Khóa luận Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá cây xuân hoa (pseudranthemum palatiferum)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************************** XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT, KHẢO SÁT TÍNH KHÁNG KHUẨN VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG OXY HÓA CỦA MỘT SỐ HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ LÁ CÂY XUÂN HOA (Pseudranthemum palatiferum). Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. PHAN PHƢỚC HIỀN ĐỖ THỊ TÚY PHƢỢNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 iii 1 LỜI CẢM TẠ Con xin khắc ghi công ơn ba mẹ và những ngƣời thân đã nuôi dƣỡng và giáo dục con nên ngƣời. Tôi xin gửi lòng biết ơn đến: - Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Ban Giám Đốc Trung Tâm Phân Tích Và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Thầy chủ nhiệm, thầy cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học. Đã hỗ trợ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thành đề tài. Tôi xin chân thành biết ơn: - TS. Phan Phƣớc Hiền. - Kỹ sƣ Trịnh Phi Ly. Đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ, giành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý giá, tạo mọi điều kiện tốt cho tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: - ThS. Huỳnh Kim Diệu đã tận tình giúp đỡ trong việc lấy mẫu lá Xuân Hoa và đóng góp những ý kiến quý báu cho luận văn. - TS. Nguyễn Ngọc Hải, Phòng Vi Sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm. - Cô và Chú Đinh Công Bảy, chủ cơ sở trà Hoàn Ngọc 7 Nga Tây Ninh đã tận tình giúp đỡ và cung cấp số lƣợng lớn lá Xuân Hoa. Chân thành cảm ơn các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài. iv TÓM TẮT Đỗ Thị Tuý Phƣợng, Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 3/2007. “ Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum). Giáo viên hƣớng dẫn: TS. Phan Phƣớc Hiền Đề tài đƣợc tiến hành tại: - Phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Phòng Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Thời gian tiến hành: từ 15/3/2007 đến 30/7/2007. Nội dung tiến hành: - Tiến hành chiết tách các phân đoạn từ cao kháng khuẩn nhất bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng, sau đó thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn này với vi khuẩn E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa. - Tiến hành sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế để tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. - Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học,Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội. - Thử nghiệm khả năng chống oxy hóa của lá Xuân hoa bằng quy trình DPPH. Kết quả đạt đƣợc: - Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với nồng độ ức chế tối thiểu là : MICE. coli = 500 µg/ml. v MICsalmonella= 500 µg/ml. - Tách chiết đƣợc 18 phân đoạn và xác định đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn là XH9, XH10, XH11, XH12, XH13. - Tiến hành tách chiết trên phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn này thu đƣợc 2 hợp chất XH-K11 và XH-K13. - Sau khi chạy phổ và tham khảo một số tài liệu, đã định danh đƣợc XH-K11 là apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử: C21H20O10 và chất XH-K13 là β- sitosterol-3-O- β-glucoside, có công thức phân tử: C35H60O5. - Khảo sát tính chống oxy hóa của lá Xuân Hoa cho thấy hàm lƣợng các phân tử ức chế DPPH là khá cao (85,7%), thông qua so sánh chỉ số IC50 của mẫu Xuân Hoa với Vitamin C: IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml). IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml). vi SUMMARY Do Thi Tuy Phuong, Nong Lam University Ho Chi Minh City. “Establishing the method of isolating, researching antibacterial activity and antioxidant property of secondary metabolite compounds extracted from Xuan Hoa leaves”. Researching Place: Physicochemiscal department, Analysis and Biochemistry Center, Nong Lam University Ho Chi Minh City. Content: - Isolating and purifying a number of fractions of this glue by column chromatography (CC) and thin layer chromatography (TLC), after that researching antibacterial property of these fractions for E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. - Using CC and TLC to isolate and purify metabolite compounds of these antibacterial fractions. - Studying antioxidant activity of Xuan Hoa leaves by using DPPH process. Result: - Identifying chloroform glue is the most antibacterial activity, with : MICE. coli = 500 µg/ml. MICsalmonella= 500 µg/ml. - Getting 18 fractions and identifying the most antibacterial active fraction. - Purifying and determining molecular formula of the two compounds: apigenin 7-O-β- glucoside and β- sitosterol-3-O- β-glucoside. - Determination of antioxidant property of Xuan Hoa extract shows that the molecular volume which inhibits oxidant activity is high (85,7% Vitamin C): IC50 xuân hoa = 66,55 (µg/ml). IC50 vitamin c = 57,05 (µg/ml). vii MỤC LỤC NỘI DUNG TRANG Lời cảm ơn .................................................................................................................... iii Tóm Tắt ......................................................................................................................... iv Mục lục .......................................................................................................................... vii Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. xi Danh sách các hình và biểu đồ ...................................................................................... xii Danh sách các bảng và sơ đồ ....................................................................................... xiii 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 2 1.2. Mục đích - Yêu cầu ................................................................................................ 2 1.2.1. Mục đích .............................................................................................................. 2 1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................................ 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................................... 3 2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa ................................................................................... 3 2.1.1. Đặc điêm thực vật học ......................................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................. 3 2.1.3. Phân bố ................................................................................................................ 4 2.1.4. Nhân giống .......................................................................................................... 4 2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa ................................................................................ 4 2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian ................................................................................. 4 2.2.2. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 5 2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan ............................................................................................. 5 2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo ............................................................... 10 2.3. Thành phần hóa học ............................................................................................... 13 2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên ..................................................... 15 viii 2.4.1. Alcaloid ............................................................................................................... 15 2.4.2. Flavonoid ............................................................................................................. 16 2.4.3. Tinh dầu .............................................................................................................. 16 2.4.4. Saponin ................................................................................................................ 17 2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột ........................................................................ 17 2.5.1. Định nghĩa ........................................................................................................... 17 2.5.2. Hình thể ............................................................................................................... 17 2.5.3. Tính chất nuôi cấy ............................................................................................... 18 2.5.4. Đặc tính sinh hóa ................................................................................................. 18 2.5.5. Sức đề kháng ....................................................................................................... 19 2.5.6. Độc tố .................................................................................................................. 19 2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên........................................................................................ 19 2.5.8. Khả năng gây bệnh .............................................................................................. 21 2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm .............................................................. 21 2.6.1. Staphyl ococcus aureus ....................................................................................... 21 2.6.2. Pseudomonas aeruginosa.................................................................................... 21 2.6.3. Escherichia coli ................................................................................................... 21 2.6.4. Salmonella ........................................................................................................... 22 2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH ............................................................................. 23 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH ...................................................... 24 3.1. Vật liệu ................................................................................................................... 24 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện ............................................................................. 24 3.2.1. Địa điểm .............................................................................................................. 25 3.2.2. Thời gian ............................................................................................................. 25 3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ................................................................................. 25 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 25 3.3.2. Hóa chất .............................................................................................................. 27 ix 3.4. Phƣơng pháp tiến hành ........................................................................................... 28 3.4.1. Xử lý nguyên liệu ................................................................................................ 28 3.4.2. Điều chế các loại cao ........................................................................................... 28 3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa .................................................................................. 28 3.4.2.2. Điều chế cao chloroform .................................................................................. 29 3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol..................................................................................... 29 3.4.2.4. Điều chế cao nƣớc ............................................................................................ 29 3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao ....................................................... 31 3.4.4. Chiết xuất một số hợp chất cao chloroform ........................................................ 32 3.4.4.1. Sắc ký cột ........................................................................................................ 32 3.4.4.2. Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 35 3.4.4.3. Sắc ký điều chế ................................................................................................ 37 3.4.4.4. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn ............................................................................. 38 3.4.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc tách chiết từ cao chloroform ....................................................................................................................................... 38 3.4.6. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH ...................................................... 40 3.4.6.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH ................................................................... 40 3.4.6.2. Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH ................................................. 40 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 44 4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết .................................... 44 4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng .................... 45 4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform ................................................................ 45 4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. ................................................ 47 4.2.2.1. Phân đoạn XH11 .............................................................................................. 47 4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 ................................................................................. 47 4.2.2.3. Phân đoạn XH13 .............................................................................................. 48 4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết. ............................................................... 49 x 4.3.1. Chất XH-K13 ...................................................................................................... 49 4.3.2. Chất XH-K11 ...................................................................................................... 50 4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform. .................................................................................................................... 52 4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa ................................................................. 55 4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C ....................................................................... 55 4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa .................................................. 56 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................................... 58 5.1. Kết luận .................................................................................................................. 58 5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 60 PHỤ LỤC ...................................................................................................................... 62 xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHI Brain Heart Infirm C Chloroform Cfu Colony forming unit COSY Correclation Spectroscopy d Double: mũi đôi DEPT Distortionlees Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethylsulfuoxid DPPH 1,1 - diphenyl - 2 - picrylhydrazyl E Ete dầu hỏa HMBC Heteronuclear multiple bond correction HSQC Heteronuclear single quantum coherence IC50 Inhibitory Concentration 50: nồng độ ức chế 50% DPPH IR Infrared Spectrometry: hồng ngoại J Coupling constant: hằng số ghép cặp LD50 Lethal dose 50: liều gây chết 50% số cá thể m Multiplet: mũi đa Me Methanol MIC Minimum Inhibitory Concentration: nồng độ ức chế tối thiểu MS Mass Spectrometry: khối phổ Nt Nhƣ trên NMR Nuclear Magnetic Resonnace: cộng hƣởng từ hạt nhân Rf Retention factor s Single: mũi đơn t Tripplet: mũi ba TSA Tryptic Soy Agar xii DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Cây Xuân Hoa............................................................................................. 3 Hình 3.1: Các pha trong bình lắc quả lê ........................................................................ 29 Hình 3.2: Chất phân tích đã đƣợc đƣa vào cột sắc ký ................................................... 33 Hình 3.3: Bình triển khai sắc ký lớp mỏng ................................................................... 36 Hình 3.4: Sắc ký điều chế ............................................................................................. 37 Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C và mẫu Xuân Hoa sau khi cho DPPH vào ................................................................................................................................. 43 Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli v à Salmonella ............................. 44 Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng ........................................................................ 47 Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng ........................................................................ 48 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. Coli ................................... 52 Hình4.5 : Các nồng độ kháng E. coli của phân đoạn XH9 ........................................... 53 Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus của phân đoạn XH9 ........................ 54 Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9 .......................... 54 Đồ thị 4.1: Vitamin C .................................................................................................... 55 Đồ thị 4.2: Mẫu Xuân Hoa........................................................................................ 56 xiii DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột ...................................................................... 7 Bảng 2.2: Kết quả đo hàm lƣợng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl4/kg thể trọng ................................................................................................................................ 9 Bảng 2.3: Hàm lƣợng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl4/kg thể trọng chuột ..................... 9 Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan ......................................................................... 10 Bảng 2.5: Ảnh hƣởng của lá tƣơi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trƣởng, bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo .......................................................................... 11 Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy .............................................................. 12 Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm ........................................................... 39 Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa..................................................... 42 Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ mẫu vitamin C ..................................................... 43 Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao ...................... 44 Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên Cao Chloroform .................................................. 45 Bảng 4.3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn ........................... 53 Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C.................................................... 55 Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của mẫu Xuân Hoa ........................................... 56 Bảng 4.6: Ảnh hƣởng của mẫu Xuân Hoa đối với độ hấp thụ của DPPH ................ 57 Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu .................................................................... 28 Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao ............................................................... 30 Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH ............................................ 41 1 Chƣơng 1 MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum) là một loại cây đƣợc dân gian biết đến nhƣ là một dƣợc liệu có thể chữa đƣợc rất nhiều căn bệnh: bệnh tiêu hóa, tiểu đƣờng, trĩ nội, chảy máu, suy nhƣợc thần kinh…Tuy nhiên, trên thực tế có rất ít nghiên cứu về cây này để có thể làm rõ vẫn đề trên. Hiện nay trên thế giới chƣa có một nghiên cứu nào sâu xa về cây này. Các nhà khoa học Việt Nam cũng chỉ mới bƣớc đầu tìm hiểu, nghiên cứu về nó. Trần Công Khánh và cộng sự (1999) đã thử độc tính cấp diễn trên chuột cho thấy cao toàn phần lá Xuân Hoa không thể hiện độc tính và có tác dụng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hƣớng bảo vệ tế bào gan. Huỳnh Kim Diệu (2003) đã thử nghiệm lá Xuân Hoa đối với heo chƣa cai sữa có tác dụng tăng trọng và chữa đƣợc bệnh dịch tả. Và gần đây, trong Hội Nghị Khoa Học và Công Nghệ Hóa Hữu Cơ Toàn Quốc lần thứ 3 Hà Nội 11 – 2005, Phan Phƣớc Hiền và cộng sự đã công bố công trình phân lập Triterpenoid và Steroid từ lá cây Xuân Hoa Psenderanthemum palatiferum họ Acanthaceae bằng phƣơng pháp cộng hƣởng từ hạt nhân. Hiện nay, nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa trở nên rất phổ biến. Phƣơng pháp chữa trị chủ yếu hiện nay là sử dụng kháng sinh. Tuy nhiên việc sử dụng kháng sinh sẽ dẫn đến rủi ro do hiện tƣợng kháng thuốc. Do đó, việc tìm ra một nguồn nguyên liệu tự nhiên có khả năng kháng khuẩn sẽ cho ta một phƣơng pháp điều trị một cách hiệu quả đối với đối với một số bệnh nhiễm khuẩn. Thêm vào đó, ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất kháng oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật có tác dụng ngăn chặn quá trình oxy hóa không mong muốn nhƣ 2 các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…Vì thế trong công trình này chúng tôi cũng khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá Xuân Hoa. Xuất phát từ yêu cầu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình kỹ thuật tách chiết, khảo sát tính kháng khuẩn và khả năng chống oxy hóa của một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa (Pseudranthemum palatiferum)”. 1.2. Mục đích – Yêu cầu 1.2.1. Mục đích Xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ cao chloroform . Xác định phân đoạn kháng vi khuẩn: E.coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa. Chiết tách một số hợp chất thứ cấp từ phân đoạn kháng khuẩn. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các hợp chất trong lá cây Xuân Hoa. 1.2.2. Yêu cầu Cô lập 4 loại cao: Ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol, nƣớc. Dùng phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch để xác định cao có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Tiến hành sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng để tách các phân đoạn và một số hợp chất từ lá Xuân Hoa. Sử dụng phƣơng pháp vòng kháng khuẩn và pha loãng liên tục để xác định nồng độ ức chế tối thiểu của các phân đoạn đƣợc ly trích từ cao chloroform. Tiến hành ly trích lá cây Xuân Hoa và đo độ hấp thụ quang (OD) ở bƣớc sóng 517 nm [3] để xác định khả năng chống oxy hóa. 3 Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về cây Xuân Hoa 2.1.1. Đặc điểm thực vật học [2] Tên khoa học: Pseudranthemum palatiferum. Họ: Ô rô (Acanthaceae) Tên thông thƣờng: Xuân Hoa, Hoàn Ngọc, Tú Linh, Nhật Nguyệt, Thần Tƣợng Linh, Lan Điền,… 2.1.2. Đặc điểm hình thái [2, 6] Cây có thể cao 1-2 m (nếu trồng trên đất vƣờn nhà), sống lâu năm. Thân cây xanh hoặc tím lục, khi già chuyển thành màu nâu, phân ra nhiều mảnh. Lá mọc đối hình mũi mác, dài 12-17 cm, rộng 3,5-5 cm, gốc lá hơi men xuống. Hoa mọc ở kẽ lá hoặc đầu cành. Cụm hoa dài 10-16 cm. Hoa lƣỡng tính, không đều, 5 lá đài rời tồn tại đến khi tràng hợp, màu trắng, ống tràng hẹp và dài khoảng 2,5 cm, có Hình 1.1: Cây Xuân Hoa 4 5 thùy chia làm hai môi, môi trên gồm hai thùy nhỏ dính liền nhau đến nửa chiều dài của thùy, môi dƣới gồm 3 thùy to, thuỳ giữa của môi dƣới có các chấm màu tím. Quả nang 2 ổ, mỗi ổ chứa 2 hạt. Mùa hoa từ tháng 4 đến tháng 5 âm lịch. Cây mọc hoang ra hoa gần nhƣ quanh năm. 2.1.3. Phân bố [6, 14] Hiện nay cây Xuân Hoa đƣợc trồng ở nhiều nơi nhƣ một loại cây thuốc gia đình. Cây mọc hoang ra hoa gần nhƣ quanh năm. Gần đây đƣợc phát hiện mọc hoang ở vƣờn quốc gia Cúc Phƣơng (Ninh Bình), rừng Bình Nguyên (Phạm Hoàng Lộ, 1999). Ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng cây Xuân Hoa để chữa một số bệnh về tiêu hóa. Ở Thành phố Hồ Chí Minh, một số nhà trồng cây Xuân Hoa để chữa táo bón. Đặc biệt gần đây nhất chúng tôi đƣợc biết có một số doanh nghiệp ở Tây Ninh đã dùng lá và rễ cây Xuân Hoa này làm trà và đƣợc bán rộng rãi ra thị trƣờng với tên gọi trà Hoàn Ngọc. 2.1.4. Nhân giống [6 ] Cây Xuân Hoa có thể nhân giống dễ dàng bằng cách giâm cành. Lấy đoạn cành bẻ, cách ngọn khoảng 20 cm, bỏ bớt vài lá phía dƣới, cắm vào đất ẩm, để chỗ mát, hàng ngày tƣới đều (khoảng 2-3 lần/ngày). Cây chịu đất xốp và độ ẩm trung bình. Chỉ sau 1 tuần cành giâm đã ra rễ. Cây phát triển nhanh. Trồng khoảng trên 2 tháng là có thể dùng làm thuốc chữa bệnh. 2.2. Công dụng của cây Xuân Hoa 2.2.1. Theo kinh nghiệm dân gian Cây Xuân Hoa đƣợc dùng trong dân gian để chữa nhiều bệnh nhƣ: - Nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hoá, đau dạ dày, đau bụng không rõ nguyên nhân. - Loét hành tá tràng, chảy máu đƣờng ruột. - Khôi phục phục sức khoẻ cho ngƣời ốm yếu, chữa suy nhƣợc thần kinh. - Chấn thƣơng chảy máu, dập gãy cơ thể, chấn thƣơng sọ não. - Viêm thận cấp và mãn, suy thận, đái ra máu, đái buốt, đái rắt. 5 - Chữa các bệnh u ở phổi, u xơ tuyến tiền liệt, đau gan, xơ gan cổ trƣớng, làm giảm đau khi bị ung thƣ gan giai đoạn phát bệnh. - Điều chỉnh huyết áp. - Ở Trung Quốc, ngƣời ta dùng rễ cây Xuân Hoa để chữa đòn ngã tổn thƣơng. Đặc biệt ở Hà Nội từ năm 1998 đã rộ lên việc trồng Xuân Hoa để chữa những bệnh thuộc đƣờng tiêu hóa. Thời gian gần đây, một số Việt kiều ở Mỹ cũng đã dùng cây Xuân Hoa để chữa bệnh đái tháo đƣờng. Bệnh nhân dùng liên tục cây Xuân Hoa giữ đƣợc ổn định tỷ lệ đƣờng trong máu. Lá Xuân Hoa không có mùi, không vị, hơi nhớt. Ngƣời ta thƣờng dùng lá tƣơi rửa sạch, nhai với mấy hạt muối rồi uống với nƣớc, giã nát lấy nƣớc uống hoặc nấu ăn. Liều lƣợng phu thuộc vào ngƣời bệnh, từng bệnh, thông thƣờng ăn 2-8 lá/ngày, chia làm 2 lần trƣớc bữa ăn. 2.3.1. Tác dụng sinh học 2.3.1.1. Bảo vệ tế bào gan [9] Để góp phần xác minh tác dụng đƣợc lƣu truyền trong dân gian và chứng minh tác dụng của cây thuốc Xuân Hoa, Trần Công Khánh và cộng sự của ông đã tiến hành nghiên cứu độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của lá cây Xuân Hoa trên in vivo.  Thử độc tính cấp - Chuột nhắt trắng, chia làm 6 lô, mỗi lô 7 con. - Thuốc thử: Cao đặc toàn phần đƣợc cân và hòa tan bằng nƣớc cất, thu đƣợc các dung dịch có hàm lƣợng khác nhau: 33,2 mg/ml; 66,8 mg/ml; 125,2 mg/ml; 222,4 mg/ml; 367,6 mg/ml; 460 mg/ml. - Tiến hành: Cho mỗi chuột uống 0,5 ml dung dịch thuốc Xuân Hoa ở các lô khác nhau: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg; 5,56 g/kg; 9,19 g/kg; 11,5g/kg thể trọng chuột. Quan sát diễn biến hành vi, sau đó giết ngẫu nhiên 3 chuột ở 3 lô khác 6 nhau: quan sát đại thể phủ tạng và làm vi thể các cơ quan chịu tác dụng của thuốc nhƣ tim - gan - thận - dạ dày - ruột. - Kết quả: o Ở các liều: 0,83 g/kg; 1,67 g/kg; 3,13 g/kg thể trọng chuột, sau khi uống thuốc và trong suốt quá trình thử nghiệm thuốc không gây thay đổi trạng thái hoạt động của chuột: Chuột vẫn bò lui tới, leo trèo, chùi râu, liếm đuôi… o Các liều cao hơn: 5,56 g/kg; 9,19 g/kh; 11,5 g/kg thể trọng chuột, sau khi uống thuốc chuột có giảm hoạt động, nhƣng sau 1giờ thì trở lại bình thƣờng, chuột rúc vào nhau, mắt lim dim, thở nhẹ nhàng. o Tất cả các chuột thí nghiệm (ở liều trên) đều không chết. Chuột sống khỏe mạnh sau 48 giờ. o Quan sát đại thể: Các phủ tạng đều bình thƣờng. o Làm vi thể các cơ quan: Cắt thành miếng mỏng và nhuộm tế bào, quan sát dƣới kính hiển vi (Bảng 2.1). Cơquan Liều Tim Gan Thận Dạ dày Ruột Đánh giá 7 Bảng 2.1: Kết quả quan sát vi thể ở chuột Kết luận: Cao toàn phần Xuân Hoa không gây chết chuột ở tất cả các liều. Nhƣ vậy, trên độc tính cấp cao Xuân Hoa không thể hiện độc tính, không có LD50.  Thử tác dụng bảo vệ tế bào gan - Chuột nhắt trắng, chi làm 6 lô, mỗi lô từ 8 – 12 con. - Cao toàn phần lá Xuân Hoa đã loại bỏ chlorophyl, hòa tan với nƣớc cất. 0,83g/kg Cơ tim bình thƣờng. Các tĩnh mạch xoang và tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Quản cầu và các ống thận bình thƣờng. Niêm mạc dạ dày và tuyến bình thƣờng. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thƣờng. Không có tổn thƣơng thực thể ở các tạng. 9,19g/kg Cơ tim bình thƣờng. Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ. Quản cầu xung huyết, các ống thận bình thƣờng. Niêm mạc dạ dày và tuyến bình thƣờng. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thƣờng. Có thoái hoá nhẹ ở gan. 11,5g/kg Cơ tim bình thƣờng. Tế bào gan hơi to, nguyên sinh chất có thoái hoá nhẹ, tĩnh mạch trung tâm trên thuỳ xung huyết. Nang Bowmann rộng ra, tế bào thành ống teo nhỏ. Niêm mạc dạ dày và tuyến bình thƣờng. Niêm mạc ruột và các tuyến bình thƣờng. Có tổn thƣơng nhẹ ở gan và thận. 8 - Mô hình gây ngộ độc gan: Gây tổn thƣơng gan chuột nhắt bằng carbon tetrachloride (CCl4) theo phƣơng pháp đƣợc dung thông thƣờng (Shibayama, 1989; Yoshitake và cộng sự, 1991) với liều 1ml CCl4/kg thể trọng (liều cao) hoặc 0,5 ml CCl4/kg thể trọng (liều thấp). - Chia chuột thành 6 lô, mỗi lô 2 nhóm: o Lô 1 (đối chứng sinh học): Chuột bình thƣờng, không gây mô hình viêm gan, không dung thuốc Xuân Hoa. o Lô 2: Gây mô hình viêm gan đối chứng, không sử dụng thuốc Xuân Hoa. o Lô 3: Gây thí nghiệm viêm gan, cho uống thuốc Xuân Hoa trƣớc, sau 1 giờ thì tiêm CCl4 vào. - Nguyên tắc của phƣơng pháp là xác định hàm lƣợng malonic dialdehyde (MDA), một trong những sản phẩm tạo ra bởi quá trình peroxy hoá lipide màng tế bào. Sản phẩm MDA có khả năng phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành phức hợp trimethine có màu hồng và có đỉnh hấp thu cực đại ở 530 – 532 nm [9]. Cƣờng độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận với nồng độ MDA. Hàm lƣợng MDA tính theo công thức: X = E x 30,8 Trong đó: X: Hàm lƣợng MDA (mM) E: Độ hấp thụ ở 532 nm. 30,8: Hệ số tắt phân tử. Bảng 2.2: Hàm lƣợng MDA trong gan chuột ở liều gây là 1ml CCl4/kg thể trọng. Lô n (số chuột) ETB MDATB 1 8 0,163 5,0296 2 12 0,458 14,1156 9 3 8 0,348 10,7091 Chú thích: MDA: Malonic dialdehyde. ETB: E trung bình. MDATB: MDA trung bình. Nhận xét: - Ở lô có sử dụng cao Xuân Hoa hàm lƣợng MDA có giảm so với lô gây mô hình (giảm từ 14,1156 xuống còn 10,7091). - Hàm lƣợng men gan (AST, ALT) quá cao, không đo đƣợc trên máy. - Xét nghiệm vi thể : Chƣa thấy dấu hiệu bình phục của tế bào gan do thuốc điều trị. Bảng 2.3: Hàm lƣợng MDA ở liều gây là 0,5ml CCl4/kg thể trọng chuột. Lô n (số chuột) ETB MDATB 1 8 0,1915 5,8982 2 12 0,385 11,547 3 8 0,203 6,2463 Nhận xét: - Ở lô có sử dụng cao Xuân Hoa hàm lƣợng MDA có giảm so với lô gây mô hình (giảm từ 11,547 xuống còn 6,2463). - Xác định hàm lƣợng men gan trên máy Cobas Mira Plus, hãng Roche (Thụy Sĩ). Bảng 2.4: Kết quả hàm lƣợng men gan. Lô n (số chuột) AST(U/l) ALT(U/l) 1 8 270 432 2 12 9668 10870 3 8 8740 10533 10 Nhận xét: - Hàm lƣợng men gan giảm nhƣng chƣa đáng kể. - Xét nghiệm vi thể: ở lô chuột có sử dụng cao Xuân Hoa và lô gây mô hình nhận thấy rằng các tế bào ở vùng thoái hoá đã bắt đầu thu nhỏ và có xu hƣớng hồi phục. Kết luận: Cao đặc toàn phần Xuân Hoa có khả năng ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, nghĩa là có xu hƣớng tác dụng bảo vệ tế bào gan trên thực nghiệm. 2.3.1.2. Ảnh hƣởng lên bệnh tiêu chảy ở heo [14] Bệnh tiêu chảy chủ yếu xảy ra ở heo chƣa cai sữa. Nhiều kháng sinh nhƣ avinamycine, colistin, oxytetracyclin, spectinomycin và trimethoprim là những phƣơng pháp phổ biến đƣợc áp dụng để điều trị bênh. Tuy nhiên, lƣợng tồn dƣ kháng sinh trong các sản phẩm động vật đƣợc xem nhƣ là một nguy cơ tiềm ẩn đối với sức khoẻ con ngƣời bởi vì tính độc và tính dị ứng của nó. Thêm vào đó, sự phát triển của các vi khuẩn kháng thuốc dẫn đến sử dụng liều lƣợng quá cao đã trở thành một vài vấn đề trên thế giới. Vì vậy, cần phải giảm việc sử dụng và thay thế vai trò của kháng sinh trong thức ăn gia súc bằng cách gia tăng việc sử dụng probiotics và những sản phẩm tự nhiên khác, đặc biệt ở đây ta sử dụng lá cây Xuân Hoa để điều trị bệnh tiêu chảy ở heo. Bảng 2.5: Ảnh hƣởng của lá tƣơi hay bột lá Xuân Hoa lên sự biểu hiện tăng trƣởng, bệnh tiêu chảy và sinh lý máu của heo. Phƣơng pháp n Đối tƣợng Xuân Hoa Liều lƣợng (g/kg thể trọng/ngày) Qua đƣờng Thời gian TN1 C1 52 Heo chƣa - - - - T1-1 52 Lá tƣơi 1 miệng 1-7 11 T1-2 52 cai sữa 1 1-30 TN2 C2 60 Heo chƣa cai sữa - - - - T2-1 60 Lá tƣơi 0,5 miệng 1-30 T2-2 60 Bột 0,1 T2-3 60 0,2 TN3 C3 62 Heo đã cai sữa - - - - T3-1 62 Lá tƣơi 0,5 thức ăn 1-30 T3-2 62 Bột 0,1 T3-3 62 0,2 Sự biểu hiện tăng trƣởng đƣợc đo lƣờng dựa vào việc tăng cân và tốc độ tăng trƣởng chậm lại. Heo tăng ít hơn 4kg/28 ngày đƣợc xem là tăng trƣởng chậm lại. Sự truyền bệnh tiêu chảy đƣợc đo lƣờng hằng ngày dựa trên tỉ lệ heo mắc bệnh trong những con heo thí nghiệm, số trƣờng hợp và thời gian mắc bệnh. Ngoài ra, Huỳnh Kim Diệu và Trần văn Hòa [14] đã tiến hành thử nghiệm khả năng trị bệnh tiêu chảy trên heo con và heo mẹ, so sánh với hai loại kháng sinh đang đƣợc sử dụng trị bệnh tiêu chảy ở heo con rất hiệu quả: Coli-norgen và Cotrimxazol. Sau 3 ngày điều trị tỉ lệ khỏi bệnh của heo lần lƣợt: Bột Xuân Hoa 92,86%; Coli-norgen 90,48%; Cotrimxazol 83,33%. Tỉ lệ tái phát theo thứ tự là: 7,14%; 9,52%; 14,29%. Bảng 2.6: So sánh hiệu quả chữa trị tiêu chảy. Loại thuốc Số heo thử nghiệm Số lƣợng heo khỏi bệnh sau khi điều trị Ngày thứ nhất Ngày thứ hai Ngày thứ ba Số con % Số con % Số con % Bột Xuân Hoa 42 10 23,81 29 69,05 39 92,86 Coli-norgen 42 10 23,81 25 59,52 38 90,48 12 Cotrimxazol 42 15 35,71 28 66,67 35 83,33 Nhận xét: Không có tác dụng phụ của lá Xuân Hoa đối với heo trong thí nghiệm này. Nồng độ ức chế nhỏ nhất của cây đƣợc tính toán là 0,75-1,5 g lá tƣơi hoặc 0,15-0,3 g bột/kg thể trọng cho phƣơng pháp này. Liều lƣợng đƣợc sử dụng cho việc ngăn chặn bệnh, nồng độ đƣợc sử dụng trong thí nghiệm nhỏ hơn nồng độ gây ức chế thấp nhất để tránh gây tác dụng phụ. Sử dụng lá hay bột Xuân Hoa có thể cải thiện những thông số đo lƣờng nói trên và kết quả có thể đƣợc giải thích nhƣ sau: Trƣớc tiên, lá Xuân Hoa chứa một tỉ lệ cao protein thô (30,8% DM: dry matter), so sánh với cỏ voi (18,6% DM) và cây sắn dây (18,4% DM). Ảnh hƣởng của liều sử dụng sẽ rất nhỏ bởi vì tỉ lệ nhỏ của nó trong khẩu phần. Thứ hai, lá Xuân Hoa có hàm lƣợng cao một số loại khoáng nhƣ: Ca (6,5% DM), K (4,4% DM), Mg (6,3% DM), Fe (0,3% DM). Hàm lƣợng Fe, đặc biệt trong các chất khoáng cao gấp 4 lần đậu nành và 3 lần gan heo. Fe trong cây sẽ góp phần cải thiện tình trạng sinh lý máu bởi vì Fe cần thiết cho heo để thúc đẩy hồng cầu, đặc biệt hemoglobin có chức năng nhƣ một thể mang oxy và cacbonic, vì thế nó đƣợc biết nhƣ một sắc tố hô hấp và giải thích tình trạng của hồng cầu. Thứ ba, trong lá có chứa một protein ổn định nhiệt đƣợc gọi là pseuderantin (0,4% trong protein thô) có hoạt tính mạnh trong việc tiêu hoá casein và do đó việc tiêu hóa sữa sẽ đƣợc cải thiện nếu bổ sung lá. Thứ tƣ, một số hợp chất hoá học trong lá và một vài tác nhân kháng khuẩn có thể ảnh hựởng tới sự phát triển và miễn dịch của heo. Kết luận: Sử dụng bột lá Xuân Hoa với 0,2 g/kg thể trọng cho 30 ngày đối với heo chƣa cai sữa và đã cai sữa đã cải thiện sự tăng trọng và ngăn ngừa bệnh dịch tả, cho nên cây trồng này có nhiều triển vọng thay thế hoặc giảm sử dụng kháng sinh trong tƣơng lai. 2.3. Thành phần hoá học [4, 5] 13 Hiện nay trên thế giới chƣa có công trình nào nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Xuân Hoa, chỉ có một số công trình nghiên cứu bƣớc đầu về cây này ở Việt Nam nhƣ Trần Công Khánh (1998), Phan Phƣớc Hiền (2005), Huỳnh Kim Diệu (2003). Các nguyên tố đa lƣợng và vi lƣợng trong lá cây Xuân Hoa khá cao so với các loại cây khác. Không phát hiện các nguyên tố kim loại nặng nhƣ Cd, Pd, As, Cr. Đáng chú ý là hàm lƣợng Vanadi khá cao (3,75 mg/100 g lá tƣơi). Ngoài ra, lá Xuân Hoa còn chứa đầy đủ các acid amin thiết yếu với hàm lƣợng tổng số khá cao (751-1365 mg%). Đó là các acid amin giữ vai trò quan trọng trong sinh tổng hợp protein cơ bắp và chống mỏi cơ thể. Thiếu chúng cơ thể sụt cân nhanh. Lá Xuân Hoa còn giàu Valin (29-1001 mg%). Thiếu acid amin này, sự phối hợp các chuyển động của bắp thịt bị rối loạn và yếu đi. Valin còn ảnh hƣởng đến hoạt động của tuyến tụy, một tuyến tiêu hoá quan trọng. Trong các công trình nghiên cứu về thành phần hóa học của lá Xuân Hoa ngƣời ta đã tìm thấy -Sitosterol, Phytol, 3-O-( -D glucopyranosyl)-Sitosterol, hỗn hợp gồm hai đồng phân epime stigmasterol và poriferasterol, n-pentacosan-1-ol và hỗn hợp của kaumpferol 3-methyl ether 7-O- -glucoside và apigenin 7-O- -glucoside [4]. Nguyễn Văn Hùng và cộng sự (2004) [4], đã phân lập đƣợc tiếp theo là: 1-triacontanol, glycerol 1-hexdecanoate, acid palmitic và acid salicylic. - Triacontanol: Là chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 87-880C, là một Ancol no bậc một, không phân nhánh với công thức là : C30H62O. 1-triacontanol là một chất điều hòa sinh trƣởng thực vật. Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy 1- triancontanol có hoạt tính kháng viêm, ức chế các quá trình peroxy hóa các chất béo có cũng nhƣ không có sự tham gia của các enzyme và làm giảm mỡ trong máu. - Glycerol 1-hexadecanoate: Dạng tinh thể màu trắng, điểm nóng chảy 65-670C, là một mono-ester của glycerin với acid Palmitic và công thức phân tử là C19H38O34. 14 - Acid palmitic: Là chất rắn màu trắng, nóng chảy ở 48-510C, có đặc trƣng của một acid béo no mạch thẳng. - Acid Salicylic: Thu đƣợc dƣới dạng tinh thể hình kim, không màu, nóng chảy ở 140-142 0C và công thức phân tử là: C7H6O3. Acid salicylic có tác dụng kháng nấm và kháng khuẩn. Acid salicylic tổng hợp đƣợc sử dụng trong nhiều loại chế phẩm dựa vào tính chất này. Với các họat tính nêu trên, sự có mặt của 1-triancontanol và acid salicylic trong lá cây Xuân Hoa có thể góp phần giải thích các hoạt tính đã đƣợc phát hiện thấy trong các công trình nghiên cứu trƣớc đây cũng nhƣ giải thích tác dụng chữa bệnh của cây Xuân Hoa theo kinh nghiệm sử dụng trong dân gian. Tám hợp chất Dotriacontan, phytol, squalen, 24-metylencycloartanol, loliolide, - sitosterol, -sitosterol 3 -O-D-glucopyranosid và stigmasterol 3 -O-D-glucopyranosid lần đầu tiên đƣợc cô lập trong lá cây Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum(Nees) Radlk, họ Ô rô (ancathaceae) của Trần Kim Thu Liễu và cộng sự (2006). 2.4. Đại cƣơng về một số hợp chất hữu cơ tự nhiên [ 7 ]. 2.4.1. Alcaloid Là những hợp chất thiên nhiên với nhiều dạng cấu trúc khác nhau và có hoạt tính sinh học rõ rệt. Đa số alcaloid hiện diện trong loài cây hạt kín, cây có hoa nhƣng cũng tìm thấy trong động vật, côn trùng, sinh vật biển, vi sinh vật và thực vật hạ đẳng. Đa số alcaloid không màu, ở dạng kết tính rắn, có nhiệt độ nóng chảy hoặc nhiệt độ phân hủy xác định. Vài alcaloid ở dạng keo, vô định hình và alcaloid ở dạng lỏng (nicotin, coniin) hoặc có màu (berberin màu vàng; betanidin màu đỏ). Các alcaloid ở dạng bazơ tự do thƣờng hoà tan đƣợc trong dung môi hữu cơ, tuy nhiên các alcaloid ở dạng bazo tứ cấp thì chỉ hòa tan trong nƣớc. Muối của đa số alkaloid thì 15 hòa tan trong nƣớc. Độ hòa tan của alkaloid và các muối của chúng giữ vai trò quang trọng trong kỷ nghệ dƣợc phẩm; trong việc trích ly chúng ra khỏi cây cỏ và trong việc bào chế alcaloid thành các dạng thuốc phù hợp. Đa số alcaloid có tính kiềm, điều này khiến cho alcaloid cực kỳ nhạy cảm, dễ bị thủy phân khi gặp ánh sáng hoăc nhiệt độ. Nhiều alcaloid đã đƣợc sử dụng để làm thuốc trị bệnh. Alcalid có tác dụng kích thích thần kinh nhƣ: strychnine, cafein, lobelin…có khả năng diệt ký sinh trùng và các nguyên sinh động vật nhƣ: emetin, quinin, conessin, berberin. Các alcaloid có tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ƣơng nên đƣợc dùng làm thuốc giảm đau trong khi giải phẩu hoặc khi bị bệnh ung thƣ giai đoạn cuối: morphin và các dẫn xuất của morphin nhƣ: heroin, codein (tuy nhiên các hợp chất này có thể gây ra tình trạng uể oải, buồn ngủ, khó thở và nghiện thuốc). Có alcaloid đƣợc bào chế làm thuốc để giảm hệ thần kinh giao cảm: reserpin, propanolol. Một số alcaloid nhƣ: berberin, palmatin, taspin…có khả năng ức chế con men sao chép ngƣợc (reverse trancriptase) đây là con men chủ yếu của retrovirus mà các loại thuốc kháng HIV tập trung tiêu diệt. 2.4.2. Flavonoid Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa…Phần lớn có màu vàng (do từ flavus là màu vàng); tuy vậy, một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng đƣợc xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học chúng có cùng khung sƣờn. Các flavonoid có thể ở dạng tự do hoặc dạng glicosid. Các đƣờng thƣờng gặp nhất là D-glucose; kế đó là D-galactose; L-Rhamnose; L-Arabinose… Chalcone hiện diện ít trong tự nhiên; flavanol và flavanonol cũng hiếm gặp; flavone và flavonol phân bố rộng rãi trong tự nhiên. Các glicisid flavonol nhƣ: rutin, quercitrin, daempherol. Kaempherol rất thƣờng xuyên hiện diện. Antocyanidine dạng glicosid thí 16 dụ nhƣ: pelargonidin; cyanidin; delphinidin…tạo màu xanh, đỏ, tím cho những cánh hoa và trái. Các flavonoid thƣờng dễ kết tinh và thƣờng có màu. Flavone có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol màu vàng nhạt đến màu vàng; chalcone màu vàng đến cam-đỏ. Các isoflavone; flavanone; flavanonol; leucoantocyanidine; catechin kết tinh không màu. Antocyanidine có màu đỏ, tím, xanh dƣơng tạo màu cho nhiều loại hoa và trái. Quercetin ở môi trƣờng kiềm thì có tác dụng kháng khuẩn kém nhƣng ở môi trƣờng acid thì có tác dụng rất rõ với vi khuẩn tụ cầu vàng, vi khuẩn tụ cầu trắng Salmonella oranienbur có tác dụng kháng nấm thực vật. Một số hợp chất thuộc loại isoflavonoid nhƣ rotenon (trích từ dây thuốc cá Derris elliptica Benth, họ Đậu) có tính độc đối với cá và côn trùng nhƣng không độc với các động vật hữu nhũ. Cũng có những hợp chất có tính diệt côn trùng nhƣ hợp chất pyrethrin (trích từ cây trừ trùng Chrysanthemum cinerariaefolium, họ Cúc). 2.4.2. Tinh dầu Nói chung, tinh dầu trích ly từ thực vật có cấu trúc terpenoid. Từ 2000 năm trƣớc ngƣời ta đã biết sử dụng turpentine để trị ho. Mentol là alcol terpen trích từ tinh dầu bạc hà có khả năng gây tê cục bộ, nên góp phần vào đặc tính trị ho của nó. Các gia vị nhƣ: hồ tiêu, gừng, nhục đậu khấu, đinh hƣơng…bên cạnh mùi vị làm chúng có giá trị trong ngành ăn uống, chúng còn có tác dụng kháng khuẩn. Nhiều tinh dầu có khả năng kháng khuẩn mạnh nhƣ: tinh dầu rau ngỗ Enhydra fluctuans; tinh dầu hồi Illicium verum; tinh dầu quế Cinhamomum; tinh dầu long não Cinnamonium campho; tinh dầu gừng Zingiber officinalist; tinh dầu nghệ Curcuma longa… 2.4.3. Saponin Là một loại glycosid phân bố khá rộng trong thực vật, có một số tính chất đặc trƣng: khi hòa tan vào nƣớc sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu còn gọi là tính phá huyết. Saponin thƣờng ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy thƣờng cao từ 200oC trở 17 lên và có thể trên 300oC. Saponin có thể bị tủa bởi acetat chì, hydroxid barium, sulfat amonium nên có thể lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. Nhiều saponin steroid là nguyên liệu đầu để tổng hợp các chất hormone steroid có hoạt tính cao. Nhiều loại saponin có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn. 2.5. Đại cƣơng về vi khuẩn đƣờng ruột [8, 12] 2.5.1. Định nghĩa Họ vi khuẩn đƣờng ruột (Enterbacteriaceae) bao gồm các trực khuẩn Gram âm, hiếu khí hoặc kỵ khí tuỳ nghi, không có men oxidase, lên men đƣờng glucose có kèm theo sinh hơi hoặc không, khử nitrat thành nitrit, có thể di động hoặc không, nhƣng nếu di động thì có nhiều lông ở xung quanh thân, không sinh nha bào. 2.5.2. Hình thể Tất cả các vi khuẩn thuộc họ này đều là trực khuẩn Gram (-). Kích thƣớc trung bình 2-4 m x 0,4-0,6 m. Một số loài hình thể không ổn định, có thể xuất hiện dạng sợi. Những vi khuẩn di động thì có nhiều lông phân bố ở khắp xung quanh tế bào. Các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột không bao giờ sinh nha bào. Mộ số có vỏ, có thể quan sát đƣợc bằng kính hiển vi thông thƣờng. 2.5.3. Tính chất nuôi cấy Các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột có thể mọc đƣợc trên môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Trong môi trƣờng lỏng, có thể lắng cặn hoặc làm đục môi trƣờng, có thể phát triển thành váng trên bề mặt, nhƣng cũng có thể vừa làm đục môi trƣờng vừa có cặn ở dƣới đáy ống. Trên môi trƣờng đặc có 3 dạng khuẩn lạc: - Dạng S: Khuẩn lạc tròn, bờ đều, nhẵn bóng. - Dạng R: Mặt khuẩn lạc khô, xù xì. Thƣờng gặp khi nuôi cấy giữ chủng. - Dạng M: Hình thức phát triển này thƣờng gặp ở những vi khuẩn có khả năng hình thành vỏ. Khuẩn lạc nhầy, kích thƣớc lớn hơn khuẩn lạc dạng S và các khuẩn lạc có xu hƣớng hòa vào nhau. 2.5.4. Đặc tính sinh hoá Những đặc tính sau đây thƣờng đƣợc xác định khi nghiên cứu vi khuẩn đƣờng ruột: 18 - Di động hoặc không di động. - Lên men hoặc không lên men một số loại đƣờng. Hai loại đƣờng thƣờng đƣợc xác định nhất là glucose và lactose. - Sinh hơi hay không sinh hơi khi lên men đƣờng. - Có hay không có một số enzym. Hai enzym thƣờng đƣợc xác định nhất là urease và tryptophanase. - Khả năng sinh ra sunfua hydro (H2S) khi dị hóa protein, acid amin hoặc các dẫn chất có lƣu huỳnh. - Phát triển đƣợc hay không phát triển đƣợc trên một số môi trƣờng tổng hợp. Ví dụ: khả năng sử dụng citrat là nguồn cung cấp cacbon duy nhất có trong môi trƣờng Simmons. 2.5.5. Sức đề kháng Vì không có khả năng hình thành nha bào nên các thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột không có sức đề kháng cao với những điều kiện hóa lý đặc biệt của môi trƣờng. Chúng dễ dàng bị tiêu diệt ở nhiệt độ sôi 100oC và bởi các hoá chất sát khuẩn thông thƣờng. Tuy nhiên nhiều loài vi khuẩn đƣờng ruột có khả năng sống nhiều ngày đến nhiều tuần, thậm chí một vài tháng ngoài môi trƣờng. Đây là điều kiện thuận lợi để các vi khuẩn gây bệnh lan truyền. 2.5.6. Độc tố Hầu hết các vi khuẩn đƣờng ruột đều có nội độc tố. Bản chất hóa học của nội độc tố là lipoposaccharid (LPS) của vách tế bào. Nội độc tố chỉ đƣợc giải phóng khi tế bào bị li giải. Nội độc tố có khối lƣợng phân tử từ 100000 đến 500000 dalton. Nội độc tố tuy tính độc không cao bằng ngoại độc tố nhƣng cũng rất độc (chỉ cần 0,05 mg nội độc tố đủ giết chết chuột nhắt sau 24 giờ). Nội độc tố có thể gây ra tình trạng sốc, nếu không đƣợc điều trị tích cực kịp thời, để chuyển thành sốc không hồi phục dẫn đến tử vong. Nội độc tố không bị mất tính độc ở 100oC trong 30 phút. Nội độc tố là chất có khả năng gây sốc. 19 Một số thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột có khả năng sinh ngoại độc tố nhƣ S.Shiga, E.Coli loại Enterotoxigenic E.Coli (ECET). Ngoại độc tố của S.Shiga làm cho bệnh lỵ nặng hơn rất nhiều, ngoại độc tố LT (Labile Toxin) của ETEC là yếu tố quyết định độc lực của vi khuẩn này. 2.5.7. Cấu trúc kháng nguyên Họ vi khuẩn đƣờng ruột có 3 nhóm kháng nguyên cơ bản: kháng nguyên O, kháng nguyên H và kháng nguyên K. - Kháng nguyên O: Là kháng nguyên thân của vi khuẩn. đây là thành phần kháng nguyên của vách tế bào. Là một phức hợp protein, poliozid và lipid, trong đó protein làm cho phức hợp có tính kháng nguyên, poliozid quyết định tính đặc hiệu kháng nguyên còn lipid quyết địng tính độc. Không bị phá huỷ ở 100oC trong hai giờ hoặc trong cồn 50% nhƣng bị mất tính kháng nguyên khi xử lý bằng formol 0,5%. Ở những vi khuẩn không có vỏ hoặc màng bọc (không có kháng nguyên K) thì kháng nguyên O nằm ở lớp ngoài cùng. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết, gọi là “hiện tƣợng ngƣng kết O” với các hạt ngƣng kết nhỏ, lắc khó tan. Ở những vi khuẩn có kháng nguyên K, hiện tƣợng ngƣng kết O có thể bị che lấp bới kháng nguyên này. Kháng nguyên O có tính đặc hiệu cao, nó thƣờng đƣợc dùng để phân loại vi khuẩn. Dựa vào kháng nguyên O ngƣời ta có thể chia một vài loài vi khuẩn thành nhiều typ huyết thanh. - Kháng nguyên H: Là kháng nguyên lông của tế bào vi khuẩn, chỉ có ở những vi khuẩn có lông. Có bản chất là protein, để phá huỷ ở 100oC hoặc trong cồn 50% nhƣng không bị phân huỷ trong formol 0,5%. Kháng nguyên H khi gặp kháng thể tƣơng ứng sẽ xảy ra “hiện tƣợng ngƣng kết H” với các hạt to hơn trong hiện tƣợng ngƣng kết O và rất dễ tan khi lắc. Những vi khuẩn có khả năng di động khi tiếp xúc với kháng thể H tƣơng ứng sẽ trở thành không di động. Kháng nguyên O và kháng nguyên H có thể đƣợc sản xuất riêng để phát hiện riêng biệt các kháng thể tƣơng ứng. Để có kháng nguyên O, ngƣời ta cho vi khuẩn này vào cồn 50%, kháng nguyên H sẽ bị phá huỷ, kháng nguyên O vẫn tồn tại. Để có kháng nguyên H ngƣời 20 ta cho vi khuẩn vào formol 0,5% thì kháng nguyên O bị phá huỷ, kháng nguyên H vẫn còn nguyên vẹn. - Kháng nguyên K: Là kháng nguyên vỏ hoặc bề mặt, kháng nguyên K nằm bên ngoài kháng nguyên thân. Nó có thể dƣới dạng một lớp vỏ dày, quan sát đƣợc bằng kính hiển vi quang học thông thƣờng (nhƣ ở Klebsiella) hoặc dƣới dạng một lớp rất mỏng chỉ có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử (nhƣ ở S.Typhy). Kháng nguyên K nếu che phủ hoàn toàn kháng nguyên O sẽ ngăn cách không cho kháng thể O gắn với kháng nguyên O làm cho phản ứng ngƣng kết không xảy ra. Trong trƣờng hợp này cần phải phá huỷ kháng nguyên K hoặc vi khuẩn phải đƣợc nuôi cấy trong điều kiện không sinh ra đƣợc kháng nguyên này. 2.5.8. Khả năng gây bệnh Nói về khả năng gây bệnh của họ vi khuẩn đƣờng ruột, trƣớc hết phải đề cập đến các nhiễm khuẩn đƣờng tiêu hóa. Họ vi khuẩn đƣờng ruột đứng đầu trong các căn nguyên vi khuẩn gây tiêu chảy. Cơ chế gây bệnh, vị trí gây tổn thƣơng ở bộ máy tiêu hóa rất khác nhau tuỳ theo từng giống, từng loài. Ngoài đƣờng tiêu hóa, các vi khuẩn đƣờng ruột còn có khả năng gây bệnh ở nhiều cơ quan khác nhƣ tiết niệu, thần kinh, hô hấp…Các thành viên của họ này đứng đầu trong các vi khuẩn gây viêm đƣờng tiết niệu, bỏ xa các vi khuẩn khác. Chúng cũng đứng đầu trong các vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết. Có thể nói khái quát ở bất kỳ bệnh phẩm nào cũng có thể gặp thành viên của họ vi khuẩn đƣờng ruột. 2.6. Một số đặc tính của vi khuẩn thử nghiệm 2.6.1. Staphyllococcus aureus - Là vi khuẩn gram dƣơng, không giáp mô, không tạo bào tử. - Sức đề kháng: nhạy cảm với Penicillin, Authromycin và Ampicilin. - Khả năng gây bệnh: o Sƣng mủ trên da, niêm mạc. o Gây ung nhọt, áp xe. 21 o Viêm vú ở bò cừu. o Gây nhiễm trùng máu dẫn đến viêm phổi, viêm thận cấp, viêm tuyến sữa và viêm tủy xƣơng. 2.6.2. Pseudomonas aeruginosa - Là vi khuẩn gram âm, có tiêm mao, vi khuẩn sinh sắc tố màu xanh. - Khả năng gây bệnh: o Gây bệnh mủ xanh ở động vật và ngƣời. o Viêm bàng quang, viêm tai có mủ ở ngƣời. 2.6.3. Escherichia coli (E.coli) - Là vi khuẩn gram âm, không bào tử - Sức đề kháng: Nhạy cảm với chloraphenicol, Streptomycin, Sunfamid, Trimethroprim. - Khả năng gây bệnh: E.coli có sẵn trong ruột, khi cơ thể bị suy yếu, sức đề kháng giảm thì E.coli mới gây bệnh: o Gây tiêu chảy o Bệnh phù thủng ở heo con o Viêm ruột 2.6.4. Salmonella - Salmonella là trực khuẩn dài 0,6 – 0,8 µm, có nhiều lông xung quanh thân, rất di động, không có vỏ, không sinh nha bào, nhuộm Gram bắt Gram âm. - Vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy tiện, mọc dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng, nhiệt độ thích hợp 37oC nhƣng có thể phát triển đƣợc từ 6 – 42oC, pH thích hợp là 7,6; phát triển đƣợc ở pH 6,9. o Trên môi trƣờng lỏng: Sau 5 – 6 giờ nuôi cấy, vi khuẩn đã làm đục môi trƣờng, sau 18 giờ môi trƣờng đục đều. o Trên môi trƣờng thạch thƣờng: Khuẩn lạc tròn lồi, bóng, thƣờng không màu hoặc màu trắng xám. 22 o Trên môi trƣờng phân lập SS: Khuẩn lạc có màu hồng; Trên môi trƣờng Istrati khuẩn lạc có màu xanh. - Độc tố: o Nội độc tố: Nội độc tố của Salmonella rất mạnh, tiêm cho chuột nhắt hoặc chuột lang liều thích hợp thì sau vài ngày chuột chết, mổ chuột thấy ruột non xung huyết, mảng Payer bị phù nễ, đôi khi hoại tử. Nội độc tố có vai trò quyết định trong tính chất gây bệnh của Salmonella. o Ngoại độc tố: Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố có thể điều chỉnh thành giải giải độc tố. - Khả năng gây bệnh: o Sốt thƣơng hàn – phó thƣơng hàn. o Ngộ độc thức ăn. 2.7. Hoạt tính chống oxy hóa DPPH [3] Hiện nay ngày càng có nhiều mối quan tâm về các chất chống oxy hóa thứ cấp từ thực vật nhƣ là nguồn bổ sung cho các hệ thống bảo vệ chống lại sự oxy hóa có hại tồn tại sẵn có trong cơ thể. Trong đời sống các sinh vật kỵ khí và hiếu khí đều thiết lập một sự cân bằng tinh tế giữa ích lợi và nguy cơ trong việc sử dụng oxy để đạt năng lƣợng. Trong quá trình hô hấp chúng đã tạo ra các hợp chất trung gian là các gốc tự do: anion superoxide (O2), hydroxyl (OH), chất oxy hóa nhƣ H2O2 có hoạt tính phản ứng rất lớn, mà từ các chất này cũng nhƣ các sản phẩm phản ứng của chúng là nguyên nhân phá hủy các phân tử sinh học nhƣ DNA, lipid, protein… Mặc dù bản thân của sinh vật đã tự phát triển các hệ thống enzyme nhằm điều hòa các loại phân tử oxy hoạt tính cao này nhƣ superoxide dismutase, catalae, glutathione peroxidase là các enzyme điều hòa nhằm duy trì sự an toàn trong giới hạn cho phép của anion superoxide, H2O2 và các hydroperoxide hữu cơ tƣơng ứng, chúng đƣợc xem là các enzyme khử độc chính trong cơ thể. Đôi khi hệ thống bảo vệ trên bị quá tải, không khí bị ô nhiễm, khói thuốc lá, bức xạ tử ngoại…các loại oxy hoạt tính cao này vƣợt quá 23 giới hạn cho phép sẽ là nguồn gây bệnh, thúc đẩy nhanh quá trình lão hóa cho sinh vật. Các chất chống oxy hóa từ thực vật đã góp phần hỗ trợ cho hệ thống bảo vệ của cơ thể, ngăn chặn oxy hóa không mong muốn nhƣ các carotenoid, flavonoid, vitamin C, E…và các hợp chất trao đổi chất thứ cấp từ thực vật đã và đang đƣợc quan tâm nghiên cứu. 24 Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.1. Vật liệu  Vật liệu: Lá cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum palatiferum).  Nguồn gốc lấy mẫu: Lá Xuân Hoa đƣợc lấy từ 2 nguồn: - Tại doanh nghiệp tƣ nhân trà 7 Nga (Tây Ninh). - Vƣờn thực nghiệm trƣờng đại học Cần Thơ. 3.2. Địa điểm và thời gian thực hiện  Địa điểm Tại phòng thí nghiệm hóa lý, Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trƣờng đại học Nông Lâm.  Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện qua 2 phần: Phần 1: Tiến hành tách chiết một số hợp chất thứ cấp từ lá Xuân Hoa và khảo sát tính kháng khuẩn. - Giai đoạn 1: Tiến hành chiết Soxhlet lá Xuân Hoa để thu các loại cao. Thời gian tiến hành từ ngày 1/4/2007 đến 27/4/2007. - Giai đoạn 2: Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các loại cao để xác định cao có hoạt tính mạnh nhất. Từ ngày 29/4/2007 đến ngày 6/5/2007. - Giai đoạn 3: Thực hiện sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên cao chloroform để tách các phân đoạn. Thời gian thực hiện từ ngày 8/5/2007 đến ngày 23/6/2007. 25 - Giai đoạn 4: Tiến hành khảo sát khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn để xác định phân đoạn kháng khuẩn. Thời gian thực hiện từ ngày 25/6/2007 đến ngày 2/7/2007. - Giai đoạn 5: Thực hiện sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên phân đoạn kháng khuẩn để tách chất sạch. Thời gian thực hiện từ ngày 5/7/2007 đến ngày 19/7/2007. - Giai đoạn 6: Gửi mẫu chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân để xác định cấu trúc của các hợp chất đƣợc tách chiết ở phòng phân tích cấu trúc, Viện Hoá Học, Trung tâm khoa học Tự Nhiên, Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội. Phần 2: Khảo sát khả năng chống oxy hóa của dịch chiết lá Xuân Hoa. Thời gian thực hiện từ 23/7/2007 đến ngày 30/7/2007. 3.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.3.1. Thiết bị và dụng cụ  Dùng cho các thử nghiệm sinh hóa: Tủ sấy. Máy xay mẫu. Bộ soxhlet. Máy cô quay. Bình lắc. Bình lắc quả lê. Phễu. Giấy lọc. Ống chạy sắc cột. Bình tam giác 50ml. Bình triển khai. Máy lắc. Bồn đánh siêu âm. 26 Micropipette loại 100 – 1000 µl. Đầu tipe loại 1000µl. Cân phân tích. Máy làm đá. Máy đo nhiệt độ nóng chảy. Máy đo OD. Ống nghiệm. Giấy bạc. Parafirm. Pipette Pasteur. Đèn cồn. Cây kẹp.  Dùng cho thử nghiệm vi sinh: Ống nghiệm. Đĩa petri. Đèn cồn. Tủ ấm. Tủ sấy. Tủ hấp autoclave. Bông không thấm. Micropipette loại 100-1000 µl. Micropipette loại Đầu tipe loại Que cấy vòng. Tâm bông vô trùng. 3.3.2. Hóa chất  Dùng cho thử nghiệm sinh hóa: 27 Methanol (Trung Quốc, Merck). Ethanol (Trung Quốc). Chloroform (Trung Quốc). Ete dầu hỏa. Acetone. H2S04 98%. Hạt silicagel kích thƣớc 0,063 – 0,2 mm. Bản mỏng silicagel (TLC) loại 25DC – alufolien 20 x 20 cm, kieselgel 60 F254, Merck. Vitamin C. DPPH (1, 1- diphenyl- 2-picrylhydrazyl).  Dùng cho thử nghiệm vi sinh: Cồn. Nƣớc cất. Muối. Môi trƣờng BHI. Môi trƣờng TSA. Môi trƣờng thạch máu. DMSO (dimethylsulfoxid). 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 3.4.1. Xử lý nguyên liệu Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý nguyên liệu. 28 3.4.2. Điều chế các loại cao Tiến hành chiết soxhlet với 670 g bột mẫu khô trong 120 giờ với EtOH 70%, thu lấy dịch lọc, cô quay để loại bỏ dung môi. 3.4.2.1. Điều chế cao ete dầu hỏa - Cho dịch lọc trên vào bình lắc quả lê, thêm 200 ml nƣớc cất vào, sau đó cho ete dầu hỏa vào. - Dịch lắc chia làm 2 pha: Pha ete dầu hỏa và pha nƣớc, hứng lấy dịch trích ete dầu hỏa, sau đó cô cạn bằng máy cô quay với áp suất thấp thu đƣợc cao ete dầu hỏa: 23 g - Tổng thể tích ete dầu hỏa dùng: 1,5 lít. Pha ete dầu hỏa Pha nƣớc Rửa sạch lá tƣơi Xuân Hoa Để khô tự nhiên Sấy khô đến trọng lƣợng không đổi ở nhiệt độ 40ºC Xay mẫu thành bột mịn 29 3.4.2.2. Điều chế cao chloroform - Lấy pha nƣớc ở trên cô quay để loại bỏ dung môi. - Cho chloroform vào lắc, dịch lắc chia làm 2 pha, thu lấy dịch chloroform, sau đó cô cạn bằng máy cô quay để loại dung môi chloroform thu đƣợc cao chloroform: 42 g - Tổng thể tích chloroform sử dụng: 2,5 lít. 3.4.2.3. Điều chế cao n-butanol - Phần còn lại sau khi đã trích với chloroform đƣợc tiếp tục tận trích với n – butanol. - Dịch trích thu đƣợc đem cô quay thu đƣợc cao n-butanol:16 g - Tổng thể tích n-butanol sử dụng: 1,3 lít. 3.4.2.4. Điều chế cao nƣớc Phần còn lại đem cô quay thu đƣợc cao thô nƣớc. Sơ đồ 3.2: Quy trình điều chế các loại cao. Dịch trích Ete dầu hỏa Bột khô 670 g chiết soxhlet với EtOH 70% Dịch trích EtOH Bã Pha nƣớc cô quay, chiết với ete dầu hỏa 30 3.4.3. Khảo sát tính kháng khuẩn của các loại cao. - Chủng vi khuẩn: E.coli, Salmonella đƣợc lấy từ bệnh xá thú y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. - Pha loãng liên tiếp để xác nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các loại cao có khả năng ức chế sự tăng trƣởng của vi khuẩn. - Môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật để tiến hành thử nghiệm vi sinh vật là môi trƣờng BHI và TSA. 31 - Pha môi trƣờng BHI: cho 15 g bột BHI và 300 ml nƣớc cất vào bình tam giác, đun nhẹ bằng microwave trong 2 phút, sau đó lọc bằng giấy lọc để loại bỏ cặn. Hấp khử trùng autoclave ở 121ºC/15 phút. - Cách pha môi trƣờng TSA: Cao thịt 2,5 g Pepton 5 g NaCl 2,5 g Nƣớc Cất 500 ml Cho tất cả vào bình tam giác, đun nhẹ bằng microwave trong 2 phút, sau đó cho 2 g agar vào. Hấp khử trùng autoclave ở 121ºC/15 phút, lấy ra đổ vào đĩa petri. - Dung môi hòa tan 4 loại cao: DMSO. - Pha ống chuẩn độ đục Mc Farland nhƣ sau: Thêm 0,5 ml BaCl2 0,048M vào 99,5 ml H2SO4 0,18 M đồng thời khuấy liên tục để tạo huyền dịch. - Phƣơng pháp: o Cân 0,2 g cao cho vào 10 ml DMSO để hòa tan, nồng độ cao lúc này là 0,02 g/ml. o Pha loãng tiếp tục cao này xuống nồng độ 0,002 g/ml (2000 µg/ml) bằng môi trƣờng BHI. o Tiếp tục pha loãng cao xuống còn một nửa nồng độ: 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml. o Xác định nồng độ vi khuẩn dựa vào ống chuẩn độ đục Mc Farland 0,5: Điều chỉnh độ đục của huyền dịch vi khuẩn sao cho ngang với độ đục của ống Mc Farland 0,5 bằng cách cho thêm nƣớc muối sinh lý 0,9%, lúc này nồng độ vi khuẩn sẽ là 108 cfu/ml. o Tiếp tục pha loãng nồng độ vi khuẩn xuống còn 107, 106 bằng môi trƣờng BHI. o Bố trí thử nghiệm vi sinh vật trên môi trƣờng thạch TSA để xác định khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao này. Cao ở các nồng độ 1000 µg/ml, 500 µg/ml, 250 32 µg/ml, 125 µg/ml đƣợc hòa tan vào môi trƣờng TSA. Nguyên tắc xác định dựa vào sự ức chế của các nồng độ cao đã pha loãng trên. Cấy vi khuẩn E.coli và Salmonella ở nồng độ 106 lên trên cùng một đĩa môi trƣờng TSA, mỗi vi khuẩn chiếm nửa đĩa. - Đọc kết quả dựa trên việc quan sát khuẩn lạc có mọc hay không trên bề mặt môi trƣờng thạch sau 24 giờ, từ đó sẽ xác định đƣợc cao nào có khả năng ức chế vi khuẩn mạnh nhất và tiếp tục đƣợc sử dụng để cô lập một số hợp chất kháng khuẩn bằng phƣơng pháp sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký điều chế. 3.4.4. Chiết xuất một số hợp chất từ cao chloroform 3.4.4.1. Sắc ký cột [1, 7]  Nguyên tắc: - Sắc ký cột loại hấp phụ đƣợc tiến hành trên một cột thủy tinh thẳng đứng với chất hấp phụ đóng vai trò tƣớng tĩnh, dung môi rửa cột đóng vai trò tƣớng động chảy qua chất hấp phụ dƣới ảnh hƣởng của trọng lực. - Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách tùy theo khả năng hấp phụ và khả năng hòa tan của nó đối với dung môi rửa cột để lấy ra đƣợc lần lƣợt trƣớc hoặc sau. - Chất hấp phụ đƣợc sử dụng phổ biến là Silicagel 60 cỡ hạt 0,063 – 0,2 mm. - Dung môi: Để triển khai sắc ký cột, ngƣời ta có thể dùng tuần tự từng dung môi riêng biệt có độ phân cực tăng dần hoặc dùng một hỗn hợp dung môi thích hợp để rửa cột. - Việc lựa chọn kích thƣớc cột rất quan trọng, thông thƣờng cột có đƣờng kính nhỏ và chiều dài càng dài thì sự tách càng tốt.  Tiến hành: Bƣớc 1: Chuẩn bị cột. - Rửa cột thật sạch, tráng lại với nƣớc cất, sau đó sấy khô. 33 - Cho bông gòn vào đáy cột (phải thật khéo nếu chặt quá chất nghiên cứu sẽ bị mắc kẹt lại không chảy xuống đƣợc, nếu không chặt thì khi đổ dung môi vào nút bong sẽ bị trôi). - Kẹp cột thẳng đứng trên giá sắt. Bƣớc 2: Nhồi cột. - Cân 200 g Silicagel cho vào becher, cho ete dầu hỏa vào sao cho lƣợng thể tích đủ làm cho silicagel trƣơng phình tối đa, tốt nhất là để qua đêm. - Cho silicagel từ từ vào cột sao cho nút bông dƣới đáy cột không bị trôi lên, kiểm tra tốc độ chảy dung môi ra khỏi cột (thông thƣờng khoảng 30-50 giọt/phút là đạt yêu cầu). - Hứng ete dầu hỏa và cho lại vào cột vài lần đến khi cột thật sự ổn định, bề mặt silicagel phải nằm ngang. Bƣớc 3: Đƣa chất phân tích vào cột. Hình 3.2: Cột sắc ký 34 - Cao chloroform phải đƣợc sấy thật khô ở nhiệt độ 40ºC để đuổi hết dung môi, khối lƣợng cao: 42 g. - Cho 8 g silicagel vào trộn đều lƣợng cao khô này, nghiền, sau đó tiếp tục sấy khô hoàn toàn, mẫu lúc này phải ở dạng bột mịn. - Sau đó cho ete dầu hỏa vào cao này sao cho hỗn hợp trở thành dạng sệt, không loãng quá cũng không đặc quá để khi đổ mẫu vào tạo thành một lớp trên bề mặt silicagel. Bƣớc 4: Triển khai cột. - Để triển khai cột ta có thể dung tuần tự các dung môi có độ phân cực tăng dần. Sự thay đổi từ dung môi này sang dung môi khác phải chuyển từ từ bằng cách pha tỷ lệ tăng dần hoặc giảm dần. - Sử dụng dung môi: ete dầu hỏa, chloroform , methanol và hỗn hợp của nó đƣợc pha theo tỷ lệ tăng dần: 1%, 2%, 5%, 10%, 25%, 50%, 100%. Bƣớc 5: Hứng và kiểm tra các phân đoạn. - Sử dụng các bình tam giác 50 ml để hứng từng phân đoạn, đánh dấu số thứ tự của bình. - Kiểm tra các phân đoạn thu đƣợc bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử đặc trƣng. 3.4.4.2. Sắc ký lớp mỏng [1, 7]  Nguyên tắc: - Sắc ký lớp mỏng (SKLM) là kỹ thuật phân bố rắn - lỏng; trong đó pha động là chất lỏng đƣợc cho đi ngang qua một lớp chất hấp trơ (ví dụ nhƣ: silicagel hoặc oxid nhôm) chất hấp thụ này đƣợc tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng nhƣ tấm kiếng hoặc tấm nhôm. - Dung môi triển khai trong SKLM thƣờng là một hỗn hợp có từ 2, 3 hoặc 4 loại dung môi khác nhau với tỷ lệ thích hợp. Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung môi thích hợp. 35 - Sử dụng SKLM để gộp các bình hứng chất chảy ra thành chung một phân đoạn nếu chúng cho kết quả Rf giống nhau.  Phƣơng pháp: Chuẩn bị: - Ống mao quản: Sử dụng pipette Pasteur, dùng kẹp kéo dài đầu pipette do sức nóng của ngọn lửa đèn cồn. - Ống nghiệm nhỏ: Chứa acetone để rửa mao quản sau mỗi lần sử dụng. - Bình khai triển: Cho dung môi ete dầu hỏa, chloroform, methanol theo tỉ lệ thích hợp vào bình, sau đó cho một tấm giấy thấm vào bình để dung môi đƣợc hoàn toàn bão hòa (khoảng 30 phút). Một hậu quả dễ thấy là nếu bình không đƣợc bão hòa thì khi dung môi là một hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm (hình lòng chão) do dung môi đi hai bên cạnh nhanh hơn đi ở giữa bảng. - Thuốc thử H2SO4 10%/EtOH: Pha 21ml H2SO4 95% với 179 ml ethanol. - Bản mỏng: Dùng bút chì kẻ một đƣờng thẳng cách đáy 1,5 cm và một đƣờng thẳng cách đầu trên 0,5 cm. Tiến hành: - Sử dụng mao quản chấm chất cần kiểm tra vào bản mỏng, mỗi vết chấm phải nhỏ, gọn 2 – 3 mm và không làm rách bản mỏng. Vết chấm ở vị trí cách cạnh đáy 1 – 1,5 cm, vết này cách vết kia 0,5 cm và cách bờ cạnh của bảng 0,5 cm. - Nhúng bản mỏng vào bình khai triển thật nhẹ nhàng, đặt bản mỏng hơi nghiêng, đậy nắp kín. Lƣu ý trong thời gian này không di chuyển bình. Mao quản trong bình sẽ dẫn chất đi lên.Theo dõi vạch dung môi chạy đến đầu trên bản mỏng cách khoảng 0,5 cm thì lấy ra, dùng mấy sấy tóc làm khô dung môi. Sau đó nhúng bản mỏng vào bình thuốc thử H2SO4 10%/EtOH, hiện vết ở 100ºC. Bản mỏng 36 Phát hiện vết: - Qua màu sắc tự nhiên. - Phát quang dƣới tia UV. - Phun thuốc thử cho màu đặc trƣng. Tính trị số Rf: Rf = ( Khoảng đƣờng di chuyển của hợp chất) / (Khoảng đƣờng di chuyển của dung môi). Một hệ dung môi giải ly phù hợp là hệ sau khi giải ly sẽ cho các vết chính có Rf khoảng từ 0,3 – 0,7. 3.4.4.3. Sắc ký điều chế [7] - Nguyên tắc cơ bản cũng giống nhƣ SKLM, chỉ khác là sử dụng bảng có kích cỡ lớn hơn (10 x 20 cm). - Dùng bút chì vạch sẵn mức xuất phát cách đáy 1,5 cm. Sử dụng vi quản để kéo dung dịch mẫu thành một dãy, có bề ngang 2-4 mm, dài suốt chiều ngang của bảng nhƣng cần chừa 1cm khoảng cách 2 đầu bảng để tránh bị hiệu ứng bờ. Sấy 37 cho dung môi bay đi, đặt bảng vào bình khai triển sắc ký, có chứa 50 ml hỗn hợp dung môi giải ly. Sau khi giải ly, hiện hình vết trên bảng sẽ có nhiều dãy ; dùng lƣỡi lam hay dao có đầu nhọn cạo những dãy lớp hấp thu có chứa chất, chứa riêng biệt trong các becher có đánh số. - Thu lấy hợp chất : Chất hấp thu Silicagel có chứa chất đƣợc chứa trong một becher, rót dung môi chloroform vào để hợp chất tan vào dung môi. Hỗn hợp đƣợc để yên 15 phút để hợp chất hòa tan hết vào dung môi. Lọc qua giấy lọc hứng vào một becher khác. Thực hiện sự trích 3-5 lần nữa để bảo đảm trích hết mẫu chất ra khỏi chất hấp thu. 3.4.4.4. Kỹ thuật kết tinh phân đoạn - Giả sử chất A có lẫn một ít chất B và C. Hòa tan mẫu vào dung môi nóng, lọc dung dịch còn nóng qua giấy lọc, để yên cho dung môi nguội từ từ, hợp chất A sẽ kết tinh rắn và lẫn trong tinh thể của nó một ít B và C. Lƣợng B và C vẫn còn lẫn trong nƣớc cái. - Lọc lấy riêng tinh thể A. Lập lại kết tinh nhƣ thế thêm vài lần nữa bằng dung môi tinh khiết sẽ cho chất A tinh khiết. 3.4.5. Khảo sát tính kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform Hình 3.4: Sắc ký điều chế 38 - Các phân đoạn thu đƣợc ở sắc ký cột đƣợc tiến hành thử nghiệm kháng khuẩn với vi khuẩn E.coli, staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa. - Môi trƣờng đƣợc sử dụng ở đây là TSA, BHI. - Dung môi hòa tan mẫu là DMSO. - Dùng phƣơng pháp vòng kháng khuẩn để kiểm tra phân đoạn nào có khả năng kháng khuẩn.  Tiến hành : - Môi trƣờng TSA dùng để đổ đĩa petri với độ dày 2/3 đĩa, để 72 giờ cho đĩa khô hoàn toàn. - Hòa tan 0,4 g mẫu mỗi phân đoạn bằng 5 ml dung môi DMSO (lúc này nồng độ mẫu là 0,02 g/ml) đun nhẹ trên ngọn đèn cồn. - Cắt 1/3 đầu ống tipe, sấy khử trùng. - Dùng đầu tipe đã đƣợc khử trùng đục lỗ đĩa, mỗi đĩa đục 5 lỗ với khoảng cách đều nhau. - Cấy vi khuẩn vào môi trƣờng BHI, chuẩn độ đục của huyền dịch vi khuẩn tƣơng đƣơng với độ đục của ống Mc Farland 0,5 bằng cách thêm nƣớc muối sinh lý 0,9%. Lúc này nồng độ vi khuẩn sẽ tƣơng đƣơng 108. Pha loãng nồng độ vi khuẩn xuống còn 107, 106 bằng môi trƣờng BHI. - Dùng tâm bông vô trùng chấm nhẹ vào huyền dịch vi khuẩn, sau đó ray đều tâm bông này lên đĩa petri có sẵn các lỗ sao cho vi khuẩn có thể đƣợc trãi đều mặt đĩa. - Dùng micropipette hút 100 µl mỗi phân đoạn mẫu lần lƣợt cho vào mỗi lỗ.  Quan sát : Sau 24 giờ, nếu lỗ nào có vòng kháng khuẩn xung quanh chứng tỏ phân đoạn đó có kháng khuẩn. Ta sử dụng phân đoạn này tiếp tục thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC).  Thử nghiệm xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn: 39 Pha loãng phân đoạn kháng khuẩn ở nồng độ 0,02 g/ml xuống 0,002 g/ml (2000µg/ml). Chuẩn bị 3 nhóm ống nghiệm tƣơng ứng với 3 loại vi khuẩn, mỗi nhóm 6 ống. Bảng 3.1 : Thể tích và nồng độ các ống nghiệm. Tên các ống nghiệm Nồng độ mẫu lúc đầu (µg/ml) Thể tích mẫu cho vào (µl) Thể tích BHI cho vào (µl) Nồng độ mẫu (µg/ml) Thể tích vi khuẩn cho vào 1ml mẫu (ml) Nồng độ mẫu cuối cùng (µg/ml) E1, P1, S1 2000 100 900 200 1 100 E2, P2, S2 2000 200 800 400 1 200 E3, P3, S3 2000 300 700 600 1 300 E4, P4, S4 2000 400 600 800 1 400 E5, P5, S5 2000 500 500 1000 1 500 E6, P6, S6 2000 600 400 1200 1 600 - Chuẩn bị 3 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1 ml môi trƣờng BHI. Cho E.coli, Staphyloccoccus aureus, Pseudomonas aeruginosa lần lƣợt vào từng ống. - Ủ tất cả các ống nghiệm trong tủ ấm 37ºC/24 giờ. - Quan sát sự thay đổi độ đục của môi trƣờng, sự tạo thành cặn ở đáy và sự tạo váng ở bề mặt ống nghiệm. 3.4.6. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa DPPH 3.4.6.1. Các tính chất của gốc tự do DPPH - Là gốc tự do bền do có hiệu ứng liên hợp trong phân tử. - Độ hấp thụ cực đại tại 517 nm do gốc tự do trên Nitơ và cho màu tím trong Methanol [3]. - Có công thức cấu tạo nhƣ sau : NO2 NO2 N˙ N O2N 40 - Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa : DPPH ˉ + AH DPPH-H + A˙ - Kết quả đƣợc đánh giá thông qua giá trị IC50 (inhibitory concentration) là nồng độ chất oxy hóa cần để ức chế (trung hòa) 50% gốc tự do DPPH trong khoảng thời gian xác định. - Mẫu Vitamin C đƣợc dùng để so sánh thông giá trị IC50. 3.4.6.2. Quy trình thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH [3]  Ly trích mẫu: Sơ đồ 3.3: Quy trình ly trích mẫu cho thử nghiệm DPPH. Cân 10 g lá tƣơi Xuân Hoa Nghiền Cho vào 25 ml Methanol Lắc ở nhiệt độ phòng 30 phút Lọc Lập lại quy trình 5 lần 41  Pha mẫu: - Cân 2 mg Cao + 5 ml Methanol, lắc cho mẫu tan hoàn toàn. Nồng độ mẫu Xuân Hoa lúc này là 400 µg/ml. - Pha loãng mẫu: Pha loãng nồng độ mẫu xuống 2, 4, 8, 16 lần. Bảng 3.2: Độ pha loãng và nồng độ mẫu Xuân Hoa Độ pha loãng (lần) Nồng độ mẫu Xuân Hoa (µg/ml) 2 100 4 50 8 25 16 12,5  Pha thuốc thử : - Cân 2,7 mg DPPH cho vào bình định mức 25 ml. 42 - Thêm 25 ml MeOH, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm MeOH vào cho đủ 25 ml. - Để ổn định trong tối 30 phút, 4ºC.  Pha dung dịch chuẩn: - Cân 2 mg vitamin C vào bình định mức 5ml. - Thêm 3 ml MeOH vào, lắc mạnh cho tan hết, sau đó thêm MeOH vào cho đủ 5 ml. Nồng độ vitamin C lúc này là 400 µg/ml. - Pha loãng dung dịch chuẩn xuống 2, 4, 8, 16 lần bằng MeOH. Bảng 3.3: Độ pha loãng và nồng độ vitamin C. Độ pha loãng (lần) Nồng độ vitamin C (µg/ml) 2 100 4 50 8 25 16 12,5  Đo dung dịch chuẩn - Cho 1ml DPPH vào 1ml dung dịch chuẩn ở từng độ pha loãng. - Để ổn định trong bóng tối 30 phút. - Đo độ hấp thụ quang (OD) ở bƣớc sóng 517nm  Đo mẫu - Cho 1ml DPPH vào 1ml mẫu Xuân Hoa ở từng độ pha loãng. - Để tất cả vào trong bóng tối, 30 phút. - Đo độ hấp thụ quang (OD) ở bƣớc sóng 517 nm. 43 Hình 3.5: Các nồng độ pha loãng của vitamin C (bên trái) và mẫu Xuân Hoa (bên phải) sau khi cho DPPH vào. 44 Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các loại cao chiết Bảng 4.1: Kết quả thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao. Các loại cao Nồng độ thử nghiệm cao nhất (µg/ml) Nồng độ ức chế (µg/ml) E.coli Salmonella Ete dầu hỏa 1000 Chƣa ức chế Chƣa ức chế n-butanol 1000 Chƣa ức chế Chƣa ức chế Nƣớc 1000 Chƣa ức chế Chƣa ức chế Chloroform 500 Ức chế Ức chế cao chloroform cao ete dầu hỏa cao n-Butanol cao nƣớc Hình 4.1: Thử nghiệm các phân đoạn kháng E.coli và Salmonella 45 Cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất. Ở nồng độ 500 µg/ml, cao chloroform không cho phép khuẩn lạc vi khuẩn mọc trên bề mặt môi trƣờng thạch TSA, trong khi đó ở nồng độ 1000 µg/ml vẫn tìm thấy khuẩn lạc mọc ở các cao còn lại. 4.2. Kết quả tách chiết của cao chloroform và các phân đoạn của chúng 4.2.1. Kết quả tách chiết của cao chloroform Thực hiện sắc ký cột trên cao chloroform với hệ dung môi: Ete dầu hỏa, chloroform, methanol và hỗn hợp của chúng. Kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử H2SO410%/EtOH cho hiện vết ở 100 o C (Bảng 4.2). Bảng 4.2: Kết quả sắc ký cột trên cao chloroform. Số thứ tự bình Tên phân đoạn Dung môi giải ly cột Cao (g) Sắc ký lớp mỏng Hoạt tính kháng khuẩn Ghi chú Hệ dung môi Thuốc thử Rf 1-26 XH1 E 4,83 E:C (9:1) H2SO4 nhiều vết Âm tính 27-49 XH2 E:C (95:5) 2,47 E:C (85:15) nt nt Âm tính 50-64 XH3 E:C (9:1) 1,74 E:C (8:2) nt nt Âm tính 65-83 XH4 E:C (8:2) 1,61 E:C (7:3) nt nt Âm tính 84-96 XH5 E:C (7:3) 1,34 C:E (8:2) nt nt Âm tính 97-108 XH6 E:C (6:4) 1,98 C:E (9:1) nt 4vết Âm tính XH7 E:C 1,35 C:E nt 3vết Âm 46 109-116 (6:4) (98:2) tính 117-126 XH8 E:C (6:4) 1,63 C nt 3vết Âm tính 127-132 XH9 E:C (5:5) 0,87 C nt 2 vết Dƣơng tính khảo sát 133-136 XH10 E:C (5:5) 0,56 C:M (99:1) nt 2 vết Dƣơng tính khảo sát 137-145 XH11 E:C (5:5) 0,78 C:M (99:1) nt 3vết Dƣơng tính khảo sát 146-155 XH12 C 2,56 C:M (95:5) nt nhiều vết Dƣơng tính 156-168 XH13 C 1,23 C:M (95:5) nt 4 vết Dƣơng tính khảo sát 169-172 XH14 C 0,96 C:M (95:5) nt 5 vết Âm tính 173-192 XH15 C:Me (99:1) 1,67 C:M (8:2) nt nhiều vết Âm tính 193-204 XH16 C:Me (98:2) 0,48 C:M (7:3) nt nt Âm tính 205-216 XH17 C:Me (95:5) 0,74 C:M (7:3) nt nt Âm tính 217-223 XH18 Me Xả cột (Chú thích: Phần hoạt tính kháng khuẩn tham khảo mục 4.4). Sắc ký cột và sắc ký bản mỏng trên Cao chloroform thu đƣợc 18 phân đoạn. Dựa vào tính kháng khuẩn của các phân đoạn chúng tôi chỉ chọn phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13 để tiếp tục khảo sát. 47 4.2.2. Khảo sát phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH13. 4.2.2.1. Phân đoạn XH11 Thực hiện sắc ký điều chế trên phân đoạn 11 với hệ dung môi triển khai C: Me (98:2) thu đƣợc hợp chất màu vàng, xung quanh có lẫn một ít tạp. Kết tinh nhiều lần hợp chất này và thực hiện việc gạn lọc sau mỗi lần kết tinh, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử hiện vết là H2SO4 10%/EtOH đến khi thu đƣợc một vết tròn màu vàng có Rf=0,36. Ký hiệu chất này là XH-K11. Nhiệt độ nóng chảy: 237ºC, trọng lƣợng 4,8 mg. 4.2.2.2. Phân đoạn XH9 và XH10 Hai phân đoạn này lúc đầu trên bản mỏng có vết khác nhau, sau nhiều lần kết tinh trong chloroform ta đã loại đƣợc tạp chất, chấm bản mỏng thấy Rf giống nhau nên gộp hai phân đoạn này lại. Tiếp tục kết tinh nhiều lần trong Ethylacetat, chloroform và thực hiện việc gạn lọc sau mỗi lần kết tinh. Kết quả cho dạng tinh thể màu vàng. Kiểm tra lại bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử hiện vết là H2SO4 10%/EtOH trong hệ dung môi triển khai CHCl3:M (98:2) cho một vết tròn màu vàng có Rf=0,36; nhiệt độ nóng Hình 4.2: Chất XH-K11 trên bản mỏng 48 chảy 237ºC trùng với chất XH-K11. Gộp chung lại với chất XH-K11 ở phân đoạn XH11 cân đƣợc 12,6 mg. 4.2.2.3. Phân đoạn XH13: Thực hiện sắc ký điều chế trên phân đoạn 13 với hệ dung môi triển khai là C:Me (9:1) thu đƣợc một hợp chất màu tím. Kết tinh nhiều lần hợp chất này và thực hiện việc gạn lọc sau mỗi lần kết tinh, kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với thuốc thử hiện vết là H2SO4 10%/EtOH đến khi thu đƣợc một chất tròn màu tím, có Rf=0,27. Ký hiệu chất này là XH-K13. Nhiệt độ nóng chảy: 218ºC, trọng lƣợng 16,6 mg. Các chất tinh khiết thu đƣợc tiếp tục đƣợc tiến hành chạy phổ một chiều, phổ hai chiều NMR để xác định cấu trúc của chúng. 4.3. Cấu trúc hóa học của các chất tinh khiết. 4.3.1. Chất XH-K13 Sắc ký lớp mỏng cho hiện vết màu tím, có Rf = 0,27, nhiệt độ nóng chảy 218oC. Hình 4.3: Chất XH-K13 trên bản mỏng 49 Phổ hồng ngoại IR (ν, cm-1) cho vạch hấp thu mạnh, rộng của nhóm OH tại 3400,20 cm -1 ; vạch 2937,99 cm-1 thể hiện sự dao động của CH2, vạch 1624,65 thuộc dao động C=C, các vạch 1457,71 và 1372,95 thuộc dao động của CH, các vạch 1064,91 và 1024,40 đặc trƣng cho liên kết của nhóm C-O (Phụ lục 1). Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục 8) cho pick ion mẹ là 577 [M + H]+ cho thấy trọng lƣợng phân tử của XH-K13 là 576. Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13C-NRM kết hợp kỹ thuật Dept cho ta thấy (phụ lục 3, 4): - Trong phân tử có 35 cacbon, trong đó có 3 cacbon tứ cấp, 14 nhóm CH, 12 nhóm CH2, 6 nhóm CH3 - Các mũi ở 140,437 và 121,129 ppm là dấu hiệu của nối đôi và ở 140,437 là C= (Cacbon tứ cấp có nối đôi), ở 121,129 là của CH=.) - Một mũi đặc trƣng ở 100,795 ppm là mũi của acetal C1' của đƣờng gắn vào C ở vị trí số 3; đƣợc chứng minh nhờ phổ HMBC (phụ lục 6) cho thấy sự tƣơng tác giữa H1' và C3. Đồng thời hằng số tƣơng tác spin-spin giữa H1' và H2' là J=8 Hz, chứng tỏ liên kết kiểu trans-diaxial, kết hợp với các số liệu phổ 13C-NRM của phần đƣờng và phổ proton hai chiều COSY (phụ lục 7 ) cho thấy phù hợp với D-Glucose và nối với khung aglycon bằng liên kết beta. Mặt khác, với kỹ thuật Dept 90 cho ta 5 mũi ở các vị trí 70,09; 73,44; 76,94; 76,75; 76,69 kết hợp phổ HSQC (phụ lục 5), HMBC cho biết đó là 5 nhóm CH-OH của gốc đƣờng. Vậy trong phân tử có 1 đơn vị đƣờng có 6 cacbon. Sau đó dựa vào phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1H-NRM (phụ lục 2) xác nhận có một vạch nhọn tại độ dịch chuyển hóa học là 5,321 ppm, có cƣờng độ tích phân là 1,000 đơn vị là của H6, cùng với tín hiệu phổ 13C-NRM ở 121,129 ( CH=); cũng phù hợp trên phổ HSQC. Mặt khác dựa vào phổ HMBC cho thấy sự tƣơng tác giữa H6 với C7, C8, C10, C4 và sự tƣơng tác giữa H1 với C3, C5, C10 nên CH2 ở vị trí số 1 phải có độ dịch 50 chuyển là 36,80 ppm và C= ở vị trí số 5; chứng tỏ khung sterol có một nối đôi tại ví trí 5-6. Mặt khác kết hợp dấu hiệu định tính trên bảng mỏng khi sắc ký lớp mỏng có màu tím khi phun H2SO4 10%, sau đó hơ nóng, cho phép giả thiết khung aglycon của XH-K13 là một Sterol có 29 cacbon chứa nối đôi ở vị trí 5-6 kết hợp với đƣờngGlucose, phù hợp với công thức của β- sitosterol-3-O- β-glucoside, công thức phân tử là: C35H60O6. Công thức cấu tạo của C35H60O6: 4.3.2. Chất XH-K11 Sắc ký lớp mỏng cho hiện vết màu vàng, có Rf = 0,36, nhiệt độ nóng chảy 237oC. Phổ 1H-NMR (DMSO, ppm, 500MHz) (phụ lục 9) cho: - 2 mũi đôi của proton nhân thơm tại = 6,45 ppm và 6,83 ppm (d, J = 2 Hz), chứng tỏ chúng ở vị trí meta. - 2 mũi đôi của proton nhân thơm tại = 6,94 ppm (d, J=8,5) và 7,95 ppp (d, J= 9 Hz), chứng tỏ chúng ở vị trí ortho. Phổ 13C-NMR (DMSO, ppm, 125 MHz) (phụ lục 11) kết hợp phổ DEPT (phụ lục 10) cho thấy XH-K11 có 21 cacbon trong đó có 1 nhóm >C=O, 1 nhóm CH2 14 nhóm – CH, 5 nhóm cacbon tứ cấp. 51 Đồng thời kết hợp phổ công hƣởng từ hạt nhân 2 chiều HSQC (phụ lục 12) và HMBC (phụ lục 13) cho thấy XH-K11 thuộc nhóm flavon và là dẫn xuất của apigenin. Phổ 13C-NMR cho một mũi đặc trƣng ở 99,90 ppm là mũi của acetal C1’ của đƣờng. Dựa vào phổ HSQC (phụ lục 12) có đƣợc giá trị H1’ = 5,06 ppm. Kết hợp phổ 1H- NMR (phụ lục 9), ta có đƣợc H1’ (1H, d, J=7,5 Hz), chứng tỏ đƣờng nối với khung aglycon bằng liên kết . Mặt khác, phổ DEPT 90 (phụ lục 10) cho ta 5 mũi ở các vị trí 73,09; 77,16; 69,56; 76,42 và 60,60 ppm. Đồng thời kết hợp với phổ HSQC, HMBC (phụ lục 13) và COSY (phụ lục 14) cho biết đó là 5 nhóm CH-OH của gốc đƣờng glucose. Vậy trong phân tử có 1 đơn vị đƣờng glucose có 6 cacbon. Từ các dữ liệu về phổ và so sánh với các tài liệu tham khảo của Phan Minh Giang (2002) và Nguyễn Văn Hùng (2004) [16], chúng tôi nhận danh chất XH-K11 là: apigenin 7-O-β- glucoside, có công thức phân tử là: C21H20O10. Công thức cấu tạo của C 21H20O10 nhƣ sau: 4.4. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của các phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform. Tiến hành phƣơng pháp đo vòng kháng khuẩn đối với 18 phân đoạn đƣợc chiết từ cao chloroform. Kết quả phân đoạn XH9, XH10, XH11, XH12, XH13 có vòng kháng khuẩn xung quanh lỗ, điều này chứng tỏ rằng các phân đoạn này có khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn. 52 (1): Phân đoạn XH9. (2): phân đoạn XH10. (3): Phân đoạn XH11. (4): Phân đoạn XH12. (5): Phân đoạn XH13. Sau đó tiếp tục thử nghiệm trên các phân đoạn kháng khuẩn này để khảo sát nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn (MIC). Bảng 4.3: Nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của các phân đoạn. Phân đoạn Nồng độ ức chế tối thiểu vi khuẩn thử nghiệm (µg/ml)- MIC E.coli S. aureus Pseudomonas XH9 400 500 500 XH10 400 500 400 XH11 300 400 300 XH12 300 400 300 XH13 300 400 400 Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm các phân đoạn kháng E. coli. (1) (2) (3) (4) (5) 53 Nhận xét: Sử dụng kết quả trên làm cơ sở cho việc lựa chọn phân đoạn nào đƣợc tiếp tục khảo sát để tách chiết các hợp chất bằng phƣơng pháp sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng. Hình 4.5: Các nồng độ kháng E.coli của phân đoạn XH9. Hình 4.6: Các nồng độ kháng Staphylococcus aureus của phân đoạn XH9. E1 E2 E3 E4 E5 E6 Eđc S1 S2 S3 S4 S5 S6 Sđc 54 Hình 4.7: Các nồng độ kháng Pseudomonas aeruginosa của XH9. Chú thích: E1, E2, E3, E4, E5, E6: E. coli từ nồng độ từ 100 – 600 µg/ml. P1, P2, P3, P4, P5, P6: Pseudomonas aeruginosa từ 100 – 600 µg/ml. S1, S2, S3, S4, S5, S6: Staphylococcus aureus từ 100 – 600 µg/ml. Đc: đối chứng 4.5. Kết quả của thử nghiệm chống oxy hóa % Ức chế DPPH = (Ao- A)/Ao x 100 Đo độ hấp thu của DPPH : A0 = 1,67458. A: Độ hấp thu của dung dịch phản ứng. IC50: Nồng độ ức chế 50% gốc DPPH. Khả năng ức chế gốc tự do đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp gốc tự do bền DPPH. 4.5.1. Kết quả đo OD đối với vitamin C Vitamin C đƣợc đo 3 lần và lấy giá trị trung bình. Bảng 4.4: Nồng độ và kết quả đo OD của vitamin C Nồng độ vitamin C (µg/ml) A (OD đo ở 517 nm) 100 1,361421 50 0,766121 P1 P2 2 P3 P4 P5 P6 Pđc 55 25 0,43277 12,5 0,28491 Kết quả đo OD và nồng độ vitamin C đƣợc thể hiện dƣới dạng biểu đồ: Đồ thị 4.1: Khả năng ức chế DPPH ở các nồng độ khác nhau của vitamin C. Các nồng độ vitamin C và phần trăm ức chế đƣợc biểu thị dƣới dạng đƣờng thẳng với phƣơng trình y = -1,355x + 124,8, với hệ số tƣơng quan R=0,999. Từ đồ thị ngoại suy giá trị IC50 của vitamin C là 57,05 (µg/ml). Vitamin C đƣợc dùng làm chất chuẩn để so sánh với mẫu cần đối chiếu là Xuân Hoa. 4.5.2. Kết quả đo OD đối với dịch chiết lá Xuân Hoa Dịch chiết mẫu Xuân Hoa đƣợc đo 3 lần và lấy giá trị trung bình. Bảng 4.5: Nồng độ và kết quả đo OD của dịch chiết lá Xuân Hoa Nồng độ dịch chiết lá Xuân Hoa (µg/ml) A (OD đo ở 517nm) 100 1,12256 50 0,70756 25 0,48307 12,5 0,34129 56 Kết quả đo OD và nồng độ mẫu đƣợc thể hiện dƣới dạng biểu đồ: Đồ thị 4.2: Khả năng ức chế DPPH ở các nồng độ khác của dịch chiết lá Xuân Hoa. Các nồng độ mẫu Xuân Hoa và phần trăm ức chế đƣợc biểu thị dƣới dạng đƣờng thẳng y = -1,897x + 161,4, với hệ số tƣơng quan R=0.998. Từ đồ thị ngoại suy giá trị IC50 của mẫu Xuân Hoa là 66,55 (µg/ml). Bảng 4.6: So sánh khả năng kháng oxy hóa của vitamin C và dịch chiết lá Xuân Hoa: Độ hấp thụ của DPPH Độ hấp thụ của (DPPH + vitamin C) Độ hấp thụ của (DPPH + mẫu Xuân Hoa) 1,67458 1,361421 1,12256 Nhận xét: - Độ hấp thụ quang của DPPH giảm từ 1,67458 xuống 1,361421 đối với trƣờng hợp có vitamin C và giảm xuống 1,12256 đối với trƣờng hợp có dịch chiết lá Xuân Hoa. Điều này có nghĩa là trong lá Xuân Hoa có một số hợp chất chống oxy hóa đã tác dụng với phân tử DPPH làm cho độ hấp thụ giảm xuống : 57 Cơ chế phản ứng của gốc tự do DPPH và chất chống oxy hóa : DPPH ˉ + AH DPPH-H + A˙ - So sánh IC50 của mẫu Xuân Hoa (66,55 µg/ml) với IC50 của vitamin C (57,05 µg/ml): Nồng độ để ức chế 50% DPPH của mẫu Xuân Hoa là 66,55µg/ml, trong khi nồng độ để ức chế 50% DPPH của vitamin C là 57,05 µg/ml, kết luận rằng hàm lƣợng các phân tử chống oxy hóa của mẫu Xuân Hoa là khá cao (bằng 85,7% vitamin C). 58 Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận - Lá Xuân Hoa đƣợc chiết soxhlet với dung môi ethanol, sau đó lần lƣợt chiết với ete dầu hỏa, chloroform, n-butanol lần lƣợt cho 4 loại cao: Cao ete dầu hỏa, cao chloroform, cao n-butanol và cao nƣớc. Thử nghiệm kháng khuẩn 4 loại cao này đối với E.coli và Salmonella, kết quả xác định đƣợc cao chloroform có hoạt tính kháng khuẩn nhất, với nồng độ ức chế tối thiểu là 500 µg/ml. - Chạy sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng trên cao chloroform, kết quả thu đƣợc 18 phân đoạn. - Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 18 phân đoạn, kết quả xác định đƣợc phân đoạn có hoạt tính kháng khuẩn là: XH9, XH10, XH11, XH12, XH13. - Kết hợp kết quả chạy sắc ký cột và thử kháng khuẩn các phân đoạn, cuối cùng chọn ra 4 phân đoạn tiếp tục khảo sát là: XH9, XH10, XH11, XH13. Tiếp tục kết tinh xác định đƣợc 2 chất: XH-K11 với nhiệt độ nóng chảy 237ºC và XH- K13 với nhiệt độ nóng chảy 218ºC. - Chạy phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều xác định đƣợc chất XH-K11 là apigenin 7-O-β-glucoside, có công thức phân tử: C21H20O10 và chất XH-K13 là β-sitosterol-3-O-β-glucoside, có công thức phân tử: C35H60O5. - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của lá Xuân Hoa dựa vào phƣơng pháp DPPH đã xác định đƣợc trong lá Xuân Hoa có chất chống oxy hóa với hàm lƣợng là khá cao (85,7% vitamin C). 5.2. Đề nghị 59 Với sự hiểu biết và kinh nghiệm có giới hạn của một sinh viên nên kết quả sẽ có những thiếu xót. Vì thời gian và kinh phí làm đề tài còn hạn hẹp nên không thể tiếp tục chiết tách thêm một số hợp chất thứ cấp trong lá Xuân Hoa có hoạt tính sinh học cao. Nếu có thời gian, tôi xin đƣợc phép đề nghị tiếp tục phân tích các thành phần và tách chiết các hợp chất thứ cấp nhằm sử dụng chúng thay thế cho kháng sinh trong tƣơng lai. Thêm vào đó, nghiên cứu sâu hơn nữa để có thể sử dụng cây Xuân Hoa nhƣ một thực phẩm chức năng là một trong những hƣớng vô cùng quan trọng. 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Nguyễn Thạc Cát, 1985. Phương pháp sắc ký. Nhà Xuất Bản Khoa Học và Kỹ Thuật. 2. Võ Văn Chi, 1997. Từ điển cây thuốc Việt Nam. Nhà Xuất Bản Hà Nội. 3. Bùi Trọng Đạt, Phùng Văn Trung, Phan Nhật Minh, Hoàng Thị Ngọc Dung và Phạm Cao Thanh Tùng, 2003. Xây dựng quy trình thử hoạt tính kháng oxy hóa DPPH và sàng lọc một số cao chiết từ cây cỏ Việt Nam.Tuyển Tập Công Trình Nghiên Cứu Khoa Học và Công Nghệ năm 2003; tr.150-155. 4. Nguyễn Văn Hùng, Lê Anh Tuấn và Nguyễn Quyết Chiến, 2004. Nghiên cứu thành phần hóa học cây Xuân Hoa (Pseuderanthemum Palatiferum Nees Radlk). Tạp Chí Khoa Học và Công Nghệ, tập 42, số 2; tr.75-79. 5. Trần Công Khánh, Nguyễn Văn Hùng, Nguyễn Thị Thanh Nhài, Lê Mai Hƣơng và Bùi Kim Liên, 1997. Góp phần nghiên cứu về thực vật, thành phần hóa học và tác dụng sinh học của cây Xuân Hoa. Tạp chí dược liệu, tập 3; tr. 37-41. 6. Trần Công Khánh, 1997. Sự thật về cây thuốc kỳ diệu-cây Xuân Hoa. Tạp Chí Thuốc và Sức Khỏe, số 101; tr.10-11. 61 7. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2000-2001. Các phương pháp nhận danh; trích ly cô lập các hợp chất hữu cơ. Trƣờng Đại Học Khoa Học Tự Nhiên. 8. Nguyễn Văn Thanh. Vi sinh học. Nhà Xuất Bản Y học. 9. Nguyễn Thị Minh Thu, Trần Công Khánh, Trần Vân Hiền, Tạ Thị Phòng, Trần Lê Du, 1999. Thử độc tính cấp diễn và tác dụng bảo vệ tế bào gan của cây Xuân Hoa. Tạp Chí Dƣợc Học, số 9; tr.15-17. 10. Bài giảng chiết xuất dƣợc liệu. Trƣờng Đại Học Y Dƣợc TpHCM. 11. Bài giảng dƣợc liệu, 2002. Trƣờng Đại Học Dƣợc Hà Nội, Bộ Môn Dƣợc Liệu. Nhà Xuất Bản Y Học. 12. Vi sinh vật y học. Bộ Y Tế, Vụ Khoa Học- Đào Tạo. TIẾNG NƢỚC NGOÀI 13. Dejian Huang, Boxin Ou and Ronald L. Prior, 2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53; p.41-56. 14. Huỳnh Kim Diệu, Châu Bá Lộc, Seishi Yamasaki and Yutaka Hirata, 2006. The effects of Pseuderanthemum palatiferum a new medicinal, on growth performances and diarrhea of piglets.JARQ, No.40; P.85-91. 15. Irina I. Koleva, Teris A. van Beek, jozef P. H. Linssen, Aede de Grôt and Lyuba N. Evstatieva, 2002. Screening of plant extract for antioxidant activity: a 62 comparative study on three testing methods. Phytichemical analysid, No.13; p.8-17. 16. Phan Minh Giang, Ha Viet Bao, Phan Tong Son. 2000. Phytochemical study on Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Raldk, Acanthaceae. Joural of chemistry, Vol.41, No.2, trang 115-118. TÀI LIỆU TRÊN MẠNG 17. http:// www.jireas. Affre.go.jp. 18. http:// www.cancerweb.ncl.ac.uk/cgi-bin/omd=antioxidants. 19. http:// www.unabridged.merriam-webster.com. Phụ lục 1 : Phổ IR của chất XH-K13. Phụ lục 2 : Phổ 1H- NMR của chất XH-K13 Phụ lục 2a: Phổ 1H- NMR của chất XH-K13. Phụ lục 2b : Phổ 1H- NMR của chất XH-K13. Phụ lục 3: Phổ 13C- NMR của chất XH-K13. Phụ lục 3a: Phổ 13C- NMR của chất XH-K13. Phụ lục 3b: Phổ 13C- NMR của chất XH-K13. Phụ lục4: Phổ Dept của chất XH-K13 Phụ lục 5: Phổ HSQC của chất XH-K13 Phụ lục 5a: Phổ HSQC của chất XH-K13. Phụ lục 5b: Phổ HSQC của chất XH-K13. Phụ lục 6: Phổ HMBC của chất XH-K13. Phụ lục 6a: Phổ HMBC của chất XH-K13. Phụ lục 6b: Phổ HMBC của chất XH-K13. Phụ lục 6c: Phổ HMBC của chất XH-K13. Phụ lục 7: Phổ COSY của chất XH-K13. Phụ lục 7a: Phổ COSY của chất XH-K13. Phụ lục 7b: Phổ COSY của chất XH-K13. Phụ lục 8: Phổ MS của chất XH-K13. Phụ lục 9: Phổ 1H của chất XH-K11. Phụ lục 10: Phổ 13CNRM và DEPT của chất XH-K11. Phụ lục11: Phổ 13CNMR của chất XH-K11 Phụ lục 12: Phổ HSQC của chất XH-K11 Phụ lục 12a: Phổ HSQC chất XH-K11. Phụ lục 12b: Phổ HSQC của chất XH-K11 Phụ lục 13: Phổ HMBC của chất XH-K11 Phụ lục 13a: Phổ HMBC của chất XH-K11 Phụ lục 13b: Phổ HMBC của chất XH-K11 Phụ lục 14: Phổ COSY của chất XH-K11 Phụ lục 14a: Phổ COSY của chất XH-K11 Phụ lục 14b: Phổ COSY của chất XH-K11. Phụ Lục14c: Phổ COSY của chất XH-K11 Phụ lục 15: Dữ liệu phổ 13C – NMR và DEPT của chất XH-K13. Vị trí C 13C – NMR Dept 135 Tín hiệu mũi (δppm) 1 36,80 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 2 29,24 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 3 76,94 CH=O Mũi dƣơng 4 38,29 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 5 140,43 C= Biến mất 6 121,29 CH= Mũi dƣơng 7 31,34 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 8 31,39 CH Mũi dƣơng 9 49,59 CH Mũi dƣơng 10 36,18 C Biến mất 11 20,56 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 12 39,30 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 13 41,82 C Biến mất 14 56,15 CH Mũi dƣơng 15 23,82 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 16 27,74 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 17 55,42 CH Mũi dƣơng 18 11,62 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90 19 18,91 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90 20 35,44 CH Mũi dƣơng 21 18,58 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90 22 33,34 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 23 25,47 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 24 45,14 CH Mũi dƣơng 25 28,71 CH Mũi dƣơng 26 19,65 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90 27 19,05 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90 28 22,59 CH2 Mũi âm, mất trong Dept 90 29 11,74 CH3 Mũi dƣơng, mất trong Dept 90 1 ' 100,79 CHOH Mũi dƣơng 2' 73,44 CHOH Mũi dƣơng 3' 76,69 CHOH Mũi dƣơng 4' 70,09 CHOH Mũi dƣơng 5' 76,75 CHOH Mũi dƣơng 6' 61,08 CH2OH Mũi âm, mất trong Dept 90 Phụ lục 16: Dữ liệu các phổ của chất XH-K13 Vị trí 1H – NMR 13C – NMR COSY HMBC C (δ ppm, J = Hz) (δ ppm ) 1H - 1H H  C 1 1,77; 0,987; m 36,80 C3, C5, C10 2 1,804; 1,508; m 29,24 3 3,43, m 76,94 H3/H4a;H3/H4b 4 4a:2,12 / 4b:2,37 38,29 H4a/H4b C2,C10,C3 /C6,C5 5 140,43 6 5,32; s; 1H 121,29 H6/H7 C7,C8,C10, C4 7 1,946; 1,97; t 31,34 H7/H8 8 1,512; m; 1H 31,39 9 0,9075; d; 1H 49,59 10 36,18 11 11a:1,4; 11b:1,5; m 20,56 12 12a:1,17; 12b:1,97; m 39,30 13 41,82 14 0,86; m; 1H 56,15 15 15a:1,13; 15b:1,52; m 23,82 16 16a:1,23; 16b:1,78; m 27,74 17 1,157; m; 1H 55,42 18 0,67; s; 3H 11,62 C13, C17,C14 19 0,96, s; 3H 18,91 C9, C10, C5 20 1,3; m; 1H 35,44 H20/H21 21 0,91, d; 3H 18,58 H21/H20 C17,C20,C22 22 22a:1,4; 22b:1,24 33,34 23 1,18; m; 2H 25,47 24 0,93; m; 2H 45,41 25 1,609; m; 1H 28,71 26 0,78; s; 3H 19,65 27 0,80; s; 3H 19,05 28 28a:1,20; 28b:1,22 22,59 29 0,82; t; 3H 11,74 1' 4,22; d, J=8 100,79 H1'/ H2' C3' 2,90; m; 1H 2' OH-2'=4,84 73,44 OH-2'/ H2' 3,12; m; 1H 3' OH-3' = 4,85 76,69 OH-3'/ H3' 3,02; m; 1H Phụ lục 17: Dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của XH-K11 Vị trí C 13C-NMR DEPT 90 DEPT 135 Kết luận (δ ppm ) 2 164,30 Biến mất Biến mất >C=O 3 102,98 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 4 181.96 Biến mất Biến mất >C=O 5 161,09 Biến mất Biến mất =C-OH 6 99,50 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 7 162,93 Biến mất Biến mất =C-O 8 94,83 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 9 156,92 Biến mất Biến mất =C–O 10 105,31 Biến mất Biến mất =C< 1’ 120,77 Biến mất Biến mất >C= 2’ 128,60 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 3’ 116,06 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 4’ 162,31 Biến mất Biến mất =C–OH 5’ 116,06 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= 6’ 127,60 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH= Glucose 1 99,90 Mũi dƣơng Mũi dƣơng >CH kề O 2 73,09 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH – OH 3 77,16 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH – OH 4 69,56 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH – OH 5 76,42 Mũi dƣơng Mũi dƣơng –CH – OH 6 60,60 Biến mất Mũi âm –CH2–OH 4' OH-4'= 4,82 70,09 OH-4'/ H4' 5' 3,07; m; 1H 76,75 Phụ lục 18: Dữ liệu phổ 13C-NMR, 1H-NMR, COSY, HMBC của chất XH- K11. Vị tríC 13C-NMR 1H-NMR COSY HMBC (δ ppm ) 1H 1H 1H 13H 2 164,30 3 102,98 6,86 (1H,s) H3 C4, C2 4 181.96 5 161,09 6 99,5 6,45 (1H, d, J = 2,0 Hz) H6 H8 H6 C8, C10 7 162,93 8 94,83 6,83 (1H, d, J = 2,0 Hz) H8 H6 H8 C6, C7, C9, C10 9 156,92 10 105,31 1’ 120,77 2’ 128,60 7,95 (1H, d, J = 9,0 Hz) H2’ H3’ 3’ 116,06 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) H3’ H2’ 4’ 162,31 5’ 116,06 6,94 (1H, d, J = 8,5 Hz) 6’ 127,60 7,95 (1H, d, J = 9,0 Hz) Glucose 1 99,9 5,06 (1H,d, J=7,5Hz) H1 C7 2 73,09 3 77,16 4 69,56 5 76,42 6 60,60