Luận văn Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó

1 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngày nay trong lĩnh vực chăn nuôi, một thành tựu đánh dấu sự tiến bộ vượt bậc của kĩ thuật nuôi cấy tế bào sinh dục là khả năng tạo được hợp tử bên ngoài cơ thể mẹ thông qua sự kết hợp tinh trùng và noãn trong điều kiện in vitro. Ở động vật, nguồn phôi dồi dào có thể phục vụ cho các mục đích khác nhau như: tạo động vật chuyển gen, khai thác nguồn tế bào mầm, nhân bản động vật, tạo đàn thú có điều kiện thí nghiệm tương đương nhau phục vụ nghiên cứu khoa học… Nhưng dù với mục đích gì, cũng cần phải qua khâu tạo nguồn noãn chín đồng loạt. Đó là bước căn bản trong thao tác liên quan đến khoa học về sinh sản. Ngày 24/04/2005, các nhà khoa học của đại học quốc gia Seoul đã thành công khi cho sinh sản vô tính một giống chó săn Afganistan (trích báo tuổi trẻ số ra ngày 05/08/2005). Trên thế giới, công nghệ sinh học trong lĩnh vực sinh sản nói chung và việc tạo noãn chín in vitro nói riêng rất phổ biến, nhưng ở Việt Nam vẫn còn rất hạn hẹp. Noãn heo là nguồn noãn dồi dào và có thể giúp hoàn thiện thao tác lấy noãn và nuôi noãn. Trên chó có một số giống quý hiếm nhưng chu kỳ sinh sản của chúng rất dài và tỉ lệ nuôi thành công rất thấp, do đó chọn nuôi trứng trên chó rất có ý nghĩa. Vì những lý do trên, đề tài “Áp dụng qui trình nuôi chín noãn in vitro trên heo và chó” được tiến hành. 1.2. Mục tiêu và yêu cầu Mục tiêu Góp phần xây dựng hệ thống qui trình nuôi cấy phôi trong điều kiện Việt Nam. Yêu cầu Phân loại nang noãn trên buồng trứng heo và chó. Áp dụng phương pháp nuôi chín noãn heo và chó. Áp dụng phương pháp nhuộm nhiễm sắc thể và thể cực của noãn chín. 2 PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Buồng trứng 2.1.1. Cấu tạo [1] Buồng trứng phát triển từ miền vỏ của tuyến sinh dục, gồm một đôi được treo ở cạnh trước dây chằng rộng và nằm trong xoang chậu. Bên ngoài là lớp màng liên kết sợi chắc như màng bao dịch hoàn. Bên trong buồng trứng chia làm hai miền: miền vỏ và miền tủy, hai miền được cấu tạo bằng lớp mô liên kết sợi xốp, tạo một chất đệm cho buồng trứng. Miền tủy có mạch máu nhiều hơn và lớp mô liên kết cũng dày hơn. Miền vỏ là nơi xảy ra sự chín noãn và rụng noãn. Bên dưới lớp màng là noãn nguyên thủy. Khi nang noãn chín, tế bào nang bao quanh noãn phân chia thành nhiều tầng tế bào hạt. Nang noãn càng phát triển thì tế bào nang phân hủy tạo ra một xoang chứa dịch. Khi trở nên chín, nang noãn được bao bọc bởi một lớp màng mỏng. Tổ chức liên kết ngoài buồng trứng lúc này dày lên để bảo vệ nang noãn chín, giữa màng liên kết và màng nang noãn là tổ chức mạch quản dày đặc. Lúc nang noãn đã thành thục thì màng bọc nang và màng bao liên kết của buồng trứng tách ra, noãn rời buồng trứng cùng với dịch nang để đi vào vòi Fallop. Màng nang noãn rách rồi liền lại ngay, các tế bào hạt trong xoang phân chia nhanh thành một khối tế bào lớn để lấp kín xoang nang noãn và trở thành thể vàng. 2.1.2. Chức năng nội tiết của buồng trứng [1], [2] Hormon được tiết ra từ nang noãn và thể vàng. Hormon từ nang noãn là estrogen, từ thể vàng là progesteron. Hàm lượng hormon liên quan đến các giai đoạn trong chu kì động dục. Hàm lượng progesteron trong thể vàng tăng sau xuất noãn và thấp khi thoái triển. Có relaxin trong pha thể vàng của chu kì nhưng pha nang noãn thì không có relaxin. Relaxin cũng không xuất hiện trong buồng trứng heo cái tơ. Nang noãn thành thục thì tế bào hạt trong biểu mô tiết ra nhiều estrogen. Estrogen làm gia súc biểu hiện động dục. Estrogen gồm estradiol và sản phẩm hóa học của nó là estrol và estriol. Estrogen liên quan đến đặc tính sinh dục thứ 3 cấp của gia súc cái, làm âm đạo tiết nhiều dịch nhầy, sừng tử cung và ống dẫn trứng được tăng cường dòng máu, tuyến vú phát triển, vỏ não hưng phấn. Hình 2.1: (a) Estradiol (b) Estriol Sau khi xuất noãn, nguyên sinh chất bên trong nang noãn tích tụ sắc tố thể vàng. Thể vàng tiết hormon progesteron. Progesteron vào máu, ức chế phân tiết gonadotropin từ tuyến yên và ức chế sự chín của nang noãn, kích thích sự hoạt động của niêm mạc tử cung để trứng được thụ tinh về nơi làm tổ và phát triển, ức chế co bóp của tử cung, giảm hormon thùy sau của tuyến yên trong thời gian gia súc có chửa và thúc đẩy tuyến vú phát triển. Hình 2.2: Progesteron 2.1.3. Buồng trứng heo và chó 2.1.3.1. Buồng trứng heo [6] Buồng trứng heo hình chùm dâu, có màu hồng vân, nằm hai bên hốc bụng. Trọng lượng buồng trứng tăng từ ngày thứ 3 đến ngày 12 sau động dục vì thể vàng phát triển. Đường kính thể vàng đạt tối đa 11 mm vào ngày 15 và giảm dần do thoái hóa. Màu và cấu trúc thể vàng thay đổi theo thời gian. Thể vàng có màu đỏ sậm vào ngày thứ 3, tím tái vào ngày 15 và màu kem hơi vàng và trắng dần vào ngày 15 – 18. Ngày thứ 3 có cục máu đỏ sậm ở giữa thể vàng, ngày thứ 6 cục máu được thay thế bởi mô liên kết hoặc bởi dịch hơi vàng, đến ngày 16 – 18 có nhiều mạch máu. Lúc bắt đầu động dục của chu kỳ tiếp theo thể vàng thoái hóa, đường kính của thể vàng chỉ còn 50 % và mất đi vào ngày 40. Số nang tối đa là 2.700.000, số nang lúc sinh 135.000, số nang mất trong quá trình phát triển là 95 %. Kích thước nang xoang là 8 – 10 mm, kích thước nang noãn thành thục là 8 – 12 mm. 4 2.1.3.2. Buồng trứng chó [6] Buồng trứng được bao bởi một túi. Khi lột bỏ túi, kích thước của buồng trứng là 1,7  0,9  0,4 cm ở chó beagle. Buồng trứng chó già tương tự như bề mặt bông cải, có kẽ hở sâu để phân chia các thùy với kích cỡ khác nhau. Khi ấy buồng trứng chứa các nang noãn tịt, mô liên kết dày đặc, vết sẹo của thể vàng, thành phần của sườn gian bào vùng tủy. Tế bào biểu mô mầm trở nên hình trụ giả với mảng lồi giống như tiêm mao. Ở chó không mang thai thể vàng thoái hóa vào ngày 20 sau động dục. Chó cái có khoảng 700.000 nang noãn lúc mới sinh, còn 350.000 lúc thành thục, trong số này khoảng 1200 – 1300 nang xoang. Khả năng thụ tinh không giảm đến khi chó được 5 tuổi. 2.2. Nang noãn 2.2.1. Đặc điểm hình thái [1] Noãn là tế bào lớn nhất cơ thể, có dạng hình cầu. Thể tích tế bào trứng lớn hơn tinh trùng nhiều lần và dài gấp 2 lần. Cấu tạo noãn gồm 3 phần:  Phần nguyên sinh chất gồm các thành phần chủ yếu là nước, vật chất hữu cơ, muối khoáng và vật chất khác.  Nhân gồm lưới nhiễm sắc thể và nhiều hạt.  Màng bao gồm 3 lớp: lớp ngoài, lớp giữa và lớp trong. Màng ngoài gồm nhiều tế bào hình nang hay hình chóp. Những tế bào này được phân bổ khắp noãn nên còn gọi là màng phóng xạ hay màng tia. Các tế bào này được gắn với nhau bởi acid hyaluronic. Khi tinh trùng gặp trứng, men hyaluronidase ở phần acrosom được tiết ra để phân giải acid hyaluronic làm màng phóng xạ tan ra và tạo điều kiện thụ tinh. Màng giữa gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ tế bào nang, là lớp nuôi dưỡng noãn. Màng giữa gọi là màng trong suốt. Màng này đảm bảo dinh dưỡng cho noãn trong buồng trứng. Trong màng chứa enzym zonalizin – men đặc hiệu chủng loài có tác dụng ngăn ngừa tinh trùng khác loài đi vào nhân noãn trong quá trình thụ tinh. Màng trong là lớp màng mỏng bao quanh phần nguyên sinh chất gọi là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi 5 dưỡng noãn đã thụ tinh. Giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng trống dày 14 – 25 µm, pH 3 – 5, chứa dịch có nồng độ ion cao. 2.2.2. Các giai đoạn phát triển của nang noãn và noãn Quá trình hình thành nang noãn xảy ra ở lớp vỏ buồng trứng, từ những nang noãn nguyên thủy phân bố ở vùng ngoại biên. Ở thời kì sau thai, nang noãn không ngừng được hình thành và phát triển từ biểu mô phôi thai. Quá trình hình thành noãn gồm 7 bước: sinh tế bào mầm nguyên thủy (PGC – primordial germ cells); di chuyển PGC tới tuyến sinh dục; định vị PGC trong tuyến sinh dục; biệt hóa PGC thành noãn nguyên bào; tăng số lượng noãn nguyên bào; bắt đầu giảm phân; dừng ở giai đoạn nhân đôi prophase I [26]. Từ PGC trở thành nang noãn được bọc bằng tế bào dẹt, nó biến thành nang quá độ. Song song với quá trình giảm phân, nang quá độ nổi lên từ vùng vỏ và chứa một noãn được bao quanh bởi một lớp tế bào sinh dưỡng, gọi là tiền tế bào hạt. Tế bào sinh dưỡng miền vỏ có nguồn gốc từ tế bào biểu mô bề mặt di chuyển ngược vào buồng trứng và tế bào hạt có nguồn gốc từ tế bào trung thận di chuyển xuyên qua buồng trứng (Sawyer và cs, 2002) [29]. Ở cừu, noãn quá độ có đường kính 25 – 53 µm, noãn đang biệt hóa là 17 – 22 µm và noãn nguyên bào 13 – 17 µm, điều đó chứng tỏ tế bào mầm tăng trưởng trước, trong và sau quá trình tạo nang noãn (Mc Natty và cs, 2000) [20]. Từ nang quá độ phát triển thành nang bậc một. Nang bậc một chỉ chứa một lớp tế bào hạt bao quanh, giai đoạn chuyển thành nang bậc một chậm hơn so với quá trình tăng trưởng của nang. Từ nang bậc một phát triển thành nang bậc hai, có từ 2 lớp tế bào hạt trở lên. Khi noãn tăng trưởng, tế bào hạt tăng sinh dày, lớp tế bào vỏ hình thành xung quanh tế bào hạt. Giai đoạn này tăng RNA, protein, ribosom, ti thể và một số chất hữu cơ khác. Từ nang bậc hai tạo nang xoang, chứa nhiều dịch và nhiều tế bào hạt bao quanh. Dịch có vai trò điều hòa các chất từ máu hoặc chất tiết trong tế bào nang như: gonadotropin, steroid, yếu tố tăng trưởng, enzym, proteoglycan, lipoprotein. Dịch tăng lên nhờ sự phát triển mao quản và dòng máu vận chuyển trong nang. Noãn lúc này được bọc bởi tế bào hạt tụ (cumulus), tạo phức hợp COC (cumulus oocyte complex). 6 Sau quá trình tăng trưởng, noãn tồn tại ở giai đoạn tiền kỳ. Sau đỉnh LH, để hoàn thành giảm phân, các noãn đã tăng trưởng đầy đủ này xuất hiện màng trong suốt tạo cầu nối giữa noãn và tế bào hạt tụ. Quá trình trưởng thành là khoảng thời gian sau đỉnh LH và xuất noãn. Quá trình này có hai biến đổi lớn: trưởng thành nhân và trưởng thành tế bào chất [3]. Trưởng thành nhân là thuật ngữ chỉ sự phục hồi quá trình phân bào giảm nhiễm và những chuyển biến đến giai đoạn MII (metaphase II). Trưởng thành tế bào chất là thuật ngữ liên quan đến các sự kiện khác: sự chuẩn bị cho trứng thụ tinh và phát triển trước làm tổ, định vị lại các tiểu thể của bào tương và các tế bào hạt. Trưởng thành nhân kéo dài 44 giờ trên heo, gồm 2 quá trình phân chia liên tục ở thời kì MI và MII, sau đó noãn dừng lại tại MII chờ thụ tinh. Ở giai đoạn này, noãn đáp ứng đỉnh LH tạo nhiều hormon steroid từ tế bào hạt, tạo nhiều hyaluronan từ tế bào hạt tụ, tiết dịch nhầy và tăng kích thước của tế bào hạt tụ. Hình 2.3 : Các giai đoạn phát triển của nang noãn [37] 2.2.3. Biến đổi đại thể của nang noãn 2.2.3.1. Nang noãn heo [6] Đường kính trung bình của nang noãn lớn tăng dần đến ngày thứ 18 của chu kì, đạt tối đa 9 mm. Nang noãn lớn có thể được thấy vào 18 giờ sau khi bắt đầu động dục nhưng sau đó sự thay đổi kích thước lại biến động. Kích thước của nang chưa đủ đánh giá vì đường kính nang khá biến động lúc xuất noãn. Nang noãn bậc 3 Nang bậc hai Nang bậc hai Nang bậc ba 7 Màu của nang noãn trưởng thành là màu hồng vỏ sò, do mạng mạch máu nằm dưới bề mặt nang noãn. Vùng trong suốt của đỉnh nang noãn là nơi xuất noãn. Khi xuất noãn, thành nang noãn vỡ và dịch hơi đỏ xuất hiện ở bề mặt nang noãn. Điểm vỡ vẫn có thể thấy được vào ngày 12 sau động dục. Động mạch xung huyết và tràn máu vào nang noãn dẫn tới noãn xuất huyết, hiện tượng này thường xuất hiện trên heo. Khi xuất noãn, nang nhuộm đỏ và đứt mạch máu, thành nang xẹp xuống và xuất hiện dịch đỏ trên bề mặt. Khoảng 2 – 3 ngày trước động dục, nang noãn lớn nhanh, lúc này có sự triển dưỡng của lớp màng bao trong của nang noãn và hòa tan một phần tế bào hạt tụ nên noãn ở trạng thái tự do lơ lửng. Noãn tự trải qua giai đoạn giảm nhiễm đầu tiên, nhân di chuyển về phía ngoại vi của tế bào và thể cực thứ nhất được tạo ra. Lúc xuất noãn, thể cực thứ nhất được đẩy ra và trục của thể cực thứ nhì được tạo nên. 2.2.3.2. Nang noãn chó [6] Nang noãn bậc một có một lớp tế bào hình lập phương còn nang noãn bậc hai gia tăng kích thước do tăng tế bào hạt và tạo xoang nang. Thông thường nang noãn bậc hai có 2 noãn hoặc nhiều hơn. Nhiều báo cáo cho thấy nang noãn đa noãn có 11 noãn, thông thường là 3 – 5 noãn. Kích thước nang noãn gia tăng vào giai đoạn tiền động dục nên giai đoạn này được xem là giai đoạn nang noãn trưởng thành. Vì phần lớn nang noãn nhỏ thoái hóa, chỉ có một số nang noãn có kích thước > 2 mm. Những nang noãn 3 – 4 mm có khoảng 8 – 10 lớp tế bào hạt, lớp màng bao trong tăng mạch quản và mô liên kết. Nang noãn 4 – 6 mm hơi phồng lên trên bề mặt buồng trứng. Một đặc tính thống nhất của nang noãn trưởng thành ở chó là nếp gấp sâu của lớp tế bào hạt, trong đó có cuộn mao quản ăn sâu vào lớp màng bao trong và chuẩn bị tạo chất vàng. Vào đầu giai đoạn động dục, nhiều nang noãn xuất noãn. Lúc thú bắt đầu chịu đực, thể cực thứ nhất chưa được tạo. Noãn được phóng thích qua lỗ nhỏ như lỗ đinh kim mà không có hiện tượng vỡ bao noãn. Noãn được phóng thích có kính thước khoảng 77  99 μm, nếu kể cả vùng trong suốt thì khoảng 95  110 μm, chứa những hạt có tính khúc xạ cao và nhiều hạt mỡ. 8 2.2.4. Nội tiết của nang noãn Sự tăng trưởng, thành thục, xuất noãn và thể vàng hóa của nang phụ thuộc vào nhiều yếu tố: kiểu chế tiết thích hợp, hàm lượng đủ và tỉ lệ phù hợp của FSH (follicle stimulating hormone) và LH (luteinizing hormone) trong huyết thanh. FSH giữ vai trò chủ đạo cho việc khởi đầu sự hình thành xoang nang, kích thích quá trình nguyên phân của tế bào hạt và quá trình hình thành dịch nang. Ngoài ra, FSH tăng khả năng cảm ứng của tế bào hạt đối với LH bằng cách tăng số lượng các thụ thể LH. Ở heo, các thụ thể LH tăng từ 300 (trong các nang bé) và lên 10.000 (trong các nang lớn trước xuất noãn). Tăng LH chuẩn bị cho quá trình thể vàng hóa của tế bào hạt. Trong giai đoạn tạo nang bậc hai, sự tăng kích thước, tăng số tế bào hạt và số nang noãn tịt bị ảnh hưởng bởi lượng kích dục tố. FSH kích thích tạo cầu nối ở tế bào hạt. LH quan trọng hơn FSH trong phát triển nang bậc hai vì qua thụ thể LH ở tế bào bao nang, khởi động sinh tổng hợp androgen để kích thích tạo thụ thể FSH ở tế bào hạt, do đó tăng ảnh hưởng FSH lên nang bậc hai [34]. Ở giai đoạn này, người ta cũng phát hiện GH (growth hormone) làm tăng sự phát triển in vitro của nang bậc hai trên chuột (Liu và cs, 1998) [14]. Trong giai đoạn tạo nang xoang, nang xoang giai đoạn sớm có thụ thể FSH ở tế bào hạt nhưng chưa phụ thuộc vào kích dục tố. Ở giai đoạn này tế bào bao nang tăng tiết steroid, trong khi tế bào hạt mất aromatase (loại enzyme biến đổi androgen thành estrogen). Điều này chứng tỏ rằng progesteron và androgen mà không phải estrogen là những hormon steroid được tạo bởi nang xoang giai đoạn sớm. Trong nang xoang giai đoạn sau, có hiện tượng giảm FSH, nang noãn tiết nhiều estradiol và inhibin và có khả năng xuất noãn. Những nang còn lại phát triển bất thường và trở thành nang tịt. Trong giai đoạn nang noãn trưởng thành, tuyến yên tiết LH tối đa và nang có khả năng xuất noãn. 9 Hình 2.4: Nội tiết nang [36] 2.2.5. Sự trƣởng thành của noãn 2.2.5.1. Quá trình trƣởng thành Trên heo, noãn nguyên bào bắt đầu giảm phân tạo noãn bậc hai, noãn bậc hai tiếp tục phát triển đến giai đoạn nhân đôi nhiễm sắc thể và dừng lại đến khi thú cái thành thục về tính. Khi heo cái xuất noãn, noãn tiếp tục phát triển đến MII và chờ thụ tinh. Trên chó, noãn rụng trước khi tạo thể cực thứ nhất. Sự tạo thể cực thứ nhất hoàn tất khoảng 48 – 60 giờ sau khi xuất noãn. Nếu được thụ tinh, noãn sẽ hoàn thành giảm phân và phát triển phôi. Quá trình noãn phát triển đến metaphase gọi là quá trình trưởng thành. Gồm 4 sự kiện xảy ra theo thứ tự như sau: nhiễm sắc thể (NST) cô đặc, nhân con biến mất, vỡ màng nhân, hình thành trục. (1) Cô đặc NST Đây là bước đầu tiên và quan trọng để phân phối đúng số NST vào noãn và thể cực. Hirano và cs (1994) phát hiện một protein gọi là condensin liên quan đến sự cô đặc NST [11]. Condensin làm tăng cấu trúc siêu xoắn của DNA. Sutani và cs (1999) khẳng định rằng condensin được phosphoryl hóa và được hoạt hóa bởi MPF (maturation promoting factor) [32]. Tuy nhiên, theo Hong Thuy Bui và cs (2004), giai đoạn này không liên quan đến MPF mà liên quan đến histon H3 (Ser 10) kinase [12]. Như ta biết, đơn vị cơ bản của NST là nucleosome tức một đoạn DNA khoảng 200 bp bao quanh protein histon; histon gồm 2 trong số 4 phân tử H2A, H2B, H3, H4. Đầu N của histon H3 liên quan đến khả năng giữ ổn định sợi NST, bị phosphoryl hóa ở vị trí serine 10, Pha nang noãn 10 sự kiện này cần thiết cho NST cô đặc lại (Wei và cs, 1999; de la Barre và cs, 2000) [35],[7]. (2) Nhân con biến mất Trong giai đoạn từ MI đến MII nhân không xuất hiện, nhưng xuất hiện vào giai đoạn tiền nhân ngay sau khi tinh trùng xâm nhập. Chất nhân dạng sợi được giải phóng vào dịch nhân lúc nhân con biến mất, sau đó vào dịch tế bào lúc vỡ màng nhân. Quá trình này được điều khiển bởi sự phosphoryl hóa và dephosphoryl hóa một protein trong nhân. Noãn heo lấy nhân vẫn có hiện tượng cô đặc NST, màng nhân biến mất và hình thành trục (Fulka và cs, 2003) [10]. Do đó, có thể nhân trong noãn không quan trọng lắm, ít nhất vào giai đoạn trưởng thành. (3) Vỡ màng nhân GVBD (germinal vesical breakdown) Màng nhân là màng đôi gồm 2 lớp lipid, lớp trong tạo bởi 3 mảnh A,B,C, có ở động vật có xương sống, là vị trí kết hợp của MPF. GVBD xảy ra khi 3 mảnh này biến mất; MPF hoạt hóa sẽ phosphoryl hóa các phân tử của mảnh, phá vỡ trạng thái polymer thành dimer. Màng nhân bị vỡ, mạng lưới nội chất gắn với màng nhân ngoài cũng vỡ. (4) Tạo trục metaphase Trong quá trình trưởng thành, trục được tạo hai lần, MI và MII. Trục MI xuất hiện sau tác dụng của MPF và hoàn thành khi MAP kinase được hoạt hóa. MPF phosphoryl hóa protein liên kết với vi ống, gồm α và β tubulin, do đó tăng biến đổi của chúng. Trong nguyên phân, hai trung thể nhân đôi và đi về hai cực tế bào. Vi sợi tỏa ra từ hai cực và tìm bắt cặp NST chị em. Cyclin B gắn với vi ống, MAP kinase gắn với cực. Giảm phân ở noãn khác với nguyên phân ở tế bào sinh dưỡng: không có trung thể, giống tế bào thực vật. Trên heo, sau GVBD, NST tạo dạng đám bụi, theo Motlik và Fulka mô tả đây là giai đoạn hướng cực muộn. Vi ống bị cắt và tỏa xung quanh đám bụi này. 2.2.5.2. Các chất liên quan (1) MPF Theo Masui và Markert (1971), progesteron gây trưởng thành noãn khi được cung cấp bên ngoài noãn, nhưng thất bại khi tiêm vào noãn [19]. Do đó, 11 chỉ tế bào chất gần bề mặt noãn nhận tín hiệu hormon. Noãn sau khi nhận tín hiệu hormon đã tạo yếu tố thúc đẩy trưởng thành gọi là MPF (maturation promoting factor hoặc M phase promoting factor). MPF gồm một đơn vị thủy phân Cdc2 và đơn vị điều hòa cyclin B. MPF xuất hiện trong giai đoạn cô đặc NST, biến mất nhân con. Trong giai đoạn vỡ màng nhân, Cdc2 kinase kích hoạt, nhưng theo Kubelka và cs (2002), màng nhân vẫn vỡ mà không có Cdc2 kinase dưới một số điều kiện đặc biệt, trong khi đó MAP kinase xuất hiện với hoạt động yếu [13]. Giai đoạn tạo trục chỉ bắt đầu khi Cdc2 kinase hoạt động và hoàn tất khi xuất hiện MAP kinase. (2) MAPK (mitogen activated protein kinase) MAPK là kinase khác liên quan đến trưởng thành noãn. Noãn GV chứa MAPK dạng bất hoạt, được phosphoryl hóa và hoạt hóa ở giai đoạn GVBD. 2.3. IVM (In vitro maturation) 2.3.1 . Lịch sử IVM [23] Năm 1935, Pincus và Enzmann tách noãn thỏ chưa trưởng thành khỏi sự ức chế của nang noãn, cho phép noãn đạt tới trưởng thành khi nuôi cấy in vitro. Năm 1983, Minato và Toyoda (Nhật) và Schroeder và Eppig (Mỹ) cho rằng noãn chuột được trưởng thành in vitro có khả năng tạo phôi nếu được thụ tinh. Năm 1983, Lenz và cs cho rằng 39oC là nhiệt độ tối ưu để noãn bò trưởng thành in vitro. Năm 1988, Lu và cs cho ra đời con bê từ kỹ thuật chín noãn và thụ tinh in vitro. Năm 1996, Eppig và O’Brien cho ra đời chuột con sau khi dùng kỹ thuật IVM, thụ tinh in vitro và chuyển phôi vào tử cung chuột mẹ. 2.3.2 . Hệ thống IVM Hệ thống nang noãn giữ cấu trúc không gian 3 chiều của nang, bảo đảm hình thái và chức năng của nang để giữ noãn tăng trưởng và trưởng thành. Bolamba và cs (1998) nuôi noãn chó trong đĩa phủ 0,6 % agar để tránh mất tế bào hạt. Kết quả là noãn chó đạt MII khoảng 8,7 % ở nang xoang giai đoạn sớm và 11,5 % ở nang xoang. Điều đó cho thấy rằng, nếu sự trao đổi các yếu tố trong buồng trứng bị gián đoạn, khả năng giảm phân bị giảm [5]. 12 Hệ thống giọt là hệ thống phổ biến nhất, noãn được nuôi trong giọt môi trường phủ dầu khoáng. Cần quan tâm đến tỉ lệ giữa số noãn nuôi và thể tích môi trường nuôi cấy. Nếu noãn quá nhiều, giảm phân bị ức chế do tế bào hạt tụ tiết nhiều yếu tố ảnh hưởng giảm phân và ngăn cản chúng tăng kích thước, từ đó giảm việc gãy các cầu nối. Sự gãy các cầu nối này sẽ gián đoạn sự truyền thông tin giữa noãn và tế bào hạt và do đó sẽ tăng giảm phân [28]. Nếu ít noãn, tỉ lệ giảm phân cũng giảm. Tỉ lệ giữa số noãn nuôi và môi trường nuôi tối ưu là 1:10. Trên chó tỉ lệ giảm phân là 16,2 % nếu nuôi 10 noãn /100 µl, và 4,6 % nếu 5 noãn/100 µl [25]. Hệ thống tế bào đơn lớp tức là noãn được nuôi với tế bào ống dẫn trứng đơn lớp. Bogliolo và cs (2002) nuôi noãn chó đạt 23,2 % sau 72 giờ [4]. Hệ thống nuôi với ống dẫn trứng, rất tốt vì gần giống điều kiện in vivo, có nhiều tế bào hơn so với hệ thống tế bào đơn lớp, có sự tiếp xúc giữa lớp nhầy và noãn, và một số yếu tố dinh dưỡng cũng như yếu tố tăng trưởng cần cho trưởng thành. Luvoni và cs (2003) nuôi noãn chó đạt 31,9 % sau 30 giờ nuôi [15]. 2.3.3 . Yếu tố ảnh hƣởng IVM 2.3.2.1. Thời gian Buồng trứng được thu từ lò mổ là nguồn tế bào trứng cung cấp cho IVM. Thời gian vận chuyển đến phòng thí nghiệm ảnh hưởng rất lớn đến tế bào trứng. Buồng trứng giữ ấm 30 – 37oC trong nước muối sinh lý vào khoảng 1 – 2 giờ. Thời gian nuôi trứng rất quan trọng, trên heo nuôi 44 – 48 giờ. Trên chó còn nhiều tranh cãi, noãn chó nuôi trong hệ thống giọt sau 72 giờ thoái hóa 74,3 % và sau 96 giờ thoái hóa 94,8 % [16]. 2.3.3.2. Nồng độ oxi và nhiệt độ Oxi ảnh hưởng lớn đến trưởng thành nhân trên chuột và bò, mức oxi 5 % tốt hơn 20 % trong không khí [9]. Nhiệt độ nuôi cấy dao động 37 – 39oC. 2.3.2.2. Môi trƣờng nuôi Có hai loại môi trường nuôi cấy, môi trường đơn giản và môi trường phức tạp. Môi trường đơn giản là dung dịch muối bổ sung nguồn năng lượng 13 như pyruvate, lactate, glucose, môi trường phức tạp thêm amino acid, vitamin, và một số phân tử khác. Môi trường đơn giản là mKRB (modified Krebs Ringer Bicarbonate), SOF (synthetic oviductal fluid), môi trường phức tạp là TCM 199 (tissue cell medium). Trong số các môi trường, TCM 199 là môi trường tốt nhất [31]. 2.3.3.4. Sự trƣởng thành của động vật giết mổ Các trứng thu từ heo trưởng thành có khả năng phát triển trong điều kiện in vitro hơn so với trứng thu từ thú chưa trưởng thành. Noãn hoàn thành giảm phân 24,6 % khi thu noãn ở pha nang noãn của chu kỳ động dục, 19,6 % ở thời kỳ yên tĩnh, 16,4 % thời kỳ không động dục [27]. 2.2.3.5. Stress Yếu tố môi trường gây stress như nhiệt độ quá cao ảnh hưởng sinh sản cá thể đực và cái. Nhiệt độ cao làm thay đổi tăng trưởng của nang noãn và chất lượng noãn. 2.3.3.6. Dinh dƣỡng cá thể cái Noãn nuôi trong môi trường dịch nang noãn thu nhận từ heo cái cho ăn đầy đủ có tỉ lệ chín nhân cao hơn so với các noãn nuôi trong dịch nang noãn từ heo cho ăn hạn chế. 2.3.3.7. Dầu khoáng hay dầu parafin Noãn nuôi trong môi trường có phủ dầu khoáng sẽ bị lớp dầu hút hormon steroid do tế bào hạt tụ tiết ra, đây là hormon quan trọng cho khả năng phát triển của noãn. Do đó, sẽ kìm hãm sự trưởng thành nhân. Đối với dầu silicon, Zn là chất nhiễm độc trong môi trường tạo giọt. 2.3.3.8. Kích thƣớc nang noãn Kích thước nang ảnh hưởng rất lớn đến tỉ lệ thành công IVM, vì kích thước khác nhau thì nang noãn ở các giai đoạn phát triển khác nhau. Theo Mao và cs (2003), tỉ lệ thành công IVM trên noãn heo là 13,8 %, 26,3 %, 33,4 % trên các noãn có đường kính lần lượt là 2 – 3 mm, 3,1 – 5 mm, 5,1 – 7 mm [17]. 2.3.3.9. Phƣơng pháp lấy noãn Để lấy noãn ra khỏi nang, có nhiều cách, trong đó cắt và hút là hai cách phổ biến nhất. Hút là dùng kim và syringe đâm vào nang và dùng lực hút để 14 hút noãn. Cách này thu noãn nhanh nhưng tỉ lệ noãn loại A và tỉ lệ thành công thấp, vì làm mất lực liên kết giữa noãn và tế bào hạt tụ. Cắt là dùng dao xẻ nang noãn và vuốt nhẹ để noãn tách ra khỏi liên kết với tế bào của nang. Cách này chậm nhưng tỉ lệ noãn loại A và tỉ lệ thành công cao. Nếu thu noãn heo bằng phương pháp hút, tỉ lệ trứng ở GVI thấp hơn (45 %) so với cách cắt (78 %) [33]. 2.3.4. Thành phần môi trƣờng IVM 2.3.4.1. Thành phần chính (1) Nƣớc Nước là thành phần chính cho mọi môi trường. Chất lượng của nước rất quan trọng, nước có chất lượng tốt phải qua hệ thống chưng cất, siêu lọc nhằm loại bỏ các chất khoáng và ion tồn tại trong nước. Hấp khử trùng để tiệt trùng. (2) Nguồn năng lƣợng Thực nghiệm cho thấy glucose, lactate, pyruvate là nguồn cơ chất năng lượng ngoại sinh quan trọng nhất cho trứng và phôi. Tuy nhiên, tùy giai đoạn phát triển mà trứng hay phôi có nhu cầu năng lượng với từng cơ chất khác nhau. Thêm glucose vào môi trường chứa pyruvate (tỉ lệ 5,5 Mm : 1 mM) làm tăng tỉ lệ MII trên noãn chuột [8]. Thêm 11 mM glucose vào môi trường nuôi cấy không tăng tỷ lệ thành công IVM trên chó. Glucose không đủ cung cấp năng lượng cho noãn chó cũng như noãn chuột, hoặc nồng độ glucose cao (20 %) ảnh hưởng xấu lên phát triển nhân của noãn chó. Glucose tăng kích cỡ tế bào hạt và trưởng thành nhân trên noãn bò. Pyruvate cũng có vai trò thúc đẩy giảm phân, noãn chuột đạt MII (71,9 %) khi nuôi với pyruvate cao hơn đối chứng (19,6 %) [18]. (3) Nguồn protein Vai trò protein trong môi trường không chỉ là nguồn đạm có sẵn mà còn là chất hấp thụ ion kim loại độc. Huyết thanh Một số loại huyết thanh thường được sử dụng là huyết thanh thai bò (FCS - fetal calf serum), huyết thanh bò lên giống (ECS - estrus cow serum), huyết thanh bò trưởng thành (BAS - bovine adult serum). FCS tăng khả năng sống của noãn chó in vitro khi thêm > 10 % mà không có tác dụng gây trưởng 15 thành. Noãn trưởng thành với tỉ lệ cao (16,3 %) khi thêm huyết thanh chó lên giống so với thêm huyết thanh chó không lên giống (11,1 %) [24]. Albumin huyết thanh Nếu không bổ sung huyết thanh, ta có thể bổ sung protein dưới dạng albumin. Albumin huyết thanh bò (BSA - bovine serum albumin) là loại thường được sử dụng nhất. Vai trò BSA thể hiện ở số lượng yếu tố tăng trưởng liên kết với protein và khả năng kìm hãm chất độc do oxy tự do gây ra và BSA không kết hợp các yếu tố như steroid, vitamin, acid, cholesterol trong đáp ứng kích thích hay ức chế. Do đó, BSA chỉ giúp noãn phát triển tới MI, không có khả năng làm noãn phát triển hơn nữa. Hai nguồn protein trên được sử dụng tùy vào mục đích. Theo kết quả nghiên cứu của Zhang và Sirard, việc bố sung BSA trong môi trường nuôi noãn không cung cấp khả năng tăng kích thước các tế bào hạt tụ và sự chín của noãn so với khi bổ sung FCS. Những kết quả tương tự cũng được ghi nhận trên noãn bò, chuột và thỏ. Qua đó cho thấy, trong FCS hiện diện một số yếu tố có khả năng tái lập lại quá trình phân bào giảm nhiễm và cung cấp khả năng chín của trứng ở điều kiện in vitro. Theo nghiên cứu trên chuột, nếu bổ sung huyết thanh trong môi trường nuôi noãn sẽ ngăn cản màng trong suốt khỏi sự cứng hóa. Ngược lại, trong môi trường có bổ sung BSA, sự cứng hóa màng xảy ra và sự xâm nhập tinh trùng bị cản trở. Do đó, BSA được sử dụng như biện pháp ngăn chặn sự xâm nhập đa tinh trùng trong các qui trình thụ tinh in vitro. (4) Muối Đây là thành phần rất quan trọng trong môi trường nuôi noãn và phôi nhằm bảo đảm áp suất thẩm thấu. Có nhiều ion chịu trách nhiệm cho sự điều hòa này, nhưng chủ yếu là Na+, K+. Hàm lượng ion trong môi trường dựa trên thành phần các chất khoáng trong huyết tương của máu. (5) Hệ đệm Hệ đệm thông dụng nhất là bicarbonate dưới 5 % CO2. Cơ chế đệm của hệ này giống với hệ đệm sinh lý máu. 16 (6) Kháng sinh Kháng sinh được sử dụng với mục tiêu hạn chế sự nhiễm khuẩn. Các loại thường sử dụng là penicillin, streptomycin, gentamycin. 2.3.4.2. Các thành phần khác (1) Hormon Nhìn chung hầu hết các môi trường đều được bổ sung hormon, đặc biệt LH/FSH. Có nhiều báo cáo cho rằng hormon trong môi trường nuôi noãn chín không chỉ tạo thuận lợi cho quá trình phân bào giảm nhiễm mà còn ảnh hưởng đến quá trình chín tế bào chất của noãn heo ở điều kiện in vitro. Ngược lại, một số báo cáo cho rằng noãn heo có thể trải qua giai đoạn GVBD trong môi trường không có hormon. Vì thế hormon cần được bổ sung hay không vào môi trường nuôi trứng chín vẫn còn là vấn đề tranh luận. Môi trường không có FSH giúp noãn vượt qua chướng ngại trong giảm phân, nhưng không giúp trưởng thành hơn được. FSH giúp trưởng thành bằng cách điều hòa cAMP, FSH giúp hạt tụ dãn nở. Ngoài ra còn thêm estradiol và progesterone vào môi trường. Tỉ lệ MII khi thêm estradiol (14,7 %) cao hơn so với đối chứng(1,5 - 8,2 %), khi thêm progesterone cao hơn (10 %) so với đối chứng (4,8 %) [22]. (2) Chất chống oxy hóa Các chất thêm vào môi trường có thể bị oxy hóa và tạo một số chất độc ảnh hưởng noãn. Chất chống oxy hóa thường được thêm vào môi trường là β- mercaptoethanol, chất này làm tăng glutathione trong tế bào. Tỉ lệ MII khi thêm 50 μM là 20 % so với đối chứng 0 % [21]. (3) Yếu tố tăng trƣởng Yếu tố tăng trưởng thường được thêm vào môi trường nuôi, tăng tỉ lệ MII (13,3 %) khi thêm 20 ng/ml EGF (epidermal growth factor), cao hơn so với đối chứng (2,7 %) [21]. 2.3.5. Vấn đề và triển vọng IVM [23] Hiện nay một phương pháp mới kinh tế hơn để lấy noãn là dùng siêu âm, có thể lấy từ bò thụ tinh và chưa thụ tinh. Kỹ thuật này thực hiện hàng tuần, có thể thu hoạch trên một năm, mỗi lần thu 4 – 5 noãn. Vấn đề là dù thu hoạch 17 trứng bằng phương pháp gì đi nữa và mặc dù tỉ lệ phôi sau thụ tinh phân chia cao, nhưng ít phôi phát triển tới phôi dâu. Vấn đề của việc lấy noãn chưa trưởng thành từ buồng trứng không chỉ ở việc tỉ lệ noãn chín, mà còn tuỳ thuộc vào chính noãn đó được qui định thành tế bào chết (apoptosis) hay thành nang noãn tịt. Apoptosis bắt đầu trong nang và sau đó ảnh hưởng đến noãn. Có bằng chứng cho thấy ngay cả noãn tốt lấy từ nang noãn bò với tỉ lệ cao apoptosis, noãn vẫn mất khả năng trưởng thành (Hendriksen và cs, 2000). Ứng dụng kiến thức này ta có thể dễ dàng tìm noãn apoptosis bằng cách nhuộm sống trong trường hợp sớm, nhờ vậy có thể đảo ngược tình thế. Trong một vài tế bào, hoạt hóa protein kinase C có thể ức chế apoptosis sớm và do đó tăng tỉ lệ noãn chín (Zhiang và cs, 1998). Một chất nữa ảnh hưởng đến quá trình trưởng thành là sterol. Chất này ảnh hưởng giảm phân, chúng có thể có vai trò gián tiếp trong tác động của kích dục tố lên việc trưởng thành của noãn (Byskov và cs, 2002 và Trafriri và cs, 2002). Nếu IVM được ứng dụng trên vật nuôi thì có tiềm năng thật sự, nhưng tình hình hiện nay trên chuột tỉ lệ thành công còn thấp, chủ yếu phát triển tới giai đoạn phôi dâu rồi dừng (Smitz và Cortvrindt, 2002). Gần đây (24/04/2005), cùng với việc cho ra đời thành công chú chó Snuppy bằng kỹ thuật sinh sản vô tính, các nhà khoa học của Đại học quốc gia Seoul hy vọng đây là bước khởi đầu của kỹ thuật tạo một số nội tạng thay thế cho người để tránh phản ứng loại thải. Đây là bước đột phá lớn trong khoa học, thao tác trên chó khó hơn các loài khác vì noãn chó chỉ trưởng thành 2 – 3 ngày sau khi được xuất noãn (trích báo tuổi trẻ số ra ngày 05/08/2005). 18 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: từ 15/3/2005 đến 15/8/2005. Địa điểm: phòng Sinh lý Sinh hóa và phòng Nuôi cấy tế bào, khoa Chăn nuôi Thú y, trường Đại học Nông Lâm TP.HCM. 3.2. Nội dung khảo sát Nội dung Chi tiết Khảo sát buồng trứng heo - Trung bình số lượng hoàng thể, nang noãn ở các mức đường kính nang ( 6 mm) trên một buồng trứng. - Liên quan giữa chất lượng noãn thu được với phương pháp lấy và kích thước nang noãn. Khảo sát buồng trứng chó - Trung bình số lượng hoàng thể, số lượng nang noãn ở các mức đường kính nang (< 2 mm; ≥ 2 mm) trên một buồng trứng. - Liên quan giữa chất lượng noãn thu được với chiều dài buồng trứng (< 2 cm; ≥ 2 cm) và với đường kính nang noãn (< 2 mm; ≥ 2 mm). - Tỉ lệ nang đa noãn trên một buồng trứng. - So sánh chất lượng các loại trứng trong nang đơn noãn và nang đa noãn. Áp dụng IVM Trên chó nuôi trong môi trường giọt, trên heo nuôi trong môi trường đĩa. Nhuộm nhiễm sắc thể và thể cực Sử dụng thuốc nhuộm orcein. 19 3.3. Vật liệu 3.3.1. Vật liệu Buồng trứng heo thịt thu tại lò mổ Nam Phong, quận Bình Thạnh, TP.Hồ Chí Minh. Buồng trứng chó ta thu tại lò mổ anh Phước, quận Thủ Đức, TP.Hồ Chí Minh. Hình 3.1: Buồng trứng heo (a) Buồng trứng dài 1 cm (b) Buồng trứng dài 1,5 cm (c) Buồng trứng dài 2 cm Hình 3.2: Buồng trứng chó 3.3.2. Hóa chất (xem thêm mục pha môi trường) Dung dịch NaCl 0.9% Cồn 70o Môi trường DBPS Môi trường HEPES Môi trường TCM 199 Dầu khoáng Một số chất phụ thêm vào môi trường nuôi trứng chín. Một số hóa chất dùng để nhuộm. 3.3.3. Thiết bị Kính hiển vi đảo ngược (Olympus) Kính hiển vi soi nổi (Nikon SMZ800) 20 Tủ ấm CO2 Tủ thao tác vô trùng Hình 3.3: Tủ ấm CO2 3.3.4. Dụng cụ Bình giữ nhiệt Kéo các loại Khay Becher 500 ml Găng tay Lọ cồn Kẹp Đầu tip các loại Pipette Pasteur vô trùng Micropipette Phin lọc (0,2µm) Đĩa petri nhựa (35 10 mm) Đĩa petri thủy tinh Lame và lamel 21 3.4. Phƣơng pháp Qui trình chung cho quá trình nuôi noãn chín Thu nhận buồng trứng Cắt nang noãn Tìm và rửa noãn Nuôi noãn Thu nhận noãn sau khi nuôi Đánh giá bước 1 Nhuộm và đánh giá bước 2 22 3.4.1. Thu nhận buồng trứng tại lò mổ Tiến hành thu nhận trực tiếp bộ phận sinh dục của thú cái ngay sau khi vừa được mổ. 3.4.2. Đánh giá buồng trứng heo Bước đầu đánh giá số hoàng thể, số nang noãn ở các mức kích thước Thực hiện cắt nang noãn Lấy noãn bằng phương pháp xé Phân loại noãn Dùng kim và syringe hút noãn Dùng kéo cắt 2 buồng trứng ở 2 bên sừng tử cung Rửa bằng cồn 90o Rửa bằng nước muối 0.9 % Trữ trong nước muối sinh lý ở 30 – 37 oC Vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm 23 3.4.3. Đánh giá buồng trứng chó Hình 3.4: Nang đa noãn trên chó 3.4.4. Phƣơng pháp chuẩn bị môi trƣờng 3.4.4.1. Trên heo Chuẩn bị 7 đĩa petri nhựa đánh số thứ tự. Đĩa 1 chứa 2 ml môi trường HEPES để rửa noãn Đĩa 2, 3, 4, 5, 6, 7 mỗi đĩa chứa 200 μl FCS; 200 μl pyruvic acid; 200 μl hMG; 1400 μl môi trường căn bản TCM199. Đĩa 2 và 3 để rửa noãn, đĩa 4 rửa vỏ nang noãn. Đĩa 5, 6, 7 mỗi đĩa chứa thêm 2 vỏ nang noãn, phủ dầu khoáng kín bề mặt, cho vào tủ ấm trước 30 phút và nuôi một loại noãn có đường kính nang khác nhau: 0,6 mm. Đo kích thước buồng trứng Cắt tách nang noãn, phân loại kích thước Thu noãn, phân loại A, B, C, và đánh giá nang một noãn, nang đa noãn 24 3.4.4.2. Trên chó Chuẩn bị 4 đĩa petri nhựa đánh số thứ tự. Đĩa 1 chứa 500 μl ECS; 50 μl pyruvic acid; 50 μl estradiol; 50 μl FSH; 50 μl hCG; 4300 μl môi trường căn bản TCM 199. Hút 2ml dung dịch ở đĩa 1 cho vào đĩa 2. Đĩa 1 và 2 dùng để rửa noãn. Các đĩa 3 và 4 dùng để nuôi noãn trong hệ thống giọt, mỗi đĩa chứa 100 μl dung dịch từ đĩa 1 và phủ dầu khoáng. Để tránh giọt môi trường vỡ, hút 50 μl, phủ dầu khoáng, sau đó thêm 50 μl còn lại. Hai đĩa này dùng để nuôi 2 loại noãn có đường kính nang noãn 2 mm. 3.4.5. Tìm và rửa noãn 3.4.6. Chuyển noãn vào môi trƣờng nuôi Chuyển các noãn sau khi rửa vào môi trường nuôi noãn chín tương ứng từng mức đường kính nang. Trên heo mỗi đĩa chứa khoảng 30 – 50 noãn, chuyển thành từng nhóm tránh phân tán, nuôi ở điều kiện 38,5oC, 5 % CO2, 40 – 44 giờ. Trên chó mỗi đĩa chứa khoảng 10 noãn, nuôi ở điều kiện 37oC, 5 % CO2, 72 giờ. Sau khi tách nang trong DPBS, đưa lên kính hiển vi độ phóng đại 40 lần Tìm noãn loại A,B, dùng pipette Pasteur hút qua đĩa rửa đến khi không còn mảnh vỡ tế bào 25 3.4.7. Thu nhận noãn sau khi nuôi Hình 3.5: Noãn trƣớc và sau khi tách tế bào hạt tụ 3.4.8. Đánh giá phân loại noãn Ta đánh giá và phân loại noãn trước khi nuôi và sau khi nuôi. Chất lượng noãn trước khi nuôi khác nhau là do bản chất noãn hoặc do cách thu nhận noãn. Noãn được thu hoạch phải có hình dạng tròn đều, noãn được phân làm 3 loại: Loại A có nhiều lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh. Loại B có một lớp tế bào hạt tụ bao xung quanh. Loại C không có hạt tụ bao quanh. Chuyển noãn sau khi nuôi vào đĩa chứa DPBS Thêm hyaluronidase 0,1 % vào để trong 15 phút Dùng pipette Pasteur làm bong lớp tế bào hạt tụ xung quanh noãn Đánh giá phân loại noãn Chuyển noãn qua lame thực hiện bước nhuộm nhiễm sắc thể (a) Noãn trước khi nuôi (a) Noãn sau khi nuôi 26 (a) Noãn loại C (b) Noãn loại B (c) Noãn loại A Hình 3.6: Phân loại noãn trƣớc khi nuôi Sau khi nuôi, noãn được phân làm 3 loại (noãn chín, noãn tốt, noãn xấu). Chỉ có noãn chín mới dùng trong thụ tinh. Theo lý thuyết tế bào học về sự phát triển của noãn, các noãn có khả năng thụ tinh là noãn chín. Chúng đòi hỏi phải trưởng thành về nhân và tế bào chất. Sự trưởng thành về nhân được đánh giá thông qua xuất hiện thể cực thứ nhất ở noãn khi noãn bên trong nang vào trước giai đoạn xuất noãn (điều kiện in vivo) hay trong các môi trường nuôi noãn chín (điều kiện in vitro). Đây là chỉ tiêu đánh giá quan trọng nhất. Riêng sự trưởng thành tế bào chất chỉ có thể xác định qua khả năng hình thành tiền nhân sau khi tinh trùng xâm nhập và sự phát triển bình thường của tiền phôi. Trên cơ sở đó có hai chỉ tiêu để đánh giá phân loại noãn: Sự đồng nhất tế bào chất của noãn Sự xuất hiện thể cực thứ nhất (a) Noãn xấu (b) Noãn tốt (c) Noãn chín Hình 3.7: Phân loại noãn sau khi nuôi 27 Bảng 3.1: Phân loại noãn sau khi nuôi Noãn xấu Noãn tốt Noãn chín Là những noãn thoái hóa Tế bào chất không đồng nhất bị co cụm hoặc phân tán. Không xuất hiện thể cực thứ nhất. Là những noãn chưa chín Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. Không xuất hiện thể cực thứ nhất. Là những noãn trưởng thành Tế bào chất đồng nhất, chiếm hết xoang tế bào. Xuất hiện thể cực thứ nhất. 3.4.9. Nhuộm noãn 3.4.9.1. Hóa chất Ethanol 100 % Acetic acid Acetol Acetol glycerol (glycerine: acetic acid: nước cất tỉ lệ 1:1:3) Acetol orcein (nước cất 16,3 ml: acetic acid 13,5 ml: orcein 0,3 g) 28 3.4.9.2. Qui trình nhuộm 3.5. Các chỉ tiêu theo dõi 3.5.1. Trên heo Số lượng hoàng thể, nang noãn thu hoạch được trên một buồng trứng Phân loại chất lượng noãn theo phương pháp thu hoạch noãn Phân loại chất lượng noãn theo đường kính nang 3.5.2. Trên chó Số lượng hoàng thể, nang noãn thu hoạch được trên một buồng trứng Phân loạichất lượng noãn theo chiều dài buồng trứng Phân loại chất lượng noãn theo đường kính nang Tỉ lệ nang đa noãn trong một buồng trứng So sánh chất lượng noãn chó trong nang đơn noãn và nang đa noãn Ngâm trong acetol trong 15 phút Rửa noãn 3 lần trong PBS-PVA để rửa trôi môi trường nuôi cấy Chuyển noãn qua lame với một ít PBS-PVA. Đậy lamel lên thật nhẹ Ngâm trong dung dịch ethanol: acetic acid tỉ lệ 3:1 trong 48 giờ Acetol được thay bằng acetol orcein màu tím trong 10 phút. Lặp lại 3 lần Acetol orcein được thay bằng acetol glycerol đến khi màu tím được thay bằng màu trắng thì ngừng lại Cố định bằng keo dán. Xem dưới kính hiển vi Rửa noãn 3 lần trong PBS- a trôi môi trường nuôi cấy 29 3.5.3. Kết quả IVM Tỉ lệ thành công sau khi nuôi noãn chó lấy từ nang noãn nhỏ và lớn 3.6. Xử lý thống kê Dùng phần mềm thống kê Stagraphics 7.0 30 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát buồng trứng heo 4.1.1. Trung bình số nang noãn thu hoạch trên một buồng trứng Bảng 4.1: Số lƣợng nang noãn thu hoạch trên một buồng trứng heo Số buồng trứng Nang nhỏ (< 4 mm) Nang trung bình (4 – 6 mm) Nang lớn (> 6 mm) Tổng số nang noãn X SD X SD X SD X SD 81 15,42 9,69 6,56 4,17 0,84 1,4 22,82 15,26 Đối với giống heo ngoại nuôi thịt được khảo sát, không thấy hoàng thể, số nang nhỏ thu được nhiều nhất, nang loại lớn thu được ít nhất. Mẫu buồng trứng được lấy ở lò mổ, chủ yếu là heo thịt 4 – 5 tháng tuổi nên heo chưa tới giai đoạn động dục. Tổng số nang noãn thu được trên một buồng trứng là 22,82, tương đương với số nang noãn thu được trên một buồng trứng bò khoảng 20 nang noãn (theo Trần Đình Lý – tài liệu không công bố). Mặc dù số nang noãn trong một buồng trứng rất nhiều, số nang tối đa là 2.700.000 (Cole and Cupps, 1959) [6], nhưng số noãn lấy được rất ít so với tổng số vì chỉ lấy được nang quan sát bằng mắt thường. 4.1.2. Đánh giá noãn heo theo phƣơng pháp thu hoạch noãn Phân chia tổng số buồng trứng thành hai phần với số lượng như nhau. Mỗi phần thực hiện hai phương pháp hút và xé. Thu và đánh giá chất lượng noãn ở mỗi phần. Bảng 4.2: Phân loại chất lƣợng noãn heo theo phƣơng pháp thu hoạch noãn Chất lượng Phương pháp Loại A Loại B Loại C Tổng số noãn n % n % n % Xé Hút 41 44 49 47 29 35 35 38 14 14 16 15 84 93 p 0,49 0,56 0,71 Chất lượng noãn thu được ở hai phương pháp xé và hút không khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê. Thu noãn bằng phương pháp hút tốn ít thời gian và công sức hơn, do đó thu trứng bằng phương pháp hút tốt hơn phương pháp xé. Tuy nhiên theo Nguyễn Văn Thuận (tài liệu không công bố) lại cho rằng, thu trứng bằng phương pháp 31 xé tốt hơn hút, vì bảo đảm lực liên kết giữa noãn và tế bào hạt. Nếu dùng phương pháp hút, do áp lực hút làm giảm lực liên kết giữa noãn và tế bào hạt, nên mặc dù cũng được đánh giá loại A, nhưng những noãn này khi nuôi sẽ đạt tỉ lệ giảm phân thấp hơn. Theo Takashi (1997), noãn heo lấy bằng phương pháp hút tỉ lệ đạt GV1 (45 %) và GV4 (0 %) thấp hơn so với phương pháp xé GV1 (78 %) và GV4 (11 %) [33]. 4.1.3. Đánh giá noãn heo theo đƣờng kính nang Thu nang noãn theo từng mức đường kính nang, lấy noãn và đánh giá chất lượng noãn. Bảng 4.3: Phân loại chất lƣợng noãn heo theo đƣờng kính nang Chất lượng Đường kính Loại A Loại B Loại C Tổng số nang noãn n % n % n % Nhỏ (< 4 mm) Trung bình (4 – 6 mm) Lớn (> 6 mm) 37 50 3 41 62 41 39 22 3 43 28 38 14 8 1 16 10 21 90 80 7 p 0,0007 0,04 0,18 Chất lượng noãn thu được theo từng mức đường kính nang có sự khác biệt về mặt thống kê. Ở đường kính nang trung bình, tỉ lệ loại A thu được nhiều nhất, ở đường kính lớn loại A thu được ít nhất. Theo quan sát, mặc dù cũng được đánh giá loại A, nhưng số noãn loại A ở kích thước lớn có nhiều lớp tế bào hạt tụ hơn loại A ở kích thước nang nhỏ hơn. Nang kích thước lớn có tỉ lệ loại A tuy ít nhưng chất lượng tốt, những noãn này khi nuôi in vitro sẽ đạt tỉ lệ giảm phân cao. Phù hợp với kết quả nghiên cứu của Mao và cộng sự (2003), tỉ lệ thành công IVM trên noãn heo ở nang có kích thước 5,1 – 7 mm (33,4 %) cao hơn nang 3,1 – 5 mm (26,3 %) [17]. Ở nang nhỏ, tỉ lệ noãn loại B cao nhất, chứng tỏ chất lượng noãn thu được xấu. Nang có đường kính < 4 mm thì tương đương với nang bậc một hoặc bậc hai, noãn liên kết chặt với vỏ nang, nên nếu lấy noãn thì cần lực mạnh, có thể lực này tác động đến tế bào hạt tụ quanh noãn. Nhìn chung, ở nang trung bình và lớn, tỉ lệ noãn loại A thu được nhiều hơn loại B và C. Do đó, khi thu noãn nên thu ở kích thước này. 32 4.2. Khảo sát buồng trứng chó 4.2.1. Trung bình số hoàng thể, nang noãn thu hoạch đƣợc Bảng 4.4: Số lƣợng hoàng thể, nang noãn thu hoạch trên một buồng trứng chó Số buồng trứng Hoàng thể Nang noãn Loại nhỏ ( 2 mm) Tổng cộng 111 X SD X SD X SD X SD 2,68 3,1 2,22 3,5 0,56 1,56 2,78 5,1 Buồng trứng chó có nhiều hoàng thể hơn nang noãn, số nang noãn nhỏ rất nhiều hơn nang noãn lớn. Chó có thời kỳ không động dục rất dài, khi ấy nang không nổi lên bề mặt buồng trứng. Thời gian lấy buồng trứng vào tháng 5 đến tháng 7, nên có thể vào thời kỳ không động dục của chó. Do đó số nang lớn rất ít. Hơn nữa, chó ở lò mổ có lẽ là chó già, nên có nhiều hoàng thể. 4.2.2. Đánh giá noãn chó theo chiều dài buồng trứng Phân chia số buồng trứng làm hai lô theo chiều dài buồng trứng (< 2 cm và ≥ 2 cm). Thu noãn và đánh giá chất lượng noãn ở mỗi lô. Bảng 4.5: Phân loại chất lƣợng noãn chó theo chiều dài buồng trứng Chất lượng Chiều dài buồng trứng Số buồng trứng Số noãn Loại A Loại B n % n % Nhỏ (< 2 cm) Lớn (≥ 2 cm) 26 28 57 16 45 13 79 80 12 3 21 20 p 0,97 0,14 Noãn thu được trên chó có chất lượng tốt. Không có noãn loại C. Chất lượng trứng thu được ở kích thước buồng trứng khác nhau thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. 33 4.2.3. Đánh giá noãn chó theo đƣờng kính nang Thu nang noãn chó và phân làm hai lô theo đường kính nang noãn (< 2 mm và ≥ 2 mm). Thu hoạch noãn và đánh giá chất lượng noãn. Bảng 4.6: Phân loại chất lƣợng noãn chó theo đƣờng kính nang Chất lượng Đường kính nang Số buồng trứng Số lượng noãn Loại A Loại B n % n % Nhỏ (< 2 mm) Lớn (≥ 2 mm) 35 19 77 11 62 9 81 78 15 2 19 22 p 0,73 0,73 Chất lượng noãn thu được ở đường kính nang khác nhau thì không có sự khác biệt về mặt thống kê. Số noãn loại A thu được nhiều hơn rất nhiều so với loại B. Trên noãn chó có một đặc điểm khác noãn heo; đó là noãn chó chứa hàm lượng lipid lớn nên nội chất có vẻ như đen và đồng nhất [28]. Do đó, trong nhiều trường hợp noãn được đánh giá loại A và B nhưng có thể không tốt lắm, nang có đường kính nhỏ chất lượng noãn có lẽ xấu hơn, do kích thước nhỏ nên lấy sẽ khó, noãn bị tác động bởi lực khi lấy và dụng cụ thao tác nhiều làm ảnh hưởng đến lớp tế bào hạt tụ. 4.2.4. Tỉ lệ nang đa noãn trong buồng trứng chó Tỉ lệ nang đa noãn trong một buồng trứng là 37,7 %. Một buồng trứng thu được trung bình 2,78 nang, nên số nang đa noãn trung bình trong một buồng trứng là 1,04. Vì không phải trong chu kỳ động dục của chó, số nang nổi trên bề mặt buồng trứng ít, nên số nang đa noãn thu được ít. Nang đa noãn thu được chủ yếu có 2 noãn, điều này khác với kết quả nghiên cứu của Cole và Cupps (1959). Theo các tác giả, nang đa noãn trung bình có khoảng 3 – 5 noãn, có nang lên đến 11 noãn [6]. Điều này có thể do giống chó khác nhau nên số lượng noãn trong nang đa noãn khác nhau, Cole và Cupps (1959) khảo sát trên giống chó săn thả, chúng tôi khảo sát trên giống chó ta. 34 4.2.5. So sánh chất lƣợng noãn chó trong nang đơn noãn và nang đa noãn Bảng 4.7: Phân loại chất lƣợng noãn chó trên nang đơn noãn và đa noãn Chất lượng Loại nang Số buồng trứng Số lượng noãn Loại A Loại B n % n % Đơn noãn Đa noãn 21 21 36 22 31 18 87 82 5 4 13 18 p 0,52 0,61 Chất lượng trứng thu được ở nang đơn noãn và nang đa noãn không có sự khác biệt về mặt thống kê. Tỉ lệ noãn loại A ở nang đơn noãn và đa noãn cao hơn loại B rất nhiều. 4.3. Kết quả về IVM Do kết quả nuôi noãn heo chưa thành công nên chỉ trình bày kết quả trên chó. 4.3.1. Trên chó Số đợt thí nghiệm nuôi noãn chín là 22 đợt, trong đó có 9 đợt trên nang lớn (đường kính nang > 2 mm) và 13 đợt trên nang nhỏ (đường kính nang < 2 mm). Có 3 đợt thành công, 2 đợt thành công trên nang noãn lớn và 1 đợt thành công trên nang noãn nhỏ. Trên noãn nhỏ, được 4 noãn chín trong 54 noãn được nuôi, đạt tỉ lệ 7 %. Trên noãn lớn, 1 noãn chín trong 6 noãn được nuôi, đạt tỉ lệ 17 %. Tỉ lệ thành công khá thấp, thấp hơn so với báo cáo của Rodgigues (2003), các tác giả đạt tỉ lệ 16,4 % khi nuôi noãn chó ở giai đoạn nghỉ ngơi với cùng thành phần môi trường của chúng tôi [27]. Tỉ lệ thành công ở nang lớn cao hơn nang nhỏ, số lượng noãn thu được ít nên không đưa ra kết luận chính xác. Tuy nhiên, điều này phù hợp với kết quả của Songsasen (2004), noãn chó đạt giảm phân 14,2 % ở nang có đường kính < 0,5 mm và 30,9 % ở nang có đường kính > 2 mm [30]. Mỗi đợt thí nghiệm, bình quân số nang được thu noãn là 16,1 nang nhỏ và 0,45 nang lớn. Trên nang nhỏ, loại noãn tốt đạt 73 % và loại noãn xấu đạt 27 %. Trên nang lớn, loại noãn tốt đạt 96 % và loại noãn xấu đạt 4 %. Noãn được nuôi đều là noãn loại A, không có sự khác biệt giữa chất lượng noãn trước khi nuôi và đường kính nang, nhưng có sự khác biệt giữa chất lượng noãn sau khi nuôi với đường kính nang, điều này phù hợp với dự đoán của chúng tôi (Mục 4.2.3. trang 33). 35 4.3.2. Kinh nghiệm trong IVM Khi pha môi trường nuôi trứng chín, môi trường căn bản là TCM 199. Trước hết pha môi trường TCM 199 với nước cất hai lần khử ion, sau đó dùng môi trường này pha các chất còn lại, mỗi chất được pha riêng, chia ra từng eppendof nhỏ cho mỗi lần dùng, trữ ở nhiệt độ thích hợp. Khi lấy noãn, nên lấy ở giai đoạn noãn còn liên kết với tế bào hạt, nếu noãn ở trạng thái tự do lơ lửng trong xoang nang thì không nên lấy. Noãn được nối với nang qua một cầu nối gồm những tế bào hạt nằm dưới vỏ nang, đính vào lớp vành tia của noãn. Cầu nối này có khả năng cho những ion và trương lực điện đi qua giữa các tế bào nang với noãn ở thời kì trước xuất noãn. Quan sát in vitro nhận thấy noãn không thể tăng trưởng nếu thiếu cầu nối này. Do đó, khi thao tác, ta nên chọn nang trong suốt, màu vàng, không nên chọn nang màu hồng vì nang màu hồng có lượng máu chảy theo mạch vào nang tăng, nang chuẩn bị xuất noãn, lúc này noãn ở trạng thái tự do lơ lửng. (a) Nang không lấy (b) Nang nên lấy Hình 4.1: Nang nên lấy và không nên lấy Khi lấy nang noãn chó, không thể dùng phương pháp hút như trên heo. Vì giai đoạn yên tĩnh và không động dục trên chó cái kéo dài, kích thước nang quá nhỏ, không nhìn thấy trên bề mặt buồng trứng trong giai đoạn này. Có thể dùng phương pháp cắt với loại có mũi kéo nhỏ và mỏng. Nếu dùng dao như trên heo, có thể gây vỡ noãn. Khi thực hiện thao tác xé noãn, nên lột sạch lớp vỏ bao ngoài nang, sau đó xem dưới kính hiển vi vị trí noãn, hai tay cầm kẹp xoay nang và cố định nang ở đầu đối diện vị trí noãn. Sau đó kẹp vỏ nang xé và lộn ngược mặt trong vỏ nang ra ngoài. Noãn sẽ nổi lên trên bề mặt lớp vỏ trong đã được lộn ngược. Dùng kẹp vuốt nhẹ và lấy noãn. Tạo môi trường giọt nuôi noãn chó, vì giọt 100 µl sẽ dễ bị loang ra đĩa, nên đầu tiên tạo giọt khoảng 50 µl, phủ dầu khoáng, sau đó thêm 50 µl còn lại. 36 4.4. Kinh nghiệm trong nhuộm nhiễm sắc thể Khi chuyển noãn qua lame với một ít PBS – PVA, cho thêm dung dịch ethanol – acetic acid tỉ lệ 3:1 để noãn dính vào lame. Sau đó ngâm vào dung dịch trên trong 48 giờ. Điều này tránh cho noãn trôi ra ngoài lame. Số noãn trôi ra ngoài lame nếu ngâm lame vào dung dịch trên là 3 trong 5 noãn, nếu nhỏ vài giọt dung dịch vào lame trước khi ngâm là khoảng 1 trong 5 noãn. Trước khi đậy lamel, cho một ít chất carnoy vào bốn góc của lamel. Carnoy là chất có đặc tính đàn hồi, giúp noãn xẹp xuống dưới áp lực của lamel một cách từ từ, lamel không dính chặt vào lame ảnh hưởng tới noãn. Nhưng ở điều kiện phòng thí nghiệm không có chất carnoy nên chúng tôi thay thế bằng mỡ bò (dùng trong sửa xe), cũng có tác dụng đàn hồi. Khi hút hóa chất ra khỏi lame, dùng giấy thấm hút từ từ. Thêm hóa chất mới vào lame cũng thực hiện nhẹ nhàng. Trong quá trình nhuộm, không xê dịch lamel. Các thao tác nhuộm đều thực hiện dưới kính hiển vi và tránh noãn trôi ra ngoài lame. Nên thêm acetol vào lame sau khi đã hút hết dung dịch ethanol: acetic acid, vì nếu không sẽ có phản ứng làm bẩn lame, không thấy mẫu nhuộm được rõ. 37 Hình 4.4: Nhuộm noãn chó đạt giảm phân (a), (b), (c) Hình 4.3: Nhuộm noãn chó không đạt giảm phân Hình 4.2: Vị trí đặt mỡ bò lên lame (a) (b) (c) 38 Hình 4.5: Thu nang noãn trên heo bằng phƣơng pháp cắt Hình 4.6: Thu nang noãn trên heo bằng phƣơng pháp hút Hình 4.7: Thu nang noãn trên chó bằng phƣơng pháp cắt 39 Hình 4.8: Hình các loại môi trƣờng. (Từ trái qua phải: môi trƣờng rửa noãn HEPES; 2 đĩa môi trƣờng nuôi noãn heo; môi trƣờng giọt nuôi noãn chó) Hình 4.9: Phƣơng pháp lấy noãn bằng kẹp Hình 4.10: Phƣơng pháp tạo môi trƣờng giọt trên chó 40 PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Đề tài đã đạt được những kết quả sau: - Đánh giá ban đầu các đặc điểm buồng trứng heo và chó. Là cơ sở cho các nghiên cứu sau này có những hướng nghiên cứu mới. - Đã áp dụng qui trình nuôi noãn heo và chó ở điều kiện phòng thí nghiệm Đại học Nông Lâm. Mặc dù tỉ lệ thành công chưa cao, đã rút ra những kinh nghiệm giúp người sau không mắc phải và tiết kiệm thời gian nghiên cứu. 5.2. Đề nghị - Tiếp tục đánh giá buồng trứng heo và chó. Trên heo đánh giá thêm chỉ tiêu giống và tuổi. Trên chó đánh giá thêm buồng trứng ở các giai đoạn của chu kỳ động dục. - Hoàn thiện qui trình nuôi noãn trên heo và chó. Kết hợp bố trí thí nghiệm để có thể so sánh sự khác biệt giữa kết quả đánh giá ban đầu và kết quả sau khi nuôi noãn chín. - Nghiên cứu tiếp sự phát triển của phôi sau khi thụ tinh và xác định giới tính phôi. 41 PHẦN 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Nguyễn Tấn Anh, Nguyễn Quốc Đạt, 1997. Thụ tinh nhân tạo gia súc gia cầm. NXB nông nghiệp. [2] Nguyễn Tiến Dũng, Dương Đình Long, Nguyễn Văn Thanh, 2002. Sinh sản gia súc. Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội. [3] Huỳng Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh in vitro và dùng PCR xác định giới tính phôi trên heo. Luận văn thạc sĩ, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. TIẾNG NƢỚC NGOÀI [4] Bogliolo L., Zedda M.T., Ledda S., Leoni G., Naitana S. and Paul S., 2002. Influence of co–culture with oviductal epithelial cells on in vitro maturation of canine oocytes. Reprod. Nutr. Dev., 42: 265 – 273 . [5] Bolamba D., Borden-Russ K.D. and Durant B.S., 1998. In vitro maturation of domestic dog oocytes cultured in advanced preantral and early antral follicles. Theriogenology, 49: 933 – 942. [6] Cole H.H. and Cupps, 1959. Reproduction in domestic animals. Academic press, New York and London, pp. 342 – 345, 369 – 374. [7] De la Barre A.E., Gerson V., Gout S., Creaven M., Allis C.D. and Dimitrov S., 2000. Core histone N – termini play an essential role in meiotic chromosome condensation. EMBOJ, 19: 379 – 391. [8] Downs S.M. and Hudson E.D., 2000. Energy subtrates and the completion of spontaneous meiotic maturation. Zygote, 8: 339 – 351. [9] Eppig J.J. and Wigglesworth K., 2002. Factors affecting the developmental competence of mouse oocytes grown in vitro: oxygen tension. Mol. Reprod. Dev., 42: 447 – 456. [10] Fulka J.Jr., Moor R.M., Loi P. and Fulka J., 2003. Enucleolation of porcine oocytes. Theriogenology, 59: 179 – 1885. [11] Hirano T. and Mitchison T.J., 1994. A heterodimeric coiled-coil protein required for mitotic chromosome condensation in vitro. Cell, 79: 449 – 458. 42 [12] Hong Thuy Bui, Emi Yamaoka and Takashi Miyano, 2004. Involvement of Histone H3 (Ser 10) phosphorylation in chromosome condensation without Cdc2 kinase and mitogen activated protein kinase activation in pig oocytes. Biol. Reprod., 70: 319 – 326. [13] Kubelka M., Anger M., Kalous J., Schults R.M. and Motlik J., 2002. Chromosome condensation in pig oocytes: lack of a requirement for either cdc2 kinase or MAP kinase activity. Mol. Reprod. Dev., 63: 110 – 118. [14] Liu X., Andoh K., Yokota H., Kobayashi J., Abe Y. and Yamada K., 1998. Effects of growth hormone, activin and follistatin on the development of preantral follicles from immature female mice. Endocrinology, 139: 2342 – 2347. [15] Luvoni G.C., Chigioni S., Allievi E. and Macis D., 2003. Meiosis resumption of canine oocytes cultured in the isolated oviduct. Reprod. Domest. Anim., 38: 410 – 414. [16] Luvoni G.C., Chigioni S., Allievi E., Macis D. and Perego L., 2003. Extension incubation time in a two-step culture system for the maturation of canine oocytes. Proc. 3 rd EVSSAR Annual Congress, 123 – 124. [17] Mao J., Caamano T.N. , Cantely T.C., Farwell R., Rieke , Smith M.F. and Day B.N., 2003. Effect of follicular size on developmental competence of porcine oocytes in vitro. American Dairy Science Association. Joint Annual Meeting, USA, [Abstract]. [18] Masaya Geshi and Naoki Takenouchi, 2000. Effects of sodium pyruvate in nonserum maturation medium on maturation fertilization, and subsequent development of bovine oocytes with or without cumulus cells. Biol. Reprod., 63: 1730 – 1734. [19] Masui Y. and Markert C.L., 1971. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. J. Exp. Zool., 177: 129 – 145. [20] Mc Natty K.P., Fidler A.E., Juengel J.L., Quirke L.D., Smith P.R. and Health D.A., 2000. Growth and paracrine factors regulating follicular formation and cellular function. Mol. Cell Endocrinol, 163: 11 – 20. [21] Min Kyu Kim, Yuda Heru Fibrianto, Hyun Ju Oh, Goo Jang, Hye Jin Kim, Kyu Seung Lee, Sung Keun Kang, Byeong Chun Lee and Woo Suk Hwang, 2004. Effect of β-mercaptoethanol or epidermal growth factor supplementation on in vitro maturation of canine oocytes collected from dogs with different stages of the estrus cycle. J. Vet. Sci., 5(3): 253 – 258. [22] Min Kyu Kim, Yuda Heru Fibrianto, Hyun Ju Oh, Goo Jang, Hye Jin Kim, Kyu Seung Lee, Sung Keun Kang, Byeong Chun Lee and Woo Suk Hwang, 2005. Effects 43 of estradiol-17β and progesteron supplementation on in vitro nuclear maturation of canine oocytes. Theriogenology 63 [Abstract]. [23] M.T.Kane, 2003. A review of in vitro gamete maturation and embryo culture and potential impact on future animal biotechnology. Animal Reprod. Sci., 79: 171 – 190. [24] Otoi T., Fujii M., Tanaka M., Ooka A. and Suzuki T., 1999. Effects of serum on the in vitro maturation of canine oocytes. Reprod. Fertil. Dev., 11:387 – 390. [25] Otoi T., willingham L., Shin T, Kraemer D.C. and Westhusin M., 2002. Effects of oocyte culture density on meiotic competence of canine oocytes. Reprod., 124:775 – 781. [26] Robert van den Hurk and Jia Zhao, 2005. Formation of mammalian oocytes and their growth, differentiation and maturation within ovarian follicles. Theriogenology 63: 1717 – 1751. [27] Rodrigues B.A. and Rodrigues L.J., 2003. Influence of reproductive status on in vitro oocyte matuation in dogs. Theriogenlogy 60: 59 – 66. [28] Sara C., Luvoni G.C., Elisa A. and Debora M., 2005. Factor involved in vivo and in vitro maturation of canine oocytes. Theriogenology 63: 41 – 59. [29] Sawyer H.T., Smith P., Health D.A., Juengel J.L., Wakefield S.J. and Mc Natty K.P., 2002. Formation of varian follicles during fetal development in sheep. Biol. Reprod.,66:1134 – 1150. [30] Songsasen N., Spindler R. and Wildt D.E., 2004. Follicular size, but not stage of reproduction or season, influences meiotic maturation of domestic dog oocytes. Reproduction, Fertility and Development, 282 – 283 [Abstract]. [31] Songsasen N., Yu I. and Leibo S.P., 2002. Nuclear maturation of canine oocytes cultured in protein-free media. Mol. Reprod. Dev., 62:407 – 415. [32] Sutani T., Yuasa T., Tomonaga T., Takio K. and Yanagida M., 1999. Fisson yeast condensin complex essential roles of non-SMC subunits for condensation and Cdc2 phosphorylation of Cut3/ SMC4. Genes Dev., 13: 2271 – 2283. [33] Takashi Nagai, Misu Ebihara, Akira Onushi and Masanori Kubo, 1997. Germinal versicle stages in pig follicular oocytes collected by different methods. Journal of Reprod. Dev., 43: 340 – 342. [34] Van den Hurk R., Bevers M.M. and Dieleman S.J., 1999. Comparative endocrinology and reproduction. New Dehli. Narosa Publishing house, pp. 296 – 312. 44 [35] Wei Y., Yu L., Bowen J., Gorovsky M.A. and Allis C.D., 1999. Phosphorylation of histone H3 is required for proper chromosome condensation and segregation. Cell, 97:99 – 109. [36] www.cytochemistry.net/.../022%20_%2019_15.jpg [37] www.wisc.edu/.../lec/lec1/female - hist.html 45 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1: THÀNH PHẦN CÁC LOẠI MÔI TRƢỜNG 1. Trên heo (a) Thành phần môi trƣờng Nước cất 100 ml TCM199 980 mg NaHCO3 220 mg Kanamycin sulphate 8mg FCS 10% Pyruvic acid 10 mg hMG 10 UI Vỏ trứng 2 cái (b) Pha TCM199 Nước cất 100 ml TCM199 980 mg NaHCO3 220 mg Kanamycin sulphate 8mg (c) Pha pyruvic acid TCM199 10 ml Pyruvic acid 10 mg Chia ra từng eppendof nhỏ để dùng dần. Trữ ở -20oC (d) Pha hMG Dùng môi trường TCM199 để pha hMG. Chia ra từng eppendof để dùng dần. Trữ ở -20oC. (e) Pha HEPES Nước cất 100 ml TCM199 980 mg NaHCO3 85 mg HEPES 596 mg Kanamycine sulphate 8 mg BSA 1g để yên 15 phút tan hết 46 Điều chỉnh pH = 7,4 bằng NaOH 1N hoặc NaOH 5N. (f) Môi trƣờng khi nuôi FCS 200 μl Pyruvic acid 200 μl hMG 200 μl TCM 199 1400 μl 2. Trên chó (a) Thành phần môi trƣờng TCM199 môi trường căn bản HEPES 25mM/l ECS 10% Gentamycin 50 μg/ml NaHCO3 2,2 mg/ml Pyruvic acid 22μg/ml Estradiol 1 μg/ml FSH 0,5 μg/ml hCG 0,03 UI/ml (b) Pha môi trƣờng căn bản TCM199 Nước cất 100ml TCM199 980 mg NaHCO3 220 mg Gentamycin 5 mg Hepes 5,97g Trữ ở 4oC. (c) Pha NaHCO3 TCM199 10ml NaHCO3 0,22g Trữ ở -20oC. (d) Pha pyruvic acid TCM199 10 ml Pyruvic acid 0,022g Trữ ở -20oC. 47 (e) Pha estradiol, FSH, hCG bằng môi trường căn bản TCM199. Trữ ở -20oC. (f) Môi trƣờng nuôi trứng chín Pyruvic acid 50 μl Estradiol 50 μl FSH 50 μl hMG 50 μl TCM199 4300 μl 3. Môi trƣờng PBS – PVA Nước cất 100 ml NaCl 800 mg KCl 20 mg Na2HPO4.12H2O 290 mg KH2PO4 20 mg Polyvinyl alcohol (PVA) 100 mg PVA được pha riêng với nước cất, gia nhiệt khoảng 70oC đến khi PVA tan hết trong nước. Sau đó được pha chung với môi trường PBS – PVA. 48 PHỤ LỤC 2. BẢNG TRONG STAGRAPHIC Analysis of Variance for HEO.LOAIA - Type I Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- ----- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- ----- MAIN EFFECTS A:HEO.PPHAP .0591267 1 .0591267 .479 .4971 B:HEO.KTHUOC 1.8879429 2 .9439714 7.652 .0007 RESIDUAL 21.341147 173 .1233592 --------------------------------------------------------------------------- ----- TOTAL (CORRECTED) 23.288217 176 --------------------------------------------------------------------------- ----- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for HEO.LOAIA --------------------------------------------------------------------------- ----- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean --------------------------------------------------------------------------- ----- GRAND MEAN 177 .4825215 .0478110 .3881326.5769104 A:HEO.PPHAP 1 84 .4960188 .0556274 .3861985.6058390 2 93 .4690242 .0536471 .3631135.5749349 B:HEO.KTHUOC 1 90 .4164220 .0370971 .3431846.4896594 2 80 .6235000 .0392682 .5459763.7010237 3 7 .4076425 .1328045 .1454584.6698265 --------------------------------------------------------------------------- --- 49 Analysis of Variance for HEO.LOAIB - Type I Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- ----- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- ----- MAIN EFFECTS A:HEO.PPHAP .0341841 1 .0341841 .351 .5609 B:HEO.KTHUOC 1.1146264 2 .5573132 5.716 .0039 RESIDUAL 16.868994 173 .0975086 --------------------------------------------------------------------------- ----- TOTAL (CORRECTED) 18.017805 176 --------------------------------------------------------------------------- ----- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for HEO.LOAIB --------------------------------------------------------------------------- ----- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean --------------------------------------------------------------------------- ----- GRAND MEAN 177 .3639194 .0425073 .2800011.4478377 A:HEO.PPHAP 1 84 .3535265 .0494567 .2558887.4511643 2 93 .3743123 .0476960 .2801503.4684743 B:HEO.KTHUOC 1 90 .4377429 .0329819 .3726297.5028560 2 80 .2755000 .0349121 .2065761.3444239 3 7 .3785153 .1180724 .1454155.6116151 --------------------------------------------------------------------------- --- 50 Analysis of Variance for HEO.loaiC - Type I Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- ----- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- ----- MAIN EFFECTS A:HEO.PPHAP .0099814 1 .0099814 .146 .7066 B:HEO.KTHUOC .2376642 2 .1188321 1.742 .1782 RESIDUAL 11.800240 173 .0682095 --------------------------------------------------------------------------- ----- TOTAL (CORRECTED) 12.047886 176 --------------------------------------------------------------------------- ----- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for HEO.loaiC --------------------------------------------------------------------------- ----- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean --------------------------------------------------------------------------- ----- GRAND MEAN 177 .1619216 .0355520 .0917345.2321087 A:HEO.PPHAP 1 84 .1711807 .0413643 .0895189.2528425 2 93 .1526625 .0398918 .0739078.2314172 B:HEO.KTHUOC 1 90 .1691564 .0275852 .1146974.2236153 2 80 .1010000 .0291996 .0433538.1586462 3 7 .2156084 .0987528 .0206497.4105672 --------------------------------------------------------------------------- --- 51 Analysis of Variance for CHO5.A - Type I Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- ----- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- ----- MAIN EFFECTS A:CHO5.buongtrung .0001369 1 .0001369 .002 .9652 B:CHO5.kichthuoc .0086363 1 .0086363 .124 .7295 RESIDUAL 3.5399402 51 .0694106 --------------------------------------------------------------------------- ----- TOTAL (CORRECTED) 3.5487134 53 --------------------------------------------------------------------------- ----- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for CHO5.A --------------------------------------------------------------------------- ----- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean --------------------------------------------------------------------------- ----- GRAND MEAN 54 .7903141 .0377690 .7144723.8661558 A:CHO5.buongtrung 1 26 .7855320 .0557147 .6736546.8974095 2 28 .7950961 .0498658 .6949635.8952287 B:CHO5.kichthuoc 1 35 .8039689 .0448452 .7139177.8940200 2 19 .7766593 .0619596 .6522418.9010767 --------------------------------------------------------------------------- --- 52 Analysis of Variance for CHO5.B - Type I Sums of Squares --------------------------------------------------------------------------- ----- Source of variation Sum of Squares d.f. Mean square F-ratio Sig. level --------------------------------------------------------------------------- ----- MAIN EFFECTS A:CHO5.buongtrung .0001369 1 .0001369 .002 .9652 B:CHO5.kichthuoc .0086363 1 .0086363 .124 .7295 RESIDUAL 3.5399402 51 .0694106 --------------------------------------------------------------------------- ----- TOTAL (CORRECTED) 3.5487134 53 --------------------------------------------------------------------------- ----- 0 missing values have been excluded. All F-ratios are based on the residual mean square error. Table of Least Squares Means for CHO5.B --------------------------------------------------------------------------- ----- 95% Confidence Level Count Average Stnd. Error for mean --------------------------------------------------------------------------- ----- GRAND MEAN 54 .2096859 .0377690 .1338442.2855277 A:CHO5.buongtrung 1 26 .2144680 .0557147 .1025905.3263454 2 28 .2049039 .0498658 .1047713.3050365 B:CHO5.kichthuoc 1 35 .1960311 .0448452 .1059800.2860823 2 19 .2233407 .0619596 .0989233.3477582 --------------------------------------------------------------------------- ---