sao mã, phiên mã và dịch mã tạo nên các protein tƣơng ứng. Một trong các tính trạng do các gen này qui định đƣợc chọn làm dấu hiệu chọn lọc để phân biệt nhữnng tế bào có tiếp nhận DNA plasmid trong số những tế bào không tiếp nhận DNA plasmid. Vi khuẩn Ecoli Xử lí CaCl2 Sốc nhiệt ở 420C trong 45 giây Cấy lên đĩa Sơ đồ 3.2 Quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn E. coli 26 3.4.2 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra Sơ đồ 3.3 Quy trình biến nạp đoạn DNA vào vi khuẩn E. coli DH5α và kiểm tra Vi khuẩn E. coli DH5α Khả nạp + CaCl2 Plasmid Bluescript II SK (+/-) Vi khuẩn mang plasmid Bluescript Sốc nhiệt Chiết tách plasmid Tinh sạch Đoạn DNA Cắt plasmid bằng HindIII Blunt - end Tinh sạch Phản ứng nối Biến nạp vào khả nạp Chọn lọc khuẩn lạc màu xanh Chọn lọc khuẩn lạc màu trắng Chiết tách plasmid Cắt plasmid bằng BamHI, HindIII Phản ứng PCR với primer T3, T7 Blunt - end 27 3.4.3 Tăng sinh vi khuẩn E. coli DH5α trên môi trƣờng LB Từ dòng vi khuẩn E. coli DH5α gốc hút 20µl dịch vi khuẩn sang ống nghiệm có chứa môi trƣờng LB lỏng. Đem nuôi cấy lắc ở 370C, 150 vòng/phút trong vòng 36-48h. Hút 1ml dịch vi khuẩn sau khi đã nuôi cấy vào ống eppendorf 1.5ml, thêm 150µl glycerol 98% vào và cất ống eppendorf vào tủ âm 70 để giữ giống. Dịch còn lại tiếp tục cấy sang các ống nghiệm để chuẩn bị tế bào khả nạp. 3.4.4 Chuẩn bị tế bào khả nạp Bƣớc 1: Hút 20µl dịch vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng. Bƣớc 2: Nuôi cấy lắc trong vòng 3-4 giờ. Bƣớc 3: Chuyển ống nghiệm chứa vi khuẩn vào thùng nƣớc đá giữ lạnh trong 10 phút. Bƣớc 4: Hút 1.5ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf 1.5ml, ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 5: Đổ bỏ phần dịch bên trên, thu phần sinh khối kết tủa bên dƣới. Lập lại bƣớc này đến khi hết dịch nuôi cấy. Bƣớc 6: Cho 1ml CaCl2 100mM lạnh vào eppendorf chứa phần sinh khối vừa thu đƣợc. Vortex nhẹ để hòa tan phần kết tủa. Bƣớc 7: Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Bƣớc 8: Đổ bỏ phần dịch bên trên, lật ngƣợc eppendorf 1 phút để làm khô kết tủa. Bƣớc 9: Cho 150µl CaCl2 100mM lạnh vào hòa tan phần kết tủa trên. Thêm 20µ glycerol vào và trữ ở -700C. Khả nạp đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp CaCl2 kết hợp với sốc nhiệt sau đó đƣợc bảo quản ở -700C. Việc thêm glycerol có tác dụng giảm sốc khi rã đông giúp việc bảo quản khả nạp đƣợc lâu hơn. Cần chú ý là phải chia nhỏ thể tích khả nạp đủ cho mỗi lần sử dụng. 3.4.5 Biến nạp plasmid pBluescript vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α bằng phƣơng pháp sốc nhiệt (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Chúng tôi tiến hành biến nạp theo 3 qui trình sau. Lƣợng DNA không lớn hơn 50ng trong một thể tích là 10μl hoặc ít hơn. 28 Quy trình 1 - Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣơc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5ml, thêm 1.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. - Thêm 500µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. - Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 2 - Hút 3µl dịch huyền phù tế bào khả nạp đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5ml, thêm 0.5µl DNA plasmid vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. - Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 100µl (đã pha loãng ½) dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. -Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370C. - Lặp lại quy trình trên nhƣng không cho DNA plasmid vào tế bào khả nạp để làm đối chứng. Quy trình 3 Lập lại quy trình 2 nhƣng không pha loãng khi hút 100µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X- gal, IPTG. 29 3.4.6 Chiết tách plasmid và sử dụng enzym cắt để kiểm tra 3.4.6.1 Chiết tách plasmid Có nhiều phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid nhƣ: Phƣơng pháp sử dụng nhiệt độ cao, phƣơng pháp SDS – kiềm. Nhƣng chúng tôi chọn phƣơng pháp SDS – kiềm để chiết tách plasmid sử dụng cho khóa luận này. Nguyên tắc của phƣơng pháp này là màng tế bào vi khuẩn bị phá vỡ bởi các tác nhân phá màng. Sau khi màng tế bào bị vỡ , dƣới tác dụng của SDS protein của tế bào sẽ bị biến tính. Nhờ vậy mà DNA sẽ tránh đƣợc sự phân hủy của DNAse. Mặt khác, sự bổ sung dung dịch II với nồng độ kiềm cao ở giai đoạn đầu của quá trình tách chiết, làm cho DNA của genome và DNA của plasmid bị biến tính. Sau đó trung hòa nhanh bằng dung dịch III, cấu trúc của DNA sẽ đƣợc phục hồi nhanh chóng. DNA của bộ gen có kích thƣớc lớn nên khó phục hồi cấu trúc hơn so với DNA của plasmid. Vì vậy DNA của plasmid sẽ nằm ở phần dịch nổi sau khi ly tâm, protein của tế bào và DNA của bộ gen sẽ bị tủa xuống. Nhƣ vậy ta có thể tách plasmid ra khỏi tế bào chủ mà không bị lẫn DNA của bộ gen. DNA của plasmid đƣợc tủa dƣới tác dụng của isopropanol nên ta thu hồi lại dễ dàng. Phƣơng pháp chiết tách DNA plasmid sử dụng SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau: Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150μl dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200μl dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm tiếp 150μl dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần. 30 Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ. Bƣớc 7: Cho vào mỗi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -200C trong 1 giờ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Tùy lƣợng mẫu mà thêm vào. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. Sau khi điện di kiểm tra sản phẩm chiết tách trên gel agarose, thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid tách chiết và DNA plasmid đối chứng. Thực hiện phản ứng cắt DNA plasmid và DNA plasmid đối chứng bằng enzym EcoRV, sau đó kiểm chứng bằng cách điện di trên gel agarose sẽ cho biết DNA plasmid chiết tách đƣợc có phải là plasmid mà mình mong muốn hay không. Qui trình li trích plasmid sử dụng AurumTM Plasmid Mini Kit (Bio-Rad) Thành phần của AurumTM Plasmid Mini Kit Resuspension solution (dung dịch hòa tan) Lysis solution (dung dịch phân giải) Neutralization solution (dung dịch trung hòa) Wash solution (dung dịch rửa) 31 Elution solution (dung dịch tách rửa) Plasmid mini columns 100 2ml capless wash tubes 100 Vi khuẩn sau khi tăng sinh trong môi trƣờng LB lỏng (theo tỉ lệ 1:20) trong vòng 16 giờ hoặc xác định mật độ tế bào bằng cách đo OD ở bƣớc sóng 600 nm đến khi OD600= 6. Bƣớc 1: Chuyển dịch vi khuẩn đã nuôi cấy vào ống eppendorf (1.5-2.0ml). Li tâm trong 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C. Loại bỏ dịch nổi bằng việc gạn hay hút. Bƣớc 2: Thêm 250µl dung dịch resuspension và vortex hoặc hút lên hút xuống đến khi cặn tế bào tan hoàn toàn. Bƣớc 3: Thêm 250µl dung dịch lysis và trộn bằng cách đảo ngƣợc eppendorf nhanh, mạnh 6-8 lần. Không vortex hoặc lắc mạnh. Dung dịch sẽ trở nên nhớt và mỏng. Bƣớc 4: Thêm tiếp 350µl dung dịch neutralization và trộn bằng cách đảo ngƣợc eppendorf 6-8 lần. Không vortex hoặc lắc mạnh. Kết tủa đã đƣợc hình thành. Bƣớc 5: Li tâm trong vòng 5 phút 13000 vòng/phút ở 40C hỗn hợp trên. Cặn đặc trắng sẽ hình thành dọc theo cạnh hoặc dƣới đáy của ống eppendorf. Dịch nổi chứa DNA plasmid. Bƣớc 6: Trong khi li tâm, chèn 1 cột plasmid mini column vào ống capless wash 2ml. Bƣớc 7: Bằng việc hút hay gạn, chuyển dịch nổi từ bƣớc 5 vào cột plasmid mini column. Li tâm 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C. Bƣớc 8: Dung dịch wash solution đƣợc cung cấp ở nồng độ 5X. Thêm vào 4 thể tích (100 ml) ethanol 95-100% trƣớc khi sử dụng. Bƣớc 9: Lấy cột plasmid mini column ra khỏi ồng wash tube. Bỏ phần nƣớc đã lọc từ ống tube, và chuyển plasmid mini column vào ống wash tube khác. Thêm vào 750µl dung dịch wash solution và li tâm 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C. 32 Bƣớc 10: Bỏ dung dịch wash solution từ ống tube, và chuyển cột plasmid mini column vào ống wash tube khác. Li tâm thêm 1 phút nữa để loại bỏ dung dịch wash solution còn lại. Bƣớc 11: Chuyển cột plasmid mini column vào ống eppendorf. Thêm 50µl dung dịch elution vào màng hoặc đế của cột và cho phép 1 phút để dung dịch bão hòa màng. Li tâm 1 phút 13000 vòng/phút ở 40C để tách rửa plasmid. Bƣớc 12: Bỏ cột mini column và trữ DNA tinh ở 40C. 3.4.6.2 Phản ứng cắt Plasmid (quy trình trích dẫn bởi Samuel S.M.Sun, 1994) Định nghĩa đơn vị enzym cắt: Một đơn vị enzym cắt giới hạn là lƣợng enzym xúc tác phản ứng cắt hết một lƣợng DNA là 1µg trong buffer thích hợp trong thời gian là 1 giờ ở nhiệt độ thích hợp. Thực hiện phản ứng cắt với các thành phần nhƣ sau Buffer 10X 2.5µl DNA plasmid 1µg Enzym EcoRV 1 unit Thêm nƣớc cho tới 25µl Ủ phản ứng ở 37oC trong 1 giờ, biến tính enzym ở 65oC trong 15 phút Điện di 8µl sản phẩm cắt trên gel agrose 1%, với hiệu điện thế 100V, trong 30 phút để kiểm tra. Tƣơng tự thực hiện phản ứng cắt với enzym RsaI và HindIII để kiểm tra sản phẩm sau khi li trích. 3.4.6.3 Quy trình điện di trên gel agarose Chuẩn bị khuôn đổ gel, gắn lƣợc vào khuôn, cân 0.1g agarose cho vào chai chứa 12.5 ml dung dịch TAE 0.5X, nấu agarose trong lò vi sóng trong 2 phút, 650W. Để nguội đến 40-500C, đổ gel vào khuôn, khi gel nguội, gỡ lƣợc ra khỏi miếng gel, lấy gel ra khỏi khuôn một cách nhẹ nhàng và đặt vào bồn điện di đã có sẵn dung dịch TAE 0.5X. Chuẩn bị một miếng parafilm (kích thƣớc tuỳ vào số mẫu chạy điện di), hút 2μl dung dịch nạp mẫu (loading dye) cho mỗi mẫu cần điện di, hút mẫu cần điện di (thể tích tuỳ thuộc vào nồng độ mẫu) trộn đều với dung dịch nạp mẫu, hút toàn bộ dung dịch vừa trộn nạp vào giếng. 33 Đậy nắp bồn điện di, cắm điện cực, điện di với hiệu điện thế 100V, thời gian 30 phút. Sau khi điện di xong, cẩn thận lấy gel ra và nhuộm trong Ethium bromide trong 10 phút, rửa kỹ gel và đọc kết quả điện di bằng phần mềm Quantity One (khi nhuộm với ethium bromide phải tuyệt đối cẩn thận). 3.4.7 Tinh sạch plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR 3.4.7.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA Các bƣớc tinh sạch DNA bằng RNAse nhƣ sau: - Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nƣớc vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3) - Thêm vào 2 l RNAse vào hỗn hợp trên - Ủ ở 370C khoảng 30 giây - Thêm vào 2 l Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1) - Ly tâm lấy phần trên sang ống khác - Cho vào 800 l ethanol 100% và ủ ở -800C khoảng 30 phút - Ly tâm bỏ phần dung dịch bên trên - Làm khô DNA và cho vào TE - Điện di và đọc kết quả Phƣơng pháp tinh sạch đƣợc thực hiện theo kit sử dụng cột GFX do hãng Amersham sản xuất, công ty Nguyên Anh cung cấp. Kit tinh sạch GFX cho phép tinh sạch DNA trực tiếp hoặc thông qua phƣơng pháp cắt gel. 3.4.7.2 Quy trình tinh sạch DNA từ gel Nhằm phân tách và thu nhận duy nhất đoạn DNA mong muốn và DNA plasmid từ bản gel agarose sau khi điện di Bƣớc 1: Gel sau khi chạy điện di, đƣợc đƣa lên hệ thống UV. Bƣớc 2: Dùng dao sắc cắt phần gel chứa band DNA cần đƣợc tinh sạch cho vào eppendoft 1.5ml ( đã cân trọng lƣợng trƣớc). Bƣớc 3: Cho capture buffer vào eppendorf chứa gel trên với tỷ lệ 10mg gel ≈ 10µl capture buffer. Bƣớc 4: Đậy nắp lại ủ ở 60oC cho đến khi agarose tan hết (5 – 15 phút). Bƣớc 5: Chuẩn bị cột GFX, đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẩu cần tinh sạch. Bƣớc 6: Sau khi ủ, đem ly tâm để tập trung mẩu ở đáy eppendorf. 34 Bƣớc 7: Hút hết mẩu sau khi ly tâm cho vào các cột đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 8: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30giây ở 40C. Bƣớc 9: Cho thêm vào cột lƣợng wash buffer tƣơng ứng (tỉ lệ 1:5 theo thể tích mẫu tinh sạch), ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C. Bƣớc 10: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 11: Hút 50µl elution buffer nhỏ vào cột GFX. Bƣớc 12: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 13: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp lại. Bƣớc 14: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 0.8 %, hiệu điện thế 100V trong 30 phút để kiểm tra kết quả tinh sạch. 3.4.7.3 Quy trình tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR bằng cột GFX Bƣớc 1: Chuẩn bị cột tinh sạch GFX đặt vào eppendorf tƣơng ứng với số mẫu cần tinh sạch. Bƣớc 2: Hút capture buffer cho vào các cột với tỷ lệ thể tích giữa capture buffer và sản phẩm PCR là 5:1. Bƣớc 3: Cho sản phẩm PCR vào các cột chứa capture buffer đã chuẩn bị ở trên, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 4: Đem ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C. Bƣớc 5: Cho thêm vào cột một lƣợng wash buffer bằng với lƣợng capture buffer cho vào ở trên, ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 giây ở 40C Bƣớc 6: Lấy cột ra và đặt vào eppendoft 1.5ml mới. Bƣớc 7: Hút elution buffer nhỏ vào cột GFX, tùy vào mục đích sử dụng sản phẩm tinh sạch mà lƣợng elution buffer có thể thay đổi. Bƣớc 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Bƣớc 9: Ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút ở 40C, lấy cột ra, đậy nắp eppendorf lại. Bƣớc 10: Điện di sản phẩm tinh sạch với sản phẩm chƣa tinh sạch trên gel agarose 1% để kiểm tra kết quả tinh sạch. 35 3.4.8 Thiết lập phản ứng tạo blunt-end cho sản phẩm PCR Theo nguyên tắc của phản ứng PCR, sau khi kéo dài mạch đơn DNA, enzym Taq polynerase sẽ gắn thêm vào cuối trình tự DNA đơn một hoặc nhiều phân tử Adenin (polyA) để ổn định trình tự DNA, do đó sau khi phản ứng PCR xảy ra chúng ta sẽ thu đƣợc sản phẩm là những đoạn DNA đầu dính. Do điều kiện của thí nghiệm phải thiết lập phản ứng nối đầu bằng giữa plasmid và đoạn DNA từ sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành thiết lập phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA với enzym DNA polymerase I large fragment (Klenow). Hình 3.1 Phản ứng tạo đầu bằng (blunt-end) cho đoạn DNA Thiết lập phản ứng phủ đầu với các thành phần nhƣ sau: NEbuffer 10X 2µl DNA từ phản ứng PCR 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl DNA fragment Klenow 1 unit (1µl) Thêm nƣớc cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút. Thiết lập phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid Plasmid sau khi cắt bằng HindIII, và thực hiện phản ứng phủ đầu bằng theo qui trình sau: NEbuffer 10X 2µl DNA plasmid 6µl (1µg) dNTPs (33µmol) 1µl Phản ứng tạo đầu bằng Đầu dính Đầu bằng 36 DNA fragment Klenow 1 unit (1µl) Thêm nƣớc cho tới 20µl Ủ phản ứng ở 250C trong 15 phút, sau đó ngừng phản ứng bằng cách thêm EDTA đến nồng độ 10mmol và ủ ở 750C trong 20phút 3.4.9 Thiết lập phản ứng nối giữa plasmid và đoạn DNA đầu bằng (phản ứng nối blunt-end) T4 DNA ligase không giống nhƣ E. coli DNA ligase, nó có thể xúc tác phản ứng nối những đoạn DNA đầu bằng (Sgaramella và Khorana 1972, Sgaramella và Ehrlych 1978). Tuy nhiên phản ứng gắn kết sẽ không có đƣợc hiệu suất cao và cần phải có các yếu tố sau: Nồng độ ATP thấp (0.5mM), (Ferretti và Sgaramella 1981), nồng độ enzym ligase cao (50unit/ml), lƣợng DNA insert và vector cao, tỉ lệ về số mol của vector và đoạn DNA insert khoảng 1: 3-10. Trong phản ứng nối blunt-end có thể thêm vào các chất có phân tử lƣợng cao nhƣ PEG hay Hexamminecobalt chloride. Các chất này có vai trò làm tăng tốc độ phản ứng ligation từ 1-3 lần, điều đó cho phép lƣợng DNA và nồng độ ligase giảm xuống và không ngừng sắp xếp sản phẩm nối, sự nối bên ngoài phân tử đƣợc ngăn chặn, khi đó chỉ có phản ứng nối giữa vector-DNA insert và phản ứng nối giữa vector-vector xảy ra. Từ lượng của vector DNA tính ra lượng của DNA chèn (ng)DNA chèn = Căn cứ vào tỉ lệ về số mol giữa vector và DNA chèn rồi dựa vào đó để tính ra lƣợng DNA cần sử dụng Thực hiện phản ứng nối với các thành phần nhƣ sau: T4 reaction buffer 1µl DNA từ sản phẩm PCR 2µl (100ng) DNA plasmid 1µl (50ng) T4 ligase 1 unit Thêm nƣớc cho tới 10µl Ủ phản ứng ở 160C qua đêm, tinh sạch trực tiếp sản phẩm bằng cách sử dụng cột tinh sạch GFX thu lại bằng 3μl elution buffer. Vector (ng) x DNA chèn (kb) Vector (kb) Tỉ lệ DNA chèn (bp) Vector X 37 3.4.10 Chuyển sản phẩm nối vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có chỉnh sửa) Thực hiện biến nạp theo quy trình sau: - Hút 10µl dịch huyền phù tế bào competent cell đã đƣợc chuẩn bị cho vào eppendorf 1.5 ml, thêm 3µl DNA plasmid tái tổ hợp vào, đảo nhẹ, giữ lạnh trong đá trong 20 phút. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bồn nhiệt 420C, giữ trong 90 giây. - Chuyển nhanh eppendorf trên vào bình nƣớc đá, giữ trong 2 phút. - Thêm 200µl môi trƣờng LB lỏng vào eppendorf và ủ ở 370C trong 1 giờ. - Hút 200µl dịch vi khuẩn đã biến nạp cho lên đĩa môi trƣờng LB có chứa kháng sinh ampicilin nồng độ 100μg/ml, X-gal, IPTG, dùng que trang trang đều trên bề mặt môi trƣờng. - Để đĩa ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô bề mặt. - Lật ngƣợc đĩa, ủ qua đêm ở 370 C (khoảng 14 - 16 giờ). - Quan sát khuẩn lạc trên đĩa petri, bắt những khuẩn lạc trắng cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ. Thực hiện biến nạp theo quy trình trên plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng. Bắt những khuẩn lạc xanh cấy sang môi trƣờng LB lỏng có kháng sinh Ampicillin (60µg/ml) trong 16-18 giờ. Thực hiện tách chiết plasmid theo qui trình ở mục 3.4.6.1. 38 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các quy trình biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn Hình 4.1 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 10:1.5 (A) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 10:1.5 phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 500µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100 µl dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C. C A B 39 Hình 4.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khuẩn ở thể tích 3:0.5 (A)Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1giờ, cấy 10 µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X-gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (B) Hình chụp gần; (C) Biến nạp chỉ có tế bào khả nạp không có plasmid (thể tích là 10µl tế bào khả nạp) phục hồi trong 200µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X- gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C; (D) Biến nạp với tỷ lệ tế bào khả nạp và plasmid theo thể tích (µl) là 3:0.5 phục hồi trong 200 µl môi trường LB lỏng trong 1h, cấy 100µl (nồng độ pha loãng ½) dịch phục hồi lên đĩa môi trường LB agar/X- gal/IPTG, ủ qua đêm ở 370C. A B C D 40 Chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 2 (ở thể tích biến nạp là 3:0.5, và dịch biến nạp đã pha loãng ½ khi trang lên đĩa) cho kết quả tốt hơn chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 1 (ở thể tích biến nạp 3:0.5, và dịch biến nạp không pha loãng khi trang lên đĩa) và chọn lọc thể biến nạp theo quy trình 3 (ở thể tích biến nạp là 10:1.5). Biến nạp theo quy trình 1 cho kết quả chỉ vài khuẩn lạc xanh xuất hiện và có rất nhiều khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng. Điều này có thể giải thích là do trong quá trình làm thí nghiệm đã có một số tế bào tự bản thân nó có khả năng kháng lại với kháng sinh hoặc là do thao tác trang X-gal không đều ở xung quanh đĩa nên các tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng không có X-gal để phân hủy vì vậy chỉ cho khuẩn lạc trắng hoặc tế bào đã tiếp nhận plasmid nhƣng quá trình phục hồi và biểu hiện của gen LacZ diễn ra chậm (đối với khuẩn lạc này khi quan sát kỹ sẽ thấy màu xanh nhạt). Kết quả biến nạp theo quy trình 2 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và khuẩn lạc trắng ít hơn rất nhiều so với biến nạp theo quy trình 1. Nhƣ vậy cho thấy quy trình 2 hiệu quả biến nạp tốt hơn và thể tích biến nạp nhƣ vậy là hợp lí. Khuẩn lạc mọc rời rạc, dễ cho thao tác chọn khuẩn lạc để cấy chuyền sang môi trƣờng lỏng nhân sinh khối để li trích đƣợc plasmid. Kết quả biến nạp theo quy trình 3 cho nhiều khuẩn lạc xanh hơn và cũng cho nhiều khuẩn lạc trắng hơn so với biến nạp theo quy trình 2. Khuẩn lạc xanh tuy nhiều nhƣng mọc dày rất khó cho việc chọn khuẩn lạc tăng sinh trong môi trƣờng lỏng. Nhƣ vậy, qua kết quả chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng LB agar/Amp/X- gal/IPTG chúng tôi thấy biến nạp theo quy trình 2 là thích hợp. 4.2 Tách chiết DNA plasmid. 4.2.1 Tách chiết DNA plasmid Bắt những khuẩn lạc xanh trên môi trƣờng đĩa và tiến hành cấy sang ống nghiệm chứa 3ml môi trƣờng LB lỏng với nồng độ kháng sinh là 60µg/ml nuôi cấy lắc ở 370C qua đêm, chọn ống có sinh khối và tiến hành tách chiết plasmid thu đƣợc kết quả nhƣ sau: 41 Kết quả tách chiết plasmid lần 1 còn lẫn rất nhiều DNA của genome vi khuẩn. Có thể điều này là do khi thêm dung dịch III vào để lâu nên cả DNA plasmid và DNA của bộ gen đều hoàn tính. Với nhận định trên tôi đã tiến hành tách chiết plasmid lần 2 để khẳng định lại quy trình. Nhờ khắc phục những sai sót của lần 1 kết quả của lần tách chiết này cho thấy đã loại đƣợc DNA của genome, thu đƣợc plasmid. Nhƣ vậy, đây là quy trình tách chiết plasmid chuẩn, mọi sai sót xảy ra đều có thể khắc phục. Kết quả tách chiết chủ yếu phụ thuộc nhiều vào thao tác, hóa chất sử dụng đơn giản. Sản phẩm tách chiết có thể dùng để thực hiện phản ứng cắt với enzyme cắt giới hạn, đây là cơ sở để kiểm tra kết quả biến nạp. DNA genome DNA plasmid 3.0kb Hình 4.3 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 1) DNA plasmid 3.0kb Hình 4.4 Sản phẩm tách chiết plasmid trên gel agarose 1% (lần 2) 42 Những điểm cần lƣu ý khi chiết tách plasmid Khi thêm dung dịch II chỉ đảo ngƣợc eppendorf khoảng 5-6 lần sau đó phải thêm dung dịch III ngay để trung hòa dung dịch II. Khi thêm dung dịch III vào phải ly tâm ngay nếu không DNA của bộ gen sẽ phục hồi cấu trúc vì vậy trong sản phẩm plasmid chiết tách sẽ có lẫn DNA của bộ gen. Ở bƣớc 7 và 8 trong quy trình tách chiết, sau khi ly tâm xong phải lấy ra nhẹ nhàng và cẩn thận hút phần dịch nổi bên trên không đƣợc hút xuống phần bên dƣới. 4.2.2 Tách chiết DNA plasmid bằng AurumTM Plasmid Mini Kit Tách chiết plasmid bằng Kit cho hiệu quả tách chiết cao hơn, lƣợng plasmid thu đƣợc nhiều hơn, tinh sạch hơn, thao tác đơn giản, nhanh. Sản phẩm tách chiết không cần phải qua bƣớc tinh sạch để sử dụng cho các bƣớc tiếp theo trong quá trình cloning. 4.3 Phản ứng cắt plasmid bằng enzyme cắt giới hạn EcoRV DC1 EcoRV 1 EcoRV 2 DC2 Hình 4.6 Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid bằng EcoRV trên gel 1% (lần 1) (DC1) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 1) sản phẩm cắt đươc bằng enzyme EcoRV; (DC2) sản phẩm li trích plasmid bằng kit; (EcoRV 2) sản phẩm không cắt được bằng EcoRV. DNA plasmid 3.0kb Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm tách chiết DNA plasmid bằng Kit trên gel agarose 1% 43 Kết quả ở hình trên cho thấy plasmid đã cắt hoàn toàn đúng kích thƣớc, vector đã đƣợc mở vòng tại vùng MCS trở thành dạng thẳng, nhƣng chỉ có sản phẩm tách chiết plasmid ở mẫu đối chứng 1 là đƣợc cắt. Do đó chúng tôi tiến hành phản ứng cắt lần 2 để kiểm tra hoạt tính cắt của enzyme EcoRV thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Mẫu (1) và (2) sản phẩm tách chiết plasmid đã không bị cắt bởi enzyme EcoRV trong khi mẫu (3), (4) đƣợc cắt hoàn toàn. Vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng cắt với enzyme HindIII để kiểm tra sản phẩm tách chiết có phải là plasmid mong muốn hay không thì thu đƣợc kết quả nhƣ sau: DC DC 1 2 Hình 4.9 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% (1), (2): sản phẩm cắt bằng HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết plasmid. DC DC 1 2 3 Hình 4.8 Kết quả điện di sản phẩm cắt bằng HindIII trên gel agarose 1% (1), (2), (3): sản phẩm cắt bằng HindIII; (DC): sản phẩm tách chiết plasmid. DC 4 3 2 1 Hình 4.7 Kết quả điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (lần 2) (DC): sản phẩm đã cắt bằng EcoRV ở lần 1; (1), (2): sản phẩm cắt bằng EcoRV; (3), (4): sản phẩm cắt bằng RsaI. 44 Plasmid đã cắt hoàn toàn và đúng nhƣ kích thƣớc của plasmid đối chứng. Do đó có thể suy ra rằng, trong quá trình làm thí nghiệm plasmid đã bị hƣ site cắt EcoRV trên vùng MCS hoặc enyme EcoRV bị giảm hoạt tính nên không thể nhận biết đƣợc vị trí site cắt EcoRV trên vùng MCS. Vì vậy để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo chúng tôi quyết định chọn sản phẩm cắt bằng HindIII, phủ đầu bằng để thực hiện phản ứng nối. Một số điều cần chú ý khi thực hiện phản ứng cắt RE sẽ giữ đƣợc hoạt tính trong một dung dịch đệm chứa 50% glycerol nếu luôn luôn đƣợc bảo quản ở -200C. Khi tiến hành phản ứng thủy giải, chỉ lấy RE ra vào phút chót sau khi đã đủ các thành phần khác và giữ trong đá trong thời gian càng ngắn càng tốt trƣớc khi cất trở lại vào -200C. Nên tiến hành phản ứng trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo thuận lợi cho sự tiếp xúc enzyme-cơ chất. Tuy nhiên để đảm bảo RE không vƣợt quá 1/10 thể tích phản ứng vì glycerol ức chế hoạt động enzyme. 4.4 Tinh sạch đoạn DNA và plasmid sau khi cắt bằng HindIII 4.4.1 Tinh sạch đoạn DNA Trong đề tài này, chúng tôi thực hiện chèn đoạn DNA từ sản phẩm PCR vào plasmid vì vậy chúng tôi tiến hành phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA sau đó tinh sạch đoạn DNA trên. Kết quả điện di cho thấy quá trình tinh sạch đã loại hết các thành phần tạp trong sản phẩm PCR. Tuy nhiên, phƣơng pháp tinh sạch trực tiếp đoạn DNA từ sản phẩm PCR chỉ nên sử dụng khi sản phẩm PCR muốn tinh sạch không có band phụ, nếu sản phẩm PCR có band phụ thì phải tinh sạch từ gel. Phản ứng tạo đầu bằng cho đoạn DNA bằng enzyme Klenow Fragment không kiểm tra đƣợc bằng phƣơng pháp điện di trên gel agarose, kết quả này chỉ có thể kiểm tra khi đã chèn vào đƣợc plasmid và biến nạp vào vi khuẩn. 45 Một số điều cần lƣu ý khi thực hiện tinh sạch đoạn DNA : Khi nhỏ elution buffer phải nhỏ ở giữa cột, từng giọt một, khi rửa hoặc thêm capture buffer nhỏ trên thành của cột, cân eppendorf trƣớc khi để gel cắt vào, gel phải đƣợc cắt vụn ra sau khi cân, sau quá trình ủ 60oC agarose phải tan hết, sử dụng agarose có nhiệt độ nóng chảy thấp (low melting agar). Chuẩn bị trƣớc khi tinh sạch: máy điện di cần đƣợc rửa sạch, bảng gel cần đƣợc rửa sạch, sử dụng dung dịch dệm TAE riêng, sau mỗi lần chạy điện di thay buffer mới. Sử dụng ethidium bromide loãng hơn ½ nồng độ thƣờng, phải đựng hộp riêng, phải thay mới khi nhuộm mẩu, tính toán số mẩu trƣớc khi chạy điện di, đổ gel tƣơng ứng số mẫu và giữ trong buffer. 4.4.2 Tinh sạch plasmid Plasmid sau khi dùng enzyme HindIII cắt mở vòng mới tinh sạch. Kết quả điện di cho thấy sản phẩm sau khi tinh sạch đã loại hết tạp trong sản phẩm. Hình 4.10 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX (1), (2): sản phẩm PCR kích thước 900bp; (3): ladder 100bp. Hình 4.11 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch đoạn DNA bằng phƣơng pháp cắt gel và thu hồi lại bằng cột GFX (1): sản phẩm PCR kích thước 223bp; (2), (3): sản phẩm PCR kích thước 900bp. 46 Từ sản phẩm trên tiến hành phản ứng phủ đầu bằng cho plasmid và tinh sạch lại bằng qui trình tinh sạch sử dụng RNAse. Sau đó tiến hành pha loãng chuẩn bị cho phản ứng nối. 4.5 Biến nạp plasmid tái tổ hợp Thực hiện phản ứng phủ đầu bằng cho sản phẩm PCR và plasmid sau khi cắt HindIII, tinh sạch sản phẩm, nối 2 đoạn sản phẩm PCR vào plasmid. Biến nạp plasmid đã nối này vào vi khuẩn E. coli DH5α khả nạp,và thực hiện tƣơng tự với plasmid chƣa tái tổ hợp để làm đối chứng thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Cả hai trƣờng hợp biến nạp đọan DNA 900bp và 223bp đều cho toàn khuẩn lạc màu trắng trên môi trƣờng LB agar/Amp/X-gal/IPTG. TS DC Hình 4.12 Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch trên gel agarose1% (DC) plasmid cắt bằng HindIII chưa tinh sạch; (TS) plasmid cắt bằng HindIII tinh sạch bằng cột GFX. Hình 4.13 Biến nạp plasmid tái tổ hợp (A) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 223bp; (B) Biến nạp plasmid đã chèn đoạn 900bp; (C) Biến nạp plasmid chưa tái tổ hợp. C A B 47 Kết quả trên có thể là đã biến nạp hoàn toàn plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn hoặc những khuẩn lạc màu trắng trên là do các tế bào vi khuẩn bị đột biến kháng kháng sinh tạo thành. Còn trên đĩa đối chứng xuất hiện cả khuẩn lạc màu xanh và trắng. 4.6 Tách chiết plasmid tái tổ hợp Chọn lọc những khuẩn lạc trắng, mọc rời rạc cấy sang môi trƣờng LB lỏng/ampicillin (60µg) nhân sinh khối qua đêm tiến hành tách chiết theo qui trình ở mục 3.4.6.1. Chạy điện di chỉ thu đƣợc toàn genome của vi khuẩn. Còn kết quả li trích plasmid của khuẩn lạc xanh trên đĩa đối chứng thì thu đƣợc DNA plasmid. Nhƣ vậy biến nạp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli DH5α chƣa thành công. Điều này có thể là do nồng độ plasmid sau khi cắt và nối sử dụng để biến nạp là chƣa phù hợp, vì chúng tôi đã không thể tính toán đƣợc nồng độ plasmid hao hụt sau khi thực hiện phản ứng cắt và nối. Hoặc cũng có thể thời gian sốc nhiệt quá ngắn nên plasmid không thể biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Do đó, trong quá trình phủ đầu bằng cho đoạn DNA và plasmid phải luôn chú ý cẩn thận tính toán các thành phần trong phản ứng cho phù hợp. Còn trong quá trình thiết lập phản ứng nối phải chú ý đến việc tính toán tỉ lệ thể tích giữa vector và đoạn DNA, nhiệt độ ủ của phản ứng sao cho phù hợp và nên thêm các chất xúc tác cho phản ứng nối nhƣ: PEG hay Hexamminecobalt chloride. Biến nạp vào vi khuẩn nên sốc nhiệt ở thời gian lâu hơn, thử nghiệm nhiều qui trình khác nhau về thời gian sốc nhiệt và kèm theo đối chứng. Vì thời gian giới hạn chúng tôi đã không thử nghiệm nhiều quy trình khác nhau nên đã không cho ra đƣợc kết quả nhƣ mong muốn. 48 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Qua quá trình tiến hành thí nghiệm chúng tôi đã thu đƣợc kết quả nhƣ sau: - Hoàn thiện quy trình chuẩn bị tế bào khả nạp bằng phƣơng pháp hóa học, tế bào khả nạp có thể tế bào khả nạp có thể giữ ở -70oC với glycerol trong thời gian 2 tháng. - Hoàn thiện đƣợc quy trình biến nạp plasmid pBluescript SK(+/-) vào vi khuẩn E. coli DH5α và chọn lọc thể biến nạp trên môi trƣờng chứa Ampicillin/X-gal/IPTG. - Đã đƣa ra quy trình tách chiết plasmid chuẩn bằng phƣơng pháp SDS – kiềm (theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989 có sửa đổi) Bắt những khuẩn lạc màu xanh từ đĩa petri cấy sang môi trƣờng LB lỏng có chứa kháng sinh. Chọn những ống có vi khuẩn phát triển tiến hành chiết tách plasmid theo quy trình sau Bƣớc 1: Hút dịch vi khuẩn từ mỗi ống cho vào mỗi eppendorf 1.5 ml, ly tâm để thu sinh khối ở 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C Bƣớc 2: Hút bỏ dịch bên trên, hút dịch vi khuẩn từ các ống nghiệm tƣơng ứng cho vào, ly tâm 10000 vòng/phút, trong 5 phút ở 200C, lặp lại cho đến khi hết dịch nuôi cấy trong ống nghiệm. Bƣớc3: Cho 150 ml dung dịch I vào mỗi eppendorf chứa sinh khối, vortex đến khi sinh khối vi khuẩn tan ra hết. Bƣớc 4: Thêm 200 ml dung dịch II, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần, sau đó thêm tiếp 150 ml dung dịch III, đảo nhanh eppendorf 5-6 lần. Bƣớc 5: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 200C. Thu hết dịch nổi cho vào eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 6: Cho vào mỗi eppendorf chứa dịch nổi vừa mới thu đƣợc 1µl RNAse, ủ ở 370C trong1 giờ. Bƣớc 7: Cho vào mồi eppendorf 300µl phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1) vortex đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C . Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. 49 Bƣớc 8: Cho vào mỗi eppendorf trên 300µl chloroform/isoamylalcohol, lắc đều, ly tâm 10000 vòng/phút trong 5 phút ở 200C. Thu dịch nổi cho vào các eppendorf mới tƣơng ứng. Bƣớc 9: Thêm vào mỗi eppendorf trên 300µl isopropanol, và ủ ở -200C trong 1 giờ, ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 200C. Hút bỏ dịch nổi, thu kết tủa. Bƣớc 10: Rửa tủa trên bằng cách cho 500µl ethanol 70% lạnh vào mỗi eppendorf, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C. Hút bỏ dịch nổi, thu lấy kết tủa và làm khô bằng cách úp ngƣợc trên giấy thấm. Bƣớc 11: Cho TE vào mỗi eppendorf để hòa tan kết tủa. Tùy lƣợng mẫu mà thêm vào. Bƣớc 12: Hút 4µl chạy điện di trên agarose nồng độ 1% trong 30 phút để xem kết quả chiết tách. - Đã thiết lập đƣợc phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn để kiểm tra kết quả tách chiết. 5.2 Kiến nghị - Tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện các quy trình cắt bằng HindIII, nối đoạn DNA từ phản ứng PCR vào plasmid pBluescript SK(+/-) và biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α. - Thực hiện phản ứng PCR kiểm tra sản phẩm nối giữa plasmid pBluescript SK(+/-) đã cắt bằng HindIII và đoạn DNA từ phản ứng PCR, giải trình tự sản phẩm nối trên. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt 1. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2002, Sinh học phân tử, NXB Giáo Dục. 2. Lê Đình Lƣợng, 2001, Nguyên lý kỹ thuật di truyền, NXB Khoa Học Kỹ Thuật. 3. Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền, Lê Thị Thủy Tiên, Huỳnh Ngọc Oanh và Cao Cƣờng, 2002, Công nghệ gen, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM. 4. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005, Sinh học phân tử - Giới thiệu phương pháp và ứng dụng, NXB Nông Nghiệp TP. HCM. 5. Phạm Duy, Huỳnh Văn Thái, 2005, Xây dựng quy trình biến nạp đoạn DNA vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α, Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Công nghệ sinh học, Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 6. Phạm Thành Hổ, 8-2003, Di truyền học, NXB Giáo Dục. 7. Tô Minh Châu, Vƣơng Thị Việt Hoa, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp và Nguyễn Thúy Hƣơng, 1999, Vi sinh vật học đại cương, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM – Trƣờng Đại Học Nông Lâm TP. HCM. 8. Trần Linh Thƣớc, Đặng Thị Phƣơng Thảo và Nguyễn Đức Hoàng, 2002, Giáo trình thực tập kỹ thuật di truyền I, NXB Đại Học Quốc Gia TP. HCM 29 trang. Tài liệu tiếng nƣớc ngoài. 9. T.A. Brown, 1997, Gen cloning an introduction, third edition, Chapman & Hall. 10. Samuel S.M.Sun, 1994 Method in plant molecular biology and Agricultural biotechnology, A laboratory Training manual, ROC Taiwan. 11. Sambrook and Russell, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, Vol I, Vol II, Vol III, CSH. 12. Sambrook J, E. F. Fritsch and T. Maniatis, 1989, Molecular cloning A laboratory manual, second edition, CSH. 13. Wolgang Schumann, 1995, Genetic Engineering Techniques. Các website 51 52 PHỤ LỤC 1. Công thức pha một số môi trƣờng dùng trong thí nghiệm  Môi trƣờng LB (Luria – Bertain) lỏng Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút  Môi trƣờng LB agar Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút.  Môi trƣờng LB + Ampicillin Trytone 10g Bacto yeast extract 5g Natrichlorua (NaCl) 10g Agar 15g Thêm nƣớc cho tới 1000 ml Hấp khử trùng ở 1210c trong 20 phút, sau đó để nguội đến 40-450c bổ sung Ampicillin nồng độ cuối 100µg/ml  Môi trƣờng LB + Ampicillin + X-gal + IPTG ( môi trƣờng chọn lọc thể biến nạp E.coli) Cho 20 µl X-gal (20mg/ml) vào mỗi đĩa petri chứa môi trƣờng LB + Ampicillin, dùng que trang, trang đều trên đĩa, để cho mặt thạch khô. Thêm tiếp 20µl IPTG (300mg/ml), trang đều trên đĩa và để cho khô mặt thạch 53 2. Các dung dịch dùng cho chiết tách DNA plasmid Dung dịch I Tris – HCl 25mM pH8 Glucose 50mM EDTA 10mM Dung dịch II (nên pha trƣớc khi dùng) Sodium dodecyl sulfat (SDS) 10% 100 µl NaOH 5N 40µl Nƣớc cất 2 lần 860µl Dung dịch III Glacial acetic 0.2M Potassium acetat 0.2M Dung dịch TE (pH8) Tris – HCl (pH8) 10mM EDTA (pH8) 1mM Dung dịch TAE 1X Tris – acetat 40mM EDTA (pH8) 1mM Loading dye Bromophenol blue 0.25% Glycerol trong TAE 1X 40% Dung dịch Lysozyme: Hoà tan 10mg trong 1ml dung dich Tris-HCl 10mM pH 8.0. Dung dịch X-gal 20mg/ml Cân 20 mg X-gal hoà tan trong 1ml dung dịch dimethylformamide (dung dịch này rất độc, phải cẩn thận khi thao tác) Dung dịch IPTG 20mg/ml (stock) Cân 20 mg IPTG (dạng bột) hoà tan trong 1 ml nƣớc khử ion, sau đó lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,2μm 54 Dung dịch kháng sinh Ampicillin 100mg/ml Cân 100mg ampicillin dạng bột, hoà tan trong 1ml nƣớc khử ion, lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ 0,45μm. 3. Các loại buffer  Buffer SuRE 10X pH 8.0(buffer enzym cắt) Tris-HCl 100mM NaCl 1M MgCl2 50mM 2-Mercaptoethanol 10mM  NEBuffer 1X pH 7.9 (buffer của enzym DNA polymerase I large fragment) NaCl 50mM Tris-HCl 10mM MgCl2 10mM DTT 1mM  Ligation buffer 10X Tris-HCl pH 7.6 660mM MgCl2 66mM DTT 100mM ATP 660μM 55 Hình 1 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II SK (+/-) 56 Hình 2 Sơ đồ cấu trúc pBluescript II KS (+/-)