Luận văn Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tôm sú (penaeus monodon) bằng mô hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phƣơng pháp hóa mô miễn dịch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * * * PHẠM MINH NHỰT BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC * * * * * BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TƠM SƯ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH LUẬN VĂN KỸ SƢ CHUYÊN NGÀNH:CƠNG NGHỆ SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. NGUYỄN VĂN HẢO PHẠM MINH NHỰT ThS. NGƠ XUÂN TUYẾN KHĨA: 2002 - 2006 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 8/2006 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY * * * * * STANDARD CHALLENGE TEST MODEL AND IMMUNOHISTOCHEMISTRY PRIMARILY INVESTIGATING PATHOGENESIS OF WHITE SPOT SYNDROME VIRUS IN BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) GRADUATION OF THESIS MAJOR: BIOTECHNOLOGY Professor: Student: PhD. NGUYEN VAN HAO PHAM MINH NHUT MSc. NGO XUAN TUYEN TERM: 2002 - 2006 HCMC, 8/2006 iv LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành cảm ơn: BGH Trƣờng Đại học Nơng Lâm TP.HCM và các thầy cơ ở Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học đã tạo mọi điều kiện để chúng em học tập tốt, đã tận tình giúp đỡ, quan tâm đến việc học tập của chúng em trong suốt 4 năm qua và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để chúng em hồn thành khĩa luận tốt nghiệp này. TS. Nguyễn Văn Hảo, ThS. Ngơ Xuân Tuyến, CN. Đồn Văn Cƣờng đã tận tình chỉ bảo, giải đáp các vƣớng mắc, các khĩ khăn mà tơi gặp phải trong suốt quá trình thực tập, giúp tơi hồn thành tốt khĩa luận tốt nghiệp này. KS. Phạm Thị Tuyết Anh đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ trong suốt quá trình tơi thực hiện đề tài. TS. Lý Thị Thanh Loan đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực tập tại Viện. Các anh chị ở phịng Mơ học tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Mơi Trƣờng và Phịng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II, Thành Phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tơi rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài. Các anh chị ở phịng Sinh Học Thực Nghiệm và Trại thực nghiệm Thủy Sản Thủ Đức đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành quá trình bố trí thí nghiệm. Bạn Trần Thị Ánh Nguyệt và các bạn thân yêu ở lớp Cơng Nghệ Sinh Học 28 đã cùng tơi chia sẻ những cảm xúc vui buồn trong thời gian học tập và giúp đỡ, động viên tơi để tơi hồn thành khĩa luận này. Và con vơ cùng biết ơn cha mẹ và những ngƣời thân trong gia đình đã luơn động viên, giúp đỡ con để con cĩ thể hồn thành khĩa luận này. Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2006. Sinh viên thực hiện Phạm Minh Nhựt v TĨM TẮT PHẠM MINH NHỰT - Đại Học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 8/2006. “BƢỚC ĐẦU KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA VIRUS ĐỐM TRẮNG TRÊN TƠM SÚ (Penaeus monodon) BẰNG MƠ HÌNH GÂY NHIỄM THỰC NGHIỆM CHUẨN VÀ PHƢƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH”. Giáo viên hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN VĂN HẢO ThS. NGƠ XUÂN TUYẾN Bệnh đốm trắng do virus đốm trắng (WSSV) gây ra là nguyên nhân gây chết hàng loạt đối với tơm sú nuơi lẫn tơm tự nhiên tại Việt Nam và trên thế giới. Các nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tơm hiện nay rất ít. Do đĩ việc hiểu rõ hơn về quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng sẽ giúp cho việc tạo ra những phƣơng thức kiểm sốt bệnh. Kết hợp mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phƣơng pháp hĩa mơ miễn dịch trên tơm sú khơng mang các virus thơng thƣờng nhằm xác định vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng, phân tích sự xâm nhiễm và tìm ra nguyên nhân gây chết trên tơm. Tiến trình thí nghiệm đƣợc thực hiện nhƣ sau: tơm khơng mang các virus thơng thƣờng đƣợc gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ với liều thấp (101,5 SID50/ml) và liều cao (104,0 SID50/ml). Ở mỗi liều gây nhiễm, tiến hành thu mẫu theo từng thời điểm sau khi gây nhiễm. Sử dụng phƣơng pháp hĩa mơ miễn dịch để khảo sát các mẫu theo từng thời điểm nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tơm sú. Các kết quả thu đƣợc: Các biểu hiện lâm sàng của tơm thí nghiệm bị nhiễm bệnh: hoạt động bất thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết, đƣợc phát hiện vào thời điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao. Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tơm sú ở liều thấp xảy ra vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ tơm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 33,3 % và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của chúng là các tế bào của tim với cƣờng độ nhiễm là (+) vi Ở liều cao, các cơ quan phát hiện dƣơng tính với virus đốm trắng vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm sau khi nhuộm bằng hĩa mơ miễn dịch. Tỷ lệ tơm bị nhiễm đốm trắng tại thời điểm này là 50 %. Và cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng ở liều cao là các tế bào của tim, mơ tạo máu, mang, tuyến anten và các tế bào của màng bao bên ngồi gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+). Ở thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và ở cả 2 liều gây nhiễm tất cả các cơ quan đều bị nhiễm virus đốm trắng. Cƣờng độ nhiễm virus đốm trắng trên các cơ quan khi gây nhiễm với liều cao và liều thấp cĩ sự khác biệt trên các cơ quan lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày, biểu mơ dƣới vỏ và mơ liên kết của màng bao gan tụy. vii MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ ........................................................................................................... ..... iv TĨM TẮT ................................................................................................................. ...... v MỤC LỤC ................................................................................................................ .... vii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... ...... x DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. xi DANH SÁCH CÁC BẢNG .......................................................................................... xii PHẦN I: GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 1.2. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.3. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3 2.1. Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tơm sú ................................................... 3 2.1.1. Miễn dịch khơng đặc hiệu của giáp xác ............................................................... 3 2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác ............................ 3 2.1.3. Hệ thống hoạt hĩa prophenoloxidase ................................................................... 3 2.1.4. Hệ thống đơng máu .............................................................................................. 6 2.1.5. Các chất ức chế proteinase ................................................................................... 7 2.1.6. Hệ thống nhận diện khơng chuyên biệt ................................................................ 7 2.1.7. Các peptide kháng khuẩn ..................................................................................... 8 2.1.8. Peroxynectin ......................................................................................................... 9 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng ................................................ 9 2.2.1. Bệnh đốm trắng .................................................................................................... 9 2.2.1.1. Lịch sử và phân bố ........................................................................................ 10 2.2.1.2. Triệu chứng, bệnh tích .................................................................................. 11 2.2.2. Virus đốm trắng .................................................................................................. 11 2.2.2.1. Phân loại và tên gọi ....................................................................................... 11 2.2.2.2. Hình thái ........................................................................................................ 12 2.2.2.3. Cấu trúc ......................................................................................................... 13 2.3. Quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng ............................................. 15 viii 2.3.1. Vật liệu gây bệnh ................................................................................................ 15 2.3.2. Cơ chế gây bệnh ................................................................................................. 16 2.3.3. Cơ chế lây lan ..................................................................................................... 17 2.4. Mơ hình cảm nhiễm chuẩn virus trên tơm ..................................................... 18 2.5. Phƣơng pháp hĩa mơ miễn dịch ..................................................................... 19 2.5.1. Nguyên lý .......................................................................................................... 19 2.5.2. Kháng nguyên ..................................................................................................... 20 2.5.3. Kháng thể ............................................................................................................ 20 2.5.4. Phƣơng pháp nhuộm ........................................................................................... 21 2.5.4.1. Phƣơng pháp trực tiếp ................................................................................... 21 2.5.4.2. Phƣơng pháp gián tiếp .................................................................................. 22 2.5.4.3. Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) .......................... 23 2.5.4.4. Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method) ................................. 23 2.5.4.5. Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LASB) .................................... 24 PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP ............................................................... 25 3.1. Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 25 3.1.1. Thời gian .............................................................................................................. 25 3.1.2. Địa điểm .............................................................................................................. 25 3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 25 3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm ................ 25 3.2.1.1. Vật liệu ............................................................................................................. 25 3.2.1.2. Dụng cụ............................................................................................................. 25 3.2.2. Các hĩa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC ....................................................... 26 3.2.2.1. Hĩa chất ............................................................................................................ 26 3.2.2.2. Vật tƣ ................................................................................................................ 26 3.2.2.3. Thiết bị .............................................................................................................. 26 3.3. Bố trí thí nghiệm ................................................................................................... 27 3.3.1. Tơm và điều kiện thí nghiệm .............................................................................. 27 3.3.2. Virus đốm trắng dịng Việt Nam (WSSV-VN) ................................................... 27 3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tơm sú .............................................................. 27 3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ................. 28 ix 3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ..................................................................................... 28 3.4.1. Phƣơng pháp pha lỗng dịch virus ...................................................................... 28 3.4.2. Phƣơng pháp thu mẫu tơm ................................................................................... 29 3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm IHC .................................................................................... 30 3.4.4. Xử lý thống kê ..................................................................................................... 34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 35 4.1. Độc lực của virus gốc dịng Việt Nam (WSSV-VN) ........................................... 35 4.1.1. Các dấu hiệu lâm sàng và tỷ lệ gây chết .............................................................. 35 4.1.2. Tỷ lệ nhiễm của tơm thí nghiệm theo từng thời điểm ......................................... 36 4.2. Khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dịng Việt Nam trên tơm sú ............................................................................................................ 37 4.2.1. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tơm sú ở liều gây nhiễm thấp (101,5 SID50/ml) ................................................................ 38 4.2.2. Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tơm sú ở liều cao (104,0 SID50/ml) .................................................................................. 42 4.2.3. So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh ............................. 46 4.3. Thảo luận .............................................................................................................. 48 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 50 5.1. Kết luận ................................................................................................................. 50 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 52 PHỤ LỤC ..................................................................................................................... 57 x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT WSSV White Spot Syndrome Virus WSSV-VN White Spot Syndrome Virus – Việt Nam WSSV-TL White Spot Syndrome Virus – Thailand WSD White Spot Disease MBV Monodon Baculovirus YHV Yellow Head Virus proPO Prophenoloxidase PO Phenoloxidase AMPs Antimicrobial Peptides LPS Lipopolysaccharide PG Peptidoglycan PPAE Prophenoloxidase Activating Enzyme CP Clotting Protein TGase Transglutaminase PAMPS Pathogen-associated Molecular Patterns PRR (PRP) Pattern Recognition Receptor (protein) GBP Beta Glucan Binding Protein LPBP Lipopolysaccharide binding protein ICTV International Committee on Taxonomy for Virus SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism SID Shrimp Infectious Dose LD Lethal Dose IHC Immunohistochemistry ctv cộng tác viên xi DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng ............................... 4 Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ............ 27 Bảng 4.1: Tỷ lệ phần trăm (%) tơm biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng ở các thời điểm sau khi gây nhiễm ................................................................................. 34 Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tơm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm ........................................................................................................ 35 Bảng 4.3: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều thấp (%) ................................................................................. 37 Bảng 4.4: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều cao (%) .................................................................................. 41 Bảng 4.5: Tỷ lệ (%) các cơ quan bị nhiễm WSSV-VN theo từng thời điểm khảo sát ... 46 xii DANH SÁCH CÁC HÌNH Trang Hình 2.1: Tơm bị bệnh đốm trắng .................................................................................. 11 Hình 2.2: Hình thái của virus đốm trắng quan sát dƣới kính hiển vi điện tử ................. 12 Hình 2.3: Thành phần các protein của virus đốm trắng ................................................. 13 Hình 2.4: Genome của virus đốm trắng.......................................................................... 14 Hình 2.5: Kháng thể đa dịng và kháng thể đơn dịng .................................................... 20 Hình 2.6: Các phƣơng pháp nhuộm IHC ........................................................................ 21 Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm .................................................................................. 26 Hình 3.2: Gây nhiễm virus trên tơm thí nghiệm ............................................................ 27 Hình 3.3: Tiêm dung dịch Davidson vào đầu tơm ......................................................... 28 Hình 3.4: Các giai đoạn thực hiện IHC .......................................................................... 29 Hình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu ................................................................................. 30 Hình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC ................................................................................. 31 Hình 4.1: Tơm bị nhiễm virus đốm trắng ....................................................................... 35 Hình 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tơm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm................................................................................................. 36 Hình 4.3: Các cơ quan khảo sát quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN .................... 37 Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều thấp. ...................................................................................................... 38 Hình 4.5: Các tế bào của các cơ quan bị nhiễm WSSV ở tơm thí nghiệm liều thấp ...... 40 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều cao ........................................................................................................ 42 Hình 4.7: Các cơ quan bị nhiễm WSSV ở liều cao sau khi nhuộm IHC ........................ 43 Hình 4.8: Đồ thị so sánh tỷ lệ nhiễm trên các cơ quan khảo sát ở liều cao và liều thấp ..................................................................................................... 45 1 PHẦN I: GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh đốm trắng (White Spot Disease) do virus gây hội chứng đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây ra trên tơm sú nuơi. Đây là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm cho nhĩm tơm he, bệnh cĩ sức tàn phá rất lớn, làm tơm chết trong thời gian rất ngắn, gây chết 100 % trong khoảng thời gian từ 3 – 7 ngày (Leong, 2005) và cĩ khả năng lây lan rất nhanh. Chính virus này đã làm suy giảm sản lƣợng tơm hằng năm trên thế giới, gây thiệt đáng kể đến nền kinh tế của nhiều quốc gia trên thế giới, trong đĩ cĩ Việt Nam. Hiện nay, trên thế giới cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về bệnh đốm trắng và WSSV ở nhiều khía cạnh khác nhau nhƣ hình thái, cấu trúc, di truyền, các yếu tố nguy cơ xảy ra dịch bệnh, phát triển thuốc, vaccine… Trong khi đĩ các cơng trình nghiên cứu về quá trình phát sinh bệnh của WSSV lại rất hạn chế. Kết quả của nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh ở các mức độ tế bào, phân tử giúp chúng ta hiểu rõ hơn cơ chế tƣơng tác quan trọng của các giai đoạn virus tiếp cận, xâm nhập, nhân bản, hình thành hạt virus bên trong và phát tán ra ngồi tế bào vật chủ. Từ những kết quả quan trọng này giúp cho chúng ta tìm ra đƣợc các thời điểm hay giai đoạn mấu chốt của quá trình nơi mà chúng ta cĩ thể phát triển các giải pháp can thiệp, ngăn chặn khác nhau (thuốc, vaccine, các yếu tố lý hố...). Đây cũng là hƣớng tiếp cận mới cho WSSV do trƣờng đại học Ghent-Bỉ đề xuất, trong đĩ sử dụng mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và các kỹ thuật nhuộm miễn dịch đặc hiệu sử dụng kháng thể đơn dịng kháng protein VP28 của WSSV để khảo sát quá trình phát sinh bệnh ở các mức độ cơ quan, mơ, tế bào và phân tử. Với phƣơng pháp này, cho phép chúng ta biết đƣợc về quá trình xâm nhiễm của WSSV theo thời gian, tiến trình, mức độ xâm nhiễm của virus ở các cơ quan đích khác nhau. Việc nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tơm sú là rất cần thiết, nĩ làm nền tảng cho các nghiên cứu chuyên sâu và các thí nghiệm đánh giá độ mẫn cảm của các dịng tơm đối với virus, hay tác dụng của các thuốc, chế phẩm, vaccine trên hệ miễn dịch của tơm đối với việc đề kháng lại virus, đồng thời nhằm phát triển các chiến lƣợc kiểm sốt WSSV và sự bùng nổ bệnh đốm 2 trắng ở các mức độ khác nhau trên tơm sú (ở mức độ cá thể, quần thể, ao nuơi, khu nuơi, khu vực nuơi, vùng nuơi và quốc gia). Từ cơ sở quan trọng đĩ, đƣợc sự phân cơng của Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học và sự chấp thuận của Viện Nuơi Trồng Thủy Sản II, tơi đã thực hiện đề tài “Bước đầu khảo sát quá trình phát sinh bệnh (pathogenesis) của virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tơm sú (Penaeus mondon) sử dụng mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn và phương pháp hĩa mơ miễn dịch (immunohistochemistry)” 1.2. Mục đích Thực hiện gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tơm sú sử dụng liều virus SID50/ml đã đƣợc chuẩn độ xác định nhằm khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng trên tơm bằng phƣơng pháp hĩa mơ miễn dịch. 1.3. Nội dung - Gây nhiễm thực nghiệm chuẩn với liều virus SID50/ml thấp và cao trên tơm sú 45 ngày tuổi, theo dõi tơm và thu mẫu theo thời gian sau cảm nhiễm. - Sử dụng IHC để khảo sát quá trình xâm nhiễm của WSSV ở các cơ quan đích khác nhau theo từng thời điểm trên cơ thể tơm. 3 PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Đặc điểm sinh học của hệ miễn dịch tơm sú 2.1.1. Cơ chế phịng vệ chung của giáp xác Hệ thống phịng vệ ở động vật đƣợc chia thành 2 nhĩm chính là miễn dịch thụ động và miễn dịch chủ động. Ở giáp xác khơng cĩ hệ thống miễn dịch chủ động, do đĩ cơ chế phịng vệ của giáp xác chủ yếu dựa vào đáp ứng miễn dịch thụ động (Jiravanichpaisal, 2005). Hệ thống phịng vệ thụ động đĩng vai trị quan trọng trong sự tồn tại của giáp xác. Lớp vỏ bên ngồi là một rào cản vật lý hữu hiệu chống lại sự gắn kết và xâm nhập của các tác nhân gây bệnh. Hệ thống phịng vệ của lớp cutin này rất hiệu quả, chống lại các tác nhân gây bệnh và các tác nhân gây bệnh chỉ tạo nên bệnh tích khi lớp vỏ bọc này bị tổn thƣơng. Đƣờng tiêu hĩa, là con đƣờng chính của sự xâm nhập, đƣợc bảo vệ bằng màng chitin. Trong ruột cĩ mơi trƣờng acid và chứa nhiều enzyme làm bất hoạt và tiêu diệt nhiều loại virus và vi khuẩn. Khi các tác nhân gây bệnh vƣợt qua đƣợc các rào cản trên xâm nhập khoang máu của cơ thể vật chủ, chúng vấp phải một cơ chế phịng vệ phức tạp liên quan đến đáp ứng miễn dịch thể dịch và tế bào. Đầu tiên, hệ thống prophenoloxidase (proPO) đƣợc hoạt hĩa tạo nên quá trình melanin hĩa và tạo ra các nhân tố liên quan đến phản ứng miễn dịch nhƣ peroxinectin. Kế tiếp, đáp ứng miễn dịch tế bào ở nhiều loại tế bào máu khác nhau sẽ tham gia vào quá trình tiêu diệt các mầm bệnh bằng cách thực bào các vi sinh vật hay bẫy chúng trong tế bào máu bằng cách đơng máu hay tạo khối u hoặc đĩng gĩi các vi sinh vật lớn hơn và các phản ứng độc tế bào. Cuối cùng, trong quá trình xâm nhập của vật lạ, một tỷ lệ lớn các phân tử tác động cảm ứng nhƣ các peptide kháng khuẩn (AMPs), các nhân tố cần cho quá trình opsonin hĩa cũng đƣợc tạo ra (Jiravanichpaisal, 2005). 2.1.2. Các tế bào máu tham gia vào đáp ứng miễn dịch của giáp xác Ở động vật cĩ vú, các loại tế bào máu khác nhau đảm nhiệm các chức năng chuyên biệt khác nhau chủ yếu liên quan đến sự sống của cá thể nhƣ sự vận chuyển oxy và sự phịng vệ chống lại sự xâm nhập của vật thể lạ. Ở động vật khơng xƣơng sống, vai trị quan trọng nhất của các tế bào máu là bảo vệ chúng chống lại sự xâm nhập của vật thể lạ (Jiravanichpaisal, 2005). Ở giáp xác, các dạng tế bào máu cĩ thể 4 đƣợc phân biệt dựa trên đặc điểm hình thái và tính chất bắt màu của chúng. Tuy nhiên, các tế bào máu của giáp xác chƣa đạt đến độ biệt hĩa rõ rệt và chƣa thể xếp thành các nhĩm tế bào máu nhƣ ở cá và động vật cĩ xƣơng sống (Đỗ Thị Hịa, 2004). Ở giáp xác thƣờng chứa ba nhĩm tế bào máu: hyaline (bạch cầu khơng hạt), semigranular (bạch cầu bán hạt) và granular (bạch cầu cĩ hạt) (Jiravanichpaisal, 2005; Đỗ Thị Hịa, 2004) với chức năng đƣợc tĩm tắt ở bảng 2.1 Bảng 2.1: Các dạng bạch cầu của giáp xác và chức năng của chúng Nhĩm bạch cầu Chức năng Thực bào Đĩng gĩi Độc tế bào Hoạt hĩa proPO Khơng hạt Cĩ Khơng Chƣa biết Khơng Bán hạt Hạn chế Cĩ Cĩ Cĩ Cĩ hạt Khơng Rất hạn chế Cĩ Cĩ Bạch cầu khơng hạt cĩ khả năng thực bào, phát hiện đƣợc trong máu các lồi giáp xác bộ mƣời chân, nhƣng số lƣợng tƣơng đối của các tế bào này thay đổi tùy theo từng lồi (Đỗ Thị Hịa, 2004). Bạch cầu bán hạt đƣợc đặc trƣng bởi sự tồn tại của một số hạt nhỏ trong tế bào chất tƣơng tự nhƣ bạch cầu cĩ hạt ở động vật cĩ xƣơng sống. Các tế bào này phản ứng với các polysaccharide cĩ trong thành phần của vách tế bào vi sinh vật nhƣ LPS ở vi khuẩn, -1,3-glucan của nấm. Các tế bào này cũng cĩ khả năng đĩng gĩi các hạt ngoại lai (Đỗ Thị Hịa, 2004). Bạch cầu cĩ hạt đặc trƣng bởi các túi hoặc hạt lớn trong tế bào chất. Đặc điểm này cĩ lẽ đĩng vai trị trong việc sản sinh, dự trữ và tiết ra các hợp chất kháng khuẩn. Các bạch cầu cĩ hạt của giáp xác khơng cĩ khả năng thực bào và khả năng đĩng gĩi các hạt ngoại lai rất hạn chế. Vai trị chính yếu của chúng là dự trữ proPO – hợp chất đĩng vai trị chính yếu trong đáp ứng bảo vệ của cơ thể giáp xác. Khi tiếp xúc với - 1,3-glucan, LPS và PG, bạch cầu cĩ hạt tiết và hoạt hĩa proPO thành PO – cĩ tác dụng xúc tác phản ứng oxy hĩa các hợp chất phenol thành quinone và sản phẩm cuối cùng là melanin. Quinone và các sản phẩm trung gian của quá trình này là những chất độc đối với vi sinh vật do hoạt tính cao của chúng (Đỗ Thị Hịa, 2004). 2.1.3. Hệ thống prophenoloxidase (proPO) 5 Động vật khơng xƣơng sống khơng cĩ kháng thể, do đĩ phải dựa vào hệ thống nhận diện khơng đặc hiệu nhƣng chúng vẫn phải nhận biết vật thể lạ và đáp ứng lại nĩ để bƣớc đầu chống lại và tiêu hủy chúng. Quá trình nhận biết các vật thể lạ đƣợc thực hiện nhờ hệ thống proPO (Sritunyalucksana, 2001). Hệ thống proPO chứa nhiều loại protein liên quan đến sự phịng vệ miễn dịch ở động vật khơng xƣơng sống. Đĩ là sự tổng hợp melanin, sự gắn kết tế bào, sự đĩng gĩi và sự thực bào. Hệ thống proPO là một hệ thống miễn dịch nhận diện khơng đặc hiệu cực kỳ hiệu quả và đƣợc hoạt hĩa bằng sự nhận biết các LPS hoặc PG cĩ ở vi khuẩn và -1,3-glucan cĩ ở nấm. Hệ thống chứa một tập hợp proteinase gồm cĩ các protein nhận biết (PRPs), nhiều loại proteinase, các nguồn tạo enzyme và proPO (Lee, 2001). Dạng hoạt động của proPO, phenoloxidase (PO) nằm trong bạch cầu cĩ hạt (Flegel, 1998), cịn đƣợc xem nhƣ là tyrosinase, cĩ khả năng thực hiện hai phản ứng: sự khử monophenol thành o – diphenol (hoạt tính monophenoloxidase) và sự oxy hĩa của o – diphenol thành o – quinone (hoạt tính diphenoloxidase). Sự tạo ra o – quinone của PO là bƣớc đầu tiên của chuỗi phản ứng sinh hĩa tổng hợp melanin (Lee, 2001). Mặc dù melanin đƣợc xem là cĩ hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp, nhƣng sự tạo ra các sản phẩm trong quá trình oxy hĩa nhƣ các anion superoxide, các gốc hydroxyl trong quá trình tạo quinoid cũng cĩ một vai trị kháng khuẩn quan trọng. Thêm vào đĩ, các phản ứng sinh học nhƣ sự thực bào, đĩng gĩi và tạo khối u cũng đƣợc hoạt hĩa.(Flegel, 1998). Hệ thống proPO đƣợc hoạt hĩa bằng các thành phần thành tế bào vi khuẩn nhƣ LPS, -1,3-glucan hay PG, từ đĩ kích thích sự hoạt hĩa của các proteinase trong hệ thống proPO (Lee, 2001). Sau đĩ dƣới điều kiện sinh lý, các protein chuyên biệt của hệ thống proPO cần sự phân cắt của các proteinase này để tạo ra trạng thái hoạt động; hệ thống proPO từ trạng thái bất hoạt với trọng lƣợng phân tử là 76 kDa đƣợc chuyển đổi thành dạng hoạt động cĩ trọng lƣợng phân tử là 62 kDa bằng enzyme hoạt hĩa prophenoloxidase (PPAE) (Sritunyalucksana, 2001). Bên cạnh đĩ, quá trình hoạt hĩa hệ thống proPO cần cĩ sự hiện diện của ion Ca2+. Nếu thiếu Ca2+ thì quá trình hoạt hĩa khơng xảy ra ngay cả khi cĩ các yếu tố kích thích (Flegel, 1998). Tĩm lại, sự hoạt hĩa proPO ở giáp xác liên quan đến hai bƣớc: Bƣớc thứ nhất là quá trình mất hạt xảy ra khi tế bào máu bị kích thích bởi các thành phần của vi khuẩn 6 nhƣ LPS, -glucan hoặc PG và tạo ra dạng bất hoạt của cả proPO lẫn PPAE. Bƣớc thứ hai địi hỏi sự tham gia của Ca2+ để chuyển đổi PPAE bất hoạt thành proteinase hoạt động để phục vụ cho quá trình biến đổi proPO thành PO hoạt động (Flegel, 1998). 2.1.4. Hệ thống đơng máu Một hệ thống khác cũng đƣợc hoạt hĩa bởi các sản phẩm của vi sinh vật là hệ thống đơng máu. Đây là một đáp ứng phịng vệ quan trọng ở giáp xác bởi vì nĩ ngăn chặn sự mất máu khi bị tổn thƣơng ở bộ xƣơng ngồi lẫn sự xâm nhập của vi sinh vật khắp cơ thể. Protein huyết tƣơng cấu thành những khối máu đƣợc gọi là các protein đơng máu (CP) (Flegel, 1998). CP đƣợc tinh sạch từ nhiều lồi giáp xác khác nhau gồm tơm hùm Panulirus interruptus, crayfish P. leniusculus, và tơm thẻ chân trắng P. vannamei. Trong tất cả các trƣờng hợp, CP đƣợc xác định là một glycoprotein với trọng lƣợng phân tử 420 kDa với 2 tiểu đơn vị tƣơng tự nhau đƣợc nối với nhau bằng liên kết disulfide. Thêm vào đĩ, thành phần cấu tạo của CP ở tơm thẻ chân trắng thì cũng tƣơng tự nhƣ crayfish, tơm hùm và cua, mặc dù những lồi này cĩ những loại tế bào đơng máu khác nhau (Flegel, 1998). Yếu tố đĩng vai trị quan trọng của quá trình đơng máu là transglutaminase (TGase) tế bào đƣợc tạo ra bởi tế bào máu (cĩ lẽ là tế bào khơng hạt) dƣới sự kích thích của các tác nhân ngoại bào. Kết quả phản ứng phân giải của TGase là tạo thành những liên kết chéo -( -glutamyl)-lysine nội phân tử giữa mặt bên của gốc glutamine trên một chuỗi polypeptide với mặt bên của gốc lysine trên một chuỗi polypeptide khác (Vargas-Albores và ctv, 1998; Flegel, 1998) Mặc dù cĩ sự khác nhau trong cấu trúc nhƣng hệ thống đơng máu của động vật cĩ xƣơng sống và động vật khơng cĩ xƣơng sống cĩ cơ chế tƣơng tự nhau mặc dù cách thức thực hiện khác nhau. Trong cả hai trƣờng hợp, khối đơng đƣợc hình thành bởi sự hoạt động của TGase kết hợp với Ca2+ trên các tế bào huyết tƣơng gây đơng, fibrinogen hoặc protein gây đơng. Tuy nhiên ở động vật cĩ xƣơng sống, địi hỏi quá trình phân cắt protein trƣớc đĩ (fibrinogen thành fibrin) để tạo nên cơ chất cho TGase trong huyết tƣơng. Trái lại, TGase ở tơm đƣợc giữ trong các tế bào máu (giống nhƣ các lồi động vật khơng xƣơng sống khác) và hoạt động ngay lập tức khi đƣợc giải phĩng. Xem nhƣ quá trình phân cắt protein trƣớc đĩ khơng cần thiết, chỉ cần sự kích 7 thích của bạch cầu khơng hạt cùng với sự xuất hiện của LPS vi khuẩn là đủ để kích thích sự giải phĩng TGase và dẫn đến quá trình đơng máu tiếp theo (Vargas-Albores và ctv, 1998; Flegel, 1998). 2.1.5. Các chất ức chế proteinase Các nhĩm proteinase, nhƣ nhĩm gây đơng máu và hệ thống proPO cần thiết cho quá trình điều hịa để ngăn ngừa sự hoạt hĩa quá mức của các nhĩm enzyme nội sinh và gây hại tế bào vật chủ. Hoạt động của các chất ức chế proteinase đƣợc tìm thấy ở nhiều lồi động vật khơng cĩ xƣơng sống, đĩng vai trị quan trọng trong quá trình kiểm sốt và điều hịa hoạt động của hệ thống đơng máu và hệ thống proPO. Các nhĩm chất ức chế đƣợc tìm ra nhƣ Kasal, Kunitz, serpin, -macroglobulin và chất ức chế metalloproteinase (Jiravanichpaisal, 2005) Trong số các chất ức chế proteinase ức chế hoạt động của hệ thống proPO thì cĩ nhiều chất ức chế proteinase ngăn chặn sự hoạt hĩa quá mức của PPAE và một chất ức chế phenoloxidase trực tiếp ức chế hoạt tính của phenoloxidase. Chất ức chế PPAE hiệu quả nhất ở crayfish là pacifastin, một protein heterodimer 155 kDa với một cấu trúc duy nhất. Nĩ chứa một chuỗi nhẹ với 9 đơn vị ức chế proteinase và một chuỗi nặng chứa 3 thùy transferrin. Phân tử này đƣợc gắn bằng các liên kết giữa các peptide và hình thành nên một chất ức chế proteinase mới đƣợc gọi là các chất ức chế serine proteinase giống pacifastin, hiện diện và ức chế hệ thống proPO ở nhiều lồi giáp xác (Jiravanichpaisal, 2005). 2.1.6. Hệ thống nhận diện khơng chuyên biệt Hệ thống miễn dịch thụ động ở động vật khơng xƣơng sống đƣợc hoạt hĩa bởi các tác nhân gây bệnh và nĩ là trung gian cho phản ứng giữa các phân tử nhận diện và tác nhân gây bệnh. Những phân tử nhận diện các vật thể lạ đƣợc Janeway gọi là các protein nhận diện kháng nguyên (PRP) (Lee, 2001). Các PRP này nằm trên bề mặt của tế bào hoặc ẩn trong hemolymph, để sẵn sàng nhận diện sự xâm nhập của vi sinh vật lạ (Jiravanichpaisal, 2005). Một số protein nhận diện đã đƣợc tìm thấy ở động vật khơng xƣơng sống. Đĩ là: Lectin/ agglutinin là những glycoprotein khơng cĩ hoạt tính phân giải nhƣng cĩ khả năng gắn kết với các carbohydrate chuyên biệt và cĩ mặt ở hầu hết các sinh vật sống. Chúng cĩ thể gắn kết tế bào và tạo ra phản ứng ngƣng kết. Tƣơng tác giữa lectin 8 và carbohydrate cĩ liên quan đến nhiều hoạt động sinh học khác nhau ví dụ nhƣ là sự vận chuyển carbohydrate của mơ và tế bào, các glycoprotein, sự gắn kết tế bào, sự opsonin hĩa và sự hình thành các khối u. Đặc biệt, các lectin type C, các lectin cĩ hoạt tính phụ thuộc vào Ca cĩ liên quan đến sự nhận biết miễn dịch ở động vật khơng xƣơng sống (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005; Newman, 2001) GBP và LPBP cĩ trình tự tƣơng tự nhƣ glucanase ở vi khuẩn nhƣng chúng khơng biểu hiện bất kỳ hoạt tính nào của glucanase và thay vào đĩ là làm tăng sự hoạt hĩa hệ thống proPO. Các GBP ở crayfish nằm trong huyết tƣơng và tƣơng tác với - 1,3- glucan để gia tăng sự hoạt hĩa của hệ thống proPO và cũng hoạt động nhƣ một opsonin để tăng khả năng thực bào (Jiravanichpaisal, 2005). Protein giống masquerade (mas-like protein) là một protein nhận diện kháng nguyên trong tế bào máu vì nĩ cĩ khả năng gắn với LPS, -1,3-glucan, vi khuẩn gram (-) và nấm men. Các mas-like protein cũng cĩ hoạt tính opsonin và gắn kết tế bào. Do đĩ, các mas-like protein là một protein đa chức năng. Trình tự aminoacid của nĩ tƣơng đồng với serine proteinase ngoại trừ sự thay thế bộ ba xúc tác  khơng cĩ hoạt tính phân giải (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005) Hemolin thuộc liên họ immunoglobulin chứa những vùng giống Ig cĩ thể gắn với phần lipid A của LPS và vi khuẩn gram (-) (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005). Vai trị của hemolin trong động vật khơng xƣơng sống vẫn chƣa đƣợc xác định rõ ràng, tuy nhiên cĩ những báo cáo cho rằng hemolin cĩ khả năng nhận biết khơng chuyên biệt và tạo ra đáp ứng miễn dịch và cũng cĩ vai trị trong sự hình thành thần kinh (Lee, 2001) 2.1.7. Các peptide kháng khuẩn Các peptide/polypeptide chống lại vi sinh vật (AMPs) do gene mã hĩa cĩ vai trị rất lớn trong giới sinh vật sống từ vi sinh vật đến thực vật và động vật. Một phần quan trọng của hệ miễn dịch tự nhiên là tạo ra những chất chống lại vi sinh vật mà chủ yếu là các peptide. Bình thƣờng, AMPs chứa ít hơn 150 – 200 amino acid và đƣợc tạo ra bởi nhiều loại tế bào khác nhau. Dựa vào sự phân bố trên mơ của chúng, cĩ thể chắc chắn rằng AMPs cĩ khả năng bảo vệ vật chủ chống lại các mầm bệnh (Jiravanichpaisal, 2005; Newman, 2001). 9 Nhiều peptide chống vi sinh vật đã đƣợc xác định từ nhiều lồi cơn trùng và chelicerate, nhƣng cũng cĩ một số peptide đƣợc tìm thấy ở giáp xác. Trong thập kỷ vừa qua, nhiều AMP đã đƣợc phân lập từ cua, tơm và crayfish. Một peptide 6.5 kDa và 3.7 kDa (callinectin) đã đƣợc xác định một phần từ tế bào máu của cua. Một họ AMP cĩ cả hoạt tính kháng khuẩn lẫn kháng nấm đƣợc phân lập từ máu của tơm Litopenaeus vannamei và đƣợc đặt tên là penaeidin (Destoumieux và ctv, 1997). Gần đây, histone H2A đƣợc tạo dịng và xác định từ tơm, L. vannamei và đầu N của nĩ đƣợc tìm thấy là cĩ tính tƣơng đồng với các peptide histone kháng khuẩn đã biết là buforin I, parasin và hipposin. Các nhân tố kháng lipopolysaccharide (ALFs) đƣợc tìm thấy trong tế bào máu của cua và gần đây là tế bào máu của P. monodon. ALF tái tổ hợp cĩ một phổ kháng nấm và vi khuẩn rộng chống lại cả vi khuẩn gram (-) lẫn vi khuẩn gram (+). Hai AMP khác, crustin và peptide cĩ nguồn gốc từ hemocyanin cũng đƣợc tìm thấy ở tơm và crayfish. Crustin, một peptide kháng khuẩn 11.5 kDa đƣợc tìm thấy ở Carcinus maenas. Đầu C của hemocyanin cĩ hoạt tính kháng nấm nhƣng cơ chế mà hemocyanin bị phân cắt và đƣợc hoạt hĩa ở tơm vần chƣa rõ ràng. Cuối cùng, 2 peptide kháng khuẩn với trọng lƣợng phân tử thấp tên là astacidin 1 và 2 đƣợc tinh sạch và xác định từ máu của crayfish P. leniuscus. Asticidin 1 với 16 amino acid đƣợc tạo ra do sự phân cắt của hemocyanin trong khi asticidin 2 với 14 aa, là một peptide giàu proline (Lee, 2001; Jiravanichpaisal, 2005). 2.1.8. Peroxinectin Trong quá trình hoạt hĩa hệ thống proPO, peroxinectin, một nhân tố gắn kết tế bào với hoạt tính peroxidase đƣợc tạo ra. Peroxinectin đƣợc tổng hợp trong các tế bào máu ở trạng thái bất hoạt, chỉ đƣợc giải phĩng khi cĩ các vật thể lạ kích thích và đƣợc hoạt hĩa bên ngồi tế bào để thực hiện sự gắn kết. Ngồi khả năng gắn kết tế bào và hoạt tính peroxidase, peroxinectin cũng là một nhân tố làm mất hạt của tế bào máu, một yếu tố mở đầu cho quá trình đĩng gĩi và opsosin hĩa (Sritunyalucksana, 2001). Chức năng gắn kết của peroxinectin đƣợc thực hiện thơng qua những motif gắn integrin, KGD- hoặc RGD motif. Ngồi việc gắn với integrin, peroxinectin cũng cĩ thể gắn đƣợc với Cu-Zn-superoxide dismutase bề mặt tế bào máu ngoại vi. Peroxinectin cĩ thể tạo ra acid hypohalic từ hydrogen peroxide và do đĩ nĩ cĩ chức năng nhƣ là một hệ thống tấn cơng vi sinh vật hiệu quả chống lại sự xâm nhập của chúng (Sritunyalucksana, 2001). 10 2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 2.2.1. Bệnh đốm trắng 2.2.1.1. Lịch sử và phân bố Virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) là một trong những nhĩm virus đƣợc xếp vào nhĩm virus gây chết cấp tính trên tơm nuơi. WSSV gây chết trên hầu hết các lồi tơm thuộc nhĩm Penaeus nhƣ P. monodon, P. japonicus, P.chinensis, P. merguiensis… và trên tất cả các giai đoạn phát triển của tơm từ ấu trùng đến tơm giống, tơm trƣởng thành (Lý Thị Thanh Loan, 2003). Mặc dù bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên vào năm 1992 tại Đài Loan, nhƣng bằng chứng cụ thể lần đầu tiên về căn bệnh này và tác nhân gây bệnh đƣợc biết vào năm 1993. Sự bùng nổ căn bệnh này xảy ra ở Nhật Bản và ở các trang trại nuơi tơm Penaeus japonicus. Trong dịch bệnh này, tỷ lệ tơm chết cao đƣợc tìm thấy trong tất cả các trang trại nuơi tơm cĩ nhập khẩu tơm giống từ Trung Quốc  một số tác giả cho rằng virus cĩ nguồn gốc từ Trung Quốc. Một năm sau đĩ, một nhĩm nghiên cứu viên Trung Quốc đã xác nhận bệnh đốm trắng (WSD) hiện diện ở Trung Quốc vào đầu năm 1993 (Zhang và ctv, 1998), chính điều này đã giải thích đƣợc điểm khởi đầu bùng nổ dịch bệnh. Năm 1994, sự hiện diện của WSSV đã cĩ ở hầu hết các quốc gia cĩ nuơi tơm ở châu Á nhƣ: Hàn Quốc, Đài Loan, Việt Nam, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Ấn Độ… Ở Việt Nam, vào tháng 2 năm 1994, tại huyện Bình Đại, huyện Thạnh Phú – tỉnh Bến Tre và tháng 3 đến tháng 4 năm 1994 tại các đầm nuơi ở huyện Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh đã phát hiện tơm bị bệnh đốm trắng chết hàng loạt sau 30 – 40 ngày nuơi (Lý Thị Thanh Loan, 2003) Năm 1995, WSSV gây chết tơm hàng loạt ở Texas ở các nơng trại nhập khẩu tơm từ châu Á (Lightner, 1999). Vào năm 1997, WSSV đƣợc tìm thấy ở miền Nam Carolina và chính sách cách ly đƣợc thực hiện nghiêm ngặt ở bang này để kiểm sốt dịch bệnh nhƣng ngƣời dân vẫn bị thiệt hại rất nhiều. Vào năm 1998, cơng bố một nghiên cứu đã phát hiện sự nhiễm WSSV trong tơm thƣơng mại nhập khẩu lấy từ các siêu thị ở Mỹ và sự rủi ro của việc mang WSSV từ châu Á sang châu Mỹ qua nguồn tơm sống và tơm đơng lạnh ngày càng rõ ràng hơn. Đến năm 1999 thì vùng phân bố địa lý của virus đã lan rộng đến nhiều nơng trại nuơi tơm ở Nicaragua, Guatemela, Panama, Ecuador. Sự xuất hiện của WSSV ở vùng Trung Mỹ và châu Mỹ La tinh đã 11 khiến Chính phủ các nƣớc ở khu vực này phải cĩ các biện pháp kiểm sốt. Chính phủ Peru đã chính thức cấm nhập khẩu ấu trùng tơm và tơm bố mẹ và Mexico cho phép nhập khẩu tơm từ Texas chỉ khi cĩ chứng nhận là trong sản phẩm khơng cĩ WSSV (Nguyễn Văn Hảo, 2000) 2.2.1.2. Dấu hiệu bệnh tích a. Dấu hiệu bên ngồi Tơm nhiễm bệnh xuất hiện dấu hiệu đỏ thân cùng với đốm trắng bên trong lớp vỏ đầu ngực, các đốm trắng cĩ kích thƣớc từ 0,5 đến 2 mm xuất hiện đầu tiên trên lớp vỏ đầu ngực và ở đốt đuơi cuối cùng (Chou và ctv, 1995; Kou và ctv, 1998). (Hình 2.1A) Tơm bị bệnh đốm trắng dễ dàng phát hiện ở tơm nhỏ (juvenile) và sắp trƣởng thành (sub-adult) b. Dấu hiệu bên trong Tế bào tơm bị bệnh đốm trắng cĩ hiên tƣợng trƣơng nhân (Chou và ctv, 1995). Gan tụy trƣơng nhân cĩ màu trắng vàng và trở nên dịn hơn Dấu hiệu đặc trƣng về mơ bệnh học là sự xuất hiện của các thể vùi Crowdry type A trong nhân trƣơng (Lightner, 1996) (Hình 2.1B) Hình 2.1: Tơm bị bệnh đốm trắng (Vlak, 2005) A: Các dấu hiệu lâm sàng (đỏ thân và xuất hiện đốm trắng) B: Tế bào nhiễm đốm trắng bị trƣơng nhân 2.2.2. Virus đốm trắng 2.2.2.1. Phân loại và tên gọi Sự phân loại của WSSV thì khơng rõ ràng. Trong những năm đầu thì WSSV đƣợc phân vào họ Baculoviradae, họ phụ là Nudibaculovirinae do hình thái và cấu trúc genome của nĩ (Wang và ctv, 1995; Wongsteerasupaya và ctv, 1995). Tuy nhiên, 12 sáu báo cáo trong Hội đồng phân loại học virus quốc tế (ICTV) đã phủ nhận họ phụ này. Do WSSV khơng cĩ quan hệ với nguồn gốc của Baculovirus đƣợc chứng minh qua sự phân tích hệ thống phát sinh lồi, nên một nhĩm nghiên cứu đã đề nghị là tạo ra một họ mới, là Whispovirus (van Hulten, 2001) Hiện nay, virus đốm trắng thuộc họ Nimaviridae, giống Whispovirus, tên gọi là virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus) Hiện nay trên thế giới đã thống nhất tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng là White Spot Syndrome Virus. 2.2.2.2. Hình thái Vỏ WSSV là những tiểu phần đối xứng, cĩ hình ellipse hoặc hình que, khơng tạo thể ẩn, đƣờng kính từ 120 – 150 nm, chiều dài từ 270 – 290 nm. WSSV cĩ một phần phụ giống nhƣ đuơi ở điểm cuối của vỏ. Một số loại nucleocapsid cá biệt cĩ đƣờng kính từ 65 – 70 nm, chiều dài từ 300 – 350 nm (Van Hulten và các ctv, 2001) A B 2.2.2.3. Cấu trúc Cấu trúc của virus đốm trắng gồm cĩ 3 phần: màng bao (envelope), nucleocapsid và vật chất di truyền - Màng bao: chứa hai loại protein là VP28 và VP19. VP28 nằm trên bề mặt của vỏ virus và đĩng vai trị chủ yếu trong quá trình gây bệnh của virus đốm trắng (van Hulten, và ctv, 2001) - Nucleocapsid đƣợc phân lập cĩ những đƣờng chéo song song và kích thƣớc khoảng 300 x 70 nm (Hình 2.3). Nucleocapsid đƣợc hình thành bởi số lƣợng lớn các vịng (khoảng 14 trong tổng số) mà những vịng này đƣợc tạo ra từ những tiểu thể hình cầu rỗng cĩ đƣờng kính khoảng 8 nm, xếp thành hai hàng song song. Nucleocapsid Hình 2.2 Hình thái của virus đốm trắng quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (Vlak, 2005) (A): phần vỏ (B): nuclocapsid 13 chứa genome của virus và phần lớn là các protein mã hĩa cho WSSV là VP664, VP26, VP24, VP15 (Leu và ctv, 2005; van Hulten và ctv, 2002). VP664, một protein lớn chứa 6.077 amino acid đƣợc mã hĩa bởi một khung đọc mở (ORF) với 18.234 nucleotide và cĩ trọng lƣợng phân tử 664 kDa, đƣợc xem là protein lõi, chịu trách nhiệm tạo nên những sọc cho nucleocapsid (Leu và ctv, 2005). VP15, một protein khơng cĩ vùng kỵ nƣớc, là một protein giống histon, một protein gắn với DNA mạch đơi (Witteveldt và ctv, 2005). Chức năng của VP26 và VP24 trên nucleocapsid vẫn chƣa rõ. Hơn nữa, cĩ khoảng 40 protein thứ yếu mã hĩa cho WSSV đã đƣợc xác định bằng cách giải trình tự protein của từng band sau khi phân tích virion WSSV bằng SDS-PAGE (Leu và ctv, 2005; Tsai và ctv, 2004; van Hulten và ctv, 2002). Tùy vị trí địa lý phân lập WSSV khác nhau mà khi xác định các đặc điểm thì chỉ cĩ điểm tƣơng tự nhƣng khơng tƣơng đồng về hình thái và proteome (Wang và ctv, 2000). Hình 2.3: (A): Gel protein của WSSV đã đƣợc tinh sạch (1: marker, 2: nucleocapsid và vỏ của WSSV đã đƣợc tinh sạch. (Lo và ctv, 2004). (B): Mơ hình virion của virus đốm trắng (Vlak và ctv, 2002) A 14 - - Vật chất di truyền của virus đốm trắng là phân tử DNA mạch đơi, siêu xoắn, dạng vịng (Hình 2.4). Giữa những khu vực phân lập WSSV khác nhau thì sẽ cĩ sự đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP). Cụ thể là cĩ 3 chủng virus đốm trắng cĩ kích thƣớc khác nhau thu đƣợc ở 3 vùng khác nhau là Trung Quốc, Đài Loan, Thái Lan: WSSV-CN cĩ kích thƣớc 305107 bp (Genbank Acceession No. AF332093), WSSV- TH cĩ kích thƣớc 292967 (GenBank Accession No. AF369029), WSSV-TW cĩ kích thƣớc 307287 (GenBank Accession No. AF440570) (van Hulten, 2001). Hình 2.4: Genome của virus đốm trắng (Yang và ctv, 2001) Hình mũi tên (vịng ngồi): Vị trí của 181 ORFs (màu đỏ và màu xanh chỉ hướng dịch mã khác nhau). Hình chữ nhật màu xanh lá chỉ 9 hrs. B: Vị trí cắt giới hạn của enzyme BamHI (vịng trong, số trong ngoặc đơn chỉ vị trí) 2.3. Quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng 2.3.1. Vật liệu gây bệnh 15 Theo Qi và ctv (2004), vỏ protein đĩng vai trị rất quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của nhiều loại virus khác nhau. Một số loại virus ở ngƣời nhƣ virus sởi, virus vaccinia, các protein vỏ hoạt động nhƣ một protein gắn kết trên bề mặt tế bào để gắn lên tế bào và làm tiền đề cho việc xâm nhiễm. Ở HBV trên vịt, protein vỏ L giúp cho virus di chuyển đến màng tế bào. Tƣơng tự thì protein vỏ của virus đốm trắng cũng thực hiện những chức năng đĩ. Do đĩ, protein vỏ này đĩng vai trị cực kỳ quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của virus đốm trắng. Một cơng trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng protein vỏ, VP28, liên quan đến quá trình xâm nhiễm vào cơ thể của tơm bằng một thí nghiệm trung hịa in vivo. Cơng trình nghiên cứu duy nhất về chức năng của VP28 đã chứng minh rằng nĩ chịu trách nhiệm gắn lên các receptor bề mặt tế bào chuyên biệt. Về đặc điểm sinh học của VP28, cĩ 5 vị trí cĩ khả năng thực hiện glycosyl hĩa đầu N, 2 vị trí glycosyl hĩa đầu O và 9 vị trí cĩ thể thực hiện sự phosphoryl hĩa. Tuy nhiên cĩ một vùng kỵ nƣớc cực mạnh hiện diện ở đầu N của VP28. Cấu trúc sinh học của VP28 chứng minh rằng nĩ cĩ thể đĩng vai trị là một protein gắn kết (Qi và ctv, 2004). Vai trị của VP28 - Protein vỏ VP28 cĩ thể gắn lên các tế bào của tơm và cĩ vai trị quan trọng trong sự tƣơng tác giữa virus và tế bào. Sử dụng kháng thể đơn dịng chống lại VP28, thu đƣợc kết quả kháng thể này trung hịa VP28  ngăn chặn quá trình xâm nhiễm của virus. - Khả năng gắn kết của VP28 lên tế bào của tơm phụ thuộc vào nồng độ. - Sự gắn kết của VP28 lên tế bào phụ thuộc vào pH. Nghiên cứu của Qi và ctv (2004) đã chứng minh rằng pH 6.0 là pH tốt nhất cho sự gắn kết lên tế bào của WSSV - VP28 khơng chỉ gắn trên tế bào mà cịn xâm nhập vào tế bào chất trong quá trình gắn kết và xâm nhập của WSSV vào tế bào của tơm. Tĩm lại, quá trình xâm nhiễm của virus đốm trắng đƣợc mơ tả nhƣ sau: Đầu tiên, VP28 trên bề mặt của virus sẽ gắn lên bề mặt của tế bào và làm trung gian cho quá trình xâm nhiễm của virus bằng cách gắn trực tiếp lên các receptor chuyên biệt cho WSSV hay đẩy mạnh quá trình xâm nhập bằng cách hoạt hĩa vị trí dung hợp để cho WSSV xâm nhập vào tế bào. Từ đĩ, VP28 cĩ thể thu đƣợc khơng chỉ trên bề mặt tế bào mà cịn trong tế bào chất (Qi và ctv, 2004). 16 2.3.2. Cơ chế xâm nhiễm  Cơ quan đích của virus đốm trắng: Trong giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm, virus đốm trắng xâm nhập vào dạ dày, mang, biểu bì, những mơ liên kết của gan tụy. Ở giai đoạn sau đĩ là cơ quan bạch huyết, tuyến an-ten, mơ cơ, mơ tạo máu, tim, đoạn ruột sau, và một số phần của ruột giữa. Hệ thần kinh và những cặp mắt kép chỉ bị nhiễm ở giai đoạn cuối. Nhƣ vậy, dạ dày, mang, biểu bì, cơ quan bạch huyết, mơ tạo máu, và tuyến an-ten bị nhiễm rất nặng ở giai đoạn cuối (Hendrik Marks, 2005). Tuy chƣa cĩ báo cáo về đƣờng xâm nhập của WSSV vào tế bào nhƣng các nhà khoa học đã xác định sự sao chép, trƣởng thành và lắp ráp của virion xảy ra trong nhân. Ở nhân, trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, xuất hiện những thể hình sợi, hình hạt (cĩ thể là chất nền của virus), những cấu trúc giống nhƣ màng. Sau đĩ cĩ thể quan sát thấy những ống dài và rỗng. Những ống nhỏ này vỡ ra thành từng mảnh nhỏ, hình thành nucleocapsid. Cĩ hai giả thuyết về sự phát triển hình dạng WSSV. Theo một số tác giả, trƣớc khi phần lõi đi vào trong thì nucleocapsid đã đƣợc bao phủ bởi màng (envelop), để lại một khoảng hở. Protein nhân (nucleoprotein) dạng sợi chui vào trong capsid qua khoảng hở này. Khi phần lõi hồn tất, phần bao thu hẹp đầu hở và tạo thành đuơi của virion trƣởng thành. Trái lại, một số tác giả khác lại cho rằng nucleocapsid hồn chỉnh đƣợc lắp ráp đầu tiên, sau đĩ mới đƣợc bao lại (Wang và ctv, 2000). Sau khi lắp ráp, virion trƣởng thành cĩ thể kết lại với nhau thành một dãy hoặc phân tán trong dịch nhân. Làm thế nào WSSV virion rời khỏi tế bào chủ vẫn chƣa đƣợc biết rõ nhƣng sau khi virion phá vỡ tế bào nhiễm bệnh thốt ra ngồi, chúng tiếp tục xâm nhập vào các tế bào bên cạnh hoặc theo phân thải ra mơi trƣờng ngồi. Tơm ăn phải virus tự do trong bùn ao và nƣớc sẽ nhiễm bệnh (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Ngọc Ánh Mai, 2005). 2.3.3. Cơ chế lây lan Quá trình truyền lây xảy ra khi mầm bệnh đƣợc truyền từ nguồn bệnh (cá thể bệnh, yếu tố truyền lây, trực tiếp từ mơi trƣờng ngồi) vào cơ thể cá thể khỏe, lúc này cá thể đã bị nhiễm bệnh. Mầm bệnh WSSV cĩ thể truyền lan theo hai trục: Trục ngang: là con đƣờng chủ yếu. Từ nguồn nƣớc, từ thức ăn, từ các giáp xác hoang dã trong ao, đặc biệt là do tơm khỏe ăn tơm chết do bị bệnh đốm trắng 17 trong ao, đây là con đƣờng lây lan rất nhanh gây chết tơm hàng loạt (Tookwinas, 1998). Một số lồi tơm hoang dã và giáp xác khác đƣợc xem là vật truyền lan gây bùng nổ bệnh đốm trắng trong ao nuơi khi chúng xâm nhập vào thơng qua con đƣờng thay nƣớc (Limsuwan và ctv,1997). Bằng xét nghiệm sinh học (bioassay) và mơ học cho thấy cua, tơm nƣớc ngọt, tơm hùm cĩ thể đĩng vai trị nhƣ là vật chủ mang hoặc chuyên chở mầm bệnh khơng triệu chứng (asymtomatic). Tơm hùm đĩng vai trị chính nhƣ là vật chủ dự trữ đối với WSSV; nĩ cĩ thể bị nhiễm từ phân chim, nƣớc thải ra biển và cĩ thể mang WSSV trong thời gian dài mà khơng bị bệnh, là nguồn lây nhiễm cho nguồn tơm bố mẹ tự nhiên (Rajendran và ctv, 1999). Ngồi ra cịn cĩ những tác nhân khác nhƣ các lồi vật ăn thịt nhƣ cá, chim, chĩ, mèo sẽ đƣa mầm bệnh từ ao này sang ao khác làm lan tràn dịch bệnh, những tác động của con ngƣời qua thao tác trong quá trình nuơi. Sử dụng phƣơng pháp lai DNA chỉ ra rằng ruột và mang tơm sú là đƣờng xâm nhập của virus đốm trắng vào cơ quan tạo máu, mang là nơi sinh sản ra virus (Chang và ctv, 1996) . Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con. Tuy nhiên, khả năng truyền theo trục dọc vẫn chƣa đƣợc chứng minh mặc dù SEMBV đã đƣợc phát hiện trong một số giai đoạn trứng tơm khi quan sát dƣới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998). 2.4. Mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn virus trên tơm Mơ hình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn là mơ hình đƣợc xây dựng nghiêm ngặt theo những điều kiện, tiêu chí nhất định đƣợc duy trì trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm nhằm gây nhiễm mầm bệnh virus, vi khuẩn trên vật chủ với liều lƣợng xác định nhằm khảo sát đặc tính, đánh giá hoạt lực của mầm bệnh gây ra trên cơ thể vật chủ. Quá trình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn đƣợc xây dựng ở đây nhằm xác định độc lực của mầm bệnh dựa trên việc xác định ID50 (infectious dose 50%) và LD50 (lethal dose 50%) 2.4.1. ID50 và LD50 A. ID50 18 - ID50 là liều lƣợng mầm bệnh xác định sử dụng cĩ thể gây nhiễm 50% động vật thí nghiệm. - Liều gây nhiễm 50 % đồng thời đo lƣờng khả năng chịu đựng của vật chủ đối với một mầm bệnh xác định, từ đĩ cho ta một cái nhìn khái quát về độc lực của mầm bệnh đĩ. B. LD50 LD50 là liều lƣợng mầm bệnh xác định khi sử dụng cĩ thể gây chết 50 % động vật thí nghiệm. 2.4.2. Một số thí nghiệm gây nhiễm thực nghiệm chuẩn trên tơm Thí nghiệm vaccin (Trích trong bài nghiên cứu “Vaccination of Penaeus monodon by injection of WSSV structural virion proteins” (Witterveldt, 2002). Trong thí nghiệm vaccin, tơm cĩ khối lƣợng khoảng 1 g đƣợc tiêm vào cơ ở đốt thứ 4 hoặc 5 của phần bụng với protein tinh sạch pha lỗng. 5 ngày sau khi tiêm vaccin lần đầu tiên, tơm đƣợc tiêm tiếp với cùng 1 lƣợng protein. Hai ngày sau khi tiêm lần 2 cho tơm, tơm đƣợc cảm nhiễm bằng tiêm virus đốm trắng với độ pha lỗng sao cho đạt đƣợc tỷ lệ chết là 70-90% trong thí nghiệm 1 và tỷ lệ chết là 100% trong thí nghiệm 2. Sau khi cảm nhiễm, tơm đƣợc nuơi trong những hồ riêng biệt để ngăn ngừa tình trạng nhiễm chéo virus đốm trắng. Chuẩn độ in vivo và cảm nhiễm WSSV trên tơm (Trích trong bài nghiên cứu “Oral vaccination of Penaeus monodon for protection against WSSV” (Witterveldt, 2004) Trong thí nghiệm này, tơm đƣợc cảm nhiễm bằng cách ngâm trong nƣớc. Để xác định số lƣợng mong muốn của virus để cảm nhiễm thu đƣợc tỷ lệ chết là 75% virus stock đƣợc chuẩn bị và đƣợc chuẩn độ in vivo. Tơm cĩ khối lƣợng khoảng 1g đƣợc ngâm vào những dịch WSSV khác nhau trong khoảng thời gian là 7 giờ. Sau đĩ vớt tơm ra, rửa và đặt vào những hồ riêng biệt để ngăn ngừa sự nhiễm chéo. Sự tử vong của tơm đƣợc ghi lại 2 lần mỗi ngày và tơm chết đƣợc kiểm tra sự hiện diện của WSSV bằng PCR. Thí nghiệm chuẩn độ virus (Trích trong bài nghiên cứu “In vivo titration of white spot syndrome virus (WSSV) in specific pathogen-free Litopenaeus vannamei by instramuscular and oral routes”) 19 Kích cỡ tơm sử dụng trong thí nghiệm này nhỏ nhất là 6 -7 g. Tơm trong thí nghiệm này đƣợc gây nhiễm qua đƣờng miệng. Quy trình gây nhiễm nhƣ sau: sử dụng một ống hút dẻo vơ trùng và một mặt kính phĩng đại (2,5X) đặt vào miệng tơm sau đĩ đặt tơm nằm dọc và chuyển dịch virus vào cơ thể tơm qua đƣờng miệng. 2.5. Phƣơng pháp hĩa mơ miễn dịch 2.5.1. Nguyên lý Hĩa mơ miễn dịch (IHC) là kỹ thuật sử dụng kết hợp giữa miễn dịch học và mơ học để phát hiện kháng nguyên trong mơ. Kháng nguyên đƣợc nhận biết bằng kháng thể chuyên biệt. Phản ứng miễn dịch đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi bằng cách thêm một enzyme, một cơ chất của enzyme và một chất tạo màu để tạo nên một phản ứng màu. Hĩa mơ miễn dịch là một kỹ thuật rất nhạy và chuyên biệt (ihcworld.com) Hĩa mơ miễn dịch đƣợc tiến hành qua các bƣớc cơ bản sau: - Bƣớc 1: Kháng thể ban đầu gắn với kháng nguyên chuyên biệt - Bƣớc 2: Phức hợp kháng thể - kháng nguyên đƣợc gắn với kháng thể thứ hai, kháng thể này cĩ gắn enzyme - Bƣớc 3: Với sự hiện diện của cơ chất và chất tạo màu, enzyme hình thành nên một dạng màu sắc ở vị trí gắn kết giữa kháng thể và kháng nguyên 2.5.2. Kháng nguyên Theo Stites và ctv (1987) kháng nguyên là những chất khi đƣa vào cơ thể một động vật cĩ thể kích ứng một phản ứng miễn dịch mà ta cĩ thể nhận biết đƣợc (miễn dịch thể dịch, miễn dịch tế bào, hay thƣờng là cả hai loại). Bản chất hĩa học của kháng nguyên thƣờng là những đại phân tử protein. Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites và ctv, 1987). Những phân tử lớn là những kháng nguyên mạnh nhƣng chỉ cĩ một số vùng giới hạn trên những phân tử đĩ tham gia gắn kết thật sự với vị trí kết hợp trên kháng thể. Những vùng này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên – kháng thể và đƣợc gọi là vùng quyết định (antigen determinant) hay vùng phản ứng. Epitope là dạng đơn giản nhất của vùng phản ứng trong phân tử kháng nguyên phức tạp. Lƣợng vùng phản ứng trên kháng nguyên thay đổi tùy theo kích thƣớc và tính phức tạp của kháng nguyên (Stites và ctv, 1987). 2.5.3. Kháng thể 20 Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhĩm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhĩm chính, đƣợc xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đĩ, IgG và IgM thƣờng đƣợc dùng trong hĩa mơ miễn dịch. Cĩ hai loại kháng thể A B Hình 2.5: Kháng thể đa dịng và kháng thể đơn dịng (Boenisch và ctv, 2002). A: Kháng thể đa dịng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên B: Kháng thể đơn dịng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên  Kháng thể đa dịng (polyclonal antibodies): Đƣợc tạo ra bởi những tế bào plasma khác nhau nên thƣờng khơng đồng nhất về hĩa miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và khơng đặc hiệu. Kháng thể đa dịng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dịng nhƣng cĩ khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dịng vẫn cĩ thể chứa những kháng thể phản ứng khơng đặc hiệu với kháng nguyên  Kháng thể đơn dịng (monoclonal antibody): Đƣợc tạo ra từ một dịng tế bào plasma nên đồng nhất về hố miễn dịch, chúng phản ứng với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Ƣu điểm của kháng thể đơn dịng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu. 2.5.4. Các phƣơng pháp nhuộm (theo IHC world) Cĩ nhiều phƣơng pháp hĩa mơ miễn dịch cĩ thể dùng để định vị kháng nguyên. việc lựa chọn phƣơng pháp thích hợp dựa trên các thơng số nhƣ loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005). 21 Â Hình 2.6: Các phƣơng pháp nhuộm IHC A: Phương pháp nhuộm trực tiếp B: Phương pháp nhuộm gián tiếp C: phương pháp nhuộm ABC (Avidin – Biotin Complex) D: Phương pháp nhộm PAP (Peroxidase anti-Peroxidase) E: Phương pháp nhuộm LSAB 2.5.4.1. Phƣơng pháp trực tiếp Phƣơng pháp trực tiếp là phƣơng pháp nhuộm màu một bƣớc và bao gồm kháng thể đƣợc đánh dấu phản ứng trực tiếp với kháng nguyên trên những vùng mơ. Kỹ thuật này chỉ sử dụng một kháng thể và quy trình thực hiện thì ngắn và nhanh. Tuy nhiên, phƣơng pháp này khơng nhạy do sự khuếch đại dấu hiệu quá ít và cũng rất ít đƣợc sử dụng (Hình 2.7.A) 2.5.4.2. Phƣơng pháp gián tiếp A B C D E 22 Phƣơng pháp gián tiếp bao gồm một kháng thể sơ cấp khơng đƣợc đánh dấu (lớp đầu tiên) phản ứng với kháng nguyên trên mơ và một kháng thể thứ cấp đƣợc đánh dấu (lớp hai) phản ứng với kháng thể sơ cấp. Phƣơng pháp này nhạy hơn do sự khuếch đại dấu hiệu thơng qua những phản ứng của kháng thể thứ cấp với những vị trí kháng nguyên khác nhau trên kháng thể sơ cấp. Thêm vào đĩ, phƣơng pháp này cũng rất kinh tế vì một kháng thể thứ cấp đƣợc đánh dấu cĩ thể sử dụng với nhiều kháng thể sơ cấp cho những kháng nguyên khác nhau. Kháng thể lớp thứ hai cĩ thể đƣợc đánh dấu với thuốc nhuộm huỳnh quang nhƣ: FITC, rhodamine hay Texas red và phƣơng pháp gián tiếp này đƣợc gọi là phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescent method). Kháng thể thứ hai cĩ thể đƣợc đánh dấu với một enzyme nhƣ peroxidase, alkaline phosphatase hay glucose oxidase và phƣơng pháp này đƣợc gọi là miễn dịch enzyme (Hình 2.7.B) 2.5.4.3. Phƣơng pháp PAP (peroxidase anti – peroxidase method) Phƣơng pháp PAP là một phƣơng pháp phát triển cao hơn phƣơng pháp gián tiếp. Phƣơng pháp này liên quan đến lớp thứ 3 là kháng thể thỏ gắn với peroxidase để tạo thành phức hợp peroxidase anti – peroxidase ổn định. Phức hợp này, bao gồm gaba – globulin thỏ và peroxidase, hoạt động nhƣ kháng nguyên lớp thứ 3 và cĩ khả năng gắn kết kháng gaba – globulin thỏ ở dê khơng tiếp hợp của lớp thứ hai. Độ nhạy của phƣơng pháp này cao hơn từ 100 – 1000 lần vì phân tử peroxidase khơng tiếp hợp hĩa học với kháng IgG nhƣng gắn kết miễn dịch và khơng làm giảm hoạt tính enzyme. Phƣơng pháp này cũng cho phép độ pha lỗng của kháng thể sơ cấp cao hơn, do đĩ loại bỏ đƣợc nhiều kháng thể khơng mong muốn và giảm sự nhuộm màu nền khơng chuyên biệt. (Hình 2.7.C) 2.5.4.4. Phƣơng pháp avidin – biotin complex (ABC method) Phƣơng pháp ABC là phƣơng pháp IHC chuẩn và là một trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng rộng rãi trong việc nhuộm màu. Avidin, một glycoprotein lớn, cĩ thể đƣợc đánh dấu bằng peroxidase hoặc fluorescent và cĩ ái lực cao đối với biotin. Biotin, một vitamin cĩ trọng lƣợng phân tử thấp, cĩ khả năng tiếp hợp với nhiều phân tử sinh học khác nhau nhƣ là kháng thể Kỹ thuật này liên quan đến 3 lớp. Lớp thứ nhất là kháng thể sơ cấp khơng đánh dấu. Lớp thứ hai là kháng thể thứ cấp đƣợc gắn với biotin. Lớp thứ ba là một 23 phức hợp của avidin – biotin peroxidase. Sau đĩ peroxidase đƣợc gắn bởi DAB hay các cơ chất khác để tạo những sản phẩm cuối cùng cĩ màu sắc khác nhau.(Hình 2.7.D) 2.5.4.5. Phƣơng pháp đánh dấu Streptavidin Biotin (LSAB) Streptavidin, cĩ nguồn gốc từ streptococcus avidini, là một phƣơng thức mới nhằm thay thế avidin. Phân tử streptavidin khơng cĩ điện tích trên mơ của động vật, khơng giống nhƣ avidin cĩ điểm đẳng điện là 10 và do đĩ loại bỏ đƣợc sự gắn kết tĩnh điện với mơ. Thêm vào đĩ, streptavidin khơng chứa các nhĩm carbohydrate nên khơng gây ra sự gắn kết với mơ lectin. LSAB là kỹ thuật tƣơng tự nhƣ kỹ thuật ABC chuẩn. lớp đầu tiên là kháng thể sơ cấp khơng đánh dấu. Lớp thứ hai là kháng thể sơ cấp đƣợc đánh dấu bằng biotin. Lớp thứ ba là phức hợp enzyme và streptavidin (HRP – Streptavidin hoặc AP – Streptavidin) để thay thế cho phức hợp avidin – biotin peroxidase. Enzyme đƣợc quan sát bằng dung dịch chất tạo sắc để tạo ra những sản phẩm cuối cĩ màu sắc khác nhau. Lớp thứ ba cĩ thể đƣợc đánh dấu bằng fluorescent dye – streptavidin nhƣ FITC – streptavidin. (Hình 2.7.E) Theo một số báo cáo gần đây cho rằng phƣơng pháp LSAB cĩ độ nhạy cao hơn 5 – 10 lần so với phƣơng pháp ABC chuẩn 24 PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THÍ NGHIỆM 3.1.1. Thời gian Từ ngày 6/3/2006 đến ngày 18/7/2006 3.1.2. Địa điểm - Gây nhiễm: Trại Thực Nghiệm Thuỷ Sản Thủ Đức-Tp HCM - Phân tích IHC: Phịng Mơ Học – Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Mơi Trƣờng và Phịng Ngừa Dịch Bệnh Khu Vực Nam Bộ – Viện Nghiên Cứu Nuơi Trồng Thủy Sản II. 3.2. VẬT LIỆU 3.2.1. Vật liệu và dụng cụ sử dụng trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm chuẩn 3.2.1.1. Vật liệu - Dịch virus gốc sử dụng trong thí nghiệm đƣợc tạo từ dịng WSSV-VN thu từ khu vực bệnh đốm trắng tại Long An năm 2003. Sau đĩ tăng sinh và tinh sạch tại Đại học Ghent – Vƣơng quốc Bỉ. - Tơm sú cĩ độ tuổi từ 45 ngày tuổi (trọng lƣợng cơ thể 8,5 g 2) đƣợc lấy từ trại nuơi tơm Cơng ty K22, huyện Thạnh Phú, tỉnh Bến Tre sau khi đã kiểm tra tơm khơng mang các mầm bệnh virus thơng thƣờng (WSSV, MBV, IHHNV, HPV, YHV, TSV). Tơm đƣợc đem về Trại Thực Nghiệm Thuỷ sản Thủ Đức, nuơi thuần dƣỡng theo các điều kiện thí nghiệm 6 ngày trƣớc khi đƣa vào gây nhiễm thực nghiệm. - Bể kính thí nghiệm cĩ thể tích 126 lít - Nƣớc biển sử dụng trong thí nghiệm đƣợc chở từ Vũng Tàu cĩ độ mặn 30 %o- 35 ‰ đƣợc pha lỗng đến 20 ‰ cho thí nghiệm. Sau đĩ xử lý nƣớc biển bằng chlorine 30 ppm. Sau 3 ngày trung hịa dƣ lƣợng chlorine.bằng NaHSO4. 3.2.1.2. Dụng cụ - Micropipette 100µl, 1000µl; eppendoff 2ml; găng tay; kim tiêm insulin; bơng gịn tiệt trùng - Máy bơm nƣớc, sục khí, đá bọt, bộ lọc cơ. - Vợt và thức ăn tơm lớn CP – 9003 P - Panh, dao, kéo vơ trùng 25 - Hĩa chất: Cồn 700, cồn 900, dung dịch Davidson, nƣớc cất, dung dịch đệm PBS, Chlorine, formaline, NaHSO4. 3.2.2. Các hĩa chất và dụng cụ sử dụng trong IHC 3.2.2.1. Hĩa chất - Xylene - Ethanol ( 100 %, 95 %, 70 %, 50 %) - Sodium azide 10 % - Tris NaCl, tris HCl pH 7.6 - H2O2 30% - Kháng thể thứ nhất 8B7 (Diagxostic – USA) - Kháng thể thứ hai (Anti-mouse Ig, biotinylated species-specific whole antibody (Amersham – Vƣơng quốc Anh) - Normal Sheep serum (Calbiochem) - Streptavidin – biotine horseradish peroxidase (HRP) (Amersham – Vƣơng quốc Anh) - 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (Sigma – USA) - Hematoxylin - Keo dán Baume Canada 3.2.2.2. Vật tƣ - Lame - Lamella - Găng tay - Khẩu trang - Kim - Kẹp - Bình tam giác - Các loại becher, ống đong 3.2.2.3. Thiết bị - Tủ lạnh - Máy ủ nhiệt - Máy xử lý mẫu - Bàn nĩng, bình rĩt paraffin 26 - Máy cắt mẫu microtome - Tủ ủ - Kính hiển vi quang học 3.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 3.3.1. Tơm và điều kiện thí nghiệm Tơm sau khi đƣợc nuơi thuần hĩa trong bể composite 4 ngày đƣợc chuyển lên các bể kính thí nghiệm chứa 70 lít nƣớc biển cĩ độ mặn 20 ‰ và nhiệt độ nƣớc là 28 0C, pH nƣớc 7,5 – 8,5 đƣợc duy trì suốt quá trình thí nghiệm. Tiến hành 2 thí nghiệm. Ở thí nghiệm thứ nhất, tơm (n = 48) đƣợc tiêm với liều thấp và ở thí nghiệm thứ hai tơm (n = 48) đƣợc tiêm với liều cao. Trong mỗi thí nghiệm, mỗi nhĩm 6 con tơm đƣợc nuơi chung trong 1 bể thí nghiệm chứa 70 lít nƣớc. Tơm thí nghiệm đƣợc cho ăn mỗi ngày 3 lần: 8; 13 và 18 giờ. Các chỉ tiêu mơi trƣờng đƣợc theo dõi: Chỉ tiêu lần 1 lần 2 Trong ngày: Nhiệt độ 8 giờ 14 giờ pH 8 giờ 14 giờ Oxy hồ tan 8 giờ 14 giờ Đầu và cuối đợt thí nghiệm Amonia Đầu thí nghiệm Cuối thí nghiệm 3.3.2. Virus đốm trắng dịng Việt Nam (WSSV-VN) Stock virus đốm trắng dịng Việt Nam sau khi chuẩn độ cĩ đƣợc nồng độ gây nhiễm 50 % số tơm thí nghiệm (SID50/ml) là 10 5,32 SID50/ml. Từ 10 5,32 SID50/ml tiến hành pha lỗng dịch virus trong PBS 1X để cĩ đƣợc liều cao (104,0 SID50/ml) và liều thấp (101,5 SID50/ml). Thể tích tiêm cho liều thấp và liều cao là 100 l 3.3.3. Gây nhiễm virus đốm trắng trên tơm sú Hình 3.1: Hệ thống bể thí nghiệm 27 Sử dụng kim tiêm insulin (1ml) hút 100 l dịch virus đã đƣợc pha lỗng và tiêm thẳng vào phần cơ giữa đốt thứ 2 và thứ 3 ở mặt bên của tơm. Sau khi tiêm khử trùng chỗ tiêm bằng cồn 70 %. 3.3.4. Thời gian theo dõi và thu mẫu để khảo sát quá trình phát sinh bệnh Thời gian theo dõi và thu mẫu nhƣ bảng 3.1 cho cả 2 thí nghiệm Mỗi lần thu mẫu là 6 con/bể và tiến hành trong 60 h Bảng 3.1: Thời gian theo dõi và thu mẫu tơm sú để khảo sát quá trình phát sinh bệnh. Bể 1 2 3 4 5 6 7 8 Đ/C Số tơm 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Thời điểm Thu mẫu 0* 6 12 18 24 36 48 60 Kết thúc thí nghiệm (*): thu ở 0 giờ để xem hiệu quả tiêm 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.4.1. Phƣơng pháp pha lỗng dịch virus Cách tính để cĩ đƣợc liều cao 104,0 SID50/100 l thể tích tiêm (Nghĩa là 10 4,0 SID50/100 µl = 10 5,0 SID50/1ml) Cách tính: Hệ số pha lỗng 10 5,32 SID50.ml -1 =10 0,32 = 2,089 lần 10 5 SID50.ml -1 Thể tích dịch virus cần để sử dụng để gây nhiễm thực nghiệm: 100µl x 6con x 8 bể = 4800 µl Thể tích dịch virus đã đƣợc chuẩn độ SID50/ml cần sử dụng để pha lỗng: Hình 3.2: Gây nhiễm virus trên tơm thí nghiệm 28 Vstock = Vsử dụng /hệ số pha lỗng = 4800 l / 2,089 = 2297,7µl (2,2977 ml)  Thành phần dịch virus liều cao là: 2,2977 ml stock SID50/ml + 2,5023 ml PBS Cách tính để cĩ đƣợc liều thấp 101,5 SID50/100µl thể tích tiêm (nghĩa là 10 1,5 SID50/100 µl = 10 2,5 SID50/1ml Cách tính: Hệ số pha lỗng: 10 5,32 SID50. ml -1 =10 2,82 lần = 660,69 lần 10 2,5 SID50. ml -1 Thể tích cần để sử dụng: 100µl x 6 x 8 bể = 4800 µl Thể tích dịch virus đã đƣợc chuẩn độ SID50/ml cần sử dụng để pha lỗng: Vstock = Vsử dụng / hệ số pha lỗng = 4800 l / 660,69 = 7,265 l Thành phần dịch virus liều thấp là: 7,265 l + 4792,735 l PBS 3.4.2. Phƣơng pháp thu mẫu tơm Thu mẫu tơm phân tích PCR: Thu chân bơi và 1 – 2 lá mang, cố định trong cồn 950 Thu mẫu tơm phân tích IHC Ở mỗi thời điểm tiến hành thu phần đầu của 6 con, tiêm và cố định trong dung dịch Davidson từ 24 – 48 h, sau đĩ chuyển qua cồn 500 ít nhất là 24h. . Hình 3.3: Tiêm dung dịch Davidson vào đầu tơm 29 Sau đĩ tiến hành cắt mẫu nhƣ sau: - 3 con xẻ dọc - 3 con cịn lại đƣợc cắt ngang làm 3 phần riêng : Phần 1: gồm ruột trƣớc, tuyến anten, biểu mơ dƣới vỏ Phần 2: phần giữa của phần đầu gồm ruột giữa, gan tụy, mang, dạ dày, mơ tạo máu, lymphoid. Phần 3: phần cịn lại của đầu 3.4.3. Phƣơng pháp nhuộm IHC Quy trình thực hiện IHC gồm 3 giai đoạn chính Ủ mẫu trong 24 – 72 giờ 12,5 giờ Làm lạnh Ủ mẫu ở 400C Quy trình 3.4: Các bƣớc thực hiện IHC Thu mẫu Cố định mẫu Xử lý mẫu Đúc mẫu Cắt mẫu Nhuộm IHC và quan sát dƣới kính hiển vi Chuyển mẫu lên lame 30 Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (theo phƣơng pháp mơ học) Bước 1: Xử lý mẫu Mẫu sau khi đƣợc cố định trong dung dịch Davidson đƣợc chuyển vào cassette và rửa 1 – 2 giờ dƣới vịi nƣớc. Sau đĩ xử lý theo quy trình 3.2. Quá trình này đƣợc thực hiện bằng máy. Tổng thời gian xử lý là 12,5 giờ Quy trình 3.5: Các giai đoạn xử lý mẫu Bước 2: Đúc mẫu Cho mẫu vào nằm sát đáy khuơn, rĩt hỗn hợp paraffin vào đầy khuơn, đậy nắp cassette và để nguội. Sau khi nến đơng lại, đặt khuơn lên bàn lạnh cho đến khi tách đƣợc khối paraffin ra khỏi khuơn và đặt lên bàn lạnh cho đến khi mặt cắt cứng lại. Bước 3: Cắt mẫu Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt mẫu microtome. Bề dày lát cắt là 5 m. Bước 4: Đính mẫu lên lame. Với mỗi lát cắt, nhỏ cồn 70 % sao cho ƣớt tồn bộ lát cắt rồi chuyển vào nồi nƣớc nĩng 400C. Dùng lame (+) vớt mẫu. Sau đĩ ủ ở 500C cho đến khi mẫu khơ hồn tồn. Cồn 70 % 30 phút Cồn 95 % (1) 30 phút Cồn 95 % (2) 30 phút Cồn 95 % (3) 30 phút Cồn tuyệt đối (1) 30 phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Cồn tuyệt đối (3) 30 phút Chloroform (1) 1,5 giờ Chloroform (2) 1,5 giờ Paraffin (1) 3 giờ Paraffin (2) 3 giờ 31 Giai đoạn 2: Tiến hành nhuộm IHC cho mẫu Quy trình 3.6: Các bƣớc thực hiện IHC Bước 1: Khử paraffin cho mẫu mơ - Xylene 1 lần 5 phút - Cồn 100 % 1 lần 5 phút - Cồn 95 % 1 lần 5 phút - Cồn 70 % 1 lần 5 phút - Cồn 50 % 1 lần 5 phút Nhúng 3 lần trong Tris buffer NaCl pH 7.6. Mỗi lần 5 phút Bước 2: Ngăn ngừa hoạt động của enzyme nội bào Ngăn hoạt động của enzyme peroxidase nội bào: Pha dung dịch gồm sodium azide (10 %), Tris - NaCl, H2O2 theo tỉ lệ 25 : 221 : 4. Lƣợng dung dịch cần pha phụ thuộc vào lƣợng lame muốn nhuộm (80μl hỗn hợp/lame). Dùng micropipette hút dung dịch và trải đều lên trên mặt mẫu. Ủ mẫu 30 phút ở nhiệt độ phịng. Khử paraffin Ngăn hoạt động của enzyme nội bào bằng SA 10% Ủ với kháng thể thứ nhất Ủ với kháng thể thứ hai Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Ủ với HRP Rửa 3 lần với Tris-NaCl 1X Hiển thị màu bằng DAB Nhuộm tạo màu nền với hematoxylin Khử nƣớc Dán keo Baume Canada 30 phút Mỗi lần 5 phút 1 giờ Mỗi lần 3 phút 1 giờ Mỗi lần 3 phút 30 phút Mỗi lần 5 phút 32 Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần). Bước 3: Ủ với kháng thể thứ nhất Pha kháng thể 8B7 mAb (kháng WSSV VP28) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:30. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3. Ủ mẫu 1 giờ ở 370C . Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/ lần). Bước 4: Ủ với kháng thể thứ hai Pha kháng thể thứ hai (kháng thể của cừu cĩ gắn biotin kháng lại kháng thể 1 từ chuột) với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3. Ủ mẫu trong 1 giờ ở 370C. Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/lần) Bước 5: Ủ với Streptavidine-biotin HRP Pha phức hợp streptavidine-biotinylated horseradise peroxidase với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lƣợng dung dịch cần pha và cách sử dụng tƣơng tự bƣớc 3. Ủ mẫu trong 30 phút tại nhiệt độ phịng. Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần). Bước 6: Làm hiển thị màu bằng DAB Pha DAB trong Tris buffer pH 7,6 khơng cĩ NaCl (0,5mg DAB/ml Tris buffer). Bổ sung ngay trƣớc khi dùng H2O2 (30 %) với tỉ lệ 3H2O2 : 5Tris buffer. Nhúng lame mẫu vào dung dịch và ủ vài phút tại nhiệt độ phịng. Kiểm tra sự hiện màu (màu nâu tích tụ trong tế bào nhiễm virus) trong phút đầu tiên sau khi nhúng lame vào dung dịch DAB. Dừng phản ứng bằng cách nhúng lame trong tris buffer pH 7,6 + NaCl. Bước 7: Nhuộm tạo nền tƣơng phản bằng cách nhúng lame vài lần vào dung dịch hematoxylin pha lỗng. Rửa cẩn thận với nƣớc cất 2 lần cho đến khi hết hematoxylin trên lamee. Bước 8: Khử nƣớc Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần. 33 Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần. Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần. Xylene 1 lần 5 phút/lần. Bước 9: Dán lamella với Baume Canada. Lame sau khi lấy ra khỏi xylene để khơ trong vài phút, nhỏ một giọt keo Baume Canada ngay trên tiêu bản mẫu, đặt lamella lên lame kính, tránh hiện tƣợng cĩ bọt khí bên trong. Giai đoạn 3: Đọc kết quả Tiến hành đọc kết quả ở các vật kính 10X, 40X và 100X. Quan sát các tế bào nhiễm WSSV bị trƣơng nhân và bắt màu nâu trên các cơ quan: lympho, ruột giữa, gan tụy, tim, mang, mơ tạo máu, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày và biểu mơ dƣới vỏ. 3.4.4. Xử lý thống kê Sử dụng phần mềm thống kê Statgraphics 7.0 để so sánh cƣờng độ nhiễm của virus đốm trắng lên các cơ quan của tơm thí nghiệm ở 2 liều tiêm. 34 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 ĐỘC LỰC CỦA DÕNG WSSV-VN TRÊN TƠM SƯ 4.1.1. Kết quả theo dõi thực nghiệm Bảng 4.1: Tỷ lệ phần trăm (%) tơm biểu hiện các dấu hiệu lâm sàng ở các thời điểm sau khi gây nhiễm Liều Thời điểm thu mẫu sau khi tiêm (giờ) Hoạt động bất thƣờng (%) Bỏ ăn (%) Đỏ thân (%) Xuất hiện đốm trắng (%) Hấp hối (%) Chết (%) 10 1,5 SID50/ml 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 24 0 0 0 0 0 0 36 66.7 0 16.7 0 0 0 48 83.3 83.3 16,7 0 0 0 60 100 100 16.7 16.7 0 16.7 10 4,0 SID50/ml 0 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 12 0 0 0 0 0 0 18 0 0 0 0 0 0 24 33.3 33.3 0 0 0 0 36 66.7 33.3 0 0 0 0 48 33.3 66.7 16.7 0 0 0 60 100 100 50 100 16.7 16.7 Đ/C 0 0 0 0 0 0 35 Hình 4.1: Tơm bị nhiễm virus đốm trắng A: Tơm bị đỏ thân (a: đỏ thân; b: đối chứng) B: xuất hiện đốm trắng trên vỏ đầu ngực.( ) Nhận xét - Các biểu hiện bất thƣờng của tơm thí nghiệm ở liều thấp xuất hiện vào thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm, trong khi đĩ ở liều cao xuất hiện vào thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm. Điều này chứng tỏ nồng độ virus càng cao thì khả năng gây nhiễm và khả năng lan truyền của chúng trong cơ thể vật chủ càng nhanh (Bảng 4.1). - Khi kết thúc thí nghiệm, tỷ lệ tơm chết do virus đốm trắng ở cả 2 liều thấp và cao là 16,7 %. Kết quả này hồn tồn phù hợp với kết quả chuẩn độ virus đốm trắng WSSV- VN. Kết quả này chứng minh rằng trong khoảng thời gian 60 giờ sau khi gây nhiễm độc lực của virus đốm trắng WSSV-VN khơng đủ để xác định đƣợc LD50 (yêu cầu số lƣợng tơm chết > 50 %) 4.1.2. Tỷ lệ nhiễm WSSV-VN của tơm thí nghiệm bằng IHC theo thời gian Bảng 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tơm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm Thời điểm ghi nhận sau khi gây nhiễm (giờ) Tỷ lệ nhiễm theo thời gian ở liều cao (%) Tỷ lệ nhiễm theo thời gian ở liều thấp (%) 0 0 0 6 0 0 12 50 33.3 18 83.3 33.3 A B A B a b 36 24 100 66.7 36 100 66.7 48 100 83.3 60 100 100 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ nh iễm (% ) tỷ lệ nhiễm theo thời gian ở liều cao (%) tỷ lệ nhiễm theo thời gian ở liều thấp (%) Hình 4.2: Tỷ lệ nhiễm của tơm thí nghiệm ở liều cao và liều thấp theo từng thời điểm Nhận xét Ở liều cao, tơm bị nhiễm WSSV đƣợc phát hiện vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm với tỷ lệ nhiễm là 50 % (3/6 con) cịn ở liều thấp thì tơm bị nhiễm WSSV cũng đƣợc phát hiện đầu tiên vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm với tỷ lệ là 33,3 % (2/6 con) (Bảng 4.2). Kết quả này chứng minh ở liều cao nồng độ virus đốm trắng cao hơn hẳn liều thấp nên khả năng tấn cơng vào tơm với cƣờng độ lớn hơn nên làm số lƣợng tơm thí nghiệm nhiễm nhiều hơn (Hình 4.2) Từ thời điểm 18 giờ đến khi kết thúc thí nghiệm 60 giờ (sau khi gây nhiễm) tỷ lệ tơm bị nhiễm WSSV tăng dần, nhƣng ở liều cao tơm bị nhiễm 100 % vào thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm, trong khi ở liều thấp tơm bị nhiễm 100 % vào thời điểm cuối thí nghiệm (60 giờ). Kết quả này chứng tỏ rằng với dịng virus đƣợc sử dụng trong thí nghiệm cĩ độc lực nhƣ nhau thì liều cao (104,0 SID50/ml) cĩ nồng độ virus cao hơn cĩ khả năng lan truyền virus đốm trắng trong cơ thể tơm sú sẽ nhanh hơn liều thấp (101.5 SID50/ml ), do đĩ tỷ lệ nhiễm của tơm với liều cao cho kết quả cao hơn liều thấp. 37 4.2. KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH PHÁT SINH BỆNH CỦA DÕNG WSSV-VN Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành khảo sát quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng dịng Việt Nam trên tơm sú ở 10 cơ quan chính: hệ tiêu hố (ruột trƣớc, dạ dày, ruột giữa), gan tụy (mơ liên kết, khe sinuse), hệ hơ hấp (mang), cơ quan lymphoid, tim, tuyến anten, mơ tạo máu và biểu mơ dƣới vỏ (Marks, 2005). Hình 4.3: Các cơ quan khảo sát quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN Đây là các cơ quan đích của virus đốm trắng. Vì thế chúng tơi khảo sát sự xâm nhiễm của virus đốm trắng trên các cơ quan này cho nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của WSSV trên tơm sú. 4.2.1 Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tơm sú ở liều gây nhiễm thấp (10 1,5 SID50/ml) Bảng 4.3: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều thấp (%) Thời gian (giờ) Cơ quan 0 6 12 18 24 36 48 60 Lympho 0 0 0 0 0 66.7 75 100 Ruột giữa 0 0 0 0 0 66.7 50 100 Mơ liên kết gan 0 0 0 0 0 16.7 0 0 Tim 0 0 50 0 33.3 66.7 66.7 100 Mang 0 0 0 16.7 16.7 66.7 83.3 100 Mơ tạo máu 0 0 0 0 0 66.7 83.3 100 Tim Gan tụy Biểu mơ dƣới vỏ Mang Mơ tạo máu Ruột trƣớc Tuyến anten Ruột giữa Dạ dày Lymphoid 38 Ruột trƣớc 0 0 0 16.7 33.3 66.7 60 100 Tuyến anten 0 0 0 0 0 66.7 60 100 Dạ dày 0 0 0 16.7 50 66.7 66.7 100 Biểu mơ dƣới vỏ 0 0 0 0 50 66.7 83.3 100 Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều thấp. A: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên tim, mơ tạo máu, lymphoid B: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên mang và tuyến anten C: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên biểu mơ dƣới vỏ, ruột trƣớc, dạ dày và ruột giữa Các tế bào bị nhiễm WSSV đầu tiên xuất hiện vào giờ thứ 12 sau khi tiêm, tại thời điểm này cĩ 2/6 con tơm thí nghiệm bị nhiễm WSSV. Vị trí xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng trên tơm sú là tim với cƣờng độ nhiễm thấp (+) (chỉ cĩ một nhân A B 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Lympho Mơ tạo máu Tim 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) T. anten Mang 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Ty r lệ nh iễm (% ) Ruột trước Ruột giữa Dạ dày Biểu mơ dưới vỏ C 39 tế bào bị nhiễm). Nhƣ vậy, tim là cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của WSSV-VN trên tơm sú (Hình 4.4.A) Ở thời điểm 18 giờ, 2/6 con tơm bị nhiễm và vị trí tấn cơng tiếp theo của WSSV trên mang, ruột trƣớc và dạ dày với cƣờng độ nhiễm (+) (Hình 4.4.B, C) Ở thời điểm 24 giờ, 4/6 con tơm bị nhiễm WSSV. Ở hệ tiêu hĩa, WSSV tấn cơng vào các tế bào biểu mơ của ruột trƣớc và dạ dày cũng với cƣờng độ (+), tuy nhiên ruột giữa chƣa bị nhiễm. Một số cơ quan khác cũng bị nhiễm WSSV trong thời điểm này là mang, tim và biểu mơ dƣới vỏ với cƣờng độ chƣa cao. Các cơ quan khác: lymphoid, gan tụy, mơ tạo máu và tuyến anten chƣa bị nhiễm tại thời điểm này. Ở thời điểm 36 giờ, cƣờng độ nhiễm WSSV trên tơm khá nặng và nhiễm trên hầu hết các cơ quan. Đặc biệt, 2 con tơm đã bị nhiễm với cƣờng độ nặng (++) trên tất cả các cơ quan, điều này phù hợp với các biểu hiện lâm sàng (đỏ thân, thân mềm và phản xạ kém). Tuy nhiên, trong lơ thí nghiệm này cĩ 2 con hồn tồn khơng cĩ những dấu hiệu lâm sàng đặc trƣng và kết quả phân tích khơng bị nhiễm WSSV (phụ lục 3) . Thời điểm 48 giờ, cĩ 5/6 con tơm bị nhiễm WSSV, hầu hết các cơ quan đều dƣơng tính với WSSV: ruột trƣớc, dạ dày, ruột giữa, tim, mang, mơ tạo máu, tuyến anten và biểu mơ dƣới vỏ bị nhiễm nặng nhất với cƣờng độ nhiễm là (++), cịn cơ quan lymphoid bị nhiễm nhẹ hơn với cƣờng độ (+), ngoại trừ tế bào mơ liên kết của màng bao gan khơng bị nhiễm (phụ lục 3) Thời điểm kết thúc thí nghiệm (60 giờ) 100 % tơm thí nghiệm đều bị nhiễm WSSV. Các tế bào bị nhiễm nặng nhất đƣợc tìm thấy ở mang, mơ tạo máu, các tế bào của ruột trƣớc, dạ dày và ruột giữa, các tế bào của lympho, tuyến anten và lớp biểu mơ dƣới vỏ với cƣờng độ nhiễm (++). Các cơ quan khác nhƣ tim bị nhiễm ít hơn, chỉ một số ít tế bào với cƣờng độ xâm nhiễm là (+). Các tế bào mơ liên kết của màng bao bên ngồi gan tụy khơng bị nhiễm WSSV. 40 1 2 A B A B A B B A B B A A 5 6 3 4 41 Hình 4.5: Các tế bào của các cơ quan bị nhiễm WSSV ở tơm thí nghiệm liều thấp 1: Biểu mơ dưới vỏ, X40 2: Ruột trước, 40X 3: Dạ dày, 40X 4: Ruột giữa, 40X 5: Mang, 40X 6: Tuyến anten, 40X 7: Mơ tạo máu, 40X 8: Tim, 40X A: Tế bào bị nhiễm WSSV B: Tế bào bình thường 4.2.2 Quá trình phát sinh bệnh của WSSV-VN trên tơm sú ở liều cao (104,0 SID50/ml) Bảng 4.4: Kết quả theo dõi tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan khảo sát ở liều cao (%) Thời gian (giờ) Cơ quan 0 6 12 18 24 36 48 60 Lympho 0 0 0 0 100 100 100 100 Ruột giữa 0 0 0 0 50 100 100 100 Mơ liên kết gan 0 0 16.7 0 50 16.7 60 100 Tim 0 0 16.7 16.7 83.3 66.7 100 100 Mang 0 0 16.7 66.7 100 100 100 100 Mơ tạo máu 0 0 16.7 0 83.3 100 100 100 Ruột trƣớc 0 0 0 60 100 100 100 100 Tuyến anten 0 0 16.7 40 100 100 100 100 Dạ dày 0 0 0 66.7 100 100 100 100 Biểu mơ dƣới vỏ 0 0 0 66.7 100 100 100 100 B A A B 7 8 42 Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn tỷ lệ xâm nhiễm của WSSV-VN trên các cơ quan ở liều cao. A: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên tim, mơ tạo máu, lymphoid B: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên mang, tuyến anten và mơ liên kết gan C: Tỷ lệ nhiễm của WSSV-VN trên biểu mơ dưới vỏ, ruột trước, dạ dày và ruột giữa Các tế bào bị nhiễm WSSV xuất hiện đầu tiên vào thời điểm 12 giờ. Ở thời điểm này cĩ 3/6 con tơm bị nhiễm trên các cơ quan: tim, mơ tạo máu, tuyến anten, mang và các tế bào nằm trên màng bao bên ngồi của gan tụy với cƣờng độ nhiễm thấp (+) (1 – 2 tế bào ). Nhƣ vậy, ở liều cao tim vẫn là cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng trên tơm sú. Ở thời điểm 18 giờ, cĩ 5/6 con tơm dƣơng tính với WSSV. Các tế bào trên tim bị nhiễm khá ít với cƣờng độ (+). Các cơ quan thuộc hệ tiêu hĩa: biểu mơ ruột trƣớc và dạ dày tuy bị nhiễm nặng hơn ở tim nhƣng cƣờng độ nhiễm vẫn là (+), nhƣng ruột 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Lympho Tim Mơ tạo máu 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ nh iễm (% ) Mơ liên kết gan Tuyến anten Mang 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ nh iễm (% ) Ruột trước Ruột giữa Dạ dày Biểu mơ dưới vỏ A B C 43 giữa vẫn chƣa bị nhiễm. Các tế bào ở mang, biểu mơ dƣới lớp vỏ carapace và tuyến anten cũng bị nhiễm với cƣờng độ (+). Từ 24 giờ đến khi kết thúc thí nghiệm (60 giờ) mức độ nhiễm WSSV của các tế bào trên các cơ quan tăng lên rất nhiều: ruột trƣớc, dạ dày, ruột giữa, mang, tuyến anten, biểu mơ dƣới vỏ, tim, mơ tạo máu, lympho. Số lƣợng tế bào bị nhiễm WSSV đƣợc tìm thấy nhiều nhất trên biểu mơ của ruột trƣớc, mơ tạo máu, dạ dày, mang và biểu mơ dƣới vỏ với cƣờng độ (++). Trên cơ quan gan tụy chỉ tìm thấy sự xâm nhập của virus đốm trắng trên màng bao bên ngồi và khe sinuse, khơng tìm thấy sự xâm nhập của virus đốm trắng vào các tế bào gan. 2 3 4 A A B B B 1 B A A 44 Hình 4.7: Các cơ quan bị nhiễm WSSV ở liều cao sau khi nhuộm IHC 1: Biểu mơ dưới vỏ carapace, 40X 2: Ruột trước, 40X 3: Dạ dày, 40X 4: Ruột giữa, 40X 5: Mang, 40X 6: Tuyến anten, 40X 7: Tim, 40X 8: Mơ tạo máu, 40X 9: Mơ liên kết của màng bao gan, 40X 10: Cơ quan lymphoid, 40X A: Tế bào bị nhiễm WSSV B: Tế bào bình thường 5 6 7 8 9 10 A A B B A A B A A A B B 45 4.2.3 So sánh giữa hai liều gây nhiễm về quá trình phát sinh bệnh Lymphoid 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m (% ) Thấp Cao Ruột giữa 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m ( % ) Thấp Cao Mơ liên kết gan 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Tim 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m ( % ) Thấp Cao Mang 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Mơ tạo máu 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m ( % ) Thấp Cao Ruột trước 0 20 40 60 80 100 12 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Tuyến anten 0 20 40 60 80 100 120 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ T ỷ lệ n h iễ m ( % ) Thấp Cao Dạ dày 0 20 40 60 80 100 12 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Biểu mơ dưới vỏ 0 20 40 60 80 100 12 0 6 12 18 24 36 48 60 giờ Tỷ lệ n hi ễm (% ) Thấp Cao Hình 4.8: Đồ thị so sánh tỷ lệ nhiễm trên các cơ quan khảo sát ở liều thấp và liều cao 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 46 1: Cơ quan lymphoid 2: Ruột giữa 3: Mơ liên kết màng bao gan 4: Tim 5:Mang 6: Mơ tạo máu 7: Ruột trước 8: Tuyến anten 9: Dạ dày 10: Biểu mơ dưới vỏ Vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm, tơm ở cả 2 liều đều nhiễm WSSV với tỷ lệ tơm bị nhiễm của liều thấp thấp hơn liều cao, ở liều thấp tơm bị nhiễm WSSV chỉ phát hiện đƣợc trên tim tỷ lệ nhiễm 33,3 % (2/6 con). Trong khi đĩ ở liều cao thì các cơ quan bị nhiễm WSSV đƣợc phát hiện: tim, mơ tạo máu, mang, mơ liên kết màng bao gan với tỷ lệ nhiễm ở mỗi cơ quan là 16,7 % (1/6 con) (Hình 4.8). Điều này chứng tỏ virus liều cao cĩ nồng độ virus cao hơn liều thấp nên khả năng xâm nhiễm và lan truyền rộng hơn liều thấp, tấn cơng vào nhiều cơ quan hơn. Thời gian thí nghiệm càng kéo dài thì mức độ xâm nhiễm của virus ở liều cao càng tăng lên so với liều thấp (24 giờ sau khi gây nhiễm thì hầy hết các cơ quan cĩ tỷ lệ nhiễm là 100 %), trong khi đến khi kết thúc thí nghiệm thì ở liều thấp tỷ lệ nhiễm ở các cơ quan mới đạt 100 % (Hình 4.8). Điều này chứng tỏ ở liều cao cĩ nồng độ virus cao hơn liều thấp nên khả năng xâm nhiễm trên các cơ quan khảo sát sẽ mạnh hơn. Bảng 4.5: Kết quả so sánh thống kê giữa liều cao và liều thấp trên các cơ quan khảo sát (với độ tin cậy 95 %) Vị trí xâm nhiễm của WSSV Yếu tố Giá trị P Cơ quan lymphoid Tiêm liều cao 0.0286 Ruột giữa Tiêm liều cao 0.1766 Mơ liên kết màng bao gan Tiêm liều cao 0.0001 Tim Tiêm liều cao 0.2596 Mang Tiêm liều cao 0.0139 Mơ tạo máu Tiêm liều cao 0.1248 Ruột trƣớc Tiêm liều cao 0.0153 Tuyến anten Tiêm liều cao 0.0070 Dạ dày Tiêm liều cao 0.0471 Biểu mơ dƣới vỏ Tiêm liều cao 0.0415 47 Dựa vào bảng thống kê so sánh giữa liều cao và liều thấp trên các cơ quan khảo sát cho thấy: Việc tiêm virus với liều cao hay liều thấp trong quá trình gây nhiễm thì khả năng nhiễm WSSV ở các cơ quan: ruột giữa, tim, mơ tạo máu khơng khác biệt nhau về mặt thống kê học (P>0.05) (Hình 4.8). Trong khi đĩ, các cơ quan khác: lymphoid, mơ liên kết của màng bao gan, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày và biểu mơ dƣới vỏ lại cĩ sự khác biệt với nhau khá rõ ràng (P<0.05) (Hình 4.8) trong đĩ sự nhiễm WSSV ở mơ liên kết của màng bao gan là cĩ khác biệt rõ ràng nhất giữa hai liều tiêm thấp và cao (P=0) (Hình 4.8.3). Cịn các cơ quan khác cũng cĩ sự khác biệt nhƣng khơng rõ ràng lắm, đĩ là cơ quan lymphoid, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày, biểu mơ dƣới vỏ và mang. Từ kết quả trên, chỉ cĩ nồng độ virus liều cao mới đủ để xâm nhập vào mơ liên kết màng bao gan, và gây nhiễm ở các cơ quan: lymphoid, mang, ruột trƣớc, tuyến anten, dạ dày và biểu mơ dƣới vỏ nặng hơn so với liều thấp. Các cơ quan cịn lại bị nhiễm nhƣ nhau ở cả hai liều tiêm. 4.3 Thảo luận Trong quá trình gây nhiễm thực nghiệm và theo dõi thí nghiệm, ở liều thấp các biểu hiện lâm sàng nhƣ hoạt động kém, bỏ ăn xuất hiện vào thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm và dấu hiệu đặc trƣng của tơm nhiễm bệnh đốm trắng là đỏ thân xuất hiện vào thời điểm 48 giờ sau khi cảm nhiễm. Trong khi đĩ, ở liều cao các biểu hiện hoạt động kém, bỏ ăn xuất hiện vào thời điểm 24 giờ sau khi cảm nhiễm và các dấu hiệu đặc trƣng xuất hiện vào thời điểm 48 giờ. Cuối thí nghiệm, chỉ cĩ 16,7 % xuất hiện đốm trắng ở liều thấp trong khi đĩ ở liều cao 100 % tơm xuất hiện đốm trắng (Bảng 4.1). Kết quả này chứng minh đƣợc với nồng độ virus cao hơn nên khả năng tấn cơng của virus đốm trắng ở liều cao mạnh hơn liều thấp nên các dấu hiệu đặc trƣng xuất hiện nhanh hơn và với mức độ nhiều hơn Trong nghiên cứu quá trình phát sinh bệnh của virus đốm trắng, chúng tơi bố trí thí nghiệm trên 2 liều thấp (101,5 SID50/ml) và cao (10 4,0 SID50/ml), sử dụng virus đốm trắng dịng Việt Nam gây nhiễm trên tơm sú (Penaeus monodon). Kết quả đạt đƣợc là tơm bị nhiễm đốm trắng vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm ở cả 2 liều, trong đĩ ở liều thấp tỷ lệ tơm bị nhiễm đốm trắng là 33,3 % và liều cao là 50 %. Thời điểm 18 giờ, ở liều thấp tỷ lệ tơm nhiễm 33,3 % (2/6 con) và tăng dần theo từng thời điểm và bị 48 nhiễm 100 % vào cuối thí nghiệm. Ở liều cao, thời điểm 18 giờ tỷ lệ tơm nhiễm là 83,3 % (5/6 con) và tỷ lệ tơm bị nhiễm đạt 100 % từ 24 giờ đến cuối thí nghiệm. Với thí nghiệm tƣơng tự của Escobedo-Bonilla, sử dụng virus đốm trắng dịng Thái Lan gây nhiễm trên tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) ở 2 liều thấp (101,5 SID50/ml) và cao (104,0 SID50/ml), kết quả là tơm bị nhiễm đốm trắng vào thời điểm 18 giờ sau khi tiêm ở liều thấp với tỷ lệ 16,7 % (1/6 con) và 12 giờ ở liều cao với tỷ lệ nhiễm 80 % (4/5 con). Ở liều thấp, thời điểm 24 giờ sau khi gây nhiễm tỷ lệ nhiễm 83,3 % (5/6 con) và đạt 100 % vào thời điểm 36 giờ. Cịn ở liều cao, thời điểm 18 giờ đến cuối thí nghiệm, tỷ lệ nhiễm đạt 100 %. Từ 2 kết quả trên chứng minh rằng, cả tơm sú lẫn tơm thẻ chân trắng đều bị nhiễm virus đốm trắng vào những thời điểm sớm của quá trình gây nhiễm. Trong nghiên cứu này chúng tơi gây nhiễm thực nghiệm bằng phƣơng pháp tiêm vào phần cơ trên thân, cơ quan xâm nhập đầu tiên của virus đốm trắng là tim ở liều thấp và trên các cơ quan tim, mang, mơ tạo máu, tuyến anten và mơ liên kết màng bao gan khi gây nhiễm ở liều cao. Khi tiến hành gây nhiễm bằng cách tiêm vào phần cơ, virus đốm trắng theo đƣờng máu lan truyền trong cơ thể tơm và xâm nhập vào tim đầu tiên, sau đĩ, máu từ tim đƣợc vận chuyển đến các cơ quan. Tuy nhiên, chỉ cĩ mơ tạo máu, tuyến anten, mang, mơ liên kết màng bao gan ở liều cao bị nhiễm. Điều này cĩ thể là do sự lan truyền của máu từ tim đến các cơ quan nhanh hay chậm và truyền máu đến cơ quan nào trƣớc. Khi đĩ, cơ quan nào đƣợc truyền máu đến đầu tiên sẽ bị nhiễm WSSV mà cụ thể đĩ là mơ tạo máu, mang, tuyến anten và mơ liên kết màng bao gan. Ở các thời điểm sau đĩ thì lần lƣợt các cơ quan đều bị nhiễm ở cử 2 liều. Đến cuối thí nghiệm, số lƣợng các cơ quan bị nhiễm đốm trắng tƣơng tự nhau ở cả 2 liều tiêm. Trong nghiên cứu của Escobedo-Bonilla, với phƣơng pháp gây nhiễm bằng cách tiêm virus qua đƣờng miệng nên vị trí tấn cơng đầu tiên của virus đốm trắng trên ruột trƣớc. Điều này khá dễ hiểu vì khi gây nhiễm qua đƣờng miệng, cơ quan đầu tiên virus đốm trắng tiếp xúc là ruột trƣớc nên ruột trƣớc là cơ quan xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng khi gây nhiễm bằng phƣơng pháp này. Với 2 liều gây nhiễm thấp và cao trên tơm sú, tỷ lệ nhiễm ở liều thấp vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm thấp hơn liều cao (33,3 % so với 50 %) và từ thời điểm 18 giờ cho đến khi kết thúc thí nghiệm, tỷ lệ tơm bị nhiễm đốm trắng ở liều thấp thấp hơn nhiều so với liều cao (bảng 4.2). Điều này do nồng độ virus ở liều cao cao hơn 49 liều thấp nên sự tấn cơng vào tơm sẽ mạnh hơn dẫn đến tỷ lệ tơm bị nhiễm đốm trắng nặng hơn. Bên cạnh đĩ, cƣờng độ nhiễm đốm trắng trên các cơ quan lymphoid, mơ liên kết màng bao gan, mang, tuyến anten, ruột trƣớc, dạ dày và biểu mơ dƣới vỏ ở liều cao nặng hơn các cơ quan này ở liều thấp vì theo Marks (2005) các cơ quan này là cơ quan đích của virus đốm trắng và với nồng độ virus cao hơn nên mức độ xâm nhiễm vào các cơ quan này nặng hơn so với liều thấp. Các cơ quan cịn lại mức độ nhiễm tƣơng tự nhau ở cả 2 liều. (bảng 4.5) (Hình 4.8) 50 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN  Theo dõi thực nghiệm và các biểu hiện lâm sàng Các biểu hiện lâm sàng của tơm bị nhiễm: hoạt động bất thƣờng, bỏ ăn, đỏ thân, xuất hiện đốm trắng, hấp hối và chết đƣợc phát hiện vào thời điểm 36 giờ ở liều thấp và 24 giờ ở liều cao.  Gây nhiễm thực nghiệm với liều thấp (101,5 SID50/ml) Bằng phƣơng pháp hĩa mơ miễn dịch phát hiện tơm bị nhiễm WSSV vào thời điểm 12 giờ sau khi tiêm, vị trí xâm nhiễm đầu tiên của virus đốm trắng là các tế bào trên tim với cƣờng độ nhiễm thấp (+). Và các cơ quan bị nhiễm tiếp theo là mang, ruột trƣớc, dạ dày ở thời điểm 18 giờ sau khi gây nhiễm. Tỷ lệ nhiễm của hầu hết các cơ quan tăng dần theo thời gian sau khi gây nhiễm và chỉ bị nhiễm 100 % vào thời điểm cuối thí nghiệm  Gây nhiễm thực nghiệm với liều cao (104,0 SID50/ml) Bằng phƣơng pháp hĩa mơ miễn dịch phát hiện cơ quan bị nhiễm WSSV vào thời điểm 12 giờ sau khi gây nhiễm trên các tế bào của tim, mơ tạo máu, mang, tuyến anten và mơ liên kết của màng bao bên ngồi của gan tụy với cƣờng độ thấp (+). Ở thời điểm 18 giờ sau khi gây nhiễm, các cơ quan cịn lại đều bị nhiễm ngoại trừ cơ quan lymphoid và ruột giữa chƣa bị nhiễm ở thời điểm này. Từ 24 giờ đến cuối thí nghiệm tất cả các cơ quan đều bị nhiễm WSSV.  Tại thời điểm 36 giờ sau khi gây nhiễm, tất cả các cơ quan đều bị nhiễm WSSV  So sánh mức độ nhiễm WSSV ở liều tiêm thấp và cao Các cơ quan lymphoid, ruột trƣớc, tuyến anten, mang, dạ dày, biểu mơ dƣới vỏ và mơ liên kết màng bao gan bị nhiễm nặng hơn khi gây nhiễm với liều cao, trong đĩ mơ liên kết màng bao gan bị nhiễm khác biệt nhiều nhất giữa liều tiêm thấp và liều tiêm cao (P=0). Các cơ quan cịn lại nhƣ tim, mơ tạo máu, ruột giữa khơng cĩ sự khác biệt về cƣờng độ nhiễm giữa 2 liều tiêm (P>0.05) 51 5.2. ĐỀ NGHỊ - Tiếp tục thực hiện quá trình gây nhiễm thực nghiệm trên tơm sú ở liều thấp và liều cao vào các thời điểm 3, 9, 15, 21, 30, 42, 54 giờ sau khi tiêm để xem thời điểm trƣớc 12 giờ sau khi gây nhiễm, virus đốm trắng đã xâm nhiễm vào các cơ quan của tơm chƣa. - Bên cạnh phân tích sự xâm nhiễm của virus đốm trắng trên các cơ quan bằng phƣơng pháp IHC, ta nên tiến hành phân tích mẫu máu (hemolymph) bằng phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang (IIF-indirect immuno fluorescent) và mẫu PCR bằng PCR định lƣợng để khảo sát sự xâm nhiễm của WSSV vào tế bào máu và biến thiên lƣợng virus trong cơ thể vật chủ sau khi gây nhiễm. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Văn Hảo, 2000. Một số vấn đề kỹ thuật nuơi tơm sú cơng nghiệp, NXB Nơng Nghiệp. 2. Đỗ Thị Hịa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muơi, 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản, Trƣờng Đại Học Thủy Sản, Khoa Nuơi Trồng Thủy Sản 3. Lý Thị Thanh Loan, 2003. Nghiên cứu một số vi khuẩn và virus gây bệnh trên tơm sú nuơi thƣơng phẩm ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long. Luận án tiến sỹ. 4. Trần Ngọc Ánh Mai, 2005. Ứng dụng kỹ thuật hĩa mơ miễn dịch để chẩn đốn bệnh đốm trắng trên tơm sú (Penaeus monodon). Luận văn tốt nghiệp 5. Bùi Quang Tề, 1998. Giáo trình bệnh của Động Vật Thủy Sản, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội. 6. Phạm Văn Tình, 2001. Kỹ thuật nuơi tơm sú. NXB Nơng Nghiệp. Tp.HCM 7. Vũ Thế Trụ, 1994. Cải tiến kỹ thuật nuơi tơm tại Việt Nam, NXB Nơng Nghiệp. Tài liệu Tiếng Anh 1. Boigegrain R. A., Helene Mattras, Michel Brehelin and Maria-Antonia Coletti-Previero, 1994. Invertebrate proteinase inhibitors. Pure & Appi. Chem., Vol. 66, No. 1, pp. 1 – 7. 2. Boenisch T., Farmilo A.J., Stead R.H., Key M., Welcher R., Harvey R., and Atwood K.N., 2002. Handbook of Immunochemical Staining Methods. 3 rd edition, Carpinteria, California, USA. 65p 3. Chen L. L., Wang H. C., Huang C. J., Peng S. E., Chen Y. G., Lin S. J., Chen W. Y., Dai C. F., Yu H. T., Wang C. H., Lo C. F. and Kou G. H., 2002. Transcriptional Analysis of the DNA Polymerase Gene of Shrimp White Spot Syndrome Virus. Virology 301, p 136 – 147. 4. Chou H.Y., Huang C.Y., Wang C.H., Chiang H.C., Lo C.F., 1995. Pathogenecity of a baculovirus infection causing white spot syndrome virus in cultured penaeid shrimp in Taiwan. Diseases of Aquatic Organisms 23, p 165 – 173. 53 5. Crockford M., 2001. White Spot Disease. Australia and New Zealand Standard Diagnostic Procedures 6. Dieu B.T.M., H. Marks, J.J. Siebenga, R.W. Goldbach, D. Zoudema, Duong. T.P, J.M. Vlak, 2004. Molecular epidemiology of white spot syndrome virus in Vietnam. Journal of General Virology , p 3607 – 3618. 7. Destoumieux .D, Marcello Muđoz, Céline Cosseau, Jenny Rodriguez, Philippe Bulet, Michel Comps and Evelyne Bachère, 2000. Penaeidin, antimicrobial peptides with chitin-binding activity are produced and stored in shrimp granulocytes and released after microbial challenge. Journal of Cell Science, p 461 – 469. 8. Donald V. Lightner, Carlos R. Pantoja. Biosecurity in shrimp farming. Department Veterrinary Science and Microbiology. University of Arizona, Tucson, USA. 9. Escobedo-Bonilla C.M., M. Wille, V. Alday Sanz, P. Sorgeloos, M.B. Pensaert, H.J. Nauwynck, 2005. In vivo titration of white spot syndrome virus (WSSV) in specific pathogen-free Litopenaeus vannamei by intramuscular and oral routes. Diseases of Aquatic Organisms 66, p 163 –