Luận văn Đánh giá một số dòng lạc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống l23, l18, md7 và md9

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------    ------ ĐINH TIẾN DŨNG ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LẠC CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC CỦA CÁC GIỐNG L23, L18, MD7 VÀ MD9 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------    ------ ĐINH TIẾN DŨNG ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ DÕNG LẠC CÓ NGUỒN GỐC TỪ MÔ SẸO CHỊU MẤT NƢỚC CỦA CÁC GIỐNG L23, L18, MD7 VÀ MD9 Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Thị Tâm Thái Nguyên - 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố. Tác giả Đinh Tiến Dũng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới T.S Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài này. Tôi xin chân thành cảm ơn giảng viên ThS. Vũ Thị Thu Thủy, KTV Nguyễn Thị Hồng Chuyên – Phòng Hóa sinh, KTV Trần Thị Hồng – Phòng Di truyền học và công nghệ gen – Khoa Sinh - KTNN - ĐHSP Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học và nghiên cứu đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn động viên và ủng hộ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tác giả Đinh Tiến Dũng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang Mở đầu………………………………………………………………..................... 1 Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu…………………………………………………… 3 1.1. Giới thiệu về cây lạc……………………………………………………. 3 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, phân bố và đặc điểm sinh học cây lạc ………...... 3 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lạc……………………………………………….. 4 1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và ở Việt Nam……………………... 5 1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật………………………………..... 7 1.2.1. Khái niệm về hạn và ảnh hưởng của hạn tới thực vật ………………….. 7 1.2.2. Tác động của hạn đối với cây lạc…......................………….................... 8 1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và di truyền của tính chịu hạn ở cây lạc………... 9 1.2.3.1 Cơ sở sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn……………………………….. 9 1.2.3.2 Cơ sở phân tử của tính chịu hạn………………………………………… 10 1.2.4 Ứng dụng của công nghệ tế bào thực vật trong đánh giá và chọn dòng chịu hạn ở lạc. ………………………………………………………….. 12 1.3. Kĩ thuật RAPD trong phân tích hệ gen thực vật .................................. 13 Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Vật liệu ……………………………......................................................... 18 2.1.1. Vật liệu thực vật……………………………………………………........ 18 2.1.2. Hóa chất và thiết bị................................................................................... 18 2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u ........................................................................ 19 2.2.1. Phương pháp đánh giá đặc điểm nông học các dòng chọn lọc................... 19 2.2.2. Phương pháp đánh giá chất lượng hạt …………………………………... 20 2.2.3. Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn ...................................... ……. 22 2.2.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm............................... 22 2.2.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phương pháp gây hạn nhân tạo ……………………………………………………… .. 24 2.2.4. 2.2.4. Phương pháp đánh giá sự thay đổi ADN genome……………….. 25 2.2.5. Xử lý số liệu và tính toán kết quả………….....................………………. 27 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Chƣơng 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc………………................ 29 3.1.1. Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R2.......................... 29 3.1.2. Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R3.......................... 37 3.1.3. Nhận xét về đặc điểm nông học và kết quả chọn lọc ngoài đồng ruộng ... 41 3.2. Chất lƣợng hạt của một số dòng lạc chọn lọc thế hệ R3....….............. 43 3.2.1. Hàm lượng lipit, protein và đường tan trong hạt của các dòng chọn lọc 43 3.2.2. Hàm lượng amino acid liên kết trong hạt của một số dòng chọn lọc và giống gốc………………………………………………………………... 45 3.2.3 Nhận xét về chất lượng hạt của các dòng lạc chọn lọc………………….. 3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng chọn lọc.............................. 49 3.3.1 Khả năng chịu hạn ở giai đoạn nảy mầm các dòng chọn lọc thế hệ R4............................................................................................................... 49 3.3.1.1. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ α – amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm………………………………………….................................... 49 3.3.1.2. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hàm lượng đường tan trong giai đoạn hạt nảy mầm …………………………………………..…………………..... 52 3.3.1.3. Mối tương quan giữa hoạt độ α-amylase và hàm lượng đường tan……… 55 3.3.1.4. Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc và giống gốc trong điều kiện hạn sinh lý ở giai đoạn hạt nảy mầm………………………………. 56 3.3.2. Khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non của các dòng chọn lọc thế hệ R4.................……...………………………………………………...…… 56 3.3.2.1 Khối lượng tươi, khô của rễ, thân lá và chiều dài rễ cây non 3 lá sau khi xử lý hạn…………………………………………………………………. 57 3.3.2.2 Ảnh hưởng của hạn nhân tạo đến tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước và chỉ số chịu hạn tương đối của các giống lạc ở giai đoạn cây non ………. 61 3.3.2.3 Khả năng phục hồi của các dòng chọn lọc khi gây hạn nhân tạo………... 63 3.3.2.4 Sự biến đổi hàm lượng proline trong giai đoạn cây non trong điều kiện hạn nhân tạo…………………………………………………………….. 64 3.3.2.5. Mối tương quan giữa hàm lượng proline và chỉ số chịu hạn……………. 66 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3.3.2.6 Nhận xét về khả năng chịu hạn của các dòng lạc và giống gốc ở giai đoạn cây non …………………………………………………………… 67 3.4. Đánh giá sự thay đổi ADN genome một số dòng chọn lọc bằng kĩ thuật RAPD …………………………………………………….……… 69 3.4.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số……………………………………….... 69 3.4.2. Phân tích đa hình ADN bằng kĩ thuật RAPD…………………………..... 70 3.4.3. So sánh sự khác nhau của các dòng chọn lọc và giống gốc ở mức độ phân tử…………………………………………………………………… 73 3.4.4. Nhận xét về đa hình RAPD……………………………………………… 75 Kết luận……………………………………………………………………...…… 76 Công trình đã công bố liên quan đến luận văn…………...……………………. 77 Tài liệu tham khảo..……………………………………………............................ 78 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng lạc trên thế giới từ năm 2000-2008 ............ 6 Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng lạc ở Việt Nam từ 2000 – 2008 .................. 7 Bảng 2.1. Các dòng chọn lọc ở thế hệ R3 và giống gốc ……………………………… 18 Bảng 2.2. Thành phần hóa chất trong phân tích hàm lượng - amylase …………….. 23 Bảng 2.3. Trình tự 5 mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD………………………… 27 Bảng 3.1. Đặc điểm nông học của các dòng lạc R2....................................................... 30 Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất ở các dòng thế hệ R2......................................... 32 Bảng 3.3. Giá trị Tα, Ttn của các đặc điểm nông học thế hệ R2.................................... 35 Bảng 3.4 Đặc điểm nông học của các dòng lạc thế hệ R3............................................. 37 Bảng 3.5 Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất của của các dòng thế hệ R3………………. 39 Bảng 3.6. Giá trị Tα, Ttn của các đặc điểm nông học thế hệ R3................................... 40 Bảng 3.7 Một số chỉ tiêu hóa sinh trong hạt các dòng thế hệ R3.................................. 44 Bảng 3.8 Hàm lượng amino acid liên kết trong hạt của một số dòng chọn lọc và giống gốc thế hệ R3………………………………………………………… 45 Bảng 3.9 Hàm lượng amino acid liên kết trong protein hạt của một số dòngchọn lọc thế hệ R3 và giống gốc ................................................................................. 47 Bảng 3.10 Thành phần và hàm lượng các amino acid không thay thế trong hạt của các dòng lạc.......................................................................................................... 47 Bảng 3.11. Hoạt độ của -amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 10% 50 Bảng 3.12. Hàm lượng đường tan trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xử lý sorbitol 10% .. 52 Bảng 3.13. Tương quan giữa hoạt độ của α-amylase và hàm lượng đường ở giai đoạn hạt nảy mầm ……………………………………......................................... 55 Bảng 3.14. Khối lượng tươi, khô của thân lá cây non 3 lá sau khi xử lý hạn………….. 57 Bảng 3.15. Khối lượng tươi, khô của rễ cây non 3 lá sau khi xử lý hạn……………….. 58 Bảng 3.16. Chiều dài rễ của các dòng lạc ở giai đoạn cây non thế hệ R4...……………. 60 Bảng 3.17. Tỷ lệ cây sống, khả năng giữ nước và chỉ số chịu hạn tương đối của các giống lạc ở giai đoạn cây non thế hệ R4…………………………………… 62 Bảng 3.18. Khả năng phục hồi của các dòng lạc chọn lọc sau khi gây hạn nhân tạo….. 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Bảng 3.19. Hàm lượng prolin của thân lá của các dòng lạc ở giai đoạn cây non các dòng chọn lọc thế hệ R4…………………………………………………… 65 Bảng 3.20. Tương quan giữa chỉ số chịu hạn và hàm lượng proline………………….. 67 Bảng 3.12. Hàm lượng và độ tinh sạch của ADN tổng số tách từ các dòng chọn lọc…. 70 Bảng 3.22 Tổng số phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD với 5 mồi ngẫu nhiên………………………………………………………. 70 Bảng 3.23 Tỷ lệ phần trăm phân đoạn đa hình khi sử dụng 5 mồi RAPD…………….. 71 Bảng 3.24 Hệ số sai khác di truyền của 3 dòng lạc giống L23 và giống gốc ………. 74 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1. Một số hình ảnh dòng R2.9 và giống gốc …………………………… 36 Hình 3.2 Một số hình ảnh dòng chọn lọc thế hệ R3………………………....... 42 Hình 3.3 Sắc kí đồ amino acid của dòng R3.26 (giống MD7)………………… 46 Hình 3.4. Biểu đồ hàm lượng amino acid không thay thế của các dòng lạc nghiên cứu với giống gốc…………………………………...………. 48 Hình 3.5. Sự biến động hoạt độ α-amylase của các dòng lạc thế hệ R4 có nguồn gốc mô sẹo chịu mất nước giống MD7……………………… 52 Hình 3.6. Biểu đồ sự biến động hàm lượng đường tan của các dòng lạc thế hệ R4 giống L18 ……………………………………………………….. 54 Hình 3.7. Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các dòng và giống gốc MD7 ở giai đoạn cây non……………………………………….. 63 Hình 3.8. Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các dòng và giống gốc R23 ở giai đoạn cây non………………………………………… 63 Hình 3.9. Sự biến động hàm lượng prolin e ở giai đoạn cây non của các dòng thuộc giống MD7, L18 và giống gốc………………………………... 66 Hình 3.10. Một số hình ảnh giai đoạn cây non, chiều dài rễ của các dòng chọn lọc thế hệ R4 trước và sau khi gây hạn và phục hồi…………………. 68 Hình 3.11. Kết quả tách chiết ADN tổng số của các giống lạc………………….. 69 Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M1 và M2 ………………………………………………………………. 72 Hình 3.13. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M3 và M4 ………………………………………………………………. 72 Hình 3.14. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR-RAPD của 6 mẫu lạc mới mồi M5.. 73 Hình 3.15. Sơ đồ mô tả quan hệ di truyền của 3 dòng lạc giống L23 và giống gốc…………………………………………………………………… 75 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid ADN Deoxyribose Nucleic Acid AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài các phân đoạn được nhân bản) ASTT Áp suất thẩm thấu CS Cộng sự CNSH Công ngệ sinh học CSCHTĐ Chỉ số chịu hạn tương đối ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ ĐHSP Đại học sư phạm HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi) Kb Kilobase KLK Khối lượng khô MGPT Môi giới phân tử MS Murashige Skoog (Môi trường theo Murashige và Skoog) NXB Nhà xuất bản PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism ADN (Phân tích ADN đa hình được nhân bản ngẫu nhiên) HSP Protein sốc nhiệt LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lượng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi) PTNT Phát triển nông thôn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế cao. Cây lạc được gieo trồng phổ biến ở hơn 100 nước với diện tích 25,6 triệu ha [13]. Hạt lạc là một trong những nguồn thực phẩm chứa nhiều chất béo và protein cần thiết cho khẩu phần ăn của con người. Ngoài ra, hạt lạc còn chứa nhiều vitamin và một lượng hydratcacbon nhất định. Hạt lạc là nguyên liệu chính để sản xuất dầu ăn, bánh kẹo, fomat,... và là mặt hàng xuất khẩu có giá trị. Các phụ phẩm của lạc (khô dầu, thân, lá) được sử dụng làm thức ăn cho gia súc hay phân bón đều rẻ tiền. Trồng lạc có tác dụng chuyển đổi cơ cấu kinh tế nông nghiệp hiện nay [12], [13]. Ở Việt Nam, cây lạc đóng vai trò quan trọng trong cơ cấu nông nghiệp, đặc biệt ở những nơi khí hậu thường xuyên biến động và điều kiện canh tác còn gặp nhiều khó khăn. Trong những năm gần đây, việc tổng kết kinh nghiệm thực tiễn và áp dụng khoa học tiên tiến vào sản xuất đã góp phần tăng năng suất một cách đáng kể [20]. Tuy nhiên, do điều kiện khí hậu của Việt Nam nắng nóng, mưa nhiều nên sản xuất lạc ở nước ta vẫn còn nhiều yếu tố hạn chế, một trong những nhân tố chính có ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng lạc là khô hạn. Để hạn chế ảnh hưởng của năng suất cây trồng nói chung, cây lạc nói riêng, ngoài các biện pháp tưới tiêu hợp lý cần sử dụng các giống có năng suất và khả năng chịu hạn cao, đặc biệt ở những vùng đất không chủ động nước. Vì vậy, nghiên cứu các đặc điểm nông học, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn của các giống lạc là rất cần thiết. Một trong những hướng nghiên cứu đang được quan tâm hiện nay là sử dụng các chỉ thị phân tử và công nghệ tế bào thực vật để cải tiến đặc điểm năng suất, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn của một số giống cây trồng, trong đó có cây lạc. Bằng kĩ thuật nuôi cấy invitro, chúng tôi đã tạo được một số dòng cây từ mô sẹo chịu mất nước của các giống lạc L18, L23, MD7 và MD9. Trên cơ sở nghiên cứu chọn dòng chịu hạn của các giống và các dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 sẹo chịu mất nước ở quần thể R0 và thế hệ R1 [49] và với mục đích chọn tạo được các dòng lạc có các đặc điểm nông học mong muốn, chất lượng hạt và khả năng chịu hạn cao, chúng tôi nghiên cứu đề tài: “Đánh giá một số dòng lạc chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống L18, L23, MD7 và MD9” 2. Mục tiêu nghiên cứu Thông qua việc đánh giá các đặc điểm nông học, sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử nhằm chọn dòng có năng suất, chất lượng và khả năng chịu hạn cao tại Thái Nguyên từ một số dòng chọn lọc có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống lạc L18, L23, MD7 và MD9. 3. Nội dung nghiên cứu 3.1. Phân tích một số đặc điểm nông học của các dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của các giống L18, L23, MD7, MD9 ở thế hệ R2, R3. 3.2. Đánh giá chất lượng hạt các dòng chọn lọc thông qua phân tích một số chỉ tiêu hóa sinh: protein, đường, lipit và thành phần amino acid trong hạt tiềm sinh ở thế hệ R3. 3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng thế hệ R4 ở giai đoạn nảy mầm và cây non. 3.4. Phân tích sự thay đổi ADN genome của một số dòng chọn lọc thế hệ R4 bằng kĩ thuật RAPD. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây lạc 1.1.1. Nguồn gốc, phân loại, phân bố và đặc điểm sinh học Vào thời kì phát hiện ra châu Mĩ, cùng với sự xâm nhập của châu Âu vào lục địa này, người ta đã biết đến cây lạc. Những người Tây Ban Nha và Bồ Đào Nha đầu tiên đến châu Mĩ đã thấy dân bản xứ trồng lạc cùng với những cây lương thực khác. Hiện nay, cây lạc được trồng phổ biến trên thế giới và Việt Nam [10]. Lạc thuộc họ đậu Leguminosae, chi Arachi, phân họ cánh Bướm phượng Papillonacea, có tên khoa học là Arachis hypogaea L. và có bộ nhiễm sắc thể 2n = 40. Về đặc điểm hình thái, cây lạc có 3 bộ phận chính là: rễ, thân và lá [4], [43]. Rễ cây lạc thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và rễ bên. Khi cây lạc được 5 lá thật thì bộ rễ tương đối hoàn chỉnh. Bộ rễ có thể ăn sâu 18cm - 30cm và rộng khoảng 30cm - 40cm. Sau khi gieo từ 15 - 30 ngày, những nốt sần đầu tiên xuất hiện do loại vi khuẩn Rhyzobium cộng sinh với hệ rễ. Tại nốt sần xảy ra quá trình cố định đạm cung cấp chất dinh dưỡng cho cây [8], [13]. Thân cây lạc thuộc loại thân thảo ít gỗ. Khi còn non thân thường tròn và đặc. Khi thân già có hình góc cạnh và rỗng giữa. Tốc độ tăng trưởng của thân tăng dần và đạt cao nhất ở thời kì ra hoa rộ. Cây lạc phân cành ngay từ gốc. Cành cấp 1 được mọc từ gốc thường có nhiều hoa, cành cấp 2 mọc từ cành cấp 1 và thường có ít hoa hơn. Số cành/cây khác nhau tuỳ giống và có ảnh hưởng trực tiếp đến số hoa và quả của cây [4], [12], [13]. Lá lạc thuộc lá kép lông chim chẵn, gồm 2 đôi lá chét. Hai lá mầm có vai trò cung cấp chất dinh dưỡng cho cây ở giai đoạn đầu. Hai lá kèm hình mũi mác có nhiệm vụ bảo vệ mầm, lá thật có màu xanh thẫm và nhọn ở đầu. Diện tích lá đạt tối đa ở thời kỳ hình thành quả và hạt nhưng lại giảm nhanh và có thể đạt giá trị âm vào thời kỳ chín. Khi hoa tắt thì lá không mọc thêm nữa. Hoa tắt được vài ngày bộ lá chuyển sang màu vàng. Lúc quả chín, bộ lá đen và rụng [13]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Hoa lạc mọc ở nách lá thành chùm từ 3 - 5 hoa/chùm. Hoa lạc màu vàng, không có cuống gồm 5 phần: lá bắc, lá đài, tràng hoa, nhị đực và nhụy cái. Khi cây có từ 9 - 10 lá thật thì hoa nở. Khi hoa nở là đã thụ phấn xong, sau đó cuống nhụy mọc dài, nghiêng xuống, đầu bầu nhụy cắm vào đất. Quá trình phân hoá hoa kéo dài nên quá trình nở hoa cũng kéo dài [13]. Quả lạc là loại quả khô thường có 2 - 3 hạt. Quả lạc bao gồm gốc quả, mỏ quả và eo quả. Eo rõ hay không rõ, vỏ quả có gân hay không có gân là đặc điểm khác nhau giữa các giống. Hạt lạc bao gồm vỏ lụa bao bọc bên ngoài, bên trong hạt có phôi với hai lá mầm và một trục thẳng. Kích thước và màu sắc hạt thay đổi tuỳ theo giống, thời vụ gieo trồng và chế độ chăm sóc [13]. Các chất khoáng cần thiết cho cây lạc bao gồm các nguyên tố đa lượng (N, P, K…) và các nguyên tố vi lượng (Mo, Bo, Cu…). Ngoài ra, số giờ nắng/ngày cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự ra hoa, tạo quả của lạc. Trong những ngày nắng hoa nở rộ và quá trình thụ phấn, thụ tinh thuận lợi hơn ngày không nắng. Điều kiện đất đai, thổ nhưỡng cũng ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây lạc. Từ những đặc điểm đó, cần có biện pháp kỹ thuật thích hợp để nâng cao năng suất, chất lượng và tính chống chịu của cây lạc [12], [13]. Căn cứ theo thời gian sinh trưởng của cây lạc, người ta chia thành giống chín sớm (thời gian sinh trưởng 90- 125 ngày) và giống chín muộn (140- 160 ngày). Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển của cây lạc từ 24oC - 33 oC, dưới 12oC hạt lạc không nảy mầm, từ 15oC tỉ lệ nảy mầm khá cao, dưới 17 oC hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm khoảng 60 - 70%, lượng mưa phân bố đều. Đất thích hợp nhất cho trồng lạc là đất có màu sáng, thoát nước nhanh, dễ vỡ, lượng canxi, lân, chất hữu cơ vừa phải, mùn ít hơn 2%, pH= 6,0 – 6,4 [13]. 1.1.2. Giá trị kinh tế Ở nước ta, lạc được coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị rất đa dạng. Trước hết, với giá trị dinh dưỡng cao nên lạc là cây thực phẩm quan trọng trong đời sống của người dân. Trong dầu lạc chứa hàm lượng axit béo chưa no cao (80% trong thành phần axit béo của dầu lạc) đây chính là loại dầu thực phẩm tốt. Trong hạt lạc có chất lecithin (photphattidyl cholin) có tác dụng trong việc làm giảm lượng cholesterol trong máu, chống hiện tượng xơ vữa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 mạch máu. Lạc là loại thực phẩm cung cấp năng lượng cao, 100g hạt lạc cung cấp 590 cal, trong khi đậu tương là 400 cal. Hạt có thể sử dụng trực tiếp hoặc ép làm dầu thực vitamin mật, sữa lạc, bơ lạc, phomat lạc... [12]. Hạt lạc chứa nhiều loại vitamin, đặc biệt là vitamin A. Vì vậy, sử dụng các sản phẩm từ hạt lạc sẽ khắc phục được sự thiếu hụt vitamin A [7]. Lạc còn được sử dụng trong chăn nuôi, khô dầu lạc chế biến thành thức ăn gia súc, vitamin mỏ quả lạc có thể nghiền thành cám, cám lạc có giá trị tương đương vitamin với cám gạo. Vỏ lạc có thành phần là cellulo và hemicellulo được sử dụng để chế biến thành vật liệu hấp phụ kim loại nặng, đây là một trong những hướng nghiên cứu có tính ứng dụng quan trọng trong việc xử lí nước thải, bảo vệ nguồn nước [10]. Ngoài giá trị dinh dưỡng, lạc còn là cây cải tạo đất rất tốt. Cũng như các cây họ đậu khác, ở rễ lạc có các nốt sần do các vi sinh vật cộng sinh cố định đạm hình thành. Nhờ khả năng này mà lượng protein ở hạt và các cơ quan như thân, lá, … cao hơn nhiều cây trồng khác. Cũng nhờ khả năng cố định đạm nên sau khi thu hoạch đất trồng lạc cũng được cải thiện rõ rệt, lượng đạm trong đất tăng, nhờ hoạt động của vi khuẩn nốt sần mà sau một vụ lạc sẽ để lại trong đất 40 – 60kg N/ha. Thân, lá lạc dùng làm phân bón cũng có hàm lượng N, P, K tương đương với phân chuồng [10]. 1.1.3. Tình hình sản xuất lạc trên thế giới và Việt Nam Hiện nay, lạc được trồng trên 100 nước và sản lượng đạt 53,38 triệu tấn. Châu Á là nơi có diện tích trồng và sản lượng lạc cao nhất, chiếm trên 60% sản lượng của thế giới. Châu Phi đứng thứ hai chiếm 30%, các châu lục khác rất ít (châu Mỹ 5%, châu Âu 0,22%) . Sản lượng lạc (trên 60%) tập chung ở một số nước như Ấn Độ (chiếm 31% sản lượng lạc toàn thế giới), Trung Quốc (15%), Xenegan, Nigieria và Mỹ [48]. Ấn Độ là nước đứng đầu thế giới về diện tích trồng lạc (trên 8 triệu ha) nhưng năng suất thấp (6,9 - 9,89 tạ/ha), sản lượng hàng năm chỉ đạt 5,4 triệu tấn. Nói chung, năng suất lạc ở Ấn Độ không đồng đều, có vùng chỉ đạt 0,5 tấn/ha, có vùng lại đạt tới 3tấn/ha [53]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Trung Quốc là nước đứng thứ hai về diện tích trồng lạc. Diện tích trồng lạc ở Trung Quốc có xu hướng tăng (năm 1993 tổng diện tích là 3379,0 nghìn ha, đến năm 2002 tổng diện tích là 4920,7 nghìn ha). Năng suất lạc ở Trung Quốc khá đồng đều ở các vùng. Nhiều năm nay, sản phẩm lạc Trung Quốc là một trong các mặt hàng nông sản xuất khẩu nổi tiếng trên thị trường quốc tế. Vào năm 60 của thế kỉ XX, năng suất lạc toàn quốc trung bình đạt 3,0 tấn/ha. Sản lượng lạc hàng năm đạt 11,89 triệu tấn, đứng đầu thế giới [48]. Mỹ là nước trồng lạc không lớn (0,59 triệu ha), nhưng năng suất lạc cao nhất thế giới (3,1tấn/ha) , sản lượng đạt 1,8 triệu tấn (số liệu năm 2003). Điều đó chứng tỏ Mỹ là nước đứng đầu về áp dụng các tiến bộ khoa học kĩ thuật [53]. Diện tích trồng lạc ở Đông Nam Á không nhiều, chỉ chiếm 12,61% diện tích thu hoạch và 12,95% sản lượng lạc của châu Á. Trong số 7 nước có trồng lạc ở khu vực này thì Myanmar là nước có diện tích trồng lạc lớn nhất, theo sau là Indonesia. Tổng diện tích trồng lạc của hai nước này chiếm tới gần 75% diện tích trồng lạc trong khu vực. Về năng suất, nhìn chung năng suất lạc trong khu vực còn ở mức thấp, trung bình là 1,17 tấn/ha. Malaysia là nước có diện tích trồng lạc không lớn (6000 ha) nhưng lại có năng suất cao nhất khu vực, trung bình năng suất đạt 2,33 tấn/ha và tương đương với mức năng suất cao của một số nước trên thế giới [51]. Bảng 1.1. Diện tích, năng suất, sản lượng lạc trên thế giới từ năm 2000 – 2008 Chỉ tiêu/năm 2000 2004 2005 2006 2007 2008 Diện tích (triệu ha) 24,49 26,37 26,96 24,67 25,45 25,06 Năng suất (tấn/ha) 1,45 1,79 1,81 1,87 2,00 2,09 Sản lượng (triệu tấn) 35,53 46,90 48,93 46,25 51,00 53,38 ( Nguồn: PAS, USDA 2008) [15] Ở Việt Nam, cây lạc được trồng rộng rãi ở hầu hết các tỉnh, thành trong cả nước và được chia theo các vùng sinh thái ở hai miền Nam, Bắc. Diện tích, năng suất và sản lượng lạc không ngừng phát triển. Năm 2000, diện tích lạc chỉ đạt 24,1 nghìn ha, với năng suất 1450kg/ha, đạt sản lượng 349,0 ngàn tấn nhưng đến năm 2007 diện tích lạc ở nước ta đã lên 27,99 ngàn ha, năng suất 1980 kg/ha, với sản lượng 554,2 ngàn tấn. Do lạc là cây trồng nhiệt đới và á nhiệt đới, Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 hơn nữa yêu cầu về đất đai không quá khắt khe nên phù hợp với điều kiện nước ta [48]. Bảng 1.2. Diện tích, năng suất, sản lượng lạc ở Việt Nam từ 2000 – 2008 Năm 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Diện tích (1000 ha) 244,9 244,6 244,7 243,8 263,7 269,6 264,7 254,5 256 Năng suất (tấn/ha) 1,45 1,48 1,62 1,67 1,78 1,81 1,87 2,00 2,09 Sản lượng (1000 tấn) 355,3 363,1 400,4 306,2 469 489,3 462,5 510 533,8 (Nguồn: theo tổng cục thống kê Việt Nam 2010) [16] Tình hình sản xuất lạc ở các vùng sinh thái khác nhau cũng rất khác nhau về diện tích, năng suất và sản lượng. Nhìn chung, các vùng trồng lạc ở miền Bắc có diện tích ổn định hơn ở miền Nam. Trong những năm gần đây, khí hậu thay đổi phức tạp, đất nông nghiệp bị rửa trôi và phong hóa nhanh, hàm lượng mùn và dinh dưỡng thấp (đất bạc màu, đất phù sa cổ, đất dốc tụ, ...). Vì vậy, trồng lạc là một trong những biện pháp cải tạo đất, tạo nền nông nghiệp bền vững [7]. 1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn 1.2.1. Khái niệm về hạn và ảnh hƣởng của hạn đến thực vật Mỗi cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trường như hạn, nóng, lạnh, mặn, ... Nếu ở ngoài giới hạn đó có thể gây hại cho sự sinh trưởng và phát triển của cây, giảm năng suất sinh học [54]. Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu hụt nước do môi trường gây nên trong suốt cả quá trình hay trong từng giai đoạn, làm ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của cây. Mức độ tổn thương của cây trồng do khô hạn gây ra có nhiều mức khác nhau như chết, chậm phát triển hay phát triển tương đối bình thường. Những cây trồng có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tương đối ổn định trong điều kiện khô hạn được gọi là cây chịu hạn và khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thương do thiếu hụt nước gây nên gọi là tính chịu hạn [1]. Hạn dẫn đến một số biến đổi trong mô và tế bào như làm biến tính và kết tủa protein, làm tăng độ lỏng của lipit màng, mở xoắn các axit nucleic. Hạn cũng phá hoại hệ thống quang hóa II trên màng thylacoid. Ảnh hưởng của hạn trước Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 hết là gây ra sự mất nước của tế bào và mô. Thiếu nước nhẹ làm ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng, thiếu nước năng gây biến đổi hệ keo nguyên sinh chất, già hóa tế bào, làm cho cây bị héo. Cuối cùng hệ nguyên sinh chất bị đứt vỡ cơ học dẫn đến tế bào và mô bị tổn thương và chết. Hạn là nguyên nhân chính của sự mất mùa và làm giảm năng suất gieo trồng [54]. Phản ứng của cây đối với hạn là sự đóng khí khổng, giảm tỷ lệ thoát hơi nước của mô, giảm quang hợp và làm tăng tích lũy axit abxisic (ABA), proline, manitol, sorbitol, sự cấu thành nhóm ascobat, glutathione, α-tocopherol,... và sự tổng hợp protein mới [72]. Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng chịu hạn ở cây lúa, ngô, đậu tương, đậu xanh ... như Lê Trần Bình và cs, 1988 [1], Chu Hoàng Mậu, 2009 [49], Đinh Thị Phòng, 2001 [41], … 1.2.2. Tác động của hạn đối với cây lạc Nước là yếu tố ngoại cảnh ảnh hưởng lớn nhất đến năng suất lạc. Tuy rằng, lạc được coi là cây trồng hạn, nhưng thực ra cây lạc chỉ chịu hạn ở một giai đoạn nhất định. Tình trạng nước trong đất có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng, phát triển của cây lạc. Điểm khủng hoảng nước của cây được nhiều tác giả công nhận là thời kỳ ra hoa rộ, thời kỳ đâm tia, thời kì sinh trưởng sinh dưỡng, thời kỳ hình thành quả và hạt. Thời kỳ nhu cầu nước của cây tương đối thấp và cũng là thời kỳ cây có khả năng chịu hạn tốt nhất là thời kỳ sinh trưởng sinh dưỡng. Sự hấp thu nước của cây lạc trong thời kỳ này ít hơn các thời kỳ tiếp theo. Điều này giải thích được nguyên nhân cây ít mẫn cảm với thiếu nước trong pha đầu sinh trưởng. Tuy nhiên nếu hạn hán kéo dài thì dù trong thời kỳ cây con cũng ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng và năng suất [54]. Khi cây lạc bị thiếu nước, chiều cao cây giảm rõ rệt, lá nhỏ, dày và cứng hơn trong điều kiện bình thường, lá từ màu xanh đậm chuyển dần sang xanh nhạt do diệp lục bị phá hủy. Thiếu nước trong thời kỳ ra hoa sẽ làm giảm số hoa, thời gian ra hoa kéo dài, quá trình thụ phấn bị cản trở. Ở điều kiện hạn, rễ có thể ăn sâu hơn 5- 10%, nhưng bán kính phân bố rễ giảm 2/3. Trong giai đoạn hình thnàh quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ chất khô tích lũy cũng cao cho nên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 cần lượng nước lớn nhất so với các giai đoạn khác trong chu kì sinh trưởng [7], [10], [51]. 1.2.3. Cơ sở sinh lý, hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn 1.2.3.1. Cơ sở sinh lý, hóa sinh của tính chịu hạn Khi môi trường khô hạn, thực vật chống lại sự mất nước và nhanh chóng bù lại phần nước đã mất nhờ hoạt động của bộ rễ và sự điều chỉnh ASTT của tế bào. Sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc hình thái của rễ và chồi nhằm giảm thiểu tối đa sự mất nước hoặc tự điều chỉnh ASTT nội bào thông qua tích lũy của các chất hòa tan, các protein và axit amin ... nhằm duy trì lượng nước tối thiểu trong tế bào. Khả năng thu nhận nước chủ yếu phụ thuộc vào chức năng của bộ rễ. Bộ rễ có hình thái khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút được nước ở những vùng sâu. Ngoài ra, cây có hệ mạch dẫn phát triển dẫn nước lên các cơ quan thoát hơi nước, hệ mô bì phát triển sẽ hạn chế sự thoát hơi nước của cây [1], [41]. Khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu có mối liên quan trực tiếp đến khả năng cạnh tranh nước của tế bào rễ cây đối với đất. Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu tăng lên giúp cho tế bào rễ thu nhận được những phân tử nước ít ỏi còn trong đất. Bằng cơ chế như vậy thực vật có thể vượt qua được tình trạng hạn cục bộ [1]. Khi phân tích thành phần hóa sinh của các cây chịu hạn, các nghiên cứu đều cho rằng khi cây gặp hạn có hiện tượng tăng lên về hàm lượng ABA, hàm lượng proline, nồng độ ion K+, các loại đường, axit hữu cơ, ... giảm CO2, protein và các axit nucleic [1], [41]. Các chất trên có chức năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu nhờ khả năng giữ và lấy nước vào tế bào hoặc ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na + , ngoài ra còn có thể thay thế vị trí của nước nơi xảy ra các phản ứng sinh hóa, tương tác với protein và lipit màng, ngăn chặn sự phá hủy màng [56]. Nghiên cứu sự đa dạng và hoạt động của enzyme trong điều kiện gây hạn đã được nhiều tác giả quan tâm. Trần Thị Phương Liên (1999) nghiên cứu đặc tính hóa sinh của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, hạn đã nhận xét rằng áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng rõ rệt tới thành phần và hoạt độ protease, kìm hãm sự phân giải protein dự trữ [27]. Một số nghiên cứu trên các đối tượng như lạc, lúa, đậu xanh, đậu tương...cho thấy, có mối tương quan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 thuận giữa hàm lượng đường tan và hoạt độ α-amylase [23], [27], [36], ...Đường tan là một trong những chất tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Sự tăng hoạt độ α-amylase sẽ làm tăng tăng hàm lượng đường tan do đó làm tăng áp suất thẩm thấu và tăng khả năng chịu hạn của cây trồng [27], [42]. Một trong các chất liên quan đến thẩm thấu được chú ý là proline. Proline là một amino acid có vai trò quan trọng trong sự điều hòa áp suất thẩm thấu trong tế bào. Theo thông báo của Chen và Muranta (2002), sức chống chịu của thực vật tăng lên khi được chuyển các gen mã hóa enzym tham gia vào con đường sinh tổng hợp proline trong tế bào [59]. Nghiên cứu của Nguyễn Hữu Cường và cs (2003) cho rằng, sự gia tăng hàm lượng proline của các giống lúa nghiên cứu có mối tương quan thuận với tính chống chịu lạnh, mặn và hạn [3]. Chu Hoàng Mậu và cs (2005) khi nghiên cứu về hàm lượng proline ở các giống lúa cạn đã nhận thấy khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn có liên quan đến hàm lượng protein và hàm lượng proline. Khi gặp hạn, cây lúa giảm hảm lượng protein, tăng hàm lượng proline. Khả năng chịu hạn của cây lúa cạn phụ thuộc tuyến tính vào hàm lượng proline [32]. Nghiên cứu trên đối tượng cây lạc cũng cho kết quả tương tự [25]. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy sự tích lũy proline có thể tăng 10 đến 100 lần ở thực vật dưới tác động của áp suất thẩm thấu [19], [41], … 1.2.3.2. Cơ sở phân tử của tính chịu hạn Phản ứng của thực vật trước tác động của hạn rất đa dạng, phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có kiểu gen, độ dài và tính khốc liệt của điều kiện ngoại cảnh. Biểu hiện của quá trình này là việc sinh tổng hợp của một loạt các chất trong tế bào, một số hoocmon hoặc chất kích thích để giúp cây có khả năng thích ứng. Khi đi sâu vào nghiên cứu ở mức độ phân tử của hiện tượng nóng, hạn ở thực vật người ta đã có những bước tiếp cận khác nhau trên nhiều loài cây trồng ở các giai đoạn phát triển. Được nghiên cứu nhiều nhất là các protein sản phẩm biểu hiện gen. Các nhóm protein được đặc biệt quan tâm bao gồm: protein sốc nhiệt, môi giới phân tử, LEA,... [55]. Protein sốc nhiệt (heat shock protein –HSPs): HSPs có ở hầu hết các loài thực vật như lúa mì, lúa mạch, lúa gạo, ngô, đậu nành, hành, tỏi, ... chúng chiếm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 khoảng 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này. HSP được tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan như: nóng, hạn, lạnh, phèn, mặn, ... Sự xuất hiện của HSP có chức năng ngăn chặn hoặc sửa chữa sự phá hủy do stress nóng và mở rộng giá trị ngưỡng chống chịu nhiệt độ cao. Trong các tế bào thực vật HSP tế bào chất tập chung thành các hạt sốc nhiệt (HSG – heat shock granules). Người ta cho rằng các HSP gắn kết trên các ARN polymeraza để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mARN trong quá trình bị stress nóng. Sau sốc nóng các hạt này phân tán và liên kết dày đặc với các riboxom hoạt động sinh tổng hợp protein [55]. HSPs được chia thành 6 nhóm dựa trên cơ sở khối lượng phân tử khác nhau: 110, 90, 70,60, 20, 8.5 kDa. Trong đó nhóm HSP 60 và HSP 70 có nhiều đại diện của chất môi giới phân tử (chaperonin), HSP 8,5 kDa (ubiquitin) có chức năng bảo vệ tế bào nhưng không phải chất môi giới phân tử. Ubiquitin có hoạt tính proteaza với chức năng phân giải các protein không có hoạt tính enzym. Ubiquitin ít chịu ảnh hưởng của nhiệt độ cao nên có vai trò tự sửa chữa khi tế bào gặp điều kiện cực đoan, đặc biệt là nhiệt độ cao [27]. Môi giới phân tử (MGPT): MGPT là một nhóm nhiều loại protein khác nhau, phần lớn các chất MGPT có hoạt tính ATP – aza. Chức năng chính của MGPT ở thực vật là tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein mới tổng hợp từ bước đầu tiên tới bước cuối cùng, ngay từ trong riboxom; chuyển protein quan màng; duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein; ngăn chặn sự hủy hoại protein chưa tạo cấu trúc không gian đúng; khởi đầu cho sự phân hủy protein biến tính [27], [71]. MGPT có 5 họ chính là : HSP70 (DnaK), chaperonin (HSP60), HSP90, HSP100 và sHSP (small HSP). Các phân tử HSP được định vị trong tế bào chất và nội bào quan như là nhân, ty thể, lập thể và mạng lưới nội chất. Có 2 họ môi giới phân tử được nghiên cứu nhiều nhất là chaperonin và HSP70 [71]. Ở thực vật HSP70 được phân lập từ nhiều loại cây khác nhau như lúa [67], ngô [64], đậu xanh [73]. LEA (Late embryogenesis abundant protein – protein tích lũy với lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình hình thành phôi): LEA là protein có Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 vai trò bảo vệ thực vật bậc cao khi môi trường xảy ra stress, đặc biệt là hạn. LEA là một trong nhóm gen liên quan đến sự mất nước của tế bào thực vật. Protein LEA hạn chế sự mất nước do điều kiện ngoại cảnh bất lợi và đóng vai trò điều chỉnh quá trình mất nước sinh lý khi hạt chín. Trong tự nhiên, phôi sau khi hình thành trong giai đoạn chín thường được chuyển sang trạng thái ngủ, lượng nước trong phôi và trong hạt giảm đến mức tối thiểu. Protein LEA được tạo ra hàng lọat trong giai đoạn muộn của quá trình hình thành phôi. Mức độ phiên mã của gen LEA được điều khiển bởi ABA, độ mất nước của tế bào và áp suất thẩm thấu trong tế bào [65]. Protein LEA có những đặc điểm chính sau: Giàu amino acid ưa nước, không chứa cystein và tryptophan, có khả năng chịu nhiệt. Protein LEA thực hiện các chức năng như cô lập ion, bảo vệ protein màng tế bào, phân hủy protein biến tính, điều chỉnh áp suất thẩm thấu. Nhiều gen LEA đã được nghiên cứu và phân lập trên các đối tượng cây trồng khác nhau [58], [64]. 1.2.4. Ứng dụng của công nghệ tế bào thực vật trong đánh giá và chọn dòng chịu hạn Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể được sử dụng để đánh giá khả năng chống chịu của cây trồng ở nhiều mức độ khác nhau như mức gen, mức tế bào riêng rẽ, các loại mô, cơ quan nuôi cấy, phân lập và cây hoàn chỉnh. Cho đến nay kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được ứng dụng rộng rãi để đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng chống chịu như chịu hạn mang lại hiệu quả cao trong chọn lọc các giống cây trồng phù hợp với điều kiện sinh thái của từng vùng miền khác nhau [21], [49]. Mundy và Chua (1998) tiến hành gây mất nước mô sẹo lúa đã nhận thấy ABA (abscisic acid) là chất làm tăng khả năng giữ nước và chống chịu mất nước của mô sẹo ở lúa. Nồng độ ABA thích hợp cho xử lý tiền mô sẹo ở lúa là 10-5 M và thời gian xử lý là 5 – 7 ngày [69]. Tác giả Đinh Thị Phòng (2001) bằng các phương pháp thổi khô mô sẹo của các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70 đã thu được 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn. Tác giả đã chọn tạo được giống DR1, DR2 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳng giống gốc [41]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Nguyễn Thị Thu Hoài (2005) khi nghiên cứu về khả năng chịu hạn của các giống lúa cạn địa phương đã kết luận rằng khả năng chịu mất nước và tốc độ sinh trưởng của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô của các giống nghiên cứu có sự sai khác rõ rệt, giống BC12 là giống chịu hạn tốt nhất so với các giống nghiên cứu [17]. Ngô Thị Liêm (2006) khi đánh giá khả năng chịu hạn của 5 giống lạc (DBG, L14, MD7, L18) ở mức độ mô sẹo trên cơ sở xác định độ mất nước, khả năng chống chịu mất nước khả năng sống sót và khả năng tái sinh cây đã cho thấy khả năng chịu hạn của các giống lạc nghiên cứu là khác nhau, cao nhất là ĐBG, thấp nhất là L18 [24], [25]. Theo tác giả Nguyễn Thị Thu Ngà (2007) khả năng chịu hạn của các giống lạc ở mức độ mô sẹo được xếp theo thứ tự từ cao xuống thấp như sau: L12 > L14 > V79 > L15 > L25 [36]. Nguyễn Thị Thu Giang (2008) khi đánh giá khả năng chịu hạn của 6 giống lạc ở giai đoạn hạt nảy mầm, giai đoạn cây non 3 lá và ở mức độ mô sẹo được sắp xếp theo thứ tự sau: L24> LCB> L23 > LBK> LTB >L08. Tác giả đã tiến hành sàng lọc được 159 dòng mô sẹo có khả năng chịu hạn và 315 dòng cây xanh của 5 giống lạc L23, L08, LTB, LCB, LBK [21]. Hoàng Tú Hằng (2009) khi đánh giá khả năng chịu hạn của một số dòng thế hệ R1, R2 của 5 giống lạc (L08, L23, LCB, LTB, LBK) trong điều kiện hạn sinh lý ở giai đoạn nảy mầm đã cho thấy các dòng R2.04, R2.09, R2.15, R2.18, R2.24 có khả năng chịu hạn tốt hơn so với các dòng chọn lọc khác và giống gốc [18]. Thân Mỹ Ngọc (2009) khi đánh giá khả năng chịu hạn của 6 dòng lạc và giống gốc ở giai đoạn hạt nảy mầm trong môi trường có bổ sung sorbitol 10% thu được kết quả dòng RD1.5 có khả năng chịu hạn cao nhất [37]. 1.3. Kĩ thuật RAPD trong phân tích hệ gen thực vật Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình chiều dài các phân đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và CS(1990), Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng. Thành phần và các bước của phản ứng RAPD dựa trên cơ sở của phản ứng PCR, chỉ khác ở kích thước mồi và nhiệt độ bắt cặp mồi, nhiệt độ bắt cặp mồi của phản ứng RAPD Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 vào khoảng 350C- 450C. Kỹ thuật RAPD có ưu điểm ở chỗ sử dụng các mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotit. Mồi có thể bám vào bất kỳ vị trí nào có trình tự nucleotit bổ sung trên phân tử ADN khuôn [29], [33], [35]. Do vậy, xác suất đoạn mồi có được điểm gắn trên phân tử ADN mẫu là rất lớn. Sự khác nhau về vị trí và số lượng các đoạn ADN có thể ghép cặp bổ sung với mồi chính là cơ sở của sự đa hình về phổ băng ADN được nhân bản. Sản phẩm được phân tích bằng điện di trên gel agarose hoặc polyacrylamide và có thể quan sát được sau khi gel được nhuộm bằng hóa chất đặc trưng. Vì vậy, tính đa hình thường được nhận ra là do sự có mặt hay vắng mặt của một sản phẩm nhân bản từ một locus [63]. Từ khi ra đời kỹ thuật RAPD đã được ứng dụng rộng rãi cho nhiều đối tượng khác nhau như đậu xanh, đậu tương, đu đủ, lạc, lúa, chuối...trong việc đánh giá đa dạng di truyền giữa các loài và trong phạm vi một loài [11], [31], [60] phân tích và đánh giá bộ genome thực vật nhằm xác định những thay đổi của các dòng chọn lọc ở mức độ phân tử [5], [40], [60]. Ngoài ra còn được ứng dụng hiệu quả trong việc tìm ra các chỉ thị phân tử để phân biệt các giống hay các loài khác nhau... Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng,Nông Văn Hải (2004) khi phân tích tính đa dạng di truyền của 8 giống tằm dâu nuôi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 đoạn mồi, kết quả nhận được 67 băng ADN nhân bản trong đó có 26 (38,8%) băng đơn hình và 41 (61,2%) băng đa hình. Đoạn mồi 0P016 cho số băng đa hình phong phú nhất, mồi 101 có tỷ lệ băng đa hình thấp nhất [2]. Lê Xuân Đắc và CS (1999) sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên để phân tích đa hình và chỉ ra sự sai khác ở mức độ phân tử của các dòng lúa tái sinh từ mô sẹo chịu mất nước [11]. Nghiên cứu đa dạng tập đoàn giống lúa có tính khác nhau với bệnh bạc lá bằng kĩ thuật RAPD, tác giả Đinh Thị Phòng đã sử dụng 21 mồi ngẫu nhiên với 36 giống lúa thu được tổng số 392 phân đoạn ADN được nhân lên. Tất cả 21 mồi RAPD đều cho tính đa hình. Sự sai khác về hệ số tương đồng di truyền giữa các giống khoảng 22% - 64 %. Có tổng số 36 giống lúa có tính kháng bệnh bạc lá khác nhau có thể sử sử dụng như là những nguyên liệu để xác định nhóm gen Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 kháng của từng giống lúa làm cơ sở trong nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá có năng xuất chất lượng cao [41]. Với 10 mồi ngẫu nhiên, Nguyễn Thị Tâm (2004) đã cho thấy các dòng lúa chọn lọc tạo ra từ mô sẹo lúa chịu nhiệt giống CR203, CS4, ML107 đã có những thay đổi ở mức độ phân tử [44]. Nguyễn Vũ Thanh Thanh (2003) nghiên cứu đa dạng di truyền của một số giống đậu xanh cho thấy trong 5 mồi ngẫu nhiên chỉ có 3 mồi RA31, RA45, RA46 cho kết quả đa hình, hệ số tương đồng giữa các giống dao động từ 0,41- 0,80 [45]. Bùi Thị Thu Thủy (2006) sử dụng 5 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của các dòng lúa chọn lọc R1 với giống gốc U17 cho thấy cả 5 mồi đều thể hiện tính đa hình, các dòng chọn lọc có mức độ khác biệt di truyền so với giống gốc từ 0,18 - 0,40 [50]. Hà Thị Phúc và CS (2005), khi nghiên cứu sự đa hình di truyền một số loài thực vật thu thập từ Mã Đà và Cát Tiên (tỉnh Đồng Nai) đã phát hiện thấy có những sai khác về hoạt độ một vài enzym bảo vệ oxy hoá cũng như phổ băng ADN giữa các mẫu ốc Bradybaena similaris thu thập được từ khu vực này so với mẫu ốc cùng loài thu thập được từ Vườn Quốc gia Cát Tiên (Tỉnh Đồng Nai) là nơi có điều kiện sinh thái tương tự Mã Đà nhưng ít bị tác động của chiến tranh hoá học [42]. Quách Thị Liên và CS (2004) khi Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophleum fordii Oliv thu được kết quả: Trong tổng số 428 phân đoạn ADN được nhân ngẫu nhiên trong phản ứng PCR-RAPD sử dụng 6 mồi với 9 xuất xứ cây Lim xanh cho 100% phân đoạn đa hình. Điều này cho thấy các mồi RAPD được nghiên cứu cho sự đa hình cao ở các xuất xứ Lim xanh [28]. Nguyễn Hoàng Nghĩa và CS (2007) khi phân tích đa dạng di truyền loài Gõ đỏ (Afzelia xylocarpa (Kurz) Craib.) bằng chỉ thị phân tử RAPD cho kết quả Các sản phẩm PCR ADN genome của các mẫu Gõ đỏ với các mồi RAPD cho thấy tất cả các mồi đều cho đa hình. Trong 6 mồi sử dụng có các mồi OPC9 và OPB10 cho nhiều băng đa hình hơn. Các mẫu Gõ đỏ có mức đa dạng di truyền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 cao. Hệ số tương đồng di truyền dao động từ 47 đến 100%. Trong tổng số 50 mẫu thu được từ 7 vùng của 4 tỉnh thì các mẫu L1, L3 và L4 (từ huyện Lắc, Đắc Lắc), K9 và K4 (từ Kon Hà Nừng, Gia Lai) có mức độ khác biệt di truyền cao hơn so với các mẫu còn lại, Mẫu K4 có mức độ khác biệt đến 53% so với các mẫu khác [38]. Nguyễn Đức Thành và CS (2005) khi nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu(Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp nhận thấy Các loài cây họ Dầu được nghiên cứu có mức độ đa dạng về mặt di truyền cao, hệ số di truyền diao động từ 0,18 đến 0,58 [46] Ở lạc, Moretzohn và cs đã nghiên cứu sự đa dạng di truyền của lạc và mối quan hệ với dạng dại của chúng trên cơ sở phân tích các vùng siêu biến của hệ gen [68]. Đánh giá sự đa dạng của một số dòng lạc trong tập đoàn giống chống chịu bệnh gỉ sắt, sử dụng với 11 mồi ngẫu nhiên, tác giả Bùi Văn Thắng, Đinh Thị Phòng đã thu được 66/109 phân đoạn ADN đa hình [47] Raina và CS (2002) đã sử dụng chỉ thị RADP – SSR phân tử để xác định sự đa dạng hệ gen và mối quan hệ hệ họ hàng giữa các giống lạc trồng và lạc dại [70]. Nguyễn Thị Hoa Lan (2004) khi sử dụng 5 đoạn mồi ngẫu nhiên để phân tích ADN hệ gen của 12 giống lạc, có 4 mồi cho kết quả đa hình với 15 phân đoạn đa hình chiếm 46,9% và các giống lạc được chia thành 2 nhóm chính, có sự sai khác về hệ số tương đồng di truyền từ 7% - 33 % [26]. Khi nghiên cứu sự đa dạng di truyền tác giả Ngô Thị Liêm (2006) đã nhận được 168 phân đoạn ADN. Năm mồi được sử dụng trong nghiên cứu đều biểu hiện đa hình. Mồi RA159 cho tỉ lệ đa hình cao nhất (81,82%), thấp nhất là mồi RA40 (9,09%). Năm giống Lạc nghiên cứu có sự khác nhau về mặt di truyền giữa 2 nhóm là 31% [25]. Nguyễn Thu Giang (2008), sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên để so sánh hệ gen của một số dòng thế hệ R1 có nguồn gốc từ giống LCB cho thấy có 6/10 cho tính đa hình, hệ số sai khác di truyền giữa các dòng chịu mất nước so với giống gốc LCB từ 0,0318 - 0,2055. Điều đó khẳng định các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 dòng có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước có sự thay đổi trong ADN genome [21], [22]. Thân Mỹ Ngọc (2009) sử dụng kỹ thuật RAPD với 10 mồi ngẫu nhiên đã thu được 344 phân đoạn ADN được nhân bản từ hệ gen 7 dòng lạc. Trong 10 mồi có 5 mồi cho tính đa hình, mồi M6 cho tính đa hình cao nhất, mồi M1 tính đa hình thấp nhất. Trong 6 dòng lạc nghiên cứu thì hệ gen dòng RM1.1 có hệ số sai khác so với giống gốc là 12%, hệ gen của dòng RD1.5 có hệ số sai khác so giống gốc là 23% [37]. Tiến hành sử dụng kĩ thuật RAPD để nghiên cứu đa dạng sinh học cây lạc dựa trên phân tích cấu trúc ADN nhằm xác dịnh mức độ sai khác ADN của các dòng lạc nhằm chọn ra dòng lạc có năng suất chất lượng cao. Đây là phương pháp mang tính ứng dụng cao. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 Chƣơng 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu thực vật Trên cơ sở nghiên cứu về chọn dòng chịu hạn của các giống lạc L18, L23, MD7 và MD9 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro [49], chúng tôi tiếp tục theo dõi đánh giá một số dòng chọn dòng ở thế hệ R2, R3, R4. Sử dụng hạt lạc của các dòng chọn lọc ở thế hệ R2 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước, kí hiệu như sau: Bảng 2.1. Các dòng chọn lọc ở thế hệ R2 và giống gốc Giống gốc Năng suất (tấn/ha) Khả năng chống chịu Thời gian sinh trưởng (ngày) Các dòng chọn lọc thế hệ R2 Tổng số (dòng) L23 3,8 – 4,8 Kháng bệnh gỉ sắt, đốm đen, chống đổ tốt 120 - 130 R2.01, R2.02, R2.03, R2.04, R2.05, R2.06, R2.07, R2.08, R2.09, R2.01, R2.11, R2.12, R2.13 13 L18 5,5 – 7 Chống đổ tốt, kháng bệnh lá và kháng héo xanh vi khuẩn lá 120 - 130 R2.14, R2.15, R2.16, R2.17, R2.18, R2.19, R2.20, R2.21 8 MD7 2,8 – 3,2 Kháng bệnh héo xanh vi khuẩn cao 120 R2.22, R2.23, R2.24, R2.25, R2.26 5 MD9 4 - 5 Kháng bệnh lá, bệnh gỉ sắt, đốm đen 125 - 130 R2.27, R2.28, R2.29, R2.30, R2.31 5 Các giống gốc do Viện Khoa học kĩ thuật Việt Nam cung cấp. 2.1.2. Hóa chất và thiết bị Hóa chất: Dùng cho các thí nghiệm phân tích hóa sinh và sinh học phân tử gồm các loại hóa chất mua của các hãng Anh, Đức, Mỹ, Trung Quốc: EDTA (Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid), CTAB, TAE, agarose,… Các hóa chất thông dụng khác: axit citric, NaOH, NaCl, ethanol (70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl cacohol, isopropanol, nước khử ion,… Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Thiết bị: Các thiết bị được sử dụng để phân tích hóa sinh và sinh học phân tử gồm: máy quang phổ UV – Vis Cintra 40 (Austraila), máy điện di + bộ nguồn PowerPar 300 (Bio – Rad, Mỹ), máy phân tích axit amin tự động – HP amino Quan Series II (Hewlett Parkard, Mỹ), máy PCR (Anh), Pipetman các loại (Gilson, Pháp), tủ sấy (Anh), cân điện tử (Thụy Sỹ), Tủ lạnh sâu – 85oC (Sanyo, Nhật), nồi khử trùng (Tomy – Nhật), máy li tâm lạnh (Đức), máy khuấy trộn Voltex (Đức), máy đo PH (Metter Toledo, Thụy Sỹ) và một số các thiết bị phụ trợ khác. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Phƣơng pháp đánh giá đặc điểm nông học các chọn lọc - Bố trí: Các dòng được trồng theo hàng, có chia ô, có đóng cọc, căng dây, gắn nhãn để tiện cho việc theo dõi và lấy số liệu. - Chế độ chăm sóc: Đối với các dòng chọn lọc và giống gốc là hoàn toàn giống nhau. - Thời vụ: Thế hệ R2 được trồng vào vụ xuân hè 2009 (từ 2/ 2009 – 6/ 2009), thế hệ R3 được trồng vào vụ thu đông 2009 (từ 8/ 2009 – 12/ 2009). - Làm đất và lên luống: Làm tơi xốp, sạch cỏ dại, lên luống rộng 1 - 1,5m, cao 25 - 30cm, có rãnh thoát nước tốt trước khi trồng. - Lượng giống: Chọn các hạt mẩy, chắc. Gieo 10hạt/luống. Các hạt cách nhau 10cm/hàng. Hàng nọ cách hàng kia 40cm. Mỗi dòng gieo10 hàng. Trung bình mỗi ô thí nghiệm 4 m2. - Bón phân: Phân hữu cơ bón trước khi trồng 10 ngày. Vôi bón lót 50% trước khi rạch hàng. Sau khi bón phân, lấp một lớp đất dày 2 - 3cm để hạt giống không bị tiếp xúc trực tiếp với phân. Bón thúc phân NPK khi cây có 2 - 3 lá thật. Sau khi cây lạc ra hoa rộ 7 - 10 ngày, bón phân thúc lần nữa để cây phát triển củ. - Gieo hạt: Trước khi gieo, ngâm hạt 2h trong nước. Gieo lúc đất ẩm (mưa nhỏ hoặc tưới) vào chiều tối, gieo hạt cách xa phân bón lót 3 - 4cm, sau đó lấp đất nhỏ dày 1- 2cm phủ kín hạt. Sau trồng 4 - 5 ngày, kiểm tra và trồng dặm những chỗ hạt không nở. - Xới lần 1: Khi cây có 2 - 3 lá thật (sau mọc 10 - 12 ngày), xới phá váng, không vun để tạo độ thoáng dưới gốc, giúp cành cấp 1 phát triển. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 - Xới lần 2: Khi cây có 7 - 8 lá thật (sau mọc 30 - 35 ngày), trước khi ra hoa và nên xới sâu 5-6 cm giữa hàng, giúp đất tơi xốp, thoáng khí, không vun gốc. - Xới lần 3: Xới vun gốc sau khi lạc ra hoa rộ 7 - 10 ngày. - Tưới nước giữ ẩm thường xuyên để lạc phát triển, đặc biệt trong thời kỳ trước ra hoa và làm quả bằng cách tưới phun. - Phòng trừ sâu bệnh: Đề phòng dế, kiến, mối hại quả và bệnh héo xanh do vi khuẩn. Kiểm tra thường xuyên phát hiện sâu bệnh để có biện pháp phòng trừ. - Theo dõi các chỉ tiêu chính sau: + Chiều cao thân chính. + Hình dạng, kích thước của nhánh (bò, đứng). + Số nhánh/ cây + Số lượng quả chắc/ cây. + Khối lượng 100 quả + Khối lượng 100 hạt. + Tỷ lệ khối lượng hạt. + Theo dõi các đặc điểm quả (3 hạt, eo thắt quả, mỏ quả, ...) Thí nghiệm nghiên cứu ngoài đồng ruộng được thực hiện tại Phường Quang Vinh – Thành phố Thái Nguyên từ tháng 2/2009 đến tháng 1/2010. 2.2.2. Phƣơng pháp đánh giá chất lƣợng hạt (1) Xác định hàm lƣợng lipit Nguyên tắc: Dựa vào tính chất tan trong dung môi hữu cơ của lipit để chiết lipit, dung môi hữu cơ được sử dụng là petroleum ether. Hàm lượng lipit được xác định theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [34]. Tiến hành: Hạt lạc sấy khô đến khối lượng không đổi, nghiền nhỏ. Cân 0,20g mẫu cho vào tube, thêm 1,5ml petroleum ether, lắc nhẹ, để qua đêm ở 40C, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, chắt bỏ dịch. Giữ lại mẫu và tiếp tục cho petroleum ether. Lặp lại 3 lần. Sau đó sấy khô lại mẫu đến khối lượng không đổi, cân mẫu. Hàm lượng lipit thu được tính bằng công thức sau: Hàm lượng lipit ( % khối lượng khô ) = (%)100  A BA Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Trong đó: A: Khối lượng mẫu trước khi chiết (g) B: Khối lượng mẫu sau khi chiết (g) (2) Xác định hàm lƣợng đƣờng tan Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, đường khử ferixianua kali thành feroxianua kali. Với sự có mặt của galetin hóa feroxianua kali kết hợp với sắt sunfat tạo thành phức chất màu xanh bền K3Fe(CN)6 → K2Fe(CN)6 Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp vi phân tích được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6]. Tiến hành: Hạt lạc đã sấy khô, bóc bỏ vỏ lụa, cân 0,2g mẫu nghiền trong 2ml nước cất. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút. Dịch chiết thu được chuyển sang ống nghiệm khác. Lấy 1ml dịch chiết, thêm vào đó 1ml K3Fe(CN)6, đun cách thủy trong 15 phút. Dung dịch sau đun để nguội, thêm 2ml hỗn hợp Fe2(SO4)3 và gelatin (đã trộn theo tỷ lệ 20:1). Hỗn hợp dung dịch thu được đo trên máy ở bước sóng 585 nm, dựa trên đồ thị đường chuẩn glucose. Hàm lượng đường khử được tính theo công thức: X (%) = (%)100  M HSPLba Trong đó: X: Hàm lượng đường khử (%) a: Hàm lượng đường khi đo trên máy (mg/ml) b: Số ml dịch chiết HSPL: Hệ số pha loãng m: Khối lượng mẫu ban đầu (3) Xác định hàm lƣợng protein Nguyên tắc: Phương pháp này có sự phối hợp giữa phản ứng biure và phản ứng thuốc thử Folin của dung dịch protein. Thuốc thử Folin tác dụng với các gốc Tyr, Trp, His trong phân tử protein để tạo nên phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm. Hàm lượng protein theo phương pháp Lowry dựa vào mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6]. Tiến hành: Hạt lạc được bóc vỏ, nghiền mịn, sấy đến khô tuyệt đối ở 1050C. Cân 0,05g mẫu cho vào eppendorf, thêm 1,5 ml đệm chiết phostphat Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 citrat PH=10, lắc đều bằng voltex 10 phút, để qua đêm ở nhiệt độ 40C, đem ly tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút, rồi thu lấy dịch để làm thí nghiệm . Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Dịch chiết được định mức lên 5ml bằng dung dịch đệm phosphat citrat (pH=10) và đo phổ hấp thụ trên máy UVvis Cintra ở bước sóng 750nm với thuốc thử foling. Hàm lượng protein được tính theo công thức : X (%) = A HSPL m   100 % Trong đó: X: hàm lượng protein (% khối lượng khô) A: nồng độ thu được khi đo trên máy (mg/ml) HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg) (4) Phân tích thành phần hàm lƣợng amino acid hạt tiềm sinh Hàm lượng amino acid được xác định trên máy HP-Amino Quant sử dụng ortho-phtalandehyt tạo dẫn xuất đối với các axi t amin bậc 1 và 9; fluoreryl- metyl-clorofomat đối với các axit amin bậc 2. Mẫu được xử lý theo phương pháp thủy phân pha lỏng theo hướng dẫn sử dụng máy phân tích axit amin tự động. 2.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn các dòng chọn lọc thế hệ R4 2.2.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm (1) Chuẩn bị mẫu: Hạt của các dòng chọn lọc sau khi bóc vỏ gỗ được ngâm trong nước 2h, sau đó ủ bằng dung dịch MS pha loãng 10 lần chứa sorbitol 10%. Hạt nảy mầm sau các thời gian ủ 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày được lấy để xác định hoạt độ α-amylase, hàm lượng đường tan. Đối chứng là các hạt lạc được ủ bằng dung dịch MS 10% không chứa sorbitol. (2) Xác định hoạt độ - amylase Nguyên tắc : Dựa vào tính chất hòa tan của -amylase trong dung dị ch đệm phosphat 0,2M, PH = 6,8. Hoạt độ -amylase được xác định dựa vào mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch iốt . Giá trị mật độ quang được đo ở bước sóng 560nm trên máy quang phổ UVvis Cintra 40. Hoạt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 độ - amylase được xác định theo phương pháp của Heilken được mô tả trong tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (1979) [8]. Tiến hành: Hạt lạc nẩy mầm bóc vỏ lụa, cân 0,25g khối lượng , nghiền trong đệm phosphat 0,2M pH = 6,8, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 0 C, thu dịch để xác định hoạt độ của enzym e. Thí nghiệm phân tích hoạt độ - amylase được tiến hành với ống thí nghiệm và ống kiểm tra, cơ chất là tinh bột 1% . Bảng 2.2. Thành phần hóa chất trong phân tích hàm lượng - amylase Ống thí nghiệm Ống kiểm tra +) 0,25ml tinh bột 1% +) 0,25ml NaCl 0,1% +) 0,5ml đệm photphat +) 0,25ml dịch chiết enzyme +) 0,25ml tinh bột 1% +) 0,25ml NaCl 0,1% +) 0,5ml đệm photphat +) 0,25ml dịch chiết enzyme +) 1,25ml axit sunfosalysilic 20% Lắc đều, ủ trong 30 phút ở 30oC +) 1,25ml axit sunfosalysilic 20% Lắc đều. Để nhiệt độ phòng 5 phút. Lấy 0,5 ml dung dịch trên + 4,5ml dd iốt loãng 150 lần. Đo trên máy quang phổ ở bước sóng 560nm. Hoạt độ -amylase được tính theo công thức: A (ĐVHĐ/ mg) = 2 1 (C C ) HSPL h   Trong đó: A: hoạt độ -amylase (ĐVHĐ/mg) C2: lượng tinh bột còn lại của mẫu thí nghiệm (mg/ml) C1: lượng tinh bột còn lại của mẫu kiểm tra (mg/ml) h: khối lượng mẫu (mg) HSPL: hệ số pha loãng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 (3) Xác định hàm lƣợng đƣờng tan Hàm lượng đường tan giai đoạn hạt nảy mầm được xác định theo phương pháp vi phân tích được mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và cs (1998) [6] tương tự mục 2.2.2 (2). Xác định mối tương quan giữa hoạt độ amylase và hàm lượng đường tan giai đoạn nảy mầm của các dòng lạc thế hệ R3 bằng toán thống kê sinh học [52]. 2.2.3.2. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non 3 lá bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo Phương pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non được tiến hành theo Lê Trần Bình và cs (1998) [1]. (1) Chuẩn bị mẫu Hạt lạc nảy mầm gieo vào các bát nhựa nhỏ có kích t hước bằng nhau, mỗi hộp 30 hạt. Cát vàng đãi sạch , phơi khô cho vào cá c hộp với lượng như nhau . Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi chỉ tiêu nghiên cứu trong điều kiện chăm sóc như nhau. Thời gian đầu tưới nước cho đủ ẩm , khi cây được 3 lá thật thì tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng lạc. (2) Xác định các chỉ số liên quan đến khả năng chịu hạn trƣớc và sau khi gây hạn - Khối lượng tươi của rễ, thân lá. - Khối lượng khô của rễ, thân lá các mẫu được sấy khô tuyệt đối ở 1050C đến khi khối lượng không đổi. - Chiều dài rễ ở mỗi giai đoạn hạn. - Xác định tỷ lệ sống sót của các dòng ở mỗi giai đoạn hạn. (3) Xác định khả năng phục hồi của các dòng ở mỗi giai đoạn hạn 100(%)  ts ph H H H Trong đó: H: khả năng phục hồi của cây sau khi xử lý hạn (%) Hph : số cây phục hồi (cây) Hts: tổng số cây gây hạn (cây) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 (4) Xác định khả năng giữ nƣớc qua các giai đoạn xƣ̉ lý hạn 100(%)  kxl xl W W W Trong đó: W: khả năng giữ nước của cây sau khi xử lý hạn (%) Wxl : khối lượng tươi của cây sau khi xử lý hạn (g) Wkxl : khối lượng tươi của cây không xử lý hạn (g) (5) Xác định chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các dòng )...(sin 2 1 nnnnnnnn akdccbbaS   Trong đó: S : chỉ số chịu hạn tương đối : là góc tạo bởi hai trục mang trị số liền nhau  = 3600/6 a, b, c, d, … k là các chỉ tiêu theo dõi n : kí hiệu các giống nghiên cứu. (6) Xác định hàm lƣợng proline Xác định hàm lượng proline theo phương pháp của Bates L.S. và cs (1973) [57]. Rễ, thân lá của các giống ở các thời điểm 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày gây hạn , cân khối lượng 0,3 gram mẫu . Thêm 10ml dịch chiết axit sunfosalisilic 3%, ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 20 phút và lọc qua giấy lọc . Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, bổ sung 2ml axit axetic và 2ml dung dịch ninhidrin, sau đó ủ trong nước nóng 1000C trong 1 giờ, ủ trong tủ đá 5 phút. Bổ sung vào bình 4ml toluene, lắc đều và lấy phần dịch có màu hồng ở trên . Đo phổ hấp thụ ở bước sóng 520 nm. Hàm lượng proline được xác định trên máy theo đồ thị chuẩn. Hàm lượng proline được tính theo công thức: 100(%)    m HSPLA X Trong đó: X: hàm lượng proline (%) A: nồng độ thu được khi đo trên máy quang phổ HSPL: hệ số pha loãng m: khối lượng mẫu (mg) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Các thí nghiệm phân tích sinh lý, hóa sinh được tiến hành tại Phòng Công ngệ Tế bào, Phòng Di truyền và Công nghệ gen, Phòng Hóa Sinh – Khoa Sinh – KTNN, Trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên. 2.2.4. Phƣơng pháp đánh giá sự thay đổi ADN genome (1) Tách chiết ADN tổng số Quy trình tách chiết ADN từ lá lạc Quy trình tách chiết và làm sạch ADN tổng số từ lá lạc theo phương pháp của Doyle J.J và J.L. Doyle có cải biến cho phù hợp [61]. Bước 1: Cân 200mg mẫu lá. Nghiền mẫu lá trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ vô trùng, nghiền thành bột mịn và chuyển ngay vào ống eppendorf 2ml. Bước 2: Bổ sung 600µl đệm tách chiết (1,5M NaCl + 100 mM Tris HCl + 20mM EDTA (Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid) + 2% CTAB), đảo nhẹ tạo thành hỗn hợp đồng nhất, ủ 1 giờ ở 65oC (thỉnh thoảng đảo đều). Bước 3: Để nguội 5 phút ở nhiệt độ phòng. Bước 4: Bổ sung 600µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo đều để tạo thành dịch. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, hút dịch nổi cho vào ống eppendorf 1,5ml mới (lặp lại bước này 2 lần). Bước 5: Bổ sung 800µl isopropanol đảo nhẹ để ở tủ -20oC trong 1 giờ. Ly tâm 12.000 v/p trong 15 phút, loại bỏ dịch nổi, thu tủa. Bước 6: Bổ sung 800µl cồn 70%. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 4oC, loại cồn thu tủa. Bước 7: Làm khô ADN ở nhiệt độ phòng. Bước 8: Hoà tan ADN trong 100µl TE. (2) Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng và độ sạch của ADN Điện di trên gel agarose. Kiểm tra chất lượng ADN thu được thông qua điện di trên gel agarose 0,8%. Đo bằng máy quang phổ hấp phụ. Xác định hàm lượng ADN trên máy quang phổ model 825-2A của hãng Hewlett Packarrd. Dung dịch ADN được đo trên máy quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm. Hàm lượng và độ sạch của ADN được tính theo công thức: Hàm lượng ADN (ng/µl) = 50 x HSPL x OD260 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Độ sạch ADN = OD260 /OD280 Trong đó: HSPL: Hệ số pha loãng OD260 : Chỉ số đo được ở bước sóng 260 nm OD280 : Chỉ số đo được ở bước sóng 280 nm Nếu tỉ lệ OD260 /OD280 = 1,8 – 2,0 thì mẫu được coi là sạch (3) Phản ứng PCR – RAPD Phản ứng RAPD được tiến hành với 5 mồi ngẫu nhiên, các mồi có trình tự dài 10 nucleotit, thông tin về trình tự của các mồi được trình bày ở bảng 2.3 Bảng 2.3. Trình tự của 5 mồi ngẫu nhiên trong phản ứng RAPD STT Mồi Trình tự mồi 1 M1 5’GGAAGTCGCC3’ 2 M2 5’GGGAAGGACA3’ 3 M3 5’GGAAGCTTGG3’ 4 M4 5’TCGGCGATAG3’ 5 M5 5’CCAGACCCTG3’ Mỗi phản ứng gồm có 25µl dung dịch chứa 10mM buffer PCR 1X đệm PCR: 2,5mM MgCl2; 100µl 4dNTPs; 200 nM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polimerase và 5 – 10ng ADN khuôn. Tiến hành nhân bản trong máy PCR – Themarmal Cycler PTC 100 theo chu trình: Bước 1: 94 0C trong 1 phút; Bước 2: 92 0C trong 1 phút; Bước 3: 36 0 C trong 1 phút; Bước 4: 72 0C trong 1 phút; Bước 5: 72 0C trong 10 phút; Bước 6: Giữ ở 40C; Từ bước 2 đến bước 4 lặp lại 45 chu kì. (4) Điện di và phân tích sản phẩm RAPD Điện di sản phẩm RAPD được thực hiện trên gel agarose 0,8% trong đệm TAE 1X. Nhuộm gel bằng ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút, rửa sạch bằng nước, soi gel trên đèn UV và chụp ảnh (5) Phân tích số liệu RAPD Thống kê các băng ADN xuất hiện và không xuất hiện trên kết quả điện di theo quy ước: 1: xuất hiện băng; 0: không xuất hiện băng ADN. Hàm lượng thông tin tính đa hình (Polymorphism information contect = PIC) của mỗi mồi xác định theo công thức: Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 PICi = 1 – ∑Pij 2 Trong đó Pij là tần số của alen thứ j của kiểu gen i được kiểm tra. Phạm vi giá trị PIC dao động từ 0 (không đa hình) đến 1 (đa hình hoàn toàn). Phân tích RAPD được thực hiện bằng phần mềm NTSYS pc version 2.1. Các thí nghiệm sinh học phân tử được tiến hành tại phòng Di truyền – Khoa Sinh – KTNN - Trường ĐHSP Thái Nguyên, phòng Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện Khoa học sự sống – Đại học Thái Nguyên. 2.2.5. Xử lý số liệu và tính toán kết quả Mỗi mẫu nghiên cứu được lặp lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê, như trung bình mẫu ( X ), phương sai ( 2 ), độ lệch chuẩn (  ) và sai số trung bình mẫu ( X S ), hệ số tương quan R , Cv %: hệ số biến dị, ... Các số liệu được xử lý bằng toán thống kê sinh học [30], [52]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Chƣơng 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm nông học của một số dòng lạc chọn lọc 3.1.1. Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R2 Đối với lạc, sinh trưởng là một đặc điểm chịu ảnh hưởng rất lớn của mùa vụ và môi trường [20]. Kết quả đánh giá khả năng sinh trưởng của các dòng lạc thế hệ R2 thông qua các chỉ tiêu về chiều cao cây, số nhánh/cây và số quả/cây được trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1 cho thấy, mức độ biến động của các dòng lạc chọn lọc về tính trạng chiều cao cây còn khá lớn trong đó thấp nhất là dòng R2.3 (3,45%) cao nhất là dòng R2.21 (34,48%). Trong số 31 dòng nghiên cứu thì có 10/31 dòng (chiếm 32,25%) có hệ số biến động nhỏ hơn so với giống gốc. Chiều cao cây là tính trạng phụ thuộc đặc điểm di truyền của giống và điều kiện ngoại cảnh của môi trường. Ở một mức độ nào đó, chiều cao cây phản ánh khả năng sinh trưởng và năng suất cây lạc [20]. Giống L23 có chiều cao thân chính dao động 27,77cm đến 41,00 cm; từ 34,25 đến 61,57cm (các dòng có nguồn gốc từ giống L18); từ 18,84 đến 65,87cm (các dòng có nguồn gốc từ giống MD7); từ 27,75 đến 38,44cm (các dòng có nguồn gốc từ giống MD9). Có 5/13 dòng chọn lọc có nguồn gốc từ giống L23 có chiều cao thân chính của cây cao hơn giống gốc (cao hơn 33,87cm); có 1 dòng của giống gốc MD9 cao hơn giống gốc. Như vậy, chiều cao thân chính của các dòng chọn lọc của giống L23 và MD9 có xu hướng thấp hơn giống gốc, mức độ ổn định của nhiều dòng lại cao hơn so với giống gốc. Tất cả các dòng chọn lọc từ mô sẹo chịu mất nước của giống L18 đều cao hơn so với giống gốc, nhiều dòng có chiều cao hơn nhiều như R2.16 cao hơn 1,8 lần và R2.18 cao hơn 1,87 lần. Giống MD7 có 1 dòng cao hơn giống gốc 2,11 lần là R2.26, còn lại các dòng đều thấp hơn so với giống gốc. Sự sai khác về chiều cao cây của các dòng chọn lọc so với giống gốc được kiểm tra bằng hàm t-Test Two sample For Mean trong chương trình Exel (α = 0,05) (Bảng 3.3). Kết quả cho thấy, sự sai khác về chiều cao cây của 87,5% số dòng của giống L18, 69,23% số dòng của giống L23, 60% số dòng của giống Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 MD9 và 80,00% số dòng của giống MD7 là có ý nghĩa (Ttn > Tα) còn sự tăng về chiều cao cây của các dòng còn lại so với giống gốc là không có ý nghĩa (Ttn < Tα). Bảng 3.1. Một số đặc điểm nông học của các dòng R2 và giống gốc Giống gốc và dòng Chiều cao thân chính (cm) Số nhánh/cây Số quả/cây X ± X S Cv % X ± X S Cv % X ± X S Cv % L23 33,87 ± 0,75 8,56 6,44 ± 0,27 16,99 26,00 ± 1,29 19,23 R2.1 30,25 ± 3,33 21,99 6,75 ± 0,85 25,30 19,75 ± 3,09 31,31 R2.2 29,30 ± 1,99 21,47 6,10 ± 0,60 31,34 25,50 ± 3,89 48,22 R2.3 41,00 ± 1,00 3,45 8,00 ± 0,01 10,00 41,00 ± 3,00 10,35 R2.4 35,44 ± 1,44 13,59 7,28 ± 0,48 27,80 29,95 ± 2,77 40,25 R2.5 36,00 ± 1,00 23,57 6,50 ± 1,50 32,64 13,50 ± 0,50 5,24 R2.6 34,75 ± 1,03 5,93 6,50 ± 0,50 15,38 32,75 ± 5,85 35,73 R2.7 32,71 ± 3,01 24,31 5,71 ± 0,68 31,49 15,43 ± 2,55 43,78 R2.8 32,70 ± 1,58 15,26 7,50 ± 0,37 15,71 20,80 ± 2,19 33,29 R2.9 38,35 ± 1,29 13,92 7,35 ± 0,36 20,37 23,47 ± 1,92 33,69 R2.10 33,40 ± 1,69 11,32 8,20 ± 0,80 21,28 29,00 ± 1,87 14,43 R2.11 27,77 ± 1,08 14,04 5,85 ± 0,42 25,98 25,54 ± 2,87 40,55 R2.12 30,17 ± 1,23 17,36 6,83 ± 0,25 15,27 36,11 ± 1,84 21,62 R2.13 29,09 ± 1,19 19,61 7,00 ± 0,32 21,96 23,91 ± 1,74 34,80 L18 34,25 ± 1,90 22,23 6,20 ± 0,44 27,40 19,07 ± 1,48 30,09 R2.14 50,25 ± 3,17 22,80 5,00 ± 0,40 29,43 22,00 ± 2,24 36,64 R2.15 50,33 ± 1,70 13,06 5,79 ± 0,27 19,55 27,80 ± 2,11 29,41 R2.16 61,57 ± 0,92 5,61 4,78 ± 0,21 16,75 22,00 ± 2,51 42,75 R2.17 44,00 ± 1,66 13,57 4,15 ± 0,19 16,58 12,31 ± 1,21 35,63 R2.18 64,60 ± 3,12 15,73 4,40 ± 0,54 38,92 13,40 ± 1,47 34,86 R2.19 46,43 ± 2,80 24,18 4,25 ± 0,28 26,48 12,13 ± 1,88 62,08 R2.20 54,88 ± 1,36 7,42 4,78 ± 0,22 13,95 19,67 ± 2,97 45,41 R2.21 38,30 ± 4,18 34,48 3,30 ± 0,26 24,94 10,90 ± 2,88 83,68 MD7 31,35 ± 0,60 7,14 4,57 ± 0,37 30,59 19,21 ± 1,61 31,37 R2.22 18,84 ± 1,02 15,82 6,11 ± 1,41 23,06 19,33 ± 1,95 42,91 R2.23 23,55 ± 1,61 22,66 4,01 ± 1,76 35,81 9,55 ± 1,96 68,44 R2.24 16,91 ± 0,96 18,79 5,18 ± 1,89 36,43 6,22 ± 1,16 57,22 R2.25 31,06 ± 0,62 8,52 5,33 ± 2,06 38,59 2,39 ± 2,30 45,64 R2.26 65,87 ± 3,52 15.95 4,54 ± 1,06 23,39 21,58 ± 1,83 41,59 MD9 36,94 ± 1,75 14,95 5,56 ± 0,32 22,71 22,24 ± 2,12 39,29 R2.27 27,75 ± 1,89 13,85 7,75 ± 1,25 32,26 30,00 ± 7,04 46,90 R2.28 28,205 ± 1,38 16,88 5,45 ± 0,31 18,99 37,08 ± 2,43 22,66 R2.29 36,63 ± 1,11 12,08 5,88 ± 0,44 29,73 21,44 ± 2,25 42,07 R2.30 30,85 ± 2,26 32,79 6,05 ± 0,44 32,83 22,55 ± 1,46 28,86 R2.31 38,44 ± 2,01 22,15 5,50 ± 0,43 33,15 22,11 ± 2,26 47,25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Số lượng nhánh/cây được dùng như một chỉ tiêu để chọn giống gián tiếp với năng suất trong các thế hệ đầu, giữa chúng có mối tương quan thuận [20]. Từ bảng 3.1 chúng tôi thấy, số nhánh/cây dao động từ 5,71 đến 8,20 ở giống L23, từ 5,45 đến 7,75 ở giống MD9; từ 3,30 đến 5,79 ở giống L18 và từ 4,01 đến 6,11 ở giống MD7. Giống L23 có 10/13 dòng có số nhánh nhiều hơn giống gốc (nhiều hơn 6,44); giống MD7 có 3/5 dòng có số nhánh cao hơn giống gốc (4,57 nhánh), giống MD9 có 3/5 dòng nhiều hơn 5,56 nhánh/cây (giống gốc), các dòng của giống L18 đều có số nhánh ít hơn giống gốc. Như vậy, đa số các dòng của giống L18 có chiều cao cây lớn hơn so với giống gốc nhưng số nhánh/cây lại ít hơn so với giống gốc. Sự sai khác về số nhánh/cây của các dòng chọn lọc so với giống gốc được kiểm tra bằng hàm t-Test Two sample For Mean (Bảng 3.3) cho thấy 70,96% sự sai khác này là có ý nghĩa (Ttn > Tα). Trong 31 dòng nghiên cứu thì có 13/31 dòng (chiếm 41,93%) có hệ số biến động nhỏ hơn so với giống gốc. Điều đó chứng tỏ sự ổn định nhanh của các dòng. Số quả/cây thay đổi theo tùy theo từng dòng và nguồn gốc mỗi dòng. Số quả trên cây dao động 13,50 đến 41,00 quả/cây ở giống L23; từ 21,44 đến 37,08 quả/cây ở giống MD9; từ 10,90 đến 27,80 quả/ cây ở giống L18; từ 2,39 đến 21,58 quả/ cây ở giống MD7. Giống L23 có 5/13 dòng có lượng qủa nhiều hơn giống gốc (nhiều hơn 26,00 quả); giống MD9 có 3/5 dòng nhiều hơn 22,24 quả/cây (giống gốc), giống L18 có 2/8 dòng có số quả nhiều hơn so với giống gốc (19,07 quả/cây),các dòng giống MD7 không đồng đều có 2/5 dòng có số quả nhiều hơn so với giống gốc (19,21 quả/cây). Dòng R2.3 của giống L23 có số quả/cây lớn nhất (44,11 quả), cao hơn 1,7 lần so với giống gốc. Kiểm tra bằng hàm t-Test Two sample For Mean (Bảng 3.3) cho thấy sự sai khác của 83,33% số dòng có số quả/ cây tăng là có ý nghĩa (Ttn > Tα). Số quả/cây có hệ số biến động dao động lớn thấp nhất là dòng R2.5 (5,24%) cao nhất là dòng R2.23 (83,68%), có 7/31 dòng (chiếm 22,58%) có hệ số biến động nhỏ hơn so với giống gốc. Kết quả phân tích các đặc điểm nông học cho thấy trong cùng điều kiện về không gian và thời gian như nhau, các dòng lạc chọn lọc và giống gốc cùng thực hiện một chế độ chăm sóc, … nhận thấy thế hệ R2 biểu hiện sự đa dạng về Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 kiểu gen và có sự sai khác so với giống gốc, một số chỉ tiêu nông học có sự biến động di truyền lớn cao hơn so với giống gốc, vì vậy cần được theo dõi ở các thế hệ tiếp theo. Về năng suất quả: Quả lạc có dạng quả đậu, có kích thước và khối lượng khác nhau, phụ thuộc vào giống, đất trồng và thời vụ; quả chín thường có từ 1 đến 3 hạt. Năng suất quả là yêu cầu cần thiết với sản xuất, đây là yếu tố bị ảnh hưởng bởi số quả chắc và khối lượng lượng hạt (Vũ Công Hậu và cs, 1995) [20]. Kết quả nghiên cứu trình bày ở bảng 3.2 Bảng 3.2 . Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất ở các dòng thế hệ R2 Giống gốc và dòng Số quả chắc/cây Khối lượng 100 quả (gram) Khối lượng 100 hạt (gram) Tỷ lệ nhân (%) X ± X S Cv % X ± X S Cv % X ± X S Cv % X ± X S Cv % L23 24,00 ± 1,23 19,86 131,80 ± 1,31 1,72 43,95 ± 0,37 1,46 58,38 ± 4,41 13,09 R2.1 17,00 ± 2,42 28,41 129,80 ± 0,23 0,31 53,71± 2,03 6,55 68,16 ± 4,77 12,11 R2.2 32,20 ± 3,71 58,15 141,41 ± 0,39 0,48 53,00 ± 2,51 8,12 65,34 ± 4,67 12,37 R2.3 33,50 ± 3,50 12,86 131,15 ± 1,20 1,59 51,25± 2,05 6,95 65,98 ± 4,69 12,31 R2.4 25,56 ± 2,76 45,78 124,30 ± 7,90 1,01 62,26 ± 0,52 1,43 80,72 ± 5,19 11,13 R2.5 17,00 ± 3,00 24,96 128,62 ± 0,15 0,21 53,06 ± 0,89 2,86 71,99 ± 4,90 11,79 R2.6 29,50 ± 5,45 36,98 122,64 ± 1,73 2,44 52,78 ± 1,76 5,79 73,65 ± 4,95 11,65 R2.7 12,14 ± 2,46 53,67 128,00 ± 1,25 1,70 59,27 ± 0,58 1,69 73,41 ± 4,95 11,67 R2.8 17,10 ± 2,15 39,80 121,72 ± 0,84 1,19 40,09 ± 0,90 3,62 54,52 ± 4,26 13,54 R2.9 19,06 ± 1,40 30,34 138,12 ± 1,10 1,38 57,47 ± 1,72 5,18 70,21 ± 4,84 11,93 R2.10 21,20 ± 1,96 20,67 134,61 ± 1,74 2,23 52,96 ± 0,44 1,42 70,31 ± 4,84 11,93 R2.11 20,85 ± 2,28 39,36 128,77 ± 3,77 5,06 56,29 ± 0,84 2,60 77,04 ± 5,07 11,39 R2.12 30,33 ± 2,11 29,44 122,31 ± 5,02 7,11 58,72 ± 0,56 1,65 78,90 ± 5,13 11,26 R2.13 21,48 ± 1,74 28,93 139,34 ± 1,44 1,79 53,30 ± 0,64 2,08 66,83 ± 4,72 12,23 L18 16,07 ± 1,40 33,80 132,86 ± 8,00 2,43 56,62 ± 0,51 1,55 73,13 ± 4,90 11,69 R2.14 19,15 ± 2,11 39,69 144,47 ± 4,49 0,15 61,76 ± 0,62 1,74 74,94 ±5,00 11,55 R2.15 24,33 ± 2,00 31,89 145,27 ± 3,09 2,25 68,17 ± 1,32 3,37 77,41 ± 5,10 11,37 R2.16 13,57 ± 1,95 53,73 147,24 ± 0,12 0,99 62,53 ± 0,69 1,88 71,57 ± 4,90 11,82 R2.17 7,92 ± 1,28 58,17 130,43 ± 1,69 5,31 46,49 ± 0,78 2,89 62,69 ± 4,60 12,63 R2.18 9,10 ± 1,20 41,58 137,83 ± 0,79 1,95 69,36 ± 0,64 1,59 80,77 ± 5,20 11,13 R2.19 5,75 ± 1,42 48,89 140,70 ± 4,05 3,25 61,07 ± 1,67 4,76 76,64 ± 5,11 11,42 R2.20 10,56 ± 1,63 46,20 147,34 ± 1,35 5,38 63,95 ± 0,78 2,13 73,24 ± 4,90 11,68 R2.21 5,60 ± 2,56 14,46 123,33 ± 2,31 3,69 57,56 ± 0,88 2,66 78,43 ± 5,10 11,29 MD7 16,43 ± 1,41 32,01 127,86 ± 0,34 4,39 60,18 ± 0,52 1,49 77,27 ± 5,10 11,38 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 R2.22 15,28 ± 1,85 51,33 122,89 ± 3,24 0,47 63,57 ± 0,65 1,77 82,71 ± 5,30 11,00 R2.23 6,73 ± 1,47 72,24 117,18 ± 6,87 10,15 69,22 ± 0,61 1,53 79,49 ± 5,80 10,03 R2.24 4,00 ± 1,17 96,82 119,19 ± 3,44 5,00 52,86 ± 0,46 1,51 71,71 ± 4,92 11,81 R2.25 15,78 ± 2,12 56,87 136,57 ± 1,70 2,16 61,30 ± 0,51 1,46 75,80 ± 5,00 11,49 R2.26 17,25 ± 1,77 50,31 140,07 ± 3,49 4,32 61,90 ± 1,67 4,68 70,42 ± 4,48 11,92 MD9 21,35 ± 2,16 41,69 121,14± 2,78 3,98 55,88 ± 0,55 1,72 75,65 ± 5,02 11,50 R2.27 23,50 ± 5,68 48,33 112,85 ± 2,17 3,33 46,07 ± 1,12 4,22 72,16 ± 4,90 11,77 R2.28 32,50 ± 2,32 24,77 116,09 ± 2,17 3,23 45,78 ± 0,53 2,00 65,09 ± 4,66 12,40 R2.29 18,13 ± 2,15 47,50 118,93 ± 0,53 0,77 50,92 ± 1,15 3,90 68,39 ± 4,77 12,09 R2.30 20,05 ± 1,32 29,55 117,59 ± 0,38 0,56 55,76 ± 1,14 3,55 74,87 ± 5,00 11,56 R2.31 19,67 ± 2,41 52,06 138,05 ± 2,89 3,63 56,12 ± 1,67 5,17 69,83 ± 4,82 11,97 Theo dõi các chỉ tiêu cấu thành năng suất của các dòng chọn lọc thế hệ R2 cho thấy, tỷ lệ quả chắc/cây dao động 12,14 đến 33,50 ở giống L23; từ 18,13 đến 32,50 ở giống MD9; từ 5,60 đến 24,33 ở giống L18 và từ 4,00 đến 17,25 ở giống MD7. Trong đó, giống L23 có 4/13 dòng có số quả chắc/cây nhiều hơn giống gốc (nhiều hơn 24,00); giống MD9 có 2/5 dòng có số quả chắc/cây nhiều hơn 21,35 quả (giống gốc); giống L18 có 2/5 dòng có số quả chắc/cây nhiều hơn giống gốc (16,07 quả/ cây) nhưng có tỷ lệ quả lép tương đối cao so với giống gốc và các dòng khác, giống MD7 có 1/5 dòng có số quả chắc nhiều hơn giống gốc (16,43 quả/ cây). Tương tự như sự sai khác về số quả/cây, 83,33% sự sai khác về số quả chắc/cây của các dòng chọn lọc so với giống gốc là có ý nghĩa (Ttn > Tα) (Bảng 3.3). Trong 31 dòng nghiên cứu thì chỉ có 5 dòng (chiếm 16,13%) có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. Khối lượng 100 quả dao động từ 121,72 gram đến 139,34 gram ở giống L23; từ 112,85 gram đến 138,05 gram ở giống MD9; từ 123,33 gram đến 147,24 gram ở giống L18; từ 117,18 gram đến 140,07 gram ở giống MD7 . Có 30,76% số dòng có nguồn gốc từ giống L23 có khối lượng 100 quả cao hơn (giống gốc); giống MD9 chỉ có 1/5 dòng có khối lượng 100 quả cao hơn 121,14 gram (giống gốc); giống L18 có 5/8 dòng có khối lượng 100 quả cao hơn giống gốc (132,86 gram); giống MD7 có 2/5 dòng là R2.5 và R2.4có khối lượng 100 quả cao hơn giống gốc (131,80 gram). Tất cả các dòng và giống lạc nghiên cứu đều có khối lượng quả trong khoảng từ 106 đến 155 gram và như vậy chúng thuộc nhóm quả Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 to (theo Vũ Công Hậu và cs, 1995) [20]. Khối lượng 100 quả có hệ số biến động không lớn dao động trong khoảng 0,21 – 10,15% trong đó có 22/31 dòng có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. Giống L23 có 11/13 dòng có khối lượng 100 hạt cao hơn giống gốc (cao hơn 43,95 gram), khối lượng 100 hạt dao động 40,09 gram đến 62,26 gram. Giống L18 có 6/8 dòng có khối lượng 100 hạt cao hơn đối chứng (cao hơn 56,62 gram) và dao động trong khoảng từ 46,49 gram đến 69,36 gram. Giống MD7 có 4/6 dòng có khối lượng 100 hạt cao hơn đối chứng (cao hơn 60,18 gram). Giống MD9 chỉ có dòng R2.30 có khối lượng 100 hạt cao hơn đối chứng (cao hơn 55,58 gram);). Như vậy, nhận thấy đa số các dòng thuộc giống L18, MD7, L23 có hạt tương đối mẩy, to chắc so với giống gốc, các dòng thuộc giống MD9 hạt nhỏ hơn so với giống gốc. Khối lượng 100 hạt có hệ số biến động thấp (≤ 8,12%) trong đó có 5/31 dòng có hệ số biến động nhỏ hơn so với giống gốc. Tỷ lệ nhân là tỷ lệ giữa khối lượng hạt và khối lượng quả. Chỉ tiêu này phụ thuộc vào chiều dày vỏ quả, khả năng tích lũy vật chất khô trong hạt và chịu ảnh hưởng của giống. Giống có tỷ lệ nhân lớn sẽ cho hiệu quả năng suất tương ứng. Thế hệ R2 của các dòng lạc có tỷ lệ nhân dao động 54,52% đến 80,72% ở giống L23 và chỉ có dòng R2.5 có tỷ lệ nhân thấp hơn giống gốc còn lại 92,30% các dòng có tỷ lệ nhân cao hơn. Giống MD9 không có dòng nào có tỷ lệ nhân cao hơn tỷ lệ nhân của giống gốc. Tỷ lệ nhân dao động từ 62,69% đến 78,43% ở giống L18; từ 70,42% đến 82,71% ở giống MD7. Giống L18 có 5/8 dòng có tỷ lệ nhân cao hơn giống gốc (73,13%), giống MD7 có 2/5 dòng có tỷ lệ nhân cao hơn giống gốc (77,27%). Hệ số biến động dao động trong khoảng 10,03 – 13,09%, trong 31 dòng nghiên cứu thì có 23 dòng có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. Chiều cao thân chính của các dòng thuộc giống L18 cao hơn so với các dòng khác và giống gốc nhưng chỉ tiêu về số quả/cây thấp hơn. Các dòng có năng suất quả cao là R2.2, R2.4, R2.7, R2.11 của giống L23 (trên 40 quả/ cây). Thế hệ R2 có mức độ biến động di truyền còn lớn về các đặc điểm nông học (chiều cao cây, số nhánh/ cây,… ). Khối lượng 100 quả, 100 hạt cao nhất ở các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 dòng như R2.2 (giống L23), R2.14, R2.15, R2.16, R2.20 (giống L118), R2.26 (giống MD7),… Bảng 3.3. Giá trị Tα, Ttn của các đặc điểm nông học thế hệ R2 (α  0,05) Dòng Ttn Tα Chiều cao thân chính Số nhánh/cây Số quả/cây Số quả chắc/cây R2.1 2,26 1,94 3,67 2,63 1,83 R2.2 2,15 1,67 1,34 3,87 R2.3 2,34 2,45 3,75 3,63 R2.4 1,67 1,98 2,65 1,31 R2.5 1,56 1,13 1,87 3,41 R2.6 1,98 1,45 2,56 2,54 R2.7 1,23 2,08 2,67 2,84 R2.8 1,45 2,67 1,95 2,94 R2.9 2,23 2,45 1,45 2,05 R2.10 2,87 3,07 1,67 2,32 R2.11 3,12 2,87 1,12 1,67 R2.12 2,14 2,07 3,08 3,86 R2.13 1,96 1,67 1,98 2,05 R2.14 3,37 2,64 2,05 2,37 R2.15 5,53 1,78 2,56 2,42 R2.16 11,36 3,08 2,45 3,75 R2.17 4,42 3,67 3,03 6,65 R2.18 8,47 4,78 2,67 5,43 R2.19 3,77 3,56 1,23 7,45 R2.20 8,02 3,30 2,54 4,53 R2.21 1,66 5,89 2,81 7,59 R2.22 2,94 4,08 0,56 1,56 R2.23 2,55 1,67 4,67 4,41 R2.24 4,45 2,97 5,67 5,48 R2.25 1,34 2,45 10,68 1,67 R2.26 7,56 1,32 1,56 1,97 R2.27 2,34 2,78 2,07 1,54 R2.28 2,03 1,45 2,87 3,45 R2.29 1,24 2,73 1,52 1,69 R2.30 1,76 3,08 1,78 1,64 R2.31 2,67 1,37 1,96 2,06 Chúng tôi tiếp tục lựa chọn tiếp 4/13 dòng của giống L23, 3/8 dòng của giống L18 và 3/5 dòng của giống MD7, 1/5 dòng của giống MD9 là những dòng có các đặc điểm nông học nổi bật so với đối chứng và các dòng khác, đồng thời Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 là dòng có sự ổn định về các tính trạng nghiên cứu để trồng tiếp thế hệ R3. Cụ thể như sau: Giống L23: R2.4, R2.9, R2.11, R2.13; Giống L18: R2.14, R2.15, R2.16; Giống MD7: R2.23, R2.24, R2.26. Giống MD9: R2.30. A B C D E F Hình 3.1. Một số hình ảnh dòng R2.9 và giống gốc A,C,E: Giai đoạn cây con 30 ngày, củ và hạt của dòng R2.9 B,D,F: Giai đoạn cây con 30 ngày, củ và hạt của giống L23 gốc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 3.1.2. Đặc điểm nông học của một số dòng chọn lọc thế hệ R3 Theo dõi các đặc điểm nông học của 11 dòng chọn lọc thế hệ R3 có nguồn gốc từ mô sẹo chịu mất nước của 4 giống lạc L23, l18, MD7 và MD9, kết quả thu được bảng 3.4. Bảng 3.4 cho thấy, mức độ biến động về các tính trạng nông học nhỏ hơn so với thế hệ R2, mỗi dòng ở thế hệ R3 tương đối đồng nhất về các chỉ số nghiên cứu (Cv% dao động nhỏ và thấp hơn thế hệ R2). Bảng 3.4. Đặc điểm nông học của các dòng lạc thế hệ R3 và giống gốc Giống gốc và dòng Chiều cao thân chính (cm) Số nhánh/cây Số quả/cây X ± X S Cv % X ± X S Cv % X ± X S Cv % L23 34,31 ± 0,78 2,27 9,18 ± 0,51 5,65 28,73 ± 2,99 10,40 R3.4 32,67 ± 1.14 3,50 6,25 ± 0,44 7,13 23,09 ± 2,87 12,42 R3.9 38,33 ± 0,96 2,51 4,83 ± 0,36 7,56 13,73 ± 2,60 13,91 R3.11 38,55 ± 1,30 3,36 5,33 ± 0,22 4,21 14,82 ± 1,13 7,66 R3.13 39,27 ± 1,60 4,08 6,18 ± 0,42 6,83 24,91 ± 1,99 7,49 L18 32,50 ± 2,01 6,19 6,70 ± 0,51 8,39 20,91 ± 2,39 11,44 R3.14 32,75 ± 2,01 4,65 4,15 ± 0,65 6,99 15,64 ± 1,96 12,53 R3.15 41,64 ± 0,81 1,95 4,25 ± 0,73 10,59 16,36 ± 1,25 6,11 R3.16 48,60 ± 2,84 5,85 3,35 ± 0,34 6,21 10,80 ± 1,09 6,51 MD7 46,09 ± 2,11 4,58 9,18 ± 0,51 5,65 26,09 ± 1,17 6,47 R3.23 36,64 ± 1,48 4,05 4,67 ± 0,54 11,59 15,64 ± 1,81 6,80 R3.24 37,55 ± 1,63 4,33 8,60 ± 0,26 3,10 21,45 ± 1,06 4,96 R3.26 46,55 ± 2,92 6,28 8,30 ± 0,63 7,63 18,36 ± 1,47 7,99 MD9 19,27 ± 1,08 5,60 7,67 ± 0,25 3,34 18,64 ± 2,11 11,31 R3.30 47,36 ± 2,06 4,34 6,45 ± 0,62 9,65 17,64 ± 1,85 10,49 Chiều cao cây: Thế hệ R3 của các dòng lạc tái sinh từ mô sẹo mất nước có nguồn gốc từ giống L23 có chiều cao thân chính dao động từ 32,67cm đến 39,27cm, có 3/4 dòng có chiều cao thân chính cao hơn giống gốc (cao hơn 34,31cm). Giống L18 có chiều cao cây dao động từ 32,50 đến 48,60cm trong đó tất cả các dòng đều cao hơn giống gốc đặc biệt có dòng R3.16 cao hơn giống gốc 1,50 lần. Dòng R3.30 của giống MD9 có chiều cao cây hơn giống gốc 2,50 lần. Giống MD7 có chiều cao cây dao động từ 37,55cm đến 46,55cm; có 1/4 dòng có chiều cao thân chính của cây cao hơn giống gốc (cao hơn 46,09cm). Hệ số biến động của cao thân chính dao động từ 1,95% đến 6,28% trong đó có 6/11 dòng có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. Sự sai khác về chiều cao cây của các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 dòng chọn lọc so với giống gốc được kiểm tra bằng hàm t-Test Two sample For Mean, kết quả cho thấy, sự sai khác về chiều cao cây của dòng R3.9, R3.11, R3.13, R3.15, R3.16, R3.23, R3.23, R3.30 là có ý nghĩa (Ttn > Tα) (Bảng 3.6). Giống L23 có số nhánh/cây dao động từ 4,83 đến 9,18; từ 3,35 đến 6,70 ở giống L18; từ 4,67 đến 9,18 ở giống MD7. Tất cả các dòng của giống L23, MD7, L18, MD9 đều có số nhánh ít hơn giống gốc. Như vậy, đã nhận thấy sự giảm về số nhánh của các dòng tuy nhiên chỉ có 81,81% số dòng có sự sai khác là có ý nghĩa (Ttn > Tα) (Bảng 3.6). Trong các dòng nghiên cứu, có 5/11 dòng có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. Số quả trên cây dao động 14,82 đến 28,73 quả/cây ở giống L23; từ 15,64 đến 20,91 quả/ cây ở giống L18; từ 18,09 đến 26,69 quả/ cây ở giống MD7. Dòng R3.9 và R3.13 là có số quả thấp nhất (<50% so với giống gốc). Ở tất cả các dòng, số quả/cây đều thấp hơn so với giống gốc. Số nhánh suy giảm so với giống gốc kéo theo năng suất quả của các dòng bị giảm so với giống gốc [7]. Hệ số biến động của số quả/cây dao động từ 6,11% - 12,53%, trong đó có 6/11 dòng có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. trong 11 dòng nghiên cứu thì sự sai khác của 10/11 dòng là có ý nghĩa (Ttn > Tα) (Bảng 3.6). Như vậy, giống với thế hệ R2, các dòng chọn thuộc giống L18 vẫn có chiều cao thân chính cao hơn so với các dòng thuộc giống khác. Thực tế, khi quan sát ngoài đồng ruộng nhận thấy, các dòng thuộc giống này có vỏ quả trơn, hạt to mẩy, nhưng số quả lại ít. Về năng suất quả: Kết quả nghiên cứu số quả chắc/cây, khối lượng 100 quả, 100 hạt, tyw lệ nhân của các dòng chọn lọc và giống gốc được trình bày ở bảng 3.5. Nhìn vào bảng 3.4 và 3.5 nhận thấy số quả chắc/cây và số quả/cây có mối tương quan thuận. Số quả chắc/cây dao động 12,54 đến 26,85 ở giống L23, từ 14,00 đến 18,69 ở giống L18, các dòng chọn lọc của giống L23, MD9 và L18 đều có số quả chắc/cây thấp hơn so với giống gốc. Giống MD7 có 2/3 dòng có số quả chắc/cây nhiều hơn giống gốc (nhiều hơn 15,38), dao động trong khoảng từ 15,38 đến 19,31 quả/cây nhưng sự sai khác chỉ có 63,63% số dòng là có ý nghĩa (Ttn > Tα) (Bảng 3.6). Hệ số biến động của số quả chắc/cây ở các dòng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 dao động trong khoảng 17,86% - 47,82%. Trong đó, có 5/11 dòng có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. Bảng 3.5. Một số chỉ tiêu cấu thành năng suất của cây lạc R3 Giống gốc và dòng Số quả chắc/cây Khối lượng 100 quả (gram) Khối lượng 100 hạt (gram) Tỷ lệ nhân (%) X ± X S Cv % X ± X S Cv % X ± X S Cv % X ± X S Cv % L23 26,85 ± 2,50 33,52 130,80 ± 1,11 1,45 45,85 ± 0,47 1,93 67,39 ± 3,23 11,29 R3.4 19,77 ± 2,62 47,82 126,10 ± 1,90 1,56 65,45 ± 0,52 1,33 71,89 ± 3,34 10,23 R3.9 15,69 ± 2,31 53,02 134,12 ± 1,13 1,47 55,57 ± 1,52 1,18 70,31 ± 3,43 11,93 R3.11 12,54 ± 1,01 29,05 121,97 ± 2,07 2,03 56,22 ± 1,54 2,30 72,33 ± 4,47 10,23 R3.13 21,77 ± 1,40 28,34 132,34 ± 1,14 1,48 51,34 ± 0,64 0,78 62,33 ± 4,42 11,34 L18 18,69 ± 1,92 36,96 132,52 ± 2,30 2,42 56,42 ± 0,51 1,55 64,43 ± 4,50 11,49 R3.14 14,00 ± 1,73 44,61 134,45 ± 1,34 1,56 46,19 ± 0,39 2,89 64,49 ± 4,66 13,63 R3.15 18,15 ± 1,14 22,69 144,40 ± 2,25 2,53 58,23 ± 1,98 4,76 71,44 ± 4,15 13,32 R3.16 14,00 ± 0,94 23,20 122,33 ± 2,35 2,62 59,25 ± 1,88 2,66 74,33 ± 3,13 10,59 MD7 15,38 ± 1,52 23,81 127,86 ± 1,94 2,04 60,34 ± 1,52 1,49 74,47 ± 3,10 11,48 R3.23 14,54 ± 1,01 22,23 114,14 ± 1,37 1,62 63,24 ± 0,61 1,53 82,44 ± 4,34 11,53 R3.24 19,31 ± 0,96 17,86 114,49 ± 1,13 1,48 52,23 ± 1,52 1,51 73,73 ± 3,94 13,41 R3.26 15,85 ± 1,28 29,02 136,44 ± 2,97 4,21 61,34 ± 1,69 4,68 71,34 ± 4,45 10,25 MD9 15,77 ± 1,84 42,00 122,34 ± 2,31 3,38 52,83 ± 0,45 1,20 70,23 ± 4,42 10,50 R3.30 15,08 ± 1,53 36,48 111,39 ± 0,48 0,47 55,76 ± 1,44 3,55 74,47 ± 3,40 11,36 Dòng R3.15 của giống L18 có khối lượng 100 quả cao nhất (144,40gram), dòng R3.30 của giống MD9 có khối lượng 100 quả thấp nhất 111,39 gram. Khối lượng 100 quả lạc dao động từ 121,97 gram đến 132,34 gram ở giống L23; từ 122,33 gram đến 144,40 gram ở giống L18; từ 114,14 gram đến 136,44 gram ở giống MD7. Giống L23 có 2/4 dòng có khối lượng 100 quả cao hơn giống gốc trong đó dòng cao nhất là R3.13 cao hơn 4,94%; dòng R3.30 của giống MD9 có khối lượng 100 quả thấp hơn giống gốc; giống L18 có dòng R3.14 và R3.15 có khối lượng 100 quả cao hơn so với giống gốc (132,52 gram); giống MD7 có dòng R3.26 có khối lượng 100 quả cao hơn giống gốc. Tất cả các dòng và giống lạc nghiên cứu đều thuộc nhóm quả to (theo Vũ Công Hậu và cs, 1995) [20]. Hệ số biến động của khối lượng 100 quả dao động từ 0,47% - 4,21% trong đó có 4/11 dòng có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Các dòng thuộc giống L23 có khối lượng 100 hạt đều lớn hơn so với giống gốc. Dòng R3.30 của giống MD9 có khối lượng cao hơn giống gốc. Các dòng thuộc giống L18 có khối lượng 100 hạt giao động từ 46,19 gram đến 59,25 trong đó có 2/3 dòng có khối lượng 100 hạt lớn hơn giống gốc (56,42 gram). Giống MD7 chỉ có dòng R3.23 có khối lượng 100 hạt cao hơn giống gốc (cao hơn 60,34 gram). Tỷ lệ nhân là tính trạng quan trọng đánh giá chất lượng hạt đồng thời phản ánh năng suất của các dòng so với giống gốc. Thế hệ R3 của các dòng lạc có tỷ lệ nhân dao động 62,33% đến 72,33% ở giống L23 trong đó có 3/4 dòng có tỷ lệ nhân cao hơn so với giống gốc. Dòng R3.30 của giống MD9 có tỷ lệ nhân 74,47% cao hơn so với giống gốc (70,23%). Tất cả các dòng của giống L18 đều có tỷ lệ nhân cao hơn so với giống gốc (64,43%). Giống MD7 có dòng R3.23 có tỷ lệ nhân 82,44% cao hơn giống gốc (74,47%). Như vậy, sự sai khác về tỷ lệ nhân của các dòng chọn lọc so với giống gốc là không lớn (<10%). Trong 11 dòng nghiên cứu thì hệ số biến động của 4/11 dòng là có hệ số biến động thấp hơn so với giống gốc. Bảng 3.6. Giá trị Tα, Ttn của các đặc điểm nông học thế hệ R3 (α  0,05) Dòng Ttn Tα Chiều cao thân chính Số nhánh/cây Số quả/cây Số quả chắc/cây R3.4 1,78 4,34 2,59 2,34 1,83 R3.9 2,12 5,43 6,54 3,23 R3.11 2,54 3,56 4,76 4,35 R3.13 2,87 3,34 3,12 2,46 R3.14 1,07 2,45 2,43 2,76 R3.15 3,32 3,65 2,45 1,45 R3.16 3,56 3,43 5,54 1,22 R3.23 3,65 3,54 3,76 1,89 R3.24 3,56 1,56 2,58 2,65 R3.26 1,32 1,79 4,54 1,16 R3.30 4,34 2,12 1,43 0,76 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 3.1.3. Nhận xét về đặc điểm nông học và kết quả chọn lọc ngoài đồng ruộng (1) Qua theo dõi đặc điểm nông học của các dòng chọn lọc ở thế hệ R2, R3 chúng tôi nhận thấy, các dòng chọn lọc ở thế hệ R2 có hệ số biến động của các chỉ tiêu nghiên cứu cao, hệ số biến động ở các dòng ở thế hệ R3 thấp hơn so với thế hệ R2. Như vậy, chứng tỏ thế hệ R3 có sự ổn định hơn về các đặc điểm nông học (chiều cao cây, số nhánh/ cây,… ). (2) Từ các dòng chọn lọc, chúng tôi chọn được một số dòng có những đặc điểm nổi bật. Từ giống L23 thu được dòng R3.4, R3.11, R3.13; từ giống L18 thu được dòng R3.14, R3.15; từ giống MD7 thu được dòng R3.24, R3.26; từ giống MD9 thu được dòng R3.30… các dòng này có nhiều tính trạng nổi bật so với các dòng khác như chiều cao cây thấp hơn, số quả/cây, khối lượng 100 quả, tỷ lệ nhân và có hệ số biến động nhỏ hơn so với giống gốc. (3) Qua phân tích và chọn lọc thực tế các đặc điểm nông học ở 2 thế hệ R2, R3, có một số nhận xét thêm sau: Các dòng lạc chọn lọc của giống L18 có chiều cao cây, kích thước lá cao hơn so với các dòng thuộc giống khác và giống gốc. Các dòng lạc chọn lọc của giống L18 có vỏ trơn hạt mẩy, còn các dòng lạc chọn lọc của giống khác có vỏ nhăn. Dòng R3.26 của giống MD7 có tỷ lệ quả 3 hạt chiếm 32,12% tổng số quả, eo thắt tương đối lớn, bên cạnh đó dòng này cũng có khối lượng 100 hạt tương đối cao so với giống gốc, cần được tiếp tục nghiên cứu. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 A B C D E F Hình 3.2. Một số dòng chọn lọc thế hệ R3 ngoài đồng ruộng và củ thu hoạch A,B: Dòng R3.13(L23) và giống L23 C,D:Quả 3 hạt dòng R3.26 (MD7) và giốngMD7 E,F:Dòng R3.14(L18) và giống L18 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 3.2. Chất lƣợng hạt của một số dòng lạc chọn lọc thế hệ R3 Qua các chỉ tiêu nông học, năng suất của các dòng chọn lọc thế hệ R2, chúng tôi lựa chọn 11 dòng tiêu biểu để đánh giá chất lượng hạt. Cụ thể như sau: Giống L23: R2.4, R2.9, R2.11, R2.13; Giống L18: R2.14, R2.15, R2.16; Giống MD7: R2.23, R2.24, R2.26. Giống MD9: R2.30. Đây cũng là các dòng được sử dụng để trồng thế hệ R3. 3.2.1. Hàm lƣợng lipit, protein và đƣờng tan trong hạt của các dòng chọn lọc Hạt tốt là hạt phải có độ đồng đều về màu sắc, kích thước, khối lượng, đạt yêu cầu về thành phần hóa sinh hạt. Trên phương diện hóa sinh chúng tôi đánh giá chất lượng hạt thông qua việc xác định hàm lượng protein, lipit và đường tan. Kết quả được trình bày ở bảng 3.7. Hàm lượng lipit trong hạt là một đặc điểm của giống, đặc biệt với lạc, vì đây là cây công nghiệp lấy dầu nên hàm lượng lipit rất quan trọng [20]. Kết quả nghiên cứu ở bảng 3.7 cho thấy, hàm lượng lipit dao động 28,03% KLK đến 33,91% KLK ở giống L23, có 2/4 dòng của giống L23 có hàm lượng lipit cao hơn giống gốc (30,08% KLK). Dòng R3.30 của giống MD9 có hàm lượng lipit thấp hơn giống gốc (thấp hơn 33,71% KLK). Ở giống L18, hàm lượng lipit dao động từ 30,35% KLK đến 36,68% KLK trong đó 100% số dòng có hàm lượng lipit cao hơn giống gốc (30,35% KLK); Giống MD7 có hàm lượng lipit dao động 29,17% KLK đến 31,08% KLK trong đó tất cả các dòng lạc của giống MD7 đều có lượng lipit cao hơn giống gốc (29,17% KLK). Như vậy, hàm lượng lipit có xu hướng tăng cao ở các dòng chọn lọc, có 72,72% số dòng có hàm lượng lipit cao hơn so với giống gốc. Hàm lượng protein trong hạt không chỉ phản ảnh phẩm chất giống mà còn liên quan đến khả năng chống chịu của cây trồng [27], [41]. Giống L23 có hàm lượng protein dao động trong khoảng 17,65% KLK đến 26,09% KLK trong đó chỉ có 1/4 dòng có lượng protein cao hơn lượng protein giống gốc là R3.11. Giống MD9 có 2/4 dòng có lượng protein cao hơn lượng protein giống gốc. Giống L18 hàm lượng protein dao động 22,32% KLK đến 26,25% KLK trong đó có 2/3 dòng có có lượng protein cao hơn lượng protein giống gốc. Tất cả các Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 dòng của giống MD7 có lượng protein cao hơn lượng protein giống gốc (17,67% KLK). Một số dòng có hàm lượng protein cao như: R3.11 (giống L23) cao hơn 1,02% so với giống gốc; R3.30 (giống MD9) cao hơn 30,86% so với giống gốc; R3.26 (giống MD7) cao hơn 27,61% so với giống gốc; R3.16 (giống L18) cao hơn 14,18% so với giống gốc. Bảng 3.7. Một số chỉ tiêu hóa sinh trong hạt lạc R3 (Đơn vị: % KLK) Giống gốc và dòng Hàm lượng lipit Hàm lựợng protein Hàm lượng đường X ± X S X ± X S X ± X S L23 30,08 ± 0,64 25,56 ± 1,72 3,73 ± 0,10 R3.4 34,58 ± 0,92 18,46 ± 0,33 3,17 ± 0,17 R3.9 28,03 ± 2,03 22,57 ± 1,04 3,05 ± 0,02 R3.11 33,91 ± 0,88 26,09 ± 1,55 3,73 ± 0,07 R3.13 28,31 ± 1,74 17,65 ± 0,96 3,28 ± 0,08 L18 30,35 ± 1,24 22,99 ± 0,05 3,18 ± 0,09 R3.14 34,88 ± 1,18 26,09 ± 0,52 3,51 ± 0,46 R3.15 30,61 ± 1,06 22,32 ± 1,15 4,05 ± 0,24 R3.16 36,68 ± 0,99 26,25 ± 0,72 3,52 ± 0,53 MD7 29,17 ± 0,61 17,67 ± 1,16 2,42 ± 0,31 R3.22 29,85 ± 0,72 21,75 ± 2,05 2,96 ± 0,68 R3.25 29,86 ± 0,43 18,23 ± 2,06 3,09 ± 0,72 R3.26 31,08 ± 1,39 22,55 ± 0,93 3,16 ± 0,14 MD9 33,71 ± 1,24 21,09 ± 0,99 2,84 ± 0,21 R3.30 27,62 ± 1,11 27,64 ± 1,68 3,01 ± 0,14 Đường tan là một trong những chỉ tiêu đánh giá chất lượng hạt. Bảng 3.7 cho thấy, các dòng chọn lọc của giống L23 đều có hàm lượng đường khử thấp hơn so với giống gốc, hàm lượng đường tan dao động trong khoảng tử 2,05% KLK đến 3,73% KLK. Dòng R3.30 của giống MD9 có hàm lượng đường tan cao hơn 5,99% so với giống gốc. Giống L18 và giống MD7 có tất cả các dòng đều có hàm lượng đường cao hơn giống gốc. Dòng R3.15 của giống L18 có hàm lượng đường tan cao nhất trong tất cả các dòng (4,05%KLK). 3.2.2. Hàm lƣợng amino acid liên kết trong hạt của một số dòng chọn lọc và giống gốc Thành phần amino acid là chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lượng protein của hạt. Bằng cách sử dụng phương pháp phân tích hàm lượng amino acid trong hạt trên hệ máy HP-Amino Quant và dựa vào sắ c ký đồ, chúng tôi xác định được Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 hàm lượng amino acid trong hạt (g amino acid/100g chất khô) chúng tôi đã xác định được hàm lượng amino acid trong protein hạt của một số dòng chọn lọc và giống gốc được thể hiện ở bảng 3.8. Đây là những dòng có các đặc điểm nông học nổi bật, đồng thời là dòng có các chỉ tiêu hóa sinh tương đối cao so với giống gốc và các dòng khác. Bảng 3.8. Hàm lượng amino acid liên kết trong hạt của một số dòng chọn lọc và giống gốc thế hệ R3 (Đơn vị: gaa/100g chất khô) STT Amino acid MD7 R3.25 R3.26 L23 R3.11 R3.13 1. Aspartic 1,024 1,931 2,331 1,164 1,270 1,235 2. Glutamic 3,398 3,188 4,488 3,219 4,429 4,070 3. Serine 0,447 1,023 1,036 1,127 0,729 0,762 4. Histidine 0,668 0,790 0,980 1,491 0,877 0,700 5. Glycine 0,680 0,620 0,620 1,485 0,859 0,775 6. Threonine 0,968 0,467 0,497 1,029 0,659 0,657 7. Alanine 1,285 0,780 0,790 1,365 1,032 0,831 8. Arginine 1,473 2,356 2,345 1,745 2,790 2,296 9. Tyrosine 0,856 2,021 1,091 1,332 1,296 1,095 10. Valine 1,062 1,428 0,964 1,496 0,942 0,919 11. Methionine 0,671 0,398 0,398 0,343 0,312 0,436 12. Phenylalanine 1,001 0,933 1,433 1,271 1,277 1,152 13. Isoleucine 1,113 0,982 0,882 1,063 0,793 0,888 14. Leucine 1,811 1,112 1,611 2,044 1,504 1,498 15. Lysine 1,360 0,568 0,808 0,722 0,765 0,616 16. Proline 0,691 0,981 1,610 2,141 0,996 1,060 Tổng số 13,527 13,992 15,945 21,972 13,598 12,406 % so giống gốc 100,00 103,43 117,87 100,00 61,89 56,46 Tổng số (FAO) (gram) 5,784 Chúng tôi xác định được 16 loại amino acid trong hạt của các dòng lạc và giống gốc. Trong đó , không có tryptophan vì loại axit amin này bị phân hủy trong quá trình thủy phân bởi HCl 6N, cystein ở dạng hỗn hợp không phân tách được, còn glutamine và asparagine chuyển hóa thà