Lên men Malolactic của Streptococcus mutans và vai trò bảo vệ vi khuẩn khỏi tổn thương Oxi hóa - Nguyễn Thị Mai Phương

92 33(4): 92-96 Tạp chí Sinh học 12-2011 LÊN MEN MALOLACTIC CủA Streptococcus mutans Và VAI TRò BảO Vệ VI KHUẩN KHỏI TổN THƯƠNG OXI Hóa NGUYễN THị MAI PHƯƠNG Viện Công nghệ sinh học ROBERT E. MARQUIS Đại học Rochester, Hoa Kỳ Lên men malolactic (malolactic fermentation - MLF) do vi khuẩn Oenococcus oeni thực hiện đ) đ−ợc nghiên cứu khá chi tiết do vai trò quan trọng của nó trong công nghiệp sản xuất r−ợu [5]. Đây là quá trình lên men thứ cấp sau quá trình lên men r−ợu do nấm men thực hiện. Trong quá trình lên men này, axit L-malic dicarboxylic đ−ợc chuyển hóa thành axit monocarboxylic L-lactic và giải phóng CO2, giúp làm tăng h−ơng vị và làm giảm độ axit của r−ợu. Sự lên men này còn đ−ợc phát hiện ở nhiều chủng vi khuẩn lactic (LAB) khác nh− các thành viên của chi Lactobacillus, Leuconostoc, và Streptococcus [1-3]. Quá trình decarboxyl hóa của L-malic đ−ợc thực hiện nhờ enzim malolactic (MLE) với sự có mặt của NAD+ và Mn2+ [11]. Sự lên men cũng đi kèm với quá trình sinh tổng hợp ATP đ−ợc xúc tác bởi enzim F(H+)-ATPase trên màng, vì quá trình lên men dẫn đến sự kiềm hóa tế bào chất do L-lactic hình thành có độ axit thấp hơn L-malic. Điều này cho phép proton đ−ợc vận chuyển từ bên ngoài vào tế bào chất thông qua hoạt động của enzim F- ATPase theo cơ chế synthetase. Kết quả là ATP đ−ợc hình thành. Mặt khác, sự sinh tổng hợp ATP có thể còn liên quan đến hệ thống vận chuyển đối ng−ợc malate/lactate (antiport) cũng có sự tham gia của F(H+)-ATPase [9]. Gần đây, Sheng và Marquis [10] đ) phát hiện thấy chủng Streptococcus mutans UA159 có mang các gene m) hoá cho quá trình lên men malolactic trong đó có SMu 0121 m) hóa cho MLE có trình tự base t−ơng tự nh− trình tự của enzim này ở các chủng LAB [1, 4]. Khi nghiên cứu về sinh lý của quá trình này, các tác giả đ) phát hiện thấy MLF có vai trò làm kiềm hóa mảng bám răng (dental plaque), vì vậy làm tăng khả năng chịu stress axit của vi khuẩn S. mutans. Bài báo này trình bày những phát hiện của chúng tôi về vai trò của MLF ở vi khuẩn S. mutans và có thể ở cả những chủng vi khuẩn Streptococcus xoang miệng khác trong việc bảo vệ tế bào khỏi tổn th−ơng oxi hóa gây ra bởi các gốc oxi hoạt động (ROS) là O2 -, H2O2 và OH - . I. PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU 1. Chủng vi khuẩn và điều kiện nuôi cấy Streptococcus mutans UA159 đ−ợc nuôi giữ và cấy chuyển hàng tuần trên môi tr−ờng thạch chứa bovine heart infusion - BHI agar (Difco Laboratories, Detroit, MI). Tế bào đ−ợc nuôi cấy trong môi tr−ờng TYM chứa 3% tryptone, 0,5% cao nấm men, 25 mM glucose và 50 mM L-malic để cảm ứng hoạt tính enzim malolactic (MLE). 2. Đo sự lên men L-malic Tế bào đ−ợc thu hoạch ở giai đoạn đầu của phase ổn định và đ−ợc rửa 2 lần bằng cách ly tâm ở tốc độ 6000 g trong 15 phút ở 4oC với dung dịch muối có chứa 50 mM KCl và 1 mM MgCl2. Tế bào sau đó đ−ợc hòa trở lại với dung dịch muối ở mật độ tế bào khoảng 1,1 mg trọng l−ợng khô/ml. Axit L-malic ở pH 4,0 đ−ợc thêm vào ở nồng độ cuối cùng là 10 mM để bắt đầu phản ứng. Sự tiếp nhận L-malic tại mỗi thời điểm nhất định đ−ợc đo bằng việc xác định hàm l−ợng L-malic đ) đ−ợc chuyển hóa thành axit L-lactic sử dụng kít của h)ng Boehringer Mannheim (Darmstadt, Germany) có chứa enzim L-malic dehydrogenase. Đây là ph−ơng pháp đặc hiệu để xác định axit L-malic. Khả năng tiếp nhận L-malic của tế bào từ quá trình MLF đ−ợc biểu diễn bằng đơn vị nanomole L-malic decarboxylated/phút/mg trọng l−ợng khô tế bào. 93 3. Tác dụng bảo vệ tế bào Các gốc oxi hoạt động (ROS) đ−ợc nghiên cứu ở đây bao gồm H2O2 (Sigma), OH - (tạo thành từ phản ứng Fenton của H2O2 kết hợp với ion kim loại có khả năng chuyển đổi là Cu2+) và O2 - (tạo thành từ hệ thống xanthine-xanthine oxidase). Cụ thể, tế bào S. mutans sau khi nuôi cấy trong môi tr−ờng TYM đ−ợc thu hoạch, rửa và hòa lại trong dung dịch muối có chứa 50 mM KCl và 1 mM MgCl2 ở nồng độ 0,4 mg trọng l−ợng khô tế bào. L-malic ở pH 4,0 đ−ợc thêm vào dung dịch tế bào để đạt nồng độ cuối cùng là 30 mM. Sau đó, H2O2, tổ hợp chất H2O2/CuCl2 (để tạo OH -) hay tổ hợp chất xanthine/xanthine oxidase (để tạo O2 -) đ−ợc tiếp tục thêm vào. ở những thời điểm nhất định, 100 àL mẫu đ−ợc lấy ra, pha lo)ng 10 lần liên tiếp với dung dịch peptone 1% (Difco Laboratories, Detroit, MI) ở pH 7,0 và đ−ợc cấy trải trên đĩa thạch BHI. Các đĩa này đ−ợc ủ trong tủ ấm 37oC trong vòng 48 giờ cho đến khi khuẩn lạc hình thành rõ rệt, có thể đếm đ−ợc bằng mắt th−ờng [8]. 4. Xác định hàm l−ợng ATP có trong tế bào chất Hàm l−ợng ATP trong tế bào chất của S. mutans đ−ợc xác định theo ph−ơng pháp đo ATP bằng huỳnh quang (bioluminescence) đ) đ−ợc Sheng & Marquis mô tả (2006). ATP đ−ợc chiết ra từ tế bào bằng đệm Tris-HCl 20 mM nóng có chứa EDTA 2 mM, pH 7,75. Hàm l−ợng ATP trong dịch chiết sau đó đ−ợc xác định sử dụng kit Luciferase/Luciferin của h)ng Promega (Madison, WI) trên máy đo huỳnh quang Luminometer Turner Designs (Sunnyvale, CA), Model DT-20/20. II. KếT QUả Và THảO LUậN 1. MLF và khả năng tiếp nhận L-malic ở vi khuẩn S. mutans Hệ thống lên men L-malolactic mới đ−ợc phát hiện và nghiên cứu ở S. mutans rất gần đây [10]. Hệ thống này đ−ợc xem là có vai trò bảo vệ tế bào S. mutans khỏi tổn th−ơng do stress axit gây ra. MLF đ−ợc bắt đầu bằng việc tiếp nhận L-malic nhờ enzim permease nằm trên màng (Smu 0125) và sau đó cơ chất này đ−ợc chuyển hóa thành axit L-lactic và CO2 nhờ MLE nằm trong tế bào chất. ở các chủng vi khuẩn có MLF đ) biết nh− LAB, MLF xảy ra mạnh tại các giá trị pH thấp hơn 3,0 [5, 11]. Để tìm hiểu khả năng tiếp nhận L-malic ở S. mutans, chúng tôi đ) tiến hành xác định khả năng đồng hóa L-malic tại các giá trị pH khác nhau để tìm ra điều kiện pH tối thích cho quá trình lên men này ở S. mutans. Kết quả trình bày ở hình 1 cho thấy, MLF ở S. mutans có thể diễn ra ở các giá trị pH khác nhau từ 3,0 đến 7,0. Tuy nhiên, giá trị pH 4,0 là thích hợp nhất cho hoạt động MLF của S. mutans, đồng nghĩa với việc vi khuẩn có khả năng tiếp nhận L-malic tốt nhất. MLF tại pH 4,0 đạt tới 10,2 mmole/phút/mg trọng l−ợng khô (TLK) tế bào so với các giá trị 3,2 ở pH 3,0; 7,8 ở pH 5,0; 4,0 ở pH 6,0 và 1,6 ở pH 7,0. Động học của quá trình tiếp nhận L-malic tại pH 4,0 cũng đ) đ−ợc xác định (hình 2) và cho thấy, tại giá trị pH 4,0, quá trình tiếp nhận đạt mức độ tuyến tính trong khoảng thời gian 60 phút đầu tiên và sau đó tiến dần đến giá trị b)o hòa. Những kết quả thu đ−ợc ở đây là cơ sở để chúng tôi lựa chọn những điều kiện thích hợp cho các nghiên cứu về MLF tiếp theo. 3.0 3.5 4.0 5.0 6.0 7.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hình 1. MLF của S. mutans tại các giá trị pH khác nhau 0 40 80 120 160 200 0 1 2 3 Hình 2. Động học của quá trình tiếp nhận L-malic của S. mutans tại giá trị pH 4,0 m m ol e L -m al at e đ −ợ c ti ếp n h ận /g iờ /m gT L K m m ol e L -m al at e đ −ợ c ti ếp n h ận /g iờ /m gT L K Phút pH 3,0 , , 5,0 , , 94 Hình 3. LMF bảo vệ S. mutans khỏi tác dụng gây chết của các gốc tự do. A. H2O2; B. OH -; C. O2 - 2. MLF bảo vệ S. mutans khỏi tác dụng gây chết của các gốc tự do MLF đ−ợc phát hiện có vai trò bảo vệ S. mutans khỏi tổn th−ơng do axit [10], nh−ng cho đến nay ch−a có công bố nào đề cập đến vai trò của nó trong các quá trình sinh lý khác của tế bào trong đó có stress oxi hóa, cùng với stress axit là hai stress rất phổ biến trong mảng bám răng. Các vi khuẩn xoang miệng trong đó có S. mutans trên mảng bám răng phải th−ờng xuyên tiếp xúc với các gốc ROS [7]. Các gốc ROS này có khả năng tấn công các đại phân tử sinh học của tế bào nh− protein, ADN và lipid, gây chết tế bào [6]. Vậy hệ thống MLF có vai trò nh− thế nào trong việc bảo vệ tế bào khỏi tác dụng gây tổn th−ơng oxi hóa do các ROS gây ra? Để tìm hiểu vấn đề này, chúng tôi đ) tiến hành nghiên cứu tác dụng gây chết tế bào S. mutans khi có mặt của các gốc tự do và L-malic (cơ chất của quá trình lên men MLF). Kết quả thu đ−ợc ở hình 3A cho thấy rằng, khi không có mặt của L-malic, H2O2 có tác dụng gây chết mạnh tế bào với giá trị D (thời gian gây chết 90% quần thể tế bào) là khoảng 15 phút. C A Đối chứng 58 mM H2O2 58 mM H2O2+ 30 mM L-malic 0 10 20 30 40 50 60 70 -5,5 -4,5 -3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5 Phút L og N /N o Đối chứng 1,25 mM xanthine + 50 mU/ml xanthine oxidase (XO) 30 mM L-malic +1,25 mM xanthine + 50 mU/ml XO 1,25 mM xanthine 50 mU/ml XO B Đối chứng 49 mM H2O2 + 29 mM CuCl2 30 mM L-malic +49 mM H2O2 + 29 mM CuCl2 49 mM H2O2 29 mM CuCl2 0 10 20 30 40 50 60 70 -10 -8 -6 -4 -2 0 Phút L og N /N o -6,5 -5,5 -4,5 -3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5 Phút L og N /N o 0 10 20 30 40 50 60 70 95 Tuy nhiên, khi có mặt của L-malic và quá trình MLF diễn ra, giá trị D tăng lên đến 27 phút, đồng nghĩa với việc tế bào đ) đ−ợc bảo vệ một phần khỏi tác dụng của ROS này. Một bức tranh t−ơng tự cũng đ−ợc tìm thấy khi tế bào đ−ợc xử lý với OH- (tạo ra từ phản ứng của H2O2 và CuCl2) và O2 - (tạo ra từ phản ứng của xanthine và xanthine oxidase). Đặc biệt, trong tr−ờng hợp có mặt của OH-, tác dụng bảo vệ của MLF là rất rõ rệt nhất với các giá trị D lần l−ợt đạt 10 và 26 phút (hình 3B). T−ơng tự nh− vậy, tác dụng bảo vệ của MLF là khá rõ ràng trong tr−ờng hợp của O2 - với giá trị D = 9 và 13 phút (hình 3C). Nh− vậy có thể thấy rằng, MLF có tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tác dụng tấn công của các gốc ROS. Đây là một phát hiện mới về mối liên quan giữa MLF và stress oxi hóa ở vi khuẩn nói chung và ở S. mutans nói riêng. 3. Sinh tổng hợp ATP trong quá trình MLF Hàm l−ợng ATP trong tế bào chất của S. mutans trong quá trình MLF tại pH 4,0 đ) đ−ợc xác định để tìm hiểu mối liên quan giữa tác dụng bảo vệ tế bào khỏi tổn th−ơng oxi hóa do ROS của MLF và quá trình sinh tổng hợp ATP. Kết quả trình bày ở hình 4 cho thấy, hàm l−ợng ATP nội sinh đ) tăng lên rõ rệt trong quá trình lên men này so với đối chứng. Tế bào sinh tổng hợp ATP mạnh trong khoảng 10 phút đầu của quá trình tiếp nhận L-malic và duy trì hàm l−ợng ATP cao trong suốt thời gian 60 phút thí nghiệm. Trong khi đó, hàm l−ợng ATP ở mẫu đối chứng lại bị giảm dần do đ−ợc sử dụng vào các hoạt động sống sinh lý của tế bào khi môi tr−ờng bị đói cơ chất và gần nh− biến mất sau 60 phút. Phát hiện này cũng đ) đ−ợc Sheng và Marquis [10] mô tả khi tế bào đ−ợc xử lý với stress axit trong điều kiện có mặt của L-malic. Nh− vậy, các số liệu thu đ−ợc trong nghiên cứu này đ) cho thấy sự tăng c−ờng sinh tổng hợp ATP trong MLF có vai trò bảo vệ tổn th−ơng oxi hóa ở vi khuẩn S. mutans và có thể là một thành phần quan trọng của đáp ứng với tổn th−ơng oxi hóa ở vi khuẩn này. Hình 4. Hàm l−ợng ATP trong quá trình MLF tại pH 4,0 III. KếT LUậN Lên men malolactic ở vi khuẩn S. mutans có vai trò trong việc bảo vệ vi khuẩn khỏi tác dụng gây chết do các gốc oxi hoạt động gây ra thông qua việc tăng c−ờng sinh tổng hợp ATP trong quá trình lên men này. TàI LIệU THAM KHảO 1. Ansanay V., Dequin S., Blondin B. & Barre P., 1993: Cloning, sequence and expression of the gene encoding the malolactic enzyme from Lactococcus lactis. FEBS Lett, 332: 74-80. 2. Arthurs C. E. & Lloyd D., 1999: Kinetics, steroespecificity, and expression of the malolactic enzyme. Appl. Environ. Microbiol, 65: 3360-3363. 3. Battermann G. & Radler F., 1991: A comparative study of malolactic enzyme and malic enzyme of different lactic acid bacteria. Can. J. Microbiol, 37: 211-217. 4. Denayrolles M., Aigle M. and Lonvaud- Funel A., 1994: Cloning and sequence analysis of the gene encoding Lactobacillus lactis malolactic enzyme: relationships with malic enzymes. FEMS Microbiol. Lett, 116: 79-86. Đối chứng 25 mM L- malic nm ol e A T P / m g T L K 0 10 20 30 40 50 60 70 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 Phút 96 5. Herrero M., García L. A. and Díaz M., 2003: Malolactic bioconversion using a Oenococcusoeni strain for cider production: effect of yeast extract supplementation. J. Ind. Microbiol. Biotechnol, 30: 699-704. 6. Imlay J. A., 2003: Pathways of oxidative damage. Annu. Rev. Microbiol, 57: 395- 418. 7. Marquis R. E., 2004: Applied and ecological aspects of oxidative-stress damage to bacterial spores and to oral microbes. Sci. Prog, 87: 153-177. 8. Phan T. N., Reidmiller J. S. and Marquis R. E., 2000: Sensitization of Actinomyces naeslundii and Streptococcus sanguis biofilms and suspensons to acid damage by fluoride and other weak acids. Arch. Microbiol, 174: 248-255. 9. Poolman B., Molenaar D., Smid E. D., Ubbink T., Abee T., Renault P. P. & Konings W. N., 1991: Malolactic fermentation: electrogenic malate uptake and malate/lactate antiport generate metabolic energy. J. Bacteriol, 173: 6030- 6037. 10. Sheng J. & Marquis R. E., 2006: Enhanced acid resistance of oral streptococci at lethal pH values associated with acid-tolerant catabolism and with ATP synthase activity. FEMS Microbiol. Lett, 262: 93-98. 11. Strasser de Saad A. M., Pesce de Ruiz Holgado A. A. and Oliver G., 1988: Malolactic enzyme in Lactobacillus murinus. Biochimie, 70: 357-365. MALOLACTIC FERMENTATION BY Streptoccocus mutans AND PROTECTION AGAINST OXIDATIVE DAMAGE NGUYEN THI MAI PHUONG, ROBERT E. MARQUIS SUMMARY Streptococcus mutans is the primary etiological agent of human dental caries. The extraordinary ability of S. mutans to adapt and survive the environmental stresses in human mouth, particularly oxidative stress even though it does not have catalase, a key protective enzyme against oxidative damage, make it be an attractive subject for dental research. In the oral cavity, S. mutans is routinely exposed to reactive oxygen species (ROS) such as hydrogen peroxide (H2O2), superoxide (O2 •−) and hydroxyl radical (OH•) generated by aerobic respiration, by H2O2 net secretors in plaque dental such as Streptococcus sanguis and S. gordonii, or by exposure to H2O2-containing dental care products. Alkali production by oral streptococci is considered important for dental plaque ecology and caries moderation. Recently, malolactic fermentation (MLF) was identified as a major system for alkali production by oral streptococci, including Streptococcus mutans. Malolactic fermentation is inducible by L-malate, involving decarboxylation of L-malate to yield L-lactic acid and concomitant reduction in acidity. Our major objectives in the work described in this paper were to further define the physiology of MLF of S. mutans and its roles in protection against oxidative stress damage. For the first time, L-malic, was found to enhance the protection of S. mutans against oxidative damage by reactive oxygen species including O2 •− generated by xanthine-xanthine oxidase system; H2O2 and OH • produced via Fenton reaction between H2O2 and metal cations at pH values of 4.0. Protection involved L-malic uptake with the significantly enhanced production of ATP from malate fermentation, to maintain ATP pool levels for physiological activities in the cells. In general, oxidative protection by malolactic fermentation against ROS damage involving catabolism of L-malic and ATP production is likely to be an important virulent trait of S. mutans. Key words: Streptococcus mutans, malolactic fermentation (MLF), oxidative damage. Ngày nhận bài: 4-5-2011