Luận văn Đánh giá tác động của chế phẩm viên nén từ nhân hạt neem (azadirachta indica a. juss) lên ngài gạo (corcyra cephalonica st.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** Lê Thị Diệp Phụng ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM VIÊN NÉN TỪ NHÂN HẠT NEEM (Azadirachta Indica A. Juss) LÊN NGÀI GẠO (Corcyra Cephalonica St.) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Cơng nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh Tháng 9/ 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HCM BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM VIÊN NÉN TỪ NHÂN HẠT NEEM (Azadirachta Indica A. Juss) LÊN NGÀI GẠO (Corcyra Cephalonica St.) Giáo Viên Hƣớng dẫn: Sinh viên thực Hiện: Th.s Lê Thị Thanh Phƣợng Lê Thị Diệp Phụng Tp. Hồ Chí Minh Tháng 9/ 2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARMENT OF BIOTECHNOLOGY ***000*** TO APPRECIATE THE EFFECT OF PRODUCTION FROM NEEM KERNEL (Azadirachta Indica A. Juss) ON RICE MOTH ( Corcyra Cephalonica St.) Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student MSc Lê Thị Thanh Phƣợng Lê Thị Diệp Phụng Term: 2002 - 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *************** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM VIÊN NÉN TỪ NHÂN HẠT NEEM (Azadirachta Indica A. Juss) LÊN NGÀI GẠO (Corcyra Cephalonica St.) Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khĩa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ DIỆP PHỤNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/ 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *************** KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM VIÊN NÉN TỪ NHÂN HẠT NEEM (Azadirachta Indica A. Juss) LÊN NGÀI GẠO (Corcyra Cephalonica St.) Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.S. LÊ THỊ THANH PHƢỢNG LÊ THỊ DIỆP PHỤNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/ 2006 LỜI CÁM ƠN ! Trƣớc tiên, tơi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu nhà trƣờng, cùng quý Thầy cơ thuộc khoa Cơng Nghệ Sinh Học, Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, đã truyền đạt cho tơi những kiến thức, kinh nghiệm, chuyên mơn quý báu trong suốt thời gian học tập tại trƣờng. Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cơ Lê Thị Thanh Phƣợng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện cũng nhƣ đĩng gĩp những ý kiến quý báu để tơi hồn thành luận văn này. Xin cảm ơn ban giám đốc, tồn thể các thầy cơ, anh chị, phịng ban trong Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tơi rất nhiều trong thời gian thực tập tại Viện. Xin cảm ơn tất cả các bạn bè đã động viên giúp đỡ tơi trong những năm tháng học tập tại trƣờng. Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn và biết ơn sâu sắc đến các bậc sinh thành, những ngƣời đã nuơi dạy tơi nên ngƣời, các anh, chị và các em trong gia đình đã luơn động viên, chia sẻ, giúp đỡ tơi trong suốt quá trình học tập. Chân thành cám ơn Sinh viên Lê Thị Diệp Phụng TĨM TẮT Đề tài “ Nghiên cứu tạo chế phẩm viên nén từ nhân hạt neem (Azadirachta Indica A. Juss) để phịng trừ ngài gạo (Corcyra Cephalonica St.)” đƣợc thực hiện tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Thủ Đức, TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 2 tới tháng 7/2006. Trong đĩ 4 chế phẩm (ký hiệu là NV1, NV2, NV3, NV4) đƣợc tạo từ dầu neem 10 % phối hợp với dịch chiết bánh dầu ở bốn nồng độ 5 – 10 – 15 – 20 %, trên nền bột talc cĩ kết hợp thêm dầu thơng và chất bảo quản BHT (butylhydroxi toluene), đƣợc thử nghiệm hiệu lực đối với ngài gạo. Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại trong điều kiện phịng thí nghiệm. Số liệu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp phân tích biến lƣợng ANOVA và phân nhĩm xếp hạng các nghiệm thức bằng trắc nghiệm Duncan. Trị số LD50 đƣợc tính theo phƣơng pháp phân tích probit. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: + Kết quả phân tích bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) cho hàm lƣợng azadirachtin, nimbin và salannin tƣơng ứng là 930,69 ppm; 262,58 ppm và 1027,48 ppm trong dầu neem và 7703,61 ppm; 841,09 ppm và 3214,56 ppm trong dịch chiết bánh dầu. + Kết quả thử nghiệm bƣớc đầu trên ngài gạo (Corcyra cephalonica St.) cho thấy các chế phẩm đều cĩ khả năng ức chế ngài gạo theo nhiều phƣơng thức và mức độ khác nhau * Gây chết: giá trị LC50 của các chế phẩm ở thời điểm 7 ngày sau xử lý đƣợc xác định là 0,8948; 0,3503; 0,1948 và 0,1881 g/ dm3, tƣơng ứng với NV1, NV2, NV3 và NV4. * Ức chế sinh sản: Chế phẩm NV3 và NV4 cĩ hiệu lực ức chế sức sinh sản của ngài gạo (thơng qua giảm số lƣợng trứng và tỉ lệ trứng nở) mạnh hơn nhiều so với chế phẩm NV2 và NV1. Các nghiệm thức xử lý chế phẩm đều khác biệt cĩ ý nghĩa so với đối chứng. * Ngồi ra, các chế phẩm cũng gây biến dạng thành trùng và làm giảm cĩ ý nghĩa trọng lƣợng nhộng, qua đĩ gĩp phần hạn chế sự phát triển của ngài gạo theo thời gian. MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm ơn.......... ............................................................................................. iii Tĩm tắt............. ............................................................................................... iv Mục lục………… ............................................................................................ v Danh sách các bảng ......................................................................................... viii Danh sách các hình và biểu đồ ........................................................................ ix 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................. 1 2. TỔNG QUAN.............................................................................................. 3 2.1. Phân loại và đặc điểm thực vật học ................................................. 3 2.1.1. Phân loại ............................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm thực vật học ......................................................... 4 2.2. Đặc tính sinh thái, kỹ thuật trồng, nhân giống và lai tạo ................. 5 2.2.1. Đặc tính sinh thái ................................................................. 5 2.2.2. Kỹ thuật nhân giống ............................................................. 5 2.2.2.1. Nhân giống tự nhiên ................................................. 5 2.2.2.2. Nhân giống nhân tạo ................................................ 5 2.2.2.3. Nhân giống vơ tính ................................................... 6 2.2.3. Chọn lọc và lai tạo ............................................................... 6 2.2.4. Kỹ thuật trồng rừng neem ở nƣớc ta .................................... 7 2.3. Các hoạt chất sinh học chính chiết xuất từ neem ............................. 7 2.3.1. Azadirachtin ......................................................................... 8 2.3.2. Salannin ................................................................................ 8 2.3.3. Nimbin ................................................................................. 9 2.3.4. Nimbidin .............................................................................. 9 2.4. Giá trị của cây neem ........................................................................ 10 2.4.1. Dùng làm thuốc bảo vệ thực vật và phân bĩn ...................... 10 2.4.2. Dùng làm dƣợc liệu .............................................................. 10 2.4.3. Bảo vệ mơi trƣờng ............................................................... 11 2.4.4. Những cơng dụng khác của neem ........................................ 11 2.5. Tình hình cây neem tại Việt Nam .................................................... 11 2.5.1. Tình hình trồng trọt .............................................................. 11 2.5.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng các hoạt chất sinh học trong cây neem ...................................................................... 12 2.6. Tình hình kho ngũ cốc trên thế giới và Việt Nam. Các nhĩm cơn trùng gây hại. Các phƣơng pháp bảo quản hiện nay ............... 14 2.6.1. Tình hình kho ngũ cốc ......................................................... 14 2.6.1.1. Trên thế giới ............................................................. 14 2.6.1.2. Tại Việt Nam ............................................................ 14 2.6.2. Các cơn trùng gây hại kho nơng sản và hậu quả .................. 15 2.6.3. Sơ lƣợc về ngài gạo (Corcyra cephalonica St.) ................... 16 2.6.3.1. Ngài gạo (Corcyra cephalonica St.) ........................ 16 2.6.3.2. Phân loại và hình thái ............................................... 16 2.6.3.3. Tác hại của ngài gạo ................................................. 16 2.6.4. Các phƣơng pháp bảo quản kho nơng sản hiện nay ............. 18 2.6.4.1. Các phƣơng pháp chung ........................................... 18 2.6.4.2. Bảo quản nơng sản bằng phƣơng pháp hĩa học ....... 19 2.6.4.3. Một số loại thuốc kiểm sốt cơn trùng kho hiện nay 19 2.7. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ............................ 20 2.7.1. Nguyên tắc ........................................................................... 20 2.7.2. Những yếu tố ảnh hƣởng ...................................................... 20 2.7.3. Ứng dụng .............................................................................. 21 2.7.3. Các bộ phận chính của máy HPLC ...................................... 21 2.8. Sơ lƣợc về một số chất phụ gia và bảo quản ................................... 21 2.8.1. Các chất chống oxy hĩa giúp tăng cƣờng bảo quản ............ 20 2.8.2. Các chất hấp phụ .................................................................. 22 2.8.2.1 Talc ............................................................................ 22 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 24 3.1. Nội dung nghiên cứu ........................................................................ 24 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................. 24 3.2.1. Kỹ thuật ép dầu từ nhân hạt neem và chiết xuất hoạt chất sinh học từ bánh dầu neem .................................................... 24 3.2.2.Định lƣợng các hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu neem .......................................................... 26 3.2.3. Tạo chế phẩm dạng viên nén với hoạt chất chính là dầu neem và dịch chiết bánh dầu ................................................. 27 3.2.4. Phƣơng pháp nhân nuơi ngài gạo trong phịng thí nghiệm .. 28 3.2.5. Thử nghiệm sinh học: đánh giá một số tác động cơ bản của 4 chế phẩm đối với ngài gạo ........................................... 29 3.2.5.1. Vật liệu ..................................................................... 29 3.2.5.2. Phƣơng pháp tiến hành ............................................. 29 3.2.6. Phƣơng pháp đánh giá kết quả ............................................. 30 3.2.7. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm............................................. 30 3.2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu.................................................... 30 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN ........................................................................... 32 4.1. Hiệu suất thu nhận dầu neem bằng phƣơng pháp ép nguội ............. 32 4.2. Kết quả định lƣợng một số hoạt chất chính trong chế phẩm neem ..................................................................................... 32 4.3. Tạo chế phẩm viên nén .................................................................... 33 4.3.1. Chất hấp phụ ........................................................................ 33 4.3.2. Hoạt chất chính .................................................................... 34 4.4. Thử nghiệm chế phẩm ..................................................................... 35 4.4.1. Tác động gây chết của các chế phẩm đối với ngài gạo ........ 35 4.4.2. Động thái gây chết của các chế phẩm đối với ngài gạo ....... 40 4.4.3. Tác động ức chế sinh trƣởng và phát triển ........................... 44 4.4.3.1. Tác động ức chế vũ hĩa của các chế phẩm đối với ngài gạo ................................................................................. 45 4.4.3.2. Tác đơng gây biến dạng sâu, nhộng, thành trùng ..... 46 4.4.4. Tác động ức chế sinh sản của các chế phẩm đối với ngài gao ................................................................................. 48 5. KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ ................................................................................ 51 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................... 52 7. PHỤ LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 4.1: Hàm lƣợng (ppm) của một số hoạt chất trong dầu neem và dịch chiết bánh dầu ............................................................................ 32 Bảng 4.2: Tỷ lệ (%) ấu trùng chết sau 3 ngày ................................................. 34 Bảng 4.3: Tỷ lệ chết (%) của ấu trùng sau 3 ngày xử lý chế phẩm ................. 35 Bảng 4.4: Độc tính của các chế phẩm đối với ngài gạo (giá trị LD50 ở thời điểm 3 ngày sau xử lý) ................................................................. 37 Bảng 4.5: Tỷ lệ chết (%) của ấu trùng sau 7 ngày xử lý ................................. 38 Bảng 4.6: Độc tính của các chế phẩm đối với ngài gạo (giá trị LD50 ỏ thời điểm 7 ngày sau xử lý) ................................................................. 39 Bảng 4.7: Tỷ lệ (%) thành trùng tạo thành dƣới tác dụng của các chế phẩm ........................................................................................................ 45 Bảng 4.8: Số trứng và tỷ lệ nở ......................................................................... 48 Bảng 4.9: Trọng lƣợng nhộng trung bình (g) ở các nghiệm thức xử lý chế phẩm neem 0,5 g .......................................................................... 49 DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ HÌNH TRANG Hình 2.1: Vƣờn neem giống 5 năm tuổi tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Thủ Đức, TP.HCM ................................................................................. 3 Hình 2.2: Các bộ phận chính của cây neem .................................................... 13 Hình 2.3: Ngài gạo........................................................................................... 17 Hình 2.4: Vịng đời ngài gạo ........................................................................... 17 Hình 2.5: Tác hại của ngài gạo ........................................................................ 18 Hình 3.1: Quy trình ép dầu và chiết xuất hoạt chất từ nhân hạt neem ............ 25 Hình 3.2: Một số máy mĩc trang thiết bị......................................................... 27 Hình 3.3: Quá trình tạo chế phẩm viên nén ..................................................... 28 Hình 3.4: Phƣơng pháp nhân nuơi ngài gạo trong phịng thí nghiệm ............. 29 Hình 3.5: Quá trình tiến hành thí nghiệm ........................................................ 31 Hình 4.1: Kết quả 3 ngày sau xử lý chế phẩm ................................................. 37 Hình 4.2: Tác động gây biến dạng của chế phẩm neem .................................. 47 Biểu đồ 4.1: Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 0,5 g/ dm 3 ................................................................................................ 40 Biếu đồ 4.2: Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 1,0 g/ dm 3 ................................................................................................ 41 Biểu đồ 4.3: Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 1,5 g/ dm 3 ................................................................................................ 42 Biểu đồ 4.4: Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 2,0 g/ dm 3 ................................................................................................ 43 Biểu đồ 4.5: Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 2,5 g/ dm 3 ................................................................................................ 44 Biểu đồ 4.6: Trọng lƣợng nhộng trung bình ở các nghiệm thức xử lý chế phẩm neem ở liều lƣợng 0,5 g/ dm3 ............................................. 50 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt Vấn Đề Đối với ngƣời nơng dân, quá trình tạo ra sản phẩm từ lúc trồng trọt tới lúc thu hoạch là cả một quá trình gian nan vất vả, nhƣng quá trình bảo quản sản phẩm sau thu hoạch sao cho khơng hao hụt về số lƣợng và chất lƣợng cũng là một vấn đề khơng đơn giản. Ngồi việc bị thiệt hại nặng nề về kinh tế, sản phẩm sau thu hoạch nhiều khi cịn bị nhiễm độc tố do vi sinh vật hoặc các đối tƣợng khác tạo ra, gây hại cho sức khỏe ngƣời tiêu dùng. Do đĩ việc bảo quản các nguồn nơng sản sau thu hoạch là hết sức cần thiết. Giải quyết tốt vấn đề này sẽ kéo dài thời gian sử dụng của sản phẩm và hạ thấp đƣợc mức thiệt hại cĩ thể xảy ra. Riêng tại nƣớc ta và nhiều nƣớc nhiệt đới khác, cơn trùng đƣợc xem là một trong những nguyên nhân gây tổn thất kho lƣơng thực nghiêm trọng nhất. Trong đĩ ngài gạo (Corcyra cephalonica St.) thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) là một trong những đối tƣợng khá nguy hiểm do tính dễ thích nghi và sức phá hoại mạnh của chúng. Các thuốc hố học xử lý cơn trùng kho hiện nay tuy vẫn bảo đảm hiệu quả phịng trị nhất định nhƣng lại gây ra những hậu quả nghiêm trọng nhƣ phá vỡ cân bằng sinh học do chúng tiêu diệt cả những lồi cĩ ích, gây ra hiện tƣợng bộc phát dịch hại. Ngồi ra, sự lạm dụng thuốc bảo vệ thực vật cũng là nguyên nhân làm cho nhiều lồi dịch hại trở nên kháng thuốc và quan trọng hơn là gây ơ nhiễm mơi trƣờng, để lại nhiều tác hại nghiêm trọng đối với sức khỏe con ngƣời. Do đĩ, từ lâu ngƣời ta cĩ xu hƣớng tìm những nguồn thuốc cĩ gốc thảo mộc để thay thế. Trong đĩ, cây neem (Azadirachta indica A. Juss) với những dẫn xuất của nĩ đƣợc chứng minh là cĩ hiệu quả cao trong kiểm sốt cơn trùng mà khơng gây hại cho các lồi thiên địch và khơng ảnh hƣởng xấu đến mơi trƣờng. Nhiều kết quả nghiên cứu trƣớc của Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã cho thấy một số dịch chiết hạt neem cĩ nguồn gốc Việt Nam (Ninh Thuận) cĩ khả năng phịng trị nhiều lồi cơn trùng và vi nấm (Vũ Đăng Khánh, 2003; Lê Thị Thanh Phƣợng, 2004). Vì vậy, đề tài tiếp tục mở ra hƣớng nghiên cứu sử dụng dầu ép và chiết xuất bánh dầu để làm nguyên liệu sản xuất thuốc phịng trị cơn trùng kho nĩi chung hay phịng trị ngài gạo nĩi riêng. Nghiên cứu nhằm nâng cao khả năng xơng hơi của các hoạt chất neem, đảm bảo hiệu quả lâu bền của sản phẩm và sự tiện lợi, an tồn trong khâu xử lý là một trong những mục tiêu chính của đề tài này. 1.2. Giới Hạn Đề Tài Do hạn chế về thời gian, đề tài chỉ tập trung nghiên cứu chế tạo và đánh giá hiệu lực của chế phẩm xơng hơi từ nhân hạt neem đối với ngài gạo ở điều kiện phịng thí nghiệm. 1.3. Địa Điểm Và Thời Gian Thực Hiện Đề Tài Đề tài đƣợc thực hiên tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới (Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh) trong thời gian từ tháng 2 tới tháng7. Chƣơng 2 TỔNG QUAN 2.1. Phân loại và đặc điểm thực vật học (Dennis, 1992; schmutterer, 1996) 2.1.1. Phân loại Cây neem cĩ tên khoa học là Azadirachta indica A. Juss. Thuộc: Bộ: Rutales Bộ phụ: Rutineae Họ: Meliaceae Họ phụ: Melioideae Tộc: Melieae Giống: Azadirachta Lồi: Indica Hình 2.1 Vƣờn neem giống 5 năm tuổi tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Thủ Đức, TP. HCM Cĩ ba cây tƣơng tự với cây Azadirachta indica A. Juss đĩ là: Melia azadirachta L., Melia indica, Antelaca azadirachta. Ngƣời ta thƣờng hay lẫn lộn giữa cây neem và cây Melia azadirachta L. nhiều nhất bởi hình dáng bên ngồi của chúng hơi giống nhau. Nhƣng thực ra chúng dễ dàng đƣợc phân biệt dựa vào đặc điểm của lá: Azadirachta indica A. Juss cĩ lá kép lơng chim một lần, trong khi đĩ Melia azadirachta L cĩ lá kép lơng chim hai lần. Cây neem cĩ rất nhiều tên gọi tùy theo từng nƣớc và địa phƣơng. Riêng tại Ấn Độ, cây neem cĩ hơn 100 tên khác nhau tùy theo vùng nhƣ: neem, nim, vepa, nimba, vembu, limba... Tại Pakistan, cây Azadirachta indica đƣợc gọi là Nimmi, ở Đức gọi là Indischer zedrach, ở Myanma (Burma) gọi là Tamarkha. Tại Việt Nam, do đặc tính chịu hạn của cây neem nên Giáo Sƣ Tiến Sĩ Lâm Cơng Định, ngƣời đầu tiên đem giống cây này từ Senegan về Việt Nam (1981) đã đặt tên Việt Nam cho nĩ là “cây xoan chịu hạn”. 2.1.2. Đặc điểm thực vật học Azadirachta indica A Juss là lồi cây thân gỗ, phát triển nhanh, ƣa ánh sáng. Cây cao trung bình 15 - 20 m, ở điều kiện thích hợp cây cĩ thể đạt tới 35 - 40 m. Thân cây thẳng trịn, cĩ thể đạt đƣờng kính 1,5 – 3,5 m. Vỏ cây cứng, nứt nẻ, cĩ vảy, màu nâu đỏ, chứa khoảng 14 % tannin. Nhựa cây cĩ màu trắng. Tâm gỗ cĩ màu hơi đỏ và khi để lâu trong khơng khí trở nên nâu đỏ. Gỗ cĩ những đặc tính giống gỗ gụ với những đƣờng vân nổi khá đẹp, rất bền và ít bị mối mọt. Neem là cây thƣờng xanh với tán lá rộng và cành lá xum xuê. Vào mùa khơ, lá cây hơi vàng nhƣng khi mùa mƣa tới cây lập tức xanh tƣơi trở lại và đâm chồi nảy lộc. Trong điều kiện khắc nghiệt nhƣ hạn hán kéo dài, cây cĩ thể rụng lá một phần hay rụng tồn bộ. Cây neem cĩ lá kép lơng chim một lần, dài khoảng 20 - 40 cm, gồm 7 - 17 cặp lá chét, màu xanh đậm, cuống ngắn, mép lá cĩ răng cƣa. Những lá cịn non thì cĩ màu hơi đỏ hoặc tía. Lá neem cĩ chứa khoảng 50 % cacbonhydrate, 20 % chất xơ, 15 % protein, 5 % chất béo, 8 % tro, 2 % canxi và chứa những axit amin thiết yếu khác. Ngồi ra lá neem cịn chứa carotene và axit ascorbic. Hoa neem nhỏ, mọc thành chùm, màu trắng, mùi thơm dịu thu hút nhiều ong bƣớm tới thụ phấn. Chùm hoa mọc ra từ nách lá, dài rũ xuống khỗng 25 cm, gồm từ 150 - 250 hoa. Một hoa riêng lẻ cĩ 5 cánh hoa, dài 5 - 6 mm, rộng 8 - 11 mm. Trên một cây cĩ cả hoa đực lẫn hoa lƣỡng tính. Bầu nhụy cĩ 3 ơ, ở đáy hoa cĩ 10 bao phấn khơng cĩ lơng. Tuyến mật hình vịng nối với bầu nhụy. Quả hạch hình bầu dục, quả trƣởng thành dài khoảng 1,4 – 2,8 cm, rộng 1,0 - 1,5 cm. Quả chín cĩ màu vàng, với lớp thịt ngọt bao quanh 1 - 2 hạt cứng. Cây neem trồng đƣợc 3 - 5 năm bắt đầu ra hoa kết quả. Tuy nhiên, năng suất quả cao và ổn định lúc cây khoảng 10 năm tuổi, từ 30 - 50 kg quả/ cây. Thời gian từ lúc nở hoa tới lúc quả chín khoảng 10 - 12 tuần, trong đĩ từ lúc quả cịn xanh tới lúc quả chín khoảng 4 – 8 tuần. Hạt neem bao gồm vỏ và nhân hạt. Vỏ hạt cứng, thơng thƣờng cĩ 1 - 2 nhân hạt bao bọc bởi lớp vỏ lụa màu nâu. Chiều dài hạt khoảng 0,9 - 2,2 cm, chiều rộng 0,5 - 0,8 cm. Hạt sẽ giảm tỉ lệ nảy mầm từ 2 - 3 tuần sau khi thu hoạch. Thời han cất trữ hạt giống khơng nên quá sáu tháng. Trong năm đầu tiên, cây neem thƣờng phát triển chậm. Từ năm thứ hai trở đi, cây phát triển nhanh hơn. Trong điều kiện thuận lợi, cây neem cĩ thể sống lên đến 150 - 200 năm. 2.2. Đặc tính sinh thái, kỹ thuật trồng, nhân giống và lai tạo 2.2.1. Đặc tính sinh thái. Theo Dennis (2002); Terwari (1992); Gunasena và Marambe (1998), cây cĩ thể phát triển tới chiều cao 30 m và đạt chu vi 2,5 m, cĩ thể sống trong điều kiện vơ cùng khắc nghiệt của mơi trƣờng nơi mà những lồi cây khác khơng thể sống đƣợc: * Khí hậu: neem thích nghi với mọi loại khí hậu, cĩ thể sống sĩt trong điều kiện thời tiết vơ cùng khắc nghiệt, nơi nhiệt độ cĩ thể lên tới 50 o C Và hạ xuống 0oC ở độ cao 1500 m so với mặt nƣớc biển. * Loại đất: neem cĩ thể phát triển mọi nơi trong vùng đất thấp nhiệt đới, cĩ thể sống ở nơi đất nghèo dinh dƣỡng, khơ, cứng, nơng, đất cát pha sét, đất cát cố định, đất mặn, đất kiềm với pH lên tới 8,5. Neem cĩ khả năng làm giàu dinh dƣỡng cho đất, tích tụ nƣớc cho vùng đất mà nĩ sinh sống, đồng thời trung hịa đất axit. * Nhu cầu nƣớc: neem cần ít nƣớc và ƣa ánh sáng, phát triển tốt nhất ở vùng cĩ lƣợng mƣa hằng năm 400 – 1200 mm. Tuy nhiên, nĩ vẫn cĩ thể sống tốt ở nơi cĩ lƣợng mƣa thấp 200 - 250 mm. Cây neem khơng thể sống đƣợc trong điều kiện băng tuyết hay lạnh giá kéo dài, hoặc nơi ngập nƣớc. 2.2.2 Kỹ thuật nhân giống (Schmutterer, 1996) 2.2.2.1 Nhân giống tự nhiên Neem cĩ thể mọc tự nhiên từ hạt hoặc từ rễ. Chim, dơi đĩng vai trị quan trọng trong phát tán hạt qua việc ăn trái tƣơi sau đĩ khạc ra hạt rơi vãi khắp nơi, khỉ và những lồi chim lớn ăn trái neem sau đĩ thải ra phân cĩ lẫn hạt neem. 2.2.2.2. Nhân giống nhân tạo Cĩ nhiều phƣơng pháp trong nhân giống nhân tạo: - Gieo hạt trực tiếp Hạt giống sau khi thu hái bảo quản 2 - 3 tuần thì đem xử lý để gieo nhằm đảm bảo tỉ lệ nảy mầm. Thời han cất trữ hạt giống khơng nên để quá 6 tháng, trong trƣờng hợp bảo quản trong tủ lanh cĩ thể kéo dài thêm vài tháng. Tuy nhiên, một vài chứng minh, hạt cất trong kho cĩ thể nảy mầm sau 5 năm với tỉ lệ sống sĩt lên tới 42 %. - Trồng bầu Hạt đƣợc gieo trong bầu ở vƣờn ƣơm.Tùy vào nhiệt độ và việc cung cấp nƣớc mà hạt sẽ nảy mầm sau 8 - 15 ngày. 2.2.2.3. Nhân giống vơ tính * Nuơi cấy mơ: tạo cây con từ mơ sẹo lá chét, lá mầm, đoạn thân, cuống lá…trong mơi trƣờng “Murashige và Skoop” cĩ bổ sung cytokinnins. Thơng thƣờng cây con cĩ thể trồng ra đất sau 12 tuần khi cây đạt chiều cao 7,5 - 10 cm và rễ cái dài khoảng 15 cm. Nếu trồng trong mùa mƣa và kiểm sốt cỏ dại tốt thì tỉ lệ sống sĩt sẽ rất cao. * Chiết ghép Phƣơng pháp này đã đƣợc thực hiện ở Ấn Độ và một số nƣớc khác. Chuẩn bị gốc ghép từ cây giống 1 - 2 tuổi (chiều dài rễ đạt khoảng 22 cm) và cành ghép khoảng 5 cm. Ghép cành lên gốc rồi quấn lại bằng bao đay, giữ trong bĩng râm cho tới khi trồng, rễ và chồi phải đƣợc tỉa bớt trƣớc khi đem trồng. * Giâm cành Cành neem đƣợc giâm trong túi PE từ 6 tháng tới 1 năm cĩ thể đem trồng. Tuy nhiên nhƣợc điểm là cành giâm khơng phát triển rễ cọc, nên khi gặp điều kiện bất lợi của mơi trƣờng nhƣ giĩ bão, cây dễ bị bật gốc và đổ ngã. Điều này cũng dễ xảy ra đối với cây nuơi cấy mơ hiện nay. 2.2.3. Chọn lọc và lai tạo Các nghiên cứu chọn lọc và lai tạo hiện nay nhằm mục đích tạo đƣợc cây neem cho năng suất quả cao cũng nhƣ hàm lƣợng dầu và các hoạt chất sinh học cao. Tuy nhiên, các nghiên cứu dựa vào yếu tố di truyền để tạo ra những cây cĩ tính trạng tốt cho đến nay vẫn chƣa thu đƣợc kết quả khả quan. Phƣơng pháp lai tạo giữa những lồi Azadirachta khác nhau để tạo ra cây lai cĩ tính trạng tốt cũng đã đƣợc tiến hành, nhƣng tới nay vẫn chƣa cĩ kết quả gì nổi bật. 2.2.4. Kĩ thuật trồng rừng neem ở nƣớc ta (Lâm Cơng Định, 1985, 1991; Bùi Anh Tuấn, 2003) Neem đƣợc trồng với mật độ: 1100 cây/ ha, kích thƣớc hố 40 × 40 × 40 cm, kỹ thuật đào hố, lấp hố, trồng tƣơng tự nhƣ những lồi cây khác, cách thức phối hợp và bố trí cây trồng cụ thể nhƣ sau: * Trồng hỗn giao giữa xoan chịu hạn với keo lá tràm, mât độ 1100 cây/ ha (keo lá tràm 550 cây/ ha + xoan chịu hạn 550 cây/ ha), phối hợp cây trồng theo hàng. Mục đích trồng keo lá tràm để che chắn giĩ, cải tạo đất, tạo điều kiện ban đầu cho xoan sinh trƣởng và phát triển thuận lợi. * Trồng theo mơ hình nơng lâm kết hợp theo hai phƣơng pháp sau: - Trồng theo băng: trồng cây rừng và cây nơng nghiệp theo từng băng xen kẽ nhau. Trên băng trồng rừng, tiến hành trồng keo lá tràm và neem hỗn giao với mật độ 1100 cây/ ha. Phƣơng pháp này bên cạnh việc đem lại lợi ích kinh tế cịn kết hợp việc chăm sĩc cây nơng nghiệp để chăm sĩc và bảo vệ cây lâm nghiệp, cho nên cây lâm nghiệp sinh trƣởng rất tốt. - Trồng theo lƣới ơ vuơng: đƣợc thực hiện bằng cách bố trí trồng rừng xung quanh, ở giữa chừa lại để sản xuất nơng nghiệp. Diện tích trồng rừng và diện tích sản xuất nơng nghiệp bằng nhau. Ƣu điểm của phƣơng pháp là vành đai rừng xung quanh sẽ bảo vệ đƣợc cây nơng nghiệp khỏi các dịch hại nhƣ bệnh do nấm, vi khuẩn…. Hai mơ hình trên đã thành cơng tại tỉnh Ninh Thuận. Cây nơng nghiệp cĩ năng suất ổn định, khơng bị sâu rầy phá hoại, cây lâm nghiệp sinh trƣởng và phát triển thuận lợi. 2.3. Các hoạt chất sinh học chính chiết xuất từ cây neem Từ neem, ngƣời ta đã chiết xuất ra rất nhiều hợp chất cĩ khả năng phịng trừ nhiều lồi cơn trùng, bên cạnh đĩ, chúng cịn đƣợc dùng để làm thuốc sát trùng, thuốc giảm đau, thuốc ngừa thai, mỹ phẩm…và nhiều ứng dụng thực tiễn khác. Cho đến nay, ngƣời ta đã chứng minh là neem cĩ khả năng ức chế hơn 400 lồi dịch hại, bao gồm: cơn trùng, nấm, vi khuẩn, virus, tuyến trùng. Trong đĩ, azadirachtin, nimbin, salannin, nimbidin là những hoạt chất sinh học cĩ tác dụng phịng trị cơn trùng, đƣợc chiết chủ yếu từ hạt neem (Dennis, 1992; Gupta và Sharma, 1998) 2.3.1. Azadirachtin Azadirachtin là một trong những hoạt chất đầu tiên đƣợc tách chiết từ neem, cĩ cơng thức phân tử C35H44O16, đƣợc cơng nhận là cĩ hoạt tính ngán ăn mạnh đối với nhiều loại cơn trùng. Một số kết quả nghiên cứu cho thấy nĩ cĩ hiệu lực tới 90 % đối với nhiều lồi sâu bọ. Azadirachtin khơng giết chết cơn trùng một cách trực tiếp mà thay vào đĩ nĩ ngăn chặn và phá vỡ quá trình sinh trƣởng và sinh sản của cơn trùng gây hại. Azadirachtin cĩ cấu trúc và hình dạng tƣơng tự với nhiều loại hormone quan trọng trong cơ thể cơn trùng, nên chúng cĩ khả năng làm xáo trộn hệ nội tiết, gây ra những rối loạn trao đổi chất trong cơ thể cơn trùng. Azadirachtin tập trung chủ yếu trong nhân hạt neem, trung bình 2 - 4 mg/ 1g nhân hạt neem, chiếm 0,2 – 0,8 % trọng lƣợng hạt. Ngồi ra azadirachtin cũng cĩ trong lá và thân cây neem nhƣng hàm lƣợng rất thấp. Do những đặc tính trên mà azadirachtin đƣợc sử dụng để sản xuất thuốc trừ sâu thay thế cho thuốc hố học, cĩ hiệu quả cao, ít độc đối với ngƣời, gia súc và khơng ảnh hƣởng xấu đến mơi trƣờng. Cấu trúc của Azadirachtin 2.3.2. Salannin Salannin cũng cĩ hoạt tính gây ngán ăn mạnh và đặc biệt là chống lại sự lột xác của cơn trùng. Trong hạt, hàm lƣợng salannin thƣờng ở trong khoảng 15 - 1247 mg/ g (Eeswara và cộng sự, 1996). Ngồi ra salannin cịn đƣợc tách chiết từ cây M. azedarach và M. volkensii . salannin, deacetylsalannin, và salannol photo-oxidized salannin 2.3.3. Nimbin Nimbin cũng là một trong những hoạt chất đầu tiên đƣợc tách chiết từ hạt và lá neem. Nimbin đƣợc báo cáo hiện diện trong mơ sẹo nuơi cấy từ vỏ thân cây neem nhƣng biến mất sau 3 tháng (Schmutterer, 1996). Nimbin cĩ hoạt tính kháng virus mạnh, đặc biệt hiệu quả đối với virus gây bệnh trên cây cà chua, bệnh đậu mùa, bệnh trên gia cầm. Cấu trúc của nimbin 2.3.4. Nimbidin Cấu trúc của minbidin Nimbidin là thành phần chủ yếu gây ra vị đắng ở hạt neem cũng nhƣ trong dịch chiết. Nimbidin chiếm khoảng 2 % trong nhân hạt neem (Eeswara và cộng sự, 1996). Nimbidin cũng cĩ hoạt tính kháng virus mạnh giống nhƣ nimbin. 2.4. Giá trị của cây neem 2.4.1. Dùng làm thuốc bảo vệ thực vật và phân bĩn Các hoạt chất sinh học phân bố khắp các bộ phận của cây neem. Tùy điều kiện và mục đích sử dụng cĩ thể tạo ra các sản phẩm phục vụ nơng nghiệp nhƣ sau: * Dịch chiết nhân hạt neem: Ngâm 50 g nhân hạt neem đã nghiền nát trong 1 lít nƣớc. Hạt chuẩn bị lấy dịch chiết khơng nên để quá 8 - 10 tháng do sau 8 tháng lƣợng azadirachtin trong hạt thấp. Sau đĩ cho hỗn hợp vào vải lọc, thu lấy dịch chiết. Cần thêm vào chất nhũ hố trƣớc khi phun lên lá để diệt cơn trùng. * Dịch chiết lá neem:1 kg lá neem xanh đã nghiền nát ngâm trong 5 lít nƣớc, để qua đêm. Sau đĩ đem lọc và thêm vào chất nhũ hĩa. Dịch chiết này hữu hiệu trong phịng trị nhiều lồi nấm gây bệnh cây và một số cơn trùng. * Dầu neem: là dầu ép hoặc ly trích từ nhân hạt neem. Nồng độ sử dụng thơng thƣờng là 30 ml dầu neem pha trong 1 lít nƣớc rồi thêm chất nhũ hĩa, phun vào sáng sớm hay chiều. Dầu neem kiểm sốt đƣợc nhiều lồi cơn trùng chích hút và ăn lá. * Bánh dầu neem: là phần cịn lại sau khi ép lấy dầu, với khoảng 1,07 – 1,36 % lƣu huỳnh, 2 – 3 % nitơ, 25,4 % protein thơ, 2 – 3 % đạm, 1 % lân, 1,4 % kali. Vì vậy, bánh dầu neem đƣợc coi là nguồn phân bĩn đầy hứa hẹn. Khi bĩn vào đất nĩ bảo vệ rễ cây khỏi tuyến trùng và kiến, làm cho đất màu mỡ. * Lá neem tƣơi và khơ: vừa cĩ vai trị diệt sâu hại, vừa làm thức ăn cho gia súc khi trộn với cỏ khơ do chứa nhiều protein, khống chất, carotene…. Lá neem cũng là nguồn phân bĩn tốt và an tồn. 2.4.2. Dùng làm dƣợc liệu Đến nay những thành phần khác nhau từ neem đã đƣợc chứng minh cĩ hiệu lực trong điều trị những bệnh nhƣ viêm khớp, ung thƣ, bệnh răng miệng, tiểu đƣờng, sốt rét, ung nhọt, bệnh ngồi da nhƣ lở loét phong cùi, bệnh gây ra bởi virus, bệnh bạch biến. Đặc biệt, neem cũng đƣợc báo cáo cĩ khả năng chữa đƣợc stress và điều khiển tỷ lệ sinh đẻ. Ngồi ra, vỏ cây neem cũng cĩ cơng dụng cầm máu, bổ gan, trị đàm và sát trùng da. Neem cịn đƣợc dùng để sản xuất mỹ phẩm nhƣ là kem bơi mặt trị mụn, sơn mĩng tay, dầu gội đầu, kem đánh răng… 2.4.3. Bảo vệ mơi trƣờng Do đặc tính sinh thái ƣu việt của neem: phát triển tốt trên đất nghèo dinh dƣỡng, sức chiu hạn cao, mà cịn cĩ khả năng cải thiện độ dinh dƣỡng và kết cấu của đất cát nghèo. Theo Lâm Cơng Định (1998), neem cĩ thể đáp ứng những tiêu chí trồng rừng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Ngồi ra, neem cịn đƣợc trồng để che mát, chắn giĩ, chống lại hiện tƣợng sa mạc hố, hiện tƣợng đất bị xĩi mịn, hạn chế lũ lụt, gĩp phần phủ xanh đồi trọc đất trống, mang lại màu xanh cho trái đất. Tại Châu Phi, trong dãy khu vực những nƣớc từ Somalia đến Mauritiania, neem đƣợc trồng để ngăn cản sự xâm lấn của sa mạc Sahara. Ở nƣớc ta: neem đƣợc trồng ở Ninh Thuận, Bình Thuận để chống lại hiện tƣợng xâm thực của cát, hạn chế hiện tƣợng cát di động, bảo vệ vùng ven biển. 2.4.4. Những cơng dụng khác của neem Ở Ấn Độ, neem đƣợc trồng để trang trí hay lấy bĩng mát, tạo cảnh quan xinh đẹp cho đƣờng phố, cơng sở. Gỗ neem màu nâu đỏ, thơm, sớ gỗ mịn, khá nặng, dùng để chế tạo hàng gia dụng cao cấp, hoặc sử dụng trong xây dựng, làm xe kéo, cán gỗ cho các dụng cụ và nơng cụ. Gỗ neem bền ít bị tấn cơng bởi mối mọt nên thích hợp làm cột nhà. Ngồi ra gỗ neem cũng là nguồn than củi cĩ chất lƣợng cao. Vỏ neem chứa tannin phục vụ cho cơng nghệ thuộc da, cơng nghệ nhuộm, nhựa mủ làm kẹo gum. Dầu neem cịn dùng để bơi trơn máy mĩc. Lớp thịt quả cĩ thể dùng để sản xuất khí metan. 2.5. Tình hình cây neem tại Việt Nam 2.5.1. Tình hình trồng trọt Năm 1981, lƣợng hạt neem giống ít ỏi mang về từ Senegal đƣợc Giáo Sƣ Lâm Cơng Định trồng tại khuơn viên trụ sở Lâm Nghiệp tỉnh Thuận Hải cũ, nay thuộc Sở Nơng Nghiệp Và Phát Triển Nơng Thơn tỉnh Bình Thuận (hiện nay cịn 1 cây do chính giáo sƣ trồng năm 1984 tại văn phịng Sở). Đúng nhƣ mong đợi, cây xoan cĩ nguồn gốc châu phi này đã tỏ ra thích nghi tốt với điều kiện khí hậu và thổ nhƣỡng của Bình Thuận, sinh trƣởng nhanh (nhất là vào mùa khơ hạn) và khơng bị sâu bệnh. (Lâm Cơng Định, 1998) Hiện nay, với những đặc tính nổi bật, neem đã đƣợc nhân giống và gieo trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên khắp nƣớc ta, đặc biệt là những nơi cĩ điều kiện mơi trƣờng khắc nghiệt nhƣ miền cát bỏng duyên hải rộng mấy trăm ngàn ha. * Cho đến nay đã phát triển 1000 ha neem tại hai tỉnh Bình Thuận và Ninh Thuận. Bình Thuận cũng đang triển khai dự án trồng 1850 ha neem dự kiến hồn tất trƣớc 2008. * Năm 1999, ban quản lý rừng phịng hộ Ninh Phƣớc, Ninh Thuận đã đƣa giống neem vận động ngƣời dân trồng thử nghiệm. Sau 6 năm phát triển trên nền cát khơ nĩng bỏng nhất nƣớc ta, cây neem đã chứng minh hiệu quả kinh tế - sinh thái của nĩ, đem lại thu nhập ý nghĩa cho ngƣời dân ở đây. Neem trồng sau ba đến bốn năm thì cho quả, hạt neem giống bán với giá từ 20.000đ/ kg – 50.000 đ/ kg. Ngƣời già yếu ở nhà nhận gia cơng đãi hạt neem rồi phơi khơ, cũng kiếm đƣợc từ 15.000 – 20.000 đ/ ngày. Thực tế tại vùng quê nghèo khĩ này, ngƣời dân đã xem cây neem là lồi cây “cứu đời mình”. * Ở Cam Ranh, Khánh Hịa cũng đã trồng thử nghiệm 7 ha neem. Khu bảo tồn thiên nhiên Trà Cú cũng đã trồng 100 ha neem để phủ xanh đất trống đồi trọc, tạo vành đai chống cháy rừng và bảo vệ rừng. 2.5.2. Tình hình nghiên cứu ứng dụng hoạt chất sinh học trong cây neem Đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu liên quan đến neem ở nƣớc ta. Từ năm 1999, Viện Sinh Học Nhiệt Đới bắt đầu thử nghiệm tác động của dầu neem đối với bọ hà phá hại khoai lang, kết quả cho thấy dầu neem cĩ khả năng xua đuổi và làm giảm mức độ kí sinh và sinh sản của bọ hà – cylas fomycarius F (Nguyễn Thị Quỳnh và ctv, 2001; Nguyễn Phƣơng Thảo và ctv, 2001). Bên cạnh đĩ, Viện cũng đã nghiên cứu và hồn thiện quy trình nhân giống cây neem invitro. Một số nghiên cứu về hiệu lực của các dịch chiết nhân hạt neem đối với ngài gạo, rầy nâu, sâu xanh da láng cũng đã đƣợc thực hiện tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới (Nguyễn Thị Minh Hà, 2001; Nguyễn Thị Thuỷ, 2001; Lê Thị Thanh Phƣợng, 2004). Theo Vũ Đăng Khánh (2003), dịch chiết từ lá và hạt neem cĩ khả năng ức chế Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum và kiềm hãm sự sinh độc tố Aflatoxin B1 của nấm Aspergillus flavus. a b c d e f Hình 2.2. Các bộ phận chính của cây neem a. Thân neem b, c. Lá neem d. Hoa neem e. Quả neem f. Hạt neem 2.6. Tình hình kho ngũ cốc trên thế giới và Việt Nam. Các nhĩm cơn trùng gây hại. Các phƣơng pháp bảo quản hiện nay 2.6.1. Tình hình kho ngũ cốc 2.6.1.1. Trên thế giới Theo thống kê của liên hợp quốc, mỗi năm trung bình thiệt hại của thế giới về lƣơng thực chiếm từ 15 - 20 %, tính ra tới 130 tỷ đơ la, đủ nuơi đƣợc 200 triệu ngƣời trong một năm (Trần Minh Tâm, 2002) Tổn thất trong kho ngũ cốc do rất nhiều nguyên nhân, cĩ thể chia làm ba nhĩm chính nhƣ sau: * Yếu tố con ngƣời: sử dụng, vận chuyển, bảo quản. * Yếu tố phi sinh vật: khí hậu, thời tiết. * Yếu tố sinh vật: tất cả những sinh vật cĩ hại, sử dụng vật chất trong kho làm thức ăn, làm nơi cƣ trú và phát triển. Trong quá trình bảo quản, sự hao hụt của nơng sản đƣợc biểu hiện ở hai dạng: hao hụt trọng lƣợng và chất lƣợng * Hao hụt về trọng lƣợng: sự giảm trọng lƣợng ở sản phẩm khi bảo quản, xảy ra do hậu quả của các hiện tƣợng lý học (bốc hơi nƣớc, sự xáo trộn, vỡ nát khi vận chuyển sắp xếp, bảo quản), hiện tƣợng sinh học (hạt, củ, quả hơ hấp thì vật chất khơ sẽ mất đi, sự sinh sản của cơn trùng cĩ hại trong sản phẩm) * Hao hụt về chất lƣợng: do những quá trình bất lợi nhƣ sự nảy mầm sớm, sự hơ hấp và những biến đổi hố sinh, tác động của vi sinh vật và cơn trùng, sự hƣ hỏng do chuột, chim, sự xay xát cơ giới… Tĩm lại, sự hao hụt về trọng lƣợng và chất lƣợng là khơng thể tránh khỏi nhƣng sự hao hụt này khơng đƣợc vƣợt quá tiêu chuẩn quy định, do đĩ những biện pháp kỹ thuật của cơng nghệ sau thu hoạch và kỹ thuật bảo quản là nội dung chủ yếu trong chiến lƣợc phát triển nơng thơn. 2.6.1.2. Tại Việt Nam Nƣớc ta là một nƣớc cĩ nền nơng nghiệp nhiệt đới ẩm, quanh năm bốn mùa luơn cĩ sản phẩm sau thu hoạch, do đĩ việc bảo quản sau thu hoạch là hết sức cần thiết. Điều này giúp đảm bảo thu nhập nâng cao đời sống nơng dân cũng nhƣ phát triển nền kinh tế quốc dân, sản xuất hàng hố xuất khẩu. Theo Trần Minh Tâm (2002), tính trung bình đối với các loại hạt, tổn thất sau thu hoạch là 10 %, cây cĩ củ 10 – 20 %, rau quả 10 – 30 %, hằng năm trung bình thiệt hại 15 %, tính ra hàng vạn tấn lƣơng thực bị bỏ đi. Nƣớc ta là một nƣớc thuộc vùng nhiệt đới ẩm giĩ mùa, một năm cĩ hai mùa chính là mùa mƣa và mùa khơ, do đĩ cơng tác bảo quản sau thu hoạch cũng chịu ảnh hƣởng bởi yếu tố khí hậu (nhiệt độ và ẩm độ), đĩ là yếu tố ngoại cảnh mà cĩ tác động thúc đẩy các hoạt động sống của hạt và các sản phẩm khác nhƣ quá trình hơ hấp nảy mầm…đồng thời cịn tạo điều kiện cho sự phát sinh phát triển của các sinh vật gây hại trong kho. 2.6.2. Các cơn trùng gây hại trong kho nơng sản và hậu quả. Trong kho ngũ cốc cĩ rất nhiều yếu tố gây hao hụt nơng sản, trong đĩ cơn trùng phá hại (thuộc nhĩm sinh vật gây hại kho) là gây ra những thiệt hại nghiêm trọng và nặng nề nhất, trong một thời gian ngắn chúng cĩ thể sinh sơi nảy nở rất nhanh chĩng, phá hại một lƣợng vật chất gấp nhiều lần nhu cầu thực tế cần cho chúng dinh dƣỡng. Chúng cĩ thể sống trong điều kiện khắc nghiệt trong kho (nhiệt độ rất cao, ẩm độ thấp), một số cĩ thể sống trong điều kiện ẩm độ của thức ăn khoảng 1 %. Ở cơn trùng phá hại kho cĩ thể chia tuổi sinh thái thành ba mốc: tuổi trƣớc sinh sản, tuổi sinh sản, tuổi sau sinh sản. Tuổi trƣớc sinh sản thƣờng rất dài và là giai đoạn phá hại trực tiếp nghiêm trọng nhất. Khi xuất hiện hàng loạt các cá thể trƣởng thành cũng là lúc chúng hồn thành một giai đoạn phá hoại nghiêm trọng nhất. Theo FAO (Food and Agriculture Organization – Tổ chức lƣơng nơng thế giới), hằng năm tổn thất về ngũ cốc dự trữ trên thế giới vào khoảng 10 %: 13 triệu tấn ngũ cốc bị mất do cơn trùng và 13 triệu tấn bị mất giá trị. Thơng thƣờng, các nƣớc nhiệt đới và bán nhiệt đới thiệt hại nặng hơn các nƣớc ơn đới (Bùi Cơng Hiển, 1995). Tác hại do cơn trùng kho gây ra biểu hiện ở việc: * Làm bẩn vật chất bảo quản do chúng thải ra cặn bã nhƣ tơ, phân, xác ấu trùng, nhộng. * Chúng là vật truyền nhiễm bệnh cho ngƣời và động vật nuơi. * Chúng mang các vi sinh vật kí sinh, nấm gây bệnh… Tĩm lại, sự mất mát do cơn trùng kho gây ra cũng rất to lớn và đa dạng. Hậu quả: * Hao hụt trọng lƣợng, giảm chất lƣợng hàng hĩa. * Mất tiền chi phí giải quyết hậu quả. * Mất uy tín trong buơn bán. * Mất hạt giống cho vụ mùa kế tiếp. 2.6.3. Sơ lƣợc về Ngài Gạo (Corcyra cephalonica St) 2.6.3.1. Ngài Gạo (Corcyra cephalonica St) Theo Bùi Cơng Hiển (1995), ngài gạo là một trong những lồi cơn trùng phá hại kho nơng sản. Ngài gạo cĩ thân màu xám hay vàng nâu, mặt bụng pha màu đen. Cánh trƣớc màu xám đen và hẹp hơn cánh sau. Màu sắc từ giữa cánh trở vào gốc cánh thẩm hơn, rìa ngồi cánh cĩ những chấm nhỏ. Cánh sau rộng cĩ màu xám trắng. Đầu và ngực màu nâu nhạt, thơng thƣờng con đực bé hơn con cái, cụ thể thân con đực dài 6 - 9 mm, cịn con cái 7 - 11 mm, sải cánh con đực dài 14 - 18 mm, cịn con cái 14 - 24 mm. Ấu trùng thƣờng tiết ra các sợi tơ để kết dính các hạt lại thành tổ để ăn hại. 2.6.3.2. Phân loại và hình thái Ngài gạo thuộc: - Họ Pyralidae (bộ ngài sáng). - Bộ Lepidoptera (bộ cánh vảy). Ngài gạo cĩ cánh khá rộng, phủ đầy vảy nhỏ và thon hình búp măng ở mút cánh. Nền cánh màu nâu nhạt với những đƣờng gân màu hơi tối. Lúc nghỉ ngơi, từ đầu cho đến mút cánh đo đƣợc 8 - 13 mm. Ngài cái cĩ kích thƣớc to hơn ngài đực rất nhiều. Con cái cĩ xúc tu dài và cong hƣớng xuống phía dƣới, trong khi xúc tu ở con đực thƣờng ngắn và khĩ thấy. Sâu non màu trắng với những lỗ thở ở mỗi đốt dày lên ở phía sau nhƣ hình lƣỡi liềm. Kén màu trắng và rất dai. 2.6.3.3. Tác Hại Của Ngài Gạo. Là một trong số những cơn trùng gây hại phổ biến đối với kho nơng sản, đặc biệt là rất phổ biến ở vùng nam và đơng nam Châu Á. Chúng thƣờng nhả tơ để kết dính các hạt nơng sản và ẩn mình trong đĩ, làm cho nơng sản bị đĩng cục. Hàng hố nhanh chĩng bị giảm sản lƣợng và phẩm chất do bị nhiễm bẩn bởi tơ, bên cạnh đĩ cục nơng sản đĩng vĩn cịn gây hƣ hỏng máy mĩc khi xay xát, và chi phí loại bỏ tạp chất nay cũng khá cao. Ngồi ra chúng cịn tấn cơng hạt giống làm hạt mất khả năng nảy mầm. Tập tính sinh sống núp trong các hạt nơng sản cũng là nguyên nhân gây khĩ khăn trong cơng tác phịng trừ lồi cơn trùng gây hại này Hình 2.3. Thành trùng ngài gạo Hình 2.4. Vịng đời của ngài gạo Trứ ng Ấ u trùng Nhộ ng Thành trùng Hình 2.5. Tác hại của ngài gạo 2.6.4. Các phƣơng pháp bảo quản kho nơng sản hiện nay 2.6.4.1. Các phƣơng pháp chung Theo Trần Minh Tâm (2002) để bảo quản kho nơng sản hiện nay cĩ 5 phƣơng pháp chung: * Bảo quản nơng sản ở trạng thái thống: để khối nơng sản tiếp xúc với mơi trƣờng khơng khí bên ngồi nhằm điều chỉnh nhiệt độ, ẩm độ trong kho một cách kịp thời thích ứng với mơi trƣờng, do đĩ giữ đƣợc ẩm độ và nhiệt độ của khối nơng sản ở trạng thái an tồn. * Phƣơng pháp bảo quản kín: đình chỉ sự trao đổi khơng khí giữa nơng sản với mơi trƣờng bên ngồi giữ cho khối nơng sản luơn ở trạng thái an tồn. Mặt khác cĩ nghĩa là bảo quản trong điều kiên thiếu oxy, do đĩ hạn chế quá trình hơ hấp của hạt, hạn chế sự phát sinh phát triển của vi sinh vật và cơn trùng phá hại. * Bảo quản nơng sản ở trạng thái lạnh: nguyên tắc dùng nhiệt độ thấp làm tê liệt các hoạt động của vi sinh vật và cơn trùng * Bảo quản nơng sản bằng phƣơng pháp hố học: dùng thuốc hố học để bảo quản nơng sản, mục đích kìm hãm những hoạt động của khối nơng sản và tiêu diệt mọi hoạt động của sâu mọt, vi sinh vât, các lồi gặm nhấm. Đây là phƣơng pháp cĩ hiệu quả cao, ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi với quy mơ lớn. * Bảo quản trong khí quyển điều chỉnh: bảo quản nơng sản trong khí quyển cĩ điều chỉnh thành phần các chất khí, đồng thời giảm nhiệt độ kho bảo quản nhằm làm chậm các hoạt động sống của nơng sản mà chủ yếu là quá trình hơ hấp. 2.6.4.2. Bảo quản nơng sản bằng phƣơng pháp hố học Là phƣơng pháp sử dụng các chất hố học, chủ yếu là các chất độc để phịng chống, bao gồm các chế phẩm hố học, các sản phẩm cĩ nguồn gốc thực vật. Hiện nay đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến, thơng dụng, hiệu quả nhất trên thế giới và ở Việt Nam. Cĩ nhiều loại khác nhau, mỗi loại cĩ cơng dụng riêng biệt và tính chất sử dụng cũng khác nhau. Muốn sử dụng tốt và hiệu quả cần phải đạt các yêu cầu sau: * Hố chất đƣợc dùng phải cĩ độc lực cao ( hiệu quả cao đối với cơn trùng) * Dễ sử dụng và ít nguy hiểm đối với con ngƣời, rất ít hoặc khơng ảnh hƣởng đến chất lƣợng của hạt và sản phẩm trong kho. * Hố chất đƣợc sử dụng khơng ăn mịn vật liệu xây dựng và các dụng cụ thiết bị trong kho. * Cĩ tính ổn định cao, khĩ nổ, khĩ cháy, rẻ tiền. Trong thực tế hiện nay chƣa cĩ loại thuốc nào cĩ thể đáp ứng đầy đủ những yêu cầu trên, nhƣng căn cứ vào tính chất đầu độc và con đƣờng nhiễm độc của thuốc mà ngƣời ta chia các loại thuốc thành 3 loại: chất độc tiếp xúc, chất độc vị độc, chất độc xơng hơi. Hiện nay các hố chất đƣợc sử dụng phổ biến trong cơng tác bảo quản nơng sản hiện nay là các hố chất xơng hơi do chúng cĩ thể áp dụng cho nhiều đối tƣợng khác nhau, chúng sinh ra khí, khĩi, mù, tác động vào đƣờng hơ hấp làm cơn trùng bị ngạt hoặc bị ngộ độc chết. Ƣu điểm là sát trùng triệt để vì chúng cĩ thể xâm nhập bất cứ chỗ nào trong kho, tuy nhiên nĩ cũng rất nguy hiểm cho ngƣời và gia súc. 2.6.4.3. Một số loại thuốc kiểm sốt cơn trùng kho hiện nay - Thuốc cĩ nguồn gốc hố học: Là những loại cĩ độc tính cao, khơng chỉ đối với sâu mọt mà cịn đối với ngƣời và gia súc…Do đĩ khi sử dụng phải tuân thủ quy định cho từng loại thuốc. Một số hố chất xơng hơi thƣờng dùng hiên nay: * Methyl bromide (CH3BR): là chất lỏng khơng màu, khơng mùi, d = 3,24, cĩ tính thẩm thấu mạnh, cĩ độc tính cao đối với cơn trùng và cũng rất nguy hại đối với ngƣời và gia súc. Methyl bromide hiện nay đã bị cấm sử dụng ở nhiều nƣớc do hậu quả phá hủy tầng ozone và đƣợc cơng bố là một trong những tác nhân gây ung thƣ. * Phosphine: khí, khơng màu, khơng mùi, trong sản xuất cĩ lẫn tạp chất nên cĩ mùi tỏi hay mùi đất đen, tỉ trọng 1,181 gần bằng tỉ trọng khơng khí (dễ thẩm thấu). Phosphine đƣợc coi là thuốc xơng hơi rất độc đối với cơn trùng hại kho, bên cạnh đĩ cũng rất độc cho ngƣời và gia súc. Phosphine tuy ít độc hơn methyl bromide nhƣng sau một thời gian dài sử dụng, hiện nay cũng đang gặp trở ngại do tình trạng kháng thuốc mạnh của nhiều lồi cơn trùng. - Thuốc cĩ nguồn gốc thảo mộc Thuốc thảo mộc diệt trừ sâu hại gồm các chất cĩ trong thực vật nhƣ nicotin trong thuốc lá và thuốc lào, rotenone trong rễ cây dây mật, pakyziron trong củ đậu, azadiarchtin trong cây xoan Ấn Độ, artemisinin trong cây thanh hoa vàng (Phạm văn lầm, 2005) Các chế phẩm cĩ nguồn gốc thảo mộc cũng cĩ tác dụng diệt trừ cơn trùng hại kho nhƣng hiệu lực khơng cao bằng thuốc hố học, tuy nhiên ƣu điểm là ít độc đối với ngƣời và gia súc, khơng ảnh hƣởng xấu tới mơi trƣờng, dễ phân hủy. 2.7. Phƣơng Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao (HPLC) (Phùng Võ Cẩm Hồng, 2004) Đây là phƣơng pháp thƣờng sử dụng để định lƣợng hợp chất thứ cấp, trong đĩ cĩ các hoạt chất trích từ cây neem. 2.7.1. Nguyên tắc Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC - High performance liquid chromatography) dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng khơng trộn lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng yên (pha tỉnh). Pha tỉnh bị hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang). Thơng thƣờng là dung mơi phân cực, pha động thƣờng là nƣớc hoặc dung mơi hữu cơ. Đơi khi pha tĩnh là những chất lỏng ít phân cực lúc đĩ pha động phải là dung mơi phân cực hơn. 2.7.2. Những yếu tố ảnh hƣởng * Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu. * Nguồn cung cấp (điện, khí, nƣớc, hố chất). * Mơi trƣờng (gây nhiễm thêm hoặc mất mẫu, gây ảnh hƣởng sức khoẻ, gây nhiễm bẩn mơi trƣờng xung quanh). 2.7.3. Ứng dụng Phƣơng pháp HPLC cĩ khả năng tách các hợp chất đặc thù nhƣ: * Các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các đối tƣợng nghiên cứu y học , sinh học. * Các hợp chất tự nhiên khơng bền. * Các hợp chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ. Ngồi ra phƣơng pháp HPLC cịn cĩ những ƣu điểm hơn sắc kí cổ điển nhƣ tốc độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng đƣợc nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ dàng vì hầu hết các detector khơng phá huỷ mẫu. Do cĩ nhiều tính năng ƣu việt nên đƣợc ứng dụng phổ biến trong các lĩnh vực: tách các acid nucleic, tách các dƣợc phẩm, tách các steroid, tách các vitamin, tách các chất bảo quản thực phẩm, tách chất bảo vệ thực vật…. 2.7.4. Các bộ phận chính của máy HPLC . 2.222 2.8. Sơ lƣợc về một số chất phụ gia và bảo quản 2.8.1. Các chất chống oxy hố giúp tăng cƣờng bảo quản (Antioxydant) Các chất chống oxy hĩa phải đảm bảo các điều kiện sau: * Khơng độc. * Cĩ hoạt tính cao ở nồng độ thấp (0,01 – 0,02 %). * Nằm ở bề mặt phân cách, cĩ tính kỵ nƣớc khá mạnh, tiếp xúc với khơng khí. * Ổn định với các điều kiện chế biến. Pha độ ng Hệ thố ng chuyể n dung mơi Hệ thố ng bơ m mẫ u Cộ t Detector Chuẩ n bị mẫ u Hệ thố ng xử lý dữ liệ u Một số antioxydant quan trọng : BHT, BHA, tocopherol, axit ascorbic… Trong đĩ BHT, BHA là những chất chống oxy hố đƣợc sử dụng phổ biến nhất. BHT (butylated hydroxytoluen) cĩ cơng thức phân tử 2,6 – di – tert – butyl – 4 – methylphenol), là tinh thể màu trắng với mùi khĩ ngửi, khơng hồ tan trong nƣớc và propylene glycol nhƣng hịa tan tốt trong cồn. BHT đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân chống oxy hĩa, do đĩ nĩ đƣợc dùng trong cơng tác bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm, dƣợc phẩm, nguyên liệu đĩng gĩi, nĩi chung là những sản phẩm cĩ chứa mỡ hoặc dầu. Ngồi BHT, BHA (butylated hydroxyanisole) cũng cĩ chức năng nhƣ BHT. BHT và BHA đƣợc biết là an tồn cho ngƣời và động vật sử dụng. 2.8.2. Các chất hấp phụ Những chất hấp phụ thƣờng đƣợc sử dụng là bột talc, cám gạo, silicagel, than hoạt tính… 2.8.2.1. Talc Talc là 1 loại khống sản, cĩ tên là hydrated magnesium sheet silicate với cơng thức hố học Mg3Si4O10(OH)2. Một tấm talc gồm hàng ngàn phiến cơ bản chồng lên nhau, phiến cơ bản là sự kết hợp của 1 lớp magnesium-oxygen/hydroxyl octahedra kẹp giữa 2 lớp siliconoxygen tetrahedra, mặt ngồi chính của phiến cơ bản này khơng chứa nhĩm hydroxyl hoặc iơn hoạt động, điều này giải thích cho tính kỵ nƣớc và tính trơ của talc. Cĩ nhiều loại talc, tất cả chúng đều mềm, dẹt, kỵ nƣớc, trơ về mặt hĩa học. Trên thực tế talc khơng hịa tan trong nƣớc, tan yếu trong axit và kiềm, khơng gây nổ hay gây cháy. Mặc dù rất ít hoạt động về mặt hố học nhƣng talc lại cĩ một ái lực lớn với các chất hữu cơ. Cơng dụng của talc: Talc là một phần quan trọng trong cuộc sống hằng ngày, đá lát đƣờng đi, tạp chí chúng ta đọc, sợi polyme, sơn… là một trong những sản phẩm làm từ talc. * Trong nơng nghiệp và thực phẩm, talc là tác nhân chống đĩng bánh hiệu quả, chống dính trong thực phẩm (kẹo gum), giúp đánh bĩng gạo, trong quá trình sản xuất dầu oliu, làm tăng sản lƣợng và sự trong của dầu. * Trong cơng nghệ sản xuất giấy, làm láng bề mặt giấy. * Sản phẩm chăm sĩc cơ thể, do tính mềm và trơ, talc đƣợc dùng nhƣ phấn xoa cơ thể, ngày nay nĩ đĩng vai trị quan trọng trong sản xuất mỹ phẩm, phấn hồng, phấn mắt, xà bơng… Chƣơng 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung nghiên cứu Chế tạo và thử nghiệm chế phẩm dạng viên nén để phịng trị ngài gạo với hoạt chất chính trích từ hạt neem trồng tại Việt Nam, bao gồm các giai đoạn nghiên cứu nhƣ sau: * Hồn thiện kỹ thuật ép dầu hạt neem và chiết xuất hoạt chất trong bánh dầu neem bằng ethanol. * Định lƣợng ba hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu: azadirachtin, salannin, nimbin. * Tạo chế phẩm dạng viên nén và thử nghiệm chế phẩm trên ngài gạo trong điều kiện phịng thí nghiệm. 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 3.2.1. Kỹ thuật ép dầu từ nhân hạt neem và chiết xuất hoạt chất sinh học từ bánh dầu neem Hạt neem thu tại tỉnh Ninh Thuận đƣợc rửa cồn 98o sau đĩ sấy khơ ở nhiệt độ 45 – 50oC. Sau đĩ sử dụng máy tách vỏ để thu nhân hạt. Nhân hạt neem đƣợc ép dầu bằng máy ép chuyên dụng hiệu Komet của Đức (cơng suất 10 kg hạt/ giờ). Ƣu điểm của máy là giữ nhiệt độ trong quá trình ép chỉ từ 35 – 40oC. Dầu neem sau khi ép đƣợc giữ ở nhiệt độ 5 – 10oC tránh ánh sáng, thêm chất bảo quản BHT 3 % và tween 5 % tạo thành chế phẩm dầu neem thơ, kí hiệu là DN (dầu neem). Bánh dầu neem (phần bã cịn lại sau khi ép dầu) đƣợc ngâm với ethanol 98o để tách các hoạt chất cịn lại theo tỉ lệ 1: 4 (bánh dầu : ethanol). Sau 24 giờ, dịch chiết thơ đƣợc loại dung mơi bằng máy cơ quay chân khơng ở nhiệt độ 60oC. Thu nhận dịch chiết và bảo quản nhƣ dầu neem, gọi là chế phẩm dịch chiết bánh dầu, kí hiệu - DCBD Hình 3.1. Quy trình ép dầu và chiết xuất hoạt chất từ nhân hạt neem Hạ t neem Tách vỏ V ỏ Nhân hạ t neem Ép dầ u Bánh dầ u Ngâm bánh dầ u Bã neem Cồ n 98 o Dị ch chiế t neem thơ Cơ quay chân khơng Cồ n thu hồ i Dị ch chiế t neem (DCBD) Dầ u neem (DN) Cồ n 980 Sấ y 45-500 C Khuấ y, lắ ng, lọ c Chấ t bả o quả n, nhũ hố Chấ t bả o quả n, nhũ hố 3.2.2. Định lƣợng các hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu neem Theo schneider và Elmer (1987) việc định lƣơng azadirachtin, nimbin và salannin đƣợc tiến hành nhƣ sau: Mẫu sau khi qua lọc (lỗ lọc = 0,45 µm) đƣợc cho vào ống đựng mẫu cĩ thể tích 1,5 ml, sau đĩ đựng vào khay đựng mẫu trong máy HPLC (hiệu Hewlett Packard 1090, series 1 – liquid chromatography) và Tiến hành chạy mẫu với các thơng số sau: - Lƣợng mẫu bơm vào cột: 0,5 µl. - Cột bảo vệ: BondapakTM C18, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 20 mm. - Cột phân tích: BondapakTM C18, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 300 mm. - Dung mơi rửa cột: CH3CN:H2O (55 – 45); tốc độ dịng: 0,5 ml/ phút. - Detector DAD, Bƣớc sĩng 220 nm. Để xây dựng đƣờng chuẩn của hoạt chất chính cần phân tích, sử dụng azadirachtin chuẩn của cơng ty Sigma (USA), nimbin và salannin chuẩn của cơng ty Trifolio GmbH (Germany). Kết quả đƣờng chuẩn nhƣ sau: - Azadirachtin: y = 3,72 x + 34,58; Hệ số tƣơng quan R = 1. - Nimbin: y = 14,49 x + 170,5; Hệ số tƣơng quan R = 0,998. - Salannin: y = 12,634 x + 73,83; Hệ số tƣơng quan R = 1. Trong đĩ: y - diện tích pick, x - nồng độ hoạt chất (ppm). Định lƣợng hoạt chất trong mẫu thử đƣợc tính tự động nhờ phần mềm chemstation hãng Aligent-technology cho kết quả nồng độ hoạt chất (ppm) cĩ trong mẫu thử. a b c d Hình 3.2. Một số máy mĩc, trang thiết bị a. Máy tách vỏ b. Máy cơ quay chân khơng c. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao d. Máy ép dầu hạt neem (komet - Đức) 3.2.3. Tạo chế phẩm dạng viên nén với hoạt chất chính là dầu neem và dịch chiết bánh dầu. Chế phẩm đƣợc tạo thành trên cơ sở phối trộn dầu neem và dịch chiết bánh dầu với chất hấp phụ thích hợp, cĩ bổ sung chất chống oxy hố. Sau đĩ đùng khuơn để tạo hình chế phẩm. Tiến hành khảo sát từng bƣớc để chọn lựa loại nguyên vật liệu và nồng độ thích hợp của chúng trong chế phẩm. Chất hấp phụ: sử dụng bột talc, cám gạo, silicagel, và than hoạt tính. Từng chất hấp phụ đƣợc trộn riêng với dầu neem và dịch chiết bánh dầu (nồng độ 5 %). Sau khi ép tạo hình, các chế phẩm thơ này đƣợc dùng để xử lý ngài gạo (đƣợc trình bày chi tiết ở mục 2.6.3. phần tổng quan tài liệu). Dựa vào kết quả ấu trùng chết sau 48 giờ, khả năng pha trộn và tạo hình để tạo ra chất hấp phụ thích hợp. Chất hỗ trợ thăng hoa: sử dụng tinh dầu thơng, tinh dầu tràm và tinh dầu bạc hà – là những thƣơng phẩm dễ dàng mua ở thị trƣờng. Tinh dầu đƣợc chọn chủ yếu dựa vào kết quả khảo sát sự hao hụt của chúng trong 24 giờ với cùng thể tích ban đầu (10 ml), cùng điều kiện thí nghiệm ( cốc thủy tinh 50 ml, nhiệt độ phịng) và khả năng dẫn dụ ngài gạo lên trên bề mặt. Thí nghiệm xác định nồng độ tinh dầu thích hợp đƣợc tiến hành trong phạm vi từ 0,25 - 0,5 - 1,0 - 2,0 – 4,0 (%) cũng dựa vào khẳ năng dẫn dụ của chúng đối với ngài gạo. Chất bảo quản: Sử dụng chất BHT (butylhydroxi toluene) ở nồng độ 3 %. Hoạt chất chính: dầu neem 10 % phối hợp với dịch chiết bánh dầu ở bốn nồng độ 5 – 10 – 15 – 20 % trên cùng nền chất hấp phụ, tinh dầu, chất bảo quản đã xác định trƣớc đĩ, tạo thành bốn cơng thức chế phẩm. Hình 3.3. Quá trình tạo chế phẩm viên nén 3.2.4. Phƣơng pháp nhân nuơi ngài gạo trong phịng thí nghiệm Ngài gạo đƣợc nuơi trong phịng thí nghiệm trong mơi trƣờng nhân tạo với thức ăn chính là cám gạo, ở điều kiện nhiệt độ phịng, ẩm độ 75 – 85 %. Sau khi vũ hố, những con thành trùng (bƣớm) đực và cái đƣợc cho nhốt riêng trong lồng cĩ lƣới đậy để đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và quét trứng thu đƣợc lên một thau cám khác để tạo điều kiện chu trứng nở. Tiến hành bổ sung cám thƣờng xuyên để ấu trùng cĩ đủ dinh dƣỡng, tăng khả năng vào nhộng. Hình 3.4. Nhân nuơi ngài gạo trong phịng thí nghiệm 3.2.5. Thử nghiệm sinh học: đánh giá một số tác động cơ bản của 4 chế phẩm đối với ngài gạo. 3.2.5.1. Vật liệu - Ấu trùng ngài gạo ( tuổi 3) nhân nuơi ở phịng thí nghiệm, trong mơi trƣờng cám gạo. - Lọ nhựa loại 1 lít và gạo sạch. - Ống bắt cặp và thu trứng. - Giấy đẻ trứng, chổi cọ, kẹp gắp, lọ ủ trứng. - Chế phẩm neem viên nén. 3.2.5.2. Phƣơng pháp tiến hành Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong các lọ nhựa thể tích 1 lít chứa 400 g gạo sạch và 20 ấu trùng ngài gạo. Sau khi đặt chế phẩm lên trên bề mặt gạo, đậy kín lọ để thuốc tác dụng. Sau 3 ngày, mở nắp lọ và đếm số ấu trùng chết. Thí nghiệm đƣợc theo dõi mỗi ngày để thu nhận số ấu trùng chết thêm và đánh giá sự sinh trƣởng của nhĩm đối tƣợng bị xử lý. Số ấu trùng ngài gạo sống sĩt sau đợt xử lý sẽ đƣợc tiếp tục nuơi dƣỡng trong điều kiện bình thƣờng để theo dõi các tác động lâu dài và đa dạng của chế phẩm neem đối với chúng. 3.2.6. Phƣơng pháp đánh giá kết quả Đếm tổng số ấu trùng chết sau 3 ngày và 7 ngày xử lý các chế phẩm, từ đĩ tính ra tỉ lệ chết của từng nghiệm thức, làm cơ sở để tính LD50 của các chế phẩm. Số ấu trùng cịn sống sĩt sau đợt xử lý sẽ đƣợc theo dõi mỗi ngày để ghi nhận một số chỉ tiêu sinh học nhƣ sau: * Tỷ lệ thành trùng tạo thành và tỷ lệ thành trùng biến dạng. * Số lƣợng trứng và tỷ lệ trứng nở của các thành trùng cĩ bề ngồi bình thƣờng và dị dạng theo cách tiến hành nhƣ sau: - Các thành trùng đực và cái cĩ hình dạng bình thƣờng trong cùng một nghiệm thức sẽ đƣợc phối cặp trong các ống nghiệm cĩ đặt sẵn băng giấy để thu trứng. Tổng số trứng sau khi đếm sẽ đƣợc ủ trong lọ thủy tinh ( loại 15 ml) cĩ chứa gạo để theo dõi số lƣợng ấu trùng nở. - Thành trùng cái biến dạng và thành trùng đực cĩ hình dạng bình thƣờng trong cùng một nghiệm thức cũng sẽ đƣợc phối cặp với nhau và cũng thực hiện các bƣớc giống nhƣ trên. 3.2.7. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm gồm cĩ 20 nghiệm thức (4 loại chế phẩm × 5 nồng độ xử lý) đƣợc bố trí theo kiểu hồn tồn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm thức cĩ chứa 20 ngài gạo tuổi 3. Bốn chế phẩm là NV1, NV2, NV3, NV4. Năm nồng độ xử lý là: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 g/ dm3. 3.2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu của các nghiệm thức đƣợc phân tích biến lƣợng ANOVA (Analysis of variance) và phân hạng theo trắc nghiệm Duncan, thao tác trên phần mềm statgraphic 7.0. Độ độc của chế phẩm (LC50, LD50) đƣợc tính theo phƣơng pháp phân tích probit. a b c d e Hình 3.5. Quá trình tiến hành thí nghiệm a,b. Bố trí thí nghiệm c. Đếm sâu chết sau thí nghiệm d. Bắt cặp ngài gạo e. Quá trình ủ trứng Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Hiệu suất thu nhận dầu neem bằng phƣơng pháp ép nguội Kết quả sử dụng máy Komet (Đức) để ép nguội nhân hạt neem (ẩm độ 14,8 %) với tốc độ 10 kg nhân/ giờ, chúng tơi thu đƣợc dầu neem màu vàng nâu với hiệu suất 30 %. Ƣu điểm của máy này là khống chế đƣợc nhiệt độ 35 - 40oC trong quá trình ép, vì vậy khơng ảnh hƣởng đến tính ổn định của các thành phần hoạt chất cĩ trong dầu. Ngồi ra, khi ép cịn trích ra đƣợc nhiều limonoid và hợp chất sulfur cĩ trong nhân hạt, gĩp phần làm tăng hoạt tính kháng khuẩn và cơn trùng của dầu neem. Nhìn chung, phƣơng pháp này dễ thực hiện, ít tốn kém, năng suất tƣơng đối cao và cĩ khả năng đáp ứng yêu cầu của sản xuất lớn. 4.2 Kết quả định lƣợng một số hoạt chất chính trong các chế phẩm neem thơ Bảng 4.1. Hàm lƣợng (ppm) của một số hoạt chất trong dầu neem và dịch chiết bánh dầu Hoạt chất Chế phẩm neem thơ Dầu neem Dịch chiết bánh dầu Azadirachtin Nimbin Salannin 930,69 262,58 1027,48 7703,61 841,09 3214,56 Tổng số 2220,75 11759,26 Theo Seeni và ctv (1993), hàm lƣợng hoạt chất trong cây neem phụ thuộc chủ yếu vào giống và điều kiện sinh trƣởng của cây. Ngồi ra, những yếu tố khác nhƣ tuổi cây, điều kiện địa lý nơi trồng ( trong đĩ quan trọng nhất là điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng), thời điểm thu hoạch quả, kỹ thuật sơ chế, bảo quản nguyên liệu và kỹ thuật chiết xuất, ly trích cũng đĩng vai trị quan trọng đối với hoạt chất. Kết quả phân tích cho thấy hàm lƣợng azadirachtin trong dầu neem Việt Nam thu đƣợc từ phƣơng pháp ép nguội là 930,69 ppm, cao hơn nhiều so với phƣơng pháp chiết xuất bằng dung mơi hữu cơ. Theo Vũ Đăng Khánh (2003), dầu neem Ấn Độ và Việt Nam đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chiết xuất bột nhân hạt neem trong hexan cĩ hàm lƣợng azadirachtin thấp, tƣơng ứng là 90 ppm và 100 ppm. Tuy nhiên, do là chất phân cực mạnh nên azadirachtin chỉ tan tốt trong dung mơi phân cực nhƣ ethanol, vì vậy trong dịch chiết bánh dầu, kết quả hàm lƣợng azadirachtin lên đến 7703,61 ppm. Hàm lƣợng nimbin và salannin trong dịch chiết bánh dầu cũng cao hơn trong dầu neem, tƣơng ứng là 841,09 và 3214,56 ppm trong dịch chiết bánh dầu; 262,58 và 1027,48 ppm trong dầu neem. Tổng cộng 3 thành phần hoạt chất chính thì dịch chiết bánh dầu chứa 11759,26 ppm, dầu neem chứa 2220,75 ppm. 4.3.Tạo chế phẩm viên nén 4.3.1. Chất hấp phụ Mục tiêu là tìm kiếm các nguyên liệu ít độc, khơng phản ứng hĩa học với chất bị hấp phụ và phức chất tạo thành sẽ giải phĩng từ từ các chất bị hấp phụ mà khơng làm thay đổi hoạt tính của chúng. Ngồi ra cịn ƣu tiên chọn loại vật liệu cĩ giá rẻ và dễ ép thành viên. Dựa vào kết quả thí nghiệm sàng lọc trên nhiều loại vật liệu tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới (Lê Thị Thanh Phƣợng, 2005), chúng tơi chỉ tập trung khảo sát hai loại nguyên liệu là bột talc và cám gạo. Các nguyên liệu trên đƣợc trộn với dầu neem và dịch chiết bánh dầu riêng rẽ hoặc phối hợp ở nồng độ 10 %, bổ sung tinh dầu thơng 1 % để hỗ trợ thăng hoa. Sau khi phối trộn, xử lí ngài gạo ở liều 2 g/ dm3. Kết quả trình bày ở bảng 4.2. Nhìn chung, sự kết hợp giữa dầu neem (DN) và dịch chiết bánh dầu (DCBD) trên 3 loại nguyên liệu đều mang lại hiệu quả gây chết ngài gạo cao hơn so với từng chế phẩm riêng lẽ. Trên nền bột talc, hỗn hợp DN – DCBD cho tỉ lệ chết ấu trùng cao nhất là 81,2 %, nhiều hơn 32,3 % so với DN 10 % và nhiều hơn 12,7 % so với DCBD 10 %. Trên nền cám gạo, hỗn hợp DN – DCBD cho tỷ lệ chết ấu trùng là 63,5 %, nhiều hơn 39 % so với DN và nhiều hơn 22,8 % so với DCBD. Tƣơng tự, trên nền talc – cám, hỗn hợp DN – DCBD cho tỷ lệ chết ấu trùng là 71,6 %, nhiều hơn 33,1 % so với DN và 19,7 % so với DCBD. Bảng 4.2. Tỉ lệ (%) ấu trùng chết sau 3 ngày Nguyên liệu Chế phẩm neem thơ (10 %) DN DCBD DN - DCBD Bột talc 48,9 a 68,5 a 81,2 a Cám gạo 24,5 c 40,7 c 63,5 c Talc: Cám (5:5) 38,5 b 51,9 b 71,6 b * Các trị số trong một cột cĩ cùng kí tự khơng khác biệt về thống kê ở p < 0,05 (trắc nghiệm Duncan) Mặt khác, DN 10 % kết hợp với DCBD 10 % trên nền bột talc gây chết 81,2 % ấu trùng, khác biệt cĩ ý nghĩa so với 2 nghiệm thức cám gạo và hỗn hợp talc-cám (tƣơng ứng là 63,5 và 71,6 %). DCBD 10 % trên nền bột talc cho tỉ lệ chết của ấu trùng (68,5 %) cao hơn DCBD 10 % trên nền cám gạo (40,7 %) và hỗn hợp talc – cám (51,9 %). Tƣơng tự, DN 10 % trên nền bột talc cũng cho tỉ lệ chết của ấu trùng (48,9 %) cao hơn so với trên nền cám gạo và hỗn hợp talc - cám (tƣơng ứng là 24,5 % và 38,5 %). Tĩm lại, các chế phẩm neem thơ đều cĩ hiệu lực gây chết ngài gạo mạnh nhất trên nền bột talc, kế đến là trên nền talc - cám, cịn trên nền cám gạo cho tỉ lệ chết ấu trùng thấp nhất. Ở đây chúng ta cĩ thể giải thích nhƣ sau: talc cĩ cấu trúc xốp, dễ hấp phụ và nhả hấp phụ nên nâng cao hiệu quả của thí nghiệm xơng hơi, cịn cám gạo cĩ lẫn nhiều tinh bột, khi gặp nƣớc sẽ trƣơng nở, khơng xốp, khĩ nhả hấp phụ, do đĩ cản trở khẳ năng bay hơi của các hoạt chất. 4.3.2. Hoạt chất chính Theo Võ Quang Long (2005), cho thấy DN và DCBD đều ức chế ngài gạo theo các phƣơng thức khác nhau từ đĩ hƣớng đến việc nên phối hợp cả DN và DCBD trong chế phẩm viên nén sao cho đạt hiệu quả cao, dễ thao tác và bảo quản. Kết quả nghiên cứu trƣớc cho thấy khả năng thăng hoa của DN rất thấp, nhƣng ngồi bản thân là hoạt chất chính, DN cịn gĩp phần bảo vệ chế phẩm trƣớc tác động ánh sáng. Từ những kết quả trên chúng tơi tiến hành tạo và thử nghiệm 4 cơng thức chế phẩm viên nén từ neem (kí hiệu NV1, NV2, NV3, NV4) với DCBD tƣơng ứng là 5 – 10 – 15 – 20 %, kết hợp trên nền bột talc, DN 10 % , dầu thơng 1 % và BHT 3 %. Các chế phẩm xử lý ngài gạo theo phƣơng thức xơng trong lọ nhựa (mục 3.2.4.2./ phần nội dung phƣơng pháp). Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày ở mục 4.4. 4.4. Thử nghiệm chế phẩm 4.4.1. Tác động gây chết của các chế phẩm đối với ngài gạo Quá trình tiến hành thử nghiệm 4 chế phẩm đƣợc phối trộn bởi DN, DCBD, bột talc và dầu thơng trên ngài gạo ở những liều xử lý khác nhau, bằng cách đặt chế phẩm vào trong lọ nhựa cĩ sẵn 20 ấu trùng ngài gạo, bịt kín lọ và tiến hành xơng trong vịng 3 ngày, sau đĩ mở nắp và ghi nhận kết quả sâu chết. Ở những nghiệm thức xử lý, nhận thấy sâu chết ở các tỉ lệ khác nhau, nằm rãi rác bên trong lớp gạo và cả trên bề mặt gạo. Ngồi tác dụng hỗ trợ thăng hoa, tinh dầu thơng 1 % trong cơng thức chế phẩm cịn cĩ khả năng thu hút ấu trùng ngài gạo ra khỏi tổ của nĩ và bị lên bề mặt, vì vậy gĩp phần nâng cao khả năng thâm nhập của chế phẩm vào cơn trùng. Ở các lơ đối chứng, khơng hề cĩ hiện tƣợng sâu chết sau 3 ngày đĩng kín nắp lọ. Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ chết của ấu trùng sau 3 ngày, chúng tơi thu đƣợc kết quả ở bảng 4.3 Nhận xét: kết quả trình bày ở bảng 4.3 cho thấy tất cả các chế phẩm từ NV1 cho đến NV4 đều cĩ khả năng gây chết cho ấu trùng sau 3 ngày xử lý ở các tỷ lệ khác nhau, tuy nhiên tác động này cịn phụ thuộc vào nồng độ xử lý của chế phẩm. Ở đây ta nhận thấy, chế phẩm NV1 ở liều xử lý 0,5 g/ dm3 cĩ hiệu lực gây chết ngài gạo thấp nhất (25,5 %), cịn chế phẩm NV4 ở liều xử lý 2,5 g/ dm3 cĩ hiệu lực cao nhất (85,3 %). Trong cùng một chế phẩm, khi tăng liều xử lý thì tỉ lệ chết của ấu trùng sau 3 ngày xử lý cũng tăng lên. Cụ thể, khi liều xử lý tăng từ 0,5 g đến 2,5 g thì hiệu lực gây chết của các chế phẩm NV1, NV2, NV3 và NV4 tăng tƣơng ứng từ 25,5 % đến 47,7 %; từ 35,8 đến 64,5 %; từ 40,2 % đến 80,7 % và từ 48,2 đến 85,3 %. Trong cùng một liều xử lý, chế phẩm NV4 với 20 % dịch chiết bánh dầu cho tỉ lệ chết ấu trùng là cao nhất, kế đến là chế phẩm NV3, NV2, cịn NV1 cho tỉ lệ chết ấu trùng là thấp nhất. Chẳng hạn với liều xử lý 2,5 g; chế phẩm NV4 gây chết 85,3 % ấu trùng (cao nhất), NV3 gây chết 80,7 % ấu trùng, NV2: 64,5 %, cịn NV1 chỉ gây chết 47,7 % ấu trùng (thấp nhất). Nhƣ vậy nồng độ dịch chiết bánh dầu khác nhau giữa các chế phẩm ảnh hƣởng đáng kể tới kết quả thí nghiệm. Khi ta tăng nồng độ dịch chiết bánh dầu thì tỷ lệ chết của ấu trùng cũng tăng theo. Nồng độ dịch chiết bánh dầu trong chế phẩm tăng kết hợp với liều xử lý của chế phẩm tăng cho kết quả tỷ lệ chết ấu trùng cũng tăng theo. Bảng 4.3. Tỉ lệ chết (%) của ấu trùng 3 ngày sau xử lý STT Chế phẩm Liều xử lý (g) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1 NV 1 25,5 29,3 35,3 41,5 47,7 2 NV 2 35,8 40,5 48,6 56,8 64,5 3 NV 3 40,2 47,7 56,5 68,8 80,7 4 NV 4 48,2 56,8 67,6 75,4 85,3 Trên cơ sở tỷ lệ chết (%) ấu trùng thu đƣợc sau 3 ngày theo dõi, chúng tơi tiến hành phân tích Probit bằng phần mềm Excel để xác định LD50 và độ độc tƣơng đối của các chế phẩm thử nghiệm, thu đƣợc kết quả ở bảng 4.4. Qua phân tích probit cho thấy LD50 ở thời điểm sau 3 ngày xử lý của các chế phẩm là 3,5818 g/ dm3; 1,3452 g/ dm3; 0,8959 g/ dm3 và 0,634 g/ dm3 tƣơng ứng với NV1, NV2, NV3 và NV4. Nhƣ vậy LD50 của NV1 > NV2 > NV3 > NV4. Gi á tr ị LD50 tỷ lệ nghịch với độc tính của chế phẩm, tức LD50 càng nhỏ thì độc tính của chế phẩm càng cao. Nhƣ vậy, độc tính của chế phẩm NV4 là cao nhất (gấp 5,65 lần chế phẩm NV1), kế đến là NV3 (gấp 3,99 lần NV1), tiếp đến là NV2 (gấp 2,66 lần NV1), cịn chế phẩm NV1 cĩ độc tính thấp nhất. Bảng 4.4. Độc tính của các chế phẩm đối với ngài gạo (Giá trị LD50 ở thời điểm 3 ngày sau xử lý) Stt Chế phẩm Phƣơng trình tƣơng quan Hệ số tƣơng quan P LD50 (g/ dm 3 ) Độc tính tƣơng đối 1 NV1 Y = 3,6891 + 0,8435 X 0,9593 0,0097 3,5818 1 2 NV2 y = 3,8781 + 0,9939 X 0,9417 0,0167 1,3452 2,66 3 NV3 Y = 3,5726 + 1,4984 0,9315 0,0212 0,8959 3,99 4 NV4 Y = 3,8098 + 1,4838 X 0,9538 0,0118 0,6340 5,65 a b c d Hình 4.1. Kết quả 3 ngày sau xử lý chế phẩm a. Đối chứng b, c, d. Sâu chết ở những lơ cĩ xử lý chế phẩm Sau khi xử lý xơng hơi trong 3 ngày, các lọ thí nghiệm đƣợc thơng thống và tiếp tục nuơi dƣỡng để theo dõi tỷ lệ ấu trùng chết thêm ở những ngày sau đĩ. Tỷ lệ chết tích lũy ở ngày thứ 7 sau xử lý đƣợc ghi nhận ở bảng 4.5 nhƣ sau: Bảng 4.5. Tỉ lệ chết (%) của ấu trùng 7 ngày sau xử lý STT Chế phẩm Liều xử lý (g) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1 NV 1 42,2 47,7 56,7 65,5 73,2 2 NV 2 58,7 67,7 75,5 78,7 85,3 3 NV 3 76,7 83,3 86,0 93,3 96,7 4 NV 4 76,7 80,2 86,8 93,3 95,5 Sau 7 ngày xử lý, nhận thấy tỷ lệ sâu chết là rất cao, ngoại trừ chế phẩm NV1 ở liều xử lý 0,5 g và 1,0 g cho tỷ lệ sâu chết khơng cao, tƣơng ứng l à 42,2 % và 47,7 %. Tất cả các nghiệm thức cịn lại đều cho tỷ lệ sâu chết trên 50 %, trong đĩ chế phẩm NV4 ở liều xử lý 2,5 g gây chết ấu trùng nhiều nhất, lên đến 95,5 %. Trong cùng một chế phẩm, khi ta tăng liều xử lý lên thì tỷ lệ chết của ấu trùng sau 7 ngày xử lý cũng tăng lên. Ví dụ, khi tăng liều xử lý từ 0,5 g lên 2,5 g thì hiệu lực gây chết ấu trùng của các chế phẩm NV1, NV2, NV3, NV4 tăng tƣơng ứng từ 42,2 % đến 73,2 %; 58,7 đến 85,3 %; 76,7 đến 96,7 %; 76,7 đến 95,5 %. Trong cùng một liều xử lý, chế phẩm NV4 với 20 % dịch chiết bánh dầu cho tỷ lệ chết ấu trùng là cao nhất, kế đến là chế phẩm NV3, NV2, cịn NV1 cho tỷ lệ chết ấu trùng là thấp nhất. Ví dụ với liều xử lý 2,5 g, chế phẩm NV4 gây chết 95,5 % ấu trùng sau 7 ngày xử lý, NV3 cho tỷ lệ chết 96,7 %, NV2: 85,3 %, NV1: 73,2 %. Bảng 4.6. Độc tính của các chế phẩm đối với ngài gạo (Giá trị LD50 ở thời điểm 7 ngày sau xử lý) STT Chế phẩm Phƣơng trình tƣơng quan Hệ số tƣơng quan P LD50 (g/ dm 3 ) Độc tính tƣơng đối 1 NV 1 Y = 3,9121 + 1,1431 X 0,9523 0,0123 0,8948 1 2 NV 2 Y = 4,3861 + 1,1274 X 0,9795 0,0035 0,3503 2,55 3 NV 3 Y= 4,5693 + 1,4878 X 0,9312 0,0213 0,1948 4,59 4 NV 4 Y = 4,6161 + 1,3992 X 0,9330 0,0205 0,1881 4,76 Qua phân tích Probit đã tính đƣợc giá trị LD50 của các chế phẩm ở thời điểm 7 ngày sau xử lý là 0,8948 g/dm3; 0,3503 g/dm3; 0,1948 g/dm3 v à 0,1881 g/dm3, tƣơng ứng với NV1, NV2, NV3 v à NV4. Nhƣ vậy LD50 của NV1 > NV2 > NV3 > NV4. Qua đĩ cũng cho thấy độc tính của 2 chế phẩm NV3 và NV4 là cao nhất, gấp 4,59 – 4,76 lần so với chế phẩm NV1, kế đến là chế phẩm NV2 (cao gấp 2,55 lần chế phẩm NV1), cịn chế phẩm NV1 cĩ độc tính thấp nhất. Mặt khác khi so sánh giữa bảng 4.3 và 4.5 ta thấy LC50 của mỗi chế phẩm ở thời điểm 3 ngày cao hơn rất nhiều so với ở thời điểm 7 ngày. Cụ thể: đối với các chế phẩm NV1, NV2, NV3, NV4, LD50 (g/ dm 3) ở thời điểm 3 ngày tƣơng ứng là 3,5818; 1,3452; 1,3452; 0,8959; 0,634, cịn ở thời điểm 7 ngày tƣơng ứng là 0,8948; 0,3503; 0,1948; 0,1881. Điều đĩ gợi ra rằng, cĩ thể rút ngắn thời gian xử lý mà vẫn bảo đảm hiệu quả tác động nếu tăng liều thuốc lên. Ví dụ đối với chế phẩm NV4: muốn diệt 50 % ngài gạo trong 3 ngày thì phải dùng lƣợng thuốc là 0,634 g/dm3 - gấp 0,634/ 0,1881 = 3,3 lần lƣợng thuốc so với khi xử lý trong 7 ngày. 4.4.2. Động thái gây chết của các chế phẩm đối với ngài gạo 0 25.5 36.3 42.2 35.8 45.4 58.7 40.2 68.5 76.7 48.2 64.8 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 ngày 3 ngày 5 ngày 7 Thời gian Tỉ lệ c hế t ( % ) NV1 NV2 NV3 NV4 Biểu đồ 4.1. Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 0,5 g/ dm3 Qua biểu đồ 4.1 ta nhận thấy ở liều lƣợng 0,5 g/ dm3, tất cả các chế phẩm đều cĩ tác dụng gây chết cho ngài gạo ở các mức độ khác nhau, tuy nhiên tỷ lệ chết của ấu trùng khơng cao lắm. Sau 7 ngày xử lý, chỉ cĩ chế phẩm NV3 và NV4 đạt 76,7 %, cịn NV2 và NV1 chỉ đạt 58,7 % và 42,2 %. Mặt khác cũng cĩ thể thấy ấu trùng tập trung chết trong 3 ngày đầu xử lý chế phẩm, trong 3 ngày đầu tỷ lệ chết ấu trùng của NV1, NV2, NV3, NV4 lần lƣợt là 25,5; 35,8; 40,2; 48,2 %, tuy nhiên tỷ lệ này vẫn cịn thấp. Cĩ thể do nồng độ thuốc xử lý quá ít nên tỷ lệ chết ấu trùng khơng cao, chỉ những ấu trùng nào mẫn cảm với thuốc mới chết trong vài ba ngày đầu xử lý chế phẩm, cịn những ấu trùng ít mẫn cảm, thì khơng chết liền ngay sau khi xử lý, mà chúng sống yếu ớt trong những ngày sau đĩ rồi mới chết. Trong khoảng thời gian từ ngày 3 tới ngày 7 tỷ lệ ấu trùng chết thêm của các chế phẩm lần lƣợt là 16,7 %, 22,9 %, 36,5 %, 28,5 %. Ở đây cĩ một sự khác biệt giữa chế phẩm NV3 và các chế phẩm khác, đĩ là trong giai đoạn từ ngày 3 tới ngày 7, NV3 cĩ tỷ lệ ấu trùng chết tăng đột biến, ngày 3 chỉ gây chết 40,2 % ấu trùng nhƣng ngày 3 tới ngày 7 tăng thêm tới 36,5 %, điều này thể hiện rõ trên biểu đồ 4.1 0 29.3 38.5 47.7 40.5 53.1 67.7 47.7 65.7 83.3 56.8 62.5 80.2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 ngày 3 ngày 5 ngày 7 Thời gian Tỉ lệ c hế t ( % ) NV1 NV2 NV3 NV4 Biểu đồ 4.2. Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 1 g/ dm3 Tƣơng tự nhƣ ở liều xử lý 0,5 g/ dm3, ở 1,0 g/ dm3, dƣới tác động của các chế phẩm, ấu trùng ngài gạo cũng tập trung chết trong 3 ngày đầu, tỷ lệ chết tuy cĩ cao hơn ở liều xử lý 0,5 g/ dm3 nhƣng nhìn chung vẫn cịn thấp, trong 3 ngày đầu chỉ cĩ NV4 gây chết 56,8 % ấu trùng, cịn những chế phẩm cịn lại cho tỷ lệ chết của ấu trùng đều dƣới 50 %, NV1, NV2, NV3 cho tỷ lệ chết ấu trùng tƣơng ứng là 29,3; 40,5; 47,7 % Quan sát biểu đồ cũng thấy ở chế phẩm NV3 cĩ sự khác biệt, trong khoảng thời gian từ ngày 3 tới ngày 7 dƣới tác động của NV3, tỷ lệ chết ấu trùng cũng tăng lên đáng kể, vƣợt qua chế phẩm NV4 mặc dù trong 3 ngày đầu nĩ gây chết ấu trùng ít hơn. 0 35.3 48.6 56.7 48.6 56.4 75.5 56.5 67.5 86.6 67.6 72.3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 ngày 3 ngày 5 ngày 7 Thời gian Tỉ lệ c hế t ( % ) NV1 NV2 NV3 NV4 Biểu đồ 4.3 Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều lƣợng 1,5 g/ dm3 Qua biểu đồ ta nhận thấy ở liều xử lý 1,5 g/ dm3, ấu trùng cũng tập trung chết trong 3 ngày đầu, tỷ lệ chết đạt mức trung bình, chỉ cĩ NV1 và NV2 cho tỷ lệ chết dƣới 50 % (35,3 % và 48,6 %), cịn NV3 và NV4 cho tỷ lệ chết ấu trùng trên 50 % (56,5 % và 67,6 %). Ở ngày thứ 7 tỷ lệ ấu trùng chết thêm của NV1, NV2, NV3, NV4 lần lƣợt là 21,4 %, 26,9 %, 30,1 %, 19 %. Ở chế phẩm NV3, trong giai đoạn từ ngày 3 tới ngày 7 cũng cho tỷ lệ chết ấu trùng tăng cao hơn so với những chế phẩm khác (30,1 %), ở ngày thứ 7 cho tỷ lệ chết ấu trùng bằng với chế phẩm NV4 mặc dù ở ngày 3 cho tỷ lệ thấp hơn. Ở liều xử lý 2,0 g/ dm3, các chế phẩm đều cho tỷ lệ chết ấu trùng khá cao, và ấu trùng cũng tập trung chết trong 3 ngày đầu. Ở đây chỉ cĩ NV1 cho tỷ lệ chết là 41,5 %, cịn tất cả các chế phẩm NV2, NV3, NV4 đều cho tỷ lệ chết trên 50 % (56,8 %, 68,8 %, 75,4 %). Chế phẩm NV3 cũng cho tỷ lệ ấu trùng chết tăng cao hơn so với những chế phẩm khác. 0 41.5 58.4 65.5 56.8 68.9 78.7 68.8 86.9 93.3 75.4 89.5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 ngày 3 ngày 5 ngày 7 Thời gian Tỉ lệ c hế t ( % ) NV1 NV2 NV3 NV4 Biểu đồ 4.4 Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều lƣợng 2 g/ dm3 Các đồ thị 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5 đều biểu thị động thái gây chết ngài gạo của các chế phẩm NV1, NV2, NV3, NV4 ở các liều lƣợng khác nhau theo thời gian. Tuy nhiên, ở liều lƣợng 2,5 g/ dm3 động thái gây chết ngài gạo của chế phẩm cĩ thể đƣợc nhận biết rõ nhất. Ấu trùng đặc biệt tập trung chết trong 3 ngày đầu, cĩ lẽ nhờ nồng độ xử lý của chế phẩm cao và tác dụng tối đa của phƣơng pháp bịt kín kho. Trong 3 ngày đầu, chỉ cĩ NV1 cho tỷ lệ chết của ấu trùng là 47,7 %, cịn tất cả các chế phẩm cịn lại đều cĩ tỷ lệ chết ấu trên 50 %. Cụ thể NV2, NV3, NV4 lần lƣợt gây chết 64,5 %; 80,7 %; 85,3 %. Trong khoảng thời gian từ 3 - 7 ngày tăng thêm 10,2 – 25,5 % ấu trùng chết, ở chế phẩm NV1 và NV2 ấu trùng chết ít và lai rai, NV3 và NV4 chết nhiều hơn. Ở đây cũng nhận thấy sự khác biệt giữa chế phẩm NV3 và những chế phẩm khác, trong 3 ngày đầu gây chết tới 80,7 % ấu trùng, rất cao so với NV1 và NV2. Trong khoảng thời gian từ ngày 3 tới ngày 7 ấu trùng chết thêm rất nhiều và đạt 96,7 % vào ngày thứ 7, một tỷ lệ rất cao gần nhƣ tuyệt đối. 0 47.7 65.5 73.2 64.5 79.5 85.3 80.7 92.5 96.7 85.3 4.3 5 5 0 20 40 60 80 100 120 0 ngày 3 ngày 5 ngày 7 Thời gian Tỷ lệ c hế t ( % ) NV1 NV2 NV3 NV4 Biểu đồ 4.5. Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều lƣợng 2,5 g/ dm3 4.4.3.Tác động ức chế sinh trƣởng và phát triển. Nhiều nghiên cứu trƣớc đây cho thấy các chế phẩm từ neem nĩi riêng, cũng nhƣ các thuốc cĩ nguồn gốc thảo mộc nĩi chung bên cạnh tiêu diệt cơn trùng một cách trực tiếp (gây chết), chúng cịn khả năng làm suy thối cơn trùng theo thời gian nhƣ ức chế sự vũ hố, ức chế đẻ trứng, gây biến dạng ấu trùng, nhộng và thành trùng. Thơng thƣờng, số cơn trùng mẫn cảm nhất sẽ chết trong vài ngày hay ngay sau khi xử lý với thuốc. Số sống sĩt cịn lại sẽ chết một phần, phần cịn lại hồn tất giai đoạn nhộng. Trong số nhộng đĩ, một phần bị chết, một phần bị biến dạng, số sống sĩt cĩ thể vũ hố, nhƣng thành trùng tạo thành cĩ thể bị biến dạng, giảm hoặc mất khả năng sinh sản. Do đĩ thí nghiệm vẫn đƣợc theo dõi tiếp tục sau khi quan sát tỷ lệ chết, để ghi nhận các ảnh hƣởng của các chế phẩm từ nhân hạt neem đối với sự sinh trƣởng và phát triển của ngài gạo. Từ đĩ nhận thấy tuy thuốc thảo mộc, mà đặc biệt thuốc thảo mộc chiết xuất từ neem khơng tác động nhanh và mạnh nhƣ thuốc tổng hợp hố học trong cơng tác phịng trừ sâu hại nhƣng nĩ cũng cĩ những ƣu điểm riêng mà thuốc tổng hợp hĩa học khơng cĩ. Thuốc hố học giết chết cơn trùng gây hại một cách trực tiếp, nhanh chĩng và gần nhƣ tuyệt đối, nhƣng cũng tăng nguy cơ kháng thuốc khi sử dụng trong một thời gian dài, gây mất cân bằng sinh thái, và đặc biệt gây ơ nhiễm mơi trƣờng, cĩ tính tồn dƣ lâu và tích tụ trong chuỗi thức ăn của sinh giới gây hại cho ngƣời và gia súc. Cịn thuốc thảo mộc chiết xuất từ neem khơng gây chết cơn trùng một cách triệt để và nhanh chĩng, tuy nhiên nĩ để lại hậu quả lâu dài trên những cơn trùng bị xử lý, khơng những ở đời cha mẹ, mà cịn ảnh hƣởng tới cả đời con cháu… của chúng. Những ấu trùng ngài gạo khơng chết khi bị xử lý với neem thì cũng sống èo uột, hoặc khi vào nhộng hay vũ hố thì nhộng hay thành trùng đều cĩ khả năng bị hoặc biến dạng hoặc mất hay giảm khả năng sinh sản… Và thế hệ con cháu của chúng cũng bị ảnh hƣởng, thí nghiệm chúng tơi quan sát tới đời thứ 3 cho thấy tỷ lệ biến dạng của thành trùng là rất cao. Do tác động lâu dài nhƣ vậy nên giảm đƣợc khả năng phá hại của ngài gạo rất nhiều. 4.4.3.1.Tác động ức chế vũ hĩa của các chế phẩm đối với ngài gạo Bảng 4.7. Tỉ lệ (%) thành trùng tạo thành dƣới tác động của các chế phẩm STT Chế phẩm Liều xử lý (g) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 1 NV 1 40,1 a 37,6 a 31,5 a 16,8 a 10,2 a 2 NV 2 36,7 b 27,9 b 16,6 b 11,4 b 8,3 b 3 NV 3 18,7 c 12,6 d 9,9 c 4,8 c 0,0 c 4 NV 4 19,8 c 16,9 c 10,9 c 4,7 c 0,0 c Qua bảng 4.6 ta thấy dƣới tác động ức chế của các chế phẩm, tỉ lệ thành trùng tạo thành ở tất cả các nghiệm thức đều thấp, khơng ở nghiệm thức nào cĩ tỷ lệ thành trùng trên 50 %, chỉ cĩ ở liều xử lý 0,5 g, chế phẩm NV1 cho tỉ lệ thành trùng cao nhất là 40,1 %. Riêng ở liều xử lý 2,5 g, chế phẩm NV3 v à NV4 đều khơng xuất hiện thành trùng, do các chế phẩm đã tác động mạnh, gây chết tồn bộ cá thể ở giai đoạn ấu trùng và nhộng. Nhìn chung, trong cùng một chế phẩm, khi liều xử lý tăng lên thì tỷ lệ thành trùng tạo thành lại giảm đi. Cụ thể, khi tăng liều xử lý từ 0,5 g đến 2,5 g thì tỷ lệ thành trùng tạo thành ở chế phẩm NV1, NV2, NV3, NV4 giảm tƣơng ứng từ 40,1% cịn 10,2 %; 36,7 % cịn 8,3 %; 18,7 % cịn 0 %; 19,8 % cịn 0 %. Cịn trong cùng một liều xử lý, thì chế phẩm NV1 cho tỷ lệ (%) thành trùng tạo thành là cao nhất, kế đến là NV2, tiếp theo là NV3, cịn NV4 cho tỷ lệ (%) thành trùng tạo thành là thấp nhất. Tĩm lại các tác động ức chế tăng trƣởng và phát triển của các chế phẩm đối với ngài gạo theo phƣơng thức phụ thuộc nồng độ, nghĩa là nồng độ càng cao thì hiệu lực càng tăng. Tuy nhiên, kết quả phân tích ANOVA và trắc nghiệm phân hạng Duncan cho thấy khơng cĩ sự khác biệt về ý nghĩa thống kê giữa chế phẩm NV3 và NV4: đều cho tỷ lệ thành trùng tạo thành thấp nhất, kế đến là NV2, cịn NV1 cho tỷ lệ cao nhất, điều đĩ chứng tỏ tỷ lệ gây chết yếu hơn của chế phẩm NV1, NV2 so với NV3 và NV4. 4.4.3.2 Tác động gây biến dạng sâu, nhộng, thành trùng Do giới hạn thời gian trong khi sự hĩa nhộng và vũ hố diễn ra quá rãi rác nên chúng tơi chỉ quan sát chứ khơng ghi nhận số lƣợng nhộng hay thành trùng bị biến dạng. Tác động gây biến dạng này của chế phẩm nhân hạt neem cũng cĩ một ý nghĩa quan trọng, gĩp phần làm giảm tác hại gây ra bởi ngài gạo. Bởi, một khi đã bị biến dạng, chúng sẽ bị giảm khả năng định hƣớng, phát tán, di chuyển, sinh sản của các cá thể. Đặc biệt quan sát cho thấy những cá thể bị biến dạng nặng khơng cịn khả năng bay lƣợn, giao phối và đẻ trứng. Kết quả quan sát cho thấy ấu trùng, nhộng, thành trùng đều cĩ khả năng bị tác động ở các mức độ nặng nhẹ khác nhau - Sâu cĩ kích thƣớc nhỏ hơn bình thƣờng, hoặc cĩ đốm đen trên lƣng, hoặc khơng thể vào nhộng, nửa sâu nửa nhộng (hình 4.2a) - Nhộng cĩ thân cong vẹo, cĩ khi cĩ màu đen, hoặc khơng thể vũ hố hồn tồn thành thành trùng (hình 4.2b, c). - Thành trùng biến dạng nhẹ: cánh hơi dợn sĩng, nhƣng cịn khả năng bay lƣợn, hoạt động giới tính và sinh sản (hình 4.2d) - Thành trùng biến dạng trung bình: cánh dợn sĩng nhiều và rõ, khĩ khăn khi bay lƣợn, nhƣng vẫn cịn khả năng bay lƣợn, sinh sản.(hình 4.2k) - Thành trùng biến dạng nặng: vũ hĩa nhƣng khơng thể thốt ra khỏi lớp gạo, cánh dị dạng nặng, bụng co rút hay vặn vẹo, phần đầu cũng bị biến dạng hoặc mất râu, khơng cịn khả năng di chuyển hoặc giao phối (hình 4.2e, f, g, h, ) a b c d e f . g h k Hình 4.2 Tác động của chế phẩm neem đối với ngài gạo a. Đối với ấu trùng b,c. Đối với nhộng d, e, f, g, h, k. thành trùng biến dạng 4.4.4. Tác động ức chế sinh sản của các chế phẩm đối với ngài gạo Để đánh giá đƣợc tác động ức chế sinh sản của các chế phẩm neem, chúng tơi đã tiến hành nhƣ sau: những con thành trùng đực và cái bình thƣờng ở mỗi nghiệm thức sẽ đƣợc cho bắt cặp với nhau, sau đĩ theo dõi và ghi nhân số lƣợng trứng đẻ ra. Số lƣợng trứng thu đƣợc sẽ đƣợc đem ủ trong các lọ ủ trứng để theo dõi tỷ lệ trứng nở. Tuy nhiên chúng tơi chỉ đánh giá ở nghiệm thức 1 tức 0,5 g chế phẩm/ dm3 vì ở nghiệm thức này cĩ nhiều thành trùng tạo thành. Bảng 4.8. Số trứng/ cặp cha mẹ và tỷ lệ trứng nở STT Chế phẩm Khả năng sinh sản Số ấu trùng/ cặp cha mẹ Số trứng Tỷ lệ nở (%) 1 NV 1 147,3 b 63,7 b 93,8 b 2 NV 2 127,7 c 62,9 b 80,3 c 3 NV 3 99,3 e 51,1 c 51,1 d 4 NV 4 101,3 d 56,2 c 56,9 d 5 Đối chứng 306,0 a 100,0 a 306,0 a Qua bảng 4.8 cho thấy khả năng ức chế sinh sản của các chế phẩm neem đối với ngài gạo. Số trứng đẻ ra từ những cặp cha mẹ bị xử lý chế phẩm là thấp hơn nhiều so với đối chứng. Hiệu lực ức chế sinh sản cĩ thể đƣợc xếp hạng nhƣ sau: NV3 > NV4 > NV2 > NV1 thể hiện qua số lƣợng trứng của NV3 là thấp nhất (99,3), kế đến là NV4 (101,3), tiếp đến là NV2 (127,7), NV1 cĩ số lƣợng trứng là cao nhất (147,3), khác biệt rất cĩ ý nghĩa so với đối chứng (306). Mặt khác, ở đối chứng cĩ tỷ lệ trứng nở là 100 %, cịn ở trứng đẻ ra từ những cặp cha mẹ bị xử lý chế phẩm thì chỉ cĩ những tỷ lệ nở nhất định, cao nhất là ở NV1, đến NV2, đến NV4, cuối cùng là NV3. Tuy nhiên NV3 và NV4 khơng khác nhau về phƣơng diện thống kê học. Kết quả cũng tƣơng tự đối với NV1 và NV2. Bảng 4.9. Trọng lƣợng nhộng trung bình (g) ở các nghiệm thức xử lý chế phẩm neem ở liều lƣợng 0,5g/ dm3 STT Chế phẩm Thế hệ Thứ 1 Thứ 2 1 NV 1 0,0258 b 0,0225 c 2 NV 2 0,0257 b 0,0235 b 3 NV 3 0,0242 c 0,0172 d 4 NV 4 0,0243 c 0,0168 d 5 Đối chứng 0,0283 a 0,0285 a Nhận xét: Trong cùng một thế hệ, cĩ sự khác biệt về trọng lƣợng nhộng giữa các chế phẩm, nhìn chung dƣới ảnh hƣởng của các chế phẩm đều cho trọng lƣợng nhộng trung bình thấp hơn hẳn so với đối chứng. Cụ thể ở thế hệ 1, trọng lƣợng nhộng giảm dần theo thứ tự: Đối chứng > NV1 = NV2 > NV3 = NV4, ở thế hệ 2, giảm dần theo thứ tự: Đối chứng > NV2 > NV1 > NV3 = NV4. Trong cùng một chế phẩm cũng cĩ sự khác biệt giữa thế hệ 1 và thế hệ 2, trọng lƣợng nhộng trung bình ở thế hệ thứ 2 luơn thấp hơn hẳn ở thế hệ thứ nhất. Từ thế hệ 1 đến thế hệ 2 trọng lƣợng nhộng trung bình giảm 0,0033 g; 0,0022 g; 0,007 g; 0,0075 g tƣơng ứng với chế phẩm NV1, NV2, NV3, NV4. Cịn đối với đối chứng khơng cĩ sự khác biệt giữa thế hệ 1 và thế hệ 2. Trọng lƣợng nhộng càng nhỏ nhộng càng suy yếu, kéo theo giảm kích thƣớc và khả năng sinh sản của thành trùng. Nhƣ vậy, các chế phẩm neem khơng những gây chết, ức chế sinh trƣởng, sinh sản đối với ngài gạo mà cịn làm giảm trọng lƣợng nhộng, khơng những ảnh hƣởng đến thế hệ cha mẹ mà cịn ảnh hƣởng thế hệ con cháu của chúng. 0.0258 0.0225 0.0257 0.0235 0.0243 0.0172 0.0243 0.0168 0.0283 0.0285 0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 1 2 Thế hệ T rọ ng lư ợn g nh ộn g tr un g bì nh (g ) NV1 NV2 NV3 NV4 Đối chứng Biểu đồ 4.6. Trọng lƣợng nhộng trung bình ở các nghiệm thức xử lý chế phẩm neem ở liều lƣợng 0,5 g/ dm3 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Sử dụng máy ép nhân hạt neem hiệu Komet (Đức) thu đƣợc dầu neem màu vàng nâu với hiệu suất 30 %. - Bằng phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), đã xác định đƣợc hàm lƣợng azadirachtin, nimbin và salannin tƣơng ứng là 930,69 ppm; 262,58 ppm và 1027,48 ppm trong dầu neem và 7703,61 ppm; 841,09 ppm và 3214,56 ppm trong dịch chiết bánh dầu. - Kết quả bƣớc đầu tạo và thử nghiệm 4 chế phẩm neem dạng viên nén (ký hiệu NV1, NV2, NV3 và NV4) với thành phần hoạt chất chính là dịch chiết bánh dầu cho thấy các chế phẩm cĩ khả năng ức chế ngài gạo theo một số phƣơng thức và mức độ khác nhau: * Gây chết: giá trị LC50 của các chế phẩm ở thời điểm 7 ngày sau xử lý đƣợc xác định là 0,8948; 0,3503; 0,1948 và 0,1881 g/ dm3, tƣơng ứng với NV1, NV2, NV3 và NV4. * Ức chế sinh sản: Chế phẩm NV3 và NV4 cĩ hiệu lực ức chế sức sinh sản của ngài gạo (thơng qua giảm số lƣợng trứng và tỉ lệ trứng nở) mạnh hơn nhiều so với chế phẩm NV2 và NV1. Các nghiệm thức xử lý chế phẩm đều khác biệt cĩ ý nghĩa so với đối chứng. * Ngồi ra, các chế phẩm cũng gây biến dạng thành trùng và làm giảm cĩ ý nghĩa trọng lƣợng nhộng, qua đĩ gĩp phần hạn chế sự phát triển của ngài gạo theo thời gian. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục nghiên cứu và thử nghiệm chế phẩm NV3 và NV4 ở quy mơ lớn hơn và mở rộng trên nhiều đối tƣợng cơn trùng hại kho khác. - Theo dõi tác động lâu dài của chế phẩm qua nhiều thế hệ cơn trùng và đánh giá khả năng kháng thuốc (nếu cĩ) - Nghiên cứu quy trình tối ƣu sử dụng chế phẩm để phịng trị các lồi cơn trùng hại kho nơng sản . TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Bùi Cơng Hiển, 1995. Cơn trùng hại kho. Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật Hà Nội. 2. Bùi Anh Tuấn, 2003. Nghiên cứu quy luật sinh trưởng và ảnh hưởng của diện tích sinh trưởng tới sinh trưởng rừng neem (Azadirachta indica A. Juss) làm cơ sở đề xuất một số phương pháp kinh doanh tại rừng trồng của ban quản lý rừng phịng hộ ven biển Ninh Phước – Ninh Thuận. Luận văn Thạc Sĩ Khoa Học Nơng Nghiệp, Đại Học Nơng Lâm, thành phố Hồ Chí Minh 3. Lâm Cơng Định, 1985. Xoan chịu hạn (Azadirachta indica A. Juss) - Một lồi cây mới thích ứng với vùng nĩng hạn Thuận Hải. Tạp chí Lâm Nghiệp tháng 8/ 1985 4. Lâm Cơng Định, 1991. Giới thiệu cây xoan chịu hạn (Azadirachta indica A. Juss) nhập nội vào vùng cát nĩng hạn Phan Thiết – Tuy Phong. Sở Nơng – Lâm Nghiệp Thuận Hải. 5. Lâm Cơng Định, 1998. Xoan chịu hạn - một lồi cây chống sa mạc hĩa, làm giàu sinh cảnh vùng nĩng hạn. Tạp chí Lâm Nghiệp tháng 1/ 1998 6. Lê Thị Thanh Phƣợng, 2004. Chiết xuất hoạt chất từ nhân hạt neem (Azadirachta indica A. Juss) và khảo sát tác động của chúng đối với ngài gạo (Corcyra cephalonica St.). Luận văn thạc sĩ khoa học Nơng Nghiệp, Đại học Nơng Lâm , Thành Phố Hồ Chí Minh. 7. Lê Thị Thanh Phƣợng, 2005. Nghiên cứu tạo chế phẩm xơng hơi phịng trị ngài gạo (Corcyra cephalonica St.) từ dầu hạt neem (Azadirachta indica A. Juss ) trồng tại tỉnh Ninh thuận. Báo cáo kết quả đề tài nghiên cứu khoa học – cơng nghệ cơ sở chọn lọc năm 2005. 8. Nguyễn Phƣơng Thảo, Nguyễn Thị Quỳnh, Nguyễn Tiến Thắng và AkikoHirano, 2001. Bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của dầu neem lên sự kí sinh của bọ hà (Cylas formicarius F.) trưởng thành trong củ khoai lang (Ipomola batatas L.). Tuyển tập cơng trình nghiên cứu khoa học cơng nghệ 1999 – 2000. Viện sinh học nhiệt đới, Trung tâm Khoa học Tự Nhiên và Cơng Nghệ Quốc Gia. Nhà xuất bản nơng nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh 9. Phạm Văn Lầm, 2005. Kỹ thuật bảo vệ thực vật. Nhà xuất bản lao động Hà Nội 10. Phùng Võ Cẩm Hồng, 2004. Bài giảng Kỹ thuật phân tích (phần lý thuyết). Bộ giáo dục và đào tạo Trƣờng Đại Học Nơng Lâm tp. Hồ Chí Minh 11. Trần Minh Tâm, 2002. Bảo quản và chế biến nơng sản sau thu hoạch. Nhà xuất bản nơng nghiệp Hà Nội. 12. Vũ Đăng Khánh, 2003. Khảo sát tính kháng nấm gây bệnh cây và nấm sinh độc tố aflatoxin của sản phẩm chiết xuất từ xoan chịu hạn (Azadirachta indica A. Juss) trồng tại Việt Nam. Luận văn thạc sĩ khoa học ngành sinh học, trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên 13. Võ Quang Long, 2005. Nghiên cứu ứng dụng dầu ép từ nhân hạt neem (Azadirachta indica A. Juss) trong phịng trừ ngài gạo (Corcyra cephalonica St.). Luận văn ra trƣờng Ngành Hĩa Học , Đại học Tơn Đức Thắng TIẾNG NƢỚC NGỒI 14. Dennis D.I.R., 1992. Neem, a tree for solving global problems. National Academy Press. Washington, D.C., USA, 141 pages. 15. Eeswara và cộng sự , 1996. Biological activity and the production of azadirachtin in neem tree. University of Aberdeen; Aberdeen. 16. Gunasena H.P.M. và Marambe B., 1998. Neem in Sri Lanca, a monograph. The University of Peradeniya – Oxford Foresty Institute (UK). Forestry Research Link, 62 pages. 17. Gupta B.N. and Sharma K.K., 1998. Neem, a wonder tree. Indian Council of Forestry and Education, Dehra Dun, India. 18. H. Schmutterer et. al., 1995. The neem tree (Azadirachta Indica A. Juss ) and other Meliaceus plants, UCH Verlasger Sellchaft, Weinheim (Federal republic of Germany) pp. 1 – 453 19. Seeni và ctv, 1993. Azadirachtin content and bioactivity of some neem ecotypes of Indica. In Neem and Environment. Volume 1. World Neem Conference, Bangalore, Indica, 24 – 28 Feb. 1993. (Eds. Singh R.P, Chari M.s., Raheja A.K. and Kraus W.). Science Publishers, Inc., USA, pp. 207 – 217. 20. Tewari D.N., Neem tree. India council of Foresty Research and Education, India, 1998, 18 pages PHỤ LỤC Phụ lục 1: kết quả định lƣợng các hoạt chất trong dầu neem Phụ lục 2: kết quả định lƣợng các hoạt chất trong dịch chiết bánh dầu Phụ lục 3: Phân tích probit, xác định LD50 sau 3 ngày xử lý chế phẩm NV1 LL 10xLL lg(10LL) TLC% Probit 0.5 5 0.6989 25.5 4.3412 1 10 1 29.3 4.4554 1.5 15 1.1761 35.3 4.6228 2 20 1.301 41.5 4.7853 2.5 25 1.3979 47.7 4.9423 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.95934 R Square 0.92034 Adjusted R Square 0.89378 Standard Error 0.07909 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 0.216823 0.2168 34.659 0.00978 Residual 3 0.018767 0.0063 Total 4 0.23559 Coefficients Standard Error t Stat P- value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Intercept 3.68906 0.163596 22.55 0.0002 3.16842 4.20969 3.16842 4.2096908 X Variable 1 0.84352 0.143281 5.8872 0.0098 0.38754 1.29951 0.38754 1.29950724 Y = 3.6891 + 0.8435 X X50= 1.5541 =lg(10LD) LD =3.5818 g/dm3 Phụ lục 4: Phân tích probit, xác định LD50 sau 7 ngày xử lý chế phẩm NV1 LL 10xLL lg(10LL) TLC% Probit 0.5 5 0.6989 42.2 4.8032 1 10 1 47.7 4.9423 1.5 15 1.1761 56.7 5.1687 2 20 1.301 65.5 5.3989 2.5 25 1.3979 73.2 5.6189 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.95239 R Square 0.90704 Adjusted R Square 0.87606 Standard Error 0.11663 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 0.398148 0.3981 29.272 0.01238 Residual 3 0.040805 0.0136 Total 4 0.438953 Coefficients Standard Error t Stat P- value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Intercept 3.91214 0.241226 16.218 0.0005 3.14445 4.67983 3.14445 4.67983187 X Variable 1 1.14306 0.211271 5.4104 0.0124 0.4707 1.81541 0.4707 1.81541444 Y = a + b X Y = 3.9121 + 1.1431 X X50 = (5 - 3.9121)/ 1.1431 X50 = 0.9517 10LD50 = 8.9475 LD50 = 0.8948 g/dm3 Phụ lục 5: Phân tích probit, xác định LD50 sau 3 ngày xử lý chế phẩm NV2 LL 10xLL lg(10LL) TLC % Probit 0.5 5 0.6989 35.8 4.6628 1 10 1 40.5 4.7596 1.5 15 1.1761 48.6 4.9649 2 20 1.301 56.8 5.1713 2.5 25 1.3979 64.5 5.3719 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.94174 R Square 0.88688 Adjusted R Square 0.84917 Standard Error 0.11313 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 0.30102 0.30102 23.52 0.01673 Residual 3 0.03839 0.0128 Total 4 0.33942 Coefficients Standard Error t Stat P- value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Intercept 3.87812 0.234 16.5735 0.0005 3.13344 4.6228 3.1334411 4.622795 X Variable 1 0.9939 0.20494 4.84978 0.0167 0.3417 1.6461 0.3416993 1.646104 y = 3.8781 + 0.9939 X X50= 1.1288 =lg(10LD) LD =1.3452g/dm3 Phụ lục 6: Phân tích Probit, xác định LD50 sau 7 ngày xử lý chế phẩm NV2 LL 10xLL lg(10LL) TLC% Probit 0.5 5 0.6989 58.7 5.2198 1 10 1 67.7 5.4593 1.5 15 1.1761 75.5 5.6903 2 20 1.301 78.7 5.7961 2.5 25 1.3979 85.3 6.0494 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.97954 R Square 0.95951 Adjusted R Square 0.94601 Standard Error 0.07382 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 0.38733 0.38733 71.084 0.0035 Residual 3 0.01635 0.00545 Total 4 0.40368 Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Intercept 4.38615 0.15268 28.7273 9E-05 3.90024 4.872 3.9002434 4.872048 X Variable 1 1.12743 0.13372 8.43114 0.0035 0.70187 1.553 0.7018654 1.552991 Y = a + bX Y = 4.3861 + 1.1274 X X 50 = (5 - 4.3861)/ 1.1274 X 50 = 0.5445 = Lg (10LD50) 10LD50 = 3.5035 LD50 = 0.3503 gam/ dm3 Phụ lục 7: Phân tích probit, xác định LD50 sau 3 ngày xử lý chế phẩm NV3 LL 10xLL lg(10LL) TLC % Probit 0.5 5 0.6989 40.2 4.751 8 1 10 1 47.7 4.942 3 1.5 15 1.1761 56.5 5.163 7 2 20 1.301 68.8 5.490 2 2.5 25 1.3979 80.7 5.866 9 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.932 R Square 0.868 Adjusted R Square 0.824 Standard Error 0.186 Observation s 5 ANOVA df SS MS F Significanc e F Regression 1 0.68418 0.684 19.70 5 0.0213 Residual 3 0.10417 0.035 Total 4 0.78835 Coefficients Standard Error t Stat P- value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Intercept 3.573 0.38542 9.269 0.002 7 2.346 4.799 2 2.3460115 3 4.79915 2 X Variable 1 1.498 0.33756 4.439 0.021 3 0.4242 2.572 7 0.4241566 8 2.57266 5 Y = 3.5726 + 1.4984 X50 = 0.9523 = lg (10 LD) 10 LD =8.9598 LD50= 0.8959 -- 0.8960 g/dm3 0.896 g/dm3 Phụ lục 8: phân tích probit, xác định LD50 sau 7 ngày xử lý chế phẩm NV3 LL 10xLL lg(10LL) TLC% Probit 0.5 5 0.6989 76.7 5.729 1 10 1 83.3 5.9661 1.5 15 1.1761 86.6 6.1077 2 20 1.301 93.3 6.4985 2.5 25 1.3979 96.7 6.8384 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.931 R Square 0.867 Adjusted R Square 0.823 Standard Error 0.185 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 0.6746 0.675 19.607 0.0214 Residual 3 0.10322 0.034 Total 4 0.77782 Coefficients Standard Error t Stat P- value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0% Intercept 4.569 0.38366 11.91 0.0013 3.3483 5.7903 3.3482833 5.790264 X Variable 1 1.488 0.33602 4.428 0.0214 0.4185 2.5573 0.41851972 2.557254 Y= 4.5693 + 1.4878 X X50= (Y50 -4.5693)/1.4878 X50= 0.2895 x= 1.9476 LD50 = 0.19476 gam/dm3 Phụ lục 9: Phân tích Probit, xác định LD50 sau 3 ngày xử lý chế phẩm NV4 LL 10xLL lg(10LL) TLC% Probit 0.5 5 0.6989 48.2 4.9549 1 10 1 56.8 5.1713 1.5 15 1.1761 67.6 5.4565 2 20 1.301 75.4 5.6871 2.5 25 1.3979 85.3 6.0494 SUMMARY OUTPUT Regression Statistics Multiple R 0.95384 R Square 0.90982 Adjusted R Square 0.87976 Standard Error 0.14888 Observations 5 ANOVA df SS MS F Significance F Regression 1 0.6709 0.6709 30.2668 0.01182 Residual 3 0.0665 0.0222 Total 4 0.7374 Coefficients Standard Error t Stat P-value Lower 95% Upper 95% Lower 95.0% Upper 95.0%