Luận văn Đánh giá chất lượng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn Hà Giang

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------------- NGÔ VĂN DƢƠNG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA CẠN HÀ GIANG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ------------------------------------- NGÔ VĂN DƢƠNG ĐÁNH GIÁ CHẤT LƢỢNG VÀ KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG LÚA CẠN HÀ GIANG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN LAM ĐIỀN Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Tác giả Ngô Văn Dƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Lam Điền đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Tôi xin cảm ơn KTV Cao Phƣơng Thảo (phòng Thực vật học), KTV Đào Thu Thủy (phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào), CN Nguyễn Ích Chiến (phòng thí nghiệm Di truyền học và Công nghệ gen), Khoa Sinh- KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Thái Nguyên) đã giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm và các thầy cô giáo, cán bộ khoa sinh - KTNN, Ban giám hiệu Trƣờng THPT Bắc Sơn, Sở GD&ĐT Thái Nguyên đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn sự động viên, khích lệ của gia đình, bạn bè và đồng nghiệp trong suốt thời gian làm luận văn. Tác giả luận văn Ngô Văn Dƣơng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU………………………………………………………………. 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây lúa………………………………………………….. 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa………………………………………... 3 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa……………………………………………… 4 1.1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam……………………. 5 1.1.4. Thành phần hoá sinh của hạt lúa............................................................. 10 1.1.5. Đặc điểm sinh học của cây lúa cạn………………………….................. 11 1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật………………………………… 13 1.2.1. Khái niệm về hạn………………………………………………………. 13 1.2.2. Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật…………….................. 14 1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và di truyền của tính chịu hạn ở cây lúa………. 16 1.2.4. Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa………………….................. 21 1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thức vật vào việc đánh giá khả năng chống chịu ở cây lúa……………………........................ 22 1.3.1. Hệ thống nuôi cấy……………………………………………………… 22 1.3.2. Một số thành tựu về đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng tế bào soma bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro……………………………… 23 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cƣ́u……………………………............... 25 2.1.1. Vật liệu thực vật………………………………………………………... 25 2.1.2. Hóa chất và thiết bị................................................................................. 25 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu................................................................................ 26 2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u ...................................................................... 27 2.2.1. Phƣơng pháp phân loại các giống lúa cạn …………………………….. 26 2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh.............................................................................. 26 2.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ bằng phƣơng pháp gây hạn 29 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên nhân tạo………………………………………………………………… 2.2.4. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro………………………………………………. 31 2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu và tính toán kết quả………………………... 33 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân loại, đặc điểm hình thái của các giống lúa…………................. 34 3.1.1. Phân loại các giống lúa………………………………………………… 34 3.1.2. Đặc điểm hình thái các giống lúa……………………………………… 35 3.2. Đánh giá chất lƣợng hạt……………………….…………………….. 37 3.2.1. Đánh giá chất lƣợng hạt trên phƣơng diện cảm quan…………………. 37 3.2.2. Đánh giá chất lƣợng hạt trên phƣơng diện hóa sinh................................ 38 3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa…………………….. 42 3.3.1. Khả năng chịu hạn của các giống ở giai đoạn nảy mầm… ...................... 42 3.3.2. Khả năng chịu hạn của các giống ở giai đoạn mạ……………………… 51 3.4. Khả năng chịu han của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn mô sẹo.. 59 3.4.1. Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trƣởng và khả năng tái sinh của các giống lúa nghiên cứu………………………………………….. 59 3.4.2. Độ mất nƣớc của mô sẹo…………………………………...................... 60 3.4.3. Khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo………………………………….. 61 3.4.4. Tốc độ sinh trƣởng của mô sẹo sau khi sử lý thổi khô………………… 62 3.4.5. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sau khi xử lý thổi khô……………….. 63 3.4.6. Xác định nhanh sức sống của tế bào mô sẹo bằng phƣơng pháp nhuộm TTC 64 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ……………………………………………. 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO……………………………………………... 69 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Diện tích, năng xuất và sản lƣợng lúa của toàn Thế giới giai đoạn từ 1970 đến 2007............................................................................................. 6 Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lúa của 10 nƣớc có sản lƣợng lúa hàng đầu thế giới năm 2007................................................................................ 7 Bảng 1.3. Tình hình sản xuất và xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam giai đoạn 1990 – 2007............................................................................................................ 9 Bảng 2.1. Các giống lúa cạn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu……………………... 25 Bảng 3.1. Phân loại các giống lúa nghiên cƣ́u……………………………………… 34 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng 1000 hạt của các giống lúa.................. 35 Bảng 3.3. Một số chỉ tiêu chất lƣợng hạt của các giống lúa………………………... 37 Bảng 3.4. Hàm lƣợng protein, đƣờng tan của các giống lúa (% khối lƣợng khô)..... 39 Bảng 3.5. Hàm lƣợng axit amin dƣ̣ trƣ̃ trong hạt của các giống lúa (g axit amin /100g mẫu)................................................................................................. 40 Bảng 3.6. Thành phần và lƣợng axit amin trong protein hạt của các giống lúa (g axit amin/ 100g protein)............................................................................. 41 Bảng 3.7. Thành phần và hàm lƣợng các axit amin không thay thế trong hạt của các giống lúa (g axit amin/ 100g protein)............................................. 41 Bảng 3.8. Hoạt độ của -amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xƣ̉ lý sorbitol 5% ( ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm)………………………………………….. 43 Bảng 3.9. Hàm lƣợng đƣờng tan của các giố ng lúa khi xƣ̉ lý sorbitol 5% ở giai đoạn nảy mầm(%)………………………………………………………. 45 Bảng 3.10. Tƣơng quan giƣ̃a hoạt đô enzyme α-amylase với hàm lƣợng đƣờng tan của các giống lúa………………………………………………………… 46 Bảng 3.11. Hoạt độ protease của các giố ng lúa khi xƣ̉ lý sorbitol 5% ở giai đoạn nảy mầm (ĐVHĐ/mg)……………………………………………... 47 Bảng 3.12. Hàm lƣợng protein của các giống lúa giai đoạn nảy mầm khi xƣ̉ lý 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên sorbitol 5 % (%)………………………………………………………….. Bảng 3.13. Tƣơng quan giƣ̃a hoạt độ protease với hàm lƣợng protein tan ở giai đoạn nảy mầm của các giống lúa………………………………………………. 50 Bảng 3.14. Tỷ lệ thiệt hại do hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ (%)……………. 52 Bảng 3.15. Khả năng giữ nƣớc của các giống lúa (%)………………………………. 53 Bảng 3.16. Chiều dài rễ tại các thời điểm gây hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ (cm)……………………………………………………………………… 54 Bảng 3.17. Chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống lúa ở giai đoạn mạ…………… 56 Bảng 3.18. Hàm lƣợng proline của các giống lúa ở giai đoạn mạ (mM/g khối lƣợng tƣơi)………………………………………………………………………. 58 Bảng 3.19. Thăm dò khả năng tạo mô sẹo, tốc độ sinh trƣởng và khả năng tái sinh của 5 giống lúa…………………………………………………………… 60 Bảng 3.20. Kiểm tra sức sống của các giống lúa cạn bằng phƣơng pháp nhuộm TTC 64 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC HÌNH Trang Hình 3.1. Hình thái hạt của các giống lúa nghiên cứu…………………………. 36 Hình 3.2. Hàm lƣợng axit amin không thay thế của các giống lúa nghiên cứu với tiêu chuẩn của FAO……………………………….……………. 42 Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ enzyme α-amylase của các giống lúa ………. 44 Hình 3.4. Định tính hoạt độ enzyme α-amylase của các giống lúa…………….. 44 Hình 3.5. Sự biến động hàm lƣợng đƣờng tan các giống lúa ở giai đoạn nảy mầm……………………………………………..………………….. 45 Hình 3.6. Sự biến động hoạt độ của enzyme protease của các giống lúa………. 47 Hình 3.7. Ảnh định tính hoạt độ enzyme protease của các giống lúa………….. 48 Hình 3.8. Hàm lƣợng protein các giống lúa ở giai đoạn nảy mầm…………….. 49 Hình 3.9. Tỷ lệ thiệt hại do hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ…………….. 52 Hình 3.10. Chiều dài rễ của các giống lúa ở giai 7 ngày hạn……………………. 54 Hình 3.11. Đồ thị hình rada biểu thị khả năng chịu hạn của các giống lúa ở giai đoạn mạ…………………………………………………………….. 55 Hình 3.12. Ảnh các giống lúa trƣớc và sau 5 ngày gây hạn ở giai đoạn mạ…….. 57 Hình 3.13. Sự biến động hàm lƣợng proline ở giai đoạn mạ của các giống lúa… 58 Hình 3.14. Tốc độ mất nƣớc của mô sẹo các giống lúa sau khi xử lý thổi khô…. 60 Hình 3.15. Khả năng sống sót của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô (%)…………. 62 Hình 3.16. Tốc độ sinh trƣởng tƣơng đối của mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy……… 62 Hình 3.17. Khả năng tái sinh cây từ mô sẹo sau khi xử lý thổi khô…………….. 63 Hình 3.18. Đánh giá khả năng chịu mất nƣớc của mô sẹo các giống lúa cạn…… 64 Hình 3.19. Khả năng phục hồi và tái sinh sau thổi khô của các giống lúa cạn ở mức độ mô sẹo………………………………………………………. 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CHỮ VIẾT TẮT ABA Abscisic Acid ATPaza Adenosin triphosphatase (Enzym phân giải ATP giải phóng năng lƣợng) ADN Deoxyribose Nucleic Acid AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều dài các phân đoạn đƣợc nhân bản) ASTT Áp suất thẩm thấu 2,4D Axit 2,4 – Dichlorphenoxyacetic cADN Complementary ADN (ADN bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngƣợc từ ARN thông tin) CS Cộng sự CSCHTĐ Chỉ số chịu hạn tƣơng đối ĐVHĐ Đơn vị hoạt độ ĐVMS Đơn vị mô sẹo EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid HSP Heat shock protein (Protein sốc nhiệt) IRRI International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa quốc tế) Kb Kilobase MS Murashige Skoog (Môi trƣờng theo Murashige và Skoog) LEA Late Embryogenesis Abundant protein (Protein tổng hợp với số lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi) PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) RAPD Random Amplified Polymorphism ADN (Phân tích ADN đa hình đƣợc nhân bản ngẫu nhiên) RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dài các phân đoạn ADN cắt hạn chế) sHSP Small heat shock protein (Protein sốc nhiệt nhỏ từ 10 - 30 kDa) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Lúa ( oryza Sativa L.) là nguồn lƣơng thực chủ yếu của hơn một nửa dân số trên thế giới. Ở Việt Nam, lúa là cây nông nghiệp có vị trí quan trọng trong nền kinh tế quốc dân. Nghề trồng lúa ở Việt Nam có từ cổ xƣa và là trung tâm đa dạng về cây lúa trồng hiện nay [52]. Hiện hay hơn 60% dân số nƣớc ta sống bằng nghề trồng lúa , nên lúa không chỉ có ý nghĩa vế mặt an ninh lƣơng thực mà còn có giá trị về mặt kinh tế cho nông dân trồng lúa và đặc biệt quan trọng đối với những bà con dân tộc miền núi. Nƣớc ta có địa hình phức tạp 3/4 lãnh thổ là đồi núi, địa hình chia cắt và diễn biến khí hậu phức tạp, lƣợng mƣa phân bố không đều giữa các vùng và các miền trong năm [8], nên hạn có thể xảy ra bất cứ mùa nào, vùng nào trong năm. Lúa là loài cây trồng rất mẫn cảm với các điều kiện ngoại cảnh và là cây chịu hạn kém [40]. Những yếu tố sinh thái bất lợi tác động lên quá trình sinh trƣởng và phát triển của cây lúa nhƣ lƣợng mƣa nhiệt độ, ánh sáng... không thuận lợi. Trên thế giới, hàng năm hạn có thể làm giảm tới 70% năng suất cây trồng nói chung [68]. Ở Việt Nam, hàng năm trung bình mất khoảng 30 vạn tấn lƣơng thực do thiên tai, trong đó hạn đƣợc xem là nhân tố chình làm giảm năng xuất lúa [1]. Bên cạnh lúa nƣớc, lúa cạn cũng chiếm một vị trí quan trọng đối với nông dân, đặc biệt là dân miền núi. Lúa cạn phân bố ở vùng núi, địa hình đồi dốc. Việt Nam lúa cạn phân bố chủ yếu ở vùng Tây Bắc, Đông Bắc Bộ và Tây Nguyên, nơi có địa hình đồi núi, mƣa nhiều nhƣng lƣợng mƣa phân bố không đều dẫn đến hạn cục bộ xảy ra thƣờng xuyên. Do đó việc nghiên cứu tính chịu hạn và nâng cao khả năng chịu hạn cho cây lúa cạn là một thực tiễn quan trọng đƣợc nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu [1], [40]. Cây lúa cạn năng xuất thấp nhƣng lại thể hiện tính ƣu việt về khả năng chống chịu hạn tốt, thích nghi cao với điều kiện sinh thái khó khăn, có chất lƣợng gạo tốt, thơm, dẻo, phù hợp với thị hiếu ngƣời tiêu dùng và có tiềm năng phát triển để phục vụ cho xuất khẩu. Hiện nay các giống lúa đƣợc canh tác phân tán, tự phát, chƣa có khoanh vùng và định hƣớng phát triển làm cho nhiều giống lúa cạn có chất lƣợng bị Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 mất dần, diện tích trồng lúa bị thu hẹp. Vì vậy sƣu tập và tuyển chọn các giống lúa cạn có chất lƣợng tốt, khả năng chống chịu cao làm cơ sở cho chọn tạo giống trở thành một vấn đề cấp thiết. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi lựa chọn đề tài: “Đánh giá chất lƣợng và khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn Hà Giang”. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Đánh giá chất lƣợng và khả năng chịu hạn của 5 giống lúa cạn trồng ở tỉnh Hà Giang. 3. Nội dung nghiên cứu - Phân loại các giống lúa nghiên cứu. - Đánh giá chất lƣợng hạt các giống lúa nghiên cứu. - Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn hạt nảy mầm. - Đánh giá nhanh khả năng chịu hạn của các giống lúa nghiên cứu ở giai đoạn mạ ba lá - Đánh giá khả năng chịu hạn ở mức độ mô sẹo bằng kỹ thuật thổi khô. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây lúa 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây lúa Cây lúa (Oryza sativa L) còn đƣợc gọi là lúa châu Á vì nó đƣợc thuần hoá từ lúa dại ở ba trung tâm đầu tiên vùng Đông Nam Á: Assam (Ấn Độ), biên giới Thái Lan – Myanmarr, Trung du Tây Bắc Việt Nam [30]. Theo tài liệu của Trung Quốc thì khoảng năm 2800 – 2700 TCN, ở Trung Quốc đã có nghề trồng lúa [6]. Markey và De Candolle, Roievich cho rằng nguồn gốc cây lúa trồng là ở Miền Nam Việt Nam và Campuchia [30]. Có tài liệu lại cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở Miền Nam Việt Nam và Campuchia [22], [30]. Có giả thuyết lại cho rằng tổ tiên của lúa Oryza là một cây hoang dại trên siêu lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán khắp các châu lục trong quá trình trôi dạt lục địa [60]. Gutschin cho rằng cái nôi của nghề trồng lúa là ở chân dãy Himalaya đổ xuống các vùng đồng bằng Bengale, Assam, Thái Lan vì ở vùng này có nhiều loại lúa hoang dại và các giống lúa trồng phong phú [6]. Tuy có nhiều các tài liệu khác nhau, các khảo cổ đã chứng minh nguồn gốc khác nhau của cây lúa nhƣng đa số các tài liệu đều cho rằng nguồn gốc cây lúa là ở vùng đầm lầy Đông Nam Á, có thể thuộc nhiều quốc gia khác nhau, sau đó do khí hậu nhiệt đới nóng ẩm cây lúa đã lan rộng ra các vùng khác nhau [22], [30]. Lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angios Permes), lớp một lá mầm (Mono Cotyledones), bộ hòa thảo có hoa (Graminales), họ hòa thảo (Graminae), lúa trồng thuộc chi Oryza (có 24 hoặc 48 nhiễm sắc thể), có 23 loài phân bố khắp thế giới trong đó có hai loài lúa trồng. Loài Oryza sativa L. trồng phổ biến trên thế giới và phần lớn tập trung ở Châu Á bao gồm ba loài phụ: Japonica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (Bắc Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên), chịu rét cao, ít chịu sâu bệnh. Indica ( đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới và cận nhiệt đới nhƣ Việt Nam, Thái Lan, Ấn Độ, Mianma), có đặc điểm hạt dài, thân cao, mềm dễ đổ, chịu sâu bệnh, năng xuất thấp, mẫn cảm với ánh sáng. Javanica có đặc điểm trung gian, hạt dài, dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ đƣợc trồng ở vài nơi thuộc Indonesia [22] . Loài Oryza Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 gluberrima S. đƣợc trồng với một diện tích nhỏ thuộc Tây Phi. Sự tiến hóa của cây lúa gắn liền với sự tiến hóa của loài ngƣời đặc biệt ở châu Á [61]. Theo điều kiện sinh thái, cây lúa chia làm hai loại, lúa cạn và lúa nƣớc. Lúa cạn, đƣợc trồng vào mùa mƣa trên đất cao, đất thoát nƣớc tự nhiên, trên những chân ruộng không đắp bờ hoặc không có bờ và không có nƣớc dự trữ trên bề mặt. Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì lúa cạn do lúa nƣớc biến đổi thành và những giống lúa này có khả năng trồng đƣợc ở những vùng khô hạn, vẫn có khả năng sinh trƣởng phát triển bình thƣờng trên ruộng có nƣớc. Đây là một đặc tính nông học của lúa cạn, khác với cây trồng khác. Hiện nay có thể chia lúa cạn thành hai nhóm: Nhóm lúa cạn cổ truyền, bao gồm những giống lúa cạn địa phƣơng, thích nghi cao và tồn tại lâu đời, tính chống chịu cao, tuy nhiên giống lúa này có hạn chế là năng xuất thấp. Nhóm lúa không chủ động nƣớc hoặc sống nhờ nƣớc trời. Loại này đƣợc phân bố trên những nƣơng bằng, chân đồi thấp cố độ dốc dƣới 5o. Đây là những giống lúa cạn mới lai tạo, có khả năng chịu hạn trong những giai đoạn sinh trƣởng nhất định, hiệu xuất sử dụng nƣớc và tiềm năng năng xuất cao [16]. Năng xuất của các giống lúa cạn thƣờng thấp do hai nguyên nhân chủ yếu: Giống xấu và đất nghèo dinh dƣỡng, phát triển trên những vùng dân trí thấp và điều kiện canh tác kém [16]. Tuy năng xuất lúa cạn không cao, trung bình đạt 15 tạ/ha, nhƣng cây lúa cạn đã góp phần vào tổng sản lƣợng lúa một cách đáng kể (từ 20% - 40% ở những vùng sản xuất lƣơng thực khó khăn), góp phần giải quyết lƣơng thực tại chỗ cho nhân dân, giảm đƣợc công vận chuyển và chủ động lƣơng thực trong một khoảng thời gian nhất định, phù hợp với điều kiện của nhiều địa phƣơng. 1.1.2. Giá trị kinh tế của cây lúa Trên thế giới cơ cấu sản xuất lƣơng thực, lúa gạo chiếm 26,5%. Sản lƣợng lúa đã vƣợt lên đứng thứ nhất trong các cây lƣơng thực với tổng sản lƣợng là 650 triệu tấn/năm. Mặc dù diện tích trồng lúa gạo đứng sau lúa mì nhƣng sản lƣợng lúa năm 1993 đã đứng vị trí thứ nhất với tổng sản lƣợng là 573 triệu tấn/năm. Đặc biệt trong Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 những năm gần đây với sụ phát triển của khoa học kỹ thuật trong công tác chọn tạo giống và canh tác, phân bón thì năng xuất và chất lƣợng lúa gạo không ngừng tăng lên [6]. Trên thế giới khoảng 40% dân số coi lúa gạo là cây lƣơng thực chính, tới 25% dân số sử dụng lúa gạo trên 1/3 khẩu phần ăn hàng ngày. Ở Việt Nam 100% dân số sử dụng gạo làm lƣơng thực chính. Trong lúa gạo chứa đầy đủ các thành phần dinh dƣỡng nhƣ tinh bột (62,5%), protein (7-10%), lipit (1-3%), xenlulo (10,9%), nƣớc 11%...[22]. Ngoài ra gạo còn chứa một số chất khoáng và vitamin nhóm B, các axit amin thiết yếu nhƣ lizin, triptophan, threonin… chất lƣợng gạo thay đổi theo thành phần axit amin, điều này phụ thuộc vào từng giống [58]. Do thành phần các chất dinh dƣỡng tƣơng đối ổn định và cân đối nên lúa gạo đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ: - Lúa gạo đƣợc chế biến thành trên 200 món ăn khác nhau [16], [61]. - Lúa gạo đƣợc dùng làm thức ăn cho gia súc với một lƣợng khá lớn. Ở các nƣớc phát triển lƣợng lúa gạo dành cho chăn nuôi chiếm một tỷ lệ cao. - Lúa gạo là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, sản xuất bánh kẹo, sản xuất rƣợu bia… Sản phẩm phụ của cây lúa đƣợc sử dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Tấm đƣợc dùng để sản xuất rƣợu, cồn axeton, phấn viết mịn… Cám đƣợc dùng để sản xuất thức ăn tổng hợp, sản xuất các vitamin nhóm B, chế tạo sơn cao cấp, làm nguyên liệu chế tạo xà phòng… Vỏ trấu để sản xuất nấm men làm thức ăn gia súc, vật liệu đóng lót hàng, vật liệu độn phân hữu cơ, làm chất đốt… Rơm rạ dùng cho công nhiệp sản xuất giấy, catông xây dựng, đồ gỗ gia dụng. Gạo là mặt hàng xuất khẩu làm tăng thu nhập quốc dân, góp phần ổn định an ninh lƣơng thực nhân loại [21], [61]. 1.1.3. Tình hình sản xuất lúa trên thế giới và ở Việt Nam 1.1.3.1. Tình hình sản xuất lúa gạo trên thế giới Theo thống kê của FAO năm 2006 có 114 nƣớc trồng lúa và phân bố ở tất cả các Châu lục trên Thế giới. Trong đó Châu Phi có 41 nƣớc, Châu Á có 30 nƣớc, Bắc Trung Mỹ có 14 nƣớc, Nam Mỹ 13 nƣớc, Châu Âu 11 nƣớc, Châu Đại Dƣơng có 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 nƣớc. Diện tích trồng lúa biến động và đạt khoảng 152.000 triệu ha, năng suất bình quân xấp xỉ 4,0 tấn/ha [61]. Châu Á là khu vực có diện tích trồng lúa lớn nhất Thế giới chiếm 90%, Châu Phi 3,6%, Nam Mỹ 3,1%, Bắc Mỹ và Trung Mỹ 1,3%... [59]. Bảng 1.1. Diện tích, năng xuất và sản lƣợng lúa của toàn Thế giới giai đoạn từ 1970 đến 2007 Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lƣợng (triệu tấn) 1970 133,10 23,8 316,38 1980 144,76 27,4 396,87 1990 146,98 35,3 518,23 2000 154,11 38,9 598,97 2001 151,97 39,4 598,03 2002 147,96 39,1 577,99 2003 149,20 39,1 583,00 2004 151,02 40,3 608,37 2005 153,78 40.2 618,53 2006 156,30 41,21 644,10 2007 156,59 41,50 651,70 (Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008 [64]) Bảng 1.1 thể hiện, diện tích canh tác lúa có xu hƣớng tăng. Song tăng mạnh nhất vào thập kỷ 60, 70 của thế kỷ XX sau đó tăng chậm dần và có xu hƣớng ổn định vào những năm đầu của thế kỷ XXI. Về năng suất lúa trên đơn vị diện tích cũng có chiều hƣớng tƣơng tự. Trong 4 thập kỷ cuối của thế kỷ XX năng suất lúa tăng gấp 2 lần từ: 23,8 tạ/ha năm 1970 đến 38,9 tạ/ha năm 2000, sau đó năng suất lúa vẫn tăng nhƣng chậm dần. Đến năm 2007 sản lƣợng lúa trên toàn thế giới là 651,70 triệu tấn. Sang những năm đầu của thế kỷ XXI, việc áp dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật vào trong thâm canh lúa, chú trọng chỉ tiêu chất lƣợng hơn số lƣợng làm cho năng suất lúa có xu hƣớng chững lại hoặc tăng không đáng kể. Tuy nhiên ở những nƣớc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 có nền khoa học kỹ thuật phát triển, năng suất vẫn cao hơn hẳn. Điều này đƣợc chứng minh qua số liệu thống kê của 10 nƣớc có sản lƣợng lúa đứng đầu thế giới (FAOSTAT, 2008) [64]. Bảng 1.2. Diện tích, năng suất và sản lƣợng lúa của 10 nƣớc có sản lƣợng lúa hàng đầu thế giới năm 2007 Tên nƣớc Diện tích (triệu ha) Năng suất (tạ/ha) Sản lƣợng (triệu tấn) Trung Quốc 29,49 63,41 187,04 Ấn Độ 44,00 32,07 141,13 Inđônêxia 12,16 46,89 57,04 Băngladesh 11,20 38,84 43,50 Việt Nam 7,30 48,68 35,56 Thái Lan 10,36 26,94 27,87 Myanma 0,82 39,76 32,61 Philippin 4,25 37,64 16,00 Brazin 2,90 38,20 11,09 Nhật Bản 1,67 65,37 10,97 (Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008) Theo số liệu của bảng 1.2, trong 10 nƣớc trồng lúa có sản lƣợng trên 10 triệu tấn/năm có 9 nƣớc nằm ở Châu Á, chỉ có một đại diện Brazin là ở Nam Mỹ. Trung Quốc và Nhật Bản là hai nƣớc có năng suất cao hơn hẳn đạt 63,41 tạ/ha (Trung Quốc) và 65,37 tạ/ha (Nhật Bản). Điều đó có thể lý giải vì Trung Quốc là nƣớc đi tiên phong trong lĩnh vực phát triển lúa lai và ngƣời dân có tính cần cù, trình độ thâm canh cao. Còn Nhật Bản là nƣớc có trình độ khoa học kỹ thuật cao, đầu tƣ lớn [19]. Việt Nam là nƣớc có năng suất lúa cao đứng hàng thứ 3 trong 10 nƣớc trồng lúa, đạt 48,68 tạ/ha. Thái Lan tuy là nƣớc xuất khẩu gạo đứng hàng đầu thế giới trong nhiều năm liên tục, song năng suất chỉ đạt 26,91 tạ/ha, Thái Lan chú trọng nhiều hơn đến canh tác các giống lúa dài ngày, chất lƣợng cao [6]. Xét về diện tích trồng lúa thì Ấn Độ là nƣớc có diện tích lớn nhất (44,00 triệu ha) còn nƣớc đứng thứ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 10 là Myanma (0,82 triệu ha). Về sản lƣợng Trung Quốc đứng đầu 187,04 triệu tấn và đứng thứ 10 là Nhật Bản 10,97 triệu tấn. Bên cạnh cây lúa nƣớc, cây lúa cạn chiếm tỉ lệ đáng kể chiếm 15% sản lƣợng gạo trên Thế giới. Lúa cạn đƣợc trồng ở khắp Châu Á, Châu Phi, Châu Mỹ La Tinh. Diện tích trồng lúa trên Thế giới khoảng 148 triệu ha (năm 1991), trong đó 19 triệu ha là lúa cạn: Châu Á có 12 triệu ha, Châu Mỹ La Tinh 3,3 triệu ha, Châu Phi 2,5 triệu ha, năng suất bình quân đạt 1 tấn/ha [76]. 1.1.3.2. Tình hình sản xuất lúa gạo ở Việt Nam. Việt Nam là một trong 10 nƣớc sản xuất lúa gạo lớn nhất trên thế giới. Năm 1980 diện tích trồng lúa là 5,6 triệu ha, sản lƣợng là 23,5 triệu tấn. Đến năm 2007 diện tích trồng lúa là 7,30 triệu ha, năng suất đạt 36,56 triệu tấn. Việt Nam là nƣớc nông nghiệp , trong đó nghề trồng lúa đóng vai trò chủ đạo trong cơ cấu cây trồng, nên lúa có ý nghĩa quan trọng trong nền kinh tế , xã hội nƣớc ta. Nằm trong vùng nhiệt đới nóng ẩm , lƣợng bức xạ mặt trời cao và đất đai phù hợp cho trồng lúa nên Việt Nam có thể trồng nhiều vụ lúa trong năm và với nhiều giống khác nhau . Cùng với việc áp dụng các biện pháp chọn , tạo giống mới có năng suất, chất lƣợng cao và khả năng chống chịu tốt nên sản lƣợng lúa gạo nƣớc ta không ngừng tăng lên, đã góp phần quan trọng đƣa bình quân lƣơng thực đầu ngƣời tăng lên. Năm 1994 bình quân lƣơng thực đầu ngƣời nƣớc ta đạt 359 kg/ngƣời/năm nhƣng đến năm 2005 đã tăng lên 476 kg. Mặc dù diện tích trồng lúa ở nƣớc ta giai đoạn 1990 -2007 không tăng nhƣng sản lƣợng và lƣợng gạo xuất khẩu không ngừng tăng đƣợc thể hiện ở bảng 1.3 [39], [62]. Năm 1990 Việt Nam xuất khẩu gạo đƣợc 1,62 triệu tấn, đến năm 2000 chúng ta đã đạt 3,50 triệu tấn. Năm 2007 Việt Nam có sản lƣợng gạo xuất khẩu lớn nhất đạt 5,23 triệu tấn và giữ vững là nƣớc xuất khẩu gạo lớn thứ hai trên Thế giới. Năm 2008 tuy diện tích trồng lúa giảm xong năng xuất và sản lƣợng đều tăng điều đó đã khẳng định vị thế cây lúa của Việt Nam. Đặc biệt sản lƣợng xuất khẩu gạo vẫn đƣợc duy trì ổn định ở mức trên 5 triệu tấn. Theo dự đoán của các chuyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 gia thì năm 2009 năng xuất, sản lƣợng và giá trị xuất khẩu gạo của Việt Nam sẽ giữ ở mức ổn định và có thể đạt 5,3 triệu tấn (theo dự báo của FAO). Bảng 1.3. Tình hình sản xuất và xuất khẩu lúa gạo của Việt Nam giai đoạn 1990 - 2007 Năm Diện tích (triệu ha) Năng suất (tấn/ha) Sản lƣợng (triệu tấn) Xuất khẩu (triệu tấn) 1990 6,042 3,18 19,225 1,62 1995 6,765 3,68 24,964 2,04 2000 7,666 4,24 32,530 3,50 2003 7,452 4,63 34,568 3,92 2004 7,444 4,86 36,158 4,00 2005 7,430 4,82 35,800 5,16 2006 7,3248 4,89 36,200 5,18 2007 7,1838 4,95 36,890 5,23 (Nguồn: Niên giám thống kê Việt Nam, 2008 [39],[62]) 1.1.3.3. Tình hình sản xuất lúa cạn trên thế giới và ở Việt Nam Tổng diện tích lúa cạn ở trên thế giới khoảng 18,960 triệu ha , chiếm 13% diện tích trồng lúa thế giới , năng suất b ình quân chỉ đạt 1tấn/ha [74]. Tuy diện tích không lớn, song nó đóng vai trò rất quan trọng và không thể thiếu đƣợc đối với nhân dân vùng núi cao, vùng sâu, vùng xa. Diện tích trồng lúa cạn phân bố không đều , chủ yếu tập trung ở châu Á , châu Mỹ La Tinh , châu Phi. Trong tƣ̀ng khu vƣ̣c diện tích gieo trồng lúa cạn cũn g khác nhau. Nhƣ̃ng nƣớc trồng nhiều là Ấn Độ , Bzazil, Indonesia, Banglades…Về tỷ lệ diện tích lúa cạn so với lúa nƣớc ở tƣ̀ng vùng cũng rất khác nhau , có những nƣớc trồng 94% diện tích lúa cạn nhƣ Liberia , Bzazil (76%)….Ở châu Á tỷ lệ này thấp hơn: Philippin (11,3%), Indonesia (21%), Malaixia (5%)…[74] Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Ở Việt Nam diện tích lúa cạn chiếm 7,5% diện tích trồng lúa , đƣợc phân bố ở các tỉnh miền núi phía Bắc (210.000 ha), vùng duyên hải Trung Bộ (77.000 ha), vùng Cao Nguyên (128.000 ha), vùng Đông Nam Bộ (233.000 ha) và một số tỉnh đồng bằng Sông Cƣ̉u Long (2.000 ha) [21]. 1.1.4. Thành phần hoá sinh của hạt lúa Trong hạt lúa khô có 1,79 – 3,07 % lipit, 5,5 – 13% protein, 62,40 – 82,51%, tinh bột, 5,7% tro và 0,48 – 1,19% đƣờng. Ngoài ra còn chứa một số chất khoáng và vitamin, nhất là vitamin nhóm B nhƣ: B1, B2, B6, PP... lƣợng vitamin B1 là 0,45mg/100g hạt, trong đó ở phôi chiếm 47%, vỏ cám 34,5%, ở hạt gạo chỉ có 3,8% nên nếu khi xát kĩ hàm lƣợng B1 trong hạt gạo còn rất thấp [20], [21], [22], [43]. Lipit chủ yếu tập trung ở vỏ gạo. Nếu ở gạo xay có hàm lƣợng lipit là 2,02% khối lƣợng khô thì gạo xát lƣợng lipit chỉ còn 0,52%. Hàm lƣợng lipit liên quan đến chất lƣợng trên hai phƣơng diện là giá trị dinh dƣỡng và giá trị bảo quản. Hàm lƣợng lipit càng cao thì bảo quản càng phức tạp [13], [63]. Tinh bột chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần vật chất khô trong hạt lúa, chiếm 62,4 – 82,51%, nó là nguồn chủ yếu cung cấp calo [20]. Tinh bột đƣợc cấu tạo bởi amylose và amylopectin. Amylose có cấu tạo mạch thẳng có nhiều ở gạo tẻ, độ dẻo thấp. Amylopectin có cấu tạo mạch nhánh có nhiều ở gạo nếp tạo nên độ dẻo đặc trƣng ở cơm [11], [15]. Protein trong hạt lúa chiếm từ 5,5 - 13,0% khối lƣợng khô của hạt. Khoảng 80% protein là glutelin, 18 – 20% là prolalin, 2 – 8% là globulin, abumin chiếm 5%. Glutelin là một loại protein quan trọng, có thành phần axit amin cân đối với gần 3% lizin, khối lƣợng phân tử lớn (20 - 22KDa và 35 - 37KDa). Prolamin gạo là một trong những protein dễ tan, dạng chính là 13KDa còn lại là những thành phần phụ, thành phần axit amin rất giàu glutamin, prolin, lơxin nhƣng thấp về metionin, cystein, threonin và tyrozin. Globulin là thành phần chính của protein trong phôi hạt thóc, khối lƣợng phân tử 26 KDa [73]. Albumin trong gạo là loại protein không đồng nhất, gồm nhiều thành phần điện di và phân li mạnh [58]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Trong lúa nƣớc hàm lƣợng protein chiếm từ 5,50 – 10,77%, các giống lúa cạn thì hàm lƣợng cao hơn từ 8,00 – 11,62%, lúa nếp cao hơn lúa tẻ và lúa thơm cao hơn lúa thƣờng. Hàm lƣợng protein trong hạt lúa không cao nhƣng là protein dễ tiêu hoá và hấp thu với ngƣời và vật nuôi . Trong hạt lúa protein có 17 loại axit amin trong đó có các axit amin không thay thế là : valine, lơxin, isolơxin, metionin, phenylalanin, lizin, threonin [13]. Kỹ thuật điện di cho phép phân tách hỗn hợp phức hệ protein thành những tiểu phần khác nhau dựa trên nguyên tắc tốc độ dịch chuyển khác nhau theo khối lƣợng của tiểu phần đó. Dựa vào các băng điện di có thể so sánh thành phần điện di giữa các mẫu nghiên cứu, xác định tính đa dạng sinh học trên cơ sở phân tích đa hình protein [33], [34]. Khi nghiên cứu đặc điểm sinh hoá của các giống lúa cạn địa phƣơng cho thấy các giống lúa nghiên cứu có số băng điện di khác nhau dao động từ 17- 20 băng, trong đó cao nhất là giống nếp lai tẻ là 20 băng. Điều này chứng tỏ hàm lƣợng của các tiểu phần protein hạt ở giống lúa nếp lai tẻ cao hơn so với các giống lúa khác [58]. Nghiên cứu về thành phần hoá sinh hạt của một số giống lúa cạn trồng phổ biến ở Bắc Kạn và Cao Bằng, kết quả phân tích thành phần điện di protein dự trữ hạt đã xác định đƣợc sự khác nhau về số lƣợng các băng điện di giữa các giống (17- 21 băng), protein dự trữ hạt biểu hiện tính đa hình [37]. 1.1.5. Đặc điểm sinh học của cây lúa cạn. Thời gian sinh trƣởng và phát triển của cây lúa kể từ khi tra hạt đến khi thu hoạch gồm 3 thời kỳ. Thời kỳ sinh trƣởng sinh dƣỡng, thời kỳ sinh trƣởng sinh thực, thời kì hình thành hạt và chín (IRRI 1991)[76]. Thời kỳ sinh trƣởng sinh dƣỡng, cây lúa hình thành nhánh, lá và một phần thân, cần có sự cân đối giữa sinh trƣởng nhánh và sinh trƣởng lá sao cho số nhánh mới sinh ra đều có khả năng tạo ra đƣợc số lá vốn có của giống. Yếu tố này rất quan trọng vì nó tạo ra số nhánh hữu hiệu tạo năng xuất cho cây [76]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Thời kỳ sinh trƣởng sinh thực. Cây lúa hình thành hoa, tập hợp hoa thành bông lúa, thời tiết thuận lợi thì số hoa của bông lúa sẽ hình thành tối đa tạo điều kiện để có nhiều hạt trên bông [76]. Thời kỳ chín, ở các hoa lúa đƣợc thụ tinh xảy ra quá trình tích lũy tinh bột và sự phát triển hoàn thiện của phôi (nếu dinh dƣỡng đủ, thời tiết tốt, không sâu bệnh) – sự hình thành hạt chắc – sản phẩm chủ yếu của cây lúa sẽ cao [76]. Thời gian sinh trƣởng và phát triển của cây lúa cạn giao động từ 3 đến 5 tháng. Đặc điểm hình thái của cây lúa gồm 3 phần chính, rễ, thân, lá. Rễ lúa gồm 3 loại chính (rễ mầm, rễ phụ, rễ bất định), rễ mầm hình thành từ rễ phôi tồn tại 5 - 7 ngày sau đó rụng đi, rễ phụ hình thành từ các đốt trên của thân lúa phát triển nhanh thành bộ rễ chùm và làm nhiệm vụ chính trong hút chất dinh dƣỡng phục vụ cho đời sống của cây lúa, rễ bất định là loại rễ phụ hình thành từ các đốt phía trên cao của thân chúng tham gia một phần vào hút chất dinh dƣỡng. Số lƣợng rễ, số lông rễ, độ lớn của rễ phụ thuộc vào từng giống, những giống lúa cạn có số lƣợng rễ, độ lớn, độ dài và đặc biệt có độ dày của vỏ rễ lớn hơn nhiều so với lúa nƣớc. Điều đó giúp lúa cạn có bộ rễ ăn sâu và phát triển tốt trong điều kiện khô hạn [21]. Trong số các tính trạng của bộ rễ đƣợc nghiên cứu thì tính trạng tổng chiều dài rễ có mối liên quan chặt chẽ đến tính chịu hạn của lúa nƣơng. Khả năng thu thập nƣớc và cung cấp đủ nƣớc thông qua rễ tới các bộ phận của cây trong điều kiện khó khăn về nƣớc đƣợc coi là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá tính chịu hạn [30]. Thân lúa: Có thân giả và thân thật. Thân giả do các bẹ lá kết hợp với nhau tạo thành (thời kỳ lúa con gái). Thân thật chỉ hình thành khi cây lúa vƣơn đốt, phần cuối của thân là bông lúa (IRRI, 1991) [76]. Lá lúa có hai loại, lá không hoàn toàn và lá hoàn toàn (lá thật). Lá lúa có màu sắc khác nhau, tùy giống. Đa số lá có màu xanh và ở các mức độ khác nhau. Trên thân lúa, lá ra kế tục nhau và xếp so le. Số lá trên thân chính phụ thuộc vào số gióng. Giống có thời gian sinh trƣởng càng dài thì số lá càng nhiều. Chỉ số diện tích lá của lúa cạn thƣờng cao nhƣng tổng số lá trên cây lại ít hơn so với lúa nƣớc [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Lúa cạn có bộ lá dày hơn, tuy hô hấp nhiều nhƣng giữ nƣớc tốt. Trên bề mặt lá có nhiều lông do vậy có thể hấp thụ sƣơng đêm. Đặc điểm của các giống lúa cạn khi độ ẩm đất giảm thì lá cuộn lại và khí khổng đóng lại để giảm sự mất nƣớc [78]. Việc đóng mở khí khổng đƣợc điều khiển thông qua điều chỉnh áp suất thẩm thấu hoặc hormon ABA (acid Abscisic) [40]. Bông lúa, có nhiều hình dạng khác nhau (bông thẳng, bông cong đầu, bông cong tròn). Bông lúa đƣợc phát triển từ cuối đốt cuối của thân, trải qua các thời kỳ phân hóa, trổ, phơi màu, thụ phấn, chín sữa, chín sáp và chín hoàn toàn [6]. Tóm lại, trong đời sống cây lúa, mỗi yếu tố cấu thành năng xuất đƣợc xác định bởi mỗi giai đoạn sinh trƣởng xác định: - Số bông/m2 đất phụ thuộc vào mật độ cấy (mật độ tra hạt), khả năng đẻ nhánh hữu hiệu, đƣợc quyết định ngay giai đoạn đầu. - Số hạt/bông đƣợc quyết định trong thời kỳ làm đòng. - Tỷ lệ hạt chắc đƣợc quyết định vào trƣớc, trong và sau khi trỗ bông. - Khối lƣợng 1000 hạt do giống quyết định, nhƣng lƣợng bức xạ mặt trời ở kỳ sau trỗ, đặc biệt là nƣớc và dinh dƣỡng có ảnh hƣởng nhất định đến tính trạng này. Các điều kiện thời tiết, chăm sóc, phân bón có ảnh hƣởng đến từng yếu tố năng suất. Hiểu biết về mối quan hệ đó là điều mấu chốt và cần thiết để tác động các biện pháp kỹ thuật, nhằm nâng cao năng suất lúa có hiệu quả. 1.2. Hạn và cơ chế chịu hạn của thực vật 1.2.1. Khái niệm về hạn Hạn đối với thực vật là khái niệm dùng để chỉ sự thiếu nƣớc do môi trƣờng gây nên trong suốt cả quá trình hay trong tƣ̀ng giai đoạn , làm ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của cây. Mƣ́c độ khô hạn do môi trƣờng gây nên ảnh hƣởng trƣ̣c tiếp đến sƣ̣ phát triển của cây, nhẹ thì làm giảm năng suất , nặng thì có thể dẫn đến tình trạng huỷ hoại cây cối và mùa màng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 Theo Robert và CS (1991) hạn đƣợc xem là nhân tố gây thiệt hại lớn nhất đối với năng suất lúa . Trên thế giới , thiệt hại do khô hạn hàng năm gây ra đối với sản xuất lúa khoảng 1,024 triệu đôla [88]. 1.2.2. Tính chịu hạn và tác động của hạn đến thực vật 1.2.2.1. Tính chịu hạn của thực vật Mỗi loài cây trồng có một giới hạn nhất định đối với các nhân tố sinh thái của môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ (nóng, lạnh), nƣớc, phèn, độ mặn… Nếu ở ngoài giới hạn đó, thì các nhân tố sinh thái này có thể gây hại, cản trở cho sự sinh trƣởng và phát triển của cây dẫn đến giảm năng suất sinh học [1]. Trong những nhân tố sinh thái của môi trƣờng thì nƣớc là một nhân tố giới hạn quan trọng của cây trồng, là sản phẩm khởi đầu, trung gian và cuối cùng của các quá trình chuyển hoá sinh hoá diễn ra trong cơ thể thực vật. Nƣớc là môi trƣờng để các phản ứng trao đổi chất diễn ra, nhƣ vậy nƣớc có ý nghĩa sinh thái và sinh lý quyết định đời sống của thực vật. Thiếu nƣớc trƣớc tiên ảnh hƣởng đến sự cân bằng nƣớc của cây, từ đó ảnh hƣởng đến các chức năng sinh lý nhƣ quang hợp, hô hấp, dinh dƣỡng khoáng do đó ảnh hƣởng đến sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Mức độ tổn thƣơng của cây trồng do thiếu nƣớc gây ra có nhiều mức độ khác nhau nhƣ: chết, chậm phát triển hay phát triển tƣơng đối bình thƣờng. Những cây có khả năng duy trì sự phát triển và cho năng suất tƣơng đối ổn định trong điều kiện khô hạn gọi là cây chịu hạn. Khả năng của thực vật có thể giảm thiểu mức độ tổn thƣơng do thiếu hụt nƣớc gây ra gọi là tính chịu hạn [1]. Hạn là một hiện tƣợng thƣờng xuyên xảy ra trong thiên nhiên và liên quan trực tiếp đến vấn đề nƣớc trong thực vật. Khái niệm “khô hạn” dùng để chỉ tình trạng mất nƣớc của cây. Hiện tƣợng mất nƣớc có thể do tác động sơ cấp, là kết quả của sự thiếu nƣớc trong môi trƣờng hoặc có thể do tác động thứ cấp đƣợc gây ra bởi nhiệt độ thấp, sự đốt nóng, hay do độ mặn của muối…Tuy nhiên rất khó có thể xác định đƣợc thế nào là một trạng thái hạn đặc trƣng vì mức độ hạn do môi trƣờng gây nên khác nhau theo từng mùa, từng năm, từng vùng địa lý và không thể dự đoán trƣớc đƣợc [81]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 1.2.2.2. Các nguyên nhân gây hạn * Hạn không khí Hạn không khí thƣờng có đặc trƣng là nhiệt độ cao (390- 420) và độ ẩm thấp (<65%). Hiện tƣợng này thƣờng gặp ở nhƣ̃ng tỉnh Miền Trung nƣớc ta vào nhƣ̃ng đợt gió Lào và ở vùng Bắc Bộ vào cuối thu , đầu đông . Hiện tƣợng này cũng xuất hiện ở một số nƣớc trên thế giới nhƣ gió Chamsin ở Israel , gió Mistral ở miền nam nƣớc Pháp…làm ảnh hƣởng nghiêm trọng đến một số loại cây trồng nhƣ phong lan, cam, chanh, đậu tƣơng...[7]. Hạn không khí ảnh hƣởng trực tiếp lên các bộ phận của cây trên mặt đất nhƣ hoa, lá, chồi non…Đối với thƣ̣c vật nói chung và cây lúa nói riêng thì hạn không khí thƣờng gây ra hiện tƣợng hé o tạm thời, vì nhiệt độ cao , ẩm độ thấp làm cho tốc độ thoát hơi nƣớc nhanh vƣợt quá mƣ́c bình thƣờng , lúc đó rễ hút nƣớc không đủ để bù đắp lại lƣợng nƣớc mất , cây lâm vào trạng thái mất cân bằng về nƣớc . Mƣ́c độ phản ƣ́ng của cây đối với sƣ̣ mất nƣớc sẽ tuỳ thuộc vào giai đoạn phát triển của chúng. Riêng đối với cây lúa hạn gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đặc biệt vào thời kỳ bắt đầu hình thành các cơ quan sinh sản cho đến lúc kết thúc quá trình thụ phấn . Hạn không khí gây hại nhất ở giai đoạn lúa phơi màu và thậm chí gây nên mất mùa nếu gặp phải đợt nhiệt độ cao và độ ẩm không khí thấp (mặc dù nƣớc trong đất không thiếu ) làm cho hạt phấn không có kh ả năng nẩy mầm , quá trình thụ tinh không xẩy ra và hạt bị lép [7]. * Hạn đất Mƣ́c độ khô hạn của đất tuỳ thuộc vào sƣ̣ bốc hơi nƣớc trên bề mặt và khả năng giƣ̃ nƣớc của đất . Hạn đất sẽ làm cho áp suất thẩm thấu của đấ t tăng cao đến mƣ́c cây không cạnh tranh đƣợc nƣớc của đất làm cho cây không thể lấy nƣớc vào tế bào qua rễ , chính vì vậy hạn đất thƣờng gây nên hiện tƣợng cây héo lâu dài . Hạn đất có thể xẩy ra ở bất kỳ vùng đất nào và thƣờng xẩy ra nhiều ở nhƣ̃ng vùng có điều kiện khí hậu , địa hình, địa chất, thổ nhƣỡng đặc thù nhƣ sa mạc ở Châu Phi ; đất trống đồi trọc của châu Á ; mùa ít mƣa và nhiệt độ thấp ở châu Âu . Tóm lại hạn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 đất tác động trƣ̣ c tiếp lên bộ phận rễ của cây làm ảnh hƣởng rất lớn đến quá trình sinh trƣởng và phát triển của chúng [7]. * Hạn toàn diện Hạn toàn diện là hiện tƣợng khi có cả hạn đất và hạn không khí xẩy ra cùng một lúc . Trong trƣờng hợp này cùng với sự mất nƣớc do không khí làm cho hàm lƣợng nƣớc trong lá giảm nhanh dẫn đến nồng độ dịch bào tăng lên , mặc dù sƣ́c hút nƣớc tƣ̀ rễ của cây cũng tăng nhƣng lƣợng nƣớc trong đất đã cạn kiệt không đủ cung cấp cho cây . Hạn toàn diện thƣờng dẫn đến hiện tƣợng héo vĩnh viễn , cây không có khả năng phục hồi [7]. Ở nƣớc ta , hiện tƣợng hạn toàn diện thƣờng xẩy ra ở các tỉnh miền Trung (Nghệ An , Quảng Trị…) gây nên thiệt hại đá ng kể về năng suất lúa vào các tháng cuối hè. 1.2.2.3. Tác động của hạn đến thực vật Ảnh hƣởng của hạn trƣớc hết là sự mất nƣớc của tế bào và mô . Bất kỳ sƣ̣ mất nƣớc nào cũng dẫn đến sƣ̣ vi phạm chế độ nƣớc và gây sƣ̣ thiếu hụt nƣớc trong tế bào. Sƣ̣ thiếu hụt nƣớc càng lớn thì ảnh hƣởng càng xấu . Thiếu nƣớc nhẹ chỉ ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng . Thiếu nƣớc nặng gây nên biến đổi hệ keo nguyên sinh chất kéo theo quá trình già hoá tế bào, làm cho cây bị héo . Khi bị khô nguyên sinh chất bị đƣ́t vỡ cơ học dẫn đến tế bào bị tổn thƣơng và chết [7]. 1.2.3. Cơ sở sinh lý, sinh hoá và di truyền của tính chịu hạn ở cây lúa 1.2.3.1. Cơ sở sinh lý của tính chịu hạn Để chống lại khô hạn thực vật có những biến đổi sinh lý, hoá sinh nhằm không để mất nƣớc. Có hai cơ chế bảo vệ thực vật tồn tại trong môi trƣờng thiếu nƣớc là cơ chế tránh mất nuớc và cơ chế chịu mất nƣớc. Cơ chế tránh mất nƣớc liên quan đến đặc điểm cấu trúc và hình thái của bộ rễ [1]. Khả năng thu nhận nƣớc chủ yếu phụ thuộc vào chức năng của bộ rễ . Những cây chịu hạn có bộ rễ khỏe, dài, mập, có sức xuyên sâu sẽ hút đƣợc nƣớc ở những nơi sâu, xa trong đất, hoặc lan rộng với số lƣợng lớn để tăng diện tích tìm kiếm nƣớc [7]. Bên cạnh đó cây có hệ mạch phát triển, dẫn nƣớc lên các cơ quan thoát Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 nƣớc, có hệ mô bì phát triển sẽ hạn chế sự mất nƣớc của cây do sự thoát hơi nƣớc. Cơ chế tránh mất nƣớc phụ thuộc vào khả năng thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm mất nƣớc một cách tối đa [1], [40]. Trong điều kiện khô hạn, áp suất thẩm thấu của dịch bào đƣợc điều chỉnh tăng lên, giúp cho tế bào thu nhận đƣợc những phân tử nƣớc ít ỏi còn lại trong đất. Bằng cơ chế nhƣ vậy, thực vật có thể vƣợt qua đƣợc tình trạng hạn cục bộ [86]. Cơ chế chịu mất nƣớc liên quan đến những thay đổi sinh hoá diễn ra trong tế bào, nhằm sinh tổng hợp các chất bảo vệ hoặc nhanh chóng bù lại sự thiếu hụt nƣớc. Tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào còn thông qua tích luỹ các chất hoà tan, các protein, các axit amin ví dụ nhƣ axit amin prolin, mannitol, fructose, K+, các enzym phân hủy gốc tự do… Sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu có hai chức năng: - Giữ và lấy nƣớc vào trong tế bào và ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+. - Thay thế vị trí nƣớc nơi xảy ra các phản ứng sinh hoá, tƣơng tác với lipit hoặc protein trong màng, ngăn chặn sự phá huỷ màng và các phức protein [1]. 1.2.3.2. Cơ sở sinh hoá của tính chịu hạn Thành phần hoá sinh của hạt nhƣ: Hàm lƣợng protein, đƣờng tan, enzym, thành phần axit amin,… không chỉ là cơ sở để dánh giá chất lƣợng hạt mà còn là các chỉ tiêu liên quan đến khả năng chống chịu của cây trồng [25], [26], [49]. Trong cơ thể thực vật, đƣờng tập chung nhiều ở thành tế bào, mô nâng đỡ, mô dự trữ, là sản phẩm của quá trình quang hợp ở tế bào. Đƣờng có nhiều vai trò quan trọng trong cơ thể sống, đó là cung cấp năng lƣợng cho cơ thể, cấu trúc và tạo hình, góp phần bảo vệ tƣơng tác đặc hiệu cho tế bào… Theo nhiều nghiên cứu, hàm lƣợng đƣờng tan có liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu của cây trồng. Đuờng tan là một trong các chất tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào. Những nghiên cứu đã thấy rằng, tăng áp suất thẩm thấu của tế bào thông qua các phân tử đƣờng tan thì làm tăng khả năng chống chịu của cây trồng [29], [41], [65]. Tác giả Đỗ Thị Dƣơng đã nghiên cứu đặc điểm sinh hoá của năm giống lúa cạn đã nhận thấy khả năng chống chịu của các giống lúa có tƣơng quan thuận với hàm lƣợng đƣờng tan và protein [11]. Ngô Thị Liêm và Nguyễn Thị Sâm khi nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 hình thái, hoá sinh hạt của một số giống lạc, nhận thấy có mối tƣơng quan thuận giữa hàm lƣợng đƣờng tan, protein, hoạt độ enzym với khả năng chịu hạn [24], [45]. Trên đối tƣợng là cây đậu tƣơng, Hà Tiến Sỹ (2007) đánh giá khả năng chịu hạn của một số giống đỗ tƣơng địa phƣơng của tỉnh Cao Bằng ở giai đoạn mầm đã nhận thấy khả năng chịu hạn của các giống có tƣơng quan thuận với tỷ lệ tăng của hàm lƣợng đƣờng tan, hoạt độ enzym amylase [46]. Axit amin prolin có vai trò quan trọng trong điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào, đồng thời nó là một axit amin ƣa nƣớc có khả năng giữ và lấy nƣớc cho tế bào, ngăn chặn sự xâm nhập của ion Na+, tƣơng tác với protein và lipit màng, ngăn chặn sự phá huỷ của màng và phức protein khác. Các kết quả nghiên cứu cho thấy khi cây trồng gặp hạn thì cây giảm tổng hợp protein và tăng tổng hợp prolin [50], [66], [85]. Sự gia tăng hàm lƣợng prolin ở thực vật khi gặp phải điều kiện bất lợi nhƣ do hạn, mặn, nóng… có liên quan đến các gen tổng hợp prolin và các gen điều khiển quá trình vận chuyển prolin. Khi môi trƣờng đất thiếu nƣớc đến mức áp suất thẩm thấu của tế bào không thể cạnh tranh đƣợc với áp suất thẩm thấu của đất thì gen tham gia vào quá trình tổng hợp prolin sẽ đƣợc hoạt hoá, xúc tiến cho việc tổng hợp prolin và vận chuyển prolin đến các mô, tế bào có nhu cầu. Khi cây ở tình trạng bình thƣờng (không chịu tác động của stress môi trƣờng) thì prolin trong cây sẽ đƣợc chuyển hoá thành glutamat. Còn khi cây rơi vào tình trạng thiếu nƣớc do hạn thì glutamat sẽ đƣợc chuyển hoá thành prolin [87], [90]. Enzym là chất xúc tác sinh học có hiệu quả cao. Mỗi một loại enzym xúc tác cho một quá trình chuyển hoá theo một kiểu phản ứng đặc hiệu nhất định. Trần Thị Phƣơng Liên (1999) khi xử lí nhiệt độ cao thì ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của các giống đậu tƣơng chịu hạn, không ảnh hƣởng đến các giống chịu nóng, còn điều kiện áp suất thẩm thấu cao thì đều ảnh hƣởng đến enzym này ở các giống [26]. Các nghiên cứu khi xử lý hạn sinh lý ở giai đoạn nảy mầm đều nhận thấy giống có hàm lƣợng protein cao thì hoạt độ enzym protease cũng cao. Tỷ lệ tăng hoạt độ enzym protease sau hạn so với trƣớc gây hạn tỷ lệ thuận với khả năng chống chịu của các giống [9], [38]. Trong giai đoạn nảy mầm enzym α – amylase là một trong những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 enzym quan trọng trong quá trình thuỷ phân tinh bột thành dextrin và mantose. Sự tăng hoạt độ của α – amylase làm tăng hàm lƣợng đƣờng tan trong cây vì vậy làm tăng áp suất thẩm thấu trong tế bào nên khả năng chịu hạn của cây cũng tăng lên [17]. Ngoài ra đã có nhiều công trình nghiên cứu vai trò của axit abscisic (ABA) [91]. Skiver và Mundy (1990) đã nghiên cứu xác định chức năng của một số gen trong việc giải mã các protein và cơ chế biểu hiện gen ở thực vật khi gặp mất cân bằng thẩm thấu xử lý ABA. Nhƣ vậy cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp không chỉ liên quan đến đặc điềm hình thái giải phẫu của cây mà còn liên quan đến những thay đổi thành phần hoá sinh trong tế bào và sự điều chỉnh các gen liên quan đến tính chịu hạn của thực vật. 1.2.3.3. Cơ chế phân tử của tính chịu hạn Để khai thác tối đa tiềm năng của các giống cây trồng cần nắm vững phản ứng của các giống cây trồng đối với các điều kiện ngoại cảnh. Phản ứng của cây trồng rất đa dạng và phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau, trong đó có kiểu gen và mức độ khắc nghiệt của điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Biểu hiện của quá trình này là việc sinh tổng hợp của một loạt các chất trong tế bào liên quan đến điều hoà áp suất thẩm thấu của tế bào. Đƣợc quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là các protein. sản phẩm của quá trình biểu hiện gen. Sự biểu hiện của các gen liên quan đến stress phụ thuộc vào khả năng nhận biết stress. Bằng chứng là tăng cƣờng các chất điều khiển phản ứng của cây trồng đối với stress. Ví dụ nhƣ ABA, axit jasmonic, ethylen, Ca++,… Mức độ biểu hiện của một số gen tăng lên, một số yếu hẳn đi. Điều hoà biểu hiện của các gen này khi gặp stress đang đƣợc tăng cƣờng nghiên cứu ở các giai đoạn khác nhau: trƣớc phiên mã và sau phiên mã [25]. Nghiên cứu tính chịu hạn của thực vật theo cơ chế chịu mất nƣớc, các nhà khoa học nhận thấy rằng các nhóm chất liên quan đến việc bảo vệ cấu trúc của tế bào và điều chỉnh áp suất thẩm thấu có vai trò đặc biệt quan trọng. Những nhóm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 chất đặc biệt quan tâm đến là protein sốc nhiệt (heat shock protein - HSP) trong đó có các chất môi giới phân tử - MGPT (molecular chaperone), Ubiquitin,… Protein sốc nhiệt ở hầu hết các loại thực vật nhƣ: lúa mỳ, lúa gạo, đậu nành, hành tỏi, … chúng chiếm 1% protein tổng số trong lá của các loài thực vật này. HSP đƣợc tổng hợp khi tế bào gặp điều kiện cực đoan nhƣ hạn, nhiệt độ cao, độ muối cao. Sự suất hiện của HSP có chức năng ngăn cản hoặc sửa chữa sự phá huỷ do stress nóng và mở rộng ngƣỡng với sự chống chịu nhiệt độ cao. Trong các tế bào thực vật, HSP trong tế bào chất tập chung thành các hạt sốc nhiệt (Heat Shock Granules – HSG). Ngƣời ta cho rằng các HSG gắn kết trên các ARN – polymease để ngăn cản sự phiên mã tổng hợp mARN trong quá trình bị stress nóng. Sau sốc nóng các HSG phân tán và liên kết dày đặc với các ribosome hoạt động sinh tổng hợp protein [25]. Dựa vào khối lƣợng phân tử HSP đƣợc chia thành 6 nhóm: HSP110, HSP100, HSP90, HSP70, HSP60, HSP8,5. Trong đó nhóm HSP70 và HSP60 có đại diện của chất MGPT, HSP8,5 (Ubiquitin) có chức năng bảo vệ cho tế bào nhƣng không phải là MGPT, chúng có hoạt tính protease và thực hiện chức năng phân giải protein không có hoạt tính enzym, ngăn chặn các protein gây độc cho tế bào. Ubiquitin có khối lƣợng phân tử thấp, ít chịu ảnh hƣởng của nhiệt độ nên chúng có vai trò tự sửa chữa khi gặp các yếu tố cực đoan nhất là nhiệt độ cao. MGPT làm một nhóm gồm nhiều loại protein khác nhau nhƣng chúng đều có chức năng tham gia tạo cấu trúc không gian đúng cho protein trong tế bào . MGPT đƣợc tăng cƣờng tổng hợp trong điều kiện cực đoan do nhu cầu cấp thiết của tế bào nhất là do tác động của nhiệt độ. Các nhóm HSP90, HSP100 đều có tính bảo thủ cao, có hoạt tính ATPase. Một số tìm thấy trong tế bào bình thƣờng, nhƣng phần lớn chúng sinh ra khi gặp các điều kiện ngoại cảnh bất lợi nhƣ hạn, nóng, lạnh. Chức năng chính của chúng là ngăn chặn sự co cụm của protein và tái hoạt hoá protein biến tính [25], [32]. Protein LEA (Late embryogenesis abundant protein) là protein tổng hợp với số lƣợng lớn ở giai đoạn cuối của quá trình phát triển phôi và là một trong những Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 nhóm protein quan trọng liên quan đến điều kiện mất nƣớc của tế bào. Nhóm gen mã hoá loại protein LEA còn đóng vai trò quan trọng trong tính chịu khô hạn của hạt. Khi điều kiện mất nƣớc xảy ra, LEA tham gia vào bảo vệ màng tế bào, cô lập ion, ổn định pH tế bào [25], [27], [32]. Nghiên cứu tính chịu hạn về mặt sinh lý, hoá sinh, cấu trúc tế bào nhận thấy một loạt những biến đổi sâu sắc ở tất cả các mức độ khác nhau trong các giai đoạn phát triển khác nhau. Điều đó chứng tỏ tính chống chịu là đa gen, tức là do nhiều gen quyết định, biểu hiện trong các giai đoạn phát triển khác nhau của cây. Ngày nay trên thực tế vẫn chƣa tìm đƣợc gen thực sự quyết định tính chịu hạn mà mới chỉ tìm thấy các gen liên quan đến tính chịu hạn. 1.2.4. Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa Nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây lúa đã thu hút đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Silva và Cs (1986) nghiên cứu đặc điểm hình thái của bộ rễ lúa nhận thấy tổng chiều dài bộ rễ có liên quan chặt chẽ đến tính chịu hạn của lúa nƣơng [84]. Sau đó các nghiên cứu về đặc điểm sinh lý, hoá sinh liên quan đến khả năng chịu hạn của lúa đƣợc quan tâm. Đinh Thị Phòng (2001) đã chọn, tạo đƣợc giống lúa DR1 và DR2 cho năng suất cao, ổn định, có khả năng chịu hạn, chịu lạnh hơn hẳn so với giống lúa gốc bằng phƣơng pháp chọn dòng tế bào soma [40]. Bằng xử lý mô sẹo lúa một tuần tuổi bằng NaCl , Lê trần Bình và Cs (1998) đã chọn đƣợc hai dòng lúa có khả năng chịu muối là C0 và C8 [1]. Lê Xuân Đắc (1998) xử lý lạnh hai giống lúa C71 và TK90 ở nhiệt độ 1±0,50C đã thu đƣợc một số dòng lúa có khả năng chịu lạnh [5]. Nguyễn Thu Hoài (2005) nghiên cứu khả năng chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phƣơng thu thập ở Bắc Kạn, Cao Bằng, Sơn La đã so sánh đƣợc khả năng chịu hạn của các giống lúa để làm vật liệu khởi đầu cho việc chọn, tạo các giống lúa [17]. Cũng theo hƣớng nghiên cứu này Bùi Thị Thu Thuỷ (2006) đã đánh giá đƣợc khả năng chịu hạn của các giống lúa CR203, U17, KD18, BT [54]. Price và Cs (2002) sử dụng RFLP và AFLP, SSR đã xác định đƣợc 142 chỉ thị phân tử liên quan đến tính trạng số lƣợng của cây lúa cạn có khả năng tránh hạn [83]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Từ thực trạng đang mất dần nguồn gen lúa cạn, đến nay đã có nhiều công trình sƣu tập đánh giá khả năng chịu hạn, đặc điểm hình thái, hóa sinh của các giống lúa nhằm bảo tồn nguồn gen quý. Đó là công trình nghiên cứu của Nguyễn Thu Hà và Cs (2003) về 47 giống lúa cạn sƣu tập tại các tỉnh phía Bắc [14], Trần Văn Thuỷ (1999) đánh giá nguồn gen cây lúa ở Tây Nguyên [53]. Các công trình nghiên cứu của Đỗ Thị Dƣơng (2001) [11], của Nguyễn Thị Hải Yến (2002) [58], Vì Thị Xuân Thủy (2008) [61], của Nguyễn Đức Hoàng (2008) [18]... đã nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa hạt, phân tích đa hình protein hạt và khả năng chịu hạn của các giống lúa. 1.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thức vật vào việc đánh giá khả năng chống chịu ở cây lúa 1.3.1. Hệ thống nuôi cấy Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể đƣợc sử dụng để đánh giá khả năng chống chịu của cây trồng ở nhiều mƣ́c độ khác nhau nhƣ mƣ́c gen, mƣ́c tế bào riêng rẽ , các loại mô , cơ quan nuôi cấy phân lập và cây hoàn chỉnh . Sƣ̉ dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thƣ̣c vật có thể nghiên cƣ́u một cách đơn độc hay tổ hợp các tác động bất lợi mà ngoài tự nhiên khó thực hiện đƣợc , qua đó cho phép tìm hiểu và xác định bản chất sinh học của tính chống chịu [1]. Đối với mỗi loại thực vật nhất thiết phải nghiên cứu tối ƣu kỹ thuật nuôi cấy thích hợp cho việc đánh giá . Nhƣ̃ng hệ thống nuôi cấy thƣờng đƣợc sƣ̉ dụng là nuôi cấy mô sẹo , nuôi cấy tế bào huyền phù , nuôi cấy tế bào trần . Đánh giá khả năng chống chịu bằng nuôi cấy mô có thể đƣợc tiến hành theo hai cách : trƣ̣c tiếp và gián tiếp. Đa số trƣờng hợp ngƣời ta tiến hành đánh giá trực tiếp . Mô sẹo đƣợc gây stress bởi các tác nhân cƣ̣c đoan . Sau thời gian để mô sẹo phục hồi , đánh giá khả năng chống chịu thông qua các tế bào sống sót . Các tế bào trên đƣợc cấy chuyể n lên môi trƣờng tái sinh cây để tiếp tục đánh giá [5], [42]. Mô sẹo là khối các tế bào mô mềm có mức độ cấu trúc thấp , chƣa phân hoá , phân chia một cách hỗn loạn và có tính biến động di truyền cao . Nhiều tác giả đã thôn g báo nhận đƣợc cây tái sinh tƣ̀ mô sẹo qua nhiều lần cấy chuyển có sự thay đổi về nhiễm sắc thể (dị bội , đa bội ) và nhƣ̃ng biến đổi di truyền khác . Mặt khác nhƣ̃ng cây tái sinh tƣ̀ mô sẹo với nhƣ̃ng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 biến đổi di truyền phong phú lại rất có ý nghĩa trong chọn giống và nhƣ vậy vật liệu di truyền của cây đó trở nên phong phú hơn [1]. Hiện nay ngƣời ta đã tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh tƣ̀ mô sẹo với hiệu suất rất cao ở nhiều loại cây trồng có ý nghĩa kinh tế nhƣ : lúa nƣớc , lúa mì , lúa mạch , thuốc lá, củ cải đƣờng, mía, chuối, đu đủ... 1.3.2. Một số thành tựu về đánh giá khả năng chống chịu và chọn dòng tế bào soma bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro Nhƣ̃ng yếu tố bất lợ i của môi trƣờng nhƣ nhiệt độ cƣ̣c đoan (nóng, lạnh), lƣợng mƣa không phù hợp (hạn), độc tố đất gây phèn (nhôm, pH thấp), mặn (muối NaCl)…là nhƣ̃ng yếu tố gây hạn chế tới năng suất cây trồng. Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào th ực vật đã đạt đƣợc những thành công nhất định trong việc nghiên cƣ́u khả năng chống chịu của cây trồng nhƣ : chịu hạn [40], [41], chịu lạnh [5], chịu nhiệt độ cao [48], chịu muối NaCl [29]. Innis M.A., Gelfand D.H.,Sninsky J.J, White T.J (1990) tiến hành gây mất nƣớc mô sẹo lúa và đã nhận thấy ABA là chất làm tăng khả năng giƣ̃ nƣớc và chịu mất nƣớc của mô sẹo lúa . Nồng độ ABA thích hợp cho việc tiền xƣ̉ lý mô sẹo lúa là 10 -5M và thời gian xƣ̉ lý là 5 đến 7 ngày [77]. Bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo in vitro, Nguyễn Hoàng Lộc và CS (1992) đã thu đƣợc 4 dòng thuốc lá chịu NaCl 1%, các dòng này vẫn duy trì khả năng chịu NaCl sau 18 tháng nuôi cấy trên môi trƣờng không có NaCl và ở thế hệ thứ nhất (R1) [29]. Lê Xuân Đắc (1998), khi xử lý lạnh 2 giống lúa 71 và TK 90 ở nhiệt độ 1 0 C0,50C đã thu đƣợc một dòng lúa duy trì khả năng chịu lạnh có triển vọng làm giống [5] Đinh Thị Phòng (2001), Bằng phƣơng pháp thổi khô mô sẹo lúa của các giống lúa CR203, CH133, Lốc, X11, C70, đã thu đƣợc 271 dòng mô và 900 dòng cây xanh có khả năng chịu hạn , tạo thành các quần thể R 0 làm nguyên liệu cho việc chọn lọc [40]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Nguyễn Hoàng Lộc (1992) sƣ̉ dụng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo kết hợp với việc tiền xƣ̉ lý bằng ABA , manitol và saccharose đã thu đƣợc các dòng mô thuốc lá SC, SC2, SC3 có khả năng chịu mất nƣớc trên 90% trọng lƣợng tƣơi [29]. Nguyễn Thị Tâm (2004), bằng phƣơng pháp x ử lý mô sẹo các giống lúa CR203, CS4, Ml107, 79-1, CN2, ĐH60 ở nhiệt độ cao (400C, 420C) đã tạo ra đƣợc 197 dòng mô có khả năng chịu nóng và 520 dòng cây xanh [48]. Nghiên cƣ́u khả năng chịu hạn ở cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng đã và đang đƣợc nhiều tác giả quan tâm . Tuy nhiên việc ƣ́ng dung kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thƣ̣c vật trong việc nghiên cƣ́u khả năng chịu hạn vẫn còn nhiều hạn chế . Trong nhƣ̃ng năm gần đây , với sƣ̣ hoàn thiện về kỹ thuật và điều kiện nuôi cấy đã mở ra nhiều triển vọng cho việc nhiên cƣ́u khả năng chịu hạn ở các đối tƣợng cây trồng khác nhau, trong đó có cây lúa. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CƢ́U 2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu thực vật Sử dụng 5 giống lúa sƣu tầm ở Huyện Bắc Quang, tỉnh Hà Giang (Tên giống lúa theo tên địa phƣơng) bao gồm: Ngái nỏ, Khẩu tán, khẩu mang, Khẩu đen, Shan râu đƣợc trình bày ở bảng 2.1. Bảng 2.1. Các giống lúa cạn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu Stt Kí hiệu mẫu Tên địa phƣơng Địa điểm thu mẫu 1 NN Ngái nỏ Bắc Quang - Hà Giang 2 KT Khẩu tán Bắc Quang - Hà Giang 3 KM Khẩu mang Bắc Quang - Hà Giang 4 KĐ Khẩu đen Bắc Quang - Hà Giang 5 SR Shan râu Bắc Quang - Hà Giang 2.1.2. Hóa chất và thiết bị Hoá chất: Hóa chất sử dụng đƣợc mua ở các nƣớc Anh, Đức, Trung Quốc... gồm: Ethanol, agarose, Na2HPO4.12H2O, axit citric, NaOH, NaCl, CuSO4, Na2CO3, C4H4O6KNa.4 H2O, thuốc thử foling, petroleum ether, SDS, acrylamide, axit sunfosalysilic, các loại đệm phosphat citrat, tinh bột chuẩn, K3[Fe(CN)6], Fe2(SO4)3, H2SO4, gelatin, 2,4D (Axit Dichlorphenoxyacetic), -NAA (Axit Naphthylacetic), kinetin, các chất khoáng đa lƣợng , vi lƣợng, vitamin, prolin chuẩn, tinh bột chuẩn , toluen, và nhiều hóa chất thông dụng khác . Thiết bị: Các thiết bị chính đƣợc sử dụng để phân tích các chỉ tiêu gồm : Máy phân tích axit amin tƣ̣ động – HP aminno Quan SeriesII (Hewlett Parkard), máy Quang phổ UVvis Cintra 40 (Australia), bộ điện di protein của hãng Biorad (Mỹ), cân phân tích điện tử (Thụy Sỹ, Anh), máy ly tâm lạnh của hãng Hittich (Đức), máy đo pH (Metter Toledo), tủ lạnh sâu -850C, box cấy, nồi khử trùng Tomy (Nhật Bản), tủ sấy, máy khuấy trộn Voltex và một số thiết bị thông dụng khác . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu Các chỉ tiêu đƣợc nghiên cứu và phân tích đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Thƣ̣c vật học , Di truyền học, Công nghệ tế bào và Công nghệ gen Khoa Sinh- KTNN, trƣờng Đại học Sƣ phạm- Đại học Thái Nguyên. 2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u 2.2.1. Phƣơng pháp phân loại các giống lúa cạn Phân loại lúa nếp , lúa tẻ dựa theo phản ứng bắt màu với dung dịch KI 1% theo Lƣu Ngọc Trình, 1997 [56]. Phân loại loài phụ dựa theo tỷ lệ dài /rộng và khả năng bắt màu với thuốc thử phenol 10% của vỏ hạt thóc theo phƣơng pháp của Chang (1976) [70]. Đánh giá các tính trạng hình thái hạt thóc, đặc điểm chất lƣợng hạt gạo xay theo tiêu chuẩn của IRRI [76]. 2.2.2. Phƣơng pháp hóa sinh 2.2.2.1. Phương pháp phân tích hóa sinh ở giai đoạn hạt tiềm sinh (1) Xác định hàm lượng protein : Hàm lƣợng protein tan đƣợc xác định theo phƣơng pháp Lowry đƣợc mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1997) [3]. Hạt thóc đƣợc bóc vỏ, nghiền mịn, sấy đến khô tuyệt đối ở 1050C. Cân 0,05g mẫu cho vào eppendorf, thêm 1,5 ml đệm chiết phostphat citrat pH=10, lắc đều bằng voltex 10 phút, để qua đêm ở nhiệt độ 40C, đem ly tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút, rồi thu lấy dịch để làm thí nghiệm. Thí nghiệm lặp lại 3 lần. Dịch chiết đƣợc định mức lên 5ml bằng dung dịch đệm ph osphat citrat (pH=10) và đo phổ hấp thụ trên máy U Vvis Cintra ở bƣớc sóng 750nm với thuốc thử foling. Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo công thƣ́c : X (%) = A HSPL m   100 % (2.1) Trong đó: X: hàm lƣợng protein (% khối lƣợng khô) A: nồng độ thu đƣợc khi đo trên máy (mg/ml) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 HSPL: hệ số pha loãng m: khối lƣợng mẫu (mg) (2) Xác định hàm lượng đường tan : Hàm lƣợng đƣờng đƣợc xác định theo phƣơng pháp vi phân tích đƣợc mô tả trong tài liệu của Phạm Thị Trân Châu và Cs (1997) [3]. Mẫu đƣợc bóc vỏ, sấy khô tuyệt đối ở 1050C. Cân 0,5g mẫu nghiền trong 4ml nƣớc cất. Ly tâm 12000 vòng/phút ở 40C trong 30 phút, thu dịch. Hàm lƣợng đƣờng tan đo phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 585 nm. Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc tính dựa trên đồ thị đƣờng chuẩn glucose. Tính kết quả tính theo công thƣ́c: X (%) = a b HSPL m   (%) (2.2) Trong đó: X: hàm lƣợng đƣờng tan (% khối lƣợng chất khô) a: mật độ quang đo đƣợc trên máy ở bƣớc sóng 585nm b: số ml dịch chiết HSPL: hệ số pha loãng m: khối lƣợng mẫu (mg) (3) Phương pháp xác định thành phần axit amin Hàm lƣợng axit amin đƣợc xác định trên máy HP - Amino Quant sƣ̉ dụng ortho- phtalandehyt tạo dẫn xuất đối với các axit amin bậc 1 và 9 – fluoreryl- metyl- clorofomat đối với các axit amin bậc 2. Mẫu đƣợc xƣ̉ lý theo phƣ ơng pháp thủy phân pha lỏng theo hƣớng dẫn sƣ̉ dụng máy phân tích axit amin tƣ̣ động. 2.2.2.2. Đánh giá khả năng chịu hạn sinh lý thông qua phân tích một số chỉ tiêu sinh hóa ở giai đoạn hạt nảy mầm (1) Chuẩn bị mẫu: Hạt của các giống lúa nghiên cứu sau khi xử lý nhiệt 350C trong 10 phút, ngâm nƣớc trong 24h sau đó ủ trong dung dịch MS chứa sorbitol 5 %. Hạt nẩy mầm sau các thời gian ủ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày đƣợc lấy để xác định hoạ t độ của enzym protease và hàm lƣợng protein tan , hoạt độ của enzym - amylase và hàm lƣợng đƣờng tan . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 (2) Xác định hoạt độ của enzym - amylase Xác định hoạt độ enzym - amylase theo phƣơng pháp của Heilken đƣợc mô tả trong tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (1979) [10]. Hoạt độ enzym - amylase đƣợc xác định dƣ̣a trên lƣợng tinh bột bị enzym thủy phân trong thời gian 30phút ở 300C. Giá trị mật độ quang đƣợc đo ở bƣớc sóng 560nm trên máy quang phổ UVvis Cintra 40. Nguyên tắc : Dựa vào tính chất hòa tan của enzym - amylase trong dung dịch đệm phosphat 0,2 M pH = 6,8. Hạt thóc nẩy mầm bóc vỏ , cân khối lƣợng , nghiền trong đệm phosphat 0,2M pH = 6,8, ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, thu dịch để xác định hoạt độ của enzym. Thí nghiệm phân tích hoạt độ enzym - amylase đƣợc tiến hành với ống thí nghiệm và ống kiểm tra , cơ chất là tinh bột 1% đo trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 560nm. Hoạt độ của enzym - amylase đƣợc tính dƣ̣a trên đồ thị đƣờng chuẩn xây dƣ̣ng bằng tinh bột. Hoạt độ enzym - amylase đƣợc tính theo công thức: A (ĐVHĐ/ mg) = 2 1 (C C ) HSPL h   (2.3) Trong đó: A: hoạt độ enzym - amylase (ĐVHĐ/mg) C2: lƣợng tinh bột còn lại của mẫu thí nghiệm (mg/ml) C1: lƣợng tinh bột còn lại của mẫu kiểm tra (mg/ml) h: khối lƣợng mẫu (mg) HSPL: hệ số pha loãng Định tính hoạt độ enzym - amylase : Thành phần hỗn hợp dịch: Thạch agar 2%, tinh bột 1% và nƣớc cất. Cho hỗn dịch vào bình tam giác đun cách thuỷ cho tan thạch , đổ vào đĩa petri dày 4mm để nguội, đục lỗ đƣờng kính 9mm. Nhỏ 100µl dịch chiết chứa enzym vào mỗi lỗ, để tủ lạnh qua đêm để enzym khuyếch tán, chuyển sang tủ ấm ở 300C trong 24giờ. Nhuộm bằng lugol 5phút và tráng lại bằng NaCl 1N. (3) Xác định hàm lượng đường tan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc xác định nhƣ mô tả ở mục 2.2.2.1 (4) Xác định hoạt độ enzym protease Hoạt độ enzym protease xác định theo phƣơng pháp Anson theo mô tả của Nguyễn Văn Mùi (2001) [36]. Hạt thóc nẩy mầm bóc vỏ , cân khối lƣợng , nghiền trong đệm phosphat (pH=6,5), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C, dịch thu đƣợc sử dụng làm thí nghiệm. Thí nghiệm phân tích hoạt độ enzym protease đƣợc tiến hành với ống thí nghiệm và ống kiểm tra đo trên máy quang phổ ở bƣớc sóng 750nm. Hoạt độ của enzym protease đƣợc tính dƣ̣a trên đồ thị đƣờng chuẩn xây dƣ̣ng bằng tyrozin . Hoạt độ enzym protease tính theo công thƣ́c: (n k) D HSPL ĐVHĐ/mg T m      (2.4) Trong đó: n: Chỉ số đo đƣợc ở bƣớc song 750nm của ống thí nghiệm (mg/ml) k: Chỉ số đo đƣợc ở bƣớc song 750nm của ống kiểm tra (mg/ml) D: số ml dịch chiết HSPL: hệ số pha loãng m: khối lƣợng mẫu (mg) T: thời gian ủ enzym với cơ chất (phút) Định tính hoạt độ enzym protease: Tiến hành tƣơng tƣ̣ nhƣ định tính hoạt độ enzym - amylase, cơ chất là gelatin 1%. (5) Xác định hàm lượng protein tan Hàm lƣợng protein tan đƣợc xác định nhƣ mô tả ở mục 2.2.2.1. 2.2.3. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ bằng phƣơng pháp gây hạn nhân tạo Phƣơng pháp đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mạ đƣợc tiến hành theo Lê Trần Bình và Cs (1998) [1]. Hạt lúa nảy mầm gieo vào các bát nhựa nhỏ có kích thƣớc bằng nhau , mỗi hộp 50 hạt. Cát vàng đãi sạch , phơi khô cho vào các hộp với lƣợng nhƣ nhau . Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần cho mỗi chỉ tiêu nghiên cƣ́u trong điều kiện chăm sóc nhƣ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 nhau. Thời gian đầu tƣới nƣớc cho đủ ẩm , khi cây đƣợc 3 lá thật thì tiến hành gây hạn nhân tạo và đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa . Theo dõi các chỉ tiêu liên quan đến khả năng chịu hạn trƣớc và sau khi gây hạn nhƣ sau: (1) Khối lƣợng tƣơi của rễ, thân lá. (2) Khối lƣợng khô của rễ , thân lá các mẫu đƣợc sấy khô tuyệt đối ở 1050C đến khi khối lƣợng không đổi. (3) Xác định khả năng giữ nƣớc qua các giai đoạ n xƣ̉ lý bởi hạn . Khả năng giƣ̃ nƣớc đƣợc tính theo công thƣ́c: 100(%) x W W W kxl xl (2.5) Trong đó: W: khả năng giữ nƣớc của cây sau khi xử lý hạn (%) Wxl : khối lƣợng tƣơi của cây sau khi xƣ̉ lý hạn (g) Wkxl : khối lƣợng tƣơi của cây không xử lý hạn (g) (4) Xác định chỉ số chịu hạn tƣơng đối của các giống theo công thức: 1 S sin (an.bn+bn.cn+ cn.dn +dn.en+...+ kn.an) 2   (2.6) Trong đó: S : chỉ số chịu hạn tƣơng đối : là góc tạo bởi hai trục mang trị số liền nhau  = 3600/9 a,b,c,d….k là các chỉ tiêu theo dõi n : kí hiệu các giống nghiên cứu . (5) Xác định tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra đƣợc theo công thức: 0 n b TH (%) nc   (2.7) Trong đó: TH: tỷ lệ thiệt hại do hạn gây ra (%) b: trị số thiệt hại mỗi cấp n0: số cây của mỗi cấp thiệt hại c: trị số thiệt hại của cấp cao nhất n: tổng số cây xƣ̉ lý Các trị số: số cây chết:trị số 3; số cây héo: trị số 1; số cây không bị ảnh hƣởng: trị số 0 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 (6) Xác định hàm lƣợng prolin Xác định hàm lƣợng prolin theo phƣơng pháp của Bate L.S. và cộng sự (1973) [67]. * Chuẩn bị mẫu: Tiến hành tƣơng tự mục 2.2.3. * Tiến hành tách chiết prolin: Rễ, thân lá của các giống ở các thời điểm 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày gây hạn , cân khối lƣợng 0,3 gram mẫu. Thêm 10ml dịch chiết axit sunfosalisilic 3 %, ly tâm lạnh 7000 vòng/phút trong 20 phút và lọc qua giấy lọc. Lấy 2ml dịch chiết cho vào bình, bổ sung 2ml axit axetic và 2ml dung dịch ninhidrin, sau đó ủ trong nƣớc nóng 1000C trong 1 giờ, ủ trong tủ đá 5 phút. Bổ sung vào bình 4ml toluene, lắc đều và lấy phần dịch có màu hồng ở trên. Đo phổ hấp thụ ở bƣớc sóng 520nm. Hàm lƣợng prolin đƣợc xác định trên máy theo đồ thị chuẩn. Hàm lƣợng prolin đƣợc tính theo công thƣ́c: (%) 100 AxHSPL X x m  (2.8) Trong đó: X: hàm lƣợng prolin (%) A: nồng độ thu đƣợc khi đo trên máy quang phổ HSPL: hệ số pha loãng m: khối lƣợng mẫu (mg) 2.2.4. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 2.2.4.1. Tạo mô sẹo từ hạt lúa - Khử trùng hạt Hạt lúa đƣợc bóc vỏ trấu và khử trùng 1 phút trong cồn 700, 25 phút trong nƣớc giaven 60%, lắc nhẹ, rƣ̉a sạch bằng nƣớc cất vô trùng 3 - 5 lần, sau đó chuyển hạt lên đĩa petri có trải giấy lọc vô trùng. - Tạo mô sẹo Hạt gạo đã khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng (MS) cơ bản [42] bổ sung 2mg 2,4D, 3% saccharose, 0,9% agar, pH=5,8. Nuôi 1 tuần trong tối , 2 tuần dƣới Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 32 ánh sáng đèn trong phòng nuôi cấy với cƣờng độ 2000lux, thời gian chiếu sáng 8/24 giờ, nhiệt độ 250C ± 10C. Đánh giá tỉ lệ tạo mô sẹo sau 3 tuần nuôi cấy của các giống theo công thức: Ci (%)= Ncp X 100 (2.9) Nt Trong đó : Ci: Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Ncp: Số hạt tạo mô sẹo Nt: Tổng số hạt nuôi cấy 2.2.4.2. Phương pháp xử lý thổi khô mô sẹo Mô sẹo sau 3 tuần nuôi đƣợc cắt thành nhƣ̃ng khối mô có kích thƣớc khoảng 3mm x 3mm. Đặt những khối mô này lên đĩa petri có lót giấy vô trùng và thổi khô bằng luồng khí vô trùng của box cấy ở các ngƣỡng thời gian khác nhau . Xác định độ mất nƣớc của mô sẹo sau 2, 4, 6 và 8 giờ xƣ̉ lý thổi khô liên tục. Độ mất nƣớc của mô sẹo sau khi xử lý thổi khô đƣợc tính theo công thức: WL (%)= Wf - Wd x 100 (2.10) Wf Trong đó : WL: Độ mất nƣớc (%) Wf: Khối lƣợng mô tƣơi (mg) Wd: Khối lƣợng mô sau thổi khô (mg) 2.2.4.3. Chọn lọc mô sẹo sống sót sau xử lý và tái sinh cây Cấy mô sẹo sau khi xử lý mất nƣớc lên môi trƣờng tái sinh cây (MS cơ bản + 2% saccharose + 0,8% agar + 1 mg/l kinetin + 0,2mg/l NAA, pH=5,8). Mật độ cấy 20 mô/bình. Nuôi dƣới ánh sáng đèn neon trong phòng nuôi cấy với cƣờng độ 2000lux, thời gian chiếu sáng 8/24 giờ. Nhiệt độ phòng nuôi 250C ± 10C. Tỷ lệ mô sẹo sống sót đƣợc đánh giá sau 3 tuần nuôi theo công thƣ́c: Sv (%)= Nvs x 100 (2.11) Nt Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33 Trong đó: Sv: Tỷ lệ mô sống sót (%) NSV: Số mô sống sót Nt: Tổng số mô xƣ̉ lý Tỷ lệ tái sinh cây đƣợc đánh giá sau 6 tuần nuôi theo công thƣ́c: RC (%) = Nr x 100 (2.12) NSV Trong đó: Rc: Tỷ lệ tái sinh Nsv: Số mô sống sót Nr: Số mô tái sinh cây 2.2.4.4. Xác định nhanh sức sống của tế bào và mô bằng phƣơng pháp nhuộm TTC Hạt của 6 giống lúa đƣợc sƣ̉ dụng làm nguyên liệu tạo mô sẹo nhƣ mục 2.2.2.1. Sau đó tiến hành xƣ̉ lý thổi khô ở ngƣỡng thời gian 4 giờ. Xác định sức sống của tế bào mô sẹo bằng p hƣơng pháp nhuộm TTC theo Towill và CS (1975) [89]. Cân 0,6 gam TTC pha loãng trong 25ml nƣớc cất . Dung dịch MS pha loãng 10 lần. Cân 30 mg mô sẹo cho vào ống nghiệm , thêm 0,5ml dung dịch MS pha loãng 10 lần và 0,25ml dung dịch TTC , để 12 giờ trong tối ở nhiệt độ 250C. Sau đó dùng pipet gạn bỏ phần dung dịch , rƣ̉a 2 lần bằng nƣớc cất rồi cho thêm 5 ml cồn 90%, thuỷ phân ở nhiệt độ 600C trong thời gian 2 giờ. Dung dịch thu đƣợc đem đo ở bƣớc sóng 485 nm. Đối chứng là mô sẹo của các giống không qua xƣ̉ lý thổi khô. 2.2.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu và tính toán kết quả Mỗi mẫu nghiên cứu đƣợc lặp lại 3 lần. Sử dụng toán thống kê để xác định các trị số thống kê, nhƣ trung bình mẫu ( X ), phƣơng sai ( 2 ), độ lệch chuẩn () và sai số trung bình mẫu ( x S ), hệ số tƣơng quan R ... Các số liệu thống kê đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng chƣơng trình Excel với mƣ́c ý nghĩa = 0,05 theo Nguyễn Hải Tuất và Ngô Kim Khôi (1996) [57]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 34 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân loại, đặc điểm hình thái của các giống lúa 3.1.1. Phân loại các giống lúa Hạt của 5 giống lúa đƣợc tiến hành phân loại theo nếp/tẻ dựa vào phản ứng bắt màu với dung dịch KI 1% theo Lƣu Ngọc Trình [56], phân loại loài phụ dựa vào tỷ lệ dài/rộng của hạt thóc và khả năng bắt màu thuốc thử phenol 10% theo Chang [70], kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.1. Bảng 3.1. Phân loại các giống lúa nghiên cƣ́u Ký hiệu mẫu Lúa nếp/tẻ Phân loại theo dài/ rộng Phân loại theo bắt màu phenol Kết luận chung về loại phụ D/R ( mm ) Loài phụ Bắt màu phenol Loài phụ NN Tẻ 2,69 Japonica - Japonica Japonica KT Tẻ 2,45 Japonica - Japonica Japonica KM Tẻ 2,40 Japonica - Japonica Japonica KĐ Tẻ 2,57 I/J + Indica Indica SR Tẻ 2,48 I/J + Indica Indica (D: Dài hạt thóc (mm); R: Rộng hạt thóc(mm); (+) Bắt màu phenol (-) Không bắt màu phenol; I/J: Không phân biệt đƣợc loài phụ) Qua bảng 3.1 cho thấy, cả 5 giống lúa đều là lúa tẻ. Căn cứ vào tỷ lệ chiều dài và chiều rộng hạt thóc thì trong 5 giống có 3 giống thuộc loài phụ Japonica và 2 giống không thể xác định đƣợc . Kết quả này phù hợp với kết luận của nhiều tác giả : nếu chỉ căn cứ vào tỷ lệ dài /rộng để phân biệt loài phụ là rất khó và thiếu chính xác, vì khó có thể khẳng định đƣợc loại lúa nào khi tỷ lệ dài/rộng nằm trong khoảng 2,3- 3,0 [56]. Căn cƣ́ vào khả năng bắt màu với thuốc thử phenol 10%, kết quả phân loại xác định đƣợc trong 5 giống lúa cạn có 2 giống thuộc loài phụ Indica và 3 giống thuộc loài phụ Japonica. Phƣơng pháp này cho phép phân loại đƣợc lúa Indica và lúa Japonica tƣơng đối chính xác. Vì vậy, có thể sử dụng phƣơng pháp này để nhận Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 35 biết gần đúng các giống lúa trong quỹ gen lúa cạn còn rất phong phú hiện nay. Tuy nhiên, trong số 3 giống thuộc loài phụ Japonica rất có thể còn có giống thuộc loài phụ Javanica, vì theo phƣơng pháp này chỉ có thể phân biệt đƣợc lúa Indica và lúa Japonica. Từ các kết quả trên nhận thấy , cả 5 giống lúa cạn sƣu tập đƣợc các giống đều là lúa tẻ . Trong đó có 2 giống thuộc loài phụ Indica và 3 giống thuộc loài phụ Japonica , các giống thu thập đƣợc đều ở huyện Bắc Quang, tỉnh Hà Giang 3.1.2. Đặc điểm hình thái các giống lúa Hình thái và kích thƣớc hạt thóc là một đặc tính quan trọng trong chọn giống lúa . Chúng tôi tiến hành phân tích đặc điểm hình thái và kích thƣớc của các giống lúa dƣ̣a theo phƣơng pháp cho điểm của IRRI [76]. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái và khối lƣợng 1000 hạt của các giống lúa Chỉ tiêu Giống Râu đầu hạt Màu râu Màu vỏ trấu Tỷ lệ dài/rộng của hạt thóc (mm) Hình dạng hạt thóc Khối lƣợng 1000 hạt (g) NN 0 0 3 2,68 2 34,660,44 KT 0 0 1 1,97 5 32,780,25 KM 5 5 7 2,91 2 29,330,38 KĐ 5 6 10 3,52 1 30,480,36 SR 9 3 4 3,29 1 31,340,27 Số liệu ở bảng 3.2 và hình 3.1 cho thấy, màu sắc của vỏ trấu ở các giống lúa nghiên cƣ́u rất khác nhau thể hiện sự đa dạng về tổ hợp gen xác định tính trạng này. Giống KĐ màu trắng (điểm 10), giống KM có chấm tím trên nền vàng rơm (điểm 7), giống KT có vành và rãnh màu vàng trên nền vàng rơm (điểm 1), giống NN màu hơi đỏ đến tím nhạt (điểm 3) và giống SR có r ãnh nâu trên nền vàng rơm (điểm 4). Theo Khush G.H và Oka H.I (1996) có tới 13 locus phân bố trên 7 nhiễm sắc thể chi phối tính trạng màu sắc vỏ trấu. Tuỳ theo tổ hợp alen của chúng mà vỏ trấu có màu sắc khác nhau, tính trạng vàng rơm là trội hơn so với tính trạng màu vàng [78]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 36 Hình 3.1. Hình thái hạt của các giống lúa nghiên cứu Về độ phủ lông trên vỏ trấu , các giống lúa thu thập đƣợc có 3 giống nhẵn là giống NN,KM, KĐ và 2 giống có lông trên sống vỏ trấu là KT và RS . Vỏ trấu nhẵn không có lông bao phủ phù hợp với thị hiếu ngƣời tiêu dùng hơn các giống có lông bao phủ. Tính trạng có râu, màu sắc râu phụ thuộc vào điều kiện môi trƣờng [6]. Trong 5 giống có giống NN và KT là không có râu đạt điểm 0, 2 giống KM và KĐ râu dài 5mm đạt điểm 5 và giống SR râu dài 9mm đạt điểm 9. Sƣ̣ đa dạng về chiều dài râu chƣ́ng tỏ các giống nghiên cƣ́u có kiểu gen khác nhau. Hình dạng hạt thóc là một tính trạng quan trọng trong chọn tạ o giống lúa. Hạt của các giống lúa tẻ thon dài càng đƣợc ƣa chuộng . Hình dạng hạt của các giống lúa nghiên cƣ́u đều có dạng thon dài . Trong đó giống KT đạt điểm 5, giống NN và KM đạt điểm 2, còn 2 giống còn lại đạt điểm 1. Nhƣ vậy hình dạng của các giống lúa đều phù hợp với thị hiếu ngƣời tiêu dùng và xuất khẩu. Khối lƣợng 1000 hạt thóc là tính trạng không chỉ phụ thuộc vào kiểu gen mà còn phụ thuộc vào môi trƣờng, mùa vụ . Đồng thời cũng là chỉ tiêu quan trọng cấu thành năng suất [46]. Dẫn liệu bảng 3.2 cho thấy , khối lƣợng 1000 hạt của các giống đều cao biến động tƣ̀ 29,33g đến 34,66g trong đó giống NN cao nhất và giống KM thấp nhất . Khối lƣợng 1000 hạt cao nghĩa là hạt mẩy , chắc, khi gieo cấy mầm khỏe, sức sống cao. KT SR NN KM KĐ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 37 Kết quả phân tích đặc điểm hình thái, kích thƣớc và khối lƣợng hạt của 5 giống lúa cạn địa phƣơng theo tiêu chuẩn của IRRI đã cho thấy tính đa dạng của các giống lúa cạn thể hiện ở màu sắc vỏ trấu, râu đầu hạt, khối lƣợng 1000 hạt… Đây là cơ sở cho việc sàng lọc các giống lúa có đặc tính tốt, đáp ứng đƣợc nhu cầu, thị hiếu của ngƣời tiêu dùng. 3.2. Đánh giá chất lƣợng hạt 3.2.1. Đánh giá chất lƣợng hạt trên phƣơng diện cảm quan Một số chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng hạt trên phƣơng diện cảm quan đƣợc nghiên cƣ́a theo phƣơng pháp cho điểm của IRRI [76]. Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.3. Bảng 3.3. Một số chỉ tiêu chất lƣợng hạt của các giống lúa Giống Dạng nội nhũ Độ bạc bụng nội nhũ Chiều dài gạo xay Hình dạng gạo xay Màu vỏ cám Hƣơng thơm NN 2 0 2 2 2 2 KT 2 0 5 5 2 2 KM 1 1 2 2 6 0 KĐ 3 0 1 1 2 1 SR 1 0 1 1 2 0 Nội nhũ của hạt gạo chƣ́a các chất di nh dƣỡng có giá trị nhƣ tinh bột , protein, lipit, vitamin... Dẫn liệu bảng 3.3 cho thấy, nội nhũ của 5 giống rất khác nhau , khi nhuộm nội nhũ bằng dung dịch I- KI 1% các giống đều bắt màu xanh giống KĐ xanh đậm điểm 3, Hai giống NN, KT bắt màu xanh nhạt điểm 2 và 2 giống bắt màu xanh nhạt nhất điểm 1 là KM, SR. Độ bạc bụng là hiện tƣợng gạo đục ở một phần hạt gạo đƣợc quy định bởi giống và ngoại cảnh. Chất lƣợng hạt gạo tỷ lệ nghịch với độ bạc bụng vì hạt gạo thƣờng bị gãy nát khi xay xát dẫn tới tỷ lệ gạo xay/thóc thấp. Mặt khác, phần bạc bụng ở hạt gạo chủ yếu chỉ có tinh bột và có ít protein . Hạt gạo bạc bụng có ít protein ở nội nhũ hơn là các hạt gạo khác trong cùng một giống . Qua dẫn liệu bảng 3.3, trong 5 giống chỉ có 1 giống KM là có độ bạc bụng (điểm 1) còn 4 giống không có độ bạc bụng (điểm 0) đây là đặc điểm tốt của các giống. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 38 Hình dạng hạt gạo xay giống hình dạng hạt thóc vì hình dạng hạt gạo do vỏ trấu khống chế nghiêm ngặt và vỏ trấu phủ kín sát với vỏ cám . Màu vỏ cám gần giống màu vỏ trấu . Chiều dài hạt gạo xay đều nằm trong khoảng 5,2mm đến 6,1mm tạo nên hình tròn bầu của hạt gạo , đây chính là hình dạng phù hợp với thị hiếu tiêu dùng của lúa tẻ. Với hình dạng này rất có lợi trong khâu xay sát, đánh bóng hạt gạo sẽ ít bị gãy , vụn. Các giống đều có độ thơm từ thơm ít đến rất thơm . Độ thơm là một chỉ tiêu góp phần nâng cao giá trị của các giống lúa . Đặc điểm này rất quý đối với nguồn gen của tập đoàn lúa gạo nƣớc ta. Nhƣ vậy, nhƣ̃ng chỉ tiêu đánh giá chất lƣợng hạt trên phƣơng diện cảm quan của hạt gạo ảnh hƣởng đến giá trị dinh dƣỡng , tỷ lệ gạo/thóc và sở thích ngƣời tiêu dùng và xuất khẩu . Trong đó xét trên phƣơng diện cảm quan thì giống NN, KT, KĐ có chất lƣợng tốt. 3.2.2. Đánh giá chất lƣợng hạt trên phƣơng diện hóa sinh 3.2.2.1 Hàm lƣợng protein , đƣờng tan trong hạt của các giống lúa Hàm lƣợng protein, đƣờng tan trong hạt là cơ sở đánh giá chất lƣợng hạt của các giống lúa. Để đánh giá chất lƣợng hạt của các giống nghiên cƣ́u , chúng tôi tiến hành phân tích hàm lƣợng protein , đƣờng tan trong hạt . Kết quả đƣợc trình bày ở bảng 3.4. Protein là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lƣợng lúa , hàm lƣợng protein tỷ lệ thuận với chất lƣợng gạo . So với các loại ngũ cốc khác thì hàm lƣợng protein của lúa thấp hơn nhƣng là các protein dễ tiêu hóa và hấp thụ với cơ thể ngƣời và động vật . Qua bảng 3.4 cho thấy hàm lƣợng protein của các giống lúa đều khá cao, dao động tƣ̀ 7,98% đến 9,18%. Trong đó giống KT cao nhất (9,18%) tiếp đến là giống KĐ , SR, NN và thấp nhất là giống KM (7,98%). Hàm lƣợng protein không chỉ là chỉ tiêu quan trọng để đán h giá chất lƣợng hạt mà còn là chỉ tiêu quan trọng đánh giá khả năng chống chịu của cây [1], [11]. Trong quá trình chín của hạt lúa , các chất gluxit đơn giản dần đƣợc chuyển hoá thành các dạng gluxit phức tạp, gluxit dự trữ chủ yếu ở dạng tinh bột tích luỹ trong hạt, do đó hàm lƣợng đƣờng tan trong hạt thấp . Bảng 3.4 cho thấy hàm lƣợng Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 39 đƣờng tan của các giống đều ở mức tƣơng đối thấp , cao nhất là giống KT 1,484% tiếp đến là giống KĐ (1,83%), SR (1,46%), NN (1,34%) và thấp nhất là giống KM (1,33%). Ngoài ra, đƣờng còn có tác dụng bảo vệ, chống lại sự khô hạn của nguyên sinh chất, điều chỉnh áp suất thẩm thấu dịch bào khi gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi. Bảng 3.4. Hàm lƣợng protein, đƣờng tan của các giống lúa (% khối lƣợng khô) Giống Protein TS (%) Đƣờng tan (%) NN 8,33  0,12 1,35  0,09 KT 9,18  0,05 1,84  0,10 KM 7,98  0,14 1,34  0,07 KĐ 9,08  0,20 1,83  0,11 SR 8,45  0,13 1,46  0,12 3.2.2.3. Hàm lƣợng axit amin trong hạt của các giố ng lúa Thành phần axit amin là chỉ tiêu quan trọng đánh giá chất lƣợng protein của hạt. Bằng cách sƣ̉ dụng phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng axit amin trong hạt trên hệ máy HP - Amino Quant và dƣ̣a vào sắc ký đồ , chúng tôi xác đị nh đƣợc hàm lƣợng axit amin trong hạt (g axit amin/100g mẫu) và đƣợc thể hiện ở bảng 3.5. Chúng tôi xác định đƣợc 17 loại axit amin trong hạt của các giống lúa. Trong đó, không có tryptophan vì loại axit amin này bị phân hủy trong quá trình thủy phân bởi HCl 6N, cystein ở dạng hỗn hợp không phân tách đƣợc , còn glutamin và asparagine chuyển hóa thành a xit glutamic và axit aspactic . Kết quả thu đƣợc cho thấy hàm lƣợng các axit amin chƣ́a nhóm SH rất thấ p: metionin dao động tƣ̀ 0,03 đến 0,05g/100g mẫu và cystein từ 0,18 đến 0,24g/100g mẫu . Giống KM có hàm lƣợng axit amin chƣ́ a nhóm SH thấp nhất (0,23g/100g mẫu ) và cao nhất là giống KT (0,36g/100g mẫu). Chất lƣợng của protein cũng đƣợc tính theo tỷ lệ của tƣ̀ng axit amin trong phân tƣ̉ protein ( g axit amin/ 100 protein) bảng 3.6. Protein của lúa chƣ́a các axit amin không thay thế : valine, lơxin, isolơxin, metionin, phenylalanin, lizin, threonin, các axit amin này đều có trong thành phần axit amin của các giống lúa nghiên cƣ́u với hàm lƣợng khác nhau . Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 40 Bảng 3.5. Hàm lƣợng axit amin hạt dự trữ của các giống lúa (g axit amin /100g mẫu) STT Axit amin NN KT KM KĐ SR 1 Axit Aspatic 0,79 0,88 0,72 0,85 0,84 2 Axit Glutamic 1,27 1,56 1,33 1,59 1,33 3 Serin 0,45 0,48 0,42 0,50 0,26 4 Histidin 0,17 0,17 0,14 0,15 0,15 5 Glycin 0,37 0,36 0,37 0,40 0,39 6 Threonin 0,32 0,28 0,30 0,27 0,28 7 Alanin 0,56 0,63 0,53 0,65 0,61 8 Arginin 0,74 0,81 0,69 0,83 0,81 9 Tyrozin 0,37 0,36 0,32 0,40 0,40 10 Cystein + Cystin 0,24 0,31 0,18 0,19 0,24 11 Valin 0,60 0,64 0,55 0,63 0,62 12 Metionin 0,03 0,05 0,05 0,03 0,05 13 Phenylanin 0,49 0,56 0,47 0,55 0,52 14 Izolơxin 0,37 0,44 0,36 0,42 0,42 15 Lơxin 0,79 0,86 0,72 0,84 0,82 16 Lizin 0,23 0,21 0,21 0,19 0,19 17 Prolin 0,50 0,49 0,48 0,48 0,44 Tổng số 8,29 9,09 7,84 8,97 8,37 Khi so sánh hàm lƣợng axit amin không thay thế của các giống lúa nghiên cƣ́u với tiêu chuẩn của FAO (1976), chúng tôi n hận thấy có threonin, valin, phenylalanin, lơxin đều có tỷ lệ cao hơn tiêu chuẩn . Axit amin isolơxin có giống KM và KĐ là đạt tiêu chuẩn còn các giống khác đều thấp hơn , trong đó giống KT thấp nhất (3,33g/100g protein). Các giống đều có methyonin và lizin thấp hơn tiêu chuẩn nhất là methyonin, kết quả này thể hiện ở bảng 3.7 và hình 3.2. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 41 Bảng 3.6. Thành phần và lƣợng axit amin trong protein hạt của các giống lúa (g axit amin/100g protein) STT Axit amin NN KT KM KĐ SR 1 Axit Aspatic 9,22 9,21 9,67 9,03 9,53 2 Axit Glutamic 21,23 24,11 20,45 25,56 27,19 3 Serin 3,87 3,51 3,55 4,04 4,92 4 Histidin 1,95 1,82 1,54 1,31 1,89 5 Glycin 3,65 3,89 3,86 3,45 3,65 6 Threonin 4,08 4,34 3,76 4,05 4,06 7 Alanin 6,12 5,32 5,98 6,15 6,65 8 Arginin 8,43 8,03 8,72 8,27 8,88 9 Tyrozin 2,98 2,87 3,03 4,11 4,28 10 Cystein + Cystin 2,16 2,34 2,15 2,78 2,93 11 Valin 6,34 6,88 5,94 6,93 6,37 12 Metionin 0,25 0,19 0,22 0,58 0,35 13 Phenylanin 6,13 6,21 6,87 6,91 6,18 14 Izolơxin 3,67 3,33 4,18 4,32 4,65 15 Lơxin 8,65 9,45 8,56 8,04 8,16 16 Lizin 3,12 2,86 2,14 2,38 3,02 17 Prolin 4,99 4,65 4,86 5,67 5,92 Tổng số 86,46 99,01 81,67 94,00 92,94 Bảng 3.7. Thành phần và hàm lƣợng các axit amin không thay thế trong hạt của các giống lúa (g axit amin/ 100g protein) STT Axit amin FAO NN KT KM KĐ SR 1 Thr 2,80 4,08 4,34 3,76 4,05 4,06 2 Val 4,20 6,34 6,88 5,94 6,93 6,37 3 Met 2,20 0,25 0,19 0,22 0,58 0,35 4 Phe 2,80 6,13 6,21 6,87 6,91 6,18 5 Iso 4,20 3,67 3,33 4,18 4,32 4,65 6 Leu 4,20 8,65 9,45 8,56 8,04 8,16 7 Lys 4,20 3,12 2,86 2,14 2,38 3,02 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 42 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Thr Val Met Phe Iso Leu Lys Axit amin Hà m l ƣợ ng ax it a mi n k hô ng th ay thế (% ) FAO NN KT KM KĐ SR Hình 3.2. Hàm lƣợng axit amin không thay thế của các giống lúa nghiên cứu với tiêu chuẩn của FAO Tƣ̀ kết quả phân tích một số chỉ tiêu về chất lƣợng hạt trên phƣơng diện cảm quan và hóa sinh của 5 giống lúa nghiên cƣ́u có thể rút ra một số nhận xét sau: (1) Các đặc điểm về chiều dài , hình dạng hạt gạo, dạng nội nhũ, độ bạc bụng, độ thơm của các giốn g lúa ít có sƣ̣ sai khác và đều phù hợp với thị hiếu tiêu dùng . Kết hợp kết quả phân tích hàm lƣợng protein , đƣờng tan, chúng tôi nhận thấy giống KT có chất lƣợng gạo là tốt nhất tiếp đến là giống KĐ , SR, NN và kém nhấ t là giống KM. (2) Hàm lƣợng và thành phần axit amin không thay thế trong hạt của các giống có threonin, valin, phenylalanin, lơxin đều có tỷ lệ cao hơn tiêu chuẩn của FAO, còn methyonin và lizin các giống đều thấp hơn tiêu chuẩn. 3.3. Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa 3.3.1. Khả năng chịu hạn của các giống ở giai đoạn nảy mầm 3.3.1.1. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của - amylase và hàm lượng đường của các giống lúa ở giai đoạn nảy mầm Amylase là enzym phân giải tinh bột , gồm 3 loại là -amylase, -amylase và glucose amylase. Enzym -amylase xúc tác cho phả n ƣ́ng thủy phân liên kết 1-4 glucozit của tinh bột và một số polysacarit khác . Enzym -mylase đƣợc tổng hợp mạnh trong quá trình nảy mầm của hạt . Sƣ̣ gia tăng hoạt độ của -amylase sẽ làm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 43 tăng hàm lƣợng đƣờng do tinh bột bị thủy phân cung cấp năng lƣợng cho quá trình nảy mầm của hạt . Khi hoạt độ -amylase tăng lên, hàm lƣợng đƣờng tăng theo nên áp suất thẩm thấu của tế bào tăng , nhờ đó mà thƣ̣c vật có khả năng chống lại sƣ̣ mất nƣớc ở giai đoạn nảy mầm. Đây là điều rất có ý nghĩa với quá trình nảy mầm của hạt, vì nó đảm bảo cho sự phát triển của mầm và cây non trong điều kiện thiếu nƣớc. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành, đánh giá khả năng chịu hạn của các giống lúa thông qua sƣ̣ thay đổi hoạt độ của  - amylase và biến động hàm lƣợng đƣờng tan ở giai đoạn nảy mầm trong điều kiện gây hạn sinh lý bằng cách bổ sung sorbitol 5%. Hoạt độ enzym α-amylase đƣợc xác định thông qua hàm lƣợng tinh bột bị thuỷ phân ở 300 C trong 30 phút, dựa vào đồ thị chuẩn tinh bột với giá trị OD đo ở bƣớc sóng 560nm. Kết quả phân tích đƣợc trình bày ở bảng 3.8 và hình 3.3. Qua số liệu bảng 3.8 và hình 3.3, hoạt độ enzym α-amylase có sƣ̣ khác nhau giƣ̃a các giống và thời gian gây hạn . Xu hƣớng chung của sƣ̣ biến động này là hoạt độ enzym α-amylase tăng dần trong 7 ngày gây hạn và cao nhất ở ngày hạn thứ 7, sau đó giảm dần ở 9 ngày tuổi . Tại thời điểm 7 ngày tuổi hoạt độ của enzym α- amylase cả 5 giống đều tăng so với thời điểm 1 ngày tuổi gây hạn sinh lý bằ ng sorbitol, sƣ̣ biến động này khác nhau giƣ̃a các giống . Trong đó giống NN tăng cao nhất 4,02 lần tiếp đến là KM (3,89 lần), KT (3,80 lần), KĐ (3,78 lần) và tăng thấp nhất là giống SR 3,75 lần. Sƣ̣ biến động cũng đƣợc thể hiện ở hình 3.4. Bảng 3.8. Hoạt độ của -amylase trong giai đoạn hạt nảy mầm khi xƣ̉ lý sorbitol 5% (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm) Ký hiệu mẫu Hoạt độ enzym -amylase (ĐVHĐ/mg hạt nảy mầm) 1 ngày tuổi 3 ngày tuổi 5 ngày tuổi 7 ngày tuổi 9 ngày tuổi NN 1,800,21 2,490,61 5,480,17 7,240,33 5,870,62 KT 1,810,29 2,570,13 5,390,23 6,880,11 5,110,19 KM 1,510,16 2,370,52 4,710,15 5,880,29 5,070,84 KĐ 1,730,35 2,440,11 5,560,37 6,390,42 5,080,65 SR 1,450,08 2,410,82 4,970,46 5,440,23 4,870,51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 44 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 3 5 7 9 Ngày đv hđ /m g h ạt n ảy mầ m NN KT KM KĐ SR Hình 3.3. Sự biến động hoạt độ enzym α-amylase của các giống lúa Kết quả nghiên cƣ́u cho thấy , sorbitol có ảnh hƣởng đến hoạt độ của enzym α-amylase ở giai đoạn nảy mầm của các giống lúa . Sƣ̣ ảnh hƣởng của sorbitol đến hoạt độ enzym α-amylase của các giống lúa có sƣ̣ khác nhau và phụ thuộc vào khả năng chịu hạn của tƣ̀ng giống. Kết quả này cũng phù hợp với nhƣ̃ng nghiên cƣ́u trên đối tƣợng lạc [24], [38], [45], đậu tƣơng [28]. 1. NN; 2. KT; 3. KM; 4. KĐ; 5. SR Hình 3.4. Định tính hoạt độ enzym α-amylase của các giống lúa A. hoạt độ enzym α-amylase 1 ngày tuổi B. hoạt độ enzym α-amylase 5 ngày tuổi A B 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 45 Hàm lƣợng đƣờng tan trong tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu của dịch bào khi cây gặp điều kiện ngoại cảnh bất lợi . Vì vậy chúng tôi khảo sát hàm lƣợng đƣờng ở giai đoạn nảy mầm với mục đích tìm mối liên quan đến kh ả năng chịu hạn của các giống lúa . Kết quả nghiên cƣ́u đƣợc trình bày ở bảng 3.9 và hình 3.5. Bảng 3.9. Hàm lƣợng đƣờng tan của các giống lúa khi xử lý sorbitol 5% ở giai đoạn nảy mầm (%) Ký hiệu mẫu Hàm lƣợng đƣờng tan (%) 1 ngày tuổi 3 ngày tuổi 5 ngày tuổi 7 ngày tuổi 9 ngày tuổi NN 4,220,21 6,280,13 7,900,24 9,750,18 6,190,42 KT 4,180,34 6,150,65 7,380,18 8,860,53 6,430,39 KM 4,210,42 6,230,23 7,150,87 9,570,51 6,530,18 KĐ 4,150,13 6,420,14 7,130,53 8,470,18 6,340,42 SR 3,970,28 6,310,12 7,170,36 7,920,55 6,130,58 Kết quả bảng 3.9 và hình 3.5 cho thấy, trong quá trình nảy mầm của hạt ở các mẫu thí nghiệm hàm lƣợng đƣờng tan đều tăng theo quy luật chung là tăng tƣ̀ 1ngày tuổi đến 7 ngày tuổi và tăng cao nhất ở thời điểm 7 ngày tuổi sau đó bắt đầu giảm vào giai đoạn 9 ngày tuổi. Sƣ̣ biến động hàm lƣợng đƣờng tan các giống khác nhau thì khác nhau . Tại thời điểm 7 ngày tuổi , hàm lƣợng đƣờng tan của giống NN cao nhất (tăng 2,31 lần) tiếp đến là KM , KT, KĐ và thấp nhất là SR (1,99 lần), sƣ̣ biến động này thể hiện ở hình 3.5. 0 2 4 6 8 1 12 1 3 5 7 9 Ngày Hà m l ƣợn g đ ƣờn g ta n ( % m g h ạt nẩy mầ m) NN KT KM KĐ SR Hình 3.5 Sự biến động hàm lƣợng đƣờng tan các giống lúa ở giai đoạn nảy mầm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 46 Khi tế bào mất nƣớc , các chất hòa tan đƣợc tích lũy trong tế bào nhằm chống lại sự mất nƣớc và tăng khả năng giữ nƣớc của chất nguyên sinh . Đây là một phƣơng thƣ́c thích nghi của thƣ̣c vật với stress của môi trƣờng [1], [40]. Kết quả nghiên cƣ́u về hàm lƣợng đƣờng tan trong giai đoạn nảy mầm của các giống lúa khi gây hạn sinh lý bằng sorbitol 5% phù hợp với những nhận định trên. Bảng 3.10. Tƣơng quan giƣ̃a hoạt đô enzym α-amylase với hàm lƣợng đƣờng tan của các giống lúa Kí hiệu mẫu Phƣơng trình hồi quy Hệ số tƣơng quan (R) NN Y = 0,75x+3,42 0,95 KT Y = 0,77x+3,48 0,94 KM Y = 0,86x+3,92 0,93 KĐ Y = 3,27x+1,44 0,94 SR Y = 0,71x+3,59 0,93 Khảo sát mối tƣơng quan giữa hoạt đ ộ enzym α-amyase và hàm lƣợng đƣờng tan đƣợc trình bày ở bảng 3.10 cho thấy hệ số tƣơng quan (R) của các giống lúa đều nằm trong khoảng 0,9 < R < 1. Điều này chƣ́ng tỏ hàm lƣợng đƣờng tan và hoạt đô enzym α-amyase có mối tƣơng quan thuận chặt chẽ . Hàm lƣợng đƣờng tan phụ thuộc tuyến tính vào hoạt độ của enzym α-amyase. Hoạt độ của enzym α-amylase càng cao thì hàm lƣợng đƣờng tan càng nhiều cung cấp cho quá trình nảy mầm của hạt, sƣ̣ sinh trƣởng c ủa mầm và điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào trong điều kiện cƣ̣c đoan. Kết quả nghiên cƣ́u của chúng tôi về hoạt độ enzym α-amylase và hàm lƣợng đƣờng tan ở giai đoạn nảy mầm khi xƣ̉ lý hạn bằ ng sorbitol 5% cho phép kết luận, hàm lƣợng đƣờng tan liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu của dịch bào và khả năng giữ nƣớc của mầm . Hoạt độ enzym α-amylase và hàm lƣợng đƣờng tan có mối tƣơng quan thuận chặt chẽ và liên quan đến khả năng nảy mầm của hạt . Giƣ̃a Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 47 các giống có sự thay đổi về hoạt độ của enzym α-amylase và hàm lƣợng đƣờng tan khác nhau liên quan đến khả năng chống chịu của từng giống . 3.3.1.2. Ảnh hưởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của protease và hàm lượng protein của các giống lúa ở giai đoạn nảy mầm Kết quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của hạn sinh lý đến hoạt độ của protease ở giai đoạn nảy mầm của các giống lúa đƣợc trình bày ở bảng 3.11, hình 3.6 và hình 3.7. Bảng 3.11. Hoạt độ của protease của các giống lúa khi xử lý sorbitol 5 % ở giai đoạn nảy mầm (ĐVHĐ/mg) Ký hiệu mẫu Hoạt độ của enzymne protease (ĐVHĐ/mg) 1 ngày tuổi 3 ngày tuổi 5 ngày tuổi 7 ngày tuổi 9 ngày tuổi NN 0,260,23 0,390,32 0,530,14 0,780,46 0,450,21 KT 0,250,31 0,320,13 0,430,43 0,690,06 0,470,56 KM 0,240,26 0,380,34 0,500,43 0,720,51 0,500,12 KĐ 0